Оптический биосенсор BIACORE
advertisement
ГУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН Оптический биосенсор BIACORE: анализ межмолекулярных взаимодействий in vitro проф. А.С.Иванов ivanov@ibmh.msk.su Москва - 2005 1 Оглавление 1. Устройство оптического биосенсора на примере BIACORE 3000. 2. Эффект поверхностного плазмонного резонанса. 3. Принцип измерения межмолекулярных взаимодействий. 4. Оптические чипы. 5. Области применения оптического биосенсора. 2 http:// www..biacore. http://www biacore.com BIACORE 3000 BIACORE S51 BIACORE C BIACORE T100 BIACORE FLEXCHIP BIACORE X BIACORE J BIACORE A100 3 BIACORE 3000 4 Пять высоких технологий в одном приборе Robotic Technology BIACORE 3000 SPR (Surface Plasmon Resonance) Detection System Laser Technology Sensor Chip: Gold-Dextran Surfaces Microfluidic System 5 Поверхностный плазмонный резонанс Surface Plasmon Resonance (SPR) Эффект полного внутреннего отражения REFRACTION T OTAL INTERNAL REFLECTION θ θ Incident angle ( θ) < critical angle for TIR Incident angle ( θ) > critical angle for TIR Фотоны не пересекают преломляющую поверхность, но их электрическое поле выходит за нее примерно на 1/4 длины волны 6 Поверхностный плазмонный резонанс Если отражающая поверхность покрыта тонким слоем золота (~ (~1/4 λ), фотоны могут взаимодействовать со свободными электронами в металле 1 4 λ Free Electrons Plasmons λ При определенных условиях фотоны могут превращаться в плазмоны и свет, соответственно, в этом случае не отражается 7 Поверхностный плазмонный резонанс Условие эффекта SPR: горизонтальная составляющая вектора фотона должна быть равна вектору плазмона – происходит резонанс и поглощение фотона Incident light vector ° Surface plasmon vecto Incident light vector = Surface plasmon vect Mismatch:No resonance Full Reflection • Match: Resonance Minimum Reflection • • surface • Gold Gold surface • θ1 • θ2 θ1 Angle θ2 Angle 8 Регистрации межмолекулярного взаимодействия с помощью SPR Электрическое (эванесцентное) поле плазмона выходит в среду за слой золота. Подвижность плазмона и, следовательно, величина его вектора и SPR угла, зависит от взаимодействия эванесцентного поля со средой за зеркалом. Т.о. с помощью SPR можно «заглянуть в зазеркалье». Величина резонансного угла пропорциональна коэффициенту преломления в тонком слое среды (до 300 нм) за золотом. По изменению резонансного угла можно регистрировать массоперенос любых веществ между свободной средой и этим слоем. 9 Сигнал SPR линейно пропорционален коэффициенту оптического преломления в зоне измерения и массе аналита независимо от его химической природы 10 Терминология Biacore Лиганд – партнер взаимодействия, иммобилизированный на поверхности чипа - биологические макромолекулы (белки, НК, …), - низкомолекулярные соединения, - молекулярные комплексы, - мембранные системы, - вирусы, клетки, … Аналит – свободный партнер в растворе (от простых веществ до клеток) аналит аналит лиганд лиганд связка 11 Регистрации межмолекулярного взаимодействия с помощью SPR На поверхности золота в зоне измерения закрепляется «лиганд» SPR регистрирует массоперенос «аналита» между средой и зоной измерения (в обе стороны) В реальном времени регистрируются: - кинетика связывания, - кинетика распада комплексов Математическая обработка кривых дает значения констант скоростей ассоциации и диссоциации, а также величину Kd. 12 Как в биосенсоре BIACORE BIACORE реализовано измерение? измерение? Свет лазера фокусируется на сенсорной поверхности и связывание «аналита» регистрируется по изменению резонансного угла (эффект SPR) Сенсорная поверхность реализована в виде специального чипа, содержащего: - часть оптической схемы, - тонкий слой золота, - систему иммобилизации «лиганда». 13 Регистрации межмолекулярного взаимодействия с помощью SPR 14 Оптический чип BIACORE чип Большой набор чипов для разных целей пенал Чип серии S 15 Варианты иммобилизации «лиганда» – Прямая химическая иммобилизация (ковалентная) – Непрямая аффинная иммобилизация (антитела, хелаты, рецепторы, биотин/авидин, …) – Мембранные системы (липидный монослой, липидный бислой, липосомы) 16 Стандартный оптический чип СМ5 - поверхность золота покрыта карбоксилированным декстраном - химическая (ковалентная) иммобилизация «лиганда» за группы: -NH2, -SH, -CHO, -COOH 17 Оптический чип SA стрептавидин - поверхность покрыта стрептавидином - иммобилизация любых биотинилированных биотин лигандов (ДНК, белки, липиды, …) Kd ~ 10-14 M 18 Оптический чип NTA NTA - NitriloT itriloTriacetic Acid - Связывание лигандов, лигандов, содержащих HisHis-tag, tag, путем образования хелата с ионами никеля 19 Оптический чип HPA - плоская гидрофобная поверхность - формирование липидного монослоя 20 Оптический чип L1 - гидрофобизированный декстран - формирование липидного бислоя - иммобилизация липосом 21 BIACORE Оптический чип В1 В1 - низкая степень карбоксилирования - низкое неспецифическое связывание молекул с высоким положительным зарядом (например, культуральные супернатанты) супернатанты) Оптический чип F1 - укороченный декстран - работа с аналитами большого размера (клетки,вирусы, …) Оптический чип С1 С1 - плоская карбокисметилированная поверхность - работа с крупными компонентами (клетки, вирусы, …) Оптический чип J1 - поверхность золота - создание собственных вариантов поверхностей и химии иммобилизации 22 Микрожидкостная система BIACORE • Малый расход реактивов • Эффективный массоперенос • Низкая дисперсия • Высокая воспроизводимость (ошибка - менее 1%) • Широкий диапазон времени эксперимента, от 1 с до 12 час • Возможность сбора образцов и фракционирования • Измерительные микро-кюветы • Пневматические микро-клапана 23 Проточные кюветы BIACORE • 4 измерительных канала (кюветы) • объем кюветы 0,02 мкл ( 2х10-8 л = 20 нл ! ) • все каналы - индивидуальны • возможны различные варианты коммутации каналов F1 F1 & 2 F2 F3 & 4 F3 F1 - 3 F4 F1 - 4 24 Микрожидкостная система 25 Сенсограмма 26 Карта скоростей on-off 10 pM 100 pM 1 nM KD 10 nM KD = koff/kon 100 nM 107 1 μM 106 kon (M-1s-1) 10 μM 105 100 μM 104 1 mM 103 102 0.0001 0.001 0.01 0.1 1 koff (s-1) 27 Ингибиторы протеазы ВИЧ (HIV-p) 10 pM 100 pM 1 nM KD 10 nM 100 nM B376 27 nM 107 kon (M-1s-1) 106 105 1 μM U75875 B369 B388 RitAmp B322 Ind B355 Saq Nelf B425 B408 B295 B4 A018 40B409 B365 B268 B429 B412 A015 A03 B439 B435 7 A017 B249 A038 10 μM 100 μM 104 B347 1 mM 103 102 0.0001 B277 0.001 0.01 A016 0.1 1 koff (s-1) 28 Программное обеспечение BIACORE BIAControl полный контроль работы биосенсора и запись сенсограмм BIAEvaluation Кинетический анализ сенсограмм BIASimulation Моделирование различных вариантов взаимодействия 29 Программное обеспечение для обработки сенсограмм The University of Utah CLAMP 30 Области научного применения оптического биосенсора Анализ межмолекулярных взаимодействий Белок – белок Белок – низкомолекулярный лиганд Рецептор – лиганд Белок – ДНК (РНК) ДНК (РНК) – ДНК (РНК) Анализ взаимодействий в надмолекулярных системах Искусственные липидные системы (монослои, бислои, мицеллы, липосомы) Биомембраны Внутриклеточные частицы Вирусы, бактерии, клетки, липопротеины, … Идентификация партнеров взаимодействия (fishing) 31 FIG. 5. Docking prediction for sulfated monosaccharides with human endostatin, which was represented with its Connolly surface colorcoded according to the electrostatic potential (from blue for negative to red for positive areas). Low energy binding modes were represented for the three monosaccharides, 1 (A), 2 (B), and 3 (C). D, ribbon representation of endostatin structure showing the basic amino acids forming basic clusters at the surface of the protein. 32 32 Скрининг потенциальных лигандов для конструирования лекарств Проверка 96 соединений на способность ингибировать связывание ILIL-4 человека с иммобилизированным рецептором (поиск антагонистов цитокинов) цитокинов) 33 Изучение фармакокинетики препарата Контроль фармакокинетики антител для терапевтических целей (Разработка и валидация фармакокинетического теста) 34 Молекулярное узнавание Гормон роста - анализ вклада индивидуальных аминокислот во взаимодействие с рецептором (аланиновый (аланиновый скрининг) Цель – создание миметика гормона роста для терапевтических целей 35 Сигнальные системы Анализ ионной селективности СаСа-зависимой сигнальной системы 36 Взаимодействие гормон-рецептор Анализ связывания рецептора эстрогена со специфической ДНК Цель – исследование действия аналогов эстрогена 37 BIACORE и протеомика (SPR / MS) Fishing Recovery Рецептор Трипсин Лизат MS Идентификация партнера 38 BIACORE и протеомика 39 Calmodulin-binding domain (captured) - Fishing of Calmodulin in bovine brain extract 40 APPLICATION NOTE 27 SPR-MS as a tool for quality control of recombinant proteins Model system - Cytochrome P450 2E1 In this study, recombinant His-tagged cytochrome P450 isozyme 2E1 (CYP2E1) was selectively captured onto the sensor surface from membrane extract of E. coli. The functional integrity of the enzyme was then tested by studying its interaction with its specific binding partner, 4-phenylimidazole. After microrecovery and proteolytic digestion, protein structure was confirmed by matrix-assisted laser desorption/ ionization (MALDI)-MS. 41 Прикладное использование оптического биосенсора Анализ продуктов питания Витамины Следы гормонов, антибиотиков, анаболиков, … Анализ качества препаратов Разработка диагностических тест-систем Разработка вакцин Диагностика 42 Прикладное использование оптического биосенсора Qflex Kits Qflex® Kit Biotin Qflex® Kit Chloramphenicol Qflex® Kit Clenbuterol Qflex® Kit Folic Acid Qflex® Kit Pantothenic Acid Qflex® Kit Ractopamine Qflex® Kit Streptomycin Qflex® Kit Sulfadiazine Qflex® Kit Sulfamethazine Qflex® Kit Sulfonamides Qflex® Kit Vitamin B12 Qflex® Kit Vitamin B2 Qflex® Kit ß-agonists 43 Спасибо за внимание 44
