IgG Rheumatoid Factor ELISA

IgG Rheumatoid Factor ELISA, EUROIMMUN
1
_____________________________________________________________________________________________________
Ревматоидный фактор IgG (IgG Rheumatoid Factor ELISA)
Иммуноферментный тест для количественного или полуколичественного определения IgG ревматоидного
фактора в сыворотке и плазме крови человека
Номер по каталогу: EA 1814-9601 G
Набор рассчитан на 96 определений
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для диагностики ревматоидного артрита.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Набор для иммуноферментного анализа IgG Ревматоидный фактор ИФА (IgG Rheumatoid Factor ELISA)
предназначен для количественного или полуколичественного in vitro определения IgG ревматоидного
фактора человека (аутоантител класса IgG к IgG человека) в сыворотке и плазме крови. В набор включены
8-луночные стрипы, разделяемые на отдельные лунки, с иммобилизованными IgG (являющимися в данном
случае антигенами). На первой реакционной стадии в лунках инкубируют разведенные исследуемые
образцы. Имеющиеся в положительных образцах специфичные антитела класса IgG (а также классов IgA и
IgM) связываются с антигенами. Для выявления связавшихся антител проводят вторую инкубацию,
используя меченные ферментом антитела к IgG человека (конъюгат фермента), способные вызвать
цветную реакцию. Интенсивность формирующегося окрашивания прямо пропорциональна концентрации
IgG ревматоидного фактора в образце.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
Необходимые реагенты и материалы, входящие в состав набора:
Компоненты набора
1. Лунки микропланшета
с иммобилизованными антигенами; 12 стрипов планшета
8-луночных (разделяемых на отдельные лунки), в рамкедержателе;
готовые к использованию
2. Калибратор 1
200 ОЕд/мл (IgG человека); готовый к использованию
3 Калибратор 2
20 ОЕд/мл (IgG человека); готовый к использованию
4. Калибратор 3
2 ОЕд/мл (IgG человека); готовый к использованию
5. Положительный контроль
(IgG человека); готовый к использованию
Цвет
---
Формат
Символ
12 х 8
STRIPS
темнокрасный
1 × 2,0 мл
CAL 1
красный
1 × 2,0 мл
CAL 2
розовый
1 × 2,0 мл
CAL 3
синий
1 × 2,0 мл
POS CONTROL
NEG CONTROL
6.
Отрицательный контроль
(IgG человека); готовый к использованию
зеленый
1 × 2,0 мл
7.
Конъюгат фермента
меченные пероксидазой антитела кролика к IgG
человека; готовый к использованию
зеленый
1×12 мл
CONJUGATE
8.
Буфер для разведения образцов
готовый к использованию
голубой
1×100 мл
SAMPLE BUFFER
9.
Промывочный буфер
10х концентрат
бесцветный
1×100 мл
WASH BUFFER
10x
10. Раствор хромоген/субстрат
ТМБ/Н2О2; готовый к использованию
бесцветный
1×12 мл
SUBSTRATE
11. Стоп-реагент
0,5 М раствор серной кислоты; готовый к использованию
бесцветный
1×12 мл
STOP SOLUTION
12. Инструкция к набору
---
1 шт.
13. Протокол с целевыми значениями
---
1 шт.
Серия
Температура хранения
Для in vitro диагностики
Невскрытый набор использовать до
___________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
IgG Rheumatoid Factor ELISA, EUROIMMUN
2
_____________________________________________________________________________________________________
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ НАБОРА
Набор должен храниться при температуре 2-8 °С. Замораживание набора не допускается. Невскрытые
компоненты набора стабильны до истечения указанного срока годности.
УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ
Обращайтесь с исследуемыми образцами, калибраторами, контролями и проинкубированными стрипами
планшетов как с потенциально инфицированными материалами. Все реагенты и материалы, являющиеся
отходами, должны быть обработаны в соответствии с действующими нормативами.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание. Перед использованием все реагенты должны быть доведены до комнатной температуры (1825 °С) примерно в течение 30 минут. После первого использования все реагенты стабильны до истечения
указанного срока годности при хранении при температуре 2-8 °С и предохранении от микробной
контаминации, если ниже не оговорены особые условия хранения.
- Стрипы с иммобилизованными антигенами
Стрипы готовы к использованию. Вскройте предохраняющую упаковку микропланшета за бороздку над
застежкой. Перед вскрытием упаковки стрипы должны быть прогреты до комнатной температуры во
избежание конденсации влаги внутри лунок. После вскрытия упаковки неиспользуемые стрипы сразу
верните в пакет и плотно закройте его имеющейся на пакете самоуплотняющейся застежкой. (Не
удаляйте пакет с влагопоглотителем).
После первого вскрытия упаковки стрипы с лунками, покрытыми антигенами, можно хранить в сухом
месте при температуре 2-8 °С по меньшей мере в течение 4 месяцев.
- Калибратор и контроли
Калибратор и контроли готовы к использованию. Перед использованием тщательно перемешать.
- Конъюгат фермента
Конъюгат фермента готов к использованию. Перед использованием тщательно перемешать.
- Буфер для разведения образцов
Буфер для разведения образцов готов к использованию.
- Промывочный буфер
Промывочный буфер является 10-кратным концентратом. Если в концентрате промывочного буфера
о
образовались кристаллы, необходимо подогреть флакон с буфером при температуре 37 С и тщательно
перемешать перед разведением. С помощью чистой пипетки отберите необходимое количество
концентрата буфера и разведите деионизированной или дистиллированной водой (1 часть реагента
плюс 9 частей дистиллированной воды).
Например, для одного стрипа: 5 мл концентрата плюс 45 мл воды.
Приготовленный разведенный промывочный буфер стабилен в течение 1 месяца при хранении при
температуре 2-8 °С и соблюдении правил использования.
- Раствор хромоген/субстрат
Раствор хромоген/субстрат готов к использованию. Закрывайте флакон сразу после использования,
поскольку содержащийся в нем раствор чувствителен к свету. Используемый раствор хромоген/субстрат
должен быть бесцветен. Не используйте раствор, если он окрасился в голубой цвет.
- Стоп-реагент
Стоп-реагент готов к использованию.
Внимание! Калибраторы и контроли были проверены на наличие антигена гепатита В, а также антител к
вирусу гепатита С, ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью методов иммуноферментного анализа и непрямой
иммунофлюоресценции, и показали отрицательные результаты. Однако, все используемые материалы
следует считать потенциально инфекционно опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры
предосторожности. Часть реагентов содержит токсичный азид натрия. Избегайте контакта реагентов с
кожей.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Исследуемые образцы:
Сыворотка крови или взятая в ЭДТА, гепарин или цитрат плазма крови.
Стабильность
Исследуемые образцы сыворотки или плазмы крови могут храниться до 14 дней при температуре 2-8 °С.
Разведенные образцы следует исследовать в течение одного рабочего дня.
___________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
IgG Rheumatoid Factor ELISA, EUROIMMUN
3
_____________________________________________________________________________________________________
Разведение образцов:
Образцы сыворотки или плазмы крови пациентов разводят 1:201 буфером для разведения образцов.
Например, разведите 5 мкл сыворотки крови в 1,0 мл буфера для разведения образцов и тщательно
перемешайте на вортексе (пипетки для этого не подходят).
ПРИМЕЧАНИЕ: Калибраторы и контроли уже предварительно разведены и готовы к использованию, их
разводить не надо.
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Для полуколичественного анализа проводите одновременно с инкубацией положительного и
отрицательного контролей и образцов пациентов инкубацию калибратора 2. Для количественного
анализа проводите одновременно с инкубацией положительного и отрицательного контролей и образцов
пациентов инкубацию калибраторов 1, 2 и 3.
Инкубация образцов
(1-я стадия)
Внесите в отдельные лунки планшета в соответствии со схемой внесения
реагентов по 100 мкл калибратора, положительного и отрицательного контролей
или разведенных образцов сыворотки или плазмы крови. Инкубируйте при
комнатной температуре (18-25 °С) в течение 30 минут.
Промывка
Вручную. Удалите содержимое лунок, затем последовательно промойте все лунки
3 раза, каждый раз внося по 300 мкл приготовленного промывочного буфера в
каждую лунку.
Автоматическая. Промойте лунки 3 раза, внося по 400 мкл приготовленного
промывочного буфера в каждую лунку (программирование устройства для
промывания планшетов в режиме переполнения: “Overflow Modus”).
Оставляйте промывочный буфер в каждой лунке в течение 30 – 60 секунд во
время каждого цикла промывки, затем удаляйте содержимое лунок. После
промывки (вручную или автоматической) тщательно удаляйте остатки
промывочного буфера из лунок, постукивая перевернутым планшетом о
фильтровальную бумагу.
Примечание. Остатки жидкости (>10 мкл), скапливающейся в лунках после
промывки, могут повлиять на субстратную реакцию и привести к получению ложно
заниженных значений оптической плотности. Неправильная промывка (например,
менее 3 промывочных циклов, слишком маленькие объемы промывочного буфера
или слишком короткое время реакции) может привести к ложно завышенным
значениям оптической плотности.
Инкубация конъюгата
(2-я стадия)
Внесите в лунки планшета по 100 мкл конъюгата фермента (меченных
пероксидазой антител к IgG человека). Инкубируйте при комнатной температуре
(18-25 °С) в течение 30 минут.
Промывка
Удалите содержимое лунок. Промойте, как описано выше.
Инкубация субстрата
(3-я стадия)
Внесите в лунки планшета по 100 мкл раствора хромоген/субстрат. Инкубируйте
при комнатной температуре (18-25 °С) в течение 15 минут (предохраняйте от
воздействия прямых солнечных лучей).
Остановка реакции
Внесите в лунки планшета по 100 мкл стоп-реагента в той же последовательности
и с той же скоростью, как и раствор хромоген/субстрат.
Измерение
С помощью планшетного спектрофотометра измеряют интенсивность
окрашивания в лунках при длине волны 450 нм (значение референтной длины
волны между 620 нм и 650 нм) в течение 30 минут после добавления стопреагента. Перед измерением осторожно встряхните микропланшет для
обеспечения равномерного распределения раствора.
___________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
IgG Rheumatoid Factor ELISA, EUROIMMUN
4
_____________________________________________________________________________________________________
СХЕМА ВНЕСЕНИЯ РЕАГЕНТОВ
A
B
C
D
E
F
G
H
1
C2
рos
neg
P1
P2
P3
P4
P5
2
P6
P7
P8
P9
P 10
P 11
P 12
P 13
3
P 14
P 15
P 16
P 17
P 18
P 19
P 20
P 21
4
P 22
P 23
P 24
5
6
7
C1
C2
C3
pos
neg
P1
P2
P3
8
P4
P5
P6
P7
P8
P9
P 10
P 11
9
P 12
P 13
P 14
P 15
P 16
P 17
P 18
P 19
10
P 20
P 21
P 22
P 23
P 24
11
12
Схема внесения реагентов в лунки стрипов 1–4 представляет собой образец заполнения лунок при
полуколичественном анализе 24 образцов сыворотки или плазмы крови пациентов (Р1–Р24).
Схема внесения реагентов в лунки стрипов 7–10 представляет собой образец заполнения лунок при
количественном анализе 24 образцов сыворотки или плазмы крови пациентов (Р1–Р24).
В соответствующие лунки вносят и инкубируют калибраторы (от С1 до С3), положительный контроль (pos.),
отрицательный контроль (neg.), а также образцы пациентов (Р 1 – Р 24). Достоверность анализа можно
увеличить, размещая и измеряя каждую анализируемую пробу в двух параллельных лунках (дубликатах).
Лунки можно отламывать от стрипов по одной. Это позволяет привести в соответствие используемое
количество лунок и количество исследуемых образцов и, таким образом, минимизировать расход
реагентов.
Положительный и отрицательный контроли выполняют роли внутренних контролей для проверки
правильности процедуры тестирования. Их следует использовать при каждой постановке анализа.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полуколичественный анализ
Результаты можно оценить полуколичественно, рассчитывая отношение ОП в лунке с контрольным
образцом или в лунке с образцом пациента относительно ОП в лунке с калибратором 2. Для расчета этого
отношения используйте следующую формулу:
Отношение (RATIO) =
ОП контрольного образца или образца
пациента
ОП калибратора 2
Фирма EUROIMMUN рекомендует следующую интерпретацию результатов:
Отношение (RATIO) < 1,0:
Отношение (RATIO) ≥ 1,0:
Отрицательный результат
Положительный результат
Количественный анализ
На графике линейной зависимости откладывают величины ОП, измеренные для 3 калибровочных
сывороток (ось Y) против концентрации антител в этих сыворотках, выраженных в ОЕд/мл (ось X)
(линейные оси координат). По полученным точкам строят калибровочную кривую для определения
концентрации антител в образцах пациентов. Для расчета кривой с помощью компьютера используйте
способ построения по точкам (“point-to-point”). Ниже приведен пример типичной калибровочной кривой. Не
используйте ее, пожалуйста, для определения концентрации антител в образцах пациентов.
___________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
IgG Rheumatoid Factor ELISA, EUROIMMUN
5
_____________________________________________________________________________________________________
2,0
1,8
1,6
ОП
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
ОЕд/мл
Если значение оптической плотности исследуемого образца превышает значение оптической плотности
калибратора 1 (200 ОЕд/мл), результат записывают как “>200 ОЕд/мл. Такой образец рекомендуется
развести 1:800 и протестировать повторно, а результат, полученный по калибровочной кривой (ОЕд/мл),
умножить на коэффициент разведения 4.
Верхняя граница интервала нормальных значений неинфицированных людей (уровень отсечения, cutoff), рекомендованная фирмой EUROIMMUN, составляет 20 относительных единиц (ОЕд)/мл.
EUROIMMUN рекомендует следующую интерпретацию результатов:
< 20 ОЕд/мл:
≥ 20 ОЕд/мл:
Отрицательный результат
Положительный результат
Для определений, проводящихся в дубликатах, следует использовать в расчетах среднее значение двух
величин. Если эти две величины существенно расходятся между собой, анализ образца следует повторить.
Для постановки диагноза всегда, кроме результатов серологических исследований, необходимо учитывать
клинические симптомы пациента.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Калибровка
Поскольку не существует международной референтной сыворотки для антител к ревматоидному фактору,
результаты даны в виде соотношения. Оно представляет собой относительную меру концентрации антител
в сыворотке или плазме крови.
Для каждой группы выполненных тестов значения оптической плотности калибратора и соотношения,
определенные для положительного и отрицательного контролей, должны укладываться в указанные для
данной серии набора диапазоны. К набору прилагается протокол, включающий эти целевые значения. Если
значения соотношений контролей выходят за рамки заданных диапазонов, следовательно, результаты
анализа могут быть недостоверными, и тест необходимо повторить.
Активность использованного фермента термозависима, поэтому значения оптических плотностей могут
изменяться, если не используется термостат. Чем выше комнатная температура (18-25 °С) во время
инкубации субстрата, тем будут выше значения оптических плотностей. Сходные колебания связаны и с
изменением времени инкубации. Однако, калибратор, контроли и исследуемые образцы подвергаются
одним и тем же воздействиям, так что результаты оказываются в значительной степени
скомпенсированными при расчете соотношений.
Антиген
На поверхности лунок планшета иммобилизованы Fc-фрагменты IgG человека, выделенные из сыворотки
козы делипидизацией, ионообменной хроматографией, расщеплением папаином и хроматографией,
основанной на принципе молекулярного сита.
Линейность: Линейность теста исследовали, используя серию разведений сыворотки пациента с высокой
концентрацией антител. Тест EUROIMMUN IgG Ревматоидный фактор ИФА линеен в пределах интервала
измерения 2 – 200 ОЕд/мл.
___________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
IgG Rheumatoid Factor ELISA, EUROIMMUN
6
_____________________________________________________________________________________________________
Аналитическая чувствительность
Предел определения IgG ревматоидного фактора в наборе IgG Ревматоидный фактор ИФА рассчитан на
основании значения оптической плотности образца, не содержащего аналита, плюс утроенное среднее
квадратичное отклонение, и является наименьшим определяемым титром антител. Предел определения
набора IgG Ревматоидный фактор ИФА составляет 2 ОЕд/мл.
Перекрестная реактивность
Перекрестная реактивность данного набора не выявлена.
Влияние гемоглобина, триглицеридов и билирубина
Не отмечено искажения результатов при исследовании данным набором гемолизированных, липемических
или желтушных образцов с концентрацией гемоглобина до 10 мг/мл, триглицеридов – до 20 мг/мл и
билирубина – до 0,4 мг/мл.
Воспроизводимость
Воспроизводимость ИФА оценивали по коэффициенту вариации (CV) в пределах одной постановки и между
постановками, проводя повторные исследования 3 образцов сыворотки крови с различной концентрацией
IgG ревматоидного фактора. Коэффициент вариации в пределах одной постановки оценивали по 20
определениям, коэффициент вариации между постановками – по 4 определениям, выполненным в течение
4 разных дней.
Вариабельность в пределах постановки,
n = 20
Сыворотка Среднее значение
CV
(%)
крови
(ОЕд/мл)
1
20
3,7
2
46
5,5
3
138
1,7
Вариабельность между постановками,
n=4х6
Сыворотка
Среднее значение
CV
(%)
крови
(ОЕд/мл)
1
23
6,0
2
53
4,7
3
147
5,1
Распространенность и специфичность
Распространенность IgG ревматоидного фактора в панели образцов сыворотки крови 40 клинически
охарактеризованных пациентов с ревматоидным артритом составила 40,0%. Специфичность,
определенная в контрольной панели образцов сыворотки крови здоровых доноров (n=286), составила
99,7%.
Ожидаемые значения
Уровни IgG ревматоидного фактора анализировали с помощью набора EUROIMMUN IgG Ревматоидный
фактор ИФА на панели сывороток крови 286 здоровых доноров. При уровне отсечения (значение cut-off) 20
ОЕд/мл доноров крови имели положительные значения IgG ревматоидного фактора.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
IgG_Rheumatoid_Factor-EA1814-9601G_rus.doc
02.10.06 14:59
Оригинал IgG Rheumatoid Factor ELISA
EA_1814G_A_UK_C04.doc
06.09.06 7:50
___________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2006
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru