применение культур клеток в биомедицинских исследованиях
advertisement
Министерство образования и науки РФ Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА МИКРОБИОЛОГИИ Направление: 06.03.01 (ОКСО 020400.62) – биология ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА Бакалаврская работа ПРИМЕНЕНИЕ КУЛЬТУР КЛЕТОК В БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ Работа завершена: "___"_________ 2015 г. ____________________ (А.А. Тухбатова) ____________________ (П.В. Зеленихин) ____________________ (О.Н. Ильинская) Работа допущена к защите: Научный руководитель к.б.н., доцент, "___"_________ 2015 г. Заведующий кафедрой д.б.н., профессор "___"_________ 2015 г. Казань–2015 Оглавление СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..................................................................................... 3 ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 4 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................... 7 1.1.Многообразие типов культур клеток .......................................................... 7 1.1.1.Типы культур клеток ............................................................................. 7 1.1.2.Морфология культур.............................................................................. 8 1.2 Культуры клеток в вирусологии ................................................................ 11 1.3.Клеточные культуры как источники биологически активных соединений ......................................................................................................... 15 1.4.Использование культур раковых клеток в разработке новых противоопухолевых средств. ........................................................................... 16 1.4.1. Раковые клеточные линии в качестве модели для изучения злокачественных новообразований. ............................................................ 17 1.4.2. Тестирование противоопухолевых средств на раковых культурах клеток.............................................................................................................. 22 1.5.Преимущества и недостатки использования культур клеток в биомедицинских исследованиях. .................................................................... 27 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................... 31 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ........................................... 32 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5-FU – 5-фторурацил AIPC — андроген-независимый рак АТСС – Американской коллекции типовых культур CCLE – Энциклопедия клеточных линий рака cDNA – комплементарная ДНК CPE (core promoter element) – Промоторы РНК-полимеразы I ECACC – Европейская коллекция клеточных культур HSV – герпис MDS – миелодиспластического синдром Р-GP — фосфогликопротеин q RT-PCR – полимеразная цепная реакция в реальном времени БАВ – биологически активные вещества ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота мРНК – матричная РНК РНК — рибонуклеиновая кислота ПЦР – полимеразная цепная реакция ЦПЭ – цитопаэтический эффект 3 ВВЕДЕНИЕ На протяжении всей истории биологии, ученые использовали в биомедицинских исследованиях различные организмы для решения медицинских проблем Развитие наиболее важных и перспективных фундаментальных и прикладных исследований в области молекулярной и клеточной биологии, генетики, эмбриологии неразрывно связано с широким использованием культур клеток человека, животных и растений. Такие центральные общебиологические проблемы как дифференцировка, канцерогенез, клеточная подвижность, пролиферация, передача наследственной информации, регуляция экспрессии генов и другие решаются, в основном, на клеточных культурах. Клеточные культуры имеют также большое значение для решения прикладных задач медицины, сельского хозяйства, биотехнологии и биологической промышленности. К основным задачам следует отнести массовое промышленное производство вакцин и физиологически активных соединений, получение моноклональных антител методами гибридомной технологии, лечение тяжелых заболеваний методами генотерапии и клеточной заместительной терапии, повышение продуктивности сельскохозяйственных животных и выведение новых сортов растений, сохранение биоразнообразия генофонда путем криоконсервации соматических и половых клеток животных и растений, разработки новых методов и процедур лечения заболеваний. Культуры тканей были впервые разработаны вначале 1900-х в качестве метода для изучения поведения клеток - свободных от изменений, которые могут возникнуть во всем организме (ответ на нормальный и индуцированный экспериментальный стресс). Первоначально, ученые использовали фрагменты тканей, но постепенно методы совершенствовались, 4 это позволило изучить поведение отдельных клеток, что привело к созданию культур клеток. В своей простейшей форме, культура клеток включает рассредоточение клеток в искусственной среде, состоящей из питательных растворов, пригодную поверхность, чтобы поддерживать рост клеток и оптимальные условия температуры, влажности и уровень газа. В такой системе, исследователь может точно определить изменения в клеточной культуре, возникшие под воздействием перспективных препаратов, в присутствии или в отсутствие других видов клеток, канцерогенных агентов, а также вирусов. Клеточные культуры могут быть выделены из крови или небольших фрагментов ткани благодаря биопсии. Например, лимфоциты (белые кровяные клетки) могут быть поражены вирусом Эпштейна-Барра, а затем выращены в культуральной среде. Также, фибробласты (клетки кожи) могут быть использованы для того, чтобы создать клеточную линию, хотя их рост в среде является ограниченным во времени. Культуры клеток занимают все более заметное и важное место в токсикологических, фармакологических и других исследованиях. При этом сфера применения расширяется, а техника культивирования in vitro совершенствуется и автоматизируется. Использование культуральных тестов является свидетельством высокого уровня эксперимента в любой сфере как фундаментальных, так и прикладных отраслях. ни могут использоваться как человеческих и животных тканей и в качестве моделей различных заболеваный (раковых, сердечно-сосудистых, диабета, неврологических, ожирения и для исследования стволовых клеток). Целью данной работы явился анализ данных литературы о сфере применения клеточных культур в современных биомедицинских исследованиях. В связи с поставленной целью решались следующие задачи: 5 1) Охарактеризовать сферы применения культур клеток животных в современных биомедицинских исследованиях и производствах 2) Определить основные преимущества и недостатки метода культур клеток в различных сферах приложения 6 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1.Многообразие типов культур клеток В течение последних трех десятилетий, культуры клеток животных имеют огромное значение для медико-биологических исследований и биотехнологической деятельности в целом. Клеточная культура – это клетки, выделенные из животных или растений, с их последующим ростом в контролируемых искусственных условиях, как правило, за пределами их естественной среды обитания. В этой процедуре клетки непосредственно выделены из организма, или из тканей, или они могут быть получены из клеточных линий или клеточных штаммов. Историческое развитие и методы получения клеточной культуры тесно взаимосвязано с теми тканями и органами, из которых они получены. Использование таких клеточных культур стало обычной практикой во многих лабораториях для различных исследований. Диапазон выращенных типов клеток огромен. Как правило, клетки чувствительны к широкому диапазону соединений и, следовательно, необходимо гарантировать, что они вступают в контакт только с теми, которые используются в исследовании, а не с посторонним материалом. Главная особенность культивированных клеток – это возможность продолжительного наблюдения и сохранение жизнеспособности в течение эксперимента. 1.1.1.Типы культур клеток А) Первичные культуры выводятся непосредственно из нормальной ткани животного либо в качестве культивируемых клеток со следующей ее диссоциацией в суспензии. Такие культуры изначально неоднородны. Подготовка первичных культур является трудоемким процессом, что в последствии позволяет сохранить их в пробирке в течение ограниченного 7 периода времени. Они сохраняют многие характеристики клеток в естественных условиях. Если первичные культуры пассивируются, то они становятся клеточными линиями. B) Непрерывные культуры состоят из одного типа клеток, которые могут быть последовательно размножены в культуре. Как клеточные линии, диплоидны и поддерживают определенную степень дифференциации. Такие линии стареют приблизительно через тридцать циклов деления. 1.1.2.Морфология культур Культуры растут либо в суспензии (в виде отдельных или небольших свободноплавающих групп клеток) или в виде монослоя. В таблице 1 приведены примеры таких клеточных линий. Таблица 1 - Часто используемые клеточные линии каждого типа культур. Клетки, растущие в монослое Название Тип и происхождение ткани Морфология MRC-5 Легкие человека Фибробласты HeLa Шейка матки человека Эпителиальные Vero Почки африканской зеленой обезьяны Эпителиальные NIH 3T3 Эмбрион мыши Фибробласты L929 Соединительная ткань мыши Фибробласты CHO Яичник китайского хомяка Фибробласты BHK-21 Почки сирийского хомяка Фибробласты HEK 293 Почки человека Эпителиальные Hep G2 Печень человека Эпителиальные BAE-1 Бычья аорта Эндотелиальные SH-SY5Y Нейробластома человека Нейробласты Клетки, растущие в суспензии Название Тип и происхождение ткани 8 Морфология NS0 Миелома мыши Лимфобласты U953 Цитотоксическая лимфома человека Лимфобласты Namalwa Лимфома человека Лимфобласты WEHI 231 Лимфома В-клеток мыши Лимфобласты HL60 Лейкимия человека Лимфобласты YAC 1 Лимфома мыши Лимфобласты U 266B1 Миелома человека Лимфобласты Форма, которую принимают клеточные линии отражают ткань, из которого они были получены, например, культуры клеток крови (лейкоз, лимфома), как правило, растут в виде суспензии в то время как клетки, полученные из твердого ткани (легкие, почки) в виде монослоев. Прикрепленные клеточные линии могут быть классифицированы как эндотелиальные (BAE-1), эпителиальные (HeLa), нейронные (SH-SY5Y), фибробласты (MRC-5). На рисунке 1 приведены примеры морфологий некоторых типов клеток, на основе информации полученной из Европейской коллекции клеточных культур (ECACC). Рисунок 1 – Примеры морфологий клеток. HeLa является наиболее широко используемой моделью клеточной линии для изучения клеточной и молекулярной биологии человека. 9 HeLa был первой культивируемой линией человеческих клеток [Gey et al., 1952] и с тех пор стала наиболее широко используемой линией в биомедицинских исследованиях. Ее применение в качестве модельного организма способствовало изучению важных биологических процессов. Эта клеточная линия была получена из раковой опухоли шейки матки пациентки по имени Генриетта Лакс, который впоследствии умерла от рака в 1951 году [Skloot, 2010]. Один из самых ранних использования HeLa клеток было разработать вакцину против вируса полиомиелита [Scherer et al., 1953]. За последние 10 лет, клеточная лини HeLa была использована для создания новых подходов, таких как микрочипы экспрессии генов профилирования [Chaudhry et al., 2002; Hnilicová et al., 2011] и исследования ответов на экологические [Murray et al., 2004; Ludwig et al., 2005] и генетические изменения [Jaluria et al., 2007]. РНК-интерференция в культуре HeLa привела к открытию функциональной классификации генов, участвующих в митозе / цитокинезе [Kittler et al., 2004; Zhu et al., 2005; Kim et al., 2007; Neumann et al., 2010], эндоцитозе [Pelkmans et al., 2005] и других клеточных процессах [Alekseev et al., 2009; Fuchs et al., 2010]. Транскриптом культуры НeLa охарактеризован при помощи технологии секвенирования второго поколения, например, были обнаружены поли(А)-РНК [Wu et al., 2008 ] и малые РНК, также клеточная линия была использована в качестве модельной системы для комбинированной глубокой протеомы и транскриптомного анализа [Nagaraj et al., 2011]. Линия клеток MRC-5 обычно используется в разработке вакцины, так как может использоваться в качестве хозяина в вирусологических исследований, также применяется для экстракорпорального цитотоксического тестирования. По инициативе Дж. Джакорда, в сентябре 1966 года была получена линия из легочной ткани 14-недельных плода мужского пола (беременность 27-летней женщины была прервана по психиатрическим показаниям). 10 Клеточная линия WI-38 была разработана в июле 1962 г. из легочной ткани, взятой из терапевтически прерванного плода примерно 3 месясячного гестационного возраста. Клетки легочной ткани были использованы для первичной культуры. Фибробластоподобная морфология клеток. 1.2 Культуры клеток в вирусологии Использование культур клеток животных и человека имеет большое значение для исследований в области биотехнологии, медицины и ветеринарии. Первоначально, их использовали в качестве материала для производства вирусных вакцин (вакцины против полиомиелита на основе клеток почек обезьян, бешенства, эпидемического паротита и краснухи с использованием клеточной линии WI-38), клеточные культуры стали незаменимым инструментом для изучения внутри- или межклеточных ответов и служат как модель in vitro во время экспериментов. [Kew et al., 2005]. Также они были использованы для диагностики вирусов in vitro или для производства широкого диапазона биологических продуктов (гормонов, интерлейкинов, интерферонов и факторов роста), в том числе имеют потенциал для диагностики терапевтических продуктов. Вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, способные реплицироваться в живой клетке (в клетки животных и растений), тем самым производя собственные копии (т.е., чтобы сформировать потомство вирионов). Еще в 1913 г. вирус коровьей оспы [Stinehardt et al., 1913], в 1930 г. вирус оспы [Rivers et al., 1913], вирус желтой лихорадки [Lloyd et al., 2003] размножали в клеточных культурах с целью производства вакцин. Тем не менее, с 1950-х годов возник интерес в использовании клеточных культур для выделения различных вирусов, в основном в связи с открытием, вируса полиомиелита размноженного в клеточных культурах [Coleman et al., 2003; Robbins et al., 1950]. Метод использования культивируемых клеток, был выдвинут для изолирования вирусов, добавления антибиотиков в среду, 11 развития химически определенной клеточной среды, и использования клеточно-распределительного оборудования для приготовления дублирующие культур [Schmidt et al., 1969]. Хотя, изначально, клетки использования в диагностических лабораториях, крупные предприятия пищевой промышленности вскоре начали массовое производство различных штаммов и линий, которые могут быть приобретены и доставлены готовые клеточные культуры. Существует множество клеток, которые могут быть выращены в колбах и пробирках, таким образом, можно исследовать вирусы человека, заражающие живые организмы. Клеточные культуры более подходящи в использовании и дешевле, чем яйца и животные, их удобнее рассматривать под микроскопом на наличие пролиферации вируса, можно использовать для обнаружения и идентификации многих вирусных патогенов человека. Изоляция вируса в клеточных культурах долгое время служила в качестве «золотого стандарта» [Hsiung, 1984]. Тем не менее, в последние годы, технический прогресс, начиная от развития моноклональных антител к введению молекулярной диагностики, обеспечили мощный толчок для использования в обнаружении присутствия вирусных инфекций. Чувствительная и специфическая вирусная идентификация может быть получена при помощи ПЦР. Молекулярные методы не требуют длительный инкубационный период, необходимый для выделения вируса в клеточных культурах, включает в себя уменьшение технической экспертизы, и являются полезными для идентификации вирусов, которые не способны к пролиферации в стандартных клеточных культурах. Первичный резус почек обезьян (RhMK), клетки почки кролика, фибробласты легкого человека (MRC-5), фибробластов крайней плоти человека, эпидермальные клетки карциномы человека (Нер-2), клетки карциномы легких человека (А549) и другие, являются примером известных типов клеток, которые принято считать стандартными для большинства вирусологических лабораторий. 12 Для культивирования вирусов используют первичные и иммортализированные (бессмертные) линии, которые были получены из нормальных тканей человека, животных, злокачественных новообразований. Выбор линии клеток для производства вакцин определяется тем, насколько хорошо вирус способен реплицироваться и как легко клеточная линия может быть сохранен. Дегенеративные изменения в клетках монослоя культур, представляет доказательства присутствия вируса. Спектр изменений широкий, начиная от опухолей до кластеризации, образования синцития, и в некоторых случаях, до полного уничтожения монослоя. Эти изменения в совокупности называются цитопатогенного или цитопатический эффект (ЦПЭ) вируса. Эпителиальная культура почки собаки (MDCK) давно известна тем, что успешно поддерживает рост вируса гриппа, также часто применяется линия Vero. Сравнивались эти две линии, чтобы определить их способность распространения типа А (холодоадаптированного) и типа В (дикого) вируса гриппа. На основе ПЦР анализа в реальном времени (qRT-PCR) было выявлено изменение чувствительности дикого (wt) и холодоадаптированного (ca) типа штаммов гриппа. Повторы в шести образцах показали, что среднее изменение составляет приблизительно ±10%. Также обнаружили, что QrtPCR, основанный на их различиях в характеристике роста культуры при различных температурах, может быть полезным для дифференцировки WT и Са штаммов гриппа. Для типа А и В данных вирусов гриппа, MDCK клетки поддерживается более быстрый рост по сравнению с Vero клеток. Для типа А клетки Vero являются более подходящими по сравнению с клетками MDCK. [Youil et al., 2002]. Вирус простого герпеса 1 типа (HSV-1) и 2 (HSV-2) относится к семейству Herpesviridae и представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК. Это семейство включает в себя 3 подсемейства: альфа-, бета-, гамма. HSV-1 и HSV-2 способны вызывать различные заболевания, в том числе поражение ротовых и половых органов, слепоту и энцефалит [Brooks et all., 13 2007]. После заражения вирусом, возникает вирусная латентность в периферических нервных ганглиях [Mundinger et all., 2008]. В отличие от других членов семейства Herpesviridae , HSV имеет низкую специфичность по отношению к заражаемому объекту; таким образом, они обладают способностью инфицировать широкий спектр хозяев. В дополнение к клеткам человека, вирусы герпеса могут инфицировать клетки животного. Эта особенность приводит к успешному распространению вирусов по всему миру. Считается, что вирус заразил 40% до 80% мирового населения [Karasneh et all., 2011]. Использовались несколько клеточных линий для распространения HSV, такие как клетки почки африканской зеленой мартышки (Vero, CV-1), почки детеныша хомячка (BHK), почек эмбриона макака-резуса (FRhK), эмбриональные клетки легких человека (HEL), клетки легких норки (ML), кролика (RK13) и клеточную линию HeLa [Mahy et all., 1998]. Среди упомянутых клеточных линий, HeLa и Vero клеточные линии показал высокую эффективность для распространения HSV. Так обнаружение HSV в культуре клеток методом золотого стандарта отличаются различной чувствительностью клеточных линий и клеточных. [Motamedifar et all., 2008]. Нахождение более чувствительных клеточных линий может улучшить этот метод. Клетки McCoy могут быть использованы в качестве подходящей клеточной линии для распространения HSV. СРЕ вируса на инфицированные клетки важны для обнаружения вируса. Несмотря на это, определяется, что механизм HSV-1 зависимого апоптоза в Нер-2 / HeLa клетках отличается от клеток Vero [Nguyen et all., 2005]. McCoy-Plovdiv новое поколение McCoy клеточных линий, которое не требует сыворотки для размножения. Значение таких клеток для размножения HSV еще не определено. Эта клеточная линия может оказаться полезной для выращивания вируса для таких исследований, как разработка вакцин [Nabavinia et all., 2015]. 14 Клеточная линия Vero была получена из почек нормальной взрослой африканской зеленой обезьяны (Cercopithecus aethiops) 27 марта 1962 года, Ю. Яшимура и Ю. Кавакита в Университете Чиба в Японии [Yasumura et all., 1963]. Эта культура клеток широко используются в вирусологических исследованиях, но также во многих других исследованиях, в том числе распространении и изучении внутриклеточных бактерий (например, Rickettsia spp) и паразитов (Neospora), и оценке воздействия химических веществ, токсинов и других соединений на клетки млекопитающих на молекулярном уровне. Кроме того, клетки Vero были лицензированы в США для производства как живой (ротавирус, осп) и инактивированной (полиовирус) вирусных вакцин, и во всем мире эти клетки были использованы для производства ряда других вирусов, в том числе вирус бешенства, реовирус и японского энцефалита [Nahapetian et al., 1986]. 1.3.Клеточные культуры как источники биологически активных соединений Биологически активным считается то соединение, которое имеет непосредственное физиологическое воздействие на растение, животное или другой микроорганизм. охарактеризовать Культуры биологическую клеток активность дают возможность изучаемых соединений непосредственно на клеточном уровне и учесть сложные эффекты смесей химических соединений [Митрохин и др., 1991]. Особый интерес представляет производство разных видов химических соединений, биологически активных веществ (БАВ), необходимых для получения лекарственных препаратов (фитопрепараты), химикатов, применяемых в сельском хозяйстве и т.д. Культуры изолированных клеток и тканей растений являются наиболее подходящими и имеют большое значение для биотехнологии. Их использование можно разделить на три направления [Шевелуха с соавт., 2003]. 15 1) Изолированные растительные клетки способны производить вещества вторичного синтеза (алкалоиды, стероиды, гликозиды, гормоны, эфирные масла и др.), применяемые в медицине, парфюмерии, косметологии и других отраслей промышленности. Как правило, эти вещества получают из каллусной ткани. Например, препарат диосгенин полученный из клеток диоскорен 2) Культуры изолированных тканей, используемы для размножения и оздоровления посадочного материала (например, для клонального микроразмножения растений). 3) Применение изолированных клеток растений в селекции. Позволяет получить быстрорастущие растения, устойчивые к различным неблагоприятным факторам среды. Сегодня миллионы людей во всем мире потребляют растительные лекарственные средства для широкого спектра применений. Одной из технологий, разработанных для крупномасштабного производства вторичных метаболитов культур растительных клеток, тканей и органов, является биореактор. Биореактор, или ферментер, представляет собой сложноустроенный аппарат или даже сооружение, основной целью которого является создание оптимальных условий для развития определенных культур клеток или микроорганизмов. Его использование представляет собой передовой метод для постоянного культивирования и производства биомассы (клеток или органов, или вегетативных побегов и корней, их конечных продуктов метаболизма и ферментов) круглый год. 1.4.Использование культур раковых клеток в разработке новых противоопухолевых средств. Рак – это молекулярно гетерогенное заболевание [Louzada et al., 2012], одна из главных причин смерти во всем мире. Существование различных типов опухолей с различными гистопатология, генетическими и эпигенетическими изменениями, и клиническими исходами [Vargo-gogola et 16 al., 2007], заключается в сложности понимания этого заболевания для создания средств химиотерапевтического действия и создания новых методов лечения. Важный сдвиг в изучении клеточных линий произошел в конце 1980-х годов, благодаря успеху клинических испытаний с культурами клеток в трансплантации мышиных новообразований [Boyd, использования in vitro опухолей 1997]. для солидных Происходило злокачественных развитие методов клеток в качестве инструмента выявления противораковых соединений. Так возникла идея разработки перечни клеточных линий, которые химиотерапевтического лечения бы резюмировали в клинических изменчивость следованиях для конкретного типа опухоли. В то время, наблюдаемый уровень реакции многих злокачественных новообразований к обычным противоопухолевым средствам составлял от 25% до 70%. Из этого можно было предположить, что от шести до девяти клеточных линий для каждого типа опухоли будет достаточно, чтобы изучить резистентность к антибиотикам. В Соединенных Штатах, в 1990 году была запущена клеточная линия National Cancer Institute 60 (NCI 60), в которую вошли 60 клеточных линий, представляющая девять различных типов опухолей [Shoemaker, 2006]. Через несколько лет, Японский Фонд Исследований Рака разработали свой перечень из 39 клеточных линий, который также представляют девять типов рака. Эти платформы привели к генерации богатства количества информации, но также привели к дальнейшей путанице в происхождении некоторых клеточных линий [Yamor, 2003]. Поэтому создание единых баз данных является необходимым шагом для медицинских и биологических исследований 1.4.1. Раковые клеточные линии в качестве модели для изучения злокачественных новообразований. Достижения в исследовании патобиологии рака берут свое начало с создания различных видов экспериментальных модельных систем, которые 17 рассматривают различные формы этого заболевания [Vargo-gogola et al., 2007], что позволяет изучить генетику и эпигенетические изменения и тестировать противоопухолевые препараты. Исследования рака основаны на использовании первичных опухолей [Louzada et al., 2012; Van Staveren et al., 2009], клеточных линий рака [Louzada et al., 2012; Van Staveren et al., 2009; Burdall et al., 2004], ксенотрансплантантов [Vargo-gogola et al., 2007; Lacroix et al., 2004; Leonetti et al., 2006], первичных клеточных культур опухолей [Van Staveren et al., 2009; Burdall et al., 2004] и мышей, полученных при помощи генной инженерии [Vargo-gogola et al., 2007]. Каждая из этих моделей используются для различных исследований, в основном потому, что некоторые виды манипуляций при генетическом анализе и ДНК метилировании, и тестировании лекарств трудно выполнимо на животных с эстетической и практической точки зрения. Клеточные линии являются реальной альтернативой для преодоления этих проблем, будучи в легко манипулироваемыми [Van Staveren et al., 2009] и генетические и эпигенетически характеризуемые. Такая модель важна для фундаментального исследования, так как содержит сведения о клеточных процессах и определяет важные гены, участвующие в возникновении злокачественных новообразований. Эти данные содержат важную информацию о сложности полигенной этиологии рака и биологических механизмах, участвующих в развитии болезни [Louzada et al., 2012]. Также изучение клеточных линий рака имеет важное значение для разработки новых противоопухолевых препаратов, понимания механизмов действия и разработки более целенаправленных противоопухолевых препаратов. Примеры приведены в таблице 2. Таблица 2 - Примеры некоторых широко используемых клеточных линий рака, полученные из различных типов клеток. По данным Европейской коллекции клеточных культур (ECАCC) и Американской коллекции типовых культур (АТСС). 18 Раковая клеточная линия Вид Разновидность рака Морфология HeLa Homo Sapiens Аденокарцинома матки шейки Эпителиальные клетки MCF-7 Homo Sapiens Аденокарцинома молочной железы Эпителиальные клетки U87MG Homo Sapiens Глиобластома/астроцитома Эпителиальные клетки HT-29 Homo Sapiens Аденокарцинома кишки A549 Homo Sapiens Карцинома легких Эпителиальные клетки ГЭС-G2 Homo Sapiens Гепатоцеллюлярная карцинома Эпителиальные клетки K-562 Homo Sapiens Хроническая лейкимия COS7 Cercopithecus aethiops Клетки почек, содержащие Фибробласты SV-40 вирусную ДНК PС53 Homo Sapiens Аденокарцинома простаты Эпителиальные клетки А-375 Homo Sapiens Злокачественная меланома Эпителиальные клетки толстой Эпителиальные клетки миелоидная Лимфотические клетки На самом деле, использование соответствующей экстракорпорального модели в исследовании злокачественных опухолей имеет решающее значение для изучения генетических, эпигенетических и клеточных путей [Louzada et al., 2012], для изучения апоптоза и прогрессии рака [Vargo-gogola et al., 2007], определения потенциальных молекулярных маркеовы [Van Staveren et al., 2009] и для скрининга и характеризации терапии заболеваний [Gazdar et al., 2010; Kao et al., 2009]. Многими биомедицинскими и фармацевтическими компаниями было признано, что результаты исследований на линиях раковых клеток, имеют важное значение в качестве модели для тестирования противоопухолевых препаратов [Gazdar et al., 2009]. 19 Несмотря на существенную роль раковых клеточных линий в биомедицинских исследованиях, возникает спор между многими научными сообществами, являются ли эти культуры клеток представителями первичной опухоли [Lacroix et al., 2004]. Некоторые авторы считают, что существует высокое, но не идеальное геномное сходство между первоначальной опухолью и клетками рака, выращенных в культуральной среде [Gazdar et al., 2010; Kao et al., 2009 ]. Раковые клеточные линии поддерживают опухолеспецифические хромосомные особенности при первичном пересевании и показывают такие же морфологические и молекулярные характеристики, что и первичная опухоль, поддерживают экспрессию "признаков рака", за исключением ангиогенеза, который требует присутствия стромальных клеток [Gazdar et al., 2010]. В качестве примера, Томлинсон и его коллеги (1998) сравнивали первичную опухоль молочной железы и культуры клеток полученные из нее. Эти авторы сообщили, что BRCA1 мутации, потеря аллели в нескольких локусах клеточные культуры сохраняют многочисленные характеристики первичной опухоли [Tomlinson et al., 1998]. Также данные получили Финлей и Бэгулей в 1984 году, раковые клетки показали аналогичную реакцию на противоопухолевые препараты в сравнению с первоначальной опухолью [Finlay et al., 1984]. Есть множество причин для использования клеточных культур злокачественных новообразований, в качестве экспериментальной модели для изучения патологии рака [Vargo-gogola et al., 2007]. Множество преимуществ для исследований процесса возникновения опухолей и для разработки новых терапевтических подходов [Gazdar et al., 2010]. Некоторые из преимуществ этой модели приведены в таблице 3. Таблица 3 - Преимущества и недостатки использования линий раковых клеток как моделей в исследовании патогенеза злокачественных новообразований. 20 Преимущества 1. Простота в обращении Недостатки и манипулировании. 1. Перекрестное загрязнение с клетками HeLa. 2. Высокая однородность. 2. Потеря естественной 3. Высокая степень сходства с неоднородности опухоли первоначальной опухоли. 4. Большое количество 3. Геномная нестабильность. и разнообразие клеточных линий 4. Возможность изменения характеристик клеток. 5. Доступность линий. 5. Микоплазменные инфекции. 6. Саморепликация. 6. Сложность 7. Легко замена в создании загрязненных долгосрочных клеточных линий культур. рака некоторых видов опухолей. 8. Воспроизводимость 7. Среда клеточной культуры результатов в правильных условиях отличается от первоначальной опухоли На самом деле, для всех экспериментальных моделей присущи преимущества и недостатки. Тем не менее, они обеспечивают адекватные модели для исследования происхождения рака, используя инициированные или раковые стволовые клетки [Vargo-gogola et al., 2007] и для тестирования. Некоторые линии раковых клеток могут быть использованы для скрининга RNAi (РНК-интерференции), как способ изучения взаимодействующих путей инициации опухоли [Louzada et al., 2012] . Это позволит причину прогрессирования рака и образования метастаз. Клеточные линии культур злокачественных новообразований подходящий инструмент для генетических и эпигенетических исследований опухолей, имеют решающее значение в тестировании противораковых лекарств [Louzada et al., 2012; Vargo-gogola et al., 2007]. 21 1.4.2. Тестирование противоопухолевых средств на раковых культурах клеток. Тестирование противоопухолевых средств на клеточных линиях рака, как правило, является одним из первых шагов в разработке новых методов лечения рака. Это позволяет увеличить число потенциальных лекарственных препаратов, которые в дальнейшем будут изучаться in vivo. Различные исследователи в течение многих лет использовали клеточных линий рака для оценки цитотоксичности, имеющие клинические прогностическую ценность [Vargo-gogola et al., 2007] в сравнении с первоначальной опухолью. У различных клеточных линий различный ответ на цитотоксические противоопухолевые препараты, например, культура клеток рака толстой кишки более устойчива к интеркалирующим ДНК-препаратам, а клетки карценомы молочной железы или лейкоза более чувствительны [Finlay et al., 1984]. Коупленд и его коллеги (2007) протестировали цитотоксичность противоракового лекарственного средства в разных линиях карценомы простаты и подтвердили, что этот препарат является более эффективным для простаты андроген-независимого рака (AIPC). В данном исследовании они предложили, что это химиотерапевтическое средство для лечения метастатического рака предстательной железы [Copeland et al., 2007], должны быть изучено в раковых культурах клеток для определения механизма действия. Тестирование противоопухолевых препаратов с использованием культивированных клеток, по сравнению с другими моделями, имеет преимущества, чем просто оценочные испытания цитотоксичности, возможность анализировать действие лекарств, их комбинации и скрининг чувствительности [Jordan et al., 2004], специфических маркеров [Nakatsu et al., 2005]. 22 сопутствующее открытие Идентификация специфических эпигенетических последовательностях и генетических изменений позволяет в целенаправленное достижение терапевтического результата и выявление новых потенциальных лекарств. Тот факт, что раковые клетки имеют запущенный онкологический механизм, делает их менее зависимыми от внеклеточных регуляторов. Культуры клеток злокачественных новообразований также способны активировать этот путь [Van Staveren et al., 2009], сохраняя геномную целостность первичной опухоли [Neve et al., 2006]. Но также, они имеют более простой транскриптом, потерявший ненужные функции [Van Staveren et al., 2009], что делает его одной из самых лучших моделей для тестирования противоопухолевых препаратов (отдельных или их комбинаций) [Louzada et al., 2012; Vargo-gogola et al., 2007; Finlay et al., 1984; et al., 2007]. Модели раковых клеточных линий всегда будут необходимы для проверки данных использования любого препарата перед его клиническими испытаниями. Это полезный метод для тестирования противоопухолевых средств. Развитие таких раковых клеточных культур было начато линии NCI60 (линии Американского Национального института рака с 60 видами клеток рака) для создания новой модели для тестирования противоопухолевых препаратов [ Shoemaker, 2006]. Впоследствии, Накатсу и его коллеги (2005) установили 45 клеточные линий (JFCR-45) из различных тканей (молочной железы, печени и желудка), чтобы определить гены, связанные с химиочувствительностью к противораковым лекарствам. Они также пытались классифицировать их по механизму действия. В этом исследовании, при помощи биоинформационного комплексного подхода, используя множество cDNA, было выявлено большое количество геновкандидатов, связанных с чувствительностью к химиотерапевтическим препаратам. Для правильной идентификации этих генов, они трансфицировали каждый из них на различных культурах клеток и 23 обнаружить, что избыточная экспрессия HSPA1A и JUN генов увеличила чувствительность митомицину С, предполагая, что эти гены играют роль в ответе на воздействие этим противоопухолевым лекарствам. Эти гены можно использовать в качестве маркеров для прогнозирования чувствительности к химиотерапевтическим лекарственным средствам, которые имеют решающее значение для более высокой эффективности препаратов [Nakatsu et al., 2005]. Нев и его коллегами (2006) использовали раковую клеточную линию ERBB2+ для изучения сигнальных путей, участвующих в терапевтическом ответе при использовании Herceptin® (Trastuzumab) в иммунотерапии. Оказалось, что эти клетки реагируют на эту терапию [Neve et al., 2007]. Таким образом, использование культур клеток злокачественных новообразований, показало, что сигнальные пути, являются мощной системой молекулярного механизма реагирования на противоопухолевый препаратов [Louzada et al., 2012]. Существование базы данных с детальной генетической и фармакологической информации о раковых клеточных культурах позволяет заранее генетически прогнозировать ответ противоопухолевых средств в доклинических испытаниях. Примером является Энциклопедия раковых клеточных линий (CCLE). Эта база данных, которая содержит информацию об экспрессии генов мРНК, данные о мутациях. Наличие инструментов молекулярного моделирования, таких как QSAR (Корреляционные соотношения структура – активность). Эта модель дает представление о молекулярных взаимодействиях исследуемых соединений с белками, участвующими в сигнальных путях [Abreu et al., 2012], или методах, которые предсказывают сродство между препаратом в конкретной мишенью, также фундаментальные инструменты, которые должны быть рассмотрены в доклинических испытаниях лекарств. Характеристика опухолевых культур клеток по состоянии клеточного цикла [Fang et al., 2002], регуляторных белков клеточного цикла 24 [Coleman et al., 2002] и наличием множественной лекарственной устойчивостью (MDR домен) [Jordan, Wilson, 2004], также имеют важное значение в тестировании противоопухолевых препаратов. Одним из наиболее успешных целевых противоопухолевых препаратов являются микротрубочки. Они представляют собой динамичную структуру, состоящую из полимеров α и β-тубулина, необходимую для постройки и поддержания клеточной морфологии, клеточной сигнализации и хромосом во время митоза. Во время митоза участвуют в формировании митотического веретена, что микротрубочки подходящей целью для антимитотической терапии [Jordan, Wilson, 2004]. В настоящее время три различных группы противоопухолевых препаратов, мишенью которых являются микротрубочки, широко используются для химиотерапии: алкалоиды барвинка (винбластин) [Huang et al., 2002], таксанамы (Taxol ®) [Coleman et al., 2003] и колхицин [Jordan, Wilson, 2004]. Эти препараты антимитотически присоединяются в сайтах связывания с β-тубулином, демонстрируя различное действие, используются для различных типов рака. Данные лекарственные средства действуют путем подавления динамики микротрубочек, приводя прекращению митоза и апоптозу [Jordan, Wilson, 2004]. Коулман и его коллеги (2002) использовали HNSCC клетки для определения механизма действия комбинации двух препаратов паклитаксела и карбоплатина. Они пришли к выводу, что комбинация этих средств приводит к увеличению активности циклина В1/CDC2, Bcl-2 фосфорилирования и блокированию митоза. Тем не менее, их исследование доказало, что эффективность ингибирования пролиферации клеток была выше при сочетании этих двух препаратов, позволяя использование этой комбинации для других моделей. Лекарственная устойчивость – это одна из основных проблем в химиотерапии рака. Хотя нет полного понимания о том, что приводит к клеточного сопротивления к некоторым видам лекарств, некоторые из них 25 уже известны. Множественная лекарственная устойчивость является механизм лекарственного оттока, который может быть вызвано усилением активности MDR1гена, что приводит к увеличению мембранных транспортеров, как P-гликопротеин (Р-GP) [Nakayama et al., 2007 ]. Профилирование линий раковых клеток на уровне метилирования ДНК также важны для прогнозирования реакции химиотерапевтического лечения. Гиперметилирование промоторных участков генов повышает чувствительность к алкилирующими агентам как кармустин (BiCNU®) [ Esteller et al., 2002]. Арнольд и его коллеги провели (2003) гиперметилирование колоректального рака, деметилирующим препаратом и обнаружили, что гиперметилирование гена уменьшает MLH1 устойчивость к противоопухолевому препарату фторурацил (5-FU) [Arnold et al., 2003]. Шену и его коллегам (2007), исследуя NCI60 линии раковых клеток, удалось разработать список метилирования маркеров, способных предсказать реакцию противоопухолевого препарата [Shen et al., 2002].Эти работы подчеркивают тот факт, что метилирование деметилирования, / обеспечивают мощную модель системы для определения новых стратегий для решения рака. Точный проблемы лекарственной механизм действия устойчивости деметилирующих при лечении агентов или закономерности сопротивления и чувствительности неясны, и это очень важно понять молекулярные изменения, вызванные этими препаратами для повышения их эффективности [Palii et al., 2002]. В клеточных линиях, воздействие азацитидином и децитабином, вызывает глобальное деметилирование ДНК путем ингибирования ДНКметилтрансфераз. Использование таких препаратов вызвает ингибирование пролиферации клеток и задерживает G2 фазу, но также может привести к восстановлению препараты в пролиферации настоящее и апоптозу. время 26 Эти противоопухолевые используются для лечения миелодиспластического синдрома (MDS) и других видов лейкоза [Palii et al., 2002]. Так, характеристика как геном и methylome линий раковых клеток позволяет открытие цели, чтобы противоопухолевых препаратов и создать более целенаправленные препараты для некоторых видов рака, обеспечивая развитие новых методов лечения [Bieche et al., 1998], так как использование миРНК, или сочетание новых или уже существующих. Выявление типов рака, его генов, способов метилирования ДНК и клеточных изменений в линиях раковых клеток имеет решающее значение для понимания механизмов действия лекарств, а также для разработки и тестирования новых усовершенствованных противоопухолевых препаратов. 1.5.Преимущества и недостатки использования культур клеток в биомедицинских исследованиях. Клеточные культуры имеют ряд преимуществ, таких как дешевизна, простота использования, обеспечивают неограниченным запасом материала и дают возможность решить этические проблемы, связанные с использованием животных и человеческих тканей. Клеточные линии также обеспечивают чистоту популяции клеток, что является важной особенностью, поскольку он обеспечивает соответствующую выборку и анализ результатов. Благодаря клеточным культурам произошла революция в области научных исследований и в производстве вакцин, тестировании различных препаратов и их цитотоксичности, продукции антител, создании искусственных тканей и синтезе биологических соединений, например, терапевтических белков [MacDonald, 1990; Schurr et al., 2009]. Судить о популярности линии клеток можно по многочисленным публикациям и американской коллекции культур клеток (АТСС), которая состоит из более чем 3600 клеточных линий более чем 150 различных видов. Однако, несмотря на то, что это важный инструмент клеточной инженерии, 27 нужно быть осторожным при использовании клеточных линий. Они должны отображать и сохранять функциональные особенности клеток тканей, из которых они получены. Поскольку культуры клеток легко поддаются генетической манипуляции, изменения их фенотипа, их основные функции и ответ на различные раздражители. Повторное пассивирование клеточных линий на протяжении длительного периода времени может в дальнейшем вызвать генотипическую и фенотипическую изменчивость, а также дрейф генов, которая может также привести к негомогенности в культурах. Таким образом, клеточные линии не способны адекватно отражать функции и могут давать разные результаты. Другой серьезной проблемой, связанной с клеточными культурами является контаминация с другими клеточными линиями и микоплазмы. Сведения о перекрестной контаминации клеточных линий межвидовой и внутривидовой были получены Вальтером Нельсоном-Ризом в начале 1970-х годов. Он показал, что в тот момент времени большинство клеточных линий используемых по всему миру были загрязнены клетками Hela [Nelson-Rees, 1981]. Даже спустя 40 лет, это по-прежнему остается серьезной проблемой [Capes-Davis et al., 2010; Jiang et al., 2009]. При контаминации линии клеток происходит введение стремительно пролиферирующихся линий клеток, которые к очень короткий промежуток времени целиком заполняют культуральную среду, тем самым загрязняя клеточную линию. Кроме того, микоплазменные контаминации клеточных культур могут сохраняться незамеченными в течение длительного периода времени и вызывает обширные изменения в экспрессии генов. На основе сведений клеточных банков, 15-35% клеточных линий оцениваются как загрязненные микоплазмами [Fleckenstein et al., 1994; Hayet al., 1989]. Таким образом, следует проявлять осторожность при использовании клеточных линий в экспериментах, где основные выводы подтверждаются в клеточных линиях. 28 Анализ данных литературы позволил определить ряд преимуществ и недостатков использования клеточных линий в биомедицинских исследованиях, которые представлены в таблице 4. Таблица 4. - Преимущества и недостатки использования клеточных культур. Преимущества • Недостатки постоянного • Возможность контроля рН, содержания проведения солей, экспериментов в строго стерильных газов, температуры; • Необходимость условиях; контроля • Возможность Необходимость в содержания нутриентов и факторов специального роста; • поддержания • гомогенности линий клеток (в том работ и при при характеристика • анализ Возможность ДНК, фенотипической иммуноферментный анализ); клеточных линий; • Простое хранение образцов; • • Известное Простой анализ результатов и • с животными Возможность микоплазмами. Дешевизна по сравнению с работой проявления нестабильности проявления нестабильности клеточных линий. значимая статистика; • Возможность происхождение генетической образцов; • необходимости 10 г) биомассу клеток; Простая (микроскопия, Резкое увеличение стоимости использовании культивировать значительную (более селективных сред); • оборудования (ламинары, инкубаторы и т.п.); Возможность числе наличии (до определенного предела); 29 заражения • Точный контроль времени и дозы обработки; • Возможность механизации; • Возможность большого количества проведения повторных экспериментов; • Сокращение временных затрат; • Сокращение числа подопытных животных. 30 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1) Культуры клеток животных широко используются в современных биомедицинских исследованиях и производствах. Основными сферами применения клеточных культур являются вирусология (включая разработку и производство вакцин), получение биологически активных соединений, тестирование биологической активности физико- химических и биологических факторов. 2) Метод клеточных культур имеет ряд весомых достоинств: возможность постоянного контроля состава среды, возможность поддержания гомогенности линий клеток и их простая характеристика, простое хранение образцов, дешевизна по сравнению с работой с животными, возможность точно контролировать время и дозу обработки, возможность механизации. Применение культур клеток животных ведет к сокращению числа используемых подопытных животных 3) Среди недостатков использования культур клеток можно выделить необходимость проведения экспериментов в строго стерильных условиях, необходимость в наличии специального оборудования, возможность проявления фенотипической нестабильности клеточных линий. 31 и генетической СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1. Митрохин, Н.М. Активация перекисного окисления липидов в митохондриях печени и острая токсичность химических соединений [Текст] / Н.М. Митрохин, И.В. Жигачева, Л.Т. Чаморовская // Гигиена и санитария. – 1991. – 1. – С.49-51. 2. Abreu, R.M. Anti-hepatocellular carcinoma activity using human HepG2 cells and hepatotoxicity of 6-substituted methyl 3-aminothieno[3,2b]pyridine-2-carboxylate derivatives: in vitro evaluation, cell cycle analysis and QSAR studies [Text] / R.M. Abreu, I.C. Ferreira, R.C. Calhelha, R.T. Lima, M.H. Vasconcelos, F. Adega, R. Chaves, M.J. Queiroz // European journal of medicinal chemistry. – 2011. – V.46. – P.5800-5806. 3. Alekseev, O.M. Analysis of gene expression profiles in HeLa cells in response to overexpression or siRNA-mediated depletion of NASP [Text] / O.M. Alekseev, R.T. Richardson, M.G. O’Rand // Biol. Endocrinol. – 2009. – V.7. – P.45. 4. Arnold, C.N. Role of hMLH1 promoter hypermethylation in drug resistance to 5-fluorouracil in colorectal cancer cell lines [Text] / C.N. Arnold, A. Goel, C.R. Boland // International journal of cancer Journal international du cancer. – 2003. – V.106. – P. 66-73. 5. Brooks, G.F. Herpesviruses. In: Jawetz, Melnick, Adelberg, editors [Text] / G. F. Brooks, J.S. Butel, S.A. Morse // Medical Microbiology. New York: McGraw-Hill. – 2007. – V.429. – P.53. 6. Burdall, S.E. Breast cancer cell lines: friend or foe? [Text] / S.E. Burdall, A. Burdall, A.M. Hanby, M.R. Lansdown, V. Speirs Breast cancer res. – 2003. – V.5. – 2. – P.89-95. 7. Chaudhry, M.A. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases [Text] / M.A. Chaudhry, L.A. Chodosh, W.G. McKenna, R.J. Muschel // Oncogene. – 2002. – V.21. – P.1934–1942. 32 8. Coleman, S.C. Analysis of cell-cycle checkpoint pathways in head and neck cancer cell lines: implications for therapeutic strategies [Text] / S.C. Coleman, Z.A. Stewart, T.A. Day, J.L. Netterville, B.B. Burkey, J.A. Pietenpol // Archives of otolaryngology - head & neck surgery. – 2002. – V.128. – P. 167-176. 9. Copeland, R.L. Cytotoxicity of 23dichloro-5,8-dimethoxy-1,4- naphthoquinone in androgen-dependent and-independent prostate cancer cell lines [Text] / R.L. Copeland, J.R. Das, O. Bakare, N.M. Enwerem, S. Berhe, K. Hillaire, D. White, D. Beyene, O. O. Kassim, Y. M. Kanaan [Text] / Anticancer research. – 2007. – V.1537. – P.1546. 10. Draganov, M. McCoy and McCoy-Plovdiv cell lines in experimental and diagnostic practice–past, present and perspectives [Text] / M. Draganov, M. Murdjeva, T. Michailova-Topalska // Journal of Culture Collections. – 2005. – V.3. – P.16. 11. El-Naggar, manganese(IV), M.M. iron(III), Antitumor cobalt(II) and activities copper(II) of vanadium(IV), complexes of 2- methylaminopyridine [Text] / M. M. El-Naggar, A.M. El-Waseef, K.M. ElHalafawy, I. H. El-Sayed // Cancer Lett. – 1998. – V.133. – P.71-76. 12. Esteller, M. Cancer as an epigenetic disease: DNA methylation and chromatin alterations in human tumours [Text] / M. Esteller, J.G. Herman // The Journal of pathology. – 2002. – V.196. – P. 1-7. 13. Evangelou, A.M. [Text] / Vanadium in cancer treatment A.M. Evangelou // Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 2002. – V.42. – P.249-265. 14. Fang, Y. Molecular characterization of permanent cell lines from primary, metastatic and recurrent malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNST) with underlying neurofibromatosis-1 [Text] / Y.Fang, A. Elahi, R.C. Denley, P.H. Rao, M.F. Brennan, S.C. Jhanwar // Anticancer research. – 2009. – V.29. – P.1255-1262. 15. Faneca, H. Vanadium compounds as therapeutic agents: some chemical and biochemical studies [Text] / H. Faneca, V.A. Figueiredo, I. Tomaz, G. 33 Gonçalves, F. Avecilla, M.C. Pedroso de Lima, C.F. Geraldes, J.C. Pessoa, M.M. Castro // J. Inorg. Biochem. – 2009. – V.103. – P.601-608. 16. Finlay, G. J. The use of human cancer cell lines as a primary screening system for antineoplastic compounds [Text] / G.J. Finlay, B. C Baguley // European journal of cancer & clinical oncology. – 1984. – V.20. – 947-954. 17. Fuchs, F. Clustering phenotype populations by genome-wide RNAi and multiparametric imaging [Text] / F. Fuchs, G. Pau, D. Kranz, O. Sklyar, C. Budjan // Mol. Syst. Biol. – 2010. – V.6. – P.370. 18. Gallagher, R. Characterization of the continuous, differentiating myeloid cell line (HL-60) from a patient with acute promyelocytic leukemia [Text] / R. Gallagher, S. Collins, J. Trujillo, K. McCredie, M.Ahearn, S. Tsai, R. Metzgar, G. Aulakh, R. Ting, F. Ruscetti // Blood. – 1979. – V.54. – P.713–733. 19. Gazdar, A.F. Lung cancer cell lines as tools for biomedical discovery and research [Text] / A.F. Gazdar, L. Girard, W.W. Lockwood, W.L. Lam, J.D. Minna, Journal of the National Cancer Institute. – 2010. – V.10. – P.1310-1321. 20. Graham, F.L. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5 [Text] / F.L. Graham, J. Smiley, W.C. Russell, R. Nairn // J. Gen. Virol. – 1977. – V.36. – P.59–74 21. Hnilicová, J. Histone deacetylase activity modulates alternative splicing [Text] / J. Hnilicová, S. Hozeifi, E. Dušková, J. Icha, T. Tománková // PLoS ONE. – 2010. – V.6. 22. Huang, Y. Regulation of Vinca alkaloid-induced apoptosis by NFkappaB/IkappaB pathway in human tumor cells [Text] / Y. Huang, Y. Fang, J. Wu, J.M. Dziadyk, X. Zhu, M. Sui, W. Fan // Molecular cancer therapeutics. – 2004. – V.3. – P.271-277 23. Jaluria, P. Enhancement of cell proliferation in various mammalian cell lines by gene insertion of a cyclin-dependent kinase homolog [Text] / P.Jaluria, M. Betenbaugh, K. Konstantopoulos, J. Shiloach // BMC Biotechnol. – 2007. V.7. – P.71. 34 24. Jordan, M.A. Microtubules as a target for anticancer drugs [Text] / M.A. Jordan, L. Wilson // Nature reviews Cancer. – 2004. – V.44. – P.253-265. 25. Kao, J. Molecular profiling of breast cancer cell lines defines relevant tumor models and provides a resource for cancer gene discovery [Text] / J. Kao, K.Salari, M. Bocanegra, Y.L. Choi, L. Girard, J. Gandhi, K.A. Kwei, T.Hernandez-boussard, P. Wang, A. F. Gazdar // PloS one. – 2009. – E.6146. 26. Karasneh, G.A. Herpes simplex virus infects most cell types in vitro: clues to its success eradication [Text] / G.A. Karasneh, D. Shukla // Virol J. – 2011. – V.8. – P.481 27. Kew, O. Vaccine-derived polioviruses and the endgame strategy for global polio eradication [Text] / O. Kew, R. Sutter, E. de Gourville, W. Dowdle, M. Pallansch // Annual Review of Microbiology. — 2005. — V. 59. — P. 587–635. 28. Kim, H. Ubiquitin-binding protein RAP80 mediates BRCA1dependent DNA damage response [Text] / H. Kim, J. Chen, X. Yu // Science. – 2007. – V.316. – P.1202–1205. 29. Kittler, R. An endoribonuclease-prepared siRNA screen in human cells identifies genes essential for cell division [Text] / R. Kittler, G. Putz, L. Pelletier, I. Poser, A.-K. Heninger // Nature. – 2004. – V.432. – P.1036–1040. 30. Kopf-Maler, P. Complexes of metals other than platinum as antitumour agents [Text] / Р. Kopf-Maler // Eur. J. Clin. Pharmacol. – 1994. – V.47. – P.1-16. 31. Lacroix, M. Relevance of breast cancer cell lines as models for breast tumours: an update [Text] / M. Lacroix, G. Leclercq // Breast cancer research and treatment. – 2004. – V.833. – P.249-289. 32. Leonetti, C. Efficacy of a nitric oxide-releasing nonsteroidal antiinflammatory drug and cytotoxic drugs in human colon cancer cell lines in vitro and xenografts [Text] / C. Leonetti, M. Scarsella, G. Zupi, W. Zoli, D. Amadori, L. Medri, F. Fabbri, M. Rosetti, P. Ulivi, L. Cecconetto // Molecular cancer therapeutics. – 2006. – V.54. – P.919-926. 35 33. Liasko, R. Beneficial effects of a vanadium complex with cysteine, administered at low doses on benzo(alpha)pyrene-induced leiomyosarcomas in Wistar rats [Text] / R. Liasko, T.A. Kabanos, S. Karkabounas, M. Malamas, A.J. Tasiopoulos, D.Stefanou, P.Collery, A. Evangelou // Anticancer Res. – 1998. – V.18. – P.3609-3613. 34. Louzada, S. Defining the sister rat mammary tumor cell lines HH-16 cl.2/1 and HH-16.cl.4 as an in vitro cell model for Erbb2 [Text] / S. Louzada, F. Adega, R. Chaver // PLoS One. – 2012– V.7. – P.299-323. 35. Ludwig, H. Role of viral factor E3L in modified vaccinia virus ankara infection of human HeLa Cells: regulation of the virus life cycle and identification of differentially expressed host genes [Text] / H. Ludwig, J. Mages, C. Staib, M. H. Lehmann, R. Lang // J. Virol. – 2005. – V.79. – P.2584–2596. 36. Motamedifar, M. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells [Text] / M. Motamedifar, A. Noorafshan. – Micron. – 2008. – V.39. – P.1331–1334. 37. Mundinger, T.A. Herpes simplex virus: Drug resistance and new treatment options using natural products [Text] / T.A. Mundinger, T. Efferth // Mol Med Rep. – 2008. – V.1.- P.611 38. Murray, J.I. Diverse and specific gene expression responses to stresses in cultured human cells [Text] / J. I. Murray, M. L. Whitfield, N. D. Trinklein, R. M. Myers, P. O. Brown // Mol. Biol. Cell. – 2004. – V.15. P.2361– 2370. 33. Nahapetian, A.T. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites [Text] / A.T. Nahapetian, J.N. Thomas, W.G. Thilly. J Cell Sci. – 1986. – V.81. – P.65–103. 39. Nabavinia, M.S. Application of McCoy Cell Line for Propagation of Herpes Simplex Virus Type 1 [Text] / M.S. Nabavinia, S. Rostami, F. Ghasemi, Z.Meshkat // Iran J Med Sci. – 2015. – V.40. – P.268-271. 36 40. Nakatsu, N. Chemosensitivity profile of cancer cell lines and identification of genes determining chemosensitivity by an integrated bioinformatical approach using cDNA arrays [Text] / N. Nakatsu, Y. Yoshida, K. Yamazaki, T. Nakamura, S.Dan, Y. Fukui, T. Yamori // Molecular cancer therapeutics. – 2005. – V.4. – P.399-412. 41. Neve, R.M. A collection of breast cancer cell lines for the study of functionally distinct cancer subtypes [Text] / R. M. Neve, K. Chin, J. Fridlyand, J.Yeh, F. L. Baehner, T. Fevr, L. Clark, N. Bayani, J. P. Coppe, F. Tong // Cancer cell. – 2006. – V.106. – P.515-527. 42. Nguyen, M.L. African green monkey kidney Vero cells require de novo protein synthesis for efficient herpes simplex virus 1-dependent apoptosis [Text] / M.L. Nguyen, R.M. Kraft, J.A. Blaho // Virology. – 2005. – V.336. – P.274–290. 43. Neumann, B. Phenotypic profiling of the human genome by timelapse microscopy reveals cell division genes [Text] / B. Neumann, T. Walter, J.-K.Hériché, J. Bulkescher, H. Erfle // Nature. – 2010. – V.464. – P.721–727. 44. Osińska-Królicka, I. Vanadium(III) complexes with L-cysteine-stability, speciation and the effect on actin in hepatoma Morris 5123 cells [Text] / I. Osińska-Królicka, H. Podsiadly, K. Bukietyńska, M. Zemanek-Zboch, D. Nowak, K. Suchoszek-Lukaniuk, M. Malicka-Bùaszkiewicz // J. Inorg. Biochem. – 2004. – V.98. – P.2087-2098. 45. Palii, S.S. DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine induces reversible genome-wide DNA damage that is distinctly influenced by DNA methyltransferases 1 and 3B [Text] / S.S. Palii, B.O. Van Emburgh, U.T. Sankpal, K.D. Brown, K.D. Robertson // Molecular and cellular biology. – 2008. – V.28. – P.752-771. 46. Rubbia-Brandt, L. Hepatocyte steatosis is a cytopathic effect of hepatitis C virus genotype 3 [Text] / L. Rubbia-Brandt, R. Quadri, K. Abid, E. Giostra, P.-J. Male, G. Mentha, L. Spahr, J.-P. Zarski, B. Borisch, A. Hadengue, F. Negro // Journal of Hepatology. – 2014. – V.33. – P.106–115. 37 47. Scherer, W.F. Studies on the propagation in vitro of poliomyelitis viruses. IV. Viral multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HeLa) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix [Text] / W.F. Scherer, J. T. Syverton, G. O. Gey // J. Exp. Med. – 1953. – V.97. – P.695– 710. 48. Shen, L. Drug sensitivity prediction by CpG island methylation profile in the NCI-60 cancer cell line panel [Text] / L. Shen, Y. Kondo, S. Ahmed, Y. Boumber, K. Konishi, Y. Guo, X. Chen, J.N. Vilaythong, J.P.Issa // Cancer research. – 2007. – V.67. – P.11335-11343. 49. Shoemaker, R.H. The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen [Text] / R.H. Shoemaker // Nat Rev Cancer. – 2006. – V.6. – P.813–823 50. Van Staveren, W.C. Human cancer cell lines: Experimental models for cancer cells in situ? For cancer stem cells? [Text] / W.C. Van Staveren, D.Y. Solis, A. Hebrant, V. Detours, J.E. Dumont, C. Maenhaut // Biochimica et biophysica acta. – 2009. – V.1795. – P.92-103. 51. Vargo-gogola, T. Modelling breast cancer: one size does not fit all [Text] / T. Vargo-gogola, J. M. Rosen // Nat Rev Cancer. – 2007. – V.7. – P.659672. 52. Wu, T.D. Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicing in short reads [Text] / T.D. Wu, S. Nacu // Bioinformatics. – 2010. – V.26. – P.873–881. 53. Yamori, T. Panel of human cancer cell lines provides valuable database for drug discovery and bioinformatics [Text] / T. Yamori // Cancer Chemother Pharmacol. – 2003. – V.52. – P.74-79. 54. Yasumura, Y. The research for the SV40 by means of tissue culture [Text] / Y. Yasumura, M. Kawakita // Nippon Rinsho. — 1963. — V. 21. — P.1201–1219. 55. Youil, R. Comparative study of influenza virus replication in Vero and MDCK cell lines [Text] / R.Youil, Q. Su, T.J. Toner, C. Szymkowiak, W.S. 38 Kwan, B. Rubin, L. Petrukhin, I. Kiseleva, A.R. Shaw, D. DiStefano // J Virol Methods. – 2004 – V.120. – P.23-31. 56. Zhu, C. Functional analysis of human microtubule-based motor proteins, the kinesins and dyneins, in mitosis/cytokinesis using RNA interference [Text] / C. Zhu, J. Zhao, M. Bibikova, J.D. Leverson, E. Bossy-Wetzel // Mol. Biol. Cell. – 2005. – V.16. – P.3187–3199. 39
