На правах рукописи АНДРЕЕВА Наталья Вячеславовна
advertisement
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет Кафедра биоинженерии На правах рукописи АНДРЕЕВА Наталья Вячеславовна ДОЛГОВРЕМЕННОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ ДЛЯ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ 03.01.06 — Биотехнология (в том числе Бионанотехнологии) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Бонарцев А.П. Москва—2016 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................... 5 ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ....................................................................... 11 1.1. Разнообразие и применение биосовместимых материалов................... 11 1.2. Свойства биосовместимых материалов ........................................................ 16 1.2.1. Основные биологические свойства........................................................ 16 1.2.2. Основные физико-химические и механические свойства ............. 18 1.3. Использование биосовместимых материалов для 3D культивирования ........................................................................................................... 21 1.4. Использование поли(3-гидроксибутират) для 3D-культивирования клеток ................................................................................................................................ 24 1.4.1. Основные свойства поли(3-гидроксибутирата) ................................ 24 1.4.2. Биосинтез и внутриклеточная деградация поли(3гидроксибутирата) ................................................................................................... 27 1.4.3. Области применения поли(3-гидроксибутирата) ............................. 29 1.5. 3D-культивирование клеток на матриксе, основанный на поли(3гидроксибутирате) и его сополимеров .................................................................. 30 1.6. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток мыши ............. 32 1.7. Репликативное старение клеток в культуре ................................................ 35 1.8. Области применения стволовых клеток в медицине ............................... 37 1.8.1. Получение стволовых клеток ................................................................... 37 1.8.2. Применение МСК в медицине: перспективы и проблемы ............ 39 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ..................................................................... 42 2.1. Материалы и оборудование .............................................................................. 42 2.2. Объекты исследования ....................................................................................... 45 2.2.1. Мезенхимальные стволовые клетки мыши ......................................... 45 3 2.2.2. Полимерный матрикс ...................................................................... 47 2.3. Изготовление полимерных матриксов ................................................. 52 2.4. Исследование морфологии и пористости матриксов .......................... 52 2.4.1. Исследование физико-термических свойств матриксов методом дифференциальной сканирующей калориметрии .................. 53 2.4.2. Исследование механических свойств полимерныхматриксов.... 53 2.4.5. Исследование гидрофильности полимерных матриксов ............. 54 2.5. Культивирование МСК мыши на матриксе ......................................... 54 2.5.1. Фенотипирование МСК мыши методом проточной цитометрии ................................................................................................. 55 2.5.2. Определение старых МСК мыши методом окрашивания на β-галактозидазу .......................................................................................... 55 2.5.3. Направленная дифференцировка МСК мыши в остеоогенную и адипогенную дифференцировку .............................................................. 56 2.5.4. Проверка МСК мыши, культивируемых на матриксе, на иммортализацию ........................................................................................ 57 2.5.5. Микроскопия .................................................................................... 57 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ....... 58 3.1. Исследование полигидроксибутирата .................................................. 58 3.1.1. Получение полигидроксибутирата ................................................ 58 3.1.2. Термо-физические характеристики полигидроксибутирата ....... 60 3.2. Сравнение параметров роста МСК мыши на матриксе и пластике .. 62 3.2.1. Характеризация поверхностного фенотипа и направленная дифференцировка МСК............................................................................. 62 3.2.2. Изучение скорости пролиферации МСК мыши на матриксе из ПГБ и культуральном пластике ................................................................ 65 3.3. Сканирующая электронная и конфокальная микроскопия ................ 71 3.4. Влияние матрикса из ПГБ на размеры клеток ..................................... 76 4 3.5. Влияние матрикса из ПГБ на старение клеток .................................... 80 3.6. Проверка МСК на иммортализацию ..................................................... 84 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................. 86 ВЫВОДЫ ............................................................................................................ 88 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................... 90 CПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................................. 91 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы В настоящее время активно развиваются научные направления, связанные с применением стволовых клеток (СК) в медицине. Такие перспективные области медицины и биологии как регенеративная медицина и тканевая инженерия в настоящее время не могут развиваться в отрыве от исследования СК. Значительное внимание в современной биомедицине уделяется восстановлению костной ткани, внутренних органов и кожи методами тканевой инженерии. Связано это, прежде всего, с тем, что поражения органов и тканей в результате хронических заболеваний, травм и врожденных патологий занимают одно из первых мест среди причин смертности, временной нетрудоспособности и развития инвалидности. Кроме того, направлений способствует клиническую практику развитие активному целого ряда таких развитию новых междисциплинарных и внедрению в биотехнологических и биоинженерных методик, а также вносит вклад в выход фундаментальных исследований в биомедицине на новый уровень благодаря интеграции медицины, биологии, других естественных наук (физики, химии и др.) и инженерных дисциплин. Одной из основных проблем использования СК в экспериментальных исследованиях и медицинской практике является то, что в процессе выращивания и культивирования в стандартных условиях клетки быстро стареют и замедляются в росте. Для того чтобы преодолеть эту проблему, клетки стали культивировать на особых матриксах из синтетических и природных биоматериалов, где СК находятся в среде, приближенной к естественному окружению в организме. Использование таких матриксов и культивирование клеток млекопитающих ex vivo позволяет исследовать 6 физиологию клеток и тканей, а также необходимо для практического использования СК в регенеративной медицине. Экспериментальные исследования на стыке биологии, химии, инженерии и медицины имеют большое значение для разработки новых биоматериалов, используемых в медицине. Такие биоматериалы могут способствовать регенерации тканей, как в естественных условиях, так и при использовании различных биоинженерных методов управления и стимуляции регенерацией, как вне организма, так и внутри него. Получение биоматериалов привело к новому направлению материаловедения, изучающего взаимодействие искусственных материалов с живыми клетками, тканями и органами: для нужд регенеративной медицины с целью полноценного замещения тканей и органов [1]. Для этого важно правильно имитировать естественные носители — внеклеточные матриксы. Важная роль внеклеточного матрикса — субстрат для прикрепления клеток, так как большая часть из них растет лишь прикрепившись и распластавшись по твердому субстрату. Клетки, отделенные от внеклеточного матрикса, быстро теряют жизнеспособность и подвергаются запрограммированной клеточной смерти — апоптозу, что часто наблюдается при 3D-культивировании клеток в объеме. В настоящее время для разработки новых матриксов и подложек для тканевой инженерии и регенеративной медицины используют биодеградируемые и биосовместимые полимеры полигидроксиалканоаты (ПГА) — поли(3-гидроксибутират) (ПГБ) и его сополимеры, получаемые биотехнологическим путем. В организме биоразлагаемые матриксы из ПГБ не образуют токсичные конечные продукты, что позволяет их использовать в медицине, в т.ч. как 3D-каркасы для культивирования и изучения физиологических и морфологических свойств клеток. В одной из работ была показана высокая степень адаптации мезенхимальных стволовых клеток (МСК) к матриксам из сополимера ПГБ – поли(3-гидроксибутират)- 7 со-3-оксивалерата (ПГБВ), имеющих развитую пористую структуру [2], а также успешная дифференцировка МСК человека в остеобласты на этом сополимере [3]. Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) жировой ткани являются перспективным инструментом клеточной терапии при различных заболеваниях, поскольку они способны трансформироваться в любые клетки соединительной ткани: в адипоциты, фибробласты, хондробласты, остеобласты и другие. В связи с этим возникла основная задача — размножение стволовых клеток в культуре для дальнейшего их применения в терапевтических целях. При использовании стволовых клеток в медицинской практике возникает ряд проблем, в частности, низкая частота встречаемости СК в органах: их сложно наработать в больших количествах, так как через небольшое время культивирования клетки начинают стареть, что препятствует их использованию в качестве терапевтического средства. Один из признаков старения — клетки начинают увеличиваться в объеме, что весьма затрудняет их миграцию в пораженные органы и ткани. Например, при внутривенном введении МСК ввиду своих размеров клетки попадают в так называемые капиллярные ловушки в различных тканях, особенно в легких, что весьма затрудняет их миграцию в орган-мишень. Кроме того, возможна доставка МСК путем их введения непосредственно через артерии, ведущие в выбранный орган, но подобный путь может привести к таким осложнениям, как микрососудистая окклюзии. Так же сильно влияет на эффективность лечения стволовыми клетками продолжительность времени их культивирования in vitro. К примеру, высокая эффективность достигается, если клетки вводятся пациенту сразу после их выделения, а если клетки культивировать 24–48 часов, то эффективность терапии резко снижается, так как размножение 8 клеток в больших количествах in vitro вызывает их старение и снижает их жизненный потенциал. Кроме того, чтобы получить большое количество первичных выделенных МСК, клетки нужно выделять из нескольких различных тканей с различиями в фенотипе, что также представляет проблему для использования МСК в терапевтических целях. Для достижения воспроизводства стволовых клеток без потери их биофункциональности, необходимо создать для них микроокружение с определенными характеристиками. Одним из подходов к решению данной проблемы является создание матриксов с развитой пористой структурой из биосовместимых полимеров. Биосовместимые и биоразлагаемые полимеры, поли(3-гидроксибутират) и его сополимеры, получаемые микробиологическим путем, можно использовать для создания таких пористых матриксов с целью культивирования и размножения МСК в необходимых количествах для терапевтических целей, что представляет большой интерес для регенеративной медицины и тканевой инженерии. Цель исследования — изучение возможности длительного культивиpoвания МСК из жирoвoй ткани мыши на поpиcтoм матриксе на оcнoвe поли(3-гидроксибутирата), подбор оптимальных условий роста клеток, а также увеличение клеточной массы и замедление клеточного старения клеток в процессе их культивирования. В сooтвeтcтвии с цeлью иccлeдoвaния были cфoрмулирoвaны cлeдующиe зaдaчи: Подбор оптимальных условий культивированияМСК из жировой ткани с использованием МСК мыши. 1. 2. Сравнение параметров роста МСК мыши в условиях 2D- (культуральный пластик) и 3D- (полимерный матрикс) культивирования. 3. Исследование изменения размеров МСК мыши при культивировании клеток на матриксе. 9 Подбор условий для наработки МСКв больших количествах, при сохранении их клеточного потенциала и жизнеспособности. 4. Оценка биосовместимости матриксов из ПГБ in vitro на культуре МСК мыши. 5. Научная новизна B хoдe данной рaбoты впервые были подобраны оптимальные условия для культивирования МСК на матриксе из полимера ПГБ, синтезированного микробиологическим биосинтезом штаммом- продуцентом Azotobacter chroococcum 7B. На примере МСК мыши было продемонстрировано, что пористый полимерный матрикс подходит для долговременного культивирования МСК, впервые было исследовано долговременное культивирование МСК мыши из жировой ткани на пористом матриксе из ПГБ, проводилось сравнение параметров роста МСК мыши в условиях 2D- и 3Dкультивирования. Впервые было показано уменьшение культивировании на пористом матриксе. размеров МСК при Изучена биосовместимость матриксов in vitro на культуре МСК мыши. Показана бóльшая выживаемость клеток, культивируемых на матриксе, по сравнению с контролем. Также показано увеличение скорости роста МСК на матриксе. Показано, что клетки, культивируемые на матриксе, меньше подвергаются старению, что говорит о том, что возможно полимерный матрикс способен защищать МСК мыши от действия кислородного стресса. Показано, что клетки культивируемые на матриксе не претерпевают трансформацию, было показано, что клетки при культивировании сохраняют свой поверхностный фенотип. длительном 10 Практическая значимость работы Разработаны новые методы долговременного культивирования МСК на пористом матриксе из ПГБ на модели мышиных МСК, которые пригодны для культивирования МСК в большом количестве для дальнейших терапевтических и научно-исследовательских целей. Разработаны оптимальные условия для долговременного культивирования и поддержание жизнеспособности клеток, а также наращивания клеточной массы. Также были получены данные, что при культивировании МСК на матриксе их размеры уменьшаются, что облегчает их миграцию в пораженные органы и ткани. Полученные данные показывают, что трехмерный матрикс на основе ПГБ, является подходящим субстратом для долговременного культивирования МСК для их возможного дальнейшего применения в терапевтических целях в регенеративной медицине, а также в научно-исследовательских целях. Публикации По теме диссертации опубликовано 7 статьей в журналах, рецензируемых ВАК РФ, 1 опубликована в зарубежном рецензируемом журнале. Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 144 источников. Диссертация иллюстрирована 38 рисунками и 3 таблицами. 11 ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 1.1. Разнообразие и применение биосовместимых материалов Стволовые клетки играют важную роль не только в разработке новых методов лечения и регенерации тканей, но и используются в качестве модели для биологических исследований. Использование СК, как неограниченного источника тканевой инженерии, дало надежду для регенерации тканей организма в лабораторных условиях. Тем не менее, влияние материала на развитие клеток в трехмерной структуре еще недостаточно изучено. Биоинженерные подходы к культивированию клеток, которые сочетают микросреды, включают в себя управление тканеспецифическим транспортом и сигнализацией и являются важными деталями для изучения развития тканей и регенерации. Вещественный состав и структура материала, используемого при культивировании клеток, влияют на их дифференцировку, рост и поведение. Различная модификация физических и биохимических свойств материала может влиять на дифференциацию СК. Например, культивирование СК в 3D матриксе, изготовленных из коллагена фибронектина, стимулирует дифференцировки клеток эндотелия; а добавление ламинина повышает способность эмбриональных стволовых клеток дифференцироваться в кардиомициты [3]. Последние исследования показывают, что биоматериалы можно представить как основные регуляторные сигналы, которые сочетаются с другими факторами при создании искусственной микросреды, с целью контролировать судьбу стволовых клеток. Предполагается, что многие перспективные терапевтические применения стволовых клеток потребуют разработку конструктивных материалов, оказывающих влияние на фенотип стволовых клеток. В этих материалах дифференциация столовых клеток происходит так же, как и в естественных 12 условиях, что можно использовать для регенерации тканей, восстановления тканевого развития, гомеостаза и восстановления после травм на протяжении всей жизни. Регенерация изношенных и пораженных тканей с использованием некоторых форм клеточной терапии становится все более вероятным и приобретает все более широкие масштабы [4]. Компоненты внеклеточного матрикса (extracellular matrix, ЕСМ), такие как белки, коллаген, ламинин, а так же протеогликаны, например гепарансульфат, в комбинации с коктейлем экзогенных растворимых факторов роста используются для создания микросреды, которая влияет на поведение стволовых клеток в лабораторных условиях [5]. Примeрами биоматериалов также являются инертные металлы, полимеры, модифицированные полисахариды. Тем не менее, у природных материалов есть свои недостатки: высокий потенциал загрязнения, что может вызвать иммунный ответ при имплантации. В последние годы были достигнуты значительные успехи в получении новых биоматериалов с заданными физико-химическими и медико-техническими свойствами. Синтетические материалы специально разработаны для взаимодействия с клетками на разных этапах (например молекулярных, клеточных и микроскопических) — тем самым они имитируют элементы природной ниши СК [6]. Химические полимеры представляют большой спектр контролируемых химических, физических и механических свойств, благодаря разнообразию доступных мономеров и сополимерных структур [7]. Диапазон их свойств чрезвычайно широк и определяется, прежде всего, конкретной сферой применения. Следует отметить, что успешное применяются те биоматериалы и их структуры, которые точно имитируют химический состав и иерархическую структуру природной ткани для замены и регенерации, в том числе адаптацию к биологическим изменениям в процессе заживления тканей и органов. К часто используемым полимерам относятся полиакрамиды, полиакрилаты, 13 полиэфиры, сложные полиэфиры, полифумараты, полифосфанезы, полигидроксибутираты, полифозфазены и многие другие. Неорганические материалы используются как остеогенная ниша, а гибриды и композиты вышеупомянутых классов — как уникальные матрицы для конкретного применения [8]. Эфиры акриловой кислоты и ее производных, так называемые биоклеи, используются в травматологии, для склеивания костей при переломах, а также для склеивания разрывов и разрезов на внутренних органах. Мембраны полиметилметакрилата, полисульфона, полиакрилонитрил являются диализно-диффузионные пленочные мембраны, применяются в аппарате «искусственная почка» [9]. Волокнистые материалы, такие как винилацета, полимер-силикатные композиты служат в качестве шовных материалов, также они используются для протезов внутренних органов; полые волокна и модули — для аппаратов «искусственные легкие». Мембраны из полимолочной кислоты, фосфатидилхолина, полиакрилата, модифицированного хитозана служат материалами для микроинкапсулирования и предназначены для создание микрочастиц диаметром от несколько микрон, которые применяются в искусственной иммунизации и введении лекарственных препаратов [10]. Эпоксисоединения, полисульфоны, полиимиды служат для создания искусственных клапанов сердца, элементов искусственного сердца. Эксперименты на стыке биологии, химии, инженерии и медицины имеют важное значение для разработки биоматериалов. Это помогает создавать аналогичные биологическим материалы для направленного развития и регенерации тканей в естественных условиях, как вне организма, так и внутри него. Получение биоматериалов привело к новому направлению материаловедения, которое изучает взаимодействие искусственных материалов с живыми клетками, тканями и органами — для нужд трансплантологии, полноценному замещению тканей и органов [11]. Например, саморегулируемые материалы, состоящие из соединительной 14 структуры предназначены для введения между имплантатом и костной тканью для снятия напряжений из-за разности в упругости соединяемых материалов, что может привести к разрушению имплантата и порче кости. Существуют целый ряд неорганических и функционализированных биоактивных покрытий в протезно-костной терапии [12, 13]. Такие материалы изменяют свои свойства под действием изменения внешней среды, например колебания температуры, кислотности, давления. Саморегулируемые материалы применяют не только в хирургии, а также в стоматологии (имплантаты и протезы), в генной терапии как система высвобождения и доставки генов и биоактивных веществ; в иммунологии — вакцины, заключенные в биологические мембраны; в фармакологии — синтез и очистка лекарственных соединений, система доставки и регулируемое высвобождение. Из биоразлагаемых материалов, получают микро- и нанокапсулы, которые нашли применение в генной терапии, в заместительной гормональной терапии при лечении диабета, очистке крови от различных продуктов распада, диагностировании и лечении опухолей различного характера [14]. В виде микрокапсул выпускают такие лекарственные препараты, как витамины, антибиотики, снотворные, противовоспалительные и многие другие. Из биоразлагаемых материалов, на основе молочной и гликолевой кислоты, получают пленки, которые используются в гинекологии, стоматологии, ольфтальмологии. Например, в оперативной стоматологии полимерные пленки могут использоваться для защиты полостей от кистозных новообразований, заживлении ран при удалении зубов и тканей [15]. Наиболее перспективными являются следующие. саморегулируемыми материалами 1. Конструктивные материалы с определенными свойствами поверхности (однородность поверхности, размер пор, проницаемость для 15 кислорода и продуктов метаболизма), находящиеся в непосредственном контакте с кровью и тканями организма. 2. Модификация тканей человека и животных, например создание искусственного сердечного клапана, растущего по мере роста ребенка. 3. Конструирование материалов методами генной и клеточной инженерии для создания искусственных тканей, применяемых при повреждении слизистых оболочек и кожи. 4. Материалы с регулируемой по времени биодеградацией, например биополимеры и композиционные материалы, как система доставки лекарственных веществ, компоненты искусственной крови, а также как шовные материалы. 5. Материалы, с увеличенным сроком эксплуатации с повышенной устойчивостью к коррозии, механическому, химическому и термическому разрушению. Предполагается, что направление материаловедения имеет большой потенциал для продвижения тканевой и клеточной инженерии. Но, несмотря на преимущества, материалы и конструкции из них имеют ряд общих побочных свойств, среди которых остро стоит вопрос о биосовместимости полимера, токсичности продуктов его распада, трудности введения и извлечения наравне с высокой стоимостью созданного материала [16]. Кроме того, может нарушаться транспорт кислорода в метаболических активных тканях (зависит от диаметра пор материала). Осложняет ситуацию присутствие неоднородности в клеточном микроокружении синтетических гелей. Благодаря своей способности имитировать характер большинства мягких тканей, гидрогели являются весьма привлекательным материалом для разработки синтетических аналогов внеклеточного матрикса. Такие сетчатые структуры сшитых полимерных цепей обладают высоким содержанием воды, поверхностным транспортом кислорода, питательных 16 веществ и продуктов метаболизма [17]. Гидрогели для культуры клеток могут быть получены из многих натуральных и синтетических материалов, предлагая широкий спектр механических и химических свойств [18]. В настоящее время ПГБ и его сополимеры, полученные биотехнологическим способом, привлекают большое внимание как биодеградируемые и биосовместимые полимеры для применения в медицине, а также в качестве 3D-платформ для культивирования и изучения физиологических и морфологических свойств клеток. 1.2. Свойства биосовместимых материалов 1.2.1. Основные биологические свойства При создании материалов медицинского и научно- исследовательского назначения важно учитывать такие параметры, как отсутствие токсичности, особенности химической и биологической инертности, объединяют механическую понятие биосовместимости стабильность. Все «биосовместимость». является эти характеристики Одним гемосовместимость, когда из свойств сводится к минимуму взаимодействия между поверхностью материала и белков крови при длительном контакте. Так, адгезия фибриногена на поверхности имплантатов приводит к повышенному тромбообразованию [19]. При хорошей биосовместимости у материалов должны отсутствовать побочные явления, такие как аллергические реакции, токсичность, воспалительные действия; не оказывать отрицательное действие на белковые и форменные элементы крови, а также на органы и ткани: вызывать антигенный и канцерогенный ответ и отклонения в системе метаболизма, провоцировать развитие инфекции, нарушать электролитический баланс [20]. Материалы, например инертные металлы, керамика, полимеры, модифицированные полисахариды, контактирующие с живыми тканями, должны иметь 17 сходные с последнии физические проявления, [21]. Такие качества, как форма, строение поверхности материалов, совместно с химической и надмолекулярной структурой влияют на биосовместимость, благодаря чему эти синтетические материалы могут заменять живые ткани. Также такие материалы должны пройти физико-химические тесты. Так, на основании значений краевых углов в условиях натекания, отекания и избирательного смачивания может быть рассчитана межфазная энергия полимера на границе с водой, что очень важно для определения поведения материала в биологической среде [22]. Помимо биосовместимости синтетические материалы должны обладать еще такими свойствами, как разрушаемость in vivo или биодеградация, что позволяет использовать биополимеры для изготовления капсул в качестве пролонгации лекарственных, а также шовных материалов, применяемых в хирургии для склеивания тканевых дефектов, герметизации паренхиматозных органов (с помощью полимерных пленок), в ортопедии, стоматологии, а также в сосудистой и тканевой инженерии. В этом случае материалы должны обладать контролируемой биодеструкцией. При распаде этих материалов в организме не должны образовываться токсические продукты, а полученные биологически безопасные продукты распада должны удаляться из организма и постепенно замещаться на естественные ткани [23]. Продукты биодеструкции таких материалов должны быть естественными для организма веществами, которые включаются в метаболические циклы клеток: моносахара, молочная, гликолевые и β-оксимасляная кислоты и др., либо нетоксические продукты, не метаболизируемые клетками и тканями. Например, при расщеплении полигликолида или полилактида образуются, соответственно, гликолевая и молочные кислоты, которые в свою очередь распадаются до углекислого газа и воды и выводятся с мочой и выдыхаемым воздухом [24]. А если устойчивые продукты биодеградации не могут быть вовлечены в 18 метаболический цикл, то тогда при попадании в кровяное русло их концентрация не должна превышать предельно допустимый уровень [25]. Скорость биодеструкции зависит от воздействия агрессивных сред к лабильным химическим связям в макромалекуле, что зависит от гидрофильности поверхности материалов, их надмолекулярной организации, а также от природы агента. По механизму распада биоматериала биологическими средами выделяют следующие процессы биодеструкции: гидролитическую деструкцию (неферментативный и ферментативный гидролиз, окислительную деструкцию, катализ ионами металлов), клеточную деструкцию, бактериальную деструкцию и механодеструкцию. А для изделий, предназначенных для замены жизненно важных органов или функций организма, например протезы кровеносных сосудов, кардиостимуляторов и т.п., процесс биодеградации приводит к потере функциональных свойств имплантата. В этом случае материалы должны быть устойчивы к биодеградации. 1.2.2. Основные физико-химические и механические свойства При создании материалов медицинского назначение, как искусственного, так и природного происхождение, среди которых металлы, керамики, естественные и искусственные полимеры, различные композиты и др., важно учитывать следующие аспекты, такие как: отсутствие токсичности, химическая и биологическая инертность, механическая стабильность. Металлы должны обладать следующими свойствами: биосовместимостью, длительным сроком службы, отсутствием коррозии, устойчивостью к локально пластической деформации [26]. 19 Высокой прочностью среди металлических материалов обладают материалы, в состав которых входят железо, титан, золото, алюминий; они используются в ортопедии, ортодонтии, в искусственных органах. А материал из никеля и титана (нитинол) обладает памятью формы и получил широкое распространениев разработках различных имплантов. Способность запоминать металлами предыдущую форму впервые было обнаружено в 1950 годах у сплава золото с кадмием, когда сплав деформировался при низкой температуре и возвращался в исходное состояния при нагревании до критической температуры. Благородные металлы (золото и платина) применяют для изготовление химически инертных протезов. Применение этих металлов в ортопедии связано с их высоким пределом текучести и жесткости. Также такие материалы должны выдерживать высокие напряжения, не проявляя остаточной деформации и излома. Материалы еще должны обладать модулем упругости, аналогичным модулю кости. Если материал обладает усталостью, когда при испытании какого-либо вида циклической нагрузки, он выходит из строя при более низком напряжении, чем предел текучести при однократном цикле испытаний, то это существенно ограничивает область применения [27, 28]. Еще одно важное свойство металлов — это устойчивость к локальной пластической деформации, которое выражается в появлении на поверхности изделия вмятин, царапин и т.д. Значение твердости металла используют также для оценки прочности материала на растяжение; твердость металла влияет на его износостойкие свойства. Главными характеристиками керамики являются биосовместимость, высокая твердость, изолирующие свойства теплоты и электричества, термо- и коррозиостойкость. Среди недостатков, ограничивающих ее применение, — это хрупкость и ломкость. Керамические материалы, используемые в медицине и в биологии, называются биокерамикой, применяются в основном для реконструкции дефектов костной ткани, — 20 например, оксид алюминия, двуокись цикория, оксид титана, алюминаты кальция и др. [29]. Композитные материалы — это смесь двух и более фаз, связанных вместе так, что передача напряжения происходит по их границе. Это многокомпонентные материалы, состоящие из полимерной, металлической, углеродной, керамической и другой основы (матрицы), армированной наполнителями из волокон, нитевидных кристаллов, тонкодисперсных частиц и др. Такие материалы создаются для того, чтобы обеспечить сочетание свойств, которые не могут быть достигнуты, с помощью материала, имеющего одну фазу. Эти материалы обладают высокой прочностью, жесткостью и т.д. Матрица в композитных материалах обеспечивает монолитность материала, передачу и распределение напряжение в наполнителе, определяет тепло-, влаго-, оген- и химическую стойкость. Различают полимерные, металлические, углеродные, керамические и др. композиты. Например, в композиционном материале «фарфор – никелид титана» компоненты слабо взаимодействуют и после спекания контакты между керамической и металлической составляющей ослаблены. При нагрузке они разрываются в первую очередь, и упругое восстановление растет; в результате деформация, является обратимой, и композит проявляет свойства сверхэластичности [30]. Полимерные материалы подразделяются на два типа: термоотверждаемые и термопластичные. Термоотверждаемые полимеры полимеризуются, приняв свою окончательную форму, и не могут быть переформированы с целью изменения формы в результате нагрева. Этот тип полимеров имеет ковалентные межмолекулярные связи. Термопластичные используются, как правило, для получения имплантов различной конфигурации из расплавов путем формования, экструзии, прессования. Этот тип не имеет межмолекулярных связей, и, как правило, 21 состоит из линейных полимерных цепей [31]. Свойства полимеров в значительной степени зависят от величины молярной массы. Важнейшими характеристиками полимеров служат молекулярная масса и степень полимеризуемости. Например, биостабильные синтетические полимеры не гидролизуются в жидких средах, не разрушаются под воздействием ферментов крови и клеток и предназначены для изготовления имплантов и устройств длительного функционирования; среди них — полиэтилен, полипропилен, полиэтилентерефталат нейлон, политетрафторэтилен, полиметилметакрилаты и др. [32]. 1.3. Использование биосовместимых материалов для 3D культивирования 3D платформы выступают в качестве альтернативы родного внеклеточного матрикса для культивирования и дифференцировки клеток, а также для формирования тканей. Матриксы являются шаблонами и стимулом для роста и дифференцировки стволовых клеток в специализированные клетки, и генерируют специфическую новую ткань так же, как и матрицы для роста клеток и тканей, в трех измерениях. Выбор материала для культуры клеток зависит от взаимодействия клеток с матрицей, поведения и миграции клеток, а также физических сигналов, например механического растяжения. Конструкция матрикса является структурой, копирующей структуру ткани организма. Так, для культивирования нервных клеток берут мягкую и чувствительную матрицу, которая аналогична мозговой ткани, а для костных и мышечных клеток подойдут более жесткие матрицы. Матриксы на основе волокон изготавливаются из синтетических биодеградируемых полимеров, таких как полимолочная кислота, и природных полимеров — коллагена, альгината, и представляют собой своеобразную сеть с регулярной и 22 беспорядочной ориентацией волокон устойчивы к растяжению. На рис. 1 показан трехмерный композиционный коллагеновой губки и ПГА [33]. матрикс, полученный из Рисунок 1 — Электронная микрофотография композиционого трехмерного матрикса, полученного из коллагеновой губки и ПГА (Е.И. Шишацкая) Для того чтобы клетки хорошо росли и развивались, матрикс должен иметь большие поры (макропоры) диаметром более 100 мкм, поры обычно соединены друг с другом, что позволяет клеткам мигрировать и способствует росту тканей, также взаимосвязанная сеть пор обеспечивает доставку питательных веществ и кислорода. Помимо пористости и конфигурации в матриксе еще должна быть поверхность или субстрат, куда прикрепляются функционирующие клетки, чтобы далее формировать свой внеклеточный матрикс [34, 35]. Поверхностная структура пор или шероховатость нанометрического масштаба влияют на функциональную активность клеток. Открытые пористые матриксы используют в качестве ткань-индуцирующих имплантов, матриксов для культивирования клеток in vitro, таких как хрондоциты, гепатоциты, отеобласты, фибробласты, мышечные, эпителиальные и стволовые клетки [36]. В работе Lu H.F., Narayanan K. et al. было продемонстрировано, что полученные три зародышевых листка из плюрипотентных стволовых клеток человека 23 (hPSC) 3D микрофибрином ECM хорошо сохраняют жизнеспособность [37]. Например, при засеве клеток на матрицу из композита коллаген/ПГА были показаны высокие адгезионные свойства и способность поддержания пролиферации в течение длительного времени [38]. Как известно, ECM регулирует поведение клеток, влияя на клеточную судьбу, выживание, миграцию и дифференциацию, а способность стволовых клеток зависит от состава 3D и окружающей среды. Основными компонентами, как уже было сказано, являются волокнистые структурные белки, такие как коллаген, фибронектин, витронектин, эластин; специализированные белки, например факторы роста, малые интергин-связывающие гликопротеины и протеогликаны, более точный состав завит от целей работы [39]. Так, Ma J., Holden K. et al. показали в своей работе, что мышиные миобласты, культивируемые в матриксе на основе композитов коллагена, имплантировали в скелетные мышцы in vivo, тем самым устранив дефект мышц у мышей [40]. Пористые полимерные материалы для трехмерного культивирование и тканевой инженерии, также служат для изучения миграции клеток, что актуально в биологии метастазирование рака, которое вызывает распространение злокачественных клеток опухоли [41]. В трехмерных матриксах были культивированы различные типы клеток для разных областей тканевой инженерии, так были культивированны первичные клетки печени, фибробласты и многие другие. Например, для дифференциации нервных клеток и регенерации нервов использовались композиционные матриксы на основе коллагена и гиалуроновой кислоты [42]. Таким образом, искусственные внеклеточные матриксы и регулирующие факторы играют важную роль в изучении дифференциации и роста клеток. 24 1.4. Использование поли(3-гидроксибутират) для 3D- культивирования клеток 1.4.1. Основные свойства поли(3-гидроксибутирата) Свойства ПГБ в особенности стереохимия, в частности, зависят от метода получения. Биосинтетический подход к синтезу ПГБ позволяет получить полностью изотактический полимер с одинаковой стереоконфигурацией атомов углерода в -положении. Мономером для синтеза ПГБ, состоящего из повторяющихся фрагментов (C4H6O2), является D(-)-3-β-оксимасляная кислота [43]. H CH3 O O n Рисунок 2 — Структурная формула поли-3-гидроксибутрата Стереоспецифичный полимеризующий фермент — ПГБ-синтетаза — определяет стереорегулярность ПГБ [44]. Стереоспецифичность и распределение электронной плотности в молекуле объясняет высокую — до 80% — кристалличность полиэфира, а его гидрофобность — амфорное состояние во внутриклеточных включениях. Рентгенографический анализ показал, что пространственной структурой молекулы является левозакрученная спираль. Кристаллизация ПГБ в условиях повышенного пресыщения происходит с образованием сфер радикально-лучистого строения — сферолитов, так как способствует накоплению большого числа примесей и структурных дефектов и, как следствие, расщеплению зародышевых кристаллов. Последующее падение пресыщение приводит к 25 более равномерному росту кристаллов с образованием сферических структур. Двойное лучепреломление дает характерное для этих структур изображение мальтийского креста, видимого в поляризованном микроскопе [45]. Для улучшения свойств поверхности матриксов применяют лазерную обработку. У этого метода есть свои преимущества — он прицельно модифицирует поверхности без разрушения материала и образование токсических продуктов. Есть предположение, что в областях, обработанных лазером, увеличивается прочность адгезионного шва между фазами, возрастает гидрофильность и, следовательно, повышаются адгезионные свойства поверхности, к которым прикрепляется большое количество клеток [46]. Получен ряд пленок с измененной поверхностью от выраженных шероховатостей до сквозных перфораций (рис. 3). Выявлено, что оптимальные параметры лазерного излучения являются следующие: Римп = 18,46 Вт и τ = 3 мс. Поверхность полимерных пленок, обработанных в таком режиме, максимальна гидрофильна. а б в Рисунок 3 — Топография поверхности пленочных матриксов из полигидроксибутирата, обработанных лазером с различной мощностью (Р) излучения (оптическая микроскопия): Р = 6,15 Вт (а); Р = 8 Вт (б); Р = 9 маркер 50 мкм (в) (Е.И. Шишацкая) 26 Сам ПГБ представляет собой бесцветное вещество с температурой стеклования 20–22 °С, средневесовой молекулярной массой в пределах 4 6 110 – 310 г/моль и коэффициентом полидисперсности 2 [47]. Температура плавления, согласно данным калориметрического анализа, 3 составляет 180 °С; плотность кристаллического ПГБ составляет 1,26 г/см , 3 аморфного — 1,18 г/см . кристаллического ПГБ. На рис. 4 представлена морфология Рисунок 4 — Морфология кристаллического поли(3-гидроксибутирата) (Е.И. Шишацкая) Для ПГБ модуль упругости равен 3,5 ГПа и прочности на разрыв — 40 МПа. Изменение условий кристаллизации и использование пластификаторов позволяет значительно улучшить механические свойства ПГБ. Первый подход предполагает увеличение центров кристаллизации для получения частиц меньшего диаметра, что значительно уменьшает жесткость полимера; второй — введение в расплав нетоксичных, хорошо смешиваемых с полимером химически инертных соединений, таких как триэтилцитрат и эфиры салициловой и ацетилсалициловой кислот [48, 49]. Высокомолекулярные соединения, как полигидроксиалканоаты и крахмал, 27 при сополимеризации, а в случае полиэфиров гидрокислот сокристаллизации, могут улучшить эластичность ПГБ [50]. 1.4.2. Биосинтез и внутриклеточная при деградация поли(3-гидроксибутирата) В большинстве ПГБ-продуцирующих штаммах синтез полиэфира проходит в три последовательные стадии: 3-кетотиолаза конденсирует два остатка ацетил-кофермента А (КoA) с образованием ацетоацетил-КоА; НАД-Н-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза стереоселективное восстановление ацетоацетил-КоА в катализирует D(-)-3-гидроксибутирил-КоА, и, в завершение, ПГБ-синтаза присоединяет эфирной связью образовавшиеся мономеры к растущей цепи ПГБ (рис. 5) [51]. ПГБ является одним из основных источников углерода в клетке, поэтому при несбалансированных условиях роста синтез углерода из ПГБ составляет важную часть клеточного метаболизма. Исследования различных продуцентов методом флуоресцентной микроскопии показали, что в пределах клетки ПГБ на начальной стадии аккумулируется вблизи цитоплазматической мембраны в виде гранул, покрытых плотным слоем паракристаллических белковых частиц, т.е. завершающая стадия синтеза гидрофобной частицы [52]. происходит именно на поверхности На рисунке 5 показан катаболизм накопленного ПГБ под действием ПГБ-деполимеразы и 3-гидроксибутиратдегидрогеназы в условиях ослабление стресса в клетки, при этом состав продуктов распада зависит от вида бактерий [53]. Связующим звеном метаболического цикла является синтез ацетил-КоА из ацетоацетила -КоА под действием -кетотиолазы. 28 Рисунок 5 — Пути синтеза и расщепления поли(3-гидроксибутирата) у бактерий Было обнаружено, что гидролизующие ферменты специфичны к состоянию полиэфира. Так, внеклеточная ПГБ-деполимераза расщепляет выделенный, частично кристаллический полимер, лишенный поверхностного белкового слоя, а внутриклеточная деполимераза 29 гидролизует нативную и, возможно, выделенную аморфную формы ПГБ [54]. Предполагается, что в ряде бактерий таких, как Ralstonia eutropha, Wautersia eutropha и Cupriavidus necator содержится несколько видов ПГБдеполимераз [55]. 1.4.3. Области применения поли(3-гидроксибутирата) ПГБ в медицине и его сополимеров используют в хирургии в качестве хирургических имплантатов, а также в гинекологии, стоматологии и многих других медицинских областях. В биотехнологии он используется как матрикс для клеточных культур [56]. Из материалов на основе ПГБ получают пленки, полые волокна и ткани, а также системы для имплантирования искусственных костей и тканей [57]. Из ПГБ получают нити, которые используются для восстановления поврежденных волокон периферической нервной системы [58]. Также были получены матриксы на основе ПГБ и его сополимеров различной пористости для улучшения пролиферации костных клеток, что является перспективным направлением [59]. Кроме того, ПГБ применяют для инкапсуляции и пролонгированному высвобождению различных химических веществ, в том числе обладающих фармакологической активностью, что позволяет использовать его в качестве лекарственных полимерных систем для контролируемого высвобождения. В экспериментах in vitro при выращивании клеток на матриксах из ПГБ, было показана хорошая выживаемость и пролиферация клеток различных типов, при этом наблюдалась низкая имплантированный материал [60]. воспалительная реакция ткани на Значительное снижение себестоимости при использовании разнообразных добавок и сополимеризации ПГБ при условии сохранения 30 способности к биодеструкции делает возможным его использование в промышленности и сельском хозяйстве. Материалы с ограниченным сроком действия для производства упаковки способны значительно уменьшить загрязнение окружающей среды, чему способствует микробиологическое производство ПГБ на субстрате из отходов пищевой промышленности [61]. В других отраслях, например в сельском хозяйстве, материалы на основе ПГБ могут быть использованы для капсулирования семян с минеральными удобрениями с целью их защиты и повышения всхожести. 1.5. 3D-культивирование клеток на матриксе, основанный на поли(3-гидроксибутирате) и его сополимеров Клетки, которые используются в тканевой инженерии и клеточной терапии можно получать из первичных тканей, а также использовать клеточные линии. Первичные ткани могут быть получены от других видов (ксеногенные ткани), от других представителях того же вида (аллогенные ткани) и от того же индивида (аутогенные ткани). У всех типов клеток условия культивирования различаются, но большинство клеток растут на материалах из полигидроксиалканоатов (ПГА). ПГА, а также полиэфиры гидроксиалкановые кислоты, которые синтезируются бактериями, в качестве углерода и энергии резервных материалов [62]. ПГА являются перспективными материалами для различных приложений, в том числе тканевой инженерии, так как они обладают полезными механическими свойствами и являются биологически совместимыми [63]. В самом деле, ПГБ и поли(3-гидроксибутират)-со-3гидроксивалерат (ПГБ-ГВ), которые являются членами семейства ПГА, разлагаются в клетках до D-3-гидроксибутирата, который входит в состав крови человека [64, 65]. Было показано, что на матриксах, полученных из 31 ПГБ и его сополимерах, хорошо растут МСК человека и дифференцируются в эндотелиальные клетки; также была проверена биосовместимость МСК к ПГБ и ПГБ-ГВ [66]. Также были проведены работы по биосовместимости полигидроксибутиратом и с фибробластами линии COS-1, где клеточная пролиферация была лучше на шероховатых поверхностях, чем на гладких. Шероховатость поверхности получали с помощью полиэтиленглюколя [67]. В других исследованиях было показано, что при культивировании различных типов клеток млекопитающих in vitro на полимерных пленках клетки лучше росли на поверхностях с различной шероховатостью. К примеру, пролиферация фибробластов выше на пленках с относительно более шероховатой поверхностью, в то время как эпителиальные клетки прикрепляются и растут только на гладких полимерных пленках [68]. В другой работе было показано, что МСК человека прикрепляются не к отдельным нитям матрикса, полученного из полиоксибутирата, а растут на сети, состоящей из нескольких или многих нитей [69]. Подложки из ПГБ и ПГБ-ГВ способствуют поддержанию роста культуру нейрональных клеток, и эти клетки были использованы для исследования болезней, связанных с травмами и повреждениями спинного мозга, которые могут привести к разрушительным неврологическим осложнениям. Так, в одном из исследований было показано отсутствие цитотоксичности подложек, а также выявлена их способность к биоразложению и биосовместимости [70]. Также на матриксах из ПГБ успешно растили взрослые клетки Шванна для регенерации аксонов после травмы шейного отдела спинного мозга у взрослых крыс [71]. Таким образом, матриксы и пленки из ПГБ и его сополимеров хорошо подходят для культивирования и роста различных типов клеток, что указывают многие проведенные исследования. А также выращенные клетки на подложках из ПГБ могут найти клиническое применение при 32 различных заболеваниях, таких как рассеянный склероз, травмы спинного мозга, остеопороз и многие другие. Клетки отвечают за регенерацию поврежденной ткани, синтезируя, внеклеточный матрикс, который является залогом синтеза здоровой функциональной ткани, а материал носителя обеспечивает механическую стабильность и служит матрицей для роста клеток в объеме. Именно взаимодействие клеток и полимера, соотношение между скоростью разрушения полимера и ростом клеток являются залогом успешной реконструкции тканей [72]. Также была показана роль матриксов из ПГБ при долговременном культивировании клеток на модели МСК мыши. Эти клетки были выбраны в качестве тестирования, поскольку они сложны и более требовательны к условиям культивирования, чем МСК других видов [73]. 1.6. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток мыши Мышиные МСК широко распространены в научных исследований благодаря способности манипулировать геномом мышей. Кроме того, установлены экспериментальные модели мыши с различными заболеваниями человека, которые представляют ценный ресурс для получения доказательства правильности концепции для клеточной терапии [74]. Номенклатура относительно этого типа клеток варьировала: сначала эти клетки называли колонеобразующими фибробластами (CFU-F), затем их дали название «клетки-предшественники» и «мезенхимальные стволовые клетки» [75]. МСК мыши впервые были выделены в 1990-х гг. [76]. МСК мыши можно получить в больших количествах из жировой ткани, костного мозга, тогда как в других тканях их очень мало. Эти клетки 33 считаются мультипотетными, их дифференцировка определяется локальным микроокружением. К дополнению к мультипотетности МСК способны поддерживать иммунную систему, синтезируя медиаторы, такие как оксид азота, простагландины, IL-6, которые модулируют Т-клеточный ответ. МСК также секретируют некоторые проангиогенные факторы, особенно в окружении с пониженной концентрацией кислорода, что делает их благоприятными при лечении ишемической болезни сердца. Хотя МСК уже могут быть использованы для лечения пациентов с критической ишемией конечностей, результаты этих исследований не могут быть удовлетворительными, поскольку все выводы пока основаны на предклинических исследованиях [77]. Еще одной важной характеристикой МСК является их способность продуцировать цитокины и факторы роста, которые поддерживают и регулируют кроветворения [78]. Как было сказано выше, что МСК мыши требовательны к условиям культивирования, при окислительных стрессах клетки могут перестать размножаться вследствие реплекативного старения, что может привести к их гибели. Условия культивирования этих клеток первоначально были описаны в 1970 г. [79]. По-прежнему возникают трудности в получении хорошего роста МСК в культуре, в результате чего они теряют со временем способность к пролиферации при стандартных условиях культивирования [80]. В одной из работ было показано свойства мышиных МСК при исследовании кровеносных сосудов, которые участвуют в опухолевых процессах с пониженным содержанием кислорода. При культивировании МСК в нормоксии (95% воздуха и 5% CO2) и в гипоксии (1% O2, 5% CO2, и 94% азота) было показано, что при гипоксии МСК формирует трехмерные капиллярные структуры [81]. Кроме того было обнаружено, что долговременное культивирование МСК в атмосфере с пониженным 34 содержанием кислорода, позволило клеткам оптимально размножаться и дифференцироваться [82]. Воздействие атмосферного кислорода индуцирует p53, TOP2A и BCL2 связанные с экспрессией Х белка (ВАХ) и митохондриальными активными формами кислорода (АФК) в первичных МСК мыши. В результате формируется окислительный стресс, который жизнеспособность клеток и их пролиферацию. Кроме того, снижает культивирование МСК в инкубаторе, содержащем 5% кислорода, увеличивает массу клеток. Быстрое прекращение пролиферации мышиных МСК в нормоксии связано с активацией пути р53 [83]. Однако культивирования при проведении коротких пассажей и пересевах при низких уровнях конфлюэнтности старение МСК в этих условиях резко замедляется. Таким образом, кислородный стресс не является фактором, непосредственно вызывающим старение МСК в культуре, а, вероятно, способен лишь потенцировать этот процесс в определенных условиях. При высевании клеток на ЕСМ или компоненты ЕСМ показали значительное увеличенные пролиферации клеток, что возможно, способствовало снижению кислорода [84]. Как известно, что МСК в культуре могут пролиферировать до 19 удвоений при этом, дифференцировке. не теряя При способности длительном к пролиферации и культивировании дифференцированный потенциал уменьшается, скорость роста клеток падает, ухудшаются функции клеток, приводящие к апоптозу, а при длительном культивировании может образоваться спонтанная патологическая трансформация МСК, в результате чего клетки приобретут онкогенный потенциал. В другой работе было показано, что плотность пассажа влияет на пролиферацию МСК, а условия культивирования были лучше при низкой плотности засева [85]. В исследованиях проведенных 2002–2003 гг. было показано, что мышиные МСК, выдерживали до 50 35 пассажей и проходили до нескольких месяцев культивирование, при этом клетки не трансформировались. Также в этой работе было еще раз показано, что длительность культивирования зависит от плотности пассажей, культуральной среды и от подложек культивирования клеток [86]. Культивирование МСК мыши in vitro и их характеристики имеют важные последствия для развития фундаментальных исследований и лечебных стратегий, таких как клеточная и генетическая терапия с использованием мышиных моделей. 1.7. Репликативное старение клеток в культуре Репликативное дифференцированных, старение так и первичных клеток в культуре, стволовых, рассматривается как многими исследователями как удобная модель процессов старения клеток, происходящих в организме, и позволяющая на основе экспериментов, проводимых в контролируемых и воспроизводимых условиях in vitro, предполагать о фундаментальных механизмах старения организмов. В настоящее время накапливается все больше данных, указывающих на то, что ранее широко принятое в качестве основной причины старения сокращение длины теломер является не единственным и во многих случаях не определяющим фактором старения клеток в культуре. Существуют свидетельства нескольких важнейших механизмов повреждения макромолекул, которые обычно действуют параллельно один другому или зависят один от другого [87]. Вероятно, любой из этих механизмов может играть доминирующую роль при тех или иных обстоятельствах. Во многих из этих процессов важную роль играют АФК (в частности свободные радикалы), набор свидетельств об их влиянии был получен достаточно давно и сейчас известен под названием «свободнорадикальная 36 теория старения». Сегодня, тем не менее, механизмы старения намного более детализированы. Так, например, обнаружено, что характер метилирования ДНК в геноме тесно связан с хронологическим возрастом [88]. Было обнаружено, что окислительный стресс (чрезмерное выделение АФК) также может иметь влияние на утрату теломер, значительно ускоряя этот процесс в определенных тканях [89]. Также на старение клеток оказывают влияние эпигенетические факторы [90]. Важной причиной старения на уровне клеток является клеточный ответ на повреждения. Из-за стохастической природы повреждений отдельные клетки стареют, например в связи с достижением границы Хейфлика, быстрее остальных клеток. Такие клетки потенциально могут представлять опасность для здоровых окружающих клеток и, соответственно, тканей и органов. Это в основном проявляется у стволовых клеток, так как их клеточное деление происходит быстрее. Например, для костного мозга это одна из возможных причин возникновение раковых клеток. Известно, что даже слабый химический стресс вызывает апоптоз стволовых клеток старых мышей [87]. Старение — это реакция на стресс, вызванная активизацией трех основных механизмов, таких как критическая эрозия теломер, накопление повреждений ДНК и дерепрессии INK4/ARF в локусе 8. Эти три процесса подавляют активацию р53 — супрессора опухолевого роста, и таким образом запускают окислительный стресс, что приводит к индуцированным стрессом преждевременного старения [91]. Возможно, культивирование клеток в специально подобранных для них условиях будет способствовать достижению оптимальных показателей для клеток типа МСК и т.д. 37 1.8. Области применения стволовых клеток в медицине 1.8.1. Получение стволовых клеток Стволовые клетки — недифференцированные (незрелые) клетки, имеющиеся у многих видов многоклеточных организмов. СК способны самообновлятся, образуя новые СК, делятся посредством митоза и дифференцируются в специализированные клетки различных органов и тканей. СК подразделяются на мезенхимальные (они способны дифференцироваться в клетки тканей мезодермального происхождения), гематопоэтические (предшественники клеток крови), нейрональные (предшественники клеток нервной системы) и др. МСК часто используют в роли трансплантата, т.к. они активизируют собственные резервы организма, способствуют образованию цитокинов и факторов роста. МСК являются предшественниками остеобластов и способствуют формированию ремоделирующих единиц. В 2001 г. ученые впервые обнаружили в жировой ткани стволовые клетки [92], и в это же время другие исследователи впервые изолировали МСК из жировой ткани [93] . Различные источники МСК подразумевают и разную обработку исходного биоматериала: жировой ткани, пуповинной крови, фетального материала, костного мозга. Условия выделения МСК для дальнейшего культивирования и условия наработки нужной клеточной массы зависят от состава культуральной среды, условий посева и культивирования, посуды и т.д. [94]. МСК отличаются относительной простотой выделения и культивирования. В одной из методик по выделению МСК из жировой ткани и костного мозга описан несложный метод выделения СК с помощью коллагеназы [95]. На рис. 6 показаны МСК, выделенные из жировой ткани. 38 Рисунок 6 — МСК выделенные из жировой ткани. Также МСК можно выделять из фетальных органов гемопоэза и из скелетных мышц. Метод выделенияи культивирования МСК относительно прост, но существует проблема получения однородной клеточной популяции мезенхимальных стволовых клеток в достаточном количестве для трансплантации и консервации в больших количествах. По известным методикам выращивания МСК из костного мозга обычно получают гетерогенные популяции клеток стромы с незначительным содержанием в них стволовых клеток. В работе с МСК используются традиционные методики работы с клетками [96], в каждом случае подбирая индивидуальную последовательность действий, условия выделения и наработки клеточной массы. Чтобы получить гомогенную культуру МСК из костного мозга, клетки культивируют в среде ДМЕМ (среда Игла в модификации Дюльбекко) с фетальной бычьей сывороткой (ФБС) [97] . Существуют еще один способ получения МСК для имплантации с целью направленной остеорегенерации [98]. В другой методике в процессе получения МСК выполняют ферментативную дезагрегацию, фильтрацию через мелкоячеистое сито, центрифугирование в растворе Хенкса, 39 ресуспендирование в ростовой среде ДМЕМ/F12, глутамин и содержащей 15% ФБС. Затем клетки сеют на пластиковые чашки и через сутки удаляют неприкрепившиеся клетки. [99]. В работе Majumdar М.К. клетки выделяли из костного мозга человека, используя экспрессию эндоглина; их культивировали в среде без сыворотки в присутствии трансформирующего фактора роста-бета (TGF-beta), используя для роста трехмерные матриксы альгинатных шариков [100]. В другой работе выделенные МСК из пуповинной крови выращивали на культуральной посуде, которая проходила предобработку в коммерческой среде MSCGM — в этом случае клетки высеивали с высокой плотностью [101]. В патенте РФ №2252252 от 20.05.2005г. описан еще один способ, где ткань сначала измельчают, обрабатывают раствором коллагеназы в среде Игла в модификации Дюльбекко, центрифугируют, а затем полученную суспензию очищают от эритроцитов с помощью лизирующего раствора и последовательно фильтруют через фильтры с разным размером пор и высеивают на матрасы или чашки Петри. Клетки получаются однородными с высоким выходом, жизнеспособными [102]. Также МСК получены из костного мозга с использованием гепарина и раствора Хенкса, а из жировой ткани — с помощью коллагеназы. Этот метод позволяет получить клетки с большим выходом [103]. Существует множество способов выделения клеток, любой из выбранных методов в зависимости от источника материала и поставленных задач. 1.8.2. Применение МСК в медицине: перспективы и проблемы Клеточные технологии считаются перспективным направлением в современной медицине. В настоящее время клеточная терапия с применением стволовых клеток является одним из основных подходов для 40 лечения многих тяжелых заболеваний. МСК могут выступать в качестве эффективного лечения многих заболеваний. Применение СК в медицине в основном находится на предклинических испытаниях. Но уже в настоящее время МСК начинают успешно использовать и в клинических испытаниях, для лечения многих тяжелых заболеваний [104]. МСК используют в качестве таргетного средства в доставки терапевтических генов в опухоли различной этиологии. Были проведены опыты на экспериментальных моделях мыши, где было показано, что МСК доставляют терапевтические гены в опухоль и вызывают противоопухолевый эффект [105]. Также проводились исследования при применении МСК, как клеточное транспортное средство для адресной доставки терапевтических генов в опухоли при лечении рака молочной железы [106]. МСК также могут найти свое применение и в стоматологии: было показано, что МСК приводит к более быстрой регенерации поврежденных костей, а также к увеличению их плотности, по сравнению с результатами при естественном заживлении костей. Были проведены эксперименты на крысах, где изучали процессы регенерации нижней челюсти после введения аутологичных МСК. Результаты показали, что МСК способствуют регенерации кости [107, 108]. В отечественной работе было проведено исследование на крысах с ишемическим инсультом: результаты показали, что введение МСК активирует пролиферацию эндогенных нейрональных СК, а также активирует ангиогенез в пограничной с повреждением области, уменьшает объем поврежденной ткани мозга [109]. Уже сейчас начали проводить клинические испытания с использованием МСК при ишемическом инсульте [110, 111, 112]. В последние годы проведены эксперименты по влиянию МСК после введения крысам с черепно-мозговой травмой, которые являются одной из актуальных проблем в неотложной нейрохирургии. Известно, что 41 ключевым фактором, отвечающим за репарацию нервной ткани, является формирование новых сосудов и генерация нервных клеток. По этим причинам использование МСК в черепно-мозговых травмах считается перспективным направлением [113, 114]. Несмотря на то, что МСК широко исследуются как в лабораториях, так и в клиниках, остается ряд нерешенных проблем, связанных с возникновением побочных действий применения МСК в терапии. К примеру, недавние исследования выявили как положительные свойства, так и недостатки МСК. Были проведены опыты на собаках, которым вводили МСК: у девяти из 10 собак развились отек легких и кровоизлияния [115]. Кроме того, введение МСК вместо нормальной регенерации поврежденного органа или ткани может запускать процесс образования тератомы, что еще больше усугубляет их функциональное состояние. Исходя из этого, использование клеточных дополнительных доклинических испытаний. технологий требуют 42 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Материалы и оборудование В нашем исследовании мы использовали следующие материалы, реагенты и оборудование. Культуральная среда ДМЕМ («ПанЭко«). Культуральная среда α-МЕМ («ПанЭко») ФБС (―Sigma-Aldrich‖). Глутамакс (―Life Technologies‖). Glutamine (―Gibco‖). Пенстреп (Pen\Strep) (―Life Technologies‖). Dexamethasone (―Sigma‖). Ascorbic acid (―Sigma‖). Insulin (―Lonza‖). 1x TrypLE Express (―Life Technologies‖). Фунгизон (―Life Technologies‖). Коллагеназа тип IA (―Sigma‖). Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР), для культуральных работ («ПанЭко» Россия). Этанол (спирт этиловый ректификованный, ГОСТ Р 51652-2000). Гидрофосфат калия (К2НРО4) («Химмед»). Сульфат магния («Химмед»). Хлорид натрия («Химмед»). Карбонат кальция («Химмед»). Карбонат аммония («Химмед»). Натрия молибдат дигидрат («Химмед»). Сахароза (―Sigma‖). 43 Агар (―Sigma‖). Цитрат натрия («Химмед»). Хлорид кальция (CaCl2) («Химмед»). Гептагидрат сульфа т а ма гния (МgSO4·7H2O) («Химмед»). Гептагидрат (FeSO4·7H2O(«Химмед»). Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) («Химмед»). Изопропиловый спирт («Химмед»). Соляная кислота («Химмед»). Серная кислота («Химмед»). Хлороформ («Химмед»). Антитела для фенотипирования МСК мыши: CD29, CD44 CD45, CD11b, CD105 (―BioLegend‖) и CD34 (―eBioscience‖). TrypLE Express (―Life Technologies‖). Trypan Blue (―Sigma‖). Агароза (―Sigma‖). Триптон(―Sigma‖). Дрожжевой экстракт (―Sigma‖). ДМСО (ООО «Химмед»). NaCl (ООО «Химмед»). KCl (ООО «Химмед»). MgCl2x6H2O (ООО «Химмед»). MgSO4x7H2O (ООО «Химмед»). Антибиотики: ампициллин, зеоцин. Полимер ПГБ. Набор для определения старых клеток в культуре (―Sigma‖). Мыши линии С57ВL/6. Перичная культура: МСК мыши. Штамм Azotobacter chroococcum 7Б. 44 TM Нейлоновые фильтры с диаметром пор 100 мкм (―BD Falcom ‖). Культуральные чашки Петри Ø 3,5 см, 10 см, 15 см (―Greiner‖). 2 2 2 Флаконы культуральные 25 см (50 мл) , 75 см (250 мл) , 175 см (750мл) (―Greiner‖). Пробирки культуральные 15 мл, 50 мл (―Greiner‖). Химическая лабораторная и мерная посуда (Россия). Серологические пипетки на 5 мл, 10 мл и 15 мл. (―Greiner‖). Наконечники для одноканальных дозаторов с фильтром и без фильтра объемом 0,5–10 мкл, 5–50 мкл, 20–200 мкл, 100–1000 мкл, (―Eppendorf‖). Дозаторы пипеточные одноканальные 0,5–10 мкл, 5–50 мкл, 20– 200 мкл, 100–1000 мкл, (―Eppendorf‖). Камера Горяева («ПанЭко»). Вискозиметр капиллярный ВПЖ-2, Ø капилляра 0,56 мм («НПП Биомер»). Дозатор для серологических пипеток электронный Profiller 446 (―Socorex‖). Центрифуга настольная (―Eppendorf‖). Центрифуга напольная (―Eppendorf‖). Амплификатор («Eppendorf»). фотоаппарат цифровой (―OLUMPUS‖). Штангенциркуль (―KRINO‖). Весы лабораторные технические PN 163 (―Mettler‖). Термостатируемая качалка Innova 4000 (―NEW BAUNWICK SCIENTIFIC‖). Мешалка магнитная MR 3001K (―Heidolph‖). Холодельник бытовой (―Indesit‖). Термостат NAPCO модель 1535 (―VWR company‖). СО2/О2 инкубатор (―Sanyo‖). Водяная баня TW-2 (―SRY Sine‖). 45 Ламинарный шкаф (―AMC‖). Световой микроскоп (―OLUMPUS‖). Световой микроскоп Биомед 1 Вар.2 («Биомед»). Цифровой окуляр MYscope 300M (―Webbers‖). Проточный цитометр Gallios (―Beckman-Coulter‖). Конфокальный микроскоп. Дифференциальный сканирующий калориметр DSC 204 F1 Phoenix (―Netzsch‖). Сканирующий электронный микроскоп Supra 50 VP LEO с системой микроанализа INCA Energy + Oxford (―LEO Carl Zeiss SMT Ltd‖) Аквадистиллятор ДЭ-4 модель 737 (―Красногвардеец‖). Спектрофотометр СФ-2000 ОКБ («СПЕКТР»). УФ-тpaнcиллюминaтope («СПЕКТР»). 2.2. Объекты исследования 2.2.1. Мезенхимальные стволовые клетки мыши В работе исследовали мезенхимальные стволовые клетки мыши линии С57ВL/6, полученные из подкожной жировой ткани. В качестве доноров использовались здоровые мыши-самки в возрасте 2-х месяцев. Мыши были получены из питомника РАН Столбовая. Получение мезенхимальных стволовых клеток мыши из жировой ткани. Для получения жировой ткани мышь умерщвлялась методом мануальной дислокации шейных позвонков. Далее для предупреждения бактериальной и грибковой контаминации все этапы выделения проводились в стерильных условиях. Шерстный покров области выделения жировой ткани обрабатывали 70% этиловым спиртом. Стерильными 46 ножницами и пинцетом жировую выделяли из мыши и переносили на 2–5 сек в 70% раствор этанола, а затем на 5–10 мин в культуральную среду для выделения МСК. Жировую ткань, полученную из брюшной полости мыши, переносили в чашку Петри диаметром 6 см со свежей средой, далее ткань мелко измельчали стерильными ножницами и аккуратно переносили в 15 мл пробирку со средой ДМЕМ с коллаганазой тип IА 2 мг/мл и 10кратными атибиотиками (пенстреп и фунгизон), инкубировали 30–40 мин при температуре +37 0 С на термостатируемой качалке. После этого пипетировали 10 мл пипеткой 50–60 раз до полного их суспендирования. Состав среды ДМЕМ для выделения МСК, г/л: коллагеназа тип А — 2,0; пенициллин — 100000 ЕД; стрептомицин — 0,1; фунгизон — 0,0025; глюкоза — 100 г. Для разделения клеток от фрагментов ткани после инкубации клетки пропускали через нейлоновый фильтр с диаметром пор 100 мкм, а затем центрифугировали в среде ДМЕМ при 367 g 7 мин трижды. Каждый раз супернатант удаляли, клеточный осадок суспендировали в новой среде ДМЕМ, не содержащей коллагеназу. Клетки нулевого пассажа рассеивали на чашки Петри диаметром 10 см и культивировали среде ДМЕМ при +37 0 С в инкубаторе в условиях гипоксии (5% СО2, 5% О2) в течение 4–6 дней до 70–80% конфлюэнтности для последующих экспериментов. Среду меняли через каждые 3 дня. Состав среды ДМЕМ для культивирования МСК, г/л,: ФБС — 100 мл; пенециллин — 100 000 ЕД; стрептомицин — 0,1; глутамин — 0,3; глюкоза — 1000. 47 Был получен биополимерный матрикс из ПГБ с характеристиками, подходящими для культивирования на нем клеток. Исследовали долговременное культивирования МСК мыши на матриксе из основе поли3-гидрокси бутирата, синтезированными микробиологическим путем, а также скорость пролиферации клеток. 2.2.2. Полимерный матрикс Был получен биополимерный матрикс из ПГБ с характеристиками, подходящими для культивирования на нем клеток. 2.2.2.1. Культурально-морфологические признаки штаммов Azotobacter chroococcum 7Б Штамм Azotobacter chroococcum 7Б относится к грамотрицателым, клетки овальные, крупные, размером 2–2,5 × 3,5–5 мкм. Молодые клетки имеют жгутики и фимбрии, что позволяет им передвигаться. В процессе старения клетки становиться полиморфными, соединяются в цепочки и объединяются в нитчатые формы. С возрастом в цитоплазме накапливаются гранулы ПГБ, они образуют агрегаты, осаждаются с образованием плотного осадка. В покое они образуют цисты и слизистые капсулы. Стадия покоя характеризуется образованием цист и слизистых капсул. Колонии на агаризованной среде Эшби — полупрозрачные, беловатые, слизистые, со временем приобретают черный или темно-бурый цвет. В качестве питания используют уксусную, лимонную и пропионовую кислоты, глюкозу, сахарозу, фруктозу, маннит, галактозу, мальтозу, крахмал. 48 Этот штамм относится к облигатным аэробам. Фиксирует атмосферный азот, использует нитратный азот. Растет при температуре в пределах от +10 бактерий от 0 С до +40 +28 0 С до 0 С, оптимальная температура для роста +32 0 С. Оптимальные условия для 0 микробиологического синтеза ПГБ: +30 С и рН 7,2. 2.2.2.2. Получение поли(3-гидроксибутирата) микробиологическим методом ПГБ был получен микробиологическим синтезом штаммом Azotobacter chroococcum 7Б. Штамм культивировали при температуре 0 +28 С на протяжении двое суток на твердоагарной среде Эшби. Состав агаризованной среды Эшби (г/л): MgSO4 — 0,2; К2НРО4 — 0,2; NaCl — 0,2; CaCO3 — 5,0; агар — 20; сахароза —20; Na2MoO4·2H2O — 0,006. Далее штамм-продуцент ПГБ Azotobacter chroococcum 7Б пересевали в жидкую среду Берка, обогащенную избыточным содержанием углерода для того, чтобы получить биомассу с высоким выходом ПГБ. Клетки выращивали в колбах на термостатируемой качалке при температуре +30 °С, 180 об/мин в течение 48 часов. Состав жидкой среды Берка (г/л): сахар — 20; CaCl2 — 0,1; KH2PO4 — 0,2. FeSO4·7H2O — 0,01; 49 МgSO4·7H2O — 0,4; цитрат натрия — 0,5; K2HPO4·3H2O — 1,05; Na2MoO4·2H2O — 0,006. Сухой вес клеток Azotobacter chroococcum 7Б определяли, высушивая образцы при +60 °С до постоянного веса. В бактериальных клетках количество ПГБ определяли путем его экстракции хлороформом, с последующим удалением растворителя и высушиванием полимера до постоянного веса при +60 °С. 2.2.2.3. Выделение и очистка полимера из биомассы Для получения сухой биомассы, суспензию центрифугировали, супернатант удаляли. К осадку для промывки добавляли чистый изопропанол и перемешивали в течение 3 часов до однородной массы. Эту процедуру повторяли дважды. Затем биомассу тщательно отжимали и тонкими слоями сушили в сушильном шкафу при +60 °С. Сухой материал измельчали. Для того что бы получить раствор ПГБ, полимер экстрагировали из сухой биомассы хлороформом путем нагревания его в течение 2 часов при температуре +35–40 °С. После этого полимер фильтровали, для того чтобы удалить не растворенный материал, потом упаривали. Для очищения ПГБ к полученному раствору добавляли изопропанол в двойном объеме, получались белые хлопья полимера. Массу охлаждали и держали 4–6 часов. Потом полимер тщательно отжимали на фильтре и промывали изопропиловым спиртом. Для высокой степени чистоты полимера, процедуру отмывки повторяли три раза. Отжатый белый гель 0 сушили в сушильном шкафу при температуре +55–65 С. 50 2.2.2.4. Определение молекулярной массы поли(3- гидроксибутирата) Молекулярную массу ПГБ определяли визкозиметром ВПЖ-2. В вискозиметр заливали 10 мл раствора и помещали в вертикальном положении в термостат на 15–20 мин. Вязкость измеряли при температуре +30 °С. Время истечения полимера с различными концентрациями в хлороформе определяли из 5–6 концентраций. Исследуемые образцы содержали концентрацию полимера в пределах 50–200 мг в 100 мл хлороформа. Время истечения составляло от 40 до 115 сек. Удельную вязкость рассчитывали по формуле: уд=(t – t0) / t0 , где t0 — время истечения растворителя, сек; t — время истечения раствора полимера, сек. Молекулярную массу вычисляли по уравнению Марка–Хаувинка– Куна, используя следующие коэффициенты: -5 0,82 [] = 7,7∙10 ∙М [116]. Точность молекулярной массы, вычисленной по уравнению Марка– Хаувинка– Куна, составляет 2–5 % [117]. 2.2.2.5. Определение содержания поли(3-гидроксибутирата) в клетках по Зевенхаузену Клеточную суспензию центрифугировали при 5000 g 20 мин. Супернатант удаляли, к осадку добавляли 10 мл воды, клетки гомогенизировали. Затем к 2 мл суспензии клеток добавляли 2М HCl и о нагревали 2 часа при 100 С на водяной бане. После нагревания оставались нерастворимые остатки — гранулы ПГБ, к ним приливали 5 мл хлороформа и плотно закрытые пробирки оставляли на ночь на о термостатируемой качалке при 28 С. Далее пробирки центрифугировали и 51 к 100 микролитрам хлороформного экстракта прилили 5 мл H2SO4конц и нагревали 10 мин на водяной бане. Количество кротоновой кислоты, после охлаждения, которая образуется в результате кислотного гидролиза ПГБ, определяли на спектрофотометре. Для измерения использовали кювету 1 см, длина волны при измерении 235 нм, в качестве контроля выступала концентрированная серная кислота. 2.2.2.6. Физико-химические свойства поли(3-гидроксибутирата) В работе был использован полимер со следующими свойствами: Химическое название полимера: поли(3-гидроксибутират), поли-β-оксибутират или полиэфир D(-)-3-гидроксимасляной кислоты. Цвет: белый с желтоватым оттенком. Растворимость: хорошо растворим в хлороформе, дихлорметане, диметилхлорамине; плохо растворим в диоксане, пиридине; нерастворим в воде, метаноле, этаноле, гексане, бензоле, ацетоне. Температура плавления: +170–180 С. Температура деградации: 240–280 С. Плотность: 1,15–1,30 г/см . Степень кристалличности 60–75%. Чувствительность к кислороду воздуха: устойчив. Чувствительность к свету: устойчив. Токсичность: нетоксичен. Биодеградация: в организме человека сначала разлагается до 3 3-оксимаслянной кислоты, далее до СО2 и воды, (было показано в работе Бонарцева А.П. в 2012 г.) Стерилизация: термообработка, дезинфицирующие растворы, -радиация дозой 5 мрад. 52 Условия хранения: в стеклянных банках или в полиэтиленовых мешках, в нормальных условиях хранения при комнатной температуре. 2.3. Изготовление полимерных матриксов При получении матриксов на основе ПГБ нужной формы и внутренней микроструктуры использовали метод порообразования с помощью карбоната аммония, который использовался, как газообразователь. Карбонат аммония массой 0,1 г измельчали в ступке и помещали в чашку Петри диаметров 5 см, далее добавляли 4 мл 3% раствора полимера в хлороформе и дожидались полного испарения растворителя. Затем чашку Петри помещали в стакан с дистиллированной водой при нагревании, для того что бы газообразования полностью прекратилось. После чего полученную пористую мембрану промывали 5 раз дистиллированной водой и высушивали. 2.4. Исследование морфологии и пористости матриксов Первичное изучение геометрии поверхности полученных структур проводилось с помощью световой микроскопии с цифровым окуляром MYscope 300M. Микрофотографии методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) получены на микроскопе Supra 50 VP LEO с системой микроанализа INCA Energy и Oxford с ускоряющим напряжением 20 кВ и максимальным разрешением 10 нм. Предварительно образцы были подготовлено согласно стандартной напыления. процедуре с использованием процедуры углеродного 53 Пористость мембран рассчитывалась по формуле: m Р1 мемб V 100% , мембПОБ где mмембр — масса мембраны после высушивания, Vмемб — объем мембраны, вычисленный исходя из линейных размеров, полученных с помощью штангенциркуля, ПОБ — средняя плотность полимера, равная 3 1,26 г/см . Размер пор определяли по данным СЭМ, а также по данным световой микроскопии с помощью программного обеспечения «Cool Ruler». 2.4.1. Исследование физико-термических свойств матриксов методом дифференциальной сканирующей калориметрии Исследование теплофизических характеристик мембран (измерение температур плавления и кристаллизации, теплоты плавления и кристаллизации, вычисление степени кристалличности) проводили с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с использованием калориметра DSC 204 F1 Phoenix. Скорость сканирования составляла 10°/мин в атмосфере азота, масса образца полимера составляла около 5 мг. Калибровка приборов осуществлялась по набору для калибровки стандарту Netzsch In (индий) (Тпл=156,6 °С). При определении степени кристалличности использовали теоретическое значение теплоты плавления 100% кристаллической фазы ПГБ, равную 146,6 Дж/г [118, 119]. 2.4.2. Исследование механических свойств полимерныхматриксов Исследования механических свойств полимерных матриксов были проведены при помощи разрывной машины системы Synergie 400 (MTS Systems Corporation, США). Образцы подвергали растяжению и измеряли изменение нагрузки. Измерения были проведены при комнатной 54 температуре. Высчитывали параметры модуля Юнга и максимального растяжения на разрыв. 2.4.5. Исследование гидрофильности полимерных матриксов Матриксы были разрезаны на образцы 10×10 мм, предварительно высушенных при температуре 37 °C и относительной влажности 10% в течение 1 недели, масса образцов до эксперимента не изменялась. После полного насыщения паров воды содержание воды была подсчитана на основе разницы образца до и после набухания. Процент поглощения воды рассчитывали, используя следующее уравнение: WU% = (Ww-Wd) × 100 % Wd где: WU% — поглощение воды (%), Wd и Ww — суть веса образца матрикса до и после погружения в условиях повышенной влажности, соответственно. Испытуемые образцы помещали в контейнер с относительной влажностью 75±5%, поддерживаемую при температуре 37±0,5 °C. После вынимания матриксов из контейнера их сразу же взвешивали, а затем сушили в эксикаторе при комнатной температуре до тех пор, пока не была достигнута постоянная масса. 2.5. Культивирование МСК мыши на матриксе Перед посевом МСК мыши на матрикс его промывали один раз дистиллированной водой и стерилизовали в 70% этаноле 1 час, далее облучали ультрафиолетом 2 часа по одному часу на каждую сторону матрикса. Клетки с матрикса после культивирования снимали в однократном растворе TrypLE Express, предварительно удалив среду, затем 55 промывали 3 раза ФСБР. В однократном растворе TrypLE Express клетки о инкубировали 10 мин при тепературе +37 С. Снятые клетки промывали 1 раз центрифугированием в среде DMEM 7 мин при 367 g и суспендировали в ФСБР. Для подсчета клеток их окрашивали трипановым синим и считали в камере Горяева. 2.5.1. Фенотипирование МСК мыши методом проточной цитометрии Для характеризации поверхностного фенотипа МСК, культивированных на чашках Петри (без матрикса) и с матриксом, клетки в 5 количестве 1×10 суспендировали в 100 мкл PE буфера (2 мМ ЭДТА, 0,5% эмбриональная бычья сыворотка, ФСБР) и инкубировали с флюоресцентномечеными антителами против поверхностных маркеров мыши CD29, CD44, CD105, CD45, CD11b и CD34 в темноте в течение 40 о мин при температуре +5 С. Клетки отмывали центрифугированием один раз в ФСБР и анализировали на проточном цитометре Gallios (BeckmanCoulter). Анализ результатов и построение диаграмм проводили с помощью программы Flowing Sofrware 2.5.1. 2.5.2. Определение старых МСК мыши методом окрашивания на β-галактозидазу Окрашивание клеток на β-галактозидазу делали по прилагаемой инструкции к набору. Из чашек Петри удаляли культуральную среду, клетки промывали раствором ФСБ, затем фиксировали в 4% растворе формальдегида в ФБС 5–10 мин при комнатной температуре. Раствор формальдегида добавляли в объеме 1,5 мл на чашку Петри диаметром 3,5 см. Далее промывали 2–3 раза раствором ФСБ. Далее добавляли 1 мл окрашивающего раствора на чашку Петри диаметром 3,5 см и инкубировали 5–6 часов (можно и всю 56 0 ночь) в СО2 инкубаторе при температуре +37 С. Затем подсчитывали окрашенные старые увеличением 4×0,19. клетки при помощи световой микроскопии Для длительного хранение в чашки Петри добавляют 70% глицерола 0 и хранят при температуре + 2…+ 8 С. Приготовление окрашивающего раствора: 1 мг/мл Х-Gal; 2 мМ MgCl2; 5 мМ K3Fe(CN)6; 5 мМ K4Fe(CN)8×3H2O. Готовится свежим, сразу перед добавлением в чашки Петри. 2.5.3. Направленная дифференцировка МСК мыши в остеоогенную и адипогенную дифференцировку Для направленной дифференцировки использовались МСК мыши от третьего пассажа. Клетки культивировали в чашках Петри диаметром 10 см в условиях гипоксии до 80% монослоя, затем клетки снова пересеивали и культивировали до 3-го пассажа. Среду меняли через каждые три дня. На третьем пассаже клетки культивировали до 50–60% монослоя, затем переводили клетки на дифференцировочную среду. При остеогенной дифференцировки клетки культивировали 25 дней, среду меняли через каждые 3 дня. При адипогенной дифференцировки клетки культивировали две недели, среду меняли через каждые 2 дня. 57 Таблица 1 — Состав среды для направленной дифференцировки Компоненты ФБС Dexamethasone β-glycerophosphate Ascorbic acid Pen\Strep Glutamine Cреда α MEM ФБС Dexamethasone Insulin Pen\Strep Glutamine Cреда α MEM Остеогенная дифференцировка Конечная Сток раствор концентрация 10% -4 -8 10 M 10 M 1M 10 мM 0,2 M 0,2 мM Адипогенная дифференцировка 10% -4 -7 10 M 10 M 10 мкг/мл 5 мкг/мл Объем 4 мл 4 мкл 400 мкл 40 мкл 40 мкл 40 мкл до 40 мл 3 мл 30 мкл 60 мкл 3 мл 3 мл до 30 мл 2.5.4. Проверка МСК мыши, культивируемых на матриксе, на иммортализацию Чтобы проверить клетки на иммортализацию, МСК, растущие на матриксе в условиях гипоксии, пересевали на пластик и культивировали 2 при нормоксии. Клетки сеяли по 500 кл/см и пассировали через 5 дней, среду меняли через каждые 3 дня. 2.5.5. Микроскопия Для определения роста МСК мыши на пористом матриксе использовали микрофотографии, полученные при помощи: световой микроскопии — микроскоп СКХ 41 (Olympus, Япония) (клетки с матрикса пересеивали на культуральный пластик). сканирующей электронной микроскопии — микроскоп Quanta 200 3D (FEI Company, США). При конфокальной микроскопии удалось установить, что рост клеток наблюдается в объеме матрикса. 58 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Исследование полигидроксибутирата 3.1.1. Получение полигидроксибутирата Полимер ПГБ, который был использован для культивирования МСК мыши, был получен путем микробиологического биосинтеза с использованием штамма-продуцента A. chroococcum 7Б. На рис. 7 показана микрофотография культуры клеток, накапливающих ПГБ. При накоплении ПГБ клетки приобретают округлую форму [121, 122]. Рисунок 7 — Морфология штамма A. chroococcum 7Б: накапливающие ПГБ клетки Световая микроскопия Выход биомассы, содержащей полимер, составил 4,5±0,5 г/л, содержание ПГБ в расчете на сухую бактериальную массу составило 59 78,6±3,4%. Средняя молекулярная масса полимера составила 8,1×10 4. Степень чистоты полимера составила 99,5%. Затем, из очищенного препарата ПГБ получали пористые матриксы, показанные на рис. 8А, размером пор 170±30 мкм и пористостью 89±4%. На рис. 8Б видно, что поверхность мембран имеет множественные поры, соединенные между собой. Важно, что матриксы имеют систему сообщающихся и проницаемых пор для обеспечения подачи питательных веществ. Также важно, что структура такого матрикса должна быть трехмерной и иметь большое количество пор, которые способствует прикреплению, пролиферации стимуляции роста клеток в похожих на естественные условия in vitro. Такая структура еще способствует наработке внеклеточного матрикса. Важно учитывать механические свойства матрикса, которые должны соответствовать месту имплантации. А Б Рисунок 8 — Внешний вид полимерной пористой мембраны, использованной в работе (А), и ее микроструктура (Б) Придание импланту пористой трехмерной структуры также важно и для заместительной регенерации костной ткани in vivo [123, 124, 125]. Эксперимент был проведен в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН. 60 3.1.2. Термо-физические характеристики полигидроксибутирата Полученная на основании анализа термограммы ДКС, как показано на рисунках 9 и 10, таблицы 2, начальная температура плавления (Tm мембраны составила 151,1°С, температура пика плавления (Tm пик нач ) 0 ) 168,7 С. Рассчитанная степень кристалличности (Хс) ПГБ — 60,7 %. Все эти данные соответствуют физико-химическим характеристикам, ранее полученным для пленок из ПГБ [118]. Это говорит о незначительном влиянии метода порообразования с помощью газообразователя на физико-химические свойства полимера. Следовательно, можно допустить, что и биосовместимость самого полимерного материала ПГБ не подверглась значительным изменениям в ходе изготовления полимерной мембраны. Рисунок 9 — ДСК термограмма полимерного матрикса из ПГБ 61 Рисунок 10 — Термограмма биополимерного матрикса, полученная методом дифферициально сканирующей микроскопии 62 Таблица 2 — Физико-химические характеристики полимера ПГБ Температура плавления (нач. и пик.), Tmonset /Tmpeak, °C 151,1 / 168,7 Кристалличность, Xc, % 60.7 Модуль Юнга, ГПа Максимальное растяжение, % Водопоглощение,% 1,66 1,4 3.5 Эти данные соответствуют физико-химическим характеристикам полимера ПГБ. Таким образом, методика изготовления биополимерного матрикса не приводит к значительным изменениям физико-химических свойств полимерного материала. 3.2. Сравнение параметров роста МСК мыши на матриксе и пластике 3.2.1. Характеризация поверхностного фенотипа и направленная дифференцировка МСК Для проверки сохранения свойств МСК, культивируемых на матриксе, клетки культивировали на матриксе и культуральном пластике в течение 30 дней (10 пассажей) при гипоксии, после чего провели характеризацию их поверхностного фенотипа по нескольким наиболее употребительным позитивным и негативным маркерам МСК. Результаты этого анализа приведены на рис. 12 и в таблице 3. Таблица 3 — Анализ экспрессии дифференцировочных маркеров для МСК мыши. Тип маркера Позитивные Негативные Маркеры CD 29 CD 44 CD 105 CD 34 CD 11b CD 45 Пластик 90,5% 98,2% 36,4% 1% 0,9% 1,0% Матрикс 94,4% 97,4% 42,2% 0,4% 1,1% 1,9% На пластике На матриксе На пластике На матриксе На пластике На матриксе На пластике На матриксе На пластике На матриксе На пластике Рисунок 12 — Анализ с помощью проточной цитометрии поверхностного фенотипа МСК, культивированных на пластике (левая колонка) и матриксе (правая колонка) Название анализируемого маркера указано под каждой диаграммой. Горизонтальные планки показывают анализируемую область, выбранную исходя из цитометрического профиля неокрашенных клеток, цифры над планкой показывают процент клеток, попадающих в анализируемую область. Горизонтальная ось показывает интенсивность флюоресценции (логарифмическая шкала), вертикальная ось — число событий. 63 На матриксе 64 Полученные данные свидетельствуют, что картина экспрессии поверхностных маркеров культивируемых МСК соответствует литературным данным. В частности, подавляющее большинство МСК красились антителами к CD29 и CD44, являющимися позитивными маркерами; в то же время окраска негативными маркерами CD45 CD34 и CD11b отсутствовала. По маркеру CD105 культивируемые клетки оказались гетерогенными, что также согласуется с литературными данными [148]. Существенных различий по поверхностному фенотипу контрольными МСК, культивированными на пластике, и МК, культивированными на поли-3-оксибутиратном матриксе, между не было обнаружено, что свидетельствует о том, что основные свойства МСК при культивировании на матриксе не меняются. Также смотрели свойства МСК с помощью направленной дифференцировки в остеобласты и адипоциты (рис. 13). Для направленной дифференцировки брали МСК от 3-его пассажа. А Б Рисунок 13 — Направленная дифференцировка МСК мыши: А — адипогенная дифференцировка; Б — остеогенная дифференцировка На рисунке видно, что мезенхимальные стволовые клетки мыши способны дифференцироваться направлении в остеогенном и адипоцитогенном 65 3.2.2. Изучение скорости пролиферации МСК мыши на матриксе из ПГБ и культуральном пластике Исследование in vitro проводились на МСК мыши, выделенных из жировой ткани мышей. На рис. 14 представлены клетки, которые были получены из жировой ткани. А Б В Рисунок 14 — Клетки мыши, полученные из жировой ткани: А — Мышь С57BL/6, Б— жировая ткань, В – МСК 66 Для изучения насколько матрикс из ПГБ применим для размножения клинически релевантных типов клеток, был проведен эксперимент по проверке долговременного культивирования и поддержания МСК мыши на матриксе в культуре. В качестве объекта тестирования были выбраны клетки мыши, поскольку они более сложны в культивировании, отличаются высокими требованиями к параметрам культуры, чем МСК других видов. МСК мыши нужно культивировать в условиях гипоксии, поскольку окислительный стресс у этих клеток вызывает репликативное старение, и они перестают размножаться в отличие от МСК человека и крысы, которые могут расти в условиях нормоксии [126, 127]. Первый эксперимент проводили в стандартных условиях 2 культивирования для МСК мыши. Клетки сеяли плотностью по 500 кл/см . Пересевы на новый матрикс проводили через каждые 4–6 дней, среду меняли через каждые три дня. Скорость роста клеток на матриксе показала, что в начальный период (около одного месяца) скорость пролиферации МСК была в основном постоянной, затем наблюдалось постепенное снижение скорости роста, которая выражалась отклонением кривой роста от прямой линии вниз (рис. 15). Такое поведение наблюдается у большинства первичных клеток, в том числе и МСК, и является одним из основных явлений репликативного старения первичных клеток в культуре. За время данного эксперимента культура прошла более 65 популяционных делений. Это является показателем высокой эффективности матрикса из ПГБ для культивирования МСК мыши, поскольку в культуре число делений МСК разных видов, в том числе и человека, в основном ниже и редко превышают значения 40–50 [128, 129, 130]. По другим литературным данным, МСК в культуре могут пройти до 20 удвоений, при этом у клеток 67 не теряется способность к дифференцировке и пролиферации. Но при последующих удвоениях рост клеток постепенно уменьшается и также снижается дифференцировочный потенциал. Рисунок 15 — Зависимость числа популяционных делений МСК мыши от времени культивирования на полиоксибутиратном матриксе (черная линия и точки соответствуют пересевам на новый матрикс) Клетки культивировали в среде DMEM с 10% сывороткой теленка в условиях гипоксии (5% О2), пересевы проводили через 4–6 дней. В течение первого месяца скорость размножения клеток была практически постоянна, а затем начала постепенно снижаться. Прямая серая линия отображает теоретическую зависимость числа делений МСК от времени в отсутствие их репликативного старения в культуре. В следующих двух экспериментах проводилось сравнение параметров роста МСК мыши пластике с разными плотностями клеток в течение 1, 3 и 5 дней в пределах одного пассажа в условиях гипоксии (5% 2 2 О2). В этом эксперименте мы сеяли по 200 кл/см и 500 кл/см (рис. 16). Данные опыты мы проводили на протяжении двух месяцев, каждый эксперимент ставили по 4 раза в трех повторностях. 68 А Б Рисунок 16 — Культивирование клеток с разными плотностями: 2 2 А — 200 кл/см ; Б — 500 кл/см . Клетки культивировали на пластике в среде DMEM с 10% сывороткой теленка в 2 условиях гипоксии (5% О2). При посеве клеток 200 кл/см и культивировании в пределах 3 дней дало лучшие результаты по сравнению с другими условиями. Полученные нами результаты согласуются с литературным данным [131, 132]. Так, в нашем исследовании было показано, что плотность пассажа влияет на экспансию МСК и что оптимальные условия пролиферации клеток были получены при посеве МСК со средней плотностью (рис. 17); при этом клетки сохраняли свои свойства: колонениеобразующую активность, иммуносуспресивные свойства, дифференцировочный потенциал, а также сохраняли свои свойства. Затем посмотрели разницу в скорости клеточного деления на протяжении трех суток в пределах одного пассажа на матриксе и пластике, рисунок 13. По литературным данным [131], скорость пролиферации МСК в течение одного пассажа падает. Чтобы показать, скорость клеточного деления на матриксе и пластике, МСК культивировали в течение суток и наблюдали, что клетки на матриксе значительно быстрее делятся, чем в контроле. Затем посмотрели разницу в скорости клеточного деления на протяжении трех суток в пределах одного пассажа (рис. 18). Данные опыты 69 проводили в течение месяца, опыты повторяли по 4 раза в трех повторностях. Рисунок 17 — Культивирования МСК мыши на матриксе и пластике в течение суток Рисунок 18 — Сравнение скорости клеточного деления МСК мыши на культуральном пластике и матриксе на протяжении 3 суток в пределах одного пассажа Здесь мы видим, небольшое увеличение роста клеток на матриксе по сравнению с пластиком. Мышиные МСК делятся с разной скоростью на протяжении одного пассажа, особенно в течение первых суток. Возможно, это связанно с контактным торможением роста клеток. Очевидно, что короткие пассажи, к примеру каждые 3 дня, более эффективны с точки зрения скорости размножение культуры и наработки мышиных МСК. Но 70 при совсем коротких пассажах клетки могут подвергаться окислительным стрессам. Далее для основного эксперимента по сравнение параметров роста клеток в 2D- и 3D-культивирования были выбраны оптимальные условия 2 посева клеток: 200кл/см и пассирование через каждые 3 дня. 2 Для этого опыта клетки каждый раз пересеивали по 200 кл/см на новый матрикс через каждые три дня. В качестве контроля клетки культивировали на пластике — в культуральных чашках Петри без матрикса (рис. 19). А Б Рисунок 19 — Скорость деления клеток в условиях гипоксии на матриксе и пластике. МСК мыши при культивировании в среде ДMEM с 10% сывороткой теленка в условиях гипоксии (5% О2): А — число популяционных делений; Б — логарифмическая зависимость Пересевы проводили через 3 дня. В течение первого месяца скорость деления клеток была практически одинакова, затем деление клеток стало постепенно снижаться. В контроле замедление происходило быстрее, чем на матриксе, p<0,05. Полученные данные показали, что при культивировании МСК мыши наблюдается разница в параметрах роста клеток на матриксе и в контроле, 71 однако клетки на матриксе прошли больше популяционных делений (ПД), чем на пластике (94 и 85 ПД соответственно), как показано на рис. 19. При этом трансформация и иммортализация клеточной культуры не происходили [133]. 3.3. Сканирующая электронная и конфокальная микроскопия На фотографии, полученной с помощью светового микроскопа (рис. 20) показан внешний вид полимерной пористой мембраны, который был использован в работе. На микрофотографии, полученной методом электронной сканирующей микроскопии (рис. 21) хорошо видно, что поверхность матрикса из ПГБ высокопористая с хорошо разветвленной сетью, которые состоят из переплетенных полимерных тяжей. Рисунок 20 —. Внешний вид матрикса из ПГБ Такая пористая система может способствовать прикреплению и росту клеток, а также транспорту питательных веществ. Так же пористая сеть матрикса имитирует естественные условия для МСК, возможно эта структура защищает клетки от воздействия окислительного стресса. 72 Рисунок 21 — Микроструктура матрикса из ПГБ Фотография, полученная с помощью конфокальной микроскопии, показывает, что клетки растут в объеме матрикса (рис. 22). Клетки проникают в толщу матрикса, используя пористую и разветвленную сеть. Рисунок 22 — Трехмерная компьютерная модель полигидроксибутиратного матрикса с культивируемыми в нем МСК, полученная с помощью конфокальной микроскопии (фотография предоставлена кафедрой бионженерии) Как можно видеть на фотографиях, выполненных с помощью сканирующего электронного микроскопа, поверхность пористой сети, не является гладкой, имеются неровности и углубления (рис. 23). Возможно благодаря шершавой поверхности, клетки крепятся в толще канальцев. 73 А Б В Рисунок 23 — Разветвленная сеть матрикса из ПГБ при разных увеличениях: А — 100 µn; Б — 10 µn; В — 3 µn. Было показано, что интенсивность роста и высокая жизнеспособность прикрепившихся клеток, зависит от шероховатости поверхности материалов из ПГБ. Шероховатость поверхности является важным параметром, она влияет на прикрепляемость клеток, на абсорбцию белков, а также влияет на гидрофильность поверхности. По литературным данным известно, что для разных типов клеток требуются поверхности с различными остеобластов коэффициентами подходит шероховатости более — шероховатая к примеру, для поверхность с однонаправленной структурой [137], а для эпителиальных клеток подходит более гладкая поверхность, тогда как для роста фибробластов зеленой 74 мартышки линии СОS-1 оптимальной шероховатостью является диапазон от 25 до 97 нм, в то же время на гладкой поверхности они практически не росли [138]. Эти данные можно использовать для разработки медицинских изделий, например пародонтологические мембраны и хирургические заплаты в костной хирургии [133]. Так, был разработан костнопластический материал на основе ПГБ в альгинатном геле, который можно использовать в качестве наполнителя при устранении дефектов костной ткани [134,135]. Так же в одной работе было показано, что при применении аутологических МСК из жировой ткани в сочетании с интрамедуллярным остеосинтезом в зону перелома бедренной кости в проксимальном отделе, способствует стимуляции процессов регенерации в зоне повреждения, что приводит к более быстрому заживлению перелома [136]. На фотографиях, полученных сканирующей электронной микроскопии, что наибольшее число клеток было, когда МСК мыши культивировали в течение месяца, далее рост клеток стал снижаться (рис. 22–28). Можно видеть, что на объемных пористых матриксах у клеток более продолжительная динамика роста, как было описано выше. Рисунок 24 — Рост МСК мыши на матриксе: 1 пассаж.Клетки культивировались в течение трех суток, а затем пересеивались на новый 75 Рисунок 25 — Рост МСК мыши на матриксе: 5 пассаж. Клетки культивировались на матриксе в течение 2,5 недель Рисунок 26 — Рост МСК мыши на матриксе: 10 пассаж. Клетки культивировались на матриксе около месяца Рисунок 27 — Рост МСК мыши на матриксе: 5 пассаж. Клетки культивировались на матриксе полтора месяца 76 Рисунок 28 — Рост МСК мыши на матриксе: 19 пассаж. Клетки на матриксе культивировались около 2-х месяцев Клетки в объемных матриксах могут расти гроздьями или создавать второй слой в отличие от роста на культуральном пластике и на пленочных поверхностях, где после образования монослоя культура клеток быстро деградирует, клетки отслаиваются от поверхности и, в конце концов, погибают. Исходя из этих результатов, можно сказать, что матрикс из ПГБ обладает хорошими адгезивными свойствами, а также способствует быстрому росту и пролиферации клеток. Максимальное количество роста клеток, растущих на матриксе, было достигнуто на третий день культивирования клеток, что говорит о хороших биологических свойствах материала и данной конструкции в целом. 3.4. Влияние матрикса из ПГБ на размеры клеток В работе было исследовано, как культивирование МСК на матриксе влияет на размеры клеток, что актуально для клеточной терапии. В некоторых исследованиях было показано, что ввиду больших размеров культивируемых МСК при внутривенном введении они не могут проходить 77 по капиллярам. Большая часть клеток задерживается в легких и погибают там, что отрицательно сказывается на лечении [139, 140, 141]. Вероятно, что такая проблема является препятствием для введения МСК людям в терапевтических целях. Например, когда МСК вводили пациентам, то обнаруживали менее 1% клеток в органах мишенях. Такой же уровень приживления МСК был показан для лечения реакции «трансплантат против хозяина» [142, 143]. Вместо того чтобы клетки попадали в пораженные органы и ткани, они попадают в ловушку капилляров или микрососудов, в том числе артериол и посткапиллярных венул; скорее всего, это зависит от размеров МСК. Культивирование и увеличение количества клеток in vitro является необходимым шагом в клеточной терапии. Однако при введении МСК в кровь возникают проблемы застревания клеток в легких [144]. Нашими коллегами в лаборатории была проведена работа по выживанию МСК при разных способах введения при отслеживании динамики сигнала щелочной фосфатазы у животных. Было показано, что при внутривенном введении МСК мышам сигнал через 1 неделю составил 10% от исходных значений. Это свидетельствует о том, что клетки, задержанные в легких, не перераспределяются в другие органы и погибают. Тогда как при подкожном и внутримышечном введении уровень сигнала через 1 неделю составлял уже 20–40%, что доказывает перспективность локальной доставки МСК к месту повреждения [145]. В этом случае возникает еще одна проблема: локально доставить МСК можно не во все пораженные органы и ткани. Чтобы решить эти проблемы и уменьшить размеры МСК, было предложено культивировать их в виде сфероидов, что приводит к снижению их размеров [146]. 78 Для клеточной терапии этот метод тоже оказался малоэффективным, поскольку при культивировании в сфероидах, как показали исследования, значительная часть МСК гибнет. Однако, если культивировать клетки в сфероидах в малых количествах, то гибель клеток относительно невелика [140]. Но малые количества клеток не достаточны для лечения пациентов. Для решения этой задачи мы растили МСК мыши на матриксах из полигидроксибутирата, в качестве контроля клетки, также выращивали на обычном культуральном пластике. Размеры клеток измеряли проточной цитометрией со стандартными сфероидами. Было показано, что размеры клеток уменьшаются при культивировании на матриксе по сравнению с пластиком (рис. 29–32) , что весьма важно для клеточной терапии. Возможно, это еще связано с тем, что в матриксах клетки растут в объеме, иммитирующими естественную среду, по сравнению с культуральным пластиком, где клетки распластаны на поверхности. Рисунок 29 — Размеры стандартных сфероидов на проточном цитометре 79 Рисунок 30 — Пассаж 1. Клетки на матриксе и пластике культивировались трое суток. Как видно на рисунке, клетки, культивируемые на матриксе, уменьшились до 6 мкм, по сравнению с пластиком Рисунок 31 — Пассаж 10. Клетки на матриксах и пластике культивировались около месяца. Здесь видно, что клетки тоже уменьшаются в размерах 80 Рисунок 32 — Пассаж 19. Клетки культивировались около двух месяцев. На этом графике показано, что клетки свои размеры практически не поменяли Как видно из графиков, уменьшение размеров клеток происходило до 10-го пассажа включительно. Здесь можно предположить, что оптимальное время культивирование клеток для внутривенного введения составляет около месяца. 3.5. Влияние матрикса из ПГБ на старение клеток Также было еще исследовано старение МСК, культивируемых на матриксе. В качестве контроля выступали клетки, растущие на культуральном пластике. Было показано, что те клетки, которые росли на матриксе, подвергались старению медленнее, по сравнению с контролем (окраска на β-галактозидазу). После первого пассажа, который длился трое суток, клетки в двух группах не проявляли признаков старения. Признаки старения уже стали 81 проявляться на пятом пассаже у контрольной группы, после двух недель культивирования, а у опытной группы, на 8–9 пассаже, после месяца культивирования. Под конец эксперимента была видна существенная разница при окраске на β-галактозидазу (рисунок 33–37, таблица 3). Рисунок 33 — Пассаж 1. МСК культивировались 3 суток. Клетки, растущие на матриксе и пластике Рисунок 34 — Пассаж 5. МСК культивировались 2 недели. Клетки растущие на матриксе и пластике 82 Рисунок 35 — Пассаж 10. МСК культивировались месяц. Клетки, растущие на матриксе и пластике Рисунок 36 — Пассаж 15. МСК культивировались 1,5 месяца. Клетки растущие на матриксе и пластике, соответственно Рисунок 37 — Пассаж 19. МСК культивировались 2 месяца. Клетки, растущие на матриксе и пластике 83 Таблица 3 — Процентное содержание стареющих клеток, p<0,05 Пассаж 1 5 10 15 19 Матр. 0% 0% 1% 1% 10,6% Пласт. 0% 1% 2% 15,3% 40,2% Полученные данные показывают, что культивирование в условиях, более приближенных к естественным, способствует заметному снижению скорости старения культуры. Пористый матрикс, подобно антиоксидантам, способен нейтрализовать кислородный стресс, а клетки пролиферируют на нем дольше по времени и с меньшими повреждениями, чем на культуральном пластике. Полученные данные позволяют утверждать, что пористые матриксы на основе полигидоксибутирата культивирования мезенхимальных показаны стволовых для клеток, длительного а также их дифференцировки в различные типы клеток, что может быть использовано в дальнейшем для заполнения дефектов различных тканей и их регенерации. По нашему мнению, данный матрикс обладает такими биологическими свойствами, как биосовместимость, и поддерживает жизнеспособность клеток и их пролиферацию, что так же востребовано в качестве использования полигидроксибутирата при разработке медицинских изделий в стоматологии, кардиохирургии, ортопедии, челюстно-лицевой хирургии и в других областях. Данный материал на оcнoвe пoли-3-гидрокcибутирaтa целесообразно использовaть в качeствe твeрдой подложки, способной поддерживать оптимальное микроокружение для клеточной культуры. Таким образом, матриксы могут быть рекомендованы для выращивания МСК перспективой применения их в тканевой инженерии различных органов. с 84 3.6. Проверка МСК на иммортализацию Чтобы проверить клетки, культивируемые на матриксе, на иммортализацию, МСК с 19-го пассажа пересеяли на пластик и 2 культивировали в условиях нормоксии. Клетки сеяли по 500 кл/см и пассировали через 5 дней (рис. 38–39). А) Б) В) Г) Рисунок 38 — Клетки, культивируемые на матриксе 19 пассаж и пересеяны на пластик На пластике клетки культивировались в условиях нормоксии. А) 1 пассаж, Б) 2 пассаж, В) 3 пассаж, Г) 4 пассаж. 85 Рисунок 39 — График показывает замедление роста и гибель МСК мыши в условиях нормоксии Поскольку МСК мыши чувствительны к кислородному стрессу, то в условиях нормоксии, они через 3–4 пассирования перестают делиться и погибают, в зависимости от иммортализованных. На рис. 39 показано, что клетки в условиях нормоксии с каждым пассажем замедляются в росте и погибают, что свидетельствует о том, что клетки, культивируемые на пластике, не претерпевают трансформацию. 86 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенное нами исследование было направлено на изучение применимости полимерного матрикса на основе ПГБ, полученного микробиологическим путем синтеза штаммов Azоtоbаctеr chооcoccum 7Б, для рaзмoжeния клиничeски рeлeвaнтных типoв клeтoк для вoзмoжнoсти дoлгoврeмeнного пoддeржaния МСК мыши на матриксе в культуре. В кaчeствe тeстирoвaния были выбрaны МСК мыши, пoскoльку oни бoлее слoжны в культивирoвaнии, чeм МСК других видoв, и oтличaются высoкoй требoвaтeльнoстью к пaрaметрaм культуры. В ходе работы мы сравнивали параметры роста МСК жировой ткани мыши при длительном культивировании на культуральном пластике (2D) и на матриксе из полигидроксибутирата (3D). При этом трансформация и иммортализация клеточных культур не происходили. Были подобраны оптимальные условия культивирования клеток, которые могли бы быть пригодным для клеточной терапии и медицинских исследований. Культивирование МСК проводили в условиях гипоксии. В хoде экспeримeнтoв по дoлгoвременнoму культивирoвaнию клeтoк, впервые было показано, что культивирование МСК мыши на матриксе из полигидроксибутирата спoсoбствует зaмeтнoму снижeнию скoрoсти стaрeния культуры. Тaкжe былo пoкaзaнo, чтo сущeствeнных различий пo пoвeрхнoстнoму фeнoтипу мeжду кoнтрoльными МСК, культивирoвaнными нa плaстике, и МСК, культивирoвaнными нa пoли-(3гидрoксибутирaтнoм) мaтриксe, нe былo oбнaружeнo, чтo свидeтeльствуeт o тoм, чтo oснoвные свoйствa МСК при культивирoвaнии нa мaтриксe нe мeняются. Было выявлено, что при культивировании МСК мыши на матриксе, скорость пролиферации клеток увеличивалась, количество клеток также 87 увеличивалось по сравнению с контролем, когда клетки росли на культуральном пластике. Нaми былo пoкaзaнo, чтo нa oбъемных пoристых мaтрикaсaх нaблюдaлaсь бoлее прoдoлжительнaя динaмикa рoстa культуры, чeм нa культуральном пластике, в котором пocле oбpaзoвaния мoнoслoя культурa клeтoк быстрo дeгрaдируeт. Бoлee тoгo, трeхмeрный пoристый пoлигидрoксибутиратный мaтрикс, пo-видимoму, спoсoбeн зaщищaть МСК мыши oт кислopoднoгo cтpecca. Также было отмечено, что культивирование МСК на пористом матриксе, уменьшает их размеры, что существенно важно при внутривенном введении клеток в терапии. Из пoлучeнных в хoдe экспeримeнтa дaнныx cлeдуeт, чтo тpexмepный мaтрикс нa ocнoвe пoлигидрoксибутиpaтa является впoлнe пoдхoдящим субстpaтoм для дoлгoвpeмeннoгo культивирoвaния мышиных МСК и их 3D-рocтa в oбъeмe биoпoлимepнoгo мaтpикca и мoжeт с уcпexoм применяться в ткaнeвoй инжeнeрии для кyльтивирoвaния МСК чeлoвeкa в клиничeских цeлях. 88 ВЫВОДЫ Нa oснoвaнии пpовeдeнных иccледoваний и пoлученных рeзультaтов мoжнo сдeлaть слeдующие вывoды. 1. Нами получен биополимерный матрикс из ПГБ характеристиками, подходящими для культивирования на нем клеток. с 2. Впервые было показано, что при долговременном культивировании МСК мыши на пористом матриксе из ПГБ количество, скорость пролиферации клеток, а также продолжительность их культивирования увеличивалась по сравнению с контролем, различий по поверхностному фенотипу между контрольными и опытными МСК, не было обнаружено, также клетки не претерпевали трансформацию и иммортализацию, что свидетельствует от том, что основные свойства МСК при культивировании на матриксе не меняются 3. Впервые было показано, что МСК мыши при долговременном культивировании на биополимерном матриксе уменьшаются в размерах. 4. Впервые было показано, что 3D-культивирование МСК мыши на матриксе показало заметное снижение скорости старение в культуре. 89 Благодарности Работа выполнена при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных исследований (грант № 14-04-01855) и при финансовой поддержке ГК №№ 16.512.11.2019, 14.740.11.1077 и 16.740.11.0652 Министерства образования и науки РФ в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научнотехнологического комплекса России на 2007–2012 годы» и ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» и ГК № 12411.1008799.13.148 Министерства промышленности и торговли РФ в рамках ФЦП «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу 90 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ СК – стволовые клекти МСК – мезенхимальные стволовые клетки ПГБ – поли(3-гидроксибутират) ПГБВ – поли(3-гидроксибутират)-со-3-оксивалерат ПГА – полигидроксиалканоат ЕСМ – внеклеточный матрикс АФК – активные формы кислорода ФБС – фетальная бычья сыворотка TGF- – трансформирующей фактор роста ФСБР – фосфатно-солевой буферный раствор ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота СЭМ – сканирующий электронный микроскоп ДСК – дифференциальный сканирующий калориметр ПД – популяционные деления TAE – трис-aцeтaтный буфер 91 CПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Bougherara H., Bureau M., Campbell M. et al. Design of a biomimetic polymer-composite hip prosthesis // J. Biomed. Mater. Res. A. — 2007. — Vol. 82. — P. 27–40. 2. Auriat A.M., Rosenblum S., Smith T.N., Guzman R. Intravascular stem cell transplantation for stroke // Transl Stroke Res. A. — 2011— Vol. 3. — P. 250–265. 3. De Paula A.C, Zonari A.A., Martins T.M. et al. Human serum is a suitable supplement for the osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells seeded on poly-3-hydroxibutyrate-co-3-hydroxyvalerate scaffolds // Tissue Eng. Part A. — 2013. — Vol. 1–2. — P. 277–289. 4. Guarnieri D., Borselli C., Zeppetelli S. et al. Biomaterials. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation // Biomaterials. — 2005. — Vol. 26 (31). — P. 6194-6207. 5. Ross J., Li L. Recent advances in understanding extrinsic control of hematopoietic stem cell fate // Curr. Opin. Hematol. — 2006. — Vol. 13(4). — P. 237–242. 6. Battista S., Guarnieri D., Borselli C. et al. The effect of matrix composition of 3D constructs on embryonic stem cell differentiation // Biomaterials. — 2005. — Vol. 26. — P. 6194–6207. 7. Liu H, Roy K. Biomimetic three-dimensional cultures significantly increase hematopoietic differentiation efficacy of embryonic stem cells // Tissue Eng. —2005. — Vol. 11. — P. 319–330. 92 8. Li Y.J., Chung E.H., Rodriguez R.T. et al. Hydrogels as artificial matrices for human embryonic stem cell self-renewal // J. Biomed. Mater. Res. A. — 2006. — Vol. 79. — P. 1–5. 9. Liu H., Collins S.F., Suggs L.J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells // Biomaterials. — 2006. — Vol. 27. — P. 6004–6014. 10. Ishikawa I., Chikazawa Y., Sato К. Proteomic analysis of serum, outflowdialysate and adsorbed protein onto dialysis membranes (Polysulfone and PMMA) during hemodialysis treatment using SELDI-TOF-MS // Am. J. Nephrol. — 2006. — Vol. 26. — P. 372–380. 11. Hyuk Im S., Jeong U., Xia Y. Polymer hollow particles with controllable holes in their surfaces // Nat. Mater. — 2005. — Vol. 4. — P. 671–675. 12. Bougherara H., Bureau M., Campbell M. et al. Design of a biomimetic polymer-composite hip prosthesis // J. Biomed. Mater. Res. A. — 2007. — Vol. 82. — P. 27–40. 13. Zhang R., Bowyer A., Eisenthal R. A smart membrane based on an // antigen-responsive hydrogel Hubble J. Biotechnol. Bioeng. — 2007 — Vol. 97. — P. 976–984. 14. Kale A.A., Torchilin V.P. ―Smart‖ drug carriers: PEGylated TATp- modified pH-sensitive liposomes // J. Liposome Res. — 2007. — Vol. 17. — P. 197–203. 15. Zelikin A.N., Becker A.L., Johnston A.P. et al. A general approach for DNA encapsulation in degradable polymer microcapsules // ACS Nano. — 2007. — Vol. 1. — P. 63–69. 93 16. Мизина П.Г., Быков В.А., Настина Ю.И., Фоменко Е.А. Введение лекарственных веществ через кожу – достижения и перспективы (обзор) // Вестник ВГУ Сер. Химия. Биология. Фармация. — 2004. — T. 1. — C. 176–183. 17. Kipke D.R. Implantable neural probe systems for cortical neuroprostheses // Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc. — 2004. — Vol. 7. — P. 5344–5347. 18. Stevens LC. The development of transplantable teratocarcinomas from intratesticular grafts of pre- and postimplantation mouse embryos (review) // Dev. Biol. — 1970. — Vol. 21 (3). — P. 364–382. 19. Mintz B, Cronmiller C, Custer RP. Somatic cell origin of teratocarcinomas // Proc. Natl. Acad. Sci. USA .— 1978 — Vol. 75 (6) — P. 2834–2838. 20. Allison B.C., Applegate B.M., Youngblood J.P. Hemocompatibility of hydrophilic antimicrobial copolymers of alkylated 4-vinylpyridine // Biomacromolecules. — 2007— Vol. 8. — P. 2995–2999. 21. for Richter G.M., Stampfl U., Stampfl S. et al. A new polymer concept coating of vascular stents using PTFEP (poly(bis(trifluoroethoxy)phosphazene) to reduce thrombogenicity and late instent stenosis // Invest. Radiol. — 2005. — Vol. 40. — P. 210–218. 22. Dong W., Zhang T., McDonald M. et al. Biocompatible nanofiber scaffolds on metal for controlled release and cell colonization // Nanomedicine. — 2006. — Vol. 2. — P. 248–252. 23. Богданова Ю.Г., Должникова В.Д., Белов Г.П. и др. Прогнозирование биосовместимости полиолефинкетонов на основании 94 энергетических характеристик их поверхностей // Вестн. Моск. Ун–та. Сер. 2. Химия. — 2008. — Т. 49. — №5. — С. 316–322. 24. Meng W., Kim S.Y., Yuan J. et al. Electrospun PHBV/collagen composite nanofibrous scaffolds for tissue engineering // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. — 2007. — Vol. 18. — P. 81–94. 25. Holm V.K., Ndoni S., Risbo J. The Stability of Poly(lactic acid) Packaging Films as Influenced by Humidity and Temperature // J. Food Sci. — 2006. — Vol. 71. — P. 40–44. 26. Loo C.Y., Sudesh K. Polyhydroxyalkanoates: Bio–based microbial plastics and their properties // Malays. Polym. J. — 2007. — Vol. 2. — P. 31–57. 27. Миней Е.Дж. Металлы / Миней Е.Дж, Бокаччини А.Р. // Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей / Хенч Л., Джонс Д. — М.: Техносфера, 2007. — С. 22 – 33. 28. Штильман, М.И. Проспект НИИ конструкционных материалов на основе графита // М.И . Штильман / Полимеры медико-биологического назначения. — М.: ИКЦ «Академкнига», 2006. – С. 143. 29. Davidge R.W. Machanical Bahaviour of Ceramic / R.W. Davidge. — Cambridge: Cambridge Univ. Press. UK, 1979. 30. Pişkin E. Biomaterials in different forms for tissue engineering / E. Pişkin // Porous materials for tissue engineering / Dean-Mo Liu, Vivek Dixit Eds. Materials Science Forum. — 1997. — Vol. 250. — P. 1–14. 31. Волова Т.Г. Полиоксиалканоаты–биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая; под ред. aкад. В.И. Шумакова. — Красноярск: Платина, 2006. — 312 с. 95 32. Волова Т. Г. Полиоксиалканоаты–биоразрушаемые полимеры для медицины / Т.Г. Волова, В.И. Севастьянов, Е.И. Шишацкая; под ред. акад. В.И. Шумакова. — Красноярск: Платина, 2006. — 312 с. 33. Vunjak–Novakovic G., Scadden D.T. Biomimetic platforms for human stem cell research // Cell Stem Cell. — 2011. — Vol. 8 (3). — Р. 252–261. 34. Griffith L.G., Swartz M.A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. — 2006. — Vol. 7. — P. 211–224. 35. Burdick J.A., Vunjak–Novakovic G. Engineered microenvironments for controlled stem cell differentiation // Tissue Eng. Part A. — 2009. — Vol. 15. — P. 205–219. 36. Селвакумаран, Д. Основы культивирования клеток и использование клеточных культур для производства биоматериалов и инжиниринга тканей / Д. Селвакумаран, Г. Джелл // Биоматериалы, искусственные органы и инжиниринг тканей / Л. Хенч, Д. Джонс. – М.: Техносфера, 2007. — 244 с. 37. Lu H.F., Narayanan K., Lim S.X. et al. A 3D microfibrous scaffold for long–term human pluripotent stem cell self–renewal under chemically defined conditions // Biomaterials. — 2012. — Vol. 33 (8). — P. 2419–2430. 38. Fan Yang, Seung–Woo Cho, Sun Mi Son, Hudson S.P. Combinatorial Extracellular Matrices for Human Embryonic Stem Cell Differentiation in 3D // Biomacromolecules. — 2010. — Vol. 11(8). — P. 1909– 1914. 39. Daley WP, Peters SB, Larsen M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine // J. Cell. Sci. — 2008. — Vol. 121 (3). — P. 255–264. 96 40. Ma J., Holden K., Zhu J. et al. The Application of Three– Dimensional Collagen–Scaffolds Seeded with Myoblasts to Repair Skeletal Muscle Defects // J. Biomed Biotechnol. — 2011. — Vol. 2011. — P. 9. 41. Ma L., Zhou C., Lin B., Wei L. A porous 3D cell culture micro device for cell migration study / Biomed. Microdevices. Author manuscript. — 2010. — Vol. 12. — P. 753–760. 42. Cunha C., Panseri S., Villa O. et al. 3D culture of adult mouse neural stem cells within functionalized self–assembling peptide scaffolds // Int. J. Nanomedicine. — 2011. — Vol. 6. — P. 943–955. 43. Verlinden R.A., Hill D.J., Kenward M.A. et al. Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoates // J. Appl. Microbiol. — 2007. — Vol. 102. — P. 1437–1449. 44. Braunegg G., Lefebvre G., Genser K.F. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: physiological and engineering aspects // J. Biotechnol. — 1998. — Vol. 65. — P. 127–161. 45. Семчиков Ю.Д. Высокомолекулярные соединения / Москва. – Н. Новгород: НГУ «Академия». — 2003. — C. 368. 46. Ueda Н. Polyhydroxyalkanoate derivatives in current clinical applications and trials / H. Ueda, Y. Tabata // Adv. Drug Deliv. Rev. — 2003. — Vol. 55. — P. 501–518. 47. Nikel P.I., Almeida A., Melillo E.C. et al. New Recombinant Escherichia coli Strain Tailored for the Production of Poly(3–Hydroxybutyrate) from Agroindustrial By–Products // Appl. Environ. Microbiol. — 2006. — Vol. 72. — P. 3949–3954. 97 48. Lootz D., Behrend D., Kramer S. et al. Laser cutting: influence on morphological and physicochemical properties of polyhydroxybutyrate // Biomaterials. — 2001. — Vol. 22. — P. 2447–2452. 49. Kunze C., Freier T., Kramer S., Schmitz K.P. Anti–inflammatory prodrugs as plasticizers for biodegradable implant materials based on poly(3– hydroxybutyrate) // J. Mater. Sci. Mater. Med. — 2002. — Vol. 13. — P. 1051– 1055. 50. Волова Т. Г., Севастьянов В. И., Шишацкая Е. И.; под ред. акад. В.И. Шумакова. Полиоксиалканоаты–биоразрушаемые полимеры для медицины / Красноярск: Платина, 2006. — 321с. 51. Verlinden R.A., Hill D.J., Kenward M.A., Williams C.D., Radecka I. Bacterial synthesis of biodegradable polyhydroxyalkanoates // J. Appl. Microbiol. — 2007. — Vol. 102. — P. 1437–1449. 52. Jendrossek D. Fluorescence Microscopical Investigation of Poly(3– hydroxybutyrate) Granule Formation in Bacteria // Biomacromolecules. — 2005. — Vol. 6. — P. 598–603. 53. Uchino K., Saito T., Gebauer B., Jendrossek D. Isolated Poly(3– Hydroxybutyrate) (PHB) Granules Are Complex Bacterial Organelles Catalyzing Formation of PHB from Acetyl Coenzyme A (CoA) and Degradation of PHB to Acetyl–CoA // J. Bacteriol. — 2007. — Vol. 189. — P. 8250–8256. 54. Gebauer B., Jendrossek D. Assay of Poly(3–Hydroxybutyrate) Depolymerase Activity and Product Determination // Appl. Environ. Microbiol. — 2006. — Vol. 72. — p. 6094–6100. 55. Handrick R., Reinhardt S., Schultheiss D. et al. Unraveling the function of the Rhodospirillum rubrum activator of polyhydroxybutyrate (PHB) 98 degradation: the activator is a PHB–granule–bound protein (hasing) // J. Bacteriol. — 2004. — Vol. 186. — P. 2466–2475. 56. Kenar H., Kocabas A., Aydinli A., Hasirci V. Chemical and topographical modification of PHBV surface to promote osteoblast alignment and confinement // J. Biomed. Mater. Res. A. — 2008. — Vol. 85. — P. 1001–1010. 57. Kalbermatten D.F., Pettersson J., Kingham P.J. et al. New fibrin conduit for peripheral nerve repair // J. Reconstr. Microsurg. — 2009. — Vol. 25. — P. 27–33. 58. Hajiali H., Hosseinalipour M., Karbasi S., Shokrgozar M.A. The influence of bioglass nanoparticles on the biodegradation and biocompatibility of poly(3–hydroxybutyrate) scaffolds // Int. J. Artif. Organs. — 2012. — Vol. 35 (11). — P. 1015–1024. 59. Лившиц В.А., Бонарцев А.П., Иорданский А.Л. и др. Микросферы из поли–3–гидроксибутирата для пролонгированного высвобождения лекарственных веществ // Высокомолекулярные соединения. Серия Б. — 2009. — T. 51. — C. 1243–125. 60. Braunegg G., Lefebvre G., Genser K.F. Polyhydroxyalkanoates, biopolyesters from renewable resources: physiological and engineering aspects // J. Biotechnol. — 1998. — Vol. 65. — 127–161. 61. Cai H., Hu X.D., Yu D.H. et al. Combined DNA vaccine encapsulated in microspheres enhanced protection efficacy against Mycobacterium tuberculosis infection of mice // Vaccine. — 2005. — Vol. 23. — P. 4167–4174. 62. Lee S.Y. Bacterial polyhydroxyalkanoates (review) // Biotechnology and Bioengineering. — 1996 — Vol. 49. — P. 1–14. 99 63. Wu Q., Wang Y., Chen G.Q. Medical Application of Microbial Biopolyesters Polyhydroxyalkanoates // Artificial Cells Blood Substitutes and Biotechnology. — 2009. — Vol. 37. — P. 1 –12. 64. Tokiwa Y., Calabia B.P. Degradation of microbial polyesters (review) // Biotechnology Letters. — 2004. — Vol. 26. — 1181–1189. 65. Choi G.G., Kim H.W., Kim Y.B., Rhee Y.H. Biocompatibility of poly(3–hydroxybutyrate–co–3–hydroxyvalerate) copolyesters produced by Alcaligenes sp MT–16 // Biotechnology and Bioprocess Engineering. — 2005. — Vol. 10. — P. 540–545. 66. Zonari A. et al. Endothelial Differentiation of Human Stem Cells Seeded onto Electrospun Polyhydroxybutyrate/Polyhydroxybutyrate–Co– Hydroxyvalerate Fiber Mesh // PloS. One. — 2012. — Vol. 7. — P. 35422. 67. Жаркова И.И. и др. Влияние модификации поли-3-оксибутирата полиэтиленнгликолем на жизнеспособность клеток, культивируемых на полимерных пленках // Биомедицинская химия. — 2012. — T. 58. — C. 579–591. 68. Cochran D., Simpson J., Weber H., Buser D. Attachment and growth of periodontal cells on rough titanium // Int. J. Oral. Max. Impl. — 1994. — Vol. 9. — P. 289–297. 69. Жаркова И.И. и др. Биосовместимость матриксов для тканевой инженерии из поли–3–оксибутирата и его композитов, полученных методом электроформирования // Биомедицинская химия: научно– практический журнал. — 2014. — Т. 60. — С. 553–560. 70. Ribeiro–Samy S., Silva N.A., Correlo V.M. et al. Development and characterization of a PHB–HV–based 3D scaffold for a tissue engineering and 100 cell–therapy combinatorial approach for spinal cord injury regeneration // Macromol. Biosci. — 2013. — Vol. 13. — P. 1576–1592. 71. Novikova L.N., Pettersson J., Brohlin M. et al. Biodegradable poly– beta–hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair // Biomaterials. — 2008. — Vol. 29. — P. 1198–1206. 72. Marler J.J., Upton J., Langer R., Vacanti J.P., Transplantation of cells in matrices for tissues regeneration // Adv. Drug. Deliv. Rev. — 1998 — Vol. 33. — P. 165–182. 73. Boregowda S.V., Krishnappa V., Chambers J.W. et al. Atmospheric oxygen inhibits growth and differentiation of marrow–derived mouse mesenchymal stem cells via a p53–dependent mechanism: implications for long– term culture expansion // Stem Cells. — 2012. — Vol. 30. — P. 975–987. 74. Krishnappa V., Boregowda S.V., Phinney D.G. The peculiar biology of mouse mesenchymal stromal cells-oxygen is the key // Cytotherapy. — 2013. — Vol. 5. —P. 536–541. 75. Phinney D.G. Building a consensus regarding the nature and origin of mesenchymal stem cells (review) // Journal of Cellular Biochemistry. — 2002. — Vol. 38. — P. 7–12. 76. Pereira R.F., Halford, K.W., O’Hara, M.D. et al. Cultured adherent cells from marrow can serve as long–lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. — 1995. — Vol. 92 — P. 4857–4861. 77. Martins L., Martin P.K., Han S.W. Angiogenic properties of mesenchymal stem cells in a mouse model of limb ischemia // Methods Mol. Biol. — 2014. — Vol. 121. 1— P. 47–69. 101 78. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow–derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells // J. Cell Physiology. — 1998. — Vol. 176. — P. 57–66. 79. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues (review) // Science. — 1997. — Vol. 276. — P. 71–74. 80. Sekiya I., Larson B.L., Smith, J.R. , Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality // Stem Cells. —2002. — Vol. 20. — P. 530–541. 81. Annabi B., Lee Y.T., Turcotte S. Hypoxia promotes murine bone– marrow–derived stromal cell migration and tube formation // Stem Cells. — 2003. — Vol. 21. — P. 337–347. 82. Siddaraju V. et al. Atmospheric Oxygen Inhibits Growth and Differentiation of Marrow–Derived Mouse Mesenchymal Stem Cells via a p53Dependent Mechanism: Implications for Lon-–Term Culture Expansion // Stem. Sells. — 2012. — Vol. 30. — P. 975–987. 83. Fan G.et al. Isolation of mouse mesenchymal stem cells with normal ploidy from bone marrows by reducing oxidative stress in combination with extracellular matrix // BioMed Centra Cell Biology. — 2011. — Vol. 12 — P. 1–14. 84. условий Шаманская Т.В., Осипова Е.Ю., Румянцев С.А. Оптимизация культивирования мезенхимальных стволовых клеток применения в клинической практике (обзор) // АГ Инфо. — 2010. — T. 3. — С. 3–7. для 102 85. Da Silva L. et al. Murine marrow–derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization // British Journal of Haematology. — 2003. — Vol. 123. — P. 702–711. 86. Thomas B.L. Kirkwood Understanding the Odd Science of Aging (review) // Stem Cell. —2005. — Vol. 120. — P. 437–447. 87. West, J., Widschwendter, M., & Teschendorff, A. E. Distinctive topology of age–associated epigenetic drift in the human interactome // PNAS. — 2013. — Vol. 110. — P. 14138–14143. 88. Von Zglinicki T. Oxidative stress shortens telomeres (review) // Trends in biochemical sciences. — 2002. — Vol. 27. — 339–344. 89. Галицкий В.А. Эпигенетическая природа старения (обзор) // Цитология. — 2009. — Т. 51. — 388–397. 90. Estrada J.C. et al. Human mesenchymal stem cell–replicative senescence and oxidative stress are closely linked to aneuploidy // Cell Death and Disease. — 2013. — Vol. 4. — e. 691. 91. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies // Tissue Engineering. — 2001. — Vol. 7. — P. —211–228. 92. Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А. (под ред.) Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная биология и медицина. — М: РеМеТэкс, 2002. —225 с. 93. Зафранская М.М., Ламовская Н.В., Нижегородова Д.Б и др. Морфология, кинетика роста и фенотип мезенхимальных стволовых клеток костного мозга и жировой ткани человека // Иммунопаталогия, аллергология, инфектология. —2010. — T. — С. 86. 103 94. Фрешни Р. (под ред.) Культура животных клеток. Методы. — М.: Мир, 1989. —153 с.. 95. Глинских Н.П., Новикова И.А., Ронь Г.И., Устьянцев И.В. Композиция для лечения воспалительных заболеваний пародонта на основе клеточных культур: Патент РФ №2210352. — М., 2003. 96. Гольдштейн Д.В. и др. Биотрансплантат и способ лечения остеопороза: Патент РФ №2265442. — М., 2005. 97. Majumbar M.K., Banks V., Peluso D.P., Morris E.A. Isolition, characterization and chondrogenic potential of human bone marrowderived multipotential stromal cells // J. Cell Physiol. — 2000. — Vol. 185. — P. 98–106. 98. Feldmann R.E. et al. Stem cell proteomes: a profile of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood // Electrophoresis. — 2005. — Vol. 26. — P. 2749–2758. 99. Тепляшин А.С. Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток: Патент. РФ №2252252. — М., 2005. 100. Cipriani P. et al. Mesenchymal stem cells (MSCs) from scleroderma patients (SSc) preserve their immunomodulatory properties although senescent and normally induce T regulatory cells (Tregs) with a functional phenotype: implications for cellular–based therapy // Clin Exp. Immunol. — 2013. — Vol. 173. —195–206. 101. Мусина Р.А., Егоров Е.Е., Белявский А.В. Стволовые клетки: свойства и преспективы использование в медицине // Молекулярная биология. — 2004. — Т. 38. — С. 563–577. 104 102. Каршиева С.Ш., Красикова Л.С., Белявский А.В. Мезенхимные стволовые клетки как средство противоопухолевой терапии // Молекулярная биология. — 2013. — Т. 47. — С. 45–54. 103. Madjd Z., Gheytanchi E., Erfani E, Asadi–Lari M. Application of stem cells in targeted therapy of breast cancer: a systematic review // Asian Pac. J. Cancer Prev. — 2013. —Vol. 14. — 2789–800. 104. Tatullo M., Marrelli M., Paduano F. The Regenerative Medicine in Oral and Maxillofacial Surgery: The Most Important Innovations in the Clinical Application of Mesenchymal Stem Cells // Int. J. Med. Sci. — 2015. — Vol. 12. — P. 72–77. 105. Майбородин И.В., Дровосеков М.Н., Тодер М.С. и др. Регенерация поврежденной кости нижней челюсти крыс на фоне введения аутологических мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения // Фундаментальные исследования. — 2011. — Т. 9. — С. 264–269. 106. Соколова И.Б. Зинькова Н.Н., Билибина А.А., Кругляков П.В., Гилерович Е.Г., полынцев Д.Г. Отеллин В.А. Возмножности применения клеточной терапии при лечении ишемического инсульта в эксперементе // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — 2007. — Т. II — C. 54–62. 107. Cyranoski D. Canada approves stem cell product (review) // Nat. Biotechnol. — 2012. — Vol. 30. — P. 571. 108. Lindvall O., Kokaia Z. Stem cell research in stroke: how far from the clinic // Stroke. — 2011. —Vol. 42. — P. 2369–2375. 105 109. Ikegame Y. et al. Fate of graft cells: what should be clarified for development of mesenchymal stem cell therapy for ischemic stroke // Front. Cell Neurosci. — 2014. — Vol. 8. — P. 322. 110. Южаков В.В., Конапляников А.Г., Рошаль Л.М. и др. Дуйствия аутологических клеток на репаративные процессы в нервной ткани при диффузной ткани головного мозга крысы / Стволовые клетки и преспектива их использования в здравохранении: Тез. докл. Всеросийской межд. научной конференции. — 2007. — C. 18. 111. Половников Е.В., Ступак В.В., Самохин А.Г. и др. Влияние мезенхиальных стромальных клеток костного мозга и жировой ткани человека на эффективность восстановления неврологического деффецита в модели черепно–мозговых травм у крыс // Бюллетень ВСНЦ со РАМН. — 2012. — Т. 3. — С. 301–304. 112. Kang M. H., Park H.M. Evaluation of adverse reactions in dogs following intravenous mesenchymal stem cell transplantation // Acta. Vet. Scand. —2014. — Vol. 56. — P.16. 113. Akita S., Einada Y., Miyaki Y., Fugita H. Properties of poly(– hydroxybutyrate) as a solution // Macromol. — 1976. — Vol. 9. — P. 774–780. 114. Рафиков С.Р., Будтов В.П., Монаков Ю.Б. Введение в физико- химию растворов полимеров — М.: Наука, 1978. —328 с. 115. Bonartsev A.P. et al. The terpolymer produced by Azotobacter chroococcum 7B: effect of surface properties on cell attachment // PLoS ONE. — 2013. — Vol. 8. — Р. e57200. 106 116. Bonartsev A.P. et al. Cell attachment on poly(3–hydroxybutyrate)– poly(ethylene glycol) copolymer produced by Azotobacter chroococcum 7B // BMC Biochemistry. — 2013. — Vol. 14. — P. 12. 117. Андреева Н.В. и др. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток мыши на матриксах из поли(3–гидроксибутирата). Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2015. — Т. 159. — C. 567–571. 118. Мышкина В.Л., Иванов Е.А., Николаева Д.А. и др. Биосинтез сополимера поли–3–гидроксибутирата–3–гидроксивалерата штаммов Azotobacter chroococcum 7Б. // Прикладная биохимия и микробиология. — 2010. — Т. 46. — С. 315–323. 119. Троценко Ю.А., Белова Л.Л. Организация и регуляция биосинтеза полигидроксибутирата–валерата у бактерий // Микробиология. — 2000. — T. 69.— C. 753–763. 120. Сharles E., Carraher J. Carrantr’s Polymer Chemisty / Jenkins M (Ed): Biomedical polymers. — 2014. — P. 484. 121. Бонарцев А.П., Бонарцева Г.А., Шайтан К.В., Кирпичников М.П. Поли-3-оксибутират и биополимерные системы на его основе // Биомедицинская химия. — 2011. — T. 57. — C. 374–391. 122. Гажва Ю.В. и др. Разработка и исследование in vivo и in vitro на костно-платического материала на основе композиции гидроксиапатита, поли-3-оксибутирата и альгината натрия // Современные технологии в медицине. — 2014. — Т. 6. — С. 6–13. 107 123. Boregowda S.V., Krishnappa V., Chambers J.W. et al. Atmospheric oxygen inhibits growth and differentiation of marrow-derived mouse mesenchymal stem cells via a p53-dependent mechanism: implications for long– term culture expansion // Stem Cells. — 2012. —Vol. 30. — P. 975–987. 124. Krishnappa V., Boregowda S.V., Phinney D.G. The peculiar biology of mouse mesenchymal stromal cells – oxygen is the key // Cytotherapy. — 2013. — Vol. 5. — P. 536–541. 125. Moussavi–Harami F., Duwayri Y., Martin J.A. et al. Оxygen effects on senescence in chondrocytes and mesenchymal stem cells: consequences for tissue engineering // Iowa Orthop. J. — 2004. —Vol. 24. — P. 15–20. 126. Stenderup K., Justesen J., Clausen C., Kassem M. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells // Bone. — 2003. — Vol. 33. — P. 919–926. 127. Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains (review) // Exp Cell Res. — 1965. — Vol. 37 — P. 614–636. 128. Ichiro Sekia, Behjamin L. Larson, Jason R. Smith, Radhinka Pochampally, Jian–GuoCul, Darwin J. Prockop. Expansion of Human Adult Stem Cells from Bone Marrow Stroma: Conditions that Maximize the Yields of Early Progenitors and Evaluate Their Quality // Stem Cells. — 2002. — Vol. 20. — 530–541. 129. Colter D.C., Class R., Di Girolamo C.M., Prockop D.J. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic–adherent cells from human bone // PNAS. — 2000. — Vol. 97. — P. 3213–3218. 108 130. Zharkova I.I., Bonartsev A.P., Boskhomdzhiev A.P. et al. The effect of poly(3–hydroxybutyrate) modification by poly(ethylene glycol) on the viability of cells grown on the polymer films // Biomed Khim. — 2012. — Vol. 58. — P. 579–91. 131. Андреева Н.В., Бонарцев А.П., Жаркова И.И., Белявский А.В. Сравнение параметров роста МСК мыши в условиях 2D и 3D культивирования / Сборник тезисов. V всероссийская научно–практическая конференция. Стоволовые клетки и регенеративная медицина. — 2013. — С. 5. 132. Гажва Ю.В., Бонарцев А.П., Мухаметшин Р.Ф., Жаркова И.И. и др. Разработка и исследование in vivo и in vitro костно–пластического материала на основе композиции гидроксиапатита и поли-3-оксибутирата и альгината натрия // Современные технологии в медицине. — 2014. — Т. 6. — С. 6–13. 133. Иванов С.Ю., Гажва Ю.В., Мураев А.А., Бонарцев А.П. Использование мембранной техники для направленной регенерации костной ткани при хирургических стамотологических вмешательствах. // Современные проблемы науки и образования. — 2012. — Т. 3. — С. 74. 134. Багаева В.В., Малько А.В., Смолянинов А.Б., Савинцев А.М. Терапевтический потенциал аутологических мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани в комплексном лечении переломов проксимального отдела бедренной кости / Сборник тезисов: Стволовые клетки и регенеративная медицина. конференция. — 2013. — С. 7. V Всеросийская научно–практическая 109 135. Van den Dolder J., De Ruijter A.J.E., Spauwen P.H.M., Jansen J.A. Observation on the effects of BMP–2 on rat bone marrow cells cultured on titanium substrates of different roughness // Biomaterials. — 2003. — Vol. 25. — С. 1853–1860. 136. Жаркова И.И., Бонарцев А.П., Босхамджиев А.П. и др. Влияние модификации поли–3–оксибутирата полиэтиленгликолем на жизнеспособность клеток, культивируемых на полимерных пленках // Биомедицинская химия. — 2012. — Т. 58. — С. 579–591. 137. Lee R.H., Pulin A.A., Seo M.J. et al. Intraveµnous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti–inflammatory protein TSG 6 // Stem Cell. — 2009. — Vol. 5. — P. 54–63. 138. Каршиева С.Ш., Красикова Л.С., Белявский А.В. Мезенхимальные стволовые клетки, как средство противоопухолевой терапии // Молекулярная биология. — 2013. — Т. 47. — C. 1–11. 139. Gao J., Dennis J. E., Muzic R.F. et al. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion // Cells Tissues Organs. — 2001 — Vol. 169. — P. 12–20. 140. Horwitz E.M., Prockop D. J., Fitzpatrick L.A. et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta // Nature Medicine. — 1999. — Vol. 5. — P. 309–313. 141. Von Bahr L., Batsis I., Moll G. et al. Analysis of tissues following mesenchymal stromal cell therapy in humans indicates limited long–term engraftment and no ectopic tissue formation // Stem Cells. — 2012. — Vol. 30. — P. 1575–1578. 110 142. Калашникова М.В., Брутер А.В., Белявский А.В. Оценка выживания мезенхимальных стволовых клеток при разных способах введения / Сборник тезисов: Стволовые клетки и регенеративная медицина. V Всеросийская научно-практическая конференция. — 2013. — C. 30. 143. Bartosh T.J., Ylöstalo J.H., Mohammadipoor A., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2010. — Vol. 107. — P. 13724–12729. 144. Anderson P., Carrillo-Gálvez A.B., García–Pérez A. et al. CD105 (endoglin)-negative murine mesenchymal stromal cells define a new multipotent subpopulation with distinct differentiation and immunomodulatory capacities // PLoS One. — 2013. —Vol. 8. — P. e76979.
