Окислительное повреждение глутатион S

Биология
УДК 615.451.16
Е.О. КОРИК, И.В. СЕМАК
ОКИСЛИТЕЛЬНОЕ ПОВРЕЖДЕНИЕ ГЛУТАТИОН S-ТРАНСФЕРАЗ ПЕЧЕНИ КРЫС
ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С МЕДЬЮ И БИЛИРУБИНОМ
It was investigated oxidative damage of glutathione S-trasferases from rat liver in the presence of copper and
bilirubin.
Одну из ключевых позиций в поддержании внутриклеточного гомеостаза занимает мультифункциональное полиизоферментное семейство глутатион S-трансфераз (ГТ), играющее
определяющую роль в формировании резистентности клетки к самым различным химическим и физическим воздействиям [1]. ГТ катализируют реакции конъюгации ксенобиотиков и
их реакционноспособных метаболитов с глутатионом, восстанавливают органические гидропероксиды, участвуют в метаболизме конечных цитотоксичных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Кроме того, ГТ обеспечивают связывание и внутриклеточный транспорт ряда эндогенных лигандов (билирубина, желчных кислот, жирных кислот, производных
гема, нейромедиаторов и стероидных гормонов), что позволяет рассматривать их в качестве
внутриклеточных белков-переносчиков.
Глутатион S-трансферазы печени благодаря высокой внутриклеточной концентрации и
способности каждой молекулы белка связывать несколько лигандов обеспечивают в физиологических условиях эффективное поддержание гомеостаза гепатоцитов. Значительный лигандсвязывающий потенциал ГТ должен предотвращать реализацию токсических эффектов
промежуточных и конечных продуктов клеточного метаболизма (билирубина, жирных и желчных кислот), накапливающихся в избыточных количествах в гепатоцитах при заболеваниях
печени. Однако в реальности этого не происходит по причинам, которые до сих пор не ясны.
Характерной особенностью заболеваний печени является избыточное накопление в гепатоцитах не только билирубина и желчных кислот, но и меди, которая может образовывать металлокомплексы с билирубином. Реакция комплексообразования сопровождается генерацией
активных форм кислорода (АФК), способных повреждать белки, нуклеиновые кислоты и инициировать процессы ПОЛ. Не исключено, что ГТ печени, обеспечивающие связывание и
транспорт билирубина, в условиях повышенного содержания меди в гепатоцитах подвергаются окислительному повреждению, что объясняет снижение их лигандсвязывающего потенциала при заболеваниях печени.
Принимая это во внимание, в условиях in vitro было изучено окислительное повреждение
ГТ печени крыс в присутствии меди и билирубина.
Материал и методика
В работе использовали аффинноочищенные препараты ГТ из печени крысы, полученные
с помощью глутатион-сефарозы 4В (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden).
Окислительное повреждение ГТ в системе Cu2+/билирубин. ГТ инкубировали в реакционной смеси, содержащей 10 мМ трис-HCl буфер (рН 7,4), 200 мкМ билирубина и 200 мкМ
CuCl2, в темноте при 37 °С в течение 2, 4, 6 ч. Аликвоту реакционной смеси использовали
для последующего электрофоретического анализа. Электрофорез белков проводили в
42
Биология
12,5 % полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по методу [2]. Гели, окрашенные Кумасси R-250, подвергались денситометрическому анализу с помощью специализированного программного обеспечения фирмы Amersham Pharmacia.
Оценка лигандсвязывающей активности ГТ. Для оценки способности ГТ связывать
медь и билирубин использовали метод тушения собственной флуоресценции ГТ. Инкубационную среду, содержащую 10 мМ трис-HCl (рН 7,4), ГТ (120 мкг или 2 мкМ), титровали CuCl2
(10÷500 мкМ) либо билирубином (0,01÷4 мкМ), регистрировали собственную флуоресценцию
ГТ при 330 нм, используя длину волны возбуждения 285 нм. Спектрофлуориметрический
анализ проводили с помощью спектрофлуориметра Cary ECLIPSЕ (Varian, Австралия).
Число сайтов связывания определяли по методу Хофмана – Нишиды, используя белок в
двух концентрациях, отличающихся друг от друга в 10 раз [3].
Результаты и их обсуждение
В настоящее время окислительное повреждение белков рассматривается как цепная реакция, в ходе которой образовавшееся при взаимодействии с АФК гидроксипроизводное
белка распадается на карбонильные фрагменты, являющиеся конечными продуктами пероксидной деструкции полипептидной цепи [4]. Согласно теории металлкатализируемого пероксидного повреждения белков образование гидроксилированных производных аминокислот обусловлено функционированием специфических электрондонорных систем, восстанавливающих молекулярный кислород до пероксида водорода и феррикатион (Fe3+) в
ферроформу (Fe2+) [5]. На первом этапе происходит связывание иона Fe2+ с поверхностью
белка. После чего с образовавшимся комплексом белок-Fe2+ реагирует пероксид водорода, в
результате чего происходит генерация in situ гидроксильного радикала, взаимодействующего с аминокислотным остатком при металлсвязывающем участке белка.
Для моделирования in vitro окислительного повреждения ГТ при заболеваниях печени мы
использовали феномен генерации АФК при взаимодействии ионов Cu2+ с билирубином. Полагают, что при образовании металлокомплекса два иона Cu2+ связываются с азотом двух
терминальных пиррольных колец билирубина [6]. Кроме того, Cu2+ может дополнительно
взаимодействовать с карбоксильными группами билирубина. При формировании металлокомплекса Cu2+ восстанавливается до Cu1+, который быстро реокисляется в Cu2+ молекулярным кислородом. Образовавшийся при этом супероксиданион-радикал спонтанно дисмутирует в пероксид водорода. Последний, в свою очередь, взаимодействует с Cu1+ в составе
комплекса, генерируя при этом гидроксильный радикал, способный повреждать белки, нуклеиновые кислоты и липиды.
В качестве мишени мы использовали аффинноочищенную ГТ печени крыс. Реакционная
смесь, содержащая ГТ, билирубин и Cu2+, анализировалась с помощью SDS-электрофореза
в полиакриламидном геле. Денситометрический анализ окрашенных Кумасси R-250 гелей
показал, что увеличение времени инкубации
ГТ в присутствии Cu2+ и билирубина сопровождается уменьшением интенсивности окрашивания электрофоретических полос, соответствующих нативным субъединицам ГТ (Ya,
Yb1/Yb2, Yc) (рис. 1). Обнаруженный феномен,
по-видимому, обусловлен фрагментацией молекул ГТ в системе Cu2+ – билирубин. Следует
отметить, что ни Cu2+, ни билирубин сами по
себе не влияли на ГТ. Повреждение ГТ в системе достигало максимальных значений через
6 ч инкубации (см. рис. 1).
Вызывает интерес выраженная в разной
степени окислительная деградация различных
Рис. 1. Денситометрический анализ изменения
изоферментов ГТ. Наиболее подверженными
интенсивности окрашивания белковых полос,
повреждающему действию АФК оказались
соответствующих нативным субъединицам
изоферменты класса альфа ГТ (субъединицы (Ya, Yb (Yb1/Yb2), Yc) ГТ печени крыс, в зависимости
от времени инкубации в системе Cu2+ – билирубин
Ya и Yc) (см. рис. 1). Полученные результаты
43
Вестник БГУ. Сер. 2. 2008. № 3
коррелируют с данными эксперимента in vivo, согласно которым при внепеченочном холестазе в первую очередь уменьшается содержание и активность именно этих изоферментов [7].
Гидроксильный радикал вследствие чрезвычайно высокой реакционной способности не может
преодолеть расстояние от места образования до
точки взаимодействия, превышающее 5÷10 его
собственных диаметров [8]. При этом практически
любая молекула, встретившаяся на его пути, является потенциальной ловушкой. Это обстоятельство существенно ограничивает возможность гидроксильного радикала, генерируемого в системе
Cu2+ – билирубин, вступать в реакцию с белками,
несмотря на то, что они являются легко окисляемыми субстратами. В этой связи очевидно, что в
случае ГТ повреждающее действие будут оказывать гидроксильные радикалы, которые образовались в непосредственной близости от белковой
поверхности, что предполагает первоначальное
взаимодействие Cu2+ и/или билирубина с ГТ.
Учитывая это, с помощью метода тушения собственной белковой флуоресценции мы изучили
способность изоферментов YaYc и YсYc ГТ связывать билирубин и Cu2+ [9]. Известно, что белки,
содержащие ароматические аминокислоты (триптофан и в меньшей степени – тирозин), флуоресцируют в области 340÷350 нм. Связывание лиганда (тушителя) с молекулой белка сопровождается
тушением собственной белковой флуоресценции.
Согласно нашим данным, титрование ГТ Cu2+
вызывает уменьшение интенсивности белковой
флуоресценции, причем длина волны максимума
спектра эмиссии сохраняется. Это свидетельствует о том, что микроокружение остатков триптофана
в молекуле белка не изменяется. Данные по тушению были представлены в координатах Штерна –
Фольмера (F0/F от [Q], где F0 и F – интенсивности
флуоресценции в отсутствие и в присутствии тушителя (Q) соответственно) (рис. 2).
Ожидается, что соотношение F0/F линейно зависит от концентрации тушителя. Прямолинейная
зависимость в координатах Штерна – Фольмера
обычно указывает на существование в растворе
одного типа флуорофоров, одинаково доступных
Рис. 2. Флуориметрический анализ
2+
для тушителя. Если присутствуют два типа флуовзаимодействия Cu и билирубина с ГТ:
рофоров и один из них недоступен для тушителя,
а – тушение собственной белковой
флуоресценции ГТ Cu2+;
то экспериментальная кривая отклоняется от либ – «исправленный» график тушения
нейности в сторону оси x. Подобный феномен чассобственной белковой флуоресценции ГТ Cu2+,
то
встречается при тушении флуоресценции трипF0испр и Fиспр – интенсивности флуоресценции
2+
тофана
в белках полярными или заряженными тув отсутствие и в присутствии Cu соответственно;
шителями, которые с трудом проникают внутрь
в – тушение собственной флуоресценции
аффинноочищенных ГТ билирубином
белковой глобулы и тушат только остатки триптофана на поверхности белка [9]. В случае Cu2+ и ГТ
кривая отклоняется от линейности в сторону оси y (рис. 2 а), что может быть обусловлено
либо эффектом внутреннего фильтра и/или образованием комплекса флуорофора и туши44
Биология
теля. С целью исключения эффекта внутреннего
фильтра для построения кривой были использованы
исправленные интенсивности флуоресценции, которые вычисляли с помощью уравнения
Fиспр = Fнабл · 10 (Авозб + Аисп)/2,
где Авозб – поглощение при длине волны возбуждения;
Аисп – поглощение при длине волны испускания.
График, построенный с учетом откорректированных интенсивностей, сохранял нелинейность, что
свидетельствует в пользу образования комплекса
флуорофора и тушителя (рис. 2 б).
Титрование ГТ билирубином, как и в случае с Cu2+,
вызывает уменьшение интенсивности флуоресценции ГТ. Однако для билирубина, в отличие от Cu2+,
зависимость в координатах Штерна – Фольмера отклоняется от линейности в сторону оси х (рис. 2 в),
что, как уже отмечалось, характерно для полярных
или заряженных тушителей, которые с трудом проникают внутрь белковой глобулы и тушат только остатки триптофана на поверхности белка [9].
Обнаруженные различия в эффектах, вызываемых
Cu2+ и билирубином, обусловлены, по-видимому,
природой тушителей, а также специфичностью их
взаимодействия с ГТ. Так, билирубин в первую очередь связывается с лигандсвязывающими сайтами
ГТ, в то время как для Cu2+, скорее всего, характерно
неспецифическое связывание с белковой поверхностью.
Вызванное билирубином и Cu2+ тушение собственной белковой флуоресценции было использовано
для определения стехиометрии связывания. Число
сайтов связывания определяли по методу Хофмана –
Нишиды. Отношение молярной концентрации связанного лиганда к белку ν было рассчитано, исходя
из общей концентрации добавленного лиганда на
1 моль белка (Ct/P):
P (C / P ) a − Pb (Ct / P )b
ν= a t
.
(1)
Pa − Pb
Для каждого выбранного значения Ct/P соотношение ∆F/∆Fmax должно быть одинаковым для двух концентраций белка – Pa и Рb.
Концентрацию свободного лиганда (С) рассчитывали для каждого значения ν согласно уравнению, в
котором Р взято в наименьшей концентрации:
Рис. 3. Тушение билирубином и Cu2+ собственной
C = P (Ct / P − ν ).
(2)
флуоресценции глутатион S-трансфераз
в координатах Хофмана – Нишиды:
Данные по тушению флуоресценции для Cu2+ и
связывание билирубина: а – с YaYc; б – с YcYc;
изофермента YaYc были обработаны в координатах
связывание Cu2+: в – с YaYc; г – с YaYc.
На
вставках
графиков а и б приводятся кривые связывания
Скэтчарда. В остальных случаях график в этих коорбилирубина с изоферментами YaYc и YcYc в координатах
динатах носил нелинейный характер, и поэтому ана- Хилла, на вставках графиков в и г – кривая связывания Cu2+
с изоферментом YaYc в координатах Скэтчарда и кривая
лиз проводили в координатах Хилла (рис. 3).
связывания Cu2+ с изоферментом YcYc в координатах
Полученные данные свидетельствуют о том, что
Хилла соответственно.
Концентрация белка составляла (мкмоль) 0,317 – (1) и
изоферменты YaYc и YcYc имеют 3 и 2 центра свя- 3,17
– (2) для изофермента YaYc; 0,371 – (1) и 3,71 – (2)
для изофермента YcYc
зывания билирубина (n) соответственно. В то время
45
Вестник БГУ. Сер. 2. 2008. № 3
как для Cu2+ обнаружено 86 сайтов, что подтверждает высказанное ранее предположение о
неспецифическом связывании ионов меди с белковой поверхностью ГТ (таблица).
Лигандсвязывающие параметры ГТ
Лиганд
Билирубин
Cu2+
KД, мкмоль
n
YaYc
YcYc
YaYc
YcYc
9,6
0,04
5
–
3,1
86,03
1,96
–
Сравнение констант диссоциации (КД) свидетельствует о более прочном по сравнению с
билирубином связывании Cu2+ с изоферментом YaYc.
С учетом этого можно предложить следующую схему окислительного повреждения ГТ в
системе Cu2+ – билирубин:
билирубин + ГТ → билирубин-ГТ
(1)
Cu2+ + билирубин-ГТ → Cu1+-билирубин-ГТ
(2)
Cu1+-билирубин-ГТ + O2 → Cu2+-билирубин-ГТ + О2–•
(3)
2О2–• + 2H+ → Н2О2 + O2
(4)
1+
Cu -билирубин-ГТ + Н2О2 → Cu2+-билирубин-ГТ +•ОН + HO–
(5)
Билирубин фиксируется в лигандсвязывающем сайте фермента (1). Cu2+ связывается с билирубином, восстанавливаясь при этом до Cu1+ (2). В свою очередь, в результате взаимодействия молекулярного кислорода с Cu1+ генерируется супероксиданион-радикал (3), который спонтанно дисмутирует в пероксид водорода (4). Последний in situ вступает в реакцию
Фентона с Cu1+ (5). Образовавшиеся гидроксильные радикалы модифицируют расположенные в непосредственной близости аминокислотные остатки. Полагают, что наиболее чувствительными к металлопосредованному окислению являются пролин, гистидин, аргинин, лизин и цистеин [5]. Полученное таким образом гидроксипроизводное белка способно распадаться, генерируя карбонильные фрагменты, являющиеся конечными продуктами окислительной деструкции полипептидной цепи.
В печени депонируется до 90 % меди, попадающей в организм человека. В норме содержание меди составляет менее 58 мкг на 1 г сухой массы печени. При заболеваниях печени
содержание меди увеличивается многократно, достигая значений 169÷356 мкг на 1 г сухой
массы печени [10], что может в конечном итоге превысить лигандсвязывающий потенциал
естественных сайтов ее аккумуляции. В свою очередь, это приведет к росту количества неспецифических сайтов, содержащих медь. Если такой сайт локализован на белке, то гидроксильный радикал может реализовать свой токсический потенциал in situ, избежав непосредственного контакта с эндогенными соединениями, в том числе с внутриклеточными антиоксидантами. Таким образом, при заболеваниях печени создаются реальные условия для
окислительного повреждения белков за счет существенного роста количества потенциальных центров генерации гидроксильного радикала на поверхности их молекул. ГТ являются
внутриклеточными транспортными белками, способными эффективно связывать как ионы
Cu2+, так и билирубин, что делает их особенно уязвимыми для АФК.
Принимая во внимание данные экспериментов in vivo и in vitro, можно допустить, что снижение лигандсвязывающего потенциала ГТ при заболеваниях печени в значительной степени обусловлено их окислительным повреждением, приводящим к спонтанной фрагментации
белковой молекулы и к ускорению протеолитической деградации фермента [11].
***
Связывание Cu2+ и билирубина с ГТ сопровождается тушением собственной белковой
флуоресценции данных ферментов. Изоферменты YaYc и YcYc имеют 3 и 2 центра связывания билирубина соответственно. В то же время для Cu2+ у изофермента YaYc обнаружено
86 сайтов связывания.
Взаимодействие Cu2+ и билирубина, связавшихся с белковой поверхностью, приводит к
неконтролируемому образованию АФК и окислительному повреждению ГТ с последующей
спонтанной фрагментацией белковой молекулы, что подтверждается данными электрофоретического анализа.
46
Биология
Субъединицы класса альфа (Ya и Yc) являются наиболее чувствительными к окислительному повреждению, что частично объясняет более выраженное по сравнению с классом мю
снижение их содержания при заболеваниях печени.
1. L i s t o w s k y I . // Physiology and Pathophysiology. 1993. P. 397.
2. L a e m m l i U . K . // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680.
3. J e a n n e N . K e t l e y , W i l l i a m H . H a b i g , W i l l i a m B . J a k o b y // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. № 2. P. 8670.
4. Ц е л и н с к и й И . В . , Ш у г а л е й И . В . , Л у к о г о р с к а я С . А . // Рос. хим. журн. 2001. Т. 45. № 2. C. 35.
5. S t u d t m a n E . R . // Free Rad. Biol. Med. 1990. Vol. 9. № 4. P. 315.
6. A s a d S . F . , S i n g h S . , A h m a d A . et al. // Chem. Biol. Interact. 2001. Vol. 137. № 1. P. 59.
7. С е м а к И . В . , К о р и к Е . О . // Биологически активные соединения в регуляции метаболического гомеостаза: Материалы междунар. науч. конф.: в 2 ч. / Под общ. ред. Л.И. Нефедова. Гродно, 2000. Ч. 2. C. 178.
8. C a d e n a s E . , D a v i e s K . J . A . // Free Radic. Biol. & Med. 2000. Vol. 29. P. 222.
9. К у д р я ш о в а Е . В . , Г л а д и л и н А . К . , Л е в а ш о в А . В . // Успехи биол. химии. 2002. Т. 42. С. 257.
10. G o l d f i s c h e r S . , P o p p e r H . , S t e r n l i e b I . // Am. J. Pathol. 1980. Vol. 99. № 3. P. 715.
11. H u n t J . V . , S i m p s o n J . A . , D e a n R . T . // Biochem. J. 1988. Vol. 250. P. 87.
Поступила в редакцию 15.08.08.
Елена Олеговна Корик – научный сотрудник НИЛ биохимии обмена веществ.
Игорь Викторович Семак – кандидат биологических наук, доцент, заведующий кафедрой биохимии.
47