Document 2677348
advertisement
РЕФЕРАТ Отчет 1 ч., 124 с., 47 рис., 3 табл., 202 источника. ЛАКТАПТИН, ВИРУС ОСПОВАКЦИНЫ, ОНКОЛИТИЧЕСКИЕ ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНЫЙ ВИРУСЫ, КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩИЙ ФАКТОР, ОПУХОЛЬ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, АПОПТОЗ, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС, ГЕН ТИМИДИНКИНАЗЫ, ГЕН ВИРУСНОГО РОСТОВОГО ФАКТОРА, ПРОТИВОРАКОВАЯ ТЕРАПИЯ, ИММУНОДЕФИЦИТНЫЕ МЫШИ Объектом исследований являются рекомбинантные штаммы вируса осповакцины, содержащие двойную встройку генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и противоопухолевого белка лактаптина. Целью настоящего проекта является разработка кандидатного лекарственного средства с направленной противоопухолевой иммуностимулирующей активностью на основе и апоптоз-индуцирующей рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего двойную встройку генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и противоопухолевого белка лактаптина. Будет также проведено сравнительное исследование несекретируемой и секретируемой форм лактаптина в составе рекомбинантного вируса. Секреция апоптозиндуцирующего белка может обеспечить дополнительное цитотоксическое действие на клетки, соседствующие с инфицированными рекомбинантным вирусом клетками внутри опухоли, за счет передачи лактаптина через межклеточное пространство. Основные результаты 1 этапа проекта: 1 Проведен аналитический обзор информационных источников, посвященный проблемам создания противоопухолевых препаратов на основе онколитических вирусов, селективно подавляющих рост опухоли, и природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток. Особое внимание уделено перспективным лекарственным препаратам, объединяющим способность онколитических вирусов селективно уничтожать клетки опухоли и способность природных белков и пептидов индуцировать апоптоз опухолевых клеток. 2 Проведены патентные исследования, определены технический уровень и тенденции развития средств, обеспечивающих профилактику и лечение опухолей. Предметом настоящего патентного поиска являлись онколитические вирусные векторы, несущие гены ГМ-КСФ и/или пептидов с противоопухолевой активностью, рекомбинантные штаммы онколитических вирусов с плазмидными векторами, несущими 4 гены ГМ-КСФ и/или пептидов, обладающие апоптотической активностью к раковым клеткам. Патентный поиск показал, что объект исследования обладает патентной чистотой, т.к. не нарушает действующих патентов РФ, касающихся рассматриваемого рекомбинантного штамма вируса осповакцины с противоопухолевыми свойствами. 3 Разработана методика конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса (VGF). Сконструированы плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat, pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat и pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat. Для конструирования плазмид использовался вектор pVGF-PE/L-Pat, содержащий левый и правый фланки гена С11R (кодирующего вирусный фактор роста) ВОВ штамма ЛИВП, синтетический ранний промотор Р7,5 ВОВ, ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L и полилинкер. 4 Проведено депонирование инсерционных плазмид pVGF-FR2-PE/L-Pat и pVGFSign-FR2-PE/L-Pat в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номерами Р-57 и Р-56, соответственно. Получены паспорта плазмид и Справки о депонировании. 5 Проведена препаративная наработка рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 (штамм Л-ИВП вируса осповакцины со встройкой гена ГМ-КСФ человека) методом роллерного культивирования в клетках почки африканской зеленой мартышки, аттестованных для производства вакцин в России. Проведена очистка и концентрирование вируса методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Полученный очищенный концентрированный препарат рекомбинантного штамма VVGMCSF-S1/3 является гомогенной вирусной суспензией с титром 109 БОЕ/мл. Генотип и стабильность встройки гена ГМ-КСФ в вирусном препарате была подтверждена методом ПЦР с использованием специфических праймеров на геномную последовательность и сруктурную часть гена ГМ-КСФ. 6 Подтверждена экспрессия гена ГМ-КСФ методом Вестерн-блот с использованием поликлональных кроличьих антител, выявляющих все формы ГМ-КСФ человека, включая негликозилированную внутриклеточную и высокогликозилированную секретируемую. С использованием цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека F-1 показано, что полученный рекомбинантный вирус продуцирует секретируемую форму биологически активного ГМ-КСФ человека. 7 Подведены итоги этапа и оформлена отчетная документация. 8 За счет внебюджетных средств проведена закупка материалов и оборудования для приготовления культуральных сред для наработки вируса. 5 Проведена государственная информационном фонде информационных технологий регистрация неопубликованных и систем НИОКР документов органов в в государственном ФГАНУ "Центр исполнительной власти". Регистрационный номер НИОКР 114081520030, дата регистрации 15.08.2014 г. Информация о проекте размещена на официальном сайте Получателя субсидии в сети интернет по адресу http://www.niboch.nsc.ru/doku.php/ru/science/gk. В настоящем проекте для усиления противоопухолевого эффекта лактаптина впервые использован вирус осповакцины, который и сам обладает природными онколитическими свойствами. Впервые для конструирования рекомбинантного онколитического вируса используется комбинация генов иммуностимулирующего белка (ГМ-КСФ) и апоптозиндуцирующего белка (лактаптин). Совместное введение в геном вируса генов апоптозиндуцирующего белка и ГМ-КСФ будет приводить к усилению лизиса раковых клеток, одновременному высвобождению большого количества слабо иммуногенных опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе организма. В результате выполнения проекта будут получены результаты, способные к правовой охране, а именно: инсерционная плазмида, обеспечивающая встройку гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины; и рекомбинантные штаммы вируса осповакцины с встроенными генами лактаптина и ГМ-КСФ, обеспечивающие продукцию секретируемого и несекретируемого варианта белка. Полученные в результате выполнения проекта научно-технические результаты могут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследования, а также при производстве лекарственных средств. Результаты проекта, а именно высокоспецифичные и малотоксичные противоопухолевые агенты будут востребованы фармацевтическими компаниями, которые занимаются терапевтических разработкой средств, и и производством практическим новых противоопухолевых здравоохранением для терапии злокачественных новообразований и улучшения качества жизни онкологических больных. Разработанные в результате выполнения проекта противоопухолевые агенты могут являться основой для производства фармацевтических лекарственных форм противоопухолевых препаратов. 6 субстанций и готовых СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ 9 1 Аналитический обзор информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ 13 2 Проведение патентных исследований 39 3 Разработка методики конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины, штамм Л-ИВП. 41 4 Депонирование и паспортизация полученных инсерционных плазмид. 74 5 Наработка штамма вируса Л-ИВП со встройкой гена ГМ-КСФ человека на клетках 4647, аттестованных для производства вакцин в России. Очистка и титрование вируса 75 6 Подтверждение экспрессии и секреции ГМ-КСФ методом Вестерн-блота или иммуноферментным анализом 94 7 Подведение итогов этапа и оформление отчетной документации. 102 8 Закупка материалов и оборудования для приготовления культуральных сред для наработки вируса. 105 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 106 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 109 7 ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ IMV внутриклеточный зрелый вирус (internal mature virus) EEV внеклеточный, покрытый оболочкой вирус (external enveloped virus) ТК тимидинкиназа (thymidine kinase) VGF ростовой фактор вируса (virus growth factor) ФНО (TNF-α) фактор некроза опухолей (tumor necrosis factor) BMPs костные морфогенетические белки (bone morphogenetic proteins) CIK цитокин-индуцированные киллеры (cytokine-induced killer) G0, G1, G2, M фазы клеточного цикла FITC флуоресцеин изотиоцианат RL2 рекомбинантный аналог лактаптина 8 ВВЕДЕНИЕ Основание и исходные данные для разработки темы: основанием для проведения ПНИ, выполняемых в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2014 - 2020 годы», является Соглашение о предоставлении субсидии от «27» июня 2014 г. № 14.604.21.0057. В связи с большой и всевозрастающей проблемой борьбы с онкологическими заболеваниями, колоссальным многообразием типов опухолей, нестабильностью либо отсутствием иммунного ответа на раковые клетки и появлением иммунодефицитных состояний при онкологических заболеваниях особенно актуальными становятся работы по разработке новых противоопухолевых препаратов с многофункциональным механизмом действия. Очень важно также, чтобы эти препараты обладали высокоизбирательными онколитическими свойствами, что способствовало бы распознаванию и уничтожению только раковых и метастатических клеток, а также высвобождению опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе хозяина. На роль таких агентов практически идеально подходят непатогенные или аттенуированные распознавания природные раковых и клеток, рекомбинантные обладающие вирусы, имеющие избирательным механизмы цитолитическим потенциалом и, возможно, экспрессирующие гены иммунологически активных и других белков, специфически усиливающих их противоопухолевую активность. Природными онколитическими свойствами обладают многие вирусы, но вирус осповакцины (vaccinia virus, VACV) занимает среди них особое положение. Структурнофункциональная организация этого вируса хорошо изучена, и он имеет длительную историю успешного медицинского применения в качестве живой противооспенной вакцины. В онкотерапии используют аттенуированные штаммы VACV. Показано, что подавление генов тимидинкиназы (ТК) и ростового фактора (VGF, virus growth factor) VACV приводит к практически полному отсутствию репликации вируса в неделящихся клетках [1], при этом эффективность разрушения раковых клеток такими двойными мутантами (VVdd) не отличалась от исходного штамма [2]. Для увеличения онкоспецифичности и онколитической активности VACV используют способность этого вируса нести большое количество введенных инородных генов (трансгенов) [3]. Полученные рекомбинантные VACV показали хороший противоопухолевый эффект в доклинических испытаниях. В настоящее время три рекомбинантных штамма VACV, разрабатываемые американской компанией Jennerex Biotherapeutics, проходят клинические испытания в качестве противоопухолевых 9 препаратов: онколитический вирус JX-929 проходит I фазу клинических испытаний для лечения рака яичников на стадии метастазов [4]; JX-594 успешно прошел I и II стадии клинических испытаний против первичного рака печени и меланомы [5]. Введение в геном онколитических вирусов генов иммуностимулирующих белков (в частности ГМ-КСФ) индуцирует специфический противоопухолевый иммунитет и усиливает онколитическую активность вирусов за счет нарушения внутриопухолевой васкуляризации [6,5]. Перспективным представляется создание рекомбинантного варианта вируса осповакцины с введением в геном VACV двух трансгенов: гена апоптоз-индуцирующего белка и гена ГМ-КСФ человека, что будет приводить к усилению лизиса раковых клеток, одновременному высвобождению большого количества слабо иммуногенных опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе организма. В ИХБФМ СО РАН из молока человека был выделен и охарактеризован белок лактаптин, являющийся протеолитическим фрагментом каппа-казеина молока человека с молекулярной массой ~8.6 кДа. Было показано, что лактаптин индуцирует апоптотическую гибель раковых клеток в культуре [7, 8]. Был получен штамм-продуцент E.coli, синтезирующий рекомбинантный аналог природного пептида, также обладающий способностью индуцировать апоптоз раковых клеток человека в культуре и тормозить рост и метастазирование опухолей животных и человека в модели ксенографтов [9,10,11,12,13]. На основе полученного рекомбинантного пептида создан новый противоопухолевый препарат "Лактаптин - концентрат для приготовления раствора для инфузий" и закончены доклинические исследования этого препарата. По результатам доклинических исследований показано, что разработанный препарат является безопасным при внутривенном применении, обладает противоопухолевой и антиметастатической активностью на модельных животных и низкой иммуногенностью и может быть рекомендован для проведения клинических испытаний. Целью настоящего проекта является разработка кандидатного лекарственного средства с направленной противоопухолевой иммуностимулирующей активностью на основе и апоптоз-индуцирующей рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего двойную встройку генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и противоопухолевого белка лактаптина. Будет также проведено сравнительное исследование несекретируемой и секретируемой форм лактаптина в составе рекомбинантного вируса. Секреция апоптоз10 индуцирующего белка может обеспечить дополнительное цитотоксическое действие на клетки, соседствующие с инфицированными рекомбинантным вирусом клетками внутри опухоли, за счет передачи лактаптина через межклеточное пространство. Все рекомбинантные варианты вируса будут получены нами на основе штамма ЛИВП VACV, который широко применялся для вакцинации людей против оспы в России до 1980 года, имеет хорошую многолетнюю медицинскую историю применения, что будет способствовать облегчению условий проведения клинических испытаний препаратов на его основе. Препаративная наработка отобранных продуцирующих лактаптин клонов вируса будет осуществлена на высоко пермиссивной и высоко технологичной культуре клеток почки китайского хомяка BHK, очистка вирусов будет осуществлена центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Будет проведена оценка стабильности рекомбинантных вирусов, биохимическая, вирусологическая и молекулярно-генетическая характеризация очищенного концентрированного препарата рекомбинантного вируса. Будут проведены испытания цитотоксической и противоопухолевой активности, а также испытания острой токсичности полученного рекомбинантного штамма осповакцины. Будет разработан Лабораторный технологический регламент получения рекомбинантного штамма вируса осповакцины. Разработка и апробация Лабораторного регламента получения кандидатного противоопухолевого лекарственного средства на основе рекомбинантного вируса осповакцины и апоптоз-индуцирующего белка лактаптина будет проводиться на опытном участке индустриального партнера проекта ООО «Фабрика биополимеров». На этом же участке планируется производство разработанного лекарственного средства для проведения доклинических и клинических исследований. Таким образом, актуальность предлагаемых в проекте исследований и запланированного результата не вызывает сомнения. В результате выполнения проекта будут получены результаты, способные к правовой охране: инсерционной плазмиды, обеспечивающие встройку гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины; рекомбинантные штаммы вируса осповакцины с встроенными генами лактаптина и ГМ-КСФ, а также способы терапии злокачественных новобразований разработанным кандидатным лекарственным средством. Задачами первого этапа выполнения проекта являются: 1 Проведение аналитического обзора информационных затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ. 2 Проведение патентных исследований. 11 источников, 3 Разработка методики конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса (VGF). 4 Депонирование и паспортизация полученных инсерционных плазмид. 5 Наработка штамма вируса Л-ИВП со встройкой гена ГМ-КСФ человека на клетках 4647, аттестованных для производства вакцин в России. Очистка и титрование вируса. 6 Подтверждение экспрессии и секреции ГМ-КСФ методом Вестерн-блота или иммуноферментным анализом. 7 Подведение итогов этапа и оформление отчетной документации. 8 За счет внебюджетных средств Закупка материалов и оборудования для приготовления культуральных сред для наработки вируса. 12 1 Аналитический обзор информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИ В связи с большой и всевозрастающей проблемой борьбы с онкологическими заболеваниями, колоссальным многообразием типов опухолей, нестабильностью либо отсутствием иммунного ответа на раковые клетки и появлением иммунодефицитных состояний при онкологических заболеваниях особенно актуальными становятся работы по разработке новых противоопухолевых препаратов с многофункциональным механизмом действия. Очень важно также, чтобы эти препараты обладали высокоизбирательными онколитическими свойствами, что способствовало бы распознаванию и уничтожению только раковых и метастатических клеток, а также высвобождению опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе хозяина. На роль таких агентов практически идеально подходят непатогенные или аттенуированные природные и рекомбинантные вирусы, имеющие механизмы распознавания раковых клеток, обладающие избирательным цитолитическим потенциалом и, возможно, экспрессирующие гены иммунологически активных и других белков, специфически усиливающих их противоопухолевую активность. Идея применения вирусов для лечения злокачественных заболеваний не является новой. Ее возникновение относят к началу XX века, когда было замечено, что у некоторых пациентов происходит спонтанная регрессия опухоли после вирусных вакцинаций или заболевания [14]. В настоящее время термин “онколитический” вирус уже широко внедрился в научную литературу. Считается, что подобный вирус способен специфично разрушать злокачественные клетки и оставлять сравнительно невредимыми нормальные. Подобное специфическое разрушение злокачественных клеток может происходить напрямую за счет преимущественной репликации вируса в этих клетках, или же оно может быть опосредовано иммунной системой, которую вирус может простимулировать. Терапия с применением онколитических вирусов имеет ряд преимуществ перед стандартными методами противораковой терапии. Вирусы могут быть модифицированы с применением технологии рекомбинантных ДНК. Таким образом, можно быстро внедрять интенсивно появляющиеся новые знания о клеточных сигнальных путях в процессе создания онколитических вирусов. В настоящее время наряду с другими вирусными семействами значительное внимание уделяется использованию потенциальных возможностей вирусов семейства Poxviridae в борьбе с онкологическими заболеваниями [15]. 13 1.1 Общая характеристика семейства Poxviridae Семейство Poxviridae входит в надсемейство крупных нуклео-цитоплазматических ДНК-содержащих вирусов (NCLDV), инфицирующих широкий спектр организмов [16,17,18]. В состав семейства Poxviridae входят два подсемейства: вирусы, относящиеся к Chordopoxvirinae, инфицируют позвоночных животных, а члены подсемейства Entomopoxvirinae – насекомых [19]. В подсемействе Chordopoxvirinae выделяют 9 родов: Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Avipoxvirus, Capripoxvirus, Cervidpoxvirus, Leporipoxvirus, Suipoxvirus, Molluscipoxvirus, и Yatapoxvirus, а в подсемействе Entomopoxvirinae – три рода: Alphaentomopoxvirus, Betaentomopoxvirus и Gammaentomopoxvirus (www.ictvonline.org). Представители одного рода антигенно и генетически связаны и имеют сходную морфологию [19]. Наиболее изучен род Orthopoxvirus, включающий в себя 9 видов, в том числе такие патогенные или условно-патогенные для человека виды, как вирус осповакцины, вирус оспы обезьян, вирус оспы коров и вирус натуральной оспы [20]. Поксвирусы являются крупными, сложноорганизованными вирусами. Покрытые оболочкой вирионы имеют кирпичеобразную или овальную форму, их размеры варьируют в пределах 220-450 нм × 140-260 нм. Существуют два вида инфекционных вирусных частиц: внутриклеточный зрелый вирус (IMV, internal mature virus) и внеклеточный, покрытый оболочкой вирус (EEV, external enveloped virus) (рисунок 1.1). IMV покрыт липопротеиновой двухслойной мембраной, окружающей плотную сердцевину (или кор). Вирусная геномная ДНК и внутрикоровые белки организованы в нуклеосому. Кор поксвирусов имеет двояковогнутую форму, в его углублениях расположены два латеральных белковых тела. EEV имеет дополнительную плотно прилегающую липопротеиновую оболочку и участвует в процессе распространения вирионов в организме инфицированного хозяина. На мембране имеются тубулы или поверхностные филаменты [19, 20]. 14 Рисунок 1.1 - Морфология вириона поксвирусов. Полный цикл размножения поксвируса происходит в изолированных участках цитоплазмы клетки, называемых вирусными фабриками или виросомами. Специфические клеточные рецепторы для поксвирусов не установлены. Предполагается, что они связываются с поверхностными детерминантами, широко представленными на разных типах клеток (глюкозаминогликанами) [21]. В частности, IMV форма вируса использует гепаран сульфат и/или экстраклеточный матриксный белок ламинин для прикрепления к клетке [22,23,24,25]. После прикрепления вириона происходит слияние клеточной и вирусной мембран и проникновение кора в цитоплазму, где начинается репликативный цикл вируса [26]. Вирус осповакцины (ВОВ) может проникать в клетки млекопитающих посредством макропиноцитоза, сопровождающегося слиянием вирусной мембраны с внутренней эндосомальной мембраной или через прямое слияние клеточной и вирусной мембраны [27,28]. Такой путь проникновения не зависит от видовой или тканевой принадлежности клеток, но дальнейшие события зависят от типа клетки: в пермиссивных клетках происходит полный цикл репликации с образованием вирусного потомства, в непермиссивных – абортивная или рестриктивная инфекция, не приводящая к образованию зрелых вирионов [21]. Важно отметить, что клетки с быстро прогрессирующим клеточным циклом, к которым относятся в большинстве своем раковые клетки, являются более пермиссивными для поксвирусной инфекции по сравнению с покоящимися неделящимися соматическими клетками. В течение первой фазы инфекции вирусная ДНК-зависимая РНК-полимераза транскрибирует ранние гены, также происходит декапсидация вириона и высвобождение геномной ДНК. Затем экспрессируются промежуточные гены и начинается репликация 15 вирусной ДНК. На поздней стадии синтезируются все структурные белки вируса. Сборка вирусного потомства начинается на внутренних мембранах инфицированных клеток, приводя к формированию IMV. IMV могут высвобождаться в результате клеточного лизиса или, покрываясь дополнительной оболочкой в аппарате Гольджи или в эндосомах, образовывать EEV [19]. EEV транспортируются к клеточной поверхности посредством микротрубочек и высовобождаются из клетки почкованием [29]. IMV способствует распространению вируса между клетками внутри инфицированной ткани, EEV обеспечивает диссеминацию вируса в организме хозяина [30,31]. EEV более устойчив, чем IMV к действию нейтрализующих антител и не инактивируется системой комплемента [32,33]. Стоковые препараты поксвирусов, используемые для онколитической виротерапии, состоят, главным образом, из IMV формы, которая обеспечивает высоко пермиссивную репликацию вируса внутри опухолевой ткани. Геном поксвирусов представлен в виде линейной двуцепочечной ДНК размером от 130 до 375 т.п.н., имеющей инвертированные концевые повторы (рисунок 1.2). Две цепи ДНК ковалентно связаны, образуя концевые шпильки. Инвертированные концевые повторы часто содержат и ряд прямых повторов. Рисунок 1.2 - Организация генома поксвирусов. Попытки получения специфических онколитических штаммов ведутся на основе четырех представителей поксвирусов: вируса миксомы (род Leporipoxvirus), танапоксвируса (род Yatapoxvirus), вируса оспы енотов и вируса осповакцины (род Orthopoxvirus). Вирус миксомы является строго специфическим патогеном кроликов и не инфицирует другие виды позвоночных, включая человека. Несмотря на очень узкий круг природных хозяев, вирус миксомы может продуктивно инфицировать и убивать не кроличьи раковые клетки как in vitro, так и in vivo , включая раковые клетки человека 16 [34,35,36,37,38,39]. Его пермиссивность для раковых клеток человека базируется на множественной разбалансировке внутриклеточных сигнальных путей, характерной для трансформированных клеток: - неспособность индуцировать интерферон и фактор некроза опухоли в ответ на вирусную инфекцию, что эффективно ингибирует репликацию вируса миксомы в нормальных первичных фибробластах человека [40,41]; - активация Akt, который усиливает миксоматозную инфекцию [42,43]; - дефекты опухоле-супрессивных механизмов, включая мутации генов р53, ataxia telangiectasia (ATM) и retinoblastoma protein (Rb) [44]. В настоящее время онколитический потенциал вируса миксомы исследован в доклинических испытаниях для различных типов опухолей in vitro, включая гематологический рак, такой как острая миелоидная лейкемия и множественная миелома, и солидные опухоли, такие как глиома, меланома и опухоль поджелудочной железы [45]. Также продемонстрированы его онколитические свойства на мышиной модели глиомы человека in vivo [38,39]. Вирус миксомы снижает экспрессию белков главного комплекса гистосовместимости I класса на поверхности инфицированных клеток глиом, что приводит к распознаванию и эффективному уничтожению таких клеток натуральными киллерами (НК) [46]. Вирус миксомы способен также индуцировать ранний противоопухолевый клеточный иммунный ответ [45]. Недавно было показано, что инфекция вирусом миксомы мононуклеарных клеток образцов костного мозга пациентов селективно элиминирует содержащиеся в этих образцах клетки миелоидной лейкемии или множественной миеломы, не влияя на способность резидентных нормальных CD34+ стволовых клеток или клеток-предшественников прививаться на иммунодефицитных мышах NOD/scid/IL2Rγ-knockout (NSG) [36,47]. Таким образом, вирус миксомы в перспективе может быть использован для очистки ex vivo образцов костного мозга онкологических пациентов от раковых клеток перед реинфузией аутотрансплантата назад больному в процессе миелоаблативной химиотерапии [47]. Для усиления онколитической активности вируса миксомы были сконструированы рекомбинантные варианты с направленными делециями генов иммуномодуляторных белков [48]. Один из этих рекомбинантов M135R-knockout MYXV (vMyx-M135KO-gfp) оказался host-range мутантом и не способен индуцировать миксоматоз у кроликов [49], но сохранил способность инфицировать и лизировать раковые клетки человека in vitro [50] и in vivo [51]. В настоящее время штамм vMyx-M135KO-gfp полностью подготовлен к проведению клинических испытаний, поскольку он обладает хорошими онколитическими 17 свойствами в отношении опухолей человека, но в то же время не вызывает миксоматоз у кроликов и полностью непатогенен для всех известных видов позвоночных животных [45]. Танапоксвирус является природным патогеном человека и вызывает легкое лихорадочное заболевание, сопровождающееся появлением одной-двух оспин на коже конечностей. Этот вирус способен селективно реплицироваться в ряде клеточных линий опухолей человека, включая клетки глиобластомы, опухолей прямой кишки и молочной железы [52]). Вирус оспы енотов был впервые выделен от здорового енота в 1961 году, а затем от некоторых других животных, в частности, кошек [53]. Он не вызывает какой-либо патологии у известных видов позвоночных, включая человека. Возможно, это связано с тем, что природный хозяин вируса оспы енотов до настоящего времени еще не найден. Несмотря на отсутствие патогенности, вирус хорошо распознает и эффективно реплицируется в широком диапазоне опухолевых клеток человека и убивает их, при этом предобработка нормальных клеток интерфероном полностью предотвращает репликацию вируса [53]. Высокочувствительными к вирусу оспы енотов оказались клетки опухоли прямой кишки HCT116, меланомы M14, рака почек ACHN и карциномы молочной железы MCF-7. Вирус оспы енотов существенно замедлял прогрессию солидных опухолей как в аллогенных ксенографтах (опухоли человека), так и в сингенных иммунокомпетентных моделях. Так, при однократной интратуморальной инъекции вируса оспы енотов в дозе 107 БОЕ в ксенографты опухоли прямой кишки человека SW620, привитые мышам линии nude, выявлялось достоверное уменьшение размера опухоли и увеличение выживаемости мышей. При внутривенном введении вируса оспы енотов мышам линии Balb/c с метастазирующей опухолью легких CT-26, вирус накапливался в опухолевой ткани и увеличивал выживаемость мышей, по крайней мере, в 2 раза (с 40 до 80 дней и более). На модели мышиной глиомы DBT внутримозговое введение вируса также способствовало достоверному уменьшению опухоли [53]. Таким образом, в доклинических исследованиях вирус оспы енотов продемонстрировал хороший онколитический потенциал и также может рассматриваться в качестве перспективной платформы для создания противоопухолевых препаратов. Наиболее изученным среди онколитических поксвирусов является вирус осповакцины (ВОВ, vaccinia virus). В настоящее время онколитические препараты на его основе проходят клинические испытания в США и Германии [3]. Вирус осповакцины имеет длительную историю медицинского применения, сыграв в свое время ключевую роль в искоренении оспы [54]. 18 1.2 Онколитические свойства вируса осповакцины Многочисленные природные свойства вируса осповакцины делают его перспективным онколитическим вирусом: - Вирус осповакцины реплицируется и лизирует клетки с высокой скоростью, тем самым, действуя как цитотоксический агент [19]. Проникая в клетку, он проявляет выраженное цитопатическое действие: уже в первые 4-6 ч происходит полное подавление синтеза хозяйских белков, что создает условия для высокоэффективной экспрессии вирусных генов и репликации вируса. Примерно 10000 копий вирусного генома образуется в первые 12 ч после заражения, половина из них включается в зрелые вирионы и выходит из клетки. Скорость лизиса клеток является одним из ключевых факторов, определяющих онколитическую эффективность вирусов [55]. - Вирус осповакцины обладает тропизмом к широкому кругу клеток. Для его проникновения не требуется определенных клеточных рецепторов и инфицирование происходит путем слияния клеточной и вирусной мембран, что увеличивает эффективность заражения in vivo [27,56]. - Вирус осповакцины, также как все поксвирусы, реплицируется в цитоплазме в специфических структурах, так называемых вирусных фабриках, и никогда не интегрирует свой геном в геном хозяина [19]. - Размер генома вируса осповакцины позволяет встраивать до 25000 пар оснований чужеродной ДНК, не нарушая инфекционности вируса [57]. - Вирус осповакцины системно распространяется по организму человека, что обеспечивает его эффективную доставку к отдаленным опухолям и метастазам. При репликации в клетке образуются различные антигенные формы вируса, включая вирусы с двойной наружной мембраной (EEV), что позволяет им преодолевать иммунный барьер и беспрепятственно распространяться с током крови [58]. - В настоящее время имеются эффективные антивирусные препараты для лечения поксвирусной инфекции в случае возникновения поствакцинальных осложнений. - Вирус осповакцины, как и все поксвирусы, генетически весьма стабилен и имеет низкую скорость спонтанного мутагенеза. Что очень существенно, вирус осповакцины обладает природной селективностью в отношении опухолевых клеток [2]. Исследование известных к настоящему времени штаммов ВОВ на способность реплицироваться в нормальных и опухолевых клетках показало, что уровень репликации всех штаммов в опухолевых клетках выше, чем в нормальных (рисунок 1.3), однако, терапевтический индекс (отношение уровня 19 репликации в раковых клетках к уровню репликации в нормальных) варьировал между штаммами. Рисунок 1.3 - Онкоспецифичность штаммов вируса осповакцины. Отношение уровня репликации штаммов VACV в опухолевых клетках к уровню репликации в нормальных клетках. В качестве нормальных клеток использовали первичную культуру клеток нормального бронхиального эпителия человека (NHBE, normal human bronchial epithelial) или эпителия малых воздушных путей (SAEC, small airway bronchial epithelial) и линии опухолевых клеток (А2780 или НСТ 116). Множественность инфекции во всех случаях составила 1.0 вирусная частица на клетку. Вирус собирали через 48 часов и титровали методом бляшек. На оси абсцисс представлены штаммы ВОВ, на оси ординат - отношение титра вируса в опухолевых клетках к нормальным из расчета на одну клетку [2]. 1.3 Аттенуированные штаммы вируса осповакцины Одним из основных требований, предъявляемых к онколитическим препаратам, является их максимальная безопасность для иммунодефицитных раковых пациентов. Показано, что подавление генов тимидинкиназы (ТК, thymidine kinase) и ростового фактора (VGF, virus growth factor) вируса осповакцины приводит к практически полному отсутствию репликации вируса в неделящихся клетках [59,60,1]. При этом эффективность разрушения раковых клеток такими двойными мутантами не отличалась от исходного штамма [2]. Для оценки диссеминации мутантного вируса в организме, а также эффективности и специфичности доставки его к опухоли использовали репортерный ген люциферазы, экспрессия которого оценивалась методом неинвазивной биолюминесценции после введения субстрата люциферина внутривенно мышам, инфицированным штаммом с двойной делецией TK и VGF генов (VVdd) или исходным WR штаммом вируса осповакцины [2]. Было установлено, что оба вируса обладали одинаковой начальной инфекционностью и общей картиной распределения репортерной люциферазы в селезенке, легких, печени и опухоли. Однако штамм VVdd быстро исчезал из всех органов кроме опухоли, в то время как штамм WR продолжал активно 20 реплицироваться и распространяться в другие ткани. Выделение инфекционных вирусных частиц из тканей иммунокомпетентных мышей после внутривенного введения 109 вирусных частиц штамма VVdd (летальная доза для WR штамма) показало, что на восьмой день после лечения титр вируса в опухоли был в 1000 раз выше (количество вирусных копий на мг ткани), чем во всех нормальных тканях, в которых вирус вообще не обнаруживался (титр ниже чувствительности метода). Токсичности не было обнаружено даже при такой высокой дозе вируса. Штамм VVdd оказался наиболее эффективен в отношении опухолевых клеток с активированной в результате малигнизации EGFR/Ras сигнальной системой [60]. Недавно была показана эффективность штамма VVdd в отношении педиатрических опухолей, таких как саркома и нейробластома, привитых иммунодефицитным мышам [61]. Другим примером является рекомбинантный вирус GLV-1h68, который обладает повышенными онколитическими свойствами за счет направленной инактивации трех вирусных генов - F14.5L, J2R (кодирует тимидинкиназу) и A56R (кодирует гемагглютинин). Этот вирус сконструирован на основе штамма Lister, в котором на место указанных генов были помещены три репортерных трансгена - ген, кодирующий светящийся химерный белок – гибрид люциферазы (из Renilla reniformis) и зеленого флуоресцентного белка (GFP); ген, кодирующий β-галактозидазу (LacZ), и ген, кодирующий ß –глюкуронидазу (gusA) [62,63]. Было установлено, что одновременная инактивация трех генов в вирусе значительно ослабляла его репликацию в нормальных мышиных клетках, в то время как в раковых клетках репликация оставалась неизменной. Внутривенное введение GLV-1h68 безтимусным мышам с подсаженными GI-101A опухолями молочной железы человека показало его повышенную специфичность к раковым клетках и уменьшенную токсичность по сравнению с исходным штаммом Lister. Исчезновение опухоли в течение 130 дней наблюдалось у 95% тестированных мышей. Тот факт, что больные мыши успешно противостоят инфекции штаммом GLV-1h68 и выживают в течение длительного эксперимента (130 дней) свидетельствует о надежной аттенуации полученного вируса. Это делает возможным продолжительную репликацию вируса до полной элиминации опухоли без существенного цитотоксического эффекта на организм, что обусловливает терапевтические достоинства вируса. Процесс разрушения опухоли у животных в реальном времени контролировали по изменению свечения репортерного белка, продуцируемого вирусом. Было показано, что по мере разрушения опухоли происходит уменьшение локального свечения экспрессируемого вирусом химерного репортерного гена люцифераза/GFP. Такой подход подтверждает возможность избирательной деструкции раковых тканей в живых организмах с помощью специально 21 сконструированных вирусов, и возможность использования рекомбинантных вирусов осповакцины в онкотерапевтических целях [64]. 1.4 Характеристика возможных трансгенов Для расширения спектра онколитических поксвирусов ряд исследователей использовали их способность нести большое количество введенных инородных генов (трансгенов). Поскольку онколитические ВОВ предпочтительно реплицируются в раковых клетках, экспрессия трансгенов также должна быть онконаправленной. Выбор соответствующего промотора позволяет проводить регулируемую экспрессию введенных генов. Чрезвычайно важным является выбор трансгена. Продукт экспрессии клонированного гена не должен обладать прямым антивирусным эффектом и приводить к гибели вируса, прежде чем он разрушит опухоль. Необходимо учитывать и тот факт, что в процессе репликации ВОВ экспрессирует большое число генов (например, рецепторов цитокинов), которые способны нейтрализовать функции некоторых трансгенов. В настоящее время известно значительное число трансгенов, которые показали свою эффективность при экспрессии в вирусе осповакцины. Это гены цитокинов и других иммуномодуляторов и иммуностимуляторов [3,2,65,66,]; ингибиторов ангиогенеза [67,68]; ферментов, превращающих внутри опухоли нетоксичные предшественники в их цитотоксические производные [69,70], а также гены апоптоз-индуцирующих белков [71,72]. Среди цитокинов, гены которых вводили в состав онколитических штаммов ВОВ, описаны: гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), интерферон-бэта (ИФН-β), ряд интерлейкинов (ИЛ), фактор некроза опухолей (ФНО). ГМ-КСФ целесообразно использовать в случае комбинированного применения противоопухолевых препаратов вместе с химиотерапией, поскольку он является стимулятором формирования гранулоцитов и макрофагов из мультипотентных клетокпредшественников [66]. Это свойство делает перспективным его клиническое использование для снижения тяжести нейтропении, вызванной миелосупрессивной (противоопухолевой) терапией. В частности, его применение позволяет снизить общую токсичность химиотерапии. Ген ГМ-КСФ человека был встроен в геном двух штаммов вируса осповакцины WR (JX-963) [2] и Wyeth (JX-594) [58, 15, 73] в район ТК гена под контролем ранне-позднего промотора ВОВ [74]. Оба этих штамма показали высокую онколитическую активность как в отношении сингенных опухолей кроликов и мышей, так в отношении аллогенных ксенографтов опухолей человека, привитых иммунодефицитным 22 мышам [45]. Сравнительный анализ рекомбинантных штаммов JX-963 и JX-594 проводили сначала на модели первичных опухолей человека, которые хорошо прививаются в организме кролика и дают метастазы. Штамм JX-963 обладал наибольшей способностью разрушать раковые клетки и полностью блокировал образование метастазов, не затрагивая нормальные органы и ткани. Анализ продукции ГМ-КСФ показал, что уровень его в крови кроликов, леченных JX-963 (610 пг/мл), выше, чем леченных JX-594 (180 пг/мл), и это, вероятнее всего, связано с более высокой скоростью репликации векторного штамма WR по сравнению со штаммом Wyeth. Полученные результаты подтвердили возможность использования штамма WR VV в качестве вектора при получении онколитических вирусов [2]. В доклинических иссследованиях испытаны также рекомбинантные ВОВ, экспрессирующие гены цитокинов ИЛ-2 и ИЛ-12 [75]. Ранее отмечалось, что эти цитокины эффективны при лечении рака за счет своей способности стимулировать цитотоксические Т-лимфоциты, усиливать клеточную активность натуральных киллеров и активизировать инфильтрацию лимфоцитов в опухоль [76,77]. Рекомбинантные вирусы, экспрессирующие гены цитокинов ИЛ-2, ИЛ-12 и гибридных цитокинов ИЛ-2–ИЛ-12, были получены на основе аттенуированного штамма Lister, в котором инактивирован ген ТК. Однако в случае генов цитокинов наилучший терапевтический эффект наблюдался при использовании низких доз вируса (102 – 103 БОЕ), поскольку при этом отсутствует риск развития системной воспалительной реакции и токсикоза вследствие гиперпродукции цитокинов. Это, так называемая, низкодозовая терапия вирусом осповакцины, которая предотвращает развитие возможных побочных осложнений [78]. Важным направлением развития онколитических штаммов VACV является их использование для активации пролекарств [79]. Пролекарства – это препараты, не токсичные даже при высоких дозах введения, но способные под действием специфических ферментов превращаться в организме в цитотоксические соединения. С целью локализации токсического эффекта в организме больного превращение пролекарств должно осуществляться под действием специфических ферментов, продуцируемых раковой опухолью. Гены специфических ферментов могут доставляться в раковые клетки с помощью онколитических вирусов [80,81,70]. В настоящее время I фазу клинических испытаний в США проходит рекомбинантный штамм vvDD-CDSR, созданный на основе штамма WR ВОВ, который имеет делеции ТК и VGF генов и вместо последнего встроен ген цитозиндезаминазы [82,68]. Этот фермент катализирует превращение пролекарства 5фторцитозина в 5-фторурацил, который является токсичным для активно реплицирующихся клеток и широко используется при лечении многочисленных форм 23 рака. Пролекарство 5-фторцитозин не оказывает нежелательных побочных токсических проявлений в нормальных тканях человека [52]. Другим примером эффективности гена пролекарства является использование уже упоминавшегося онколитического вируса осповакцины GLV-1h68, несущего ген ßгалактозидазы кишечной палочки [62,63]. При размножении в клетках опухоли бактериальный (галактозид применяется фермент осуществляет дуокармицина) в в превращение нетоксичного химиотерапевтический онкологической практике [64]. препарат, Под пролекарства который действием широко образующегося дуокармицина наблюдалась индукция апоптоза в клетках опухоли молочной железы GI101A in vitro, а также регрессия аналогичных ксенографтов у мышей in vivo. Перспективным направлением в развитии онколитической терапии является включение в состав вирусов генов противооопухолевых белков. Ранее на мышах с подкожно введенной глиомой было показано, что рекомбинантный ВОВ, экспрессирующий ген опухолевого супрессора р53, обладает высокой противораковой активностью [83]. Нативный белок р53 контролирует сигнальные пути, приводящие к апоптозу поврежденных и измененных клеток. У 40-60% раковых больных регистрируются мутации в гене этого белка, что приводит к нарушению его супрессорной функции и неконтролируемому делению клеток [84,85]. Введение в раковые клетки нативного р53 может способствовать восстановлению механизмов противоопухолевой защиты [86]. Для повышения терапевтической эффективности рекомбинантных вирусов осповакцины, в частности, при лечении глиобластомы, было использовано сочетание низких доз вирусов, экспрессирующих гены интерлейкинов (102 – 103 БОЕ), с высокой дозой вируса, экспрессирующего ген белка р53 (107 БОЕ) [87]. Известно использование в качестве трансгена гена апоптина [88]. Апоптин является одним из неструктурных белков вируса анемии цыплят (VP3), который отвечает за гибель клеток при вирусной инфекции [89]. Это белок длиной 121 аминокислот (14 кДа), который способен индуцировать апоптоз широкого спектра раковых и трансформированных клеток, но не нормальных клеток. Апоптоз, вызываемый апоптином, не зависит от р53 и не подавляется экспрессией антиапоптозного белка Bcl-2 [71]. В лаборатории участников настоящего проекта ген апоптина был встроен в геном ВОВ (штамм Л-ИВП) в район делеции VGF-гена [71,90]. Полученный аттенуированный рекомбинантный вариант ВОВ обладал значимо большей избирательной литической активностью в отношении клеток злокачественных опухолей человека (А549, А431, U87MG, RD и MCF7) по сравнению с исходным штаммом Л-ИВП и его вариантом с делецией гена вирусного ростового фактора (без встройки апоптина). Эксперименты на nude мышах с ксенографтами эпидермоидной 24 карциномы человека А431 также показали высокую противоопухолевую эффективность рекомбинантного штамма ВОВ со встройкой гена апоптина [91, 90]. Ziauddin и соавторы [92] показали возможность лечения рака толстого кишечника с помощью рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего ген TRAIL (TNFRelated Apoptosis-Inducing Ligand). TRAIL – родственный ФНО цитокин, состоящий из 281 аминокислоты [93]. Этот белок нетоксичен и постоянно синтезируется во многих тканях человека. Для него известно пять рецепторов, два из которых (TRAIL-R1 и TRAILR2) содержат функциональные «домены смерти» (DD, Death Domain), способные индуцировать р53-независимый апоптоз в большинстве раковых клеток, но не в нормальных клетках [94,95]. Данный рекомбинантный штамм продуцировал высокий уровень белка TRAIL в раковых клетках и по сравнению с векторным вирусом оказывал повышенное противоопухолевое действие. Исследования, проведенные на больных раком толстого кишечника, показали, что гены TRAIL-R1 и TRAIL-R2 экспрессируются, в основном, в раковых клетках, и апоптоз пропорционален уровню экспрессии этих генов. Таким образом, за счет связывания продуцируемого вирусом рекомбинантного белка TRAIL с рецепторами R1 и R2 происходит запуск каскада процессов, приводящих к избирательному апоптозу опухолевых клеток [95]. Известно, что костные морфогенетические белки (bone morphogenetic proteins, BMPs), которые принадлежат TGF-ß суперсемейству белков, участвуют в регуляции карциногенеза за счет дифференциации стволовых клеток опухоли, что приводит к снижению их туморогенного потенциала и повышению чувствительности к химиотерапии [96,97]. Белок ВМР-4 был встроен в геном штамма ВОВ GLV-1h68 с получением нового рекомбинантного вируса GLV-1h285, что привело к существенному усилению его онколитической активности в отношении глиобластомы на модели иммунодефицитных мышей. Причем, этот эффект обладал высокой устойчивостью и защищал мышей от рецидива опухоли за счет уничтожения ее стволовых клеток [98]. Одним из хорошо изученных подходов к лечению рака является использование антиангиогенных препаратов для уменьшения кровоснабжения опухолевых тканей [99,100]. Многочисленные клинические данные указывают на важную роль ангиогенеза в прогрессировании злокачественной опухоли [101,102]. Ключевым медиатором ангиогенеза является васкулярный эндотелиальный фактор роста (VEGF, vascular endothelial growth factor), повышенная продукция которого выявлена во многих раковых клетках. Показано, что блокирование VEGF близко родственными молекулами ингибирует рост опухоли [103]. Наиболее привлекательными для целей противоопухолевой терапии являются производные рецептора VEGF. Растворимый 25 рецептор VEGFR-1-Ig, который связывается как с мышиным, так и с человеческим VEGF, был использован для получения онколитического вируса VVdd-VEGFR-1-Ig на основе штаммa WR вируса осповакцины с делециями генов ТК и VGF [104]. На мышиной модели рака почки было показано, что рекомбинантный вирус VVdd-VEGFR-1-Ig подавляет рост опухоли значительно лучше, чем исходный вектор, и при этом не проявляет заметной токсичности даже при внутривенном введении 105 вирусных частиц. На основе GLV-1h68 был также сконструирован рекомбинантный вирус GLV1h108, несущий встройку гена одноцепочечного антитела GLAF-1 [105]. Этот ген экспрессирует одноцепочечные антитела, которые связываются с человеческим и мышиным VEGF. Однократная внутривенная инъекция GLV-1h108 мышам с ксенографтами опухоли легких человека приводила к регрегрессии опухолей, которая была существенно более выражена по сравнению с исходным штаммом ВОВ. Накопление экссудата в плевральной полости является частым осложнением при онкологической патологии. Тяжесть этого процесса зависит от интенсивности инвазии плевры раковыми клетками и экспрессии VEGF. Внутривенное введение GLV-1h108 мышам с подкожно имплантированной аденокарциномой легких эффективно уменьшало размер опухоли и контролировало образование плеврального экссудата. Предполагается, что этот эффект обуславливается как прямым ингибированием VEGF за счет связывания с GLAF-1, так и индукцией воспалительной реакции в ответ на вирусную инфекцию клеток опухолевого узла [106]. Регулятор клеточного цикла 6 (cell division cycle 6; Cdc6) играет важную роль в процессе сборки пререпликативных комплексов и существенен для инициации репликации ДНК в делящихся эукариотических клетках. Мутации в Walker A домене этого белка вызывают нарушения в сборке пререпликативных комплексов и, как следствие этого, нарушение репликации ДНК. На основе, опять же, штамма GLV-1h68 был сконструирован вариант вируса осповакцины GLV-1h237 со встройкой гена, кодирующего мутантный домен Walker A Cdc6 белка. Противоопухолевые свойства этого рекомбинанта были исследованы на модели иммунодефицитных мышей с ксенографтами опухоли легкого человека [107]. Штамм GLV-1h237 продемонстрировал существенно улучшенную противоопухолевую активность в сравнении с родительским штаммом GLV1h68. Таким образом, комбинирование онколитической виротерапии с агентами, ингибирующими синтез ДНК хозяйской клетки, представляет еще один многообещающий подход улучшения противоопухолевой терапии. Рекомбинантный эритропоэтин человека (rhEPO) представляет собой гликопротеин и гормон, который регулирует формирование эритроцитов и используется для лечения 26 опухолеассоциированной анемии [108,109]. В ряде клинических испытаний было обнаружено, что rhEPO усиливает рост опухолей человека [110,111]. В ряде доклинических исследований было также показано, что rhEPO оказывает антиапоптотический эффект, индуцирует ангиогенез и также усиливает рост опухолей [112,113]. Однако многие другие исследования не выявили такого вредоносного эффекта rhEPO [114,115,116]. Сконструирован рекомбинантный вариант вируса осповакцины GLV-1h210, экспрессирующий hEPO, и его противоопухолевая активность исследована на модели ксенографтов рака легкого человека, привитого иммунодефицитным мышам [117]. Экспрессия hEPO не влияла на репликацию вируса, но существенно увеличивала число эритроцитов и уровень гемоглобина при однократной внутривенной инъекции мышам. Рекомбинант GLV-1h210 продемонстрировал достоверно большую регрессию опухоли в сравнении с исходным штаммом GLV-1h68 [117]. Этот эффект, по всей вероятности, обуславливается локализованной экспрессией hEPO, в результате чего увеличивается число сосудов и облегчается распространение вируса внутри опухоли. Таким образом, использование в качестве трансгена hEPO не только усиливает онколитическую активность вируса осповакцины, но также нивелирует опухоле-ассоциированную анемию. 1.5 Клинические испытания противоопухолевых препаратов на основе ВОВ Штамм JX-594 был первым среди онколитических поксвирусов, с которым было разрешено проведение I фазы клинических испытаний. Этот штамм разработан в американской компании Jennerex Biotherapeutics и французской компании Transgene и получил коммерческое название pexastimogene devacirepvec – Pexa-Vec. Первые клинические испытания Pexa-Vec были проведены Mastrangelo с соавторами в США при интратуморальном введении неоперабельным больным с меланомой [118]. В этом исследовании была показана безопасность многократного интратуморального введения Pexa-Vec, функциональная активность ГМ-КСФ и регрессия опухолей. Дальнейшие исследования включали I и II фазы клинических испытаний как меланомы, так и солидных опухолей (гепатоцеллюлярной карциномы), которые продемонстрировали, что Pexa-Vec оказывает противоопухолевый эффект не только при интратуморальном, но также и при внутривенном введении, несмотря на наличие нейтрализующих антител у вакцинированных против оспы пациентов [119,120,121,122]. Способность Pexa-Vec эффективно достигать опухоли и преодолевать нейтрализующий иммунитет оказалась неожиданностью для исследователей, но она объяснялась необходимостью введения высоких доз вируса для достижения терапевтического эффекта, которые превосходили вирус-нейтрализующий потенциал сывороток крови вакцинированных пациентов. 27 Наилучший терапевтический эффект проявлялся при повторном внутриопухолевом введении препарата. Так пациентам, у которых появились новые опухоли после окончания лечения, вводили снова вирус внутрь опухоли, и они отвечали на лечение аналогично первому введению препарата [73]. Это позволяет заключить, что наличие циркулирующих нейтрализующих антител не исключает противоопухолевую активность вируса при локальном введении. О том, что ВОВ может инфицировать раковые клетки и реплицироваться в них, несмотря на наличие в организме системных нейтрализующих антител, сообщалось и ранее [123,124]. По всей видимости, это происходит вследствие способности вируса переходить из одной раковой клетки в другую не только через кровоток, но и через межклеточные мостики. Pexa-Vec продемонстрировал способность реплицироваться в опухоли даже после девяти циклов интратуморального введения, несмотря на наличие высоких титров антител в крови [121]. У пациентов не было выявлено побочных эффектов при введении высоких доз вируса Pexa-Vec: 2х109 БОЕ (внутривенно) или 1х109 БОЕ (интратуморально). Напротив, наблюдался дозо-зависимый терапевтический эффект, который коррелировал с увеличением времени выживания пациентов. Внутривенное введение обеспечивало доставку вируса в метастазирующие опухоли, где он реплицировался и экспрессировал ГМ-КСФ дозо-зависимым образом, не затрагивая нормальные ткани, поскольку ТК- вирус преимущественно реплицируется в делящихся раковых клетках [119] . Интратуморальное введение также приводило к выходу вируса в кровоток, что позволяло ему достигать отдаленных неинъецированных частей опухоли и метастазов [119,122]. Терапевтическая эффективность Pexa-Vec обуславливается его прямым онколитическим действием, ГМКСФ индуцированным усилением противоопухолевого иммунитета, а также антиваскулярным эффектом вируса в опухолевых узлах [125,126,127]. В ряде случаев эффект Pexa-Vec существенно усиливался в комбинации с традиционной противоопухолевой терапией [120,128]. Однако очередность лечения в данном случае является чрезвычайно важным фактором, поскольку ряд химиопрепаратов ингибируют репликацию вируса [45]. В одном из клинических испытаний перед стандартным лечением сорафенибом (sorafenib) три пациента с гепатоцеллюлярной карциномой сначала получили интратуморальную инъекцию Pexa-Vec. У всех пациентов наблюдали развитие внутриопухолевого некроза и остановку прогрессии болезни [129], в то время как обработка только Pexa-Vec не индуцировала некрозы, а монотерапия сорафенибом оказывалась эффективной только в 40% случаев [130,131]. Сорафениб является оральным низкомолекулярным мультикиназным ингибитором с антипролиферативным и антиангиогенным эффектом. По всей видимости, Pexa-Vec 28 способен повышать чувствительность клеток гепатоцеллюлярной карциномы к сорафенибу. Механизмы такого синергического действия еще предстоит изучить, однако эффективность комбинированной терапии с Pexa-Vec была показана еще для одного ингибитора рецептора VEGF – сунитиниба (sunitinib) [129]. Штамм JX-963, кроме встройки гена ГМ-КСФ в ТК гене, содержит дополнительную делецию гена вирусного ростового фактора (virus growth factor, VGF). Показано, что подавление генов тимидинкиназы и ростового фактора ВОВ приводит к практически полному отсутствию репликации вируса в неделящихся клетках [1], при этом эффективность разрушения раковых клеток такими двойными мутантами (VVdd) не отличалась от исходного штамма [2]. Этот штамм также разработан в американской компании Jennerex Biotherapeutics и в настоящее время проходит I фазу клинических испытаний для пациентов с солидными опухолями. Созданный на основе JX-963 штамм vvDD-CDSR, в котором вместо VGF гена встроен ген цитозиндезаминазы дрожжей (см. выше) показал высокую эффективность в отношении педиатрических солидных опухолей и в настоящее время также проходит I фазу клинических испытаний в США в комбинации с химиотерапией [82]. В компании Genelux Corporation (США) на основе выше описанного штамма ВОВ GLV-1h68 был разработан противоопухолевый препарат, получивший коммерческое название GL-ONC1 [63]. В настоящее время GL-ONC1 проходит I-II фазы клинических испытаний в группах пациентов с солидными опухолями, перитонеальным канцероматозом, опухолями головы и шеи и раком легких. При лечении этим препаратом происходит инфильтрация и активация иммунных клеток внутри опухолевого узла, что играет существенную, если не определяющую, роль в элиминации опухоли [45]. 1.6 Проблемы и перспективы Многочисленные доклинические исследования и проводимые в настоящее время клинические испытания показывают перспективность вируса осповакцины как онколитического агента. Геном этого вируса способен эффективно поддерживать экспрессию разнообразных трансгенов, усиливающих его природные противоопухолевые свойства. Встройка трансгенов осуществляется в участки вирусной ДНК, кодирующие гены вирулентности вируса осповакцины, что одновременно приводит к аттенуации вируса и повышению безопасности его использования для онкологических больных, многие из которых страдают иммунодефицитами разной степени тяжести. В качестве перспективного и высоко безопасного вектора используется также штамм MVA вируса осповакцины, у которого удалено около 30% генома и большая часть факторов 29 вирулентности. Этот вирус не способен реплицироваться в нормальных клетках млекопитающих, однако способен инфицировать, активно размножаться и вызывать лизис раковых клеток. Экспрессия трансгенов в составе вируса осповакцины способна обеспечить дополнительный тропизм вируса к раковым клеткам, усилить внутриопухолевую диссеминацию, адресную литическую активность вируса, обеспечить локальную химио- и радиотерапию. Открытие генов новых противоопухолевых белков может быть сразу же использовано для встройки их в геном вируса осповакцины с целью получения препаратов с улучшенными антираковыми свойствами. Вирус осповакцины способен инфицировать и лизировать широкий круг раковых клеток человека in vitro, однако, in vivo эффективность вируса несколько ниже вследствие сложной архитектоники ряда опухолей и наличия внутриопухолевых барьеров. Тем не менее, в отличие от многих других вирусов с ограниченным тропизмом и слабым онколитическим потенциалом, вирус осповакцины при интратуморальном введении способен лизировать гетерогенные клетки опухоли, включая стволовые, предупреждая тем самым формирование рецидивирующего рака. Вирус осповакцины способен находить и инфицировать метастазы при внутривенном введении, что является самой сложной проблемой при лечении метастатических форм рака. Тем не менее, проблема доставки к опухолям онколитических вирусов является одной из важнейших в успехе всей виротерапии. Все вирусы являются сильными иммуногенами и индуцируют формирование иммунного ответа, включая антивирусный клеточный ответ и вируснейтрализующие антитела, поэтому для многократного использования одного и того же вируса в процессе лечения необходимо использовать высокие дозы [119], что в ряде случаев может вызывать осложнения. В настоящее время разрабатываются различные подходы для преодоления иммунологических барьеров виротерапии. Перспективным показало себя использование клеточных носителей, которые инфицируются ex vivo вирусом перед инфузией в организм, это, так называемый, метод «троянского коня» [132, 133, 134]. Клинические испытания в качестве носителей онколитических вирусов проходят в настоящее время мезенхиматозные стволовые клетки, которые продуктивно инфицируются вирусами ex vivo [135, 136]. Другим примером являются цитокин-индуцированные киллеры (cytokine-induced killer; CIK), несущие фенотипические маркеры натуральных киллеров (NK) и Т-клеток, экспрессирующие рецептор NK группы 2D (NKG2D) и не ограниченные по аллелям генов белков главного комплекса гистосовместимости [137]. Эти клетки опосредуют гибель опухолевых клеток за счет распознавания стресс-ассоциированных лигандов, экспрессированных на 30 поверхности опухолевых клеток [137]. Через 72 часа после внутривенного введения CIK клетки локализуются преимущественно в опухолевом узле. СIK клетки могут являться эффективным средством доставки онколитического вируса осповакцины в опухолевые клетки для преодоления антивирусного иммунитета [138]. Авторами данного проекта предлагается создание кандидатного противоопухолевого лекарственного средства на основе рекомбинантного штамма вируса осповакцины с двойной делецией генов тимидинкиназы и ростового фактора и встройкой в делетированные участки генома двух трансгенов – ГМ-КСФ человека и апоптозиндуцирующего белка лактаптина. Лактаптин является одним из биологически активных белков человеческого молока, а именно протеолитическим фрагментом каппа-казеина молока человека с молекулярной массой ~8.6 кДа, обнаруженным, выделенным и охарактеризованным в лаборатории биотехнологии ИХБФМ СО РАН [7, 8]. В состав молока человека входит множество белков с различными биологическими функциями, но до сих пор для некоторых из этих белков не установлено, какую именно функцию, кроме питательной, такие белки могут выполнять в организме младенцев, находящихся на грудном вскармливании. В последнее время много исследований посвящено изучению кишечной микрофлоры младенцев и показано, что микрофлора младенцев-искусственников отличается от микрофлоры детей, питающихся материнским молоком [139]. В числе обнаруженных активностей белков молока можно выделить следующие: • способность усиливать усвоение питательных веществ за счет специфических белков, связывающих питательные вещества; • способность ингибировать такие ферменты, как ингибиторы трипсина, которые в активном состоянии лимитируют расщепление белков. • ферментативная активность, обеспечивающая расщепление и всасывание питательных веществ; • активность, направленная на усиление скорости роста; • модуляция иммунной системы; • защита от патогенов. Белки молока подразделяются на классы, в которых можно выделить сывороточные белки, казеины и муцины. В молозиве высоко содержание сывороточных белков и среди них можно выделить иммуноглобулины, лактоферрин и α-лактальбумин. 31 Напротив, казеины в молозиве могут полностью отсутствовать, появляясь только на 4-5-й день лактации, и их концентрация увеличивается стремительно [140]. К биологически активным белкам молока относятся лактоферрин, лизоцим, секреторные IgA, гаптокоррин (белок, связывающий витамин B12), α-лактальбумин, липаза, стимулирующая желчные кислоты, κ-казеин и β-казеин. 1.7 Казеины молока Казеины молока являются неструктурированными белками с массой около 20 кДа, которые подразделяют на α-, β- и κ-казеины. Для всех трех типов казеинов описана компактная конформация, которая может характеризоваться общей низкой гидрофобностью и суммарным отрицательным зарядом на внешней поверхности. При значениях pH 4-5, суммарный заряд белка стремится к нулю и белок принимает максимально структурированную конформацию [141]. Казеины, играющие важную роль в развитии младенца, составляют 20-40% от всех белков молока человека. β-Казеины имеют множественные сайты фосфорилирования. При расщеплении небольшие фосфопептиды во-первых, способствуют абсорбции кальция, а во-вторых, образуют казеиноморфины (опиоидные пептиды), имеющие сродство к опиоидным рецепторам и участвующие в регуляции периодов сна и бодрствования. κ-Казеины молока человека высоко гликозилированы (до 40%) и препятствуют адгезии бактерий на стенках кишечника, например Helicobacter pylory [142], Структура гликанов κ-казеина сходна со структурой поверхностных полисахаридов слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта и гликозилированные к-казеины могут быть растворимой “приманкой” для патогенов. 1.7.1 Биологически активные пептиды казеина Расщепление белков молока в желудочно-кишечном тракте играет важнейшую роль в формировании биологически активных пептидов. Именно такая физиологическая трансформация больших белковых молекул позволяет разнообразить их биологическую активность, даже в случае, когда предшественник не обладает активностью. Так, в работе [143] описаны короткие фрагменты казеина, полученные в процессе гидролиза казеина пепсином и экстрактом поджелудочной железы in vitro. Для разных пептидных фрагментов были показаны разные биологические активности: пептиды β-CN [KVLPVP f(169-174)] и RYLGY [αs1-CN f(90-94)] обладали антигипертензивным действием, а пептид AYFYPE [αs1-CN f(143-148)] был эффективной ловушкой радикалов. В работе Liepke описан фрагмент к-казеина (63-117), обладающий антибактериальными свойствами. [144], Этот пептид подавлял рост как грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий, 32 так и дрожжей. В работе López-Expósito были описаны три фрагмента протеолиза бычьего к-казеина f(18-24), f(30-32), and f(139-146), которые обладали притивомикробным действием в отношении Escherichia coli и Listeria innocua [145]. 1.8 HAMLET как пример белка молока человека, обладающего противоопухолевым действием В 1995 г в Каролинском университете при исследовании влияния белков материнского молока на адгезию бактерий на клетках рака легкого было обнаружено, что определенные фракции молока подавляли жизнеспособность раковых клеток [146] Цитотоксической активностью обладала казеиновая фракция, полученная обработкой молока в кислых условиях. Дальнейшие исследования показали, что основным компонентом цитотоксической фракции был мультимер α-лактальбумина. Обычный αлактальбумин не обладал указанной активностью, что указывало на модификацию структуры этого белка, необходимую для приобретения биологической активности. Мультимерный α-лактальбумин обладал также активностью в отношении других трансформированных клеток человека, эмбриональных и лимфоидных клеток. Авторы предположили, что такие цитотоксические способности белков молока усиливают иммунные свойства слизистой кишечника, добавляя к антимикробным свойствам способность регулировать функционирование лимфоцитов и эпителия. В дальнейшем авторы показали, что фракция женского молока, содержащая мультимер α-лактальбумина, вызывает апоптоз только незрелых эпителиальных и раковых клеток, но не зрелых здоровых клеток [147]. Далее исследователи показали, что для противоопухолевой активности α-лактальбумина необходим кофактор, которым оказалась олеиновая кислота. Комплекс, обладающий цитотоксической активностью в отношении раковых клеток и состоящий из α-лактальбумина и олеиновой кислоты, был назван HAMLET (рисунок 1.4) [148]. 33 Рисунок 1.4 - HAMLET представляет собой комплекс, сотоящий из частично неструктурированного α-лактальбумина и олеиновой кислоты. На модели ксенографтов глиобластомы человека, трансплантированной непосредственно в мозг крысам, впервые был показан противоопухолевый эффект HAMLET [149]. Для лечения на 7-й день после трансплантации опухолевых клеток животным вводили HAMLET. Томографическое исследование показало, что лечение препаратом HAMLET приводило к уменьшению среднего размера глиобластом у леченых животных по сравнению с животными, получавшими α-лактальбумин. Исследование противоопухолевого действия комплекса HAMLET на группе добровольцев с кожной папилломой показало, что поверхностное нанесение HAMLET на область папиллом вызывает гибель трансформированных клеток [150]. Для достижения терапевтического эффекта препарат наносили раз в день в течение трех недель, после чего наблюдали уменьшение размера папилломы на 75% у 100% пациентов, по-сравнению с 15% пациентов, получавших плацебо. Исследование противоопухолевого действия HAMLET также проводили на перевиваемой карциноме MB49 мышей, трансплантированной мышам линии С57BL/6 в мочевой пузырь. Введение раствора HAMLET осуществляли непосредственно в мочевой пузырь курсом из 5-ти введений [151]. В результате лечения, средний размер опухолей у животных, получавших HAMLET, был на 24% меньше, чем у животных в контрольной группе. Очевидными недостатками препарата HAMLET являются трудоемкость способа введения препарата, ограниченный спектр опухолей, доступных для такого способа терапии (т.к. достижение лекарственного эффекта предполагает непосредственный контакт препарата с клетками опухоли) и его невысокая эффективность. 1.9 Лактаптин В ЛБТ ИХБФМ СО РАН с помощью ряда хроматографических подходов из молока человека был выделен, охарактеризован и идентифицирован белок - протеолитический фрагмент каппа-казеина человека с молекулярной массой ~8.6 кДа, индуцирующий апоптотическую гибель клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 [7,8]. 1.9.1 Выделение и исследование цитотоксической активности природного лактаптина В качестве источника белка использовали молоко, предоставленное донорами в различные периоды лактации (от 3 недель до 12 месяцев). Плазму молока анализировали 34 ионообменной хроматографией на сорбенте Fractogel TSK DEAE-650. Цитотоксическую активность хроматографических фракций в отношении клеток аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 анализировали методом МТТ-теста [7]. Дополнительную очистку цитотоксического фактора молока проводили методом аффинной хроматографии на цикарбон-сефарозе и хроматографией на Protein C4 сефарозе. MALDI-TOF спектрометрический анализ продуктов трипсинолиза цитотоксического фактора позволил идентифицировать его как фрагмент к-казеина человека (с 66 по 123 а.о.) с молекулярной массой 8,6 кДа. Обнаруженный пептид был назван лактаптином. Гибель раковых клеток, индуцируемая лактаптином, сопровождалась морфологическими изменениями, характерными для апоптоза: разрушением монослоя, откреплением клеток от пластиковой подложки, конденсацией ядра, выпячиванием отростков цитоплазмы, уменьшением числа и снижением флуоресценции митохондрий в присутствии родаминовых красителей. 1.9.2 Получение рекомбинантных аналогов лактаптина и оценка их цитотоксической активности Создание лекарственного препарата на основе природного лактаптина ограничено источником сырья и высокими финансовыми затратами, поэтому для исследования апоптотической активности были получены генно-инженерные аналоги лактаптина RL1 и RL2. Последовательность RL1 была короче последовательности лактаптина на 9 а.о. с Nконца, последовательность RL2 содержала полную последовательность лактаптина и последовательность к-казеина (23-57) с N-конца (рисунок 1.5). Оба аналога содержали последовательность из 6 остатков гистидина на С-конце молекулы [9]. Рисунок 1.5 - Последовательности лактаптина и его аналогов RL1 и RL2 относительно структуры к-казеина молока человека. LP-лидерный пептид. Молекулярная масса RL1 соответствовала расчетной массе в 8.9 кДа, аналог RL2 имел молекулярную массу 14 кда и частично был представлен формой гомодимера 28 кДа, образующейся благодаря S-S связям остатков цистеина. 35 Было показано, что наибольшей цитотоксической активностью в отношении раковых клеток человека в культуре обладал аналог лактаптина RL2, который вызывал характерную для ранних этапов апоптоза экспозицию фосфатидилсерина на внешней плазматической мембране и характерную для более поздних этапов апоптоза фрагментацию ДНК [10]. При этом мезенхимальные стволовые клетки человека MSC были нечувствительны к апоптотическому действию лактаптина [152]. 1.9.3 Лактаптин и апоптоз Апоптоз или программируемая клеточная гибель - это процесс необходимый для развития и поддержания функционирования организма. Нарушение регуляции процесса апоптоза ведет к развитию онкологических заболеваний, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, аутоиммунных заболеваний. Соединения, способные избирательно индуцировать апоптоз в раковых клетках рассматриваются как потенциальных кандидаты для разработки противораковых лекарственных препаратов. Морфологические изменения в раковых клетках под действием лактаптина и его аналога RL2 характеризуются как апоптотические: конденсация ядра и фрагментация хроматина, выпячивание клеточной мембраны и появление апоптотических телец (рисунок 1.6). Рисунок 1.6 - Морфологические изменения, происходящие в клетке при апоптозе. Методом проточной цитометрии было показано, что под действием рекомбинантного аналога лактаптина RL2 происходит индукция апоптоза в клеках MCF7, сопровождающаяся экспозицией фосфатидилсерина на внешней плазматической мембране клеток [152]. Методами проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии показано, что инкубация клеток с RL2 приводит к изменению потенциала митохондрий и потери целостности митохондриальных мембран (ММ), что, в свою очередь, запускает 36 выход из митохондрий в цитоплазму проапоптотических факторов, в первую очередь, молекул цитохрома С, активирующих сборку апоптосомы в цитоплазме, активацию каспазы-9 и реализию программы апоптоза по внутреннему (митохондриальному) пути [152,11]. Методом проточной цитометрии также была продемонстрирована активация эффекторных каспаз -3 и -7 в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB-231 под действием RL2 [152, 13]. Оценка изменения уровня мРНК и белков апоптотического каскада в клетках MDA-MB-231 под действием аналога лактаптина показала, что RL2 угнетает продукцию антиапоптотического гена bcl-2 как на уровне мРНК, так и на уровне белка. При этом не было отмечено достоверного изменения экспрессии гена p53 под действием RL2 как на уровне РНК, так и на уровне белка. Таким образом, RL2 индуцирует p53-независимый тип апоптоза [13]. 1.9.4 Противоопухолевое действие лактаптина Было показано, что рекомбинантный аналог лактаптина RL2 подавляет рост опухолей (гепатомы мышей А1 и аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB231) и замедляет развитие метастазов [152, 13, 12]. Исследование противоопухолевой активности лактаптина на животных показало, что курс инъекций лактаптина эффективно ингибирует рост гепатомы мышей ГА1 в солидной форме, и терапевтический эффект лактаптина был сопоставим с эффектом циклофосфамида в терапевтической дозе. Комбинированная терапия лактаптином и циклофосфамидом выявила аддитивный противоопухолевый эффект в отношении асцитных опухолей. Гистоморфометрический анализ показал трехкратное уменьшение спонтанных метастазов в печени мышейопухоленосителей, получавших лечение лактаптином по сравнению с контрольной группой. В процессе лечения животных препаратом лактаптина не было выявлено выдимых побочных эффектов. Исследование противоопухолевого потенциала лактаптина на мышах ксенографтах с трансплантированной опухолью аденокарциномы молочной железы человека MDA-MB-231 показало, что лактаптин тормозит рост опухоли на 43% по сравнению с контрольными животными [13]. Вывод: Таким образом, аналитический обзор информационных источников, затрагивающих научно-техническую проблему, исследуемую в рамках проекта, показал, что создание кандидатного лекарственного препарата, основой которого будет являться рекомбинантный вариант вируса осповакцины с введенными в геном вируса трансгенами: 37 геном апоптоз-индуцирующего белка лактаптина и гена ГМ-КСФ человека, представляется весьма перспективным. Разработанное лекарственное средство будет усиливать лизис раковых клеток и приводить к одновременному высвобождению большого количества слабо иммуногенных опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе организма. Секреция апоптоз-индуцирующего цитотоксическое действие на белка клетки, может обеспечить соседствующие с дополнительное инфицированными рекомбинантным вирусом клетками внутри опухоли, за счет передачи лактаптина через межклеточное пространство. 38 2 Проведение патентных исследований В ходе выполнения 1 этапа работ по проекту были проведены патентные исследования, в результате которых были получены достоверные данные об уровне техники, тенденциях развития и патентно-лицензионной ситуации. Целью настоящих патентных исследований является исследования технического уровня и тенденций развития средств, обеспечивающих профилактику и лечение опухолей, в частности, рака молочной железы. Предметом настоящего патентного поиска (объектом исследования) являются онколитические вирусные векторы, несущие гены ГМ-КСФ и/или пептидов с противоопухолевой активностью; рекомбинантные штаммы онколитических вирусов (в том числе вируса осповакцины) с плазмидными векторами, несущими гены ГМ-КСФ и/или пептидов (в том числе пептидов женского молока), обладающих апоптотической активностью к раковым клеткам. Выводы и рекомендации отчета о патентных исследованиях: За отчетный период по объекту исследования опубликовано 87 патентных документов. Ведущими в данном направлении являются научно-исследовательские и медицинские компании США (Wellstat Biologics Corporation; Cell Genesys Inc.; Jennerex Inc.; University New York; University Pennsylvania; Neotropix Inc.; Pro Virus Inc.), а также канадские компании Oncolytics Biotech Inc. и Ottawa Health Researh Inst. Среди европейских стран наиболее перспективные разработки, проходящие процедуру патентования, имеют компания Германии Bayer Schering Pharma AG, компания Великобритании Biovex Ltd. и компания Швейцарии Novartis AG. К тенденциям развития объекта исследования относятся следующие: - разработка противоопухолевых препаратов на основе пептидов женского молока; - создание рекомбинантных штаммов онколитических вирусов, продуцирующих противоопухолевые пептиды; - создание рекомбинантных штаммов онколитических вирусов, продуцирующих цитокины; - создание рекомбинантных штаммов онколитических вирусов осповакцины, продуцирующих ГМ-КСФ и противоопухолевые пептиды. В результате выполнения настоящей научно-исследовательской работы могут быть разработаны патентоспособные технические решения, касающиеся рекомбинантного штамма вируса осповакцины с двойной делецией генов тимидинкиназы и ростового 39 фактора и встройкой в делетированные участки генома двух трансгенов – апоптозиндуцирующего белка лактаптина и ГМ-КСФ человека. Патентный поиск показал, что объект исследования обладает патентной чистотой, т.к. не нарушает действующих патентов Российской Федерации, касающихся рассматриваемого рекомбинантного штамма вируса осповакцины с противоопухолевыми свойствами. Отчет о патентных исследованиях оформлен отдельным документом. 40 3 Разработка методики конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины, штамм Л-ИВП 3.1 Материалы и методы В работе использовали химические реактивы марки хч (Россия): соляная кислота, гидроксид натрия, ледяная уксусная кислота, соли, спирт этиловый; реактивы производства «Sigma» (США): акриламид, Трис-HCl, ацетат натрия, бромистый этидий, трис-(гидроксиметил)аминометан (Трис), динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na2ЭДТА), триптон, дрожжевой экстракт, агар; ферменты и реактивы производства ЗАО «СибЭнзим»: рестриктазы, Pfu и Taq ДНК-полимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты, маркеры молекулярных весов; наборы ДНК-сорб и РИБОсорб, (производства Интерлабсервис, Россия) для выделения ДНК; наборы фирмы QIAGEN Gel Extraction kit, PCR Purification kit, Plasmid Miniprep kit, EndoFree Plasmid Maxi kit для выделения продуктов амплификации из ПЦР-смеси и агарозного геля, очистки ДНК плазмид в аналитических и препаративных количествах. Для определения нуклеотидной последовательности ДНК использовали наборы реагентов фирмы ABI. 3.1.1 Получение компетентных клеток E.coli XL2-Blue Колонию с чашки с LB-агаром (тетрациклин 12 мкг/мл) поместить в 4 мл LB среды (тетрациклин 12 мкг/мл) и инкубировать ночь при 37°C. Добавить 1 мл ночной культуры к 100 мл предварительно нагретой до 37°C LB среды (тетрациклин 12 мкг/мл) в колбе объемом не менее 250 мл и инкубировать при покачивании при 37°C до достижения плотности культуры 0,5-0,6 при А600. Культуру охладить во льду, перенести в стерильные центрифужные стаканы и осадить при 4000 g, 4°C в течение 5 мин. Удалить супернатант, поместить клетки в лед, тщательно ресуспендировать в 30 мл охлажденного (4°C) буфера TFB1 и выдержать суспензию во льду 90 мин, периодически перемешивая. Собрать клетки центрифугированием при 4000 g, 4°C в течение 5 мин, слить супернатант и аккуратно ресуспендировать осадок в 4 мл охлажденного (4°C) буфера TFB2. Аликвоты по 300 мкл перенести в стерильные охлажденные центрифужные пробирки, поместить их в охлажденную коробку для хранения и хранить при минус 70°C. 3.1.2 Состав буферов TFB 1: 100 мМ RbCl, 80 мМ MnCl2 , 30 мМ KAc, 10 мМ CaCl2, 15% глицерин, рН 5,8 TFB 2: 10мМ MOPS, 10 мМ RbCl, 75 мМ CaCl2, 15% глицерин, рН 6,8 (доводят КОН) Буферы стерилизуют с использованием разовых стерильных фильтров Millipore 0,22 мкм. 41 3.1.3 Трансформация компетентных клеток E.coli XL2-Blue Разморозить компетентные клетки, поместив их в лед на 10 мин. К 100-120 мкл компетентных клеток добавить не более 10 мкл охлажденной во льду лигазной смеси, тщательно перемешать и выдержать во льду 20 мин. Перенести пробирку в термостат (42°C) и прогревать в течение 90 сек. Добавить 300 мкл LB среды (37°C), поместить в термостат на 37°C и инкубировать 60 – 90 мин, периодически перемешивая. Перенести 150 мкл и оставшиеся клетки на чашки с LB-агаром (ампициллин 100 мкг/мл). Состав LB среды на 1 л: триптон - 10 г, дрожжевой экстракт – 5 г, NaCl - 10 г. Антибиотики: Ар - 100 мг/мл, Тс - 25 мг/мл. Все генно-инженерные манипуляции (получение и трансформация компетентных клеток E.coli, наработка и анализ рекомбинантных ДНК) проводили по [153]. 3.1.4 Наработка и выделение ДНК клонов Отдельную колонию с чашки после трансформации клеток лигазной смесью перенести стерильно в пробирку с 4 мл LB среды (100 мкг/мл ампициллин), инкубировать при покачивании 12 ч в термостате при 37°C. Засеять 6 – 12 клонов. Из полученной биомассы выделить ДНК, используя набор QIAprep Spin Miniprep Kit, согласно протоколу производителя. Качество выделенной ДНК проверить электрофорезом в 1% агарозном геле. 3.1.5 Анализ ДНК клонов с помощью ферментов рестрикции Реакцию проводить в 20 мкл раствора: 3-5 мкл выделенной ДНК, 2 мкл соответствующего буфера (поставляется с ферментом), 3-5 ед. фермента, до 20 мкл добавить стерильную воду. Реакцию проводить в условиях, указанных в паспорте к ферменту. Результаты рестрикции анализировать электрофорезом в 1,2 – 1,5% агарозном геле (в зависимости от длины ожидаемых рассчитанных фрагментов). 3.1.6 Подготовка векторной ДНК и фрагмента для проведения лигазной сшивки Для получения векторной ДНК, содержащей два разных сайта лигирования, 10 мкг ДНК в 200 мкл соответствующего буфера обработать одним из ферментов, контролируя степень реакции электрофорезом в 1% агарозном геле. После полного расщепления ДНК осадить добавлением 20 мкл 3 М ацетата натрия, рН 7.0 и 500 мкл этилового спирта. После центрифугирования при 10000 об/мин в течение 5 мин супернатант слить и осадок промыть 70% спиртом. Полученный после центрифугирования осадок высушить, 42 используя вентилятор, или на воздухе. Обработку вторым ферментом проводить аналогично описанному выше. Фрагмент для клонирования получали методом ПЦР на соответствующей матрице. Для каждого случая условия реакции подбирались индивидуально. Векторную ДНК и ПЦР-фрагмент после обработки соответствующими ферментами очищали электрофорезом в 1,5% агарозном геле с последующей экстракцией из геля набором QIAquick Gel Extarction Kit согласно прилагаемому протоколу. 3.1.7 Проведение лигазной сшивки Реакцию лигирования проводили в объеме 15 – 20 мкл при 5 – 10 – кратном избытке ПЦР-фрагмента в условиях, рекомендованных производителем фермента (лигазы). ПЦР проводили, используя подходы, изложенные в PCR Application Manual, Roche Diagnostics Mannheim, Germany. Праймеры рассчитывали в программе Oligo 6.0. Ампликоны предсказанной длины характеризовали электрофорезом фрагментов в 1,5% агарозном геле. 3.1.8 Секвенирование плазмидной ДНК Реакцию секвенирования проводили с использованием BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosystems, USA) с последующей очисткой продуктов реакции секвенирования с помощью набора DyeEx Spin Kit (Qiagen, USA). Разделение очищенных продуктов реакции секвенирования осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA). Анализ исследуемых нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерной программы “Sequencher Version 4.0.5”. 3.2 Результаты На отчетном этапе работы перед нами стояла задача конструирования инсерционных плазмид, которые бы позволили на следующем этапе получить рекомбинантные штаммы вируса осповакцины со встройкой гена лактаптина в районе гена вирусного ростового фактора. В качестве вирусного штамма-реципиента для встройки гена лактаптина будет использован рекомбинантный штамм вируса осповакцины VV-GMCSF-S1/3, который содержит встройку гена ГМ-КСФ человека в районе структурной части гена вирусной тимидинкиназы. В целевых рекомбинантах будет двойная встройка генов ГМ-КСФ и лактаптина с одновременной инактивацией двух 43 вирусных генов (тимидинкиназы и вирусного ростового фактора), которые являются факторами вирулентности. Инактивация этих двух генов обеспечит дополнительную аттенуацию исходного вируса, а также его онконаправленность за счет уменьшения способности реплицироваться в нормальных непролиферирующих клетках. Все поксвирусы, включая штаммы вируса осповакцины, кодируют собственные ДНК-зависимые РНК-полимеразы, направляющие синтез мРНК вирусных белков, поэтому чужеродные гены, вводимые в геном поксвирусов, должны быть подстроены под контроль поксвирусных промоторов. Гены поксвирусов подразделяются по времени экспрессии на ранние, промежуточные, поздние, а также экспрессируемые в течение всего цикла развития вируса [19]. Время экспрессии вирусных генов определяется структурой промоторов. Структура промоторов вируса осповакцины хорошо изучена, выявлены функционально значимые последовательности с целью конструирования наиболее эффективных транскрипционных структур, и на основе полученных данных синтезированы искусственные высокоэффективные промоторы ВОВ [154]. Экспрессию лактаптина в составе вируса осповакцины целесообразно проводить с ранне-позднего промотора, чтобы этот пептид нарабатывался в максимально возможном количестве в опухолевой ткани для последующей индукции апоптоза раковых клеток. С целью получения таких эффективных экспрессирующих оперонов на первом этапе работы нами был проведен синтез двух ранне-поздних промоторов вируса осповакцины (ВОВ). 3.2.1 Синтез двух высокоэффективных ранне-поздних промоторов вируса осповакцины для экспрессии трансгенов в составе генома вируса Ранее для экспрессии чужеродных генов в составе вируса осповакцины использовали фрагмент его генома размером 120 п.н., обладающий промоторной активностью. Этот фрагмент генома ВОВ получил название промотора белка 7,5 кДа (Р7,5К) поскольку теоретически стоял в составе ОРТ белка с таким молекулярным весом. Далее была проведена работа по сужению промоторного участка в составе этого фрагмента генома ВОВ и получены консенсусные последовательности размером около 40 п.н., обеспечивающие эффективную ранне-позднюю экспрессию чужеродных генов в составе ВОВ [154]. На основе этих структур нами были рассчитаны структуры дуплексов, и синтезированы фрагменты ДНК для конструирования двух синтетических промоторов вируса осповакцины РE/L и P7,5 (рисунок 3.1). Размер синтетических промоторов составляет 36 (P7,5) и 42 (РE/L) п.н. соответственно, и их последовательности не перекрываются, что позволяет встраивать несколько трансгенов в один или разные участки генома вируса осповакцины. 44 А Структура синтетического промотора Р7,5: 5'- GGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCAC Для его конструирования были рассчитаны и синтезированы два олигонуклеотида длинойй 60 п.о. каждый: 5 'TCGACGGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCACGCTAGCAAGCTTGGAT CCG 5' AATTCGGATCCAAGCTTGCTAGCGTGCAATAAATAGATCTAGTTTTTCAATTTTTGGC CG При взаимном отжиге они образовывают следующую структуру: SalI P7,5 Nhe I HindIII BamHI Eco RI 5 '- TCGACGGCCAAAAATTGAAAAACTAGATCTATTTATTGCACGCTAGCAAGCTTGGATCCG GCCGGTTTTTAACTTTTTGATCTAGATAAATAACGTGCGATCGTTCGAACCTAGGCTTAA -5 ' Б Структура синтетического промотора PE/L: 5'- GGCCAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAA Для клонирования промотора PE/L были рассчитаны и синтезированы два олигонуклеотида длиной 66 п.о. каждый: 5'- CGATGGCCAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAAGGTACCACTAGTATGCATAT 5'-CGATATGCATACTAGTGGTAСCTTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTGGCCAT При взаимном отжиге они образовывают следующую структуру: ClaI PE/L KpnI SpeI Nsil ClaI CGATGGCCAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAAGGTACCACTAGTATGCATAT TACCGGTTTTTAACTTTAAAATAAAAAAAAAAAACCTTATATTTCCATGGTGATCATACGTATAGC Рисунок 3.1 - Схема синтеза синтетических промоторов Р7,5 (А) и PE/L (Б). В нашем случае эти два промотора использованы для экспрессии трансгенов ГМКСФ и лактаптина, а также для экспрессии гена устойчивости к пуромицину в составе инсерционных плазмид. Поскольку лактаптин является белком, индуцирующим апоптоз раковых клеток человека, целесообразно, наряду с несекретируемой формой его экспрессии в составе вируса осповакцины, использовать также секретируемый вариант. Секреция апоптозиндуцирующего белка из инфицированной клетки позволит этой клетке эффективнее поддерживать репликацию вируса, а также обеспечит дополнительный лизис окружающих инфицированную клетку опухолевых клеток. Для правильного понимания механизмов секреции белков в эукариотических клетках мы провели обзор данных литературы по сравнительному анализу лидерных последовательностей известных секретируемых белков. 45 3.2.2 Сравнительный анализ лидерных последовательностей для эффективной секреции апоптоз-индуцирующих белков в составе рекомбинантных вирусов осповакцины Секреция белков является важнейшим этапом продукции функционально активных и терапевтически безопасных белков в эукариотической клетке. Она включает [155]: - транслокацию белка через мембрану эндоплазматического ретикулума (ЭР); - N-гликозилирование и сборку (folding) в полости ЭР; - выход из ЭР; - модификацию в аппарате Гольджи; - и, наконец, выход из секреторных гранул в межклеточное пространство. Секретируемые белки в эукариотической клетке синтезируются на рибосомах, которые тесно ассоциированы с мембранными транслокационными каналами [156]. Получаемые полипептидные цепочки перемещаются в полости гранулярного эндоплазматического ретикулума, где они N-гликозилируются и в присутствии различных ферментов правильным образом процессируются и сворачиваются. N-связанные олигосахариды увеличивают растворимость и стабильность многих белков, тем самым способствуя их правильной сборке [157]. Таким образом, линейные последовательности аминокислот получают после транслокации в эндоплазматический ретикулум необходимую трёхмерную структуру, после чего перемещаются в цитозоль. Неправильно собранные белки задерживаются в ЭР и не направляются далее в секреторные компартменты. Следовательно, будет белок секретироваться из клетки или нет, зависит, в основном, от его способности транслоцироваться в ЭР и правильно собираться в его полости. Транспорт белка в эндоплазматический ретикулум обеспечивает короткая сигнальная последовательность (сигнальный или лидерный пептид) от 3 до 60 аминокислот, расположенная на N-конце синтезируемого белка, которая затем отщепляется специфической сигнальной пептидазой [158]. Сигнальный пептид состоит из трех консервативных доменов (как и в случае бактериальных сигнальных пептидов): амино-концевая полярная область (n-район, область, домен), центральный гидрофобный домен (h-район, область, домен) и С-концевой нейтральный, но полярный гидрофильный домен (с-район, область, домен) (рисунок 3.2). 46 Рисунок - 3.2 Структура сигнального пептида Лидерный пептид содержит в n-районе положительно заряженные и полярные аминокислоты, которые закрепляют (удерживают) его на мембране, тем самым обеспечивая функционирование гидрофобной части. Гидрофобная часть сигнальной последовательности содержит не менее 7-8 гидрофобных аминокислот. В системе клеток млекопитающих in vitro было показано, что баланс между положительным зарядом nобласти и гидрофобностью h-области определяет эффективность лидерного сигнала [158]. В случае эукариотических белков в этом районе доминирует лейцин (Leu), далее следуют валин, аланин, фенилаланин и изолейцин (Val, Ala, Phe and Ile). Сигнальный пептид котрансляционно отщепляется сигнальной пептидазой. Специфичность расщепления определяется последними аминокислотами с-района сигнальной последовательности: согласно правилу (-1,-3) аминокислоты на этих позициях должны быть маленькие и нейтральные, чтобы расщепление протекало корректно [159,160]. Предпочтительным является наличие в позиции -3 и -1 аланина [161]. Поскольку секреторному сигнальные пути, важно пептиды контролируют идентифицировать их продвижение последовательности белков и по сайты отщепления. Количество последовательностей секретируемых белков в базе данных экспоненциально увеличивается, и это стимулировало развитие компьютерных методов для быстрой и надежной идентификации сигнальных пептидов, информация о которых приведена в [162] и [163]. Choo и Ranganathan, используя базу данных первичной структуры 1877 секретируемых эукариотических белков, проанализировали свойства аминокислот, входящих в состав n-, h- и с-районов сигнальной последовательности, и сравнили их с лидерными последовательностями прокариотических белков (168 белков грам- положительных и 307 грам-отрицательных бактерий). Оказалось, что длина лидерной последовательности у эукариот варьировала от 15 до 35 а.к. (пик в области 22 а.к.). Похожая картина наблюдалась у грам-отрицательных бактерий (пик в облсти 23 а.к.). Грам-положительные бактерии имели бимодальное распределение длины лидера с пиком в области 29 а.к. и 41 а.к. Полученные результаты по протяженности и структуре 47 сигнального пептида согласуются с расчетными данными, пoлученными с использованием других компьютерных программ [164]. Сайт протеолиза, определенный как Р1-Р1´, находится в позиции -1 (Р1, последняя аминокислота сигнальной последовательности) и +1 (Р1´, первая аминокислота зрелого белка). Частота встречаемости аминокислот (%) в той или иной позиции в промежутке [-10 +10] приведена в таблице 3.1 [163]. Таблица 3.1 - Частота встречаемости аминокислот в позициях лидерного пептида. Лидер Зрелый белок В нижней части таблицы приведена усредненная характеристика каждой позиции. Отмечается важность позиций Р1 и Р3, прилегающих к сайту протеолиза, где предпочтительными являются маленькие алифатические аминокислоты аланин, глицин, серин (Ala, Gly, Ser). В позиции Р2 предпочтительными являются лейцин и серин. Интересно, что когда был посчитан суммарный заряд, оказалось, что в отличие от прокариот, только 57% сигнальных последовательностей эукариотических белков имеют положительный заряд (более 96% у прокариот). В то же время для зрелых белков серьезных различий по суммарному заряду не обнаружено (рисунок 3.3). 48 Рисунок 3.3 - Распределение суммарных зарядов аминокислотных последовательностей лидерных районов и зрелых белков эукариот и прокариот Имеется достаточно большое количество работ по изучению влияния N-концевой части зрелого (mature) белка, прилегающей к лидеру, на уровень секреции эукариотических белков в прокариотической системе экспрессии. Kajava с соавторами экспериментально показали, что для грамм-отрицательных бактерий суммарный заряд первых 18 а.к. является критичным для уровня секреции щелочной фосфатазы: введение двух положительно заряженных аминокислот (К, К) в положения 2 и 3 зрелого белка приводило к замене отрицательного (-1) заряда на положительный (+1) и резкому сокращению продукции секретируемой фосфатазы. Авторы делают предположение, что этот район белка взаимосвязан с n- и h-доменами сигнального пептида [165]. С другой стороны, цитоплазматические белки, секретируемые как в эукариотах, так и в граммположительных бактериях, часто имеют заряд в этой области белка, превышающий (+2), однако, секреция протекает эффективно [166]. Zhang и Henzel проанализировали секвенированные N-концевые последовательности 270 секретируемых рекомбинантных белков человека [162]. Оценка частоты встречаемости той или иной аминокислоты в области, прилегающей к сайту протеолиза, показала, что некоторые аминокислоты (пролин, глутамин) имеют преимущества, например, по сравнению с тирозином, который практически отсутствует в N-конце зрелого белка; с другой стороны, для пролина оказалась запрещенной +1позиция. Это согласуется с теоретически рассчитанными данными, приведенными выше [163]. Отмечается достаточно высокая встречаемость в +1 позиции глутамина: в процессе синтеза белка N-концевой глутамин циклизуется в пироглутамовую кислоту с помощью глутаминциклазы [167], что может защищать секретируемые белки от деградации внутриклеточными аминопептидазами (рисунок 3.4). 49 Рисунок 3.4 - Частота встречаемости отдельных аминокислот в N-концевой части зрелого белка. По оси Х – позиция аминокислоты, по оси У – 2 log отношения наблюдаемой частоты встречаемости определенной аминокислоты к общему количеству этой аминокислоты в данной позиции у всех анализируемых белков Основность N-концевой части и гидрофобность h-домена играют определяющую роль в транслокации белка в ЭР. Следовательно, изменение основности и гидрофобности сигнальной последовательности должно влиять на уровень секреции белка. В случае прокариот и дрожжей этот вопрос подробно изучен [168,169,170]. В случае эукариотических систем экспрессии эта проблема изучена недостаточно. Zhang c соавторами получили ряд мутантных сигнальных пептидов интерлейкина-2 человека (IL2) (мутации затрагивали аминоконцевую и гидрофобную области, что приводило к изменению либо основности, либо гидрофобности, либо того и другого одновременно) и 50 исследовали влияние этих изменений на экспрессию эндостатина [171]. Выбор данной лидерной последовательности обусловлен тем, что она широко используется при коммерческой наработке белков [172,173]. Полученные результаты обобщены в приведенной ниже в таблице 3.2: Таблица 3.2 - Влияние модификации сигнального пептида интерлейкина-2 на уровень экспрессии эндостатина Авторы установили, что модификации как в каждой области отдельно, так и совместно приводят к увеличению секреции, как это имеет место у прокариот [174]. Однако, результат таких модификаций в случае эукариот менее предсказуем: так, если в случае прокариот более высокий заряд в катионном домене приводит к значительному повышению секреции [174], в эукариотической системе значительное увеличение заряда (ILba4-ENDO) наоборот приводило к уменьшению секреции по сравнению с природным лидером интерлейкина-2 (таблица 3.2). Модификация центрального домена в направлении повышения гидрофобности (замещение гидрофильных остатков на лейцин или введение дополнительного лейцина) приводила к увеличению уровня секреции (таблица 3.2). Это подтверждает вывод [175] о том, что гидрофобный домен лидерного пептида играет ключевую роль в транслокации белка в ER. Более того, одновременная модификация упомянутых выше доменов приводит к значительно большему повышению уровня секреции по сравнению с модификацией каждого отдельно (таблица 3.2). Это позволяет сделать заключение о тесной взаимосвязи функций этих районов, несмотря на то, что мутация в N-области приводит к уменьшению секреции, когда эта модификация сочетается с повышением гидрофобности центрального участка, происходит резкое увеличение секреции (ILco1-ENDO, ILco3-ENDO). Таким образом, эти результаты говорят 51 о том, что основная аминоконцевая и гидрофобная коровая области сигнальной последовательности функционируют как единое целое. Важная роль гидрофобного домена была показана и ранее [175]. Были синтезированы химерные белки, состоящие из зрелого белка пре-пролактина и сигнальных пептидов, в которых гидрофобная часть (6 – 17 аминокислот) была заменена различным числом остатков лейцина, и исследовали эффективность транслокации in vitro в системе клеток млекопитающих. Авторы установили, что эффективность транслокации через ЭР-мембрану зависела от протяженности лейцинового участка и достигала максимума при 10 остатках, но уменьшалась при дальнейшем увеличении числа лейцинов до 20 (в случае E.coli оптимальная длина лейциновой цепи была 8 – 10 и отклонение в ту или иную сторону на две аминокислоты приводило к резкому падению уровня транслокации [176]. Кроме того, ими были также синтезированы химерные белки с сигнальными последовательностями, в которых указанная выше область (гидрофобный домен) была заменена на аминокислоты лейцин+аланин (в равном соотношении). Результаты оказались аналогичными лейциновой серии лидеров, однако максимальный уровень транслокации достигался при более высоком содержании лейцин+аланин (14 аминокислот по сравнению с 10-ю лейцинами). Авторы объясняют это меньшей гидрофобностью аланина и делают вывод о том, что общая гидрофобность, а не протяженность центрального домена определяют уровень транслокации, и, следовательно, секреции белков. Используя базу данных секретируемых пептидов и программы компьютерного моделирования [177,178,179]; были оптимизированы и синтезированы несколько лидерных последовательностей [180]. Для оценки их эффективности в клетках человека, авторы разработали модельную систему на основе секреторного белка – плацентарной щелочной фосфатазы - SEAP. SEAP – природный секретируемый белок со своим сигнальным пептидом (MLLLLLLLGLRLQLSLG), который был заменен на синтетические последовательности, и такие химерные гены были встроены в экспрессирующую кассету на основе векторной рDNA3.1 (рисунок 3.5). 52 Природный-MLLLLLLLGLRLQLSLG 38- MWWRLWWLLLLLLLLWPMVWA 34- MRPTWAWWLFLVLLLALWAPARG 32- MKVQWLLLWVLLLLVLFCSRAQG 30- MRPWTWVLLLLLLICAPSYA 28- MMWLWLVLLLLCLAGNVQA 24- MPPKKCLLLLLTLLLLISTTFG 20- MAGGVAGLLLALLLPSALS 16-MKLLLIFFVLVVWMGPAHR 12-VRGVLALLLMALQMDASSPLG 8-MSADCSWGAAFGALLPLAAG 4-MTKHLGVLFAGFTSADVSMQEA 2-MIFNPMVVFLFCVSNHALR 1-MDLVSWTFMEVSTLVLPKRP 0-MLAALRRACTSACRVPIKPTHLAQG Рисунок 3.5 - Искусственные сигнальные последовательности [180]. Полученными конструкциями трансфицировали клетки человека HEK293 и измеряли ферментативную активность и в среде, и в лизатах клеток. Отношение активностей характеризовало “силу” лидера. Данные приведены на рисунке 3.6. Как видно из рисунка, авторам удалось найти последовательность лидера, обладающего значительно большей эффективностью по сравнению с природным как в общей продукции белка, так и в его секреции. BLAST – поиск в GenBank не обнаружил какой-либо гомологичной природной сигнальной последовательности [180]. Чтобы определить, содержит ли этот сигнал корректный сайт протеолиза, авторы секвенировали N-концевую часть нескольких белков (TR6, TL7, хемокин β-7), полученных в человеческих клетках с использованием этой сигнальной последовательности (вместо природной): структура секвенированных участков полностью соответствовала структуре природных белков. 53 Рисунок 3.6 - Сравнение эффективности синтетических лидерных последовательностей pSEAP – конструкция с природным лидером Полученные результаты позволили авторам сделать вывод о возможности ранжирования природных сигнальных пептидов по их эффективности, используя современные программы. Сводная таблица, приведенная авторами, содержит около 200 лидерных последовательностей секретируемых белков человека. Stern и Knappskog также исследовали влияние различных лидерных пептидов на продукцию/секрецию рекомбинантного белка на примере гуманизированной люциферазы (Gaussia Luciferase) в трансфицированных клетках СНО [181,182]. В экспериментах природный лидер люциферазы был заменен на сигнальную последовательность человеческого альбумина и интерлейкина-2 поскольку известно, что эти белки секретируются с высокой эффективностью в клетках млекопитающих. Измерение ферментативной активности секретируемого фермента показало, что сигнальный пептид IL-2 значительно снижал уровень продукции и секреции, а в случае использования лидера альбумина и продукция, и секреция были на очень низком уровне. Предполагая возможное влияния N-концевой области “родного” белка на функцию лидера, авторы получили конструкции, в которых между сигналом и геном люциферазы присутствовала последовательность про-альбумина. Однако это не привело к увеличению продукции активного фермента. С другой стороны, наличие этих лидеров не оказывало существенного влияния на уровень РНК (89% и 77% соответственно); очевидно, что снижение продукции активного фермента связано с пост-транскрипционными событиями. Так как сигнальный пептид люциферазы хорошо проявил себя в системе клеток млекопитающих, авторам казалось важным 54 протестировать его на секрецию эукариотических белков. Для этой цели были сконструированы химеры, содержащие кодирующие области эндостатина и лидерных пептидов альбумина и люциферазы. Оказалось, что уровень продукции человеческого эндостатина был значительно выше при использовании сигнального пептида люциферазы. Полученные данные без сомнения доказывают возможность использования неэукариотических сигнальных последовательностей для наработки эукариотических белков. Более того, авторы обращают внимание на перспективность использования именно сигнального пептида люциферазы. Oosterhoff и соавторы использовали лидерную последовательность легкой цепи иммуноглобулина (Ig kappa) для получения секретируемой карбоксилэстеразы в COS-7 клетках, используемой в про-драг терапии, и показали его высокую эффективность [183]. Эта лидерная последовательность была использована и при получении секретируемого химерного белка трансактиватора транскрипции (ТАТ) и апоптина (Ар) для онкологических целей [184]. Имеется много примеров использования лидерных последовательностей для эффективной секреции внутриклеточных, мембран-связанных белков и белков, которые изначально секретируются по механизмам, не связанным с сигнальными пептидами. Так, сигнальный пептид гормона роста человека (hGH) был использован для секреции внутриклеточного белка icIL-1ra-II (WO26562). Morris с соавт. описывают использование сигнального пептида hGH для секреции природного мембран-связанного белка CDL40L [185], а Pecceu с соавторами – для экспрессии и секреции зрелой формы интерлейкина-1β (IL-1β), у которого отсутствует свой лидер и его секреция – это процесс, зависимый от клеточных ферментов [186]. Авторы показали, что использование сигнального пептида hGH приводит к 97% выходу IL-1β из клетки. В патенте Chitlary защищает метод продукции и секреции рекомбинантных белков с использованием сигнального пептида hGH вместо природного или эндогенного [187]. В качестве примера приводится метод получения интерлейкин-18-связывающего белка (IL18BP) – ингибитора провоспалительного цитокина интерлейкина-18 (IL18). Таким образом, анализ лидерных (сигнальных) последовательностей показал, что все они состоят из трех консервативных доменов: амино-концевая полярная область (nregion), центральный гидрофобный домен (h-region) и С-концевой нейтральный гидрофильный домен (с-region). В состав n-region входят положительно заряженные и полярные аминокислоты, которые закрепляют и удерживают секретируемый белок на мембране, тем самым обеспечивая функционирование h-region. Центральная часть сигнальной последовательности содержит не менее 7-8 гидрофобных аминокислот. В 55 случае эукариотических белков в этом районе доминирует Leu, далее следуют Val, Ala, Phe и Ile. Специфичность отщепления белка сигнальными пептидазами определяется последними тремя аминокислотами с-region. Аминокислоты в этих позициях должны быть маленькие и нейтральные, предпочтительным является Ala. Оптимальная длина лидерной последовательности составляет 22 а.к. Основываясь на этих данных, на следующем этапе работы нами были сконструированы инсерционные плазмиды с модифицированными лидерными последовательностями для секреции пептида лактаптина в составе вируса осповакцины. 3.2.3 Получение универсальной векторной плазмиды для встройки чужеродных генов в район вирусного гена С11R, кодирующего фактор роста вируса осповакцины (ВОВ) За основу была взята ранее синтезированная плазмида pXJP-P7,5synth-PE/L-Pat (рисунок 3.7), в которой последовательно расположены: левый от EcoRI сайта фрагмент гена тимидинкиназы ВОВ (tk-ген) (левый фланк рекомбинации, TK-flank 1), раннепоздний синтетический промотор Р7,5, полилинкер для встройки чужеродных генов, правый от EcoRI сайта фрагмент tk-гена и последовательность К3R, расположенная в геноме сразу за tk-геном (правый фланк рекомбинации, ТК-flank 2); для отбора рекомбинантных клонов ВОВ введен ген устойчивости к пуромицину под контролем другого ранне-позднего синтетического промотора PE/L ВОВ. Рисунок 3.7 - Физическая карта плазмиды pXJP-P7,5synth-PE/L-Pat. Puro – ген устойчивости к пуромицину, Ap – ген устойчивости к ампициллину 56 В этой плазмиде ТК-фланки были заменены на последовательности ВОВ, содержащие ОРТ C10L (L-flank) и ОРТ C12L (R-flank) и расположенные слева и справа от гена С11R в геноме ВОВ соответственно. Фрагменты генома ВОВ были получены полимеразной цепной реакцией с использованием в качестве матрицы ДНК ВОВ штамм Л-ИВП и следующих пар праймеров: - для получения фрагмента R-flank длиной 980 п.н., содержащего ОРТ C12L и фланкированного сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции EcoRI и PvuII EcoRI R-flank Up: 5’ – ctcccgaattcTCAGAAAACCCAAACACTACAACGT PvuII R-flank Low: 5’ – cttctcagctgGGAAACACCGATATGTGGAGGC - для получения фрагмента L-flank длиной 939 п.н., содержащего ОРТ C10L и фланкированного сайтами узнавания эндонуклеаз рестрикции SalI и Nsil Nsil L-flank Up: 5’ – cccccatgcatCACCATCATATCAACGCTGGTAACTAT SalI L-flank low: 5’ – tttccgtcgacTCAGTGTGTGTTTATGACAAGATTGGG Получение универсальной векторной плазмиды проводили в два этапа. На первом этапе конструирования ТК-flank 2 был замещен на R-flank гена С11R. Для этого ДНК pXJP-P7,5synth-PE/L-Pat и ПЦР-фрагмент ДНК ВОВ R-flank были обработаны ферментами рестрикции PvuII и EcoRI, очищены в агарозном геле и выделены с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (рисунок 3.8). Рисунок 3.8 - Анализ векторной ДНК и ПЦР-фрагмента. Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1 - pXJP-P7,5synth-PE/L-Puro+EcoRI+PvuII 2 – ПЦР-фрагмент (R-flank, 980 п.н.), нанесено по 2 мкл 57 В результате совместного лигирования ПЦР-фрагмента и вектора и трансформации компетентных клеток E.coli XL-Blue были получены клоны, из которых выделена ДНК. Обработка ДНК клонов рестриктазой BglII, один из сайтов узнавания которой лежит внутри клонируемого фрагмента, позволила отобрать два клона, содержащих фрагмент расчетной длины (708 п.н.). Полученную плазмидную ДНК, обозначенную как pXJPRflank VGF, дополнительно анализировали с использованием ферментов рестрикции XbaI и EcoRV (рисунок 3.9). М 1 2 Рисунок 3.9 - Рестрикционный анализ ДНК плазмиды pXJP-RflankVGF. Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1 - + XbaI (4013, 406, 149, 51); 2 - + XbaI + EcoRV (3350, 663, 406, 149, 51) Физическая карта плазмиды pXJP-RflankVGF приведена на рисунке 10. Рисунок 3.10 - Физическая карта плазмиды pXJP-RflankVGF Pat – ген устойчивости к пуромицину, Ap – ген устойчивости к ампициллину 58 На втором этапе TK-flank1 в плазмиде pXJP-Rflank VGF был замещен на ПЦРфрагмент - L-flank C11R генома ВОВ. Для этого ДНК и ПЦР-фрагмент (праймеры приведены выше) были обработаны рестриктазами Nsil и SalI и выделены из агарозного геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (рисунок 3.11). М 1 2 Рисунок 3.11 - Анализ векторной ДНК и ПЦР-фрагмента. Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1 - pXJP-Rflank VGF + Nsil + SalI; 2 – ПЦР-фрагмент (L-flank, 939 п.н.), нанесено по 2 мкл. В результате совместного лигирования ПЦР-фрагмента и вектора и трансформации компетентных клеток E.coli XL-Blue были получены клоны, из которых выделена ДНК. Обработка ДНК клонов рестриктазой PvuII, 2 сайта узнавания которой лежат внутри клонируемого фрагмента, позволила отобрать два клона, содержащих фрагмент расчетной длины (1560 п.н.). Полученную плазмидную ДНК pVGF-PE/L-Pat дополнительно анализировали с использованием ферментов рестрикции (рисунок 3.12). M 1 2 3 4 5 6 7 8 M Рисунок 3.12 - Рестрикционный анализ pVGF-PE/L-Pat. Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1, 2 – кл. 1,2 + AvaII + XbaI (1533, 1334, 820, 406, 332, 222, 149, 110, 51 п.н.); 3,4 - кл. 1,2 + PvuII + EcoRI (3385, 988, 572, 12 п.н.); 5,6 - кл. 1,2 + ZspI + XbaI (3063, 1288, 406, 149,51 п.н.); 7,8 - кл. 1,2 + PvuII (3385, 1560, 12 п.н.) 59 Физическая карта pVGF-PE/L-Pat приведена на рисунке 3.13. Рисунок 3.13 - Физическая карта плазмиды pVGF-PE/L-Pat В этой плазмиде содержатся ген устойчивости к пуромицину Pat под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L (для селекции рекомбинантных клонов ВОВ), левый и правый фланки гена С11R ВОВ штамма Л-ИВП для гомологичной рекомбинации, приводящей к делеции гена С11R, синтетический ранне-поздний промотор Р7,5 и следующий за ним полилинкер для встройки целевых генов; селективный маркер ген устойчивости к ампициллину. 3.2.4 Получение инсерционных плазмид, содержащих ген лактаптина (FR2фрагмент), для встройки в район гена С11R ВОВ штамма ЛИВП, кодирующего вирусный фактор роста 3.2.4.1 Получение инсерционной плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat Исходным вектором для конструирования рекомбинантной плазмиды явилась синтезированная выше ДНК pVGF-PE/L-Pat. В полилинкер этой плазмиды, расположенный между двумя фланками генома ВОВ, под контроль синтетического раннепозднего промотора Р7,5 (P7,5synth) ВОВ был введен фрагмент гена каппа-казеина человека, кодирующий пептид с 24 по 134 аминокислотные остатки и гистидиновый тракт из 6-ти а.о. (рисунок 3.14). 60 Met Asn Gln Lys Gln Pro Ala Cys His Glu Asn Asp Glu Arg ATGAACCAGAAACAACCAGCATGCCATGAGAATGATGAAAGAC Pro Phe Tyr Gln Lys Thr Ala Pro Tyr Val Pro Met Tyr Tyr CATTCTATCAGAAAACAGCTCCATATGTCCCAATGTATTA Val Pro Asn Ser Tyr Pro Tyr Tyr Gly Thr Asn Leu Tyr TGTGCCAAATAGCTATCCTTATTATGGAACCAATTTGTAC Gln Arg Arg Pro Ala Ile Ala Ile Asn Asn Pro Tyr Val CAACGTAGACCAGCTATAGCAATTAATAATCCATATGTGC Pro Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Pro Ala Val Val Arg Pro His CTCGCACATATTATGCAAACCCAGCTGTAGTTAGGCCACA Ala Gln Ile Pro Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Asn Ser His TGCCCAAATTCCTCAGCGGCAATACCTGCCAAATAGCCAC Pro Pro Thr Val Val Arg Arg Pro Asn Leu His Pro Ser CCACCCACTGTGGTACGTCGCCCAAACCTGCATCCATCAT Phe Pile Ala Ile Pro Pro Lys Lys Ile Gln Asp Lys Ile Ile TTATTGCCATCCCCCCAAAGAAAATTCAGGATAAAATAAT Ile Pro Thr Ile Gly Gly Ser His His His His His His Stop CATCCCTACCATCGGCGGATCACATCACCATCACCATCACTAA Рисунок 3.14 - Нуклеотидная и аминокислотная последовательности фрагмента каппаказеина человека с 24 по 134 аминокислотные остатки (лактаптин) и гистидиновый тракт Фрагмент ДНК, кодирующий район каппа-казеина, был получен методом ПЦР на матрице ДНК pGSD/FR2 (рисунок 3.15) [10] с использованием пары праймеров, обеспечивающих наличие в амплификационном фрагменте сайтов рестрикции HindIII и EcoRI: HindIII FR2 For (S2): 5’ –aatccaagcttATGAACCAGAAACAACCAGCA EcoRI FR2 Rev (S2): 5’ –ctatcgaattcTTAGTGATGGTGATGGTGATGTG Рисунок 3.15 - Физическая карта плазмиды pGSD/FR2 61 Векторная ДНК и продукт амплификации, кодирующий фрагмент каппа-казеина человека, были обработаны рестриктазами HindIII и EcoRI; затем ПЦР-фрагмент и линеаризованный вектор очищали электрофорезом в 1,5% агарозном геле с последующим выделением ДНК с помощью набора QIAquick Gel Extraction («Qiagen», США) в соответствии с рекомендациями производителя. В результате лигирования векторной ДНК и фрагмента, кодирующего фрагмент каппа-казеина человека, была получена инсерционная плазмида pVGF-FR2-PE/L-Pat. Рестрикционный анализ ДНК двух клонов pVGF-FR2-PE/L-Pat приведен на рисунке 3.16. М 1 2 3 4 Рисунок 3.16 - Рестрикционный анализ ДНК pVGF-FR2-PE/L-Pat. 1,2 – pVGF-FR2-PE/L-Pat кл. 5,8 + HindIII + EcoRI (4945, 372 п.н.); 3,4 – pVGF-FR2-PE/L-Pat кл. 5,8 + PvuII (д. б. 3385, 1168 и 752 п.н.). Нуклеотидная последовательность клонированного фрагмента была подтверждена секвенированием. Физическая карта полученной плазмидной ДНК приведена на рисунке 3.17. 62 Рисунок 3.17 - Физическая карта плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat. L-flank и R-flank –фрагменты генома ВОК, фланкирующие ген VGF слева и справа; PE/L и P7,5 synth – промоторы ВОВ; Pat – ген устойчивости к пуромицину; FR2 – ген лактаптина ДНК плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat содержит левый и правый фланки гена С11R, кодирующего вирусный фактор роста ВОВ штамма Л-ИВП; синтетический ранне-поздний промотор Р7,5; ген лактаптина (FR2); ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L (для отбора рекомбинантных клонов ВОВ); селективный маркер - ген устойчивости к ампициллину. 3.2.4.2 Клонирование гена лактаптина с сигнальной последовательносью GMCSF+15 аминокислот GM-CSF – получение инсерционной плазмиды pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat Для получения секретируемого варианта лактаптина решено было использовать сигнальную последовательность гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ, GM-CSF), который является секретируемым белком и эффективность экспрессии которого в составе рекомбинантного ВОВ была нами исследована. Кроме непосредственно лидерной последовательности ГМ-КСФ для секреции важна также примыкающая к ней N-концевая часть белка в размере 15 аминокислотных остатков. Для сохранения корректности трансляции нами был также сохранен фрагмент матричной РНК ГМ-КСФ, расположенный перед сигнальной последовательностью (рисунок 3.18). P R V R A K V L W R M W L Q S L CCACGCGTCCGGGCTAAAGTTCTCTGGAGGATGTGGCTGCAGAGCCTG L L L G T V A C S I S A P A R S CTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCG P S P S T Q P T E H CCCAGCCCCAGCACGCAGCCCTGGGAGCAT Рисунок 3.18 - Нуклеотидная последовательность сигнального пептида с первыми 15-ю аминокислотами ГМ-КСФ. Красным выделен сигнальный пептид, зеленым – фрагмент ГМ-КСФ, первые 10 аминокислот – участок мРНК. Представленная на рисунке 3.18 последовательность была ранее успешно использована нами для получения секретируемой формы белка р53 в составе рекомбинантного вируса осповакцины, поэтому конструирование инсерционной плазмиды для встройки гена лактаптина проводили в два этапа. На первом этапе была 63 получена промежуточная плазмида pXJP-Sign-FR2-PE/L-Pat, в которой ген лактаптина встроен сразу за лидерной последовательностью ГМ-КСФ. Для получения вектора для встройки гена лактаптина плазмида pXJP5.2-S2-(GM-CSF)-p53-PE/L-Puro (рисунок 3.19) была обработана рестриктазами EcoRI и HindIII с целью удаления гена р53 из химеры с лидерной последовательностью гена ГМ-КСФ. Рисунок 3.19 - Физическая карта плазмиды pXJP5.2-S2-(GM-CSF)-p53-PE/L-Puro. Leader – лидерная последовательность ГМ-КСФ, GM-CSF – фрагмент гена (первые 15 а.к.) ГМ-КСФ Фрагмент FR2 был получен полимеразной цепной реакцией на матрице ДНК плазмиды pGSD/FR2 [10] с использованием пары праймеров, содержащих сайты рестрикции EcoRI и HindIII: HindIII FR2 For (S2): 5’ – aatccaagcttATGAACCAGAAACAACCAGCA EcoRI FR2 Rev (S2): 5’ –CTATCgaattcTTAGTGATGGTGATGGTGATGTG Линеаризованная ДНК и продукт аплификации были обработаны рестриктазами HindIII и EcoRI, очищены электрофорезом в 1,5% агарозном геле с последующим выделением ДНК с помощью набора QIAquick Gel Extraction («Qiagen», США). После совместного лигирования, трансформации и выделения рекомбинантных клонов (наличие фрагмента 1121 п.н. после обработки рестриктазой PvuII, один из сайтов которой имеется в клонируемом фрагменте), была получена плазмида pXJP-Sign-FR2-PE/L-Pat. Анализ трех выделенных клонов полученной ДНК с помощью ферментов рестрикции приведен на рисунке 3.20. Все клоны имеют расчетную структуру. 64 М 1 2 3 4 5 6 М 7 8 9 10 11 12 М 13 14 15 Рисунок 3.20 - Рестрикционный анализ ДНК pXJP-Sign-FR2-PE/L-Pat. Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1,2,3 – кл.1,2,3 + PvuII (4172, 1121 п.н.); 4,5.6 – кл. 1,2,3 + SalI+EcoRI (4513, 780 п.н.); 7,8,9 – кл. 1,2,3 +BmeI (AvaII) (3619, 821, 332, 222, 189, 110 п.н.); 10,11,12 – кл. 1,2,3 + BmeI+EcoRI (2379, 1240, 821, 332, 222,189, 110); 13,14,15 – кл. 1,2,3 + EcoRI+HindIII (4921, 372 п.н.); длины фрагментов соответствуют расчетным. Физическая карта полученной плазмиды pXJP-Sign-FR2-PE/L-Pat приведена на рисунке 3.21. Рисунок 3.21 - Физическая карта pXJP-Sign-FR2-PE/L-Pat. P7,5 natur – природный фрагмент генома ВОВ (120 п.н.), обладающий промоторной активностью – см выше. ДНК плазмиды pXJP-Sign-FR2-PE/L-Pat была использована в качестве матрицы для ПЦР при получении кассеты, содержащей FR2 и сигнальную последовательность ГМКСФ. Для этого была использована пара праймеров, которые фланкированы сайтами узнавания рестриктаз NheI и EcoRI: 65 NheI FR2 For (S2)-VGF: 5’ – gcatcgctagcCCACGCGTCCGGGCTAAA EcoRI FR2 Rev (S2)-VGF: 5’ –ctatcgaattcTTAGTGATGGTGATGGTGATGTG После обработки векторной ДНК pVGF-PE/L-Pat и продукта аплификации рестриктазами NheI и EcoRI, очистки электрофорезом в 1,5% агарозном геле с последующим выделением ДНК с помощью набора QIAquick Gel Extraction («Qiagen», США) была проведена лигазная сшивка, трансформация компетентных клеток E.coli XLBlue и анализ клонов. Отбор рекомбинантных клонов был проведен по наличию фрагментов 1168 и 878 п.н. после обработки рестриктазой PvuII. Полученная инсерционная плазмида была названа pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat. Рестрикционный анализ трех отобранных клонов приведен на рисунке 3.22. М 1 2 3 4 5 6 М Рисунок 3.22 - Рестрикционный анализ клонов плазмиды pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat. Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1 – 3 – кл.1,2,3 + HaeIII; 4 – 6 - кл.1,2,3, + BglII (4249, 1194 п.н.) Структура встроенного фрагмента ДНК двух клонов была подтверждена секвенированием. Поскольку структура клонов совпадала, для дальнейшей работы ДНК одного из секвенированных клонов была наработана в препаративном варианте, выделена с использованием набора QIAgen EndoFree Plasmid Maxi Kit и дополнительно пронализирована (рисунок 3.23). 66 М 1 2 3 Рисунок 3.23 - Рестрикционный анализ ДНК плазмиды pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat (препаратив). Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1 + EcoRI+SalGI (5071, 546 п.н.), 2 - + PvuII (3385, 1168, 878, 12 п.н.), 3 - + NheI+EcoRI (4939, 504 п.н.) Как следует из рисунка 3.23 структура полученной инсерционной плазмиды pVGFSign-FR2-PE/L-Pat соответствует расчетной. Плазмида pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat содержит левый и правый фланки гена С11R, кодирующего вирусный фактор роста ВОВ штамма ЛИВП для гомологичной рекомбинации с вирусной ДНК, синтетический ранне-поздний промотор Р7,5 ВОВ, последовательность, кодирующую сигнальный пептид и первые 15 аминокислот ГМ-КСФ, ген лактаптина (FR2); ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L ВОВ (обеспечивает отбор рекомбинантных клонов ВОВ); селективный маркер - ген устойчивости к ампициллину. Физическая карта pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat приведена на рисунке 3.24. Рисунок 3.24 - Физическая карта плазмиды pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat. Sign (GM-CSF) – сигнальный пептид 67 3.2.4.3 Клонирование гена лактаптина с сигнальной последовательносью GMCSF– получение инсерционной плазмиды pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat Для последующего сравнения уровня секреции лактаптина в составе рекомбинантного вируса осповакцины нами был также сконструирован вариант инсерционной плазмиды с укороченным лидерным фрагментом GM-CSF, не содержащим 15 N-концевых аминокислот белка. Такая конструкция может обеспечить большее сохранение апоптоз-индуцирующих свойств лактаптина в отношении раковых клеток, хотя может привести и к снижению уровня секреции. Поскольку вклад этих двух процессов – секреция и апоптоз, индуцируемый лактаптином – в онколизис еще только предстоит изучить, необходимо иметь разные варианты конструкций, включая несекретируемую, средне и высоко секретируемую формы лактаптина. Конструирование инсерционной плазмиды также проводили в два этапа. На первом этапе была получена промежуточная плазмида pXJP-S short-FR2-PE/L-Pat, в которой ген лактаптина был встроен сразу за укороченной сигнальной последовательностью ГМ-КСФ. Для этого плазмида pXJP5.2-S-(GM-CSF)-p53-PE/L-Puro (рисунок 3.25), содержащая укороченный лидерный фрагмент гена GM-CSF (рисунок 3.26) в составе химеры с геном р53, была обработана рестриктазами EcoRI и HindIII, и линеаризованная ДНК была выделена, как описано ранее. Рисунок 3.25 - Физическая карта ДНК плазмиды pXJP5.2-S-(GM-CSF)-p53-PE/L-Puro 68 P R V R A K V L W R M W L Q S L CCACGCGTCCGGGCTAAAGTTCTCTGGAGGATGTGGCTGCAGAGCCTG L L L G T V A C S I S CTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCT Рисунок 3.26 - Нуклеотидная последовательность укороченного сигнального пептида ГМКСФ. Желтым выделен сигнальный пептид, первые 10 аминокислот – участок мРНК. Фрагмент FR2, фланкированный сайтами рестрикции EcoRI и HindIII, был использован тот же, что и при получении промежуточной плазмиды pXJP-Sign-FR2-PE/LPat. После совместного лигирования, трансформации и выделения рекомбинантных клонов (наличие фрагмента 372 п.н. после обработки рестриктазами RI +Hind и 459 п.н. после обработки рестриктазами RI+Bam) была получена плазмида pXJP- S short -FR2PE/L-Pat (рисунок 3.27). Рисунок 3.27 - Физическая карта плазмиды pXJP- S short -FR2-PE/L-Pat. P7.5 natur – природный фрагмент генома ВОВ (120 п.н.), обладающий промоторной активностью – см выше. Sign – укороченный сигнальный пептид Полученная ДНК pXJP-S short-FR2-PE/L-Pat была использована в качестве матрицы в ПЦР при получении фрагмента, содержащего ген лактаптина с лидерной последовательностью гена ГМ-КСФ с помощью праймеров, уже использованных ранее при клонировании лактаптина с удлиненной сигнальной последовательностью (сигнал + 15 аминокислот ГМ-КСФ): 69 NheI FR2 For (S2)-VGF: 5’ – gcatcgctagcCCACGCGTCCGGGCTAAA EcoRI FR2 Rev (S2)-VGF: 5’ –ctatcgaattcTTAGTGATGGTGATGGTGATGTG После обработки рестриктазами фрагмент был выделен с помощью набора QIAquick Gel Extraction и лигирован с векторной ДНК pVGF-PE/L-Pat (NheI – EcoRI) (рисунок 3.28). М 1 2 Рисунок 3.28 - Анализ компонентов лигазной смеси. Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1 - pVGF-PE/L-Pat (NheI – EcoRI), 2 – ПЦР – фрагмент, содержащий ген лактаптина Лигазной смесью трансформировали компетентные бактериальные клетки, из нескольких колоний были выделены плазмидные ДНК и проанализированы с помощью рестриктазы PvuII, один из сайтов которой имеется внутри клонированного фрагмента (рисунок 3.29). М 1 2 3 4 5 6 М 7 8 9 10 11 12 Рисунок 3.29 - Анализ ДНК клонов с использованием PvuII. Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1 – 12 – ДНК клонов 1 – 12 Наличие в гидролизатах фрагментов, соответствующих расчетным (3385, 1168, 833 п.н.), позволило выбрать два клона, которые были наработаны для последующей 70 трансфекции эукариотических клеток в препаративном количестве, выделены с использованием набора QIAgen EndoFree Plasmid, чтобы удалить примеси эндотоксинов, и дополнительно охарактеризованы (рисунок 3.30). М 1 2 3 4 5 6 М М 7 8 9 10 Рисунок 3.30 - Рестрикционных анализ препаративно наработанных и очищенных в условиях Endo-free плазмидных ДНК (2 клона): Электрофорез в 1,5% агарозном геле. 1, 2 – кл. 3, 4 + PvuII (3385, 1168, 833 п.н.); 3, 4 – кл. 3, 4 + EcoRI + SalI (4897, 501 п.н.); 5, 6 – кл. 3, 4 + BglII (4249, 1149 п.о.); 7, 8 - кл. 3, 4 + AvaII (3914, 820, 332, 222, 110 п.н.); 9, 10 - кл. 3, 4 + HaeIII (1579, 1102, 587, 458, 434, 267, 220, 210 … п.н.). Полученная инсерционная плазмидная ДНК была названа pVGF-S short-FR2-PE/LPat. Ее физическая карта представлена на рисунке 3.31. Рисунок 3.31 - Физическая карта плазмиды pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat. Sign – укороченная сигнальная последовательность ГМ-КСФ. Остальные обозначения как на рисунке 3.17 и рисунке 3.27. 71 Сконструированная инсерционная плазмида pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat содержит левый и правый фланки гена С11R, кодирующего вирусный фактор роста ВОВ штамма ЛИВП для гомологичной рекомбинации, и далее последовательно: природный раннепоздний промотор Р7,5К ВОВ, последовательность, кодирующую усеченный сигнальный пептид, ген лактаптина (FR2); ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L ВОВ, который обеспечивает отбор рекомбинантных клонов ВОВ; селективный маркер - ген устойчивости к ампициллину. Выводы Разработана методика конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины, штамм ЛИВП. Для эффективной экспрессии гена лактаптина и гена селективного маркера (обеспечивает устойчивость к пуромицину рекомбинантных вирусов) на первом этапе работы были синтезированы два ранне-поздних промотора ВОВ. Размер синтетических промоторов составляет последовательности не 36 (P7,5) и перекрываются, 42 что (РE/L) п.н., соответственно, предотвращает и их внутримолекулярную рекомбинацию при конструировании нескольких трансгенных оперонов в составе одной инсерционной плазмиды. Согласно разработанной методике сконструированы три инсерционные плазмиды для последующего получения рекомбинантных вариантов вируса осповакцины со встройкой гена лактаптина в структурную часть гена вирусного ростового фактора. Первая инсерционная плазмида pVGF-FR2-PE/L-Pat содержит левый и правый фланки гена С11R, кодирующего вирусный фактор роста ВОВ штамма Л-ИВП, синтетический ранне-поздний промотор Р7,5, ген лактаптина (FR2); ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L ВОВ. Эта плазмида обеспечит получение рекомбинантного варианта ВОВ, экспрессирующего внутриклеточную несекретируемую форму лактаптина. Поскольку лактаптин является белком, индуцирующим апоптоз раковых клеток человека, целесообразно, наряду с несекретируемой формой его экспрессии в составе вируса осповакцины, использовать также секретируемый вариант. Для получения секретируемого варианта лактаптина в качестве лидерного пептида использовали сигнальную последовательность гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ, GM-CSF) с примыкающей к ней N-концевой частью белка в размере 15 аминокислотных остатков и фрагментом матричной РНК ГМ72 КСФ, расположенный перед сигнальной последовательностью. С учетом всех этих данных нами была сконструирована инсерционная плазмида pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat, в которой, кроме фланков гена С11R, сразу за промотором Р7,5 ВОВ в единой рамке с геном лактаптина расположена последовательность, кодирующая сигнальный пептид и первые 15 аминокислот ГМ-КСФ; а также ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L ВОВ, который будет обеспечивать отбор рекомбинантных клонов ВОВ. Для последующего сравнения уровня секреции лактаптина в составе рекомбинантного вируса осповакцины нами был также сконструирован вариант инсерционной плазмиды с укороченным лидерным фрагментом GM-CSF, не содержащим 15 N-концевых аминокислот белка. Сконструированная плазмида pVGF-S short-FR2PE/L-Pat, также как и предыдущие, содержит левый и правый фланки гена С11R, природный ранне-поздний промотор Р7,5К ВОВ, последовательность, кодирующую усеченный сигнальный пептид (short вариант) в единой рамке трансляции с геном лактаптина (FR2); ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического раннепозднего промотора PE/L ВОВ. Все сконструированные нами инсерционные плазмиды будут использованы на следующем этапе для получения рекомбинантных вариантов вируса осповакцины. 73 4 Депонирование и паспортизация полученных инсерционных плазмид При выполнении работ 1 этапа проекта, согласно разработанной методике конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса (VGF), были сконструированы плазмиды pVGF-FR2-PE/LPat, pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat и pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat. Для конструирования плазмид использовался вектор pVGF-PE/L-Pat, содержащий левый и правый фланки гена С11R (кодирующего вирусный фактор роста) ВОВ штамма ЛИВП, синтетический ранний промотор Р7,5 ВОВ, ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L и полилинкер. Проведено депонирование инсерционных плазмид pVGF-FR2-PE/L-Pat и pVGFSign-FR2-PE/L-Pat в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номерами Р-57 и Р-56, соответственно. Получены паспорта плазмид и Справки о депонировании. Акт наработки плазмид, акт передачи материала в Государственную коллекцию Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Паспорта плазмид и Справки о депонировании приложены к Отчету о ПНИ отдельными документами. Плазмида pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat (короткий лидер + лактаптин) пока не депонирована, поскольку целесообразность этой конструкции еще предстоит изучить на следующем этапе работы. 74 5 Наработка штамма вируса Л-ИВП со встройкой гена ГМ-КСФ человека на клетках 4647, аттестованных для производства вакцин в России. Очистка и титрование вируса Работы по наработке и очистке штамма вируса Л-ИВП со встройкой гена ГМ-КСФ человека были проведены совместно с соисполнителем проекта ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» располагает лицензией на проведение вирусологических работ и имеет санитарное разрешение для проведения вирусологических работ с предполагаемыми вирусными агентами. Вирус осповакцины (ВОВ) имеет длительную и успешную историю медицинского применения в качестве живой вакцины при искоренении оспы на земном шаре [188]. В разных странах для вакцинации против оспы использовали разные штаммы вируса осповакцины. Одним из штаммов, который использовался в России, является Л-ИВП, биовариант штамма Листер (Lister) [189]. Для предотвращения возможных поствакцинальных осложнений разработан целый ряд аттенуированных вариантов вируса осповакцины с делециями участков генома, ответственных за вирулентность [190]. Ген тимидинкиназы (tk) является фактором вирулентности ВОВ, инактивация которого приводит к существенной аттенуации вируса in vivo [191]. Этот район генома широко используется для встройки чужеродных генов (трансгенов) с целью получения бивалентных вакцин (гены протективно значимых белков возбудителей вирусных и бактериальных заболеваний [192]. или онколитических препаратов (гены иммуностимулирующих, цитотоксических и других белков [3,45]. Вставка в геном вируса генов цитокинов в качестве трансгенов является универсальной технологией для повышения иммуностимулирующей активности вируса как при вакцинации, так и при лечении онкологических заболеваний [3]. ГМ-КСФ – полипептидный цитокин, относится к группе гранулоцитарномакрофагальных колониестимулирующих факторов. Стимулирует образование колоний гранулоцитов и макрофагов из коммитированных предшественников. ГМ-КСФ in vivo и in vitro не только стимулирует пролиферацию и созревание миелоидных клетокпредшественников, но может также усиливать различные функции зрелых эффекторных клеток: повышает способность нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов к фагоцитозу и разрушению микроорганизмов [193,194], увеличивает антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность в отношении опухолевых клеток [195,196]. ГМ-КСФ целесообразно использовать в случае комбинированного применения противоопухолевых препаратов вместе с химиотерапией для снижения тяжести нейтропении [65], а также в 75 комбинации с другими трансгенами, усиливающими онколитическую активность вируса, в частности, с геном апоптоз-индуцирующего белка лактаптина [8]. Ранее ген ГМ-КСФ человека был встроен в геном двух штаммов вируса осповакцины WR (JX-963) [2] и Wyeth (JX-594) [197] в район tk-гена под контролем ранне-позднего промотора ВОВ [198]. Штамм JX-594 был первым среди онколитических поксвирусов, с которым было разрешено проведение клинических испытаний. Этот штамм разработан в американской компании Jennerex Biotherapeutics и французской компании Transgene и получил коммерческое название pexastimogene devacirepvec – PexaVec. Терапевтическая эффективность Pexa-Vec обуславливается его прямым онколитическим действием, ГМ-КСФ индуцированным усилением противоопухолевого иммунитета, а также антиваскулярным эффектом вируса в опухолевых узлах [125,126, 127]. Штамм JX-963, кроме встройки гена ГМ-КСФ в tk-гене, содержит дополнительную делецию гена вирусного ростового фактора (virus growth factor, VGF). Этот штамм также разработан в американской компании Jennerex Biotherapeutics и в настоящее время проходит I фазу клинических испытаний для пациентов с солидными опухолями. Нами создан рекомбинантный штамм VV-GMCSF-S1/3 на основе российского вакцинного штамма ВОВ Л-ИВП. Этот штамм имеет ряд преимуществ по сравнению с вышеописанным штаммом JX-594 (Pexa-Vec) по следующим параметрам: - штамм Wyeth вируса осповакцины, на основе которого создан JX-594, никогда не использовался в России в качестве противооспенной вакцины и не известен российской медицинской общественности, поэтому использование Л-ИВП, как мы надеемся, упростит получение разрешения на проведение клинических испытаний будущих противоопухолевых вирусных препаратов в России; - уровень продукции ГМ-КСФ под контролем синтетического промотора в составе рекомбинантного штамма JX-594 очень низок – 20-40 пикограмм на мл культуральной среды при инфекции клеток с множественность 0,1 БОЕ/клетка [66], в то время как штамм VV-GMCSF-S1/3 продуцирует секретируемый ГМ-КСФ человека под контролем природного промотора ВОВ с эффективностью не ниже, чем 1 мкг/мл среды; - штамм JX-594, кроме гена ГМ-КСФ, несет в своем составе крупный фрагмент бактериальной ДНК свыше 3000 п.н. (ген ß-галактозидазы E.coli) в непосредственной близости от гена ГМ-КСФ, который может дестабилизировать структуру всего района встройки, и экспрессия которого под высокоэффективным промотором ВОВ р7,5К может негативно сказываться на жизнедеятельности клетки. 76 Исходя из вышесказанного, полученный нами рекомбинантный штамм VVGMCSF-S1/3 является перспективной платформой для получения на его основе противоопухолевых препаратов. Важным шагом в этой работе будет являться получение двойного рекомбинанта на основе VV-GMCSF-S1/3 со встройкой гена лактаптина в ген VGF c одновременной инактивацией последнего. Полученный двойной рекомбинант будет обладать высокой онкоселективностью за счет инактивации двух генов – факторов вирулентности (ТК и VGF), иммуностимулирующей (за счет экспрессии ГМ-КСФ) и апоптоз-индуцирующей (за счет экспрессии лактаптина) активностью в отношении опухолей человека, в частности, опухоли молочной железы. 5.1 Материалы и методы В работе были использованы следующие материалы: L-глутамин сухой (Fluka, USA), трипсин сухой (Invitrogen), версен (Диа-М), глицерин (Serva, Германия), кристаллический фиолетовый и агароза (Sigma, США), маркеры белка и ДНК для электрофореза (AppliChem), набор для определения концентрации белка «Bio-Rad Protein Assay Kit» (Bio-Rad, США), фетальная бычья сыворотка - ФБС (HyClone, USA), пластиковая культуральная посуда (Nunck, Дания), криопробирки, роллеры (Диа-М), среды DMEM и DMEM/F12 сухие (Invitrogen, США), диметилсульфоксид, сахароза, натрий бикарбонат (Amresco, Испания). В работе использовали также следующие реактивы: соляная кислота, гидроксид натрия, спирт этиловый, ледяная уксусная кислота; реактивы производства «Sigma» (США): акриламид, Трис-HCl, (гидроксиметил)аминометан (Трис), ацетат натрия, динатриевая бромистый соль этидий, трис- этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na2ЭДТА); ферменты и реактивы производства ЗАО «СибЭнзим», Taq ДНКполимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты; наборы для выделения вирусной ДНК: ДНКсорб (Интерлабсервис, Россия), DNA Blood Mini kit (Qiagen, США) и DNA extraction kit (Zymo Research, США). 5.1.1 Буферы и растворы TE: 1 мМ EDTA, 10 мМ Tris-HCl, pH 8.0; TAE: 40 мМ Tris-HCl, 40 мМ CH3COOH, 2 мМ EDTA, pH 8.0; PBS: одна таблетка PBS на 500 мл дистиллированной воды; Раствор трипсина: PBS 1X, 1 mM ЭДТА, 0,05% трипсин; TBS pH 7,6: 50 мM Tris, 150 мM NaCl, довести pH до pH 7.6 с помощью HCl; Лизирующий буфер: 150 мМ NaCl, 50 мM Tris, 1% Тритон Х-100, рН 7.6; 77 Краситель для электрофореза: 0,25% бромфеноловый синий, 30% глицерин в Н2О, 6х буфер TE. 5.1.2 Культуры клеток Все культуры были получены из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». CV1 – трансформированная культура клеток почки африканской зеленой мартышки; 4647 – аттестованная для производства вакцин в России культура клеток почки африканской зеленой мартышки; TF-1- цитокин-зависимые клетки эритролейкоза человека. 5.1.3 Культивирование и ростовая среда Культивирование получаемых клеточных линий проводили с использованием следующих вариантов ростовых сред: - среда DMEM c добавлением 10% ФБС, стандартной концентрации антибиотиков (ампициллин -100 мкг/мл, гентамицин -80-160 мкг/мл и амфотеррицин В – 25 мкг/мл); - среда F12/DMEM (1:1) c добавлением 10% ФБС, стандартной концентрации антибиотиков (пенициллин – 100 мкг/мл и стрептомицин – 100 мкг/мл); - среда 199 без фенолового красного для спектрофотометрического анализа жизнеспособности клеток; - среда RPMI c добавлением 10% ФБС и стандартной концентрации канамицина – 100 мкг/мл. 5.1.4 Криоконсервация и размораживание клеточных линий Для замораживания в жидком азоте (-1960С) клетки снимали с поверхности культуральных сосудов раствором трипсина с версеном (1:3), осаждали из суспензии центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин и суспендировали в среде для заморозки, состоящей из среды DMEM с добавлением 40-80% ФБС и 10% ДМСО. Концентрацию клеток доводили до 1-2 млн клеток/мл, клеточную суспензию расфасовывали в полиэтиленовые ампулы (Nunk, Дания) по 1 мл. Ампулы помещали в пары жидкого азота (минус 120ºС) или в холодильник (минус 70ºС) на 24 часа, после чего переносили непосредственно в жидкий азот. Размораживали клетки, помещая ампулы в теплую воду с температурой 37 - 41ºC, после чего отмывали клетки в среде DMEM с добавлением 10% ФБС и осаждали центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Далее клетки суспендировали в ростовой среде DMEM с 10% ФС и высевали в культуральные планшеты или стеклянные сосуды. 78 5.1.5 Вирус В работе использовали вирус осповакцины, штамм Л-ИВП, ранее полученный из коллекции вирусных штаммов проф. С.С. Маренниковой, НИИ вирусных препаратов РАМН (г. Москва) и рекомбинантный штамм VV-GMCSF-S1/3, полученный на его основе. Исходные стоки вирусов подращивали на культуре клеток CV-1. Титр вируса определяли методом бляшек на монослое клеток CV-1, окрашенном фиксирующим раствором кристаллического фиолетового (2 г/л кристаллический фиолетовый, 50 мл/л формальдегид, 100 мл/л этанол, вода). 5.1.6 Наработка и очистка вируса осповакцины Вирус нарабатывали в роллерном инкубаторе INCUDRIVE D-I (Schuett, Германия) с использованием роллерных бутылей 850 см2 (Corning, США) и V=1000 мл (Schuett, Германия). Для наработки использовали клетки почки африканской зеленой мартышки 4647. Вирус очищали в градиенте плотности сахарозы по следующей методике: 1) монослой клеток 4647, выращенный в роллерных бутылях, инфицировали вирусом осповакцины с множественностью 1,0 БОЕ/клетка; 2) инкубировали 48 часов при температуре 37ºС до образования 100% ЦПД, получали криолизат (три цикла замораживания-оттаивания) инфицированных клеток; 3) дебрис осаждали низкоскоростным центрифугированием 10 мин при 5000 об/мин; 4) супернатант концентрировали центрифугированием 14000 об/мин, 1,5 часа; 5) осадок восстанавливали в 0,05 М Трис, рН 9.0, обрабатывали ультразвуком и выделяли вирус центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (25-45%); 6) хорошо видимый вирусный бэнд отбирали, разводили в соотношении 1:2 0,05 М Трис, рН 9.0 и осаждали очищенный вирус 14000 об/мин, 1,5 часа; 7) осадки после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы объединяли суспендированием в 11 мл буфера 0,05 М Трис-HCl, рН 9.0 и титровали методом бляшек на монослое клеток CV-1. 5.1.7 Оценка стабильности генома рекомбинантного штамма вируса осповакцины Оценку стабильности встройки гена ГМ-КСФ проводили методом ПЦР с использованием рассчитанных праймеров для районов гена вирусной тимидинкиназы. Для подтверждения рекомбинантного фенотипа рассчитывали две пары праймеров: одна пара лежит во фланкирующих место встройки последовательностях вирусного генома, вторая включает праймер, лежащий внутри гена 79 ГМ-КСФ, и праймер на геномной последовательности, тем самым осуществляя привязку встройки к определенному району вирусного генома. Расчет структур праймеров выполняли в среде ПО «Vector NTI v.9.1» производства «Madison Inc.» (США), специфичность полученных последовательностей оценивали, используя программу «BLAST», интегрированную в систему базы данных «GenBank». Обработку и анализ нуклеотидных последовательностей проводили в среде ПО «Vector NTI v.9.1» производства «Madison Inc.» (США) и ПО секвенатора «ABI 3130xl» (США). В качестве контоля использовали ДНК, выделенную из дикого типа вируса осповакцины штамма Л-ИВП. Вирусную ДНК выделяли по следующей методике: 1) осаждение дебриса - 1,5 мл вирусной суспензии центрифугировали при 3000об/мин 5 минут; 2) осаждение вируса - супернатант переносили в центрифужные пробирки к ротору JA-21 (10 мл) и центрифугировали 1 час при 18000 об/мин; 3) осадок ресуспендировали в 100 мкл ТЕ или воды; 4) к ресуспендированному осадку добавляли 170 мкл 46% сахарозы, 10 мкл 30% саркозила, 20 мкл протеиназы К (10 мг/мл), 6 мкл 5 М NaCl, мкл 0,5М ЭДТА, и инкубировали 2 часа при 56ºС; 5) экстрагировали белки равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1), к водной фазе добавляли 1:10 3 М NaAc pH 5,5 и изопропанол в равном объеме, и инкубировали ночь при -20ºС, 6) центрифугировали при 10000 об/мин 10 минут; 7) осадок подсушивали и растворяли в 100 мкл воды, добавляли 1:10 3 М NaAc pH 5,5 и 3 объема этанола и инкубировали ночь при -20ºС; 8) центрифугировали 10000 об/мин 10 минут; 9) осадок растворяли в 30 мкл ТЕ буфера и использовали для амплификации в разведении 1:10. Или с использованием набора «РИБО-сорб» (K2-1-Et-100, Комплект реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала (ЦНИИ эпидемиологии, Роспотребнадзор, Россия): 1) лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 прогревали при температуре 60°С до полного растворения кристаллов; 2) в пробирки на 1,5 мл раскапывали по 450 мкл лизирующего раствора; 3) в каждую пробирку добавляли по 200 мкл исследуемого материала (вирус можно использовать сразу после осаждения дебриса, без осаждения вируса), перемешивали на 80 вортексе при 56°С 10 мин., осаждали на центрифуге для сброса капель жидкости с крышки; 4) сорбент ресуспендировали, интенсивно перемешивая на вортексе, добавляли в каждую пробирку отдельным наконечником по 25 мкл ресуспендированного сорбента; 5) перемешивали содержимое пробирок на вортексе и оставляли на 10 мин. при комнатной температуре, тщательно перемешивая каждые 2 мин.; 6) пробирки центрифугировали на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение 1 мин; 7) надосадочную жидкость из каждой пробирки отбирали отдельным наконечником; 8) в пробирки добавляли по 500 мкл раствора для отмывки 1, перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, центрифугировали пробирки на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение 1 мин., отбирали надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником; 9) добавляли в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 3, перемешали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, пробирки центрифугировали на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение 1 мин, отбирали раствор для отмывки 3 из каждой пробирки отдельным наконечником; 10) в пробирки добавиляли по 500 мкл раствора для отмывки 4, перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента, пробирки центрифугировали на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение 1 мин, полностью отбирали раствор для отмывки 4 из каждой пробирки отдельным наконечником; 11) сорбент высушивали, поместив пробирки с открытыми крышками в термостат при температуре 56°С на 15 мин (или под вентилятором, до исчезновения спиртового запаха); 12) в пробирки с высушенным сорбентом добавляли по 40-100 мкл очищенной воды, используя наконечник с аэрозольным барьером (имеющий специальную маркировку «RNase-free», «DNase-free»), перемешивали на вортексе, прогревали в термостате при температуре 56°С 5 мин, перемешали на вортексе и осаждали сорбент на центрифуге при 10000 - 14000 об/мин в течение 2 мин, непосредственно перед добавлением в ПЦР-смесь, центрифугировали 2 мин при 10000 - 14000 об/мин, отбирали аликвоту сверху, не допуская попадания сорбента в реакционную смесь. Или с использованием набора QIAGEN DNeasy Blood&Tissue Kit, при котором обращали внимание на следующие важные моменты: 81 1) для выделения на 1 колонке использовать не более 1 млн инфицированных клеток (пен флакон или одна лунка 6-ти луночного планшета); 2) буферы AW1 и AW2 поставляются в концентратах – перед использованием добавить этиловый спирт (в количестве, указанном на баночке), пометить на крышке; 3) буферы ATL и AL могут преципитировать в процессе хранения, для растворения осадка можно прогреть до 56°С в течение 5 мин; 4) центрифугирование проводить при комнатной температуре; 5) предварительно нагреть термомиксер (или водяную баню) до 56°С. Непосредственно выделение вирусной ДНК осуществляли по следующей методике: 1) подготовить криолизат вирус-инфицированных клеток путем трех-кратного замораживания-оттаиния; 2) добавить к 200 мкл криолизата 180 мкл буфера ATL; 3) добавить 20 мкл Proteinase K из набора; 4) добавить 200 мкл буфера AL, тщательно перемешать на вортексе, инкубировать 10 мин при 56°С; 5) добавить 200 мкл 96-100% этанола, помешать на вортексе; 6) перенести смесь на колонку Mini Spin, помещенную в 2 мл пробирку, центрифугировать 1 мин при 8000 об/мин.; поместить колонку в новую пробирку, использованную выбросить вместе с жидкостью; 7) добавить 500 мкл буфера AW1, центрифугировать 1 мин при 8000 об/мин., поместить колонку в новую пробирку, использованную выбросить вместе с жидкостью; 8) добавить 500 мкл буфера AW2, центрифугировать 3 мин при 14000 об/мин., поместить колонку в новую 1,5-2 мл пробирку (не из набора), использованную выбросить вместе с жидкостью, не допускать соприкосновения колонки с отцентрифугированной жидкостью! 9) элюция с колонки: нанести на середину мембраны 50-100 мкл буфера AE, оставить при комнатной температуре на 10 мин., центрифугировать 1 мин при 8000 об/мин. Для получения большего выхода, можно повторить элюцию с колонки (лучше в другую пробирку, концентрация ДНК будет меньше). 5.2 Результаты Ранее нами был сконструирован рекомбинантный вирус осповакцины, несущий в гене тимидинкиназы встройку кДНК гена ГМ-КСФ человека. Структура этой кДНК представлена на рисунке 5.1. Полноразмерная ДНК копия (кДНК) матричной РНК ГМ82 КСФ человека размером 850 п.н. была выделена из полученной нами кДНК библиотеки, клонирована в универсальный вектор pUC19 и секвенирована (рисунок 5.1). Структура клонированной кДНК ГМ-КСФ совпадала со структурой, депонированной в GenBank (Accession M11220.1). Далее эта последовательность была перенесена в полилинкер pXJP5.2 с получением плазмиды pXJP5.2-GMCSF (рисунки 5.2 - 5.4). Рисунок 5.1 - Структура фрагмента плазмидной ДНК pUC19/GM-CSF, в которой в район полилинкера встроена последовательность кДНК ГМ-КСФ. Красным выделена область лидерной последовательности, функциональная часть гена начинается с Ala-Pro-Ala. Встройку гена ГМ-КСФ проводили в структурную часть гена вирусной тимидинкиназы с одновременным его разрушением. Ген тимидинкиназы расположен в центральной консервативной части генома вируса осповакцины, поэтому все генноинженерные конструкции для получения делеционных и инсерционных мутантов в этом районе могут одинаково эффективно использоваться при конструировании рекомбинантов разных штаммов вируса осповакцины, а также и других оротопоксвирусов. Ген тимидинкиназы ортопоксвирусов (tk-ген) необходим для обеспечения высокого уровня вирусной репликации [199] и удаление этого гена приводит к значительной аттенуации ортопоксвирусов, дополнительно обеспечивая селективность их репликации в опухолевых 83 клетках [200]. Селективность обусловлена наличием в интенсивно делящихся клетках опухоли большого количества предшественников нуклеотидов и ферментов нуклеотидного синтеза, что восполняет отсутствие собственной вирусной тимидинкиназы. В слабо делящихся или покоящихся высоко дифференцированных клетках вирусная тимидинкиназа играет существенную роль для репликации вируса. Для встройки чужеродных генов в район вирусного гена тимидинкиназы с одновременной его инактивацией нами была сконструирована плазмида pXJP5.2, в которой последовательно расположены: левый от EcoRI сайта фрагмент tk -гена (левый фланк рекомбинации), ранне-поздний промотор белка 7.5 кДа вируса осповакцины, полилинкер для встройки чужеродных генов, правый от EcoRI сайта фрагмент tk -гена и последовательность К3R, расположенная в геноме сразу за tk-геном (правый фланк рекомбинации) (рисунок 5.2). ClaI (23) ApaLI (3591) Eco RV (307) TK - flank 1 SalI (623) Pst I (3169) P7,5 BglII (648) NheI (665) pXJP 5.2 HindIII (671) 3913 bp BamHI (677) Eco RI (683) TK-flank 2 ApaLI (2345) ApaLI (1847) NdeI (1854) Рисунок 5.2 - Генетическая карта плазмиды pXJP5.2. Для получения рекомбинантных вариантов вируса осповакцины была сконструирована инсерционная плазмида pXJP5.2-GM-CSF по следующей схеме: BamHI – HindIII фрагмент (850 п.н.) из плазмиды pUC19-GM-CSF (рисунок 5.1), содержащий лидерную и кодирующую последовательности GM-CSF, был встроен в ДНК pXJP 5.2 по тем же сайтам. Далее было проведено полноразмерное секвенирование полученной плазмиды с использованием следующего набора праймеров, рассчитанных с помощью программы Vector NTI: Пара 1: Sense TK-flank-1 5' CAGAATTAATTAGACGAGTTAGACG 84 Antisense GM-CSF 5' CCTCCAGAGAACTTTAGCCC Пара 2: Sense GM-CSF 5' GCCGCTCTAGAGTATCCCTC Antisense TK-flank 2 5' TCTCGGTTTCCTCACCCAAT Пара 3: Ap_sense 5' - TCATTGGAAAACGTTCTTCG TK1_antisense 5' – CCCACGGCTTCTAATTTATT Пара 4: TK2_sense 5' - GATCCAAACGAGGAGGAAAT ORI_antisense 5' – CTCTGACTTGAGCGTCGATT Пара 5: ORI_sense 5' - CCTGACGAGCATCACAAAAA AP_antisense 5' – CGAAATAGACAGATCGCTGA. Полная нуклеотидная последовательность инсерционной плазмиды pXJP5.2/GM-CSF приведена на рисунке 5.3. 85 86 Рисунок 5.3 - Нуклеотидная последовательность плазмиды pXJP5.2/GM-CSF. Голубым выделены фланки tk-гена, серым – промотор гена 7.5 кДа с регуляторными областями (согласно [198]), желтым ген ГМ-КСФ с обозначенным лидером (красный), стартом трансляции (ATG). Как следует из рисунка 5.3 ген ГМ-КСФ встроен в рамку с ранне-поздним протяженным промотором вируса осповакцины и имеет в своем составе как аутентичную лидерную последовательность ГМ-КСФ человека, так и 5’ нетранслируемый район мРНК, которой важен для трансляции. Фланкирующие фрагменты tk-гена были соотнесены с данными GeneBank и определены точные границы фланков, а также положение гомологичных последовательностей в геноме вируса осповакцины штамм Lister клон ВОВ107 (Accession DQ121394). В результате, 1й фланкирующий фрагмент плазмиды (длина 595 п.н.) оказался гомологичен фрагменту 83070 - 83665 п.н. генома вируса осповакцины штамм Lister клон ВОВ107. 2й фланкирующий фрагмент (длина 944 п.н.) гомологичен фрагменту 83696 84639 п.н. генома вируса осповакцины штамм Lister клон ВОВ107. Между фланкирующими элементами имеется делеция размером 31 п.н. в центре tk-гена в район которой введен природный промотор ВОВ р7.5К (276 п.н.) [16] и полилинкер для встройки трансгенов (рисунок 5.2). В район полилинкера по BamHI и HindIII сайтам и был встроен ген ГМ-КСФ, как описано выше. Генетическая карта плазмиды pXJP5.2/GM-CSF и фрагмент генома рекомбинантного варианта вируса осповакцины со встройкой гена ГМКСФ в структурной части гена вирусной тимидинкиназы представлены на рисунке 5.4. 87 А Б SD SEQ P3 P TK flank 1 AP r p7.5k Hum GM -CSF GM-CSF antisense pXJP5 2 GM-CSF seq 5229 bp Prom otor 7,5 TK flank 1 hum GM-CSF TK2 internal antisense TK VV sense TK flank 2 ORI L Y EFF TK2 internal antisense Lister VACV107 81001-87000 7346 bp TK flank 2 Рисунок 5.4 - Встройка гена ГМ-КСФ человека в район гена тимидинкиназы вируса осповакцины. А – генетическая карта инсерционной плазмиды, Б – фрагмент генома VV с встроенным геном ГМ-КСФ человека в ТК ген. Поскольку все мутантные и рекомбинантные варианты с поврежденным ТК-геном имеют фенотип ТК-минус, для их селекции мы используем также дефектные по тимидинкиназе культуры клеток Rat2 TK¯ (фибробласты эмбриона крысы) и Н 143 ТК¯ (клетки остеосаркомы человека, сублиния клеток HOS). Селекция ведется с добавлением в культуральную среду бромдезоксиуридина в концентрации 25 мкг/мл. На рисунке 5.5 представлена схема конструирования рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3. Рисунок 5.5 - Схема конструирования рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 путем гомологичной рекомбинации ДНК ВОВ и ДНК плазмиды pXJP5.2-GMCSF, в которой последовательно расположены: L-tk – левый фланк встройки, представляющий собой фрагмент генома ВОВ штамма Л-ИВП, соответствующий району 83070-83665 п.н. 88 штамма Lister 107 (GenBank DQ121394) и включающий 244 п.н. N-концевой части tk-гена; р7.5К - природный ранне-поздний промотор ВОВ; GMCSF – ДНК копия матричной РНК ГМ-КСФ человека; R-tk – представляющий собой фрагмент генома ВОВ штамма Л-ИВП, соответствующий району 83696-84639 п.н. штамма Lister 107 (GenBank DQ121394) и включающий 257 п.н. С-концевой части tk-гена; APr– ген устойчивости к ампициллину; ORI – область начала репликации. Полученный рекомбинантный штамм обладает свойствами типичного представителя ВОВ, но в отличие от векторного вируса имеет фенотип ТК-ГМКСФ+. 5.2.1 Наработка и очистка рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 Для наработки рекомбинантного штамма нами была использована культура клеток 4647, аттестованная для производства вакцин в России. Культура клеток была получена из Музея ГНЦ ВБ «Вектор» и имеет следующие характеристики: крупные эпителиоподобные клетки, ядра круглой и овальной формы с хроматиновой зернистостью, ядрышки различной формы и величины от 1 до 4 в ядре, цитоплазма гомогенная. Для отработки метода нами было проведено два крупных выделения вируса на 80 и 60 культуральных матрасах 650 мл, 175 см2 (Griener, Австрия). Результаты экспериментов приведены в таблице 5.1 и на рисунке 5.6. Как видно из данных таблицы и рисунка нам удалось повысить эффективность выделения вируса с 0,25 мг/матрас (выделение 1) до 0,63 мг/матрас (выделение 2). Это связано, во-первых, с оптимизацией условий культивирования клеток, и, во-вторых, с рядом модификаций метода очистки вируса. Для оптимизации культивирования клеток 4647 мы заменили бикарбонатный буфер в культуральной среде ДМЕМ на HEPES, который обладает большей буферной емкостью и позволяет инкубировать инфицированные клетки не 24 часа как ранее, а 48 часов без изменения рН среды. Увеличение времени инфекции, в свою очередь, позволяет повысить эффективность наработки вируса (количество вируса на инфицированную клетку). Ниже приведена модифицированная методика очистки вируса: 1) монослой клеток 4647, выращенный на культуральных матрасах 650 мл, 175 см2 (Griener, Австрия), инфицировали вирусом осповакцины, штамм VV-GMCSF-S1/3 с множественностью 1,0 БОЕ/клетка; 2) инкубировали 48 часов при температуре 37°С до образования 100% ЦПД, получали криолизат (три цикла замораживания-оттаивания) инфицированных клеток; 3) дебрис осаждали низкоскоростным центрифугированием 10 мин при 5000 об/мин; 4) супернатант концентрировали центрифугированием 14000 об/мин, 1,5 часа; 89 5) осадок восстанавливали в 0,05 М Трис, рН 9.0, обрабатывали ультразвуком и выделяли вирус центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (25-45%); 6) все вирусные бэнды (bands, объем 5 мл) из градиента плотности сахарозы объединяли, добавляли равный объем 0,05 М Трис, рН 9.0 и центрифугировали 20000 об/мин 1 час для осаждения вируса, осадок ресуспендировали в 5 мл, расфасовывали в микропробирки, обрабатывали ультразвуком и замораживали при минус 40оС; 7) осадки после центрифугирования в градиенте плотности сахарозы объединяли суспендированием в 11 мл буфера 0,05 М Трис-HCl, рН 9.0 соответственно (таблица 5.1), расфасовывали в микропробирки и замораживали при минус 40оС; 8) замороженные бэнды и осадки титровали методом бляшек на монослое клеток CV1. Таблица 5.1 - Характеристика препаративно очищенных препаратов вируса осповакцины. № 1 2 Препарат вируса Бэнд Объем образца, мл 80 Титр, БОЕ/мл 1,0 х 109 ОП260 Осадок 11 1,2 х 109 0,723 5 0,45 Бэнд 60 1,7 х 109 0,637 24,6 0,41 осадок 11 3,1 х 109 1,858 13,1 1,2 (1:10) 0,316 Количество вируса, мг 16,2 Концентрация мг/мл 0,2 * - в бэндах вирус находится в растворе сахарозы соответствующей плотности (1,16 г/мл); - осадок после бэнда в градиенте плотности сахарозы, растворен в буфере 0,05 М ТрисHCl, рН 9.0. На рисунке 5.7 привидена иммуннохимическая характеризация двух очищенных препаратов вируса осповакцины из 1 (осадок, 0,45 мг/мл) и 2 (осадок, 1,2 мг/мл) выделений. Как видно из данного рисунка белковый профиль препаратов очищенного вируса стабильно сохраняется от выделения к выделению. Чистота препарата, в соответствии с иммуноблотом, составляет не менее 90%. 90 А 1 2 3 Б 4 1 2 3 С 4 1 2 3 4 Рисунок 5.7 - SDS-PAGE и иммуноблот анализ очищенных препаратов вируса осповакцины, штамм VV-GMCSF-S1/3, с иммунной и неиммунной сыворотками человека. А - SDS-PAGE, 10%; B – иммуноблот с сывороткой человека, иммунизированного вирусом осповакцины; С – иммуноблот с отрицательной сывороткой человека. 1 – Маркер молекурного веса (BioRad, “Precision Plus ProteinTM Standards. Dual Color”, Cat 161-0374) – 4 мкл; 2 – Маркер молекурного веса (BioRad, “Prestained SDS-PAGE Standards, Low Range” Cat 161-0305)- 4 мкл; 3 – препарат очищенного вируса осповакцины №1 (осадок) – 2 мкл; 4 – препарат очищенного вируса осповакцины №2 (осадок) – 2 мкл. Оптимизированный метод наработки и очистки вируса осповакцины использовался для получения препаративных количеств рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 с использованием высокотехнологичной роллерной установки INCUDRIVE D-I (Schuett, Германия) (см раздел «Материалы и методы»). Всего было наработано и очищено 50 мг вируса, титр которого составляет 1,0 х 109 БОЕ/мл, вирус расфасован в микропробирки по 0,5 мл и хранится при минус 80°С. 5.2.2 Оценка стабильности встройки гена ГМ-КСФ в процессе наработки и очистки рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 Стабильность встройки в геноме рекомбинантного штамма после проведения процедур наработки и очистки проверяли методом ПЦР с использованием следующих праймеров: TKVVsense 20 п.н. 5' cgatgttcttcgcagatgat 3' TK2 internal antisense 20 п.н. 5' ttctgtgagcgtatggcaaa 3' GM-CSF antisense 20 п.н. 5' gggctaaagttctctggagg 3' Праймер TKVVsense расположен на вирусном геноме слева от фланкирующей последовательности плазмиды pXJP5.2-GMCSF и «привязывает» встройку гена ГМ-КСФ непосредственно к вирусной ДНК (рисунок 5.4). Праймер TK2 internal antisense лежит 91 внутри правого фланкирующего фрагмента вирусного генома, который является общим для плазмиды и вирусной ДНК (рисунок 5.4). С использованием пары праймеров TKVVsense×TK2 internal antisense при наличии встройки гена ГМ-КСФ с вирусной ДНК амплифицируется фрагмент 2092 п.н., а при отсутствии встройки (вирус «дикого» типа, исходный штамм Л-ИВП) - 748 п.н. При использовании пары праймеров TKVVsense×GM-CSF antisense амплификация происходит только с рекомбинантной вирусной ДНК, поскольку праймер GM-CSF antisense лежит внутри гена ГМ-КСФ (рисунок 5.4) – при наличии встройки размер амплифицированного фрагмента составляет 1018 п.н., в случае вируса дикого типа – 0 (рисунок 5.8). M 1 2 3 4 Рисунок 5.8 - Электрофоретический анализ в 1% агарозе ПЦР-фрагментов, амплифицированных с помощью двух специфических пар праймеров: TKVVsense×TK2 internal antisense (дорожки 1-2) и TKVVsense×GM-CSF antisense (дорожки 3-4), позиции праймеров указаны на рисуноке 4. М – маркер молекулярных весов М28 (НПО «СибЭнзим», Россия): 3000, 1500, 1000, 900, 800, 700…100 п.н. Дорожка 1 – Л-ИВП, фрагмент 748 п.н. (отсутствие встройки гена ГМ-КСФ); дорожка 2 - рекомбинант VVGMCSF-S1/3, фрагмент 2092 п.н. (наличие встройки гена ГМ-КСФ); дорожка 3 – Л-ИВП, амплификации не происходит, так как последовательность, комплементарная праймеру GM-CSF antisense, отсутствует; дорожка 4 – очищенный наработанный препарат рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3, фрагмент 1018 п.н. (наличие встройки гена ГМ-КСФ). Как следует из рисунка 5.8 препарат очищенного рекомбинантного штамма VVGMCSF-S1/3 содержит встройку, соответствующую по размеру гену ГМ-КСФ человека, а наличие фрагмента 1018 п.н. в случае использования пары праймеров TKVVsense×GMCSF antisense свидетельствует о правильности структуры встроенного гена. Отсутствие примесной полосы, соответствующей вирусу «дикого» типа, в ПЦР с парой праймеров 92 TKVVsense×TK2 internal antisens (дорожка 2 на рисунке 5.8) свидетельствует о чистоте полученного препарата рекомбинантного штамма. Выводы Наработан и очищен в препаративных количествах вирусный препарат, который будет использован как платформа для конструирования противоопухолевых двойных рекомбинантных штаммов со встройкой в ген вирусного ростового фактора трансгена лактаптина. Вирусный препарат наработан на основе штамма рекомбинантного вируса осповакцины VV-GMCSF-S1/3, который депонирован в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» за номером V-631, справка о депонировании № 03.15/1381 от 26.04.2013 г. Очищенный и наработанный в препаративном количестве (50 мкг) вирусный препарат генетически стабилен, содержит встройку гена ГМ-КСФ человека в структурной части гена вирусной тимидинкиназы и не имеет примесей вируса «дикого» типа. Генотип и генетическая стабильность препарата подтверждена высокочувствительным методом ПЦР с использованием двух пар праймеров, одна из которых расположена во фланкирующих встройку последовательностях вирусного генома, а вторая в структурной части гена ГМ-КСФ Наработанный и очищенный штамм вируса осповакцины VV-GMCSF-S1/3 получен на основе вакцинного штамма Л-ИВП, который широко применялся в медицинской практике для борьбы против оспы в России, но с 1980 года такая вакцинация прекращена вследствие искоренения натуральной оспы на земном шаре [188]. Таким образом, большинство людей не имеют антител к вирусам группы оспы, что существенно увеличивает эффективность использования вируса осповакцины в качестве противоопухолевого препарата. Встройка гена ГМ-КСФ с одновременной инактивацией гена тимидинкиназы обеспечивает дополнительную аттенуацию и иммуногенность вируса. 93 6 Подтверждение экспрессии и секреции ГМ-КСФ методом Вестерн-блота или иммуноферментным анализом 6.1 Материалы и методы В работе были использованы следующие материалы: L-глутамин сухой (Fluka, USA), трипсин сухой (Invitrogen), версен (Диа-М), глицерин (Serva, Германия), кристаллический фиолетовый и агароза (Sigma, США), маркеры белка и ДНК для электрофореза (AppliChem), набор для определения концентрации белка «Bio-Rad Protein Assay Kit» (Bio-Rad, США), фетальная бычья сыворотка - ФБС (HyClone, USA), пластиковая культуральная посуда (Nunck, Дания), криопробирки, роллеры (Диа-М), среды DMEM и DMEM/F12 сухие (Invitrogen, США), диметилсульфоксид, сахароза, натрий бикарбонат (Amresco, Испания). В работе использовали также следующие реактивы: соляная кислота, гидроксид натрия, спирт этиловый, ледяная уксусная кислота; реактивы производства «Sigma» (США): акриламид, Трис-HCl, (гидроксиметил)аминометан (Трис), ацетат натрия, динатриевая бромистый соль этидий, трис- этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na2ЭДТА); ферменты и реактивы производства ЗАО «СибЭнзим», Taq ДНКполимераза, дезоксинуклеозидтрифосфаты; наборы для выделения вирусной ДНК: ДНКсорб (Интерлабсервис, Россия), DNA Blood Mini kit (Qiagen, США) и DNA extraction kit (Zymo Research, США). 6.1.1 Буферы и растворы TE: 1 мМ EDTA, 10 мМ Tris-HCl, pH 8.0; TAE: 40 мМ Tris-HCl, 40 мМ CH3COOH, 2 мМ EDTA, pH 8.0; PBS: одна таблетка PBS на 500 мл дистиллированной воды; Раствор трипсина: PBS 1X, 1 mM ЭДТА, 0,05% трипсин; TBS pH 7,6: 50 мM Tris, 150 мM NaCl, довести pH до pH 7.6 с помощью HCl; Лизирующий буфер: 150 мМ NaCl, 50 мM Tris, 1% Тритон Х-100, рН 7.6; Краситель для электрофореза: 0,25% бромфеноловый синий, 30% глицерин в Н2О, 6х буфер TE. 6.1.2 Культуры клеток Все культуры были получены из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». CV1 – трансформированная культура клеток почки африканской зеленой мартышки; 4647 – 94 аттестованная для производства вакцин в России культура клеток почки африканской зеленой мартышки; TF-1- цитокин-зависимые клетки эритролейкоза человека. 6.1.3 Культивирование и ростовая среда Культивирование получаемых клеточных линий проводили с использованием следующих вариантов ростовых сред: - среда DMEM c добавлением 10% ФБС, стандартной концентрации антибиотиков (ампициллин -100 мкг/мл, гентамицин -80-160 мкг/мл и амфотеррицин В – 25 мкг/мл); - среда F12/DMEM (1:1) c добавлением 10% ФБС, стандартной концентрации антибиотиков (пенициллин – 100 мкг/мл и стрептомицин – 100 мкг/мл); - среда 199 без фенолового красного для спектрофотометрического анализа жизнеспособности клеток; - среда RPMI c добавлением 10% ФБС и стандартной концентрации канамицина – 100 мкг/мл. 6.1.4 Криоконсервация и размораживание клеточных линий Для замораживания в жидком азоте (-1960С) клетки снимали с поверхности культуральных сосудов раствором трипсина с версеном (1:3), осаждали из суспензии центрифугированием при 1000 об/мин 5 мин и суспендировали в среде для заморозки, состоящей из среды DMEM с добавлением 40-80% ФБС и 10% ДМСО. Концентрацию клеток доводили до 1-2 млн клеток/мл, клеточную суспензию расфасовывали в полиэтиленовые ампулы (Nunk, Дания) по 1 мл. Ампулы помещали в пары жидкого азота (минус 120ºС) или в холодильник (минус 70ºС) на 24 часа, после чего переносили непосредственно в жидкий азот. Размораживали клетки, помещая ампулы в теплую воду с температурой 37 - 41ºC, после чего отмывали клетки в среде DMEM с добавлением 10% ФБС и осаждали центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Далее клетки суспендировали в ростовой среде DMEM с 10% ФС и высевали в культуральные планшеты или стеклянные сосуды. 6.1.5 Вирус В работе использовали рекомбинантный штамм вируса осповакцины VV-GMCSFS1/3, полученный на основе штамма Л-ИВП (коллекция вирусных штаммов проф. С.С. Маренниковой, НИИ вирусных препаратов РАМН (г. Москва)). Исходные стоки вируса подращивали на культуре клеток CV-1. Титр вируса определяли методом бляшек на монослое клеток CV-1, окрашенном фиксирующим раствором кристаллического 95 фиолетового (2 г/л кристаллический фиолетовый, 50 мл/л формальдегид, 100 мл/л этанол, вода). 6.1.6 Вестерн-блот анализ рекомбинантных белков Монослой клеток CV-1 (90% поверхности), выращенный в культуральном матрасе объемом 650 мл (Greiner), инфицировали рекомбинантным штаммом ВОВ VV-GMCSFS1/3 или исходным штаммом ВОВ Л-ИВП с множественностью 1 БОЕ/кл. Инкубировали 24 часа при 37°С в атмосфере 5% СО2, поддерживающую среду (DMEM+2% фетальной бычьей сыворотки (HyClone)) удаляли, клетки разрушали лизирующим буфером (50 мM Tрис-HCl pH 7.5, 150 мM NaCl, 1% Triton X-100, 5мM MgCl2, proteases inhibitor cocktail) в объеме 7 мл, проводили 3 раунда замораживания-оттаивания, затем трехкратную обработку ультразвуком (20 сек при 200-300 W с 10-ти сек охлаждением после каждой обработки), центрифугирование 14000 об/мин, 30 мин, 4°C, супернатант анализировали в Western blot анализе с использованием в качестве первичных антител Rabbit anti-human GM-CSF Polyclonal antibody (PerroTech, США). В качестве вторичных антител - Anti-rabbit IgG (Whole molecule) alkaline phosphatase conjugate (Sigma, США). Электрофоретическое разделение белков проводили в камере «BioRad» в 5% концентрирующем и 14% разделяющем акриламидном геле при V=100. Перенос белков с геля осуществляли в камере MiniTrans-Blot cell «BioRad» на мембрану Immun-Blot TMPVDF Membrane for Protein Blotting 0,2 мкм при V=100 1 час 20 минут. Затем мембрану промывали буфером для переноса и помещали в блокирующий раствор - ТВS рН 7,4 с 5% молоком (Skim Milk Powder, Biochemika, Fluka) на 1 час при комнатной температуре (КТ) на качалке. Отмывали мембрану 3 раза по 5 минут ТВS рН 7,4 на качалке и инкубировали 16 часов, при +4ºС с первичными антителами в рабочей концентрации 0,2 мкг/мл, в ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 и 5% молока. После связывания с первичными антителами мембраны отмывали 3 раза по 5 минут ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 на качалке, затем проводили связывание с вторичными антителами в рабочем разведении 1:5000 в ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 и 5% молока в течение 1 часа при КТ на качалке. После связывания с конъюгатом отмывали 3 раза по 5 минут ТВS рН 7,4 с 0,1% Tween-20 на качалке и 1 раз буфером для субстрата (АР – буфер: 100 мМ Трис, 100 мM NaCl, pH 9,5 с добавлением 50 мM MgCl2). В качестве субстрата использовали BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) и NBT (NitroBluetetrazolium). Останавливали реакцию промыванием мембраны дистиллированной водой. 96 6.1.7 Определение специфической активности секретируемого рекомбинантным вирусом осповакцины ГМ-КСФ Для оценки специфической активности ГМ-КСФ использовали цитокин-зависимую линию клеток эритролейкоза человека TF-1. Определяли стимуляцию пролиферации клеток TF-1 различными разведениями культуральной среды, содержащей секретируемый ГМ-КСФ. Для проведения эксперимента в среде RPMI (Invitrogen, США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки готовили 2-кратные разведения культуральной среды от инфицированных VV-GMCSF-S1/3 клеток CV-1 в диапазоне 1:500 – 1:4000 или рекомбинантного белка ГМ-КСФ до конечных концентраций 0,1; 1; 2; 4; 8 нг/мл (калибровка). В качестве отрицательного контроля использовали среду RPMI и культуральную среду клеток CV-1, инфицированных исходным штаммом ВОВ Л-ИВП. В лунки 96-ти луночного планшета вносили 50 мкл вышеуказанных разведений или контрольных образцов и добавляли 50 мкл суспензии клеток TF-1 в среде RPMI с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки по 2х104 клеток/лунка. Планшеты помещали в термостат при температуре 37˚С, 5% СО2, влажности 85% и инкубировали 72 часа. После инкубации в каждую тестируемую лунку добавляли 50 мкл реагента ХТТ (Sigma, США) и PMS (Fluka, США), который получали добавлением к рабочему раствору с содержанием XTT 1 мг/мл раствора PMS 1,25 мМ из расчета: на каждый мл ХТТ – 20 мкл PMS. Планшет инкубировали еще 4 часа и определяли оптическую плотность ОП490/620 на планшетном спектрофотометре SpectraCount (Packard, США). Каждую точку делали в пяти повторностях, определяли среднее значение и дисперсию для различных концентраций культуральной среды и очищенного рекомбинантного белка ГМ-КСФ, строили гистограмму зависимости ОП от разведений и концентрации. Стимуляцию пролиферации TF-1 клеток рассчитывали в процентах по отношению к контролю. За 100% принимали количество живых клеток в отрицательном контроле. 6.2 Результаты 6.2.1 Экспрессия гена ГМ-КСФ в геноме наработанного и очищенного рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 97 Экспрессию гена ГМ-КСФ и секрецию целевого белка в культуральную среду подтверждали Western blot анализом (рисунок 6.1). В качестве первичных антител использовали поликлональную сыворотку кролика, которая регистрирует все формы ГМКСФ человека, включая негликозилированную внутриклеточную форму и формы с разной степенью гликозилирования. ГМ-КСФ человека синтезируется в виде белка- предшественника (144 а.о.) с последующим отщеплением сигнального пептида (17 а.о.). Таким образом, зрелый полипептид содержит 127 ао (14.4 кДа). Показано существование 16-ти различных изоформ ГМ-КСФ человека, продуцируемого в клетках эукариот. Эти изоформы, имеющие различный характер гликозилирования, обуславливают гетерогенность природного ГМ-КСФ и разброс молекулярных масс от 14.4 до 32 кДа, что мы и наблюдаем на рисунке 6.1 Б. Не гликозилированный ГМ-КСФ, продуцированный в E. сoli и использованный нами как контроль, имеет молекулярную массу 14.4 кДа, что и видно на рисунке 6.1. Как следует из рисунка 6.1, полученный нами рекомбинантный штамм эффективно секретирует ГМ-КСФ в культуральную среду (рисунок 6.1, дорожки 12), причем в культуральной среде выявляются только высоко гликозилированные формы ГМ-КСФ, в то время как в клеточных лизатах (рисунок 6.1, дорожки 3-4) регистрируется широкий диапазон изоформ ГМ-КСФ с разной степенью гликозилирования. А Мв 1 2 3 4 5 Б Мв 1 2 3 4 5 Рисунок 6.1 - Анализ экспрессии гена ГМ-КСФ человека в составе рекомбинантного ВОВ VV-GMCSF-S1/3. Электрофореграмма (А) и Western blot (Б). Размер негликозилированного зрелого ГМ-КСФ человека - 14.4 кДа (дорожка 5, негликозилированный ГМ-КСФ человека, продуцированный в клетках E.coli). Дорожки 1,3 – изоформы ГМ-КСФ человека, соответствующие различной степени 98 гликозилирования белка: 1 – культуральная среда клеток CV-1, инфицированных рекомбинантом VV-GMCSF-S1/3, 48 ч инкубации; 2 – контроль, культуральная среда клеток CV-1, инфицированных Л-ИВП, 48 ч инкубации; 3 - лизат клеток CV-1, инфицированных рекомбинантом VV-GMCSF-S1/3, 48 ч инкубации; 4 – контроль, лизат клеток CV-1, инфицированных Л-ИВП, 48 ч инкубации; М - маркер молекулярного веса 250, 150, 100, 75; 50, 37, 25, 20, 15 кДа (BioRad, Kaleidoscope Prestained Standards). В Western blot анализе использовали в качестве первичных антител Rabbit anti-human GMCSF Polyclonal antibody (PerroTech). В качестве вторичных антител - Anti-rabbit IgG (Whole molecule) alkaline phosphatase conjugate (Sigma). Полученные результаты показывают, что ГМ-КСФ выявляется только в культуральной среде и лизатах клеток CV-1, инфицированных рекомбинантным штаммом VV-GMCSF-S1/3 (рисунок 6.1). В клетках, инфицированных Л-ИВП, ГМ-КСФ не выявляется. В культуральной среде представлена секретированная форма ГМ-КСФ с большим молекулярным весом (рисунок 6.1, дорожка 1, 25-32 кДа) вследствие более полного гликозилирования, в отличие от внутриклеточного ГМ-КСФ, выявленного в лизатах клеток, где представлен широкий диапазон изоформ ГМ-КСФ (рисунок 6.1, дорожка 3, 18-32 кДа). В качестве положительного контроля использовали негликозилированную форму ГМ-КСФ, полученную в клетках E.coli (рисунок 6.1, дорожка 5, 14.4 кДа). 6.2.2 Оценка биологической активности ГМ-КСФ, секретируемого рекомбинантным штаммом VV-GMCSF-S1/3 Биологическую активность ГМ-КСФ человека, секретируемого из клеток CV-1, инфицированных рекомбинантом VV-GMCSF-S1/3, оценивали по уровню стимуляции пролиферации клеток эритролейкоза человека TF-1. Данный тест основан на способности цитокин-зависимых клеток линии TF-1 пролиферировать только в присутствии ГМ-КСФ и ряда других цитокинов человека. Пролиферативную активность оценивали микрометодом на 96-луночных культуральных планшетах (Costar) с использованием реагента XTT [201,202] и культуральной среды ДМЕМ, полученной через 48 часов после заражения клеток СV-1 рекомбинантным VV-GMCSF-S1/3 или контрольным (дикий тип, штамм ЛИВП) ВОВ. Перед использованием культуральную среду осветляли центрифугированием 10 минут при 5000 об/мин (подробно – см раздел «Материалы и методы»). Для оценки концентрации ГМ-КСФ в культуральной среде использовали очищенный и охарактеризованный препарат рекомбинантного ГМ-КСФ, полученного в клетках E.coli [34]. Результаты экспериментов представлены на рисунке 6.2. 99 Титрование GMCSF в среде на культуре клеток TF-1 в реакции ХТТ 400 350 Standart GMCSF 300 MEDIUM GMCSF % 250 200 150 100 50 0 8 ng/ml 1:500 4 ng/ml 1:1000 2 ng/ml 1:2000 1 ng/ml 1:4000 0,1 ng/ml 1:8000 Control GMCSF-концентрация, Среда-разведение Рисунок 6.2 - Анализ биологической активности ГМ-КСФ человека, экспрессированного в составе рекомбинантного вируса осповакцины VV-GMCSF-S1/3. По оси Y биологическая активность ГМ-КСФ - % стимуляции пролиферации цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека TF-1. За 100% принимали количество живых клеток, выращенных в необработанной среде и при добавлении среды с клеток CV-1, инфицированных вирусом дикого типа Л-ИВП. По оси Х – концентрация рекомбинантного прокариотического препарата ГМ-КСФ (калибровка) или разведение культуральной среды клеток CV-1, инфицированных рекомбинантом VV-GMCSF-S1/3 и исходным штаммом Л-ИВП (отрицательный контроль). Из данных рисунка 6.2 следует, что пролиферативная активность культуральной среды от инфицированных очищенным концентрированным препаратом рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 клеток CV-1 соответствует концентрации 40 мкг/мл калибровочного белка ГМ-КСФ. Это свидетельствует о том, что полученный препарат рекомбинантного штамма продуцирует секретируемый биологически активный ГМ-КСФ человека в клетках млекопитающих и может использоваться в качестве штаммареципиента для встройки противоопухолевых трансгенов, в частности, гена лактаптина с целью получения онколитических иммуностимулирующих препаратов. Выводы: Экспрессия гена ГМ-КСФ в составе препаративно наработанного и очищенного препарата рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 подтверждена методом Вестернблот с использованием в качестве детектирующих антител поликлональной сыворотки кролика, выявляющей как негликозилированную 100 внутриклеточную, так и ряд гликозилированных форм ГМ-КСФ человека, включая секретируемую полностью гликозилированную форму с молекулярным весом 32 кДа. Показана эффективная секреция ГМ-КСФ в клетках CV-1, инфицированных рекомбинантным препаратом VVGMCSF-S1/3. Секретируемый ГМ-КСФ обладает высокой биологической активностью, которая была показана в ХТТ-тесте с использованием цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека TF-1. Пролиферативная активность культуральной среды от инфицированных очищенным концентрированным препаратом рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 клеток CV-1 соответствует концентрации 40 мкг/мл калибровочного белка ГМ-КСФ. 101 7 Подведение итогов этапа и оформление отчетной документации В результате проведения работ по этапу № 1 «Выбор направления исследований. Получение инсерционных плазмид. Наработка штамма вируса Л-ИВП со встройкой гена ГМ-КСФ» соглашения о предоставлении субсидий от 27 июня 2014 г. № 14.604.21.0057 были выполнены следующие работы: 1 Проведен аналитический обзор информационных источников, посвященный проблемам создания противоопухолевых препаратов на основе онколитических вирусов, селективно подавляющих рост опухоли, и природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток. 2 Проведены патентные исследования, определены технический уровень и тенденции развития средств, обеспечивающих профилактику и лечение опухолей. Патентный поиск показал, что объект исследования обладает патентной чистотой, т.к. не нарушает действующих патентов РФ, касающихся рассматриваемого рекомбинантного штамма вируса осповакцины с противоопухолевыми свойствами. 3 Разработана методика конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса (VGF). Сконструированы плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat, pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat и pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat. Для конструирования плазмид использовался вектор pVGF-PE/L-Pat, содержащий левый и правый фланки гена С11R (кодирующего вирусный фактор роста) ВОВ штамма ЛИВП, синтетический ранний промотор Р7,5 ВОВ, ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L и полилинкер. 4 Проведено депонирование инсерционных плазмид pVGF-FR2-PE/L-Pat и pVGFSign-FR2-PE/L-Pat в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номерами Р-57 и Р-56, соответственно. Получены паспорта плазмид и Справки о депонировании. 5 Проведена препаративная наработка рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 (штамм Л-ИВП вируса осповакцины со встройкой гена ГМ-КСФ человека) методом роллерного культивирования в клетках почки африканской зеленой мартышки. Проведена очистка и концентрирование вируса методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Полученный очищенный концентрированный препарат рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 является гомогенной вирусной суспензией с титром 109 БОЕ/мл. Генотип и стабильность встройки гена ГМ-КСФ в вирусном препарате была подтверждена методом ПЦР с использованием специфических праймеров на геномную последовательность и сруктурную часть гена ГМ-КСФ. 102 6 Подтверждена экспрессия гена ГМ-КСФ методом Вестерн-блот с использованием поликлональных кроличьих антител, выявляющих все формы ГМ-КСФ человека, включая негликозилированную внутриклеточную и высокогликозилированную секретируемую. С использованием цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека F-1 показано, что полученный рекомбинантный вирус продуцирует секретируемую форму биологически активного ГМ-КСФ человека. 7 Подведены итоги этапа и оформлена отчетная документация 7.1 Отчётная (техническая) документация о работах по Плану-графику исполнения обязательств, расходы на которые возмещаются за счет средств субсидии: 7.1.1 Промежуточный отчет по ПНИ (1 этап) 7.1.2 Отчет о патентных исследованиях 7.1.3 Методика конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса осповакцины. 7.1.4 Акт о наработке и очистке инсерционных плазмид. 7.1.5 Акт о наработке и очистке штамма вируса Л-ИВП со встройкой гена ГМ-КСФ. 7.1.6 Паспорта инсерционных плазмид. 7.1.7 Справки о депонировании инсерционных плазмид. 7.2 Документация, предусмотренная Соглашением о предоставлении субсидии и нормативными актами Заказчика: 7.2.1 Письмо-представление; 7.2.2 Резюме проекта; 7.2.3 Заключение индустриального партнёра на отчетную документацию; 7.2.4 Акт приёма-передачи отчётной документации индустриальному партнеру; 7.2.5 Акт о выполнении условий предоставления субсидии (финансовый); 7.2.6 Акт оценки исполнения обязательств на этапе № 1 7.2.7 Отчет о выполнении требований по достижению значений показателей результативности предоставления субсидии; 7.2.8 Отчет об осуществлении расходов по соглашению о предоставлении субсидии; 7.2.9 Выписка из протокола заседания ученого совета от 24 декабря 2014 г 7.2.10 Регистрационная карта НИОКР (копия); 7.2.11 Документы, подтверждающие выполнение показателей результативности предоставления субсидии; 7.2.12 Документы, подтверждающие расходование внебюджетных средств. 103 8 За счет внебюджетных средств проведена закупка материалов и оборудования для приготовления культуральных сред для наработки вируса. Внебюджетное финансирование работ обеспечено за счет средств индустриального партнера проекта ООО «Фабрика биополимеров». Таким образом, работы этапа №1 «Выбор направления исследований. Получение инсерционных плазмид. Наработка штамма вируса Л-ИВП со встройкой гена ГМ-КСФ» Соглашения о предоставлении субсидии от «27» июня 2014 г. № 14.604.21.0057 выполнены полностью и удовлетворяют условиям Соглашения, Технического задания и Плана-графика. 104 8 Закупка материалов и оборудования для приготовления культуральных сред для наработки вируса При выполнении 1 этапа проекта за счет средств Индустриального партнера ООО «Фабрика биополимеров» были приобретены материалы и оборудование необходимое для приготовления культуральных сред для наработки вируса в том числе: - весы прецизионные, - весы аналитические, - шкафы ламинарные, - термостаты с охлаждением, - шейкер инкубатор, - стерилизаторы MLS-3781L, - мешалка верхнеприводную 47 D, - штатив R 472 напольный, - низкопульсационный перистальтический моноблочный насос, - устройство для стерильного спаивания трубок Sterile tube fuser dry, - устройство для нарезки и запаивания трубок Hot lips tube sealer. Культуральные среды, необходимые для наработки вируса, предполагается готовить и хранить с применением стерильных одноразовых мешков Flexboy из многослойной полимерной пленки. Приобретенные «Устройство для стерильного спаивания трубок Sterile tube fuser dry» и «Устройство для нарезки и запаивания трубок Hot lips tube sealer» - это автоматизированные устройства стерильного соединения и рассоединения термопластичных трубок, которые используются для соединения двух замкнутых систем, содержащих/не содержащих жидкости, друг с другом с сохранением стерильности. Соединение трубок проводится в 2 этапа: посредством высокочастотного запаивания концы соединяемых трубок герметизируются; загерметизированные концы трубок нагреваются бесконтактным радиочастотным нагревательным элементом и соединяются между собой. Всего на проведение 1 этапа работ в рамках Соглашения о предоставлении субсидии индустриальный партнер проекта ООО «Фабрика биополимеров» затратил 2 845 592 руб. (Два миллиона восемьсот сорок пять тысяч пятьсот девяносто два) рубля. 105 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В связи с тем, что на сегодняшний день онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности как в нашей стране, так и за рубежом особенно актуальными становятся работы по разработке новых противоопухолевых препаратов с многофункциональным механизмом действия. Очень важно, чтобы эти препараты обладали высокоизбирательными онколитическими свойствами, что способствовало бы распознаванию и уничтожению только раковых и метастатических клеток, а также высвобождению опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе хозяина. Целью настоящего проекта является разработка кандидатного лекарственного средства с направленной противоопухолевой иммуностимулирующей активностью на основе и апоптоз-индуцирующей рекомбинантного штамма вируса осповакцины, содержащего двойную встройку генов гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) человека и противоопухолевого белка лактаптина. Совместное введение в геном вируса генов апоптоз-индуцирующего белка и ГМКСФ будет приводить к усилению лизиса раковых клеток, одновременному высвобождению большого количества слабо иммуногенных опухолеассоциированных антигенов и презентации их иммунной системе организма. Такой подход создания противоопухолевых препаратов используется впервые Будет также сконструирован секретируемый вариант лактаптина в составе двойного рекомбинантного вируса осповакцины. Секреция апоптоз-индуцирующего белка может обеспечить дополнительное цитотоксическое действие на клетки, соседствующие с инфицированными рекомбинантным вирусом клетками, внутри опухоли за счет передачи лактаптина через межклеточное пространство. Полученные в результате выполнения проекта научно-технические результаты могут быть использованы в фундаментальных и прикладных исследования, а также при производстве лекарственных средств и в практическом здравоохранении. В результате выполнения 1 этапа работ по Соглашению о предоставлении субсидии были решены следующие задачи: 1 Проведен аналитический обзор информационных источников, посвященный проблемам создания противоопухолевых препаратов на основе онколитических вирусов, селективно подавляющих рост опухоли, и природных белков и пептидов, способных вызывать апоптотическую гибель раковых клеток. Особое внимание уделено перспективным лекарственным препаратам, объединяющим способность онколитических 106 вирусов селективно уничтожать клетки опухоли и способность природных белков и пептидов индуцировать апоптоз опухолевых клеток. 2 Проведены патентные исследования, определены технический уровень и тенденции развития средств, обеспечивающих профилактику и лечение опухолей. Предметом настоящего патентного поиска являлись онколитические вирусные векторы, несущие гены ГМ-КСФ и/или пептидов с противоопухолевой активностью, рекомбинантные штаммы онколитических вирусов с плазмидными векторами, несущими гены ГМ-КСФ и/или пептидов, обладающие апоптотической активностью к раковым клеткам. Патентный поиск показал, что объект исследования обладает патентной чистотой, т.к. не нарушает действующих патентов РФ, касающихся рассматриваемого рекомбинантного штамма вируса осповакцины с противоопухолевыми свойствами. 3 Разработана методика конструирования и очистки инсерционных плазмид для встройки гена лактаптина в район гена ростового фактора вируса (VGF). Сконструированы плазмиды pVGF-FR2-PE/L-Pat, pVGF-Sign-FR2-PE/L-Pat и pVGF-S short-FR2-PE/L-Pat. Для конструирования плазмид использовался вектор pVGF-PE/L-Pat, содержащий левый и правый фланки гена С11R (кодирующего вирусный фактор роста) ВОВ штамма ЛИВП, синтетический ранний промотор Р7,5 ВОВ, ген устойчивости к пуромицину под контролем синтетического ранне-позднего промотора PE/L и полилинкер. 4 Проведено депонирование инсерционных плазмид pVGF-FR2-PE/L-Pat и pVGFSign-FR2-PE/L-Pat в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» под номерами Р-57 и Р-56, соответственно. Получены паспорта плазмид и Справки о депонировании. 5 Проведена препаративная наработка рекомбинантного штамма VV-GMCSF-S1/3 (штамм Л-ИВП вируса осповакцины со встройкой гена ГМ-КСФ человека) методом роллерного культивирования в клетках почки африканской зеленой мартышки, аттестованных для производства вакцин в России. Проведена очистка и концентрирование вируса методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Полученный очищенный концентрированный препарат рекомбинантного штамма VVGMCSF-S1/3 является гомогенной вирусной суспензией с титром 109 БОЕ/мл. Генотип и стабильность встройки гена ГМ-КСФ в вирусном препарате была подтверждена методом ПЦР с использованием специфических праймеров на геномную последовательность и сруктурную часть гена ГМ-КСФ. 6 Подтверждена экспрессия гена ГМ-КСФ методом Вестерн-блот с использованием поликлональных кроличьих антител, выявляющих все формы ГМ-КСФ человека, включая 107 негликозилированную внутриклеточную и высокогликозилированную секретируемую. С использованием цитокин-зависимых клеток эритролейкоза человека F-1 показано, что полученный рекомбинантный вирус продуцирует секретируемую форму биологически активного ГМ-КСФ человека. 7 Подведены итоги этапа и оформлена отчетная документация. 8 За счет средств индустриального партнера ООО «Фабрика биополимеров» проведена закупка материалов и оборудования для материально-технического обеспечения работ по проекту, в том числе для приготовления культуральных сред для наработки вируса. Проведена информационном государственная фонде регистрация неопубликованных НИОКР документов в в государственном ФГАНУ "Центр информационных технологий и систем органов исполнительной власти" Регистрационный номер НИОКР 114081520030, дата регистрации 15.08.2014 г. Информация о проекте размещена на официальном сайте Получателя субсидии в сети интернет по адресу http://www.niboch.nsc.ru/doku.php/ru/science/gk. Таким образом, требования технического задания и плана-графика, заявленные на 1 этап проведения работ «Выбор направления исследований. Получение инсерционных плазмид. Наработка штамма вируса Л-ИВП со встройкой гена ГМ-КСФ» по Соглашению о предоставлении субсидии от 27 июня 2014 г № 14.604.21.0057 выполнены полностью. 108 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1 McCart A., Bartlett D., Moss B. Combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector // US Patent. – 2007. - N 7208313 2 Thorne S., Hwang T., O’Gorman W. et al. Rational strain selection and engineering creates a broad-spectrum, systemically effective oncolytic poxvirus, JX-963 // J. Clin. Invest. – 2007. – V. 117. – P.3350–3358 3 Кочнева Г.В., Сиволобова Г.Ф., Юдина К. и др. Онколитические поксвирусы. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология – 2012. – №1. – С. 8–15 4 Lee J.H., Roh M.S., Lee Y.K., Kim M.K. et al. Oncolytic and immunostimulatory efficacy of a targeted oncolytic poxvirus expressing human GM-CSF following intravenous administration in a rabbit tumor model // Cancer Gene Ther. –2010. – V. 17. – P. 73–9. 5 Marchesi V. Immunotherapy: Oncolytic vaccinia virus shows promise in liver cancer // Nat Rev Clin Oncol. – 2013. – V. 10. – P. 182. 6 Cerullo V., Pesonen S., Diaconu I. et al. Oncolytic adenovirus coding for granulocyte macrophage colony-stimulating factor induces antitumoral immunity in cancer patients // Cancer Res. – 2010. – V. 70. – P. 4297–309. 7 Некипелая В.В., Семенов Д.В., Потапенко М.О., Кулигина Е.В., Кит Ю.Я., Романова И.В., Рихтер В.А. Докл Биохим Биофиз, 2008, 419, 268–271. 8 Власов В.В., Рихтер В.А., Семенов Д.В., Некипелая В.В., Кулигина Е.В., Потапенко М.О. Пептид, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека // Патент РФ № 2317304. 2008. 9 Тикунова Н.В., Семенов Д.В., Бабкина И.Н., Кулигина Е.В., Коваль О.А., Фомин А.С., Матвеева В.А., Матвеев А.Л., Матвеев Л.Э., Рихтер В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFK2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом каппа-казеина человека, и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа- казеина человека, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам. Патент РФ №2401307. 2009 10 Semenov D.V., Fomin A.S., Kuligina E.V., Koval O.A., Matveeva V.A., Babkina I.V., Tikunova N.V., Richter V.A. Recombinant analogs of a novel milk pro-apoptotic peptide, lactaptin, and their effect on cultured human cells // Protein J. – 2010. – V. 3. – С. 174–180. 11 Koval O.A., Fomin A.S., Kaledin V.I., Semenov D.V., Potapenko M.O., Kuligina E.V., Nikolin V.P., Nikitenko E.V., Richter V.A. A novel pro-apoptotic effector lactaptin inhibits tumor growth in mice models // Biochimie. – 2012. – V. 94. – P. 2467–2474. 109 12 Коваль О.А., Каледин В.И., Кулигина Е.В., Семенов Д.В., Фомин А.С., Потапенко М.О., Рихтер В.А. Способ лечения опухолей у млекопитающих. Патент РФ № 2461566, 2011. 13 Koval O.A., Tkachenko A.V., Fomin A.S., Semenov D.V., Nushtaeva A.A., Kuligina E.V.,Zavjalov E.L., Richter V.A. Lactaptin induces p53-independent cell death associated with features of apoptosis and autophagy and delays growth of breast cancer cells in mouse xenografts // PloS ONE. – 2014. – V. 9. – P. e93921. 14 Kelly E. and Russell S. History of oncolytic viruses: genesis to genetic engineering // Mol. Ther. – 2007. – V. 15. – P. 651–659. 15 Kirn D. and Thorne S. Targeted and armed oncolytic poxviruses: a novel multi-mechanistic therapeutic class for cancer // Nat. Rev. Cancer. – 2009. – V. 9. – P. 64–71. 16 Fischer M., Allen M., Wilson W. et al. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2010. – 107 (45). – P. 19508–19513. 17 Iyer L., Aravind L., Koonin E. Common origin of four diverse families of large eukaryotic DNA viruses // J. Virol. – 2001. – V. 75. – № 23. – P. 11720–11734. 18 Koonin E. and Yutin N. Origin and evolution of eukaryotic large nucleo-cytoplasmic DNA viruses// Intervirology. – 2010. – V. 53. – P. 284–292. 19 Moss B. and Damon I. Poxviridae. In: Knipe D.M. and Howley P.M. // Fields Virology. 5th ed. Lippincott Williams and Wilkins, Philadelphia. – 2007. 20 Shchelkunov S., Marennikova S., Moyer R. Orthopoxviruses pathogenic for humans // Berlin, Heidelberg, New York, Springer. – 2005. 21 McFadden G. Poxvirus tropism // Nat. Rev. Microbiol. – 2005. – V. 3. – P. :201–213. 22 Bengali Z., Townsley A.C., Moss B. Vaccinia virus strain differences in cell attachment and entry // Virology. – 2009. – V. 389. – P. 132–140. 23 Chan W.M., Bartee E.C., Moreb J.S. et al. Myxoma and vaccinia viruses bind differentially to human leukocytes // J. Virol. – 2013. – V. 87. – P. 4445–4460. 24 Chiu W.L., Lin C.L., Yang M.H. et al. Vaccinia virus 4c (A26L) protein on intracellularmature virus binds to the extracellular cellular matrix laminin //J. Virol. – 2007. – V. 81 – P. 2149–2157. 25 Chung C.S., Hsiao J.C., Chang Y.S., Chang W. A27L protein mediates vaccinia virus interaction with cell surface heparan sulfate // J. Virol. 1998. – V. 72. – P. 1577–1585. 26 Moss B. Poxvirus cell entry: How many proteins does it take? // Viruses. – 2012. – V. 4. – P. 688–707. 110 27 Mercer J., Helenius A. Vaccinia virus uses macropinocytosis and apoptotic mimicry to enter host cells // Science. – 2008. – V. 320 – P. 531–535. 28 Mercer J., Helenius A. Apoptotic mimicry: phosphatidylserine-mediated macropinocytosis of vaccinia virus // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2010. – V. 1209. – P. 49–55. 29 Ward B.M. The taking of the cytoskeleton one two three: how viruses utilize the cytoskeleton during egress // Virology. – 2011. – V. 411 – P. 244–250. 30 Payne L.G. Significance of extracellular enveloped virus in the in vitro and in vivo dissemination of vaccinia // J. Gen. Virol. – 1980. – V. 50. – P. 89–100. 31 Smith G.L., Vanderplasschen A., Law M. The formation and function of extracellular enveloped vaccinia virus // J. Gen. Virol. – 2002. – V. 83. – P. 2915–2931. 32 Ichihashi Y. Extracellular enveloped vaccinia virus escapes neutralization // Virology. – 1996. – V. 217. – P. 478–485. 33 Vanderplasschen A., Mathew E., Hollinshead M. et al. Extracellular enveloped vaccinia virus is resistant to complement because of incorporation of host complement control proteins into its envelope // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. – V. 95. – P. 7544–7549. 34 Stanford M.M., McFadden G. Myxoma virus and oncolytic virotherapy: a new biologic weapon in the war against cancer // Expert Opin. Biol. Ther. - 2007. – V. 7. – P. 1415–1425. 35 Bartee E., Chan W.M., Moreb J.S. et al. Selective purging of human multiple myeloma cells from autologous stem cell transplantation grafts using oncolytic myxoma virus // Biol. Blood Marrow Transplant. - 2012. – V. 18. – P. 1540–1551. 36 Kim M., Madlambayan G.J., Rahman M.M. et al. Myxoma virus targets primary human leukemic stem and progenitor cells while sparing normal hematopoietic stem and progenitor cells // Leukemia. – 2009. – V. 23. – P. 2313–2317. 37 Chan W.M., Rahman M.M., McFadden G. Oncolytic myxoma virus: the path to clinic // Vaccine. - 2013. – V. 31. – P. 4252–4258. 38 Lun X., Yang W., Alain T. et al. Myxoma virus is a novel oncolytic virus with significant antitumor activity against experimental human gliomas // Cancer Res. - 2005. – V. 65. – P. 9982–9990. 39 Liu J., Wennier S., McFadden G. The immunoregulatory properties of oncolytic myxoma virus and their implications in therapeutics // Microbes and Infection. – 2010. – V. 12. – P. 1144–1152. 40 Bartee E., McFaddenG. Humancancer cells have specifically lost the ability to induce the synergistic state caused by tumor necrosis factor plus interferon-β // Cytokine. - 2009. – V. 47. – P. 199–205. 111 41 Bartee E., Mohamed M.R., Lopez M.C. et al. The addition of tumor necrosis factor plus βinterferon induces a novel synergistic antiviral state against poxviruses in primary human fibroblasts // J. Virol. – 2009. – V. 83. – P. 498–511. 42 Wang G., Barrett J.W., Stanford M. et al. Infection of human cancer cells with myxoma virus requires Akt activation via interaction with a viral ankyrin-repeat host range factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA – 2006. – V. 103. – P. 4640–4645. 43 Werden S.J., McFadden G. The role of cell signaling in poxvirus tropism: the case of the MT5 host range protein of myxoma virus // Biochim. Biophys. Acta – 2008. – V. 1784. – P. 228– 237. 44 Kim M., Williamson C.T., Prudhomme J. et al. The viral tropism of two distinct oncolytic viruses, reovirus and myxoma virus, is modulated by cellular tumor suppressor gene status // Oncogene. – 2010. – V. 29. – P. 3990–3996. 45 Chan W.M. and McFadden G. Oncolytic poxviruses // Annu. Rev. Virol. - 2014. – V. 1 – P. 191–214. 46 Ogbomo H., Zemp F.J., Lun X. et al. Myxoma virus infection promotes NK lysis of malignant gliomas in vitro and in vivo // PLoS ONE. – 2013. – V. 8. – P. e66825. 47 Bartee E., Meacham A., Wise E. et al. Virotherapy usingmyxoma virus prevents lethal graftversus-host disease following xeno-transplantation with primary human hematopoietic stem cells // PLoS ONE. – 2012. – V. 7. – P. e43298. 48 Johnston J.B., McFadden G. Technical knockout: understanding poxvirus pathogenesis by selectively deleting viral immunomodulatory genes // Cell Microbiol. – 2004. – V. 6. – P. 695– 705. 49 Barrett J.W., Sypula J., Wang F. et al. M135R is a novel cell surface virulence factor of myxoma virus // J. Virol. – 2007. – V. 81. – P. 106–114. 50 Barrett J.W., Alston L.R., Wang F. et al. Identification of host range mutants of myxoma virus with altered oncolytic potential in human glioma cells // J. Neurovirol. - 2007. – V. 13. – P. 549–560. 51 Stanford M.M., Shaban M., Barrett J.W. et al. Myxoma virus oncolysis of primary and metastatic B16F10 mouse tumors in vivo // Mol. Ther. - 2008. – V. 16. – P. 52–59. 52 Lee H. and Essani K. Differential Susceptibility of Human Cancer Cell Lines to Wild-Type Tanapoxvirus Infection. // The Open Virology Journal – 2010. – V. 4. – P. 1–6. 53 Evgin L., Vaha-Koskela M., Rintoul J. et al. Potent oncolytic activity of raccoonpox virus in the absence of natural pathogenicity // Mol. Ther. - 2010. – V. 18. – P. 896–902. 112 54 Fenner F., Henderson D., Arita I. et al. Smallpox and its eradication // World Health Organization, Geneva 1988. 55 Wein L., Wu J. and Kirn D. Validation and analysis of a mathematical model of a replication competent oncolytic virus for cancer treatment: implications for virus design and delivery // Cancer Res. – 2003. – V. 63. – P.1317–1324. 56 Moss B. Poxvirus entry and membrane fusion // Virology. – 2006. – V. 344. – P.48–54. 57 Smith G. and Moss B. Infectious poxvirus vectors have capacity for at least 25000 base pairs of foreign DNA // Gene. – 1983. – V. 25. – P.21–28. 58 Kirn D., Wang Y., Liang W. et al. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion // Cancer Res. – 2008. – V. 68. – P.2071–2075. 59 Buller R., Chakrabarti S., Cooper J. Deletion of the vaccinia virus growth factor gene reduces virus virulence // J. Virol. - 1988. – V. 62. – P. 866–874. 60 McCart J.A., Ward J.M., Lee J. et al. Systemic cancer therapy with a tumorselective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes // Cancer Res. – 2001. – V. 61. – P. 8751–8757. 61 Lun X., Ruan Y., Jayanthan A. et al. Double-deleted vaccinia virus in virotherapy for refractory and metastatic pediatric solid tumors // Mol. Oncol. – 2013. – V. 7. – P. 944–954. 62 Zhang Q., Yu Y., Wang E. et al. Eradication of Solid Human Breast Tumors in Nude Mice with an Intravenously Injected Light-Emitting Oncolytic Vaccinia Virus // Cancer Res. – 2007. – V. 67. – P. 10038-10046. 63 Zhang Q., Liang C., Yu Y. et al. The highly attenuated recombinant vaccinia virus GLV1h68: comparative genomic features and the contribution of F14.5L inactivation // Mol Genet Genomics. – 2009. – V. 282. – P. 417-435. 64 Seubert C., Stritzker J., Hess M., et al. Enhanced tumor therapy using vaccinia virus strain GLV-1h68 in combination with a b-galactosidase-activatable prodrug seco-analog of duocarmycin SA // Cancer Gene Therapy. – 2011. – V. 18. – P. 42–52. 65 Kim J., Oh Y., Park B. et al. Systemic armed oncolytic and immunologic therapy for cancer with JX-594, a targeted poxvirus expressing GM-KSF // Mol. Ther. – 2006. – V. 14. – P.361– 370. 66 Kirn D., Wang Y., Le Boeuf F. et al. Targeting of interferon-beta to produce a specific, multimechanistic oncolytic vaccinia virus // PLoS Med. – 2007. – V. 4. – P. 2001–2010. 67 Guse K., Sloniecka M., Diaconu I. et al. Antiangiogenic Arming of an Oncolytic Vaccinia Virus Enhances Antitumor Efficacy in Renal Cell Cancer Models // Journal of Virology. – 2010. – V. 84. – P. 856–866. 113 68 Tysome J., Briat A., Alusi G. et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatinangiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer // Gene Ther. – 2009. – V. 16. – P. 1223–1233. 69 Chalikonda S., Kivlen M.H., O'Malley M. et al. Oncolytic virotherapy for ovarian carcinomatosis using a replication-selective vaccinia virus armed with a yeast cytosine deaminase gene // Cancer Gene Ther. – 2008. – V. 15. – P. 5–25. 70 McCart A., Puhlmann M., Lee J. et al. Complex interactions between the replicating oncolytic effect and the enzyme/prodrug effect of vaccinia mediated tumor regression // Gene Therapy. – 2000. – V. 7. – P. 1217–1223. 71 Кочнева Г.В., Бабкина И.Н., Лупан Т.А. и др. Апоптин усиливает онколитическую активность вируса осповакцины in vitro // Молекулярная биология – 2013 – Т. 47, № 5 – С. 842–852. 72 Tedcastle A., Cawood R., Di Y. et al. Virotherapy-cancer targeted pharmacology // Drug Discov Today. – 2012. – V. 17(5-6). – P. 215-220. 73 Breitbach C.J., Burke J., Jonker D.et al. Intravenous delivery of a multimechanistic cancertargeted oncolytic poxvirus in humans // Nature. – 2011. – V. 477. – P. 99–104. 74 Chakrabarti S., Sisler J. and Moss B. Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression // Biotechniques. – 1997. – V. 23. – P. 1094–1097. 75 Chen В., Timiryasova T., Haghighat P. et al. Low-Dose Vaccinia Virus-Mediated Cytokine Gene Therapy of Glioma // Journal of Immunotherapy – 2001. – V. 24. – P. 46–57. 76 Addison C., Bramson J., Hitt M. et al. Intratumoral coinjection of adenoviral vectors expressing IL-2 and IL-12 results in enhanced frequency of regression of injected and untreated distal tumors // Gene Ther. 1998. – V. 5. – P. 1400–1409. 77 Fernandez N., Levraud J., Haddada H. et al. High frequency of specific CD8+ T cells in the tumor and blood is associated with efficient local IL-12 gene therapy of cancer // J. Immunol. – 1999. – V. 162. – P. 609–617. 78 Cox G., Melillo G., Chattopadhyay U. et al. Tumor necrosis factor-alpha-dependent production of reactive nitrogen intermediates mediates IFN-gamma plus IL-2-induced murine macrophage tumoricidal activity // J. Immunol. – 1992. – V. 149. – P. 3290–3296. 79 Greco O. and Dachs G. Gene directed enzyme/prodrug therapy of cancer: historical appraisal and future prospectives // J. Cell Physiol. – 2001. – V. 187. – P. 22–36. 80 Fukuda K., Abei M., Ugai H. et al. E1A, E1B double-restricted replicative adenovirus at low dose greatly augments tumor-specific suicide gene therapy for gallbladder cancer // Cancer Gene Ther. – 2009. – V. 16. – P. 126–136. 114 81 Braidwood L., Dunn P., Hardy S. et al. Antitumor activity of a selectively replication competent herpes simplex virus (HSV) with enzyme prodrug therap // Anticancer Res. – 2009 – V. 29. – P. 2159–2166. 82 Russell S.J., Peng K-W., Bell J.C. Oncolytic virotherapy // Nat. Biotechnol. – 2012. – V. 30 (7). – P. 2–14. 83 Timiryasova T., Li J., Chen B. et al. Antitumor Effect of Vaccinia Virus in Glioma Model // Oncology Research. – 1999. – V. 11. – P. 133–144. 84 Ellenhorn I, Joshua D., Diamond D. et al. Modified vaccinia ankara expressing P53 in cancer immunotherapy // Patent No N7563448. – 2009. 85 Hainaut P. and Hollstein M. p53 and human cancer: the first ten thousand mutations // Adv. Cancer Res. – 2000. – V. 77. – P. 81–137. 86 Almazov V.P., Kochetkov D.V. and Chumakov P.M. The use of p53 as a tool for human cancer therapy // Mol. Biol. (Russian). – 2007. – № 41. – P. 947–963. 87 Chen B., Timiryasova T., Andres M. et al. Evaluation of combined vaccinia virus-mediated antitumor gene therapy with p53, IL-2, and IL-12 in a glioma model // Cancer Gene Ther. – 2000. – V. 7. – P. 1437–1447. 88 Los M., Panigrahi S., Rashedi I. et al. Apoptin, a tumor-selective killer // Biochim. Biophys. Acta. – 2009. – V. 1793. – P. 1335–1342. 89 Maddika S., Mendoza F.J., Hauff K. et al. Cancer-selective therapy of the future: apoptin and its mechanism of action // Cancer Biol. Ther. – 2006. – V. 5. – P. 10–19. 90 Чумаков П.М., Кочнева Г.В., Бабкина И.Н. и др. Рекомбинантная плазмидная ДНК pGEM-Puro-DS-Apo, последовательностями рекомбинантный содержащая генома штамм синтетический вируса ген осповакцины VVdGF-ApoS24/2 вируса апоптина, из района осповакцины, фланкированный С10L-С12L, и продуцирующий апоптин. // Пат. 2492238 Российская Федерация., 10.09.2013 91 Kochneva G., Zonov E., Grazhdantseva A. et al. Apoptin enhances the oncolytic properties of vaccinia virus and modifies mechanisms of tumor regression // Oncotarget. – 2014 – V. 10 – pii: 2579. 92 Ziauddin M., Guo Z., O'Malley M. et al. TRAIL gene-armed oncolytic poxvirus and oxaliplatin can work synergistically against colorectal cancer // Gene Therapy. – 2010. – V. 17. – P. 550-559. 93 Wiley S., Schooley K., Smolak P. et al. Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis // Immunity. – 1995. – V. 3. – P. 673–682. 115 94 Sheridan J., Marsters S., Pitti R. et al. Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors // Science. – 1997. – V. 277. – P. 818. 95 Ryu H., Chang K., Chang S. et al. Expression of TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) receptors in cervical cancer // Int J Gynecol Cancer. – 2000. – V. 10. – P. 417-424. 96 Lombardo Y., Scopelliti A., Cammareri P. et al. Bone morphogenetic protein 4 induces differentiation of colorectal cancer stem cells and increases their response to chemotherapy in mice // Gastroenterology. – 2011. – V. 140. – P. 297–309. 97 Piccirillo S.G., Vescovi A.L. Bone morphogenetic proteins regulate tumorigenicity in human glioblastoma stem cells // Ernst Schering Found. Symp. Proc. – 2006. – V. 5. – P. 59–81. 98 Duggal R., Geissinger U., Zhang Q. et al. Vaccinia virus expressing bone morphogenetic protein-4 in novel glioblastoma orthotopicmodels facilitates enhanced tumor regression and long-term survival // J. Transl. Med. - 2013. – V. 11. – P. 155. 99 Isayeva T., Kumar S., Ponnazhagan S. Anti-angiogenic gene therapy for cancer // Int. J. Oncol. – 2004. – V. 25. – P. 335-343. 100 Karrasch M., Mescheder A. Use of Oncolytic Viruses and Antiangiogenic Agents in the Treatment of Cancer // Patent US. – 2009. – N 20090317456. 101 Garcea G., Doucas H., Steward W. et al. Hypoxia and angiogenesis in pancreatic cancer // ANZ J Surg. – 2006. – V. 76. – P. 830–842. 102 Ikeda N., Adachi M., Taki T. et al. Prognostic significance of angiogenesis in human pancreatic cancer // Br J Cancer . – 1999. – V. 79. – P. 1553–1563. 103 Kim K., B. Li, Winer J. et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth in vivo // Nature. – 1993. – V. 362. – P. 841–844. 104 Guse K., Sloniecka M., Diaconu I. et al. Antiangiogenic Arming of an Oncolytic Vaccinia Virus Enhances Antitumor Efficacy in Renal Cell Cancer Models // Journal of Virology. – 2010. – V. 84. – P. 856–866. 105 Frentzen A., Yu Y.A., Chen N. et al. Anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 encoded by oncolytic vaccinia virus significantly enhances antitumor therapy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2009. – V. 106. – P. 12915–12920. 106 Weibel S., Hofmann E., Basse-Luesebrink T.C. et al. Treatment of malignant effusion by oncolytic virotherapy in an experimental subcutaneous xenograft model of lung cancer // J. Transl. Med. - 2013. – V. 11. – P. 106. 107 Hofmann E., Grummt F., Szalay A.A. Vaccinia virusGLV-1h237 carrying a WalkerAmotif mutation of mouse Cdc6 protein enhances human breast tumor therapy inmouse xenografts // Int. J. Oncol. - 2011. – V. 38. – P. 871–878. 116 108 Bohlius J., Weingart O., Trelle S., Engert A. Cancer-related anemia and recombinant human erythropoietin—an updated overview // Nat. Clin. Pract. Oncol. – 2006. – V. 3. – P. 152–164. 109 Glaspy J.A. Erythropoietin in cancer patients // Annu. Rev. Med. – 2009. – V. 60. – P. 181– 192. 110 Henke M., Laszig R., Rube C. et al. Erythropoietin to treat head and neck cancer patients with anaemia undergoing radiotherapy: randomised, double-blind, placebo-controlled trial // Lancet. – 2003. – V. 362. – P. 1255–1260. 111 Leyland-Jones B., Semiglazov V., Pawlicki M. et al. Maintaining normal hemoglobin levels with epoetin alfa inmainly nonanemic patients withmetastatic breast cancer receiving first-line chemotherapy: a survival study // J. Clin. Oncol. – 2005. – V. 23. – P. 5960–5972. 112 Ghezzi P., Brines M. Erythropoietin as an antiapoptotic, tissue-protective cytokine // Cell Death Differ. – 2004. – V. 11(Suppl. 1). – P. 37–44. 113 Yasuda Y., Fujita Y., Matsuo T. et al. Erythropoietin regulates tumour growth of human malignancies // Carcinogenesis. – 2003. – V. 24. – P. 1021–1029. 114 Hardee M.E., Kirkpatrick J.P., Shan S. et al. Human recombinant erythropoietin (rEpo) has no effect on tumour growth or angiogenesis // Br. J. Cancer. – 2005. – V. 93. – P. 1350–1355. 115 LaMontagne K.R., Butler J., Marshall D.J. et al. Recombinant epoetins do not stimulate tumor growth in erythropoietin receptor–positive breast carcinoma models // Mol. Cancer Ther. – 2006. – V. 5. – P. 347–355. 116 Swift S., Ellison A.R., Kassner P. et al. Absence of functional EpoR expression in human tumor cell lines // Blood. – 2010. – V. 115. – P. 4254–4263. 117 Nguyen D.H., Chen N.G., Zhang Q. et al. Vaccinia virus–mediated expression of human erythropoietin in tumors enhances virotherapy and alleviates cancer-related anemia in mice // Mol. Ther. – 2013. – V. 21. – P. 2054–2062. 118 Mastrangelo M.J., Lattime E.C. Virotherapy clinical trials for regional disease: in situ immune modulation using recombinant poxvirus vectors // Cancer Gene Ther. – 2002. - V. 9. – P. 1013–1021. 119 Breitbach C.J., Burke J., Jonker D.et al. Intravenous delivery of a multimechanistic cancertargeted oncolytic poxvirus in humans // Nature. – 2011. – V. 477. – P. 99–104. 120 Heo J., Reid T., Ruo L. et al. Randomized dose-finding clinical trial of oncolytic immunotherapeutic vaccinia JX-594 in liver cancer //Nat. Med. – 2013. – V. 19. – P. 329–336 121 Hwang T.H., Moon A., Burke J. et al. A mechanistic proof-of-concept clinical trial with JX594, a targeted multi-mechanistic oncolytic poxvirus, in patients with metastatic melanoma. // Mol. Ther. – 2011. - V. 19. – P. 1913–1922. 117 122 Park B.H., Hwang T., Liu T.C. et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial // Lancet Oncol. – 2008. – V. 9. – P. 533–542. 123 Lee S., Eisenlohr L., McCue P. et al. Intravesical gene therapy: in vivo gene transfer using recombinant vaccinia virus vectors // Cancer Res. – 1994. – V. 54. – P. 3325–3328. 124 Robinson B., Mukherjee S., Davidson A. et al. Cytokine gene therapy or infusion as treatment of solid human cancer // J. Immunother. – 1998. – V. 21. – P. 211–217. 125 Liu T.C., Hwang T., Park B.H. et al. The targeted oncolytic poxvirus JX-594 demonstrates antitumoral, antivascular, and anti-HBV activities in patients with hepatocellular carcinoma // Mol. Ther. – 2008. – V. 16. – P. 1637–1642. 126 Parato K.A., Breitbach C.J., Boeuf F.L. et al. The oncolytic poxvirus JX-594 selectively replicates in and destroys cancer cells driven by genetic pathways commonly activated in cancers // Molecular Therapy. – 2012. – V. 20. – P. 749–758. 127 Hou W., Chen H., Rojas J. et al. Oncolytic vaccinia virus demonstrates antiangiogeniceffects mediated by targeting of VEGF // Int. J. Cancer. – 2014. - V.135 (5) - P. 1238-1246. 128 Wennier S.T., Liu J., McFadden G. Bugs and drugs: oncolytic virotherapy in combination with chemotherapy // Curr. Pharm. Biotechnol. – 2012. – V. 13. – P. 1817–1833. 129 Heo J., Breitbach C.J., Moon A. et al. Sequential therapy with JX-594, a targeted oncolytic poxvirus, followed by sorafenib in hepatocellular carcinoma: preclinical and clinical demonstration of combination efficacy // Mol. Ther. – 2011. – V. 19. – P. 1170–1179. 130 Cheng A.L., Kang Y.K., Chen Z. et al. Efficacy and safety of sorafenib in patients in the Asia-Pacific region with advanced hepatocellular carcinoma: a phase III randomised, doubleblind, placebo-controlled trial // Lancet Oncol. – 2009. – V. 10. – P. 25–34. 131 Llovet J.M., Ricci S., Mazzaferro V. et al. Sorafenib in advanced hepatocellular carcinoma // N. Engl. J. Med. – 2008. – V. 359. – P. 378–390. 132 Munguia A.,Ota T., Miest T., Russell S.J. Cell carriers to deliver oncolytic viruses to sites of myeloma tumor growth // Gene Ther. - 2008. – V. 15. – P. 797–806. 133 Power A.T., Wang J., Falls T.J. et al. Carrier cell–based delivery of an oncolytic virus circumvents antiviral immunity // Mol. Ther. - 2007. – V. 15. – P. 123–130. 134 Willmon C., Harrington K., Kottke T. et al. Cell carriers for oncolytic viruses: Fed Ex for cancer therapy // Mol. Ther. - 2009. – V. 17. – P. 1667–1676. 135 Mader E.K., Butler G., Dowdy S.C. et al. Optimizing patient derived mesenchymal stem cells as virus carriers for a phase I clinical trial in ovarian cancer // J. Transl.Med. – 2013. – V. 11. – P. 20-26. 118 136 Josiah D.T., Zhu D., Dreher F. et al. Adipose-derived stem cells as therapeutic delivery vehicles of an oncolytic virus for glioblastoma // Mol. Ther. - 2010. – V. 18. – P. 377–385. 137 Thorne S.H., Negrin R.S., Contag C.H. Synergistic antitumor effects of immune cell–viral biotherapy // Science. - 2006. – P. 311. – P. 1780–1784. 138 Sampath P., Li J., Hou W. et al. Crosstalk between immune cell and oncolytic vaccinia therapy enhances tumor trafficking and antitumor effects // Mol. Ther. - 2013. – V. 21. – P. 620– 628. 139 Isolauri E. Development of healthy gut microbiota early in life // J Paediatr Child Health. – 2012. – Suppl 3:1-6. doi: 10.1111/j.1440-1754.2012.02489.x. 140 Kunz C., Lönnerdal B. Re-evaluation of the whey protein/casein ratio of human milk // Acta Paediatr. – 1992. – V. 81. – P. 107–12. 141 Chakraborty A., Basak S. pH-induced structural transitions of caseins // J Photochem Photobiol B. – 2007. – V. 87(3). – P. 191–9. 142 Strömqvist M., Falk P., Bergström S., Hansson L., Lönnerdal B., Normark S., Hernell O. Human milk kappa-casein and inhibition of Helicobacter pylori adhesion to human gastric mucosa // J Pediatr Gastroenterol Nutr. – 1995. – V. 21(3). – P. 288–96. 143 del Mar Contreras M., Sanchez D., Sevilla M, Recio I, Amigo L. Resistance of caseinderived bioactive peptides to simulated gastrointestinal digestion // Int Dairy J. – 2013. – V. 32 – P. 71–78. 144 Liepke C., Zucht H.D., Forssmann W.G., Ständker L. Purification of novel peptide antibiotics from human milk // J Chromatogr B Biomed Sci Appl. – 2001. – V. 752. – P. 369–77. 145 López-Expósito I., Minervini F., Amigo L., Recio I. Identification of antibacterial peptides from bovine kappa-casein // J Food Prot. – 2006. –V. 69(12). – P. 2992–7. 146 Håkansson A., Zhivotovsky B., Orrenius S., Sabharwal H., Svanborg C. Apoptosis induced by a human milk protein // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1995. – V. 92(17). – P. 8064–8. 147 Håkansson A., Andréasson J., Zhivotovsky B., Karpman D., Orrenius S., Svanborg C. Multimeric alpha-lactalbumin from human milk induces apoptosis through a direct effect on cell nuclei // Exp Cell Res. – 1999. – V. 246(2). – P. 451–60. 148 Svensson M., Håkansson A., Mossberg A.K., Linse S., Svanborg C. Conversion of alphalactalbumin to a protein inducing apoptosis // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2000. – V. 97(8). –P. 4221–6. 149 Fischer W., Gustafsson L., Mossberg A.K., Gronli J., Mork S., Bjerkvig R., Svanborg C. Human alpha-lactalbumin made lethal to tumor cells (HAMLET) kills human glioblastoma cells 119 in brain xenografts by an apoptosis-like mechanism and prolongs survival // Cancer Res. –2004. –V. 64(6). – P. 2105–12. 150 Gustafsson L., Leijonhufvud I., Aronsson A., Mossberg A.K., Svanborg C. Treatment of skin papillomas with topical alpha-lactalbumin-oleic acid // N Engl J Med. – 2004. – V. 350(26). – P. 2663–72. 151 Mossberg A.K., Hou Y., Svensson M., Holmqvist B., Svanborg C. HAMLET treatment delays bladder cancer development // J Urol. – 2010. – V. 183(4). – P. 1590-7. 152 А. S. Fomin, O.A. Koval', D.V. Semenov, M.O. Potapenko, E.V. Kuligina, Y.Y. Kit, V.A. Richter. Analysis of biochemical markers of MCF-7 cell apoptosis induced by a recombinant analogue of lactaptin // Bioorg. Chem. – 2012. – V.38. – С. 1–7. 153 Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. // Cold Spring Press. – 1989, Cold Spring Harbor, NY. 154 Merchlinsky M. et al.. Construction and characterization of vaccinia direct ligation vectors // Virology. – 1997. – Vol. 238 – P.444–451. 155 Sakaguchi M: Mutational analysis of signal-anchor and stop transfer sequences in membrane proteins. // Membrane Protein Assembl. – 1997. – P. 135-l 50. 156 Crowley K.S., Liao S., Worrell V.E., Reinhart G.D., Johnson A.E. Secretory proteins move through the ER membrane via an aqueous, gated pore // Cell. – 1994. - Vol. 76. - P. 461-471. 157 Feng W., Matzuk M.M., Mountjoy K., Bedows E., Ruddon R.W. The asparagine-linked oligosaccharides of the human chorionic gonadotropin p subunit facilitate correct disulfide bond pairing // J. Biol. Chem. - 1995. – Vol. 270. – P. 11851-l1859. 158 Sakaguchi M., Tomiyoshi R., Kuroiwa T., Mihara K., Omura T. Functions of signal and signal-anchor sequences are determined by the balance between the hydrophobic segment and the N-terminal charge // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1992. – Vol. 69. – P.16-19. 159 von Heijne G. Patterns of amino acids near signal-sequence cleavage sites // Eur. J. Biochem. – 1983. – Vol. 133. – P. 17–21. 160 von Heijne G. Signal sequences: The limits of variation // Journal of Molecular Biology. – 1985. – Vol. 1. – P. 99-105. 161 Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. and von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavagesites // Protein Engineering. – 1997. – Vol. 10. – P. 1-6. 162 Zhang H., Henzel W. Signal peptide prediction based on analysis of experimentally verified cleavage sites // Protein Science. – 2004. – Vol. 13. – P. 2819–2824. 120 163 Choo Kh., Ranganathan Sh. Flanking signal and mature peptide residues influence signal peptide cleavage // BMC Bioinformatics. – 2008. – Vol. 9. – P. 15. 164 Hiller K., GroteA., Scheer M., Mu¨nch R., Jahn D. PrediSi: prediction of signal peptides and their cleavage positions // Nucleic Acids Research. – 2004. - Vol. 32. – P. 375-379. 165 Kajava A., Zolov S., Kalinin A., Nesmejanova M. The Net Charge of the First 18 Residues of the Mature Sequence Affects Protein Translocation across the Cytoplasmic Membrane of Gram-Negative Bacteria // J. Bacteriol. – 2000. – P. 2163–2169. 166 Fekkes P., Driessen A. Protein targeting to the bacterial cytoplasmic membrane // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 1999. – Vol. 63. – P.161–173. 167 Kamp R., Tsunasawa S., Hirano H. Application of new deblocking aminopeptidase from Pyrococcus furiosis for microsequence analysis of blocked proteins // J. Protein Chem. -1998. – Vol. 17. – P. 512–513. 168 Kendall D., Bock S., Kaiser E. Idealization of the hydrophobic segment of the alkaline phosphatase signal peptide // Nature. – 1986. – Vol. 321. – P. 706–708. 169 Izard J., Rusch S., Kendall D. The amino-terminal charge and core region hydrophobicity interdependently contribute to the function of signal sequences // J Biol Chem. – 1996. – Vol. 271. – P. 579- 582. 170 Morioka-Fujimoto K., Marumoto R., Fukuda T. Modified enterotoxin signal sequences increase secretion level of the recombinant human epidermal growth factor in Escherichia coli // J. Biol. Chem. – 1991. – Vol. 266. – P. 1728–1732. 171 Zhang L., Leng Q., Mixson J. Alteration in the IL-2 signal peptide affects secretion of proteins in vitro and in vivo // J. Gen. Med. Res. – 2005. – Vol. 7. – P. 354–365. 172 Sasada R., Marumoto R., Igarashi K. Secretion of human EGF and IgE in mammalian cells by recombinant DNA techniques; use of a IL-2 leader sequence // Cell Struct. Funct. – 1988. – Vol. 13. – P. 129–141. 173 Suzuki K., Nakazato H., Matsui H., et al. NK cell-mediated antitumor immune response to human prostate cancer cell, PC-3: immunogene therapy using a highly secretable form of interleukin-15 gene transfer // J. Leukoc. Biol. – 2001. – Vol. 69. – P. 531–537. 174 Sagiya Y., Yamagata H., Udaka S. Direct high-level secretion into the culture medium of tuna growth hormone in biologically active form by Bacillus brevis // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1994. – Vol. 42. – P. 358–363. 175 Hatsuzawa K., Tagaya M., Mizushima S. The hydrophobic region of signal peptides is a determinant for SRP recognition and protein translocation across the ER membrane // J. Biochem. – 1997. – Vol. 121. – P. 270–277. 121 176 Hikita C., Mizushima S. Effects of Total Hydrophobicity and Lengtohf the Hydrophobic Domain of a Signal Peptide on in Vitro Translocation Efficiency // J. Biol. Chem. - 1992. – Vol. 267. – P. 4882-4888. 177 Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. and von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavagesites // Protein Engineering. – 1997. – Vol. 10. – P. 1-6. 178 Nielsen H., Krogh A. Prediction of signal peptides and signal anchors by a hidden Markov model // Proceeding of the 6th International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. – 1998. – P. 122 – 130. 179 ftp://virus.cbs.dtu.dk/pub/signalp/HUMANSIG.red. 180 Barash S., Wang W., Shib Y. Human secretory signal peptide description by hidden Markov model and generation of a strong artificial signal peptide for secreted protein expression // Biochemical and Biophysical Research Communications. – 2002. – Vol. 294. – P. 835–842. 181 Stern B., Olsen L.C., Tröße C., Ravneberg H. and Pryme I.F. Improving mammalian cell factories : The selection of signal peptide has a major impact on recombinant protein synthesis and secretion in mammalian cells // Trends Cell Mol. Biol. – 2007. – Vol. 2. – P. 1-17. 182 Knappskog S., Ravneberg H., Gjerdrum C., Troβe C., Stern B., Prymea I. The level of synthesis and secretion of Gaussia princeps luciferase in transfected CHO cells is heavily dependent on the choice of signal peptide // Journal of Biotechnology. – 2007. – Vol. 128. – P. 705–715. 183 Oosterhoff D ., Pinedo H., van der Meulen I., de Graaf M., Sone T., Kruyt F., van Beusechem V., Haisma H., Gerritsen W. Secreted and tumour targeted human carboxylesterase for activation of irinotecan // British Journal of Cancer. – 2002. – Vol. 87. – P. 659 – 664. 184 Flinterman M., Farzaneh F., Habib N., Malik F., Gaken J., Tavassoli M. Delivery of Therapeutic Proteins as Secretable TAT Fusion Products // Molecula.r Therapy. – 2009. - Vol. 17. – P. 334-342. 185 Morris A., Remmele Jr., Klinke R., Macduff B.M., Fanslow W.C. and Armitage R. . Incorporation of an Isoleucine Zipper Motif Enhances the Biological Avtivity of Soluble CD40L (CD 154) // The journal of Biological Chemistry. – 1999. – Vol. 474. – P. 418-423. 186 Pecceu F., Dousset P., Shire D., Cavrois E., Marchese E., Ferrara P., Kaghad M., Dumont X., Lupker J. Human interleukin lb fused to the human growth hormone signal peptide is Nglycosilated and secretede by chinese hamster ovary cells // Gene. – 1991. – Vol. 97. – P. 253-8 187 Chitlary E., Amitai H., Helman D. Homogeneity and secretion of recombinant proteins in mammalian systems. // US Patent 7,282,352 B2. – 2007. 122 188 КАК ЭТО БЫЛО: программа глобальной ликвидации оспы в воспоминаниях ее участников // Под ред. С.С. Маренниковой. – ЦЭРИС, Новосибирск, 2011. – 276с. 189 Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы // М.: КМК Scientific Press Ltd. – 1998. – 386с. 190 Максютов Р.А., Гаврилова Е. В., Щелкунов С. Н. Разработка современных противооспенных вакцин // Вопросы вирусологии. – 2011. – Т. 56. - №6. – С. 4-8. 191 Серпинский О.И., Кочнева Г.В., Урманов И.Х., Сиволобова Г.Ф., Рябчикова Е.И. Конструирование рекомбинантных вариантов ортопоксвирусов путем встройки чужеродных генов в межгенный промежуток вирусного генома // Молекуляр. биология. – 1996. - № 30. – С. 1064-1073. 192 Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. // Сибирское университетское издательство, Новосибирск. - 2010. - 514с. 193 Weisbart R.H., Golde D.W., Cark S.C., Wong G.G., Gassan J.C. Human granulocytmacrophage colony-stimulating factor is a neutrophil activator // Nature. – 1985. – Vol. 314. – P. 361-363. 194 Fleischmann J., Golde D. W., Weisbart R. H., Gasson J. C. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances phagocytosis of bacteria by human neutrophils // Blood. – 1986. – V. 68(3) – P. 708-711. 195 Kushner B.H., Cheung N.K. GM-CSF enhances 3F8 monoclonal antibody-dependent cellular cytoxicity against human melanoma and neuroblastoma // Blood. – 1989. – V. 73(7) – P. 1936-1941. 196 Berois N. and Osinaga E. Glycobiology of neuroblastoma: impact on tumor behavior, prognosis, and therapeutic strategies // Front. Oncol. – 2014. - V. 4 - P. 2-13. 197 Kirn D. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy. // U.S.A. Patent # 2010/0303714 A1 – 2010. 198 Cochran M.A. et al. In vitro mutagenesis of the promoter region for a vaccinia virus gene: evidence for tandem early and late regulatory signals. // J. Virol. – 1985. – V. 54(1). – P. 30-37. 199 Buller R.M.L., Smith G.L., Cremer K. Decreased virulence of recombinant vaccinia virus expression vectors is associated with a thymidine kinase-negative phenotype. // Nature. – 1985. – Vol. 317. – P.813-815. 200 Jacobs В., Mitnik C., Langland M. Mutants of Vaccinia Virus as oncolytic Agents. // U.S. Patent. – 2007. – N 2007/0036758 A1. 201 Monks A., Scudiero D., Skehan P., Shoemaker R., Paull K., Vistica D., Hose C., Langley J., Cronise P., Vaigro-Wolff A. Feasibility of a High-Flux Anticancer Drug Screen Using a Diverse 123 Panel of Cultured Human Tumor Cell Lines // Journal of the National Cancer Institute. - 1991. V. 83. N 11. – P. 757-766. 202 Scudiero D.A., Shoemaker R.H., Paull K.D., Monks A., Tierney S., Nofziger T.H., Currens M.J., Seniff D., Boyd M.R. Evaluation of a Soluble Tetrazolium/Formazan Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture Using Human and Other Tumor Cell Lines. // Cancer Research. – 1988. –V. 48. – P. 4827-4833. 124