016851 B1 016851 B1 (11) 016851

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
016851
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2012.08.30
(21)
Номер заявки
(51) Int. Cl. A61K 39/395 (2006.01)
A61M 1/36 (2006.01)
A61P 1/04 (2006.01)
200802086
(22)
Дата подачи заявки
2007.05.14
(54)
СПОСОБ И СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ
КИШЕЧНИКА
B1
016851
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
В изобретении представлен способ лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD), при
котором получают биопсийный образец кишечника, полученный из воспаленной ткани пациента;
механически обрабатывают образец для получения клеточной суспензии; идентифицируют
поверхностные клеточные маркеры активированных лейкоцитов, выбранных из T-лимфоцитов,
нейтрофильных гранулоцитов и эозинофильных гранулоцитов в этой суспензии; получают
антитела к одной или более чем одной активированной клетке и иммобилизируют их на носителе;
готовят колонку, заполненную носителем; отводят порцию периферической крови пациента для
того, чтобы она прошла через колонку перед повторной инфузией ее пациенту для того, чтобы
активированные лейкоциты связались с антителами на носителе и таким образом удалялись из
кровотока. Также раскрыты соответствующие колонки и носители и их применение в данном
способе.
Тёрн Магнус, Винквист Ола (SE)
Поликарпов А.В., Борисова Е.Н. (RU)
B1
(56) WO-A-0224307
EMMRICH JOERG et al. Gastroenterology,
130 (2006): suppl. 2, April, 2006, "Mobilization of
Mucosa Lymphocytes By Leukocytapheresis"
Nationa Library of Medicine (NLM) file
Medline, Medline accession no. 11968580, Polко J.
et al. "Importance of determination of lymphocytes
in intestinal mucosa biopsy specimens using flow
cytometry in the evaluation of ulcerative colitis
activity", vol. 48, no. 3, March, 2002, page 197-201
US-B1-6866846
van Deventer S.J.H. "New biological therapies
in inflammatory bowel disease", Best Practice &
Research Clinical Gastroenterology, vol. 17, no. 1,
page 119-130, 2003
WO-A2-0012113
Körber J. et al. "A Case of Crohn's Disease
with Increased CD8 T-Cell Activation and Remission
during Therapy with Intravenous Immunoglobulins",
Scandinavian Journal of gastroenterology, no. 33
(1998)
William J. Sandborn et al. "Biologic Therapy
of Inflammatory Bowel Disease", Gastroenterology,
2002, 122, page 1592-1608
Hiroyuki Hanai et al. "Leukocyte Adsorptive
Apheresis kfor the Treatment of Active Ulcerative
Colitis: A Prospective, Uncontrolled, Pilot Study",
Clinical Gastroenterology and Hepatology, 2003, 1,
page 28-35
016851
(31) 0601075-5
(32) 2006.05.12
(33) SE
(43) 2009.06.30
(86) PCT/SE2007/000459
(87) WO 2007/133147 2007.11.22
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
АЙТИЭЙЧ ИММЬЮН ТЕРАПИ
ХОЛДИНГЗ АБ (SE)
016851
Область изобретения
Данное изобретение относится к способу лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD), в
частности неспецифического язвенного колита и болезни Крона, и к средствам для применения в лечении.
Предшествующий уровень техники
Неспецифический язвенный колит и болезнь Крона являются проявлениями воспалительного заболевания кишечника (IBD). Другие формы IBD включают лимфоцитарный колит и коллагенозный колит.
Пациентов с молниеносным язвенным колитом в настоящее время лечат высокими дозами стероидов.
Фаза III клинических испытаний антител против фактора некроза опухоли альфа (TNFα) находится в
процессе проведения. Оба лекарственных средства представляют собой общие ингибиторы воспаления.
Они эффективны приблизительно в 50% случаев, но вызывают серьезные неблагоприятные эффекты.
Часто у пациентов также могут быть реккурентные эпизоды молниеносного колита. У пациентов с молниеносным колитом, не реагирующих на консервативное лечение, быстрое хирургическое вмешательство является обязательным. Неспецифический язвенный колит всегда ограничен только толстой кишкой.
При молниеносном колите производят резекцию толстой кишки и формируют внешнюю илеостому. После восстановления и возможно дальнейшего медицинского лечения воспаления культи прямой кишки у
большинства пациентов осуществляют или илеоректальный анастамоз, или восстановительную пластику
с тазовым тонкокишечным резервуаром для восстановления целостности кишечника. Обе оперативные
процедуры влекут за собой жидкий стул приблизительно шесть раз в сутки и нарушения водного и минерального балансов.
У пациентов, страдающих болезнью Крона, воспаление обычно наблюдается в наиболее отдаленной
части тонкого кишечника и начальной части толстого кишечника (илеоцекальный участок), но воспаление может быть локализовано в любой части желудочно-кишечного тракта. Медицинское лечение не
может вылечить заболевание, хотя может быть обеспечено временное облегчение с помощью противовоспалительных лекарств, таких как стероиды и азатиоприн. Хирургическое вмешательство с резекцией
стенозированных и фистулированных сегментов показано для приблизительно 50% пациентов; у половины из них происходят рецидивы и требуется дополнительное хирургическое вмешательство. Таким
образом, способ, который может специфически остановить воспаление при IBD и предотвратить рецидивирующее заболевание у конкретного пациента, является очень оправданным.
В WO 2005113037 раскрыт фильтр и способ удаления выбранных веществ из образца биологической жидкости. Фильтр состоит из внешнего корпуса, ввода и вывода. Внутри внешнего корпуса предложено множество фильтрационных поверхностей, и на эти фильтрационные поверхности нанесено по
меньшей мере одно покрытие. Это по меньшей мере одно покрытие содержит по меньшей мере два связывающих модуля, которые в свою очередь селективно связываются друг с другом. Один связывающий
модуль селективно связан с фильтрационными поверхностями, а другой связывающий модуль имеет такую конфигурацию, чтобы селективно связываться с выбранными веществами, которые следует удалить
из жидкого образца. По мере того как жидкий образец проходит через ввод, внешний корпус и вывод,
выбранные вещества селективно связываются с фильтрационными поверхностями через покрытие. Жидкий образец представляет собой образец крови. Один выбранный жидкий компонент представляет собой
компонент крови, выбранный, среди прочего, из лейкоцитов, гранулоцитов и лимфоцитов.
Фильтрационные среды и аппарат для отделения лейкоцитов от крови раскрыты, среди прочего, в
JP 2003265596; US 5885457; JP 04187206; US 4936993; JP 03000074; JP 02167071; JP 02009823; JP
10057477.
Цели изобретения
Цель изобретения заключается в том, чтобы предложить способ лечения IBD, в частности неспецифического язвенного колита и болезни Крона.
Еще одна цель изобретения заключается в том, чтобы предложить средства для применения в этом
способе.
Дополнительные цели изобретения станут очевидны из следующего краткого описания изобретения
или его предпочтительных воплощений, проиллюстрированных в графических материалах и в формуле
изобретения.
Краткое изложение сущности изобретения
В воспалительном процессе при IBD T-клетки взаимодействуют с лейкоцитами. Из лейкоцитов при
стимуляции некоторыми кофакторами высвобождаются токсичные агенты. Эти токсичные агенты повреждают клетки кишечника. Посредством проточной цитометрии вещества, полученного при интестинальных биопсиях пациентов с активной IBD, авторы изобретения идентифицировали лейкоцитарные
поверхностные клеточные маркеры активированных T-лимфоцитов и активированных нейтрофильных и
эозинофильных гранулоцитов, клеток, которыми обогащена область воспаления, но которые также присутствуют в циркулирующей периферической крови.
Настоящее изобретение основано на гипотезе, что эти активированные клетки отвечают за инициирование и поддержание воспаления при IBD, и что их удаление из кровотока может уменьшить или даже
устранить такое воспаление. Эта концепция подразумевает, что воспалительный статус каждого пациен-1-
016851
та уникален с точки зрения степени активации лейкоцитов и вида и относительных соотношений инфильтрующих T-клеток, параметров, которые варьируются от пациента к пациенту, и тяжести заболевания, и на него влияют лекарственные средства, вводимые пациенту. В настоящем изобретении не прибегают к использованию неспецифических лейкоцитарных абсорбентов, известных в данной области техники, таких как хлопок и другие полимерные волокна. В контексте данного изобретения IBD включает
главным образом болезнь Крона и неспецифический язвенный колит, а также коллагенозный колит, характеризующийся водянистым стулом, нормальной эндоскопией, но гистопатологическим скоплением
коллагена в подслизистой оболочке кишечника, и лимфоцитарный колит, характеризующийся присутствием больших количеств лимфоцитов в слизистой оболочке кишечника в сопровождении диареи.
Согласно изобретению пациента, страдающего от IBD, подвергают колоноскопии. Берут одну или
несколько биопсий пораженной ткани кишечника. Из единственного или комбинированного биопсийного материала готовят суспензию однородных клеток. Присутствие T-лимфоцитов, B-лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и эозинофильных гранулоцитов в суспензии однородных клеток определяют
посредством проточной цитометрии, используя антитела против CD4, CD8, CDS, CD15, CD19. Кроме
того, активационный статус иммунных клеток, проникающих в слизистую оболочку, исследуют, используя антитела против маркеров активации, таких как CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44 и
CD66b. В принципе, воспалительный статус каждого отдельного пациента уникален с точки зрения степени активации и типа клеточной инвазии, и параметров, которые варьируются в зависимости от тяжести
заболевания и принимаемых лекарственных средств. На основании результатов этого исследования используют лейкаферезную колонку для направленного удаления доминантной клеточной популяции, вызывающей воспаление. Для удаления активированных T- и B-лимфоцитов используют антитела, распознающие маркер активации CD69, связанный с твердой подложкой. Для удаления активированных нейтрофильных гранулоцитов используют антитела против молекул хоминга в кишечник или против CD66b;
колонка, заполненная носителем, на котором иммобилизовано антитело против интегрина α4β7, будет
удалять лейкоциты данного типа. Таким образом, клетки крови в периферических отделах системы кровообращения, активированные в лимфатических узлах, дренирующих места воспаления в кишечнике по
пути к слизистой оболочке кишечника с получением дополнительного локального воспаления, будут
удалены посредством такого, основанного на антителах, лейкафереза периферической крови. Это
уменьшит или даже ингибирует дополнительный рекрутинг аутореактивных в отношении кишечника Tклеток.
В соответствии с настоящим изобретением раскрыта колонка для лейкафереза, заполненная подходящим твердым носителем с большим отношением поверхности к объему, поверхность которого несет
антитела, способные связываться с активированными лейкоцитами, циркулирующими в периферической
крови, причем активированные лейкоциты выбраны из T-лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и
эозинофильных гранулоцитов. Пропускание периферической крови пациента, страдающего IBD воспалением, сквозь колонку приведет к связыванию активированных лейкоцитов с антителами, и, таким образом, удалению их из системы кровообращения. Гомеостатические механизмы истощения активированных лейкоцитов в циркулирующей периферической крови приведут к снижению количества активированных лейкоцитов, перемещаемых в кишечник, и, таким образом, к снижению количества активированных лейкоцитов в кишечнике. В данной заявке на изобретение термин "антитело" включает антитела, в
частности моноклональные антитела, и их фрагменты или модификации, сохраняющие связывающую
способность соответствующим антителом в отношении антигена/антитела, включая рекомбинантно измененные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты.
Этот тип "специализированного" лейкафереза способен отсортировывать активированные лейкоциты, специфически активированные в отношении клеток слизистой оболочки кишечника, таким образом
удаляя важный фактор в воспалительном процессе и реверсируя молниеносный колит. У пациентов,
страдающих от болезни Крона, применяются такие же принципы, за исключением лейкоцитов; в данном
случае лейкоциты активированы в отношении антигена(ов), локализованного более глубоко в стенке кишечника. Путем идентификации антигенов, вызывающих воспаление, можно отобрать антигены для их
презентации в состоянии, иммобилизованном на твердом носителе, лейкоцитам, пропускаемым через
колонку, и таким образом связывать активированные лейкоциты.
В зависимости от типа кишечника и степени воспалительной активации лейкаферезную колонку
используют для направленного удаления доминирующей клеточной популяции, вызывающей воспаление. Истощение активированных T-лимфоцитов в периферической крови является особенно предпочтительным.
Предпочтительным является удаление активированных T-лимфоцитов из периферической крови
пациента, страдающего от IBD, путем контакта лимфоцитов с антителами против CD69 или антителом
против интегрина α4β7; эти антитела можно использовать сами по себе или в комбинации. Активированные нейтрофильные гранулоциты и эозинофильные гранулоциты могут быть удалены соответствующим образом путем их контакта с антителами против CD66b и CD9 соответственно.
В соответствии с настоящим изобретением такие активированные нейтрофильные гранулоциты и
-2-
016851
эозинофильные гранулоциты также могут быть идентифицированы в периферической крови пациентов,
страдающих от IBD.
В соответствии с первым предпочтительным аспектом изобретения удаление активированных Tлейкоцитов и/или активированных нейтрофильных гранулоцитов, и/или активированных эозинофильных
гранулоцитов достигается путем использования колонки, содержащей также два или более типа антител
на твердом носителе. Предпочтительно для каждого антитела применяется отдельный носитель.
В соответствии со вторым предпочтительным аспектом изобретения отдельные носители, каждый с
другим антителом или другими антителами, помещают в соответствующее количество отдельных колонок. Предпочтительно, чтобы колонки были соединены последовательно.
В соответствии с третьим предпочтительным аспектом изобретения несколько биопсийных образцов, полученных посредством колоноскопии от пациентов, страдающих IBD, объединяют, механически
обрабатывают с получением суспензии однородных клеток, и анализируют посредством проточной цитометрии, чтобы идентифицировать присутствие активированных лейкоцитов, выбранных из Tлимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и эозинофильных гранулоцитов, возможно активированных
B-лимфоцитов, путем воздействия на них специфических антител, в частности антител против CD4,
CD8, CD3, CD15 и CD19.
В соответствии с четвертым предпочтительным аспектом изобретения статус активации иммунных
клеток, внедрившихся в слизистую оболочку, полученных с помощью колоноскопии от пациентов, страдающих IBD, определяют путем воздействия на внедрившиеся иммунные клетки антител против активационных маркеров, таких как CD69, CD62L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44 и CD66b.
T-лимфоциты, предрасположенные к миграции в слизистую оболочку стенки кишечника, экспрессируют α4β7-интегриновый рецептор, который связывается с MAdCAM-1 (клеточной адгезионной молекулой 1 - мукозным адрессином), экспрессирующейся на эндотелии. В соответствии с настоящим изобретением такие внедрившиеся T-клетки могут быть удалены из периферического кровообращения посредством лейкафереза с использованием колонки, содержащей носитель, на котором иммобилизовано
антитело к α4β7-интегриновому рецептору.
Таким образом, пациента, страдающего IBD, у которого биопсийные образцы, исследованные посредством проточной цитометрии, указывают на активное воспаление, можно подвергать лейкаферезу,
основанному на антителах, разработанному для удаления специфических клеточных популяций, ответственных за локальное воспаление кишечника. Внутривенный доступ осуществляют, например, в антекубитальные вены, соединенные с гепаринизированными трубочками, присоединенными с перистальтическим насосом, прокачивающим приблизительно 30 мл крови в 1 мин. Кровь проходит через лейкаферезную колонку с сконструированным антителом, и трубочку снова вводят, например, в противоположную
антекубитальную вену. Например, пациента подвергают 60 мин лейкафереза, который удаляет активированные клетки приблизительно из половины или немного меньше чем половины объема крови (60×20 мл
= 1800 мл). Независимо от объема крови, удаленного за одну процедуру лейкафереза, лечение повторяют
3-5 раз в течение от 1-3 недель для удаления вновь появляющихся в крови кишечно-активированных иммунных клеток. За этим может следовать дополнительное исследование однородных клеток из биопсийных образцов кишечника посредством проточной цитометрии, как описано выше.
В соответствии с особенно предпочтительным аспектом изобретения раскрыт способ лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD), включающий: (а) получение биопсийного образца кишечника из воспаленной ткани пациента; (б) механическую обработку образца с получением клеточной суспензии; (в) идентификацию поверхностных клеточных маркеров активированных лейкоцитов, выбранных из T-лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и эозинофильных гранулоцитов в суспензии; (г)
получение антител против активированных лейкоцитов; (д) иммобилизацию антител против активированных лейкоцитов на общем носителе или на отдельных носителях; (е) приготовление колонки, заполненной носителем(ями); (ж) отведение порции периферической крови пациента для того, чтобы она
прошла через колонку перед повторной инфузией пациенту, чтобы указанные активированные лейкоциты связались с антителами на носителе(ях) и таким образом удалялись из кровотока. Предпочтительно,
чтобы носители, несущие антитела против активированных T-лейкоцитов и активированных нейтрофильных гранулоцитов и/или активированных эозинофильных гранулоцитов, находились в отдельных
колонках, которые могут быть соединены последовательно или параллельно. Также предпочтительно в
данном способе обратиться к единственной колонке с загруженными отдельными носителями, на которых иммобилизованы антитела к двум или более чем двум активированным T-лимфоцитам, активированным нейтрофильным гранулоцитам и активированным эозинофильным гранулоцитам, возможно активированным B-лимфоцитам соответственно. Предпочтительно, чтобы колонка по изобретению обладала объемом в незагруженном состоянии от 20 до 100 мл, в частности от 30 до 50 мл, но также пригоден
другой больший объем, например вплоть до 500 мл. При использовании колонок с большим объемом
важно освободить их от крови в конце обработки, чтобы поддерживать потерю крови на минимуме. Это
можно сделать посредством промывки их, например, физиологическим раствором до тех пор, пока промывающая среда не вытеснит почти всю или фактически всю кровь из колонки. Поверхности колонки
-3-
016851
или трубочки, контактирующие с кровью, должны быть такого типа, который препятствует свертыванию; следовательно, предпочтительно использовать колонки и трубочки с гепаринизированными поверхностями. Способы получения или модификации поверхностей, которые не активируют систему
свертывания, хорошо известны в данной области техники. Таким образом, обычно от одной трети до
двух третей объема крови пациента, предпочтительно около половины объема его крови или немного
меньше, пропускают через колонку за одну обработку. Обычно одной обработки недостаточно для обеспечения ремиссии или длительного освобождения от симптомов или существенного подавления симптомов. Следовательно, обработку предпочтительно повторяют от двух или трех до пяти и более раз в течение от одной до трех недель от первой обработки. Биопсийный образец кишечника является одним из
нескольких таких образцов, полученных от пациента, и где образцы объединяли перед механической
обработкой для получения клеточной суспензии. Особенно полезны в способе по изобретению антитела
против CD69 или антитела против интегрина α4β7 в отношении активированных T-лимфоцитов в периферической системе кровообращения, антитела, которые также предпочтительны для иммобилизации на
носитель по изобретению. Присутствие активированных T-лимфоцитов в слизистой оболочке кишечника
преимущественно обнаруживают путем воздействия на клеточную суспензию или клетки, выделенные
из суспензии, специфических антител против одного или более маркеров активации CD69, CD62 L,
CD25, CD27, HLA-DR, CD44, CD66b.
"Получение антител" включает приобретение таких антител из коммерческих или других источников.
Далее изобретение будет описано более подробно посредством ссылок на его предпочтительные
воплощения, проиллюстрированные в графических материалах.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1-4 показана экспрессия маркеров активности на CD4+ T-клетках и нейтрофильных гранулоцитах из периферической крови и слизистой оболочки кишечника;
на фиг. 5-9 показаны результаты разделения активированных CD4+ T-клеток периферической крови
и нейтрофильных гранулоцитов на колонках MACS (магнитно активированная клеточная сортировка);
на фиг. 10 показана колонка по изобретению, соединенная с системой кровообращения пациента.
Описание предпочтительных воплощений
Вещества и методы.
Сбор и приготовление образцов.
При колоноскопии IBD-пациента с молниеносным язвенным колитом биопсийные образцы собирали, немедленно переносили в пробирки, заполненные физиологическим раствором, и затем обрабатывали
в пределах 1 ч. Суспензии однородных клеток биопсийных образцов получали, используя стеклянный
гомогенизатор со свободной посадкой. Затем клетки дважды промывали буфером для флюоресцентной
сортировки активированных клеток (FACS), содержащим 0,05% NaN3, 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,4% тринатрий цитрата дигидрата в PBS (фосфатно-буферный солевой раствор).
Гепаринизированную периферическую кровь этого же пациента подвергали гемолизу с использованием 0,83 мас.% водного хлорида аммония и дважды промывали буфером FACS с получением суспензии
лейкоцитов.
Клеточные суспензии раздельно инкубировали с моноклинальными антителами, конъюгированными с флюорохромом, в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. После последнего промывания клетки суспендировали в 500 мкл буфера FACS и анализировали.
Антитела.
Для всех антигенов (CD4, CD69, CD66b) использовали mAbs (моноклональные антитела) мыши
против человека, конъюгированные с флюоресцеина изотиоцианатом (FITC), фикоэритрином (РЕ) или
перидининхлорофилл протеином (PerCP). Также осуществляли изотипически сходное контрольное мечение, используя в качестве контролей неспецифического окрашивания конъюгированное с флюорохромом антитело мыши против IgMk человека и IgG2bk. Все антитела, используемые для проточной цитометрии, были приобретены в Becton Dickinson (BD) Biosciences/Pharmingen, San Diego, USA. Анти-FITCконъюгированные микрогранулы MicroBeads (супрамагнетические частицы наноразмера, связанные со
специфическими антителами) получали в Miltenyi Biotech, GmbH, Germany.
Анализ посредством проточной цитометрии.
Анализ посредством проточной цитометрии проводили на цитометре FACS Calibur, оборудованном
двумя лазерными источниками (BD Immunocytometry systems, San Jose, CA, USA). Десять тысяч клеток
отсчитывали и анализировали в каждом образце. Для анализа данных применяли программное обеспечение Cell Quest Pro от Becton Dickinson.
Колонка для лейкафереза.
Внутривенный доступ в виде первой канюли 1 вводят в антекубитальную вену 8. Первую канюлю 1
соединяют с первой гепаринизированной трубочкой 2, на которой функционирует перистальтический
насос 3, прокачивающий приблизительно 30 мл крови в минуту. Своим другим концом первую гепаринизированную трубочку 2 соединяют с первым концом колонки для лейкафереза 4, имеющей объем 50
-4-
016851
мл, заполненной гранулированным твердым носителем 5, таким как Sepharose®, на котором иммобилизованы антитела, индуцированные против активированных T-лейкоцитов, собранные у пациента. Твердый носитель 5 с иммобилизованными антителами удерживается на месте с помощью первого и второго
корпусов фильтров 10, 11. Другой конец лейкаферезной колонки 4 соединен со второй гепаринизированной трубочкой 6, которая связана со второй канюлей 7 на ее другом конце. Вторую канюлю 7 вводят в
противоположную антекубитальную вену 9. Венозную кровь заставляют течь от антекубитальной вены 8
к противоположной антекубитальной вене 9 через колонку 4, где активированные T-лимфоциты связываются с антителом на носителе 5 и таким образом удерживаются в колонке. Процедура лейкафереза
обычно занимает 60 мин, что позволяет удалить активированные клетки приблизительно из половины
или немного меньше чем половины объема крови (в зависимости от массы тела человека; 60×20 мл =
1800 мл). Обработку повторяют, например, 3-5 раз в течение 1-3 недель, чтобы удалить вновь появляющиеся в кровотоке кишечно-активированные иммунные клетки. Затем может следовать дополнительное
исследование однородных клеток из биопсийных образцов кишечника с помощью проточной цитометрии, как описано выше. Соответствующим образом проводили аферез активированных нейтрофилов
и/или активированных эозинофилов. Дополнительные способы прикрепления антител к твердым носителям в аффинной хроматографии, полезные в изобретении, описаны в Nisevitch M. and Firer M.A., J. Biochem. Biophys. Methods. 49 (2001) 467-480, включенной здесь посредством ссылки.
Пример 1.
Разделение MACS. Два миллилитра гепаринизированной периферической крови здорового донора
стимулировали SEB (4 мкг/мл) и моноклональным анти-CD28 антителом (10 мкг/мл) в течение 2 ч при
37°C с получением активированных T-клеток и нейтрофильных гранулоцитов. Для получения смешанной популяции активированных клеток и клеток в состоянии покоя последовательно добавляли 2 мл не
стимулированной крови. Лейкоциты фиксировали, а эритроциты удаляли посредством гипотонического
лизиса. Лейкоциты промывали и инкубировали с FITC-конъюгированными анти-CD69 или CD66b. После
10 мин инкубации при 4°C в темноте клетки промывали и инкубировали в течение еще 15 мин с антиFITC микрогранулами. Клетки разделяли на колонке MACS и отрицательную и положительную фракции
собирали в разные пробирки. Наконец клетки промывали и анализировали с помощью FACS.
Пример 2.
У пациентов с IBD активированные CD4+ T-клетки содержатся в периферической крови и в кишечнике. Авторы изобретения исследовали суспензии однородных клеток крови и биопсийных образцов
толстой кишки 10 пациентов с Mb Крона и 12 пациентов с неспецифическим язвенным колитом. У пациентов с IBD обнаруживаются CD4+ T-клетки с активированным фенотипом в периферической крови,
поскольку обнаружены Т-хелперные клетки, экспрессирующие очень ранний маркер активации (фиг. 1).
В биопсийных образцах пациентов, страдающих IBD, большая часть CD4+ T-клеток экспрессируют маркер активации CD69 как признак воспалительного T-клеточного ответа, сосредоточено в стенке толстой
кишки, ответственного за аутоиммунное разрушение толстой кишки (фиг. 2). Активированные T-клетки,
обнаруженные в периферической крови, вероятно, представляют собой Т-клетки, которые активированы
в интестинальном лимфатическом узле, дренирующем воспаленный сегмент толстой кишки, и эти клетки
находятся на пути к очагу воспаления, представляя собой популяцию клеток, которая должна быть удалена.
Пример 3.
У пациентов с IBD активированные нейтрофильные гранулоциты содержатся в периферической
крови и в кишечнике. Нейтрофильные гранулоциты представляют собой часть системы врожденного
иммунитета и принимают участие в активации и поддержании локального воспаления. В периферической крови пациентов с IBD большая часть нейтрофильных гранулоцитов экспрессирует небольшие количества CD66b, однако часть нейтрофильных гранулоцитов экспрессирует большие количества CD66b,
что указывает на активированный фенотип (фиг. 3). Значительная доля нейтрофильных гранулоцитов из
биопсийных образцов толстой кишки пациентов с активным IBD представляет собой CD66bHi (фиг. 4),
указывая на то, что активация системы врожденного иммунитета, вероятно, вовлечена в инициацию кишечного воспаления.
Пример 4.
Активированные CD4+ T-лимфоциты можно удалить из периферической крови. Удаление активированных T-лимфоцитов, экспрессирующих маркер активации CD69 из периферической крови (фиг. 5),
клеток, которые находятся на пути к воспаленной слизистой оболочке толстой кишки, может быть достигнуто с использованием специфических антител и колонки. Водную суспензию T-лимфоцитов, меченных активационным маркером CD69, прогоняли через колонку, заполненную магнитными гранулами,
конъюгированными с вторичным анти-FITC антителом. Неактивированные T-лимфоциты успешно отделяли и обогащали в элюате с колонки, демонстрируя, что большинство CD69+ клеток может быть удалено из периферической крови (фиг. 6).
Пример 5.
Удаление активированных нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови. Активирован-5-
016851
ные нейтрофильные гранулоциты, идентифицируемые по высоким уровням экспрессии маркера клеточной поверхности CD66b (фиг. 7), инкубировали с магнитными гранулами, конъюгированными с вторичными анти-FITC анителами, и подвергали очистке на колонке. Большая часть активированных нейтрофилов, экспрессирующих маркер активации CD66b в количестве от среднего до высокого, захватывалась
на колонке и, таким образом, удалялась из периферической крови (фиг. 8).
Пример 6.
Пример лечения пациента, страдающего IBD. Пациента, страдающего IBD, подвергали колоноскопии. Отбирали несколько биопсийных образцов. Из объединенных биопсийных образцов готовили суспензию однородных клеток. Активированные лейкоциты, то есть T-лимфоциты, B-лимфоциты, нейтрофильные гранулоциты и эозинофильные гранулоциты, в суспензии однородных клеток идентифицировали посредством проточной цитометрии, используя антитела, например, к CD4, CD8, CD3, CD15, CD19.
Кроме того, определяли статус активации иммунных клеток, внедрившихся в слизистую оболочку, используя антитела против маркеров активации, таких как, например CD69, CD62 L, CD25, CD27, HLADR, CD44 и CD66b.
Готовят лейкаферезную колонку, содержащую антитела против лейкоцитов и активированных иммунных клеток, внедрившихся в слизистую оболочку. Объем колонки может варьироваться в широких
пределах, но, в целях экономии и поддержания потери крови на минимальном уровне, предпочтительным является объем 30-50 мл. Антитела иммобилизованы на подходящем носителе, таком как Sepharose®, с помощью любого способа ковалентного связывания антител с твердым носителем. Например,
для отдельного пациента используют антитела против маркера активации CD69 для удаления активированных T-клеток и антител против молекул хоминга в кишечник кишечника или против CD66b для удаления активированных нейтрофильных гранулоцитов, или анти-CD9 антитело для удаления активированных эозинофильных гранулоцитов. Колонка может поставляться предварительно заполненной носителем, на котором иммобилизовано одно или несколько антител, или она может быть изготовлена индивидуально, например, с использованием стратегии нековалентной иммобилизации, например, носителя,
содержащего белок A или стрептавидин, который связывается с Fc-доменом антитела или биотинилированным антителом соответственно. Готовую или индивидуально приготовленную лейкаферезную колонку соединяют с периферическим кровотоком пациента аналогично искусственной почке на период времени, достаточный для того, чтобы обеспечить пропускание через нее нескольких объемов крови, предпочтительно от трех до пяти объемов крови.
Пример 7.
Лейкаферезные колонки для захвата специфических клеточных популяций или комбинаций специфических клеточных популяций. Колонка, содержащая носитель, нагруженный антителами к интегрину
α4β7, удаляет T-клетки, экспрессирующие молекулу хоминга в кишечник (фиг. 9), таким образом, клетки периферической крови, активированные в лимфатическом узле, дренирующем область воспаления в
кишечнике, по пути к слизистой оболочке кишечника, вызывающие дополнительное местное воспаление, удаляются в процессе процедуры лейкафереза, основанной на антителах. При заполнении колонки
носителем, несущим анти-CD69 антитело, будут удалены активированные T- и B-лимфоциты из кровотока и, таким образом, будет ингибироваться дополнительный рекрутинг аутореактивных T-клеток кишечника. Аналогичным образом, колонка, заполненная носителем, несущим анти-CD66b антитело, удаляет активированные нейтрофильные гранулоциты; для соответствующего удаления активированных
эозинофильных гранулоцитов предпочтительным является анти-CD9 антитело. Эти носители можно использовать по отдельности или в комбинации, например, в параллельно или последовательно соединенных колонках, каждая из которых содержит один тип носителя, или в одной колонке, содержащей несколько типов носителя, например, в случае, когда одна колонка несет CD69, а другая несет CD66b. Для
оптимизации удаления T-клеток в колонке с заданным размером и твердым носителем плотность антител
на поверхности субстрата, аффинность антител, скорость потока крови, проходящей через колонку и т.д.,
могут варьироваться.
Таким образом, пациента, страдающего IBD, биопсийные образцы которого, исследованные посредством проточной цитометрии, указывают на активное воспаление, подвергают основанному на антителах лейкаферезу, предназначенному для удаления специфических клеточных популяций, ответственных за локальное кишечное воспаление. Внутривенный доступ осуществляется, например, через антекубитальные вены, соединенные с гепаринизированными трубочками, на которые воздействует перистальтический насос, прокачивающий приблизительно 30 мл крови в минуту. Кровь прогоняют через лейкаферезную колонку по изобретению и трубочки снова вводят, например в противоположную антекубитальную вену. Пациент в течение 60 мин подвергается процедуре лейкафереза, которая удаляет активированные клетки приблизительно из половины объема крови (60×20 мл = 1800 мл). Обработку повторяют 3-5 раз в течение 1-3 недель для удаления вновь появляющихся в крови активированных в кишечнике
иммунных клеток. За результатом далее может следовать дополнительное исследование отдельных клеток из биопсийных образцов кишечника посредством проточной цитометрии, как изложено выше.
-6-
016851
Пояснения к чертежам
Фиг. 1 - экспрессия маркера активности CD69 относительно низкая на CD4+ T-лимфоцитах периферической крови (экспрессируется 3,8% CD4+ T-клеток со средней интенсивностью флюоресценции
(MFI) 20,0);
фиг. 2 - CD4+ T-лимфоциты из слизистой оболочки кишечника проявляют повышенную экспрессию CD69 (72,8%, MFI 33,5);
фиг. 3 - большинство нейтрофильных гранулоцитов периферической крови экспрессируют низкие
количества CD66b; но 11,5% проявляют повышенную экспрессию, что свидетельствует о клеточной активации; MFI клеток в окне M1 составляет 104,3;
фиг. 4 - нейтрофильные гранулоциты слизистой оболочки кишечника демонстрируют более высокую MFI CD66b (629,7 в окне M1) и повышенную долю активированных нейтрофильных гранулоцитов;
фиг. 5 - CD4+ T-лимфоциты перед отделением CD69-позитивных клеток: 5,9% этих клеток экспрессирует CD69;
фиг. 6 - CD4+ T-лимфоциты после отделения CD69-позитивных клеток; позитивная фракция состоит из 61,6% CD69-позитивных CD4+ T-клеток;
фиг. 7 - нейтрофильные гранулоциты до отделения CD66b-позитивных клеток: 42,7% клеток экспрессируют CD66b в степени от средней до высокой;
фиг. 8 - нейтрофильные гранулоциты после отделения CD66b-позитивных клеток: 86,6% нейтрофилов в позитивной фракции экспрессируют CD66b в степени от средней до высокой;
фиг. 9 - CD4+ T-лимфоциты до и после отделения α4β7 интегринпозитивных клеток: 37,4% клеток
экспрессируют α4β7 интегрин в степени от средней до высокой до MACS и 92,9% после MACS.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD), включающий: (а) подготовку
биопсийного образца кишечника, полученного из воспаленной ткани пациента; (б) механическую обработку образца для получения клеточной суспензии; (в) идентификацию поверхностных клеточных маркеров активированных лейкоцитов, выбранных из T-лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и эозинофильных гранулоцитов в суспензии; (г) получение антител против указанных активированных лейкоцитов; (д) иммобилизацию указанных антител против указанных активированных лейкоцитов на общем
носителе или на отдельных носителях; (е) приготовление колонки, заполненной указанным носителем(ями); (ж) отведение порции периферической крови пациента для того, чтобы она прошла через колонку перед повторной инфузией ее пациенту, чтобы указанные активированные лейкоциты связывались
с указанными антителами на носителе(ях) и таким образом удалялись из кровотока.
2. Способ по п.1, где указанные носители, несущие антитела к указанным активированным лейкоцитам, находятся в разных колонках, соединенных последовательно или параллельно.
3. Способ по п.1 или 2, где от одной трети до двух третей объема крови пациента пропускают через
колонку за одну процедуру лечения.
4. Способ по любому из пп.1-3, где лечение повторяют от трех до пяти раз и более в течение от одной до трех недель.
5. Способ по любому из пп.1-4, где указанный биопсийный образец кишечника представляет собой
один из нескольких таких образцов, полученных от пациента, и где указанные образцы объединяют до
механической обработки для получения клеточной суспензии.
6. Способ по любому из пп.1-5, где присутствие активированных T-лимфоцитов идентифицируют
посредством воздействия на них одного или более чем одного специфического антитела против CD4,
CD8, CD3, CD15, CD19.
7. Способ по любому из пп.1-5, где присутствие активированных T-лимфоцитов идентифицируют
посредством воздействия на них одного или более чем одного специфического антитела против CD69,
CD62 L, CD25, CD27, HLA-DR, CD44.
8. Способ по любому из пп.1-5, где антитело против активированных лейкоцитов, иммобилизованное на носителе, выбрано из антитела против CD69 и антитела против интегрина α4β7.
9. Способ по любому из пп.1-5, где антитело против активированных нейтрофильных гранулоцитов,
иммобилизованное на носителе, представляет собой антитело против CD66b.
10. Способ по любому из пп.1-5, где антитело против активированных эозинофильных гранулоцитов, иммобилизованное на носителе, представляет собой антитело против CD9.
11. Лейкаферезная колонка, заполненная носителем, на котором иммобилизованы антитела против
поверхностных клеточных маркеров активированных лейкоцитов, выбранных из T-лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и эозинофильных гранулоцитов, где указанные активированные лейкоциты представляют собой активированные лейкоциты в биопсийном образце, полученном из воспаленной ткани
кишечника пациента, страдающего воспалительным заболеванием кишечника (IBD), механически обработанном для получения клеточной суспензии, и где указанные антитела против активированных Tлимфоцитов выбраны из антител против CD69 и интегрина α4β7; и где указанные антитела против акти-7-
016851
вированных нейтрофильных гранулоцитов выбраны из антител против CD66; и где указанные антитела
против эозинофильных гранулоцитов выбраны из антител против CD9.
12. Комбинация одной или более чем одной лейкаферезной колонки по п.11, соединенных параллельно или последовательно.
13. Аппарат для лейкафереза, включающий колонку по п.11, насос для крови, последовательно соединенный с колонкой, и средство для соединения насоса и колонки с венозной системой пациента.
14. Носитель для T-лейкафереза, содержащий иммобилизованное на нем одно или более чем одно
антитело, полученное против активированных лейкоцитов, выбранных из T-лимфоцитов, нейтрофильных гранулоцитов и эозинофильных гранулоцитов, выделенных из воспаленной ткани кишечника пациента, страдающего воспалительным заболеванием кишечника (IBD), где указанные антитела против активированных T-лимфоцитов выбраны из антител против CD69 и интегрина α4β7; и где указанные антитела против активированных нейтрофильных гранулоцитов выбраны из антител против CD66; и где указанные антитела против эозинофильных гранулоцитов выбраны из антител против CD9.
15. Носитель по п.14, где активированные лейкоциты выделены из одного или нескольких биопсийных образцов, полученных из воспаленной ткани кишечника.
Фиг. 1
Фиг. 2
-8-
016851
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
-9-
016851
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 8
- 10 -
016851
Фиг. 9
Фиг. 10
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 11 -