Изучение прогностической значимости маркеров клеточной

ÕÈÐÓÐÃÈß. ÒÐÀÂÌÀÒÎËÎÃÈß È ÎÐÒÎÏÅÄÈß
УДК: 616.7: 576.3
Д.В. БУЛАНОВ
Московская городская онкологическая больница №62
ИЗУЧЕНИЕ ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ ЗНАЧИМОСТИ МАРКЕРОВ
КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА
В ОПУХОЛЯХ ГРУППЫ САРКОМЫ ЮИНГА/PNET
Научный руководитель – профессор А.Н. Махсон
В последние годы на основании данных классической морфологии и результатов,
полученных с помощью новых методов исследования (культура клеток, молекулярная
генетика, иммуногистохимия), выделена группа низкодифференцированных мелкокруглоклеточных опухолей нейроэктодермальной природы, развивающихся в мягких
тканях и костях у детей и взрослых лиц молодого возраста, для обозначения которых
предложен термин “примитивные периферические нейроэктодермальные опухоли”
(PNET). Проблема имеет весьма существенное практическое значение для проведения
дифференциальной диагностики в ряду формально похожих злокачественных опухолей (лимфома, эмбриональная рабдомиосаркома, синовиальная саркома, мелкоклеточный вариант остеосаркомы), в связи с чем примитивная нейроэктодермальная
опухоль, саркома Юинга вызывают в гистогенетическом и клинико-диагностическом
отношении особый научно-практический интерес. На основе анализа литературных
данных, примерах собственных клинических наблюдений представить морфологическую, иммуногистохимическую характеристику, критерии дифференциальной
диагностики примитивных нейроэктодермальных опухолей.
Ключевые слова: опухоль, иммуногистохимия, саркома Юинга
At the last years on the grounds of given classical morphology and result, got by means
of new methods of the study (the culture of the hutches, molecular genetics), is chosen
group of high grade malignant small round cell tumors neural natures developing in soft
tissue and bone beside child and adult persons of the young age, for indication which is
offered term “primitive neuroectodermal tumors” (PNET). The problem has more essential
practical importance for undertaking the differential diagnostics abreast formally similar
malignancies (lymfoma, embryonic rhabdomyosarcoma, synovial sarcoma, small cell
osteosarcoma), in connection with than, primitive neuroectodermal tumor, Ewing sarcoma,
cause in histogenetic and clinic-diagnostic attitude special scientifically-practical interest.
On base of the analysis literary data, the example of the own clinical observations to present
morphological, immunogistochemistry feature, criteria of the differential diagnostics and
prognosis of primitive neuroectodermal tumors.
Key words: tumor, immunogistochemistry, Ewing sarcoma
Прогресс в понимании молекулярнобиологических особенностей гистогенеза
опухолей группы саркомы Юинга/PNET
стал возможным с развитием современных методов морфологической, иммуногистохимической, цитогенетической и
молекулярно-биологической диагностики.
На сегодня количество показателей, рассматриваемых в качестве потенциальных
молекулярных маркеров, увеличивается
лавинообразно, отражая достижения и находки в области изучения механизмов регуляции, пролиферации и дифференцировки
опухолевых клеток1. Было показано, что для
семейства так называемых периферических примитивных нейроэктодермальных
опухолей (PNET) также характерно наличие ряда тканеспецифических маркеров2,
однако на сегодняшний день эти данные
противоречивы, мнения исследователей
о прогностической ценности показателей
экспрессии онкомаркеров при злокачественных мелкокруглоклеточных опухолях
костей и мягких тканей расходятся.
Цель исследования: изучить морфоиммуногистохимические признаки саркомы Юинга для обоснования критериев
прогноза заболевания.
Материалы и методы
Исследования проводили на биопсийном материале патологоанатомического
отделения Московской городской онко-
Кушлинский Н.Е., Трапезников Н.Н., Соловьев Ю.Н. и
др. Биохимические и эндокринологические исследования при остеосаркоме – основа патогенетических
методов лечения опухоли // Вестник РАМН. – 2002. - №
1. - С.71-74; Трапезников Н.Н., Мачак Г.Н., Соловьев Ю.Н.
и др. Лечение остеосаркомы конечностей на рубеже
столетий (полувековой опыт исследований) // Вестник
РАМН. – 2001. - № 9. - С.46-48.
2
1
Леенман Е.Е., Кочурова Н.В., Белогурова М.Б., Пожариский К.М.. Иммуногистохимическое исследование
мелкоклеточных сарком и факторов (NM23, 044), прогнозирующих метастазирование у детей // Вопр. онкол.
- 2003. – Т.49, № 2. – С.21-25; Fellinger E.J., Garin-Chesa P.,
Triche T.J. et al. Immunohistochemical analysis of Ewing’s
sarcoma cell surface antigen p30/32MIC2 // Am. J. Pathol.
- 1991. – Vol.139. – P.317-325.
Àñïèðàíòñêèé âåñòíèê Ïîâîëæüÿ ¹ 3-4, 2009
83
ÕÈÐÓÐÃÈß. ÒÐÀÂÌÀÒÎËÎÃÈß È ÎÐÒÎÏÅÄÈß
логической больницы №62. В протокол
исследования был включен биопсийный
материал, полученный при толстоигольной
биопсии от 35 больных с морфологически
верифицированным диагнозом саркомы
Юинга (24-мужчин, 11-женщин, медиана
возраста составила 26,8 лет). Использовали парафиновые срезы, окрашенные
гематоксилин-эозином и по Ван Гизон.
Оценивали показатели обнаружения (частоту обнаружения и степень выраженности
– долю клеток, экспрессирующих данный
маркер) следующих факторов: маркеров
апоптоза bax и bcl-2, ядерного маркера
PCNA, маркера клеточной пролиферации
Ki-67, белка p53.
Иммуногистохимическое исследование
с помощью иммунопероксидазного метода
проводилось на срезах с парафиновых блоков толщиной 3-4 мкм.
После депарафинизации и обезвоживания в целях блокирования эндогенной
пероксидазы срезы обрабатывали 0,3%
Н2О2 в течение 20 мин., промывали в
дистиллированной воде и с целью демаскировки антигенных детерминант подвергали температурной обработке в буферах
рН = 6,0 (Target Retrievel solution, DAKO)
в СВЧ-печи длительностью 20 мин. или
на «водяной бане» в течение 30 мин. при
t = 98 °С. Для ряда антител использовался
EDTA-буфер с рН = 9,0, температурную обработку в этом случае проводили в течение
30-35 мин. После отмывания в TBS 3 раза
по 5 мин. наносились первичные мышиные или кроличьи антитела. Инкубацию
с первичными антителами проводили во
влажной камере в течение 30-60 мин (в
зависимости от маркеров — цитоплазматических, мембранных или ядерных) при
комнатной температуре. После инкубации с
первичными антителами срезы промывали
в TBS 3 раза по 5 мин, затем на 30 мин. при
комнатной температуре наносился авидинбиотиновый комплекс, конъюгированный
с пероксидазой, с использованием LSAB+,
Dako (двухшаговый метод) или системы
детекции EnVision+ (Dako) (одношаговый
метод) в течение 30 мин. при комнатной
температуре. Выявление пероксидазной
активности осуществляли с помощью DAB+
(Dako). Ядра докрашивали гематоксилином.
При использовании системы детекции
EnVision+ методика сокращалась на один
«шаг», так как после первичных антител
наносился полимер, конъюгированный с
вторичными антителами к иммуноглобулинам мыши и кролика, и ферментом.
Обработку данных проводили на персональном компьютере в программе «Статистика» (Statsoft, Inc). Сравнительный анализ
84
параметрических признаков проводился с
помощью критерия Стьюдента, непараметрических количественных признаков проводился с помощью критерия Манна-Уитни.
Для сравнения качественных признаков
использовались критерии хи-квадрат (x2)
и Фишера.
Для определения наличия и количественной характеристики выраженности
связи между отдельными структурно-функциональными показателями проводили
с помощью корреляционного анализа с
использованием коэффициента ранговой
корреляции Спирмена.
Результаты исследований
Изучение частоты обнаружения различных факторов на срезах показало, что в
целом у всех обследованных пациентов выявлялись: маркер клеточной пролиферации
Ki-67 и ядерный фактор PCNA, более чем
у половины пациентов было обнаружено
наличие белка p53, маркеры bcl-2 и bax обнаруживались примерно у трети больных,
соответственно в 37,8 % и 34,5 % случаев.
Количественная оценка экспрессии
вышеперечисленных маркеров показала,
что наибольшим таковой показатель для
маркеров Ki-67 и PCNA, соответственно
- 81,5+6,4 % и 80,3+5,7 %. Относительно низким был у больных саркомой Юинга/PNET
уровень экспрессии белка p53 - 14,7+3,9 %,
значение данного показателя для маркера
bcl-2 составило 12,9+4,1 %. Самым низким
у обследуемых был уровень экспрессии
маркера bax – доля таких клеток составила
лишь 6,9+2,5 %.
Если фактор клеточной пролиферации
Ki-67 и ядерный фактор PNCA выявлялись
у всех больных независимо от пола, то маркер p53 чаще обнаруживались у женщин – в
83,3 % случаев, в то время как у пациентов
мужского пола – достоверно реже – лишь
в 56,5 % случаев. Наряду с этим маркер
апоптоза bcl-2 был выявлен только у 16,7
% больных женского пола и достоверно
(p<0,05) чаще обнаруживался у мужчин – в
39,1 % случаев. Что же касается маркера bax,
то частота его обнаружения в биоптатах
больных саркомой Юинга и PNET не различалась в зависимости от пола и составила
30,4 % у мужчин и 33,3 % у женщин.
Сравнение выраженности экспрессии
не выявило отличий для маркеров Ki-67 и
PCNA, значения этих показателей у мужчин
составляли, соответственно 78,6+4,9 % и
80,0+5,8 %, а у женщин – соответственно
89,2+6,6 % и 80,0+4,3 %. В то же время у женщин было достоверно (p<0,05) больше клеток, экспрессирующих белок p53 (21,7+1,8
%), тогда как у больных саркомой Юинга
и PNET значение данного показателя со-
Íàó÷íî-èíôîðìàöèîííûé ìåæâóçîâñêèé æóðíàë
ÕÈÐÓÐÃÈß. ÒÐÀÂÌÀÒÎËÎÃÈß È ÎÐÒÎÏÅÄÈß
ставило 14,1+1,9 %. Напротив, экспрессия
маркера апоптоза bcl-2 у мужчин составила
13,7+2,5 %, более чем в 3 раза превышая
уровень соответствующего показателя у
женщин 4,2+0,8 %. Уровень экспрессии фактора bax у мужчин также был достоверно
(p<0,05) выше такового у женщин, значения
показателей составили, соответственно
8,5+1,0 % и 5,0+1,1 %.
Оценка возрастных отличий экспрессии маркеров показала, что они также в
первую очередь характерны для белка р53
и фактора апоптоза bcl-2. Так, если фактор
клеточной пролиферации Ki-67 и ядерный
фактор PCNA обнаруживались у больных
всех возрастов, то маркер р53 достоверно
(p<0,05) чаще был выявлен у относительно
молодой популяции больных саркомой
Юинга и PNET (в 68,4 % случаев), в то время
как этот белок обнаруживался несколько
реже - у 50 % больных более старшего возраста. Наиболее выраженным было отличие
по частоте обнаружения маркера bcl-2,
данный фактор апоптоза был выявлен у 70,0
% больных старшей возрастной группы и
лишь у 21,1 % пациентов больных в возрасте до 30 лет. Частота обнаружения другого
фактора апоптоза bax была примерно на
одном уровне – его выявили у 36,8 % молодых пациентов и у 30 % больных более
старшего возраста.
Сравнение выраженности экспрессии
изучаемых маркеров в клетках опухоли в
зависимости от возраста больных продемонстрировало аналогичную картину. Так,
если для маркеров пролиферации Ki-67 и
PCNA значения данного показателя было
примерно на одном уровне, то белок p53
обнаруживался в 18,2+5,9 % клетках у больных до 30 лет, что было достоверно (p<0,05)
выше соответствующего значения в группе
больных старшего возраста - 8,0+1,8 %. Резко
выраженными были различия экспрессии
маркера bcl-2 в сравниваемых возрастных
группах. Так, если у относительно молодых
пациентов значение данного показателя составило лишь 2,9+1,8 %, то у больных саркомой Юинга и PNET в возрасте до 30 лет этот
маркер апоптоза был больше на порядок,
составив 32,0+5,1 %. Сравнение показателя
экспрессии другого фактора апоптоза - bax
- не позволило выявить достоверных отличий, хотя в группе относительно молодых
больных его значение составило 7,9+3,0 % и
несколько превышало таковое в подгруппе
пациентов старшего возраста – 5,5+3,9 %.
Сравнительная характеристика обнаружения в срезах больных в зависимости от
выявления метастазов продемонстрировала отличия по маркерам p53 и bax. Так, если
частота обнаружения фактора пролифе-
рации маркера Ki-67 и ядерного фактора
PCNA была одинаковой – они выявлены у
всех больных саркомой Юинга/PNET вне
зависимости от наличия у них метастазов,
то маркер p53 значительно чаще был выявлен у 78,6 % больных с метастазами и только
в 46,7 % случаев у пациентов с отсутствием
таковых.
Несколько реже при обнаружении метастазов находили маркер апоптоза bcl-2 – в
35,7 % случаев, тогда как он был выявлен у
46,7 % пациентов с отсутствием метастазов.
Наконец, наиболее выраженные отличия
обнаружены были для маркера bax – отсутствие метастазов ассоциировалось его
обнаружением у 53,3 % больных, в то время
как при наличии метастазов его выявили
лишь в 14,3 % случаев.
Оценка выраженности экспрессии маркеров в клетках опухоли продемонстрировала несколько большее количество клеток,
экспрессирующих маркер пролиферации
Ki-67, у пациентов с метастазами – у таких
больных значение данного показателя
составило 89,4+10,8 %, при этом наблюдалась тенденция к превышению такового
показателя в группе больных с отсутствием
метастазов – 74,0+6,9 %. Экспрессия маркера PCNA у больных саркомой Юинга и
PNET была примерно одинаковой, независимо от наличия метастазов и отсутствия
таковых, соответственно - 81,1+16,9 % и
79,7+11,2 %.
Достоверно (p<0,05) более выраженной
была экспрессия белка p53 при обнаружении метастазов (21,1+5,7 %), в то время
как при их отсутствии - 8,7+2,0 %. Уровень
экспрессии маркера bcl-2 был на одном
уровне в обеих подгруппах пациентов, в то
время как значение данного показателя для
другого показателя апоптоза bax - составило 3,2+1,3 %, что было достоверно (p<0,05)
меньше такового в подгруппе пациентов, у
которых метастазов обнаружено не было
- 10,7+1,8 %.
Изучение взаимосвязи течения заболевания с уровнем выявления маркеров пролиферации и апоптоза продемонстрировало существенные отличия для факторов
p53, bcl-2 и bax в зависимости от прогрессирования или ремиссии у пациентов. Так,
маркеры Ki-67 и PCNA обнаруживались у
всех пациентов, больных саркомой Юинга
и PNET, а частота обнаружения белка p53 у
больных с прогрессированием заболевания
- 80,0 %. Значение данного показателя было
почти в 2 раза (p<0,05) выше по сравнению
с частотой обнаружения данного фактора
у пациентов с ремиссией заболевания (42,9
%). Также почти в 2 раза чаще при неблагоприятном лечении заболевания у больных
Àñïèðàíòñêèé âåñòíèê Ïîâîëæüÿ ¹ 3-4, 2009
85
ÕÈÐÓÐÃÈß. ÒÐÀÂÌÀÒÎËÎÃÈß È ÎÐÒÎÏÅÄÈß
саркомой Юинга и PNET обнаруживался и
маркер bcl-2 (в 46,7 % случаев), в то время как
у пациентов с ремиссией значение данного
показателя составило лишь 28,6 %. Наряду с
этим выявление еще одного маркера - bax
- чаще отмечено у больных с ремиссией (в
50,0 % случаев) и лишь у 20,0 % больных с
прогрессированием заболевания.
Оценка уровня экспрессии изучаемых
маркеров в опухолевых клетках больных
саркомой Юинга и PNET показала большую
ее выраженность (91,7+12,5 %) для фактора
пролиферации Ki-67 при прогрессировании, в то время как у больных с ремиссией
значение данного показателя составило
70,5+8,8 %, хотя достоверных отличий
межгрупповых значений установлено не
было.
На одном уровне была выраженность
экспрессии маркера PCNA при различном
течении заболевания, в то же время уровни
экспрессии маркеров p53 и bcl-2 составили у
пациентов с прогрессией заболевания соответственно 21,3+6,3 % и 17,7+5,0 %, что достоверно (p<0,05) превышало соответствующие
значения у пациентов с ремиссией – 7,5+4,8
% для белка p53 и 7,9+5,1 % для маркера
апоптоза bcl-2. Экспрессия же маркера bax в
клетках опухолей пациентов с относительно
благоприятным течением заболевания была
более выраженной, составив 11,8+3,5 %, что
достоверно (p<0,05) превышало таковое в
подгруппе пациентов с прогрессированием
заболевания – 2,7+2,0 %.
Результаты корреляционного анализа
свидетельствуют о наличии ряда взаимосвязей между исследуемыми показателями. Так, выявлено наличие прямой
умеренной связей (r=0,32) связи между
показателями «возраст» и «прогрессирование заболевания», однако выявленная
связь недостоверна (p<0,05). Экспрессия
маркера пролиферации Ki-67 была умеренно положительно связана с показателем
возраст (r=0,30; p>0,05), однако наиболее
выраженной была взаимосвязь возраста
с уровнем экспрессии маркера апоптоза
bcl-2 - выявлена прямая сильная (r=0,82)
достоверная связь. В то же время уровень
экспрессии ядерных маркеров PCNA и p53
была отрицательно связан с возрастом,
коэффициенты корреляции составили
соответственно r=-0,26 и r=-0,27.
Более выраженными были взаимосвязи
исследуемых параметров с частотой обнаружения метастазов и течением заболевания. Так, было установлено наличие прямой
достоверной связи показателя «метастазы»
с уровнем экспрессии маркера Ki-67 (r=0,44;
p<0,05) а также аналогичной - для белка p53
(r=0,41; p<0,05). В то же время показатель
86
экспрессии маркера апоптоза bax был связан отрицательно с обнаружением метастазов (r=-0,31). Для показателя «прогрессирование» были выявлены аналогичные, более
сильные достоверные связи. Так, выявленная
прямая положительная связь с прогрессией
заболевания для уровней экспрессии маркеров Ki-67 (r=0,60) и p53 (r=0,46), в то же время значение коэффициента корреляции для
связи маркера апоптоза bax с прогрессией
заболевания составило r=-0,38.
Обсуждение результатов
В настоящее время общепризнанно,
что патоморфологические особенности
саркомы Юинга /PNET, выявляемые при
гистологическом исследовании, являются
недостаточными для установления окончательного диагноза3. Проводимое в последние годы активное и целенаправленное
изучение саркомы Юинга позволило выявить множество опухолеспецифических
генетических повреждений, являющихся
промоторами неконтролируемой клональной пролиферации4. Наши исследования
подтверждают, что разнообразные дефекты
генома обусловливают клиническую гетерогенность злокачественных новообразований изучаемой группы и являются значимыми прогностическими факторами.
В нашем исследовании установлено, что
у всех больных экпрессируются маркер
клеточной пролиферации Ki-67 и ядерный
фактор PCNA. Наличие белка p53 выявляется
более чем в половине случаев, значительно
реже выявляются bcl-2 и bax. Наибольшей
является выраженность экспрессии для Ki67 и PCNA, относительно низкий уровень
экспрессии белка p53, bcl-2 и bax.
Проведенные исследования показали,
что обнаружение маркеров может быть
в определенной мере прогностическим
фактором дальнейшего течения заболевания. Установлена зависимость частоты и
выраженности экспрессии от обнаружения
метастазов и прогрессирования опухоли.
Так, у пациентов с метастазами был выше
уровень экспрессии белка p53.
Наряду с этим, для маркеров bcl-2 и bax
было выявлено обратное соотношение
3
Cavazzana A.O., Magnani J.L., Ross R.A. et al. Ewing’s sarcoma
is an undifferentiated neuroectodermal tumor // Prog.
Clin. Biol. Res. – 1988. – Vol.271. – P.487-498.; De Vita V.,
Hellmann S., Rosenberg S. Cancer: Principles and Practice of
Oncology, 6 th Edition. - Published by Lippincott Williams &
Wilkins, 2001; Fletcher C.D., Unni K.K., Mertens F. Pathology
and genetics of tumors of soft tissue and bone. – Lyon: IARC
Press, 2002.
4
De Alva E., Kawai A., Healey J.H. et al. EWS-FLI1 fusion
transcript structure is an independent determinant of
prognosis in Ewing’s sarcoma // J. Clin. Oncol. – 1998.
– Vol. 16. – P. 1248; Folpe A.L., Goldblum J.R., Rubin B.P. et al.
Morphologic and immunophenotyping diversity in Ewing
family tumors. A study of 66 genetically confirmed cases //
Am. J. Surg. Pathol. - 2005. – Vol.29. – P.1025-1033.
Íàó÷íî-èíôîðìàöèîííûé ìåæâóçîâñêèé æóðíàë
ÕÈÐÓÐÃÈß. ÒÐÀÂÌÀÒÎËÎÃÈß È ÎÐÒÎÏÅÄÈß
– для последнего отсутствие метастазов
ассоциировалось его обнаружением у 53,3
% больных, в то время как при наличии
метастазов его выявили лишь в 14,3 % случаев. Подобная тенденция наблюдалась и в
отношении показателей, характеризующих
выраженность экспрессии маркера bax.
Установлены существенные отличия для
факторов p53, Ki-67, bcl-2 и bax в зависимости от прогрессирования или ремиссии
у пациентов: при неблагоприятном течении
опухоли высокой была частота обнаружения
белка p53, маркера апоптоза bcl-2. В то же
время выявление маркера bax чаще было отмечено у больных с ремиссией. Выявленная
закономерность была характерна как для частоты выявления, так и для показателя уровня
экспрессии вышеупомянутых маркеров.
Выявленные тенденции были подтверждены и охарактеризованы количественно
с помощью корреляционного анализа,
результаты которого свидетельствовали о
наличии ряда взаимосвязей между исследуемыми показателями.
В целом следует отметить, что несмотря
на значительный прогресс знаний в области
костной патологии, до настоящего времени
остается много неясного в вопросах диагностики мелкокруглоклеточных опухолей костей и мягких тканей. В исследованиях последних лет всё чаще предпринимаются попытки
установить прогностическую значимость
различных цитогенетических маркеров для
данного вида опухолей. На наш взгляд, учет
морфологических факторов прогноза может послужить важнейшим инструментом
выработки стратегии лечения исследуемой
группы опухолей и позволяет надеяться на
достижение значимых результатов в лечении
больных с данной патологией.
Àñïèðàíòñêèé âåñòíèê Ïîâîëæüÿ ¹ 3-4, 2009
87