Автореферат () - Институт молекулярной патологии и

На правах рукописи
Сладкова Евгения Анатольевна
ЦИТОАРХИТЕКТОНИКА И СВОЙСТВА
ПОВЕРХНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ
У ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ (ДОНОРОВ) И ПРИ
РАЗВИТИИИ ЛИМФОПРОЛИФЕРАТИВНЫХ
ПРОЦЕССОВ НА ОСНОВЕ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
А В Т О Р Е Ф Е РАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск – 2015
Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» Министерства образования и науки Российской
Федерации.
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
доцент
Скоркина Марина Юрьевна
Официальные оппоненты:
Бгатова Наталия Петровна, доктор биологических наук, профессор,
заведующая лабораторией ультраструктурных исследований ФГБНУ
Научно-исследовательского института клинической и экспериментальной лимфологии (Новосибирск).
Гуляева Людмила Федоровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией молекулярных механизмов канцерогенеза ФГБНУ Научно-исследовательского института молекулярной биологии и биофизики (Новосибирск).
Ведущая организация:
ФГБНУ Научно-исследовательский институт экспериментальной и
клинической медицины, лаборатория цитологии и клеточных культур
(Новосибирск).
Защита состоится: «_____» _____________ 2015 г. в ___ час.
на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБНУ Институте молекулярной
патологии и патоморфологии по адресу 630117, Новосибирск, ул. Тимакова, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ
Института молекулярной патологии и патоморфологии
http://pathomorphology.ru
Автореферат разослан «_____» ______________ 2015 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета
доктор биологических наук,
профессор Молодых Ольга Павловна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Действие целого спектра стимулов (вирусов,
канцерогенов и т.п.) наряду с трансформацией функционального состояния
клетки сопровождается изменением структуры ее поверхности, что в итоге
приводит к появлению у нее новых биологических свойств (Wroblewski
J.M. et al., 2002; McLead I.X. et al., 2011). В зависимости от природы и
интенсивности возмущающего воздействия, адаптивные реакции клеток
проявляются неодинаково, однако общими их свойствами являются изменения цитоархитектоники, формы и поверхности (Wolf K. et al., 2003). В
связи с этим одной из актуальных проблем клеточной биологии является
изучение функциональных свойств и структуры поверхности лимфоцитов
в норме и при патологии (например, развитии опухолей в системе крови). Решение данной проблемы позволит установить ранние изменения
структурно-функциональных свойств лимфоцитов, характерных для
неопластической клетки, а также разработать терапевтические подходы,
направленные на уничтожение аномальных клеток.
Степень разработанности темы исследования. В настоящее время в
литературе представлены данные многочисленных научных исследований,
касающихся вопросов опухолевого перерождения клеток (Зуева Е.Е., 2008;
Тамкович С.Н. и др., 2008; Чеботкевич В.Н. и др., 2010), метастазирования и образования лейкостазов (Сорокин Ю.Н. и др., 2013). Нарушение
пролиферации и дифференцировки лимфоцитов при развитии лимфопролиферативных заболеваний обусловлены изменением их генетической и
метаболической систем (Lopez J.I. et al., 2008), что отражается на особенностях их метастатического потенциала, механизмах формирования и
функционирования поверхностного аппарата клетки (Шутова М.С., 2010;
Dong C. et al., 2005; Kraning-Rush C.M. et al., 2012). Доказано, что процесс
развития неопластических лимфоидных клеток сопровождается изменением заряда (Тарасова И.М., 1985) и свойств плазмалеммы (Горло Е.И., 2000).
Несмотря на многочисленные экспериментальные данные, представленные
в источниках литературы, открытым остаётся вопрос об особенностях
цитоархитектоники, механических и электрических свойств клеточной
поверхности, изменяющихся в процессе опухолевого перерождения.
Решение данной проблемы стало возможным благодаря внедрению
в экспериментальные исследования технологий сканирующей зондовой
микроскопии, использующей различные модификации атомно-силовых
микроскопов. Преимуществами атомно-силовой микроскопии, по сравнению с традиционными способами исследования, являются: трехмерная
визуализация топографии (Kamruzzaham A.S.M. et al., 2004); интеграция
морфологических изображений клеточной поверхности с ее механическими свойствами (Simone A., Durrieu M.C., 2006); получение информации об упруго-эластических (Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю., 2013) и
электрических свойствах клеток (Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю., 2014).
1
Внедрение атомно-силовой микроскопии создает новые направления в
изучении морфологических и функциональных особенностей клеточной
поверхности.
С учетом вышесказанного сформулированы цель и поставлены задачи
исследования.
Цель работы: охарактеризовать цитоархитектонику и свойства
поверхности лимфоцитов в норме (у здоровых людей) и при развитии
лимфопролиферативных процессов на основе метода атомно-силовой
микроскопии.
Задачи исследования:
1. Измерить поверхностный потенциал лимфоцитов в норме и при
развитии лимфопролиферативных процессов.
2. Изучить цитоархитектонику поверхности и упруго-эластические
свойства лимфоцитов в норме и в условиях пролиферации.
3. Охарактеризовать миграционную активность и организацию элементов цитоскелета лимфоцитов в норме и в условиях пролиферации.
4. Проанализировать цитоархитектонику и функциональные свойства
лимфоцитов здоровых людей и больных лейкозом на моделях митогенстимулированной пролиферации.
Научная новизна. На основе комплексного подхода с использованием современных методов атомно-силовой микроскопии получены новые
данные о структуре и функциональных свойствах нормальных и трансформированных лимфоцитов. Впервые показано, что развитие миелопролиферативного процесса сопровождается изменением морфологии,
упруго-эластических свойств и миграционной активности лимфоцитов.
Установлены различия архитектоники, жесткости и организации цитоскелета лимфоцитов в условиях острого и хронического типов лимфобластной пролиферации. Показано, что в период ремиссии лимфобластного
лейкоза лимфоциты сохраняют свойство, характерное для клеток в стадии
обострения болезни – способность распластываться на подложке. Установлено повышение потенциала поверхности лимфоцитов при развитии
лимфопролиферативных процессов как миело-, так и лимфобластного
ростков кроветворения.
Научная новизна работы заключается так же в том, что на модели
митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов удалось доказать
и подтвердить ранние изменения свойств и структуры поверхности различных субпопуляций лимфоцитов в норме и при развитии лимфопролиферативных заболеваний. Так, установлено, что реакция лимфоцитов на
митогенную стимуляцию проявляется в образовании клеток с повышенным потенциалом поверхности и сниженной двигательной активностью.
Теоретическая и практическая значимость. В выполненном исследовании представлены новые сведения о структурной организации и
функциональных свойствах лимфоцитов в норме и при развитии пролиферативных процессов. Полученные данные имеют важное теоретическое и
2
практическое значение в области клеточной биологии в качестве критерия,
позволяющего объективно дифференцировать нормальные лимфоциты от
клеток, обладающих злокачественными свойствами.
Комплексное исследование цитоархитектоники и функциональных
свойств лимфоцитов в условиях пролиферации позволило установить
объективные маркеры, которые можно использовать для прогноза степени
и тяжести течения острых и хронических типов лимфопролиферативных
заболеваний. На основе полученных данных, а также с учетом ранее разработанных способов («Способа исследования нативных клеток крови»;
патент РФ № 2398234; «Способа определения упругости клеток крови»;
патент РФ № 2466401), создан «Способ прогнозирования течения острого
и хронического типов лимфобластного лейкоза» (патент РФ № 2541189).
Разработаны рекомендации по оценке локомоторной активности опухолевых лимфоцитов при выполнении исследований в рамках Федеральной
целевой программы 1.3.2. «Проведение научных исследований целевыми
аспирантами», соглашение № 14.132.21.1320 от 01.10.2013.
На модели митогенстимулированной пролиферации клеток показано,
что образовавшиеся лимфобласты больных острым лимфобластным лейкозом в ремиссии и хроническим лимфолейкозом после лечения обладают
функциональными свойствами, сходными с агрессивными лимфобластами
больных острым лимфолейкозом. Подобная реакция клеток на митоген, в
отсутствие противоопухолевой терапии, указывает на способность лимфоцитов сохранять злокачественные свойства у больных как острым лимфолейкозом в ремиссии, так и хроническим лимфолейкозом после лечения.
Полученные результаты используются в учебном процессе на кафедре экологии, физиологии и биологической эволюции НИУ «БелГУ» при
разработке учебно-методических пособий по дисциплинам «Физиология
крови» для магистров по направлению 020400.68 – Физиология человека
и животных, «Иммунология» для студентов направления подготовки
020200.62 – Биология; «Цитология и гистология» для студентов направления подготовки 020400.62 – Биология.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Развитие острых и хронических лимфопролиферативных процессов
в системе крови сопровождается повышением поверхностного потенциала
лимфоцитов.
2. Упруго-эластические свойства и тонкая организация цитоархитектоники поверхности лимфоцитов специфична для каждого типа пролиферации.
3. Пролиферативные процессы сопровождаются изменением миграционной активности лимфоцитов: снижение ее у больных хроническим
лимфолейкозом после лечения и острым лимфолейкозом в фазу ремиссии,
и увеличение – у больных острым миелобластным и острым лимфобластным лейкозом в фазу обострения.
4. Адаптивный ответ лимфоцитов на моделях митогенной стимуля3
ции, как в группе здоровых людей, так и больных лейкозом проявляется
в образовании трех морфологически разнородных субпопуляций клеток
с характерными особенностями цитоархитектоники, повышенным потенциалом поверхности и сниженной миграционной активностью, однако в
изменении упруго-эластических свойств клеток однозначной зависимости
не установлено.
Степень достоверности полученных результатов и выводов
диссертации обусловлена теоретическим анализом, личным участием
автора во всех сериях экспериментального исследования, использованием современных высокоточных методов атомно-силовой микроскопии,
соответствующих компьютерных программ обработки и анализа изображений, большим объемом фактического материала, который обработан с
использованием традиционных методов статистики, получением патентов
на изобретения, публикацией данных диссертации в статьях, докладах на
международных конференциях и научных семинарах.
Апробация работы. Основные результаты диссертационных исследований представлены на III Евразийском конгрессе по медицинской физике
и инженерии «Медицинская физика – 2010» (Москва, 2010); 14-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология –
наука XXI века» (Пущино, 2010); VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012); XVII Российском симпозиуме по растровой и электронной
микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ
– 2012) (Черноголовка, 2012); 16-ой Международной Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино,
2012); X Всероссийской молодежной научной конференции Института
физиологии Коми «Физиология человека и животных: от эксперимента к
клинической практике» (Сыктывкар, 2012); 17-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века»
(Пущино, 2013); IX Международной конференции «Микроциркуляция и
гемореология» (Ярославль, 2013); XXII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва-Волгоград, 2013); IV Международной
научно-практической конференции «Научные перспективы XXI века.
Достижения и перспективы нового столетия» (Новосибирск, 2014), расширенном заседании кафедры экологии, физиологии и биологической
эволюции НИУ «БелГУ» (Белгород, 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ,
в том числе 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для
публикации результатов исследования, 3 патента на изобретения.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 172 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов
и методов исследования, результатов собственных исследований и их
обсуждения, выводов, списка сокращений, списка литературы (287 источников, в том числе 192 – иностранных). Работа включает 24 таблицы,
иллюстрирована 109 рисунками.
4
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведено 3 серии экспериментов, в каждой из которых исследовали
кровь больных лейкозом (255 обследованных от 18 до 45 лет) и здоровых
людей (160 обследованных от 25 до 45 лет). В работе использовали кровь
больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) в стадии обострения и ремиссии болезни, хроническим лимфобластным В-клеточным лейкозом (ХЛЛ) после лечения. Забор
крови, общий клинический анализ крови здоровых и больных людей, а
также цитохимический анализ клеток крови больных лейкозом и постановка диагноза выполнены на базе клинико-диагностической лаборатории
областной клинической больницы им. Святителя Иоасафа г. Белгорода с
участием специализированного медицинского персонала.
Первая серия исследований включала изучение свойств и структуры
поверхности, культивируемых в питательной среде, лимфоцитов больных лейкозом. Во второй и третьей серии исследований моделировали
митоген-стимулированную нагрузку на лимфоциты в культуре и изучали
свойства и структуру поверхности субпопуляций клеток. Согласно данным
литературы, митогены способны вызывать в здоровых клетках трансформации, сходные с преобразованиями, происходящими при опухолевом
перерождении (Шутова М.С., 2009; Ломакин М.Е., 2011). Во второй серии
экспериментов к культуральной среде добавляли Кон А, в третьей – ФГА.
В каждой серии экспериментов исследовали кровь 50 доноров, 25 пациентов с диагнозом ОЛЛ на стадии обострения болезни и 15 в ремиссии,
25 больных ХЛЛ и 20 пациентов с ОМЛ.
Взятие крови, проведение общего и дифференциального анализа
крови. Забор периферической крови здоровых людей и больных лейкозом
осуществляли из локтевой вены. Общий и дифференциальный анализ
крови проводили при непосредственном участии врачей-лаборантов клинической лаборатории на автоматическом гематологическом анализаторе
Beckman Coulter LH500 (Франция, 2010).
Цитохимическая диагностика лейкозов. С целью диагностики
острых типов лейкозов использовали алгоритм цитохимической диагностики, принятый в клинической онкогематологии (Почтарь М.Е. и др.,
2003). Диагностику хронического лимфобластного лейкоза осуществляли
методом селективного гейтирования на проточном цитометре FACS Cantu
II (США, 2010), используя стандартные панели моноклональных антител
для Т- и В-лимфоцитов.
Культивирование лимфоцитов. Культивирование лимфоцитов
осуществляли согласно схеме (патент РФ № 2084523, Фролова И.В. и
др., 1987). Для приготовления пробы 1 мл свежевыделенной суспензии
лейкоцитов смешивали с 5 мл питательной смеси и инкубировали в течение 48 часов при 37°C в присутствии 5% CO2 (Зайцева Е.М. и др., 2011).
При моделировании процессов митогенной стимуляции деления клеток в
5
культуральную среду добавляли Кон А и ФГА, доза составила 0,02 мл на
5 мл культуральной среды (патент РФ № 2084523; Эшмен Р.Ф., 1987). По
истечении времени инкубации готовили суспензионные препараты для
исследований структуры и функциональных свойств клеток.
Методы исследования клеток крови на АСМ. Режим полуконтактного сканирования. Геометрические параметры и микрорельеф поверхности
лимфоцитов изучали в полуконтактном режиме на атомно-силовом микроскопе ИНТЕГРА Вита фирмы NT-МDТ (Зеленоград, 2009). Для сканирования использовали кантилеверы серии NSG03 с радиусом закругления
10 нм. Пробоподготовку для АСМ проводили согласно разработанным
на кафедре способам при непосредственном участии автора (патент РФ
№ 98248, патент РФ № 2009125268). Из пробы сканировали по 15 клеток
каждой субпопуляции лимфоцитов. На полученных сканах измеряли
морфометрические параметры клеток и анализировали неоднородности
их клеточной поверхности на участках мембраны площадью 3Х3 мкм.
Морфометрию клеток осуществляли, используя программные продукты
Nova (NT-MDT, Россия, 2009) и Gwyddion (Czech Metrology Institute, 2004).
Режим силовой спектроскопии. Упруго-эластические свойства лимфоцитов изучали в режиме силовой спектроскопии согласно двум методическим подходам. В первом случае измеряли общую жесткость клетки
с использованием модифицированного зонда, изготовленного на основе
полимерных микросфер, прикрепленных к типлессу серии CSG 11, согласно разработанному автором в коллективе с соавторами способу (патент
РФ № 2466401). Во втором случае оценивали механические свойства поверхности в локальных участках. Для этого использовали стандартный
зондовый датчик серии NSG 03, при наложении нагрузки на клеточную
поверхность в 25 точках. Расчеты глубины погружения зонда в образец,
силы прижатия зонда к образцу и модуль Юнга осуществляли по общеизвестным формулам (Israelachvili J., 1992; Capella B., Dieter G., 1999).
Режим зонда Кельвина. Суспензию лейкоцитов для измерения потенциала поверхности (ПП) готовили согласно схеме (патент № 2027188;
Шереметев Ю.А. и др., 1995). Измерение ПП осуществляли с помощью
кантилевера с токопроводящим титановым покрытием серии NSG03/TiN
(Nanoworld, USA). Из каждой пробы сканировали по 15 клеток и проводили обработку полученных сканов в программе Nova (NT-MDT, Россия).
Изучение функциональной активности лимфоцитов. Функциональную активность лимфоцитов оценивали с помощью реакции торможения миграции лимфоцитов (РТМЛ) в прямом капиллярном тесте
с учетом жизнеспособности клеток не менее 95% (Новиков Д.К. и др.,
2006). Двигательную активность клеток анализировали, используя индекс торможения миграции лимфоцитов (ИТМЛ). ИТМЛ вычисляли для
митогенстимулированных лимфоцитов в сравнении со спонтанной (без
митогена) миграцией. Расчет проводили по известной формуле (Новиков
Д.К., 2005).
6
Морфологические методы анализа цитологических фиксированных препаратов лимфоцитов. С целью изучения особенностей
организации элементов цитоскелета, измерения их длины (Ченцов Ю.С.
и др., 1982), учета числа ядрышек (Howell W.M., 1980) и оценки пролиферативного потенциала лимфоцитов (Маркина Т.Н., 2011) готовили
цитологические препараты по общепринятым стандартным методикам.
Анализ цитологических препаратов осуществляли с помощью комплекса
аппаратно-программной визуализации изображения «ВидеоТестМастерМорфология» (производитель НПФ «ВидеоТест», Санкт-Петербург, 2004).
Для визуализации цитоскелетных структур использовали программное
обеспечение «Видео-Тест-Размер 5.0».
Методы статистической обработки. Результаты исследований
представлены в виде среднеарифметических значений с их средними
стандартными ошибками. Исследуемые параметры находятся в пределах
нормального распределения. Статистический анализ проведен с использованием критерия Стьюдента для 5%-го уровня значимости (Лакин Г.Ф.,
1968; Платонов А.Е., 2000).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Структурно-функциональные свойства лимфоцитов доноров и
больных лейкозом. По данным исследования гематологического профиля
больных лейкозом установлено снижение числа эритроцитов у пациентов
с диагнозом острый миелобластный тип. Так, число эритроцитов и концентрация гемоглобина снижены соответственно на 35% и 39% (р<0,05)
по сравнению с показателями крови доноров (табл. 1).
Число лейкоцитов в крови больных ОЛЛ и ХЛЛ возросло соответственно на 975% и 503% (р<0,05), а в стадии ремиссии острого лейкоза
снизилось на 34% (р<0,05) по сравнению с контролем.
В группе больных ОМЛ установлено увеличение жесткости поверхности на 64% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (табл. 2).
Изменение механических свойств клеточной поверхности лимфоцитов больных ОМЛ происходит одновременно с повышением потенциала
поверхности и их миграционной активностью. Так, ПП лимфоцитов
больных ОМЛ увеличился на 8% (р<0,05) по сравнению с лимфоцитами
доноров. При этом лимфоциты этих больных сохраняли самую высокую
способность к миграции по сравнению с другими формами лейкоза. Их
миграционная активность возросла на 162% (р<0,05) по сравнению с
контролем (рис. 1).
В лимфоцитах больных ОМЛ и доноров выявлена сеть цитоскелетных структур, расходящаяся от ядра радиально. Плотность расположения
фибрилл, при наблюдении в световой микроскоп была настолько велика,
что идентифицировать отдельные нити было не возможно, в результате,
7
Таблица 1. Гематологический профиль обследованных пациентов
Доноры
ОЛЛ
ХЛЛ после
ОМЛ
ОЛЛ
(контроль)
в ремиссии лечения
RBC, 1012 л-1 4,3±0,5
2,8±0,2*
4,1±0,3
4,9±0,5
4,5±0,4
Hb, г/л
145,0±25,0 88,6±8,6*
131,7±6,2 148,5±5,7 132,8±10,4
Ht, усл.ед.
0,44±0,2
0,3±0,02
0,38±0,1
0,46±0,3
0,6±0,2
MCV, мкм3
87,5±4,5
93,5±1,5
94,4±1,5
96,2±3,6
88,6±1,7
MCH, пг/кл/
30,5±4,5
31,7±0,8
32,4±2,4
32,2±1,8
29,6±0,7
MCHC, г/л
335,0±32,5 338,8±9,4 343,1±9,4 340,4±8,4 334,1±3,1
PLT, 109 л-1
275,0±28,5 236,3±15,4 234,6±17,2 228,6±11,2 212,7±31,9
MPV, мкм3
8,5±1,5
7,3±0,4
8,7±1,1
7,4±0,8
9,0±0,9
*
*
WBC
6,5±1,5
8,86±4,1
69,9±2,1
4,3±0,9
39,2±4,6*
Параметр
Примечание: * – статистически достоверные различия между значениями лимфоцитов доноров и больных лейкозом по критерию Стьюдента при р<0,05. RBC
– число эритроцитов, Hb – концентрация гемоглобина, Ht – гематокрит, MCV –
средний объем эритроцита, МСН – средняя концентрация гемоглобина в 1 эритроците, MCHC – средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах, PLT – количество тромбоцитов, MPV – средний объем тромбоцита, WBC – число лейкоцитов.
Таблица 2. Свойства поверхности и длина пучков элементов цитоскелета
лимфоцитов
Группа
Модуль Юнга, мПа
ПП, мВ
Длина, мкм
Доноры (контроль)
3,9±0,1
- 37,3±0,6
0,78±0,2
ОМЛ
6,4±0,3*
- 34,7±0,3*
0,95±0,2
*
*
ОЛЛ
1,8±0,2
- 27,8±0,9
1,77±0,2*
*
*
ОЛЛ в ремиссии
2,5±0,1
- 29,0±0,5
0,81±0,1
ХЛЛ после лечения
11,2±0,5*
- 6,7±0,2*
0,69±0,1
Примечание: * – статистически достоверные различия между значениями лимфоцитов доноров и больных лейкозом по критерию Стьюдента при р<0,05.
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
Доноры
ОМЛ
ОЛЛ
ОЛЛ в ХЛЛ после
ремиссии лечения
Рис. 1. Число лимфоцитов после миграции в 1 мкл суспензии.
8
а
в
б
г
д
Рис. 2. Элементы цитоскелета в лимфоцитах: а – доноров, б – больных ОМЛ,
в – больных ОЛЛ, г – больных ОЛЛ в ремиссии, д – больных ХЛЛ (стрелкой показаны пучки структур цитоскелета, располагающиеся вокруг ядра).
проводили анализ пучков цитоскелетных структур, состоящих из скопления фибрилл (рис. 2).
Визуальных различий в строении и расположении элементов цитоскелета в лимфоцитах больных ОМЛ по сравнению с клетками доноров не
выявлено. Длина пучков в группе больных ОМЛ достоверно не отличалась
от контроля (см. табл. 2). Изменение механических свойств и локомоторной активности лимфоцитов больных ОМЛ сопровождалось появлением
на их поверхности однотипных глобулярные выступов, которые были
собраны локально в структуры дугообразной формы, что придавало ей
«рифленость» (рис. 3).
В группе больных ОЛЛ при микроскопировании мазков обнаружены
бластные формы с неправильными контурами цитоплазмы и ядром, занимающим большую часть клетки. Жесткость лимфоцитов больных ОЛЛ
снизилась на 54% (р<0,05) по сравнению с группой доноров (см. табл. 2).
Потенциал поверхности этих клеток был повышен на 34% (р<0,05) по
сравнению с лимфоцитами доноров (см. табл. 2). Количество мигрировавших лимфоцитов в группе больных ОЛЛ возросло на 79% (р<0,05) по
сравнению с контролем (см. рис. 1). Элементы цитоскелета в подвижных
лимфоцитах больных ОЛЛ были собраны в тонкие длинные отдельно лежащие пучки, расходящиеся от ядра радиально (см. рис. 2). Длина пучков
цитоскелетных структур увеличилась на 126% (р<0,05) по сравнению
с группой доноров (см. табл. 2). Рельеф поверхности лимфоцитов был
сглажен (см. рис. 3).
В суспензии культивированных лимфоцитов больных ОЛЛ в ремиссии
не выявлено бластных форм лимфоидного ряда. Модуль Юнга лимфоци9
1
а
в
б
г
4
3
2
д
е
Рис. 3. Рельеф поверхности лимфоцитов: а – доноров, б – больных ОМЛ, в –
больных ОЛЛ, в – больных ОЛЛ в ремиссии (1 тип), д – больных ОЛЛ в ремиссии
(2 тип), е – больных ХЛЛ (1 – дугообразные скопления глобулярных выступов;
2 – крупные инвагинации плазмалеммы; 3 – глобулярные выступы сферической
формы; 4 – скопления глобулярных выступов).
тов был снижен на 36% (р<0,05), а потенциал поверхности – повышен на
29% (р<0,05; см. табл. 2) по сравнению с группой доноров. Количество
мигрировавших лимфоцитов в группе больных ОЛЛ в ремиссии снизилось на 28% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. рис. 1). В клетках со
сниженной миграционной активностью основная масса элементов цитоскелета располагалась отдельными структурами в области околоядерного
пространства (см. рис. 2).
Несмотря на общие свойства структура поверхности лимфоцитов
больны ОЛЛ в ремиссии была различна. Согласно полученным данным
на АСМ выделено два типа клеток в зависимости от конфигурации их
поверхности (см. рис. 3). Для лимфоцитов с первым типом клеточной
поверхности характерно наличие мелких глобулярных структур, которые чередовались с крупными инвагинациями плазмалеммы. Для лимфоцитов со вторым типом рельефа клеточной поверхности характерно
наличие глобулярных образований и редко встречающиеся мелкие
инвагинации.
В группе больных ХЛЛ после лечения были обнаружены крупные
лимфоциты, похожие на бласты. Форма клеток варьировала от округлой
до неправильной. Цитоплазма клеток располагалась в виде тонкого
ободка, околоядерное пространство было четко выражено. Жесткость
лимфоцитов больных ХЛЛ возросла на 187% (р<0,05) по сравнению с
клетками доноров, потенциал поверхности – повышен на 456% (р<0,05;
см. табл. 2). Миграционная активность «жестких» лимфоцитов больных
ХЛЛ была снижена. Число вышедших из капилляра клеток уменьшилось
10
на 30% (р<0,05) по сравнению с лимфоцитами доноров (см. рис. 1). Для
малоподвижных лимфоцитов больных ХЛЛ характерна максимальная локализация цитоскелетных структур в околоядерной зоне. Пучки фибрилл
представляли собой два типа структур: прямые и извитые (см. рис. 2). На
клеточной поверхности присутствовали глобулярные выступы, которые
были сгруппированы в структуры неправильной формы.
Таким образом, для лимфоцитов больных как хроническим, так и
острым типами лейкоза, вне зависимости от стадии течения болезни,
характерно повышение заряда клеточной поверхности. В группе больных ОЛЛ высокая миграционная активность лимфоцитов в сочетании
со снижением их жесткости и расположением длинных цитоскелетных
пучков в виде отдельных нитей, предопределяет формирование условий
для выхода «мягких» лимфоцитов в ткани. В период ремиссии ОЛЛ лимфоциты сохраняют свойство пониженной жесткости, однако способность
их к миграции существенно снижена, за счет значительного укорочения
длины структур цитоскелета.
По данным литературы, наблюдаемые свойства могут быть связаны
с воздействием химиотерапевтических препаратов на клетку (Barret A.J.,
2009). У пациентов больных ХЛЛ после лечения возрастает жесткость
клетки на фоне снижения миграционной активности, элементы цитоскелета клеток расположены в околоядерной зоне в виде коротких пучков.
Структурно-функциональные свойства Кон А-стимулированных
лимфоцитов. В условиях митогенной стимулированных лимфоцитов в
культуре, как доноров, так и больных различными типами лейкоза были
обнаружены субпопуляции микроцитов, нормоцитов и бластов. В культуре лимфоцитов больных ОМЛ выявлены субпопуляции микроцитов и
нормоцитов, бласты отсутствовали. Форма микроцитов округлая сходная
с клетками доноров, ядро занимало большую часть клетки. Под влиянием
Кон А жесткость микроцитов больных ОМЛ увеличилась на 64% (р<0,05)
по сравнению с контролем (табл. 3).
В субпопуляции нормоцитов больных ОМЛ встречались формы с цитоплазмой, расположенной в виде тонкого ободка, либо широкого участка,
ядро в таких клетках было смещено к полюсу. Жесткость нормоцитов
достоверно не отличалась от клеток доноров (см. табл. 3).
Под влиянием Кон А потенциал поверхности лимфоцитов больных
различными типами лейкоза увеличился. Так, в группе больных ОМЛ
потенциал возрастал на 298% (р<0,05) по сравнению с контролем (см.
табл. 3).
В результате проведенных исследований установлено снижение двигательной активности лимфоцитов больных разными формами лейкоза
под влиянием Кон А. Количество мигрировавших клеток больных ОМЛ
уменьшилось на 36% (р<0,05) по сравнению с контролем (рис. 4).
В культуре лимфоцитов больных ОЛЛ микроциты имели правильную
округлую форму и ядро, занимающее большую часть клетки. Модуль Юнга
11
Таблица 3. Величины модуля Юнга и ПП лимфоцитов в условиях стимуляции Кон А
Модуль Юнга (мПА)
Группы
ПП, мВ
Микроциты Нормоциты
Бласты
Доноры (контроль)
11,4±0,4
8,2±0,9
7,3±0,2
-21,1±0,5
*
ОМЛ
18,7±0,3
8,5±0,5
–
-5,3±0,7*
ОЛЛ
10,7±0,4
8,3±0,9
6,5±0,2
-14,0±0,3*
*
*
*
ОЛЛ в ремиссии
3,4±0,1
1,6±0,1
1,8±0,1
-6,2±0,3*
*
*
*
ХЛЛ после лечения
6,5±0,2
2,3±0,3
1,6±0,2
-2,5±0,2*
Примечание: * – статистически достоверные различия между значениями лимфоцитов доноров и больных лейкозом по критерию Стьюдента при р<0,05.
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Доноры
ОМЛ
ОЛЛ
ОЛЛ в ХЛЛ после
ремиссии лечения
Рис. 4. Число лимфоцитов после миграции в 1 мкл суспензии.
их был снижен в среднем на 5% (р<0,05) по сравнению с лимфоцитами
доноров (см. табл. 3). Нормоциты были округлой формы, с центрально
расположенным ядром, форма которого повторяла форму клетки. Среди
бластных форм преобладали широкоцитоплазматические клетки, в единичных случаях наблюдали формы с узким ободком цитоплазмы. По данным АСМ достоверных различий между значениями средней жесткости
нормоцитов и бластов больных ОЛЛ и клетками доноров не установлено.
Потенциал поверхности трансформированных лимфоцитов больных ОЛЛ
возрастал на 51% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 3).
Исследуя культуру лимфоцитов больных ОЛЛ на стадии ремиссии
болезни при митогенной стимуляции, наблюдали присутствие трех
субпопуляций клеточных форм, морфология которых не изменялась по
сравнению с острым течением заболевания. Однако свойства поверхности
этих клеток существенно отличались от контроля и от клеточных форм,
характерных для острого течения заболевания. Для всех субпопуляций отмечали снижение жесткости поверхности: микроцитов – на 70% (р<0,05),
нормоцитов – на 78% (р<0,05), бластов – на 58% (р<0,05) по сравнению
с соответствующими субпопуляциями доноров (см. табл. 3). Потенциал
12
поверхности трансформированных лимфоцитов больных ОЛЛ в ремиссии
возрастал на 240% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл.
3). При этом количество мигрировавших клеток уменьшилось на 16%
(см. рис. 4).
В культуре лимфоцитов больных ХЛЛ все клеточные формы были
правильной округлой формы с ядром, занимающим большую часть клетки.
Жесткость микроцитов, нормоцитов и бластов больных ХЛЛ уменьшилась
соответственно на 43%, 72% и 80% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 3). Потенциал поверхности Кон А-трансформированных
лимфоцитов больных ХЛЛ увеличился на 744% (р<0,05). Одновременно с
увеличением заряда поверхности лимфоцитов больных ХЛЛ происходило
снижение их двигательной активности на 25% по сравнению с контролем
(см. рис. 4).
Таким образом, в условиях митогенной стимуляции деления лимфоцитов больных различными типами лейкоза общая реакция клеток
проявляется в увеличении заряда поверхности, снижении двигательной активности и уменьшении жесткости лимфоцитов в ряду микроциты – нормоциты – бласты. Нормоциты больных ОМЛ в отсутствие
миелобластов приобретают функциональные характеристики близкие к
нормоцитам здоровых людей. Механические и электрические свойства
Кон А-трансформированных бластов больных ОЛЛ в ремиссии и ХЛЛ
после лечения сопоставимы с аналогичными свойствами лимфобластов,
циркулирующих в крови больных ОЛЛ. Следовательно, жесткость и заряд поверхности лимфоцитов могут выступать клеточными маркерами,
указывающими на развитие опухолевого процесса в системе крови.
Структурно-функциональные свойства ФГА-стимулированных
лимфоцитов. В культуре лимфоцитов больных ОМЛ микроциты были
округлой формы, со сниженным модулем упругости на 58% (р<0,05) по
сравнению с клетками доноров (табл. 4).
Форма нормоцитов больных ОМЛ была округлой, жесткость повышена
на 29% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 4). В субпопуляции бластов больных ОМЛ встречались клетки, как с правильными
округлыми контурами, так и овальной формы, цитоплазма и тех и других
форм располагалась широким ободком вокруг ядра. Жесткость лимфобластов снижена на 50% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл.
4). Потенциал поверхности ФГА стимулированных лимфоцитов больных
ОМЛ увеличился на 42% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл.
4). Число мигрировавших лимфоцитов снизилось на 33% по сравнению
с группой доноров (рис. 5).
В культуре лимфоцитов больных ОЛЛ на стадии острого течения
заболевания форма клеток всех субпопуляций была округлой, ядро занимало большую часть клетки. Жесткость нормоцитов увеличилась на 10%
(р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 4). Достоверных изменений
модуля Юнга в субпопуляциях микроцитов и бластов не установлено. По13
Таблица 4. Величины модуля Юнга и ПП лимфоцитов в условиях стимуляции ФГА
Модуль Юнга, мПА
Группы
ПП, мВ
микроциты нормоциты
бласты
Контроль (доноры)
8,7±0,8
7,1±0,1
6,8±0,3
-41,3±0,7
ОМЛ
3,7±0,2*
8,3±0,7
3,4±0,4*
-23,8±0,5*
ОЛЛ
9,7±0,4
7,8±0,3*
6,8±0,1
-34,4±0,9*
*
ОЛЛ в ремиссии
–
7,5±0,5
3,7±0,3
-5,6±0,8*
*
*
*
ХЛЛ после лечения
1,6±0,1
3,4±0,4
2,1±0,2
-10,7±0,7*
Примечание: * – статистически достоверные различия между значениями лимфоцитов доноров и больных лейкозом по критерию Стьюдента при р<0,05.
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Доноры
ОМЛ
ОЛЛ
ОЛЛ в ХЛЛ после
ремиссии лечения
Рис. 5. Число лимфоцитов после миграции в 1 мкл суспензии.
тенциал поверхности субпопуляций лимфоцитов больных ОЛЛ увеличился
на 17% (р<0,05) по сравнению с клетками доноров (см. табл. 4).
В состоянии ремиссии у больных ОЛЛ под влиянием ФГА микроцитов
не обнаружено. Нормоциты больных ОЛЛ в ремиссии имели овальную
или вытянутую форму. Для бластов характерна округлая правильная форма
ядра и ровные контуры цитоплазмы, которая располагалась тонким ободком. Встречались бластные формы с ядром, смещенным к периферии, и
широким участком цитоплазмы. Достоверных различий между значениями
жесткости нормоцитов больных ОЛЛ в ремиссии и доноров не выявлено.
Жесткость лимфобластов снижена на 45% (р<0,05) по сравнению с контролем (см. табл. 4). Потенциал поверхности субпопуляций лимфоцитов
больных ОЛЛ в ремиссии увеличился на 86% (р<0,05) по сравнению с
клетками доноров (см. табл. 4), миграционная активность лимфоцитов
снизилась на 34% (р<0,05; см. рис. 5).
В культуре лимфоцитов больных ХЛЛ микроциты были округлой
формы, ядро занимало большую часть клетки. Форма нормоцитов овальная, ядро вытянуто по одной из осей, контуры цитоплазмы изрезаны. В
лимфобластах ядро состояло из нескольких лопастей, широкий ободок
14
цитоплазмы был с многочисленными выростами по периферии. Модуль
Юнга микроцитов, нормоцитов и бластов больных ХЛЛ снизился соответственно на 82%, 52% и 31% (р<0,05) по сравнению с контролем (см.
табл. 4). Потенциал поверхности трансформированных лимфоцитов больных ХЛЛ увеличился на 74% (р<0,05; см. табл. 4), число мигрировавших
лимфоцитов снизилось на 39% (р<0,05) (см. рис. 5).
Таким образом, на модели ФГА-стимулированных лимфоцитов
установлено присутствие субпопуляций лимфоцитов с увеличенным
потенциалом поверхности и сниженной миграционной активностью.
Изменение жесткости в субпопуляциях клеток больных лейкозом происходит неоднозначно.
В целом, проанализировав структурно-функциональную организацию
лимфоцитов при развитии лимфопролиферативных процессов, выявлено
сходство их свойств во время течения хронического лейкоза после лечения
и острого лейкоза на стадии ремиссии болезни. В частности, для них характерно снижение миграционной активности клеток, увеличение потенциала
поверхности, локализация элементов цитоскелета в околоядерной зоне и
образование на плазмалемме глобул различной конфигурации.
На моделях митоген-стимулированных лимфоцитов показано, что
пролиферация как модельных лимфобластов, так и прошедших опухолевое перерождение в естественных условиях сопровождается снижением
жесткости и повышением потенциала поверхности клеток.
ВЫВОДЫ
1. Развитие острых и хронических лимфопролиферативных процессов
сопровождается появлением в периферическом русле лимфоцитов с повышенным зарядом клеточной поверхности.
2. Жесткость лимфоцитов при развитии острого миелобластного и
хронического лимфобластного лейкоза повышена, однако острый лимфобластный тип пролиферации, как в стадии обострения, так и в ремиссии
характеризуется появлением лимфоцитов со сниженной жесткостью.
3. В норме (у здоровых людей-доноров) цитоархитектоника мембран
лимфоцитов представлена однотипными глобулярными структурами
округлой формы. При развитии лимфопролиферативных процессов на поверхности лимфоцитов появляются либо скопления дугообразных структур (острый миелобластный тип) и конгломераты нерегулярной формы
(хронический лимфобластный тип), либо поверхность теряет большую
часть глобулярных структур (острый лимфобластный тип).
4. Развитие острых форм лимфо-и миелобластного типов пролиферации сопровождается увеличением миграционной активности лимфоцитов,
в то же время течение хронического типа после лечения и острого лимфобластного лейкоза на стадии ремиссии болезни – снижением двигательной
активности клеток.
15
5. При развитии острого лимфопролиферативного процесса элементы
цитоскелета в лимфобластах собраны в тонкие пучки, расходящиеся от
ядра радиально, в результате чего клетки приобретают неправильные
контуры с вытянутыми краевыми участками цитоплазмы. При развитии хронического типа лимфопролиферативного процесса элементы
цитоскелета в лимфоцитах собраны в короткие пучки, сосредоточенные
в околоядерном пространстве, при этом форма клеток чаще округлая и
реже неправильная.
6. В митогенстимулированных лимфоцитах, как у здоровых людей,
так и при лимфопролиферативных процессах установлено повышение
потенциала поверхности и снижение миграционной активности клеток.
7. Цитоархитетконика поверхности Кон А-стимулированных лимфоцитов представлена морфологическими образованиями нерегулярной
формы. Рельеф поверхности ФГА-стимулированных лимфоцитов был
сглажен, однако в единичных случаях идентифицировали морфологические структуры, не изменяющие общую картину цитоархитектоники.
8. На моделях митогенстимулированной пролиферации установлено
снижение жесткости лимфоцитов при хроническом типе лимфопролиферативных состояний. В условиях острого типа лимфобластной пролиферации
жесткость лимфоцитов изменяется в зависимости от природы митогена
и субпопуляции клеток.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. С целью ранней диагностики развития лейкозов, риска метастазирования и выявления индикаторов развития лейкостазов может быть
рекомендован «Способ прогнозирования течения острого и хронического
типов лимфобластного лейкоза» (патент РФ № 2541189), основанный на
комплексном подходе изучения миграционной активности, механических
и электрических свойств клеточной поверхности.
2. С целью изучения морфофизиологических параметров клеток крови, при развитии патологий может быть рекомендовано использование
инструментария на базе АСМ, в частности измерение поверхностного
потенциала и модуля Юнга лимфоцитов, а также анализ архитектоники
мембран.
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
АСМ – атомно-силовая микроскопия
Кон А – конканавалин А
ОЛЛ – острый лимфобластый лейкоз
ОМЛ – острый миелобластный лейкоз
ПП – потенциал поверхности
ФГА – фитогемагглютинин
16
ХЛЛ – хронический лимфобластный лейкоз
ХМЛ – хронический миелобластный лейкоз
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, в рамках Федеральной целевой программы «Научные
и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг.
мероприятие 1.3.2. «Проведение научных исследований целевыми аспирантами», соглашение № 14.132.21.1320 от 01.10.2013.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Патент на изобретение РФ № 2398234 «Способ исследования нативных клеток», заявка № 2009125268, дата приоритета 01.07.2009. Авторы: Федорова М.З., Скоркина М.Ю., Чернявских С.Д., Сладкова Е.А.,
Забиняков Н.А.
2. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Чернявских С.Д., Сладкова Е.А., Забиняков Н.А. Методика оценки морфометрических параметров нативных
клеток крови с использованием АСМ // Бюллетень экспериментальной
биологии и медицины. – 2010. – Т. 150, № 8. – С. 238-240.
3. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Сладкова Е.А., Забиняков Н.А.
Упругие свойства клеток крови больных лейкозом // Сборник материалов
III Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2010». – Москва. – 2010. – Т. 1. – С. 349-352.
4. Сладкова Е.А., Забиняков Н.А. Использование наномеханического
сенсора для изучения морфофункциональных профилей клеток крови //
Всероссийский конкурс научно-исследовательских работ студентов вузов в
области нанотехнологий и наноматериалов. – Москва. – 2010. – С. 210-214.
5. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Чернявских С.Д., Забиняков Н.А.,
Сладкова Е.А. Сравнительная оценка морфофункциональных характеристик нативных и фиксированных эритроцитов // Цитология. – 2011. – Т.
53, № 1. – С. 17-21.
6. Патент на изобретение РФ № 2466401 «Способ определения упругости клеток крови», заявка № 2011109741 от 15.03.2011. Авторы: Скоркина
М.Ю., Федорова М.З., Сладкова Е.А., Забиняков Н.А.
7. Скоркина М.Ю., Федорова М.З., Муравьев А.В., Сладкова Е.А.
Использование наномеханического сенсора для изучения морфофункциональных свойств лимфоцитов здоровых доноров и больных хроническим
лимфобластным лейкозом // Клеточные технологии в биологии и медицине. – 2012. – № 3. – С. 172-175.
8. Сладкова Е.А. Мембранный потенциал и упругие свойства лимфоцитов больных острым лимфобластным лейкозом // Материалы VII
сибирского съезда физиологов. – Красноярск. – 2012. – С. 483-484.
17
9. Сладкова Е.А. Сравнительная характеристика архитектоники лимфоцитов здоровых доноров и больных острым лимфобластным лейкозом
// XVII Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и
аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2012). – Черноголовка. – 2012. – С. 488-489.
10. Сладкова Е.А. Морфологические параметры и модуль упругости
лимфоцитов, активированных митогенами // Сб. мат. 16-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука
XXI века». – Пущино. – 2012. – C. 444.
11. Сладкова Е.А. Роль длины микротрубочек и морфологии клеточной поверхности в подвижности лимфоцитов, трансформированных
митогенами // Сборник материалов X Всероссийской молодежной научной конференции Института физиологии Коми «Физиология человека
и животных: от эксперимента к клинической практике». – Сыктывкар.
– 2012. – С.218-220.
12. Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю. Структурно-функциональные особенности лимфоцитов больных лимфобластным лейкозом // Цитология.
– 2013. – Т. 55, № 6. – С. 388-393.
13. Патент на изобретение РФ № 2541189 «Способ прогнозирования
течения острого и хронического типов лимфобластного лейкоза», заявка
№ 2013131646 от 09.07.2013. Авторы: Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю.,
Шамрай Е.А.
14. Сладкова Е.А. Влияние митогенов на структуру и механические
свойства плазмалеммы лимфоцитов больных ОЛЛ // Сборник материалов
17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых
«Биология – наука XXI века». – Пущино. – 2013. – C. 453-454.
15. Сладкова Е.А. Сравнительная оценка морфофизиологических
параметров лимфоцитов больных ОЛЛ и ОМЛ методом АСМ // XVIII
Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2013). – Черноголовка. – 2013.
16. Сладкова Е.А. Сравнительная оценка локомоторного потенциала
лимфоцитов больных ОЛЛ, ХЛЛ и ОЛЛ в ремиссии // Сборник материалов
IX Международной конференции «Микроциркуляция и гемореология». –
Ярославль. – 2013. – С. 43.
17. Сладкова Е.А. Влияние фитогемагглютинина на структурно-механические свойства клеточной поверхности лимфоцитов // Сборник
материалов XXII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова.
– Москва-Волгоград, 2013. – С. 486-489.
18. Сладкова Е.А., Скоркина М.Ю. Оценка поверхностного потенциала
лимфоцитов больных лейкозом методом зонда Кельвина // Биофизика. –
2014. – Т. 59, вып. 2. – С. 310-313.
19. Сладкова Е.А. Использование модифицированного сенсора для
определения жесткости клеточной поверхности // Сборник материалов
18
IV Международной научно-практической конференции «Научные перспективы XXI века. Достижения и перспективы нового столетия». – Новосибирск. – 2014. – С. 151-152.
20. Сладкова Е.А. Оценка структурно-функционального статуса митоген-трансформированных лимфоцитов // Научный результат. – 2014. – №
1 (1). – С. 12-20.
Соискатель
Е.А.Сладкова