Автореферат - Институт биологии гена РАН
advertisement
На правах рукописи Шелудченков Антон Александрович Исследование механизма цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 на опухолевые клетки специальность 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммуногенетики рака Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Сащенко Лидия Павловна Официальные оппоненты: Молотковская Ирина Михайловна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН), руководитель Группы липидных модуляторов иммунитета Отдела иммунологии Прасолов Владимир Сергеевич, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), заведующий лабораторией клеточных основ развития злокачественных заболеваний Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук (ИБР РАН) Защита состоится «___» __________ 2014 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук по адресу: http://genebiology.ru/dissertation/Dis-Sheludchenkov.pdf Автореферат разослан: «___» __________ 2014 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук 2 Грабовская Л.С. Общая характеристика работы Актуальность темы исследования. Баланс между клеточным делением и клеточной смертью играет важную роль в процессе развития и гомеостаза многоклеточных организмов. При этом нарушения в любом из этих процессов могут иметь патологические последствия для организма, вызывая нарушения эмбриогенеза, нейродегенеративные заболевания или же возникновение и развитие опухолей. Именно поэтому критически важную роль играют механизмы регуляции клеточного цикла и, в частности, механизмы запуска программы клеточной смерти. В настоящее время вызывает несомненный интерес исследование регуляции процессов, запускаемых под действием цитотоксических белков в клетках. Охарактеризовано множество цитотоксических белковых факторов, секретируемых клетками иммунной системы и способных запускать программу клеточной смерти, взаимодействуя с рецептором на поверхности клетки. В число этих факторов входят TNF-α, FasL, TRAIL и другие. Описаны случаи, когда стимуляция одного и того же рецептора может, в зависимости от физиологического состояния клетки, приводить к запуску двух альтернативных программ клеточной смерти: апоптоза и некроптоза. Такая ситуация, в частности, имеет место для рецептора TNFR1: стимуляция лигандом TNF-α может приводить к запуску как апоптоза, так и некроптоза. При этом продолжают обнаруживаться всё новые цитотоксические факторы, а также новые регуляторные белки. Регуляция механизма цитотоксического действия важна для предотвращения неконтролируемого уничтожения клеток, при этом белки-регуляторы могут проявлять функциональную активность, конкурентно связываясь с цитотоксическим фактором или с рецептором, препятствуя запуску цитотоксического сигнала. В лаборатории молекулярной иммуногенетики рака, где и была проведена настоящая работа, ранее было показано, что Tag7/PGLYRP1, представляющий собой пептидогликанраспознающий белок, и главный белок теплового шока, шаперон Hsp70/Hsp70-1A, способны взаимодействовать, формируя устойчивый белковый комплекс Tag7-Hsp70 – новый цитотоксический агент, проявляющий активность в отношении клеток некоторых опухолевых линий. Было также показано, что этот же самый комплекс способны секретировать лимфокин-активированные киллерные клетки CD8+–типа, культивируемые в отсутствии клеток-мишеней. Кроме того, было установлено, что в роли белков-регуляторов цитотоксического действия Tag7-Hsp70 могут выступать Ca2+-связывающий белок метастазин-1 (Mts1/S100A4), способный взаимодействовать как с Tag7, так и с Hsp70, препятствуя формированию цитотоксически активного Tag7-Hsp70, а также ингибитор 3 АТФазной активности Hsp70, его кошаперон HspBP1. При этом оставались невыясненными механизмы запуска цитотоксических процессов в клетках-мишенях под действием Tag7Hsp70, как и характеристика самих процессов. Исследование механизма действия новых цитотоксических агентов, как и поиск новых белков-регуляторов их активности, представляют значительный интерес как для фундаментальных, так и для прикладных исследований. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в расширении представления о механизмах регуляции цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 и выяснении механизмов цитотоксических процессов, запускаемых под действием Tag7-Hsp70 в опухолевых клетках. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи: 1) изучить взаимодействие внеклеточного HspBP1 с Tag7 в кондиционной среде опухолевых клеток линии CSML-0 и в сыворотке крови человека; 2) охарактеризовать цитотоксические процессы, индуцируемые комплексом Tag7-Hsp70 в опухолевых клетках; 3) выявить рецептор на поверхности опухолевых клеток, участвующий в индукции цитотоксических процессов под действием Tag7-Hsp70. Научная новизна работы. В диссертационной работе впервые продемонстрировано, что белок Tag7 образует с белком HspBP1 стабильный комплекс в супернатантах опухолевых клеток и в сыворотке крови человека. При этом взаимодействие Tag7 с HspBP1 препятствует формированию цитотоксически активного комплекса Tag7-Hsp70 и может служить защитной мерой организма от воздействия этого комплекса. Установлена идентичность цитотоксических процессов в опухолевых клетках, индуцированных воздействием Tag7Hsp70 и TNF-α. Показано, что Tag7-Hsp70, подобно TNF-α, индуцирует в опухолевой клетке два альтернативных механизма клеточной смерти: быстро протекающий каспазозависимый апоптоз и медленно протекающий RIP1-зависимый некроптоз. Из гетерогенной культуры L929 выделены клоны, в которых под действием Tag7-Hsp70 запускается только один механизм клеточной смерти. Установлено, что антиоксидант ионол, ингибитор лизосомальных ферментов хлорохин и хелатор кальция EGTA ингибируют некроптоз, запускаемый под действием комплекса Tag7-Hsp70. Показано, что Tag7-Hsp70 индуцирует цитотоксические процессы в опухолевых клетках, взаимодействуя с рецептором TNFR1. Практическая ценность исследований. Раковые заболевания в настоящее время занимают лидирующую позицию в ряду основных причин смерти среди населения планеты. Поиск новых цитотоксических препаратов, а также исследование механизмов гибели опухолевых клеток под действием этих препаратов чрезвычайно важны для развития новых 4 стратегий специфической противоопухолевой иммунотерапии. Установление молекулярных механизмов цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 на опухолевые клетки может быть использовано для разработки противоопухолевых лекарственных препаратов на его основе. При этом расширение представления о регуляции цитотоксической активности Tag7-Hsp70 и выяснение роли HspBP1 в этом процессе может способствовать разработке препаратов, корректирующих иммунный ответ, а также систем для диагностики состояния иммунной системы организма и восприимчивости клеток организма к вакцинам, разработанным на основе Tag7-Hsp70. Апробация результатов диссертационной работы. Результаты работы были доложены на международных школах и конференциях: XXV Международная зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», посвящённая 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН (Москва, Россия, 2013), 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология – наука XXI века» (Москва, Россия, 2012), 1st EATI & 3rd ERI-ICP Conferences “Death, Danger, Inflammation and Immunity” (Париж, Франция, 2012). Публикации. По материалам диссертационной работы было опубликовано 6 печатных работ. Из них статей в рецензируемых журналах – 3, материалов конференций – 3. Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах, содержит 17 рисунков, 1 таблицу и включает следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Результаты и обсуждение», «Материалы и методы», «Выводы» и «Список литературы», содержащий 139 ссылок. 5 Содержание работы Результаты исследований и их обсуждение 1. Влияние белка HspBP1 на цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7- Hsp70. 1.1. Клетки CSML-0 секретируют и Tag7, и HspBP1. Ранее в лаборатории молекулярной иммуногенетики рака, где и проводилась настоящая работа, было установлено, что белок HspBP1, который является кошапероном Hsp70, способен взаимодействовать не только c Hsp70, но и с Tag7 in vitro. Такое взаимодействие препятствует формированию цитотоксически активного Tag7-Hsp70. При этом для восстановления цитотоксической активности необходимо добавить Hsp70 в концентрации, превышающей в 5 раз концентрацию Tag7-HspBP1. Для выяснения, имеет ли взаимодействие между Tag7 и HspBP1 физиологическую важность, мы проанализировали взаимодействие Tag7 и HspBP1, выделяемых клетками. Известно, что Tag7 – это секреторный белок, который может выделяться лимфоцитами и представителями некоторых линий опухолевых клеток. Относительно выделения белков Hsp70 и HspBP1 во внеклеточную среду известно значительно меньше. Сравнительно недавно было показано, что клетки могут выделять эти белки при попадании в стрессовую ситуацию. Мы исследовали кондиционные среды опухолевых клеток различных линий на наличие в них экзогенного культивировались стрессорных в течение условиях бессывороточной Клетки HspBP1. среде. 24 ч голодания После в в этого кондиционная среда отбиралась, осаждалась в ТХУ и анализировалась на наличие HspBP1 при помощи вестерн-блоттинга. В результате такого анализа было обнаружено, что в кондиционных средах клеток линий CSML-0 (неметастазирующая аденокарцинома мыши), HeLa (рак шейки матки человека) и L-929 (фибросаркома мыши) присутствует HspBP1, при этом наиболее сильный сигнал был зарегистрирован в случае клеток CSML-0 (рис. 1А). Поскольку ранее было показано, 6 Рис. 1. Анализ кондиционных сред клеток различных опухолевых линий. А. Кондиционные среды клеток (по 50 мкл) осаждали в 7% ТХУ, после чего анализировали методом вестернблоттинга с использованием антител к HspBP1. Б. Кондиционная среда клеток CSML-0 иммунопреципитировалась на колонках с иммобилизованными на сефарозе антителами к Tag7 и к HspBP1. Белки связавшейся фракции анализировались методом вестернблоттинга с использованием антител к Tag7, к Hsp70 и к HspBP1. что клетки CSML-0 способны секретировать Tag7, мы выясняли, не могут ли белки Tag7 и HspBP1 образовывать в кондиционной среде клеток CSML-0 комплекс Tag7-HspBP1. Для этого были приготовлены две иммуноадсорбционные колонки: одна – с иммобилизованными на сефарозе антителами к Tag7, а другая – к HspBP1. Кондиционная среда клеток CSML-0 разделялась на этих колонках, после чего колонки тщательно отмывались от неспецифично связавшихся белков, а связавшиеся фракции элюировались триэтиламином, pH 12. Затем белки связавшихся фракций разделялись при помощи SDSPAGE и анализировались методом вестерн-блоттинга. При этом и Tag7, и HspBP1 детектировались в связавшейся фракции каждой из колонок, что свидетельствует о формировании комплекса Tag7-HspBP1 в кондиционной среде (рис. 1Б). В то же время Hsp70 не связывался ни с первой, ни со второй колонкой, указывая на то, что кондиционная среда клеток CSML-0 не содержит ни комплекса Tag7-Hsp70, ни комплекса Hsp70-HspBP1. Было интересно выяснить, образуется ли комплекс Tag7-HspBP1 внутри клетки или же клетка выделяет каждый из белков отдельно, а комплекс формируется уже в кондиционной среде. С помощью конфокального микроскопа было установлено, что и Tag7, и HspBP1 равномерно распределены по цитоплазме клетки, при этом мы не обнаружили организованных гранулярных структур с признаками колокализации этих белков (Рис. 2). Можно предположить, что белки Tag7 и HspBP1 секретируются отдельно, а комплекс формируется за пределами клетки. Рис. 2. Локализация белков Tag7 и HspBP1 в клетке CSML-0. Tag7 выделен зелёным цветом, HspBP1 – красным. Правая картинка соответствует наложению двух сигналов: от Tag7 и от HspBP1. Фотографии получены при помощи конфокального микроскопа Leica TCS SP2 (Wetzlar, Germany) при 100-кратном увеличении. 1.2. HspBP1 препятствует формированию цитотоксического Tag7-Hsp70. Кондиционная среда клеток CSML-0, полученная при культивировании клеток в отсутствии сыворотки, не проявляла цитотоксической активности по отношению к клеткам опухолевой линии L-929 (фибросаркома мыши). Мы решили проверить, может ли 7 титрование этой кондиционной среды белком Hsp70 привести к появлению цитотоксичности, как это было показано ранее для рекомбинантного комплекса. Для этого определялась концентрация комплекса Tag7-HspBP1 в кондиционной среде клеток CSML-0 следующим образом. Кондиционная среда разделялась на иммуноадсорбционной колонке с иммобилизованными на сефарозе антителами к Tag7, после чего концентрация белка в связавшейся фракции измерялась по методу Бредфорд. Поскольку ранее мы установили, что в кондиционной среде CSML-0 белки Tag7 и HspBP1 присутствуют в виде комплекса Tag7-HspBP1 (рис. 1Б), то концентрацию Tag7-HspBP1 рассчитывали в предположении эквимолярной концентрации белков в связавшейся фракции. Далее кондиционная среда клеток CSML-0 инкубировалась с двумя различными концентрациями Hsp70: эквимолярной (10-9 М) и 5-кратной (5×10-9 М) по отношению к концентрации Tag7-HspBP1. При эквимолярной концентрации Tag7-HspBP1 и Hsp70 цитотоксическая активность кондиционной среды оставалась низкой, менее 5%, однако при 5-кратном избытке Hsp70 она резко возрастала, превышая 25%. При этом цитотоксическая активность блокировалась при добавлении антител как к Tag7, так и к Hsp70 (рис. 3). Рис. 3. Изменение цитотоксической активности кондиционной среды (супернатанта) клеток CSML-0 при добавлении Hsp70. Слева направо: супернатант CSML-0, содержащий ~10-9 М комплекса Tag7-HspBP1; супернатант, к которому добавлен Hsp70 в эквимолярной концентрации (10-9 М); супернатант, к которому добавлен Hsp70 в 5-кратной концентрации (5×10-9 М); супернатант, к которому добавлены антитела к Hsp70 и Hsp70 в 5-кратной концентрации; супернатант CSML-0, к которому добавлены антитела к Tag7 и Hsp70 в 5-кратной концентрации. Антитела к Tag7 и к Hsp70 добавлялись за 30 мин до добавления белков. Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим. Эти результаты позволяют предположить, что белок Hsp70 способен вытеснять белок HspBP1 из комплекса Tag7-HspBP1 за счёт конкурентного связывания с белком Tag7, так же, как это было показано ранее для рекомбинантного комплекса, при этом формируется цитотоксически активный комплекс Tag7-Hsp70. Сама по себе кондиционная среда CSML-0 8 в нашем опыте не обладала цитотоксической активностью, поскольку в ней Tag7 присутствовал не в составе цитотоксического комплекса Tag7-Hsp70, а в составе неактивного комплекса Tag7-HspBP1. Не исключено, что при выращивании клеток CSML-0 в других физиологических условиях – при добавлении сыворотки или в условиях теплового стресса – кондиционная среда этих клеток будет содержать белок Hsp70 в концентрациях, достаточных для формирования комплекса Tag7-Hsp70, проявляющего цитотоксическую активность. 1.3. HspBP1 связывается с Tag7 в сыворотке крови человека Для выяснения биологической значимости формирования белкового комплекса Tag7HspBP1 мы решили установить, может ли Tag7-HspBP1 формироваться in vivo. В качестве материала для анализа мы выбрали сыворотку крови человека. Известно, что белки Hsp70 и HspBP1 присутствуют в составе сыворотки человека. О присутствии же Tag7 в сыворотке человека данных не было. Мы выясняли, присутствует ли Tag7 в составе сыворотки и, если присутствует, вступает ли он во взаимодействие с белками Hsp70 и HspBP1. Белки сыворотки сорбировались на иммуноадсорбционной колонке с иммобилизованными антителами к Tag7, связавшиеся белки анализировались методом вестерн-блоттинга. В результате Tag7 и HspBP1 были обнаружены в сыворотке каждого 3его из 9 обследованных доноров, при этом Tag7 всегда обнаруживался в комплексе с HspBP1 (рис. 4). Эти же данные были подтверждены нанесением тех же самых образцов на колонку с антителами к HspBP1: Tag7 был обнаружен во фракциях, связавшихся с колонкой (рис. 4). Рис. 4. Присутствие комплекса Tag7-HspBP1 в сыворотке человеческой крови. Белки сыворотки наносились на колонки с иммобилизованными на сефарозе антителами к Tag7, к HspBP1 и к Hsp70. Белки связавшейся фракции в каждом случае анализировались при помощи вестерн-блоттинга с использованием антител к Tag7, к Hsp70 и к HspBP1. Таким образом, HspBP1 может связываться с Tag7 не только in vitro, но и в кондиционных средах опухолевых клеток, а также в сыворотке крови человека. Tag7 был обнаружен у 30% обследованных доноров, но мы нигде не обнаружили свободного Tag7: он всегда находился в комплексе с HspBP1. В этом можно увидеть ещё один механизм ингибиторного действия HspBP1 на цитотоксическую активность комплекса Tag7-Hsp70: связываясь с Tag7, HspBP1 препятствует формированию цитотоксически активного Tag7-Hsp70, и в этом случае только 9 повышенная концентрация Hsp70 может приводить к созданию такого комплекса. Можно предположить, что таким образом контролируется цитотоксическое воздействие Tag7-Hsp70 на клетки организма: несмотря на то, что цитотоксическое действие Tag7-Hsp70 специфично в отношении опухолевых клеток, не исключено, что накопление и длительная циркуляция этого комплекса в крови могут привести к повреждению и гибели лимфоцитов и клеток эпителия сосудов. 2. Исследование механизмов цитотоксических процессов, запускаемых в клетках опухолевой линии L-929 под действием белкового комплекса Tag7-Hsp70. 2.1. Исследование кинетики цитотоксических процессов, запускаемых в клетках L929 под действием Tag7-Hsp70. Далее мы исследовали, как осуществляется передача цитотоксического сигнала в клетки L-929 при их контакте с белковым комплексом Tag7-Hsp70. Следовало установить: 1) какие процессы, приводящие клетку к гибели, активируются под действием исследуемого комплекса; 2) участвует ли в передаче цитотоксического сигнала рецептор клеточной поверхности или же Tag7-Hsp70 попадает в клетку путём эндоцитоза, после чего активирует комплекс реакций, приводящих к клеточной гибели. При исследовании кинетики цитотоксического действия Tag7-Hsp70 мы обнаружили, что добавление Tag7-Hsp70 к инкубационной среде клеток опухолевой линии L-929 приводит к появлению двух пиков гибели в культуре: один из пиков наблюдался через ~3 ч, а другой – через ~18-24 ч после добавления белкового комплекса. Известно, что в клетках L-929 классический цитокин TNF-α способен запускать два альтернативных механизма клеточной смерти: апоптоз и некроптоз. При этом первый механизм развивается очень быстро, в течение 1-3 ч, а второй развивается значительно медленнее, приводя к клеточной смерти через ~20 ч. Сравнение кинетики цитотоксического действия Tag7-Hsp70 и TNF-α на клетки L-929 обнаружило аналогию: кривые зависимости величины клеточной смерти от времени инкубации клеток с цитотоксическим агентом коррелируют, при этом в каждом случае обнаруживается 2 пика цитотоксической активности: через ~3 ч и через ~18-24 ч (рис. 5). Можно предположить, что и под действием Tag7-Hsp70, и под действием TNF-α в клетках активируются сходные механизмы цитотоксичности. Мы обратили внимание, что в культуре L-929 клеточная смерть под действием Tag7Hsp70 не превышала 25 %. Этот факт может объясняться гетерогенностью клеток-мишеней по отношению к цитотоксическому действию белкового агента: известно, что генетически 10 гомогенные клеточные линии, выделенные из тканевых культур, могут содержать субпопуляции, обладающие разной чувствительностью к действию цитотоксических агентов. Рис. 5. Кинетика цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 и цитокина TNF-α на клетки опухолевой линии L-929. Клетки L-929 инкубировали с Tag7-Hsp70 (10-9 М) или с TNF-α (10-9 М). Цитотоксическая активность определялась методом окрашивания трипановым синим. Нелинейный характер кривой, отражающей зависимость величины клеточной смерти от времени инкубации клеток с комплексом Tag7-Hsp70, а также дискретность цитотоксического действия комплекса позволяют предположить, что и в нашем случае в культуре L-929 присутствует по меньшей мере две субпопуляции клеток, в каждой из которых под действием Tag7-Hsp70 запускается свой механизм передачи цитотоксического сигнала, приводя к клеточной гибели через соответствующий временной интервал. Используя метод предельного разведения, нам удалось получить отдельные клоны клеток L929: был получен клон L-929s1, который проявлял гибель только в течение первых 4 ч, а также клон L-929s2, который проявлял гибель не ранее чем после 16 ч инкубации с Tag7Hsp70 (рис. 6). Уровни гибели клеток в этих клонах были существенно выше, чем в клетках гетерогенной популяции, как видно из графиков на рисунке 6. Кроме того, некоторые клоны оказались устойчивыми к цитотоксическому действию Tag7-Hsp70 (L-929r на рис. 6). Но при культивировании клонов, высокочувствительных к цитотоксическому действию Tag7-Hsp70, через 7-10 дней их чувствительность по отношению к комплексу снижалась, видимо, отражая возникновение в культуре признаков гетерогенности, что сильно затрудняло работу 11 с этими клонами и препятствовало воспроизводимости результатов. В результате в дальнейших исследованиях мы использовали стабильную культуру клеток L-929 с относительно низким цитотоксическим эффектом, наблюдаемым при добавлении Tag7Hsp70, но с высокой воспроизводимостью результатов. Рис. 6. Чувствительность различных клонов клеток опухолевой линии L-929 к цитотоксическому действию белкового комплекса Tag7-Hsp70 в сравнении с чувствительностью клеток гетерогенной культуры. Клоны клеток L-929 были получены методом предельного разведения. Полученные клоны инкубировались с Tag7-Hsp70 (10-9 М) в течение 24 ч. Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим. 2.2. В клетках L-929 запускается каспазозависимый апоптоз, приводящий к пику клеточной смерти через 3 ч инкубации с Tag7-Hsp70. Появление двух пиков гибели в культуре L-929, обнаруживаемых после добавления Tag7Hsp70, позволило предположить, что под действием Tag7-Hsp70 в этих клетках запускаются два цитотоксических процесса, протекающих с различной скоростью. Самой известной программой клеточной смерти является программа апоптоза. При этом все ключевые пути классического апоптоза протекают при непосредственном участии каспаз. В результате ингибиторного анализа мы выяснили, что клеточная смерть, детектируемая через 3 ч после добавления Tag7-Hsp70 к клеткам L-929, протекает с участием каспаз: добавление каспазного ингибитора широкого спектра действия Ac-YVAD-CHO полностью блокировало цитотоксическую активность комплекса (рис. 7А). Аналогичный эффект блокирования клеточной смерти был обнаружен и в случае цитокина TNFα (рис. 7Б). 12 Известно, что апоптоз может запускаться за счёт стимуляции рецептора смерти на клеточной поверхности, что приводит к активации инициаторной каспазы 8 (или, в некоторых случаях, каспазы 10), которая непосредственно активирует эффекторную каспазу 3. Для того чтобы установить, участвует ли рецептор смерти в запуске механизма апоптоза, приводящего к пику клеточной смерти в культуре L-929 через 3 ч после добавления Tag7Hsp70, мы проанализировали участие каспазы 8 в этом механизме с помощью специфичного ингибитора Ac-IETD-CHO. При добавлении Ac-IETD-CHO к клеткам L-929 наблюдался аналогичный эффект подавления цитотоксической активности комплекса через 3 ч, как и при добавлении каспазного ингибитора Ac-YVAD-CHO (рис. 7А). Рис. 7. Ингибиторный анализ цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 (А) и TNF-α (Б) при добавлении к клеткам линии L-929. Левые столбцы на диаграммах соответствуют клеточной смерти через 3 ч после добавления цитотоксического агента; правые столбцы – через 20 ч. Комплекс Tag7-Hsp70 и цитокин TNF-α добавлялись к клеткам в конечной концентрации 10-9 М. Ингибиторы каспаз добавлялись в инкубационную среду за 1 ч до добавления Tag7-Hsp70, в конечной концентрации 5 мМ. Nec-1 добавлялся за 30 мин до добавления Tag7-Hsp70 в конечной концентрации 5 мМ. Цитотоксическая активность измерялась методом окрашивания трипановым синим. Эти результаты указывают на то, что сигнальный каскад апоптоза в этом случае запускается через рецептор смерти. При этом клеточная смерть, детектируемая через 20 ч после добавления каждого из цитотоксических агентов – Tag7-Hsp70 и TNF-α – к клеткам, не блокировалась ингибиторами каспазной активности (рис. 7), указывая на существование ещё одного, бескаспазного, механизма клеточной смерти. 2.3. В клетках L-929 запускается каспазонезависимый некроптоз, приводящий к пику клеточной смерти через 20 ч инкубации с Tag7-Hsp70. Для установления механизма клеточной смерти, детектируемой через 20 ч после добавления Tag7-Hsp70 к клеткам L-929, мы сначала исследовали участие каспаз. 13 Добавление каспазного ингибитора Ac-YVAD-CHO не только не вызвало снижения цитотоксической активности через 20 ч инкубации клеток с Tag7-Hsp70, но, наоборот, привело к увеличению числа погибших клеток, при этом 10 %-ный прирост погибших клеток был численно равен, с учётом погрешности измерений, снижению их гибели, наблюдаемой через 3 ч, что указывало на то, что в этом случае имеет место альтернативный бескаспазный механизм клеточной смерти (рис. 7А). Аналогичный результат был получен и для цитокина TNF-α (рис. 7Б). Это возможно в случае, если оба цитотоксических процесса запускаются через один и тот же рецептор клеточной поверхности, который участвует в запуске двух механизмов цитотоксичности. При использовании вместо Ac-YVAD-CHO специфичного ингибитора каспазы-8 (Ac-IETD-CHO) наблюдался такой же, как и в случае каспазного ингибитора Ac-YVAD-CHO, эффект ингибирования цитотоксической активности Tag7Hsp70, обнаруживаемой через 3 ч, и её повышения через 20 ч, что указывает на явную роль рецептора смерти в переключении цитотоксических сигналов (рис. 7). Известно, что в случае запуска цитотоксических процессов в клетках L-929 через рецептор смерти каспаза-8 участвует в активации апоптозного каскада, а её ингибирование (за счёт мутаций или при добавлении ингибиторов) стимулирует фосфорилирование протеинкиназы RIP1 и запуск RIP1-зависимого некроптоза. Для установления роли RIP1 в осуществлении механизма клеточной смерти, детектируемой через 20 ч после добавления Tag7-Hsp70 к клеткам L-929, мы использовали ингибитор Nec-1, способный специфично блокировать киназную активность RIP1, но не RIP3. Предварительная инкубация клеток L929 с Nec-1 привела к блокировке цитотоксического действия Tag7-Hsp70, детектируемого через 20 ч (Рис. 7А). Это значит, что комплекс Tag7-Hsp70 вызывает RIP1-зависимый некроптоз в клетках L-929, приводящий к клеточной смерти, обнаруживаемой через 20 ч после добавления комплекса. Таким образом, было установлено два механизма клеточной смерти – каспазозависимый апоптоз и каспазонезависимый некроптоз, – запускаемые в клетках L-929 под действием белкового комплекса Tag7-Hsp70. При этом каспаза-8 выступает в роли переключателя между двумя этими процессами, что было показано при блокировке её действия за счёт добавления специфичного ингибитора. 2.4. В клеточной смерти, детектируемой через 20 ч после добавления Tag7-Hsp70 к клеткам L-929, важную роль играют АФК, лизосомальные гидролазы и ионы Ca2+. В настоящее время в литературе нет единого мнения об осуществлении механизма некроптоза после формирования некросомы RIP1-RIP3. При этом известны различные 14 факторы, участвующие в развитии некроптоза после активации RIP1, в число которых входят кислородные радикалы (АФК), лизосомальные гидролазы и ионы Ca2+. Участие АФК в осуществлении механизмов клеточной смерти, запускаемых в клетках L929 под действием Tag7-Hsp70, мы исследовали при помощи антиоксиданта ионола (бутилгидроскитолуол, BHT, C15H24O), который представляет собой липофильное органическое соединение, химическое производное фенола, проявляющее антиоксидантную активность и предотвращающее повреждающий эффект от свободных кислородных радикалов в клетке, в частности, за счёт блокирования активности комплексов дыхательной цепи митохондрии. Участие лизосом в осуществлении некроптоза мы исследовали при помощи ингибитора активности лизосомальных ферментов, хлорохина. Хлорохин представляет собой лизосомотропный агент, способный блокировать ферментативную активность лизосомальных гидролаз, вышедших из лизосомы в цитозоль клетки, препятствуя понижению pH в цитоплазме клетки. Как видно на рисунке 8, добавление антиоксиданта ионола и ингибитора активности лизосомальных ферментов хлорохина не влияло на клеточную смерть через 3 ч. Этот результат подтверждает, что как митохондрии, так и лизосомы остаются неповреждёнными и не участвуют в апоптозе, наблюдаемом через 3 ч после добавления Tag7-Hsp70 к клеткам. При этом клеточная смерть, обнаруживаемая через 20 ч, полностью блокировалась как при добавлении ионола, так и хлорохина, тем самым указывая на явную роль митохондрий и лизосом в осуществлении некроптоза, приводившему к клеточной смерти через 20 ч (рис. 8). Роль ионов Ca2+ в запуске клеточной смерти через 20 ч мы исследовали при помощи вещества EGTA – хелатора, способного связывать ионы Ca2+. Как видно из рисунка 8, предварительное добавление EGTA в концентрации 2 мМ подавляло цитотоксическое действие Tag7-Hsp70: клеточная смерть снижалась с 27 % до 1 % (рис. 8). Повышение концентрации ионов Ca2+ в цитоплазме клетки может индуцировать проницаемость лизосомальных мембран, вызывая активацию Ca2+зависимых цитозольных ферментов, таких как цитозольная фосфолипаза cPLA2 и Ca2+зависимые цитозольные протеазы кальпаины. Известно, что оба этих фермента могут принимать участие в индукции некроптоза, причём их активация предшествует выходу лизосомальных протеаз в цитозоль. После своего выхода из лизосомы, лизосомальные гидролазы могут принимать участие в индукции проницаемости митохондриальной мембраны, что приводит к накоплению АФК, участвующих в некроптозе. Таким образом, белковый комплекс Tag7-Hsp70 способен запускать два механизма клеточной смерти после его добавления к клеткам L-929: каспазозависимый апоптоз, вызывающий клеточную смерть через 3 ч инкубации клеток с комплексом, и альтернативный, каспазонезависимый некроптоз, вызывающий клеточную смерть через 20 ч 15 инкубации клеток с комплексом. При этом картина гибели клеток L-929 под действием Tag7Hsp70 аналогична картине клеточной смерти, запускаемой под действием классического цитокина TNF-α. Через 3 ч клеточная смерть по механизму апоптоза запускается при участии каспазы-8, но без участия митохондрии; через 20 ч клетки погибают по бескаспазному механизму, RIP1-зависимому некроптозу, который блокируется при добавлении молекулыингибитора Nec-1. Добавление антиоксиданта ионола и ингибитора лизосомальной активности хлорохина подавляло клеточную смерть через 20 ч, тем самым указывая на участие митохондрий и лизосом в осуществлении клеточной смерти в этом случае. Добавление Ca2+-связывающего хелатирующего агента EGTA также блокировало цитотоксическое действие Tag7-Hsp70, тем самым указывая на роль ионов Ca2+ в осуществлении клеточной смерти: возможно, в клеточной смерти через 20 ч задействованы цитозольная Ca2+-зависимая фосфолипаза cPLA2 или кальпаины, Ca2+-зависимые нелизосомальные протеазы. Рис. 8. Анализ участия АФК, лизосом и ионов Ca2+ в осуществлении цитотоксических процессов, запускаемых в клетках L-929 под действием Tag7Hsp70. Клетки преинкубировали с ингибитором лизосомальных ферментов хлорохином (5 мкМ) или антиоксидантом ионолом (1 мкМ) в течение 1 часа, или с хелатором кальция EGTA (2 мМ) в течение 30 мин, затем добавляли Tag7-Hsp70 (10-9 М) и определяли цитотоксическую активность через 3 ч и через 20 ч методом окрашивания трипановым синим, а также MTT-тестом. 16 3. Выявление рецептора на поверхности клеток L-929, способного взаимодействовать с белковым комплексом Tag7-Hsp70. 3.1. Поверхностный рецептор TNF-R1 клеток L-929 способен взаимодействовать с Tag7-Hsp70. Индукция под действием Tag7-Hsp70 двух альтернативных цитотоксических процессов в культуре L-929 позволила предположить, что этот комплекс взаимодействует с рецептором на клеточной поверхности. Сходство в кинетике цитотоксического действия и механизмах индуцированных цитотоксических процессов комплекса Tag7-Hsp70 и TNF-α также указывало на то, что Tag7-Hsp70 может связываться с рецептором TNFR1, как и TNF-α. Поэтому поиск рецептора, участвующего в индукции цитолиза под действием Tag7Hsp70, был нашей следующей задачей. С этой целью солюбилизированные мембранные белки клеток L-929 подвергались аффинной хроматографии на иммуноадсорбционной колонке с иммобилизованными антителами к Tag7, на которой был предварительно преципитирован комплекс Tag7-Hsp70. Среди связавшихся с комплексом белков представлял интерес белок с молекулярной массой 50 кДа, соответствующей молекулярной массе мышиного TNFR1. С помощью MALDI-анализа в этой полосе было обнаружено 6 пептидов, характерных для рецептора TNFR1. Для подтверждения этих результатов через эту же иммуноадсорбционную колонку пропускались солюбилизированные мембранные белки клеток предварительно очищенные на L-929, аффинной колонке с иммобилизованными на сефарозе антителами к TNFR1. После разделения связавшейся белковой фракции с помощью SDS-PAGE и последующего MALDI-анализа в полосе, соответствующей молекулярной массой 50 белку кДа, с было детектировано 9 пептидов, характерных для мышиного TNFR1, что соответствует 26% перекрытия аминокислотной последовательности и позволило нам с высокой степенью уверенности утверждать, что комплекс Tag7-Hsp70 может связываться с TNFR1 (табл. 1). 17 p50 880.52 1002.56 1038.61 1257.74 1658.83 1717.91 1755.95 2174.16 2356.10 TNFR1 880.38 1002.49 1039.56 1256.61 1658.85 1718.79 1754.82 2175.02 2357.00 Delta M 0.14 0.07 -0.95 1.13 -0.02 -0.88 1.13 -0.86 -0.90 пептид 187-193 40-48 251-259 87-97 428-442 62-77 395-408 377-394 108-128 Таблица 1. Детекция пептидов, характерных для TNFR1, после MALDI-TOF-анализа белка p50. Первая слева колонка соответствует пептидам в составе p50, вторая слева – пептидам в составе TNFR1, третья – разницам масс, 4-ая – номерам аминокислот, соответствующих пептидам. Массы пептидов приведены в единицах (а.е.м.). Далее через ту же иммуноадсорбционную колонку с иммунопреципитированным Tag7-Hsp70 пропускался белок s-TNFR1, представляющий собой внеклеточную часть рецептора TNFR1. В связавшейся фракции был обнаружен белок с молекулярной массой, характерной для s-TNFR1, взаимодействующий с антителами к TNFR1. Таким образом, мы получили прямое подтверждение того, что внеклеточная часть рецептора взаимодействует с комплексом Tag7-Hsp70 (рис. 9). Эти результаты свидетельствуют о том, что Tag7-Hsp70 взаимодействует именно с рецептором TNFR1 на поверхности клеток L-929. Поскольку лигирование TNFR1 может приводить к апоптозу и некроптозу в клетках, полученный результат указывает на то, что мы обнаружили новый лиганд к TNFR1: в роли этого лиганда способен выступать Tag7-Hsp70. Рис. 9. Связывание s-TNFR1 с белковым комплексом Tag7Hsp70, адсорбированным на сефарозе с иммобилизованными антителами к Tag7. Белковый комплекс Tag7-Hsp70, приготовленный из рекомбинантных белков, преципитировался на хроматографической колонке с иммобилизованными на сефарозе антителами к Tag7. Колонка отмывалась от неспецифично связавшихся белков, затем на колонке преципитировался рекомбинантный s-TNFR1 (Sigma). Связавшаяся фракция анализировалась методом вестернблоттинга с использованием антител к TNFR1. Ковалентная сшивка (кросс-сшивка) белкового комплекса Tag7-Hsp70 с рецептором клеточной поверхности. Для установления стехиометрии связывания комплекса Tag7-Hsp70 с рецептором TNFR1 проводилась кросс-сшивка белков на поверхности клеток L-929. Белковый комплекс Tag7-Hsp70 метился биотином двумя способами: в одном случае биотином метился Tag7 в составе комплекса, а в другом случае – Hsp70. После мечения комплекс инкубировался с клетками при 4 ºC, чтобы избежать интернализации рецептора внутрь клетки, затем добавлялся сшивающий агент BS3. Солюбилизированные мембранные белки иммунопреципитировались на колонке с антителами к TNFR1. Связавшаяся фракция анализировалась с помощью вестерн-блоттинга с использованием конъюгата стрептавидина с пероксидазой для детекции биотина. В обоих случаях была идентифицирована полоса с молекулярной массой ~140 кДа, соответствующая молекулярной массе тройного комплекса Tag7-Hsp70-TNFR1 (мол. масса Tag7 составляет 20 кДа, Hsp70 – 70 кДа, TNF-R1 – 50 кДа) 18 (Рис. 10). Эти данные свидетельствуют о том, что белки в составе комплекса связаны в стехиометрии 1:1:1. Рис. 10. Взаимодействие комплекса Tag7-Hsp70 с рецептором TNFR1 на поверхности клеток L-929. Левая дорожка соответствует биотинилированному Tag7, правая – Hsp70 в составе комплекса Tag7-Hsp70. Белковый комплекс Tag7-Hsp70 готовился из рекомбинантных белков, после чего Tag7-Hsp70 добавлялся в инкубационную среду клеток L-929 до конечной концентрации 10 нМ. После инкубации в течение 2 ч клетки промывались, затем проводилась сшивка мембранных белков при помощи BS3. После сшивки мембранные белки солюбилизировались, после чего наносились на колонку с иммобилизованными на сефарозе антителами к TNFR1. Колонка промывалась, а специфично связавшаяся фракция анализировалась при помощи вестерн-блоттинга с использованием стрептавидин-пероксидазы для детекции биотина. Цитотоксическое действие белкового комплекса Tag7-Hsp70 блокируется антителами к TNFR1. Мы сделали попытку «заблокировать» рецептор, через который белковый комплекс Tag7Hsp70 передаёт цитотоксический сигнал, за счёт добавления антител к TNFR1. Антитела добавлялись за 30 мин до внесения комплекса, в различном разведении (рис. 11). При добавлении антител в конечной концентрации ~50 нМ цитотоксический эффект от воздействия комплекса Tag7-Hsp70 снижался более, чем в 2 раза. При концентрации антител ~100 нМ наблюдалось практически полное блокирование цитотоксического действия Tag7Hsp70. При этом гибель клеток в контрольных образцах не превышала 2 %. Сами по себе антитела также не проявляли цитотоксической активности в отношении клеток в диапазоне исследованных концентраций: при добавлении антител к клеткам L-929 в максимальной использованной концентрации, 200 нМ, клеточная смерть в культуре была такой же, как и в контрольных образцах. 19 Рис. 11. Блокировка цитотоксической активности Tag7-Hsp70 в культуре L929 антителами к TNFR1. Антитела добавлялись в инкубационную среду клеток в различном разведении, за 30 мин до добавления комплекса Tag7-Hsp70 (10-9 М). Цитотоксическая активность измерялась через 20 ч методом окрашивания трипановым синим. Клеточная смерть в контрольных образцах не превышала 2 %. Таким образом, полученные данные говорят в пользу того, что нам удалось обнаружить новый лиганд, способный взаимодействовать с рецептором TNFR1: в роли этого лиганда способен выступать белковый комплекс Tag7-Hsp70. Классическим лигандом к рецептору TNFR1 служит TNF-α, при этом специфичность связывания очень высока: Kb ~ 10-9-10-10 M. Наши данные свидетельствуют, что мы обнаружили ещё один, не описанный ранее лиганд – белковый комплекс Tag7-Hsp70, – который также взаимодействует с TNFR1. Белки TNF-α и Tag7 обладают похожей молекулярной массой (17,3 кДа и 20 кДа, соответственно), однако аминокислотные последовательности этих белков совершенно различны, что подтверждает анализ при помощи BLAST®. Это отражается и на третичной структуре: в случае TNF-α она формируется из β-листов, которых обнаруживается более 10, в то время как PGLYRP1 состоит из трёх α-спиралей и четырёх β-листов. Hsp70 и TNF-α не обнаруживают ни сходства по молекулярной массе, ни сходства в первичной структуре, ни в третичной структуре. При этом выглядит удивительным, что белковый комплекс Tag7-Hsp70, как мы убедились, способен взаимодействовать с TNFR1, аналогично цитокину TNF-α. Это указывает на сложность молекулярных механизмов взаимодействий между белками, способных приводить к формированию белковых комплексов с совершенно новыми свойствами. 20 Выводы 1. Установлено, что белок Tag7 образует с белком HspBP1 стабильный комплекс в кондиционной среде клеток опухолевой линии CSML-0 и в сыворотке крови человека. Взаимодействие Tag7 с HspBP1 препятствует формированию цитотоксически активного комплекса Tag7-Hsp70 и может служить защитной мерой организма от действия этого комплекса. 2. Показано, что Tag7-Hsp70 индуцирует в опухолевых клетках два альтернативных механизма клеточной смерти: апоптоз и некроптоз. 3. Из гетерогенной культуры L-929 выделены клоны, в которых под действием Tag7- Hsp70 запускается только один механизм клеточной смерти. 4. Установлено, что антиоксидант ионол, ингибитор лизосомальных ферментов хлорохин и хелатор кальция EGTA ингибируют некроптоз, запускаемый под действием комплекса Tag7-Hsp70 в опухолевых клетках. 5. Показано, что Tag7-Hsp70, как и классический цитокин TNF-α, индуцирует цитотоксические процессы в опухолевых клетках, взаимодействуя с рецептором TNFR1. Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи: 1. Шелудченков А.А., Кабанова О.Д., Сащенко Л.П., Романова Е.А., чл.-корр. РАН Гнучев Н.В., Яшин Д.В. Клеточная смерть опухолевых клеток линии L-929, индуцированная белковым комплексом Tag7-Hsp70, аналогична гибели этих же клеток под действием TNF-α. 2013. Доклады академии наук, 452(2): 230-232. 2. Yashin D.V., Dukhanina E.A., Kabanova O.D., Romanova E.A., Lukyanova T.I., Tonevitskii A.G., Belogurov A.A., Raynes D.A., Sheludchenkov A.A., Gnuchev N.V., Guerriero V., Georgiev G.P., Sashchenko L.P. 2012. Extracellular HspBP1 inhibits formation of a cytotoxic Tag7-Hsp70 complex in vitro and in human serum. Biochimie, 94(1): 203-206. 3. Яшин Д.В., Духанина Е.А., Кабанова О.Д., Романова Е.А., Лукьянова Т.И., Шелудченков А.А., Сыкулев Ю.К., чл.-корр. РАН Гнучев Н.В., Сащенко Л.П. Механизмы инактивации цитотоксического Tag7-Hsp70-комплекса. 2012. Доклады академии наук, 442(5): 712-713. Тезисы конференций: 1. Шелудченков А.А., Кабанова О.Д., Яшин Д.В., Сащенко Л.П. Два механизма клеточной гибели, в которых участвует рецептор TNFR1, запускаемые в опухолевых клетках под действием цитотоксического белкового комплекса Tag7-Hsp70. XXV Международная зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической 21 биологии и биотехнологии», посвящённая 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН. ИБХ РАН, Москва, 11-15 февраля, 2013, сборник тезисов, стр. 33. 2. D. Yashin, E. Dukhanina, O. Kabanova, E. Romanova, A. Sheludchenkov and L. Sashchenko. New Role of PGRP-S (Tag7) protein in human immune defense. 1st EATI & 3rd ERIICP Conferences “Death, Danger, Inflammation and Immunity”, Institut Pasteur, Paris, France, May 31 – June 1, 2012, abstract book, p. 81. 3. Шелудченков А.А., Яшин Д.В., Кабанова О.Д. Механизмы цитотоксического действия белкового комплекса Tag7-Hsp70 на опухолевые клетки. Ингибирование цитотоксической активности Tag7-Hsp70 in vitro и in vivo. 16-я Международная Пущинская школаконференция молодых учёных «Биология – наука XXI века», Пущино, Россия, 16-21 апреля, 2012, сборник тезисов, стр. 158. 22
