получение и контроль антигенов для аллергической диагностики

ПОЛУЧЕНИЕ И КОНТРОЛЬ АНТИГЕНОВ ДЛЯ АЛЛЕРГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
ТРИХОФИТИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Щурихин Б.Г., Кухар Е.В
Трихофития часто сопровождается изменением иммунобиологического состояния
организма больного, проявляющихся в виде аллергических реакций. Для выявления
сенсибилизации к аллергенам грибкового происхождения применяются пробы, при которых
аллерген вводится внутрикожно, либо проводится эпикутанная или эпидермальная проба [1].
Кожные пробы ранее были одним из популярных методов диагностики микозов. Для их
постановки до начала 90-х годов прошлого столетия был налажен производственный выпуск
отдельных грибных аллергенов в России, но в настоящее время он прекратился, и теперь, там
где есть возможности, аллергены изготавливают в лабораторных условиях [2].
Для диагностики дерматомикозов в различное время предлагались аллергены, антигены
и сывороточные препараты. Также в качестве специфических аллергенов для выявления
микогенной сенсибилизации могут применяться вакцины из убитых грибов, фильтраты,
белковые и полисахаридные извлечения жидких культур [3].
Для приготовления аллергенов из дерматофитов (трихофитин, фавин, микроспорин)
авторами предложено несколько методов: Плато, Плято-Нейссера, Блоха и Массини,
Блументаль-Гаупт, Блоха, Лабушера и Шаафа.
Метод Плато является относительно простым методом. По Плато гриб выращивают на
сахарном бульоне при комнатной температуре 2-3 месяца. Выросшую пленку гриба
размельчают, фильтруют, добавляют 0,25% фенола и разливают по ампулам [4].
Методом Плято-Нейссера из патогенных мицелиальных грибов аллерген получают
после культивирования на среде Сабуро в течение 3 месяцев при 26° С. По окончанию срока
культивирования пленку гриба растирают, добавляют культуральную жидкость и 0,25-0,5%
фенола. Полученную кашицеобразную массу встряхивают на шуттель-аппарате, ставят на 24
часа в термостат, затем фильтруют 5.
Согласно методу Блоха и Массини гриб выращивают на бульоне, пленку растирают с
песком (кизельгуром) до полного размельчения грибницы; кашицу прессуют винтовым или
гидравлическим прессом, а сок фильтруют через свечу Шамберляна и разливают фильтрат по
ампулам.
Метод Блументаль-Гаупт основан на том, что 4-5 недельную культуру гриба фильтруют
через свечу Беркефельда, затем массу гриба растирают и помещают на 48 часов в шуттельаппарат, после этого центрифугируют 2 часа при 2-3 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость
смешивают с этиловым спиртом, осадок высушивают и растворяют в физиологическом
растворе. В данном случае получается 2 антигена: первый, так называемый токсин, полученный
после фильтрации культуры через свечу, который может быть использован как аллерген, и
второй, полученный из эндотоксина после центрифугирования и осаждения этиловым спиртом.
При получении аллергенов методом Блоха, Лабушера и Шаафа культуру гриба
выращивают 3-4 месяца на мальтозном бульоне, после чего растирают со снегом угольной
кислоты или песком, центрифугируют в течение 2 часов, фильтруют. Полисахариды в
фильтрате несколько раз осаждают метиловым спиртом. Отделенный центрифугированием
осадок высушивают и растворяют в физиологическом растворе до желаемой концентрации [6].
Сообщается об использовании методов замораживания-оттаивания, воздействия
трихлоруксусной кислотой по методу A. Boivin, M. Mesrobeanu (1936) и обработке биомассы
грибов ацетоном по Cruickshank C.N. (1961) при изготовлении аллергенов из Т. verrucosum, T.
mentagrophytes, T. equinum [7].
Стерильность аллергенов достигается повторным прогреванием в водяной бане в
течение 1 часа при 70-80° С. В качестве консервантов для всех аллергенов используется 0,25%ный раствор фенола или мертиолят (1:10 000). Для определения минимальной дозы все
аллергены стандартизируют биологическими методами на экспериментальных животных,
больных и здоровых людях [4, 5].
С. Сейфуллин атындағы ҚазАТУ –ң Ғылым жаршысы /
Вестник науки КазАТУ им. С.Сейфуллина. – 2011. - № 2 (69).- С. 50-56.
Целью нашей работы было получение и контроль антигенов для аллергической
диагностики трихофитии крупного рогатого скота.
Материалы и методы исследований
Аллерген получали методом Плято-Нейссера [4].
Антиген с преимущественно белковыми компонентами получали модифицированным
нами методом L. Табатабай et all. (1979) [8].
Контроль физических и биологических свойств аллергенов проводили по общепринятой
схеме [9].
Для контроля безвредности, апирогенности, токсичности аллергена были использованы
мыши беспородные 6-8 недельного возраста в количестве 10 голов; мыши в количестве 20
голов для постановки аллергической реакции.
Условия содержания животных в контрольной и опытных группах были одинаковыми.
Состав кормовой смеси выдерживался в соответствии с принятыми рекомендациями по
кормлению лабораторных беспородных мышей. Доступ к кормам и воде был свободным.
Аллерген, полученный по методу Плято-Нейссера, и белковый антиген, полученный по
методу L. Табатабай et all. (1979) в нашей модификации, использовали для постановки
аллергической пробы [4].
Результаты исследований и краткое обсуждение
Для получения аллергена мицелий гриба Т. faviforme, выращенный на среде Сабуро в
течение 3 месяцев отделяли от культуральной жидкости, помещали в стерильную ступку и
растирали со стерильным стеклом. После измельчения мицелия в ступку добавляли
культуральную жидкость до получения кашицеобразной массы. Грибную массу переносили в
колбу, встряхивали в течение часа и устанавливали в термостат при 37° С на 24 часа. Жидкость
фильтровали через асбестовый фильтр, консервировали фенолом до 0,5% концентрации,
фильтрат разливали по флаконам, укупоривали, хранили при 4 С.
Технологическая схема получения аллергена представлена на рисунке 1.
Культивирование дерматомицета на среде
Сабуро 3 месяца при t 28 С
Сырой мицелий
Измельчение в ступке до однородной массы
Встряхивание в течение часа шуттель-аппаратом
Помещение на 24 часа в термостат при t 37 С
Фильтрация через асбестовый фильтр
Консервирование аллергена
Разлив по флаконам
Рисунок 1 – Технологическая схема получения аллергена по Плято-Нейссеру
У полученного аллергена определяли концентрацию белка по Бредфорду, углеводов –
серно-фенольным методом пробой Молиша. Результаты исследований показали, что с 1 г
сырого мицелия получали в среднем 0,452 мл препарата аллергена Плято-Нейссера с
концентрацией углеводов 2,5  0,02, что составило 0,25% от общего количества биомассы.
Концентрация белка в препарате составляла в среднем 0,125  0,02, или 0,013%. Отношение
углеводов к белкам составило 20:1.
Белковый антиген получали щадящим методом по L. Tabatabai et all. (1979) в нашей
модификации, которая заключалась в дополнительном этапе предварительной обработки
мицелия перед непосредственным выделением белка. Мицелий обрабатывали раствором
фенола для максимального освобождения от полисахаридных компонентов, составляющих
основную часть клеточной стенки дерматомицета.
Выход белкового антигена, после модификации нами метода L.Tabatabai et all. (1979),
составил 0,375 мг/мл, то есть, с 1 г биомассы было получено 1,5 мл антигенного препарата со
средней концентрацией белка 0,25 мг/мл.
Общая технологическая схема получения белкового антигена по разработанной нами
технологии представлена на рисунке 2.
Полученные препараты стандартизировали по содержанию основного вещества – по
концентрации углеводов или белков. Хранили препараты при 4° С в условиях бытового
холодильника.
Культивирование дерматомицета
14 суток при t 28 С

Получение сырой мицелия

Экстракция водным раствором фенола
30 минут при t 65-68 С

Центрифугирование
при 3 500 оборотах/15 мин

Получение сырого мицелия

Экстракция цитратным буфером
16-20 часов при t +37 С
и непрерывном перемешивании

Центрифугирование
при 3 000 оборотах/20 мин

Отбор супернатанта

Центрифугирование
при 3 000 оборотах 20 мин

Отбор супернатанта

Консервирование белкового антигена
20% азидом натрия
Рисунок 2 – Технологическая схема получения белкового антигена дерматомицетов
Контроль физических и биологических свойств аллергена проводили по общепринятой
схеме через 10 суток после разлива, укупорки аллергена во флаконы и установки на хранение.
Препараты в дальнейшем использовали для постановки аллергической пробы.
Физические свойства определяли визуально по следующим параметрам: прозрачность,
мутность, цветность, однородность, наличие примесей, запах, осадок, рН.
Аллерген Плято-Нейссера представлял собой раствор, имеющий вид прозрачной
жидкости светло-желтого цвета с легким запахом фенола. При проверке аллергена во флаконах
до их вскрытия установлено: жидкость оставалась однородной, прозрачной, светло-желтого
цвета, без осадка и опалесценции. После вскрытия ампулы определили наличие слабого
характерного запаха фенола, рН – 6,8.
Белковый антиген представлял собой прозрачный, слегка опалесцирующий раствор с
легким запахом фенола. Во флаконах раствор однородный, без наличия осадка и примесей.
После вскрытия флакона определяется наличие характерного запаха фенола, рН – 6,4.
Стерильность аллергенов проверяли методом посевов на стандартные питательные
среды: МПБ, МПА, МППБ под вазелиновым маслом, на среду Сабуро при 37-38° С. Препараты
вносили в количестве 0,5 мл в каждую чашку Петри и 0,1 мл – в пробирку. Посевы
выдерживали при +26 и +37° С в течение 10 суток. Проверка на стерильность показала
отсутствие контаминации посторонней микрофлорой и плесневыми грибами.
Безвредность препаратов проверяли на белых мышах 6-8 недельного возраста,
подобранных по методу аналогов, весом 15±0,5 г. В опыте оценивались следующие параметры:
живая масса, наличие изменений на кожных покровах, аппетит, шерстный покров.
Опытным животным вводили внутрибрюшинно по 0,3 мл различного аллергена.
Контрольным животным вводили фенолизированный физиологический раствор. Период
наблюдения составил 15 суток. Состояние мышей впервые сутки было в пределах нормы.
Животные слегка беспокоились, строили гнезда, аппетит не пропал, жажда не наблюдалась.
Через сутки состояние нормализовалось, мыши вели себя спокойно, поедали корм и пили воду
без особенностей. При клиническом осмотре животных к 10-м суткам все мыши остались
живыми, у животных опытных групп улучшился аппетит, шерстный покров очистился, мыши
прибавили в весе, были активны и энергично двигались. Снижения веса не отмечалось, средний
вес составил 15±0,34 г. Данные опыта позволили сделать заключение о безвредности
препарата.
Постановку аллергической пробы проводили на белых мышах, кроликах и телятах, для
чего создавали опытные группы по методу пар аналогов. В качестве аллергенов использовали
препарат-аллерген, изготовленный по методу Плято-Нейссера, и белковый антиген,
полученный по методу Табатабай (1979).
При постановке аллергической пробы применяли накожную пробу со скарификацией и
внутрикожный метод введения аллергена. Аллерген вводили с правой стороны шеи, а антиген –
с левой. Участок кожи, предварительно освобожденный от волос, протирали 70% этиловым
спиртом. Наносили каплю испытуемого раствора, проводили скарификацию кожи и втирали
раствор стеклянной палочкой. При внутрикожном введении иглу вводили отверстием вверх в
толщу кожи под острым углом к её поверхности. При правильном введении иглы инъецируемая
жидкость поднимала верхний эпителиальный слой, и на месте введения образовывался
пузырек.
Дозу введения подобрали ранее эмпирическим путем: мышам – 0,01 мл, кроликам – 0,1
мл, телятам – 0,2 мл.
Результаты аллергической пробы учитывали через 1, 24, 48 и 72 часа. Учет результатов
аллергической пробы проводили по схеме, предложенной Елиновым Н.П. Индекс 2+ оценивали
как положительная реакция, индекс 3+ оценивали как резко положительная реакция [2].
Результаты постановки аллергической пробы на беспородных белых мышах, животных
предварительно иммунизированных вакциной ЛТФ-130, представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Результаты аллергической пробы на белых мышах
Метод
введения
накож
в/кож
Средний диаметр эритемы на месте введения аллергенов, мм (М±m) после
введения через
1ч
24 ч
48 ч
72 ч
1ч
24 ч
48 ч
72 ч
полисахаридный
Белковый
4,6±0,1
4,75±0,05
4,75±0,05
4,8±0
-
Нами установлено, что аллергическая реакция у иммунных мышей при скарификации и
внутрикожном введении аллергенов проявлялась в течение 30-35 минут после введения.
Аллергическая реакции кожи немедленного типа проявилась в течение получаса в виде
эритемы до 5 мм, которая исчезла после 2 часов. Цианоз кожи на месте введения сохранялся в
течение 24 часов. При этом реакция на белковый антиген была более интенсивной и легко
учитывалась.
Для создания лабораторной модели опыта на кроликах подбирали две опытные группы
по три кролика весом около 1,8-2 кг. Животные предварительно не иммунизировались.
Отдельной группой в опыт отбирали кроликов с явной патологией кожи невыясненной
этиологии (клинически проявлялась алопецией и взъерошенностью шерстного покрова) из
стационарно неблагополучного очага по трихофитии частного сектора с. Дамса.
Животным первой опытной группы внутрикожно инсулиновым шприцем для
однократного применения вводили по 0,1 мл антигена Плято-Нейссера с правой стороны. Во
второй опытной группе кроликам аналогично ввели по 0,1 мл белкового антигена. Третьей
группе кроликов вводили оба аллергена, соответственно, на правой и левой сторонах туловища.
Одновременно с этим, с левой стороны туловища, вводился физиологический раствор, в той же
дозе. Манипуляции проводились на заранее выстриженных поверхностях кожи и обработанных
70% этиловым спиртом.
Состояние кроликов в период наблюдения было в пределах нормы. Животные вели себя
спокойно, нарушений аппетита и жажды не наблюдалось. Здоровые и больные животные
поедали корма, и пили воду без особенностей в течение всего периода наблюдения. У
животных двух опытных групп наличие эритемы и папул не выявили, следовательно, реакция
на введение аллергена отрицательная. При клиническом осмотре животных 3-ей опытной
группы на 2-е сутки отмечено: у больных кроликов на месте введения обоих аллергенов
обнаружены эритемы и папулы размером до 0,3 см, то есть наблюдается положительная
аллергическая реакция в ответ на введения аллергенов.
Следовательно, выбранная нами доза и место введения у лабораторных животных
оказались достаточными, чтобы выявить сенсибилизацию у зараженных или
иммунизированных животных и не вызвать интоксикацию организма. При этом белковый
антиген давал более выраженную аллергическую реакцию на коже.
Аллергическую реакцию на поголовье крупного рогатого скота отрабатывали на
телятах 3-4 месячного возраста в условиях ветеринарной клиники КАТУ им. С.Сейфуллина в
количестве 4 голов. Белковый антиген, приготовленный по методу L. Tabatabai et all. (1979),
вводили с правой стороны средней части шеи, внутрикожно, на заранее выстриженную
поверхность, в дозе 0,2 мл. Учет реакции производили через 48 и 72 часа.
Двое животных реагировали на введение аллергена отрицательно. У одного бычка
реакция была слабоположительная и у одного сомнительная. Клинически это выражалось в
наличие эритемы и папулы, размером более 1 см. Место введения аллергена, было, более
горячим на ощупь, чем расположенные рядом участки кожи. Через месяц у этих животных
проявилась клиническая форма трихофитии. Появление характерных трихофитийных
поражений отмечались в области головы.
Заключение
Таким образом, нами получен аллерген по методу Плято-Нейссера и белковый антиген
по модифицированному методу L. Tabatabai et all. Контроль биологических свойств позволил
установить безвредность препарата для лабораторных животных и отсутствие контаминации.
Установлено, что антиген, полученный по методу Плято-Нейссера, и белковый антиген по
методу L. Tabatabai et all., обладают аллергенными свойствами. Получение антигенов не
требует дорогих реактивов и доступно в условиях любой лаборатории. Отработана доза
введения аллергена для крупного рогатого скота, равная 0,2 мл, место введения – средняя часть
шеи. Учёт результатов аллергической пробы для диагностики трихофитии крупного рогатого
скота может проводиться как визуально, так и с помощью кутиметра.
Литература
1. Пыцкий В.И., Адрианова Н.В., Артомасова А.В. Аллергические заболевания. – М.:
Триада-Х, 1999. – С. 102-114.
2. Елинов Н.П. Противовоспалительные, антисептические и химиотерапевтические
средства // В кн.: Блинов Н.П., Громова Э.Г. Современные лекарственные препараты. – СПб,
2000. – С. 591-595.
3. Сорокалетова В.М. Биологические препараты, используемые для иммунотерапии и
иммунопрофилактики болезней животных // Метод. указания к лабораторным занятиям. –
Новосибирск, 2005. – 20 с.
4. Курасова В.В., Костин В.В., Малиновская Л.С. Методы исследования в ветеринарной
микологии. – М., 1971. – 312 с.
5. Дудка И.А., Вассер С.П., Элланская И.А. и др. Методы экспериментальной
микологии / Справочник. – Киев, 1982. – С.122-415.
6. Фейер Э., Олах Д., Сатмари Ш. и др. Медицинская микология. – Бутапешт, 1966. – С.
15-233, 390, 566-577, 795-799, 867-868.
7. Салах Эль Дин Абдель Карим Али. Биологические свойства возбудителей
дерматомикозов животных – T. verrucosum, T. mentagrophytes, T. equinum при различных сроках
культивирования: автореф. … канд. вет. наук:. 16.00.03. – М., 1980. – С. 3-5.
8. Tabatabai L.B., Deyoe B.L. Isolation and characterisation of toxic fractions from Brucella
abortus // Infect. Immunity. – 1979. – Vol. 26, №3. – Р. 668-679.
9. ГОСТ 4.492-89 – Система показателей качества продукции. Препараты
биологические ветеринарные. Номенклатура показателей.
Түйін
Авторлардың Плято-Нейссер әдісі бойынша алынған аллергені және өздерінің
модификациялаған L. Tabatabai et all. әдісі бойынша алған ақзатты антигенінің аллергендіқ
қасиеті бар. Биологиялық қасиеттерін зерттеу барасында препараттың стерилді және қауіпсіз
екені анықталды. Антигенді алу әдісі қымбат реактивтерді қажет етпейді және кез келген
зертхана жағдайында жүргізуге болады.
Ірі қара малдың трихофитиясын балау үшін аллергиялық реакцияның қойылымы
оңтайландырылды. Аллергенді ірі қара малға енгізу мөлшері – 0,2 мл, енгізу орыны –
мойынның ортанғы аумағы. Ірі қара мал трихофитиясын балау үшін койылатын аллергиялық
сыналым нәтижесін есепке алу визуалды (көзбен көру арқылы) және де кутиметр көмегімен
жүргізіледі.
Summary
Authors are received allergen on method Plato-Neisser and an albuminous antigene on method
L. Tabatabai et all., modified by us, possessing allergenic properties. The control of biological
properties has shown sterility and harmlessness of preparations. Reception of antigenes does not
demand dear reactants and is accessible in conditions of any laboratory.
Statement of allergic reaction for diagnostics trichophytosis large horned livestock is fulfilled.
A doze of introduction of allergen for large horned livestock - 0,2 ml, a place of introduction - an
average part of a neck. The account of results of allergic test for diagnostics trichophytosis large
horned livestock can be spent as visually, and by means of kutimetr.