4. Автореферат Уласов И.В.
advertisement
На правах рукописи УЛАСОВ ИЛЬЯ ВАЛЕНТИНОВИЧ РАЗРАБОТКА АДЕНОВИРУСНОГО ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛИОБЛАСТОМЫ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ 14.01.12 – онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2016 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр им Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации, в лаборатории нейроонкологии Унивеститета Чикаго (США,Чикаго) и в Центре передовых методов терапии опухолей головного мозга Шведского медицинского центра (США, Сиэтл). Научный консультант: Доктор медицинских наук, профессор Барышников Анатолий Юрьевич Официальные оппоненты Боженко Владимир Константинович, доктор медицинских наук, заслуженный врач России, профессор, заведующий отделом молекулярной диагностики и экспериментальной биотерапии опухолей федерального государственного бюджетного учреждения Российский научный центр рентгенрадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Забережный Алексей Дмитриевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной биологии и биотехнологии федерального государственного бюджетного научного учреждения Всероссийский научноисследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Олег Витальевич Калюжин, доктор медицинских наук, Профессор кафедры клинической иммунологии и аллергологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Ведущая организация: Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена — филиал Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита состоится «12» мая 2016 года в 12-00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.01 на базе ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России(115478 г. Москва, Каширское шоссе, д.23). С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России (115478, г. Москва Каширское шоссе, д.24) и на сайте www.ronc.ru Автореферат разослан «..........» ............................2016 года Ученый секретарь диссертационного совета д.м.н., профессор Шишкин Юрий Владимирович 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Опухоль головного мозга в структуре неопластических заболеваний человека занимает одно из последних мест, но выживаемость пациентов с этим заболеванием крайне невелика. В то время как в США из года в год наблюдается снижение числа регистрированных случаев с опухолями головного мозга [Kohler, 2011], в Европе, наоборот, сохраняется тенденция к росту [Ohgaki, 2005, и Wohrer, 200]. В России число больных с опухолью мозга также увеличивается на 1,1% в год. По величине прироста заболеваний предполагается, что это число будет и дальше неуклонно расти [Горбунова с соавт., 2004]. Бессимптомное начало и развитие опухоли головного мозга затрудняет диагностику, особенно на начальном этапе, и, соответственно, терапию этого заболевания. В силу появившихся значительных успехов в нейровизуализационной диагностике неоплазмов головного мозга, главным способом лечения больных является применение хирургической резекции и радиои химиотерапии [Горбунова с соавт., 2004]. Однако, несмотря на значительные успехи в применении данных методов, выживаемость больных остается невысокой, главным образом вследствие невозможности удаления 100% опухоли хирургической резекцией [Clarke, 2013], а также появления радио- и химиорезистентной популяции стволовых клеток опухоли. Таким образом, очевидна причина поиска новых и совершенствования старых методов лечения, а также развития диагностической базы с целью ранней диагностики злокачественных новообразований головного мозга у людей. На сегодняшний день в Европе и Российской Федерации неуклонный рост количества заболеваний мультиформной глиобластомой вызывает повышенный интерес к проблеме их изучения. В последнее время к этиологическим факторам, активирующим появление неопластических клеток в головном мозге, также 3 относят персистенцию онкогенных вирусов в организме. Во многом этому способствует сложившаяся в России и странах СНГ клиническая ситуация, благоприятная для увеличения количества таких хронических инфекций в результате роста числа случаев пересадки органов и излишнего применения иммуносупрессивных химиопрепаратов. Таким образом, разработка экспериментальных подходов, демонстрирующих высокую противоопухолевую и анти-глиомную активность, позволяющих контролировать рост неопластических клеток, является актуальной задачей для генной терапии. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью работы является разработка, характеристика и экспериментальное тестирование аденовирусного генетического препарата для лечения опухоли головного мозга человека с использованием моделей глиобластомы человека in vitro, in vivо и ex vivo. Задачи исследования: 1. Охарактеризовать клетки опухоли головного мозга человека с позиции возможности терапии онколитическими векторами. 2. Оптимизировать структуру онколитического вектора для достижения максимальной цитотоксичности. 3. Установить механизм клеточной цитотоксичности в ответ на инфекцию онколитическим вектором. 4. Изучить роль химиопрепаратов и ионизирующего излучения в усилении антиглиомного потенциала генно-инженерной вирусной самореплицирующейся вакцины на основе генома аденовируса человека 5 серотипа. 5. Определить алгоритм и механизм глиобластомы, используя онколитический вектор. 4 комбинированного лечения НАУЧНАЯ НОВИЗНА В настоящей работе впервые охарактеризована роль белка фибера аденовируса человека серотипа 5 в регуляции репликативного цикла. В результате проведенной работы показано, что цитоплазматическая локализация фибера негативно влияет на процессинг вирусных белков и сборку капсомеров. Также впервые доказано, что изменение локализации белка фибера нарушает процесс выделения инфекционных частиц из клетки. Несмотря на ядерную локализацию, функция белка фибера является аналогичной транскрипционным факторам, регулирующим экспрессию. В настоящей работе впервые предположено, что эволюционно консервативный фрагмент белка фибера (шафт и тейл) имеет разные сигналы ядерного транспорта в дополнение к находящемуся в N-терминальной части аминокислотной последовательности. В процессе исследования показано, что мультиформные глиобластомы человека, имеющие высокие пролиферативные и туморогенные свойства, могут быть использованы в качестве клеток-мишеней для терапии онколитическими аденовирусами. При выполнении настоящей работы была создана панель онколитических векторов, содержащих различные белки фибера аденовирусов человека для направленной инфекции клеток глиобластомы человека. Впервые в рамках одного исследования проведен скрининг перевиваемых и первичных клеточных линий глиобластомы человека на предмет их чувствительности к инфекции онколитическим вирусами. В то же время продемонстрировано, что именно модификация белка фибера 5/3 обеспечивает высокий уровень трансдукции клеток глиобластомы. Впервые на модели опухоли человека показано, что таргетная терапия опухоли головного мозга онколитическим генно-инженерным вектором, содержащим модификацию белка фибера 5/3 и под контролем промотора гена сурвивина человека увеличивает выживаемость 5 животных, имеющих глиобластому. С использованием ионизирующей радиации и химиотерапии были смоделированы условия применения генно-инженерного препарата для экспериментальной терапии глиобластомы человека. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ В результате проведенного исследования разработаны и предложены для доклинического исследования критерии выбора тактики лечения больных с мультиформной глиобластомой. Внедрение их в лечебную работу позволит осуществить дифференцированный подход к тому или иному методу лечения данной категории больных в зависимости от различных факторов: присутствия вирусных онкогенов, вирусных первичных клеточных рецепторов и так далее. Созданные биологические тест-системы на основе первичных клеток глиобластомы человека применяются для тестирования новых антиглиомных препаратов в Шведском медицинском центре. Современные подходы в лечении глиобластомы предполагают применение основных принципов комбинированной таргетной терапии - одновременной терапии специфических экспериментальные мишеней. подходы, Несмотря возникновение на существующие резистентных популяций неопластических клеток влияет на эффективность использования стандартных методов лечения. В нашей работе мы предложили применять темодал и ионизирующую радиацию в комбинации с онколитическим вектором, что позволит обеспечить принцип целенаправленного ингибирования клеточных мишеней. ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА Автору принадлежит концепция создания онколитического вектора на основе генома аденовируса типа 5 человека с использованием транскрипционных 6 и трансдукционных модификаций генома и капсида вируса, а также стратегия изучения противоопухолевого эффекта с использованием клеточных линий глиом человека. Автор непосредственно проводил обработку и анализ данных, разрабатывал методические документы и осуществлял внедрение технологий и экспериментальных подходов с оценкой их эффективности. Все представленные в диссертационной работе научные результаты получены автором как лично, так и при его координации коллективами лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭдиТО ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» Минздрава России, лаборатории нейроонкологии университета Чикаго, а также Центра генной терапии университета штата Алабамы в г. Бирмингеме, Центра передовых методов терапии опухолей головного мозга и Шведского медицинского центра в г. Сиэтл. СООТВЕТСТВИЕ ПАСПОРТУ СПЕЦИАЛЬНОСТИ Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 — онкология, конкретно — пункту 2. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ: 1. Результаты оценки роли белка фибера для амплификации рекомбинантных дефектных и онколитических аденовирусов. 2. Данные по сравнительному анализу аденовирусных систем, дефектных по репликации. 3. Экспрессия сурвивина человека как возможная причина резистентности глиобластомы к терапии темозоломидом (темодалом) и ионизирующей радиации. 4. гена Таргетинг СD46 аденовирусным вектором 5/3 под контролем промотора сурвивина человека обеспечивает 7 высокий уровень трансдукции перевиваемых и первичных клеток глиобластомы человека как in vitro так и in vivo. 5. Вектор 5/3 служит платформой для доставки антисмысловых РНК. 6. Комбинация терапевтического вектора с экспериментальной терапией опухолей увеличивает цитотоксичность вируса. 7. Алгоритмы применения генетического генно-инженерного препарата в комбинации с экспериментальными химиопрепаратами. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты работы были доложены на научной конференции в рамках межлабораторного семинара ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» Минздрава России. Материалы диссертации доложены и обсуждены на совместном заседании Центра генной терапии (GTC) Университета Алабамы в Бирменгеме (University of Alabama at Birmingham), лаборатории нейроонкологии Университета Чикаго (University of Chicago), Центра передовых методов терапии опухолей головного мозга (Center for Advanced Brain Tumor Treatment) Шведского медицинского центра в г. Сиэтл «Cherry Hill»(Swedish Medical Center, Seattle), на открытых семинарах Института системной биологии г. Сиэтл (ISB, Seattle, USA), Центра рака университета Чикаго в г. Чикаго (Comprehensive Cancer Center, The University of Chicago, Chicago, USA), Центра низкомолекулярных материалов(CNM) Аргонской национальной лаборатории (ANL, USA) и лаборатории молекулярной генетики внутриклеточного транспорта, Института биологии гена (ИБГ, Москва, Россия) а также: на 73-ом, 74-ом, 75-ом и 76-ом международных конгрессах ассоциации нейрохирургов США (г. Новый Орлеан, США, 2005; г. Св. Франциско, США, 2006; г. Вашингтон, США, 2007; г. Чикаго, США, 2008), на 8-ой, 10-ой, 11ой, 14-ой и 15-ой международных конференциях Американского сообщества клеточной и генной терапии (ASGCT) (г. Св. Луис, США, 2005; г. Сиэтл, США, 8 2007; г. Бостон, США, 2008; г. Сиэтл, США, 2011; г. Вашингтон, США, 2012), на международной конференции Американского института онкологов США (г. Чикаго, США, 2006), на 11-ой и 17-ой международных конференциях сообщества нейроонкологов (г.Орландо, США, 2006; г. Вашингтон, США, 2012), на ежегодной международной конференции Американской ассоциации исследования рака (AACR) (г. Анахейм, США, 2005; г. Чикаго, США, 2012; г. Сан Диего, США, 2014), научно-практической конференции с международным участием им. Чарлза Хиггинса университета Чикаго (г. Чикаго, США, 2005), на ежегодной научной конференции лаборатории Колд Спринг Харбор «Cold Spring Harbor Gene Therapy» (г. Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, 2005), на XIV и XV Российских онкологических конгрессах (Москва, 2010 и Москва, 2011г). ПУБЛИКАЦИИ По материалам диссертации опубликовано 125 работ, включая 5 глав в книгах, 74 статей, включая 53 научные статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России и 46 тезисов российских и международных научных конференций. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 255 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы и экспериментальной части, включающей материалы, методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Работа иллюстрирована 2 таблицами и 57 рисунками, библиографический указатель включает 503 публикации. 9 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Клинический материал Клинические образцы опухоли головного мозга человека и морфологически нормальной ткани головного мозга, извлеченные в результате резекции участка головного мозга у больных с эпилепсией, были получены в результате оперативных вмешательств. Всего проанализировано более 200 образцов от больных в патологической службе отделений нейроонкологии Российского онкологического научного центра (РОНЦ), Университета Чикаго, штат Иллинойс, США и Центра передовых методов лечения опухолей головного мозга, Шведского медицинского центра, Сиэтл, США. Клеточные линии В данной работе были использованы следующие линии клеток: HEK293 (клетки почки эмбриона человека), 911 (клетки ретинобластомы человека), A549 (клетки аденокарциномы легкого человека), глиобластомы человека: М59К, D54MG, D65, U87, U118, U373, U251, N10 и KINGS. Первичные ограниченно перевиваемые (до 6 пассажа) линии клеток глиобластомы человека ГБМ 1-16 и 71 получены в Шведском медицинском центре/Центре экспериментальной терапии. Получение и характеристика аденовирусных векторов Дефектные по репликации аденовирусные вектора: Ad5∆E1∆E3∆Fib (был получен от Dan Von Seggern (Университет Лахойа, США), RGD-luc, Pk7-Luc, Cav1Luc и Cav2Luc были предоставлены д-р Zheng Zhu (GTC, UAB, США). Онколитические вирусы: ONYX015 (был предоставлен д-р David Ornelles (Wake Forrest University, США), ∆24 был получен от д-р Juan Fueyo (MD Anderson Cancer Center, USA), CRAd-S-pK7 и CRAd-S-RGD (были получены от д-р David Сuriel (Saint Louis University School of Medicine). Для получения онколитических векторов использовали плазмиду pAd.hSurvivin, содержащую делецию оснований 10 4357-3327 аденовируса человека серотипа 5, под контролем промотора гена сурвивина человека и аденовирусные плазмиды Ad5/3GFP, Аd5/5GFP, Ad5/11GFP, Ad5/35GFP, Ad5/5-RGD и pvk50-pK7. На 13-й день после трансфекции HEK293 клеток по стандартной методике [Graham, 1991] проводили белковый и рестрикционный анализ вирусных антигенов и выделенной ДНК. Титрование вирусов проводили, используя метод бляшкообразования, описанного раннее [Fueyo, 2003]. Биоинформатический анализ экспрессии генов с использованием баз данных TCGA, Oncomine и Rembrandt Зависимость выживаемости пациентов с опухолями головного мозга различной степени злокачественности от уровня экспрессии CD46, САR, DSG2 была изучена с использованием TCGA (Геномный проект по исследованию опухолей, США, cancergenome.nih.gov), Oncomine (Университет штата Мичиган, США) и Rembrandt (Repository of Molecular Brain Neoplasia Data, Национальный Институт Рака, США, http://rembrandt.nci.nih.gov ). Флуороцитометрический анализ клеточных популяций Экспрессия клеточных рецепторов была проведена с использованием первичных антител к рецептору CAR (клон RmcB, любезно предоставленный д-р Joanne Douglas (Gene Therapy Center University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, США), CD46 (ab175096, Abcam, США) и DSG2 (#5180, Epitomics-Abcam, США). Вторичные антитела, конъюгированные с FITC или ALEXA 586 (Оба Life Technologies, США) были использованы для визуализации клеточных антигенов, используя FACsARIA II (Becton-Dickinson, США). Количественный ПЦР клеточных и вирусных мРНК или микроРНК Смеси клеточной и вирусной ДНК, а также РНК были экстрагированы из клеточного монослоя или тканевых срезов 5µ, используя «DNeasy tissue» (Qiagen, США), мини-набор «RNeasy» как описано ранее [Ulasov, 2012]. Соотношение 11 вирусных E1A или Е4 к количеству использованной в количественной реакции ДНК, кДНК гена сурвивина, клеточной микроРНК к уровню контрольной микроРНК (SNORD47) было определено, соответственно, в каждом образце. Последовательности праймеров были описаны нами ранее для E1A, E4, GAPDH [Ulasov, 2007 и Ulasov, 2008]. Все праймеры амплифицируют участки, соответствующие 15-230 пн. Количественный анализ экспрессии генов и клеточных микроРНК методом PCR в 96-луночном планшете (Array) РНК контрольных и/или обработанных химиопрепаратом или вирусным агентом клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, а также клеток из парафиновых срезов проанализирована в толщиной 96-луночном 10 микрон, планшете, была выделена содержащем и затем праймеры к проангиогенным факторам (array growth factors), генам, участвующим в реакции аутофагии (array autophagy) и апоптоза (array apoptosis) или клеточным микроРНК согласно рекомендациям компании-производителя (Qiagen, США). Анализ экспрессии клеточных лизатов с помощью вестерн-блоттинга в ПААГ Контрольные или обработанные PFTa (p53), Baf A1(Бафиломицин А1, Sigma, США), 3 Ma (3-Methyladenine, Sigma, США) и/- или инфицированные аденовирусом, неопластические клетки были исследованы в 10% ПААГ-геле как описано ранее [Ulasov, 2015]. Тестирование цитотоксического действия реагентов in vivo Потенциальная цитотоксичность терапевтических агентов была изучена в случае внутримозгового введения как описано ранее [Ahmed, 2008] Создание систем in vivo для тестирования терапевтических препаратов Мыши с дефектным иммунитетом (голые мыши, Nude mice) были получены из питомника Charles River Laboratory (Чарльстон, Южная Каролина, США), 12 Jackson Laboratory (Бар Харбор, США) и содержались в условиях вивария в соответствии с нормами биоэтики, принятыми в Университете Чикаго (Чикаго, США). Животные после интраперитонеальной кетамино/хелазиновой анестезии были помещены в стереотактическую рамку для внутримозгового введения клеточной суспензии. Спустя 7 дней после развития опухоли и формирования кровеносных сосудов мыши были одинаково распределены между группами для получения внутриопухолевой инъекции онколитического вируса (в дозе 100 инфекционных доз на клетку). Мышам контрольной группы вводили PBS в том же режиме. Увеличение продолжительности жизни животных выражали в процентах, и для каждой группы была построена кривая выживаемости Каплан-Мейер. Применение и получение подкожной модели глиомы человека линии U373 было описано ранее [Nandi, 2008]. Окрашивание тканевых срезов производили по стандартной методике гематоксилин-эозином и иммуногистохимически Иммуногистохимическое окрашивание тканевых срезов производили, как описано ранее [Каверина с соавт., 2012]. Белковая экспрессия была визуализирована с использованием инвертированного микроскопа Nikon Eclipse Ti-U; микрофотографии собраны с использованием камеры Nikon digital sight DSQi1Mc. Статистический анализ Результаты представлены в виде стандартного значения ± стандартное отклонение. Статистический анализ был выполнен с использованием теста Стьюдента (программа SPSS 13.0, США). Разница меньше 0,05 означала существенное различие. 13 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ — ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПОДХОД В ЛЕЧЕНИИ ГЛИОБЛАСТОМЫ ГОЛОВНОГО МОЗГА Выживаемость длиной в 18,1 месяцев в случае комбинации хирургической резекции с ионизирующей радиацией и 5 циклами химиотерапии темодалом (темодалом) является средним значением продолжительности жизни для большинства пациентов при мультиформной глиобластоме (ГБМ). Для улучшения выживаемости применяются многие экспериментальные подходы. Вирусная генная терапия позволяет доставлять рекомбинантную ДНК в клетки-мишени, используя вирусный вектор. Несмотря на сильные преимущества использования векторов на основе аденовируса человека серотипа 5, эффективная инфекция клеток-мишеней рецепторов на аденовирусом поверхности (Рисунок требует 1). присутствия Оказалось, что первичных целый ряд неопластических клеток, таких, как клетки мультиформной глиобластомы и меланомы, экспрессируют ограниченное количество (Коксаки- CAR аденовирусный рецептор) на своей поверхности [Huang, 2005]. Таким образом, потеря экспрессии белка CAR снижает эффективность применения аденовирусных векторов на основе генома серотипа человека 5. Рисунок 1 — Перенацеливание аденовирусной частицы на альтернативные рецепторы глиомы повышает таргетинг (направленную инфекцию) аденовирусный рецептор. 14 клеток-мишеней. CAR - первичный Таким образом, нам предстояло решить комплексную задачу по созданию онколитического вектора, специфичного к клеткам глиобластомы и способного доставлять рекомбинантный генетический материал. С этой целью нами был проведен предварительный анализ экспрессии таких первичных рецепторов, как CAR, десмоглеин 2 (DSG2) и CD46 на поверхности глиобластомы. Используя базы данных TCGA и REMBRANDT, мы детектировали усиленную транскрипцию гена CD46, которая коррелировала с уровнем злокачественности. Как представлено в таблице 1 и на рисунке 2, не опухолевая ткань существенно выше экспрессирует CAR в сравнении с образцами, содержащими опухоли в степени II, III и IV. Самый высокий уровень экспрессии CD46 был обнаружен в ГБМ. По данным литературы известно, что стволовые клетки глиобластомы обеспечивают резистентность к терапии и вторичный рост глиобластомы [Murat, 2008, Svendsen, 2011 и Okada, 2014]. Рисунок 2 — Биоинформатический анализ транскрипции CD46, DSG2 и CAR в клетках глиобластомы, с использованием клинической базы данных TCGA. Уровень экспрессии выражен в логарифмах с основанием 2. Количество клинических образцов, использованных при составлении диаграммы: здоровые клетки (Не опухолевая ткань, НБ), степень II (Астроцитома), степень III (Олигодендроглиома) и степень IV (ГБМ). 15 Таблица 1 — Статистический анализ уровней экспрессии генов CD46, DSG2 и CAR(CXADR), представленных на рисунке 2 DSG2 CXADR CD46 217901_at 203917_at 207549_x_at НБ vs. Степень II 0,72 7,05E-06* 0,66 НБ vs. Степень III 0,59 0,002* 0,66 НБ vs. ГБМ (Степень IV) 3,28E-05 0,014* 0,002* Степень II vs. Степень III 0,76 0,18 0,31 Степень II vs. Степень IV 0,0002* 0,0018* 2,06E-06* 0,015 0,204 0,005 Степень III) vs. ГБМ (Степень IV) *Примечание: Достоверность различий по сравнению с показателями была выявлена путем T-теста. Таким образом, создание генно-инженерной векторной системы подразумевает высокую эффективность инфекции для всего спектра опухолевых клеток, включая стволовые клетки глиобластомы. Наши предварительные результаты свидетельствуют, что стволовые клетки, взятые для вестерн-блоттинга, формируют нейросферы и имеют высокий уровень экспрессии SOX2 (Рисунок 3А и Б), что подтверждает использование стволовых условий для их культивирования. Далее, по данным иммуноблоттинга, большинство стволовых клеток ГБМ экспрессируют десмоглеин 2 и CD46 (Рисунок 3В), что также коррелирует с данными иммунофлуоресцентного анализа, подтверждающего презентацию десмоглеина 2 (DSG2) и CD46 на поверхности клеток глиобластомы 16 человека [Ulasov, 2015]. Следовательно, таргетинг этих клеток с использованием DSG2 и CD46 может обеспечить высокую трансдукцию неопластических клеток. Роль белка фибера в вирусной репликации, транскрипции и сборке вирусных вирионов Получение аденовирусных векторов включает в себя стадию амплификации вирусов с использованием клеточных систем. По данным литературы известно, что экспрессия в них полноразмерного белка фибера существенно увеличивает репликацию и высвобождение вирусных частиц [Belousova, 2003]. Однако остается неясным, как изменение локализации белка фибера может влиять на эффективность сборки аденовируса в клетках, стабильно экспрессирующих полноразмерный белок фибера. С этой целью мы делетировали сигнал ядерного транспорта (Nuclear localization signal, NLS) и сигнал упаковки белка-фибера в состав аденовирусных капсомеров (penton-associated signal, PAS) в нуклеотидной последовательности, кодирующей фибер (Рисунок 4А). Предполагалось, что, благодаря этим делециям, фибер аденовируса серотипа 5 будет способен тримеризоваться (Рисунок 4Б) и накапливаться в цитоплазме (Рисунок 4Г), но не способен транспортироваться в ядро инфицированной клетки. Для того, чтобы понять, как мутантный белок фибера будет влиять на репликативный цикл аденовируса в клетке, клетки НЕК293, экспрессирующие pPDV67, pPAS и pNLS, были инфицированы аденовирусом Ad5E1E3dFib. Данные белкового анализа указывают, что инфекция клеток HEK293, стабильно экспрессирующих pNLS и pPAS, приводит к накоплению белков сердцевины в аденовирусных вирионах по сравнению с вирионами Ad5E1E3dFib, выращенным в присутствии фибера дикого типа аденовируса человека 5 серотипа (Рисунок 5А). 17 Рисунок 3 — Характеристика стволовых клеток по экспрессии маркеров стволовых клеток и первичных аденовирусных рецепторов CD46, DSG2 и СAR. Формирование нейросфер (А) и повышенная экспрессия SOX2 (Б) детектирована в первичных клетках, полученных от пациентов с диагнозом ГБМ. Микрофотографии: увеличение 20х, Шкала 40 микрон. Б) Количественный ПЦР экспрессии SOX2 детектирован в CD133-положительных клетках. Эксперимент проведен дважды в 3х-повторах. Статистическая разница в экспрессии SOX2 между CD133-положительными и CD133-негативными клетками (#, ##, ###) определена с помощью теста Манн-Уитни. p<0,05; В) Анализ белковых фракций первичных клеток ГБМ с мезенхимальным, пронейральным и пролиферативным подтипом. Перевиваемые клетки глиобластомы человека (A172, U87, U118, U251) и первичные линии клеток пациентов с диагнозом «глиобластома» были выращены в бессывороточной среде, содержащей ростовые факторы (FGF, EGF) для поддержания роста стволовых клеток. GAPDH использовали в качестве контроля для нанесения одинакового количества белка в лунки. Мембраны с иммобилизованными белками инкубировали с антителами, узнающими DSG2, CD46, и CAR. L маркер молекулярного веса. 18 Рисунок 4 — Устранение сигналов ядерной локализации и упаковки фибера в вирусный капсомер влияет на клеточную локализацию фибера. А) Схема строения N-терминального участка белка фибера аденовируса человека типа 5. Последовательности, в сигнале ядерной локализации (NLS, синий цвет) или упаковки в капсомер (PAS, красный цвет), были делетированы в исходной плазмиде pPDV67 с целью получения плазмид pNLS и pPAS; Б) Анализ белковых фракций клеток HEK293, трансфицированных плазмидами pPDV67, pNLS и pPAS, был произведен в денатурирующих/не денатурирующих условиях в ПААГ. Электрофоретические фракции были инкубированы с антителами 4D2, узнающими тример и мономер белка фибера. Лунка 1 и 2: wt-аденовирус типа 2, 1.8х10(10) вирусных частиц на лунку не инкубированного/инкубированного в буфере Лаемли; лунка 3, 4 и 5: В лунку геля было нанесено белка, полученного из трансфицированных клеток HEK293 плазмидами pPDV67, pNLS и pPAS; В) Клеточная локализация дикого и мутантных типов белка фибера аденовируса человека типа 5 была произведена методом иммунофлуоресценции с использованием антител к белку фибера человека (4D2, зеленый цвет). Ядра клеток выявляли DAPI (синий цвет). Увеличение 40х, шкала 50 микрон. Оказалось, что рост вируса Ad5E1E3dFib в клетках, экспрессирующих мутантные формы белка фибера, сопровождается увеличенной продукцией белков сердцевины. Поскольку экспрессия данных белков может влиять на процесс вирусной репликации и сборку вирусных частиц, мы изучили уровень вирусной 19 репликации и накопления вирусных продуктов в присутствии дикого или мутантных форм фибера вирусом Ad5E1E3dFib. Рисунок 5 - Белок фибера аденовируса контролирует экспрессию вирусных белков сердцевины и влияет инфекционность вирионов. А) Белковый анализ аденовирусных вирионов Ad5E3E1dFib, выращенных в присутствии фибера дикого типа (pPDV67), дефектного по сигналу ядерной локализации (pNLS) и сигналу ядерной упаковки (pPAS). Вирусные фракции были собраны после амплификации вируса, очищены в градиенте CsCl, сконцентрированы по белку, и 30 мкг тотального белка, детектированного методом Бредфорда, было внесено в лунку 10% ПААГ. Иммуноблоттинг белковых фракций вирусов был проанализирован с поликлональной сывороткой против белков аденовируса человека серотипа 5. Показана экспрессия промежуточных продуктов экспрессии белков сердцевины; эффект делеции сигнала ядерного транспорта и упаковки в капсомер белка фибера на репликативный цикл вектора Ad5E3E1dFib. Б) Количественное определение вирусной ДНК после амплификации вирусного вектора Ad5E3E1dFib на клетках HEK293, экспрессирующих полноразмерный белок фибера дикого (pPDV67) и мутантного (pNLS и pPAS) типа аденовируса человека серотипа 5. Ось ординат - уровень вирусной ДНК после нормализации к количеству тотальной ДНК. Ось абсцисс - список контрольных и инфицированных клеток; В) Титрование вирусных частиц Ad5E3E1dFib показывает, что нарушение клеточной локализации белка фибера приводит к накоплению вирусных частиц в инфицируемых клетках. Ось ординат - уровень вирусных 20 прогенных частиц, детектируемых в супернатанте. Ось абсцисс - список клеток. Эксперимент проведен дважды в 3х повторах. Статистическая разница между образцами была проанализирована с использованием теста Манна-Уитни* p<0,05. По данным количественного ПЦР, представленных на Рисунке 5Б, экспрессия pPDV67 статистически значимо увеличивала уровень вирусной ДНК, детектируемой по количеству копий Е4 ДНК. При этом экспрессия дикого фибера приводила к увеличению репликации вируса в 5,6 раз по отношению к клеткам, не экспрессирующим фибер. Схожие результаты были получены для линии клеток HEK293, трансфицированной вектором pPAS. С другой стороны, трансфекция плазмидой pNLS приводила к ещё большему накоплению вирусной ДНК по отношению к клеткам, трансфицированным pPDV67 и затем инфицированным Ad5E3E1dFib (p<0,05). Данные результаты могут свидетельствовать об увеличенной продукции вирионов. С целью проверки этого предположения нами был проанализирован супернатант от клеток, инфицированных вектором Ad5E3E1dFib после их трансфекции плазмидами pPDV67, pPAS или pNLS (Рисунок 5В). Трансфекция плазмидой pPDV67 увеличивала продукцию вирионов по отношению к контролю Ad5E3E1dFib в ~15,3 раза. В то же самое время титр Ad5E3E1dFib оказался сниженным в клетках, экспрессирующих мутантный фибер, особенно фиберхимеру с делецией в сигнале ядерного транспорта (~9 раз по отношению к титру в клетках HEK293-PpDV67). Получение аденовирусных вирионов с тропизмом к рецептору CD46 и DSG2 Создание генно-инженерного рекомбинантного препарата на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, узнающего рецептор CD46, подразумевает внесение модификаций в последовательность фибера, узнающего первичный рецептор. На рекомбинантных первом этапе работы аденовирусных предстояло векторов, 21 выяснить стабильно или способность транзиентно экспрессирующих фибер аденовируса типа 3, узнающего рецептор СD46, доставлять генетический материал в клетки-мишени. Для этого были использованы 3 различные аденовирусные системы, способные обеспечить трехмерную конфигурацию фибера для эффективного узнавания рецептора [Xia, 1994, Jakubczak, 2001], но отличающиеся по степени встраивания химерного фибера [Krasnykh, 2001, Borovjagin, 2005 и Von Seggern, 1998] Как показывают данные белкового анализа, представленные на Рисунке 6А, все 3 системы позволяют получить аденовирусные вирионы, содержащие химеры фибера. Среди этих трех векторов именно стабильное встраивание химеры в состав вектора DefAd5/3 обеспечивает высокую эффективность трансдукции клеток глиом (Рисунок 6Б). Рисунок 6 — Сравнительный анализ экспрессии химерных белков фибера и эффективности трансдукции клеток глиобластомы аденовирусными векторами, дефектными по репликации. А) Иммуноблоттинг аденовирусных вирионов Ad-3кноб, FF-кноб3, и DefAd-5/3 с использованием геля ПААГ и антител 4D2 против эпитопов тримерного белка фибера. Лунка 1-Ad-3кноб, Лунка 2- defAd-5/3, Лунка 3- FF-кноб3; Б) Увеличенная продукция репортерного гена люциферазы была показана для вируса, стабильно экспрессирующего рекомбинантную химеру 5/3 в перевиваемых клетках глиобластомы D65MG и U118. Эксперимент был проведен два раза в 3х повторах, через 48 часов после инфекции клеток глиобластомы рекомбинантными векторами в дозе 100 инфекционных частиц на клетку.”*” или “#” p<0.05 статистическое значение было определено по отношению к экспрессии FF-кноб3 или AdWT-Luc-векторов соответственно. 22 Чтобы проверить уровень нейротоксичности компетентного вектора с модификацией фибера 5/3, мы инфицировали первичные астроциты человека в дозе 100 инфекционных единиц вирусами CRAd-5/3WT или AdWT (Рисунок 7А). Как видно, вектор CRAd-5/3WT эффективно реплицируется в здоровых клетках головного мозга и демонстрирует сниженную экспрессию 934±52.8 против 7849±182 репликации вектора AdWT на первый день после инфекции. Далее на 3 день оба вектора показывают схожую репликативную активность 8.23х10(7)±4.92x10(6) вирусных копий вектора AdWT vs 1.82х10(8) ±7.1х10(6) CRAd-5/3WT. При этом высокий уровень репликации CRAd-5/3WT сопровождается токсичностью клеток (39.2±2.11% от общего числа клеток) (Рисунок 7Б). Рисунок 7 — Онколитический вектор, имеющий 5/3-модификацию в белке фибера аденовируса, демонстрирует высокую нейротоксичность здоровых клеток (астроцитов). А) CRAd-5/3WT реплицируется в астроцитах. Количественный анализ вирусной репликации произведен на астроцитах, инфицированных контрольным вирусом (AdWT) и вирусом, узнающим клеточный рецептор CD46 (CRAd-5/3WT), путем подсчета количества копий вирусной Е4 после нормализации к 1 нг тотальной ДНК. Ось ординат - уровень вирусной ДНК после нормализации к уровню тотальной ДНК в пробе. Ось абсцисс - список инфицированных клеток; Б) Вирусная репликация CRAd-5/3WT приводит к клеточной токсичности, детектируемой в реакции пролиферации астроцитов, 23 инфицированных контрольным вектором AdWT и CRAd-5/3WT. Эксперимент проведен дважды в 5ти повторах каждый, и среднее значение использовано для построения графика. Непарный Т-тест * p<0.05 vs результатов контрольного вектора. Ось ординат — уровень токсичности в каждом из образцов. Ось абсцисс список инфицированных клеток. Таким образом, наши результаты свидетельствуют, что, несмотря на изменение тропизма вируса путем перенацеливания вирусной частицы на рецептор CD46, уровень инфекции оставался достаточно высоким для вектора CRAd-5/3WT. Известно, что клетки астроцитов экспрессируют на своей поверхности рецептор CD46 [Gordon, 1992 и Mcquaid, 2002], таким образом присутствие CD46 может поддерживать инфекцию CD46-зависимого вектора и тем самым способствовать развитию нейротоксичности. По нашему мнению, данные результаты предполагают дальнейшую модификацию CRAd-5/3WT, которая смогла бы снизить токсичность 5/3-модифицированного вектора и увеличить его специфичность, например, за счет использования опухолеспецифического промотора. Сурвивин — активный компонент резистентности глиобластом к терапии темодалом и ионизирующей радиацией Текущие химиотерапии, терапевтические хирургической подходы, резекции основанные и на применении радиотерапии, увеличивают продолжительность жизни пациентов, но не предотвращают возникновение рецидива мультиформной глиобластомы. По данным литературы, стволовые клетки глиобластомы (ГСК) человека, отвечающие за прогрессию опухоли, обладают резистентностью к терапии [Bao, 2006 и Hale, 2014], значит, использование онколитической виротерапии в терапии глиобластомы может быть направлено на таргетинг стволовых клеток глиобластомы человека в качестве адъювантной терапии для ионизирующей радиации и химиотерапии. 24 Одним из важных подходов в изучении механизма резистентности к текущим терапевтическим подходам является использование модельных систем. Так, оказалось, что стволовые клетки глиобластомы пациентов вырабатывают значительное количество сурвивина [Dahan, 2014]. В силу повышенного уровня активности белка сурвивина, регулирующего клеточную реакцию на стресс и резистентность к терапии, клонирование промотора гена сурвивина в состав аденовирусной конструкции сможет обеспечить специфичность таргетинга резистентных клонов аденовирусным вектором. Данные анализа экспресии сурвивина в тканях пациентов с диагнозом «глиобластома» и первичных клеточных линиях ГБМ показывают, что сурвивин активен как in vitro, так и in vivo, однако остается открытым вопрос: будет ли сурвивин активен в стволовых клетках опухоли. Поскольку в литературе отмечалось, что клетки-носители маркера CD133 обладают резистентностью к терапии [Shibahara, 2013 и Tamura, 2013], мы разделили первичные клетки мультиформной глиобластомы по уровню экспрессии маркера CD133. Типичный уровень в них колебался в пределах 15,2-26,2% от общего количества опухолевых клеток (Рисунок 8А), что коррелирует с данными литературы [Miconi, 2015]. Активация клеточных программ в стволовых клетках глиобластомы имеет тенденцию к высокой активности транскрипционных участков, кодирующих эти белки [Fan, 2006; Galatro, 2013; Jiang, 2013]. Таким образом, можно предположить, что клонирование промотора, чей ген активен в стволовых клетках глиобластомы, позволит увеличить направленную инфекцию стволовых клеток. 25 Рисунок 8 — Экспрессия гена сурвивина в стволовых клетках мультиформной глиобластомы, несущих поверхностный рецептор CD133. А) Анализ экспрессии маркера CD133 стволовых клеток в образцах глиобластомы человека, проведенный методом проточной цитофлуориметрии. Уровень экспрессии белка CD133 был определен по отношению к изотипическому контролю. На рисунке указан процент АПС-меченых опухолевых клеток для первичных образцов ГБМ1, ГБМ2 и перевиваемой линии клеток глиобластомы человека U251; Б) Количественный анализ активности кандидатов-промоторов в первичных клетках глиобластомы, разделенных по уровню экспрессии маркера CD133 (CD133-позитивные и CD133-негативные). Соотношение экспрессии для CD133, BMI1, CXCR4, CMYC, MUSASHI, SOX2, SURVIVIN, NESTIN, OCT3, OLIG2 и NANOG генов в CD133-позитивных и CD133негативных клетках был определен, и среднее значение было подсчитано для каждой группы, представленной 7 образцами опухолей (мультиформная глиобластома). Ось ординат экспрессия каждого из генов - проанализирована в реакции ПЦР. Ось абсцисс - список генов. Недавние исследования показали, что в стволовых клетках происходит накопление транскриптов SOX2 и CD133, а также трансактивация транскрипционных факторов, отвечающих за фенотипические и генотипические свойства стволовых клеток опухоли [Cox, 2012; Aaberg-Jessen, 2013]. Как и ожидалось, в нашем исследовании высокая экспрессия SOX2, OLIG2, CMYC коррелировала с низкой активностью нестин (NESTIN). Было также показано, что 26 ген белка сурвивина имеет самую высокую активность среди исследуемых кандидатов-промоторов (Рисунок 8Б). Значительный интерес представляет экспериментальное исследование с целью изучения активности промотора для специфичности аденовирусной инфекции. С этой целью нами была сконструирована панель вирусных векторов, содержащих короткую и длинную версии промотора сурвивина человека. В дальнейшем нас интересовало, может ли длинная и короткая версии промотора гена сурвивина обеспечивать высокий уровень токсичности. На основании того факта, что короткая версия промотора гена сурвивина является более активной в клетках холангиосаромы человека [Zhu, 2006], мы протестировали рекомбинантные вирусы с короткой (S-S) и длинной (S-L) версией промотора сурвивина (Рисунок 9). Как представлено на Рисунке 10А, внутриопухолевая инъекция онколитического вируса, содержащего S-S промотор, вызвала существенное снижение роста подкожной опухоли U87 (p<0.05). Сходные с этим различия в нарушении клеточной пролиферации мы наблюдали при инфекции первичных линий клеток глиобластомы ГБМ1 и ГБМ2 (Рисунок 9Б). По встраиванию тимидиновой метки в активно пролиферирующие клетки опухоли нами было отмечено, что вектор S-S эффективно ингибировал рост этих клеток на 30-40% больше, чем онколитический вирус с длинной версией промотора (Рисунок 9В). Далее рекомбинантные вирусы были тестированы на перевиваемых клетках глиобластомы. По окрашиванию клеток кристаллвиолетом векторы S-S и S-L показывали сходную онколитическую активность в дозе 100 (U87 и U118) и 10 (A172) ИЕ/клетку. В то же время мы детектировали существенное 10-кратное увеличение цитотоксической активности для вектора S-S в клетках #10 и U251 по отношению к вирусу с более длинной формой промотора сурвивина. Таким образом, можно предположить, что клонирование короткой версии промотора гена сурвивина может увеличить активность 5/3-модифицированного вектора в 27 клетках глиобластомы, особенно резистентных к терапии темодалом и ионизирующей радиацией. Рисунок 9 — Активности короткого и длинного промотора гена сурвивина в обеспечении специфичности и токсичности онколитического вектора. А) Репрезентативные микрофотографии клеточной линии U87, выросшей подкожно и получившей внутриопухолевую инъекцию вектора CRAdWT-S-L-RGD или CRAdWT-S-S-RGD в дозе 100 инфекционных единиц на клетку.*p<0,05, тест Манна-Уитни; Б и В) Сравнительная токсичность онколитических вирусов, имеющих 345 и 1200 пар нуклеотидов промотора гена сурвивина человека. Сто (100), 10 и 1 инфекционная частица были использованы для инфекции клеток глиобластомы человека U87, U251, A172 и #10. Через 10 дней после инфекции дефектным по репликации (E1def), S-L (длинная версия промотора гена сурвивина человека), S-S (короткая версия) и CRAdWT-RGD онколитическими вирусами, клетки были окрашены по методике, описанной в Материалах и методах; Б) Сравнительный анализ пролиферации самореплицирующихся вирусов CRAd-S-SRGD и CRAd-S-L-RGD был проведен с использованием метода встраивания тимидиновой метки в активно пролиферирующиеся клетки [Yu, 1993]. Реакция проведена через 3 дня после инфекции. Результаты пролиферации проверены в 10 повторах, и среднее значение±стандартное отклонение было использовано для построения диаграммы. Ось ординат - уровень тимидина, встроенного в клетки. Ось абсцисс - список онколитических вирусов. Разница между CRAd-S-S- 28 RGD и CRAd-S-L-RGD “*” и “**”p<0.05 (тест Манн-Уитни) для ГБМ1 и ГБМ2. В) Детекция вирусной токсичности кристаллвиолетом, проведенная на 10й день после инфекции клеток вирусами в различной концентрации. Рисунок 10 — Схема строения рекомбинантных вирусов, содержащих длинную и короткую версию промотора гена сурвивина человека. Короткая (~345 п.н.,S-S) и длинная (~1200 п.н., SL) версии промотора, содержащие чувствительный к радиации транскрипционный участок промотора гена сурвивина человека, были клонированы в состав рекомбинантного вируса, содержащего мотив RGD в петлях белка фибера 5 серотипа или кноб-участки белка фибера аденовируса человека 3, 11 и 35 серотипов. Полученные вектора получили название CRAd-SRGD, CRAd-S-5/3, CRAd-S-5/11 и CRAd-S-5/35. ITR - инвертированные терминальные повторы, pA - сигнал полиаденилирования. В качестве контроля использовались дефектный по репликации, но содержащий ген люциферазы под контролем короткой версии промотора гена сурвивина человека (E1def) и дикий тип аденовируса человека (AdWT). 29 ОНКОЛИТИЧЕСКИЙ ВИРУС CRAd-S-5/3 ДЕМОНСТРИРУЕТ ВЫСОКУЮ ИЗБИРАТЕЛЬНУЮ ТОКСИЧНОСТЬ ПО ОТНОШЕНИЮ К ГЛИОБЛАСТОМЕ Присутствие промотора гена сурвивина человека для контроля экспрессии Е1-аденовирусной области при наличии дикого типа фибера аденовируса типа 5 позволило изучить роль модификаций фибера RGD, pK7 и 5/3 (Рисунок 10) для вирусной репликации и вирус-индуцируемой токсичности. Рисунок 11 — Вектор CRAd-S-5/3 показывает специфичность репликации в клетках глиобластомы. Количественный анализ вирусной репликации был проведен методом ПЦР в реальном времени с использованием ДНК, выделенной из клеток глиобластомы (А) и срезов головного мозга человека (Б), инфицированных онколитическими вирусами. Эта ДНК была проанализирована на 1, 3 и 9 (А) или 1 и 3 дни после начала инфекции (Б). Ось ординат уровень вирусной ДНК после нормализации к общему уровню ДНК в исследуемой пробе. Ось абсцисс - список вирусов. “*”, “**”, “***” и “#”,“##” статистическая разница между репликациями CRAd-S-5/3 vs CRAd-S-pK7 в клетках глиобластомы (M58K и D65MG) и образцах головного мозга человека (НБ1 и НБ2), не содержащих глиобластому (p<0,05). 30 Оказалось, что клонирование всех трех модификаций увеличило вирусную репликацию в клетках глиобластомы по отношению к контрольному вектору CRAd-S-WT в среднем в 200-500 раз (Рисунок 11А, p<0,05). Особенно отмечено, что на 9й день вирусной репликации оба: и CRAd-S-pK7, и CRAd-S-5/3 вектора демонстрируют высокий уровень репликации. В отличие от репликации CRAd-SpK7 в здоровых клетках головного мозга, CRAd-S-5/3 реплицируется довольно слабо. В целом, при инфекции срезов головного мозга пациентов, не содержащих неопластические клетки, мы наблюдали 100-кратное снижение репликации CRAdS-5/3 по отношению к CRAd-S-pK7 (Рисунок 11Б). Таким образом, наши данные свидетельствуют о преимуществах, которые несет модификация 5/3 для избирательной репликации аденовируса в клетках глиобластомы. Самореплицирующийся генно-инженерный препарат CRAd-S-5/3 специфичен по отношению к клеткам глиобластомы человека Для сравнительной оценки эффективности онколитических векторов мы тестировали противоопухолевый эффект на перевиваемых и первичных клетках глиобластомы и на астроцитах человека, а также на внутримозговых моделях глиобластомы человека U87 и U251. На Рисунке 12А было показано, что сравнении с другими векторами, CRAd-S-5/3 демонстрировал 100% токсичность в клетках U87 и U251 в дозе 1 и 0,1 ИЕ/клетку. В первичных астроцитах, в отличие от CRAd-S-5/11 и CRAd-S-5/35, CRAd-S-5/3 показывал активность, соответствующую негативному контролю (Рисунок 12Б). Далее в первичных непластических клетках ГБМ4, CRAd-S-5/3 эффективно ингибировал их пролиферацию в концентрации 10 ИЕ/клетку. Из результатов, представленных в Рисунке 12В, следует, что 50%-процентная выживаемость мышей, получивших U87, и затем инъекцию CRAd-S-WT, AdWT, CRAd-S-5/11 и CRAd-S-5/35, была практически одинаковой (36 день). Применение же CRAd-S-5/3 вызывало достоверное увеличение продолжительности жизни мышей (УПЖ) = 40% (p <0,05 31 против PBS). В ксенографтах U251 CRAd-S-5/3 демонстрировал 50% выживаемость на 47 день после имплантации опухолей (p < 0,05 против PBS). Рисунок 12 — Противоопухолевая активность онколитических векторов в перевиваемых клетках глиобластомы, первичных астроцитах и первичных ГБМ. Токсичность онколитических вирусов, исследуемая в клетках глиобластоым человека (А) и первичных астроцитах человека (Б, верх) окраской кристаллвиолетом 10 дней после инфекции вирусами. Первичные клетки глиобластомы резистентны к вирусной инфекции онколитическим вирусом. Чувствительность опухолевых клеток к инфекции AdWT, CRAd-S-WT, CRAd-S-5/3, CRAd-S-5/11, CRAd-S-5/35 или CRAd-S-pK7 в различных концентрациях была измерена на 5 день после инфекции с помощью метода МТТ. Эксперимент проведен дважды в 4х повторах на опыт. Ось ординат кратность пролиферации по отношению к негативному контролю. Ось абсцисс - список онколитических вирусов. Столбцы с черным, синим, зеленым и красным цветом соответствуют 0,01, 0,1, 1 и 10 множественности инфекции вируса на клетку. # p<0,05 vs CRAd-S-WT; В) Медиана выживаемости мышей с внутримозговыми ксенографтами U87 и U251 в зависимости от лечения онколитическим вектором. Эффективность терапии онколитическим вирусом была установлена с использованием внутримозговых моделей мышей U87 (верхняя часть рисунка) и 32 U251 (нижняя часть рисунка). Группа из 5 мышей на 7 день после инокуляции опухолевых клеток в головной мозг была в равной степени разделена для внутримозговой инъекции векторами PBS, AdWT, CRAd-S-WT, CRAd-S-5/3, CRAd-S-5/11, CRAd-S-5/35 или CRAd-S-pK7 в дозе 100 инфекционных единиц на клетку. Выживаемость мышей была установлена для каждой из групп. Ось ординат - процент выживаемости мышей в каждой группе. Ось абсцисс дни после имплантации опухолевых клеток в головной мозг мышей. Статистические различия были изучены с помощью теста Лог-Ранк. Вектор CRAd-S-5/3 демонстрирует 50% выживаемость мышей на 51 и 49 дни после имплантации им глиом человека линий U251 или U87. Таким образом, полученные результаты позволяют считать перспективной применение генно-инженерного препарата CRAd-S-5/3 для лечения глиобластомы человека. Несмотря на статистически достоверное увеличение общей выживаемости мышей с внутримозговыми ксенографтами U87, почти 50% мышей погибают в течение первых 60 дней после имплантации опухолевых клеток в головной мозг, следовательно, необходимо дальнейшее усиление терапевтического потенциала генно-инженерного препарата. СПОСОБЫ УСИЛЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА ОНКОЛИТИЧЕСКОГО ВЕКТОРА IN VITRO И IN VIVO Усиление вирусной репликации генно-инженерного препарата CRAd-S-5/3 верапамилом Терапевтический эффект онколитического вектора зависит не только от способности селективно доставлять рекомбинантную ДНК в клетки-мишени, нарабатывать вирусные продукты, ограничивать клеточную пролиферацию, но и высвобождать прогенные частицы для инфекции близлежащих опухолевых клеток. Данные экспериментальных исследований показывают, что длинный репликативный цикл аденовируса может лимитировать использование векторов для экспериментальной терапии. Так, нами показано, что верапамил в 33 концентрации 1,42µМ и 14,2µМ снижает пролиферацию опухолевых клеток U87 и U251 на~60 и ~87% соответственно. Далее, несмотря на увеличение вирусной токсичности и увеличения продукции вирионов в клетках глиобластомы U251 в присутствии верапамила, схожего эффекта мы не наблюдали в клетках линии U87. Данные литературы показывают, что in vivo многие стволовые клетки глиобластомы могуть быть резистентны к верапамилу в силу тесного взаимодействия с клетками микроокружения, как например эндотелиальными клетками [Bahr, 2003]. Механизм клеточной смерти, вызываемый вирусом CRAd-S-5/3 Наши недавние исследования показали, что онколитический вирус на основе генома аденовируса типа 5, имеющий промотор гена сурвивина, контролирующий экспрессию ранних генов аденовируса, индуцирует апоптоз в клетках глиом [Ulasov, 2009]. При этом кроме слабой активации проапоптотических белков, таких как BIK (1,26-кратное против контроля) и BIM (2,26 против контроля) вирусная инфекция затрагивает, как правило, один из главных эффекторов клеточной реакции, ген AKT1 [Shi, 2004; Lu, 2009]. В наших опытах онколитический вирус под управлением промотора гена сурвивина человека активирует AKT1, что выражается в большей экспрессии фосфорилированной формы (pAKT) на 5 день вирусной инфекции. В литературе отмечено, что активация этого белка позволяет активировать клеточные программы, ответственные за выживаемость [Suzuki, 2010; Schultz, 2012], например, аутофагию. Регуляция программируемой клеточной смерти микроРНК 7d в ответ на инфекцию CRAd-S-5/3 Вирусная инфекция клеток онколитическим вирусом сопровождается активацией клеточных сигнальных путей [Homicsko, 2005; Xiao, 2010]. В недавних публикациях была установлена тесная взаимосвязь экспрессии Е1А, клеточных 34 микроРНК7, miR-92, miR-18, miR-15, miR-93, miR-25 с уровнем аутофагии [Su, 2010; Tazawa, 2012; Tazawa, 2013]. Эти результаты предполагают, что клеточные микроРНК являются необходимыми для развития клеточной токсичности и поддержания клеточного гомеостаза. Было отмечено, что, несмотря на значительное разнообразие онколитических векторов, многие рекомбинантные вирусы отличаются друг от друга по способности вызывать онколизис клетокмишеней. В нашем эксперименте мы сравнили способности AdWT, ONYX015 и CRAd-S-5/3 вызывать онколизис через индукцию клеточных микроРНК. Предполагая, что CRAd-S-5/3 является более эффективным в контексте глиомной виротерапии, мы сравнили возможность индукции микроРНК7d как эффектора аутофагии и токсичности (Рисунок 13А). Оказалось, что CRAd-S-5/3 демонстрирует высокую цитотоксичность U118 в дозе 100 (~85% токсичность) и 10(~65%) инфекционных единиц на клетку и U87 в дозе 10 ИЕ /клетку (~61%). Рисунок 13 — Сравнение клеточной токсичности онколитических векторов, используя in vitro и in vivo модели глиобластомы человека. А) Выживаемость опухолевых клеток в присутствии различных концентраций (100; 10; 1; 0,1 и 0,001) рекомбинантных вирусов AdWT, CRAd-S-5/3 и ONYX015. Результаты одного теста представлены на диаграмме. Ось ординат - процент выживаемости клеток после терапии вирусом. Ось абсцисс - исследуемые онколитические 35 вирусы. *Т тест vs AdWT, p<0,05 и &Т тест vs ONYX015; Б) кривая Каплан-Мейер выживаемости мышей с внутримозговой опухолью головного мозга U87, получивших инъекцию онколитическими векторами в дозе 100 единиц на клетку. Ось ординат - процент выживаемости мышей в каждой группе. Ось абсцисс - дни после имплантации. Тест Лог-Ранк p<0,05 vs AdWT; Корреляция экспрессии микроРНК7d с индукцией аутофагии онколитичеcкими вирусами. А) Количественный ПЦР экспресcии вирус-индуцируемой микроРНК7d в клеточных образцах и тканевых срезах внутримозговой ксенографтов U87 после инъекции онколитических векторов. Ось ординат - уровень микроРНК7d после нормализации к уровню внутреннего контроля SNORD47. Ось абсцисс - эксперименты, проведенные in vitro и in vivo; Б) Индукция аутофагии, определяемая в тканевых срезах внутримозговых ксенографтов U87, содержащих AdWT, ONYX015 или CRAd-S-5/3 после инкубации с антителами LC3-II. Увеличение Х200, Шкала 40 микрон. При концентрации 100 ИЕ на клетку вектора ONYX015 и AdWT показывают сходную с CRAd-S-5/3 активность в клетках U87. В эксперименте in vivo мы, используя внутримозговую модель U87, показали терапевтическую эффективность онколитического вектора CRAd-S-5/3 по сравнению с AdWT и ONYX015. Оказалось, что 40% выживаемость мышей, несущих внутримозговую опухоль и получивших впоследствии внтуримозговую инъекцию онколитического вируса CRAd-S-5/3, была установлена на 54 день имплантации опухоли. 50% выживаемость для групп AdWT и ONYX015 составляла в среднем 38 дней для каждой из них (Рисунок 13Б). Чтобы установить, является ли пролонгированная выживаемость мышей в ответ на инъекцию CRAd-S-5/3 результатом активации экспрессии клеточных микроРНК, нами проведен транскрипционный анализ индукции микроРНК в ответ на инфекцию AdWT, ONYX015 и CRAd-S-5/3. По нашим результатам, полученным и проанализированным с помощью программы компании Qiagen, все три вектора экспрессируют микроРНК7d, участвующую в индукции клеточной аутофагии (Рисунок 13В). Причем уровень микроРНК7d был самым высоким в 36 клетках, инфицированных CRAd-S-5/3 (622±157,1) и наименьшим AdWT(12,5±1,34). In vivo мы также наблюдали, что CRAd-S-5/3 индуцировал больше микроРНК7d (12,5±3,56), что соответствовало высокому уровню аутофагии, детектированной в реакции иммуногистохимии с антителами LC3-II (Рисунок 13Г). Таким образом, наши данные коррелируют с данными других исследователей, подтверждающими развитие аутофагии в ответ на инфекцию онколитическими аденовирусами in vitro и in vivo [Rajecki, 2009; Li, 2013]. Несмотря на развитие аутофагии, активация выживаемости клетки в присутствии онколитического агента снижает эффективность применения вектора как противоопухолевого агента. В этой связи было предложено изучить эффективность использования онколитического аденовируса в комбинации с текущими терапевтическими подходами, применяемыми в клинике, такими, как, например, темодал, ионизирующая радиация и др. Использование стандартных методов лечения: ионизирующая радиация и темодал для усиления генно-инженерного препарата CRAd-S-5/3 Выбор тактики терапевтического лечения мультиформной глиобластомы в первую очередь связан с попыткой ограничить клеточную пролиферацию и инвазию. Недавние исследования показали, что гетерогенная опухоль глиобластомы содержит в своей среде клетки, обладающие инвазивными свойствами, и резистентные к терапии [Inda, 2014; Fine, 2015] за счет экспрессии сурвивина. Более того, наличие радиационно-индуцирующей области в составе короткой версии клонированного промотора гена сурвивина [Zhang, 2013] делает аденовирусную транскрипцию контролируемую промотором гена сурвивина зависимой от ионизирующей радиации. В связи с этим нами показано, что активация промотора ионизирующей радиацией приводит к 20-40% увеличению вирусной цитотоксичности CRAd-S-5/3 на в клетках глиом и, как следствие, активации вирусной транскрипции (от 2-10 раз) и усилению противоопухолевого 37 эффекта. Также значительное усиление противоопухолевой активности онколитического вируса было обнаружено нами в комбинации с темодалом [Ulasov, 2009], одним из «золотых стандартов» противоопухолевой химиотерапии глиобластом. В основе эффективного применения онколитического вектора в комбинации с темодалом и/ или ионизирующей радиацией лежит активация различных механизмов клеточной смерти, включая аутофагию. Впервые индукцию аутофагии темодалом описал Kanzawa с соавт., предполагая, что такая клеточная реакция лежит в основе цитотоксической реакции многих терапевтических агентов, включая онколитические вектора. Однако, во многих первичных клетках глиобластом, уровень аутофагии оказался сниженным, что негативно отразилось на их чувствительности к терапии онколитическим вирусом и темодалом [Ulasov, 2015]. Присутствие онкогенного цитомегаловируса снижает чувствительность глиом к инфекции онколитическим вирусом СRAd-S-5/3 В последнее время особое внимание в нейроонкологии приковано к трансформирующей роли цитомегаловируса человека. В связи с отмеченной ролью цитомегаловируса в подавлении клеточного апоптоза мы изучили роль онкогенного вируса в регуляции аутофагии. С этой целью мы проанализировали первичные клетки глиобластомы человека на предмет экспрессии ими цитомегаловирусных антигенов. Было установлено, что ~50% (6 из 12) исследуемых линий содержат белковые продукты цитомегаловируса человека (IE1/IE2 и CMVpp65), представленные на Рисунке 14А. При этом уровень вирусной экспрессии коррелирует со сниженным уровнем аутофагии, что выражается в аккумуляции клеточного LC3-I размером 18кДа (Рисунок 14Б) и низкой чувствительности к инфекции CRAd-S-5/3 (Рисунок 14В, p=0,04). Раннее было показано, что тамоксифен ингибирует экспрессию цитомегаловируса в клетках миобластов артерии [Speir, 2000]. Таким образом, можно предположить, 38 что тамоксифен, ингибируя цитомегаловирус, может потенцировать антиглиомный эффект CRAd-S-5/3 в клетках со сниженной аутофагией. Применение тамоксифена как индуктора аутофагии Применение терапевтических агентов, таких как, темодал (темозоломид), на ранних этапах развития ГБМ позволяет ингибировать пролиферацию неопластических клеток и способствует выживаемости пациентов [Mrugala, 2010]. Однако некоторые пациенты демонстрируют резистентность к химиопрепарату [Prados, 2000] за счет активации клеточных ингибиторов таких как антиапоптотический сурвивин. Рисунок 14 — Экспрессия цитомегаловируса человека нарушает аутофагию в клетках глиобластомы. А) и Б) Анализ экспрессии белков IE1, pp65, p62 и LC3 был проведен в первичных образцах и перевиваемых клетках глиом человека линии LN229 после инфекции их цитомегаловирусом человека (5ИЕ/ клетку, штамм Towne) и через 48 часов после инфекции (В). Антитела к GAPDH были использованы в качестве контроля для нанесения одинакового количества белка в лунку ПААГ-геля. Разделение белковых фракций было проведено дважды, и результаты одного эксперимента представлены на рисунке; Г) Среднее значение токсичности CRAd-S-5/3 было взято для построения диаграммы, характеризующей чувствительность CMVинфицированных и неинфицированных первичных клеток глиобластомы. Тест Манн-Уитни p<0,05 39 В литературе показано, что, сурвивин не только ингибирует апоптоз, но и регулирует появление рецидивов глиомы [Dahan, 2014]. Более того, недавние публикации достоверно предположили, что тамоксифен, антиэстрогенный продукт, аттенуирует трансляцию сурвивина [Nakayama, 2000; Hong, 2013] и демонстрирует пролонгированный терапевтический эффект в клетках рака печени [Guo, 2009] и глиобластомы [Harmalkar, 2015; He, 2015] человека. Следовательно, так как и ионизирующая радиация, и темодал индуцируют экспрессию сурвивина на уровне мРНК и белка, экспрессия аденовирусных белков под контролем промотора гена сурвивина в присутствии тамоксифена сможет эффективно ингибировать рост резистентных клонов и вызывать специфическую токсичность. В таком случае ожидается, что снижение уровня трансляции сурвивина будет сопровождаться индукцией аутофагии [Cho, 2012; Liu, 2015]. С этой целью дефектные клетки глиобластомы человека Beclin-1 были инфицированы CRAd-S5/3 в присутствии тамоксифена (Рисунок 15А). Мы детектировали усиление аутофагии в комбинации CRAd-S-5/3+тамоксифен, что выражалось в увеличенной конверсии LC3-I в LC3-II (в среднем в 2-3 раза по отношению к контролю). Вместе с тем, как и ожидалось, совместная терапия клеток глиобластомы онколитическим вирусом и тамоксифеном снижала экспрессию сурвивина и потенциировала накопление фосфорилированной формы гистона Н2АХ (Рисунок 15Б) c ~19.2% (CRAd-S-5/3) до ~58% (CRAd-S-5/3+ТАМ, p<0.05). 40 Рисунок 15 — Тамоксифен промотирует аутофагию и усиливает цитотоксический эффект онколитического вируса в опухолевых клетках первичной глиобластомы. А) Результаты анализа конверсии клеточного LC3-I в присутствии тамоксифена и онколитического вируса CRAd-S-5/3 методом иммуноблоттинга. Лунка 1 - Контрольные клетки, Лунка 2 - Клетки, обработанные тамоксифеном, Лунка 3 - Клетки, трансдуцированные рекомбинантным вектором CRAd-S-5/3, Лунка 4 - Клетки, трансдуцированные рекомбинантным вектором CRAd-S-5/3 в присутствии тамоксифена. 10 микрограмм клеточных лизатов были проанализированы в ПААГ и проинкубированы с антителами LC3. GAPDH использовали в качестве контроля для нанесения образцов. Соотношение изоформ белка LC3-II к LC3-I было подсчитано для каждого образца. Эксперимент проведен дважды и результаты одного представлены на рисунке; Б) Среднее значение фосфорилированной формы гистона H2AХ, подсчитанное для каждого образца, обработанных тамоксифеном и/или онколитическим вирусом CRAd-S-5/3, было использовано для построения диаграммы. Тест Манна-Уитни, p<0,05 vs экспрессии ядерного H2AХ в группе клеток, инфицированных CRAd-S-5/3. 41 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В нашей работе была поставлена задача сконструировать генно-инженерный самореплицирующийся вектор, специфичный к клеткам глиобластомы и индуцирующий цитотоксичность неопластических клеток in vitro и in vivo. Текущие клинические испытания, проводимые в мире, и предварительные результаты, полученные в медицинской практике, позволили сделать выбор в пользу создания вектора на основе генома аденовируса человека для доставки рекомбинантной ДНК с целью терапевтической интервенции глиом. Однако применение самореплицирующегося генно-терапевтического препарата на основе генома аденовируса типа 5 без внесения дополнительных модификаций не отвечает критериям специфичности по отношению к неопластическим клеткам головного мозга. По нашим данным, использование рецептора CD46 и высокая активность промотора гена сурвивина позволяет многократно усилить специфичность вектора и снизить возможную нейротоксичность. Более того, данные сравнительного анализа рекомбинантных аденовирусов, узнающих CD46, позволяют предположить, что использование кноб-домена аденовируса типа 3 обеспечивает высокое связывание вириона с поверхностью клетки-мишени. Эффективность применения аденовирусных векторов зависит от чувствительности клетки к инфекции аденовирусным вектором. Как было показано, активация клеточных программ, таких, как стресс, обеспечивает реакцию клетки на внешнее воздействие, в том числе посредством усиления резистентности. Данные, представленные в нашем автореферате, позволяют оценить возможные причины такого поведения клеток глиобластомы и предлагают пути их преодоления. К настоящему времени известна целая группа генов, известных как белки-супрессоры, контролирующие ответ клетки на внешнее воздействие в виде активации пролиферации, ангиогенеза, клеточного деления и общей резистентности. Более 42 того, оказалось, что данные экспериментальных исследований предполагают наличие большего числа химиопрепаратов, повышающих аденовирусную цитотоксичность и снижающих роль супрессоров опухоли. В результате оказалось, что применение ингибиторов р53, Хеджхог-сигнального пути и кальциевых каналов усиливает специфичность аденовирусного вектора, особенно в контексте первичных опухолевых клеток. Развитие клеточной цитотоксичности аденовирусными векторами влияет на их использование в качестве генно-инженерных векторов. По данным литературы и нашим данным, онколитический аденовирус под контролем промотора гена сурвивина индуцирует аутофагию и апоптоз. В настоящей работе показано, что, в сравнении с другими онколитическими векторами, CRAd-S-5/3 индуцирует значительное количество микроРНК7, которая активирует аутофагию. Эти результаты были позднее подтверждены данными других исследователей, которые свидетельствуют об активной роли индукторов аутофагии, таких, как микроРНК7d, аденовирусных белков области Е4, в активации аутофагии. Полученные данные вносят существенный вклад в развитие понимания молекулярного механизма аденовирусной цитотоксичности, что необходимо для моделирования вирусных векторов с усиленной токсичностью по отношению к неопластическим клеткам. Белковый анализ клеток первичных глиобластом человека показал, что сниженная экспрессия клеточных белков, таких, как Beclin-1, может вносить существенный вклад в регуляцию чувствительности неопластических клеток к аденовирусной инфекции. Было показано, что у пациентов с ГБМ, демонстрирующих сниженную экспрессию Beclin-1 в результате персистенции цитомегаловируса, эффективность инфекций клеток глиобластомы аденовирусом снижена. Установлено, что 58% тканей пациентов с диагнозом глиобластома содержат продукты экспресии цитомегаловируса человека. Поскольку развитие аутофагии было продемонстрировано 43 для цитотоксичности многих противоопухолевых агентов, мы считаем важнейшей задачей повышение эффективности аутофагии параллельно с ингибированием персистенции онкогенных вирусов. В нашей работе мы установили, что тамоксифен повышает аутофагию, тем самым усиливая противоопухолевый эффект вектора CRAd-S-5/3. При этом следует подчеркнуть практическое значение полученных данных, поскольку тамоксифен нашел свое применение в клинических испытаниях в США [Odia, 2015; Zhou, 2015]. 44 ВЫВОДЫ 1. Разработаны и продемонстрированы методические подходы к анализу чувствительности опухолевых клеток мультиформной глиобластомы к инфекции аденовирусным вектором на основе фрагментов геномов аденовируса человека различных серотипов. 2. Определена зависимость клеточной локализации белка фибера аденовируса от наличия мутаций в N-концевой части аминокислотной последовательности гена. Показано, что мутантная форма белка фибера, дефектная по сигналу ядерного транспорта, имеет цитоплазматическую и ядерную локализацию. 3. Впервые проведено сравнение эффективности накопления рекомбинантного аденовируса в присутствии поверхностного белка фибера аденовируса с различной клеточной локализацией. Продемонстрированы условия снижения инфекционности аденовирусных частиц. Определено, что аденовирус, выращенный в инфицированных клетках и содержащий мутантный фибер в цитоплазме, обладает сниженной инерционностью по отношению к опухолевым клеткам человека (в среднем 4-15 раз). 4. Впервые продемонстрировано, что клеточный мембранный рецептор CD46 является новой молекулой-мишенью для аденовирусной терапии глиобластомы. Проведен сравнительный анализ трансдукции клеток глиобластомы рекомбинантными аденовирусами, содержащими рецептор-связывающие участки к белку CD46 в составе кноб-домена белка фибера. Отмечено, что стабильное встраивание кноб-домена аденовируса человека серотипа 3 в составе фибера обеспечивало высокий уровень инфекции клеток глиобластомы человека (10-100 кратное увеличение) в сравнении с контрольным вектором AdWT. 5. С целью усиления специфичности экспрессии вирусных цитотоксичных белков области Е1А (транскрипционного подхода) проведен скрининг кандидатов-промоторов и показано преимущество применения промотора гена 45 сурвивина человека в контроле специфичности вирусной транскрипции. Комбинирование транскрипционного и трансдукционного подходов в создании генно-инженерного вектора позволило получить CRAd-S-5/3. Показано, что онколитический вектор CRAd-S-5/3 индуцирует антиглиомный терапевтический эффект in vitro и in vivo. 6. На перевиваемых «мультиформная и первичных глиобластома» клетках изучено пациентов действие 12 с диагнозом онколитических аденовирусных векторов. Показано, что эффективность ингибирования роста глиобластомы человека вектором CRAd-S-5/3 характеризуется высокой цитотоксичностью к опухолевым клеткам и повышением выживаемости мышей с глиобластомой человека. 7. Определен и охарактеризован процесс клеточной цитотоксичности, вызываемый в ответ на инфицрование онколитическим аденовирусом под контролем промотора гена сурвивина человека. Регистрация изменений в экспрессии клеточных белков зафиксировала появление смешанной клеточной реакции на основе апоптоза и аутофагии. 8. Определены клеточные белки и коротко-размерные РНК, приводящие к индукции аутофагии онколитическим вирусом в глиобластоме человека. Отмечено, что эффективность онколитического аденовектора зависит от уровня экспрессии микроРНК7d. Показано терапевтическое значение микроРНК7d при медикаментозной интервенции глиобластомы онколитическими аденовирусными векторами и химиопрепаратами. 9. Определены условия снижения уровня аутофагии в клетках глиобластомы человека. Показано, что персистенция цитомегаловируса в опухолевых клетках снижает экспрессию Beclin-1 и конверсию клеточного LC3-I в LC3-II. В случае снижения аутофагии в клинических образцах, был предложен комбинированный 46 способ терапии клеток глиобластомы со сниженной аутофагией с помощью онколитического вектора в присутствии тамоксифена. 10. Проведена оценка чувствительности клеток, не инфицированных цитомегаловирусом, к терапии темодалом и ионизирующей радиации, и отмечена индукция генов, отвечающих за резистенцию к ним. 11. Комплексное применение химиопрепаратов темодал, ингибиторов p53, L- кальциевых каналов и, Хеджхог сигнального пути, расширяет возможности онколитической терапии и позволяет достичь пролонгированного терапевтического эффекта при минимальной нейротоксичности in vitro и in vivo. 12. Полученные данные позволяют рекомендовать генно-инженерный препарат на основе онколитического аденовируса CRAd-S-5/3 в качестве адъюванта на доклинические испытания 47 СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Афанасьева, Д.А. Механизмы лекарственной устойчивости меланомы /Д.А. Афанасьева, М.А. Барышникова, И.В.Уласов с соавт//Российский биотерапевтический журнал. — 2015. — 14 (2). — С. 17–22. 2. Каверина, Н.В. Влияние метилирования промотора KISS1 на подавление экспрессиии гена в клетках рака молочной железы и церебральных метастазах/Н.В.Каверина, И.В.Уласов, И.А.Фаворская с соавт//Вестник РОНЦ. — 2011. — 22 (4). — С.17-24. 3. Уласов, И.В. Антиглиомная аденовирусная виротерапия: механизм, регуляция и клинические перспективы/И.В.Уласов, Н.В. Каверина, А.Ю. Барышников с соавт// Российский биотерапевтический журнал. — 2014. — 2. — С. 11-18. 4. Уласов, И.В. Белок фибера аденовируса человека обеспечивает стабильность вирусных капсидов/И.В.Уласов, А.Тусон, А.Ю.Барышников//Российский биотерапевтический журнал. — 2014. —2. — С. 51-56. 5. Уласов, И.В. ДНК-вакцины: Гуморальный и клеточный ответ./ И.В. Уласов, О.А. Верховский, А.В. Капитонов с соавт//Сельскохозяйственная Биология. — 2000. — 6.— С. 121-133. 6. Уласов, И.В. Ингибирование активности клеточных транспортеров глиобластом сенсибилизирует клетки-мишени к инфекции онколитическим вектором в присутствии ионизирующей радиации/И.В. Уласов, Н.В. Каверина, З.Г.Кадагидзе с соавт// Российский биотерапевтический журнал. — 2015. — 14(2). — С. 65–70. 7. Уласов, И.В. Ингибитор клеточного белка Р53 позитивно регулирует цитотоксичность онколитического вектора в клетках глиобластомы/И.В. Уласов, Н.В. Каверина, А.Ю. Барышников//Российский биотерапевтический журнал. — 2015. —14 (1). — С. 25–28. 8. Уласов, И.В. Инфекция клеток глиом онколитическим вирусом сенсибилирует их к терапии темодалом/ И.В.Уласов, Н.В.Каверина, А.Ю. Барышников// Российский биотерапевтический журнал. — 2014. — 13(4). — С. 45–49. 9. Уласов, И.В. Подавление активности регуляторных Т- клеток аденовирусными векторами/И.В. Уласов, Н.В.Каверина, А.Ю.Барышников с соавт//Вестник РОНЦ. — 2014. — 25 (3-4). — С.55-58. 10.Уласов, И.В. Подавление экспрессии клеточной металлопротеиназы тип 14 усиливает противоопухолевый эффект темодала и ионизирующей радиации в клетках глиобластом человека/И.В. Уласов, Н.В. Каверина, З.Г. Кадагидзе с соавт// Российский биотерапевтический журнал. — 2015. — 14 (2). — С. 53–58. 11.Уласов, И.В. Роль сурвивина в диагностике и терапии опухолей головного мозга/ И.В.Уласов, Н.В. Каверина, А.Ю. Барышников//Российский биотерапевтический журнал. — 2014. — 3. — С. 61-65. 48 12.Ahmed, A.U. A Comparative Study of Neural and Mesenchymal Stem Cell-Based Carriers for Oncolytic Adenovirus in a Model of Malignant Glioma/A.U.Ahmed, M.A.Tyler, B. Thaci et al//Molecular Pharmacology. — 2011. — 8 (5). — P. 1559-72. 13.Ahmed, A.U. Bone marrow mesenchymal stem cells loaded with an oncolytic adenovirus suppress the anti-adenoviral immune response in the cotton rat model/A.U. Ahmed, C.E.Rolle, M.A.Tyler et al//Molecular Therapy. — 2010. — 18 (10). — P. 111. 14.Ahmed, A.U. Neural Stem Cell-based Cell Carriers Enhance Therapeutic Efficacy of an Oncolytic Adenovirus in an Orthotopic Mouse Model of Human Glioblastoma/ A.U.Ahmed, B.Thaci, N.G. Alexiades et al//Molecular Therapy. — 2011. — 18 (10). — P.1-11. 15.Auffinger, B. MicroRNA targeting as a therapeutic strategy against glioma/B.Auffinger, B.Thaci, A.Ahmed et al//Current Molecular Medicine. — 2013 .— 13 (4). — P. 535-42. 16.Breidenbach, M. Genetic replacement of the adenovirus shaft fiber reduces liver tropism in ovarian cancer gene therapy/ M. Breidenbach, D.T. Rein, M. Wang et al//Human Gene Therapy. — 2004. — 15 (5). — P. 509-18. 17.Dey, M. Virotherapy against malignant glioma stem cells/M. Dey, I.V.Ulasov, M.S. Lesniak//Cancer Letters. — 2010. — 289. — 1. — P. 1005-11. 18.Kim, C.K. Therapeutic effect of neural stem cells-based anti-glioma oncolytic virotherapy enhanced by combination with antioxidant agent/C.K.Kim, A.U.Ahmed, B.Auffinger et al//Molecular Therapy. — 2013. — 21 (11). — P. 2063-73. 19.Kim, D.H.Magnetic Vortices as Mediators of Cellular Mechano-transduction/D.H. Kim, E.A. Rozhkova, I.V.Ulasov et al//Nature Materials. — 2010. — 9 (2). — P. 16571. 20.Kirby, T.O. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity/ T.O. Kirby, A. Rivera, D. Rein et al. //Clinical Cancer Research. — 2004. —10 (24). — P. 8697-703. 21.Kranzler, J.M. Stem Cells as Delivery Vehicles for Oncolytic Adenoviral Therapy/ J.M. Kranzler, M.A. Tyler, A.M. Sonabend et al//Current Gene Therapy. — 2009. — 9 (5). — P. 389-95. 22.McDermott, R. MicroRNAs in brain metastases: big things come in small packages/ R.McDermott, P. Gabikian, S. Sarvaiya et al//Journal of Molecular Medicine. — 2013. — 91 (1). — P.5-13. 23.Nandi, S. A Chimeric Adenovirus with an Ad3 Fiber Knob Modification Augments Glioma Virotherapy/S. Nandi, I.V.Ulasov, Y.Han et al//Journal of Gene Medicine. — 2009. — 11 (11). — P.1005-11. 24.Nandi, S. Low-dose radiation enhances survivin mediated adenoviral virotherapy against malignant glioma stem cells/S. Nandi, I.V. Ulasov, M.A.Tyler et al//Cancer Research. — 2008. — 8 (14). — P. 5778-84. 49 25.Paul, C.P. Characterization of infectivity of knob-modified adenoviral vectors in glioma/ C.P. Paul, M. Everts, P Dent et al//Cancer Biology and Therapy. — 2008. — 7 (3). — P. 786-93. 26.Sonabend, A. Conditionally replicative adenoviral vectors for malignant glioma/ A. Sonabend, I.V. Ulasov, M.S. Lesniak //Reviews in Medical Virology. — 2006. — 16 (2). — P. 99-115. 27.Sonabend, A.M. Biodistribution of an oncolytic adenovirus after intracranial injection in permissive animals: a comparative study of Syrian Hamster and Cotton rats/A.M. Sonabend, I.V. Ulasov, Y. Han et al//Cancer Gene Therapy. — 2009. — 16 (4). — P. 362-72. 28.Sonabend, A.M. Emerging role of new transgenic mouse models in glioma research/ A.M. Sonabend, I.V. Ulasov, M.S. Lesniak//Expert Review of Anticancer Therapy. — 2007. — 7 (12). — P.S7-13. 29.Sonabend, A.M. Mesenchymal stem cells effectively deliver an oncolytic adenovirus to intracranial glioma/A.M. Sonabend, I.V. Ulasov, A.A. Rivera et al//Stem Cells. — 2008. — 26 (3). — P. 831-41. 30.Thaci, B. Anti-angiogenic therapy increases intratumoral adenovirus distribution by inducing collagen degradation/B.Thaci, I.V.Ulasov, A.U.Ahmed et al//Gene Therapy. — 2013. — 20 (3). — P. 318-27. 31.Thaci, B. Depletion of myeloid-derived suppressor cells during interleukin-12 immunogene therapy does not confer a survival advantage for anti-glioma therapy/B.Thaci, A. Ahmed, I.V.Ulasov et al//Cancer Gene Therapy. — 2014. — 21 (1). — P. 38-44. 32.Thaci, B. Pharmacokinetic study of neural stem cell-based cell carrier for oncolytic virotherapy: Targeted delivery of the therapeutic payload in an orthotopic brain tumor model/B.Thaci, A.U.Ahmed, I.V.Ulasov et al//Cancer Gene Therapy. — 2012.—19 (6).—P. 431-42. 33.Tyler, M.A. Cancer Cell Death by Design: Apoptosis, Autophagy, and Glioma Virotherapy/M.A. Tyler, I.V.Ulasov, M.S.Lesniak//Autophagy — 2009. — 5 (6). — P. 856-7. 34.Tyler, M.A. Enhanced transduction of malignant glioma with a double targeted Ad5/3-RGD fiber modified adenovirus/ M.A. Tyler, I.V. Ulasov, A. Borovjagin et al//Molecular Cancer Therapeutics. — 2006. — 5 (9). — P. 2408-16. 35.Tyler, M.A. Neural stem cells target intracranial glioma to deliver oncolytic adenovirus in vivo/M.A. Tyler, I.V. Ulasov, A. Sonabend et al//Gene Therapy. — 2009. — 16 (2). — P. 262-78. 36.Tyler, M.A. Vector therapies for malignant glioma: Shifting the clinical paradigm/ M.A. Tyler, A.M. Sonabend, I.V. Ulasov et al//Expert Opinion Drug Delivery. — 2008. — 5 (4). — P. 445-58. 50 37.Ulasov, I. MT1-MMP silencing by a shRNA-armed glioma-targeted oncolytic adenovirus (CRAd) exhibits anti-tumor effect in vitro and in vivo/I. Ulasov, A.B.Borovjagin, N.Kaverina et al//Cancer Letters. — 2015. — 365(2). — P. 240-50. 38.Ulasov, I.V. An oncolytic adenoviral vector carrying the tyrosinase promoter for glioma gene therapy/I.V. Ulasov, A.A. Rivera, D.M. Nettelbeck et al//International Journal of Oncology. — 2007. — 31 (5). — P. 1177-85. 39.Ulasov, I.V. CD46 represents a target for adenoviral gene therapy of malignant glioma/ I.V. Ulasov, M.A.Tyler, S. Zeng et al//Human Gene Therapy. — 2006. — 17 (5). — P. 556-64. 40.Ulasov, I.V. Clinical significance of KISS1 protein expression for brain invasion and metastasis/ I.V.Ulasov, N.V. Kaverina, P.Pytel et al//Cancer. — 2012. — 118 (8). — P. 2096-105. 41.Ulasov, I.V. Combination of adenoviral virotherapy and temozolomide chemotherapy eradicates malignant glioma through autophagic and apoptotic cell death in vivo/I.V. Ulasov, A.M. Sonabend, S. Nandi et al/British Journal of Cancer. — 2009. — 100(7). — P. 1154-64. 42.Ulasov, I.V. Comparative evaluation of survivin, midkine and CXCR4 promoters for transcriptional targeting of glioma gene therapy/ I.V. Ulasov, A.A. Rivera. A.M. Sonabend et al //Cancer Biology and Therapy. — 2007. — 6 (5). — P. 679-85. 43.Ulasov, I.V. Evaluation of E1A double mutant oncolytic adenovectors in antiglioma gene therapy/I.V. Ulasov, M. Tyler, A.A. Rivera et al//Journal of Medical Virology. — 2008. — 80 (9). — P. 1595-603. 44.Ulasov, I.V. Novel recombinant adenoviral vector that targets the interleukin-13 receptor alpha2 chain permits effective gene transfer to malignant glioma/ I.V. Ulasov, M.A. Tyler, Y. Han et al//Human Gene Therapy. — 2007. — 18 (2). — P. 118-29. 45.Ulasov, I.V. Oncolytic adenoviral vectors which employ the survivin promoter induce glioma oncolysis via a process of beclin-dependent autophagy/I.V. Ulasov, M.A. Tyler, Z.B. Zhu et al//International Journal of Oncology. — 2009. — 34 (3). — P. 72942. 46.Ulasov, I.V. Survivin-driven and fiber modified adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma/I.V. Ulasov, Z.B. Zhu, M.A. Tyler et al//Human Gene Therapy. — 2007. — 18 (7). — P. 589-602. 47.Ulasov, I.V. Targeting adenovirus to CD80/CD86 increases gene transfer efficiency to malignant glioma/I.V. Ulasov, A.A. Rivera, A. El Andaloussi et al//Journal of Neurosurgery. — 2007. — 107. — P. 617-627. 48.Ulasov, I.V. The emerging role of MMP14 in brain tumorigenesis and future therapeutics/ I.V. Ulasov, R.Yi, D.Guo et al//BBA in Cancer. — 2014. — 1846 (1). — P. 113-10. 49.Van Houdt, W. The human survivin promoter; a novel transcriptional targeting strategy for treatment of glioma/W. Van Houdt, Y. Haviv, B. Lu et al //Journal of Neurosurgery. — 2006. — 104 (4). — P.583-592. 51 50.Velicu, S. Cross-priming of T cells to intracranial tumor antigens elicits an immune response that fails in the effector phase but can be augmented with local immunotherapy/ S. Velicu, Y. Han, I.V. Ulasov et al//Journal of Neuroimmunology. — 2006. — 174 (1-2). — P.74-81. 51.Yun, J. A novel adenoviral vector labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles for real-time tracking of viral delivery/J. Yun, A.M. Sonabend, I.V.Ulasov et al//Journal of Clinical Neuroscience. — 2012. — 19 (6). — P. 875-80. 52.Zheng, S. Fiber-knob modifications enhance adenoviral tropism and gene transfer in malignant glioma/S. Zheng, I.V. Ulasov, M.A. Tyler et al//Journal of Gene Medicine. — 2007. — 9 (3). — P. 151-160. 53.Zhu, Z.B. Incorporating the survivin promoter in an infectivity enhanced CRAd— analysis of oncolysis and anti-tumor effects in vitro and in vivo/ Z.B. Zhu, S.K. Makhija, B. Lu et al//International Journal of Oncology. — 2005. — 27 (1). — P. 237-46. 52
![[616.83+616.853]-005.4:611 КОНЦЕПЦИЯ ЛИПОФУСЦИНОЗА НЕЙРОНОВ](http://s1.studylib.ru/store/data/002627730_1-6bc88aee6473a74291a5c72d40266774-300x300.png)