На правах рукописи АРТЕМЕНКО ЕЛИЗАВЕТА ГЕОРГИЕВНА
advertisement
На правах рукописи АРТЕМЕНКО ЕЛИЗАВЕТА ГЕОРГИЕВНА ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЯДЕРНЫХ АНТИГЕНОВ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА, ВЫЯВЛЯЕМЫХ С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ. 14.00.29. - гематология и переливание крови 03.00.04.-биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2004 Работа выполнена в Государственном некоммерческом учреждении «Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук» НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Т.И. Булычева, доктор биологических наук О.В. Зацепина ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор В.М. Погорелов, доктор биологических наук Е.С. Надеждина ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт биоорганической Овчинникова РАН. химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Защита диссертации состоится « » 2004 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.042.02 в Гематологическом научном центре РАМН (125167, Москва, Новозыковский проезд, дом 4а). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН. Автореферат разослан « » 2004 года. Ученый секретарь диссертационного совета, старший научный сотрудник, кандидат биологических наук 2 В.Д. Реук ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Исследования клеток, проводимые методами иммуноцитохимии с использованием антител, получили очень широкое распространение как в фундаментальной клеточной биологии, так и в повседневной клинической практике. На сегодняшний день благодаря достижениям гибридомной биотехнологии в распоряжении исследователей имеется большое количество различных моноклональных антител (MICA) - стандартных и однородных реагентов, доступных для получения в лабораторных условиях в неограниченном количестве. Одной из областей их применения является изучение клеточной пролиферации, поскольку изменения в наличии или распределении различных антигенов, происходящие в клетках по ходу клеточного цикла, можно идентифицировать с помощью соответствующих антител. Помимо этого, в клинической практике количественный показатель пролиферативной активности, определяемый с помощью МКА, является важной характеристикой неопластической клеточной популяции и используется для прогнозирования скорости опухолевого роста. Антигенные структуры, экспрессия которых ассоциирована с клеточным циклом, могут быть локализованы на мембране и в цитоплазме, однако наибольший интерес вызывают ядерные антигены, так как основные изменения в процессе деления клеток сосредоточены именно в клеточном ядре. В мире получен ряд моноклональных антител к ядерным антигенам, ассоциированным с клеточной пролиферацией, часть из которых локализуется в особом компартменте клеточного ядра ядрышках. Ядрышко является обязательным структурным компонентом ядер клеток эукариотов, в котором происходит синтез рибосомных РНК и сборка прерибосомных частиц. Изменение функционального состояния ядрышка в ходе клеточного цикла сопровождается также изменением его иммуноцитохимических особенностей, что отчетливо проявляется при использовании антител к различным ядрышковым белкам. За последние два десятилетия в результате получения и применения моноклональных антител был открыт ряд новых белков, имеющих ядрышковую локализацию, антитела к которым нашли применение в клинической практике. Наиболее известным является белок Ki-67, выявляющийся в поздней G1-стадии, S, G2 и М-фазах клеточного цикла, но отсутствующий в Go-периоде (Gerdes J. et al., 1983). Кроме того, известен ряд других белков ядрышка, которые можно рассматривать в качестве возможных маркеров клеточной пролиферации. К ним, в частности, можно отнести основной ядрышковый белок В23/нуклеофозмин, а также белки, которые участвуют в транскрипции рибосомных генов. Эти белки обладают, как правило, аргентофильными свойствами и окрашивании клеток солями серебра в интерфазе и ядрышковых организаторов хромосом в митозе. Известно, что количество аргентофильных белков, определенное цитохимически на тотальных препаратах клеток или с помощью блотов в клеточных экстрактах, отражает способность клеток к пролиферации, закономерно изменяется в динамике клеточного цикла и является надежным цитохимическим маркером клеточного метаболизма в целом (Derenzini M. et al., 1990; Roussel P., Hernandez-Verdun D., 1994). Однако в литературе до сих пор отсутствуют прямые доказательства того, что локализация и количество белка В23 в клетках действительно изменяются с течением клеточного цикла, которые были бы получены с использованием антител к этому белку. В то же время, набор моноклональных антител к индивидуальным ядрышковым белкам, которые можно было бы использовать не только для изучения фундаментальных вопросов, связанных с биогенезом рибосом, но и для решения прикладных задач, на сегодняшний день является явно недостаточным. В связи с этим, детальное изучение нового моноклонального антитела ЗС9, полученного в лаборатории клинической иммунологии ГНЦ РАМН (зав. лаб. - проф. Булычева Т.И.), которое направлено к ядрышковому антигену, является на сегодняшний день крайне актуальной задачей. Целью работы явилась идентификация антигена, выявляемого новым моноклональным антителом ЗС9, а также изучение возможности использования этого антитела для анализа пролиферативной активности клеток в лабораторной и клинической практике. Задачи работы. 1. Определить электрофоретическую подвижность и описать локализацию антигена, выявляемого моноклональным антителом ЗС9, с помощью световой иммуноцитохимии. Методом иммунопреципитации выяснить возможное соответствие ЗС9-антигена основному белку ядрышка В23/нуклеофозмину. 2. Разработать оптимальную методику для иммунофлюоресцентного и иммунопероксидазного выявления антигена с помощью антитела ЗС9 на фиксированных препаратах клеток, учитывая его принадлежность к IgMклассу иммуноглобулинов. 3. Определить качественные и количественные изменения выявляемого антигена при переходе клеток из состояния покоя к пролиферации на модели первичной культуры донорских лимфоцитов, стимулированных фитогемагглютинином. 4. Провести сравнительный анализ динамики антигена, выявляемого антителом ЗС9, и известного маркера клеточного цикла белка Ki-67 при индуцированной активации лимфоцитов к пролиферации. 5. Оценить возможность использования антитела ЗС9 для анализа пролиферативной активности клеток в лабораторной и клинической практике при различных злокачественных заболеваниях системы крови. 4 Научная новизна. Установлено, что полученное моноклональное антитело ЗС9 выявляет ядрышковый белок В23/нуклеофозмин. Разработан оптимальный режим для иммунофлюоресцентного и иммунопероксидазного выявления белка В23 с помощью антитела ЗС9 на препаратах фиксированных клеток. С помощью антитела ЗС9 выявлены количественные и качественные изменения в распределении В23 в лимфоцитах периферической крови человека, стимулированных к пролиферации фитогемагглютинином. Моноклональное антитело к В23 было впервые использовано для оценки пролиферативной активности гемопоэтических клеток. Сравнительный анализ показал, что накопление белка В23 происходит уже в ранней G1-стадии, до появления в них известного маркера пролиферирующих клеток белка Ki-67. Полученные данные указывают на то, что антитело ЗС9 позволяет выявить более ранние стадии пролиферации, чем антитело Ki-67. Показаны статистически значимые различия (р<0,05) по экспрессии В23 в лимфоцитах здоровых лиц и больных различными лимфопролиферативными заболеваниями. Теоретическое и практическое значение. Полученный в лаборатории штамм гибридомных клеток ЗС9 является пригодным для создания препарата моноклонального антитела к белку В23 в лабораторном и промышленном производстве. Секретируемое им антитело может служить инструментом для фундаментальных исследований в области цитологии и молекулярной биологии. Помимо этого, оно может быть рекомендовано в качестве реагента, используемого в дополнение к существующей диагностической панели моноклональных антител для иммунофенотипирования клеток больных лейкозами и лимфомами, позволяя производить оценку пролиферативной активности патологических клеток. Иммунопероксидазная методика упрощена и адаптирована для дальнейшего широкого лабораторного использования. Отработана оптимальная методика проведения иммунофлюоресцентного окрашивания, позволяющая выявлять типичный для белка В23 характер свечения. Положения, выносимые на защиту: 1. Моноклональное антитело ЗС9 выявляет антиген, соответствующий основному ядрышковому белку В23/нуклеофозмину, и направлено к его обеим изоформам (В23.1 и В23.2). 2. На модели стимулированной фитогемагглютинином культуры донорских лимфоцитов выявлено, что белок В23 является надежным иммунохимическим маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации. Ядрышковый белок В23 начинает 5 выявляться в клетках раньше маркера репликативного периода - белка Ki67. 3. На основании клинико-лабораторного анализа обследуемых лиц (30 здоровых и 70 больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями) показана положительная корреляция между экспрессией антигенов В23 и Ki-67 (r=0,2; р<0,05). Выявлены статистически значимые различия (р<0,05) по степени экспрессии В23 в лимфоцитах здоровых лиц и больных всех нозологических форм лимфопролиферативных заболеваний, а также больных хроническим В-лимфолейкозом и лимфосаркомой. Апробация работы состоялась на заседании проблемной комиссии «Кроветворение в норме и патологии, молекулярная биология, биотехнология» Гематологического научного центра РАМН. Материалы диссертации были доложены на XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, октябрь 1999 г.), на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, июнь 2000 г., июнь 2002 г., июнь 2004 г.), на I Всероссийском съезде гематологов (Москва, апрель 2002 г.), на научно-практической конференции «Новое в гематологии и клинической трансфузиологии» (Москва, апрель 2003 г., апрель 2004 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, сентябрь 2004 г.), на Международном научном семинаре «Современная диагностика лимфопролиферативных заболеваний» (Санкт-Петербург, октябрь 2004 г.). По материалам диссертации опубликовано три статьи в центральных журналах и трое тезисов, в том числе одна статья - в зарубежной печати. Структура и объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных данных, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 244 работы, в том числе 17 отечественных авторов. Диссертация иллюстрирована 4 таблицами, 3 рисунками и 11 фотографиями. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе исследовали клетки перевиваемых линий различной видовой и тканевой принадлежности (суспензионные культуры: Daudi, Ramos, полученные из трансформированных клеток хронического Влимфоцитарного лейкоза человека; монослойные культуры: HeLa - из клеток карциномы шейки матки человека, СПЭВ - из клеток свиной почки эмбрионального возраста, ЗТЗ - из мышиных фибробластов), лимфоциты, 6 выделенные из периферической крови практически здоровых лиц (30 доноров), а также лимфоидные клетки, выделенные из периферической крови, селезенки и лимфатических узлов больных с реактивными состояниями и лимфопролиферативными заболеваниями, находящихся на лечении в клинических отделениях ГНЦ РАМН (70 человек). Клетки были использованы для постановки иммунологических реакций, культивирования, получения гибридом и так далее. Определение природы антигена, выявляемого антителом ЗС9, проводили методом иммунопреципитации в сочетании с иммуноблотированием. Для этого клетки линий Ramos и HeLa лизировали, затем лизаты иммунопреципитировали добавлением антитела ЗС9. После этого преципитаты, нанесенные на нитроцеллюлозную мембрану, инкубировали с антителами с известной направленностью к белку В23 (20В2 и анти-В23, любезно предоставленные д-ром Чаном (Dr. P. К. Chan; Baylor College of Medicine, Houston, Texas 77030, USA)), а также с ЗС9. Выявление связавшихся антител производили иммунопероксидазным методом, используя аминоэтилкарбозоль в качестве колориметрического агента. Изучение локализации антигена в фиксированных клетках проводили непрямым иммунофлюоресцентным и иммунопероксидазным методами, причем и в том, и в другом случае потребовалось отрабатывать специальные протоколы проведения реакций, учитывая, что антитело ЗС9 относится к IgM-классу иммуноглобулинов. Непрямую иммунофлюоресцентную реакцию проводили на клетках, нанесенных на 8луночные стекла, предварительно обработанные поли-L-лизином, которые затем центрифугировали для более прочного прикрепления клеток к поверхности стекла. Из-за специфических свойств антитела ЗС9 оказалось затруднительным выбрать адекватный метод фиксации клеток, который позволил бы получить в результате специфическое ядрышковое свечение. Из множества опробованных вариантов был выбран следующий: обработка 0,5 %-ным Тритоном Х-100 на фосфатном солевом буфере (PBS, рН 7,5) 5 мин, затем фиксация 2%-ным параформальдегидом на PBS 20 мин при комнатной температуре. Зафиксированные препараты клеток инкубировали с антителом ЗС9 либо с другими, затем - с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, мечеными ФИТЦ (FITC, Sigma), и докрашивали флюоресцентным красителем на ДНК, ДАПИ (DAPI, Sigma). Для выявления специфического ядрышкового окрашивания с помощью непрямой иммунопероксидазной реакции также потребовался подбор адекватной фиксации. С этой целью клеточную суспензию подготавливали и наносили на стекла, как описано выше, а затем препараты обрабатывали следующим способом: фиксация абсолютным ацетоном 10 мин при -20°С; высушивание в течение 10 сек. Зафиксированные клетки инкубировали с первыми антителами, затем - со вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, после чего на препараты наносили готовый к работе субстрат-хромоген 7 аминоэтилкарбозоль (AEG, DAKO). Полученные препараты докрашивали гематоксилином Майера. Иммунофлюоресцентные и иммунопероксидазные препараты клеток исследовали и фотографировали с помощью микроскопов "Аксиофот" (Carl Zeiss, Германия) и Leuka (Leuka, Германия). В контроле ко вторым антителам вместо первых антител использовали PBS. Для того, чтобы изучить качественные и количественные изменения выявляемого антигена при переходе клеток от состояния покоя к пролиферации, была использована модель первичной культуры лимфоцитов здоровых доноров, стимулированных фитогемагтлютинином (ФГА). Выделенные из крови лимфоциты культивировали в присутствии митогена в течение различных промежутков времени, после чего фиксировали и окрашивали иммунофлюоресцентным и иммунопероксидазным методами. Параллельно на тех же сроках проводили количественное определение белка В23 на иммуноблотах ФГА-стимулированных лимфоцитов (совместно с к.б.н. Дергуновой Н.Н.). Для этого использовали цветовое сканирование и компьютерный денситометрический анализ с применением программы «Chromo» (Dergunova N.N. et al., 2002). Помимо изучения динамики белка В23 в активированных клетках, на каждом сроке культивирования определяли степень пролиферативной активности лимфоцитов по уровню включения 3 Н-тимидина (совместно с к.м.н. Шпаковой А.П.). В качестве контроля к каждому опыту использовали лимфоциты, которые инкубировали в тех же условиях без ФГА. Первичная оценка диагностического и прогностического значения антигена, выявляемого МКА ЗС9, при различных злокачественных заболеваниях системы крови была проведена совместно с сотрудниками клинических подразделений ГНЦ РАМН. Статистическая обработка данных, полученных при исследовании экспрессии антигена, выявляемого МКА ЗС9, в различных типах клеток, проводилась с использованием статистического пакета «Statistica», v. 5.0 (совместно со ст.н.с. Э.Г. Гемджяном, лаборатория биостатистики ГНЦ РАМН). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Идентификация антигена, выявляемого моноклональным антителом ЗС9. В результате проведенной гибридизации в лаборатории был получен клон клеток, который продуцировал моноклональное антитело (МКА) ЗС9, специфически окрашивающее ядрышки в клетках Ramos после их фиксации ацетоном (рис. 1). 8 Рис. 1. Окрашивание интерфазных клеток культуры Ramos антителом ЗС9 а непрямая иммунофлюоресценция; б - соответствлющий фазовый контраст. Антитело окрашивает ядрышки (стрелки), нуклеоплазма и цитоплазма практически не окрашены Увел х2000. Начальное изучение внутриклеточной локализации антигена и предварительное определение электрофоретической подвижности давали основание полагать, что МКА ЗС9 реагирует с ядрышковым белком В23. Для окончательной идентификации антигена, узнаваемого МКА ЗС9, нами были параллельно использованы МКА 20В2 и анти-В23, обладающие доказанной специфичностью к белку В23. На Вестерн-блотах тотальных клеточных лизатов, полученных из культур Ramos и HeLa, все три антитела проявляли себя сходным образом: выявляли одну доминантную (тяжелую) и одну-две минорных (более легких) полосы в области 35-40 кДа (рис. 2). Кроме того, все антитела давали практически идентичное окрашивание методом непрямой иммунофлюоресценции ЗС9 20В2 а-В23 Рнс 2 Вестерм-блот тотальных клеточных яизатов Ramos окрашенных антителами ЗС9 20В2 и анти В23 1 2 3 Окончательно природа антигена, узнаваемого МКА ЗС9, была затем прямо установлена методом иммунопреципитации. Антиген, иммунопреципитируемый из экстрактов клеток HeLa с помощью ЗС9, реагировал с контрольными антителами к В23, 20В2 и анти-В23, демонстрируя при этом практически тот же характер окраски, что и в тотальных клеточных лизатах (рис. 3). На основании результатов иммуноцитохимического окрашивания различных клеток антителом ЗС9, иммуноблотинга и иммунопреципитации было сделано заключение о том, что МКА ЗС9 специфически реагирует с ядрышковым белком В23/нуклеофозмином. 9 Рис 3 Вестерн блот тотальных клеточных лизатов HeLa (дорожки 1 и 3) и преципитатов из лизатов клеток HeLa (дорожки 2 и 4) окрашенных антителами ЗС9 или 2082 Подбор оптимальных иммуноцитохичическш способов выявления ядрышкового антигена с помощью МКА ЗС9 Как указывалось выше, с помощью МКА ЗС9 удавалось получить специфическое иммунофлюоресцентное окрашивание ядрышек в клетках Ramos после их фиксации ацетоном, однако данный способ фиксации давал нестабильные результаты как внутри одного препарата, так и от опыта к опыту. Таблица 1 Результаты окрашивания интерфазных клеткок разных культур млекопитающих моноклональным антителом ЗС9 в зависимости от \словий их фиксации (иммунофлюоресцентный метод) Способ фиксации абсолютный ацетон 10 мин, -20° С 2% параформальдегид 20 мин, затем 0,5% Тритон X100 на PBS 5 мин, 20 °С 0,5% Тритон Х-100 на PBS 5 мин, затем 2% параформальдегид 20 мин, 20 ° С абсолютный метанол 10 мин, -20° С абсолютный метанол 10 мин, затем абсолютный ацетон 10с,-20° С Клеточные культуры Daudi I Ramos +- HeLa +- спэв | зтз +- +- -н- ++ ++ ++ - - - - - 10 Обозначения: ++ Маркируемый антиген в интерфазных клетках выявляется только в ядрышках, характер иммуномечения клеток одинаков на всей площади препарата, результаты окраски стабильно воспроизводятся от опыта к опыту; +- Характер окрашивания клеток варьирует на разных участках препарата и в разных опытах, ядрышки окрашиваются только в части клеток; Избирательное иммуномечение ядрышек в клетках отсутствует, окрашиваются нуклеоплазма и цитоплазма. Из таблицы 1 видно, что способность антитела связываться с антигеном обнаруживала сильную зависимость от условий обработки и фиксации клеток, но в одних и тех же условиях разные клетки демонстрировали идентичный характер окрашивания ядрышек. После тщательного подбора фиксаторов и условий фиксации был выработан специальный протокол иммуноцитохимического выявления ядрышкового антигена с помощью МКА ЗС9. Из всех использованных вариантов только предварительная обработка клеток 0,5 % раствором Тритона Х-100 с последующей фиксацией 2 % параформальдегидом позволяла получать стабильное и специфическое окрашивание ядрышек во всех использованных типах клеток. В данных условиях контрольные антитела анти-В23 и 20В2 окрашивали ядрышки так же, как ЗС9, то есть ярко и практически однородно, при этом флюоресценции цитоплазмы в интерфазных клетках не наблюдалось. В работе было уделено особое внимание разработке оптимального протокола проведения иммуноцитохимической реакции с использованием вторых антител, меченых пероксидазой хрена, для того, чтобы обеспечить возможность применения МКА ЗС9 в рутинных лабораторных исследованиях. Было установлено, что способность антител связываться с антигеном так же, как и в случае непрямой иммунофлюоресценции, обнаруживала сильную зависимость от условий обработки и фиксации клеток. При фиксации клеток 2% параформальдегидом с последующей пермеабилизацией Тритоном Х-100 или ацетоном, а также в случае последовательной фиксации метанолом и ацетоном характер окрашивания варьировал на разных участках препарата, при этом, помимо ядрышек, часто оказывались окрашенными цитоплазма и нуклеоплазма. Из всех опробованных вариантов только обработка клеток ацетоном (-20° С, 10 мин) с последующим кратковременным (не более 30 сек) высушиванием позволяла получать стабильное и специфическое окрашивание ядрышек во всех использованных типах клеток. Изучение локализации антигена, выявляемого МКА ЗС9, в динамике клеточного цикла. Для того, чтобы описать характер иммунофлюоресцентного окрашивания клеток антителом ЗС9 в митозе, мы использовали монослойную культуру клеток HeLa, поскольку в этих клетках 11 индивидуальные стадии митоза могут быть легко идентифицированы по морфологии и после окрашивания хромосом красителем ДАЛИ. Характер иммуномечения митотических клеток HeLa антителом ЗС9 в целом оказался идентичным таковому при окраске антителами 20В2 и анти-В23. На стадии прометафазы и в метафазе антиген был локализован преимущественно вокруг митотических хромосом. Кроме того, в клетках на стадии прометафазы отчетливо была видна окраска центросом. В анафазе В23 располагался на поверхности хромосом, а также был виден в составе цитоплазматических ярко флюоресцирующих гранул, которые получили название ядрышковых дериватов. В ранней телофазе окрашивались формирующиеся ядрышки и многочисленные мелкие проядрышки; в цитоплазме сохранялись ядрышковые дериваты. В ходе телофазы количество проядрышек и цитоплазматических включений постепенно уменьшалось, так что к концу митоза характер окрашивания дочерних клеток соответствовал таковому в интерфазе. Изменения в локализации В23 в лимфоцитах при переходе от состояния покоя к пролиферации под действием фитогемагглютинина. В качестве модельной системы для изучения перехода клеток от состояния покоя к активной пролиферации были выбраны лимфоциты периферической крови человека, активированные ФГА. Клетки культивировали в присутствии митогена в течение 6, 16, 24, 48, 72 и 96 часов, после чего фиксировали и проводили иммунофлюоресцентный анализ- препаратов. В качестве контроля ко всем срокам инкубации использовали лимфоциты, которые культивировали без добавления ФГА. Для контроля за активностью пролиферации параллельно измеряли 3 уровень включения Н-тимидина на эти же сроки инкубации. Было 3 установлено, что средний уровень включения Н-тимидина в исходных и контрольных лимфоцитах колебался пределах тех же значений, что и в лимфоцитах, которые были активированы ФГА в течение 6-24 ч. Максимальное включение предшественника наблюдалось через 48-72 ч после ФГА-стимуляции, но понижалось к 96 ч. Вступление ФГА-стимулированных лимфоцитов в S-период в условиях наших экспериментов было также изучено с помощью антитела к белку Ki-67, который является известным ядерным маркером начала репликации ДНК. Первые положительно меченные анти-Кл-67 ядрышки наблюдали через 24 ч после начала активации клеток. На 48-72 ч около 80% лимфоцитов содержали положительно окрашенные ядрышки. В контрольных (ФГА-нестимулированных) лимфоцитах ядрышки окрашивались антителом ЗС9 сравнительно слабо и преимущественно по периферии. Однако в процессе культивирования лимфоцитов с митогеном характер окрашивания ядрышек резко изменялся. Первые признаки накопления В23 в ядрышках проявлялись уже через 16 ч после ФГАстимуляции. Эти изменения включали в себя увеличение интенсивности окрашивания и размеров ядрышек до 1.3-1.7 мм в диаметре. 12 Однако наиболее заметные изменения в локализации В23 наблюдали 3 в лимфоцитах на 48 и 72 ч активации, когда уровень включения Нтимидина возрастал на несколько порядков по сравнению с контролем. Кроме того, на 48-72 ч подавляющее большинство клеток имели ядрышковую локализацию Ki-67. В этих же условиях ядрышки максимально интенсивно окрашивались антителом к В23 и по своей морфологии не отличались от ядрышек активно пролиферирующих клеток линий Ramos и Daudi. Параллельно иммуноцитохимическим исследованиям, на каждом этапе культивирования был проведен количественный анализ содержания белка В23 на иммуноблотах ФГА-стимулированных лимфоцитов (рис. 4). Все изменения в характере окрашивания лимфоцитов антителом ЗС9 были подтверждены полученными количественными данными. Возрастание количества В23 демонстрировало экспоненциальную зависимость от времени. При этом на начальных этапах стимуляции (6 ч) оно было незначительным и статистически незначимым. Однако уже к 16 ч количество В23 увеличивалось примерно в два раза, и по мере инкубации клеток с ФГА продолжало постепенно возрастать. После 24 ч культивирования уровень белка В23 в лимфоцитах начинал стремительно подниматься, и к 72 ч достигал максимального значения, которое в 30-50 раз превосходило изначальный показатель. Количественный анализ В23 в лимфоцитах после 72 ч инкубации с ФГА и клетках культуры Ramos показывал очень близкие значения содержания В23. часы Рис. 4. Компьютерный денситометрический анализ содержания белка В23 в неактивированных лимфоцитах, лимфоцитах после стимуляции ФГА и в клетках культуры Ramos. Каждая точка является средним значением от трех сканирований. • 13 экспериментальное определение; • ~ откорректированное (расчетное) определение; • - нестимулированные лимфоциты через 72 ч культивирования; верхняя точка (о) соответствует количеству белка В23 в клетках Ramos. Очень слабое увеличение количества В23 после 6 часов стимуляции не является статистически значимым, тогда как между остальными точками имеются статистически значимые различия (р<0,05). Экспрессия белка В23 в лимфоцитах доноров и пациентов с различными лимфопролиферативными заболеваниями (оценка с помощью непрямого иммунопероксидазного метода). После подсчета результатов иммунопероксидазного окрашивания с целью их дальнейшей обработки экспрессия антигена В23 была подразделена на 4 степени: 1. единичные клетки окрашены (<10%); 2. преобладание неокрашенных клеток (11-50%); 3. преобладание окрашенных клеток (51 - 90%); 4. практически все клетки окрашены (>90% ). В результате иммунопероксидазной реакции донорских лимфоцитов с МКА ЗС9 в некоторых клетках можно было наблюдать слабо окрашенные небольшие округлые зоны, соответствующие ядрышкам. Необходимо отметить, что при данных условиях проведения реакции в клетках культуры Ramos, использованных в качестве положительного контроля, ядрышки окрашивались интенсивно и четко. Выявлено, что основная масса донорских лимфоцитов в большинстве случаев оставалась неокрашенной. Лица, у которых клетки практически не окрашивались (1-ая степень), составили 53% от общего числа обследованных доноров, а те, у которых на препаратах наблюдали менее половины окрашенных клеток, составили 30% (1-ая и 2-ая степени экспрессии, соответственно). Доноры с 3-ей степенью экспрессии составили 17 %, при этом ни в одном случае не было выявлено максимального значения экспрессии В23, соответствующего 4-ой степени (таблица 2). Среди всех обследованных больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями ни один не принадлежал к 1-ой группе по степени экспрессии В23, к которой было отнесено большинство доноров. Среди пациентов с низкозлокачественными формами лимфопролифераций, такими, как доброкачественная форма хронического В-лимфоцитарного лейкоза, в пределах одной нозологической группы наблюдались различные варианты окрашивания, от слабого до максимально выраженного (таблица 2). В случаях же неоплазий с высоким индексом пролиферации, определяемым по мечению клеток антителом Ki67, всегда наблюдалось интенсивное окрашивание антителом ЗС9 (4-ая степень экспрессии В23) (таблица 2). 14 Таблица 2. Экспрессия В23 у лимфопролиферативными заболеваниями Нозологическая форма Норма (доноры) Реактивные состояния Хронический Влимфоцитарный лейкоз Лимфома из клеток мантийной зоны Центрофолликулярная лимфома Лимфома из клеток маргинальной зоны Волосатоклеточный лейкоз Беркиттоподобная лимфома / диффузная В-крупноклеточная лимфома здоровых лиц и больных различными Количество больных с указанной степенью экспрессии белка В23 1 степень 2 степень 3 степень 4 степень 17 9 4 2 12 5 2 9 12 2 - - 4 4 - 1 - 2 - 1 3 3 - 2 - 2 4 На ограниченном контингенте больных было проведено изучение взаимосвязи между экспрессией белка В23 и некоторыми клиниколабораторными показателями заболевания, которые учитываются при диагностике и/или прогнозировании течения болезни. В эту группу вошли экспрессия маркера пролиферации антигена Ki-67, экспрессия поверхностного активационного маркера CD38, распространенность заболевания и ответ на терапию. Выраженность этих показателей так же, как и экспрессия В23, была поделена на ранговые группы. В результате было получено, что между экспрессией В23 и Ki-67 имеется положительная корреляция (коэффициент ранговой корреляции Спирмена rs=0,2; p<0,05); между другими параметрами корреляции не обнаружено. Для выявления различий между отдельными нозологическими группами по степени экспрессии белка В23 был проведен корреляционный анализ исследуемого показателя у больных с учетом нозологии заболевания. В результате было выявлено, что группы «хронический Влимфоцитарный лейкоз» и «диффузная В-крупноклеточная лимфома/лимфома Беркитта» различаются статистически значимо (Uкритерий Манна-Уитни; р<0,05). Для других групп значимые различия не 15 обнаружены. При этом показано, что степень экспрессии В23 в группе доноров наименьшая и значимо отличается (р<0,05) от всех нозологических групп, включая лимфопролиферативные заболевания с низкой степенью злокачественности. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Основным результатом настоящей работы явилась идентификация антигена, выявляемого новым моноклональным антителом ЗС9, а также изучение возможности использования этого антитела для анализа пролиферативной активности клеток в лабораторной и клинической практике. Сравнение полученного МКА и имеющихся в нашем распоряжении лабораторных образцов антител анти-В23 и 20В2 (Chan P.K. et al, 1985; Ochs R. et al., 1983) с установленной специфичностью к белку В23 показало, что эти антитела обладают сходными, но не идентичными свойствами. ЗС9 отличается от известных антител тем, что относится к IgM классу иммуноглобулинов и при проведении реакции непрямой иммунофлюоресценции проявляет специфическую активность только в условиях экстракции клеток перед фиксацией. Очевидно, это связано с тем, что иммуноглобулины класса М (IgM) имеют сложную пентамерную организацию и большие, по сравнению с иммуноглобулинами других классов, размеры. Весьма вероятно, что в стандартных условиях фиксации клеток параформальдегидом или метанолом доступ к внутриклеточным антигенам для таких антител затруднен. Предфиксационная экстракция клеток буфером, содержащим Тритон Х-100, очевидно, делает эпитопы в молекуле В23 "открытыми" для взаимодействия с антителами. В условиях, оптимальных для работы с антителом ЗС9, контрольные антитела 20В2 и анти-В23 также окрашивали ядрышки равномерно и интенсивно, при этом флюоресценции цитоплазмы в интерфазных клетках не наблюдалось. Существенно, что артефактного перераспределения антигена в данном случае не происходило, поскольку контрольные антитела окрашивали экстрагированные и неэкстрагированные клетки сходным образом. Как нами было показано, на иммуноблотах лизатов клеток Ramos три разных антитела к В23 выявляли одну доминантную (тяжелую) и одну-две минорных (более легких) полосы в области 35-40 кДа, что хорошо соответствовало данным, полученным для МКА 20В2 и анти-В23. Такой характер окрашивания объясняется тем, что фосфопротеин В23 имеет, по крайней мере, 2 изоформы: В23.1 и В23.2 и соответственно), различающиеся по электрофоретической подвижности. Поскольку на иммуноблотах все три антитела проявляли себя сходным образом, а также давали практически идентичное окрашивание методом непрямой иммунофлюоресценции, то эти наблюдения позволили 16 предположить, что все антитела выявляют одинаковые изоформы В23. Известно, что антитело к В23, описанное Ochs с соавторами, в основном взаимодействует с фосфорилированной доминантной изоформой В23, В23.1, которая имеет электрофоретическую подвижность около 40 кДа. Мы полагаем поэтому, что ЗС9 также преимущественно взаимодействует с В23.1. В соответствии с известными данными о распределении белка В23 на разных стадиях клеточного цикла наши наблюдения также показали, что внутриклеточная локализация В23 изменялась в ходе митоза. При этом существенно, что МКА ЗС9 окрашивало митотические клетки HeLa аналогично другим антителам к В23. В наших условиях, как правило, не удавалось выявить только нуклеоплазматический (в интерфазе) и цитоплазматический (в митозе) В23. Есть все основания полагать, что эти фракции белка В23 экстрагируются при обработке нефиксированных клеток буфером, содержащим детергент. В пользу этого говорит тот факт, что в пермеабилизованных клетках В23 не выявлялся также ни одним из контрольных антител, хотя при стандартных условиях фиксации нуклеоплазматический и цитоплазматический В23 сохранялись. Известно, что при переходе клеток из состояния покоя к активной пролиферации происходят значительные изменения в распределении В23. Так, например, при исследовании ткани печени было установлено, что в усиленно делящихся опухолевых клетках количество В23 выше, чем в нормальных покоящихся гепатоцитах, примерно в 5-10 раз. Кроме того, существующие данные по взаимодействию В23 с РНК, ДНК и некоторыми белками, участвующими в регуляции клеточного цикла (Hingorani К. et al., 2000), позволяют предположить, что В23 ассоциирован с клеточной пролиферацией. В пользу этого также говорят наблюдения о том, что нарушение экспрессии В23 может приводить к дерегуляции клеточного цикла и к неконтролируемому злокачественному росту клеток. Было установлено, что белок В23 можно рассматривать в качестве маркера пролиферации в случае регенерации печени и гиперплазии печеночных клеток (Yun J. et al., 2002). В дополнение к существующим данным, результаты настоящей работы, проведенной на ФГАстимулированных лимфоцитах человека, не только показывают, что характер окрашивания ядрышка антителом ЗС9, как и количество самого белка В23, оказывается в прямой зависимости от пролиферативного статуса клеток, но и свидетельствуют о том, что эти изменения происходят до появления в клетках известного маркера репликативного периода, каким является антиген Ki-67. Многочисленные исследования взаимодействия МКА Ki-67 с различными типами клеток показали, что антиген Ki-67 экспрессируется в пролиферирующих, но не в покоящихся (Go) клетках. Методы с применением МКА Ki-67 являются достаточно популярными и доступными для клиник. Однако, необходим внимательный подход при их использовании для оценки ростовой фракции опухолевых клеток. Так, в некоторых случаях, Ki-67-позитивные клетки 17 описывают как клетки, аналогичные опухолевым, хотя в определенных тканях всегда существует ростовая фракция нормальных клеток, в частности, в зародышевых центрах лимфатических узлов. В то же время, имеются данные о том, что в некоторых случаях при использовании МКА Ki-67 существенно недооценивается ростовая фракция опухолевых клеток, в сравнении с результатами гистологического исследования. Так, например, в экспериментах на культуре ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови доноров было выявлено, что антиген, связываемый МКА Ki-67, начинает экспрессироваться в поздней Giстадии, и его уровень поддерживается в S, G2 и М-фазах клеточного цикла. Очень важно отметить, что клетки, которые переходят в G1 из G0 под воздействием митогена, на ранних этапах не содержат Ki-67, в то время как клетки, перешедшие в G1 из митоза, всегда Ki-67-позитивны (Gerdes J. et al, 1984). Из этого следует, что клетки после митоза проходят иные метаболические превращения, чем Go-клетки, впервые вступающие в цикл. Исходя из этих данных, можно предположить, что ранние стадии стимуляции митогеном, не выявляемые с помощью МКА Ki-67, представляют собой начальный этап пролиферации и не являются частью клеточного цикла. Именно поэтому наше особое внимание при изучении динамики В23 в ходе ФГА-стимуляции было направлено на изучение ранних «Ki-67-негативных» этапов активации лимфоцитов. В лимфоцитах, не стимулированных ФГА, наблюдали слабо окрашенные кольцевидные зоны, соответствующие ядрышкам. Такой характер окраски ядрышек определялся их крайне низкой транскрипционной активностью и общей архитектурой. Известно, что в нестимулированных лимфоцитах центральная часть ядрышка занята крупным фибриллярным центром, лишенным В23, а гранулярный компонент, являющийся структурным "вместилищем" В23, сильно редуцирован и смещен на периферию ядрышка (Зацепина О.В., Сметана К., 1985). По мере активации лимфоцитов к пролиферации происходили значительные изменения в распределении белка В23. Первые признаки накопления В23 появлялись уже через 14-16 ч инкубации, т.е. до вступления лимфоцитов в S-фазу и появления в них маркера репликативного периода антигена Ki-67, которое происходило только через 24 ч после начала ФГА-стимуляции. По-видимому, это накопление белка В23 связано с активацией ядрышек при вступлении клеток в Gjпериод, сопровождающийся подъемом синтеза рРНК. На поздних сроках ФГА-стимуляции (48-72 ч) ядрышки лимфоцитов по своей морфологии и характеру окрашивания не отличались от ядрышек активно пролиферирующих клеток культур Ramos и Daudi. В этих же 3 условиях уровень включения Н-тимидина достигал максимального значения, что, очевидно, свидетельствует о наибольшей пролиферативной активности клеток. Иными словами, на поздних сроках основная масса 18 лимфоцитов находилась в S-G2-nepиодаx клеточного цикла. Данное предположение подкрепляется результатами положительного Ki-67окрашивания большинства клеток, и, помимо этого, находится в полном соответствии с литературными данными о динамике изменений структуры и числа ядрышек в ответ на ФГА-стимуляцию (Petrzilka G., Schroeder Н., 1979; Wachtler F. et al., 1980,1982). Проведенный количественный анализ содержания В23 в активированных лимфоцитах полностью соответствует динамике окрашивания лимфоцитов антителом ЗС9. Первые статистически значимые различия в содержании В23 выявлены уже на сроке 16 ч. В этот период большинство клеток находилось в начальной/средней G1 -стадии клеточного цикла, и, по нашим данным, их еще нельзя идентифицировать с помощью МКА Ki-67. Уровень содержания В23 в лимфоцитах достигал наибольшего значения к 72 ч стимуляции, когда, как было показано выше, пролиферативная активность лимфоцитов максимальна, и оказывался практически таким же, как в клетках культуры Ramos. Таким образом, можно заключить, что характер окрашивания ядрышек антителом к В23 является надежным иммуноцитохимическим маркером пролиферативного статуса клеток. Более того, при дополнительном проведении количественного анализа, иммуноцитохимическое выявление В23 может быть использовано, как более ранний, чем Ki-67, маркер активации лимфоцитов, и, вследствие этого, может найти применение в клинической практике. Иммуноцитохимическое выявление основных компонентов ядрышка, таких, как белок В23, коррелирующих с пролиферативным статусом клетки, могло бы служить важным инструментом при индивидуальном изучении опухолевых патологий. Результаты, подтверждающие данное предположение, были получены для нескольких типов злокачественных новообразований, таких как карцинома простаты, прямой кишки, желудка (Bocker Т. et al., 1995; Nozawa Y. et al., 1996; You B.J. et al., 1999). Возможность подобного использования МКА ЗС9 в онкогематологии была изучена нами на клетках доноров и больных различными лимфопролиферативными заболеваниями. Для этих целей нами был выбран непрямой иммунопероксидазный метод выявления В23 с помощью МКА ЗС9. Преимуществами данного метода являются простота и доступность для большинства гематологических учреждений страны, а также практически неограниченный срок хранения препаратов. После проведения иммунопероксидазной реакции с МКА ЗС9 было отмечено, что в большинстве случаев основная масса донорских лимфоцитов оставалась неокрашенной. Полученные данные хорошо согласуются с имеющимися в литературе сведениями, касающимися морфофункциональных особенностей малоактивных ядрышек лимфоцитов (Wachtler F. et al., 1982). Характерно, что ни в одном случае не было выявлено максимальное значение экспрессии, соответствующее 4-ой 19 степени. В зависимости от природы заболевания клетки больных по частоте реагирования с МКА ЗС9 занимали промежуточное место между лимфоцитами доноров и активно пролиферирующими клетками лимфобластоидных линий (Daudi, Ramos). Важно отметить, что ни один из обследованных больных, в том числе и с неагрессивной формой заболевания, не был отнесен к 1-ой группе по степени экспрессии В23, в которой оказалось большинство доноров. Характерно, что в случаях неоплазий высокой степени злокачественности всегда наблюдали интенсивное окрашивание антителом ЗС9 (4-ая степень экспрессии В23). Статистически значимые различия по экспрессии В23 были выявлены между группами «хронический В-лимфоцитарный лейкоз» и «диффузная В-крупноклеточная лимфома/ Беркиттоподобная лимфома», а также между донорами и каждой из групп больных. Тот факт, что не во всех случаях удалось получить значимые различия, в значительной степени объясняется малочисленностью больных в группах с редко встречающимися нозологиями. Помимо этого, необходимо отметить, что больные, принадлежащие к одной нозологической группе, могут значительно различаться по некоторым клинико-лабораторным параметрам, в том числе и по пролиферативной активности патологических клеток, что может свидетельствовать о том, что классификация не всегда точно отражает природу заболевания. Обнаруженная незначительная корреляция между экспрессией В23 и Ki-67 свидетельствует о том, что стадии клеточного цикла, в течение которых выявляются данные белки, совпадают лишь частично. Это предположение находится в соответствии с полученным нами данным по динамике В23 и Ki-67 в ФГА-стимулированных лимфоцитах. Большой интерес представляет продолжение исследований в этом направлении с дальнейшим накоплением количественных данных, результатом которого может стать повышение достоверности начальных результатов исследования, а также выявление более тонких различий между отдельными нозологическими группами с помощью МКА ЗС9. Однако уже данное исследование, выявившее определенные корреляции, свидетельствует о том, что оценка количества В23 с помощью МКА ЗС9 может быть важной для диагностики различных злокачественных заболеваний системы крови, а также использоваться при прогнозировании течения заболевания. ВЫВОДЫ 1. Идентифицирован ядрышковый антиген с электрофоретической подвижностью 35-40 кДа, выявляемый моноклональным антителом ЗС9. Доказано, что он соответствует основному ядрышковому белку В23/нуклеофозмину. 20 2. Показано, что антитело ЗС9 направлено к обеим изоформам белка В23 доминирующей В23.1 (электрофоретическая подвижность 37-38 кДа) и минорной В23.2 (электрофоретическая подвижность 35-36 кДа). 3. Разработаны оптимальные условия иммунофлюоресцентного и иммунопероксидазного выявления белка В23 в различных типах клеток с учетом принадлежности антитела ЗС9 к IgM-классу иммуноглобулинов. 4. Прослежены качественные и количественные изменения в распределении ядрышкового белка В23 в динамике клеточного цикла. Установлено, что белок В23 является надежным иммунохимическим маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации. 5. На модели ФГА-стимулированной культуры донорских лимфоцитов показано, что белок В23 начинает выявляться в клетках раньше маркера репликативного периода белка Ki-67. 6. Выявлена положительная корреляция между экспрессией антигенов В23 и Ki-67 (г=0,2; р<0,05) в клетках больных с различными лимфопролиферативными заболеваниям. Обнаружены статистически значимые различия (р<0,05) по степени экспрессии В23 между группой здоровых лиц и больными каждой из нозологических форм, а также между больными с хроническим В-лимфолейкозом и В-лимфосаркомой. 1. Список работ, опубликованных по теме диссертации. Артеменко Е.Г., Булычева Т.И., Дергунова Н.Н., Малашенко О.С., Зацепина О.В., Дудник О.А. «Отечественные моноклональные антитела к ядрышковому белку В23 и их применение для анализа пролиферативной способности клеток». Цитология, 2000, №3, т. 42 (10), стр. 259-260. 2. Булычева Т.Н., Артеменко Е.Г., Дергунова Н.Н., Дудник О.А., Шпакова А.П., Малашенко О.С., Зацепина О.В. «Анализ пролиферативной активности клеток с помощью новых моноклональных антител к ядрышковому белку В23/нуклеофозмину». Цитология, 2000, №3, т. 42 (10), с. 944-954. 3. Булычева Т.Н., Артеменко Е.Г., Калинина И.А., Дергунова Н.Н., Малашенко О.С., Зацепина О.В., Дудник О.А. «Выявление ядрышкового антигена в различных клетках с использованием отечественных моноклональных антител». Клиническая лабораторная диагностика, 2000, №1, с.37-38. 4. N.N. Dergunova, T.I. Bulycheva, E.G. Artemenko, A.P. Shpakova, A.N. Pegova, E.G. Gemjian, O.A. Dudnik, O. V. Zatsepina, O.S. Malashenko. «A major nucleolar protein B23 as a marker of proliferation activity of human peripheral lymphocytes». Immunology Letters, 2002, 83, pp 6772. 21 5. Булычева Т.И., Дергунова Н.Н., Артеменко Е.Г., Малашенко О.С., Зацепина О.В. «Новая роль ядерного белка В23 как маркера ранней пролиферативной активности лимфоцитов человека». Материалы конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», 2002, стр. 102-103. 6. Булычева Т.И. , Артеменко Е.Г., Дергунова Н.Н., Шпакова А.П., Малашенко О.С., Калинина И.А., Дейнеко Н.Л., Карасева О.В., Зацепина О.В. «Новые моноклональные антитела к антигену клеточной пролиферации ядрышковому белку В23/нуклеофозмину». Проблемы гематологии и переливания крови, 2003, №2, стр. 34-35. 22 Подписано в печать 21.102004 г. Формат 60x90,1/16. Объем 1,5п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 452 Отпечатано в ООО "Фирма Блок" 107140, г. Москва, ул. Русаковская, д.1. т. 264-30-73 www.blokO1 centre.narod.ru Изготовление брошюр, авторефератов, печать и переплет диссертаций. №21509 РНБ Русский фонд 2005-4 19955
