Голубенко Рамиля Ахметовна - Гематологический научный
advertisement
На правах рукописи Голубенко Рамиля Ахметовна «Динамика плазменнорастворимых антигенов системы HLA при трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток больным гемобластозами» 14.00.29-гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2006 г. 2 Работа выполнена в Государственном учреждении – Гематологическом научном Центре Российской Академии Медицинских наук Научные руководители: доктор биологических наук Л. П. Порешина доктор медицинских наук, профессор Л. С. Любимова Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А.А. Рагимов доктор медицинских наук, профессор Г.Л. Менткевич Ведущая организация: Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М. Ф. Владимирского Защита диссертации состоится «___» __________2006 года в ___часов на заседании диссертационного совета Д 001.042.01 в Гематологическом научном центре Российской Академии Медицинских наук (125167, Москва, Новозыковский проезд, дом 4 а). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного Центра Академии Медицинских наук Автореферат разослан « » Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук 2006 года. Е.Е. Зыбунова 3 Общая характеристика работы Актуальность проблемы Острая реакция трансплантат против хозяина (РТПХ) является серьёзным осложнением трансплантации аллогенного костного мозга, приводящим в 15 - 20% случаев к летальному исходу. Течение позднего посттрансплантационного периода может значительно осложнять хроническая РТПХ, которая, примерно, в таком же проценте случаев заканчивается фатально. Известно, что в основе иммунологических осложнений после трансплантации аллогенного костного мозга (ТКМ) лежит конфликт между иммунокомпетентными клетками донора и реципиента. Отсутствие различий по основным антигенам системы HLA между донором и реципиентом указывает на наличие других неизвестных антигенов, которые участвуют в индукции РТПХ. Критерии диагностики РТПХ являются ограниченными и заключаются, в основном, в оценке клинической картины заболевания и результатов гистологических исследований материала из пораженных органов–мишений, которые не всегда бывают информативными. Что же касается иммунологических показателей, то их роль в диагностике РТПХ остается мало изученной. Работами Зотикова Е.А. с соавт.(1995 г) было показано, что у 37% реципиентов с острой РТПХ выявляются плазменнорастворимые HLA антигены, но корреляции этого показателя с клиническими проявлениями различных форм РТПХ и приживлением трансплантанта по данным исследования эритроцитарного химеризма проведено не было. Отмечено также появление в ряде случаев аутоантител к эритроцитам и лимфоцитам у реципиентов костного мозга (Порешина Л.П.с соавт.,1993г). Наибольший интерес представляют плазменнорастворимые HLA, поскольку рядом авторов обнаружена их определенная взаимосвязь с отторжением почечного трансплантата (Koelman CA et al, 2000; Aultman D et al, 1999). Есть также единичные работы, касающиеся обнаружения плазменнорастворимых антигенов после трансплантации костного мозга 4 (Sediva A et al, 2000; Xia R et al 2005). Однако следует признать, что динамика иммуносерологических показателей, частота их выявления в посттрансплантационном периоде и значение в диагностике РТПХ остаются мало изученными. Кроме того, в отечественной практике до сих пор не использовался метод иммуноферментного анализа для выявления плазменнорастворимых антигенов, который применяется большинством зарубежных исследователей. В связи с этим детальный анализ иммуносерологических показателей у больных до и после трансплантации костного мозга представляется актуальным. Выявление возможной связи этих показателей с проявлениями острой и хронической РТПХ является важным для ее диагностики и своевременного начала терапии осложнения. Цель исследования Изучить динамику плазменнорастворимых HLA у больных после трансплантации аллогенных гемопоэтических клеток, частоту выявления эритроцитарных, лимфоцитотоксических антител и естественных изогемагглютининов с учетом характера эритроцитарного химеризма. Задачи исследования 1. Установить частоту обнаружения плазменнорастворимых HLA у реципиентов костного мозга и их значение для диагностики реакции трансплантат против хозяина. 2. Модифицировать и применить метод иммуноферментного анализа для выявления плазменнорастворимых антигенов и сопоставить результаты их исследования методом ингибиции анти-HLA антител с данными иммуноферментного анализа. 3. Установить влияние темпа нарастания донорских эритроцитов в крови реципиента на развитие и степень тяжести реакции трансплантат против хозяина. 4. Установить значение в диагностике реакции трансплантат против хозяина антиэритроцитарных, антилимфоцитарных антител, динамики естественных изогемагглютининов. 5 Научная новизна На основании 715 исследований, проведенных у 49 реципиентов аллогенных гемопоэтических плазменнорастворимых антигенов клеток, (ПРА) в установлена диагностике роль острой и хронической реакции трансплантат против хозяина. Новыми являются данные, показавшие, что ПРА выявляются у до 93% пациентов с острой РТПХ, и до 100% больных с хронической формой и практически отсутствуют у больных без этих осложнений и лиц контрольной группы. Они свидетельствует о том, что наличие ПРА является характерным для РТПХ и может использоваться в качестве дополнительного теста ее диагностики. Установлено прогностическое значение появления ПРА для ранней диагностики острой и хронической РТПХ после немиелоаблативного кондиционирования, выявлено соответствие степени тяжести РТПХ и уровня ПРА. В то же время не обнаружено корреляции между темпом увеличения содержания донорских эритроцитов в крови, развитием и степенью тяжести РТПХ. Впервые в отечественной практике модифицирован метод иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления ПРА у реципиентов костного мозга, при использовании которого получены данные, аналогичные таковым при применении метода ингибиции анти-HLA антител. На основании анализа частоты выявления антиэритроцитарных, антилимфоцитарных антител, динамики естественных изогемагглютининов у реципиентов костного мозга сделано заключение о том, что эти показатели не имеют диагностической значимости. Новизна исследования заключается в детальном исследовании динамики иммуносерологических показателей и их значения в диагностике РТПХ, которые являются мало изученными и практически не освещены в литературе. Результаты работы углубляют наши знания об особенностях иммунологических изменений, происходящих у реципиентов костного мозга в посттрансплантационном периоде при развитии острой и хронической форм РТПХ. 6 Практическое значение работы Вопросы, освещенные в данной работе, представляют не только научный, но и практический интерес. Показано, что появление ПРА специфично для острой и хронической РТПХ и может использоваться в ее диагностике. Это является важным, так как подходы к распознаванию такого серьезного осложнения аллогенной ТКМ являются ограниченными. В то же время не найдено диагностической значимости других иммуносерологических показателей, изученных у реципиентов костного мозга. Модифицирован метод иммуноферментного анализа для выявления плазменнорастворимых HLA у реципиентов костного мозга, который до сих пор не использовался в отечественной практике. Он может быть применим в тех случаях, когда в HLA-фенотипе пациента не содержатся антигены, специфичные анти-HLA антителам тест-реагента, который используется в методе ингибиции лимфоцитотоксических анти -HLA антител. Важно, что результаты определения ПРА с помощью ИФА не имели принципиальных различий с данными, полученными методом ингибиции лимфоцитотоксических анти -HLA антител, который применяется в ГНЦ РАМН на протяжении длительного времени. Проведенные исследования могут способствовать улучшению диагностики РТПХ и результатов миелотрансплантаций. Положения, выносимые на защиту 1. Появление плазменнорастворимых антигенов является характерным признаком острой и хронической РТПХ и может использоваться в диагностике этих осложнений. 2. Результаты определения ПРА с помощью метода иммуноферментного анализа аналогичны данным, полученным с помощью метода ингибиции лимфоцитотоксических анти – HLA антител. 7 3. Обнаружение противоэритроцитарных антител, динамика эритроцитарного химеризма и естественных изогемагглютининов не имеют значения для диагностики РТПХ. Внедрение в практику Основные положения диссертационной работы Голубенко Р.А. внедрены в практику работы отделения химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН и являются фрагментом научноисследовательской эффективность работы, выполняемой трансплантации по плану аллогенных и НИР «Изучить аутологичных гемопоэтических клеток в комплексной терапии острых лейкозов и хронического миелолейкоза», № гос. регистрации 01200602115. Метод ингибиции лимфоцитотоксических анти–HLA антител применяется в лаборатории иммуногематологии ГНЦ РАМН для выявления плазменнорастворимых антигенов системы HLA. Модифицированный впервые для обнаружения ПРА в отечественной практике метод ИФА может быть рекомендован к применению в тех случаях, когда в HLA фенотипе пациента отсутствуют антигены, специфичные антиHLA антителам тест-реагента, который используется в методе ингибиции лимфоцитотоксических анти –HLA антител. Апробация работы и публикации. Апробация работы состоялась на заседании Проблемной комиссии Гематологического научного центра РАМН «Гемобластозы и депрессии кроветворения» 23 июня 2006 года. Материалы и основные положения диссертационной работы были доложены на конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004г), научнопрактической конференции «Новое в гематологии и трансфузиологии» (Москва, 2005 г), 15-ой Международной конференции «СПИД, рак и общественное здоровье» (Санкт-Петербург, 2006), 32-ом ежегодном 8 Европейском конгрессе по трансплантации костного мозга (стендовый доклад), в г. Гамбурге в 2006 г. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 129 стр. и состоит из введения, обзора литературы, методической главы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 19 таблицами и 8 рисунками. Диссертация выполнена в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (научный руководитель член-корр. АМН РФ проф. В.Г. Савченко ), лаборатории иммуногематологии М.Н.Васильевой, (зав. а к.м.н. также Л.Л.Головкина) лаборатории с участием н.с. клинико-вирусологической диагностики гепатитов и СПИД (зав.- д.б.н. Ф.П.Филатов ) с участием с.н.с., к.б.н. Т.А. Гаранжа ГНЦ РАМН (директор- академик А.И. Воробьев). Соавторами опубликованных работ являются сотрудники ГНЦ РАМН: к.м.н. А.А. Бурцев, М.Н.Васильева, к.б.н. Т.А. Гаранжа, к.м.н. Л.Л.Головкина, к.б.н. Р.М.Кутьина, д.м.н., проф. Л.С.Любимова, д.б.н. Л.П.Порешина, д.м.н., член-корр.В.Г.Савченко, Д.С. Тихомиров, д.б.н. Ф.П. Филатов. Содержание работы Характеристика больных В настоящей работе использованы материалы наблюдений за 57 больными, которые находились на лечении в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН в период с января 2000 по май 2005 гг. и 17 донорами костного мозга. Согласно поставленным задачам в первой части работы представлены результаты изучения роли плазменнорастворимых антигенов системы HLA в диагностике острой и хронической реакции трансплантат против хозяина. 9 Они основаны на наблюдении за 57 реципиентами гемопоэтических клеток, из которых 49 осуществлена аллогенная ТКМ; группу сравнения составили 8 реципиентов аутологичной трансплантации стволовых клеток периферической крови, а также 17 доноров костного мозга. Помимо изучения динамики плазменнорастворимых HLA, которой уделено основное внимание в работе, нами также исследовано значение фиксированных на эритроцитах иммунных антител, естественных изогемагглютининов и лимфоцитотоксических антител в диагностике РТПХ. Анализ клинического материала - изучение клинической симптоматики РТПХ, факторов, ассоциирующихся с ее развитием, проведен у 49 пациентов, которым была применена трансплантация аллогенного костного мозга. Среди них было 23 мужчины и 26 женщин. Медиана возраста составила 24 года (от 15 до 51). У 20 диагностирован острый лейкоз (ОЛ), у 10 миелодиспластический синдром (МДС), у 19 хронический миелолейкоз (ХМЛ). У 30 из 49 пациентов давность диагностики не превышала 12 месяцев, 55 % больных с острыми лейкозами (11 из 20) к моменту ТКМ были в фазе I ремиссии, 17 из 19 больных ХМЛ (89 %)– в хронической фазе заболевания. Донорами для больных во всех случаях были HLA- идентичные сиблинги, ареактивные в реакции смешанной культуре лимфоцитов. В качестве режима кондиционирования перед ТКМ использовались два режима: миелоаблативный и немиелоаблативный. Первый применен 36 пациентам; он включал бусульфан (БУ) в общей дозе 16 мг/кг массы тела и циклофосфан (ЦФ) в общей дозе 120 мг/кг массы тела. Программа немиелоаблативного кондиционирования применена 13 больным и в 3 случаях включала ЦФ, бусульфан и флюдарабин, у 9 пациентов - антитимоцитарный иммуноглобулин (АТГ) 10 мг/кг- 4 дня, бусульфан 4 мг/кг-2 дня и флюдарабин 30 мг/м2-6 дней, а у 1 больного – БУ, АТГ и цитозар в дозе 2 г/м2 в сутки в течение 5 дней. 10 Для предупреждения развития РТПХ всем больным применялись циклоспорин А и метотрексат по стандартной схеме. В 20 случаях больные дополнительно получали преднизолон, а 3 пациентов - метронидазол. В качестве источника стволовых гемопоэтических клеток после миелоаблативного кондиционирования только в одном случае применяли стволовые клетки, полученные из периферической крови донора после стимуляции Г - КСФ. В остальных 35 случаях использовали костный мозг. После немиелоаблативного кондиционирования в 10 случаях применяли костный мозг, а в 3- стволовые клетки, полученные из периферической крови донора. Среди больных, которым была произведена аутологичная трансплантация гемопоэтических клеток, преобладали мужчины -7 человек. Медиана возраста составила 23 года (от 20 до 44 лет). Большинство больных страдало острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) - 5, у 3 диагностирован острый миелобластный лейкоз (ОМЛ). Все больные отнесены к группе высокого риска. Аутотрансплантация была выполнена в период первых 2 лет с момента диагностики заболевания, причем 6 пациентов находились в фазе I ремиссии, а 2 - во 2 ремиссии. Во всех случаях для кондиционирования использовалась состояние программа больных миелограмм, а БУ+ЦФ. было так же К моменту удовлетворительным. картина кондиционирования Данные трепанобиоптатов гемограмм, этих больных свидетельствовали о ремиссии ОЛ. Больным после аутотрансплантации профилактика РТПХ не проводилась. Среди доноров костного мозга было примерно одинаковое число женщин и мужчин, медиана возраста составила 29 лет. Возраст доноров не превышал 50 лет, большая часть доноров была моложе 30 лет (52,9%). Эксфузия костного мозга произведена 16 донорам и у 1 получены стволовые клетки периферической крови. 11 Методы исследования. Выявление плазменнорастворимых HLA в сыворотке реципиентов проводили с помощью метода ингибиции аллоиммунных лимфоцитотоксических анти-HLA антител совместно с н.с. Васильевой М.Н. Для этого тест-реагент, содержащий анти –HLA антитела в титре не ниже 1:32, разводили исследуемой сывороткой реципиентов и доноров костного мозга в 2, 4, 8 и т. д. раз. В качестве тест-реагента была использована сыворотка больной С. с лимфоцитотоксическими антителами анти-HLA-А-2, В-7, В-8 специфичности. Специфичность антител была установлена в лаборатории иммуногематологии по панели стандартных HLA типированных доноров. Для истощения анти - HLA антител тест-реагент титровали с исследуемой сывороткой реципиентов до и в разные сроки после ТКМ и сывороткой доноров костного мозга в круглодонных 96 луночных планшетах и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 часа. После инкубации проводили лимфоцитотоксический тест. Для этого 1 мкл содержимого каждой лунки переносили в планшеты Терасаки и добавляли по 1 мкл лимфоцитов доноров, содержащих с больным или донором костного мозга общие HLA. После инкубации в течение 1 часа при температуре +370С добавляли 5 мкл кроличьего комплимента, затем 1 час инкубировали при комнатной температуре. По окончании инкубации содержимое планшет встряхивали, добавляли по 1мкл краски «трипановая синь» и проводили учет результатов. Снижение на несколько разведений или до нулевых значений титра тест-реагента указывало на содержание в сыворотке исследуемого больного растворимых HLA, которые ингибировали анти -HLA антитела тест-реагента (положительный результат). Это выражалось в ступенях: 1 ступень - уменьшение титра тест-реагента на 1 разведение (исходный титр 12 1:64, после истощения 1:32); 2 ступени - уменьшений титра тест-реагента на два разведения от исходного; максимальное - снижение титра тест-реагента в наших опытах достигало 4 ступеней (исходный титр 1:64, а после истощения 1:4). Если титр лимфоцитотоксических антител тест-реагента оставался исходным после истощения исследуемыми сыворотками реципиентов или доноров и не отличался от титра с сывороткой АВ (IV) группы, то это указывало на отсутствие плазменнорастворимых HLA (отрицательный результат). Применение иммуноферментного анализа для определения плазменнорастворимых антигенов. Наряду с использованием описанной выше методики, принятой в лаборатории иммуногематологии ГНЦ РАМН, был модифицирован метод иммуноферментного анализа применительно к определению плазменнорастворимых антигенов совместно с к.б.н. Т.А.Гаранжа. Указанный метод широко используется в лаборатории клиниковирусологической диагностики гепатитов и СПИД ГНЦ РАМН для исследования доноров и больных на наличие гепатитов, СПИД, цитомегаловирусных и других вирусных инфекций. Для обнаружения плазменнорастворимых HLA антигенов до настоящего времени он не применялся. Для того чтобы метод ИФА можно было использовать в этих целях, потребовалась его модификация. Она состояла в том, чтобы на 1 этапе происходило образование комлекса «моноклональное антитело - плазменнорастворимый антиген». Для этого инкубацию исследуемой сыворотки с антителом W6/32 проводили в отдельной планшете. Было необходимо подобрать разведения моноклонального антитела и конъюгата и определить, какие из них являются рабочими. При этом учитывали рекомендации фирмы-производителя используемых тест-реагентов. Ниже представлено подробное описание модифицированной методики. 13 Лимфоциты выделяли из гепаринизированной венозной крови по стандартной методике в градиенте фиколла (Ficoll Histopaque, "Sigma") . Исследуемые сыворотки крови были получены от доноров и больных до трансплантации гемопоэтических стволовых клеток и в различные сроки после трансплантации (до +919 дня). Пробирку с 5 мл венозной крови без стабилизатора ценрифугировали 15 мин при З тыс. об/мин, после чего отбирали сыворотку в микропробирки типа «эппендорф» для хранения. Сыворотки хранились в морозильнике при температуре -20°С. Коммерческие продукты. Моноклональное антитело W6/32, реагирующее с мономорфным эпитопом α-цепи молекулы HLA человека I класса (HLA-A, B, C) и молекулярной массой 44-45 kDa - коммерческий продукт фирмы «Сорбент», представляет собой мышиное антитело к HLA человека I типа. Были использованы рабочие разведения 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1000. Положительный контроль, содержащий антигены системы HLA I типа, был предоставлен доктором Jankowska- Gan E (University of Wisconsin Hospital and Clinics). Анти-мышиный коньюгат IgG козы к антителу W6/32, меченный пероксидазой хрена (фирмы «Сорбент»), использовался в рабочих разведениях 1:800, 1:1000, 1:2000, 1:3000, 1:4000, 1:6000. Постановка ИФА. Метод ИФА выполнялся согласно рекомендациям фирмы «Сорбент». В лунки 96-луночного планшета (MaxiSorp фирмы "Nunc") вносили 50 мкл полилизина (полимера- носителя) (в концентрации 0,5мкг/мл) и инкубировали при комнатной температуре в течение 12-18 часов (планшет 1). Затем в каждую лунку добавляли по 50 мкл клеточной суспензии, содержащей 100 - 200 тыс. лимфоцитов. В результате на дне лунок формировался плотный монослой жизнеспособных лимфоцитов, качество которого контролировали под микроскопом. В другой 96-луночный планшет вносили по 50 мкл антитела W6/32 в рабочем разведении 1:800 и по 50 мкл предварительно разведенных сывороток (цельную и в разведении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32) (планшет 2). Оба планшета помещали в термостат UB6 14 "Kendro" и инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Затем планшет с сорбированными лимфоцитами 3 раза промывали PBS-T (фосфатно-солевым буфером с 0.1% тритона X- 100, рН 7.4) на автоматическом отмывателе Washer Columbus фирмы "Тесаn". Из планшета 2 в планшет 1 вносили по 50 мкл смеси антитела с сывороткой и помещали в термостат на 1 час, после чего трижды отмывали раствором PBS-T. Затем в лунки планшета 1 вносили по 50 мкл конъюгата в разведении 1:4000. Планшеты инкубировали 60 минут при 37°С, затем 5-кратно отмывали в PBS-T. Субстрат (тетраметилбензидин) растворяли в цитратном буфере, содержащем перекись водорода, до концентрации 0.5 мг/мл и вносили в лунки по 50 мкл. Планшет помещали в темное место на 15±5 минут и останавливали реакцию добавлением в каждую лунку 100 мкл 2N серной кислоты. Степень оптического поглощения образцов измеряли на спектрофотометре «Multiskan» фирмы «Labsystems» при длине волны 450 нм. Результаты ИФА оценивали количественно по величине S/N, т.е. по отношению оптической плотности образца (S) к оптической плотности положительного контроля (N). Значение S/N принимали в качестве коэффициента реактивности каждой сыворотки с антителом. Коэффициент реактивности менее 2,3 свидетельствовал о высокой концентрации плазменнорастворимых антигенов в образце, и расценивался нами как Коэффициент Jankowska- Gan E). свидетельствовал положительный о низкой (по рекомендациям реактивности концентрации от 2,3 и д-ра более плазменнорастворимых антигенов в образце, и расценивался нами как отрицательный. В дальнейшем оперировали именно этими коэффициентами. Изучение других иммуносерологических показателей. Помимо определения значения плазменнорастворимых антигенов в диагностике РТПХ представлялось интересным оценить значение и некоторых изучались других иммуносерологических динамика эритроцитарного показателей. химеризма, В частности, естественных 15 изогемагглютининов, частота образования в посттрансплантационном периоде антиэритроцитарных и антилимфоцитарных антител. Динамику приживления костного мозга изучали по эритроцитарным антигенам системы АВ0 и резус с помощью иммунологического метода дифференциальной агглютинации эритроцитов. Объектом исследования служили эритроциты периферической крови, взятые с добавлением гепарина 0,2 мл (1 мл – 5 тыс. Ед.). Для исследования уровня естественных изогемагглютининов использовали сыворотку крови пациента, полученную после ретракции сгустка. С целью выявления различий перед ТКМ по эритроцитарным антигенам систем АВ0 и резус пары донор-реципиент типировали методами агглютинации на плоскости и солевой агглютинации. При этом отмечали исходное наличие неагглютинированных эритроцитов, что могло быть связано с проводимой до ТКМ трансфузионной терапией (антигены системы резус, кроме D, которые не учитываются при проведении трансфузий). Исследования проводили с периодичностью 1 раз в неделю. Подробное описание метода дано в статье Порешиной Л.П.(2004 г.) При различиях по антигенам системы резус, MN и другим между донором и реципиентом использовали качественную оценку. Для этого применяли непрямую пробу Кумбса и реакцию агглютинациии эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами (фицин). Определение титра естественных изогемагглютининов в сыворотках реципиентов проводили в реакции солевой аггютинации. Прямой антиглобулиновый тест применяли при исследовании эритроцитов пациентов для выявления фиксированных антител. Сыворотки всех реципиентов до и после ТКМ исследовали на наличие лимфоцитотоксических антител в лимфоцитотоксическом тесте. Описание методов «Иммуносерология» (1998г). подробно приводится в сборнике 16 Методы статистической обработки. Полученные результаты клинических и лабораторных исследований обработаны с помощью программы Excel и статистического пакета "Statistics". Для расчета статистической значимости различий между группами применены критерий хи-квадрат Пирсона, коэффициент согласия каппа, непараметрические критерии Манна-Уитни (U-критерий при участии с.н.с. Э.Г. Гемджана (лаборатория биостатистики ГНЦ РАМН; зав. лаб. тех. н. С.М.Куликов). Помимо описанных специальных методов исследования больным проводили общепринятые исследования крови и костного мозга с подсчетом гемо и - миелограмм. Эти исследования выполняли в клинико- диагностической лаборатории ГНЦ РАМН (заведующая – Тихонова Л.Ю.), иммунологическое типирование пар донор-реципиент проводили совместно с к.б.н. Р.М. Кутьиной в лаборатории иммуногематологии, реакцию смешанной культуры лимфоцитов выполняли с к.м.н. А.П. Шпаковой (лаб. клинической иммунологии, зав.- д.м.н. проф. Т.И. Булычева) ГНЦ РАМН. Основные результаты работы и их обсуждение Результаты определения ПРА методом ингибиции аллоиммунных лимфоцитотоксических анти-HLA антител. Плазменнорастворимые антигены системы HLA изучены у 43 больных, т.к. в фенотипе 6 больных не содержались антигены, специфичные анти-HLA антителам тест-реагента. Острая РТПХ диагностирована у 23 из 43 пациентов (53%), а хроническая - у 30 больных (70%), преимущественно, экстенсивной формы (у 22). Из 19 больных с ОЛ у 15 предтрансплантационное 17 кондиционирование было миелоаблативным, а у 4 пациентов – немиелоаблативным. Последний режим применен также всем 9 пациентам с МДС. При ХМЛ режим кондиционирования во всех 15 случаях был миелоаблативным. В 18 случаях диагностирована как острая, так и хроническая РТПХ. Отмечено, что у пациентов с ОЛ и МДС после немиелоаблативного кондиционирования острая РТПХ развивалась в 2 раза чаще, чем после применения бусульфана в сочетании с циклофосфаном (у 10 и 5 пациентов, т.е. в 77% и 33% соответственно, р = 0,02). Хроническая РТПХ у пациентов с ОЛ+МДС наблюдалась также преимущественно после немиелоаблативного кондиционирования в сравнении с миелоаблативным режимом (у 10 из 13 больных и у 6 из 15, т.е. в 77% и 40% соответственно, р=0,01). Отмечено, что у пациентов с ХМЛ острая РТПХ III-IV степени тяжести развивалась чаще (в 5 случаях), чем у пациентов с ОЛ и МДС, которым был также применен миелоаблативный режим кондиционирования (у 1 больного); р =0,06. Количество определений ПРА колебалось от 3 до 33, в среднем каждому пациенту было проведено 16 исследований. Общее количество определений равнялось 715. В контрольной группе проведено 56 исследований. Исследования проводились до начала кондиционирования, в день трансплантации гемопоэтических клеток (0 день), еженедельно в течение всего срока госпитализаций (первой и повторных), а далее в динамике во время амбулаторных исследований пациентов. Максимальные сроки исследования составили 50 мес. На протяжении первых 3 мес. исследования, в которые была диагностирована острая РТПХ, проведено 251 исследование, а в более поздние сроки, типичные для развития хронической РТПХ - 463 исследования. Плазменнорастворимые антигены обнаружены у 21 из 23 пациентов с острой РТПХ (91%). 18 При анализе частоты обнаружения ПРА у больных с острой РТПХ разной степени тяжести установлено, что частота выявления ПРА при острой РТПХ 1-2 степени тяжести составила 93% (из 23 больных), а 3-4 степени тяжести – 89%, т.е. ПРА обнаружены у большинства пациентов с острой РТПХ (табл. 1). Таблица 1 Частота выявления ПРА при острой РТПХ (n=23) Острая РТПХ Острая РТПХ I-II степени тяжести III-IV степени тяжести Число Число больных 14 Частота больных с выявления ПРА (%) 13 93 Число Частота больных с выявления ПРА (%) 8 89 Число больных 9 Подобный анализ был проведен и у больных с хронической РТПХ (табл.2). При обследовании 30 пациентов ПРА были выявлены у 29 пациентов (97%): у всех пациентов с локальной формой и в 95% случаев экстенсивной хронической РТПХ. Таким образом, и при хронической РТПХ ПРА обнаруживались практически у всех пациентов. Таблица 2 Частота выявления ПРА при различных формах хронической РТПХ (n=30) Локальная Экстенсивная 19 Число Число Частота Число Число Частота больных с больных с выявления РТПХ ПРА ПРА (%) РТПХ ПРА ПРА (%) 8 8 100 22 21 95 больных с больных с выявления У больных без острой и хронической РТПХ ПРА найдены только в 2 случаях, причем у обеих пациенток были тяжелые инфекционные осложнения. Также представляло интерес установить, можно ли использовать наличие ПРА для ранней диагностики РТПХ. Для этого были сопоставлены сроки выявления ПРА и диагностики острой РТПХ при разных режимах кондиционирования. Оказалось, что у подавляющего большинства пациентов эти сроки совпадали (табл. 3). Иными словами, в большинстве случаев острой РТПХ наличие ПРА не может использоваться в целях ранней диагностики этого осложнения. Таблица 3 Сроки выявления ПРА и диагностики острой РТПХ (M ±m , дни) Режим Число Сроки Сроки Диагноз больных выявления появления n=17 ПРА РТПХ 3 54,3± 3,8 56±3,0 > 0,05 5 31± 6,1 33,8±4,4 > 0,05 Р миелоаблативный ОЛ миелоаблативный ХМЛ 20 немиелоаблативный ОЛ+МДС 9 39,6±7,3 46,4±9,0 >0,05 В то же время изучение сроков выявления ПРА и диагностики хронической РТПХ у пациентов, у которых была только хроническая РТПХ, показало, что ПРА появлялись статистически достоверно раньше, чем симптомы хронической РТПХ. Эти данные позволяют заключить, что у больных без острой РТПХ с наличием ПРА существует большая вероятность развития хронической РТПХ (табл. 4). Таблица 4 Сроки выявления ПРА и диагностики хронической РТПХ (M ±m , дни) у больных только с этим осложнением Появление ПРА 61 ± 8,12 Диагностика хронической РТПХ 149 ± 14,8 Р < 0,001 О зависимости уровня ПРА от степени тяжести РТПХ можно судить по числу пациентов с максимальным истощением тест-реагента, то есть снижением титра антител на 3-4 разведения. Таких больных при острой РТПХ III-IV степени тяжести было достоверно больше, чем при I-II степени тяжести (табл. 5). Зависимости уровня ПРА от степени тяжести локальной и экстенсивной хронической РТПХ не выявлено. Таблица 5 Зависимость уровня ПРА от степени тяжести РТПХ Число Больные с максимальным исследованных истощением тест-реагента больных 21 Группы больных больных Число % 14 4 29* 9 8 89* Острая РТПХ I-II ст. тяжести Острая РТПХ. III-IV ст. тяжести Примечание: * - статистически достоверные данные При обследовании лиц контрольной группы (8 пациентов после аутологичной трансплантации стволовых клеток и 17 доноров костного мозга) ПРА не выявлены. Таким образом, на основании проведенного анализа можно заключить, что методом ингибиции анти - HLA антител ПРА выявлены у большинства пациентов с острой и хронической РТПХ, что может использоваться в диагностике этих осложнений (рис.1). Больные без острой РТПХ, у которых выявляются ПРА, имеют высокий риск развития хронической РТПХ; у больных с острой РТПХ уровень ПРА соответствует степени ее тяжести. Больная М.В.В. 3,5 3,5 3 3 2,5 2,5 ПРА ПРА 2 2 ПРА 1,5 1,5 ОСТРАЯ РТПХ 1 1 0,5 0,5 0 РТПХ 0 до ТКМ +15 +28 +43 +50 до ТКМ +55 +82 Дни ТКМ Дни ТКМ 3,5 3 2,5 ПРА ПРА Больная А.М.А. 2 ПРА 1,5 +120 210 22 Больной У.Г.Д. Рисунок 1 . Динамика плазменнорастворимых антигенов у больных с различной формой РТПХ. Из приведенных клинических примеров видно, что до ТКМ ПРА у этих пациентов не выявлялись и были обнаружены у больной А.М.А. во время острой, у больного У.Г.Д.- хронической РТПХ, и у больной М.В.В. в период острой, а затем и хронической РТПХ. Выявление ПРА методом иммуноферментного анализа (ИФА) При исследовании 88 образцов сывороток, полученных от 15 больных и 14 доноров костного мозга, ПРА были обнаружены у 7 из 8 пациентов с РТПХ, что составило 87%. При сравнении результатов определения ПРА методом ИФА и ингибиции анти- HLA антител у больных с и без РТПХ показано, что частота выявления ПРА при использовании двух этих методов существенно не различалась (табл. 6). Таблица 6 Результаты определения ПРА методами ИФА и ингибиции анти HLA антител 23 Методы определения ПРА Частота выявления ПРА при РТПХ (%) иммуноферментный 87 ингибиции анти HLA 91 антител Для более точной оценки корреляции результатов исследования ПРА методами ИФА и ингибиции анти - HLA антител был проведен статистический анализ данных с помощью коэффициента согласия каппа, который подтвердил, что оба метода являются чувствительными для выявления ПРА и коррелируют между собой (табл. 7). Таблица 7 Сравнение методов определения ПРА с помощью коэффициента согласия каппа Коэффициент Методы определения ПРА ложно ложно всего положительные отрицательные ошибок согласия каппа (95% доверительный интервал) с РТПХ ИФА 5 (20%) 1 (3,6%) 6(11,3%) 2 (8%) 0 (0%) 2 (3,8%) 0,77 (0,60-0,94) с ИФА 1,0 Метод ингибиции анти- HLA антител 0,92 (0,82-1,0) 0,84 Специальный раздел исследований был посвящен изучению других иммуносерологических показателей: динамики эритроцитарного химеризма, 24 антиэритроцитарных антител антиглобулиновый (прямой тест), естественных изогемагглютининов. Количество эритроцитов донорского фенотипа в крови реципиентов без острой РТПХ, а также с острой и хронической РТПХ проанализировано в сравнении на +30,+60 и +90 дни. Оказалось, что при ежемесячном исследовании количество донорских эритроцитов у больных с и без РТПХ не имело отличий. Таким образом, темп увеличения содержания эритроцитов донорского фенотипа не оказывал влияния на развитие РТПХ (рис. 2). 90 Количество эритроцитов донорского фенотипа, % 60 Хроническая РТПХ Острая РТПХ 30 Без острой РТПХ 0 30 60 90 дни после ТКМ Рисунок 2. Количество эритроцитов донорского фенотипа после миелотрансплантации, (%). При анализе частоты обнаружения антиэритроцитарных антител установлено, что у больных с РТПХ число положительных и отрицательных результатов прямой пробы Кумбса было практически одинаковым, то есть 25 появление положительной прямой пробы Кумбса нельзя связать с развитием РТПХ. В то же время обнаружена зависимость положительной пробы Кумбса от АВ0-совместимости донора и реципиента. Установлено, что при большой несовместимости число больных с положительной прямой пробой Кумбса было достоверно большим, чем в совместимой группе (рис.3). Положительная прямая проба Кумбса, % 70 60 50 40 Большая несовместимость 30 Малая несовместимость 20 Совместимые 10 0 1 Совместимость по АВ0 системе Рисунок 3.Частота положительной прямой пробы Кумбса в зависимости от АВ0-совместимости донора и реципиента При анализе естественных изогемагглютининов показано, что у больных, у которых группа крови уже сменилась на донорскую, антитела могут быть донорского типа, типа реципиента или вообще отсутствовать. Частота развития РТПХ у пациентов этих групп не имела достоверных отличий. Антилимфоцитарных аутоантител не было обнаружено ни в одном случае. 26 Таким образом, не выявлено связи между наличием антиэритроцитарных антител, динамикой эритроцитарного химеризма, естественных изогемагглютининов и развитием РТПХ. Выводы. 1. При исследовании 49 пациентов с гемобластозами установлено, что наличие плазменнорастворимых HLA антигенов может использоваться для диагностики острой и хронической формы реакции трансплантат против хозяина, при которой методом ингибиции анти-HLA антител они выявлены у 21 из 23 (91%) и 29 из 30 больных (97%) соответственно и не обнаружены у большинства пациентов без этих осложнений и у всех лиц контрольной группы. 2. Модифицирован и впервые в отечественной практике применен для выявления плазменнорастворимых антигенов метод иммуноферментного анализа, с помощью которого они обнаружены у 87% пациентов с реакцией трансплантат против хозяина и не найдены у всех больных без этого осложнения и доноров, что совпадает с результатами, полученными методом ингибиции анти-HLA антител. 3. Установлено, что появление плазменнорастворимых антигенов у больных без острой реакции трансплантат против хозяина (в среднем на 61,0±8,12 дни) имеет прогностическое значение для развития хронической формы реакции трансплантат против хозяина (в среднем на 149,0±14,8 дни, р < 0,05), которая наблюдалась у всех таких пациентов. 4. Получены данные, свидетельствующие плазменнорастворимых антигенов о степени соответствии уровня тяжести реакции трансплантат против хозяина: при острой форме III-IV степени тяжести максимальный уровень плазменнорастворимых HLA выявлялся в 3 раза чаще, чем у больных с I-II степенью тяжести этого осложнения (89% против 29%, р < 0,05). 27 5. По данным исследования эритроцитарного химеризма на +30, +60 и +90 дни влияния темпа нарастания донорских эритроцитов в крови реципиентов на развитие реакции трансплантат против хозяина и степень ее тяжести не установлено. 6. Взаимосвязи между появлением у больных антиэритроцитарных антител, характером замещения естественных изогемагглютининов реципиента на донорские в результате изменения его группы крови и развитием реакции трансплантат против хозяина не выявлено. Список опубликованных работ по теме диссертации 1. Васильева М.Н., Порешина Л.П., Головкина Л.Л., Голубенко Р.А., Любимова Л.С.// Плазменнорастворимые HLA антигены в сыворотках больных после алломиелотрансплантации. Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии (Материалы Российской научнопрактической конференции.С-П., 8 – 10 июня. 2004. С.140. 2. Голубенко Р.А., Васильева М.Н., Порешина Л.П., Любимова Л.С.. Плазменнорастворимые HLA антигены в сыворотках больных после трансплантации аутологичного костного мозга. Проблемы гематологии и переливания крови, 2005, 1, стр.30. 3. Порешина Л.П., Васильева М.Н., Голубенко Р.А., Бурцев А.А., Любимова Л.С., Савченко В.Г. Зависимость развития реакции «трансплантат против хозяина» от типа эритроцитарного химеризма. Проблемы гематологии и переливания крови, 2005, 1, стр.50. 4. Golubenko R., Lubimova L., Poreschina L. Soluble HLA-antigens in serum of patients who underwent autological bone marrow transplantation. Abstract, EBMT 2006, P 486. 5. Голубенко Р.А., Васильева М.Н., Порешина Л.П., Любимова Л.С., Кутьина Р.М., Головкина Л.Л., Савченко В.Г. Плазменнорастворимые HLA у реципиентов костного мозга. Проблемы гематологии и переливания крови, 2005,2, стр. 26-32. 28 6. Голубенко Р.А., Гаранжа Т.А., Тихомиров Д.С., Филатов Ф.П., Любимова Л.С., Порешина Л.П., Определение ПРА иммуноферментным методом у реципиентов аллогенного костного мозга, Русский журнал, том 10 , №2, 2006г.
