ISSN 1563-0218 Индекс 75866 25866 Əл
advertisement
Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті ҚазҰУ ХАБАРШЫСЫ Биология сериясы АЛМАТЫ Основан 22.04.1992 г. Регистрационное свидетельство № 766. Перерегистрирован Министерством культуры, информации и общественного согласия Республики Казахстан 25.11.99 г. Регистрационное свидетельство №956-Ж Редакционная коллегия: Шалахметова Т.М., д.б.н., проф., (научный редактор) Тулеуханов С.Т., д.б.н., проф., (зам.научного редактора) Оразова С.Б., к.б.н. (ответственный секретарь) тел.: 377-33-29 Айдосова С.С. д.б.н., проф., Айташева З.Г. д.б.н., проф., Бисенбаев А.К. д.б.н., Заядан Б.К., д.б.н., проф., Иващенко А.Т. д.б.н., проф., Карпенюк Т.А. д.б.н., проф., Мукашева Т.Д. д.б.н., Мухитдинов Н.М. д.б.н., проф., Нуртазин С.Т. д.б.н., проф., Сапаров К.А. д.б.н., проф., Шигаева М.Х. д.б.н., проф., Шулембаева К.К. д.б.н., проф. Вестник КазНУ Серия биологическая № 4 (56) 2012 г. ИБ № 5720 Подписано в печать 31.08.2011. Формат 90х110 1/8. Бумага офсетная № 1. Печать офсетная. Уч.-изд.л. 16. Тираж 500 экз. Заказ № 298 Цена договорная. Издательство «Қазақ университеті» Казахского национального университета имени аль-Фараби. 050038, г.Алматы, пр. аль-Фараби, 71, КазНУ. Отпечатано в типографии издательства «Қазақ университеті» ISSN 1563-0218 Индекс 75866 25866 Казахский национальный университет имени аль-Фараби ВЕСТНИК КазНУ Серия биологическая № 4 (56) 2012 Внеочередной. Собственник КазНУ имени аль-Фараби СОДЕРЖАНИЕ: ПЛЕНАРНЫЕ ДОКЛАДЫ Саубенова М.Г. Достижения Института Микробиологии И Вирусологии Кн Мон Рк Мансуров З.А. Нанотехнологии: 20 Летняя Деятельность и перспективы развития. Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д. Разнообразие микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности Алмагамбетов К.Х., Молдагулова Н.Б., Ануарбекова С.С., Сармурзина З.С. Коллекции микроорганизмов, их использование и развитие МИКРОБИОЛОГИЯ Абдиева Г.Ж., Имадиева А.М., Қайырманова Г.Қ., Жұбанова А.А., Акимбеков Н.Ш. Ағын судан бөлініп алынған деструктивті белсенді гетеротрофты микроорганизмдерді идентификациялау жəне иммобилиздеу……………………………………………………………… Айдаркулова Р.С., Науанова А.П., Айтенова М.Б. Фунгицидті қасиетке ие сhaetomium туысына жататын саңырауқұлақ штамдарын арпаның тамыр шірігі ауруына қарсы қолдану.............................................................. Аленькина С.А., Трутнева К.А., Никитина В.Е. Влияние лектинов азоспирилл на содержание салициловой кислоты в корнях проростков пшеницы …………………………………………………………………... Алимарданова М.К., Надирова С.А., Султанбекова А.Б. Биотехнологические аспекты использования вторичного белково– углеводного сырья…………………………………………………………. Алмагамбетов К.Х., Сармурзина З.С., Молдагулова Н.Б., Абитаева Г.К. Влияние экстрактов лекарственных растений на биологические свойства микроорганизмов Антоновская Л.И., Белясова Н.А., Рокало И.П. Использование метаболической активности бактерий для оценки степени бактериостойкости материалов…………………………………………….. Баяқышова Қ., Гаврилова Н.Н., Ратникова И.А. Ассоциациялар құрамына кіретін мұнайтотықтырушы микроорганизмдердің культивирлеу жағдайларын іріктеу .......................................................... Блиева Р.К. Повышение продуктивности и селекция микромицетовпродуцентов ферментов............................................................................ Ботбаева Ж.Т., Науанова А.П., Əбдукерім Р.Ж. Разработка технологии получения эффективного биофунгицида – стимулятора роста растений на основе микроорганизмов……………………………… Велямов М.Т., Дарахунова Н.Н., Бержанова Р.Ж. Обогащение овощных напитков пектином является жизненно важным ……………. Велямов М.Т., Бержанова Р.Ж., Амирбаева М.М., Амангелді А.А. Көкөністердің микробиологиялық ластануының мониторингі кезіндегі негізгі көрсеткіштерді зерттеу................................................................... Велямов М.Т., Амангелды А.А., Амирбаева М.М. Картопты, орамжапырақты, сəбізді сақтау кезінде микроорганизмдердің түрлерін анықтау... 6 8 14 16 20 24 28 31 32 34 37 40 43 46 49 52 Damdinsuren L., Selenge Ts., Tsend-Ayush D.Meat value chain nalysis, renewal strategyin Mongolia.................................................................................................... Дэлгэрмаа С., Цэрэндулам Ц. Биоцидное действие экстрактов растений на различные виды микроорганизмов Заядан Б.К., Кирбаева Д.К., Садвакасова А.К., Болатхан К. Содержание биологически активных веществ смешанных культур микроводорослей при совместном культивировании………………………….. Зорина А.А., Степанченко Н.С., Новикова Г.В., Лось Д.А. Функциональная геномика и фосфопротеомика стрессовых ответов у цианобактерий……………………………………………………….. Игнатова Л.В., Бражникова Е.В., Мукашева Т.Д., Цзю В.Л., Бержанова Р.Ж., Сыдыкбекова Р.К., Шукешева С.Е. Скрининг активных нефтедеструкторов среди дрожжеподобных грибов рода Aureobasidium................................................................................................................................................... Калиева А.К., Блиева Р.К. Рenicillium cyclopium 2-11 штамынан алынған пектинлиаза ферменттерінің физика-химиялық қасиеттерін зерттеу жəне синтетикалық жуғыш заттарда іс жүзінде қолдану............................................................................................................................................................. Канаев А.Т., Мырзаханова И.А. Новые методы обеззараживания и оценка состояния воды водовода «астрахань – мангышлак»………………………………………………………………………………………… Кирбаева Д.К., Заядан Б.К., Уразбекова Г.Е., Темирбаев С.А. Əртүрлі концентрациялы цинк сульфатының spirulina platensis-тің өнімділігіне əсері……………………………………………………....... Е.В. Куприянова, Н.А. Пронина Со2-концентрирующий механизм алкалофильных цианобактерий из содовых озер………………………………………………………………………………………………………... Мукашева Т.Д., Бержанова Р.Ж., Шигаева М.Х., Сыдыкбекова Р.К., Игнатова Л.В., Даутова Д., Сартаева А.А. Стабилизация популяции и селекция микроорганизмов - деструкторов полициклических ароматических углеводородов………………………………………………………………………...................... Бержанова Р.Ж., Мукашева Т.Д., Шигаева М.Х., Сыдыкбекова Р.К., Игнатова Л.В., Искакова Ж.К., Дуйсембинова Д., Алашбаева А., Сартаева А.А. Сообщества актиномицетов рода Streptomyces в подзональных подтипах почв равнинной территории Казахстана...................................................................... Мукашева Т.Д., Шигаева М.Х., Бержанова Р.Ж., Сыдыкбекова Р.К., Игнатова Л.В., Даутова Д., Алашбаева А., Сартаева А.А. Разработка регламента получения многокомпонентных композиций из микроорганизмов-деструкторов и оценка возможности их использования для биоремедиации………………. Өнерхан Г., Заядан Б.К.2, Билал С. Зеренді көлінен алынған су үлгілеріне chlorella sp-3k штамын өсіру арқылы биотест жүргізген нəтижелер Ратникова И.А., Н.Н. Гаврилова Н.Н., Л.П. Треножникова, К. Баякышова, А.Х. Хасенова. Устойчивость к желчи молочнокислых, пропионовокислых бактерий и их ассоциаций, адаптированных к низкому значению рН……………………………………………………………………………………………… Сагындыков У.З., Мамырбекова Ж., Макажанова Х.Х., Губарева С.С. Түйе сүті негізіндегі құрғақ биологиялық белсенді қоспаның сапалық мінездемесі....................................................................................... Сагындыков У.З., Кожахметова З.А., Мустафаева М.Ж. Влияние фитонцидов борщевика сосновского на микрофлору смешанных силосов…………………………………………………………………………….... С.Сагындыкова, Б. Мухамбетов, А. Нурлыбеков, С.А. Надирова ,У.З. Сагындыков, Бержанова Р.Ж. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных почв..................................................................................... Савицкая И.С.Популяционный уровень кишечных пробиотических бактерий и фекальные мутагены....... Савицкая И.С., Тарасов В.А., Кистаубаева А.С., Воронова Н.В. Батарея бактериальных тест-систем для генетической токсикологии……………………………………………………………….............................. Савицкая И.С., Кистаубаева А.С., Нигметова К., Воронова Н.В.Исследование антагонистической активности и жизнеспособности клеток лактобацилл, иммобилизованных на карбонизованном сорбенте... Савицкая И.С., Кистаубаева А.С., Абдулжанова М., Жумагалиева Ж. Принципы отбора штаммов для нового лактосодержащего пробиотика………………………………………………………………………….. Сыдыкбекова Р.К., Каргаева М.Т., Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д., Бержанова Р.Ж., Игнатова Л.В., Бражникова Е.В. Распределение грамположительных бактерий в целинных почвах равнинной территории Казахстана…………………………………………………………………………………………….. Шемшура О.Н. Определение хитинолитической активности у грибов антагонистов……………………….. Шемшура О.Н., Бекмаханова Н.Е., Мазунина М.Н. Исследование нематостатической активности белковых фракций гриба Аspergillus sp……………………………………………............................................. Чуркина Г.Н. Микробиологическая активность южных черноземов в плодосменных севооборотах………... БИОТЕХНОЛОГИЯ Абай Г.Қ., Ерназарова А.К., Кайырманова Г.К. Ластанған ағын суларда кездесетін цианобактерияларды зерттеу.......................................................................................................................... Авксентьева О.А., Жмурко В.В. Генетический контроль путей морфогенеза in vitro изогенных по генам PPD линий озимой пшеницы Triticum aestivum l………………………………....................................... 2 53 57 59 62 64 66 70 73 76 78 81 85 91 94 97 99 100 102 107 110 114 119 123 125 128 130 133 Алмаганбетов Ж.С., Джокебаева С.А., Бейсембаева Р.У., Оразова С.Б. Көк-жасыл микробалдырлардың мутуалистік типті дикультураларын айқындау.................................................................. Alikulov Z., Myrzabaeva M., Utupov T., Babenko O. Xenobiotic transforming activity of animal molybdoenzymes……………………………………………………………………………………………………. Алыбаева Р.А., Билялова Г.Ж., Кожахметова А.Н. Оценка устойчивости генотипов пшеницы к свинцу и цинку для создания экологически чистой технологии ее возделывания......................................... Аимбетов Р.С., Бисенбаев А.К., Сарбасов Д.Д. GLY-934 обеспечивает взаимодействие риктора с SIN1… Асрандина С.Ш., Кенжебаева С.С., Атабаева С.Д. Құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлардың бидайдың тұзды ортаға төзімділік қасиетіне тигізетін əсері.................................................. Атабаева С.Д., Кенжебаева С.С. Трансгенные растения для фиторемедиации................................................ Басыгараев Ж.М., Ибрагимова С.А., Ережепов Ə.Е. Тулегенова Ж.Б., Абылайханов Е.Т. Цитокинин медиаторының физиологиялық белсенділігінін биотест көмегімен зерттеу..................................................... Берсимбай Р.И. Роль геномных исследований в изучении предрасположенности к бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких...................................................................................................... Бишимбаева Н.К., Ережепов А.Е., Шилманова А.А., Нахимова А., Сартбаева И.А. Бидайдың сомаклонды варианттарының тұзға төзімділігін зерттеу...................................................................................... Гончарова А.В., Карпенюк Т.А., Цуркан Я.С. Углеводородокисляющие микроорганизмы активного ила как сорбенты тяжелых металлов....................................................................................................................... Джолдыбаева Б.C., Алтыбаева Н.А., Бисенбаев А.К. Изучение действия экзогенной Н2О2 на жизнеспособность клеток алейронового слоя зерна пшеницы………………………………………………… Джусупова Д.Б.. Внедрение курса «Экологическая биотехнология» для подготовки в вузах специалистов экологов................................................................................................................................... Davletova K. Sh., Yerezhepov A.Y. Biotechnology: achievements and consequences………………………...... Жакешбаева Р.Б., Альмурзаева С.И. Мұнаймен ластанған топырақтың ауылшаруашылығында маңызды өсімдіктерге əсерін анықтау.............................................................................................................................. Жұмабаева Б.Ə., Тұрашева С.Қ., Абдықалықова Ұ.О. «Казахстанская-10» бидай сортының сомаклондарының селекциялық белгілерін анықтау........................................................................................... Жусипова Д.А., Абдиева Г.Ж., Жакипбекова А.С., Тансикбаева Г.С. Лактобактериялардың белсенді штамдары негізінде сүтқышқылды сусын алу.................................................................................................... Заядан Б.К., Отаров А.О., Баймаханова Г.Б., Ораз Г., Кумар М. Изучение альгофлоры рисовых полей шиелийского района кызылординский области и выделение бактериологически чистых культур микроводорослей и цианобактерий.................................................................................................................... Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Оразова С.Б., Джокебаева С.А., Бейсембаева Р.У. Поиск микроводорослей и микроорганизмов, синтезирующих арахидоновую кислоту и ее производные.............. Кенжебаева С.С., Асрандина С.Ш., Доқтырбай Г. Жаздық бидайдың мутантты формаларына құрғақшылықтың əсері...................................................................................................................................... Кебекбаева К.М., Джобулаева А.К., Треножникова Л.П., Хасенова А. Жизнеспособность и биологическая активность актиномицетов сине-фиолетовой группы после длительного хранения Кебекбаева К.М. Длительное хранение культур микроорганизмов в коллекции. Кожалакова А.А., Жубанова А.А. Эффективность использования абсорбента нефти на основе торфяного сфагнового мха.................................................................................................................................................. Курманбаев А.А., Файзулина Э.Р., Ауэзова О.Н., Байгонусова Ж.А., Саданов А.К., Шорабаев Е.Ж. Биоремедиация нефтезагрязненной почвы испытательного полигона тоо «жылыой-болашак» ассоциациями нефтеокисляющих микроорганизмов...................................................................................... Қазыкен Д. Гель хроматографиясымен mtor комплекстерін бөліп алу.............................................................. Қосманбетова Н.Б., Донбаева М.Н., Баубекова А.С., Мелдебекова А.А., Конуспаева Г.С. Lactococcus acidophilus жəне lactococcus plantarum сүтқышқылды бактерияларымен ұйытылған түйе сүтінің физикахимиялық қасиеттерінің өзгеруі......................................................................................................................... Мусалдинов Т.Б. Влияние биопрепарата «альгин» на посевные качества семян и повышение устойчивости к корневой гнили сахарной свеклы Мухамбетжанов С.К., Ережепов А.Е., Кударов Б.Р. 2, Ережепов Д.А. Выращивание кормового злака brachiaria spp. в условиях in vitro Нуржанова А.А., Жунусова Ж.С., Кашкеев К., Ермекова М.Ш. Фиторемедиационный потенциал дикорастущих видов растений.......................................................................................................................... Савицкая И.С., Жубанова А.А., Кистаубаева А.С., Болекбаева А.Б. Антибиотикорезистентность лактобацилл – пробиотиков................................................................................................................................ Савицкая И.С., Кистубаева А.С., Абдулжанова М., Жумагалиева Ж. Принципы отбора штаммов для нового лактосодержащего пробиотика 3 137 140 142 145 150 153 158 160 163 167 172 176 178 181 183 186 190 194 198 201 203 205 207 209 211 214 216 218 222 227 Сайдсұлтанова Ж.С., Галиева Л.Д., Тезекбаева Б.К., Шарафутдинова Д.А., Малахова Н.П. Бидайдың клеткалық культураларындағы супероксиддизмутаза (СОД) ферментінің белсенділік деңгейіне қолайсыз жағдайлардың əсері........................................................................................................................ Табыс Д., Бейсембаева Р.У., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В. Топырақ микроорганизмдерін арахидон қышқылының көзі ретінде зерттеу........................................................................................................................ Тайпакова С.М., Жанаева А.Б., Бисенбаев А.К. Клонирование и экспрессия КДНК эндо-β-1,4-глюканазы гриба Aspergillus niger в E. coli и характеристика рекомбинантного белка................................. Треножникова Л.П., Айткельдиева С.А., Хасенова А.Х., Шакиев С.Ш., Ултанбекова Г.Д., Саданов А.К. Перспективы исследования экстремофильных микроорганизмов в Казахстане...................... Ұлтанбекова Г.Д., Саданов А.Қ., Гаврилова Н.Н., Шорабаев Е.Ж., Усикбаева М.А. Жоғары өнімді азотсіңіретін кең спектрлі бейімделгіш симбиозды өсімдік-микробты жүйені таңдап алу технологиясы..... Шығаева М.Х., Сағындықова С.З., Дүйсекенова А.Б. «Софмайя» шұбат сусынын дайындаудың ғылыми негізі.............................................................................................................................................................. Шығаева М.Х., Сағындықова С.З., Дүйсекенова А.Б. Изучение микроорганизмов фарша из осетровых рыб..................................................................................................................................................................... НАНОТЕХНОЛОГИЯ Gilmanov M. K., Gilmanova S.M., Tutkyshbaev S.O., Kaster, Begzat A.N. The new nanocapsules for succesful therapy of spinal tuberculosis ................................................................................................................... Жандосов Ж.М., Керимкулова А.Р., Бийсенбаев М.А., Мансуров З.А., Жубанова А.А. Возможность использования углеродного материала на основе абрикосовых косточек в процессе гемоперфузии........... Жандосов Ж.М. Синтез углеродных материалов из скорлупы грецких орехов путем карбнизации в присутствии фосфорной кислоты ......................................................................................................................... Зарубина А.П., Лукашев Е.П., Деев Л.И., Пархоменко И.М., Рубин А.Б., Шойынбекова С.А., Жылқыбаев О.Т.2, Кұрманкұлов Н.Б.. Люминесцентті бактериялардың тест-жүйелерін пайдаланып бір қабатты көміртекті нанотүтікшелердің биологиялық эффекттерін биотестілеу........... Заядан Б.К., Маторин Д.Н., Болатхан К., Садвакасова А.К., Усербаева А.А., Балтабекова А.Ж. Влияние наночастиц серебра и золота на параметры флуоресценции хлорофилла мутантов зеленой микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii Dang …………………………………………………………….. Каиров У.Е., Зиновьев А.Ю., Карпенюк Т.А., Раманкулов Е.М. ДНК-микрочипы: от основ технологии к анализу данных Керимкулова А.Р., Султанова Н.А., Гильманов М.К., Мансуров З.А., Абилов Ж.А., Жусупова Г.Е., Бурашева Г.Ш., Жандосов Ж.М., Ескалиева Б.К. Применение наноструктурированных углеродных адсорбентов для выделения биомолекул и лекарственных растительных субстанций …......... ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ Алдибекова К.Н. Электромагниттік өрісті геоаномальды бөлімдердің техногендік ерекшеліктерін зерттеу...................................................................................................................................................................... Атабаева С.Д., Кенжебаева С.С. Трансгенные растения для фиторемедиации........................................... Атамбаева Ш.А. Свойства онкогенов рака молочной железы ........................................................................ Бари А.А., Хайленко В.А., Иващенко А.Т. Характеристики связывания miR414 с mRNA генов хромосомы 4 Arabidopsis thaliana ....................................................................................................................... Берилло О.А., Исабекова А.С., Хайленко В.А., Иващенко А.Т. Характеристики связывания межгенных, интронных и экзонных miRNA с mRNA генов, кодирующих интронные miRNA .................... Богуспаев К.К., Фалеев Д.Г., Перова И.А., Ережепов Д.А. Влияние биогумуса на поглощение тяжелых металлов (Cd, Zn) гиперакумулятором тяжелых металлов Helianthus annuus L ................... Богуспаев К.К., Касымбеков Б.К., Фалеев Д.Г., Оразова С.Б., Ишангалиева С.С., Перова И.А. Влияние эндомикоризы на некоторые биохимические показатели растений Avena sativa L. И Phaseolus vulgaris L. при почвенном загрязнении тяжелыми металлами в условях лабораторного эксперимента ...... Исабекова А.С., Хайленко В.А., Иващенко А.Т. Связывание межгенных microRNA человека с сайтами mRNA генов, участвующих в развитии рака толстой кишки .............................................................. Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Джокебаева С.А., Бейсембаева Р.У., Оразова С.Б. Поиск микроводорослей и микроорганизмов, синтезирующих арахидоновую кислоту и ее производные Колумбаева С.Ж., Бегимбетова Д.А., Ловинская А.В., Калимагамбетов А.М. Содержание первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов в печени лабораторных крыс при воздействии фипронила и фипронил-сульфона .................................................................................................. Нурмаханова А.С., Атабаева С.Ж., Айдосова C.С., Махашова А., Қалдыбекқызы Г., Кенжебаева С.С., Асрандина С.Ш., Чунетова Ж.Ж.Тұздану жəне мыс иондарының əртүрлі бидай сорттарының өсуіне əсері .......................................................................................................................... Оразова С.Б., Джокебаева С.А., Актамбаева А., Джумабаева Л., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В. Балдырлардың моно- жəне аралас дақылдарындағы липидтердің жинақталуы ............................................. Романова С.М. Значение гидрохимических и гидробиологических показателей для исследования качества 4 232 235 239 244 247 248 251 253 256 259 262 267 270 274 278 280 285 288 292 300 304 307 312 316 319 323 327 природных вод Казахстана .................................................................................................................... К.Р. Утеулин, С.К. Мухамбетжанов, Г. Бари, А. Искакова Влияние комплексной обработки семян композицией хелатированных микроэлементов, стимуляторов роста и пленкообоазующих веществ на адаптацию растений кукурузы к солевому стрессу ........................................................................................... К.Р. Утеулин, А. Отаров, А. Искаков, С.К. Мухамбетжанов, Г. Бари Влияние обработки карбосиметилцеллюлозой и поливиниловым спиртом в качестве пленкооброзователей на прорастание и всхожесть семян риса ............................................................................................................................................ Т.Л. Тажибаева Действие низкотемпературного стресса на изопероксидазы пшеницы, различающиеся по изоэлектрическим точкам ................................................................................................................................ О.М. Цивилева, И.М. Учаевa, А.Н. Панкратов, Ю.Д. Маркович, В.Е. Никитина Акридон-n-уксусная кислота в искусственной культуре базидиомицета: первоначальное исследование на примере Lentinula edodes ...................................................................................................................................................... ИННОВАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ И БИОТЕХНОЛОГИЯ А.И.Абугалиева, К.К.Кожахметов, Т.В. Савин Оценка и маркирование диких сородичей пшеницы и их гибридов с коммерческими сортами по содержанию Fe, Zn и составу глютенина ……………………... П.Г.Алексюк Изучение способности сапонинов, полученных из корня растения Allochrusa Gypsophiloides формировать iscomatrix ………………………………………………………………………… Д.Ж.Асаубаева, Н.Б. Ахматуллина, О.Г.Чередниченко Индукция эффекта свидетеля в лимфоцитах человека при воздействии ионизирующей радиации …………………………………………………………. DA Bekbolsynov, VB Ogay, EK Raimagambetov and AE Mukhambetova Mesenchymal stem cell in hyaluronic acid scaffold as a therapeutic tool for osteoarthritis – preliminary report …………………………… З.Б. Есимсиитова, У.С.Шапенова Морфологическое исследование почек крыс в эксперименте С.А.Ибрагимова, Н.Г. Ригер, Е.Ю. Гуккенгеймер, Д.П. Сафонов, Ш.М. Нурмолдин, А. С. Есиббаева Изучение свойств нового биосенсора для экологического мониторинга раннего антропогенного загрязнения природных водоемов …………………………………………………………. Т.Р. Рыспеков Cовременная постагрогенная сукцессия на различных ландшафтах как экологический объект изучения природы ……………………………………………………………………………………….. И.А. Солдатова, М.С. Абитаева, Э.С. Омиртаева, А.П. Богоявленский Изучение иммуностимулирующей и профилактической активности растительного препарата S.O. … А.С. Турмагамбетова, П.Г. Алексюк, И.А. Зайцева, А.П. Богоявленский, В.Э. Березин Изучение антивирусной активности растений Dianthus caryophyllus и Stellaria media . Ремеле В.В. Микологический мониторинг зерна основных культур Казахстана Пономарева Е.Г., Шелудько А.В., Никитина В.Е. Сравнительная характеристика лектинов бактерий рода azospirillum Райымбекова Л.Т., Кузнецова Т.В., Олейникова Е.А. “Қайсар сүт” жəне “Ақбұлақ ” мал кешендерінің сүтінің қауіпсіздігі мен микробиологиялық көрсеткіші жəне сүт қышқылы бактерияларын бөліп алу". А.П. Науанова, А.С. Кошаева, А.Ж. Назарова Влияние различных технологий обработки почвы в зернопаровом севообороте на распространение целлюлозоразрушающих микроорганизмов в почве Г.Мунхцацрал, О.Энхтуяа, С.Дэлгэрмаа Некоторые результаты исследования антибактериального действия лишайника вида Xanthoparmelia Camtschadalis (Ach.) Hale, собранного на территории Монголии 5 331 33 33 340 34 351 353 35 3 36 36 36 371 37 37 38 382 385 ПЛЕНАРНЫЕ ДОКЛАДЫ М.Г. Саубенова ДОСТИЖЕНИЯ ИНСТИТУТА МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ КН МОН РК Институт микробиологии и вирусологии (ИМВ) АН КазССР был образован на базе Сектора микробиологии Института ботаники АН КазССР постановлением Президиума Академии Наук КазССР № 13 от 30.01.1956 г. Основой для возникновения Института микробиологии и вирусологии была возглавляемая членкорреспондентом АН КазССР, профессором Д.Л. Шамисом лаборатория технической микробиологии, которая успешно занималась насущными проблемами промышленности Казахстана в области виноделия, хлебопечения, кормопроизводства, молочной промышленности. Результаты исследований находили широкое практическое применение. Одной из основных проблем второй половины ХХ века была недостаточность кормовой базы животноводства. К чести нашего Института, именно в нем были заложены научные основы силосования растительного сырья; выделены, изучены и внедрены в практику кормопроизводства бактерии, используемые в качестве заквасок при ферментации и консервировании как легко-, так и трудносилосующихся растений. Предприятия по производству заквасок функционировали в различных областях Советского Союза. И неслучайно, что «Казбиосил» - специализированные концентрированные закваски, содержащие высокоэффективные штаммы молочнокислых бактерий, предназначенные для силосования широкого набора кормовых растений, получили в настоящее время дальнейшее развитие и, соответственно, столь высокую оценку. В плане продолжения исследований в данном направлении была разработана и в последующем широко внедрена технология твердофазной ферментации целлюлозосодержащих отходов растениеводства, в том числе неутилизируемых отходов – рисовой соломы, шелухи зерновых и лузги подсолнечника, с получением корма с высокими показателями поедаемости, перевариваемости, питательности. Решения этой задачи добивались многие научные коллективы Советского Союза, однако столь малозатратная, простая и эффективная технология была разработана только в нашем институте. То же самое можно сказать и о способе протеинизации малоценных кормов путем выращивания кормовых дрожжей на дрожжерастильных установках, также успешно внедряемых в различных областях СССР, в том числе на Беланском маисовом комбинате (г. Владикавказ). Одним из наиболее актуальных вопросов, решаемых в лаборатории физиологии микроорганизмов (ранее лаборатории технической микробиологии), был вопрос, стоящий перед молочной промышленностью Казахстана. Следует отметить, что Майя Хажетдиновна Шигаева в течение многих лет являлась научным консультантом лаборатории. Именно под ее руководством и при непосредственном участии были развиты исследования микрофлоры казахских национальных напитков, и разрабатывалась проблема повышения сроков их хранения. Являясь заместителем директора по науке ИМВ АН КазССР, М.Х. Шигаева в той или иной степени влияла на научные исследования, проводимые в других лабораториях института. Перейдя же на должность заведующего кафедрой микробиологии КазГУ им. С.М. Кирова в 1971 году, Майя Хажетдиновна не только не утратила научных связей с ИМВ, но и способствовала обеспечению его квалифицированными кадрами, успешно трудящимися все последующие годы на благо микробиологии и вирусологии. В настоящее время РГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК на праве хозяйственного ведения (ИМВ на ПХВ) является ведущей научной организацией в Республике Казахстан, разрабатывающей фундаментальные и прикладные проблемы в области микробиологии и вирусологии, направленные на укрепление научно-технического потенциала Республики и развитие социально-экономической сферы. Основным предметом деятельности Института является проведение научных исследований в области микробиологии и вирусологии, разработка микробных и вирусных препаратов для защиты окружающей среды, сельского хозяйства, медицины, пищевой и других отраслей промышленности, а также подготовка научных кадров в области микробиологии и вирусологии. Основными направлениями научной деятельности Института являются: разработка технологий биоремедиации окружающей среды с использованием микроорганизмов, а также изучение механизмов трансформации металлов; разработка технологий и бактериальных препаратов для микробиологической очистки водоемов, почвы и промышленных стоков от нефтяных загрязнений; 6 разработка фундаментальных основ совершенствования диагностических критериев фитопатогенов и средств защиты растений от заболеваний сельскохозяйственных культур; создание препаратов пробиотиков, а также столовых молочнокислых напитков, для профилактики и лечения кишечных инфекций и дисбактериозов у людей и сельскохозяйственных животных; поиск и изучение новых антибиотиков, повышение активности продуцентов известных антибиотиков; изучение проблем длительного сохранения промышленно ценных штаммов микроорганизмов, повышение активности продуцентов биологически активных веществ, сохранение и пополнение коллекционного фонда микроорганизмов; изучение механизмов циркуляции вируса гриппа на территории Республики Казахстан, выделение штаммов вируса гриппа от человека, животных и птиц, их биохимический, иммунохимический, молекулярный и филогенетический анализ; выделение штаммов парамиксовирусов птиц, имеющих большое практическое значение для сельского хозяйства Казахстана, их биохимический, иммунохимический, молекулярный и филогенетический анализ; совершенствование методов иммунодиагностики и молекулярной диагностики орто- и парамиксовирусов, разработка усовершенствованных тест-систем для упрощенной экспрессдиагностики вирусных инфекций; разработка вакцинных препаратов нового поколения на основе очищенных вирусных белков, поиск и изучение новых иммуностимуляторов для повышения эффективности вакцинных препаратов; разработка новых лечебных и профилактических антивирусных препаратов растительного и микробного происхождения для лечения и профилактики вирусных инфекций; изучение механизмов патогенного действия вируса гриппа и его структурных компонентов на клеточные структуры и органы. РГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК являлся головной организацией основного научного направления «Биологические основы промышленной микробиологии и биотехнологии» программы фундаментальных исследований «Закономерности функционирования биологических систем – основа создания инновационных технологий для медицины, сельского хозяйства и охраны окружающей среды» на 2009-2011 гг. В настоящее время в институте выполняются научные исследования по 20 – ти проектам грантового финансирования, 6-ти проектам Республиканских научно-технических программ на 2012-2014 гг. Институт микробиологии и вирусологии разработал и рекомендовал производству ряд новых технологических решений. В области экологии «Бакойл KZ» – высокоэффективный бактериальный препарат для микробиологической очистки водоемов, почвы и промышленных стоков от нефтяных загрязнений. Основой препарата являются активные штаммы нефтеокисляющих бактерий. Результаты полевых испытаний препарата показали снижение содержания нефти в нефтезагрязненной почве на 77-86 %. В области сельского хозяйства «Ризовит – АКС» – высокоэфективный препарат, созданный на основе штаммов клубеньковых бактерий. Действие препарата основано на способности клубеньковых бактерий фиксировать атмосферный азот. Препарат повышает урожай, качество готовой продукции и плодородие почвы, позволяет получать экологически чистый продукт, снижает заболеваемость растений. Рынок сбыта налажен. «Казбиосил» - специализированные концентрированные закваски, содержащие высокоэффективные штаммы молочнокислых бактерий, продуцентов молочной, уксусной кислот. Биоконсерванты предназначены для силосования широкого набора кормовых растений. «Кальдарин» - препарат на основе целлюлолитических бактерий для получения корма с повышенными показателями поедаемости, переваримости и питательности путем твердофазной ферментации целлюлозосодержащих отходов растениеводства, в том числе неутилизируемых. Кормовая добавка «Бентобак» – пробиотик физиологического назначения, способствует лучшему усвоению грубых кормов, снижению риска ацидоза у животных. Препарат приводит к приросту живой массы сельскохозяйственных животных на 30%, уменьшению затрат корма на 5%. Препарат представляет собой ассоциацию пропионовокислых и целлюлозолитических бактерий. В области защиты растений 7 Триходермин – грибной препарат для борьбы с корневыми гнилями картофеля, сахарной свеклы и других овощных культур. В области ветеринарии Лактовит – лечебно-профилактический препарат на основе молочнокислых и пропионовокислых бактерий для профилактики колибактериоза и сальмонеллеза молодняка сельскохозяйственных животных и птиц. В области здравоохранения Розеофунгин – широкоспектральный противогрибковый полиеновый антибиотик для лечения глубоких и поверхностных микозов. Спектр действия данного антибиотика значительно шире известных противогрибковых препаратов. Плантафермин – лечебно-профилактический препарат на основе молочнокислых и бифидобактерий. Предназначен для лечения и профилактики дисбактериозов различной этиологии, воспалительных и инфекционных заболеваний желудочно-кишечного и урогенитального трактов. Полилактобак – пробиотик, составленный из ассоциации молочнокислых и пропионовокислых бактерий. Испытан для лечения больных доброкачественной гипертензией предстательной железы 1 и 2 степени, осложненной после катеризации воспалением нижних мочевых путей. Применение препарата повышает эффективность стандартного антибактериального лечения в 2,5 –3,7 раза. Ферментированный свекольный сок – продукт для диетического и лечебного питания. Обладает положительной терапевтической эффективностью при лечении хронических заболеваний: гастрита, энтероколита, гепатита, холецистита. Может быть использован в комплексной терапии при желудочно-кишечных, сердечно-сосудистых и злокачественных заболеваниях, а также при диабете, атеросклерозе. В соответствии в Указом Президента Республики Казахстан от 17 ноября 2011 года №176 работе «Технология создания и организация производства биопрепаратов «Казбиосил», «Ризовит-АКС», «Бакойл-KZ» для сельского хозяйства и охраны окружающей среды», представленной Институтом микробиологии и вирусологии, авторами которой являются Саданов Аманкелди Курбанович, Айткельдиева Светлана Айткельдиновна, Гаврилова Нина Николаевна, Ратникова Ирина Александровна и другие, присуждена Государственная премия в области науки и техники. Эти препараты широко внедряются в Республике Казахстан. Таким образом, Майя Хажетдиновна как человек, отдавший много сил как в области научных изысканий, так и в подготовке кадров высокой квалификации для Института микробиологии и вирусологии, внесла достойный вклад в его процветание. З. А. Мансуров НАНОТЕХНОЛОГИИ: 20 ЛЕТНЯЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ Рассмотрены основные направления и разработки в области нанотехнологий в Институте проблем горения. Значимость и перспективность полученных результатов определяется их признанием и внедрением на предприятиях Республики Казахстан. Представлены инновационные разработки в области наноматериалов различного функционального назначения на основе исследований карбонизации отходов растительного сырья, проведенных в Институте проблем горения за последние 20 лет в области сельского хозяйства и медицины. Шигаева Майя Хажетдиновна – известный в Казахстане и странах дальнего и ближнего зарубежья ученый в области микробиологии. В 1949 г. окончила лечебный факультет Казахского государственного медицинского института им. В.М. Молотова. Трудовая деятельность академика Шигаевой М.Х. в Казахском национальном университете аль-Фараби началась в 1972 г. заведующим кафедрой, деканом биологического факультета. Свой юбилей Майя Хажетдиновна встречает в расцвете своей славы, в кругу близких родных, коллег, учеников, которым она дала путевку в жизнь, открыв двери в увлекательный мир Науки! Академик Шигаева М.Х. – человек удивительной научной судьбы, ее научные интересы находятся на стыке биологии и медицины, а в последнее время нанобиотехнологии, неудивительно, что тематика конференции, посвященная юбиляру, включает и секции нанотехнологии. Ниже представлены последние инновационные разработки ИПГ в области биологии, сельского хозяйства и медицины. Разработаны наноструктурированные материалы, имеющие практическое значение в качестве сорбентов для: селективного выделения биостимулятора фузикокцина; 8 очистки крови (в частности, от липидо-полисахаридов); детоксикации организма энтеросорбцией. 20 лет назад при изучении образования каталитического углерода на хромитовом шламе были получены углеродные нанотрубки рис. 1. Наблюдается образование нескольких УНТ из одного источника – явление октопус [1]. Рисунок 1. Электронные микрофотография углеродных нанотрубок полученных при изучении образования каталитического углерода на хромитовом шламе Одним из приоритетных направлений является создание нанокомпозиционных систем. Большое внимание уделяется синтезу углеродных наноматериалов различного назначения, в частности, высокоэффективных и доступных углерод-содержащих сорбентов, которые могут быть использованы для очистки промышленных выбросов от сероводорода, оксидов серы и азота, а также стоков от загрязнений фенолами и другими органическими соединениями. Перспективным сырьем при получении таких углеродных композиционных систем является ежегодно возобновляемые отходы сельхоз продукции (виноградные, абрикосовые косточки, рисовая шелуха) с широким спектром их применения. Полученные наноструктурированные материалы используются в качестве сорбентов для очистки промышленных сточных вод и питьевой воды от ионов тяжелых металлов и органических примесей, для извлечения благородных металлов, в качестве катализаторов гидроочистки и гидрообессеривания для облагораживания бензинов, для получения олефинов и ароматических соединений из бытового газа и газовых промышленных выбросов. Синтезированные углеродные наносорбенты были испытаны для очистки и выделения физиологически активного вещества цитокинина из сложной смеси. Изучено действие их в качестве медиаторов на повышение стрессоустойчивости важнейших злаковых культур Казахстана ин всхожесть семян пшеницы в условия засоления почвы. Разработка нового материала для детоксикации крови и организма (ИНГО-1 и ИНГО-2) [13]. Задачей технического решения является разработка способа получения из растительного сырья мезопористого углеродного сорбента, применяемого в качестве гемосорбента, отвечающего следующим требованиям: высокая степень химической чистоты; высокая сорбционная емкость по отношению к удаляемым веществам; инертность по отношению к форменным элементам крови; отсутствие пылеобразования (выделения ультрадисперсных частиц). Нами разработано изделие ИНГО-1 – стерильная, однократного применения колонка с сорбентом для очистки крови от токсинов. Новизна состоит как в конструкции колонки, так и в свойствах сорбента. Основные преимущества нашей колонки: - колонка выполнена по технологии предотвращающей пылеобразование в процессе сорбции; - колонка снабжена встроенным фильтром для предотвращения попадания в кровь дисперсных частиц; - колонка обеспечивает штатное подключение к большинству аппаратов для гемодиализа и гемосорбции. На рис. 2 представлен общий вид гемосорбента блочного типа изготовленного из карбонизированной рисовой шелухи. Геометрия макроструктуры гемосорбента оптимизирована для снижения повреждения форменных элементов крови. На рис. 3 представлена схема гемосорбента в картридже для использования очистки крови. В настоящее время закончены положительные предклинические исследования на собаках. 9 Рисунок 2. Общий вид блочного гемосорбента Рисунок 3. Гемосорбент в картридже На рисунке 4 представлена адсорбция ЛПС карбонизованной рисовой шелухой. Рисунок 4. Адсорбция ЛПС карбонизованной рисовой шелухи Применение энтеросорбентов ИНГО-2 в качестве сорбционной терапии может обеспечить решение комплексной задачи – детоксикации желудочно-кишечного тракта и нормализации кишечной микроэкологии. Благодаря наличию развитой пористой структуры энтеросорбент на основе карбонизованной рисовой шелухи ИНГО-2 имеет высокую удельную поверхность и способен адсорбировать различные органические и неорганические вещества, в том числе микробный липополисахарид, что обеспечивает возникновение качественно новых сорбционных свойств, а именно позволяет препарату сорбировать высокомолекулярные и средне молекулярные соединения, к которым, в частности, относятся энтеротоксины микробного происхождения. Проведенное электронно-микроскопические исследование показало, что между микробными клетками и карбонизированным материалом регистрируется сорбционное взаимодействие (рис. 5). Рисунок 5. Сорбция клеток L. fermentum на поверхности ИНГО-2 Видно, что клетки на поверхности ИНГО-2 расположены в основном в виде микроколоний. Этот факт может иметь существенное значение, поскольку межбактериальное агрегирование, происходящее в микроколониях – начальный этап образования биопленок, в которых бактерии значительно лучше защищены от неблагоприятных воздействий [4-6]. Полученный энтеросорбент ИНГО-2 обладает высокой сорбционной способностью, а также наличием в его макромолекулах различных функциональных групп. Это позволяет связывать и выводить энтеральным путем бактериальные клетки и продукты их жизнедеятельности, эндогенные и экзогенные токсины, проникающие в желудочно-кишечный тракт. Энтеросорбент ИНГО-2 восстанавливает биоценоз кишечника, снижает концентрацию токсинов в крови, плазме и 10 асцитической жидкости, другие биохимические показатели, нарушенные при экзо- и эндотоксинемии. В таблице 1 приведены данные по влиянию искусственной желудочной среди на биотитр препарата. Таблица 1. Влияние искусственной желудочной среды на биотитер препарата Вид препарата Колонии, образующие Кратность падения титра единицы До процесса Жидкий концентрат 3,7 х 109 лактобактерий Лактобактерии на 1,6 108 активированном углероде Лактобактерии на 1,1 108 карбонизованной рисовой шелухе После процесса 5,2 х 105 7100 1,1 106 145 3,23 106 34 Из таблицы 1 следует, что лактобактерии, адсорбированные на карбонизованной рисовой шелухой в пять раз больше удерживаются в среде желудка, чем в случае использовании традиционного углеродного сорбента. В целом, эта разработка имеет огромное социальное значение – выпуск новой наукоемкой продукции для внутреннего потребления и на экспорт, основанной на новейших научных разработках; улучшение здоровья нации; экономическая безопасность – независимость от внешнего рынка фармацевтической продукции; создание новых рабочих мест (порядка 300 чел); наполнение рынка отечественными товарами высокого качества казахстанского содержания; развитие высоких технологий путем формирования совместных кластеров науки и производства; сохранение и развитие кадрового потенциала науки. Нанопористый углеродный сорбент для молекулярно-ситовой хроматографии белковолипидного комплекса Большая часть фармацевтических препаратов и биомолекул чувствительна к повышенным температурам, поэтому в фармацевтических производствах широко используют хроматографию с применением разных видов сорбентов [7]. Однако совершенствование хроматографических сорбентов становится невозможным без применения идей и методов нанотехнологий. В этом плане большой интерес представляют собой наноструктурированные, нанопористые сорбенты, имеющие лучшие характеристики, чем стандартные сорбенты (например, сефарозы и сорбенты для гидрофобной хроматографии – октил – и фенилагарозные гели) [8-10]. На мировом рынке практически не имеется сорбентов пригодных для очистки биомолекул в производственных масштабах. Существующие сорбенты крайне дороги, их стоимость колеблется от нескольких сот до нескольких тысяч долларов и предназначены они в основном для аналитических целей. Эти сорбенты большей частью изготовлены из таких углеводных полимеров как декстрановые или агарозные гели [11, 12]. Они имеют очень низкую механическую прочность. Такие гели легко атакуются грибками и микробами, поэтому все эти сорбенты недолговечны и срок их эксплуатации не превышает нескольких месяцев. Они малопригодны для разделения веществ в препаративных количествах. Поэтому существует острая необходимость, основываясь на принципах нанотехнологий создания принципиально нового поколения сорбентов предназначенных для очистки биомолекул и биоструктур [13]. Цель настоящей работы – разработать такие сорбенты, которые бы отличались высокой механической прочностью и выдерживали большое давление, обладали большой емкостью и высокой износоустойчивостью, позволяющий им работать в длительное время [14-16]. На рис. 6а представлен снимок поверхности целой частицы углерода из абрикосовых косточек карбонизованных при температуре 800°С. Для анализа взяты образцы, диспергированные до 1 мм. Общий вид частицы представлен на рис. 6б. Как видно из этого рисунка, частицы имеют пористую структуру. Нами проведено углубленное электронно-микроскопическое исследование структуры материала, карбонизованного при температуре 800°С, при больших увеличениях. При увеличении до 1100 раз можно увидеть, что на поверхности образца присутствуют крупные поры от 1500 нм до 3000 нм и на границах крупных пор видны двойные пористые оболочки. Как видно на микроснимке, при более сильном увеличении на внутренней поверхности крупных пор присутствуют поры размером 200 нм и менее. 11 Рисунок 6. Электронный микроснимок поверхности частиц карбонизованных образцов при 800°С, масштаб а – 1 : 100, б –1 : 1100, в – 1 : 4000. В качестве цветного маркера для МСХ мы взяли общепризнанные стандарты: 1 – голубой декстран фирмы “Фармация” с молекулярной массой 2 млн. г/моль, 2 – пищевой краситель, имеющий фирменное название “Sunset Yellow” (оранжево-желтый) с молекулярной массой 300 г/моль (рис. 7). На рис. 7 приведен график разделения этих двух молекулярно-ситовых маркеров. Как видно из графика применение нашего сорбента позволило провести разделение маркеров с высоким разрешением. Рисунок 7. Хроматограмма молекулярно-ситовых маркеров: 1 – голубой декстран, 2 – пищевой краситель “Sunset Yellow”. Следующей задачей исследования явилось применение углеродного сорбента для очистки крупного белок-липидного комплекса (БЛК) которым является субклеточная органелла растительной клетки – сферосома. Так как БЛК представляют собой округлые тельца диаметром ~1 мкм, то для ее очистки необходим сорбент с очень крупными порами. Для этих целей годятся агорозные гели “Сефарозы” типов 2В или 4В. Для получения бесклеточного экстракта 6 г сухих семян пшеницы сорта “Стекловидная-24” тщательно растирали в фарфоровой ступке в 0.05 М трис-HCl буфере, рН 7.4. Полученный гомогенат центрифугировали при 10000 × g в течение 10 мин. Затем, полученный бесклеточный экстракт фракционировали на колонке с углеродным сорбентом. Результаты фракционирования представлены на рисунке 8. Как видно из рис. 8, БЛК выходят в первом высокомолекулярном пике. А все вещества с более низкой молекулярной массой выходят во втором пике. Полученные результаты свидетельствуют о полной пригодности данного углеродного сорбента нанопористой структурой для молекулярноситовой хроматографии крупных белок-липидных комплексов, таких как сферосомы. Рисунок 8. Молекулярно-ситовая хроматограмма БЛК из зерна пшеницы на колонке с углеродным сорбентом 12 Определены особенности молекулярно-ситовой хроматографии белок-липидного комплекса на углеродном сорбенте. Полученные результаты говорят о пригодности данного углеродного сорбента нанопористой структурой для молекулярно-ситовой хроматографии крупных белок-липидных комплексов, таких как сферосомы. Микроудобрение «Фитомикрофертилайзер» (ФМФ) Микроудобрение получено методом нанотехнологии из экстракта проростков пшеницы, и имеет сертификат соответствия (КZ.7500317.01.01.16379) и стандарт организации (СТ ТОО 060540013624-022010). По физико-химическим свойствам микроудобрение представляет собой прозрачную жидкость желтовато-зеленого цвета содержащую основное химическое соединение дитерпенового ряда фузикокцин (С38Н58О13), являющееся катализатором синтеза ростовых веществ, а также комплекс микроэлементов, амино - и фенолкислот, что предопределяет разностороннее его влияние на процесс развития сельскохозяйственных культур. Определение структуры микроудобрения и чистоты выделенного фузикокцина осуществлено Институтом биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук. Первые опыты по его применению были заложены на посевах озимой пшеницы сорта «Стекловидная-24» в РГП «Научно-производственный центр земледелия и растениеводства (2006г.). Затем в 2008г. микроудобрение испытано на посевах сахарной свеклы в ПСК «Жер-Ана» Алматинской и озимой ржи в ТОО «Бишкульская птицефабрика» Северо-Казахстанской областей. Установлено, что созревание происходит на 15 дней раньше, а урожайность повышается на 20-30 %. Казахским НИИ защиты и карантина растений при проведении серии лабораторных и полевых опытов по определению физиологической активности микроудобрения «Фитомикрофертилайзера» на яровой пшенице и ячмене установлено, что накопление листо-стебельной массы и корневой системы превысило над контрольными посевами соответственно на 47,2 % и 39,7 %, а прибавка урожая составила 7,3 ц/га. На производственных посевах ТОО «Астана Жаңа Ағысы» в Есильском районе Акмолинской области, где культура земледелия уступает опытным посевам ТОО «НПЦЗХ им. А.И.Бараева», с каждого из 48 га с использованием ФМФ в среднем собрано по 21,6 ц против 15,8 ц/га полученных с посевов произведенных без обработки микроудобрением или производственная эффективность составила почти 30,4%. Преимущества применения микроудобрения - простота технологии, ФМФ целесообразно использовать в баковых смесях при предпосевной обработке семян и протравливании посевов, т.е. не требуются дополнительных затрат; - оптимизация норм высева семян за счет повышения полевой всхожести, развития корневой системы, лучшей перезимовки растений; - гарантированное повышение урожайности на 25-30 %. Влияние на экологию окружающей среды: - восстановление плодородия почв за счет усиления развития корневой системы, активизации микрофлоры почвы (азотфиксируюших и фосфатмобилизующих бактерий, симбиотических грибов и т.д.). - уменьшение заболеваемости растений и повышение их устойчивости к климатическим и солевым стрессам за счет активизации «генов устойчивости»; - уменьшение полегания колосовых зерновых за счет утолщения стенки стебля и снижения норм высева семян. 1. Мансуров З.А. Карбонизованные наноструктурированные материалы // Углеродные наноструктурированные материалы на основе растительного сырья. - 2010.- С. 32-46. 2. Дигель И.Э., Жубанова А.А., и др. Возможности использования наноструктурированных карбонизованныхматериалов для предотвращения септического шока// Углеродные наноструктурированные материалы на основе растительного сырья. - 2010.- С. 223-259. 3. Савицкая И.С., Жубанова А.А., Кистаубаева А.С. Перспективы использования пробиотиков, иммобилизованных на сорбентах с наноструктурированной поверхностью // Углеродные наноструктурированные материалы на основе растительного сырья. - 2010.- С. 260-295. 4. Волков М.Ю. Эффективные формы пробиотиков, иммобилизованных на природных адсорбентах // Пищевые ингредиенты. Сырье и добавки. – 2007. – №1. – С. 48-51. 5. Савицкая И.С. Микроэкологчиеский статус кишечных лактобацилл в норме и при микроэкологических состояниях // Бюллетень Московского общества испытателей природы, отд. Биологический, 2007. – Т. 112. В.1 – С. 96-99. 6. Dunne W.M. Jr. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? Clin. Microbiol. Rev. – 2002. – Vol. 15. - P. 155-156. 7. Чижков В.П.,Бойцов В.Н., Демин А.В. Общая теория разделения и жидкостная экстракция // Журн. физ. химии. 2011. Т.85. № 3. С.565. 13 8. Maнсурова. Р.M. Физико-химические основы синтеза углеродсодержащих композиции // Монография. Алматы, XXI век, 2001. 180 с. 9. Mansurov Z.A., Gilmanov M.K.// Nanostructural Carbon Sorbents for Different Functional Application/ in the book Sorbents: Properties, Materials and Applications, 2009 “Nova Science Publishers, Inc (New York). Editor: Thomas P. Willis. Chapter 7. pp 217-284. 10. Патент РК №20922 от 25.12.2008. Способ повышения урожайности сельскохозяйственных культур // Мансуров З.А., Гильманов М.К., Керимкулова А.Р., Басыгараев Ж.М., Ибрагимова С.А., Гильманов С.М, Бийсембаев М.А., Тулейбаева Ш.А. 11. Гильманов М.К., Дильбарканова Р., Гуккенгеймер Е.Ю., Кульбаева Г.А. Методы очистки и изучения сферосом семян злаковых культур // Статьи методического сборника ИМБиБ Методы молекулярной биологии, биохимии, иммунохимии и биотехнологии.- Алматы, 1999. – С. 98-103. 12. Гильманов М., Фурсов О., Францев А. Методы очистки и изучение ферментов растений. // Наука, 1981. 123 с. 13. Kerimkylova A.R., Sabitov A.N., Gilmanov M.K., Mansurov Z.A. Purification of spherosome by chromatography on nanostructural nanocarbocorb// Вестник КазГУ. Серия биологическая. – 2008. – №1(36). – С. 137-138. 14. Мансуров З.А., Шабанова Т.А., Мансурова Р.М. Морфология микро - нано частиц карбонизированного растительного сырья // Вестник КазНУ. Сер. химическая. - 2004. - № 2 (34). - С. 129-135 15. Mansurov Z.A., Zhylybaeva N.K., Ualieva P.S., Mansurova R.M. Obtaining Procedure and Properties of the sorbents from Plant Raw Material // Chemistry for Sustainable Development, 10 (2002) C. 321-328. 16. Maнсуров З.А., Наноуглеродные материалы, Вестник КазНУ, серия химическая, 2003; 2 (30): С.29-31. М.Х. Шигаева, Т.Д. Мукашева РАЗНООБРАЗИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ И ПРОДУКТОВ ИХ ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТИ (ДГП НИИ «Проблем биологии и биотехнологии» РГП «КазНУ имени аль-Фараби») Освещены достижения в области синэкологического изучения разнообразия микроорганизмов. результаты микробного разнообразия различных типов почв Казахстана. Представлены Биологическое разнообразие относят к числу фундаментальных понятий биологии. Характерной чертой мира живых организмов является огромное разнообразие их жизненных форм. Именно с разнокачественностью живых организмов (структурной, физиологической, генетической, функциональной) связано устойчивое существование жизни как планетарного явления. Отсюда разнообразие органического мира и способы его поддержания на Земле издавна служат предметом изучения всех без исключения биологических дисциплин: ботаники, зоологии, микробиологии, систематики, генетики, экологии, биогеографии, эволюционной биологии и др. Понятие биологическое разнообразие довольно емкое и разные области знания придают ему различное содержание. В самом общем смысле его определяют как меру разнокачественного состава жизни, его видового и таксономического богатства на различных уровнях организации живого жизненных форм, видов, популяций, сообществ, экосистем. На каждом уровне используются свои критерии оценки разнообразия, от стр>тсгурно-типологических до определения числа и соотношения компонентов на надорганизменных уровнях организации [1, 2]. Микроорганизмы играют исключительную роль биоценологических и санитарных функциях почвы, в поддержании жизни растений и животных, обеспечении естественной устойчивости экосистем. Поэтому в центре внимания микробиологов всегда находились вопросы численности, разнообразия и функционирования почвенных микроорганизмов. В последние годы исследования микробного населения почвы проводятся на более высоком уровне - биоценологическом и синэкологическом, позволяющим исследовать таксономическую структуру микробного сообщества, понять механизмы устойчивости и стабильности сообществ. Стабильность же систем непосредственно связана с экологическим разнообразием составляющих их компонентов. Успех в изучении микроорганизмов во многом определяется эффективностью методов исследования. В настоящее время почвенные микробиологи и экологи располагают значительным арсеналом методов от классических, метода посева, прямого микроскопирования до молекулярногенетических [3]. Каждый из этих методов имеет свои достоинства и ограничения. Классический метод посева достаточно информативен, но трудоемок и требует опыта работы в области систематики. Молекулярно - генетические методы обладают высокой пропускной способностью, но не позволяют судить о физиологических особенностях и экологических функциях обнаруживаемых бактерий. Эффективность традиционного (чашечного) метода значительно возросла благодаря использованию отдельных групп микроорганизмов в качестве удобных моделей. Основные исследования выполнены на следующих модельных группах микроорганизмов: дрожжевых грибов, мицелиальных грибов, актиномицетов и анаэробных бактериях. Так, при использовании этих методов установлено, что видовая структура бактерий подзональных подтипов почв равнинной территории Казахстана разнообразна. Во всех типах почв доминировали представители бактерий рода Bacillus, 14 Rhodococcus, и Pseudomonas, Kocuria. В серобурых пустынных почв Казахстана доминировали виды Bас. megaterium, Bac mycoides, Agromyces ramosus, R. baikonurensis. В бурой пустынной, светло и средне каштановых почвах в большом количестве обнаружены виды Bac. megaterium, Bacillus asahii и Rh. erythropolis, в темнокаштановой почве Bас. megaterium и Rh. equi, а в черноземах доминировали виды Rh. erythropolis, R. baikonurensis, Bас. мegaterium, Bacillus circulans,Ps. cepacia и Ps. aeroginosa. Видовой состав актиномицетов, выделенных из почв Казахстана также весьма разнообразен и были выделены актиномицетные комплексы, которые были идентифицированы как представители следующих родов: Actinomadura, Streptomyces, Micromonospora, Nocardiopsis, Chainia, Streptoverticilium. Актиномицеты рода Actinomadura и Streptomyces встречались во всех типах почв Казахстана и доминировали по сравнению с другими родами. Видовое разнообразие актиномадур представлен А. citrea и А. еchinospora, которые являются доминантой группой для среднекаштановой и темно-каштановой, карбонатной почвы. Во всех типах почв выявлены стпретомицеты, и представлены следующими видами: Streptomyces griseoflavus Streptomyces albus, Streptomyces cyaneus и Streptomyces coelicolor. В средне каштановой и темно-каштановой карбонатной почве были обнаружены представители редких форм актиномицетов Nocardiopsis alborubidus. Для образцов черноземной почвы доминантным видом является только Chainia alba.Показано, что актиномицетные комплексы серобурой, пустынной почвы и чернозема обыкновенного представлены родом Micromonospora и встречались виды Micromonospora inositola и Micromonospora olivasterospora. При изучении состава микромицетов серо-бурой пустынной и бурой пустынной почв установлено, что доминирующими являются грибы рода Cladosporium. В данных почвах также встречаются грибы рода Aspergillus. Изучение видового состава микромицетов показало, что род Cladosporium представлен единственным видом Cladosporium herbarum. Изоляты рода Aspergillus идентифицированы как Aspergillus oryzae. Все они были охарактеризованы по ряду морфологических и физиологических признаков. Выявлены видоспецифические особенности микромицетов [4]. Для каждого типа почвы характерна специфика в составе дрожжевой микрофлоры. Показано, что численность и таксономическая структура дрожжевых организмов существенно изменяются в зависимости от типа почвы. Серобурые пустынные и бурые пустынные характеризуются малочисленностью и бедностью видового состава дрожжевых организмов. В светло-каштановых и темно-каштановых почвах доминировали виды Aureobasidium pullulans, Lipomyces Starkeyi и Lipomyces tetrasporus. В черноземе обыкновенном кроме Aureobasidium pullulans, Lipomyces Starkeyi и Lipomyces tetrasporus, также доминировали Cryptococcus albidus, Cr. laurentii и Rhodotorula glutinis. В каштановых и черноземных почвах аскомицентные дрожжи Candida curvata, C.sp.(podzolica) и Cr.terreus являются минорными видами. Во всех без исключения почвах весьма широко представлены виды Aureobasidium pullulans и Lipomyces Starkeyi [5] . Основные результаты использования синэкологических подходов в изучении микробных сообществ почв можно в тезисном виде сформулировать следующим образом: определены основные источники и факторы, определяющие микробное разнообразие; пути миграции микроорганизмов вдоль почвенных ярусов; установить связи между местоположением определенных микроорганизмов с их функциями и стратегиями жизни. Подобные исследования еще немногочисленны, но они показали перспективность использования методов количественной синэкологии в оценке разнообразия микроорганизмов и их сохранения для человечества. Еще в 1990 г. Заварзин Г. А. [5]. поднимал вопрос о необходимости сохранения уникальных природных сообществ. В последние годы в ряде международных конференций вопрос ставился более широко - о необходимости сохранения почв вместе с его живым населением. Звягинцевым Д.Г. с сотр. [6], Добровольской Т.Г. с соавт [3] на большом экспериментальном материале установлено, что сукцессионный подход, учитывающий распределение микроорганизмов в пространстве и времени, наиболее полно выявляет микробное разнообразие. В ходе этих исследований показано, что микробное разнообразие зависит от типа почв (субстрата) и определяется многими экологическими факторами: содержанием органического вещества, влажностью, кислотностью, содержанием солей. Влияние типа субстрата на видовое разнообразие микроорганизмов обнаружено при изучении их распределения в биогеоценозах в ряду: растений-подстилка- почвенные горизонты. На примере коринеподобных бактерий установлено, что максимальное разнообразие бактерий наблюдается в подстилке, где идет интенсивное накопление и разложение растительного материала. С дернового горизонта почвы видовое разнообразие уменьшается вплоть до минимума в самых нижних почвенных горизонтах. 15 Применение различных молекулярно-биологических методов в микробиологии дало возможность более глубокого изучения микробных сообществ. Например, метод реассоциации связан с определением скорости реассоциации ДНК, экстрагированной из почвы. Процесс реассоциации выделенной и расплавленной ДНК исследуют спектрофотометрически, используя геном Escherichia coli в качестве этанола. По мнению исследователей, константа реаасосиации является идеальной количественной характеристикой, выражающей количество пар оснований в негомологичной ДНК. Она эквивалентна размеру генома в целом и может быть использована для характеристики разнообразия бактериальных сообществ, а также происходящих в них изменений, связанных с различными воздействиями – природными и антропогенными. Получить количественную информацию о метаболически активных или численно доминирующих популяций в почве можно используя метод гибридизации с олигонуклеотидными маркерами in situ, меченными флуоресцентными красителями. Метод основанный на выделении экстрактов ДНК из почвы при помощи дифференциального центрифугирования в градиенте СsCl позволяет в дальнейшем провести более детально исследование молекулярными методами – гибридизация, фингерпринт и т.д. Большинство работ по оценке биоразнообразия почв и изучению филогенетических взаимоотношений внутри сообществ микроорганизмов базируются на исследованиях нуклеиновых кислот при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с соответствующими филогенетическими маркерами (16S рРНК, 18S рРНК и др.) [7, 8]. Определение микробного разнообразия почв при помощи молекулярно-генетических методов проводится давно. Так, Ueda T., et. al. при изучении почвы под посевами сои констатировал наличие крупных групп: грамположительные бактерии с высоким содержанием Г+Ц, зеленые серные бактерии, протеобактерии, креноархеи и клоны, которые не попадают ни в один из известных основных филотипов домена Bacteria, представленных в виде филогенетического древа /8/. Широкое использование молекулярно-генетических методов приводят к описанию новых видов микроорганизмов. Так, при анализе атлантической лесной экосистемы (Бразилия) было описано, что преобладающими группами являются Acidobacteria (63%), далее следуют Proteobacteria (25,2%), Gemmatimonadetes (1,6%), Actinobacteria (1,2%), Bacteroidetes (1%), Chloroflexi (0,66%), Nitrospira (0,4%), Planctomycetes (0,4%) и Firmicutes (0,26%). 48 последовательностей (6,5%) представлены неизвестными бактериями /9/. Статистический анализ показал, что бактериальное разнообразие находится под влиянием таких факторов, как высота, соотношение Ca2 + / Mg2 +, содержание Al3 + и фосфора. 1Чернов И.Ю. Биологическое разнообразие: сущность и проблемы //Успехи совр. биологии. 1991, т.З, вып. 4. С 499507. 2Розанов С.К. Показатели разнообразия в оценке сущессионного состояния экосистем. //Успехи совр. биол. 1999, т. 119, №4. С. 404 -410 3Добровольская Т.Г., Лысак Л.В., Зенова Г.М., Звягинцев Д.Г. Бактериальное разнообразие почв: оценка методов, возможностей, перспектив. //Микробиология, 2001, N92. С. 149-167 4 Сыдыкбекова Р.К., Бержанова Р.Ж., Мукашеав Т.Д., Шигаева М.Х. Численность бактерий в подзональных почвах равнинной территории Казахстана //Вестник КазНУ, серия экологическая 2011 № 4. - С. 14 – 17. 5Заварзин Г.А., Жилина Г.Н., Клевбрин В.В. Алкалофильное сообщество и его функциональное разнообразие. //Микробиология, 1999, т. 68. С. 579-5995 6 Звягинцев Д.Г., Бабьева И.Н., ЗеноваГ.М., Полянская J1.M. Разнообразие грибов и актиномицетов и их экологические функции.//Почвоведение, 1996, №6. С. 705-713 7 Kirk J. L., Beaudette L.A, Hart M., Moutoglis P., Klironomos J. N., Lee H., Trevors J. T. Methods of studying soil microbial diversity//Journal of Microbiological Methods. – 2004. - № 58. – Р.69–188. 8 Ueda T., Suga Y., Matsuguchi T. Molecular phylogenetic analysis of a soil microbial community in a soybean field // Eur. J. Soil. Sci. - 1995. - V.46. - P.415 – 421. 9 Faoro H., Alves A. C., Souza E. M., Rigo L. U., Cruz L. M., Al-Janabi S. M., Monteiro R. A., Baura V. A., Pedrosa F. O. Influence of soil characteristics on the diversity of bacteria in the Southern Brazilian Atlantic forest // Applied and Environmental Microbiology. – 2010. - Vol. 76, № 14. - Р. 4744-4749. К.Х .Алмагамбетов, Н.Б. Молдагулова, С.С. Ануарбекова, З.С.Сармурзина КОЛЛЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ, ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И РАЗВИТИЕ (Республиканская коллекция микроорганизмов, e-mail: rcmkz@list.ru) В настоящей работе представлены сведения о коллекции промышленных микроорганизмов, касающиеся таксономии, численности, технологий хранения и генотипирования культур. Столь же актуальны вопросы оценки интеллектуального потенциала промышленных штаммов, развития коллекций тест-культур. Микробиология является важной составляющей биологической науки, относится к фундаментальным дисциплинам высшей школы, как в университетах биологического профиля, так и в 16 медицинских вузах. Никто не сомневается в том, что достижения и перспективы развития биологических технологий в самых разных сферах человеческой деятельности основаны на использовании микроорганизмов, наряду с объектами животного и растительного происхождения. История развития микробиологии в нашей республике подобна вчерашним общесоюзным и сегодняшним мировым тенденциям ее развития. Начиналась она с микробиологии почвы и воды, с сельскохозяйственной микробиологии, далее самостоятельное развитие получили медицинская и санитарная микробиология, затем и промышленная микробиология. Со второй половины прошедшего столетия берет начало развитие микробиологической промышленности, производство биопрепаратов на основе микробиологического синтеза и процессов брожения, а с конца ее – развиваются технологии получения при помощи генно-модифицированных микроорганизмов рекомбинантных белков, в том числе медицински значимых гормонов и цитокинов. Развитие микробиологии в Казахстане связано с научной и педагогической деятельностью ученых-микробиологов, открывавших соответствующие научные институты и кафедры при вузах, создавших научные школы, являющихся авторами монографий, учебников и учебных пособий по микробиологии, а также крупных внедрений практических разработок в производство. Это Макиров К.А., Шамес Д.Л., Жуматов Х.Ж., Чулаков Ш.А., Иллялетдинов А.Н., Шигаева М.Х., Ахматуллина Н.Б., Никитина Е.Т., Тулемисова К.А., Жубанова А.А., медицинские микробиологи - Котова А.Л., Снопкова В.А, Сарбасова Ш.И. и др. Среди научных организаций и вузов республики больший вклад в развитие микробиологии внесли коллективы Института микробиологии и вирусологии (ИМиВ) и кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии КазНУ им. аль-Фараби. В лабораториях этих организаций начиналось интенсивное развитие фундаментальных и прикладных исследований; они и сегодня остаются в Казахстане признанными флагманами научных исследований и разработок в области микробиологии. Каковы сегодняшние направления научных исследований и разработок в области микробиологии? Анализ тематик грантов, выигравших конкурс Комитета науки МОН РК на 2012 -2014 годы по направлениям «Науки о жизни», «Интеллектуальный потенциал...», «Глубокая переработка...» и «Энергетика...» показало следующее. По направлению «Науки о жизни» тематика 14 грантовых исследований связана с разработкой микробных биопрепартов. Это пробиотики, заквасочные культуры, кормовые добавки, биоинсектициды, биоудобрения и нефтедеструкторы. По направлению «Интеллектуальный потенциал» - 11 грантов, в том числе 2 по разработке биопрепаратов для ростостимуляции и борьбы с фитопатогенами сельскохозяйственных растений, 1 по селекции энтомопатогенных микроорганизмов, 2 по исследованию гетеротрофных бактерий реки Есиль, 2 по селекции микроорганизмов-нефтедеструкторов и 4 гранта по сохранению и развитию коллекций промышленных микроорганизмов. По направлению «Глубокая переработка.» 5 грантов, в том числе по разработке пробиотиков для птицеводства, получению пробиотических продуктов на основе верблюжьего молока, по биконсервантам на основе бактериоцинпродуцирующих лактобацилл и 1 по биовыщелачиванию урана. По направлению «Энергетика» - 1 грант по разработке технологий получения биодизельного топлива на основе микроводорослей, 1 грант нацелен на получение рекомбинатных микроорганизмов, эффективно экспрессирующих целлюлазы (табл.1). Таблица 1. Количество «микробных» грантов в рамках приоритетных направлений развития науки на 2012-2014 гг. Темы грантов Биопрепараты: Пробиотики Корм. добавки Нефтедеструкторы Биоудобрения Закваски Биоинсектициды Биоконсерванты Диагнс. препараты Сохран. и развитие коллекций Науки о жизни Интеллектуальн. потенциал 4 1 1 3 1 2 - 1 1 4 Глубокая переработка 1 1 1 1 - Формально по названию тематик грантов можно говорить о классике, в какой-то мере об устоявшихся направлениях научных разработок по биопрепаратам. Но при оценке содержания грантов 17 однозначно то, что запланированные исследования отличаются от прошлых по таксономическим группам микроорганизмов (родам, видам и штаммам), используемым в качестве объекта научных исследований и разработок. Более важно то, что в научных исследованиях и разработках все шире используются современные, а именно молекулярно-биологические и генетические методы и технологии. Вместе с тем очень мало грантов по энзимологии микроорганизмов. Определение ферментативной активности, выделение, очистка и стабилизация фермента очень важны при оценке качества штаммов. Как пример можно привести всего лишь один грант - "Разработка научных основ применения микробных липаз для очистки сточных вод предприятий пищевой промышленности и бытовых стоков» (ИМиВ). Отсутствуют грантовые исследования по мутагенезу и селекции промышленных штаммов, получению штаммов-сверхпродуцентов. В 1970-80 годы штаммы-сверхпродуценты антибиотиков, ферментов, аминокислот, витаминов и других биологически активных соединений были получены именно этими методами. Не менее актуальна проблема разработки генно-модифицированных микроорганизмов, продуцирующих рекомбинантные белки, биологически активные низкомолекулярные пептиды. Особенно остро они востребованы в медицинской практике. Это инсулин, интерлейкины, интерфероны, ростовые факторы и др. Можно привести в качестве примера лишь два гранта, нацеленных на получение рекомбинантных белков, используемых в диагностической практике и в переработке растительного сырья. Соответственно, это гранты «Получение рекомбинантных полимераз, востребованных в научных исследованиях и диагностической практике» (НЦБ) и «Создание рекомбинантных штаммов микроорганизмов, эффективно экспрессирующие гены целлюлаз для получения биотоплива из целлюлозосодержащего сырья» (КазНУ). Такова картина грантовых исследований, связанных с использованием в качестве биообъекта микроорганизмов. Микробиологические ресурсы, это, прежде всего, промышленные мироорганизмы, используемые в разных отраслях производства (в растениеводстве, в производстве и переработке пищевой продукции, в животноводстве в качестве кормовых добавок, в медицине, ветеринарии и защите окружающей среды). Это консорциумы микроорганизмов, используемых в качестве заквасок, пробиотиков, биоудобрений, биоинсектицидов и др. Это микроорганизмы - сверхпродуценты антибиотиков, ферментов, витаминов, аминокислот и других биологически активных соединений. Данная группа микроорганизмов получена именно методами селекции и мутагенеза, особенно интенсивно использовавшихся во второй половине прошедшего столетия. Это генномодифицированные микроорганизмы, продуцирующие рекомбинантные белки. Микробиологические ресурсы общепринято связывать с коллекционными культурами промышленных микроорганизмов, находящимися на хранении в чистом виде и жизнеспособном состоянии, с сохранением целевой биологической активности. Культуры хранятся современными технологиями лиофилизации и криоконсервации, а также классическими методами субкультивирования. В коллекциях в плановом порядке проверяется жизнеспособность и аутентичность культур, используя с этой целью микробиологический, достаточно трудоемкий метод посевов и пересевов. Проводится подсчет количества жизнеспособных клеток трудоемким методом серийных разведений, наряду со спектрофотометрическим измерением оптической плотности суточных культур при определенной длине волны и многие другие виды коллекционных работ. На предмет сохранности культур в коллекциях научных организаций были проанализированы в сравнительном аспекте два Каталога микроорганизмов. Первый был издан в 2003 году и включает перечень микроорганизмов, хранившихся в то время в 7 организациях (ИМиВ, Институт фармбиотехнологии, КазНИИ пищевой промышленности, НИИ плодоводства и виноградарства, КазНИВИ, Алматинский биокомбинат и НИСХИ). Второй Каталог издан в 2010 году и составлен только по коллекции ИМиВ. Каталог 2003 года состоит из 665 культур, в том числе бактерий – 285, включая 74 культуры актиномицет, мицелиальных грибов – 280 и дрожжей – 76. Среди бактерий, хранящихся в коллекциях доминируют бациллы (Bacillus thuringiensis и B.subtilis)- 47 культур и лактобациллы (Lactobacillus spp.) - 55 культур. Из 665 культур 230 относятся к патогенам растений и животных (коллекции НИСХИ и КазНИВИ), 110 культур насчитывала в то время коллекция ИМиВ. Каталог коллекции ИМиВ, составленный в 2010 году включает 357 культур, в том числе актиномицет 212 штаммов, бактерий 79, дрожжей 39 и мицелиальных грибов 28. 18 Сопоставлении коллекционных культур, хранящихся в ИМиВ по Каталогам 2003 и 2010 гг. Показало следующее. Так, присутствующие в Каталоге 2003 года 17 культур актиномицет, выделенных профессором Чормоновой Н.Т. в Каталоге 2010 года отсутствуют. Культуры актиномицет, принадлежащие к родам Actinomadura, Amycolata и Nocardia, присутствующие в Каталоге 2003 года также отсутствуют в Каталоге 2010 года. Из 8 культур, заложенных на хранение в свое время профессором Никитиной Е.Т. (Катлог 2003 г.) остались только 2 (Каталог 2010 г.). Отрадно, что штамм Streptomyces griseoruber (продуцент антрациклиновых антибиотиков, а также стимулятор роста растений), выделенный в свое время М.Х.Шигаевой и К.А.Тулемисовой сохранился по сей день, он есть в списках Каталогов 2003 и 2010 годов. Но вместе с тем, Каталог изданный в 2010 году показывает, что коллекция ИМВ пополнилась большим количеством стрептомицет, продуцентов витаминов группы В и антибиотика целикомицина (авторы Балицкая А.К. и Сартбаева У.А.). Число дрожжевых культур увеличилось с 17 до 39 культур, они в основном представлены сакшаромицетами и кандидами. Мицелиальных грибов в 2003 году было 4 культуры, а в 2010 в ИМиВ их уже 28. К сожалению, ни в Каталоге 2003 года, ни в Каталоге 2010 года нет сведений о числе коллекционных культур, защищенных патентами. В музее коллекционных культур Республиканской коллекции микроорганизмов (далее РКМ) в настоящее время 414 культур (табл.2), хранящиеся теми или иными альтернативными способами, часть коллекционных микроорганизмов генотипирована (табл.3). Таблица 2. Перечень коллекционных культур РКМ Микроорганизмы Молочнокислые бактерии Бациллы Актиномицеты Иные таксономические группы бактерий Мицелиальные грибы Дрожжи Микроводоросли Всего Таблица 3. Количество генотипированных Микроорганизмы Молочнокислые бактерий Бациллы Актиномицеты Иные группы бактерий Мицелиальные грибы Дрожжи Микроводоросли Всего культур, находящихся Количество культур 107 81 17 57 79 40 33 414 на хранении в РКМ, в том Субкультивирование 63 Лиофилизация 35 Криоконсервация 79 Генотипирование 41 11 7 30 79 40 33 263 14 32 11 92 66 10 25 79 33 332 21 15 11 19 107 числе Наряду с количественными характеристиками более важны качественные показатели. В РКМ очень малое число защищенных патентами коллекционных культур, малый процент генотипирования штаммов, недостаточен охват коллекционных культур технологией лиофилизации. Очень важно наличие сведения о культурах, используемых в биопроизводстве. Эти сведения позволили бы говорить о конечных результатах работы по селекции промышленных микроорганизмов, в том числе по коллекционной работы. В 1970 - 80-е годы в г.Степногорске была развитая биотехнологическая промышленность союзного значения. В промышленной зоне города было налажено крупнотоннажное микробиологическое производство кормовой аминокислоты – лизина, антибиотиков для животноводства – менонзина и тилозина, средств защиты растений – бактоларвицида, лепидоцида и 19 других биопрепаратов. С распадом Союза крупнотоннажное микробиологическое производство в г.Степногорске прекратило свое существование. Примерно такая же участь постигла и второе по масштабам микробиологическое производство Казахстана того времени - Алматинский биокомбинат. В настоящее время имеет место малое биопроизводство, на уровне опытно-промышленных объемов. Это выпуск биоудобрений, заквасок, пробиотиков и других биопрепаратов, выпускаемых малыми партиями. Промышленная микробиология, биотех-нология микророганизмов пока остается на обочине индустриально-инновационного развития государства. Охраноспособность коллекционных культур и их реальное использование в биопроизводстве актуальны с позиции их нематериальной, интеллектуальной ценности. Коллекционные штаммы микроорганизмов, продуцирующие те или иные биологические активные вещества являются результатом многолетней работы как отдельных ученых, так и целых коллективов. Многие годы с затратой бюджетных средств чистые культуры этих микроорганизмов хранятся в жизнеспособном состоянии, проводятся работы по поддержанию их изначальной биологической активности. Само собой разумеется, можно оценить материальные затраты на поддержание коллекционых культур, но более важно учесть нематериальные активы, вложенный в них интеллектуальный труд ученых. Есть Постановление Правительства Республики Казахстан от 2002 года по оценке интеллектуальной собственности. В отношении микроорганизмов – это патентование штамма и оценка стоимости патента через лицензированных оценщиков интеллектуальной собственности, т.е. оценка через охранный документ – патент. Путем оценки патентов можно пополнить уставной капитал предприятия, амортизировать их в качестве нематериальных активов. Но подавляющее большинство коллекционных культур не имеет патентной поддержки, можно ли на этой основе говорить об отсутствии интеллектуальной компоненты, об отсутствии нематериальных активов в коллекциях промышленных микроорганизмов. Наверное нельзя. Сейчас функционируют инновационные патенты, требующие от патентуемого штамма только локальную новизну и полезные свойства. Можно ли путем получения инновационных патентов увеличить число защищенных охранными документами коллекционных культур. Насколько прочную правовую основу дадут инновационные патенты при оценке нематериальных активов, интеллектуальной ценности коллекций культур промышленных микроорганизмов. О тест-культурах и референс-штаммах. Это достаточно специфическое направление работы коллекций микроорганизмов. Тест-микроорганизмы, необходимы для микробиологического контроля лекарственных средств, для оценки чувствительности к антибиотикам, определения антагонизма, мутагенности, других контрольно- аналитических работ, а также для научных исследований и для образовательного процесса. К примеру, для микробиологического контроля лекарственных средств можно использовать только культуры из коллекции ATCC, а при оценке антагонизма, антибиотикочувствительности достаточны референс-штаммы. Вместе с тем, недостаточно целенаправлены работы по формированию коллекций тест-культур, необходимых для обеспечения ими потребностей научных организаций и производств, нет развития их сервисной востребованности. *** Өндірістік микроорганизмдер коллекцияларының таксономиялары, саны, сақтау технологиялары мен генотиптелуі түралы мəліметтер келтірілген.Өндірістік штамдардың интеллектуалды потенциалын бағалау, тест-дақылдар коллекциясын дамытудың ақ манызы қарастырылған. *** The article provides information about the collections of industrial microorganisms on the taxonomy, population, technology of storage and genotyping of cultures. Evaluation questions of the intellectual potential of industrial strains and collections of test cultures are equally relevant. МИКРОБИОЛОГИЯ Г.Ж. Абдиева, А.М. Имадиева, Г.Қ. Қайырманова, А.А. Жұбанова, Н.Ш. Акимбеков АҒЫН СУДАН БӨЛІНІП АЛЫНҒАН ДЕСТРУКТИВТІ БЕЛСЕНДІ ГЕТЕРОТРОФТЫ МИКРООРГАНИЗМДЕРДІ ИДЕНТИФИКАЦИЯЛАУ ЖƏНЕ ИММОБИЛИЗДЕУ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті, e-mail: aia_beautiful_soul@mail.ru) Экологиялық биотехнологияның маңызды мəселелерінің бірі судың қорын сақтау, су қоймаларының əртүрлі ластағыштармен ластануының алдын алу жəне ағынды суларды тазарту болып табылады. Қазақстанның барлық территориясында қазіргі таңда көптеген тұрғылықты жерлермен 20 өндіріс орындарының ағынды сулары табиғи жəне жасанды су қоймаларды ластауы бірден - бір кең таралған өзекті мəселе болып отыр. Ағынды сулардың құрамы орналасу орнына, шығу тегіне жəне ластану көзіне байланысты əртүрлі. Қоршаған ортаның ластанған объектілерін тазарту мен биоремедиациялауда деструктивті активті микроорганизм штамдарының маңызы зор. Ағын сулардың құрамындағы ластағыш органикалық заттарды тазарту мақсатында микроорганизм - деструктор қауымдастықтары пайдаланылады. Ағын сулардың ластануы бүгінгі таңда өзекті мəселе болып отыр [1]. Жұмыстың мақсаты ағынды судан бөлініп алынған гетеротрофты микроорганизмдерді идентификациялау жəне түрлі тасушыларға иммобилизденген клеткаларын пайдалану мүмкіндігін зерттеу. Əдістер мен материалдар Зерттеу обьектілер ретінде Астана қаласының тазалау құрылғыларының ағынды суынан бөлініп алынған Б1 жəне Т1 гетеротрофты бактерия штамдары алынды. Ағынды судан бөлініп алынған гетеротрофты бактерияларды идентификациялау дəстүрлі микробиологиялық əдістері арқылы морфолого-культуралдық, физиология-биохимиялық қасиеттері зерттелінді [2;3]. Гетеротрофты бактериялардың генетикалық идентификациясы 16S pPHK 8-806 гендерінің фрагменттерін секвенирлеу негізінде жүргізілді. Нуклеотидтердің тізбектерін білгілі ретпен орналасуы “BigDye Terminanor v 3.1 Cycle sequencing Kit жиынтығы қолданылып Сэнгер əдісімен анықталды. Нəтижелер мен талқылау Зерттеу нəтижесінде Астана қаласының тазалау құрылғыларының ағынды суынан бөлініп алынған Б1 штамының морфологиялық қасиеттері бойынша жеке-жеке орналасқан қысқа таяқша пішінді грамм оң бактериялар, ал Т1 штамы дара, ұзын, грамм оң таяқшалар, екі дақыл да спора жəне капсула түзетін, қозғалысқа қабілетті бактериялар екендігі анықталды (сурет 1). Қатты қоректік орталарда Б1 штамы ақ-сұр, жылтыр, дұрыс формалы, дөңгелек, диаметрі 1-2 мм, аралығында колониялар түзді. ЕПС қоректік орта лайланып, бетіне қаймақ түзіп өседі, ал Т1 штамы пішін дұрыс формалы, шеті иректелген, жылтыр емес, күнгірт, беті кедір-бүдір, көлемі 2-3 мм болатын колониялар. А Б Сурет1. Б1 жəне Т1 штамдарының морфологиясы: А) Б1 штамы; Б) T1 штамы Гетеротрофты бактериялар физиология-биохимиялық қасиеттерін зерттеуде олардың етпептонды желатинді ортада жəне сүтте өсуі, көмірсулар жəне спирттерді ыдырату қабілеттілігі, каталаздық белсенділігі жəне температураның əртүрлі мəнінде (300С, 370С, 480С) өсу ерекшеліктері ескерілді. Штамдардың физиология-биохимиялық қасиеттерін зерттеу нəтижесінде Б1 жəне Т1 штамдарының каталаза оң, протеолитикалық белсенділікке ие, сүтте өсуі жоқ, температураның 300Сқарқынды, 370С -əлсіз, 48 0С өсуге төзімсіздігі анықталды. Б1 штамы көмірсулар мен спирттерден глюкоза, сахароза, галактоза, крахмал, сорбит, маннитті белсенді жəне орташа ыдыратқаны анықталды. Астана қаласының тазалау құрылғыларының ағынды суынан бөлініп алынған гетеротрофты бактериялардың морфология-культуралдық, физиология-биохимиялық қасиеттері зерттелініп, генетикалық идентификация жасалынып түрге дейін жіктелінді. Б1 штамы Bacillus subtilis жəне Т1 штамы Bacillus cereus өкілдері екендігі анықталды. Гетеротрофты бактериялардың генетикалық идентификациясы бактерия клеткасының ДНҚ-сын секвинерлеу арқылы жүргізілді. Нуклеотидтердің тізбектерін белгілі ретпен орналасуы Сэнгер əдісімен анықталды. Идентификация үшін алынған нуклеотидтердің тізбегін дүниежүзілік геннің тізбегімен салыстырғанда Б1 штамының гені Bacillus subtilis Т1 штамының гені Bacillus cereus, өкілдерінің геніне сəйкес келгені анықталды. 21 М Б1 Т1 М -К Б1 Т1 +К 10000 3000 1000 500 100 Сурет 2. Агарозды гельде жасалған электрофорез үлгісі Б1 штамының генетикалық идентификациясы: Б1 Bacillus subtilis AATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGG TGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACC GGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGA CCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCT GAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA GGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCG GATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGT ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCG TTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCC GGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATT CCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGG TCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGA. Acces Description Max Total Query E Max sion score score coverage value ident JF738126.1 Bacillus subtilis strain B20-B 16S 1376 1376 100% 0.0 100% ribosomal RNA gene, partial sequence HQ640429.1 Bacillus subtilis strain wheat bran-1 1376 100% 0.0 100% 1376 16S ribosomal RNA gene, partial sequence HQ219927.1 Bacillus subtilis strain ATY8 16S 1376 100% 0.0 100% 1376 ribosomal RNA gene, partial sequence Т1 штамының генетикалық идентификациясы: Т1_ Bacillus cereus TAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCC ATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTT CGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTG AGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGA CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAA GAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGC GCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGA AACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA GATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAA GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT. Accession Description Max Total Query E Max score score coverage value ident JF750734.1 Bacillus cereus strain EBT1 16S 1343 1343 100% 0.0 100% ribosomal RNA gene, partial sequence JF706262.1 Bacillus cereus strain BCC01 16S 1343 1343 100% 0.0 100% 22 ribosomal RNA gene, partial sequence JF496498.1 Bacillus cereus strain WA6-16 16S ribosomal RNA gene, partial sequence 1343 1343 100% 0.0 100% Адсорбцияланған клеткалар % Экологиялық биотехнологияда қоршаған орта объектілерін əртүрлі ластағыштардан тазартуда микроорганизмдердің бос жəне иммобилизденген клеткалары негізіндегі биокатализаторлар кеңінен қолданылады. Иммобилизденген клеткаларды алуда клеткалардың адсобциялық белсенділігі, тасушының табиғаты мен құрлысы, тасушыға бекінген клетканың десорбциялану көрсеткіші ескеріледі [4]. Жұмыста Bacillus subtilis-Б1 жəне Bacillus cereus-Т1 штамдарының пенополиуретанға (ППУ), полипропиленді талшыққа (ППТ) жəне цеолитке иммобилиздену динамикасы зерттелінді (сурет 3;4). Bacillus subtilis-Б1 штамының ППУ, ППТ жəне цеолитке адсорбциялану белсенділігі анықталынды (сурет 3). Зерттеу нəтижесінде Bacillus subtilis-Б1 штамының ППУ, ППТ тасушыларына иммобилизденуі алғашқы сағаттарынан бастап, қарқынды жүрген. Bacillus subtilis-Б1 ППУ сорбциялану 1-ші сағатта 54,5% клеткалар иммобилизденіп, 24 сағатта сорбцияланған клеткалардың саны 65%–ға жеткен (сурет 3). 80 70 60 50 40 30 20 10 0 ППУ ППТ Цеолит 0 1 3 5 7 24 Уақыт,сағат Сурет 3. Б1 штамының əр түрлі тасушыларға иммобилизденуі Ал ППТ-ға алғашқы кезеңінде 45%, 24 сағатта 60% клеткалар сорбцияланған. Bacillus subtilis-Б1 цеолитке иммобилизденуі ППУ, ППТ сорбенттерге қарағанда төмен деңгейде болды. Bacillus subtilis-Б1 штамы иммобилизденудің 5 сағатында сорбцияланған клеткалардың саны 10% болып, 24 сағатқа 40% жеткен. тасушының жоғары болғанын, ал цеолитке иммобилиздену динамикасы төмен болғаны анықталды. Сурет 4. Bacillus cereus-Т1 штамының əртүрлі тасушыларға иммобилизденуі Bacillus cereus-Т1 штамының ППУ, ППТ жəне цеолитке қарағанда белсенді жүрген. ППУ –ға 1ші сағ. 22%, 24 сағатта 40% Bacillus cereus-Т1 штамының клеткалары сорбцияланса, ППТ тасушыларына 1-ші сағ. 2%, 24 сағатта 35% иммобилизденсе, цеолитке 5- ші сағатта 32%, 24 сағатта 24 % иммобилизденген. Алынған нəтижелер Bacillus cereus-Т1 штамының адсорбциялану белсенділігінің төмендігін көрсетті (сурет 3). 23 Сонымен, гетеротрофты бактерияларды иммобилиздегенде Bacillus subtilis-Б1 штамы жəне Bacillus cereus-Т1 штамдары пенополиуретанға жəне полипропиленді талшықта иммобилизденудің жоғары динамикасын көрсетті, ал цеолитте иммобилизденудің динамикасы төмен болды. Ағынды судан бөлініп алынған гетеротрофты Bacillus subtilis-Б1 жəне Bacillus cereus-Т1 штамдарын əртүрлі органикалық заттармен ластанған қоршаған орта объектілерін тазартуда тиімді иммобилизденген деструктивті белсенді микроорганизмдер негізіндегі биокатализаторлар ретінде қолдануға болады. 1.Научно- популярный и образовательный журнал. Экология и жизнь. 1(92) ’2010 2.Практикум по микробиологии: Учеб: пособие для студ.высш. учеб.заведений./А. И. Нетрусов, М.А Егорова, Л.М Захарчук и др.; Под.ред А.И Нетрусова.- М.: Издательский центр «Академия», 2005.-608 с. 3.Практикум по микробиологии. Под ред. Н.С Егорова. Учебное пособие. М.: Изд-во Моск.ун-та, 1976.307 с 4. Синицина А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Издво Мгу, 1994.288 с *** В работе идентифицированы гетеротрофные бактерии-деструкторы различных органических загрязнителей, выделенные из городских очистных сооружений. Изучены сорбционная активность бактерии-деструкторы на различные носителей. *** In this research work has been identified heterotrophic destructive bacteria of organic pollutants isolated from wastewater treatment facilities and studied their sorption activity on various types of sorbents. ОƏК: 633.16:631.461.61:630*443 Р.С. Айдаркулова, А.П. Науанова, М.Б. Айтенова ФУНГИЦИДТІ ҚАСИЕТКЕ ИЕ СHAETOMIUM ТУЫСЫНА ЖАТАТЫН САҢЫРАУҚҰЛАҚ ШТАМДАРЫН АРПАНЫҢ ТАМЫР ШІРІГІ АУРУЫНА ҚАРСЫ ҚОЛДАНУ (С.Сейфуллин атындағы Қазақ агротехникалық университеті) Бұл мақалада зертханалық жəне танаптық жағдайларда арпа өсімдігінің тамыр шірігі ауруын қоздыратын Fusarium жəне Bipolaris фитопатогендеріне қарсы Chaetomium туысына жататын целлюлозаны ыдыратушы саңырауқұлақтардың фунгицидтік қасиеті зерттелді. Зерттеу жұмыстарының нəтижесінде Chaetomium туысы саңырауқұлақтарының антагонистік белсенділігі туралы зертханалық жағдайда алынған мəліметтер танаптық жағдайдағы тəжірибелермен дəлелденді. Өткен ғасырдың 70 - ші жылдарының басында академик А.И. Бараев ұсынған егіншіліктің топырақ қорғау жүйесінде топырақты аудармай аңыз қалдырып өңдеу тəсілі Қазақстан мен Батыс Сібірдің далалы аймағында кең қолданысқа ие болды. Топырақты аудармай өңдеу тəсілі қысқы жауын – шашынды жинау арқылы құрғақшылықты жеңуге, топырақты дефляция мен су эрозиясынан қорғаудың мəселелерін шешуге көмектескенмен, егістіктің арам шөптермен ластануына əкеп соқтырады [1]. Топырақтың жоғарғы қабатында өсімдік қалдықтарын қалдыру ауыл шаруашылық дақылдарының ауруларын тудыратын патогенді микроағзалардың жиналуына ықпал етеді [2]. Топырақ құнарлылығын сақтау жəне арттыру тек өсімдік қалдықтарын шірітіп, қарашірікке айналдыру ғана емес, сонымен қатар өсімдіктерді фитопатогендерден қорғау ауру тудырушы инфекцияның жалпы потенциалын төмендетіп, сол арқылы химиялық пестицидтердің қолданылу мөлшерін азайтатын экологиязациялаумен тығыз байланысты. Топырақ патогендері, əсіресе тамыр шірігі ауруын қоздырушылар топырақтың құнарлығына тікелей əсер етеді [3]. Дəнді дақылдардың саңырауқұлақ ауруларымен күресуде антагонист-саңырауқұлақтарды пайдаланудың болашағы зор. Олар өсімдіктердің аурумен зақымдануын төмендетіп, өсуі мен дамуын ынталандырып, өнімділікті арттырады жəне қоршаған ортаны ластамайды [4]. Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақтар – целлюлозаны ыдыратушы нағыз сапрофиттер. Олардың кейбір түрлері фунгицидтік қасиеттерге ие, сонымен қатар топырақтың қара шірік қабатын жақсартатын жəне оның құнарлығын арттыратын, көптеген өсімдіктерге өсуді ынталандыру белсенділігі бар антибиотиктер мен басқа да метаболиттерді бөлуге негізделген [5]. Қазіргі таңда өсімдіктердің потенциалды өнімділігін жəне бейімделушілік қасиеттерін жүзеге асыруды қамтамасыз ететін, өсімдік қалдықтарын белсенді шірітетін, фитопатогенді ауру қоздырғыштарының дамуын тежейтін немесе шектейтін полифункционалды микроағзалар штамдарын іздеу мен іс жүзінде қолдану ауыл шаруашылығы ғылымдарының саласындағы негізгі міндеттерінің бірі. Топырақтағы целлюлозаны ыдыратушы микроағзалардың қызметін өсімдіктердің табиғи көмекшілері ретінде пайдаланудың маңызы зор. Осыған орай Солтүстік Қазақстанның оңтүстік 24 карбонатты қара топырағынан бөлініп алынған Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақ штамдарының целлюлазалық жəне антагонистік белсенділік танытуы экологиялық егіншіліктің өзекті мəселелерін шешуде қолдануға болатындығын айқындайды. Ғылыми зерттеу жұмысының мақсаты Chaetomium туысына жататын целлюлозаны ыдыратушы саңырауқұлақ штамдарының зертханалық жəне танаптық жағдайларда арпаның тамыр шірігі ауруының қоздырғыштарына қарсы антагонистік белсенділігін анықтау. Зерттеу əдістері Тəжірибелер 2009 жылы зертханалық жəне танаптық жағдайларда С. Сейфуллин атындағы Қазақ агротехникалық университетінің микробиология зертханасында мен Ақмола облысы, Целиноград ауданына қарасты, Қосшы ауылындағы «Нива» шаруа қожалығында жүргізілді. Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақ штамдарын бөліп алуға арналған топырақ үлгілері А.И.Бараев атындағы Қазақ астық шаруашылығы ғылыми зерттеу институтынан əкелінді. Н.А.Красильниковтың [6] сериялық сұйылту əдісі арқылы дайындалған топырақ суспензиялары целлюлоза көзі қосылған Гетчинсон – Клейтонның қатты қоректік ортасына себілді. Chаetomium туысына жататын саңырауқұлақтың 8 штамы бөлініп алынды. Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақ штамдарын идентификациялау Т.С.Кириленко [7] мен Н.П.Черепанованың [8] анықтағыштары қолданылды. Chаetomium туысына жататын саңырауқұлақтардың негізгі ауру қоздырғыштарға антагонистік қасиеті Н.А.Красильниковтың [6] ұсынған агарлы блок əдісімен зерттелді. Өсу жəне қарым-қатынас сипаты өсірудің 7 тəулігінде анықталды. Chаetomium штамдарының гиперпаразиттік белсенділігі Л.Л.Великанов жəне т.б. сандық бағалау шкаласы бойынша анықталды [9]. Өсірудің жетінші тəулігінде патогеннің өсуінің тежелуі пайыздық мөлшерде келесі формула арқылы есептелді: Р = (К - А)/К 100, мұндағы өсудің тежелуі, %; К – бақылаудағы өсу; А – Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақ штамдарының өсуі. Бөлініп алынған штамдардың астық дақылдарының өсіп, өнуіне əсерін зерттеу үшін танаптық тəжірибелер жүргізілді. Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақтың 3 штамының өсімдік қалдықтарын шірітуде арпаның Донской сортының өсуі мен өнуіне əсерін салыстырмалы бағалау үшін ұсақ мөлтекті танаптық тəжірибе жасалды. Зерттеу нəтижелері Зертханалық жағдайда Chaetomium туысы саңырауқұлақтарының антагононистік белсенділігін зерттеу үшін целлюлозаны ыдыратушы жəне фитопатогенді саңырауқұлақтар Петри табақшасындағы агарлы қоректік орталарға себілді. Петри табақшасындағы қос культура 25°С температурадағы термостатқа өсіруге қойылды. 7 тəуліктен соң тест-ағзаның агарлы блогының айналасында фитопатогенді саңырауқұлақтардың өсуінің тежелу аймағы анықталды. Кестеде көрсетілгендей целлюлозаны ыдыратушы саңырауқұлақтардың барлық штамдары фитопатогендердің өсуін тежегені байқалады (кесте 1). Кесте 1 - Chaetomium саңырауқұлақтарының тамыр шірігі ауруын тудырушы фитопатогендердің өсуін тежеуі Штамм Саңырауқұлақтардың тежелу аймағы, мм A. tenius B. sorokiniana F. sporotrichiella Бақылау 51.8±0,40 53.6±0,32 45.3±0,10 Ch. №1 6.8±0,03 5.9±0,08 7.6±0,11 Ch. №3 8.0±0,05 6.0±0,05 10.9±0,05 Ch. №4 8.0±0,09 12.8±0,34 12.3±0,12 F. sporotrichiella саңырауқұлағының тежелу аймағы 7.6 мм-ден 12.3 мм аралығында ауытқыды. A. tenius саңырауқұлағының тежелуі 6.8 мм-ден 8.0 мм-ге дейінгі аймақты алып жатса, Bipolaris sorokiniana саңырауқұлағында бұл көрсеткіш 5.9 – 12.8 мм құрады. Целлюлоза ыдыратушы саңырауқұлақтарының ішінде антагонистік белсенділік Ch. spirochaete №4 штамдарында жоғары болды. Əсіресе F. sporotrichiella фитопатогенді саңырауқұлағының өсуі қатты тежелді. Гиперпаразиттік белсенділік Ch. angustum №1 жəне Ch. spirochaete №4 саңырауқұлақ штамдарында айқын байқалды (сурет 1). 25 8 - F №7 + Ch. №1 штамдары; 2- В №15 +Ch. №1 штамдары; 18- A №41 +Ch. №1 штамдары. Сурет 1 – Арпаның тамыр шірігі ауруын қоздырушы фитопатогенді саңырауқұлақтардың өсуінің тежелуі Ch. angustum №1 жəне Ch. spirochaete №4 патоген өскен ауданның 50-60% жаулап алды жəне спора түзуі байқалды. Ch.angustum №3 саңырауқұлағының гиперпаразиттік белсенділігі 25-50% аралығын қамтыды (кесте 2). Кесте 2 – Chaetomium саңырауқұлақтарының фитопатогенді саңырауқұлақтармен қарым –қатынасы жəне гиперпаразиттік белсенділігі Штамм Патоген мен антагонист арасындағы Штамдардың гиперпаразиттік белсенділігі қарым-қатынас A. tenius B. sorokiniana F.sporotrichiell A. tenius B. F. sporotrichiella a sorokiniana Бақылау Ch. №1 А А А 2++ 2 2+ Ch. №3 Б Б Б 1+ 2 1 Ch. №4 Б Б А 2+ 2 3++ 2009 жылы танаптық жағдайда целлюлозаны ыдыратушы Cladosporium жəне Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақтардың өсімдіктердің тамыр шірігі ауруымен қарқынды зақымдалуы мен дəнді дақылдардың өнімділігіне əсері зерттелді. Арпаның тамыр шірігі ауруының таралуы мен дамуы вегетациялық кезеңнің барысында бақыланып отырды. Осы жылы аурудың дамуы 36.1%-дан 17.5%- ға дейін тежелсе, аурудың таралуы 61.5 –дан 34.4% -ға дейін шектелді. Тамыр шірігі ауруының таралуы мен дамуы бақылаумен салыстырғанда, 16.4% -53.2 жəне 24.3-63.2% төмендеген (кесте 3). Жүргізілген танаптық сынақтар Донской арпа сортының өсуі мен дамуына айқын ынталандырушы ықпалы бар целлюлозаны ыдыратушы саңырауқұлақтардың штамдарының тиімділігін анықтауға мүмкіндік берді. Танаптық жағдайда жүргізілген құрылымдық талдау нəтижелері өсімдіктерінің шығымына, масақтағы дəндерінің санына целлюлоза ыдыратушы саңырауқұлақтардың жоғары деңгейде жағымды əсер ететінін көрсетті. Кесте 3– Арпа егістігінде тамыр шірігі ауруының таралуы мен дамуы Нұсқа Аурудың таралуы, % Аурудың дамуы, % Бақылау 73,6 47,6 Ch. №1 34,4 30,5 Ch. №3 61,5 36,1 Ch. №4 36,5 17,5 Арпаның өнімділігі Chaetomium саңырауқұлақтарының əр түрлі штамдарына байланысты 372.4 ден 472.2-ге дейін г/м2 ауытқыды. Chaetomium саңырауқұлағы штамдары аурудың дамуын шектеп, өнімділікті орташа есеппен 24.1-79.8% арттырды (кесте 4). Өнімділіктің максимальды деңгейі Ch. angustum №1 нұсқасын пайдаланған байқалады, өнімділік 488.4 г/м2 құрады. Кесте 4 – Целлюлоза ыдыратушы саңырауқұлақтарын қолданылған арпаның Донской сортының құрылымдық талдауының көрсеткіштері, 2009 ж. Нұсқа Сақталуы, Өнімді Өсімдік Масақтың МасақӨнімдідана сабақтардың биіктігі, ұзындығы, см шалар-дың лігі, 26 саны, дана Бақылау Ch. №1 Ch. №3 Ch. №4 130 147 182 211 см 4,39 3,65 4,1 3,68 саны, дана 47,9 47,2 47,0 45,8 6,05 5,79 6,45 6,29 17,0 15,1 15,9 15,2 г/м2 327,3 488,4 372,4 472,2 Арпаның тамыр шірігі ауруына қарсы биологиялық тиімділігі дəндердің Ch. spirochaete №4 саңырауқұлағының штамдарымен өңделген мөлтектерінде байқалды (сурет 2). 63,2 80 60 35,9 40 20 32,98 24,1 26 18,25 0 0 0 бақылау Сһ. шт 1 Сһ. шт 3 Сһ. шт 4 биологиялық тиімділігі Сурет 2 - Целлюлозаны ыдыратушы микроағзалармен инокуляцияланған Донской арпа сортының биологиялық жəне шаруашылық тиімділігі Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақтармен өңделген арпа дəндерінің шаруашылық тиімділігі Ch. angustum №1 штамдарының негізінде ең жоғары болды жəне 18.25% жəне 32.98% сəйкес келді. Жалпы алғанда целлюлоза ыдыратушы микроағзаларды арпа егістігінде пайдалану тамыр шірігі ауруын тежеп, дақылдың ауруға төзімділігін жəне өнімділігін арттырды, бұл əрине, биологиялық жəне шаруашылық тиімділігіне əсер етті. Қорыта айтқанда тамыр шірігі ауруларының қоздырғыштарына целлюлозаны ыдыратушы саңырауқұлақтардың ішінде Ch. spirochaete №.4 штамдары жоғары антагонистік белсенділік көрсетті, оның фитопатогендерді тежеу аймағы 8.0 мм-12.8 мм аралығын құрады. Ch.angustum шт.1 жəне Ch. spirochaete шт.4 саңырауқұлақтарының гиперпаразиттік белсенділіктері жоғары болды. Олар патоген өскен ауданның 50-60% жаулап алып, қарқынды спора түзді. Ch.angustum шт.3 саңырауқұлағы 25-50% гиперпаразиттік белсенділікке ие болды. Chaetomium саңырауқұлақтарының штамдары аурудың таралуы мен дамуын 53.2 -63.2% шектеп, арпаның өнімділігінің артуына əкеп соқтырды. Chaetomium туысына жататын саңырауқұлақтармен өңделген арпа дəндерінің шаруашылық тиімділігі Ch.angustum шт.1 штамдарының негізінде ең жоғары көрсеткішке ие болды жəне 30.68% жəне 32.98% сəйкес келді. 1. Каличкин В.К. Минимальная обработка почвы в Сибири: проблемы и перспективы //Земледелие. -2008. - №5. - С. 24-26. 2. Науанова А.П., Чуркина Г.Н. Биологическая активность черноземов Северного Казахстана. – Шортанды. 2007. - 137 с. 3. Семынина Т.М. Влияние агротехнических приемов на численность конидий Bipolaris sorokiniana в почве // Защита и карантин растений. - 2008. - №9. - С.24-25 4. Тулемисова К.А., Мазунина В.И., Кулдыбаев М.М. Роль микробных метаболитов в повышении урожайности растений.- А.: Наука. - 1981. -172 с. 5. Биологическая защита растений /под ред. Н.Н. Штернсис. - М.: Колос. - 2004. - 264 с. 6. Красильников Н.А. Методы изучения почвенных микроорганизмов и их метаболитов. - М.: МГУ. - 1966. -215 с. 7. Кириленко Т.С. Определитель почвенных сумчатых грибов. – Киев: Наук. Думка. - 1978. - 264 с. 8. Черепанова Н.П. Сумчатые грибы рода Cheatomium. - Л.: Изд. Ленин. ун-та. - 1989. - 168 с. 9. Великанов Л.Л., Сухоносенко Е.Ю., Николаева С.И., Завелишко И.А. Сравнение гиперпаразитической и антибиотической активности изолятов рода Trichoderma Pers.: FR. и Gliocladium Virens Miller, Giddens et Foster по отношению к патогенам, вызывающим корневые гнили гороха //Микол. и фитопатология. -1994. - Т.28. - вып.6. -С.52-56. *** В этой статье исследованы в лабораторных и полевых условиях фунгицидные свойства целлюлозоразрушающих грибов рода Chaetomium против возбудителей корневой гнили ячменя Fusarium и Bipolaris. В результате антагонистических 27 свойств грибов рода Chaetomium исследования полученные данные в лабораторных условиях были подтверждены на полеых опытах. *** In this article exploring in laboratory and field conditions fungicidal quality of cellulosadestruction mushrooms Chaetomium against stimuli rooted decay of barley mushrooms Fusarium and Bipolaris. In result antagonistic qualities of mushrooms Chaetomium investigations obtained datum in laboratory conditions there were confirmated on field experiences С.А. Аленькина, К.А. Трутнева, В.Е. Никитина ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНОВ АЗОСПИРИЛЛ НА СОДЕРЖАНИЕ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ ПШЕНИЦЫ (Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов (Россия), е-mail: alenkina@ibppm.sgu.ru В настоящей работе изучено в динамике изменение эндогенного содержания и соотношение свободной и связанной форм салициловой кислоты в корнях проростков пшеницы при воздействии лектинов двух штаммов азотфиксирующих ассоциативных бактерий рода Azospirillum – A. brasilense Sp7 и его мутанта по лектиновой активности A.brasilense Sp7.2.3. Установлены различия в ответной реакции растений на воздействие лектинов этих двух штаммов. Полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны выступать в качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы Необходимым условием развития экологического земледелия является создание методов и технологий формирования, поддержания эффективного функционирования высокоинтегрированных микробно-растительных систем, сочетающих в себе полезные свойства и растений, и микроорганизмов. В настоящее время информации о функционировании ассоциативных симбиозов пока еще недостаточно для глубокого понимания этого явления, и многие вопросы остаются пока неясными. Кроме общепризнанных ведущих факторов, синтеза фитогормонов и вклада в азотное питание растений за счет фиксации молекулярного азота, несомненно, существует и ряд других аспектов позитивного воздействия микропартнера ассоциативного симбиоза на жизнедеятельность макропартнера. Учитывая функциональные особенности гемагглютинирующих белков азоспирилл было выдвинуто предположение, что лектины наряду с другими поверхностными структурами способны участвовать не только в адгезии бактерий на корнях растений [1], но и влиять на метаболизм растительной клетки. Действительно, оказалось, что лектины способны стимулировать прорастание семян [2], проявлять по отношению к растительной клетке митогенную и ферментмодифицирующую активности [3, 4], изменять уровень сигнальных соединений - цАМФ, оксида азота (NO), перекиси водорода в корнях проростков пшеницы, и тем самым участвовать в формировании защитных реакций растений [5, 6]. Частью защитных реакций растений является увеличение уровня салициловой кислоты (СК) в растительной клетке. Известно, что под воздействием различных биогенных факторов содержание СК в тканях растений может возрастать в десятки раз [7]. Задачей настоящего исследования явилось изучение влияния лектинов азоспирилл на содержание СК в корнях проростков пшеницы. Объектом исследования служили два штамма азотфиксирующих ассоциативных бактерий рода Azospirillum – A. brasilense Sp7, полученный из Института микробиологии РАН (г. Москва) и A. brasilense Sp7.2.3 – мутант по лектиновой активности [8], а также корни проростков пшеницы (Triticum aestivum L.) сорта Саратовская 29. Культуры азоспирилл выращивали на жидкой синтетической среде для флоккуляции при 37°С в течение 18 ч [9]. Выделение лектинов с поверхности клеток проводили методом Eshdat и Sharon [10]. Очищенные препараты лектинов получали ранее описанным способом [5]. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд [11]. В работе использовали 3-суточные проростки пшеницы. Семена стерилизовали 1 мин 60%-ным этанолом и проращивали на дистиллированной воде при 22°С. Для изучения влияния лектинов на содержание СК корни проростков инкубировали с растворами лектинов в течение двух часов. Контролем служили корни, не обработанные растворами лектинов. Получение свободной и связанной форм СК проводили по методу, изложенному в работе [12]. 1г корней был тщательно отмыт дистиллированной водой и фиксирован горячим 96%-ным этанолом. 28 Корни гомогенизировали, затем СК экстрагировали из корней 80% кипящим этанолом. Экстракт был разделен на две части для получения свободной и связанной форм СК. Определение содержания СК проводили на газовом хроматографе Shimatzu GH-2010 (Япония) с использованием колонки Eguity-1 (Supelco) при температуре 200°. ФАЛ (КФ 4.3.1.5) экстрагировали из тканей проростков 0.1 М боратным буфером с рН 8.8 при +4°С в течение 30 мин при соотношении масса:объем 1:17. Реакционная смесь состояла из 0.1 мл ферментного препарата и 0.4 мл боратного буфера рН 8.8, содержащего 12 мМ L-фенилаланина. В контроль вместо фермента добавляли 0.1 мл боратного буфера. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Активность фермента определяли спектрофотометрическим методом по изменению оптической плотности при 290 нМ. Активность ФАЛ выражали в единицах оптической плотности (ΔЕ/г сырой массы)[13]. Опыты проводили в 3-кратной биологической и 5-кратной аналитической повторностях. Цифровой материал обработан статистически с помощью программы «Анализ данных электронных таблиц Microsoft Excel». В таблицах приведены средние арифметические из всех определений и их стандартные отклонения. Как уже было отмечено выше, в работе были исследованы лектины двух штаммов азоспирилл – A. brasilense Sp7 и мутантного штамма A. brasilense Sp7.2.3. Лектины этих двух штаммов являются гликопротеинами, выделенными с поверхности бактериальных клеток с молекулярной массой 36 кДa и специфичностью к L-фукозе и D-галактозе [8]. Лектин мутантного штамма отличался от лектина родительского штамма антигенными свойствами. Предыдущими исследованиями было показано, что эти белки обладают различной функциональной активностью [2-6]. Изменение содержания СК в корнях проростков пшеницы при воздействии лектинов родительского и мутантного штаммов свидетельствует о том, что они оказывают заметное влияние на этот показатель. Для исследований были взяты четыре концентрации лектинов - 5, 10, 20, 40 мкг/мл. В ходе проведенных экспериментов мы измеряли количество свободной и конъюгированной форм СК, поскольку формы СК легко переходят одна в другую и при этом обладают разной биохимической и физиологической активностью [14]. Результаты показали, что лектины изменяли содержание СК лишь через час инкубации с корнями. Оба лектина вызывали увеличение концентрации свободной и уменьшение концентрации конъюгированной форм СК при всех изучаемых концентрациях. Для лектина родительского штамма наблюдалось снижение эффекта с увеличением концентрации лектина. Максимум увеличения свободной СК отмечался при концентрации 5 мкг/мл, Для лектина мутантного штамма максимальное значение наблюдалось при 10 мкг/мл. Что касается связанной формы СК, то для обоих штаммов с увеличением концентрации происходило снижение оказываемого лектинами эффекта. Максимальное снижение происходило при концентрации лектинов – 5 мкг/мл. Лектин мутантного штамма по сравнению с лектином родительского штамма наиболее эффективно увеличивал количество свободной СК и менее эффективно изменял содержание связанной формы СК. Как видно из рис.1 количество образовавшейся свободной СК и количество гидролизованной связанной СК неравнозначно, особенно в случае с лектином мутантного штамма. В связи с этим возникает вопрос, является ли аккумуляция СК результатом только гидролиза конъюгатов, или же наряду с процессом гидролиза происходит и ее синтез de novo. Для ответа на этот вопрос определяли активность фермента, ответственного за синтез СК – фенилаланин-аммиак-лиазы. мкг/г сырой массы A. brasilense Sp7 A. brasilense Sp7.2.3 10 8 6 4 2 0 1 2 контроль лектин 10 мкг/мл лектин 40 мкг/мл 1 2 лектин 5 мкг/мл лектин 20 мкг/мл Рисунок 1. Содержание конъюгированной (1) и свободной (2) форм СК в корнях проростков пшеницы в контроле и при предобработке лектинами A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp7.2.3 Как показали результаты, индукция активности ФАЛ происходила как в случае с лектином родительского, так и мутантного штамма, но лектин мутантного штамма в данном случае проявлял 29 большую активность, особенно при концентрации – 10 мкг/мл. Из рис. 1 и табл. 1 видно, что при воздействии лектина мутантного штамма прослеживается очень четкая корреляция между изменением содержания свободной СК и активностью ФАЛ в корнях для изучаемых концентраций лектина, что не отмечается при инкубации с лектином родительского штамма. Таблица 1. Активность ФАЛ в корнях проростков после инкубации с лектинами A. brasilense Sp7 и Sp7.2.3 Обработка Активность ФАЛ, % Вода (контроль) Лектин A. brasilense Sp7 - 5 мкг/мл Лектин A. brasilense Sp7 - 10 мкг/мл Лектин A. brasilense Sp7 - 20 мкг/мл Лектин A. brasilense Sp7 - 40 мкг/мл Лектин A. brasilense Sp7.2.3 - 5 мкг/мл Лектин A. brasilense Sp7.2.3 - 10 мкг/мл Лектин A. brasilense Sp7.2.3 - 20 мкг/мл Лектин A. brasilense Sp7.2.3 - 40 мкг/мл 100 ± 3 115 ± 5 105 ± 4 110 ± 6 120 ± 3 150 ± 4 210 ± 3 110 ± 9 105 ± 3 Полученные результаты свидетельствуют о том, что лектины повышают активность βглюкозидазы, о чем свидетельствуют ранее полученные нами данные [3], которая превращает конъюгированную форму СК в свободную и активируют ФАЛ, отвечающую за синтез СК. Однако степень участия лектинов в первом и во втором случае различна. Лектин родительского штамма обладает большей регулирующей активностью по отношению к β-глюкозидазе, лектин же мутантного штамма – к ФАЛ. Полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны выступать в качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы. 1. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Пономарева Е.Г., Савенкова Н.Н. Изучение роли клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы // Микробиология.- 1996.- Т. 65.- № 2.- С. 165-170. 2. Никитина В.Е., Богомолова Н.В., Пономарева Е.Г., Соколов О.И. Влияние лектинов азоспирилл на способность семян к прорастанию // Известия АН. Серия биологическая.- 2004.- № 4.- С.- 431-435. 3. Alen’kina S.A., Payusova O.A., Nikitina V.E. Effect of Azospirillum lectins on the activities of wheat-root hydrolytic enzymes // Plant and Soil.- 2006.- V. 283.- № 1-2.- P. 147-151. 4. Чернышева М.П., Аленькина С.А., Никитина В.Е., Игнатов В.В. Внеклеточные протеолитические ферменты штамма Azospirillum brasilense Sp7 и регулирование их активности гомологичным лектином // Прикл. биохимия и микробиология.- 2005.- Т. 41.- № 4.- С. 444 - 448. 5. Аленькина С.А., Матора Л.Ю., Никитина В.Е. Оценка влияния лектинов азоспирилл на уровень цАМФ в растительной клетке // Микробиология.- 2010.- Т. 79.- №6.- С. 856-858. 6. Аленькина С.А., Никитина В.Е. Изменение содержания оксида азота в корнях проростков пшеницы под влиянием лектинов азоспирилл // Доклады РАСХН.- 2011.-Т. 79.- №6.- С. 12-14. 7. Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Индуцированная устойчивость растений и салициловая кислота. // Прикл. биохимия и микробиология.- 2007.- Т. 43.- №4.- С. 405-411. 8. Аленькина С.А., Петрова Л.П., Никитина В.Е. Получение и характеристика мутанта по лектиновой активности // Микробиология.- 1998.- T. 67.- № 6.- C. 782-787. 9. Sadasivan L., Neyra C.A Flocculation in Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum // J. Bacteriol.1985.- V. 163.P. 716-723. 10. Echdat Y., Ofek I., Yachow-Yan Y., Sharon N., Mirelman D. Isolation of mannose-specific lectin from E.coli and its role in the adherence of the bacterial to epithelial cells // Biochem. Biophis. Res. Commun. // Biochem. Biophis. Res. Commun.- 1978.- V. 85.- P. 1551-1559. 11. Bradford M. M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem.- 1976.- V. 72.- P. 248-254. 12. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Свободная и коньюгированные формы салициловой кислоты: содержание и роль в картофеле // Прикл. биохимия и микробиология. -2005.- Т. 41.- №3.- С. 1-4. 13. Zucker M. Induction of phenylalanine ammonialyase in Xaritin leaf disk. Photosythetic reguirement and effect of daylegth // Plant Physiol.- 1969.- V. 44.- P. 91-112. 14. Тарчевский И.А., Максютова Н.Н., Яковлева В.Г., Гречкин А.Н. Янтарная кислота – миметик салициловой кислоты // Физиология растений.- 1999.- Т.46.- №1.- С. 23-28. 30 УДК 637. М.К. Алимарданова, С.А. Надирова, А.Б. Султанбекова БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВТОРИЧНОГО БЕЛКОВО– УГЛЕВОДНОГО СЫРЬЯ (Алматинский технологический университет) В настоящее время на современном уровне развития промышленности, в производстве продуктов питания огромное значение придается экономии сырьевых ресурсов, снижению их себестоимости и выпуску продуктов высокого качества. Известно, что сыворотка - это ценный молочный продукт, укрепляющий здоровье,который получается при изготовлении сыра или творога. Сыворотка практически не содержит жиров, в то же время богата ценными белками. В молочную сыворотку переходят практически все соли и микроэлементы молока, а также водорастворимые витамины, причем в подсырной сыворотке их значительно больше, чем в творожной. Выявлено, что в сыворотке содержатся такие ценные минеральные вещества, как калий, кальций, магний, фосфор, а также много витаминов. Палитраэнергетические вещества и различные минеральные соли сыворотки позволяет использовать его в качестве основы различных диет. Спектр лечебного действия сыворотки очень широк: улучшение работы почек и нормализация функции печени; улучшение кровообращения и предотвращение развития атеросклероза; положительное воздействие на нервную систему; профилактика заболеваний сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, сосудов головного мозга, сахарного диабета. Основной составной частью сухих веществ молочной сыворотки является лактоза, массовая доля которой составляет более 70 °/о сухих веществ сыворотки. Особенностью лактозы является ее замедленный гидролиз в кишечнике, в связи с чем ограничиваются процессы брожения, нормализуется жизнедеятельность полезной кишечной микрофлоры, замедляются гнилостные процессы и газообразование. Кроме того, лактоза в наименьшей степени используется в организме для жирообразования. Сывороточные белки содержат в своем составе больше незаменимых аминокислот, чем казеин, являются полноценными белками, которые используются организмом для структурного обмена, в основном для синтеза белков печени, образования гемоглобина и плазмы крови. Доказано, что состав белков молочной сыворотки больше соответствует составу белков женского молока, чем состав белков коровьего молока, что позволяет использовать белки сыворотки в производстве детских молочных продуктов. Особенностью молочного жира сыворотки является более высокая, чем в молоке, степень его дисперсности, что положительно влияет на его усвояемость. Содержание составных частей молока и биологические свойства сыворотки позволяют отнести ее к ценному промышленному сырью, которое можно переработать в различные пищевые и кормовые средства. Благодаря своему мягкому вкусу молочная сыворотка сочетается практически со всеми продуктами: применяется как ингредиент различных коктейлей, при выпечке хлебобулочных изделий и т.д. Таким образом, молочная сыворотка и продукты из нее являются незаменимыми в питании пожилых людей и людей с избыточной массой тела, а также с малой физической нагруженностью. В Алматинском технологическом университете в течение ряда лет проводятся исследования возможности использования сыворотки для создания напитков, а также для выделения мембранными технологиями концентратов сывороточных белков с целью дальнейшего применения их для фортификации пищевых продуктов и создания функциональных продуктов питания. Одним из путей использования молочной является выпуск продуктов на основе молочной сыворотки с натуральными ингредиентами, приносящими пользу здоровью людей, повышающими его сопротивляемость заболеваниям, способные улучшить многие физиологические процессы в организме, позволяющие человеку долгое время сохранять активный образ жизни. Широкие перспективы при производстве продуктов с натуральными ингредиентами на основе молочной сыворотки возникают при применении в качестве обогатителей продуктов местного фитосырья. Сырьевые возможности позволяют удовлетворить пищевую промышленность в этих видах сырья. 31 1. Крусь Н., Тиняков В.Г., Фофанов Ю.Ф., «Технология молока и оборудование предприятий молочной промышленности», -М.: Агропромиздат, -1986. 2. Берман C.JI. «Углеводы молока». Труды Вологодского молочного института. вып. № 3, -Москва; -1966. 25-43 с. 3. Горбатова К.К. «Биохимия молока и молочных продуктов». Легкая и пищевая промышленность, -Москва; -1984. -344 с. 4. Храмцов А.Г., Евдокимов И.А. «Рациональная переработка молочной сыворотки». Молочная промышленность, вып. №4, -Москва; -1996. С. 10-12. 5. Храмцов А.Г. и др. «Молочная сыворотка: переработка и использование». «Сыроделие». – Москва; -1999. - №2. -С. 23-25. 6. Алимарданова М.К. «Комбинированные функциональные продукты и их роль в питании», -Алматы; 2006. -52 с. 7. Алимарданова М.К. «Казахские национальные молочные продукты», - Алматы; -2006. -176 с. УДК 579.083.13:579.22 К.Х. Алмагамбетов, З.С. Сармурзина, Н.Б. Молдагулова, Г.К. Абитаева ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТОВ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКРООРГАНИЗМОВ (РГП «Республиканская коллекция микроорганизмов» КН МОН РК) Развитие фармтехнологий, основанных на применении лекарственных средств растительного происхождения особо актуально [1, 2]. Растительные лекарственные средства, производимые отечественными фармпроизводителями применяются при лечении самых различных заболеваний соматического, инфекционного и онкологического генеза [3-6]. Вместе с тем совершенно недостаточно исследовано влияние оригинальных фитопрепаратов на нормальную микрофлору кишечника, на ее резидентных и транзиторных представителей. А подобные исследования уместны в силу широкой распространенности дисбактериоза кишечника [7]. Материалы и методы Использованы СО2-экстракты салсоколлина, экдифита, атеролида, саусалина, гроссгемина, арглабина нативного, пиностробина и эфирные масла аяфрола и эферола. Изучено их влияние на представителей микрофлоры кишечного биотопа - Lactobacillus fermentum, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli и Klebsiella ozaenae. Оценивались жизнеспособность и биологические свойства данных микроорганизмов при культивировании их на питательных средах, содержащих различные концентрации (от 0,000032 до 0,02 г/мл) вышеперечисленных фитосубстанций. Оценивалась антагонистическая активность L. fermentum по отношению к тесткультурам: E. coli, Ser. marcescens, Pr.mirabilis, Kl. ozaenae, S. aureus и Candida albicans методом отсроченного антагонизма. Для изучения плазмокоагулазной активности St. aureus использовали сухую цитратную кроличью плазму (ЗАО «БИОЛЕК», Украина). Определение гемолитической активности Str. pyogenes осуществляли путем посева на 5% кровяной агар. Оценка антимикробной активности фитосубстанций. Результаты и обсуждение Исследована жизнеспособность микроорганизмов на питательных средах, содержащих фитосубстанции эндемичных лекарственных растений в различных концентрациях (0,02; 0,004; 0,0008; 0,00016; 0,000032 г/мл). На таблицах 1 и 2 приведены данные о влиянии на микроорганизмы кишечного биотопа фитосубстанций в 2-х концентрациях: минимальной - 0,000032 и максимальной 0,02 г/мл. В минимальной концентрации все фитосубстанции не оказывали влияния на жизнеспособность микроорганизмов, за исключением арглабина и саусалина, которые слабо ингибировали рост S. aureus. В максимальной концентрации (0,02 г/мл) фитосубстанции эффективно подавляли жизнеспособность микроорганизмов (табл.1). Таблица 1 - Влияние фитосубстанций на жизнеспособность микроорганизмов Фитосубстанции арглабин салсоколлин атеролид саусалин экдифит L. fermentum +++ +++ +++ S. aureus +++ + +++ +++ 32 Str. рyogenes +++ +++ +++ E. coli +++ ++ - Kl. оzaenae +++ +++ гроссгемин, ++ ++ ++ +++ +++ пиностробин + + + ++ аяфрол + +++ эферол +++ +++ Примечание: (+++) - высокая ингибирующая активность, (++) - средняя, (+) – слабая, (-) – отсутствует. Все фитосубстанции в концентрациях от 0,000032 до 0,04 г/мл практически не влияют на антагонистическую активность лактобацилл по отношению к тест-культурам, за исключением гроссгемина и пиностробина, которые ингибируют активность лактобацилл по отношению к Candida. Наряду с изучением возможного негативного влияния фитосубстанций на полезную антагонистическую активность резидентных представителей кишечной микрофлоры - лактобацилл, также практически значима оценка влияния фитосубстанций на плазмокоагулазную активность стафилококков и гемолитическую - стрептококков. Оказалось, что низкие концентрации фитосубстанций не оказывали влияния на время свертывания кроличьей плазмы культурой S. aureus. Но максимальная концентрация (0,02 г/мл) почти всех фитосубстанций задерживала время свертывания плазмы на протяжении 2, 3 и 6 часов наблюдения. Свертывание плазмы отмечено лишь к 18 часу наблюдения. А арглабин, экдифит, саусалин и эферол полностью ингибировали плазмокоагулазную активность S. aureus (в течение 2-24 часов наблюдения свертывания плазмы не отмечено). Вместе с тем атеролид, даже в максимальной концентрации не оказывал влияния на плазмокоагулазную активность стафилококков. Гемолитическая активность пиогенного стрептококка при культивировании в питательной среде, содержащей фитосубстанции атеролида, гроссгемина и пиностробина не изменяется. Но арглабин, саусалин и экдифит в концентрациях 0,02 и 0,004 г/мл полностью ингибируют данную активность Str. рyogenes (табл.2). Таблица 2 - Влияние фитосубстанций на гемолитическую активность Str. рyogenes (зона гемолиза, в см) Фитосубстанции Концентрации фитосубстанций (г/мл ) 0,02 0,004 0,0008 0,00016 0,000032 контроль арглабин 10,0 10,0 9,0 9,0 салсоколлин 8,0 8,0 8,0 8,0 9,0 атеролид 9,0 9,0 9,0 9,0 8,0 9,0 саусалин 10,0 9,0 9,0 9,0 экдифит 10,5 10,0 10,0 9,0 гроссгемин, 11,0 12,0 12,0 13,0 12,0 12,0 пиностробин 11,0 10,0 10,0 11,0 12,0 10,0 аяфрол 12,0 13,0 12,0 12,0 12,0 эферол 11,0 13,0 12,0 12,0 12,0 Примечание: (-) – отсутствие зоны гемолиза Таким образом, фитосубстанции, исследованные in vitro в концентрациях сопоставимых c терапевтическими дозами оказывают влияние на жизнеспособность и биологические свойства микроорганизмов, представителей кишечного биотопа. Так арглабин, саусалин, экдифит и гроссгемин в максимальной концентрации подавляют жизнеспособность всех исследованных микроорганизмов. А салсоколлин и атеролид, наоборот, практически не оказывают влияния на их рост и размножение. В последующих исследованиях предполагается оценить влияние фитосубстанций на кишечный микробиоценоз в опытах на лабораторных животных, in vivo. 1.С.М.Адекенов Актуальные проблемы развития отечественной фармацевтической отрасли.//Фармацевтический бюллетень.2011.-№№ 3-4.- С.11-18. 2. Васильев A.B., Полоз Т.П., Соколов H.H. Лекарственные растения России неиссякаемый источник для создания новых высокоэффективных лечебно-профилактических препаратов и БАД // Вопросы медицинской химии №2,2000; 3. Смагулов М.К., Ахметова С.Б., Садырбеков Д.Т., Алмагамбетов К.Х., Атажанова Г.А., Адекенов С.М. Химический состав и антимикробная активность эфирного масла аянии кустарничковой (Ajania fruticulosa (Ldb.) Poljak).// В сб. «Химия и применение природных и синтетических биологически активных соединений» Алматы.-2004.-с.155-160. 4. Ахметова С.Б., Смагулов М.К., Аксартов Р.М., Адекенов С.М. Антимикробная активность сесквитерпеновых лактонов и их производных.// Российский биотерапевтический журнал.-2005.-т.3.-№1.-с.83-84. 5. Drozd J., Anuszewska E. The influence of plant raw materials, containing ellagic acid and selected antibiotics on immunological response in mice.// Acta Pol. Pharm.–2005.– Vol. 62, N 3.– P. 237–240. 33 6. Федорова Ю.С., Кузнецов П.В., Сухих А.С., Карелина О.А., Герасимова Р.Н. Сравнительная оценка антибактериальной активности фитопрепаратов из некоторых видов растений рода Hedysarum (Сем. Fabaceae). // Фармацевтические науки. – 2011, №3. – С. 2107. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых // КМК Scientific Press. М. 2003. - 220 с. *** Мақалада өсімдік экстрактылары (салсоколлин, экдифит, атеролид, саусалин, гроссгемин, арглабин нативный, пиностробин) мен эфир майларының (аяфрол, эферол) микроорганизмдерінің биологиялық құрамына əсерін зерттеудің нəтижелері көрсетілген. Бұл препараттардың тіршілік қабілеттілігі мен биологиялық белсенділігі əртүрлі концентрацияда (0,000032-ден 0,02 г/мл дейін) Lactobacillus fermentum, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli жəне Klebsiella ozaenae зерттелді. *** The results of investigation of the effect of plant extracts (salsokollin, ekdifit, aterolid, saussalin, grossgemin, Arglabin native, pinostrobin) and essential oils (ayafrol and eferol) on the biological properties of microorganisms presents this article. These drugs were studied at different concentrations (from 0,000032 to 0,02 g / ml) on the index of viability and biological activity of Lactobacillus fermentum, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli and Klebsiella ozaenae. Л.И. Антоновская, Н.А. Белясова, И.П. Рокало ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ БАКТЕРИОСТОЙКОСТИ МАТЕРИАЛОВ (Белорусский государственный технологический университет, e-mail: biocidmethod@mail.ru) Введение. Исходя из литературных данных [1], одной из серьезных проблем, с которыми сталкиваются различные отрасли промышленности, является проблема биоповреждения материалов и изделий. Понятно, что биокоррозия сокращает срок службы изделий и приводит к нарушению режимов технологических процессов, однако серьезность этой проблемы состоит не только в порче или разрушении материалов и изделий, но в том, что биоповреждения материалов зачастую могут приводить к угрозе здоровья и жизни людей, поскольку бактерии и грибы, повреждающие материал, могут быть причиной аварий, а также источником кожных, аллергических и других заболеваний. Для решения этой проблемы в состав материалов вводят биоцидные вещества или наносят защитные покрытия с антимикробными свойствами, эффективность которых должна быть адекватно оценена. Используемые на сегодняшний день методы оценки степени бактериостойкости материалов обладают рядом существенных недостатков, ограничивающих их применение. Среди широко используемых методов выделяют качественные, основанные на визуальной оценке степени бактериостойкости материалов и количественные, основанные, либо на определении выживаемости клеток в присутствии биозащищенного материала, либо на определении диаметра зон ингибирования роста бактерий. Целью нашей работы являлась разработка совершенно новых подходов для количественной оценки степени бактериостойкости материалов, основанных на использовании метаболических особенностей бактерий. Объекты и методы исследований. Объектами исследования служили синтезированные в ГНУ «Институт общей и неорганической химии» НАН Беларуси коррозионностойкие полимерные композиции (КПК), предназначенные для использования в качестве биозащитных покрытий изделий и конструкций из металла, эксплуатируемых в условиях повышенного содержания микроорганизмов, в частности для защиты оборудования нефтяного комплекса. Из литературных данных [2, 3] известно, что наиболее активными микроорганизмами, повреждающими материалы и изделия в данной отрасли промышленности, являются сульфатредуцирующие бактерии (СРБ). Следовательно, в качестве тесткультур при оценке бактериостойкости КПК использовали выделенные нами из образцов промывных вод нефтеперерабатывающего комплекса сульфатредуцирующие бактерии Desulfovibrio LSL-1, которые осуществляют специфический способ запасания энергии – «сульфатное» дыхание, сопровождающееся диссимиляционным восстановлением сульфатов с образованием сероводорода и сульфидов. Кроме КПК в качестве объектов исследования в данной работе использовали созданные в лаборатории химии тонких пленок НИИ «Физико-химических проблем БГУ» керамические фильтры (КФ), поверхность пор которых модифицирована наночастицами серебра. Необходимость биозащиты этих материалов возникла в связи с тем, что при длительной их эксплуатации на поверхности образуются заметные невооруженным глазом скопления микроорганизмов (биообрастания), которые значительно ухудшают гидродинамическую проницаемость фильтров. Как показали наши предыдущие 34 исследования [4], наиболее часто в составе биобрастаний фильтрующих элементов встречаются представители рода Pseudomonas. Поэтому, в качестве тест-культур при оценке бактериостойкости КФ использовали выделенные нами из состава биообрастаний облигатно аэробные бактерии Pseudomonas aeruginosa Р-С. В качестве арбитражного для оценки бактериостойкости исследуемых материалов использовали разработанный нами ранее и аттестованный в Белорусском государственном институте метрологии (БелГИМ) адсорбционно-титриметрический метод [5], который заключается в определении количества молочной кислоты, образующейся в культуральной жидкости за счет жизнедеятельности адсорбированных на поверхности материала жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий. Концентрацию накопившейся молочной кислоты определяли кислотноосновным титрованием. Для дифференцировки испытуемых образцов материалов на биозащищенные и незащищенные использовали относительный параметр степени бактериостойкости (DS). Материал признается бактериостойким, если DS ≥ 0.45. Для сравнения результатов оценки степени бактериостойкости образцов КПК по отношению к сульфатредуцирующим бактериям использовали качественный метод, положенный в основу ГОСТ 9.085–78 [6], который заключается в совместном инкубировании исследуемых образцов и СРБ в питательной среде, содержащей железо, с последующей визуальной регистрацией образования черных зон сульфида, которые учитываются при оценке бактериостойкости по трехбалльной шкале. Результаты и их обсуждение. Для количественной оценки антибактериальных свойств КПК нами разработан анаэробно-суспензионный метод. Его суть заключается в определении содержания сероводорода в культуральной жидкости после совместного инкубирования сульфатредуцирующих бактерий с исследуемыми образцами КПК в анаэробных условиях. При этом меньшее количество сероводорода в культуральной жидкости является отражением более выраженных антибактериальных свойств исследуемого материала. Регистрацию количества сероводорода проводили фотоколориметрически на основе цветной реакции образования метиленового синего. Для уменьшения влияния различного рода факторов на показатели, позволяющие судить о степени бактериостойкости анализируемых материалов в анаэробно-суспензионном методе, разработали относительный количественный параметр степени бактериостойкости ( AH S , отн. ед.), 2 который показывает во сколько раз уменьшается метаболическая активность СРБ при инкубировании с биозащищенным образцом по сравнению с контролем. AH2S 1 где Cî áð. CK (1) , – концентрация сероводорода в пробе культуральной жидкости (КЖ) с образцом Cî áð. материала, содержащим биоцидную добавку, мг/дм3; CK – средняя (по результатам трех измерений) концентрация сероводорода в контрольной пробе КЖ, мг/дм3. За результат принимали среднее арифметическое ( AH S ) трех параллельных определений параметра степени бактериостойкости для каждой из трех проб КЖ с образцом материала, содержащим биоцидную добавку. Установлено, что для нескольких серий образцов КПК зависимость между параметрами AH S и DS носит линейный характер и с ее помощью найдено пограничное значение параметра AH S , которое составило 0.68 (соответствует параметру DS=0.45). Образцы КПК, для которых AH S ≥ 0.68 следует считать бактериостойкими. В табл. 1. Приведены результаты определения антибактериальных свойств нескольких новых образцов КПК с помощью двух методов. Табл. 1 – Степень бактериостойкости образцов КПК Образец КПК1 КПК2 КПК3 КПК4 КПК5 AH S , отн.ед. 0.92 0.90 0.91 0.45 0.50 0.65 0.61 0.63 0.27 0.31 DS , отн.ед. 2 2 2 2 2 Из представленных в табл. 1 данных следует, что как с помощью параметра DS, так и с помощью параметра AH S , исследованные образцы КПК располагаются в ряду по степени ухудшения их антибактериальных свойств: КПК1 → КПК3→ КПК2 → КПК5 → КПК4. Иными словами, результаты оценки степени бактериостойкости материалов, полученные с помощью анаэробно-суспензионного метода полностью совпали с результатами, полученными с помощью арбитражного адсорбционно-титриметрического метода. 2 35 Поскольку в арбитражном адсорбционно-титриметрическом методе в качестве тест-культуры использовали молочнокислые бактерии, а исследуемые покрытия разработаны для защиты металлических изделий от биологического обрастания и биокоррозии под действием СРБ, сочли целесообразным сравнить полученные результаты с результатами качественного метода, положенного в основу ГОСТ 9.085–78 [4]. На рис. 1 представлены результаты оценки степени бактериостойкости образцов КПК, полученные с помощью ГОСТ 9.085–78 . Рис. 1 – Культуральные гели Desulfovibrio sp. LSL-1 после совместного инкубирования с образцами КПК Из рис. 1 видно, что лучшие антибактериальные свойства проявляют образцы КПК1, КПК2, и КПК3 (0 баллов по ГОСТ 9.085–78), а образцы КПК4 и КПК5 вообще не способны ингибировать развитие бактерий (II балла по ГОСТ 9.085–78). Эти данные подтверждают полученные с помощью разработанного метода результаты: действительно, антибактериальные свойства образцов КПК4 и КПК5 оцениваются параметром AH S , не достигающим значения 0,68, и их нельзя считать бактериостойкими. Таким образом, можно заключить, что разработанный анаэробно-суспензионный метод дает более адекватную оценку антибактериальным свойствам материалов, чем стандартный качественный метод по ГОСТ 9.085–78. Для оценки антибактериальных свойств КФ нами был разработан количественный метод, основанный на оценке респираторной активности облигатно-аэробных бактерий. В основу метода положено инкубирование бактерий P. aeruginosa Р-С в питательной среде с биозащищенным материалом и определения дыхательной активности клеток. Контролем служила суспензия бактерий в среде без материала. Регистрацию кислорода в культуральной жидкости осуществляли с использованием кислородомера АЖА-101МА. Получали графические зависимости концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости с биозащищенным материалом и без него от длительности инкубирования. Для каждой кривой задавали аппроксимацию полиномом степени, соответствующей уровню достоверности аппроксимации R2≥0,995. В качестве показателя антибактериальной активности использовали коэффициент эффективности ингибирования дыхания клеток EI , который рассчитывали по формуле: EI (2) EI 2 EI min где EI – коэффициент эффективности ингибирования дыхания клеток для опытного образца; EI min – коэффициент эффективности ингибирования дыхания клеток для контрольного образца. T EI c(t )dt (3) 0 T где c(t ) – уравнение зависимости концентрации растворенного кислорода в среде от длительности инкубирования, полученное в результате аппроксимации, мг/дм3; T – длительность инкубирования, мин. Основывались на допущение, что антибактериальные свойства материалов выражены тем сильнее, чем выше показатель EI . Результаты оценки антибактериальных свойств материалов по респираторной активности облигатно аэробных бактерий в сравнении с арбитражным адсорбционно-титриметрическим методом [5] приведены в табл. 2. Табл. 2 – Степень бактериостойкости образцов КФ Образец КФ31 КФ32 КФ33 1.30 1.21 1.22 EI , отн.ед. Концентрация молочной 2.26·10-3 3.27·10-3 3.15·10-3 кислоты, моль/дм3 36 Используя метод оценки антибактериальных свойств материалов по респираторной активности облигатно аэробных бактерий, удалось показать (табл. 2), что образец КФ31 демонстрирует более выраженные антибактериальные свойства, чем образцы КФ32 и КФ33, что подтверждается результатами, полученными с помощью арбитражного адсорбционно-титриметрического метода. Поскольку молочнокислые бактерии, используемые в качестве тест-культур в арбитражном адсорбционно-титриметрическом методе не учувствуют в процессе биообрастания фильтрующих элементов, провели дополнительные исследования по оценке степени бактериостойкости КФ с помощью описанного в литературе и широко используемого диффузионного метода, который заключается в измерении ширины зон задержки роста тест-культур на агаризованной среде, формирующихся под действием диффундирующих веществ с антибактериальной активностью. В качестве тест-культуры использовали выделенные нами из состава биообрастаний бактерии P. aeruginosa Р-С. Результаты представлены на рис. 2. Рис. 2 – Зоны ингибирования роста бактерий P. aeruginosa Р-С в диффузионном методе Как видно из рис. 2, все три опытных образца обеспечивают практически одинаковые по ширине зоны ингибирования роста тест-бактерий. Это можно объяснить невысокой чувствительностью метода, не позволяющей дифференцировать близкие по антибактериальной активности материалы. Заключение. Таким образом, для оценки степени бактериостойкости материалов и изделий разработано два количественных метода, позволяющих по степени ингибирования метаболической активности тест-бактерий под действием биоцидных добавок в составе исследуемых материалов, судить об их эффективности. Разработанные методы позволяют получать объективные количественные показатели и различать схожие по антибактериальным свойствам образцы биозащищенных материалов, характеризуются хорошей воспроизводимостью, небольшими трудозатратами и доступностью используемых средств. 1. Sanchez-Silva M., Rosowsky D. Biodeterioration of construction materials: State of the art and future challenges // Journal of Materials in Civil Engineering. – 2008. – Vol. 20, № 5. – P. 352–365. 2. А.Ф. Андреева [и др.]. Определение скорости коррозии стальных тонкопленочных матриц под воздействием экзополимеров сульфатвосстанавливающих бактерий // Современные проблемы физического материаловедения. – К.: Ин-т пробл. материаловедения НАН Украины. – 2009. – Вып. 18. – С. 121–125. 3. Beech I., Sunner J. Biocorrosion: towards understanding interactions between biofilms and metals // Current Opinion in Biotechnology. – 2004. – Vol. 15, № 3. – Р. 181–186. 4. Антоновская Л.И., Райский А.П., Белясова Н.А. Выделение и идентификация микроорганизмов из состава биообрастаний половолоконных ультрафильтрационных мембранных элементов // Материалы Республиканской научной конференции с международным участием «Научные стремления – 2010». Национальная академия наук Беларуси. – 2010. – Ч 2. – С. 449–452. 5. Антоновская, Л.И. Разработка метода определения степени устойчивости материалов и изделий с биоцидными добавками к биообрастаниям // Молодежь в науке – 2009: прил. к журн. «Весцi нацыянальнай акадэмii навук Беларусi». – 2010. – Ч. 4.– С. 3–7. 6. Единая система защиты от коррозии и старения. Жидкости смазочно-охлаждающие. Методы испытаний на биостойкость: ГОСТ 9.085–78. − Введ. 01.02.1979. − М.: Издательство стандартов. Государственный комитет СССР по стандартам. Государственный стандарт Союза ССР, 1979. – 10 с. 37 УДК: 579.64:504.53.054 Қ. Баяқышова, Н.Н. Гаврилова, И.А. Ратникова АССОЦИАЦИЯЛАР ҚҰРАМЫНА КІРЕТІН МҰНАЙТОТЫҚТЫРУШЫ МИКРООРГАНИЗМДЕРДІҢ КУЛЬТИВИРЛЕУ ЖАҒДАЙЛАРЫН ІРІКТЕУ (ҚР БҒМ ҒК «Микробиология жəне мирусология институты» РМК) Зерттеу барысында А4, А5 жəне А6 ассоциацияларының құрамына кіретін микроорганизмдерді культивирлеу жағдайлары жəне оларды бірге культивирлеу үшін ең қолайлы қатынастары іріктелініп алынды. Қазақстан пайдалы қазбалар мен мұнай өндіруде əлемдегі жетекші елдердің бірі болып саналады. Осыған байланысты, негізгі экологиялық проблемалар мұнай жəне тау-кен өндіру саласындағы өнеркəсіптердің əрекеттерімен тығыз байланысты. Əлемдік практикада кеңінен қолданылатын рекультивациялық шаралар, қазіргі микробиологиялық рекультивация əдістеріне, мұнайтотықтырушы микроорганизмдердің белсенділігі жоғары штамдарын пайдалануға негізделген. Қоршаған ортадағы нысаналарды мұнай жəне мұнай өнімдерінен тазалау мақсатында тиімділігі жоғары биопрепараттарды дайындау – тек, штамдардың физиологиялық ерекшеліктерін ескере отырып, ортаның ластану жағдайына бейімделген, көмірсуларын тотықтырушы микрорганизмдер мен асасоциацияларды қолдануға негізделген, жəне оған оларды өндірудің өзіндік технологиясын жасап шығарған жағдайда ғана мүмкіндік туады [1]. Зерттеу жұмыстың мақсатына: ҚР БҒМ ҒК «Микробиология жəне вирусология институты» РМК алынған мұнайтотықтырушы микроорганизмдер мен олардың ассоциацияларын культивирлеу жағдайлары мен қоректік орталарды іріктеу жатады. Зерттеу əдістері жəне материалдар Зерттеу нысанына мұнайтотықтырушы бактериялардың Arthrobacter sp. П-1, 24, К-3, Candida sp. культуралары жатады. Культуралар қиғаштап қатырылған қоректік агар ЕПА-да өсірілді. Сұйық қоректік ортаға егу, есертіліп отырған микроорганизмдердің бастапқы культураларын – ЕПА-дан (n×108КОЕ/мл) 1% мөлшерде шайынды алынып егіледі. Өсіру 280С температурада 24 жəне 48 сағат тербелгіште жүргізілді. Ассоциацияларды алу мақсатында, сұйық қоректік ортада өсірілген мұнайтотықтырушы микроорганизмдер тең қатынаста араластырылды. Бактериялардың тіршілікке қабылетті клеткаларын анықтау ЕПА тығыз қоректік ортасына белгілі сұйылту дəрежесіне сай Петри аяқшасына егу жолымен жүргізілді. Бактериялардың мұнайтотықтыру белсенділігі, 2% шикі мұнай қосылған сұйық қоректік ортада 10 тəулік бойы тербелгіште өсіріліп, олардың мұнайды пайдалану (сіңіру) мүмкіндігі гравиметрикалық əдіспен анықталды. Нəтижелер жəне оларды талдау Arthrobacter sp. 24 жəне К-3, Candida sp. дрожжылардан құралған А4 ассоциациясына қоректік орталар жəне оларды культивирлеу жағдайларына іріктеу жүргізілді. Қоректік орталардың мына нұсқалары сыналды (г/л): 1. NH4NО3 – 1,0; K2HPO4 – 1,0; KH2PO4 – 1,0; MgSO4 – 0,2; CaCl2 – 0,02; FeCl3 – 2 тамшы концентрленген ертіндісі; NaCl – 10,0; дистилденген су – 1л. дейін 2. Жүгері экстракты – 10,0; дрожжылар ферментолизаты – 3,0; NaCl – 10,0; су – 1 л. дейін, pH 7,2–7,5 3. КН2РО4 – 2,0; Na2HPО4 – 3,0; MgSО4 – 0,5; (NH4)2SО4 – 2,0; СаС12 – 0,01; FeС13 – 0,05; соя ұны – 5,0, сахароза – 10,0; су – 1 л. дейін, рН 7,0–7,2. 4. ЕПС 5. № 1 қоректік орта нұсқасына + 10г/л қоректік сорпа + 10 г/л сахароза. Культураларды егер алдынада қоректік ортаға 2% мөлшерде мұнай қосылды. Культивирлеу тербелгіште 10 тəулік бойы жүргізілді. Содан кейін (1–2 тəуліктен соң) тіршілікке қабылетті клеткалардың саны мен мұнайды пайдалану пайызы (10 тəуліктен кейін) анықталды [2]. Кесте 1 – Сұйық мұнай қосылған əртүрлі қоректік орталарда өскен мұнай тотықтырғыш бактериялардың саны Қоректік орталардың Бактериялар Бактериялық клеткалар саны, КОЕ/мл нұсқалары штамдары 1 1 сутки 3,0×105 24 38 2 сутки 5,0×105 2 3 4 5 1 2 3 4 5 2,0×105 1,6×107 1,2×108 2,0×106 2,8×108 1,8×108 4,0×107 1,3×107 1,4×108 24 24 24 24 К-3 К-3 К-3 К-3 К-3 2,0×106 2,5×108 2,2×109 3,5×108 2,4×109 2,6×109 2,0×108 2,0×108 3,0×109 Кестеде көрсетілгендей, сынаққа алынған қоректік орталарға 2% сұйық мұнай қосқан кезде, бактериялық клеткалар саны 2-тəулікте көбірек жиналатынын көреміз. Оның үстіне 24 штамм үшін ең жақсы қоректік орта № 4 (ЕПС) болса, К-З штамын – №№ 1, 2 жəне 5 қоректік орталарда культивирлеу қолайлы. Қоректік ортаға қою мұнайды қосқанда ең үздік көрсеткішті К3 штамы № 2 жəне 3, ал 24 штамм – № 3 қоректік орталарда көрсетті. Жай көзбен бақылау барсында, бір қатар нұсқаларда: екі штамда да (сұйық мұнай қосылған) № 2 жəне 4 қоректік орталарда, К-3 штамында сонымен бірге № 3 қоректік ортада (қою мұнай қосылған) 5 тəулікте-ақ мұнайдың ыдырауы байқалады. К-3 штамын № 2 жəне 3 орталарда өсіргенде, 10 тəулікте сұйық мұнайды 100%-ға, № 4 ортада № 32,3 % пайдаланды. № 5 қоректік ортада өсірген кезде 24 штамм мұнайды 77% сіңірді. Культивирлеу мерзімінің ұзақтығы мен аэрацияның қажеттілігі – культураларды ЕПС-да өсіру арқылы анықталды. Аэрацияның қарқаны – тербелгішке арналған көлемдері 50-ден 250 мл болатын 750-мл-лік колбаларға қоректік орта құйып, өсіру арқылы анықталды. Культуралар тербелгіште 280С температурада 2 тəулік өсірілді. Сынаққа алынған культураларды ЕПС-да өсірген кезде, бір тəуліктен кейін клеткалардың ең көп мөлшерде (1,7-10,0×109 КОЕ/мл дейін) жиналатыны анықталды. 24 штамды көлемі 50 - 200 мл қоректік ортада өсіргенде биомассаның жиналуы жағынан бəлендей өзгеріс байқалмады, ал қоректік ортаның көлемін 250 мл көтергенде, бактериялық клеткалардың саны n×107 КОЕ/мл дейін төмендегенін көреміз. Осыған байланысты, мұнайтотықтырушы бактериялардың сынаққа алынатын культураларын ферментерда өсірген кезде, ауаның технологиялық шығыны 0,8-1,0 V/мин (қоректік ортаның көлеміне шаққанда) болды. К3 штамын 50 - 250 мл қоректік ортада өсіргенде, биомассаның жиналуы жағынан ерекше өзгеріс байқалмады. Бұл К3 штамын ферментерде өсіргенде, ауаның технологиялық шығыны 0, 6V/мин (қоректік ортаның көлеміне шаққанда) артпайтынын көрсетеді. Candida sp. дрожжылары ең көп биомассаны, ВД қоректік ортасына 1 г/л ет-пептонды сорпа мен 1 г/л сахароза қосып даярланған модификацияланған (№ 5 орта) қоректік ортада 1 тəулік өсіргенде жəне ауаның технологиялық шығыны 0, 6V/мин (қоректік ортаның көлеміне шаққанда) болған жағдайда ғана түзеді. А4 ассоциациясының құрамына кіретін микроорганизмдер культураларының əр қайсысын, жекежеке өсіру қажеттігі анықталды. Микроорганизмдерді жеке өсірген кездегі ассоциацияның мұнайтотықтыру белсенділігі 54,7 %, ал бірге культивиргенде – 18,2 % болды. Arthrobacter sp. 24, К-3 и П-1 бактериялары мен Candida sp., дрожжысынан тұратын, А5 жəне Arthrobacter sp. 24, К-3 жəне П-1 бактерияларынан тұратын А6 ассоциацияларының биомасса жинақтауына жағдайлар іріктеп алынды. Микроорганизмдердің биомассаны жинақтауы үшін қоректік орта ретінде, ВД мен ЕПС-ға қосымша 1 г/л ет-пептонды сорпа мен 1 г/л сахарозны қосылған орталар сыналды. Сынаққа алынған культуралар қоректік орталардың екі нұсқасында да бірдей жақсы өсетіні белгілі болды. Соның ішінде Arthrobacter sp П-1 культуралары екінші тəулікте клеткаларды мейілінше көп жинақтаса, Candida sp., Arthrobacter sp. 24 жəне К-3 – бірінші тəулікте жинақтайды. А5 ассоциациясын дайындауда микроорганизмдер үйлесімділігінің 9 нұсқасы алынды (таблица 2). Кесте 2 – Микроорганизмдерді өсіру əдісінің А5 ассоциациясы бактерияларының титрі мен мұнайтотықтыру белсенділігіне əсері Бақылаумен салыстырғанда Тəжірибе нұсқалары Ассоциация титрі, (бірге өсіру), мұнайтотықтыру КОЕ/мл белсенділігінің өсуі, %. 6 24+К-3+П1;Candida sp. 5,6×10 22±0,90 39 24+К-3; П-1+Candida sp. 4,1×107 17±0,06 7 24+ Candida sp; К-3+ П-1 2,4×10 12±0,07 24+ П-1; К-3; Candida sp. 4,6×108 31±0,30 24+К-3 + Candida sp; П-1 3,9×107 9±0,02 24+ Candida sр+П-1; К-3 2,8×107 30±0,40 Candida sр.+ П-1+ К-3; 24 3,0×107 30±0,60 Раздельное культивирование 1,8×108 30±0,50 А5 ассоциациясы нұсқалары ішінде микроорганизмдер клеткаларын жинақтауы жағынан ең тəуірі, культуралары жеке культивирлеп, соңынан теңдей қатынаста (2,0×108) қосып араластырылған 8нұсқа мен Arthrobacter 24 Arthrobacter П-1-мен бірге жəне Arthrobacter К3-ды Candida sp.-мен өсіріліп, соңынан теңдей қатынаста (4,6×108) араластырылған 3-нұсқа болатыны анықталды. Культураларын жеке-жеке өсіріп бірдей қатынаста араластырып дайындалған ассоциация, барлық 4 штамы бірге өсірілген ассоциацияға қарағанда мұнайтотықтыру белсенділігі жағынан 30 %-ға артық болды. Arthrobacter 24, Arthrobacter П-1 жəне Candida sp. культуралары бірге, ал Arthrobacter К3 жеке өсірілген 6-нұсқада, жəне де Arthrobacter К3, Arthrobacter П-1 жəне Candida sp. бірге, ал Arthrobacter 24 жеке өсіріп, соңынан 3:1 қатынаста араластырылған 7-нұсқада да дəл осындай нəтиже алынды. А6 ассоциациясының құрамына кіретін культураларды жеке-жеке өсірілгенде, оның мұнайтотықтыру – 26%, ал 24 жəне П-1 культураларын бірге, К-3 культурасын жеке өсіріліп, соңынан араластырылған нұсқада – 27 % болды. Сонымен, зерттеу барысында А4, А5 жəне А6 ассоциацияларының құрамына кіретін микроорганизмдерді культивирлеу жағдайлары жəне оларды бірге культивирлеу үшін ең қолайлы қатынастыры іріктелініп алынды. 1. Звягинцев Д.Г., Умаров М.М., Чернов Ю.И. и др. Микробиологические сообщества и их функционирование в процессах деградации и самовосстановления почв / Деградация и охрана почв/ Под ред. Г.В.Добровольского.М.Изд-во МГУ, 2002.С.441-445. 2. Гаврилова Н.Н., Айткельдиева С.А., Ратникова И.А., Треножникова Л.П., Баякишева К., Хасенова А.Х. Подбор условий культивирования нефтеокисляющих бактерий // Биотехнология. Теория и практика. – 2010. - №3. – С. 15-18. *** Подобраны условия культивирования микроорганизмов, входящих в состав ассоциаций А4, А5 и А6 и оптимальные их соотношения для совместного культивирования. **** The conditions for cultivation of microorganisms belonging to theassociation, A4, A5 and A6 and their relationship to the optimal co-cultivation. Р.К. Блиева ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ И СЕЛЕКЦИЯ МИКРОМИЦЕТОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ФЕРМЕНТОВ (РГП «Микробиология жəне вирусология институты» КН МОН РК) В статье представлены результаты многолетних исследований о путях увелечения биосинтеза жизненно необходимых для различных отраслей промышленности и сельского хозяйства энзимов. Показана необходимость изучения физиологической регуляции направленного биосинтеза ферментов, разработан новый более продуктивный и экономичный способ выращивания микромицетов на подложке в нитчато-губчатый структуре. Разработан перспективный способ селекции микромицетов-продуцентов ферментов, позволяющий не только восстановить утерянную активность культур, но и увеличить ее активность от 3 до 10 раз, а в некоторых случаях до 30 раз. Одной из центральных задач современной микробиологии является направленный биосинтез таких востребованных и важных активных веществ как ферменты и разработка способов повышения их образования. При отработке технологии получения ферментов необходимо стремиться к возможно более полному использованию биологического потенциала применяемых штаммов микроорганизмов и вести процесс биосинтеза с максимальной интенсивностью. Зная основные биологические возможности выбранных продуцентов ферментов и параметры их образования, можно создать необходимые условия культивирования и получить заданную производительность ферментационного процесса. Значительное количество гидролитических ферментов образуют некоторые штаммы микромицетов и бактерий. Но большей агрессивностью в расщеплений органических субстратов 40 обладают микромицеты благодаря наличию более мощного биологического потенциала, определяемого набором и количеством образуемых ферментов. Вот почему при производстве ферментов предпочтение при выборе продуцентов отдают микромицетам. Для нормального развития продуцентов ферментов существенное значение имеет правильное выявление оптимальных компонентов питательной среды и их концентраций. Одной из важных составляющих питательной среды является источник углерода. Он служит не только питательным субстратом для микроорганизмов и источником энергии, но и способен иногда вызывать индукцию образования гидролитических ферментов, таких как к примеру амилаза и пектиназа. Нами ранее было установлено, что культура Asp.oryzae 3-9-15 для своего роста и развития, а также для максимального достижения образования α-амилазной активности в качестве источника углерода использует крахмал и продукты неполного его гидролиза. Для максимального биосинтеза пектинрасщепляющих ферментов (ПР) нами установлено также, что необходимо присутствие в среде не только легкоусвояемых углеводов, но и пектина, который индуцировал биосинтез фермента у Asp.niger П и Asp.awamori. Образование ферментов заметно репрессировалось при концентрации легкометаболизируемых источников углерода свыше 2%; в этом случае наблюдали разное понижение процесса образование ПР ферментов. При использовании в качестве источника углерода смеси лактозы с пектином, мы наблюдали максимум образовали ферментов у Asp.niger П (табл. 1). Таблица 1. Влияние источников углерода и их смесей в среде на рост культуры и образование ПР ферментов свободными клетками Asp.niger П Источники Вес сухого ПкА, Продуцирующая Добавлено пектина Продуцирующая углерода в мицелия ед/мл способность 1 г (0,5%) способность, среде мицелия, ед/г ед/г мицелия Вес сухого Пк А, мицелия,г ед/мл Пектин 0,332 4,18 12,59 Крахмал 0,210 0,74 3,52 0,700 4,24 1,42 Инулин 0,280 0,50 1,79 0,700 1,98 2,83 Лактоза 0,020 0 0,330 10,14 30,72 Сахароза 0,270 0,84 3,11 1,190 3,52 2,68 Мальтоза 0,265 0,72 2,72 0,680 2,40 3,52 Фруктоза 0,140 0 0,700 4,06 5,80 Галактоза 0,9 0 0,470 1,44 3,06 Глюкоза 0,225 0 0,680 2,28 3,35 Глицерин 0,020 0 0,540 1,26 2,33 Это объясняется тем, что пектин индуцирует биосинтез ферментов, скорость потребления которого выше, чем лактозы. Лактоза же медленно гидролизуется и при постепенном потреблении усиливает биосинтез ферментов. Малые концентрации высвобождающейся глюкозы и галактозы не вызывают репрессии синтеза пектинрасщепляющих ферментов. При использовании же в качестве источника углерода пектина в сочетании с легкометаболизируемыми углеводами в больших концентрациях наступает катаболитная репрессия. Поэтому легкометаболизируемые источники углерода необходимо подавать в среду в ограниченном количестве. Известные до сих пор способы культивирования продуцентов гидролитических ферментов, создающие благоприятные условия для роста и развития культур микроорганизмов, содержат оптимальный источник углерода, азота и минеральные соли. Однако недостатком этих способов является невысокий уровень биосинтеза гидролитических ферментов при пышном росте продуцентов. Для увеличения биосинтеза α-амилазы, повышения продуктивности культуры целесообразно применять ингибиторы роста микромицетов – производные оксифосфоната гетероциклического ряда (табл. 2). Таблица 2. Влияние различных концентраций производных нитразоацетона на образование αамилазы Asp.oryzae 3-9-15 Испытуемые Амилолитическая активность, ед/мл вещества Дозировки, г/л без 0,00015 0,0005 0,002 0,008 0,015 добавления Контроль без 4,24 добавления 41 испытуемых веществ… ИЗО-1 10,0 12,0 9,0 нет роста ИЗО-2 9,0 11,0 9,0 нет роста ИЗО-3 7,0 9,0 нет роста ИЗО-4 7,0 9,0 1,0 нет роста ИЗО-5 1,2 5,0 нет роста Эти ингибиторы задавали в среду в количестве 0,0005 г/мл, что приводило к увеличении биосинтеза α-амилазы более чем в 2-3 раза [1]. Действие этих веществ основано на угнетении роста культуры, вызывая изменения структуры клетки. Ультраструктурные исследования показали, что клетка, борясь за выживания, образует дыры в плазмолемме. Эти образования возможно способствовали большему вытеканию образовавшихся ферментов из клетки в культуральную жидкость, увеличивая ее активность в 2-3 раза. Усиление синтеза ферментов достигалось нами не только путем подбора активных продуцентов, введением специфических индукторов, подбором состава питательной среды и оптимальных значений рН роста в процессе культивирования, но и путем введения неспецифических эффекторов, ингибиторов и активаторов роста микромицетов [2]. Изучение физиологии микромицетов тесным образом связано с методом культивирования. В условиях глубинного культивирования мицелиальные грибы растут в виде пеллетов. Нами обоснован новый принцип культивирования микромицетов, отличный от традиционного глубинного метода культивирования. В предложенном методе культивирования микромицеты растут на подложке в глубинных условиях роста в рыхлой нитчато-губчатой структуре. Создавая условия благоприятные для их роста, мы преследовали цель формирования вегетативного мицелия при глубинном культивировании клеток в естественной нитевидной форме без скручивания гиф в шарики путем удлинения и разветвления нитей в линейном направлении на поверхности подложки с максимумом доступа к клеткам кислорода и питательных веществ [3;4]. Разработанный метод культивирования иммобилизованных клеток в нитчато-губчатых структурах отрабатывался на промышленных штаммах продуцентов гидролитических ферментов – αамилазы и ПР фермент. Asp.niger П и Asp.oryzae 3-9-15 и подтвержден на продуцентах протеолитически ферментов, коллагеназы и лиазы (Asp. awamori 21/96, Penicillium cyclopium-2-11) [5;6]. Вследствие ряда факторов: иммобилизации клеток и роста продуцентов в нитчато-губчатой структуре, накопления значительной концентрации активной биомассы на подложке, биосинтеза ферментов системой клеток, увеличением клеточной проницаемости, происходит возрастание ферментативной активности культуральной жидкости от 2 до 10 раз (в зависимости от этапов процесса), удлинение стационарной стадии активного ферментообразования в 3-5 раз; значительно увеличивается общий срок культивирования продуцента, обеспечивается многократность использования иммобилизованной культуры и получения целевого продукта. Производство ферментных препаратов, основанное на использовании микромицетов – наиболее мощных производителей энзимов, может быть рентабельным лишь при условии применения высокоактивных продуцентов. Поэтому задача получения высокоактивных штаммов продуцентов ферментов является первоочередной и актуальной [7-10]. В отличие от непрерывного культивирования микроорганизмов, полунепрерывное выращивание иммобилизованной культуры с периодической сменой питательной среды создает условия для формирования гетерогенной системы популяции с многообразием вариантов. Изменчивость, формирование большого разнообразия микромицетов в условиях иммобилизации и полунепрерывного культивирования является установленным нами фактом. Среди множества вариантов, возникших в процессе длительного выращивания иммобилизованной культуры отбирались только те, которые были намного активнее по ферментообразующим свойствам [11,12]. Таким образом, создан один из эффективных методов селекции микромицетов – продуцентов ферментов. Метод основан на отборе новых более активных форм микроорганизмов из непрерывно выращиваемой длительное время на твердой подложке иммобилизованной культуры в условиях полунепрерывной смены питательной среды. Этот метод позволил получить высокоактивные штаммы микромицетов по протеолитической, коллагеназной и лиазной активности. 1. Азербаев И.Н., Блиева Р.К. и др. Способ культивирование продуцентов амилазы. Патент РФ №513074. 2. Блиева Р.К. Абиюров К.И. и др. Способ получения пектиназы. Патент РФ №696051. 42 3. Steliana Clapco. Селекция некоторых штаммов микромицетов продуцентов пектолитических ферментов и оптимизация условий развития и биосинтеза: Автореф….. докт.биол.наук. – Румыния, 2006. – 26 с. 4. Блиева Р.К. Устройство для культивирования микроорганизмов в нитчато-губчатой структуре. Патент РФ №1047954. 5. Блиева Р.К. Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение преимущества культивирования микромицетов-продуцентов ферментов в нитчато-губчатой структуре перед пеллетами (Биологические подходы к решению актуальных проблем…) Кызылорда, - 2011. - С. 111-114. 6. Сафуани Ж.Е. Биосинтез протеолитических ферментов иммобилизованной культуры Aspergillus awamori 2-10 и использование их для мягчения конского мясо: Автореф. …канд.биол.наук. – Алматы, 2005. – 17 с. 7. Калиева А.К. Penicillium cyclopium 2-11 пектинлиаза ферменттерінің биосинтезі жəне оларды синтетикалық жуғыш заттарда іс жүзінде қолдану: Автореф. …канд.биол.наук. – Алматы, 2006. - 17 с. 8. Шигаева М.Х. Селекция дрожжей. – Алма-ата: Наука, 1975. – 150 с. 9. Steliana Clapco. Селекция некоторых штаммов микромицетов продуцентов пектолитических ферментов и оптимизация условий развития и биосинтеза. - Автореф…. докт.биол.наук. – Румыния, 2006. – 26 с. 10. Михайлова Р.В., Семашко Т.В., Лобанок А.Г. и др. Спонтанная изменчивость Penicillium funiculosum ( штамм БИМ 7-15) – продуцента глюкозооксидазы // Микробиология и фитопатология. – 2001. – Т.35. – Вып.5. – С. 73-79. 11. Михайлова Р.В., Жуковская Л.А., Лобанок А.Г. Изучение спонтанной изменчивости Penicillium adamezii ЛФ F2044 – продуцента глюкозооксидазы // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. – Т. 43. - №2. – С. 229-233. 12. Блиева Р.К., Искакбаева Ж.А. Селекция микромицетов-продуцентов ферментов // Биотехнология. Теория и практика, - 2008. - №2. - С. 24-30. *** Бұл мақалда көп жылдар бойы əртүрлі өндіріс аумағына жəне ауылшаруашылықта қолданылатын энзимдердің биосинтезін жоғарылату жолдары зерттеулеріне нəтиже берілген. Ферменттердің мақсатты биосинтезі үшін физиологиялық бақылау жүргізілуі керек екені көрсетілген жəне микромицеттерді экономикалық жағынан тиімді əрі өнімділігін жоғарылатыу мақсатында жіпті-губкалы құрылымдағы табаншаларды қолдану əдісі өңделген. Ферменттердің микромицетпродуценттерінің жоғалған белсенділігін қалпына келтіретін жəне белсенділігін 3-тен 10 есеге дейін көтеретін, кейбір жағдайда 30 есеге дейін жоғарылататын тиімді селекцияның əдісі өңделген. УДК 579:631.811.98 Ж.Т. Ботбаева, А.П. Науанова, Р. Ж. Əбдукерім РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОГО БИОФУНГИЦИДА – СТИМУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ НА ОСНОВЕ МИКРООРГАНИЗМОВ (Казахский агротехнический университет им. С Сейфуллина, e-mail: zhanar.b.t@mail.ru) В этой статье представлены методы разработки эффективного биофунгицида на основе селекционных активных штаммов бактерий рода Bacillus, которые были генотипированы по гену 16s РНК. Определено распространение и развитие фузариозно-гельминтоспориозной инфекции, а также корневой гнили зерновых культур. Определена биологическая и выявлена хозяйственная эффективность использования биофунгицида в технологиях выращивания пшеницы. Заболевания растений являются одним из факторов, серьезно ограничивающих продуктивность сельского хозяйства во всем мире. Ежегодный ущерб, причиняемый фитопатогенными микроорганизмами, значительная часть которых представлена паразитическими грибами, составляет, по разным оценкам, от 15 до 20% общей продуктивности мирового растениеводства [1]. Сегодня практически нет незараженных семян и, в зависимости от погодных условий, в период вегетации семена могут быть заражены до 70%. В семенном фонде большинства хозяйств, практически отсутствует здоровый материал, почти каждая партия семян в той или иной мере заражена различными патогенными микроорганизмами. Так, на ячмене преобладают Bipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker, виды родов Altemaria, Fusarium. Во влажные годы в общем комплексе грибов на семенах ячменя встречаемость Bipolaris sorokiniana может достигать 47,6%, видов р. А1ternaria – 31,7%, p. Fusarium – 17,5%; на озимой пшенице – видов p. Alternaria – 51,7%, p. Fusarium – до 15%. Пораженность семян различных сортов яровой пшеницы находится в пределах 47,5 – 62,3%, из них p. Fusarium – 23 – 37,5%, р. Altemaria – 10 – 34,4% [2, 3]. В настоящее время стратегия биологического метода защиты растений от болезней не ставит задачу полного уничтожения вредных организмов, а ориентирует на регулирование популяции патогена на уровне ниже экономического порога вредоносности /4/. В связи с этим применение микробиологических средств защиты растений требует глубокого изучения биологических особенностей взаимоотношения патогена с растением – хозяином и почвенным микробным ценозом. В борьбе с грибными болезнями сельскохозяйственных культур перспективно использование микробов – антагонистов. Они снижают пораженность растений болезнями, стимулируют рост и развитие, увеличивают урожайность, не загрязняют окружающую среду [3, 4, 5]. Против возбудителей корневой гнили разработаны способы обогащения ризосферы зерновых культур антагонистами путем обработки 43 семян фунгицидами [6]. Поэтому разработка эффекивныхфунгицидов на основе полезных микроорганизмов-антагонистов в настоящее время является актуальной задачей защиты растений от заболеваний. Цель исследований – разработать на основе селекционных активных штаммов бактерий рода Bacillus эффективного биофунгицида от фузариозно-гельминтоспориозной инфекции зерна и корневой системы. Материалы и методы исследования Полевые опыты были проведены на полях ТОО «Нива» Акмолинской области Северного Казахстана. Отбор почвенных образцов проводили методом конверта на глубину пахотного слоя (0-10, 10-20, 20-30 см). Для постановки модельного эксперимента использовали емкости со стерильной почвой по 200 гр. в каждом варианте, затем почву инокулировали суспензией из консорциума фитопатогенных грибов Fusarium heterosporum, Fusarium oxysporum, Bipolaris sorokiniana перемешивали стерильным шпателем и добавляли наполнитель в количестве 20 гр., затем вносили по 20 мл культуральной жидкости 3-х суточной культуры микроорганизмов. Для получения биомассы фитопатогенных грибов использовалась питательная среда Чапека-Докса, после стерилизации в среду добавлялось небольшое количество спор грибов. Затем колбы ставились в термостатируемый шейкер при 30С0 130 об/мин и культивировали 7 суток. В качестве исследуемых объектов были использованы два консорциума на основе разных штаммов микроорганизмов рода Bacillus, которые были отобраны по антагонистической активности. В качестве наполнителей консорциумов подобран наполнитель - цеолит. Консорциум №1состоит из Bacillus шт. 9, шт. 29, шт. 31, шт. 2+цеолит). Консорциум №2состоит из Bacillus шт. 18, шт. 46, шт. 31, шт. 9+цеолит. Выделение ДНК из исследуемых штаммов-антагонистов провели с помощью специального набора фирмы «Fermentas». Чтобы увидеть фрагменты выделенного ДНК амплифицированных фрагментов провели электрофорез при напряжении 5V/см3 в течение 1 часа. Для проведения амплификации 16s РНК с помощью прямого праймера — AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG и обратного праймера - GGA CTA CCA GGG TAT CTA AT. Очистка сиквенс продукт продуктов провели с помощью Ac Na (ацетат нария). Микологический анализ пораженных частей растений и семян проведен по методике М.К. Хохрякова [7] и Н.А. Наумовой [8]. Для идентификации видового состава фитопатогенных грибов используются определители: В.И. Билай [9], М.А. Литвинова [10], Б.А. Хасанова [11], монография Б.Д. Ермековой [12]. Наработку эффективного фунгицида проводили в ферментере «Bioflo 110» объемом 2 литра. Интенсивность поражения пшеницы корневой гнилью устанавливали по 4-х бальной шкале [13]. Результаты и обсуждение Для идентификации были взяты 6 штаммов микроорганизмов показавшие наиболее лучшие результаты по антагонистической активности. Идентификация бактерий вида Bacillus основана на обнаружении и амплификации фрагмента гена с помощью полимеразной цепной реакции, которая представляет собой многократное цикличное повторение трех процессов: тепловая денатурация ДНК в исследуемой пробе; гибридизация (отжиг) исследуемой ДНК со специфическими олигонуклеотидными зондами (праймерами); синтез комплементарных цепей ДНК с помощью термостабильной ДНКполимеразы. выделение суммарной ДНК; ПЦР, то есть реакция амплификации фрагмента гена 16s РНК, электрофорез продуктов ПЦР в агарозном геле. Подробное описание идентификации с помощью молекулярно-генетических методов указанных штаммов ранее нами была опубликована [14] . На основе проведенных молекулярно-генетических методов исследуемый штаммы рода Bacillus sp.18, Bacillus sp. 46 относятся к виду Bacillus pumilus, что максимальная их гомология составляет 99,0%, штаммы Bacillus sp.2 Bacillus sp.29 относятся к Bacillus subtilis (99,%), и штаммы Bacillus sp.31, Bacillus sp.9 гомологичны со штаммом Bacillus cereus (99 %). Для разработки эффективного фунгицида необходимо наработка биомассу в ферментере. Наработку проводили в ферментере «Bioflo 110» объемом 2 литра (рисунок 1а). По окончании процесса культивирования, отбирают пробы для определения количества бактерий и отсутствия посторонней микрофлоры. Культуральную жидкость из ферментера передают в передвижные емкости. Далее бактериальную суспензию (рисунок 1б) концентрировали с помощью центрифуги при 4000 об/мин., в течение 30 мин для хранения в разных температурных режимах (-200 и -40 ). 44 а) б) в) Рисунок 1- Процесс культивирования в ферментере штаммов– антагонистов из рода Bacillus а) Процесс наработки микробной суспензии в ферментере «Bioflo 110» б) передвижные емкости для приема культуральной жидкости из ферментера в) Концентрированные микробные суспензии На полях ТОО «Нива» заложен полевой опыт в пяти вариантах в трехкратной повторности с растениями пшеницы инокулированых биофунгицидным препаратами консорциум №1 и консорциум №2. Опыты заложены на естественном инфекционном фоне. В качестве контроля использовали посевы пшеницы без инокулирования штаммами бактерий. В текущем году исследований распространение и развитие корневой гнили пшеницы наблюдалось в течение всего вегетационного периода. В условиях 2011 года развитие болезни в фазу кущения колебалось в пределах 17,0 – 22,2%. Наибольшее распространение корневых гнилей в фазу кущения варьировало от 33,3% до 52,6% (таблица 1). Таблица 1 – Распространение и развитие корневых гнилей в посевах пшеницы, 2011 г. Вариант Распространение болезни, % Развитие болезни, % кущение полная кущение полная спелость спелость Контроль 57,7 35,4 21,5 13,7 Консорциум 1 52,6 27,2 17,5 8,8 Консорциум 2 48,9 22,7 17,0 6,8 В условиях Северного Казахстана яровые зерновые культуры, в частности пшеница, ежегодно поражаются корневыми гнилями (возбудители – гриб Bipolaris sorokiniana и некоторые виды рода Fusarium). Повреждение корневой системы, эпикотеля и основания стебля зачастую приводит к гибели растений или отрицательно влияет на формирование элементов структуры урожая [15]. Развитие болезни в фазу полной спелости находилось в пределах 6,8- 8,8%. Наибольшее распространение и развитие корневых гнилей на момент уборки урожая отмечено на контрольном варианте 35,4% и 13,7% соответственно. Биопрепараты ограничили развитие болезни в среднем на 3,8-21,3% (таблица 2). Таблица 2 – Биологическая и хозяйственная эффективность использования биопрепаратов против корневой гнили в посевах пшеницы, 2011 г. Вариант Биологическая Хозяйственная эффективность, эффективность, % % Контроль Консорциум 1 21,3 3,8 Консорциум 2 20,8 8,6 Из таблицы 2, можно сделать вывод, что против корневой гнили наиболее эффективным фунгицидом является - Консорциум 2. Хозяйственная эффективность биофунгицида Консорциум 2 превышает на 8,6% контрольного варианта. 45 Заключение Таким образом, можно сделать вывод, что в условиях острозасушливого 2011 года внесение в почву биологического фунгицида снижает распространение корневой гнили на 5,1-24,4% по сравнению с контролем в фазу кущения. Распространение болезни колебалось в пределах 22,7-52,6%. Несмотря на это к фазе полной спелости выявлено снижение отмеченных показателей на вариантах, где семена были обработаны Консорциумами 1 и 2, где развитие болезни не превышало 10-12%. В 2011 году фунгицидная активность препаратов привела к снижению корневой гнили на 4-10%. Биологическая эффективность, т.е. процентное снижение развития болезни на опытном варианте по сравнению с контролем Консорциумов 1 и 2 против корневой гнили пшеницы была высокая (20,821,3%). Полученные результаты расширяют область использования экологически безопасных технологий защиты растений. Среди биологических средств защиты растений от вредных организмов антагонисты представлены весьма слабо. Полученные нами данные частично восполняют этот пробел. 1.Сатубалдин К.К., Менликиев М.Я., Сангинас Л.А., Никитин С.Б. Интеграл – высокоэффективный биологический препарат комплексного действия //ЗАО научно производственная система «Элита-комплекс». - 2002. – С.3–4. 2.Санин С.С., Черкашин В.И., Назарова Л.Н., Соколова Е.А. Фитосанитарная экспертиза зерновых культур. - М.: ФГНУ «Росинформагротех». - 2002. – 140 с. 3.Долженко В.И., Котикова Г.Ш., Здрожевская С.Д. Средства защиты растений для предпосевной обработки семян. – Санкт-Петербург: Всероссийский НИИ защиты растений (ВНИИ). - 2001. – 54 с. 4.Пересыпкин В.Ф. Сельскохозяйственная фитопатология. – М.: Агропромиздат. - 1989. – 480 с. 5.Левитин М.М., Тютерев С.Л. Грибные болезни зерновых культур // Защита и карантин растений. – 2003. – №11. – С. 48. 6.Зинченко В.А. Химическая защита растений: средства, технология и экологическая безопасность. – М.: Колос С. 2006. – 232 с. 7. Хохряков М.К. Морфолого-биологическое обоснование систематики грибов рода Helminthosporium (sensu lato) на злаках. -Aвтореф. докт. биол. наук. – Ленинград. - 1953. - 30 с. 8.Наумова Н.А. Анализ семян на грибную и бактериальную инфекцию. – М.: - 1960. –37 c. 9.Билай В.И. Фузарии. Киев. - 1977. – 442 с. 10. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов. Л.: - 1967. – 303 с. 11. Хасанов Б.А. Обзор грибов из рода Bipolaris Shoem // Микология и фитопатология. - 1991. - Т.25. - вып.4. - С. 360366. 12. Ермекова Б.Д. Почвенные грибы и обыкновенная корневая гниль колосовых зерновых. - Алма-Ата: Наука. - 1988. 144 с. 13. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. - М.: Агропромиздат. - 1985. -351 с. 14. Ботбаева Ж.Т. и др. Идентификация почвенных штаммов бактерий-антагонистов рода Bacillus молекулярногенетическими методами //Вестник КАТУ. - 2011. - №1 (67). - С.44-49. 15. Егорычева М.Т., Бурлакова С.В. Эффективность предпосевного протравливания семян // Защита и карантин растений.– 2009. - №8.- С. 43-44. *** Бұл мақалада 16s РНҚ гені бойынша генотипирленген белсенді Bacillus туысына жататын штамдары негізінде дайындалған тиімді биофунгицидті өңдеу əдістері көрсетілген. Астық тұқымдастарындағы фузариозно-гельминтоспориозды жəне тамыр шіріктері инфекцияларының дамуы жəне таралуы анықталған. Биофунгицидтерді астық тұқымдастарының аталған ауруларына қарсы қолдану кезіндегі биологиялық жəне шаруашылық тиімділігі анықталған. *** This article shous hou to develop effective biofungicida based on brecding strains of bacteria Basillus which were genotipirovany RNA gene 16 S. Defined the dissemination and development of fuzariozno-gel’mintosproiznoj infection, as well as root rot agriculture crops. Define biological and economic efficiency of the utilization of biofungicida identied in wheat cultivation technology. УДК 608.2:62. М.Т. Велямов, Н.Н. Дарахунова, Р.Ж. Бержанова ОБОГАЩЕНИЕ ОВОЩНЫХ НАПИТКОВ ПЕКТИНОМ ЯВЛЯЕТСЯ ЖИЗНЕННО ВАЖНЫМ (ТОО «КазНИИ перерабатывающей и пищевой промышленности»1 КАИ МСХ РК, Казахский национальный университет им. аль-Фараби2) В настоящей работе проанализированы результаты исследований по актуальности производства овощных напитков и эффективности получения ферментативным методом пектина, основанный на микробиологическом способе извлечения, из выжимок овощей и обогащения им напитков для получения полноценных с оздоровительными свойствами продуктов. В современных условиях роста стрессовых ситуаций и ухудшения экологической обстановки важное место в питании человека отводится биологически ценным продуктам переработки 46 растениеводческого сырья, в частности овощей, способствующих снижению уровня заболеваний и повышению иммунитета жизнедеятельности человеческого организма [1]. Продукты полученные из столовой свеклы и моркови, из-за содержащихся в них углеводов, витаминов, пектина, и других жизненно важных соединений, являются весьма полезными при профилактике и лечении гипертонической болезни, атеросклероза, заболеваний сердечно - сосудистой системы, благоприятствующего процессу кроветворения, страдающих заболеваниями печени, при лечении злокачественных новообразований, лечения глазных болезней, при полиартритах, нарушениях минерального обмена, дисбактериозах кишечника, нефритах и др [2]. Учитывая выше отмеченное использование данных продукций в ежедневном потребительском рационе людей весьма необходимо. Однако, указанная проблема, в условиях Казахстана остаётся нерешенной и крайне злободневной. Основной причиной, которой является то, что до сих пор не налажена эффективная технология переработки отмеченных овощей в Казахстане. Имеющиеся технологии переработки столовой свеклы и моркови не совершенны, а следовательно полезные показатели полученных продукций низкие и потребительская их восстребованность сниженна. Одним из аспектов улучшения их качественных показателей и степени повышения рентабельности их переработки является более углубленное совершенство технологии их переработки. По литературным сведениям известно, что в выпускаемых продукциях (соках и напитках) из столовой свеклы и моркови почти не содержится такой ценный продукт, как пектин, хотя в них он содержится в большом количестве[3]. Пектиновые вещества это высокомолекулярные гетерополисахариды, главным структурным компонентом которых является a-D-галактуроновая кислота (полигалактуронид). Кроме галактуроновой кислоты в значительно меньших количествах (10-17%) в составе пектиновых веществ присутствуют также D-галактоза, L-арабиноза, L-рамноза и другие нейтральные моносахариды. Пектиновые вещества открыты в 1825 году; название происходит от греч. слова pĕctós свернувшийся, застывший. Они содержатся в большом количестве в плодах, клубнях и стеблях растений; входят в состав межклеточного вещества, придают клеткам пластичность и играют важную роль в процессах жизнедеятельности. При этом пектин защищает организм от воздействия радиоактивных и тяжелых металлов (свинца, стронция и других), задерживает развитие вредных микроорганизмов в кишечнике, способствует выведению из организма холестерина. Пектиновая кислота может использоваться в качестве носителя лекарственных веществ. Пектины оказывают противоязвенное действие и являются легким слабительным, а с различными металлами образуют комплексные соединения - хелаты, которые легко выводятся из организма. Поэтому продукты, содержащие пектины, особенно показаны людям, проживающим на радиоактивно зараженной территории. Пектиновые вещества широко используют в кондитерском производстве, хлебопечении, сыроварении, текстильной промышленности. Кроме того, его присутствие в продукциях необходимо для стабильного сохранения комплекса жизненно важных витаминов и микроэлементов, а также для их полноценного усвоения организмом [4]. Поэтому весьма важна разработка эффективной технологии извлечения пектина из них и обогащения полученных продукций. По литературным данным известно, что в процессе сокового производства, они не растворяясь переходят почти всецело в продукты их переработки, в данном случае в их выжимку[5]. В промышленности пектины получают из яблочных выжимок, кожуры цитрусовых плодов, свекловичного жома, вымолоченных корзинок подсолнечника. В данном случае используются различные технологии получения пектина. В большинстве пектиновые вещества из растительного сырья извлекают при нагревании обычно 0,1 н раствором фосфорной или другой кислоты; экстракт концентрируют, фильтруют и осаждают пектиновые вещества спиртом. Для очистки используют образование пектатов, из которых пектиновые вещества освобождают действием кислот. Количественное определение проводят гравиметрическим методом (осаждение спиртом), методом потенциометрического титрования, основанного на взаимодействии пектовых кислот с гидроксидом кальция и т.д [6]. Однако в современных условиях наиболее перспективным и эффективным является ферментативный метод выделения пектина, основанный на микробиологическом способе извлечения. Микробиологический способ получения пектина основан на кислотно-термическом гидролизе и последующим спиртовым осаждением из гидролизата. Получение пектина зарубежными компаниями в настоящий момент основано именно на такой технологии. По оценкам многих экспертов за рубежом, производство пектина по классической технологии целесообразно лишь при объемах производства не менее 2000 тонн пектина в год из-за огромных 47 затрат на производство, утилизацию кислых сред и амортизационные отчисления на восстановление технологического оборудования. Использование ферментных препаратов существенно упрощает технологический процесс получения пектина и его аппаратурное оформление, сокращает расход этанола на стадии выделения пектина. С этой целью используют целлюлазы и гемицеллюлазы или пектолитические ферменты. Гидролиз пектолитическими ферментами приводит к удалению с помощью эндополигалактуроназ фрагментов полигалактуроновой кислоты из состава протопектина. При этом структура комплекса целлюлозы и гемицеллюлозы не затрагивается, что физически затрудняет процесс экстракции пектина и позволяет получать его препараты с более высоким относительным содержанием полигалактуроновой кислоты. В этом варианте технолгии важно ограничить степень гидролиза пектина в процессе экстракции, чтобы получить продукт достаточно высокой молекулярной массы. Большинство полигалактуроназ эндотипа синтезируются в сочетании с пектинэстеразой, которая необходима для проявления их активности. В препаратах пектолитических ферментов соответственно присутствуют оба вида фермента. При гидролизе растительного сырья пектолитическими препаратами происходит не только вырезание фрагментов полигалактуроновой кислоты, но и частичная деэтерификация последней. Это оценивается положительно в тех случаях, когда получают пектин лечебно-профилактического назначения высокой комплексообразующей способностью. При получении пектинов-структурнообразователей важно сохранить высокую степень этерификации, поэтому целесообразно использовать первый путь ферментативного гидролиза сырья. При гидролизе целлюлозы облегчается выход комплекса полигалактуроновой кислоты и гемицеллюлоз из клеточных стенок. Гидролиз гемицеллюлоз приводит к повышению содержания полигалактуроновой кислоты в выделяемом пектине, при отсутствии в используемых ферментных препаратах пектолитических ферментов полигалактуроновая кислота пектина не расщепляется, а степень ее этерификации не изменяется. Получаемый пектин содержит частично метоксилированную полигалактуроновую кислоту, ковалентно связанную с фрагментами гемицеллюлозы, поскольку полное отщепление нейтральных полисахаридов обычно не достигается. Одновременно с этим из сырья выделяются растворимые формы пектина, если они не извлечены на предшествующих стадиях переработки сырья[7] Следовательно, отработка эффективных технологий извлечения пектина, щадящим ферментативным способом, из выжимок овощей, в частности из столовой свеклы и моркови, после их переработки, т.е. получения овощных соков, напитков, с последующим обогащением их пектиновым экстрактом, является весьма необходимым в технологическом режиме их производства. Как видно из отмеченного разработка глубокой технологии переработки овощей направленная на вытяжку из отходов производства напитков из овощей (столовой свеклы и моркови) используя, эффективный ферментативный способ извлечения пектина из их выжимом, с последующим обогащением полученной продукции, несомненно, повысит технологические качественные показатели продукции и их рыночную восстребованность, что является несомненно актуальной и жизненно важной. 1. Есполов Т.И., Мамышов М.М., Сулейменова Н.Ш. Современное состояние сельскохозяйственных угодий и перспектвы развития экологического образования в аграрном секторе республики Казахстан// Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана.-2010.-№ 7.- С.31-36. 2. Кусаинова А.Б. Текущее состояние и дальнейшие перспективы развития отраслей переработки сельхозпродукции.//Пищевая и перерабатывающая промышленность Казахстана.- №1.-2008.- С.2. 3. Широков Е. П., Полегаев В. И. Хранение и переработка плодов и овощей. – М.: Агропромиздат, 1989. 4. Токтосунова Б. Стабилизация пектином каротиноидов морковного сока // Пищевая промышленность.-2007.-№6.-С. 16-18 5. Левченко Б.Д. Использование полезных свойств пектиновых веществ в медицинской практике // Электротехнология пектиновых веществ: Тез. Докл. 4 н.-т. Сем.-К., 1993.- с.ЗО. 6. Бондарь С.Н., Голубев В.Н. Экстрагирование свекловичного пектина // Пищевая промышленность, 1992, №12, С.1819. 7. Голубев В.Н., Шелухина Н.П. Пектин: химия, технология, применение. - Москва, 1995,-387с. 48 М.Т. Велямов, Р.Ж. Бержанова, М.М. Амирбаева, А.А. Амангелді КӨКӨНІСТЕРДІҢ МИКРОБИОЛОГИЯЛЫҚ ЛАСТАНУЫНЫҢ МОНИТОРИНГІ КЕЗІНДЕГІ НЕГІЗГІ КӨРСЕТКІШТЕРДІ ЗЕРТТЕУ (ЖШҚ «Қазақ ҒЗИ қайта өңдеу жəне тағам өнеркəсібі» 1, əл-Фараби атандағы Қазақ Ұлттық университеті 2) Тағам жəне қайта өңдеу өнеркəсібінде жоғары сапалы өнімдерді кең көлемде алуда маңызды болып, негізгі бөлігін қолданылатын шикізаттың сапасы болып табылады. Зиянды заттардың саны айтарлықтай көп – бұл металлдар, пестицидтер, радионуклидтер, токсиндер, микроорганизмдер дəрілік препараттар жəне т.б. /1/. Бірақ, əр түрлі ластағыштардың (пестицидтер, ауыр металлдар, радионуклеотидтер жəне т.б.) əсерінен микроорганизмдер қауымдастықтарындағы фитотоксикалық қасиеттерге əкелетін өзгерістер басты қауіпті тудырады: олардың түрлік əркелкілігі артады, сандық реттелуі бұзылады, түрлік басымдылық өзгереді. Осының бəрі елдегі экологиялык жағдайдың нашарлауын көрсетеді жəне бұл тікелей адамның антропогенді іс–əрекетімен байланыстылығын анықтайды, дəлірек айтқанда, бұл ауылшаруашылық өнімдерінің, соның ішінде өсімдік шаруашылығындағы гербицидтер қалдықтары, ауыр металлдар мен микробиологиялық ластану жəне т.б. /2/. Көріп отырғанымыздай, өсімдік шаруашылығы өнімдерінің жарамсыздығын тудыратын негізгі себеп микроорганизмдер болып табылады. Көкөністердегі микроорганизмдердің көбеюін зерттей келе, көкөністерде болатын негізгі витаминдер көзі, микро жəне макроэлементтерге адам организміндегі иммундық жағдай тікелей тəуелділіггі анықталды. Берілген мақалада картоп, сəбіз, орамжапырақ, қызанақ көкөністерінің микробиодлогиялық ластануы бойынша мониторинг жүргізу арқылы жеке зерттеулер нəтижелеріне жəне əдебиет көздеріне негізделген аналитикалық ақпараттар берілген. Жоғарыда аталғандай, картоп жəне көкөніс дақылдарының тағамға жарамсыздығының негізгі себебі – сыртқы ортадан түскен микроорганизмдердің активті дамуы. Мысалы, орамжапырақтың сыртқы жаппырақтары 1 г топыраққа есептегенде 1-2 млн. микроорганизмдер қауымдастықтары болады. Одан да көп микрофлора картоп түйіндері мен тамыр жемістілерде болады, өйткені олар топырақта қалыптасады, ал 1 г топырақта 2-3 млрд. микроб клеткалары жəне адам үшін патогенді болып табылатын əр түрлі микроорганизмдер түрі кездеседі /3/. Көкөністердің бетінде өнімнің тез бұзылуына жəне олардағы токсиндердің түзілуіне алып келетін алып келетін ішек таяқшалары, сапрофиттер, протейлер, коккалар, актиномицеттер, зең саңырауқұлақтар, ашытқылыр жəне т.б. микроорганизмдер болады /4/. Жемістер мен көкөністерді сақтау кезінде қалыпты тіршілік процестерімен қатар түрлі микроорганизмдер əрекетімен жəне дамуымен болатын өзгерістер жүреді, бұл өз кезегінде, көкөністердің бұзылуы мен ауруына алып келеді. Ал қалыпты жағдайда өнімдердің беткі жағында ауру тудырмайтын эпифитті микроорганизмдер кездеседі. Көп жағдайда саңырауқұлақтардың түрлерінен, жиі бактериялар əсерінен ауру туындауы мүмкін /5/. Көкөністер мен өнімдердегі судың жəне қоректік заттардың жоғары мөлшерде болуы көптеген микроорганизмдер үшін қолайлы жағдай болып табылады сондықтан оларды булануды болдырмау үшін ауа ылғалдылығының жоғары (85-95 %) жағдайында сақтауды қажет етеді. Осының нəтижесінде аталған көкөністердің микроорганизмдер дамуының салдарынан бұзылуы оңай болады, яғни өнімдердің нағыз иммунитеті тез төмендейді /6/. Көптеген зерттеулер нəтижелері бойынша саңырауқұлақтардан (фитофтороз, фузариозды құрғақ шірік, фомозды шірік жəне т.б.) бактериалдық аурулардан (ылғал шірік, қара тұяқ, сақиналы шірік) жыл сайын 30% өнім ысрабқа ұшырайды /7/. Фитофтороз – өте кең таралған ауру тудырғыш, қауіпті картоп ауруы болып табылады. ауру қоздырушыс - саңырауқұлақ Phytophthora infestans (Mont) de Bary, ол қыс кезінде зақымдалған түйнектерде сақталады да бириншілік инфекция ошағы болып табылады. Түйнектердің зақымдалуы жинау кезінде, сонымен қатар, вегетация кезіндегі тамшылы су жаңбыры жəне өсу кезінде болады /8/. Фузариозды шірік – ауру құрғақ жəне ылғалды шірік түрінде дамиды. Құрғақ шірік кезінде сəбіздерде еніп кеткен ашық түсті дақтар байқалып , ұлпа ашық не ақшыл – қоңыр түсті болып, орта жағы қуыстанған күйде болады. Қоздырушылары: Fusarium: F.coeruleum, F. solani, F. sambucinum, F. oxysporum, F. Cumartii /9/. Сакиналы шірік – қоздырушысы Corynebacterium sepedonicum картоп өсірілетін негізгі аудандарда таралған. Өнім ыстабы 40% дейін жоғарылауы мүмкін /10/. 49 Ылғалды бактериалдық шірік – тамырөнімділердің бактериалдық ауруы. Зақымданған ұлпа ылғалды созылмалы болып, коптеген бактериядан тұрады да жағымсыз иіс түзелі. Əдетте тамырдың құйрақ жағынан басталады. Қоздырушысы – бактериялар туысына Pectobacterium. Corynebacterium, Pseudomonas, Bacillus жатады. Ылғал шіріктен жыл сайын 10% өнім ысрабқа ұшырайды, ал кей жылдары 30-60% . түйнектердегі осы жəне басқа да бактериялардың болуы картопты сақтау кезінің жағдайларымен байланысты. Бактериялардың барлық түрлерінің іс-əрекеті сақтағышта температура жəне ауа ылғалдылығы жоғарылауы əсерінен болатын жеткіліксіз вентеляция кезінде айтарлықтай жоғарылайды. Бактериялар түйнектерге механикалық зақымдалулар арқылы түседі, қотырмен зақымдалу, фитофтороз, фомоз, құрғақ шірік, сонымен қатар, шіркейлер жəне фитогельминттермен зақымдалу кезінде. Тасымалдау жəне сақтау кезіндегі сəбіздің негізгі ысрабы ақшыл жəне сұр шірік, фомоз, сұр зең жəне бактериалды аурулардан болады. Сəбіз көкөнісі ішінен ең көп таралған шірік аурулары (сұр, ақшыл, қара). Əсіресе, зиянды сұр шірік. Сұр шіріктің қоздырушысы - Botrytis cinerea Pers саңырауқұлағы. Ол əдетте сақтауға қойған уақыттан 1-2 ай өткеннен соң зақымдайды. Қоздырушысы топырақтағы өсімдік қалдықтарында сақталып, сол арқылы сақтау орындарына, яғни қоймаларға барады. Фомоз ( құрғақ шірік) – қоздырушысы Phoma rostrcepii саңырауқұлағы. Вегетация немесе жерде сақтау кездерінде өсімдік зақымданады. Сақтау барысында өнімде қара түсті дақтар пайда болады. Зақымданған ұлпа бұзылып, қуыстар пайда болады. Қоздырушысы ұрықтар мен топырақта сақталады. Картоп жəне сəбізді сақтау кезіндегі аурудың зияндылығын төмендеуі көп жағдайда арнайы шаруашылықта қарастырылатын, агротехникалық, биологиялық жəне химиялық əдістер күресу жағдайларының дұрыс жүргізілуіне тəуелді. Сақтау кезіндегі микроорганизмдер əсерінен туындайтын негізгі аурулар механикалық зақымданған ( қысымшылық, зақымдылық, айғыздар жəне т.б.), əлсізденген, тіптен еш зақым келмеген түрде сипатталуы мүмкін. Олар өнім ұлпаларын тез бұзатын жəне химиялық құрамын өзгеріске ұшырататын ферменттердің көптеген түріне ие болып келеді. Микроорганизмдерге қорек ретінде клетка қабықшасы арқылы қоршаған ортадан түсіп отыратын əтрүрлі ерігіш заттар бола алады. Микроорганизмдермен зақымданған өнімдер шіріп кетеді, бұзылады, тұтынушылық қасиеттерін жоғалтады /11/. Сақтаудың оптималды жағдайы сатылымға шығатын сау өнімнің жоғары қауіпсіздігін қамтамасыз ете алмайды. Бұл патогенді микроорганизмдердің қолайсыз жағдайға жоғары бейімделу қабілеттілігімен түсіндіріледі /12/. Сақтаудың ұзақтылығы бірқатар факторлармен анықталады, дақылдарды өңдеудегі топырақклиматтық əсерден бастап, сұрыптық ерекшеліктер тыңайтқыштарды рационалды қолдану, агротехникадан, суарудан, зиянкестерден қорғау жүйесінен (аурулардан жəне арамшөптерден), жинау əдістері жəні мерзімінен, өңдеу жəне де сақтау жағдайлары мен əдістерімен анықталады. Көкөністердегі барлық биохимиялық процестердің бəрі температураға тəуелді. Жоғары температурада зат алмасу процестері тез жүреді, ылғал, витамин, органикалық заттар азаяды. Зат алмасу процестерінің температураға тəуелділігі Wan Hoff санымен анықталады. Мысалы, сəбіз жəне орамжапырақ үшін бұл сан 2 жəне 3 аралығында болады, яғни, 10°С жоғары температурада тыныс алу қарқындылығы екі немесе үш еселенеді /13/. Организмнің микроорганизмдер əсеріне қарсы тұру қасиеті иммундылық деп аталады. Өсіп жатқан, дамып жатқан жемістер, түйнектер, түйнек жемістер əлсіз немесе ескіргендерге қарағанда ауруларға төзімдірек болып келеді. Белгілі, көптеген аурулар жинау жəне тасу барысында зақымданған үлгілерде байқалады. Өнімдердің ауруларға деген тұрақтылығына ұлпалардың құрылымы мен өнім қабығы əсер етеді. Қаншалықты ұлпа мен қабықша тығыз болса соншалықты микроорганизмге клеткаға ену қиын болады. Өнімдердің эпидермис пен басқа да ұлпаларының қалыңдығы мен құрылымы əр түрлі сорттарда ерекшеленеді. Сондықтан, эпидермисі қалың жəне микроорганизмдерге ішіне енуі қиынға соғатын көкөністерді өсірген тиімді /14/. Сондықтан, агротехникалық жағдайларды ескере отырып, көкөністер мен картопқа жүргізілген микробиологиялық мониторинг көрсеткіштері - экологиялық таза жəне бəсекеге қабілетті өнім шығаратын өндірісте жəне оларды алдын ала ескеру шаралары үшін ауылшаруашылық өнімдерді қайта өңдеу бағытында маңызды болып табылады. Жоғарыда айтылғандарға сүйене отырып санитарлық ережелерге жəне норма (СанПиН) «Тағам өнімдерінің тағамдық құндылығына жəне қауіпсіздігіне гигиеналық талаптар» (№ 4.01.071.03 50 11.06.2003жыл) көкөністердің микробиологиялық көрсеткіштеріне мониторингтік зерттеулер жүргіздік. Көкөністердің – сəбіз, орамжапырақ, картоп, қызанақтың микробиологиялық ластануына зерттеу үшін үлгілерді дайындау жəне таңдау ГОСТ-у 26668 бойынша жүргізіледі. Сəйкесінше анализ жасалынған үлгілерде колония түзу бірлігін (КТБ), мезофилді аэробты жəне факультативті анаэробты микроорганизмдер үшін ГОСТ 10444.3-75 бойынша, ашытқылар үшін ГОСТ 10444.12-75 бойынша, ал мицелиалды саңырауқұлақтар үшін ГОСТ 10444.13-75бойынша анықталды. Таза дақылдарды алу үшін жəне микроорганизмдердің биохимиялық идентификациясы үшін ,өскени колонияларды стандартты агарлы немесе сұйық орталарда егу жүргіздік. Көкөністердің жəне картоптың беткі қабатынан бөлініп алынған бактерия, ашытқы жəне саңырауқұлақ микрофлораларының туыстарын идентификациялау үшін, сəйкесінше, бактерия, ашытқы, саңырауқұлақ анықтауыштары арқылы жүргіздік /15,16,17/. Көкөністердің микробиологиялық ластануына жүргізілген мониторингтік зерттеулер нəтижелері, сау өнімнің (бақылау) эпифитті микрофлорасының сандық құрамы жəне ауру белгілері анықталған (тəжиірбе) өнімдердің үлгілерінің микрофлорасы келесі кестеде берілген. Кесте 1 – Классикалық микробиологиялық əдіс арқылы алынған КТБ нəтижелері Өнімнің атауы Үлгі Көкөніс микрофлорасы бактерия картоп орамжапырақ сəбіз қызанақ ашытқы мицелиалды саңырауқұлақ бақылау 1х103 2х103 2х101 тəжірибе 8х104 30х103 4х101 бақылау 1х105 4х102 1х103 тəжірибе 5х105 16х103 2х101 бақылау 3х103 21х103 1х102 тəжірибе 2х105 40х103 1х103 бақылау 10х103 20х103 1х101 тəжірибе 2х105 50х103 4х102 Көкөніс жəне картоп үлгілеріне жүргізілген микробиологиялық зерттеулердің салыстырмалы анализінде анықталғандай, бактерия, ашытқы, мицелиалды саңырауқұлақтардың КТБ анықтауда нақты нəтижелер алынды. Сонымен қатар, берілген нəтижелер жоғарыда аталған Қазақстан Республикасында тіркелген СанПиН көсеткіштерімен сəйкес келеді. Картоп жəне көкөністерінің эпифитті микрофлорасын сапалы бағалаудағы микробиологиялық зерттеулер нəтижелері төмендегідей микроорганизмдер бар екенін анықтады: бактериялар туысынан Azotobacter, Alcaligenes, Pseudomonas, Lactobacillus, Bacillus, Sarcina, Acidominococcus, Corynebacterium, Enterobacter, Micrococcus; ашытқылардан - Saccaromyces; мицелиалды саңырауқұлақтардан - Fusarium, Penicillum, бұлар жоғарыда аталған көкөністердегі аурулардың этиологиясына қатысада. Сонымен, өсімдік шаруашылығы өнімдерінің микробиологиялық ластануына зерттеулер жүргізу арқылы, оларды сақтау жəне өсіру кезеңдеріне микроорганизмдердің КТБ анықтау бойынша микробиологиялық зерттеу жүргіжу, алдын ала ескерту шараларды эффективті жасау мақсатында жəне сапалы, қауіпсіз өнім алу үшін сонымен қатар, өнімдердің шығымының төмендеуі мен ұзақ мерзімде сақталуы үшін өте маңызды екендігі бізге белгілі болды. 1 Тыныбек Е.Г. Виды пищевой продукции в законе «о безопасности пищевой продукции»// Ж. Пищевая и перерабатывающая промышленность Казахстана,-№4,-2007г. 2 Кусаинова А.Б. Текущее состояние и дальнейшие перспективы развития отраслей переработки сельхозпродукции.//Ж. Пищевая и перерабатывающая промышленность Казахстана,-№1,-2008г.-С.2. 3 Хранение и технология с/х продуктов. Под ред. Л.А. Трисвятского,М., Колос,1975.446с. 4 Калин Ю. Применение озона при хранении свежих овощей и фруктов, Молдова. . 5 Широков В.П., Полегаев В.И. Хранение и переработка плодов и овощей. – М.:Агропромиздат, 1982. – 196 с. 6 Лукьянец В.Н., Амиров Б.М. Столовые корнеплоды. Алматы, Алейрон, 2006.-68с. 51 7 Хранение картофеля. Рекомендации под ред. Бабаева С.А.– Кайнар, 2006. – 18 с. 8 Попкова К.В., Шнейдер Ю.И., Воловик А.С., Шмыгля В.А. Болезни картофеля,- М.:Колос,1980.-с.304. 9 Искаков Н.С. и Сарсенбаев К.Б. Фузариозная сухая гниль картофеля на юго-востоке Казахстана и меры борьбы с ней // Научная основа возделывания картофеля в Казахстане.-Алма-Ата,1980.-С.154-166. 10 Дьяченко В.С. Болезни и вредители овощей и картофеля при хранении.М.:Агропромиздат,1985.- С.4, 11, 41. 11 Турбекова А.С. Сохраняемость картофеля и моркови при использовании препаратов из растительного сырья. Автореф. Дисс.на соиск.уч.степени канд.наук, Алматы. 1999. 12 Петак Г, Садовская Н.Особенности хранения моркови. 13 Ярмилка В. Современные способы хранения плодов, овощей, ягод и винограда, Украина. . 14. Избасаров Д.С, Урюпина Т.Л., Султанова З.К., Амиржанов Б.С. Формирование и прогнозирование устойчивости и качества плодов яблони и винограда.//Монография-Алматы:Мектеп,2006,256 с. 15 Краткий определитель Берги. Под редакцией Дж. Хоулта – М.: Издательство «Мир», 1980, 494 с. 16 Определитель бактерий Берджи 9-е изд. в 2-х т. /Дж. Хоулт, Н. Криг, П. Снит, Дж. Стейли, С. Уильмс. /Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина – М.: Мир, 1997. т.1. – 432 стр., т.2. – 368 стр. 17 Красильников Н.А. Определитель бактерии и актиномицетов. – М.-Л. – АНСССР. – 1949 – 201с. УДК 608.2:62. М.Т. Велямов, А.А. Амангелды, М.М. Амирбаева КАРТОПТЫ, ОРАМЖАПЫРАҚТЫ, СƏБІЗДІ САҚТАУ КЕЗІНДЕ МИКРООРГАНИЗМДЕРДІҢ ТҮРЛЕРІН АНЫҚТАУ (ЖШҚ «Қазақ ҒЗИ қайта өңдеу жəне тағам өнеркəсібі»1, əл-Фараби атандағы Қазақ ұлттық университеті 2) Қазіргі кездегі қоршаған ортаның қолайсыз жағдайларында ерекше маңыздылықты экологияның өзара байланысы жəне азық – түлік өнімдерінің қауіпсіздігі мəселесі алады. Көптеген ғалымдардың зерттеулеріне сəйкес азық –түлік қнімдерінің қауіпсіздік мəселесі Қазақстан Респбликасының барлық өңірлерін қамтыған. Осыған орай, тағамдық өнімдердің жəне шикізаттардың əр түрлі микроорганизмдермен ластануы ерекше қауіп тудырады. Микроорганизмдермен ластанған өнімдерді пайдалану адамдарда ауру туғызуы мүмкін. Бұл мақалада картоп, орамжапырақ жəне сəбіз көкөніс өнімдерін сақтау кезіндегі үнемі кездесетін микроорганизмдердің идентификациясы жайында мəліметтер көрсетілген. Зерттеу материалы ретінде «Аксор», «Тамыр», «Тоқтар» -картоп сорттары, «Алау», «Шантенэ» - сəбіз, «Бегабатская», «Ташкентская» -орамжапырақ сорттары, оңтүстікте 2 шаруашылықта: Алматы облысының таулы аймағында орналасқан Қарасай ауданындағы Қайнар жəне Оңтүстік Қазақстан облысының Сайрам ауданындағы Тассай ауылдарында өсірілген. Зерттеу объектісі ретінде – бактерия, ашытқы жəне мицелиалды саңырауқұлақ микроорганизмдері болды. Микроорганизмдер санын қоректік орталарға тереңдік егу əдісін пайдаланып анықтады. Инкубация бактериялар үшін +28...30°С температурада, саңырауқұлақтар мен ашытқылар үшін +25...27°С температураларда жүргізілді. Өскен колонияларды санау (КТБ –колония түзу бірлігі) бактериялар үшін 2 тəулікте, саңырауқұлақтар мен ашытқыларға 5-7 тəулікте жүзеге асырылды. Микробиологиялық ластануды бақылау көкөніс өнімдерін сақтау мерзімінде өткізілді. Зерттеулер мен нəтижелер Микробиологиялық зерттеулер нəтижесінде көкөніс үлгілерінің (сəбіздің, орамжапырақтың, қызанақтың) жəне картоптың микрофлорасы бактериялармен , ашытқылармен жəне зең саңырауқұлақтарынан тұратыны анықталды. Оңтүстік Қазақстан өлкесінен алынған зерттелетін үлгілердегі жоғарыда аталған микроорганизмдер КТБ анықтау барысында, бастапқы кезеңдермен салыстырғанда 6 ай сақталғаннан соң бұл көрсеткіштің барлық зерттелген микроорганизмдерде 1-2 lg10 ге дала шарттарындағы көкөністердің технологиялық өңдеулердің белгілі дəрежесіндегі əсермен салыстыра анықтадық. Сонымен қатар, кейбір ашытқылардың КТБ корсеткіштерінің жоғарылауын Петри табақшаларында өсіру барысында ашытқылардың өсуін шектеген мицелиальды саңырауқұлақтар өкілі Alternaria туысының азаюы немесе мүлдем болмауымен байланыстыруға болады. Алматы жəне Оңтүстік Қазақстан облыстарынан алынған зерттеу сынақтарындағы (проба) зерттеу нəтижелерінің кейбір өзгешеліктерін өсірілетін көкөніс сорттарының өсірудегі жəне табиғи өзгешеліктерімен түсіндіруге болады. Сонымен бірге, көрсетілген шаруашылықтардан алынған сынақ үлгілерінде өсірудің барлық сатыларында келесі микроорганизмдер байқалды, сəбізде: бактериялар – Azotobacter, Micrococcus, Pseudomonas,Bacillus, мицелиалды саңырауқұлақтар – Alternaria жəне саңырауқұлақ – Saccharomyces;орамжапырақта белокачанды: бактериялар – Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, 52 мицелиалды саңырауқұлақтар – Alternaria жəне саңырауқұлақ – Saccharomyces, картоп үлгілерінде: бактериялар – Azotobacter, Micrococcus, Pseudomonas, Bacillus, Acidominococcus,жəне мицелиалды саңырауқұлақтар – Botrytis,Alternaria жəне саңырауқұлақ – Saccharomyces. Бұдан басқа, п.«Тассай» үлгілерінен осы кезеңде қосымша келесі микроорганизмдер анықталды. Сəбіздің «Шантенэ» сорты: ашытқылар – Phaeococcus, Torulopsis, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, белокочанды орамжапырақтың «Ташкентская» сорты: бактериялар – Enterobacter жəне ашытқылардан – Debоrymyces, Schizosaccharomyces,картоп үлгілерінің «Тохтар» сортында белгілі болды: бактериялар – Pseudomonas жəне ашытқылар - Phaeococcus, Torulopsis, Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Criptococcus;«Аксор» сортында бактериялар – Micrococcus, Pseudomonas, ашытқылар – Phaeococcus, Torulopsis, Rhodotorula, Criptococcus; Осы уақытта п. «Қайнар» алып келінген үлгілерде қосымша орамжапырақтарда Rhodotorula ашытқылары, «Аксор» жəне «Тамыр» сорттарынан Debaromyces, Torulopsis, Rhodotorula, Criptococcus ашытқылары жəне мицелиалды саңырауқұлақ - Monillia анықталды. Аналитикалық зерттеулердің нəтижесінде əдебиеттермен анықталғандай, Pseudomonas туысының микроорганизмдері картоптың «Ылғалды шірік» ауруының этиологиясына қатысатындығы, ал Bacillus бактерияларымен біріксе сəбіз жəне қызанақта аналогиялық ауруларға себеп болады. Corynebacterium туысының бактериялары орамжапырақтарда «Сақиналы шірік» ауруына қатысады. Fuzarium туысының бактериялары сəбіздің «Фузариозды құрғақ шірік», ал Bоtrytis – «Сұр шірік» ауруларына себеп болады. Демек, микробиологиялық ластанудың мониторингін жүргізуде зерттелетін көкөніс үлгілерінде аталған микроорганизмдердің Осы мəліметтерді негізге алып, микробиологиялық тұрғыдан қауіпсіз жəне сапалы көкөністік өнім алудаолардың микрофлорасын анықтау үшін мониторингтік зерттеулер жүргізілуі керек. Өйткені корсетілген микрооганизмдер тағамдық өнімдерді дайындауда сақталуы мен қауіпсіздігіне əсер етеді. 1 Ремеле В.В., Абилева А.К., Атабаева Б.С., Махамбетова Р.И. Микробиологический мониторинг зерна различных культур урожая 2007 г. в различных регионах Казахстана//Вестник сельскохозяйственной науки Казахстана 2/2009,стр.63-64. 2 По итогам конференции «Качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и пищевых продуктов»//Хранение и переработка сельскохозяйственного сырья, 11/2004, стр.58-62. 3 Фробишер М. Основы микробиологии. Изд-во «Мир». – М.1965., 678 С. 4 Широкову Е.П «Практикум по технологии хранения и переработки плодов и овощей». – М. Колос, 1974. *** В данной статье представлены результаты по идентификации наиболее часто встречающихся микроорганизмов в стадии хранения овощных культур таких, как картофель, капуста и морковь. *** In given article are presented results on identifications of most constantly meeting microorganisms to stages of cultivation of vegetable cultures, in particular a potato, cabbage and carrots. L. Damdinsuren, Ts. Selenge, D. Tsend-Ayush МEAT VALUE CHAIN ANALYSIS,RENEWAL STRATEGYIN MONGOLIA (Mongolian University of Science and Technology) Моngolia besides fully supplying its population’s meat demand, it also has 30-40 thousand ton of meat reserve annually, other value added products of butchering, total of 100 million USD export products, also meat processing and exporting experiences [1]. Therefore guaranting pastoral Mongolian meat’s value, informing international market, improving value added meat and meat products export has important significance in Mongolian meat industry, stock raising and its veterinary development. Моngolia has enough meat reserve and its law, legal environment, state policy and strategy have been basically defined to support and develop meat market. Mongolian meat market analysis results have been united and completed in SWOT analysis, and some strategysuggestions have been promoted for value chain’s renewal. Key word:SWOT, production, supply, export, market Preface Моngolia supplies 8,2 million head of stock annually which is 223,1 thousand ton of meatfor its population’s meat demand, and even though it is capable of exporting 30-40 thousand ton of meat and meat products annually, its average annual meat export is 16-18 thousand ton[3]. One of progresses which occured in meat export is mutton and goat meat’s export increase, total of 28,9thousand ton meat has been exported in 2010, and 41.7% is held by this progress. In 2010 stock meat, gut and byproducts export has exceeded by 1.5 times comparing with last year[4, 5]. 53 In order to renew meat value chain wholly in Mongolian domestic market, reliable chain of supply with stock origin, meat, product’s veterinary hygiene, sanitary fully guaranteed product is “hersmen-stock preparers-meat factory-specialized trade units” and further it is possible to implement food safety control’s ISO 22000 standard in every participant’s activity of this chain[2,3]. 1. Мeat value chain analysis According to Mongolian state constitutional law,stock is under government protection, according to Food law meat is “strategically important product” and that is why government is implementing “Моngolian stock”, “Food safety”etc national programs and steps to perfect meat value chain in orderto protect stock health, support meat production and export. Mongolian`s meat market survey’s result has been united and analyzed with SWOT(Table 1). Table 1 Мeat value chain SWOT analysis Advantage Мeat general reserve is sufficient, meat product need is stable, according to Mongolian state law meat is a strategically important product; Моngolian government, administration, international organizations, donor countries are implementing plans and projects to improve stock origin and breed, fight infectious and noninfectious stock diseases, support meat production and export. Foreign market agree that pastoral stock meat is better than farm stock in nutritive biological significance and its usagecharacteristics. Opportunity Implement law of agricultural originated goods and product exchange, “Моngolian stock”, other plans and projects,also increase factory processed meat amount; Increase production of value added product from 1 stock and increase cost chain participants’ revenue Develop veterinary, meat processing factory, trade, logistical enterprises’ collaboration and cooperation, occupy stable place in foreign market with meat and meat production, food and nutritional products and technical products. Disadvantage Danger and risk Мeat processing factory’s marketing control is unsatisfactory and current asset is not enough; Do no fully consider foreign market requirementsfor meat processing technology renewal. High possibility of natural and climatic unpleasant phenomenon and catastrophe; Underestimate Моngolian stock and meat’s value, block from entering foreign market, preparing meat in illegal way and exporting has increased recently. Within government policyframe to improve herdsmen’s living standard and develop agro-business chain “Аgricultural originated goods and product exchange law”, “Моngolian stock” and other programs have been implemented and this provides opportunity to increase production of value added product from 1 stock, increases revenue of value chain participants, improves cooperation and collaboration of veterinary, meat processing factory, trade and logistical units, occupies stable rank in foreign market with meat, meat products, food and nutritionaltechnical goods. Meat value chain renewal goal and implementing strategy, result data have all been defined based on SWOT analysis (Table 2).We have selected 2 factors which shows stock production, supply stages, value chain’s internal factor’s advantages and disadvantages, 2 factors of external factor’s decent environment’s, and also 2 main factors ofadverse environment. Out of 4 internal factors in stock production, supply stages and value chain, the most influencing factor is dealer’s chain (33,4%), and meat butchering hygiene condition (26,5%). However the most influencing external factor is herd structure(47,3%), investment and loan origin (28,3%)(Figure 1).CI describes value’s reality compatible condition’s index, and CRdescribes its compatible condition’s ratio. When CR<0.1 it is seen as value has reached compatibility. Мeat production, supply’s internal factor is CR=0,024, external factor is CR=0.057 so it fulfills requirements. Agricultural originated goods, establish herdsmen accomplice who will participate in product exchange activity, level up its activities, provide value added meat and product for export, considering population’s purchase ability locate low price product’s meat factory, explore new power, implement technological renewing programs etc matters needs to be settled. 54 Table 2 Мeat value chain’s SWOT analysis matrix Internal factors External factors Advantage (S) Disadvantage (W) Decent condition (O) Adverse condition(T) One. Мeat production, supply stages, value chain 1.Мeat reserve, need 3.Hygiene 1.Government support 3.Law and business 2.Production capacity 4.Dealers chain 2.Investment, loan environment origin 4. Herd structure Internal factors’ valuation matrix 1 2 3 4 PV 1. 1 3 0,33 0,247024 1 2. 1 1 0,33 0,153274 λmax 4,066719 1 3. 0,33 1 3 0,264881 CI 0,02224 1 4. 3 3 0,33 0,334821 CR 1 0,024711 5,33 6 5,33 4,67 1 External factors’ valuation matrix 1. 2. 3. 4. PV 1. 0,33 1 0,33 0,122024 1 2. 3 3 0,33 0,282738 λmax 4,154268 1 3. 1 0,33 0,33 0,122024 CI 0,051423 1 4. 3 3 3 0,473214 CR 1 0,057136 1 8 4,67 8 2 SWOT matrix IC EC Current -0,248 -0,261 2015 0,003 0,014 2021 0,245 0,247 Figure 1. Мeat value chain factors influencing amount 2. Value chain’s renewal strategy Renewal’s strategical tendency that is based on meat value chain’s results aim to overcome consequences and based on this sector’s internal environment’s advantages use external environment’s pleasant opportunities in short time, weaken non-pleasant influences in medium term, remove its disadvantages in medium term, also improve its weak point in dangerous conditions(Table 3). Table 3 Мeat value chain’s SWOT analysis result, strategy tendency SO-based on this sector’s advantages use external WO – by improving sector’s disadvantages use environment’s pleasant opportunities: external environment’s pleasant opportunities: Short-term strategy Medium-term strategy - Let herdsmen’s group and accomplice develop into Receive stock, drive herd to factory, determine agricultural unit’s exchange participant, let pastoral and herd driving road; “dealers” get involved in stock preparing and Advertise pastoral stock meat’s nutritional and 55 - - - supply chain; Grant current asset loan to meat processing factories, establish price and reward structure based on stock quality and hygiene index; Based on renewal of meat factory’s technology, stock reserve and population settlement implement new factories building activity in Agricultural master plan frame. ST – based on sector’s advantages use overcoming opportunities of external environment’s nonpleasant influence: Medium-term strategy Extend processing factory’s seasonal work through feeding out stock, storing meat, meat and bone flour, other types of fodder, stock raising utility’s production etc, approve and support help suggestionsfor herdsmen; Improve soum’s veterinary, processing factory’s hygiene control-rating laboratory’s ability biological advantages, expand foreign channels, receive foreign consulting service in order to increase value added meat and meat products, technical and nutritious goods export; Meat value chain participants need to get certificated training in stock and meat preparing and supply, its storage, sales hygiene WT –by improving its weak point in sector’s external environment’s non-pleasant condition and overcome its consequences: Long-term strategy Establish “Meat” complex and cluster in stock reserve territory; Implant meat value chain’s good agricultural practice (GAP, GMP, GLP), danger analysis, critical point control structure (HACCP), and ISO 22000 standard; Establish “Organic Mongolian meat”, “Mongolian sheep gut” brands, government and private sectors and implement it together. Strategy tendency will develop herdsmen’s group and accomplice into agricultural exchange participant in short time, let “dealers” get involved in stock preparing and supply chain, grant current asset loan to meat processing factories, establish price and reward structure based on stock quality and hygiene index, based on technology renewal, stock reserve and population settlement implement new factories building activity in Agricultural master plan frame, extend stock preparing and meat production’s seasonal work in medium term, approve and support help suggestions for herdsmen, improve soums’ veterinary and processing factory’s hygiene and control-rating laboratory’s ability, establish “Meat” complex and cluster in stock reserve territoryin long term, implant meat value chain’s good agricultural practice(GAP, GMP, GLP), danger analysis, critical point control structure (HACCP) and ISO 22000 standards, establish “Mongolian organic meat”, “Mongolian sheep gut” brands and set its implementing goals. Under unified goal to increase Mongolian organic meat, meat originated value added other products’ export, producer and government needs to implement special program(Figure 2). Figure 2. Оrganic meat, goods, product export’s increasing tendency In order to improve stock preparing and supply, set hygiene proper habit in meat production and sales chain, standard implementation, provide product safety, improve local control and laboratory capacity, producers have been doing lot of work. Keep hygiene good agriculture practice(GAP, GHP, GMP, GLP)in meat value chain’s every stage, provide safety, execute local control, danger analysis, critical point control structure (HACCP), needs close collaboration between EU and other international organization in order to conduct ISO 22000 international safety control standard in food chain. This will become fundament for Mongolian stock and meat production to enter non-traditional foreign market. 1. L.Dadminsuren. Mongolian meat industry development strategy.- // Collected report of International scientific practical conferences, Bashkortoston, March 25-26 of 2010, pages 216-221 2. L.Damdinsuren. Mongolia’s meat market various analysis, strategy. - //“Proper usage of food-technology” Research conference summa , UB., 2011 3. Report of Meat value chain study, Mongolian Organic Meat Research Center., UB.,2011 56 4. Mongolian Statistical Yearbook, 2010 5. Agriculture sector in 2010, National Statistical Office of Mongolia 6. www.monorgmeat.mn С. Дэлгэрмаа, Ц.Цэрэндулам БИОЦИДНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТОВ РАСТЕНИЙ НА РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ МИКРООРГАНИЗМОВ (Монгольский Государственный университет науки и технологии, г.Улан-Батор, Монголия *Институт пищевой инженерии и биотехнологии, г.Улан-Батор, Монголия **Текстильный институт при Институте производственных технологий и дизайна, МГУНТ, г.Улан-Батор, Монголия, E-mail: delgermaa_sovd@yahoo.com) В настоящее время для защиты текстильных и ковровых материалов от биоразрушения под действием различных видов микроорганизмов применяются разные способы защиты. Одним из таких способов является использование при крашении волокон экстрактов растений, обладающих бактерицидным действием. В нашей стране такой способ обработки является новинкой, поэтому на пути его внедрения в практику у нас возникают различные трудности. Прежде всего это связано с изучением химического состава веществ, которые содержатся в наземных частях растений и оказывают биоцидное действие. Поэтому для своей исследовательской работы мы выбрали пять наиболее распространенных растений, которые могут содержать вещества, задерживающие рост микроорганизмов. Цель работы – изучение антимикробного действия экстрактов растений и выявление химических веществ, содержащихся в них. В качестве объектов исследования мы выбрали ревень (Rheum undalatum L.), тимьян (Thymus dahurica L.), подорожник (Plantago major L.), чистотел (Chelidonium majus L.), крапиву (Urtica dioica L.), которые произрастают повсеместно на территории нашей страны. Для работы мы приготовили 30%, 60%, 96%-ные спиртовые экстракты данных растений. Из этих экстрактов 0.1 мл, 0.5мл, 1мл суспензий вносили в расплавленный и охлажденный до 45оС питательный агар /мясо-пептонный агар/, который затем разливали в стерильные чашки Петри. После остывания на поверхности питательной среды делали посев трёх различных видов микроорганизмов – кишечной палочки E.coli, споровой бациллы Bacillus, плесневого гриба Penicillum. Данные микроорганизмы культивировали при температурах 37оС /E.coli/ и 27оС /Bacillus, Penicillum/. После культивирования проводили подсчёт колоний данных микроорганизмов. При этом обнаружено, что с повышением концентрации экстракта в питательной среде число колоний микроорганизмов уменьшается. При объеме 1 мл 96% спиртового раствора растений рост кишечной палочки совсем прекращается, а количество колоний других двух микроорганизмов уменьшается в 5 раз /график 1, 2/. 200 150 150 100 0, 1 ml 100 0,1 ml 50 50 0 0 Thymus Thymus RheumChelidonium rheum chelidonium График 1. Изменение числа колоний E.coli /60% экстракт растений График 2. Изменение числа колоний плесневого гриба /60% экстракт растений/ Как видно из графиков, при увеличении объема суспензии экстрактов растений в питательной среде число колоний в чашке Петри резко уменьшается. При объеме 1 мл суспензии культура кишечной палочки не дает роста, а число колоний гриба в питательной среде с тимьяном уменьшается с 188 до 8. Для выявления различных химических соединений в данных растворах мы проводили тонкослойную хроматографию. Для этого сначало мы фракционировали эти растворы в разных органических растворителях: хлороформе, этилацетате, и брызгали раствором Драгендорфа. При этом 57 нами в экстракте чистотела обнаружен полярный алкалоид. С помощью спектрофотометра мы проводили измерение в УФ поле при 254 нм, 365 нм длине волны. При использовании раствора Драгендорфа алкалоид дает желтое пятно. /рис. 1/ Рисунок 1. Тонкослойная хроматография / 1-254 нм, 2-365нм, 3-раствор Драгендорфа / При изучении состава флаваноида в экстрактах растений нами обнаружен рутин. UV254 (NP) UV365 (NP) Рисунок 2. Хроматограмма сравнения рутина в фракции этилацетата ревеня и чистотела с рутин тригидратом Для подверждения результатов тонкослойной хроматографии мы провели паралелльно исследование на аппарате жидкостной хроматографии. При этом в экстракте ревеня так же обнаружен рутин. Стандартом служил стандартный раствор рутина. Запись хроматограммы показана на рисунке 3. Рисунок 3. Сравнительная хроматограмма экстракта ревеня и стандартного раствора рутина ВЫВОДЫ: При проведении данной работы нами сделаны следующие выводы: 1.Отобранные нами для исследования растения хорошо экстрагируются в спирте и воде. В 60%ном спиртовом растворе этих растений содержание сухих веществ самое оптимальное и составляет 1818.2%. 2.При добавлении этих растворов в питательную среду для культивирования микроорганизмов самым оптимальным объемом считаем 1 мл экстракта. При этом объеме рост микроорганизмов уменьшается почти в 5-8 раз. Для кишечной палочки этот объем является губительным. 58 3.При изучении химического состава данных растений мы фракционировали данные экстракты в различных органических растворителях и проводили тонкослойную хроматографию. При этом в экстракте чистотела нами обнаружен полярный алкалоид. 4.Для выявления флаваноида мы проводили сравнение результатов тонкослойной хроматографии с результатами жидкостной хроматографии. При этом установлено, что в фракции этилацетата ревеня и чистотела содержится флаваноид-гликозид рутин. УДК: 582.26. 27 Б.К. Заядан, Д.К. Кирбаева, А.К. Садвакасова, К. Болатхан СОДЕРЖАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ СМЕШАННЫХ КУЛЬТУР МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ПРИ СОВМЕСТНОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ (КазНУ имени аль-Фараби, г. Алматы) В работе представлены экспериментальные данные о совместном культивировании смешанных культур микроводорослей на модифицированных средах. Результаты эксперимента показали, что при культивировании смешанных культур микроводорослей на модифицированных средах наблюдается увеличение скорости роста клеток и, соответственно, с повышением биологически активных веществ по сравнению с контролем. Создание мощной промышленности микробиологического синтеза способно обеспечить человека и животных белками, аминокислотами и физиологически активными соединениями. В этом аспекте наиболее перспективным и экономичным представляется массовое выращивание микроводорослей, позволяющее осуществлять микробиологический синтез ценных органических соединений за счет энергии света и углекислоты в больших масштабах, т.к. давно доказано, что автотрофный путь биосинтеза является более эффективным в отношении получения биомассы, чем гетеротрофный. Особый интерес заслуживают протококковые водоросли, в частности хлорелла и сцендесмус, обладающие уникальными составами и не требующие особых условий для выращивания 1; 2. В настоящий момент одним из самых перспективных направлений в области исследования микроводорослей является создание препаратов растительного происхождения, удачно сочетающих высокую активность и мягкое действие на организм человека с минимальными побочными эффектами. Удобрительные и питательные свойства фототрофных микроводорослей хлореллы, сценедесмуса обусловлены высоким содержанием в них белков жиров витаминов и микроэлементов. Урожайность биомассы микроводорослей чрезвычайно велика 3; 4. В связи с этим целью исследований являлась разработка технологии массового культивирования производственно-ценных штаммов смешанных культур микроводорослей (Chlorella vulgaris Z-1 и Scenedesmus obliquus var. оbliquus) на стандартной и модифицированных средах для получения биологически активных веществ. Материалы и методы Объектом исследования являлись микроводоросли Chlorella vulgaris Z-1 и Scenedesmus obliquus var. оbliquus из коллекции из коллекции фототрофных микроорганизмов кафедры микробиологии КазНУ им. аль-Фараби. Штаммы микроводорослей культивировали на жидких питательных средах 04 в лабораторном фотобиореакторе в контролируемых условиях при освещении лампами интенсивностью 4000-5000 люкс, температуре 23-250С. С целью перемешивания культуру барботировали воздухом, освобожденным от СО2 последовательным пропусканием через раствор щелочи. Контроль над темпом роста и размножением микроводорослей в культуре осуществляли на основании учета изменений их численности и биомассы с помощью камеры Горяева [5]. Содержание общего белка в биомассе опеделяли методом Лоури, пигментов – по спектрам поглощения ацетоновых экстрактов, регистрируемых с помощью спектрофотометра Specord UV-VIS [6, 7]. Результаты и обсуждение В ходе эксперимента нами изучена динамика роста клеток и накопления биомассы при культивировании смешанных культуры Chlorella vulgaris Z-1 и Scendesmus obligus var. оbligus на разных оптимизированных средах в течение 10 суток. Для эксперимента питательная среда 04 была модифицирована внесением концентраций экстракта куриного помета (10%) и бикарбоната натрия 0,2 г. 59 Смешанные культуры микроводорослей культивировали следующих средах: Варианты опыта: №1 вариант стандартная среда 04 (контроль); №2 вариант среда 04 с экстрактом куриного помета (5%+ 0,2г NaHCO3); №3 вариант среда 04 с экстрактом куриного помета (10%+0,2г NaHCO3); Исходное число клеток смешанных штаммов Chlorella vulgaris Z-1 и Scendesmus obligus var. оbligus составило 0,1х106 кл/мл (Рисунок 1). Число клеток млн/мл 60 50 40 30 20 10 0 0 2 контроль 4 6 вариант №1 8 10 12 суток вариант №2 Рисунок 1 - Динамики роста клеток смешанных культуры микроводорослей на оптимизированных средах Как видно из рисунка 1, на 10 суток выращивания микроводорослей в лабораторной установке число роста клеток в контроле достигло 47,4х106 кл/мл, тогда как в вариантах №1 и №2 эти показатели составляет 50,9х106 и 58,6х106 кл/мл. В эти же сроки нами определялось накопление биомассы клеток смешанных культур. Установлено, что вес сухой биомассы смешанных штаммов в контроле достиг величины – 3,2 г/л, тогда как в варианте №1 накопление биомассы составило 3,5 г/л, а в варианте №2 этот показатель составил 4,1 г/л. Таким образом, установлено, что при совместном культивировании клеток микроводорослей на питательной среде 04 с добавлением экстракта куриного помета (10%) и бикарбоната натрия с концентрацией 0,2 мг/л наблюдается увеличение скорости роста клеток по сравнению с контролем. Далее нами определялось содержание хлорофиллов «а» и «в» в биомассах смешанных культур Chlorella vulgaris Z-1 и Scendesmus obligus var. оbligus за 10 сутки при культивировании в биореакторе (Таблица 1). Таблица 1 – Накопление хлорофиллов (а и в) в биомассе смешанных культур микроводорослей при массовом культивировании Варианты мг/л хлорофилл а хлорофилл в контроль 1,9±0,02 1,1±0,01 опыт 2,5±0,06 1,4±0,03 Анализируя состав пигментов можно увидеть, что по сравнению с контрольными вариантам в опытном варианте, наблюдается самое высокое содержание пигментов: хлорофилла «а» - 1,9 мг/л, хлорофилла «в» - 1,1 мг/л, в контроле эти цифры составляют хлорофилла «а» - 2,5 мг/л, хлорофилла «в» - 1,4 мг/л соответственно. Таким образом, при культивировании смешанных культур микроводорослей на питательной среде с добавлением экстракта куриного помета в концентрации 10% и 0,2 г NaHCO3 наблюдается увеличение скорости роста клеток и, соответственно, повышение количества хлорофиллов по сравнению с контролем. Известно, что количество пигментов в клетках находится в тесной взаимосвязи с условиями роста организмов. Особенно его количество увеличивается при внесении азотных удобрений. Среди большого числа биологически активных соединений практический интерес представляют водорастворимые белки и пигменты (каротиноиды, β-каротина), имеющие огромное значение и практический интерес как для фармации и медицины, так и пищевой промышленности и косметологии. Далее нами изучалось содержание общего белка в биомассе при совместном 60 культивировании микроводорослей. Для получения конечного продукта культивировании смешанных культур микроводорослей проводили на лабораторной установке. Показатели содержания общего белка в смешанных культур клеток микроводорослей - Chlorella vulgaris Z-1 и Scendesmus obligus var. оbligus при выращивании их в лабораторном биореакторе, в контролируемых условиях сравнивались с таковыми в контроле на стандартной среде 04 (Рисунок 2) Контроль 45,5% опыт 52,0% Рисунок 2 – Накопление белка в биомассе смешанных культур микроводорослей на модифицированном средах Исследование накопления общей биомассы микроводорослей в течение 14 суток при росте на стандартной и на модифицированных средах выявило следующее: в 1-варианте (контроль) белок составляет 45,5%, во 2-варианте – 52,0% Данные о содержании общее каротиноидов и β-каротин в смешанных культур микроводорослей получавших в течение 14 дня биомассе представлены в рисунке 3. 0,5 1,28 0,7 1 1,6 1,5 1,1 количество пигментов, мг/л 2 0 контроль опыт каротиноиды b-каротин Рисунок 3 – Накопление каротиноидов и β каротина в биомассе смешанных культур микроводорослей Как видно из рис. 3, химический анализ биомассы показал, что при внесении в среду 10% экстракта куриного помета и бикарбоната натрия в среде 0,2 мг/л наблюдается значительные изменения. Так, содержание каротиноидов и β-каротина увеличилось в 2 раза и составило: 1,6 мг/г – каротиноидов, 1,28 мг/г - β-каротина, по сравнению с контролем (каротиноидов -0,9 мг/г и β-каротина - 0,7 мг/г). Таким образом, в проведенные нами исследования показали, что при совместном культивировании смешанных культур микроводорослей на модифицированных средах может накапливать в своих клетках огромное количество пигментов (каротиноидов и β-каротин) и является самым богатым из известных в настоящее время природных источников провитамина А. 1. Soeder С. J. Massіve cultіvatіon of mіcroalgae: results and prospects // Hydro- bіologіa. - 1980. - Vоl. 72. - P.197-209. 2. Селяметов Р.А., Якубов Х.Ф. К изучению витаминного состава хлореллы и сценедесмуса. - В кн.: Культивирование водорослей и высших водных растений в Узбекистане. Ташкент: Фан, 1971, с. 59-60. 2. Жубанова А.А., Заядан Б.К. Перспективы использования микроводорослей в биотехнологии, // Биотехнология. Теория и практика, 2002, N4, стр. 63-70. 4. Мельников С.С. Хлорелла: Физиологически активные вещества и их использование / С.С. Мельников, Е.Е. Мананкина - Минск: Наука тэхніка, 1991. 79 с. 5. Сиренко Л.А., Сакевич А.И., Осипов Л.Ф., Лукина Л.Ф. и др. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. - Киев: Наукова думка, 1975. - 247с. 6. Вecker Е. W. Bіotechnology and explotatіon of the green alga Scenedesmus obluguus // Іndіan Bіomass. – 1984. - Vоl. 4. Р.1-19. 7. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / Под редакцией Скурихина И.М., Тутельяна В.А. - Москва, 1998. -342 с. *** Жұмыста модификацияланған ортада өсірген микробалдырлардың аралас дақылдарының тəжірибелік көрсеткіштері берілген. Тəжірибелік нəтижелер бойынша модификацияланған ортада өскен микробалдырлардың аралас дақылдарының клеткаларының өсу жылдамдығы мен биологиялық белсенді заттары бақылауға қарағанда жоғарылағаны анықталды. 61 *** The experimental data combined cultivation of are mixed cultures of microalgae on the modified environments. Presented the results of experiment show that during the cultivation of the mixed cultures of microalgae on the modified environments were observed speed enhancing of cell growth and accordingly with the increase of bioactive substances as compared with control. А.А. Зорина, Н.С. Степанченко, Г.В. Новикова, Д.А. Лось ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГЕНОМИКА И ФОСФОПРОТЕОМИКА СТРЕССОВЫХ ОТВЕТОВ У ЦИАНОБАКТЕРИЙ (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, e-mail: losda@ippras.ru) В работе рассматриваются проблемы идентификации систем восприятия и передачи сигналов стрессовых ответов у цианобактерий с применением методов ДНК-микрочипов и фосфопротеомики. Современные методы исследования экспрессии генов, помимо традиционных РНК-ДНК гибридизации, обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией и др., предполагают использование ДНК-микрочипов для изучения транскрипции генов и массспектрометрический анализ белков для изучения и идентификации продуктов трансляции соответствующих генов. Применение ДНК-микрочипов и масс-спектрометрии в сочетании с методами направленного мутагенеза позволяют с высочайшей точностью определять влияние той или иной мутации на транскрипцию генов или на посттрансляционные модификации белков. Это особенно важно при изучении систем восприятия и передачи стрессовых сигналов или сигналов об изменении параметров окружающей среды, которые состоят, как правило, из протеинкиназ и протеинфосфатаз, осуществляющих фосфорилирование и дефосфорилирование белков, и таким образом регулирующих их активность. Двухкомпонентные системы регуляции состоят из сенсорной гистидинкиназы (Hik) и регулятора ответа (Rre) и формируют центральное ядро фосфатной сигнальной системы у цианобактерий [1]. Сенсорная гистидинкиназа воспринимает изменения в окружающей среде через сенсорный домен. Изменения его конформации приводят к автофосфорилированию Hik по консервативному остатку гистидина с использованием донорной АТФ. Фосфат затем переносится на консервативный аспартат получающего домена белка – регулятора ответа Rre. После фосфорилирования, Rre также меняет свою конформацию, в результате чего приобретает способность связываться с ДНК. Связывается он обычно с промоторами генов, локализованных далее по курсу всей цепочки пути адаптации, связанного с генной экспрессией. У цианобактерии Synechocystis имеется 47 генов, кодирующих гистидинкиназы, и 45 генов регуляторов ответа. Соответствующие этим генам белки являются кандидатами на роль сенсоров и передатчиков сигналов об изменении окружающей среды [2]. Как правило, инактивация генов, кодирующих белки-сенсоры и/или передатчики, приводит к невозможности запуска ряда генов стрессовых ответов, поэтому применение ДНК-микрочипов в данном случае способно дать однозначный ответ на вопрос о том, какие гены контролируются той или иной сенсорной гистидинкиназой. С использованием ДНК-микрочипов были идентифицированы сенсоры низкой (Hik33) и высокой (Hik34) температуры, солевого и гиперосмотического стресса (Hik2, Hik10, Hik16, Hik41), двухкомпонентная система, регулирующая транспорт ионов марганца при их недостатке (Hik27-Rre16) и некоторые другие [3-6]. В отличие от сенсорных гистидинкиназ, серин-треониновые протеинкиназы эукариотического типа у прокариот участвуют в регуляции основных физиологических процессов (подвижность клеток, метаболизм при повышенных температурах и т.п. [2, 7]. Мутации по генам серин-треониновых протеинкиназ редко приводят к видимым нарушениям в транскрипции генов и чаще выражаются в неспособности фосфорилирования отдельных белков. Такие изменения невозможно определить на уровне транскрипции даже с помощью микрочипов, и для их определения более подходят методы фосфопротеомики – определение профилей фосфорилирования по серину и треонину с помощью двумерного электрофореза с последующей идентификацией белков методами масс-спектрометрии. Примером такого определения может служить фосфопротеомный анализ субстратов серинтреониновых протеинкиназ у Synechocystis при тепловом стрессе. В геноме Synechocystis имеется 12 генов, кодирующих серин-треониновые протеинкиназы. Мутантные штаммы, полученные по каждому из этих генов, исследовались на предмет их способности фосфорилировать белки по остаткам серина и треонина в нормальных условиях роста и при тепловом стрессе. Методом MALDI-TOF были 62 идентифицированы метионил-тРНК-синтетаза, большая субъединица RuBisCo, 6-фосфоглюконат дегидрогеназа, фактор элонгации трансляции Tu (TufA), тРНК δ2-изопентенил-пирофосфаттрансфераза, белок теплового шока GrpE и малый ко-шаперонин GroES, являющийся компонентом системы, участвующей в рефолдинге белков после их денатурации в условиях теплового или солевого стресса. Все перечисленные белки являются субстратами для серин-треониновых протеинкиназ. Белок GroES был экспрессирован в клетках Escherichia coli, очищен и использовался в экспериментах по фосфорилированию in vitro с использованием белковых экстрактов, полученных из клеток Synechocystis дикого типа и 12 мутантов, дефектных по генам серин-треониновых протеинкиназ. Эти эксперименты показали, что белковые экстракты, в которых отсутствует одна из трех протеинкиназ – SpkC, SpkF или SpkK, не способны фосфорилировать GroES. В то же время, реверсии соответствующих мутаций приводили к восстановлению фосфорилирования этого белка. Таким образом, было показано, что три протеинкиназы, SpkC/F/K, участвуют в фосфорилировании малого шаперонина GroES. При этом работают они, видимо, последовательно друг за другом, формируя каскад из трех этапов фосфорилирования, последним из которых является фосфорилирование GroES [8]. В клетках дикого типа гистидинкиназа Hik34 и фактор транскрипции HrcA репрессируют экспрессию оперона groESL при оптимальной температуре роста. Тем не менее, экспериментально подтверждено присутствие и GroES, и GroEL в экстрактах белков из клеток, выращенных при нормальной температуре. Это указывает на то, что Hik34 и/или HrcA репрессируют транскрипцию не полностью. Мы предполагаем, что фосфорилирование по остаткам серина и треонина, по крайней мере, в случае GroES и GroEL, осуществляется конститутивно и зависит только от количества доступного субстрата. Тепловой стресс вызывает индукцию экспрессии оперона groESL, накопление в клетке GroEL и GroES и обеспечивает достаточные количества субстрата для серин-треониновых протеинкиназ, которые фосфорилируют эти шаперонины, что, согласно принятой в настоящее время схеме, облегчает их олигомеризацию. Мутации в генах hik34 и hrcA выражаются в конститутивной экспрессии groESL оперона. Указанные белки накапливаются в значительных количествах и подвергаются модификации серин-треониновыми протеинкиназами. Полученные нами данные о существовании фосфорилированной формы GroES дают основания предполагать, что серинтреониновое фосфорилирование этого ко-шаперонина может быть чрезвычайно важным для формирования функционального олигомерного GroESL комплекса. Таким образом, систематический анализ библиотек мутантов цианобактерий с помощью ДНКмикрочипов и с помощью методов фосфопротеомики позволяет идентифицировать гены, кодирующие различные сенсорные системы клеток [9], а также другие системы фосфорилирования, участвующие в регуляции клеточных процессов. 1.Зорина А.А., Миронов К.С., Степанченко Н.С., Синетова М.А., Коробан Н.В., Зинченко В.В., Куприянова Е.В., Аллахвердиев С.И., Лось Д.А. Системы регуляции стрессовых ответов у цианобактерий // Физиология растений. – 2011. Т. 58. № 5. С. 643-663. 2.Лось Д.А. Сенсорные системы цианобактерий. – Москва: Научный Мир. – 2010. 219 с. 3.Suzuki I., Los D.A., Kanesaki Y., Mikami K., Murata N. The pathway of perception and transduction of low-temperature signals in Synechocystis // EMBO J. – 2000. V. 19. P. 1327-1334. 4.Yamaguchi K., Suzuki I., Yamamoto H., Lyukevich A., Bodrova I., Los D.A., Piven I., Zinchenko V., Kanehisa M., Murata N. A two-component Mn2+-sensing system negatively regulates expression of the mntCAB operon in Synechocystis // Plant Cell – 2002. V.14. P. 2901-2913. 5. Suzuki I., Kanesaki Y., Hayashi H., Hall J.J., Simon W.J., Slabas A.R., Murata N. The histidine kinase Hik34 is involved in thermotolerance by regulating the expression of heat shock genes in Synechocystis // Plant Physiol. – 2005. V. 138. P. 1409-1421. 6.Shumskaya M.A., Paithoonrangsarid K., Kanesaki Y., Los D.A., Zinchenko V.V., Tanticharoen M., Suzuki I., Murata N. Identical Hik-Rre systems are involved in perception and transduction of salt signals and hyperosmotic signals but regulate the expression of individual genes to different extents in Synechocystis // J. Biol. Chem. – 2005. V. 280. P. 21531-21538. 7.Panichkin V.B., Arakawa-Kobayashi S., Kanaseki T., Suzuki I., Los D.A., Shestakov S.V., Murata N. Serine/threonine protein kinase SpkA in Synechocystis sp. strain PCC 6803 is a regulator of expression of three putative pilA operons, formation of thick pili, and cell motility // J. Bacteriol. – 2006. V. 188. P. 7696-7699. 63 8.Zorina A., Stepanchenko N., Novikova G.V., Sinetova M., Panichkin V.B., Moshkov I.E., Zinchenko V.V., Shestakov S.V., Suzuki I., Murata N., Los D.A. Eukaryotic-like Ser/Thr protein kinases SpkC/F/K are involved in phosphorylation of GroES in the cyanobacterium Synechocystis // DNA Research – 2011. V. 18. P. 137-151. 9. Los D.A., Zorina A., Sinetova M., Kryazhov S., Mironov K., Zinchenko V.V. (2010) Stress sensors and signal transducers in cyanobacteria. Sensors 10: 2386-2415. Л.В. Игнатова, Е.В. Бражникова, Т.Д. Мукашева, В.Л. Цзю, Р.Ж. Бержанова, Р.К. Сыдыкбекова, С.Е. Шукешева СКРИНИНГ АКТИВНЫХ НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ СРЕДИ ДРОЖЖЕПОДОБНЫХ ГРИБОВ РОДА AUREOBASIDIUM (Казахский нациоанальный университет имени аль-Фараби) Одной из серьезных проблем восстановления природной среды при добыче, транспортировке и переработке нефти является ликвидация нефтяного загрязнения и утилизации отходов нефтяной промышленности. Наиболее перспективным направлением биоремедиации нефтезагрязненных объектов является применение биологического метода, основанного на использовании биохимического потенциала микроорганизмов, позволяющих ускорить разложение нефти и нефтепродуктов, не нанося дополнительного ущерба нарушенной экосистеме [1,2]. Микробиологическая активность является важным фактором при утилизации нефтяных загрязнений. Однако высокомолекулярные парафины, ароматические и полициклические соединения, содержащиеся в сырой нефти, прочно связываются с почвенными частицами, образуя гидрофобные пленки, и становятся практически недоступными для ферментных систем микроорганизмов. Одним из важнейших механизмов окисления гидрофобных углеводородов нефти является продуцирование микроорганизмами-нефтедеструкторами биосурфактантов, которые способствуют десорбции и солюбилизации нефтяных углеводородов, тем самым, облегчая их ассимиляцию микробными клетками [3]. Поскольку углеводородокисляющие микроорганизмы растут на границе раздела фаз «углеводород/вода», синтез эмульгаторов при высокой клеточной плотности увеличивает площадь поверхности углеводородных капель, создавая оптимальные условия питания для большего числа бактерий. В то же время, при использовании такого сложного субстрата, как нефть, по окончании процесса ферментативного окисления ее легкодеградируемых фракций наличие эмульгатора позволяет микроорганизмам, отсоединяться от «использованной» нефтяной капли и переходить к «свежему» субстрату [4]. Поверхностно-активные вещества, продуцируемые дрожжеподобными грибами Aureobasidium pullulans, могут являться мощным регулятором активности микробной популяции [5,6]. Одним из важных критериев оценки поверхностно-активных веществ при их практическом использовании является способность к эмульгированию углеводородов. Цель исследований – оценка эмульгирующей и нефтедеструктирующей активности штаммов дрожжеподобных грибов Aureobasidium pullulans. Материалы и методы В качестве объектов были выбраны 30 штаммов Aureobasidium pullulans, способных к продукции различных биологически активных соединений: экзополисахаридов и меланинов. Эмульгирующую активность определяли спектрофотометрически при выращивании на минеральной среде Чапека-Докса в течение 7 суток. Динамику численности изучали при росте в полупогруженных условиях на минеральной среде 8Е. При изучении деструкции нефти оценивали суммарный показатель ее убыли как в жидкой среде, так и в стерильном песке, определяемый весовым методом (гравиметрия). Культуры выращивали на минеральной среде 8Е, содержащей 1%, 2% и 3% сырой нефти от общего объема. Первоначальное содержание нефти в песке составило 12 500 мг/кг, что соответствует умеренно-сильному уровню загрязнения, поскольку превышает ориентировочно допустимое количество (ОДК) нефти в почве в 11 раз. Продолжительность опыта - 14 суток. Определение фитотоксичности проводили по стандартной методике с использованием семян редиса. Результаты и обсуждение Эмульгирование углеводородов с помощью поверхностно-активных веществ улучшает поступление гидрофобных органических загрязнителей из почвы и воды в микробные клетки и соответственно их деградацию. 64 Показано, что в процессе роста микроорганизмов возрастает оптическая плотность фильтрата. Степень эмульгирования у всех вариантов разная, но динамика эмульгирования одинаковая: с началом роста идет увеличение эмульгирования и максимального значения оно достигает к 120 часам культивирования (0,8-1,9) (рис. 1, а). В результате было отобрано 5 штаммов-нефтедеструкторов А2, А3, А4, Н2 и П7 с максимальным значением эмульгирующей активности на 5-е сутки опыта (от 1,74 до 1,86 оп. ед.), из которых наибольшей эмульгирующей способностью обладает культура П7 (1,86). На следующем этапе проведено изучение динамики численности наиболее активных штаммов А2, А3, А4, Н2 и П7. В результате было показано, что в течение первых суток происходит активное размножение клеток у всех культур (рис.1, б), что сопровождается резким повышением эмульгирующей активности, особенно у штаммов П7, А1 и А3. Вероятно, это связано с началом экскреции экзометаболитов, в частности биоэмульгаторов. Максимум значений эмульгирующей активности, а также численности культур приходится на 5-е сутки, что связано с высоким уровнем продукции внеклеточных полисахаридов. А Ось абсцисс – время (часы); ось ординат – оптическая плотность (D); Ось абсцисс – время (часы); ось ординат – общее микробное число (КОЕ/г) Рисунок 1. Динамика эмульгирующей активности (А) и численности микроорганизмов (Б) на минеральной среде 8Е Исследованные штаммы различались по степени деструкции нефти. Как видно из результатов таблицы 1, 2% концентрация нефти в среде является оптимальной для роста всех штаммов, о чем свидетельствуют высокие показатели деструктивной активности. Низкие показатели на среде с 1% нефти, скорее всего, связаны с недостатком субстрата как для ростовых процессов, так и для синтеза поверхностноактивных соединений. Увеличение концентрации нефти до 3%, чревато увеличением концентрации токсичных компонентов нефти, обладающих биоцидным и мутагенным воздействием. Наиболее активными оказались культуры А4, Н2 и П7, способные к утилизации нефти более чем на 40% (таблица 1). Таблица 1. Деструкция нефти дрожжеподобными грибами в жидкой среде № 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Варианты Исходное содержание опыта нефти в среде, мг/л 2 3 Контроль (1% 8 760,23 ± 350,41 нефти) А2 1% 8 760,23 ± 350,41 А4 1% 8 760,23 ± 350,41 Н2 1% 8 760,23 ± 350,41 П7 1% 8 760,23 ± 350,41 А3 1% 8 760,23 ± 350,41 Контроль (2% 14 568,61 ± 582,74 нефти) А2 2% 14 568,61 ± 582,74 А4 2% 14 568,61 ± 582,74 Н2 2% 14 568,61 ± 582,74 П7 2% 14 568,61 ± 582,74 А3 2% 14 568,61 ± 582,74 Контроль (3% 20 621,14 ± 824,84 нефти) А2 3% 20 621,14 ± 824,84 65 Содержание остаточной нефти, мг/л 4 8 667,72 ± 346,71 Разница контролем, % 5 0,0 ± 0,00 4 859,02 ± 194,36 4 457,21 ± 178,29 4 960,33 ± 198,41 7 445,82 ± 297,83 5 069,71 ± 202,79 14 448,93 ± 577,96 43,94 ± 1,76 48,61 ± 1,94 42,82 ± 1,71 14,11 ± 0,56 41,53 ± 1,66 0,0 ± 0,00 3 287,32 ± 131,49 3 159,61 ± 126,38 2 632,43 ± 105,30 1 867,72 ± 74,71 3 737,21 ± 149,49 19 931,54 ± 797,26 77,25 ± 3,09 78,11 ± 3,13 81,82 ± 3,27 87,07 ± 3,48 74,12 ± 2,97 0,0 ± 0,00 14 502,31 ± 580,09 27,24 ± 1,09 с 15 А4 3% 20 621,14 ± 824,84 11 454,02 ± 458,16 42,54 ± 1,70 16 Н2 3% 20 621,14 ± 824,84 13 773,23 ± 550,93 30,93 ± 1,24 17 П7 3% 20 621,14 ± 824,84 8 872,04 ± 354,88 55,52 ± 2,22 18 А3 3% 20 621,14 ± 824,84 12 606,52 ± 504,26 36,83 ± 1,47 При изучении процесса биодеструкции нефти наиболее активными культурами Aureobasidium pullulans в модельных экспериментах в задачу исследований входила очистка нефтезагрязненного стерильного песка с использованием дрожжеподобных грибов в комплексе с древесными опилками. Как видно из результатов таблицы 2, на 14-е сутки при интродуцировании клеток штаммов A. pullulans П7 и А4 остаточное количество нефти в почве было самым низким и составило 1,73 г/кг у штамма А4 и 1,03 г/кг у штамма П7. Таким образом, было установлено, что исследуемые штаммы по способности разлагать сырую нефть располагаются в следующей последовательности: П7 (1,03 г/л) > А4 (1,73 г/л) >Н2 (2,35 г/л) > А2 (2,74 г/л) > А3 (4,12 г/л) Параллельно было проведено определение фитотоксичности почв с использованием семян редиса. Данный тест широко используется в различных экспериментах, благодаря тому, что является весьма удобным и показательным. Фитотоксичность обработанного песка была различна и зависела от интродуцируемых культур. Максимальная токсичность отмечена в контрольном варианте, о чем свидетельствует процент проросших семян редиса (8,4%), минимальная – после внесения культур Н2 (82,2%) и П7 (85,8%); в остальных вариантах этот показатель варьировал от 38,2% до 78,4%. Таблица 2. Деструкция нефти дрожжеподобными грибами в модельных экспериментах № Вариант Содержание остаточной нефти, г/кг На 7-е сутки На 14-е сутки 1 Контроль 7,68 ± 0,30 7,24 ± 0,29 Кол-во Разница с проросших контролем, % семян, % 0,0 8,43 2 А2 3,33 ± 0,13 2,74 ± 0,11 56,64 ± 2,26 38,21 3 А3 4,78 ± 0,19 4,12 ± 0,16 73,03 ± 2,92 66,32 4 А4 2,54 ± 0,12 1,73 ± 0,06 91,12 ± 3,64 78,43 5 Н2 3,21 ± 0,12 2,35 ± 0,09 96,31 ± 3,85 82,22 6 П7 1,32 ± 0,05 1,03 ± 0,04 86,58 ± 3,46 85,81 Заключение В результате исследований были отобраны 5 штаммов-нефтедеструкторов с максимальным значением эмульгирующей активности (А2, А3, А4, Н2 и П7), из которых наибольшей эмульгирующей способностью обладала культура П7. Установлена зависимость между численностью исследуемых штаммов и их эмульгирующей активностью. Показано, что максимальных значений эти величины достигают на 5-е сутки культивирования. Было установлено, что исследуемые штаммы по способности разлагать сырую нефть располагаются в следующей последовательности: П7 > А4 >Н2 > А2 > А3 1. Киреева Н.А. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. - Уфа: БашГУ, 1994.-172 с. 2. Молотков И.В., Касьяненко В.А. Рекультивация нефтезагрязненных почв // НефтьГазПромышленность. - 2005. С.307-311. 3. Herbes S.E., Sсhwa1l L. R. Microbial transformation of polycyclic aromatic hydrocarbons in pristine and petroleum contaminated sediments. - Appl. Envir. Microbiol. – 1978. - V. 3. - С. 306. 4. Коронелли Т. В. Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов //Усп. Микробиологии. - 1980. - Вып. 15. С. 99 5. Crescenzi V. Microbial Polysaccharides of Applied Interest: Ongoing Research Activities in Europe // Biotechnol. Prog. 1995. - №3. - P.251-259. 6. Reeslev М., Jorgensen В. Exopolysaccharide production and morphology of Aureobasidium pullulans grown in continuons cultivation with warying cemmonium glucose ratio in the growth medium // J. Biotechnol.- 1996.- №2.-C.131-135. *** Microbiological activity is an important factor at utilization of oil pollution. The surface-active substances produced by Aureobasidium pullulans, can be a powerful regulator of activity of microbic population. As a result of researches emulsifying and oil destruction activity of strains Aureobasidium pullulans was estimated 66 А.К. Калиева1., Р.К. Блиева2 PENICILLIUM CYCLOPIUM 2-11 ШТАМЫНАН АЛЫНҒАН ПЕКТИНЛИАЗА ФЕРМЕНТТЕРІНІҢ ФИЗИКА-ХИМИЯЛЫҚ ҚАСИЕТТЕРІН ЗЕРТТЕУ ЖƏНЕ СИНТЕТИКАЛЫҚ ЖУҒЫШ ЗАТТАРДА ІС ЖҮЗІНДЕ ҚОЛДАНУ (Қ.Жұбанов атындағы Ақтөбе мемлекеттік университеті, Ақтөбе қ1 , ҚР БҒМ «БЗО» РМК «Микробиология жəне вирусология институты» ЕМК, Алматы қ2) Бұл жұмыста ПЛ ферменттерінің препараттары алынды, зерттелген ферменттерді СЖЗ құрамында қолдануға мүмкіндік беретін олардың физикалық-химиялық қасиеттері зерттелді. Пектолитикалық ферменттер сусын жəне шарап өндірістерінде жеміс-жидектерді, көкөніс шырындарын ағартуда жəне шарап дайындауда кеңінен қолданылады. Бұл қазір осы ферменттердің кең таралуын қамтамасыз ететін ескі үдерістердің бірі болып табылады. Пектин ыдыратушы ферменттерді қолдану кезінде жеміс жəне көкөніс шырындары тұтқырлығының тез түсуі, лайлығының төмендеуі жəне өсімдік материалдарының құрғақ заттарына қайта есептегенде олардың шығымының артуы жүреді. Қазақстандық оқымыстылар жеміс-жидек шырындарының шығымын арттыру үшін олардың шығуын 7-12%-ға арттырып, сонымен бірге жүзім шараптарының тез пісіп жетілуі үшін A.niger-ді өсіру кезінде алынған пектин ыдыратушы ферменттерді жемісті қолданды [1]. Л.И. Сапунова жəне басқалар [2] көкөніс жəне жеміс-жидек шикізатын қайта өңдеудің жаңа технологиясын қалыптастыруда жəне бұрыннан белгілі технологияларды жетілдіруде P.adametzii, P.citrinum жəне P.janthinellum препараттарын ұсынады. Сонымен қатар, пектолитикалық ферменттерді зығыр талшығын алу үдерісін жетілдіру үшін зығырды ылғалдандыруда қолданды [3]. Өнеркəсіпте қолданылатын, мысалы пектолитикалық ферменттердің препараттарымен норвегиялық жəне ситхиндиялық шыршаларды немесе осы ферменттерді түзетін ерекше бактериялармен жұмсақ ағаш тұқымдарын өңдеу пектолитикалық ферменттердің потенциалды мүмкіндіктерінің бірі болып табылады. Биологиялық өңдеудің тиімділігі ең күшті микробиологиялық əсер етуді күшейтетін, ажырататын жəне өңдейтін шел қабықты алумен шектеледі [4]. Пектолитикалық ферменттерді мал шаруашылығында əртүрлі ауылшаруашылығы малдарының қоректену рационына енгізу арқылы азықтың сіңімділігін арттырып, соның есебінен өнімділікті көтеруге қолданылғаны жөнінде мəліметтер бар. Сондай-ақ ірі қара малдардың төлдері мен құстарды жемдеу кезінде пектолитикалық ферменттерді қолдануда оң нəтижелер алынды [5,6]. Медицинада əртүрлі өсімдіктерден құнды дəрі қоспаларын алудың мəні зор. Dioscorsa caucasica Lipsky тамыр сабағынан диосгенинді бөліп алу үдерісінде Г10X пектоклостридинді қолдану оның шығымын 16%-ға арттыратыны белгілі болды [7]. Біз матадағы көміртекті дақтарға – жуғыш заттардың əсер ету тиімділігін көтеру үшін пектин ыдыратушы ферменттерді белсенді қоспалар ретінде қосып, қолданудың жаңа жолын ұсынып отырмыз. Олардың қолданылуы ПЛ ферменттерінің субстраттық өзгешеліктерінің əсеріне, рН-тың сілтілі мəнінде құрамы жағынан күрделі пектинді көмірсуларды сумен тез кететін жай байланыстарға ыдырату мүмкіншілігіне негізделген. P.cyclopium 2-11 штамындағы пектинлиаза ферменттерін заттарды жуу үшін қолдану жəне оларды тиімді пайдалану туралы ой-пікір біздің алдымызға пектинлиазалы əсері бар құрғақ ферментті препараттарын алу мақсатын қойды. Зертханалық жəне өндіріс жағдайында ферменттерді бөліп алу үшін көбінесе органикалық ерітінділер мен бейтарап тұздарды қолданады. Тұндырма ретінде əдетте 96,5%-дық этанол, 98%-дық изопропанол, химиялық таза ацетон жəне аммоний сульфатын пайдаланады; соңғысын пайдалану кезінде бөлінген ақуызды диализ жолымен тұздардан еркінату үшін қосымша операциясын жүргізу қажет. Ақуыздарды органикалық ерітінділермен тұндыру эффекті қарама-қарсы фермент топтарының тұздануын азайту құбылысына негізделген. Ақуыз бетінің гидрофобты бөліктерінде орналасқан су молекулалары органикалық ерітінді молекуласына ауыстырылуы мүмкін. Бұнда ақуыздардың ерігіштігі төмендейді, ақуыз молекулаларының тұнуы мен агрегаттануы жүреді. Иммобилизацияланған P.cyclopium 2-11 культурасының культуралдық сұйықтығынан пектинлиаза ферменттерінің препараттарын бөліп алу үшін дəстүрлі тұндырма – этил спиртін қолдандық. Культуралдық сұйықтықтың 1 литрінен 2 г ферментті препарат алынды. рН 10 болғанда 1 литр культуралдық сұйықтықтан этил спиртімен тұндыру арқылы алынған 2 г ферментті препарат құрамында көп таралған ферменттердің бар-жоқтығына биохимиялық талдау жүргізіліп, Рухлядова А.П [8] əдістемесі бойынша анықталды. Биохимиялық талдау P.cyclopium 2-1167 ден алынған ферментті препарат бір текті емес екендігін көрсетті. Құрамына қатысатын ақуыздар ретінде полигалактуроназа жəне протеиназа болды (кесте 1). Кесте 1 – P.cyclopium 2-11-ден этил спиртімен тұндырып алынған ферментті препараттың сипаттамасы № Препараттың ферментті құрамы Көрсеткіштердің мəні, б/г 1 Пектинлиаза ферменті, ПЛ 143,3 2 Полигалактуроназа 3,3 3 Протеиназа 3,0 Ферментті препараттарды іс жүзінде қолдану мүмкіншіліктерін анықтайтын маңызды сипаттамаларға қолайлы рН, температура жəне субстрат өзгешеліктері жатады. Су иондары концентрациясының өзгеруі оны рН-тың сілтілі мəнінде арттырып, қышқыл жəне бейтарап ортаның рН мəнінде төмендете отырып, пектинлиаза ферменттерінің белсенділігіне əсер ететіндігі белгілі болды (сурет 1). P.cyclopium 2-11 пектинлиаза ферменттерінің рН қолайлы əсері 10-11 аралығында болатындығы дəлелденді. 40 35 30 г/ 25 20 б , 15 Б Л 10 П 5 0 Сурет 1 – P.cyclopium 2-11штамынан алынған зерттелетін ферментті препараттың рН қолайлы əсерінің айқындалуы 3 4 5 6 7 рН 8 9 10 11 Сурет 1 – P.cyclopium 2-11 штамынан алынған зерттелетін ферментті препараттың рН қолайлы əсерінің айқындалуы Зерттелетін ферменттер рН-тың тек белгілі бір аралығында белсенді. Сондықтан да P.cyclopium 2-11 пектинлиазаның температураға тұрақтылық əсерін зерттеуді 1 сағат ішінде рН 10 болғанда температураның əртүрлі көрсеткіштерінде жүргіздік. Температураның жоғары шегі 50-60ºС кезінде ферментативтік белсенділіктің температураға тəуелділігін көрсететін энзиматикалық реакциялар «қоңырау тəріздес» болуымен сипатталатыны белгілі болды (сурет 2). Температураны 70ºС-қа дейін көтеру белсенділіктің күрт төмендеуіне əкеліп соқты. Пектинлиаза ферменттерін зерттеуде олардың субстратты өзгешеліктерінің əсерін анықтаудың мəні зор. Ғылыми еңбектерде Penicillium туысына жататын – пектинлиаза саңырауқұлақтарының өзгешелік əсеріне қатысты мəліметтер жоқ. Осыған орай, пектинлиазаның əртүрлі пектинді заттардың гликозидті байланыстарын ыдыратуға қабілеттілігі зерттелді. Өздерінің субстраттарына қарағанда пектинлиаза ферменттерінің өзгешелігі жоғары жəне қанықпаған олигоуронидтерді қалыптастыра отырып, α-1-4 байланысын үзіп, жанама өнімдердің қалыптасуынсыз белгілі химиялық реакцияларды жылдамдатады. 40 35 ПЛБ, б/г 30 25 20 15 10 5 0 30 40 50 60 70 t, C Сурет 2 – P.cyclopium 2-11 штамынан алынған зерттелетін ферментті препараттың термотұрақтылығы 68 Субстраттар ретінде əртүрлі этерлену деңгейіндегі рамногалактуронандарды жəне пектин қышқылын қолдандық. Ферменттің бірдей концентрациясында полигалактуронатлиазамен аз этерленген D-галактуронан (78%) белсенді ыдырады, одан кейін полиметилгалактуронатлиазамен жоғары этерленген D-галактуронан (96%), бəрінен де пектин қышқылы аз гидролизге түсті. Ферментті препараттарды іс жүзінде қолдану үшін СЖЗ жоғары сілтілі ортасының ұзақ уақыт бойы əсер ету тұрақтылығын анықтадық. P.cyclopium 2-11 пектинлиаза ферменттерінің белсенділігіне СЖЗ жоғары сілтілі ортасының əсері (рН-12) жəне əсер етуінің ұзақтығының (1 сағат ішінде) тұрақтылығы 20-60°С кезінде зерттелді (сурет 3). Тəжірибе нəтижелері СЖЗ сілтілі ортасының ұзақ уақыт бойы əсер етуі P.cyclopium 2-11 штамындағы ПЛ ферменттерінің белсенділігіне 50-60ºС кезінде де өзгеріс келтірмейтінін көрсетті. 25 20 г/ б , Б Л П 15 10 5 0 20 30 40 50 60 t, C Сурет 3 – P.cyclopium 2-11 штамындағы ПЛ ферменттерінің тұрақтылығына температураның əртүрлі көрсеткіштерінде жуғыш заттардың сілтілі ортасының ұзақ уақыт бойы əсер етуі Сонымен, зерттелген ферменттердің рН, температураның қолайлы əсері жəне субстраттық өзгешелігі анықталды. Препараттың қолайлы рН əсері 10-11 аралығында жəне температура 50-60ºС кезінде тұрақты болатындығы дəлелденді. Препараттың субстраттық өзгешеліктері анықталды. Аз этерленген жəне жоғары этерленген D-галактуронан қолайлы субстраттар болып табылды. СЖЗ-тың жоғары сілтілі ортасы температура 50-60ºС кезінде де ПЛ ферменттерінің тұрақтылығына əсер етпейді. ПЛ ферменттерін кір жуғыш заттарда қолдану туралы ой зерттелген ферменттердің қолайлы рН əсері мен температурасын анықтағаннан кейін туды. P.cyclopium 2-11 штамындағы пектинлиаза ферменттерінің көміртекті дақтарға тиімділік əсері жуғыш заттардың құрамында зертхана жəне өндіріс жағдайында əл-Фараби атындағы ҚазҰУ-нің кір жуу орталығында сыналды. СЖЗ құрамындағы зерттелетін ферменттердің жуу қабілетін зертханалық жағдайда сынау кезінде көлемі 3,0-3,5 см болатын, мақтадан тоқылған қалың ақ матаға жидектің, жемістің, көкөністің жəне шараптың дақтары жағылды. Дақтарды бір тəуліктен соң синтетикалық жуғыш ұнтақпен, 1-ші нұсқасында – СЖЗ-пен (бақылау), 2-ші нұсқасында – фермент (10 мл) қосылған СЖЗ-пен, 3-ші нұсқасында – кір сабынмен, 4-ші нұсқасында – фермент (10 мл) қосылған кір сабынмен жуылды. Жүргізілген сынақтың нəтижесінде синтетикалық жуғыш заттар мен кір сабынның құр өзі дақтарды кетіре алмайтындығы белгілі болды. Тек ферментті СЖЗ-қа қосу дақты кетіруде синергетикалық тиімділік берді. Өндіріс жағдайында зерттеудің нысаны ретінде əртүрлі дақтармен ластанған ас үй жұмысшыларының халаттары мен асхана кірлері сыналды. Бақылау ретінде 50-60ºС кезінде 1 сағат ішінде киімді құрамында энзимдер жоқ СЖЗ-пен жудық. Тəжірибенің 1-ші нұсқасында кірді фермент қосып, дағдылы тəртіп бойынша жудық. Тəжірибенің 2-ші нұсқасында да кірді дағдылы тəртіп бойынша жудық, бірақ бақылаумен салыстырғанда СЖЗ-ты 2 есе аз қостық (кесте 2). Кесте 2 – Синтетикалық жуғыш заттардың тиімділік əсерін жоғарылату үшін ПЛ ферменттерін қолдану № Тəжірибе нұсқалары Қосылатын СЖЗтың мөлшері, г/1 кг киім 1 СЖЗ (бақылау) 10 69 СЖЗ-қа ПЛ ферментінің қосылатын мөлшері (%) - СЖЗ пен ПЛ синергетикалық тиімділік əсері, (%) 65 2 СЖЗ+ ферментті препарат 10 0,5 90 3 ½СЖЗ+ферментті препарат 5 0,5 90 Жүргізілген тəжірибелер пектинлиаза ферменттерінің синтетикалық жуғыш заттардың тиімділік əсерін арттыруда оң нəтижелер көрсетті. Егер синтетикалық жуғыш заттардың көміртекті дақтарды кетіруіне шамасы жетпесе, жуғыш заттарға ферменттерді қосу синергетикалық тиімділік береді. Кір жуу сапасы 90%-ға дейін жоғарылады, кір таза, əрі аппақ болды, бірақ аздаған сарғайған дақтар білінді. Бұл препаратта α-амилаза болмағандықтан ыдырамай қалған, құрамында крахмалы бар көміртектер болса керек. ПЛ ферменттерін 0,5%, 1 кг кірге 10 г СЖЗ-ты қосқанда жуу мүмкіншілігі 65%-дан 90%ға, яғни 25%-ға көтерілетіндігі белгілі болды. ПЛ ферменттерді кір жуғыш заттарға 0,5 % көлемінде қосу СЖЗ шығынын 2 есе қысқартуға мүмкіндік берді. 1. Мартаков А.А., Молдабаева Р.К., Дианова О.П., Бекетаева Л.И. Применение пектолитического фермента, продуцента гриба Asp.niger, для увеличения выхода виноградного сусла //Виноделие и виноградарства СССР. - 1962. - № 5. 2. Сапунова Л.И., Михайлова Р.В., Лобанок А.Г. Изучение свойств пектинлиазных препаратов Penicillium adametzii, P.citrinum и P.janthinellum // Прикладная биохимия и микробиология. - 1995. - Т.31, - Вып. 3. - С. 267-271. 3. Капитонова Л.С. Применение микробных ферментов в первичной обработке льна. В кн.: Теоритеческие и прикладные аспекты синтеза ферментов микроорганизмами. – Минск: Наука и техника. - 1982. - с. 155-167. 4. Dunleavy J.A., Fogarty W.M. Proceedings of the British Wood Preserving Association, 21st //Annual Conference, Cambridge, - 1971. - p.1. 5. Блиева Р.К., Абиюров Б.Д., Беркінова К.А., Джиембаев Б.Ж. Способ получения пектиназы. - А.с. №696051.1979. СССР. 6. Калунянц К.А., Ездаков Н.В., Привняк Н.Г. Применение ферментных препаратов в животноводстве //Применение продуктов микробиологического синтеза в животноводстве. М.: Колос, 1980. С.213-316. 7. Румянцева Г.И. Получение высокоочищенной β-глюкозидазы Geotrichum candidum, исследование ее свойств и условий применения. - Автореф. дис… канд. техн. наук. – М.: 1978. - 24 с. 8. Уонг Д., Коней Ч., Демайн А и др. Ферментация и технология ферментов, М.: Легкая и пищевая промышленность. – 1983. - 335 с. УДК 579.82 А.Т. Канаев, И.А. Мырзаханова НОВЫЕ МЕТОДЫ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ И ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ВОДЫ ВОДОВОДА «АСТРАХАНЬ – МАНГЫШЛАК» (Казахский национальный педагогический университет имени Абая) К новым конкурентоспособным методам обеззараживания относится ультрафильтрация через поливолокнистые мембраны с размером пор порядка 0,01 мкм, обеспечивающие эффективность обеззараживания 100% со сроком службы мембран не менее 10 лет. Ультрафильтрационные методы нашли применение на многих десятках водопроводных станций, в том числе на нескольких производительностью более 100 тыс.м3/сут. Низко- и высоковольтные разряды токов высокой частоты, облучение ускоренными электронами, гамма-облучение, лучи лазера и др., пока не нашли широкого применения на городских водопроводах. Дезинфицирующие средства нового поколения. В России в Институте эколого-технологических проблем (ИЭТП) (г. Москва) разработаны и получены экологически безопасные полимерные биоцидные препараты широкого спектра действия (без хлора) с длительным периодом последействия, обладающие свойствами катионных флокулянтов. Их идентификация приведена в таблице 1. Таблица 1 - Экологически безопасные дезинфектанты. Название. Класс опасности по Действующее вещество ГОСТ 12.1.007-76 БИОПАГ 1V Относится Ш Полигексаметиленгуанидин гидрохлорид к Полигексаметиленгуанидин 70 Номера свидетельств, патентов Свидетельство о государственной регистрации Р №0430048/4 от 13.06.2000 г. Свидетельство о государ- катионоактивным ПАВ ФОСФОПАГ 1V Ш фосфат ственной регистрации №004499/5 от 23.09.1999 г. Свидетельство о государПолидиоксадодекангуанидин ЭКОПАГ 1V Ш ственной регистрации №0044хлорид 99/4 от 23.09.1999 г. Гидрофобные гуанидины Сополимеры Патент №2144929 (ГЕМБИЦИД и др.) Полигексаметиленгуанидина Приоритет от 28.05.1998 г. Действующим веществом дезинфицирующих средств является гексаметиленгуанидин (ПГМГ). ПГМГ воздействует на клетки микроорганизмов, вызывая прекращение выработки ферментов, в результате чего клетки гибнут в течение 30-60 мин при концентрации рабочего раствора 0,1 – 3,0 мг/л. По внешнему виду биоциды представляют прозрачную бесцветную жидкость или с желтоватой окраской. При концентрации рабочего раствора 1 % по действующему веществу рН = 7,0 – 9,5. В твердом виде содержание активного вещества не менее 95%. Дезинфектанты рекомендованы для обеззараживания воды плавательных бассейнов, дезинфекции белья, предметов ухода за больными, поверхностей строительных конструкций в лечебно-профилактических учреждениях, в пищевой промышленности для дезинфекции помещений и при хранении продукции в складских помещениях. Исследованы возможности и условия применения этих реагентов в качестве дезинфектантов и катионных флокулянтов при очистке маломутных цветных вод. Биоциды, разработанные в ИЭТП, получили известность и находят применение в Канаде, Польше, Германии, Белоруссии и на Украине. Катионные биоциды семейства ПГМГ не содержат хлора, не образуют в воде токсичных соединений, не придают воде запаха и привкуса, не вызывают аллергии, не накапливаются в организме, обеспечивают пролонгированное биоцидное последействие. Не вызывая коррозии, предотвращают биообрастание оборудования и трубопроводов систем охлаждения и оборотного водоснабжения. Дезинфектант инактивирует как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы. Обесцвечивает бактерицидное воздействие как на традиционные паразитарные фаги, вирусы, бактерии и простейшие микроорганизмы, так и на возбудителей венерических болезней, ВИЧ-инфекции, дерматофитов, грибов. По данным, приведенным в таблице 2, возможно сделать вывод, что Фосфопаг имеет биоцидную потенциальную способность примерно на уровне хлора по ОМЧ и колииндексу. Доза Фосфопага в 2,0 мг/л при продолжительности контакта 60 мин является достаточной для полного обеззараживания воды до питьевого качества при исходных ОМЧ до 536 КОЕ/мл и колииндексе 536 КОЕ/л. Таблица 2 - Очистка речной воды с обеззараживанием фосфопагом и хлором Остат. Хлоро ОМЧ, Коли-индекс, Наименование алюминий, КОЕ/мл КОЕ/л форм, мкг/л мг/л 1.Исходная речная 480 230 0 14 вода Фосфопаг, мг/л: 0.5 1.5 3.0 Хлор, мг/л: 0.5 1.5 3.0 СанПиН 2.1.4.1074-01 2.Исходная речная вода Фосфопаг, мг/л: 1.0 1.5 2.0 Примечание: Остаточный фосфопаг, мг/л - 8 8 8 24 8 3 0.38 0.40 0.24 14 14 14 0.2 0.5 1.1 3 3 2 50 78 <3 <3 <3 0.4 0.4 0.4 0.5 36 46 70 60 - 1100 536 - - - 12 <3 <3 16 6 2 - - - 71 1) Исходную воду обрабатывали коагулянтом (А12SО4)3 при добавке фосфопага и хлора при продолжительности контакта 60 мин. 2) Исходную воду обрабатывали Фосфопагом без коагулянта. 3) Декантат пропускали через бумажный фильтр с белой лентой. В условиях ВОС п.Кигач применение Фосфопага оправдано главным образом на стадии обеззараживания с обеспечением длительного периода последействия. Применительно к двухступенчатой схеме осветления и обесцвечивания Волжской воды на стадии обеззараживания доза биоцида – 1,0 мг/л, продолжительность контакта – 60 мин, концентрация рабочего раствора – 0,1-1 %, эффект обеззараживания 99,9 %, период последействия дезинфектанта может быть в пределах 7 – 20 суток при наличии допустимого остаточного количества Фосфопага или Биопага в воде. Из рассмотрения традиционных и новых дезинфектантов возможно сделать следующие выводы: а) Новые дезинфектанты ПГМГ имеют примерно одинаковую с хлором, УФ-обеззараживанием и озонированием инактивирующую способность при дозах 1-1,5 мг/л и продолжительности контакта 1 ч. б) Допустимые концентрации Биопага и Фосфопага в питьевой воде составляют соответственно 1,0 и 1,5 мг/л, ПДК для воды водоемов – 0,1 мг/л. в) Рекомендовано дозирование препаратов в количестве до 0.3 мг/л перед осветлительным фильтром и дополнительно 0,2 мг/л перед подачей в водовод и сеть для создания, пролонгированного эффекта. г) Доза Биопага в 1 мг/л при контакте 1 ч обеспечивает полное обеззараживание воды по нормируемым микроорганизмам, включая колифаг Т. Продолжительность последействия – от 7 и более суток. д) Для приготовления рабочих растворов ПГМГ (0,1-4,0 %) и его дозирования в воду используют стандартное оборудование. Оценка влияния обеззараживания Биопагом на качества речной и транспортируемой воды. С целью оценки влияния обеззараживания речной и транспортируемой воды биоцидным реагентом «Биопаг» на их стабильность и коррозионную активность проведены эксперименты с определением потенциала осаждения и коррозионной активности проб воды до и после обработки Биоцидом (τк = 3060 мин). Карбонатные испытания осуществляли динамическим методом, коррозионную активность воды определяли на коррозиметре «Ока» по методике, разработанной в АКХ им. Панфилова. Коррозионная активность воды выражается скоростью коррозии стального вращающегося цилиндрического электрода и измеряется в мг/см2. Шкала определения агрессивности воды имеет следующие качественные характеристики: не более 0,1 мг/см2 – низкая; 0,1 – 0,2 – средняя; более 0,2 – высокая. Было проведено обоснование возможности изучения процессов коррозии, протекающих на внутренней поверхности водопроводных труб с помощью вращающихся цилиндрических электродов. «Вращающийся цилиндрический электрод» представляет собой цилиндр, погруженный в исследуемый раствор и крутящийся с постоянной частотой внутри другого цилиндра – неподвижного сосуда. Моделируются условия экстремально неблагоприятные для стальных водоводов – коррозия обнаженной поверхности при максимальной подаче кислорода – окислителя. Устройство обеспечивает частоту вращения электрода около 1500 об/мин, что для диаметра его – 10 мм (S=10 см2) соответствует развитому турбулентному режиму (число Rе >5000) и скорости течения воды 0,65 м/с или среднесуточному расходу воды в водоводе 60000 м3/сутки. Качественная механическая подготовка образцов перед опытом необходима для получения достоверных и воспроизводимых результатов по коррозионной активности воды и заключалась в зачистке его боковой поверхности абразивными шкурками различной крупности. Во избежание щелевой коррозии и устранения краевых эффектов образцы предварительно оксидируются. После окончательной зачистки образцов до зеркального блеска их торцы покрываются химически стойким лаком. Обезжиривание образцов проводится спиртом. Объем исследуемой воды – 0,5 л. Коррозионная активность контролируется аналитически по содержанию железа в воде и растворенных продуктах коррозии. Продукты коррозии на поверхности образца растворяются в соляной кислоте (плотностью 1,12 г/см3), ингибированной уротропином. Исследованную воду с нерастворимыми продуктами коррозии фильтровали, оставшиеся на фильтре продукты коррозии также растворяют соляной кислотой (d=1.12 г/см3). Таким образом, общее количество металла, подвергшегося коррозии, переводят в раствор и анализируют по железу фотоколориметрическим методом. Образец просушивают на фильтровальной бумаге и подвергают визуальному осмотру на предмет локальной коррозии с подсчетом питтингов и язв, а также их замером. По разности 72 концентрации общего железа ΔFе в испытуемом растворе до и после эксперимента (τ = 3 ч) определяют абсолютную коррозионную активность воды Н по формуле: Н Feобщ S , мг / см 2 , (1) где: S – поверхность образца, см2. Проведенные карбонатные испытания показали: дозирование в пробы речной и транспортируемой воды (449, 652, 973 км) реагента Биопаг в количестве 1-2 мг/л повышает стабильность воды, приводя потенциал осаждения карбоната кальция в область оптимальных значений 4-10 мг/л для транспортирования воды по стальным незащищенным водоводам; учитывая обеззараживающий эффект и пролонгирующее действие Биопага, его некоррозионный характер и неспособность к образованию токсичных компонентов при контакте с водой, стойкость к окислению, наличие гигиенических сертификатов целесообразно провести испытания его применения на водоводе по трассе Кульсары-Жана Узень; добавка Биопага к речной воде пр. Кигач понижает ее коррозионную активность, и скорость коррозии образца из стали 17Г1С. 1. Исследование начальных этапов биокоррозии стали. Жиглецова С.К., Родин В.Б., Кобелев В.С., Александрова Н.В., Расулова Г.Е., Холоденко В.П. Прикладная биохимия и микробиология, 2000, том 36. – С. 637-641. 2. Таубе П.Р., Баранова А.Г., Химия и микобиология воды. – М.: Высшая школа, 1983, 280 с. 3. Эванс Ю.Р. Коррозия и окисление металлов. – М.: Машгиз, 1962, 856 с. 4. Рачев Х., Стафанова С. Справочник по коррозии. – М.: Мир, 1982, 520 с. 5. Коррозия. Справочник // Под ред. Шраера Л.Л. - М.: Металлургия, 1981, 632 с. 6. Рейзин Б.Л., Стрижевский И.В., Шевелев Ф.А. Коррозия и зашита коммунальных водопроводов. - М.: Стройиздат, 1979, 398 с. 7. Шлугер М.А., Ажогин Ф.Ф., Ефимов Е.А. Коррозия и защита металлов. - М.: Металлургия, 1981, 215 с. 8. Герасимов В.В. Прогнозирование коррозии металлов. - М.: Металлургия, 1989, 152 с. УДК: 579.26: 582.264 Д.К. Кирбаева, Б.К. Заядан, Г.Е. Уразбекова, С.А. Темирбаев ƏРТҮРЛІ КОНЦЕНТРАЦИЯЛЫ ЦИНК СУЛЬФАТЫНЫҢ SPIRULINA PLATENSIS-ТІҢ ӨНІМДІЛІГІНЕ ƏСЕРІ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті, Алматы, Қазақстан) Зерттеу жұмысында əртүрлі концентрациялы екі валентті цинк сульфатының цианобактерия Spirulina platensis өнімділігіне (белок, хлорофилл а, каротиноидтар) əсері қарастырылады. Соңғы жылдары иммунды жүйені көтеруде белсенділігі зор өсімдіктер жəне микробалдырлар пигменттерін медицинада жаңа диагностикалық препараттарды алуға кең қолданылады. Жарық фотосинтез арқылы клетка метаболизміне əсер ететін болса, цианобактериялардың хлорофилдері мен фикоцианиндері ең негізгі жарықты жинаушы жəне энергияны фотожүйелік орталық реакцияларға жеткізуші қызмет атқарады /1; 2/. Тірі организмде төменгі мөлшерде болуына қарамастан микро- жəне ультрамикроэлементтер əртүрлі ферменттер мен гормондардың, витаминдердің құрамына кіріп, клетканың қалыпты қызметі мен барлық организмнің толық дамуын қамтамасыз етеді /3/. Қазіргі кезде халық санағының тағам құрамында көптеген микронутриенттердiң төмендiгiнен көптеген ауру түрлерінің көбеюіне, гипомикроэлементоздың дамуына əкелiп соғуда. Əсіресе тіршілікке маңызды цинк микроэлементі организмнің барлық клеткаларының қалыптасуына өте қажетті жəне адам организміне цинк тəулігіне 2-3 г шамасында түсіп тұру керек. Ал оның көптеген мөлшері теріде, бауырда, бүйректе, көз қарашығында жəне сілекей бездерінде болады. Мұндай маңызды антиоксиданттық қасиетке ие микроэлементтің микробалдыр құрамына жинақталуы мен оның əсерін зерттеу өзекті /4-6/. Көптеген жағдайда биологиялық активті қоспа өндіру үшін микроэлементтердің бейорганикалық тұздарын қолданады жəне олардың төмен концентрацияда болуына қарамастан организмде сіңімділігі төмен болады немесе шамадан тыс мөлшерде қолдану кезінде токсикалық əсер беру қаупі жоғарлайды. Сондықтанда биотехнологиялық əдіспен алынып, эссенциялық микроэлементке байытылған жаңа органикалық азықтық өнім ретінде спирулина клеткаларында өсірілген тəжірибелерді көптеп кездестіруге болады /7/. Осыған байланысты бiздiң тəжiрибе жүргiзу мақсатымыз цинк сульфатының 73 əртүрлі концентрациясында цианобактерия Spirulina platensis штамының өнiмдiлiгiн зерттеу өзекті деп қарастырылды. Материалдам мен əдістер Зерттеу жұмысына əл-Фараби атындағы ҚазҰу-нің микробиология кафедрасының микробалдырлар коллекциясынан алынған цианобактерия Spirulina platensis штаммы қолданылды. Тəжірибеге алынған спирулина клеткалары лабораториялық жағдайда стандардты Заррука ортасында /8/, 4000 люкс жарықта, 28-300 С температурада өсірілді. Ал тəжірибелік нұсқалар екі валентті цинк сульфатымен байытылды: 0 (бақылау); 1.0; 2.0; 3.0; 5.0 мг/л. Клеткалардың оптикалық тығыздығы фотоэлектроколориметр əдісімен, балдырлардың пигменттік құрамы 96% этанолда экстракциялау арқылы спектрофотометрде (662, 470 нм толқын ұзындығында) анықталды /9/. Зерттеу нəтижелері Алдымен тəжірибе мақсатқа жету үшін цинктің əртүрлі концентрациясында өскен Spirulina platensis клеткаларының өсу көрсеткіштері анықталды (Сурет 1). Бастапқы екі тəулік бойы өскен бақылаудағы клеткалардың өсу тығыздығына қарағанда, тəжірибедегі нұсқаларда өскен клеткалар бейімделгіштік кезеңде болғаны анықталды. Сурет 1. Цинк сульфатының əртүрлі концентрациясындағы Spirulina platensis клеткаларының өсу динамикасы белок % Ал тəжірибенің 8-ші тəулігінде бақылаудағы клеткалардың өсу көрсеткіштері 0,31 шамасында болып, бұл кезде цинктің əртүрлі концентрациясында өскен клеткалардың да өсу қарқыны біршама (1.0мг/л -0,26; 2.0мг/л-0,23; 3.0 мг/л-0,21; 5.0мг/л-0,15) теңескен нəтижелер алынды. Алайда, 10-шы тəулікте бақылаумен (0,34) салыстырғанда, цинктің 1.0 мг/л концентрациясындағы спирулина клеткаларының өсуі көрсеткіштері 1.0мг/л -де 0,25-ге, 2.0 мг/л-де 0,21-ге жетіп, ал цинктің 3.0 мг/л концентрациясында 0,19, 5.0 мг/л-де 0,14 төмендегені белгіленді. Бұл нəтижелерден бақылаудағы стандардты Заррука ортасына қарағанда, қоректік ортасы цинк микроэлементімен байытылған орталардағы Spirulina platensis клеткаларының өсуі 8 тəулікке дейін қарқынды дамып, кейінгі тəуліктерде өсуі біршама төмендейтіні анықталды. Кейін бізбен осы тəуліктегі құрғақ биомассалардың белоктық құрамының жиналу көрсеткіштері де қадағаланып, бұл көрсеткіштерді 2-ші суреттен көруге болады. 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Бакылау 1.0 мг/л 2.0 мг/л 3.0 мг/л 5.0 мг/л Сурет 2. Цинк сульфатының əртүрлі концентрациясында өскен Spirulina platensis биомассаларындығы белок көрсеткіштері, (%) 74 Спирулинаны Заррука ортасында (бақылауда) жəне цинктің 4 түрлі концентрацияларында 8 тəулік бойы өсірілген биомассаларындығы белок көрсеткіштері мынадай нəтижелер берді: бақылауда – 56,9%, цинктің 1.0 мг/л концентрациясында 57,8%, 2.0 г/л-де 59,5%, 3.0 мг/л-де 41,6% жетіп, 5.0 мг/л концентрациясынан 27,4 % белок алынды. Бұл көрсеткіштерден цинктің 1,0-2.0 мг/л концентрацияларының тиімділігін атап өтуге болады. Сондай-ақ, тəжірибе барысында екі валентті цинк сульфатының əртүрлі концентрацияларында өскен спирулина биомассасының пигменттерінің құрамы анықталды (кесте 1). Кесте 1 – Цинк сульфатының əртүрлі концентрацияларында өскен Spіrulіna platensіs биомассасындағы пигменттердің сандық көрсеткіші, (%) Цинк сульфаты қосылған Заррука ортасының əртүрлі концентрациялары, мг/л Бақылау (Заррука) 1,0 мг/л 2,0 мг/л 3,0 мг/л 5,0 мг/л каротиноидтар хлорофилл а, 0,23±0,009 0,28±0,01 0,32±0,01 0,15±0,006 0,11±0,003 0.94±0,03 1,2±0,06 1.5±0,05 0,51±0,02 0,37±0,01 Алынған зерттеу бойынша (бақылауда: каротиноидтары 0,23%, хлорофилл а 0.94%) цинктің 1,02.0 мг/л концентрацияларында өскен спирулина биомассасының каротиноидтары 0,28-0.32%, хлорофилл а 1.2-1.5% шамасында болса, ал цинктің 3.0-5.0 мг/л концентрацияларындағы каротиноидтар 0,15-0.11%, хлорофилл а 0.51-0.37% құрады. Тəжірибе нəтижесінде, цинк сульфатының 1,0-2.0 мг/л концентрациялары спирулинаның өнімділігін оптималды əсер берсе, бұл кезде керісінше, 5.0 мг/л концентрациялары спирулинаның белок құрамын 29,5%-ға, хлорофилл мен каротиноидтар құрамын 0,57-0,12% төмендететіні анықталды. Олай болса, бұл тəжірибе нəтижелеріндегі оптималды көрсеткіштерімен көзге түскен цинктың 1,0-2.0 мг/л концентрациялары келешекте спирулина ортасын бұл микроэлементпен байытуда тиімді көрсеткіш болып табылды. Алайда спирулинаның өсуіне цинк сульфатының біршама тежеушілік əсер берген 3,0-5.0 мг/л концентрацияларыда, спирулина құрамындағы бірқатар маңызды өнімділік көрсеткіштеріне айтарлықтай өзгерістер енгізбеді. 1. Reed R. H., Warr S. R. C., Richardson D. L., Moore D. J. and Stewart W. D. P. Bluegreen algae (cyanobacteria): prospects and perspectives // Plan. and Soil. – 1985. – V. 89. – P. 97 – 106. 2. Litchtenthaler H.K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes // In: Packer L., Glazer N, editors. Methods in enzymology. – San Diego: Acad. Pres. – 1987. – V.148. – P. 350 – 381. 3. Скальный А.В. Микроэлементозы человека, диагностика и лечение. - М.: Изд-во КМК, 1999. - 96 с. 4. Hosetti B.B., Shivaraj R. V., Patil H. S. Effect of zink on the treatment of domestic sewage by Scenedesmus quadricauda // Environ. Ecol. - 1999. - 8, №4. - P. 1220 - 1223. 5. Павлова О.Н., Грибанова Е.А., Желонкин Н.Н., Боронец Т.Ю., Первушкин С.В., Пурыгин П.П. Современные подходы к классификации биологически активных добавок к пище // Вестник СамГУ. - 2007. - № 9. – С. 256-269. 6. Мazo G.N., Savvin S.N., Pronina N.A. Chemical speciation of Zn, Cu and Cr in Spіrulіna platensis microalgae // ICP Information Newsletter. – 2002. - Vol. 27. - P. 138-139. 7. Changwal M.L. Earth food Spіrulіna: A new food to restore our health and planet. Spіrulіna Health Library. - Madras, India, 1994. - 28 р. 8. Zarrouk C. Contribution a l’etude d’une cyanophycee. Influence de divers facteurs physiques et chimiques sur la crossance et la photosynthese de Spirulina maxima // Ph. D. thesis. – Paris, 1966. – P. 138. 9. Tandeau de Marsac N. Complementary chromatic adaptation: physiological conditions and action spectra // In: Packer L., Glazer N, editors. Methods in enzymology. – San Diego: Acad. Press. – 1988. – V.167. – P.318 – 328. *** Изучено влияние разных концентраций двухвалентного цинка на кривые роста и накоплению общего содержания белка, каротиноидов, хлорофилл а цианобактерии Spirulina platensis. Установлено, что содержание цинка, значительно превышающие его в среде Заррука не вызывают изменение биохимического состава и ингибирования роста клеток. *** The influence of different concentration of bivalent zinc on growth curve and accumulation of total protein, carotenoids, chlorophyll of cyanobacteria Spirulina platensis is studied. The content of zinc, considerable exceeding in the Zаrrouk medium does not cause the change of biochemical composition and inhibition of cell growth. 75 Е.В. Куприянова, Н.А. Пронина СО2-КОНЦЕНТРИРУЮЩИЙ МЕХАНИЗМ АЛКАЛОФИЛЬНЫХ ЦИАНОБАКТЕРИЙ ИЗ СОДОВЫХ ОЗЕР (Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук) В данном обзоре обсуждается история возникновения механизмов, дающих возможность осуществления эффективного фотосинтеза в данную геологическую эпоху. Обсуждается необходимость СО2-концентрирующего механизма для цианобактерий, обитающих в условиях содовых озер. Цианобактерии являются одними из «старожилов» на нашей планете. Остатки первых прокариот, в том числе напоминающих современные нитчатые цианобактерии, обнаруживаются в древнейших из известных на Земле осадочных породах, возраст которых составляет 3.8 млрд. лет [1]. С тех пор цианобактерии не претерпели существенных изменений с точки зрения морфологии и ультраструктуры. И их древние остатки можно с успехом классифицировать по современным альгологическим справочникам [2]. После своего возникновения прокариоты безраздельно господствовали на нашей планете в течение 2 млрд. лет, что составляет больше половины от истории жизни на Земле в целом. При этом они формировали сообщества, так называемые циано-бактериальные маты, состоящие соответственно из цианобактерий и бактерий. Считается, что расцвет прокариот случился после «изобретения» цианобактериями примерно 3.5 млрд. лет назад оксигенного фотосинтеза, использующего в качестве источника электрона воду [3]. А поскольку вода – очень доступный субстрат, это и дало возможность такой широкой экспансии. Ранняя атмосфера Земли, образовавшаяся в Архее в результате дегазации магмы, была восстановительной. В то время она состояла из паров воды, большого количества СО2 и других газов, таких как метан, азот, окись углерода и др. По некоторым оценкам, содержание СО2 в то время достигало примерно 80% [4]. Именно в период господства на Земле прокариот огромное количество СО2, находящегося в ранней атмосфере, оказывается связанными в виде строматолитов – слоистых отложений, состоящих в основном из карбоната кальция, и представляющих собой минерализованные циано-бактериальные сообщества [2]. Одновременно со стоком СО2, фотосинтетический кислород, выделявшийся в результате жизнедеятельности цианобактерий, постепенно насыщал атмосферу. Примерно 2 млрд. лет назад уровень его содержания достиг 1% от современного, что считается началом атмосферы нового, окислительного типа. К середине Протерозоя (1.7-1.8 млрд. лет назад) атмосфера Земли стала полностью аэробной. Этот глобальный процесс затронул перестройку всей геосферно-биосферной системы Земли [2, 5]. Таким образом, именно прокариоты дали возможность эволюции развиваться по тому сценарию, который нам сегодня известен. С появлением кислорода в атмосфере стало возможно использовать энергетически более выгодный процесс кислородного дыхания вместо анаэробного брожения, и получать 38 молекул АТФ вместо двух из одной молекулы глюкозы. Одновременно возник озоновый слой, преграждающий путь ультрафиолету. Все это дало возможность появления высокоорганизованных эукариот, выхода жизни на сушу, и появления всех основных групп известных ныне животных и растений [1]. Вместе с тем, широкое использование оксигенного фотосинтеза привело около 350 млн. лет назад к критической ситуации для самих фотосинтетиков [6]. В результате неуклонного снижения концентрации СО2 в атмосфере Земли с одновременным повышением содержания в ней кислорода, СО2 стал лимитирующим ресурсом, а оксигеназная реакция РБФК/О приобрела статус серьезной проблемы. Таким образом, формирование механизмов, позволяющих сохранять фотосинтетическую активность, стало в этот период важным условием дальнейшего существования и развития фотосинтетических организмов. Преодолеть возникшую ситуацию можно было двумя путями: 1) увеличить количество ключевого фермента фиксации СО2 – РБФК/О и ее сродство к диоксиду углерода: по этому пути пошло большинство растений С3-типа; 2) увеличить внутриклеточную концентрацию СО2 – то есть, создать СО2-концентрирующий механизм. Эта стратегия привела к появлению С4- и САМ-метаболизма. Перед цианобактериями, вклад которых в преобразование ранней атмосферы был наиболее существенный, также встала задача сохранения эффективности фотосинтеза. Наряду с другими водными С3-фотосинтетиками – микроводорослями, придерживаясь второй адаптационной стратегии, цианобактерии «изобрели» СО2-концентрирующий механизм, отличный от С4- и САМ-путей, известный сейчас под аббревиатурой ССМ (от англ. – «carbon concentration mechanism») [6, 7]. Работу ССМ обеспечивает фермент карбоангидраза (КА, КФ 4.2.1.1) совместно с 76 переносчиками соединений неорганического углерода (Сi). В результате их слаженной работы в районе активного сайта РБФК/О создается концентрация СО2, в 1000 раз превышающую таковую в среде, окружающей клетку. КА участвует во всех этапах ССМ (поглощение Сi, предотвращение утечки Сi из клетки, внутриклеточное преобразование форм Сi) [8]. Сформированная древними цианобактериями окислительная атмосфера дала толчок к развитию и распространению эукариот. Со временем последние постепенно вытеснили прокариотические сообщества в экологические ниши с экстремальными условиями обитания: соленые лагуны, гидротермы или содовые озера с высоким содержанием карбонатов и показателем рН. Именно в этих условиях они развиваются и в наши дни. Поскольку в таких местах обитания отсутствуют высшие организмы, подобные микробные сообщества называются «реликтовыми» и считаются аналогами экосистем прошлого [2]. С точки зрения изучения появления и эволюции ССМ особенный интерес представляют алкалофильные цианобактерии содовых озер. На настоящее время не существует единого мнения по поводу функционирования у них механизма концентрирования Ci. С одной стороны, эти организмы развиваются в среде с высоким содержанием бикарбоната. Теоретически подобные условия не требуют создания или поддержания ССМ. С другой стороны, наличие у алкалофильных цианобактерий всех компонентов ССМ, а именно КА и переносчиков Ci, было показано экспериментально [9-12]. Кроме того, нами было продемонстрировано накопление внутриклеточного пула Ci до величин, сравнимых с пресноводными цианобактериями, у одного из представителей содовых озер - Rhabdoderma lineare [9]. Мы также наблюдали увеличение числа карбоксисом у этого организма при низкой концентрации экзогенного Ci (неопубликованные данные). Именно в карбоксисомах цианобактерий происходит преобразование внутриклеточного пула Ci, существующего в форме бикарбоната, в СО2, являющийся субстратом для РБФК. Таким образом, ССМ может существовать у цианобактерий содовых озер как артефакт, сохранившийся у клеток с тех времен, когда они еще не были вытеснены эукариотами в экстремальные условия обитания. В этом случае ССМ может активироваться при неблагоприятных условиях: известно, что гидрохимические показатели воды содовых озер подвержены периодическим изменениям вследствие сезонных циклов опреснения [11]. Второй причиной сохранения функционально активного ССМ у цианобактерий содовых озер может служить недостаток подходящей формы экзогенного Ci: избыток карбоната или низкая концентрация бикарбонат-ионов при высоких рН может служить спусковым механизмом для индукции ССМ [9]. Еще одна гипотеза состоит в том, что бентосные цианобактерии, обитающие в условиях плотного циано-бактериального мата, могут испытывать необходимость в ССМ из-за возможного дефицита в экзогенном Ci как вследствие низкой скорости диффузии Ci в воде, так и из-за наличия толстого экзополисахаридного слоя у самих клеток, препятствующего проникновению к ним субстрата [6, 13]. Для кальцифицирующих цианобактерий, таких как Microcoleus, диффузия Ci может быть также осложнена из-за отложения нерастворимого осадка карбоната кальция во внешних слоях клетки [10]. Однако, несмотря на то, что функционирование ССМ у алкалофильных цианобактерий из содовых озер еще оставляет неразрешенные вопросы, уже на данном этапе исследования можно заключить следующее. Поскольку в клетках «реликтовых» цианобактерий, предки которых имеют возраст около 3.8 млрд. лет, были обнаружены все компоненты ССМ, это может указывать на более древнее происхождение этого механизма, чем относящееся к 350 млн. лет назад, как это принято считать в настоящее время. 1. Еськов К.Ю. Удивительная палеонтология: история Земли и жизни на ней. - Москва: ЭНАС.- 2008.- 312 с. 2. Заварзин Г.А. Становление Биосферы // Вестник РАН.- 2001.- T. 71. - C. 988-1001. 3. Konhauser K. Biogeochemistry: deepening the early oxygen debate // Nature Geoscience.- 2009.- V. 2.- P. 241–242. 4. Сорохтин О.Г., Ушаков С.А. Развитие Земли.- Москва: МГУ.- 2002.- 560 с. 5. Заварзин Г.А. Эволюция геосферно-биосферной системы // Природа.- 2003.- T. 1.- C. 27-35. 6. Price G.D., Badger M.R., Woodger F.J., Long B.M. Advances in Understanding the Cyanobacterial CO2-ConcentratingMechanism (CCM): Functional Components, Ci Transporters, Diversity, Genetic Regulation and Prospects for Engineering into Plants // J. Exp. Bot.- 2008.- V. 59.- P. 1441-1461. 7. Пронина Н.А. Организация и физиологическая роль СО2-концентрирующего механизма при фотосинтезе микроводорослей // Физиология растений. - 2000. - Т. 47. - С. 801-810. 8. Куприянова Е.В., Пронина Н.А. Карбоангидраза – фермент, преобразивший биосферу // Физиология растений. 2011. - Т. 58. - С. 163-176. 9. Dudoladova M.V., Kupriyanova E.V., Markelova A.G., Sinetova M.P., Allakhverdiev S.I., Pronina N.A. The thylakoid carbonic anhydrase associated with photosystem II is the component of inorganic carbon accumulating system in cells of halo- and alkaliphilic cyanobacterium Rhabdoderma lineare // Biochim. Biophys. Acta.- 2007.- V. 1767.- P. 616-623. 77 10. Kupriyanova E., Villarejo A., Markelova A., Gerasimenko L., Zavarzin G., Samuelsson G., Los D.A., Pronina N. Extracellular carbonic anhydrases of the stromatolite-forming cyanobacterium Microcoleus chthonoplastes // Microbiology.- 2007.- V. 153.- P. 1149-1156. 11. Миходюк О.С., Заварзин Г.А., Ивановский Р.Н. Транспортные системы для карбоната у экстремально натронофильной цианобактерии Euhalothece sp. // Микробиология. - 2008. - Т. 77. - С. 465-471. 12. Kupriyanova E.V., Sinetova M.A., Markelova A.G., Allakhverdiev S.I., Los D.A., Pronina N.A. Extracellular -class carbonic anhydrase of the alkaliphilic cyanobacterium Microcoleus chthonoplastes // J. Photochem. Photobiol. B: Biology.- 2011.- V. 103.- P. 78-86. 13. Raven J.A., Cockell C.S., De La Rocha C.L. The evolution of inorganic carbon concentrating mechanisms in photosynthesis // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci.- 2008.- V. 363.- P. 2641-2650. Т.Д. Мукашева, Р.Ж. Бержанова, М.Х. Шигаева, Р.К. Сыдыкбекова, Л.В. Игнатова, Д. Даутова, А.А. Сартаева СТАБИЛИЗАЦИЯ ПОПУЛЯЦИИ И СЕЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ - ДЕСТРУКТОРОВ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ (Казахский национальный университет имени аль-Фараби, Казахстан, г.Алматы) Проведена сравнительная оценка методов отбора активных вариантов у штамма Rhodococcus equi 51КС. Установлено, что для селекции вариантов с повышенной деструктивной активностью можно рекомендовать два метода – метод продленного культивирования в жидкой среде с ПАУ и метод продленного культивирования с постепенным возрастанием ПАУ в среде. Подверженность микроорганизмов, применяемых в микробиологической промышленности, популяционным изменениям приводит к снижению их продуктивности и эффективности технологического процесса. Это вызывает необходимостью проведения исследований по стабилизации популяции и отбору культур с высокой стабильной активностью. К числу ценных в практическом отношении культур относятся углеводородокисляющие микроорганизмы, способные утилизировать углеводороды. Важность отбора вариантов, обладающих, высокими способностями к деструкции, представляет большой интерес с точки зрения создания полноценных и высококачественных препаратов для экобиотехнологических целей [1]. Использование новых селекционных подходов, направленных на повышение адаптивных возможностей и получение преимущественно полезных мутаций получило развитие сравнительно недавно. Традиционно для получения продуктивных штаммов микроорганизмов использовали индицированный мутагенез с последующим отбором полезных мутантов, который применяется до сих пор. В настоящее время применяют новые методы, основанные на технологии рекомбинантных ДНК (генетическая инженерия). Однако использование рекомбинантных штаммов микроорганизмов для экологических целей не целесообразно. Поэтому необходимо разрабатывать иные подходы для отбора высокоактивных вариантов у микроорганизмов - деструкторов. Одним из таких является использование методов, основанных на повышение адаптивных возможностей микроорганизмовдеструкторов. При хранении промышленных штаммов микроорганизмов, помимо потери жизнеспособности клеток, наблюдается также процессы популяционной изменчивости. При этом доминантный фенотип замещается другими измененными исходными свойствами и продуктивной активностью, происходит потеря штаммами приоритетных свойств. Это обусловило необходимость проведения работ по разработке подходов повышения деструктивной активности микроорганизмов, входящих в состав препаратов для биоремедиации загрязненных экосистем после их хранения. В этой связи были проведены исследования по раззрабоки методических рекомендации для отбора перспективных микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов. Материал и методы В работе использовали штамм Rhodococcus equi 51КС [3-4]. Рост микроорганизмов на твердых полициклических ароматических углеводородах изучали при выращивании микроорганизмов на агаризованной минеральной среде с добавлением ПАУ на поверхность питательной среды. Способность штаммов к трансформации полиароматических углеводородов изучали на агаризованной минеральной среде 8Е по методике [5]. Микроорганизмы выращивали на агаризованной минеральной среде на чашках Петри с нафталина (50 мг/л, 100 мг/л и 150 мг/л) и антрацена (25 мг/л, 50 мг/л и 100 мг/л). Углеводороды растворяли в хлороформе, равномерно распределяли по поверхности среды, затем наливали второй тонкий слой среды. Колонии микроорганизмов, способные использовать 78 углеводороды образовывали зоны просветления, не флуоресцирующие в ультрафиолетовых лучах поверхностного слоя углеводорода. Определение стабильности признака роста на ПАУ. Стабильность признака биодеградации штаммов-деструкторов определяли после хранения штаммов в течение года при температуре 4 - 5о С в холодильнике. После хранения культур микроорганизмов, проводили активизацию способности к росту на среде, содержащей 7% Тенгизской нефти. Затем проверяли стабильность признака роста на нафталине и антрацене. Стабильность признака определяли следующим образом: бактериальную культуру выращивали в мясопептонном бульоне (МПБ) при 28оС в течение 2 суток, после чего 0,1 мл бактериальной культуры вносили в 10 мл свежего МПБ для повторного выращивания. Процедуру повторяли 3-4 раза каждые 0, 3, 5 и 10 суток. На 3, 5, и 10 сутки роста из разведений делали высевы на чашки Петри с агаризованной средой (МПА) для получения изолированных колоний. Методом реплик сто отдельных колоний переносили на селективные чашки с нефтью. Стабильность признака определяли как процентное соотношение количества вариантов, сохранивших способность к росту на изучаемом субстрате, к общему числу проверенных вариантов. Отбор вариантов, растущих при высоких концентрациях нафталина и антрацена. Культуру выращивали на питательной среде МПБ или на синтетической среде с нафталином и антраценом. Через 5-10 суток роста культуры высевали на твердые питательные среды. Культуру, выращенную в МПБ, высевали на МПА с целью получения отдельных вариантов. Произвольно взятые варианты, методом реплик пересевали на твердую питательную среду, содержащую различные концентрации нафталина (150 -1000 мг /г) и антрацена (100 - 500 мг/л). Варианты, обладающие способностью к росту на высоких концентрациях ПАУ, сохраняли в течение одного месяца, затем проверяли стабильность признака роста на высоких концентрациях нафталина и антрацена. Метод накопительно-адаптационный. Штамм выращивали на МПА в пробирках. Суспензию клеток вносили в жидкую среду с нафталином (300 мг/л) или антраценом (150 мг/л). Полученную таким образом суспензию клеток переносили в жидкую среду с нафталином (500 мг/л) или антраценом (300 мг/л) и культивировали на качалке в течении 10 суток. Через 10 суток культивирования на качалке, производили высев суспензии на МПА с целью получения отдельных колонии. Метод продленного культивирования. Штамм выращивали на МПА в пробирках. Суспензию клеток вносили в жидкую среду с нафталином (300 мг/л) или антраценом (150 мг/л). Через 10 суток выращивания на качалке суспензию объемом 10 мл переносили в колбы с жидкой средой, содержащие нафталин (300 мг/л) или антрацен (150 мг/л) культивировали 10 суток. Через 10 суток еще раз суспензию переносили в колбы с жидкой средой, содержащие нафталин (300 мг/л) или антрацен (150 мг/л) культивировали 10 суток. Затем производили высев суспензии на МПА с целью получения отдельных колонии. Метод продленного культивирования постепенным возрастанием концентрации ПАУ. Штамм выращивали на МПА в пробирках. Суспензию клеток вносили в жидкую среду с нафталином (300 мг/л) или антраценом (150 мг/л). Через 10 суток выращивания на качалке суспензию объемом 10 мл переносили в колбы с жидкой средой, содержащие нафталин (400 мг/л) или антрацен (200 мг/л) культивировали 10 суток. Через 10 суток еще раз суспензию переносили в колбы с жидкой средой, содержащие нафталин (500 мг/л) или антрацен (300 мг/л) культивировали 10 суток. Затем производили высев суспензии на МПА с целью получения отдельных колонии. Произвольно взятые колонии, методом реплик пересевали на твердую питательную среду, содержащую различные концентрации нафталина (300 -1000 мг /г) и антрацена (200 - 500 мг/л). Колонии, обладающие способностью к росту на высоких концентрациях ПАУ, сохраняли в течение одного месяца или более 3 месяцев, затем проверяли стабильность признака роста на высоких концентрациях нафталина и антрацена. Результаты и обсуждение Разработка новых селекционных подходов, направленных на повышение адаптивных возможностей микроорганизмов-деструкторов получило развитие сравнительно недавно. Отбор вариантов с повышенной активностью у штаммов – деструкторов представляет собой задачу, специфичную для каждого конкретного случая. Так, при изучении естественной изменчивости можно провести стабилизирующий отбор активных вариантов у микроорганизмов - деструкторов. Однако в селекции микроорганизмов – деструкторов важна их адаптация к потреблению загрязнителя. Для отбора активных вариантов часто используют метод накопительных культур. Кроме т ого, еще в 1926 году для отбора деструкторов, усваивающих ароматические соединения, Доорен-де-Ийонгом был применен метод продленного культивирования в присутствии в среде ксенобиотика [6]. Сейчас он 79 практически забыт, но в последние годы привлек внимание исследователей работающие с микроорганизмами, окисляющие углеводороды. Все эти подходы были использованы для получения вариантов с высокой деструктивной активностью у штамма Mycobacterium thermoresistible 119-3ГМ [78]. С целью рекомендации метода по отбору вариантов с высокой деструктивной активностью были проведены такие же исследования со штаммом Rhodococcus equi 51КС, который также хорошо растет на различных ПАУ (таблица 1). Так, отобрано 789 вариантов у штамма Rhodococcus equi 51КС, полученных при использовании накопительно-адаптационного метода. Проверена их способность к росту при концентрации ПАУ от 200 до 1000 мг/л. Из 789 вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС всего 25 вариантов росли на твердой среде с ПАУ, содержащие высокие концентрации. Получены 908 вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС при использовании метода продленного культивирования. Все варианты были проверены на способность к росту при концентрации ПАУ от 300 до 1000 мг/л. Всего 13 вариантов росли на твердой среде с нафталином при концентрации 750 мг/л и 10 вариантов - 1000 мг/л, 15 вариантов росли на твердой среде с антраценом при концентрации 250 мг/л и 7 - 500 мг/л. Отобрано 966 вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС полученных при использовании метода продленного культивирования с постепенным возрастанием концентрации нафталина. Из них 13 вариантов росли на твердой среде с нафталином при концентрации 500 мг/л и 6 вариантов при 1000 мг/л. и 16 вариантов росли на твердой среде, содержащие высокие концентрации антрацена. В таблице 2 представлены сведение о стабильности вариантов, отобранных при использовании трех методов штамма Rhodococcus equi 51КС, которые исследовались на протяжении трех пересевов. Не все отобранные варианты штамма Rhodococcus equi 51КС сохранили признак роста на высоких концентрациях ПАУ при последующих пересевах. Наибольшее число вариантов, которые сохранили признак роста на средах с высоким содержанием ПАУ, были отобраны методами продленного культивирования и продленного культивирования с постепенным возрастанием ПАУ. Необходимо, отметить, что не все из отобранных вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС сохранили признак роста на высоких концентрациях ПАУ при пересевах. Таблица 1 - Рост вариантов на различных концентрациях нафталина штамма Rhodococcus equi 51КС ПАУ в Мор КоличеКонцентрация ПАУ в среде, мг/л среде фоти ство Количество вариантов (р<0,01) мг/л п вариантов нафталин 700 750 800 850 900 950 1000 накопительно-адаптационный метод нафтал 1 787±7,3 25±1,3 23±0,3 12±0,2 7±0,2 5±0,2 5±0,2 2±0,2 ин 2 2±0,2 2±0,2метод продленного культивирования нафтал 1 906±7,3 13±1,3 13±0,3 12±0,2 12±0,2 11±0,2 11±0,2 10±0,2 ин 2 2±0,2 2±0,2метод продленного культивирования с постепенным возрастанием ПАУ нафтал 1 966±9,3 19±1,3 12±1,7 10±1,1 10±1,1 7±1,2 7±1,2 6±1,3 ин 2 12±7,3 6±1,5 антрацен 300 350 400 450 500 накопительно-адаптационный метод антрац 1 883±9,4 25±2,8 9±1,9 6±0,3 5±1,2 5±0,3 ен 2 10±1,3 7±1,3 метод продленного культивирования антрац 1 784±6,3 15±1,3 13±1,6 11±1,3 11±1,5 7±0,9 ен 2 5±1,1 3±0,3метод продленного культивирования с постепенным возрастанием ПАУ антрац 1 874±7,3 13±2,8 11±1,8 10±0,8 8±0,9 6±0,8 ен 2 4±0,3 3±0,5 - 80 Наиболее количество вариантов, сохранивших способность к росту на высоких концентрациях ПАУ, были получены с использованием этих же методов. Эти данные совпадают с результатами, полученными на штамме Mycobacterium thermoresistible 119-3ГМ. Таблица 2 - Стабильность признака роста вариантов вариантов штамма Rhodococcus equi 51КС. Условия отбора Количество вариантов проверенных 2 вариантов на нафталине и антрацене у отобранных Пассажи 3 абс % абс % абс накопительно-адаптационный метод нафталин 25 23 100 18 72,1 12 антрацен 15 100 100 12 71,0 5 метод продленного культивирования нафталин 23 23 100 20 86,3 12 антрацен 21 100 100 15 71,5 10 метод продленного культивирования с постепенным возрастанием ПАУ нафталин 19 19 100 17 82,6 12 антрацен 16 12 88,8 10 62,5 8 4 % 48,1 33,3 56,1 47,6 53,1 41,1 Экспериментальный анализ методов селекции микроорганизмов-деструкторов токсических поллютантов исследователями до сих пор не проводился. Отсутствуют также исследования по совершенствованию способов отбора вариантов с повышенной активностью у микроорганизмовдеструкторов полициклических ароматических углеводородов. Отбор устойчивых микроорганизмов к токсичному субстрату и способных к росту при высоких его концентрациях, возможно, облегчается при наличии в среде ксенобиотика. На основании полученных данных можно предположить, что отбор вариантов, способных к росту при более высоких концентрациях ксенобиотика можно проводить при выращивании их на селективных средах, где в качестве селективного фактора является загрязнитель. Таким образом, сравнительная оценка разных методов отбора вариантов, способных к росту на высоких концентрациях ПАУ показала, что наиболее перспективными являются два метода: продленного культивирования в жидкой среде с ПАУ и продленного культивирования в жидкой среде с постепенным возрастанием в ней ПАУ. 1 Margesin R., Labbe D., Schinner F., Greer C.W., Wryte L.G. Characterizition of hydrocarbjn-degrading microbial population in contaminated and pristine alpine soils // Appl. Environ. Microbiol. - 2010. - Vol.69, .№6. - P. 3085-3092 3 Предпатент РК № 16968, МПК7 С 12 N 1/20. Штамм бактерии Mycobacterium thermoresistible 119-3ГМ используемый для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов / Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д., Сыдыкбекова Р.К., Атемова Г.Т. - Опубл. 23.12.2004; Бюл. №1. 4 Мукашева Т.Д. Оценка деструктивной активности различных форм биопрепаратов из нефтеокисляющих микроорганизмов //Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2007. - № 1 (31). –С. 75-81 5 Кiyohara Н., Nagao К., Уanа К. Rapid screen for bacteria degradatrion of water - insoluble solid hydrocarbons оn agar plates // Appl. Environ. Microbiol. - 1982. - Vol. 43, № 1. - Р. 454-457. 6 Скрябин Г.К., Головлева Л.А.Использование микроорганизмов в органическом синтезе. М. «Наука», - 1976. 323 с. 7 Мукашева Т.Д. Изучение популяционной изменчивости углеводородкисляющего штамма Mycobacterium thermoresistible 119- 3ГМ //Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2010. - № 3 . – С. 73-75. *** Бейімденудің үш тəсілін Rhodococcus equi 51КС субстрат штамына пайдалану кезінде орта құрамында жоғарғы денгейде нафталин жəне антрацен болғанда өсу қабілеті жақсы байқалады. *** When you use three methods to adapt to the strain of Rhodococcus equi 51KS substrate selection options, as well as the ability to increase in environments with a high content of naphthalene and anthracene. 81 Р.Ж. Бержанова, Т.Д. Мукашева, М.Х. Шигаева, Р.К. Сыдыкбекова, Л.В. Игнатова, Ж.К. Искакова, Д. Дуйсембинова, А. Алашбаева, А.А. Сартаева СООБЩЕСТВА АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА STREPTOMYCES В ПОДЗОНАЛЬНЫХ ПОДТИПАХ ПОЧВ РАВНИННОЙ ТЕРРИТОРИИ КАЗАХСТАНА (Казахский национальный университет имени аль-Фараби, Казахстан, г. Алматы) Известно, что представители рода Streptomyces являются наиболее распространенным родом актиномицетов в почвенном комплексе. Актиномицеты живут в различных почвах, особенно часто их обнаруживают в подзолистых и красноземах [1]. Ряд исследователей из различных типов почв впервые выделили штамм 19/97М Streptomyces lateritius Sveschnikova и проведены исследования по твердофазному культивированию биологически активного штамма на коре пихты и лиственницы и древесной зелени пихты [2, 3]. Ряд авторов проводили исследования динамики изменений в структуре сообщества актиномицетов чернозема обыкновенного и показали, что в сообществе стрептомицетов верхнего слоя почвы во все сезоны высокую долю участия имеют St.sporoherbeus секция Azureus серии Coerulescens и St.grisinus из секции Cinereus серии Achromogenes (21-24 и 11-17% соответственно). Тогда как в слое 10-20 см весной и осенью доминирующее положение занимал St.sporoherbeus, а летом – St. grisinus и St. dayalbaghensis из секции Albus серии Albocoloratus. В нижележащем слое (20-30 см) в весенний и летний периоды наибольшая доля участия характерна для St.violaceomaculatus из секции Roseus серии Roseovilaceus,а осенью- St.enduracidicus из секции Cinereus серии Chromogenes, St.grisinus и St.sporoherbeus [4]. Материалы и методы исследований Для определения видов актиномицетов были изучены следующие диагностические признаки [5, 6]. Морфологические – форма цепочек спор и характер поверхности оболочки спор. Для изучения морфологического строения репродуктивных структур культуры актиномицетов выращивали на среде овсяной агар в чашках Петри. Тип образования цепочек и характер поверхности спор определяли у зрелых культур обычно на 7-14-й день роста, иногда более поздние сроки. Кусочек агара с мицелием помещали на предметное стекло, срезав бритвой предварительно весь лишний агар, и просматривали под микроскопом MOTIC BA 300. Для обнаружения изомеров ДАПК биомассу актиномицетов в количестве одной микробиологической петли помещали в маленькую пробирку и заливали 0,1 мл 6 н. HCl. Проводили разделение аминокислот с использованием растворителей: метанол: дистиллированная вода: 6 н. HCl:пиримидин [7]. Культуральные свойства - цвет воздушного и субстратного мицелия, цвет растворимых пигментов окрашивающих среду, производили на 7-, 14- и 21-й день роста культуры. Субстратный мицелий со спорами наблюдали, используя метод можно желобка. Актиномицеты выращивали на агаризованной овсяной среде, используя метод желобка. В агаровой пластинке в чашке Петри вырезали стерильным скальпелем желобок шириной в 1 см на всю глубину агара. Края желоба засевают культурой актиномицета. На засеянные участки желобка помещали предметное стерильное стекло. Чашки инкубировали в термостате при температуре роста актиномицета. Стекла снимали с агара, фиксировали жидкостью Карнуа, окрашивали метиленовым синим (водный 1 %-й раствор) и рассматривали под микроскопом. Результаты и обсуждения Актиномицеты широко распространены в природе и основным местом их обитания является почва. При изучении распространения актиномицетов в почвах немалую роль играет видовой их видовой состав. При изучении различных типов почв Казахстана была установлена смена доминирующих форм. Результаты исследований показали, что отдельные типы почв имеют характерные спектры доминирующих форм микроорганизмов. Некоторые виды могут встречаться в разнообразных почвах. Доминирующее положение в черноземе обыкновенном занимали актиномицеты рода Streptomyces. На питательных средах доминировали кожистые обособленные колонии, на поверхности которых воздушный мицелий образовывал хлопьевидные переплетения. Актиномицеты рода Streptomyces были обнаружены во всех типах почв Казахстана на глубине 0-10 и 10-20 см. Каждый тип почвы характеризовался специфическим спектром наиболее распространенных видов стрептомицетов. Все выделенные стрептомицеты распределяли согласно принципу классификации, предложенной Г.Ф. Гаузе. При этом было установлено, что большинство актиномицетов по цвету воздушного мицелия принадлежали к следующей секции Albus, Imperfectus, Helvoloflavus и Cinereus. А по цвету субстратного мицелия на минеральной среде стрептомицеты каждой секции подразделяются на серии Aureus, Albus, Roseus и Cinereus. Если образуется темно- зеленый, бурый или черный растворимый 82 пигмент, то считается, что культура образует меланоидные пигменты. Такие культуры встречались только в бурой пустынной почве. Идентичные штаммы стрептомицетов группировали на основании морфологических (строение репродуктивных структур) и культуральных признаков (окраска воздушного и субстратного мицелия, образование растворимых пигментов и характер роста культур) при росте на крахмало-казеиновой среде. Для определения видовой принадлежности исследовали морфологические и культуральные признаки, строение органов спороношения на среде овсяной агар. При определении видов у актиномицетов также учитывали их способность образовывать красящее вещество (пигменты), диффундирующие в среду. У представителей рода Streptomyces – колонии часто кожистые и обособленные, поверхность вначале гладкая, а на 14 сутки формируются переплетения воздушного мицелия. Воздушный мицелий состоит из различных спор, образуя цепочки спор на ветвях воздушного мицелия, спиральные цепочки спор с хорошо развитыми правильными, растянутыми спиралями, число спиралей от 2 до 5. Воздушный мицелий белый. Цвет субстратного мицелия определяли по цвету обратной стороны колонии. Если цвет субстратного мицелия изменяется в процессе роста культур, то последний цвет будет основным. Цвет субстратного мицелия описывали на овсяном агаре на 7-, 14- и 21-й день роста культуры. Диагностическую ценность имеет только хорошо выраженная окраска. Грамположительные, растут при температуре 25 – 300С. У этих культур в клеточной стенке пептидогликана содержится LL-ДАПК. Все изученные культуры этого рода выделяют пигменты, диффундирующие в культуральную среду (рисунок 1). Все культуры каталазоположительные. Различаются между собой по разложению крахмала, желатины и казеина. Из культуральных показателей для разделения актиномицетов на группы наиболее значима окраска культур пигментация. По этому признаку представители рода Streptomyces поделили на две группы бесцветные и пигментированные. Анализируя таблицу 1 можно сказать, что в каждом типе почвы имеется специфический спектр распространенных видов актиномицетов рода Streptomyces. Для большинства видов стрептомицетов отмечена явная приуроченность к определенному типу почв. Род Streptomyces встречается во всех типах почв Казахстана. Из них наиболее распространенный вид это S.albus, который встречался почти во всех исследованных образцах почвы. Представители вида S.coelicolor выделены из серобурой пустынной, бурой пустынной, светлокаштановой щебнистой и среднекаштановой почве. Культуры S.griseoflavus и S. сyaneus главным образом выделялись только из бурой пустынной почвы Карагандинской области. Вид S. сyaneus можно считать основным представителем типичного чернозема. Таблица 1 - Распределение доминантных видов представителей рода Streptomyces в почвах различных типов (тыс. КОЕ/г почвы) Тип почв S. S. S.albu S. S.capu coelicol griseofl s cyaneus ensis or avus Серобурая, пустынная, Алматинская обл. 1,5 2,8 Серобурая, пустынная, Карагандинская обл. 11,2 11,8 Серобурая, пустынная, Жамбылская обл. Бурая пустынная, Карагандинская обл. 0,5 21,5 3,1 Светло-каштановая, щебнистая, Карагандинская 0,1 обл. Среднекаштановая, Карагандинская обл. 1,1 10,2 50,3 Темно-каштановая, карбонатная, Акмолинская область, Жаркаинский район Темно-каштановая, карбонатная, Акмолинская 1,2 область, Ерейментауский район Чернозем обыкновенный, Северо-казахстанская область Чернозем южный, Акмолинская область, 12,3 Зерендинский район Чернозем южный, Костанайская область 8,9 83 Следует отметить, что культура Streptomyces capuensis выявлена только в среднекаштановой почве Карагандинской области, а в других исследованных почвенных образцах практически отсутствовала (рисунок 1). Streptomyces coelicolor Streptomyces griseoflavus Рисунок 1 – Макроморфология и микроморфология актиномицетов рода Streptomyces Стрептомицеты делятся на две группы. Первые при росте на питательных средах есть культуры, которые не образуют красящие вещества. К ней отнесена только одна культура Streptomyces cyaneus. Воздушный мицелий таких актиномицетов может быть белым, светло-серым, кремовым, нижняя сторона колонии бесцветная. Актиномицеты второй группы образуют красящие вещества - пигменты. Колонии этих культур при росте на питательных средах приобретали различную окраску: синюю, фиолетовую, желтую, оранжевую, черную, коричневую. По этому признаку культуры Streptomyces griseoflavus, Streptomyces albus, Streptomyces coelicolor и Streptomyces capuensis отнесены к актиномицетам второй группы. Внешний вид колоний актиномицетов также различен: колонии бывают с гладкой, бугристой, складчатой и зернистой поверхностью. Воздушный мицелий у всех изученных актиномицетов формировался на поверхности колонии. Нити его отходят от мицелия колонии, разрастаются в густую пушистую, бархатистую или мучнистую массу. У культуры Streptomyces griseoflavus – колонии округлой формы, поверхность морщинистая, характерен белый воздушный мицелий, субстратный мицелий темно-коричневого цвета, при росте на глюкозо-дрожжевой среде образуют черный растворимый пигмент, выделяющийся пигмент окрашивает среду, это связано с образованием меланоидных пигментов. При изучении морфологических признаков было установлено, цепочки спор спиральные. Данная культура отнесена серии Albus и представлена видом Streptomyces griseoflavus (рисунок 2). Рисунок 2 – Мицелий со спиралями у актиномицетов вида Streptomyces coelicolor Streptomyces albus цепочки спор в виде крючков, спирали с одним завитком, споры гладкие, на среде глицерин – нитратный агар колонии округлой формы, поверхность морщинистая, субстратный мицелий темно-бурого цвета, а воздушный мицелий серый с различными оттенками, меланоидные пигменты не образует. К серии Helvoloflavus отнесен вид Streptomyces cyaneus на среде глицерин – нитратный агар колонии оранжевого цвета округлой формы, поверхность выпуклая морщинистая, не выделяет пигмент в среду, воздушный мицелий желтоватый, субстратный оранжевый. Представители секции Cinereus отнесены к виду Streptomyces coelicolor на среде глицерин – нитратный агар колонии округлой формы, поверхность морщинистая, выделяют растворимые 84 пигменты, окрашивающие среду, субстратный мицелий буроватого цвета, воздушный мицелий серый с различными оттенками. У этой культуры цепочки спор прямые, волнистые. Культура, отнесенная к серии Imperfectus, идентифицирована как Streptomyces capuensis – колонии черного цвета, поверхность гладкая, но со временем поверхность становится морщинистой, выделяет темно бурый пигмент в среду, характерен специфический запах; субстратный мицелий темно коричневого цвета, а воздушный мицелий плохо развит. Исследования целинного состояния подзональных подтипов почв равнинной территории Казахстана показали, что во всех типах почв выявлены стрептомицеты, и представлены следующими видами: Streptomyces griseoflavus Streptomyces albus, Streptomyces cyaneus и Streptomyces coelicolor. 1 Гришко В.Н., Сыщикова О.В. Сообщества актиномицетов рода Streptomyces в почвах, загрязненных тяжелыми металлами // Почвоведение. - 2009. - № 2. - С. 235-243. 2 Звягинцев Д.Г., Зенова Г.М., Оборотов Г. В. Мицелиальные бактерии засоленных почв // Почвоведение. - 2008. - № 10. - С. 1250-1257. 3 Зенова Г.М., Грядунова А.А., Поздняков А.И., Звягинцев Д.Г. Аэробные и микрофильные актиномицеты агротрофяной и трофяной типичных почв // Почвоведение. - 2008. - №2. - С. 235-240. 4 Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М., Полянская Л.М. Разнообразие грибов и актиномицетов и их экологические функции // Почвоведение. - 1996. - №6. – С. 705-713. 5 Гаузе Г.Ф., Т.П. Преображенская, Свешникова М.А, Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов.- М.: Наука, 1983. - 258 c. 6 West M. J., Williams S.T., Embley T.M., Munro J.C. Using bacteriofages for skrining of soil and soil isolates on presence of specific Аctinomycetes // The 9-th Intern. Sym. on the Biol. of Actinomycetes. - Moscow, 1994. 7 Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. - Изд-во МГУ, 1991. - С. 131 – 132. *** Қазақстан топырағынан бөлініп алынған актиномицеттердің түрлік құрамы алуантүрлі. Барлық топырақ үлгілерінен стрептомицеттер бөлініп алынды жəне келесі түрлермен белгіленді: Streptomyces griseoflavus Streptomyces albus, Streptomyces cyaneus жəне Streptomyces coelicolor. *** Species composition of actinomycetes from soil of Kazakhstan is very diverse. In all types of soil found stpretomicety and are represented by the following species: Streptomyces griseoflavus Streptomyces albus, Streptomyces cyaneus and Streptomyces coelicolor. Т.Д. Мукашева, М.Х. Шигаева, Р.Ж. Бержанова, Р.К. Сыдыкбекова, Л.В. Игнатова, Д. Даутова, А. Алашбаева, А.А. Сартаева РАЗРАБОТКА РЕГЛАМЕНТА ПОЛУЧЕНИЯ МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ КОМПОЗИЦИЙ ИЗ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ И ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ (Казахский национальный университет имени аль-Фараби, Казахстан, г. Алматы) Использование препаратов на основе микроорганизмов, состоящих из различных штаммов, способных окислять углеводороды нефти, приводит к ускорению процесса очистки почвы. В условиях повышенного уровня загрязнения природной среды нефтью и нефтепродуктами необходимо применять препараты из композиции из разных видов нефтеокисляющих микроорганизмов. Так, в России наиболее известными из них являются «Путидойл», «Деворойл», «Биодеструктор», «Экойл», «Олеворин», «Родотрин», «Микрозим тм Петро тит», «Эконадин». В Казахстане разработана композиция на основе природных штаммов Pseudomonas putida ГНПО ПЭ-Р-6, Pseudomonas fluorescens ГНПО ПЭ-Р-5, Bacillus subtilis ГНПО ПЭ-Р-7 и комплекса минерального удобрения дигидрофосфата аммония и гирофлорида калия [1]. Препараты, разработанные в России не применимы в условиях Казахстана. Для использования таких препаратов для очистки почвогрунтов и нефтешламов необходимо создания особых условий с учетом климатических параметров. Использование зарубежных препаратов нерационально. Эти препараты отличаются дороговизной для казахстанских потребителей. В связи с этим при разработке биопрепаратов для очистки почвогрунтов и нефтешламов актуальной задачей является создание многокомпонентных композиции из нефтеокисляющих микроорганизмов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Углеводородокисляющие микроорганизмы: Mycobacterium thermoresistible 119-3ГМ, Rhodococcus equi 51КС, Mycobacterium sp. 222АТ, Mycobacterium sp. 229СЗ; Rhodococcus sp. 1СЗ, Rhodococcus sp. 115КК; Bacillus sp. 26АТ, Bacillus sp. 114КС; Pseudomonas sp. 122АС и культуры дрожжей Candida nitratiovorans В1, Candida chilensis В2, Trichosporon cutaneum Р20СО2 и Trichosporon terrestre СМ7 [2]. 85 Для определения оценки деструктивной активности углеводродкисляющих микроорганизмов использовали минеральную среду следующего состава (г/л): K2HPO4 - 1,0; MgSO4 - 0,2; KH2PO4 - 1,0; NH4NO3 - 1,0; CaCl2 - 0,02; FeSO4 – 0,002; дистиллированная вода – 1л; нефть и нефтепродукты добавляли от 30 мл/л до 200 мл/л. Питательные среды для получения высокого выхода биомассы: Среда 8Е – (NH4)2HPO4 – 0,5 г/л, КН2РО4 – 0,7 г/л, MgSO4 × 7H2O - 0,8 г/л, NaCl – 0,5 г/л [3]. Среда Раймонда - NH4NO3- 1г/л, К2НРО4 – 1 г/л, КН2РО4 – 1 г/л, МgSО4 - 0,2 г/л, СаСl2 - 0,02 г/л, FeSO4-0,002 г/л, дрожжевой экстракт 1 г/л, 1 литр дистиллированной воды [4].Среда Макланга - NaNO3 – 2 г/л, MnSO4 × 7H2O - 0,3 г/л, Fe(SO4)3 – 0,001 г/л, K2HPO4 - 1 г/л, ZnSO4 - 0,002 г/л [5]. Минеральная среда - K2HPO4 - 1,0; MgSO4 - 0,2; KH2PO4 - 1,0; NH4NO3 - 1,0; CaCl2 - 0,02; FeSO4 – 0,002 [6]. Питательная среда для получения посевного материала: – (NH4)2HPO4 – 0,5 г/л, КН2РО4 – 0,7 г/л, MgSO4 × 7H2O - 0,8 г/л, NaCl – 0,5 г/л [7]. Активация культур после хранения. Для активации культур использовали клетки микроорганизмов в экспоненциальной фазе их роста. После хранения двухсуточные культуры бактерий и трехсуточные культуры дрожжей смывали с косяков и переносили в минеральную среду, содержащую в качестве единственного источника углерода и энергии 3% ксенобиотика. Культивирование осуществляли на качалке в условиях интенсивной аэрации при температуре 28 0С. Бактерии выращивали 48 часов, а дрожжевые культуры 72 часа. На 2, 3 сутки роста из соответствующих разведений делали высевы на чашки Петри с агаризованной средой (МПА или СА) для получения изолированных колоний, затем адаптированные колонии микроорганизмов высевали на косяки. Получение биомассы клеток. Для получения биомассы композиции, состоящей из углеводородокисляющих штаммов, культуры по отдельности выращивали минеральной среде с титром клеток 109. В качестве посевной среды использовали минеральную среду. Культуры в посевной среде выращивали на качалке 2 суток. Инокулят из посевной среды переносили в минеральную среду. Для этого в колбы на 500 мл вносили по 100 мл минеральной среды. Культуры выращивали при температуре 280С на качалке 220 об/мин в течение 2 суток для бактерий и 3 суток для дрожжей до титра клеток 1010-11. Из полученного посевного материала брали по 1 мл клеточной суспензии и все шесть штаммов выращивали в ферментационной среде. Колбы засевали подготовленными суспензиями клеток предлагаемых штаммов в таком количестве, чтобы в 1 мл минеральной среды содержалось около 109 клеток. Биомассу микроорганизмов культивировали на качалке при 220 об/мин в течение 48 часов. Через 48 часов определяли общую численность. Аналогичные эксперименты проводили с использованием среды Раймонда и Макланга. Получение посевного материала. Клетки каждого штамма после хранения со скошенного агара переносили в колбы со средой следующего состава: (NH4)2HPO4 – 0,5 г/л, КН2РО4 – 0,7 г/л, MgSO4 × 7H2O - 0,8 г/л, NaCl – 0,5 г/л. В качестве органических веществ использовали дрожжевой автолизат в количестве 0,5% и 1% и в качестве единственного источника углерода и энергии 3% дизельного топлива. Культивировали на качалке при аэрации и температуре 28°С в течение 2 -3 суток. Результаты и обсуждение Подбор и отработка основных параметров для получения многокомпонентной композиции, состоящей из комплекса разных родов микроорганизмов В мировой практике широко используется технология биоремедиации - внесения в загрязненные нефтепродуктами участки почвы и воды концентрированных биопрепаратов на основе углеводородокисляющих микроорганизмов, которые интенсифицируют метаболизм нефтезагрязненных почв. Для получения посевного материала бактериальные штаммы выращивали 20 - 24 часов, a дрожжевые штаммы 72 часа. Затем, на стадии получения биомассы инокуляты соединяли в одну колбу со средой того же состава, внося в качестве посевного материала штаммы в соотношении (1:1), При этом сокращается срок их совместного культивирования до 26-28 часов, с конечным нейтральным значением pH культуральной жидкости. В течение эксперимента определяли вес сухой биомассы и pH среды. Препараты, используемые в очистки экосистем, представляют собой биомассу жизнеспособных клеток или лиофилизированные клетки штаммов деструкторов. Для получения максимального выхода клеточной биомассы большое значение имеет получение посевного материала в предферментационной стадии из многокомпонентных композиций. 86 Как видно из полученных данных, при культивировании предферментационной стадии углеводородокисляющих штаммов на среде, содержащей 1% автолизата, вес сухой биомассы примерно увеличивался в 4 раза (рисунок 1, а). На первые сутки вес сухой биомассы в среднем составил 0,9 г на 100 мл среды, а на вторые сутки сухой вес биомассы равнялся 3,8 г на 100 мл среды. При внесении в среду 0,5 % дрожжевого автолизата сухой вес и плотность полученной биомассы поднялся на 2 порядка по сравнению с исходным весом. Так исходный вес составил – 0,9 г на 100 мл среды, а на 2 сутки 2,1 – 2,5 г на 100 мл среды (рисунок 1, б). Таким образом, оптимальные концентрации компонентов среды как 1% автолизата увеличивает выход получения посевного материала. Совместное культивирование штаммов – деструкторов на последнем этапе позволяет упростить и удешевить процесс промышленной наработки препарата, получить конечный продукт с более высоким титром углеводородокисляющих клеток и с нейтральным значением pH культуральной жидкости, полнее утилизировать основные компоненты питательной среды. а) среда с 1% автолизата б) среда с 0,5 % автолизата Рисунок 1 – Получение посевного материала для наработки биомассы нефтеокисляющих микроорганизмов Состав компонентов питательной среды и их концентрации были специально подобраны. Выращивают каждый штамм индивидуально в соответствии с их физиологическими особенностями. Инокулят из предферментационной стадии переносили в ферментационную среду. Выращивание проводили в колбах с рабочим объемом 500 мл, инокулят вносили в количестве 10 % от объема среды. При культивировании композиций в среде с рН 7,3 сухой вес биомассы на 2 сутки выращивания достигал максимальных значений 7,8 г/мл. Тогда как исходный вес сухой биомассы на первые часы культивирования составил 1,3 г/мл. Кратность увеличения составляла примерно 6,1 раза (рисунок 2, а). Из полученных результатов следует, что при совместном культивировании штаммов, значения pH культуральной жидкости в течение процесса ферментации находилась в пределах 7,3-7,5, что является несомненным достоинством процесса. Также были определен температурный режим культивирования. Температура среды является наиболее значимым лимитирующим фактором всех метаболических процессов. Штаммы новых композиций выращивали при температуре 200С, 28° С, 300С и 350С. Было показано, что оптимальный температурный интервал для роста и развития углеводородокисляющих микроорганизмов является 280 С. При температуре 280С наблюдается максимальный прирост биомассы композиции, оптическая плотность клеточной суспензии увеличивается в 4 раза по сравнению с исходными значениями. В начальные сутки оптическая плотность равнялась – 0,15, а на сутки значения достигли до 0,55 оп. единиц (рисунок 2, б). Отклонения от этой температуры, как в сторону уменьшения 200С, так и в сторону увеличения 350С замедляется процесс роста и развития углеводородокисляющих микроорганизмов. Падает титр клеточной биомассы многокомпонентной композиции. Это связано с тем, что исследуемая группа УОМ является мезофильной и указанные температурные условия для них наиболее оптимальны. Следует также учесть, что при повышении температуры наблюдается уменьшение растворимости кислорода в воде, что отрицательно сказывается на росте и развитии новых композиций. 87 а) рН среды б) температура среды Рисунок 2 – Прирост клеточной биомассы новых композиции нефтеокисляющих микроорганизмов при рН и температуре Таким образом, оптимальной температурой для роста и развития многокомпонентной композиции надо считать 280 С. При разработке новых композиции исходили из общего положения о том, что эффективность биопрепарата определяется высоким титром клеток в этом препарате. Использование нативной биомассы нефтеокисляющих микроорганизмов или их суспензий ограничено сроками хранения, как правило, один месяц. Известно, что для хранения используют различные сорбенты: минеральные (вермикулит, цеолит, керамзит), органические (торф, солома, опилки), синтетические (ткани, волокна). Для концентрирования клеточной биомассы многокомпонентной композиции в качестве стабилизаторов использовали опилки и бентонит. При выращивании клеточной биомассы композиции нефтеокисляющих микроорганизмов получили препарат с высоким титром клеток 10,8х1012 КОЕ/мл. По данным литературы известно, что добавка стабилизатора позволяет сохранить высокую углеводородокисляющую активность препарата во время хранения. Густая клеточная биомасса, представляющая собой концентрат живых клеток штаммов и остатков питательной среды, добавляли опилки для сгущения (в количестве 5 г на 300 мл среды). Затем ставили на хранение при температуре +40С на 3 месяца. На каждом этапе контролировали численность жизнеспособных клеток в препарате. До хранения количество жизнеспособных клеток в биопрепарате было в пределах 10,1 х 1012 КОЕ/мл, а после 90 дней хранения количество жизнеспособных клеток оставалось на высоком и составило 9,8 х 1012 КОЕ/мл. Клетки культур, выращенные в течение 48-72 часов, помещали в стерильные флаконы, затем вносили стерильный бентонит из расчета 1:1, проверяли количество жизнеспособных клеток до хранения и после хранения. Проверяли численность жизнеспособных клеток в 1 мл биомассы. При проверке было установлено, что титр жизнеспособных клеток снижается только на два порядка. Численность на первые сутки составила 11,8 х 1012 КОЕ/мл, после хранения было в пределах 7,3 х 109 КОЕ/мл. Таким образом, после 3 месяцев хранения образцы биомассы композиций состоящих из нефтеокисляющих микроорганизмов, приготовленные с использованием в качестве носителя бентонита, выживаемость клеток в биопрепаратах снижалась на два порядка. Изучение деструктивной активности биопрепарата в модельных условиях. Для создания биопрепаратов нами использовались бактериальные культуры и дрожжевые организмы. Проведена серия модельных опытов по изучению активности биомассы композиции при внесении их в естественно загрязненные почвы. Композиции из штаммов – деструкторов из нефтеокисляющих микроорганизмов вносили из расчета 500 мг на 100 г загрязненной почвы. Продолжительность эксперимента составила 20 дней. Определяли приживаемость микроорганизмов и количество остаточной нефти в нефтезагрязненной почве. Для сгущения биомассы использовали опилки. Модельные исследования по очистки почвогрунта и нефтешлама. В почвогрунте исходная степень загрязнения нефтяными углеводородами составила 230,9 г/кг почвы. Через 20 суток количество нефти в контроле без внесения микроорганизмов снизилось лишь до 219,1 г/кг почвы. В опытных вариантах содержание нефти на 20 сутки снизилось до 38,37 г/кг при внесении биопрепарата, состоящей 8 нефтеокисляющих культур. Степень утилизации нефтяных углеводородов составила 83,1%. 88 Таблица 1 - Остаточное количество нефти в нефтезагрязненной почве с внесением композиции из штаммов – деструкторов (почвогрунт) Степень потребления Контроль без внесения Конечная Начальная нефти в почве, % биопрепарата концентрация концентрация углеводородов, г/кг углеводородов, г/кг сухой почвы сухой почвы почвогрунт 230,9±1,6 212,1±0,3 38,37±2,9 83,4 нефтешлам 119,5±0,9 105,1±1,3 23,02±1,9 80,8 Аналогичные модельные эксперименты проведены по очистке замазученных грунтов, жидких отходов бурения и твердых горючих нефтесодержащих отходов на нефтешламе. Исходное содержание углеводородных компонентов в нефтешламе составило 119,5 г/кг почвы. В результате экспериментально лабораторных исследований установлено, что на 20 сутки окислению подверглось до 80,7% нефти. Кроме того, более высокая эффективность применения 8 культур объясняется и сложностью субстрата, каковым является нефтешлам, представляющей собой тяжелые нефтяные остатки, содержащие в среднем (по массе) 10 – 56% нефтепродуктов, 30 – 85% воды, 1,3 – 46% твердых примесей. В почвогунте и нефтешламе с внесением биомассы композиции на двадцатые сутки были выявлены морфологические колонии, идентичные внесенным штаммам. Установлено, что при интродуцировании в почву нефтеокисляющих бактерий и дрожжей клетки сохраняли свою жизнеспособность (рисунок 3). Рисунок 3 – Колонии микроорганизмов на МПА, выделенные из почвогрунта и нефтешлама на 20 сутки после внесения препарата Таким образом, результаты проведенных предварительных научных исследований позволяют разработать дальнейшую технологию по обезвреживанию замазученных грунтов, жидких отходов бурения и твердых горючих нефтесодержащих отходов полигона г. Уральска. Полученные результаты имеют практическое значение для очистки нефтесодержащих объектов. На основе полученных результатов исследований будет разработана технология по обезвреживанию замазученных грунтов, жидких отходов бурения и твердых горючих нефтесодержащих отходов именно касающегося полигона г.Уральска. Изучение деструктивной активности биомассы композиции в полевых условиях. Технология биологической очистки загрязненных нефтью грунтов и нефтешламов. Процесс очистки начинается на площадке накопления нефтешламов. Визуально оценивалапсь степень замазучивания грунта. Наблюдения за процессом очистки опытного полигона в условиях экспериментального нефтяного загрязнения начались в 21 июне 2010 года. Полигон находится в 9 км от западной части г. Уральска, по трассе Саратов-Уральск. Полигон предназначен для хранения и утилизации нефтяных отходов и буровых шламов, привезенных из нефтяных месторождений и организации, занимающихся добычей и переработкой нефти. Занимаемая площадь полигона примерно 3000 м2. Растительность скудная, представлена полынью и житняком. Климат умеренно-засушливый, ветер северо-западный, скорость ветра 0,5 м/с, температура воздуха на период проведения очистных мероприятий был в пределах от 480С до 54 0С. В начале экспериментов были приготовлены 2 делянки площадью 200 м2, затем производили боронование почвы, следующим этапом работы было внесение биопрепарата. 89 Визуально почвогрунт темного цвета, маслянистый, резкий запах мазута и нефтепродуктов. Надо учесть тот факт, что почвогрунт и нефтешлам хранится в шламонакопителе в течение 1 года. В почвогрунте исходное содержание нефти составило 750,7 г/кг почвы. Через 10 суток содержание нефти понизилось до 364,3 г/кг почвы, утилизации подверглось до 51,4% нефти. Через 2,5 месяца после внесения биомассы композиции из нефтекисляющих микроорганизмов остаточное количество нефти в почвогрунте составило 121,0 г/кг почвы, а процент утилизированной нефти составил 86,3 %. Первоначально в нефтешламе содержалось до 137,2 г/кг почвы нефтяных углеводородов. Темпы разложения нефтяного загрязнения приходятся на начало эксперимента. Максимум углеводородокисляющей активности биомассы из нефтеокисляющих микроорганизмов пришелся на 10 сутки после начала эксперимента, вследствие чего и деструкции подверглось свыше 58,1% и остаточное количество нефтяных углеводородов составило до 57,4 г/кг почвы. На 63 сутки количество неподвергшейся деструкции нефти составило 16,8 г/кг почвы. А степень потребления нефти составила 87,5%. В контроле без внесения биомассы из нефтеокисляющих микроорганизмов понизилось на 3,9 % от начального содержания. В течение всего времени проведения работ проводились аэрация и орошение. Таким образом, разработан регламент получения многокомпоненных композиции нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки почвогрунтов и нефтешламов, а также и технология очистки нефтезагрязненных почвогрунтов шламов. Предложенную технологию можно считать крупномасштабной и достаточно эффективной. В микрополевых условиях на полигоне после внесение биомассы новых композициий степень утилизации углеводородов на 20 сутки в почвогрунте и нефтешламе составила до 83,1% и 80,7% соответственно. 1. Вельков В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации // Биотехнология. – 2001. – № 2. – С.70 –76. 2. Карасёва Э.В., Гирич И.Е., Худокормов А.А., Алешина Н.Ю., Карасёв С.Г. Биоремедиация черноземной почвы, загрязненной нефтью // Биотехнология. – 2005. - № 2. – С. 67-72. 3. Плешакова Е.В., Позднякова Н.Н., Турковская О.В. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путем стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры // Прикладная биохимия и микробиология. - 2005. - №1. - С.42 – 50. 4. Патент 2805 Россия. Консорциум микроорганизмов «Devoroil», используемый для очистки почвенных и солонцеватых экосистем от загрязнения нефтепродуктами /Борзенков И.А., Милехина Е.И. и др. - Опубл. 15.12.95; Бюл. №16. 5. Kilbone J., Daram A., Abbasian J., Kayser K.J. Isоlation and characterisation of Sphingomonas sp. GTIN11 capable of carbosole metobolism in petroleum // Biochem. And Biophys. Res. Commun. - 2002. - Vol.297, № 2. - P.242-248. 6. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Дульгеров А.Н., Иванов В.Н. Применение биопрепарата «Лестан» для очистки почвы от углеводородов нефти // Прикладная биохимия и микробиология. - 1996. - Т.32, №2. - С. 219-223. 7. Патент СССР 1805097. Ягафарова Г.Г., Скворцова И.Н., Зиновьев А.П. Ягафаров И.Р. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. 30.03.93. 8. Шигаева М.Х., Мукашева Т.Д., Сыдыкбекова Р.К., Бержанова Р.Ж. Подбор питательной среды для приготовления препаратов из нефтеокисляющих микроорганизмов //Вестник КазНУ. Серия биологическая. – 2007. - № 1 (31). – С.90-95. 9. Мукашева Т.Д., Шигаева М.Х., Сыдыкбекова Р.К., Бержанова Р.Ж. Изучение новых штаммов углеводородокисляющих микроорганизмов для биоремедиации почв // Международная научно-практическая конференция «Современные проблемы экологии и устойчивое развития общества», Алматы, Казакстан, 30 сентября – 1 октября 2010 года. Материалы. С. 223-226. 10. Бержанова Р.Ж., Мукашева Т.Д., Шигаева М.Х., Сыдыкбекова Р.К. Оптимизация условий культивирования новых композиций из углеводороокисляющих микроорганизмов //Вестник КазНУ серия биологическая №2 (48) часть 2, 2011. - С. 77-81. *** В лабораторных исследованиях были установлены и подобраны основные параметры и условия культивирования многокомпонентной композиции и разработан регламент получения многокомпонентных композиций нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки почвогрунтов и нефтешламов, а также технология очистки нефтезагрязненных почвогрунтов шламов. *** In laboratory studies were identified and selected key parameters and conditions of cultivation of multi-component compositions and formulated rules for mnogokomponennyh compositing microorganisms to clean soil and oil sludge and oilcontaminated soil and sludge decontamination technology. 90 ƏОЖ 502/504.064.3:582.259 Г. Өнерхан1, Б.К. Заядан2, С. Билал ЗЕРЕНДІ КӨЛІНЕН АЛЫНҒАН СУ ҮЛГІЛЕРІНЕ CHLORELLA SP-3K ШТАМЫН ӨСІРУ АРҚЫЛЫ БИОТЕСТ ЖҮРГІЗГЕН НƏТИЖЕЛЕР (1 Ш.Ш.Уəлиханов атындағы Көкшетау мемлекеттік университеті, 2 Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті) Көкшетау өңірі көлдерінің су экожүйелерінен бөлініп алынған микробалдырлардың штамдарынан, табиғи суларда тез өсетін жəне ластанған суларды тазалау қабілеті жоғары Chlorella sp-3K штамы сұрыптап алынып, осы штамм көмегімен Зеренді көл суына биотестілеу жүргізілді. Биотестілеу нəтижесінде Зеренді көл суында Chlorella sp-3K штамы клеткалар саны 16,8х106±0,5-ке дейiн өсіп, орташа улылықты көрсетті. Табиғи суларды тазалаудың бірнеше əдістері бар, олар – механикалық, физикалық жəне биологиялық əдістер. Соның ішінде ең тиімдісі биологиялық əдіс болып есептеледі. Бірақ та биологиялық əдіс қазіргі уақытқа дейін бактериялар негізінде жүріп келеді. Сондай-ақ тазалау негізінде балдырлар мен жоғары сатыдағы өсімдіктердің рөлі зор. Соның ішінде балдырлармен тиімді тазалау қолға алынып жатыр. Олар автотрофты организмдер ретінде фотосинтез кезінде су ортасындағы қоспалардың минералдануын жылдамдатады [1]. Көптеген балдырлар мен су макрофиттері тек минералдық заттармен ғана емес, сонымен қатар жай органикалық қосылыстармен де қоректенеді. Олар белсенді түрде азот ионын, фосфор мен басқа да биогенді заттарды сіңіреді. Құрамында 40-50мг/л азоты бар қоректік ерітіндідегі хлорелла мен сценедесмус 5-7 тəулік ішінде басқа бактерияларды толығымен жояды екен. Протококты балдырлар мен көптеген жоғары сатыдағы өсімдіктердің бактериоциттік қасиеті бар. Оларды ағын суға қосқанда жұқпалы микроорганизмдер жойылады. Ал хлорелла мен сценедесмустың антибактериялық қасиеті жоғары, олар тырысқақ, оба, туберкулез, ішек жəне т.б. ауру туғызатын микробтарға кері əсері бар [2,3]. Балдырлардың биомассасымен байытылған ағын суларды жер суғаруға пайдаланады. Хлорелла, сценедесмус, анкистродесмус жəне т.б. протококты балдырлар ауыл шаруашылық өсімдіктеріне бағалы биостимулятор болып табылады. Олар жерді витаминдермен, амин қышқылдарымен байытады жəне ондағы органикалық заттардың құрамын жоғарылатады. Хлорелла мен сценедесмус жəне т.б. балдырлардың суспензиясын ретімен пайдаланып, жерді суарып отырса, күріш, жуа жəне мақта өсімдігі (20-25 пайызға) жəне т.б. ауыл шаруашылық дақылдарының өнімділігі жоғарылайды [4,5,6]. Табиғи жəне жасанды суайдындарына улы заттардың түсуінен экожүйе бұзылу процестерге ұшырайды. Экотоксиканттар немесе улы заттарға ауыр металл қосылыстары (сынап, қалайы, мыс, мырыш, қорғасын жəне хром металдары), хлорорганикалық, күкіртті органикалық заттар, пестицидтер, мұнай жəне мұнай өнімдері, синтездік белсенді заттар, қышқылдар, фенолдар жəне т.б. қосылыстар жатады [3]. Қазіргі кезде суайдындарының улылығын жедел анықтайтын тəсіл ретінде биотестілеу əдістемесі, яғни улы заттардың зияндылық дəрежесін көрсететін биологиялық тест-организмдер қолданылады. Зертханалық тəжірибе жағдайындағы судың сапасын анықтауда тест–организмдердің тіршілігі, көбею жылдамдығы, тіршілік процестерінің қарқындылығы (тыныс алу, асқорыту, фотосинтез) қимыл əрекеттік реакциялары сияқты көрсеткіштер есепке алынады. Бұл тəжірибелер улылығы жоғары, тез əсер ететін химиялық заттарды анықтауға бағытталған [7]. Тест-организмдерді таңдауда бірнеше шарттар орындалуы тиіс. Олардың көлемі өте ірі емес, өсуі күрделі емес, тіршілік циклі қысқа жəне улы заттарға сезімталдығы жоғары жəне орташа деңгейде болуы қажет [8]. ЗЕРТТЕУ ОБЪЕКТІЛЕРІ МЕН ƏДІСТЕРІ Биологиялық модельдi нысандарды пайдалану нəтижесiнде гидросфераға биотест жүргiзу биология ғылымында кеңiнен таралған тəсiлдердiң бiрi. Əр түрлi химиялық қосылыстардың уыттылығын бағалауда, су ортасын биотестiлеу процесiнде осы уытты заттардың əсерiн сезiне алатын тiрi организмдер қолданылады. Соңғы жылдары су экожүйелерiндегi антропогендiк факторларды зерттеуге Chlorella, Chlamydomonas, Scenedesmus туыстарын пайдалануда [4,7,8]. Жұмыста тестілеу жүргiзiлген судағы улы заттардың əсерiнен балдырлардың көбею қарқындылығының өзгеруiн бақылау суымен салыстыра отырып анықтауға негiзделген биотестілеу əдістемесі қолданылды. Қарқынды көбеюдiң көрсеткiшi – балдырлар клеткаларының өсiм санының коэффициентi болып табылады. Улылықтың белгiсi бақылаумен салыстырғанда тест жүргiзiлетін судағы клеткалардың өсiм 91 санының коэффициенттерiнiң төмендеуi болып келедi. Қысқа мерзiмдi биотестілеу – 96 сағат iшiнде балдырларға тест жүргiзілетін судағы өте улы əсердiң барын, ал ұзақ – 14 тəулiк ішінде созылмалы улы əсерді анықтауға мүмкiндiк бередi. Тест нысаны ретінде арнайы бөлініп алынған микробалдыр Chlorella sp-3K штамы пайдаланылды. Балдырлардың дақылын қоректiк ортасы бар залалсыздандырылған колбаға ашық жасыл түс беретiн мөлшерде енгiздік. Балдырлар дақыл бетiнен 30-40 см қашықтықта орналасқан күндiзгi жарық шамдарында тəулiк бойы жарық түсiру кезiнде өсiріледi, жарықтану 2000-3000 л/к. Егу үшiн экспоненциалды өсу сатысында 5-7 тəулiктiк балдырлардың дақылы пайдаланылды. Биобақылау жүргiзу алдында оны төртiншi нөмірлі мембрандық сүзгiш немесе сүзгiштiк қағаз арқылы Зейтц аппаратының көмегiмен қоюлатады. Клеткаларды дақылды тұндырудан кейiн колбадан ортаны сорып алумен шоғырландыруға болады. Балдырлар сүзгiштен 30-50 мл бақылау суы бар колбаларға көшiрiледi. Егу үшiн қолданылатын клеткалардың сұйықтық санын тексередi. Сұйықтықта клетка саны 5-10 млн.кл/мл болу керек [8]. Колбаларды мақта-дəкелi тығындармен тығындайды, оларды жақсылап араластырады жəне əр колбадағы клеткалар санын анықтайды. Клеткалар санын санау үшiн Горяевтің есеп камерасы пайдаланылды. Олардың саны 25-50 000 кл/мл болу керек. Колбаларды люминостатқа немесе тiк түсетiн күн сəулелерiнен қорғаланатын, жақсы жарықтанған жерге қояды. Биотестілеу жарықта жəне қолайлы температурада жүргiзiледi. Биотестілеу 96 сағаттан кейiн аяқталады. Суда өте улы əсердiң бар -жоғын анықтау үшiн, əр колбадан клеткалардың санын санайды. Өте улы əсер болмаған жағдайда биотестілеу жалғастырылады. Жетiншi тəулiкте бақылау жəне тест жүргiзiлген суды жаңа алынған суға ауыстыру жасалады [9]. Алғашқы 7 тəулiк бойы биотестілеу жүргiзiлген колбалардың құрамын жақсылап араластырады. Резинкалы грушасы бар пипеткамен əр колбадан 25 мл-ден алып, жаңадан дайындалған ерiтiндiлерге құйып араластырады. Əрi қарай əр колбадағы клеткалар санын анықтайды. Кейiн тағы 7 тəулiк бойы биотестілеу жалғастырылады. 14-тəулiктен кейiн тест жүргiзiлген су балдырларға созылмалы улылық əсерді көрсете ме, жоқ па дегенді анықтайды. Бақылаумен салыстырғанда тест жүргiзiлген судағы клеткалар өсiм саны коэффициентінің төмендеуі тест жүргiзiлген суда балдырларға өте немесе созылмалы улылық əсердiң бар екендігін көрсетедi [10]. НƏТИЖЕЛЕР МЕН ТАЛҚЫЛАУЛАР Зеренді көлі Көкшетау қыратының тау аралық ойысында, Ақмола облысы Зеренді ауданының солтүстік шығысында, «Көкшетау» мемлекеттік ұлттық табиғи саябағы аумағында орналасқан. Көл Көкшетау қаласынан 50 шақырым жерде орналасқан. Көл теңіз деңгейінен 370,4 метр абсолютті биіктікте жатыр. Су жинау бассейні – 97,7 км2. Көлдің батыс жағы төбешікті, ал оңтүстікшығыс жəне солтүстік жағалаулары жадағай тегіс болып келеді. Суайдынының оңтүстік-батыс бөлігі қайың, қарағайлы орманмен көмкерілген. Қалған бөліктері далалы, егістікті жерлерге ұласады. Көлдің ұзындығы – 6 км, ені – 2,5 км, ауданы орташа есеппен – 1070 га, максималды тереңдігі 6,5 м-ге тең. Көл жағалауының ұзындығы 21,3 км. Көл беті негізінен ашық, жағаға жақын жерлерін қамыс басқан. Көл түбі тегіс, лайлы, жағалаулары құмды, қиыршық тас пен қойтасты. Көл - ағынсыз. Көлге оңтүстік жағалау тұсынан ұзындықтары 0,3-1,5 км болатын мезгілдік сипаттағы суағарлар келіп құйылады. Бұл тек көктем айларында бірнеше күнде немесе қатты сел, жаңбыр жауған күндері болады. Көл суы тұрмыстық-шаруашылық мақсаттарда қолданылады. Зеренді көлінің жағалауында демалыс базалары, демалыс лагерьлері, сауықтыру-шипажайлары жəне қысқа мерзімді демалыс орындары бар[11] . Табиғи суларға бейімделген микробалдырларды зертхана жағдайында өсіріп, оларды келешекте су тазалау жүйесіне қолдану мақсатында Көкшетау өңірі көлдерінен су сапасын анықтауда маңызды нысан болатын Chlamydomonas reinhardtii var reinhardtii Dang., Chlorella vulgaris var vulgaris Beijerinck., Chlorella sp., Scenedesmus obliquus, Euglena viridis Ehr, Spirulina major, Phormidium foveolarum, Osсillatoria tenuis жəне Ankistrodesmus falcatus var radiatus микробалдырлар түрлері бөлініп алынып, сипаттама берілді. Көкшетау өңірі көлдерінің су экожүйелерінен бөлініп алынған осы микробалдырлардың штамдарынан, табиғи суларда тез өсетін жəне ластанған суларды тазалау қабілеті жоғары түрлері сұрыпталды. Нəтижесінде зерттеуге алынған микробалдырлар арасынан Chlorella sp3K штамы белсенділік көрсетті [12]. Chlorella sp-3K штамының əр түрлі су үлгілерінде жақсы өсіп, жоғары нəтиже беретіндігі басқа да зерттеулер мен əдебиеттерде келтірілген [13]. Біздің Chlorella sp-3K штамының өнімділігін тексеріп, сұрыптаудағы мақсатымыз Зеренді көлінен алынған су үлгілеріне осы штамм көмегімен биотестілеу жүргізу болып табылады. Зерттеу 92 əдісінде тест жүргізілетін судағы улы заттардың əсерінен микробалдырлардың көбею қарқындылығының өзгерісін бақылауымен салыстыра отырып есепке алатын биотестілеу əдісі қолданылды. Бұл бiр клеткалы микробалдырды биотестілеуге қолданудың негiзгi артықшылығы оның зертханалық жағдайда көптеген ұрпақтар бойы клетка популяциясын бақылауға мүмкiндiк беретiн жоғарғы көбею жылдамдығы болып саналады. Chlorella sp-3K микробалдыры жүйелiк қатынасы бойынша Chlorophyta бөлiмiнiң Protococcophyceae класының Chlorococcales қатарының Chlorellaceae тұқымдасының Chlorella туысының өкiлi. Клеткалары пиреноидты, бірақ байқалмайды. Chlorella vulgaris-ке қарағанда клеткалары кішірек, диаметрi 2-3,5 мк. Клеткалары көбейер алдында 7,5-8мк дейiн үлкейедi. Негiзгi қоректiк ортасы стандартты 04 қоректiк ортасы (сурет 1). Сурет 1 – Chlorella sp-3K. Зеренді көліне биотестілеу жүргізу үшін бақылау жəне тəжірибеге арналған қоректік орталары жəне Chlorella sp-3K штамы пайдаланылды. Одан кейін оған тест-организм Chlorella sp-3K штамы енгізілді. Клеткалардың өсу динамикасы 8 күн бойы зерттелініп, алынған мəліметтерге салыстырмалы анализ жасалынды. Таза бақылау суы мен көл суларының дақылдық ортасын дайындау үшін клеткалардың қоректенуіне қажетті минералды тұздар 04 стандартты қоректік ортасына сəйкес келетін мөлшерде қосылды. Таза су жəне көл суларына 04 стандартты жасанды қоректiк ортаға сəйкес келетін минералды тұздарды қосу арқылы Chlorella sp-3K штамын 8 күн өсiрiп, олардың клеткаларының өсу динамикасына зерттеу жүргiздiк. Зерттеу жұмысына көл суларының 2 түрлi нұсқасы алынды. 1нұсқаға 2 есе сұйылтылған көл сулары, ал 2-нұсқаға алғашқы алынған көл суы сынамасы өзгертiлмей алынды. Енгізілген хлорелла клеткасының санын барлық нұсқаларда бірдей 5х106±0,6 мл болғыздық. Клеткалардың өсу динамикасы 8 күн бойы бақыланғанда таза бақылау суындағы Chlorella sp-3K штамының клеткалар саны 4 тəулiкте 23 х106±0,65 өскенi анықталды. 2 есе сұйылтылған 1 нұсқадағы көл суында Chlorella sp-3K штамы клеткалар саны алғашқы 4-тəулiкте 1 мл-де 19,5х106±0,45 дейiн өсті де, келесi тəулiктерде өсуi байқалмады. Ал алғашқы алынған көл суы сынамасы өзгертiлмей алынған 2 нұсқада клеткалар саны алғашқы 4-тəулiкте 1 мл-де 16,8х106±0,5 дейiн өсті де, келесi тəулiктерде өсуi байқалмады (кесте 1). Кесте 1 – Зеренді көлінің суына биотестілеу жүргізгендегі Chlorella sp-3K клеткасының өсуі Тəулік бойынша 1 мл-дегі клетка саны Сынамалар 0 2 4 6 8 Бақылау 5х106±0,25 19,2 х106±0,6 23 х106±0,65 22,5 х106±0,55 22 х106±0,54 1-нұсқа 5 х106±0,3 13,8 х106±0,36 19,5 х106±0,45 18,4 х106±0,5 16,3 х106±0,48 2-нұсқа 5 х106±0,3 10,4 х106±0,35 16,8 х106±0,5 15,1 х106±0,49 13,2 х106±0,46 Зеренді көлінің суын Chlorella sp-3K штамының көмегімен биотестілегендегі клеткалардың өсу динамикасы 2- суретте көрсетiлдi. Бақылаумен салыстырғанда тест жүргiзiлген суда хлорелла клеткаларының өсiм саны төмендеу болды. Себебі Зеренді көлінде Chlorella sp-3K штамының өсуіне кедергі келтіретін фторид, сульфаттардың ШРМ-нен артық мөлшерлері бар. 93 30 Клетка саны, млн/мл 20 10 Бақылау 1 нұсқа 0 0 4 Тəулік 8 Сурет 2 – Зеренді көлі су сынамасы жəне бақылаудағы Chlorella sp-3K штамының өсу динамикасы Биотестілеу жүргізген зерттеу нəтижесінде Chlorella sp-3K штамы Зеренді көліндегі улы заттар концентрациясына орташа сезімтал екені анықталды. Зерттеулерден байқағанымыздай табиғи суларға микробалдырлар көмегімен биотест жүргізу жылдам, əрі тез жəне химиялық зерттеулер нəтижесін толықтыратындығы анықталды. 1. Унифицированные методы исследования качества вод // Методы биологического анализа воды. Приложение І. Индикаторы сапробности. – М.: СЭВ, 1977. – С. 11-42. 2. Унифицированные методы исследования качества воды // Методы биологического анализа воды. Приложение 3. Крайнюкова А.Н. Биотестирование в охране вод от загрязнения // Методы биотестирования вод. – Черноголовка, 1988. – С. 4-14. 4. Музафаров А.М., Таубаев Т.Т., Методы массового культивирования и применения хлореллы. – Ташкент: Фан, 1974. – 120 с. 5. Шаланки Я. Биомониторинг природной среды. // Журн.общ. биол. –1985. – Т.46, №6. – С. 743-752 6. Таубаев Т.Т. Хлорелла. – Ташкент: Фан, 1980. – 150 с. 7. Биоиндикация и биотестирование природных вод. // Тез. Докл. Всесс. конф. – Ростов, 1986. – С. 198. 8. Заядан Б.К., Су экожүйелерiне биологиялық тест жүргiзуге жасыл балдыр Chlorella sp-1 табиғи түрiн пайдаланудың маңызы // Вестник КазГУ, Серия экологии. – 2001. – №2. – Б. 25-29. 9. Биоиндикация загрязнений наземных экосистем / Под ред. Р. Шуберт. – М.: Мир, 1988. – С. 324. 10. Шорабаев Е.Ж., Болатхан Б.К. Өндірістік қалдық суларды жасыл балдырлар көмегімен биобақылау жəне тазарту. // ҚазМАУ нəтижелер, ізденістер. – 1999. – №4. – Б. 183-186. 11. Ақмола облысының су қоры: Ақмола облыстық қоршаған ортаны қорғау туралы материалдар. – Көкшетау, 2008. – 105 б. 12. Өнерхан Г. Көкшетау өңірі көлдерінің экологиялық жағдайын альгофлора көмегімен бағалау: биол. ғылым. канд. ... дисс. –Алматы, 2010. – 112 б. 13. Заядан Б.К. Роль фототрофных микроорганизмов в мониторинге, функционировании и ремедиации водных экосистем: автореф. … д-ра биол. наук. – Алматы, 2006. – 38 с. *** В работе проведено биотестирование озер по штамму Chlorella sp-3K выделенного с водных экосистем озер Кокшетауского региона, который отличается быстрой размножаемостью и очищающей способностью загрязнений природных вод. В результате биотестирования, выявлено, что воды озера Зеренда средний уровень токсичности: рост клеток средний 16,8±0,5 млн/мл. *** Respective was biotesting lakes on cultures of microseaweed allocated with water ecosystem of lakes Кокshetau region is carried out is especial on strain Chlorella sp-3K, distinguished fast duplicate and clearing ability of pollution of natural waters. As a result of biotesting, is revealed, that waters of lake Zerenda an average level toxicity: growth of crates average 16,8±0,5 mln/ml. УДК: 579:576.6 Ратникова И.А., Н.Н. Гаврилова Н.Н., Л.П. Треножникова, К. Баякышова, А.Х. Хасенова УСТОЙЧИВОСТЬ К ЖЕЛЧИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ, ПРОПИОНОВОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ АССОЦИАЦИЙ, АДАПТИРОВАННЫХ К НИЗКОМУ ЗНАЧЕНИЮ РН (РГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК, e-mail: iratnikova@almanet.kz) Исследованные штаммы молочнокислых бактерий являются более чувствительными к желчи, чем к низкому значению рН. Наиболее чувствительными к желчи оказались культуры L. plantarum 22, L. brevis Б-3 , L. plantarum 2в и 14д. Адаптированные к низкому значению рН культуры L. brevis Б-3 и L. plantarum 22 стали более устойчивыми к желчи по сравнению с исходными. Наиболее устойчивыми к желчи являются культуры L. fermentum 27 и P. shermanii. Непременным условием для получения эффективных пробиотиков является использование штаммов с высокой антимикробной активностью к наиболее часто встречающимся возбудителям заболеваний, доминирующим в данном регионе. Кроме того, в необходимых случаях для усиления лечебного действия в отношении определенных возбудителей заболеваний должна проводиться коррекция микробного состава препарата. Для этого надо иметь в резерве штаммы с высокой 94 S. gallinarum S. aureus № 9 S. aureus № 3316 K. pneumoniae 444 C. albicans Mycobacterim B5 2 4,1 3 12,0 4 13,0 5 14,0 6 13,5 7 12,0 8 1,0 9 23,0 10 27,0 11 5,3х108 6,3 4,2 0 10,5 0 13,0 0 15,5 0 12,5 0 13,0 0 9,0 0 23,0 12,0 2,0 9,0х10 3 1,2х10 9 5,6 0 0 0 0 0 0 13,0 15,0 5,2х10 6 6,5 0 0 0 0 0 0 12,0 0 3,0х10 3 4,1 12,5 12,5 15,0 12,0 17,0 10,0 20,0 27,5 6,3х10 8 6,1 0 0 0 0 0 0 0 11,0 9,0х10 3 4,1 11,0 11,5 15,0 11,0 16,0 0 23,0 24,0 6,6х10 8 4,12 20 10,0 0 17,0 0 22,0 10,0 29,0 1,5х10 9 Варианты опыта рН 1 Б3, исходная контроль Б3 исходная опыт Б3 адаптированная контроль Б3 адаптированная опыт 14д исходная опыт 14д исходная контроль 14д адаптированная опыт 14д адаптированная контроль 2в адаптированная контроль 95 P. multocida E. coli антимикробной активностью к различным возбудителям заболеваний. Штаммы микроорганизмов, входящие в состав пробиотиков, должны обладать также адгезивными и ростовыми свойствами, которые позволят им быстро колонизировать слизистую поверхность желудочно-кишечного тракта. Резистентность бактериальных клеток к реактогенной среде желудка и верхних отделов кишечника также является необходимым условием выживания пробиотических микроорганизмов. При этом основными факторами, губительно действующими на пробиотические микроорганизмы, являются низкое значение рН и желчные кислоты [1,2]. Материалы и методы Культуры молочнокислых бактерий L. plantarum 2в, 22, 14д, L. fermentum 127 и 27, L. brevis Б-3 и пропионовокислых бактерий P. shermanii , исходные и адаптированные к низким значениям рН, выращивали в течение 18 ч при температуре 370С в жидкой питательной среде MRS [3], содержащей 3% бычьей желчи. Затем в них определяли количество жизнеспособных бактерий путем высева из соответствующих разведений в чашки Петри на твердую питательную среду MRS а также антагонистическую активность методом диффузии в агар в отношении тест-культур: Escherichia coli, Salmonella, gallinarum, Staphylococcus aureus № 9, Staphylococcus aureus № 3316, Klebsiella pneumoniae 444, Cadida albicans, Mycobacterim B5 [4]. Каталазную активность пропионовокислых бактерий устанавливали по интенсивности разложения культурой перекиси водорода. В таблице представлены средние результаты не менее чем из трех повторностей. Контролем служили те же культуры молочнокислых и пропионовокислых бактерий, выращенные в исходной среде MRS без желчи. Результаты и их обсуждение В предыдущих исследованиях нами проведена адаптация молочнокислых и пропионовокислых бактерий к рН 3. Целью настоящих исследований было изучение устойчивости к желчи у исходных и адаптированных к низкому значению рН молочнокислых и пропионовокислых бактерий, входящих в состав разработанных нами пробиотиков. Результаты опыта представлены в таблице 1. Таблица 1 - Содержание бактериальных клеток и антагонистическая активность молочнокислых бактерий при росте в питательной среде с 3% желчи Тест-культуры, мм Титр, КОЕ/мл 2в адаптированная 5,59 10,0 0 0 0 0 0 0 11,0 3,2х10 5 опыт 2в исходная 4,22 15,5 0 0 12,0 0 16,0 0 19,0 2,0х10 9 контроль 2в исходная опыт 5,80 9,5 0 0 0 0 0 0 0 1,0х10 5 22 исходная 4,26 19,0 0 0 11,0 0 16,5 0 19,0 2,0х10 9 контроль 22 исходная опыт 6,20 0 0 0 0 0 0 0 0 2х10 3 22 4,10 23,0 11,0 0 10,0 0 22,0 0 28,0 3,4х10 8 адаптированная контроль 22 5,88 0 0 0 0 0 0 0 11,0 2,0х10 7 адаптированная опыт 27 исходная 4,66 20,0 10,0 10,0 14,0 10,0 18,5 10,0 20,0 3,8х10 9 контроль 27 исходная опыт 5,37 0 0 0 0 0 11,5 0 12,0 2,7х10 8 27 4,36 10,0 10,0 10,0 14,0 10,0 17,0 13,0 23,0 2,0х109 адаптированная контроль 27 5,76 0 0 0 0 0 11,0 0 0 1,6х108 адаптированная опыт 127 исходная 4,14 12,0 9,0 10,0 11,0 10 20,0 13,0 27,0 2,0х109 контроль 127 исходная 5,42 0 0 0 0 0 0 0 12,0 9,6х10 6 опыт 127 4,21 10,0 10,0 10,0 12,0 10,0 10,0 12,0 23,0 3,4х10 9 адаптированная контроль 127 6,13 0 0 0 0 0 0 0 16,0 8,9х10 6 адаптированная опыт Установлено, что под воздействием желчи существенных изменений в морфологии колоний молочнокислых и пропионовокислых бактерий исследованных штаммов не происходит. Как видно из представленной таблицы, адаптированная к низким значениям рН культура L. brevis Б-3 имеет более высокий титр бактериальных клеток по сравнению с исходной (1,2х109 против 5,3х108). При росте в питательной среде с желчью снижение титра бактерий у исходной культуры произошло на 5 порядков (9,0х103 против 5,3х108 в контроле), а у адаптированной – на 3 (5,2х106 против 1,2х109 в контроле). В контроле исходная и адаптированная культуры L. brevis Б-3 обладали антагонистической активностью ко всем испытанным тест-культурам. При выращивании культур молочнокислых бактерий в питательной среде с желчью антагонистическая активность выявлена лишь в отношении Mycobacterim B5 и С. аlbicans. В контроле исходная культура L. plantarum 2в имела титр молочнокислых бактерий 2х109 КОЕ/мл, адаптированная к низким значениям рН – 1,5х109 КОЕ/мл. После выращивания в питательной среде с 3% желчи содержание бактериальных клеток было ниже на 4 порядка и составило у исходной культуры 1,0х105 КОЕ/мл, у адаптированной – 3,2х105 КОЕ/мл. В контроле адаптированная к низким значениям рН культура L. plantarum 2в превосходила исходную по антагонистической активности. В отличие от исходной культуры, она обладала активностью в отношении клинического штамма стафилококка MRSA №3316 и S. gallinarum, а в отношении остальных тест-культур (E. сoli, P.multocida, Mycobacterim B5) зоны подавления роста были больше на 5-10 мм. При выращивании культур молочнокислых бактерий в питательной среде с желчью антагонистическая активность выявлена только к E. coli и Mycobacterim B5. Исходная культура L. plantarum 22 в контроле содержала жизнеспособных клеток 2,0х109 КОЕ/мл, адаптированная к низким значениям рН - 3,4х108 КОЕ/мл. После выращивания в питательной среде с 3% желчи содержание бактериальных клеток было ниже на 6 порядков и составило у исходной 96 культуры 2х103 КОЕ/мл. У адаптированной культуры снижение титра бактерий произошло на 1 порядок (2,0х107 КОЕ/мл). В контроле адаптированная к низким значениям рН культура L. plantarum 22 также превосходила исходную по антагонистической активности. При выращивании культур молочнокислых бактерий в питательной среде с желчью антагонистическая активность сохранилась только к Mycobacterim B5. Исходная культура L. fermentum 27 в контроле имела титр молочнокислых бактерий 3,8х109 КОЕ/мл, адаптированная к низким значениям рН – 2,0х109 КОЕ/мл. При выращивании в питательной среде с 3% желчи содержание бактериальных клеток было ниже на 1 порядок и составило у исходной культуры 2,7х108 КОЕ/мл, у адаптированной – 1,6х108 КОЕ/мл. В контроле исходная и адаптированная культуры L. fermentum 27 обладали антагонистической активностью ко всем испытанным тесткультурам. При выращивании культур молочнокислых бактерий в питательной среде с желчью антагонистическая активность выявлена в отношении P. multocida и Mycobacterim B5. При выращивании в питательной среде с 3% желчи содержание бактериальных клеток L. fermentum 127 было ниже на 3 порядка и составило у исходной культуры 9,6х10 6 КОЕ/мл, у адаптированной - 8,9х106 КОЕ/мл по сравнению с 2,0х109 с 3,4х109 в контроле, соответственно. В контроле исходная и адаптированная культуры L. fermentum 127 обладали антагонистической активностью ко всем испытанным тест-культурам. При выращивании культур в питательной среде с желчью антагонистическая активность выявлена только к Mycobacterim B5. Исходная культура P. shermanii в контроле содержала жизнеспособных клеток 2,5х1010 КОЕ/мл, адаптированная – 6,5 х1010 КОЕ/мл. При выращивании в питательной среде с 3% желчи содержание бактериальных клеток было ниже на 2 порядка и составило у исходной культуры 1,0х108 КОЕ/мл, у адаптированной – 8,0х108 КОЕ/мл. Данная культура восстанавливает титр клеток и антагонистическую активность после пассажа в питательную среду без желчи. Таким образом, исследованные штаммы молочнокислых бактерий являются более чувствительными к желчи, чем к низкому значению рН. Наиболее чувствительными к желчи оказались культуры L. plantarum 22 (снижение титра произошло на 6 порядков), культур L. brevis Б-3 (на 5 порядков), L. plantarum 2в и 14д (на 4 порядка). Адаптированные к низкому значению рН культуры L. brevis Б-3 и L. plantarum 22 оказались более устойчивыми к желчи по сравнению с исходными на 2 и 5 порядков, соответственно. Наиболее устойчивыми к желчи (снижение титра бактерий на 1 порядок) являются культуры L. fermentum 27 и P. shermanii. 1 Ху Yю-gang, et.al. Изучение характеристик жизнеспособности рекомбинантного Lactobacillus casei 393 в искусственных желудочно-кишечных средах // J. Microecol. - 2006.- N 6. - С.423-426. 2 Голод Н.А., Лойко Н.Г., Мулюкин А.Л. и др. Адаптация молочнокислых бактерий к неблагоприятным для роста условиям // Прикладная биохимия и микробиология. - 2009. - T. 42. - № 2. - С. 317-335. 3 Ратникова И.А. Исследование микроорганизмов на способность к антиинтерфероновой активности // Известия АН РК, сер. мед. и биол. – 2000. – № 1. – С. 78-80. 4 Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. - М.: Наука, 1986. – 273 с. *** Сүт қышқылды бактерияларының зерттеліп отырған штамдары рН төменгі мəніне қарағанда, өт қышқылына сезімтал келеді. L. plantarum 22, L. brevis Б-3 , L. plantarum 2в жəне 14д культуралары өт қышқылына едəуір сезімтал болса, бейімделген культуралар рН-тың төменгі мəніне сезімтал. L. brevis Б-3 жəне L. plantarum 22 культуралары бастапқы штамдармен салыстырғанда, өт қышқылына төзімдірек келеді. L. fermentum 27 жəне P. shermani культуралары өт қышқылына жоғары төзімді болып келеді. *** The investigated strains of lactic acid bacteria are more sensitive to bile than in a low pH value. Most sensitive to bile cultures were L. plantarum 22, L. brevis B-3, L. plantarum 2b, and 14d. Adapted to the low pH value of culture L. brevis B3 and L. plantarum 22 were more resistant to bile compared with baseline. The most resistant to bile cultures are L. fermentum 27 and P. shermanii. У.З. Сагындыков1, Ж. Мамырбекова2, Х.Х. Макажанова1, С.С. Губарева 3 ТҮЙЕ СҮТІ НЕГІЗІНДЕГІ ҚҰРҒАҚ БИОЛОГИЯЛЫҚ БЕЛСЕНДІ ҚОСПАНЫҢ САПАЛЫҚ МІНЕЗДЕМЕСІ (Алматы технологиялық университеті1, əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті2; Қазақ өңдеу жəне тамақ өнеркəсібі ғылыми-зерттеу институты3) Бұл жұмыста түйе сүтінің негізінде құрғақ биологиялық белсенді қоспаны кептіру тəсілдері мен олардың сапалық көрсеткіштері зерттелген. Қазақ халқын түрлі тағамдармен қамтамасыз етуде бие жəне түйе сүттерінің негізінде жасалған ұлттық қышқыл сүт өнімдерінің алатын орны ерекше. Жылқы жəне түйе шаруашылығы дамыған, 97 Титрлік қышқылдылығы, Т° Аминді азот, % Сүт қышқылы, % Сқб саны Лактоза, мг/00мл ұлттық дəстүрге айналған Қазақстандық ферменттелген өнімдерді өндіру жақсы дамыған. Қазақ ғалымдары М.Х. Шығаева, Т.Ш. Шарманов, М.Г. Саубенова, С.З. Сағындықова қымыз бен шұбаттың тағамдық жəне биологиялық бағалылығын анықтап, өнімнің негізін құрайтын сүт қышқылы бактерияларының қауымдастықтарынан жəне ашытқы саңырауқұлақтардан жасалған құрама ашытқылар мен қышқыл сүт тағамдарының сапасы жəне аурудың алдын алу қасиеттері бар, ұлттық қышқыл сүт тағамдарын алуды зерттеген. Қазіргі кезде қышқылсүт өнімдерін өндіруде қолданылатын ашытқылар, жақын жəне алыста орналасқан елдерден алынады. Бірақ бұлардың қауіпсіздік көрсеткіштері жөнінен сипаттамалары мен толық құжаттар көбінесе жоқ болып шығатын кездері жиі кездеседі. Осыған орай Қазақстандағы шикі сүтті өңдейтін əртүрлі аймақтарда, табиғи көздерден бөлініп алынған микроорганизмдердің жаңа штамдары негізінде, қышқыл сүт тағамдарын өндіру үшін микроорганизмдердің белсенді штамдарынан композициялар жəне консорциумдардан отандық ашытқылар жасау қажеттілігі туындап отыр. Республиканың əртүрлі аймақтарында өндірілетін сүт тағамдарының микробиологиялық құрамын зерттеу, сүттің кенеттен ашуына жауапты микроорганимздердің басымдылық көрсететін топтарын анықтау, сүт қышқылы бактерияларының таралуы жөнінен мəліметтерді көбейтудің жəне ашытқы жасауда биологиялық жаңа дақылдарды сұрыптап алудың маңызы зор [1-4]. Бізбен лиофилды жəне шашыратпа əдістерімен 3 жəне 6 айдан кейін сақтау барысында құрғақ биологиялық белсенді қоспаның салыстырмалы бағалауын (кесте) (сүтқышқылы мен бифидобактериялардың сандық құрамы, сүт қышқылы, нəруыз, амин азоты, лактоза жəне С дəруменнің құрамы) жалпыға мəлім əдістермен жүргіздік [5-7]. Барлық препараттар құрғақ, қараңғы жерде +8-10ºС температурада сақталды. Тəжірибе жағдайында лиофилды жолмен кептірілген препараттың рН-ы жəне титрлік қышқылы шашыратпа кептіргеннен аз ғана айырмашылық болды, жасуша титрі кептіру əдісінен айырмашылығы болмады. Кесте 1 – Құрғақ биологиялық белсенді қоспаның сапалық көрсеткіштерін салыстырмалы бағалау Bif Шашыратпа 1010 1010 0,223 8,7±0,2 3,0±0,1 12,2±0,2 7,65±1,2 Сублимациялық 1012 1012 0,263 8,0±0,1 2,8±0,2 8,8±0,2 12,15±0,9 35±4 С дəрумені, мг/100мл MRS нəруыз, % Кептіру əдістері 29±2 Зерттеу барысында шашыратпа жəне сублимациялық кептіру барысында сүтқышқыл бактерияларының, сүт қышқылының, нəруыздың құрамы бірдей болды, дегенмен сублимациялық жолмен кептіргенде С дəрумені қоспада көбірек болды деген тұжырымға келдік. 1 Шарманов Т.Ш. Новые направления в создании здоровой пищи //Пищевая и перерабатывающая промышленность. - 2000. - №2. - С.20-21. 2 Шығаева М.Х., Қасымбекова С.К. жəне басқалар. Қазақстанның əр түрлі облыстарының шұбат үлгілерінен бөлініп алынған лактобацилдер // Жаршы. – 2002. - №9.- С.25-28. 3 Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Никитина Е.Т., Байжомартова М.М. Перспективы повышения качества и лечебно-профилактических свойств шубата // Вестник КазНУ. Сер.Биол. – 2002. - №1. - С.23-28. 4 Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Нурумбетова Б.К. Ассоциация молочнокислых бактерий и дрожжей для сбраживания кобыльего молока // Вестник КазНУ. Сер.биол. - 2001. - №1(13). - С.75-78. 98 5 Нармуратова М.Х., Конуспаева Г.С., Иващенко А.Т., Луазо Ж., Файе Б. Изучение физико – химического состава верблюжьего молока ЮКО// Вестник серия биологическая. - Алматы. - №1 (36), 2008. - С.176-181. 6 Филиппович Ю.Б. «Практикум по общей биохомии». – М. - 1975г. - С.75-76 7 Г.Н.Грусь, А.М. Шалыгина, З.В.Волокитина. Методы исследования молока и молочных продуктов. – М. 2000. – 250 с. У.З. Сагындыков1, З.А. Кожахметова2, М.Ж. Мустафаева1 ВЛИЯНИЕ ФИТОНЦИДОВ БОРЩЕВИКА СОСНОВСКОГО НА МИКРОФЛОРУ СМЕШАННЫХ СИЛОСОВ (Алматинский технологический университет1, Казахский аграрный университет2) В настоящей работе изучено влияние фитонцидов борщевика Сосновского на микрофлору смешанных силосов. В смешанном силосе применялись как выделенные, так и известные штаммы молочнокислых бактерий. Молочнокислое брожение издавна находит применение в ряде отраслей пищевой промышленности и сельского хозяйства, преимущественно в целях сохранения некоторых видов пищевых продуктов, в том числе и силоса. Обеспечивается это благодаря молочнокислым бактериям, в процессе жизнедеятельности которых образуются органические кислоты (молочная и уксусная), оказывающие угнетающее действие на микроорганизмы, вызывающие порчу продуктов. Наиболее благоприятным местом обитанием молочнокислых бактерий является почва и культурные растения. По данным Е.И. Квасникова, О.А. Нестеренко, численность этих бактерий определяется содержанием в почве органических веществ. Так, в 1г почвы среднеазиатских пустынь и полупустынь насчитываются единичные клетки, целинных сероземов – десятки и редко сотни, а луговых и лугоболотных до 1 тыс. клеток. При опустынивании луговой почвы численность молочнокислых бактерий возрастает в тысячи раз [1, 2]. С целью изучения влияния фитонцидов борщевика Сосновского на микрофлору смешанных силосов нами были проведены опыты. В качестве вариантов опыта взяты силосуемые культуры в соотношениях 70:30 (т.е. 70% борщевика Сосновского и 30% - бобовые растения). В качестве биоконсервантов использовали три отобранных штамма молочнокислых бактерий L. plantarum (3, 10 и 13), отличающихся высокой кислотообразующей и антагонистической активностью. Типовые культуры L. plantarum 34 и АМС взяты в качестве контрольных вариантов. Опыты поставлены в лабораторных условиях. Срок хранения опытных образцов один месяц. При вскрытии опыта определяли общую численность бактериальных организмов и количество молочнокислых бактерий. Данные анализа отражены в таблице. Таблица 1 – Влияние фитонцидов борщевика Сосновского на численность бактерий Вариан Молочнокислые бактерий, млн/г ты силос + L. силос + АМС силос + L. силос +L. силос + L. опыта plantarum 3 plantarum plantarum 10 plantarum 13 34 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Б. С. – люцерна (70:30) 100,7 ± 10,0 98,7± 1,9 99,5± 1,9 96,1± 1,9 98,8± 1,9 79,8± 1,8 114,6± 10,3 98,7±1,9 130,3± 11,1 118,2± 11,2 Б. С. – соя (70:30) 100,8 ± 10,1 99,4 ±1,9 104,5± 10,2 91,1± 1,9 102,0± 10,1 73,4± 1,7 107,6± 10,2 92,1± 1,9 122,3± 12,3 101,0± 10,0 Б. С. – донник (70:30) 119,5 ± 10,1 119,5 ± 10,1 118,1± 10,1 118,1± 10,1 116,1± 10,1 79,4± 1,7 119,8± 10,2 99,3± 1,9 125,0± 10,1 131,4± 10,1 Примечание: 1- общее количество бактерий, 2 – численность молочнокислых бактерий 99 Во всех вариантах опытов со смешанным силосом, где соотношение борщевика Сосновского к бобовым составляло 70:30, численность молочнокислых бактерий значительно превышала таковую у силосов, приготовленных с типовыми культурами L. plantarum 34 и АМС. Так, в варианте опыта со смешанным силосом из борщевика Сосновского и люцерны количество молочнокислые бактерий составляет 118,2, в то время как, в этом же силосе, но с использованием L. plantarum 34 численность молочнокислых бактерий составляет всего 98,7 млн/г силоса. Аналогичная закономерность проявляется и в других вариантах опыта. Все это свидетельствует об устойчивости новых штаммов L. plantarum 3, 10 и 13 к фитонцидам борщевика Сосновского. 1. Дегтярева И.А., Алимова Ф.К., Шакирова Ш.К., Гибадуллина Ф.С. Влияние типа растительной формации на микрофлору силоса //Кормопроизводство. – 2000. - №12. – С.26-28. 2. Квасников Е.И., Нестеренко О.И. Молочнокислые бактерий и пути их использования.-. М.: Наука, 1975.- 384с. С.Сагындыкова1, Б. Мухамбетов1, А. Нурлыбеков1, С.А. Надирова2 ,У.З. Сагындыков2, Р.Ж. Бержанова БИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕКУЛЬТИВАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ (Филиал «Экологическая биотехнология» «НЦБ РК» КН МОН РК1, Алматинский технологоический университет2, e-mail: utemurat@yahoo.fr) В данной работе приведены материалы по рекультивации нефтезагрязненных почв Атырауской области. Микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата «Бакойл» адаптированы к природно-климатическим условиям западного Казахстана и к средам с высокой соленостью, безопасны для почвенного микробиоценоза. В настоящее время среди различных техногенных нарушений природы одним из наиболее серьезных и трудно устраняемых является нефтезагрязнение. Нефть и ее компоненты (ароматические, нафтеновые и парафиновые углеводороды) являются одними из самых опасных загрязнителей, попадающих в почву в процессах добычи, транспортировки, переработки и хранения. Хронические разливы нефти приводят к быстрой и полной деградации ландшафтов (Израэль, Ровинский 1986; Amadi et al., 1993). Для ускорения процесса самоочищения почв от нефти используются все природные резервы экосистемы, в том числе и биологические. Микробиологические методы очистки почв способны дополнять различные технологии, а в определенных ситуациях не имеют аналогов (Walker, 1985; Пиковский, 1993; Н.А. Киреева и др., 2001). В настоящее время интенсивно разрабатываются и применяются методы микробиологической очистки природных сред от нефтяного загрязнения, основанные на использовании чистых или смешанных культур углеводородокисляющих микроорганизмов в сочетании с различными веществами, стимулирующими их активность. Эффективность этих методов может быть значительно повышена путем изменения соответствующих физико-химических условий среды и внесением ассоциации специально подобранных штаммов микроорганизмов, обладающих выраженными углеводородокисляющими свойствами. (Славина, Середина, 1992; Сидоров и др., 1997). Одним из важных условий микробиологической очистки нефтезагрязнений является способность различных групп микроорганизмов (бактерий, актиномицетов, дрожжевых грибов и миксомицетов) совместно «бороться» с загрязнением, а также обладать высокой иннокулятивной жизнеспособностью (Звягинцев и др., 2001) [1-4]. Так как углеводородокисляющие микроорганизмы являются постоянными компонентами почвенных биоценозов, появилось стремление использовать их катаболическую активность для восстановления загрязненных нефтью почв. Ускорить очистку почв от нефтяных загрязнений с помощью микроорганизмов возможно в основном двумя способами: - активизируя метаболическую активность естественной микрофлоры почв путем изменения соответствующих физико-химических условий среды; - внесением специально выделенных из естественной микрофлоры активных нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязненную почву. «Национальный центр Биотехнологии РК» КН МОН РК создал "технологию рекультивации загрязненных нефтью и нефтепродуктами земель, с помощи выделенных из аборигенной микрофлоры культур микроорганизмов-деструкторов", прошедшей государственную экологическую экспертизу. По количеству и токсичности данная деятельность относится к IV категории опасности. Технология рекультивации загрязненных нефтью и нефтепродуктами почвы с помощью выделенных из аборигенной микрофлоры культуры микроорганизмов-деструкторов применяется при рекультивации замазученных территорий с 2006 г. Работы по микробиологической очистке почвы проводились на загрязненных территориях месторождения «Жанаталап» (Атырауская область), месторождения «Косчагыл» (Атырауская область), биоремедиационная площадка ТОО «Эко-техникс» (г.Кульсары, Атырауская область), на месторождениях «Узень», «Жетибай», «Каламкас» 100 (Мангистауская область) Работы осуществлялись под контролем комитетов по охране природы этих регионов. С помощью агротехнических приемов можно ускорить процесс самоочищения загрязненных нефтью почв путем создания оптимальных условий для проявления потенциальной катоболитической активности углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в состав естественного микробиоценоза. Рыхление загрязненных почв увеличивает диффузию кислорода, снижает концентрацию углеводородов в почве, обеспечивает разрыв поверхностных пор, насыщенных нефтью, но в то же время способствует равномерному распределению компонентов нефти и нефтепродуктов в почве и увеличению активной поверхности взаимодействия. При этом создается оптимальный водный, газовоздушный и тепловой режим растет численность микроорганизмов, их активность, усиливается активность почвенных ферментов, увеличивается энергия биохимических процессов. Оптимальная температура почвы для внесения препарата 20 — 38 0С. В марте 2011года в филиале «Экологическая биотехнология» «НЦБ РК» КН МОН РК поставлен модельный эксперимент по очистке нефтезагрязненных почв. Почва с месторождения «Косчагыл». Для проведения эксперимента использовали 30 пластмассовых латков размером 15х13 см и высотой 10 см. Схема модельного эксперимента (рисунок 1): Рисунок 1 - Схема модельного эксперимента М1 М2 М3 М4 М5 М6 М7 М8 М9 М10 М1 М2 М3 М4 М5 М6 М7 М8 М9 М10 М1 М2 М3 М4 М5 М6 М7 М8 М9 М10 М1- контроль; М2- контроль+увлаж.; М3- Рыхл. + увлаж.; М4- Рыхл. + увлаж.+Мин.Удоб.+Орг. Удоб.; М5- Рыхл. + увлаж.+известь; М6- Рыхл. + увлаж.+Биопрепарат «Бакойл»; М7- Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Мин.Удоб.; М8 -Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Орг.Удоб.; М9- Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Мин.Удоб.+ Орг.Удоб.; М10-Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Мин.Удоб.+ Орг.Удоб.+Известь (комплексный); Проведен химический анализ гравиметрическим методом для определения исходного содержания нефти в почве. Содержания нефти в почве составило 147 000 мг/кг. Биопрепарат «Бакойл» введен в почву модельного эксперимента (на участках с биопрепаратом) один раз, согласно иструкции биопрепарата, препарат наносится путем распыления на загрязненную поверхность. Агротехническте мероприятия (рыхление, увлажнение) проводилось 2 раза в неделю. Через 30 дней после внесения консорциумов микроорганизмов отобраны образцы почв с лотков. Проведен химический анализ образцов, гравиметрическим методом, определено содержание нефти в почве после введения биопрепарата. Результаты в таблице. По результатам исследования наиболее эфективным для очистки нефтезагрязненных почв показал 10 вариант опыта (Рыхл. + увлаж. +Биопрепарат «Бакойл»+ Мин.Удоб.+ Орг.Удоб.+Известь), деструкция нефти-52,38%. Микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата «Бакойл» адаптированы к природноклиматическим условиям западного Казахстана и к средам с высокой соленостью, безопасны для почвенного микробиоценоза, так выделены из нефтезагрязненных почв Атырауской области. Микроорганизмы, входящие в состав биопрепарата используют нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника питания. Таблица 1 – Определение количества нефти Название Исходное Содержание нефти пробы содержание нефти, мг/кг через месяц после внесения биопрепарата, мг/кг М1 147 000 143 600 М2 147 000 142 000 М3 147 000 141 000 М4 147 000 128 000 М5 147 000 127 300 М6 147 000 94 000 М7 147 000 83 000 101 Деструкция нефти, % 2,31 3,40 4,08 12,92 13,40 36,05 43,53 М8 М9 М10 147 000 147 000 147 000 80 000 78 600 70 000 45,57 46,53 52,38 Биопрепарат «Бакойл» подходит для очистки нефтезагрязненой поверхности почвы, процесс деструкции протекает в период от нескольких недель до нескольких месяцев в зависимости от степени загрязнения объекта, химического состава загрязнителя , климатических и физико-химических параметров среды. 1. Кахаткина, М. И. Состав гумуса пойменных почв, загрязненных нефтью / М.И. Кахаткина // Рациональное использование почв и почвенного покрова Западной Сибири. Томск, 1986. - с.42 - 49. 2. Микробиологическая рекультивация нефтезагрязненных почв / Н. А. Киреева и др..- М. : ОАО «ВНИИОЭНГ», 2001. 40 с. 3. Пиковский, Ю. И., Солнцева, Н. П. Геохимическая трансформация дерново-подзолистых почв под влиянием потока нефти / Ю. И. Пиковский, Н. П. Солнцева // Техногенный поток веществ в ландшафтах и состояние экосистем.-М:Наука, 1981.-С.13-21 4. Глазовская, М. А. Способность окружающей среды к самоочищению / М. А. Глазовская, // Природа. 1979. - №3. - С. 12 - 14. УДК596 И.С. Савицкая ПОПУЛЯЦИОННЫЙ УРОВЕНЬ КИШЕЧНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ БАКТЕРИЙ И ФЕКАЛЬНЫЕ МУТАГЕНЫ (Казахский национальный университет им. аль-Фараби) В организме человека в результате химического взаимодействия между определенными соединениями, входящими в состав пищи, или их метаболической активации в некоторых случаях могут синтезироваться мутагены [1, 7, 15]. Образование мутагенных продуктов из исходных веществ возможно и в процессе их микробной трансформации [3, 12]. Такой процесс может происходить при нарушении микробной экологии кишечника, поскольку участие дисбиотической микробиоты в канцерогенезе подтверждено многими экспериментальными данными. Усиленный синтез таких бактериальных ферментов как α- и β-глюкозидаза, β-глюкуронидаза, 7-α дегидроксилаза, 7-αстероиддегидрогеназа, нитроредуктаза, азоредуктаза активизирует реакции преобразования многих проканцерогенов в канцерогены. Эти ферменты эффективно продуцируют клостридии, бактероиды, вейллонеллы, эшерихии, актиномицеты, гемофильные бактерии [1,6]. На самом деле, спектр метаболической активности этих микроорганизмов значительно шире, что позволяет им воздействовать на многие субстраты, попадающие в организм человека из окружающей среды, а также эндогенного происхождения, с образованием разнообразных мутагенов и канцерогенов. В то же время нормальная микрофлора кишечника принимает участие в обезвреживании мутагенов за счет ферментативного воздействия и продукции антимутагенов. Установлена антимутагенная и противоопухолевая активность клеток или фрагментов клеточных компонентов лактобацилл, бифидобактерий, пропионовокислых бактерий, энтерококков и их метаболитов, присутствующих в культуральной жидкости или в ферментированных продуктах [2,9,18]. Противоопухолевые свойства пробиотической флоры основаны как на стимуляции ими противоопухолевого иммунитета, так и на прямом токсическом воздействии их клеток и метаболитов на новообразования [4,14,17]. При этом не стоит игнорировать имеющиеся единичные сведения о том, что избыточное количество бифидобактерий в кишечнике может быть сопряжено с риском развития колоноректального рака, ассоциированного с повышенной -глюкозидазной, -глюкуронидазной и азоредуктазной активностью при щелочной реакции среды, что может происходить при переходе от растительной к мясной диете [1,6]. Если это так, то изменение популяционного уровня представителей облигатной кишечной флоры может приводить к снижению или увеличению мутагенности фекальных масс. Ранее генотоксичность фекалий определяли либо по наличию в них мутагенов после введения таковых экспериментальным животным, либо оценивали мутагенный фон фекальных экстрактов, полученных от контингента лиц, предпочитающих мясную или вегетарианскую диету [8-13]. Содержание же фекальных мутагенов при микроэкологических нарушениях кишечника до сих пор не исследовано. Дисбиозы кишечника, как правило, характеризуются снижением популяционного уровня бифидобактерий и лактобацилл [1]. Цель исследования - определение мутагенного фона экстрактов фекалий при стандартном и сниженном популяционном уровне бифидобактерий, лактобацилл и кишечных палочек. Материалы и методы В работе были использованы фекальные экстракты, полученные от 52 человек, у которых предварительно проводили бактериологический анализ микробного пейзажа фекалий по стандартной 102 методике [1]. Для приготовления экстрактов из кишечного содержимого в качестве экстрагента использовали дистиллированную воду, добавляемую к свежему образцу, содержащемуся в стерильном пенициллиновом флаконе, в соотношении 2:1. Содержимое флакона растирали стеклянной палочкой, измельчали в блендере, отстаивали 10-15 мин, полученную суспензию центрифугировали 20 мин при 50 000 g. Надосадочную жидкость отбирали в отдельный флакон, осадок снова подвергали экстракции по указанной схеме. Смесь стерилизовали мембранным фильтрованием через фильтры диаметром 0,45 мкм, затем 0,22 мкм. Для приготовления фекалазы (ферментативных экстрактов фекалий) образцы, собранные от 5 здоровых и 6 доноров с дефицитом лактофлоры обрабатывали в лаборатории не позднее, чем через полчаса после акта дефекации [16]. Фекалии суспендировали в 10 mM Na-фосфатном буфере в соотношении 1:1 или 1:3 (вес:объем) в зависимости от консистенции. Для получения бесклеточного ферментативного экстракта и лизиса бактериальных клеток, присутствующих в полученной суспензии, их разрушали ультразвуком (22 кГц) 3 раза по 40 сек при охлаждении (в ледяной бане) на дезинтеграторе УЗДН-1. Фрагменты клеток удаляли центрифугированием при 30 000 g 20 мин при 40С на ультрацентрифуге UP-65 (Германия). Сохранение нативной ферментативной активности в экстрактах определяли с помощью общепринятого теста на β-галактозидазу. Поскольку количество этого фермента в индивидуальных образцах значительно варьировало, экстракты смешивали, чтобы получить объединенный ферментативный экстракт фекалий, которые стерилизовали ультрафильтрацией и хранили при - 700 С. Тестирование на мутагенность проводили в модифицированом тесте Эймса с индикаторными штаммами Salmonella typhimurium ТА-98 и ТА-100 [5]. Штаммы несут мутацию ауксотрофности по гистидину и ревертируют под действием мутагенов, вызывающих мутации типа сдвига рамки считывания (штамм ТА 98) или замены пар оснований в молекуле ДНК (штамм ТА 100). Принцип метода состоит в том, что под действием мутагена на селективной среде вырастают ревертанты по гистидину, по числу которых определяют мутагенный эффект. Принято считать, что таковой имеет место в случае, если уровень индуцированных тестируемым агентом реверсий более чем в 2 раза превосходит спонтанный фон мутирования используемого штамма [7]. Суспензию клеток тест-штамма предварительно инкубировали с опытным вариантом в течение 2 час при 370, затем клетки отмывали от него и высевали на чашки с селективной средой. В качестве потенциальных промутагенных субстратов или мутагенов для позитивных контролей использовали: N-нитрозо-N´-нитронитрозогуанидин (НГ) - 1 мкг/мл; N-нитрозо-N-метилмочевину (НММ) – 100 мкг/мл (фирмы Sigma, США); 3-амино-1,4-диметил-[5Н]-пиридин-[4,3] индол (Trp-P), приготовленный из пиролизатов триптофана. Статистическая обработка. Для решения вопроса о наличии связи между снижением количества защитной микрофлоры и мутагенной активностью фекалий применяли корреляционный анализ. Рассматриваемые в данном случае признаки являются качественными так как они не распределяются в вариационный ряд и имеют только два противоположных нечисловых значения, которые удобно обозначить их «+» и «-». Тогда учитываемые признаки группируются в 4-х клеточную корреляционную решетку, а степень их сопряженности измеряется с помощью коэффициента ассоциации Дж. Юла rа, вычисляемого на основе данных опыта. Коэффициент ассоциации может принимать значения от –1 до 1. Если rа<0-корреляция отрицательная, если rа>0-корреляция положительная. Чем ближе абсолютное значение rа к 1, тем сильнее корреляция. Для оценки достоверности эмпирического коэффициента ассоциации вычисляют его отношение к средней ошибке m, которое должно быть больше стандартного значения критерия t Стьюдента для данного числа степеней свободы k = n-2 и уровня значимости Р. Результаты Полученные вышеописанным способом водные экстракты фекалий добавляли в количестве 0,5 мл на чашку; для определения спонтанного уровня мутирования к суспензии клеток тест-штаммов, высеваемых на селективную среду, добавляли аликвоты дистиллированной воды. Этим способом была исследована мутагенная активность фекальных экстрактов, полученных от 52 человек, у которых предварительно был проанализирован качественный и количественный состав кишечного микробиоценоза. Анализ их микробных карт позволил разделить обследуемый контингент на две группы. В первой группе, состоящей из 12 человек, не было зарегистрировано отклонений от принятого стандарта содержания основных представителей резидентной микрофлоры. Во второй группе, состоящей из 40 человек, были выявлены микроэкологические нарушения, проявляющиеся в снижении на 1-3 порядка логарифма популяционного уровня бифидобактерий и/или лактобацилл, уменьшении общего количества кишечных палочек и появлении их измененных форм. При исследовании на мутагенность экстрактов фекалий, взятых от 12 человек, включенных в 1 группу, мутагенная активность выявлена только в 1 экстракте при использовании штамма ТА 100 и 2-х для штамма ТА 98 (таблица 1). Причем, даже обнаруженная слабая мутагенная активность, когда 103 максимальное число ревертантов в образцах экстрактов превосходило их уровень в чистом контроле, находилась почти на нижней границе статистической значимости различий. Таблица 1. Мутагенность фекальных экстрактов для индикаторных штаммов Salmonella typhimurium Состояние кишечной микрофлоры Мутагенная активность экстрактов, выявленная на штамме S.typhimurium ТА100* ТА98* 1/12 2/12 28/40 36/40 Нормобиоценоз Дисбактериоз Примечание* в числителе указано количество проб, содержащих мутагены; в знаменателе – общее количество протестированных экстрактов Иная картина наблюдается во второй группе. При исследовании мутагенности фекалий от 40 пациентов с дисбактериозом, генотоксиканты, индуцирующие повышенный уровень реверсий у штамма ТА 100 обнаружены в 28 из них, и только в четырех отсутствовали мутагенные агенты, действующие по механизму сдвига рамки считывания, которые удается зарегистрировать при помощи штамма ТА 98. Далее с использованием штамма ТА 100 отдельно исследована мутагенность экстрактов фекалий в случае дефицита трех доминирующих групп кишечных бактерий – бифидобактерий, лактобацилл и кишечных палочек (рис.). В состоянии нормобиоценоза мутагенность обнаружена только в 1 из 12 (8,3% случаев) исследованных экстрактов. При дефиците бифидобактерий и лактобацилл (снижении популяционного уровня на 2 и более порядков) мутагенная активность обнаружена в 15 случаев из 23 (65%). Среднее количество ревертантов, обнаруживаемое у бактерий индикаторного штамма сальмонелл ТА-100 в присутствии фекальных экстрактов, взятых от людей с дефицитом бифидобактерий, составляло 480 ревертантов/чашку, лактобацилл – 360 ревертантов/чашку, а при совместном снижении их количества – 580 ревертантов /чашку, что соответственно в 5,6; 4,2 и 6,4 раза превышало естественный фон мутабильности индикаторного штамма. Содержание мутагенов в этих фекальных экстрактах было в 4,8; 3,6 и 5,2 раз больше, чем в экстрактах из фекалий людей со стандартным популяционным уровнем бифидобактерий и лактобацилл. Среднее число гистидиновых ревертантов / чашку 600 500 400 300 200 100 Дефицит КП Дефицит ББ и ЛБ Дефицит ББ Дефицит ЛБ Норма Спонтанный фон 0 Рисунок 1. Содержание мутагенов в кишечнике при стандартном и сниженном популяционном уровне бифидобактерий, лактобацилл и эшерихий Обозначения: ЛБ-лактобациллы; ББ-бифидобактерии; КП-кишечные палочки. При дисбалансе эшерихиозной микрофлоры мутагенность выявлена в 5 из 17 (30%) исследованных экстрактах. Однако уровень мутаций у индикаторного штамма лишь в 2,5 раза больше спонтанного фона мутирования при снижении на 1-2 порядка общего количества полноценных кишечных палочек и в 2,2 раза превосходит его при повышенном содержании в популяции измененных форм эшерихий (слабоферментирующих и лактозонегативных). Количество ревертантов в 104 этих вариантах статистически не отличалось от данных, полученных при определении мутагенности экстрактов фекалий с нормальным уровнем эшерихиозной микрофлоры. Для установления причинно-следственной связи между состоянием кишечной микрофлоры и содержанием мутагенных соединений в фекалиях человека, полученные данные были подвергнуты корреляционному анализу. Корреляции между качественным и количественным составом эшерихиозной микрофлоры и мутагенной активностью экстрактов фекалий не обнаружено, коэффициент ассоциации во всех случаев мал и его отличие от нуля можно отнести к случайным. Однако существует достаточно тесная корреляция между популяционным уровнем лактобацилл и бифидобактерий и уровнем фекальных мутагенов. Коэффициент ассоциации для этих двух признаков оказался равным –0,41. Знак «минус» указывает на то, что корреляция отрицательная, т.е. в случае, когда количество бифидобактерий и лактобацилл у данного обследуемого соответствует норме, то мутагенная активность фекалий скорее всего не будет выявлена. Напротив, при снижении количества бифидобактерий и лактобацилл в кишечнике будет иметь место повышение содержания мутагенов в фекалиях. Отношение коэффициента ассоциации, вычисленного на основании полученных нами данных, к его средней ошибке mr больше стандартного значения критерия t Стьюдента для k = 38 и Р = 0,01,что говорит о его достоверности. Ни у одного из обследованных не наблюдался избыточный бактериальный рост каких-либо представителей условно патогенной микрофлоры, что могло бы обусловить продукцию мутагенных соединений в толстом кишечнике. Поэтому увеличение содержания генетически активных соединений в данном случае определяется дефицитом бифидобактерий и лактобацилл непосредственно, а не косвенно, через увеличение численности эшерихиозной микрофлоры. Чтобы проверить это, из фекалий 6 человек с дисбактериозом, у которых был выявлен дефицит бифидобактерий и лактобацилл специальным образом был приготовлен ферментативный бесклеточный экстракт – фекалаза дефицит (Фд). Такой же экстракт получен и из фекалий людей с нормальной микрофлорой - фекалаза норма (Фн). Эти экстракты инкубировали в течение 2 часов с растворами модельных мутагенов, далее добавляли к индикаторным штаммам, у которых определяли уровень индуцированных ими мутаций. Результаты этих экспериментов представлены в таблице 2. Таблица 2. Мутагенная активность N-нитрозо-N-метилмочевины (НММ) и N-нитрозо-N-нитронитрозогуанидина (НГ) и пиролизата триптофана (Тrp-P) после преинкубации с фекалазой. Штамм модельный мутаген ТА100 - НММ ТА 98 - НГ ТА 98 - Trp-P и Число гистидиновых ревертантов / чашку Без мутагена С мутагеном Мутаген + Фн (спонтанный (позитивный фон) контроль) 125±9 1400±53 436±25 42±5 432±12 215±16 37±4 608±32 580±38 Мутаген + Фд 1230±36 354±22 600±44 Оказалось, что ферментативные экстракты, полученные из фекалий со сниженным количеством бифидобактерий и лактобацилл - Фд, практически не оказывают антимутагенного действия в отношении НММ и НГ, в то время как в присутствии препарата фекалазы, приготовленной из кишечного содержимого со стандартным популяционным уровнем этих бактерий - Фн, мутагенная активность НММ снижалась в 3,2 раза и вдвое для НГ. Уровень мутагенного эффекта пиролизата аминокислоты триптофана (Тrp-P) не изменялся в присутствии обеих вариантов фекалазы и практически не зависел от того, какое количество бифидобактерий и лактобацилл находилось в кишечных пробах. Обсуждение Бактериям, постоянно обитающим в кишечнике человека, достаточно часто приходиться контактировать с мутагенами, которые либо уже содержатся в пище, либо образуются в результате ферментативной метаболической активации промутагенов, причем осуществляемой не только самим хозяином, но и его микрофлорой. Поэтому в процессе длительного существования в таком биотопе они приобрели эффективные системы антимутагенной защиты. Поскольку доминирующим звеном кишечной микроэкологии являются бифидобактерии и лактобациллы, именно эти микроорганизмы должны обладать такими функциями, ведь именно антимутагенные способности позволяют им поддерживать постоянный и эволюционно выработанный уровень мутабильности. Тогда становится понятным, почему уменьшение популяци этих бактерий может привести к повышению мутагенного 105 фона в кишечнике, что продемонстрировано приведенными в данной работе экспериментальными данными. К настоящему времени известно, что бидобактерии и лактобациллы, вегетирующие в кишечнике, обладают системой многоуровневой защиты от самых различных мутагенов [2]. Микроорганизмы могут продуцировать ферменты, оказывающие антиоксидантное действие или инактивирующие мутагены, блокировать метаболическую активацию их, активизировать работу репарационных систем клетки и многое другое. Наблюдаемое в эксперименте снижение мутагенной активности N-нитрозо-N-метилмочевины и N-нитрозо-N-нитро-нитрозогуанидина после преинкубации их с фекалазой свидетельствует о том, что бифидобактерии и лактобациллы имеют ферменты, действие которых приводит к снижению индуцированного этими мутагенами уровня индуцированных реверсий у индикаторных штаммов. Это может быть связано с действием бактериальных редуктаз, восстанавливающих мутагены до гидроксиламинов [9]. Есть данные, что процессы, происходящие при гидролизе микроорганизмами соответствующих субстратов масляной кислоты влияют на инактивацию пищевых проканцерогенов, таких как нитрозамины, которые обычно образуются в результате метаболической активности бактерий-комменсалов у людей, употребляющих богатую белком пищу [13]. Впрочем, необязательно в качестве бактериальных антимутагенов могут выступать белкиферменты. Дезактивация нитрозогуанидина, например, может быть связана с тиоловыми соединениями [2]. Не только бактериальные метаболиты, но и клетки симбиотических бактерий, проявляют высокую дисмутагенную активность в отношении мутагенов широкого спектра действия. К ним относятся так называемые пиролизатные мутагены, выделенные первоначально из жаренных, богатых белками продуктов. Бактерии резидентной кишечной микрофлоры, такие как лактобациллы, обладают способностью связывать мутагенные продукты пиролиза триптофана, образующиеся при термической обработке пищи [18]. Причем, связывают этот мутагенный продукт даже нежизнеспособные клетки. Это объясняет, почему при обработке пиролизата триптофана фекалазой, представляющей собой бесклеточный фекальный ферментативный экстракт, не происходило снижения его мутагенной активности. В связи с этим перспективным представляются не только скрининговые исследования по поиску активных штаммов, но и работы, направленные на выяснение механизмов действия и идентификацию бактериальных метаболитов, обуславливающих антимутагенный эффект. Это позволит провести обоснованный отбор пробиотических бактерий, способных оздоравливать микрофлору кишечника и наделять ее широким спектром протекторных свойств, включая антимутагенную и антикацерогенную активности. 1. Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М.:Гэотар-Медиа.2007.- 304с. 2. Воробьева Л.И., Абилев С.К. Антимутагенные свойства бактерий (обзор). Прикладная биохимия и микробиология. 2002, 38(2):115-127. 3. Дурнев А.Д. Мутагены и антимутагены в продуктах питания. Генетика, 1997, 2 (33): 65-176. 4. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Бондаренко В.М. Иммуномодулирующая и антиканцерогенная активность нормальной микрофлоры кишечника. Эксперим. клин. гастроэнтерол. 2004, 4:54-59. 5. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности среды с помощью бактериальных тест – систем. Методические указания. М., Наука.1985. 6. Шендеров Б.А. Микроэкологические аспекты канцерогенеза. Антибиотики и химиотерапия. 1990, 35 ( 3):165-170. 7. Ames B.N. Mutagenesis and carcinogenesis: exogenous and endogenous factors. Environ. Mol. Mutagen.1989, 14(16): 6677. 8. Gerniglia C.E., Howard P.C., Fu P. et al. Metabolism of nitropolycyclic aromatic hydrocarbons by human intestinal microflora. Bochem.Biophys.Res.Com. 1984, 123 (1):262-270. 9. Hosono A., Sagae S., Tokita E. Desmutagenic effect of cultured milk on chemically induced mutagenesis in Escherichia celli B/r WP2 trp- hcr. Milchwissnscahaft. 1986, 41(3): 142-145. 10. Kingston D.G., Van Tassel R.L., Wilkins T.D. The fecapentaenes, potent mutagens from human feces. Chem. Res. Toxicol.1990, 3: 391-400. 11. Kuhnlein U., Bergstrom D., Kuhnlein H. Mutagens in feces from vegetarians and non vegetarians. Mut. Res. 1981, 85(1):112. 12.Moore W.E., Moore L.H. Intestinal floras of populations that have a high risk of colon cancer. Appl. Environ. Microb.1995, 9(61):3202-3207. 13. Mower R.F., Ichinotsubo D., Wang L.W. et al. Fecal mutagens in two Japanese population with different colon cancer risk. Cancer Res.1982, 42(3): 1164-1169. 14. Reddy B.S. Possible mechanisms by which pro- and prebiotics influence colon carcinogenesis and tumors. J. Nutr. (Suppl.). 1999, 129: 1478- 1482. 15. Sigimura T. Food ad source of complex mixtures and carcinogens. WHO. Int. Agency Res. Cancer. (Lyon). 1990, P.399407. 106 16.Tamura G., Gold C., Ferro-Luzzi A., Ames B.N. Fecalase: A model for activation of dietary glycosides to mutagens by intestinal flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980, 77(8): 4961-4965. 17. Wollowski I., Rechkemmer G., Pool-Zobel B.L. Protective role of probiotics and prebiotics in colon cancer. Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73: 451-455. 18. Zhang X.B., Ohta Y. Antimutagenicity and binding of lactic acid bacteria from a Chinese cheese to mutagenic pyrolizates. J. Dairy Scince, 1990, 73 (10):2702-2710. *** С помощью бактериальной тест-системы Эймса на штаммах Salmonella typhimurim TA 100 и ТA 98 исследована мутагенная активность фекальных экстрактов, полученных от 52 человек, у которых предварительно бактериологическим методом был проанализирован качественный и количественный состав кишечного микробиоценоза. Анализ микробных карт позволил разделить обследуемый контингент на две группы, первую, состоящую из 12 человек, без выраженных отклонений от принятого стандарта содержания основных представителей резидентной микрофлоры, и вторую из 40 человек с выявленным снижением на 1-3 порядка популяционного уровня бифидобактерий, лактобацилл и кишечной палочки. Показано, что снижение на 2-3 раза логарифма стандартного количества бифидобактерий и лактобацилл в кишечнике приводит к повышению мутагенного фона экстрактов фекалий. Связи между качественным и количественным составом эшерихиозной микрофлоры и мутагенной активностью экстрактов фекалий не установлено. Ферментативные экстракты фекалазы, полученные из фекалий с высоким содержанием бифидобактерий и лактобациллп значительно снижали выраженный мутагенный эффект нитрозометилмочевины и нитрозогуанидина. И.С. Савицкая, В.А. Тарасов, А.С. Кистаубаева, Н.В. Воронова БАТАРЕЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТОКСИКОЛОГИИ (Казахский национальный университет им. аль-Фараби) Одним из перспективных направлений экологических исследований является генетическая токсикология и ее новый раздел – экотоксикогенетика, который изучает воздействие факторов среды на генетический аппарат различных организмов в составе биоценоза. Основной задачей этого направления является создание методологии для классификации факторов окружающей среды по степени их генетической опасности и осуществление мероприятий, направленных на уменьшение возможных неблагоприятных генетических последствий [1]. Химические соединения, повсеместно распространенные в природе, способные мигрировать по пищевым цепям и представляющие наибольшую опасность, носят название суперэкотоксиканты [2]. Для контроля за их содержанием в окружающей среде, необходимо разработать тест-системы для выявления как отдельных генотоксикантов, так и оценки суммарной активности этих факторов в сложных смесях и природных средах, прежде всего в почве. Поскольку основное количество загрязнителей попадает именно в этот биосферный объект, при проведении эколого-генетического мониторинга почв имеет смысл осуществлять не только выявление и оценку мутагенного потенциала химических соединений, традиционно поступающих в почву, но и определять уровень загрязнения мутагенами почвенного покрова – среды обитания почвенных микроорганизмов. В связи с этим традиционно применяемые в генетической токсикологии бактериальные тесты с успехом могут применяться для данных целей не только из-за своей краткосрочности, но и ввиду возможности определения мутагенного воздействия загрязнителей на обитающие в почве прокариоты. Для этого на практике основное тестирование или просеивающую программу можно начинать с применением первичной батареи, состоящей из трех разновидностей тестов [3]. В первую включены репарационные тесты, в которых оценивается ДНК - повреждающая активность тестируемых агентов. Они основаны на регистрации большего ингибирующего действия этих агентов у дефектных по репарации штаммов по сравнению с диким типом. Экспресс - методы регистрации агентов, взаимодействующих с ДНК, разработаны для различных микроорганизмов: B.subtilis, P.mirabilis, E. coli. В целом эта группа методов носит название RecА-тест, который в настоящее время существует в разных модификациях. Это, прежде всего, диффузионный тест - «spot»-тест и получивший наибольшее развитие чашечный метод - «plate incorpоration test» [4]. Принципиально они регистрируют один и тот же эффект – различие в токсичности испытуемых соединений в зависимости от наличия или отсутствия recА функции, одного из ключевых ферментов, участвующих в репарационных процессах. Однако результаты, полученные в «spot»-тесте трудно оценить количественно, в этом методе в большей степени регистрируется качественный эффект. Чашечный тест более трудоемкий, по сравнению с другими модификациями и хуже поддается автоматизации. Измерение же оптической плотности бактериальной культуры может быть легко автоматизировано путем использования фотоколориметрических методов, и в этом отношении суспензионный тест является наиболее перспективным в плане создания автоматизированных систем 107 массового скрининга. Разработанная на кафедре биотехнологии КазНУ им.аль-Фараби и в лаборатории молекулярной организации генома Иогена АН России модификация этого теста связана не просто с определением количества клеток в суспензионной культуре, а с учетом -галактозидазной активности в lac+ штаммах E.coli RR1 (recА+) и E.coli HB101(recА-) после контакта с мутагеном. Уровень продукции этого фермента также измеряется фотометрически, отдельно для recА+ и recА- мутантов. Это связано с наличием специфических красителей для –галактозидазы и, в связи с этим, высокой точностью измерения ее активности в клетках, т.е. с повышением разрешающей способности метода спектрофотометрии. Предлагаемая тест-система была апробирована на ряде классических мутагенов, индуцирующих в ДНК различные типы первичных повреждений. Для этого у recA+ и recA- штаммов E.coli после 2-х часовой обработки мутагеном определялась оптическая плотность суспензии и активность – галактозидазы. В качестве модельных мутагенов использовали классическимй алкилирующий агент метилметансульфонат (ММС), основным типом первичных повреждений которого являются модифицированные основания в ДНК. Параллельно с ним исследовали ДНК-тропное действие бифункционального алкилирующего агента – Митомицина С (МтС), в результате действия которого, наряду с индукцией моноаддуктов, образуются еще и межнитевые сшивки. Таблица - Сравнительная чувствительность суспензионного Rec -теста и Rec -хромотеста Мутаген Митомицин С Метилметансульфонат Нитрозометилмочевина Нитрозогуанидин 2-Нитрофлуорен Этидиумбромид 2-Аминопурин Доза, (мкг/мл), при которой наблюдается % снижение регистрируемых параметров Активность βОптическая плотность галактозидазы РД50 КРД50 ЛД50 КЛД50 recАrecА+ recАrecА+ 1,5 120,0 0,0013 17,0 120,0 0,14 2,0 131,0 0,013 177,0 327,0 0,5 4,2 213 0,02 97 176 0,5 0,2 6,2 0,03 1,7 5,8 0,3 11,0 545,0 0,08 163,0 270,0 0,6 36,0 43,0 0,8 70,0 92,0 0,8 227,0 212,0 1,1 205,0 210,0 1,0 Кч recхромотеста 56,0 33,3 25,0 10,0 30,0 1,0 1,0 Параметры дозовой кривой рассчитывали в полулогарифмическом масштабе, а эффективность работы тест-системы учитывали по величине коэффифиента К ЛД50, который вычисляли по отношению дозы мутагена, вызывающего 50% гибель клеток (ЛД50) у штамма recA- по сравнению со штаммом recA+. Для варианта Rec-теста К ЛД50= ЛД50 recA-/ ЛД50 recA+. В случае Rec-хромотеста коэфффициент рассчитывали подобным образом, но при этом определяли дозу мутагена, которая вызывает 50% снижение ферментативной активности – галактозидазы – редукционную дозу (РД50). Для Rec-хромотеста КРД50= РД50 recA-/ РД50 recA+. По этим данным определяется коэффициент чувствительности (Кч), по которому можно сравнить эти два теста. Коэффициент чувствительности Rec-хромотеста Кч = К ЛД50/ КРД50. Эффективность работы системы оценивалась по величине коэффициента R50, регистрирующего кратность показателей 50% снижения активности фермента или плотности культуры у recA+ и recAштаммов после воздействия мутагена. Видно, что Кч предлагаемой тест-системы значительно различается в зависимости от того, какого типа повреждения ДНК вызывает тот или иной мутаген. Так, при воздействии таких агентов как 2-Аминопурин и этидиумбромид, коэффициент Кч =1, т.е. значения К ЛД50 (концентрация клеток) и КРД50 (редукция активности –галактозидазы у recA+ и recAштаммов) не различаются. Этого и следовало ожидать, поскольку данные мутагены индуцируют повреждения, которые реализуются как ошибки репликации. Однако, для других использованных в работе мутагенов, запускающих работу репарационных систем, значения сравниваемых коэффициентов различаются в 10,0 – 33,3 раза для алкилирующих мутагенов, а в случае МтС в 56 раз. Полученные данные позволяют заключить, что эта новая система «RecА-хромотест» является сверхчувствительной и может быть использована не только для обнаружения мутагенов, но и мутагенного фона объектов окружающей среды с различной степенью загрязнения [5]. 108 В основе другой категории методов тестирования химических веществ на генетическую активность с помощью индикаторных микроорганизмов лежит экспериментальная проверка их способности индуцировать генные мутации. Для этого чаще всего используется бактериальная тестсистема Эймса, ставшая уже классической. Метод основан на способности мутагенов вызывать реверсии к прототрофности у ауксотрофных по гистидину штаммов S.typhimurium. Ревертировавшие под действием мутагена клетки при высеве на селективную питательную среду образуют колонии. Если исследуемый агент оказывается мутагеном, то в его присутствии число таких колоний будет больше, чем в контроле (спонтанный уровень мутаций). Предложено достаточно большое число различных модификаций теста Эймса. Основная идея усовершенствований – автоматизация процедуры тестирования и/или повышение чувствительности к отдельным типам мутагенов. Среди наиболее значимых отметим «градиент»-тест Эймса и автоматизированный «спиральный» тест Эймса [6]. С помощью этих модификаций можно одномоментно на одной чашке оценивать мутагенные свойства веществ сразу в нескольких концентрациях. Вместе с тем тест Эймса, несмотря на несомненную популярность, имеет и недостатки. Метод достаточно трудоемок, требует большого количества реактивов, оценка результатов может быть проведена лишь через 48 часов инкубации индикаторных бактерий с испытуемым образцом. Кроме того, тестирование нерастворимых в воде соединений может быть затруднено или даже вообще неосуществимо ввиду сложности его диффузии в слой селективного агара на чашке. И, наконец невозможно оценить мутагенную активность образцов, содержащих токсические компоненты. Поэтому предлагается новая модификация теста Эймса, основанная на биолюминесцентном методе индикации АТФ бактериальных клеток, в основе которого лежит взаимодействие АТФ, люциферазы и люциферина, сопровождающееся свечением. Т.е. биолюминесцентные варианты теста предусматривают использование штаммов, имеющих гены lux [7]. При этом одновременно определяется рост и ауксотрофов и прототрофов, что обеспечивает возможность параллельного измерения не только мутагенного, но и токсического эффекта. При этом время анализа значительно сокращается, реакция происходит в жидкой среде, измерение поддается автоматизации, что исключает субъективный фактор оценки, присутствующей в тесте Эймса. Данная модификация с успехом испытана на двух стандартных мутагенах – метилметансульфонате и нитрохинолиноксиде. Высокая чувствительность данного теста позволяет рекомендовать его для системы экологического контроля. Существование в клетках E. coli системы генов SOS- ответа, выражение которых происходит координированно в ответ на действие мутагенов, создает реальную возможность, путем учета индукции активности любого из известных SOS - генов при действии испытуемого соединения, судить о его мутагенной активности. Эта принципиальная возможность реализована при создании так называемых SOS – хромотестов. Путем слежения за синтезом фермента β- галактозидазы, находящегося под контролем SOS-индуцибельного промотора, полученные системы позволяют качественно и количественно оценивать генотоксичность тестируемых соединений. В настоящее время SOS – хромотест существует в двух вариантах – «хромосомном» и «плазмидном». Достаточно обширный экпериментальный материал по сравнению эффективности SOS – хромотеста с широко известным тестом Эймса указывает, что по уровню прогностической способности эти тесты примерно одинаковы. Это касается также и порога чувствительности тестов, однако по времени, затрачиваемому на одно измерение, а также простоте и возможности автоматизации SOS – хромотест несомненно превосходит тест Эймса. Следует сказать, что это сравнение относится к случаю – «хромосомного» варианта SOS – хромотеста [8]. Однако проведенные нами исследования по определению генотоксичности таких загрязнителей, как фосфорорганические и триазиновые пестициды показали, что SOS – хромотест на базе плазмиды pJB43 превосходит «хромосомный» аналог Килларде и др. по минимально обнаруживаемой концентрации (порогу чувствительности), времени, затрачиваемому на одно измерение и коэффициенту индукции в несколько раз. Достоверный эффект наблюдается в области малых доз – 1 и 10 мкг/мл, для которых активности на штаммах Эймса не обнаружено [9]. Общим достоинством бактериальных тестов является быстрота, экономичность, высокая чувствительность, возможность автоматизации. Краткосрочные бактериальные тест-системы, применяемые в генетической токсикологии, могут быть использованы в системе экологического мониторинга для измерения мутагенного фона объектов окружающей среды. 109 1. Новиков А.В. Экология, окружающая среда и человек // М.: Наука. – 2001. – 306 c. 2. Fahring R.F., Lang R., Madle S. General strategy for the assessment of genotoxicity // Mutat. Res. – 1991. – Vol. 252. – P. 161-163. 3. Тарасов В.А., Абилев С.К., Велибеков Р.М., Асланян М.М. Эффективность батарей тестов при оценке потенциальной мутагенной опасности химических соединений // Генетика. – 2003. - Т.39. - №10. – С.1406-1417. 4. Yamaguci T. Mutagenic activity of various kinds of cheese on the Ames, rec and umu assay // Mutat. Res.-1989. Vol. – 224. - №4. -P.493-502. 5. Савицкая И.С., Махмудова Г.С., Кистаубаева А.С., Ахметова Ж.А. Перспективы использования автоматизированных бактериальных тест-систем для массового скрининга генотоксичных агентов в почве // Сборник материалов II Международной конференции «Современные проблемы геоэкологии и сохранение биоразнобразия». - Бишкек, 2007 - С. 278-280. 6. Diehl M., Fort F. Spiral Salmonella assay: validation against the standard pour-plate assay // Environ. Mol. Mutagen. – 1996. – Vol. 27. – P. 227-236. 7. Guadano A., Pena E., Azucena G.C., Jose F.A. Development of new bioluminescent mutagenicity assay based on the Ames test // Mutagenesis, 1999, Vol.14, № 4. -P.411-415. 8. Quillardet P., Huisman O.,De An R., Hofnung M. SOS-chromotesti, ei direct assay of induction of a SOS function in Escherichia coli k12 to measure genotoxicity // Proc. Nat. Acad . Sci. (USA). - 1982. - Vol.79. - P.5971-5975. 9. Савицкая И.С., Махмудова Г.С., Кистаубаева А.С., Ахметова Ж.А. Перспективы использования автоматизированных бактериальных тест-систем для массового скрининга генотоксичных агентов в почве // Сборник материалов II Международной конференции «Современные проблемы геоэкологии и сохранение биоразнобразия». - Бишкек, 2007 - С. 278-280. Приводится краткая характеристика основных разновидностей бактериальных тест-систем на мутагенез и репарацию, применяемых в экотоксикологии. Обсуждаются их достоинства и недостатки. Разработана новая модификация Recхромотеста. Она рекомендуется для использования в генетической токсикологии при скрининговых исследованиях для определения ДНК-тропной и антигенотоксической активности различных факторов. *** The short characteristic of the basic versions of bacterial test systems on mutation and a reparation, applied in ecotoxicology is resulted. Their merits and demerits are discussed. Is developed new updating Rec-hromotests. It is recommended for use in genetic toxicology at screenings researches for definition of DNA-trops and antigen toxics to activity of various factors. И.С. Савицкая, А.С. Кистаубаева, К. Нигметова, Н.В. Воронова ИССЛЕДОВАНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК ЛАКТОБАЦИЛЛ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА КАРБОНИЗОВАННОМ СОРБЕНТЕ (Казахский национальный университет им.аль-Фараби) При пероральном приеме пробиотиков, содержащих живые микроорганизмы или их активные метаболиты, преодоление естественных барьеров (кислая среда и протеолитические ферменты желудка или секреты мембран кишечных и слизистых оболочек и ворсинок) сопровождается значительной потерей исходной активности готовых лекарственных форм. Клинико-экспериментальные исследования показали, что под действием желудочного сока и желчи пробиотики теряют более 90% своей активности еще до момента попадания в кишечник [1]. Для сохранения жизнеспособности клеток бактерий-пробиотиков их можно, но и закреплять на поверхности носителя-сорбента [2]. Среди сорбентов, которые могут быть использованы для иммобилизации пробиотиков особый интерес представляют активированные угли нового типа, полученные путем высокотемпературной карбонизации и последующей активации отходов растительного происхождения, таких как скорлупа грецких и кокосовых орехов, абрикосовые косточки, рисовая шелуха и т.п. Несомненным достоинством этих сорбентов является то, что производятся они из дешевого, причем ежегодно возобновляемого растительного сырья. Широкий диапазон размеров пор и большая удельная поглощающая поверхность карбонизованных материалов обеспечивают наличие у них высоких прикрепительных и детоксикационных свойств [3]. Это послужило основанием для изучения возможности иммобилизации клеток лактобацилл на сорбенте из зауглероженной рисовой шелухи (ЗРШ), полученной Институте проблем горения КазНУ им.аль-Фараби. Цель работы: Исследовать влияние иммобилизации клеток лактобацилл на зауглероженной рисовой шелухе на их антагонистическую активность и устойчивость к неблагоприятным факторам. Материалы и методы исследования В качестве пробиотического компонента использованы отобранные ранее 3 штамма бактерий рода Lactobacillus, принадлежащие к трем наиболее типичным видам интестинальной лактофлоры: L.fermentum АК-2R, L.acidophilus AA-1R и L.plantarum AP-1R. 110 Иммобилизацию клеток лактобацилл проводили в течение 10 часов, затем носитель отмывали от слабо прикрепившихся клеток изотоническим раствором и использовали в дальнейших экспериментах. Эффективность сорбции бактерий рассчитывали по разнице концентраций клеток микроорганизмов в культуральной среде до и после сорбционного процесса [4]. Для определения степени устойчивости иммобилизованных клеток лактобацилл к биологическим жидкостям использовали желудочный сок (20-30%), который добавляли в среду, содержащую 109 КОЕ/мл бактериальных клеток. Клетки лактобацилл экспонировали с желудочным соком в течение 60 мин, после чего производили высев на твердую среду МРС-1 для определения количества жизнеспособных клеток. Антагонистическую активность определяли после совместного культивирования комплекса иммобилизованных клеток лактобацилл (КИКЛ) в жидкой питательной среде MRС-5 в течение 24 часов в отношении трех тесткультур Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus и Candida albicans. Результаты и обсуждение В литературе встречаются разноречивые данные о времени установления сорбционного равновесия в системе клетка-носитель. Некоторые авторы считают, что сорбция клеток из концентрированной суспензии микроорганизмов обычно полностью проходит за 5-10 минут, дальнейшее продление времени контакта, как правило, не увеличивает количества сорбированных клеток. Однако, для некоторых микроорганизмов сорбционный процесс продолжался в течение более длительного взаимодействия клеточной суспензии с носителем [4]. В наших экспериментах количество сорбированных клеток после 10 часового контакта суспензии с носителем намного выше, чем после 12 часового, что может объясняется изменением свойств поверхности клеток в процессе длительной иммобилизации [5]. Однако, увеличение времени контакта суспензии микроорганизмов с носителем до 24 часов не приводило к возрастанию количества прикрепившихся клеток. На основании этого можно считать, что 10 часов - оптимальное время для иммобилизации клеток лактобацилл на ЗРШ в использованных условиях. Для повышения эффективности иммобилизации иногда предлагается окислительная модификация сорбентов гипохлоритом натрия, озоном [6] или поверхность сорбционных материалов обрабатывают двухвалентными катионами или этанолом [7]. Такой способ может менять заряд на поверхности дисперсионных частиц и часто приводит к усилению взаимодействия с противоположно заряженными группами на поверхности клетки. В связи с этим, с целью увеличения удельной емкости сорбент ЗРШ предварительно обрабатывали этанолом. Для этого использовали сетчатый стакан (стакан Бернрейтера), замачивали 100 г сорбента в 500 мл 80% этанола, смесь перемешивали и оставляли на 3 часа, затем сорбенты извлекали из цилиндра, после чего промывали дистиллированной водой и автоклавировали при 1 атм. в течение 1 часа. Данные, иллюстрирующие способность клеток лактобацилл к иммобилизации на сорбенте ЗРШ, обработанным вышеуказанным способом, приведены в таблице 1. Таблица 1 – Эффективность иммобилизации клеток лактобацилл на ЗРШ Штаммы Эффективность сорбции, % ЗРШ ЗРШ после обработки этанолом 44±0,2 65±8,0 Десорбция клеток, % ЗРШ ЗРШ после обработки этанолом 10±0,4 2±0,1 L.acidophilus AA1 40±0,07 62±4,0 12±0,06 4±0,2 L.plantarum AP-1 54±0,3 78±6,0 8±0,5 3±0,05 L.fermentum АК2R Установлено, что после обработки сорбента этанолом его клеточная загрузка увеличилась и достигает – 62-78%. Кроме того, при модифицировании поверхностей этанолом десорбция клеток также снижается, что свидетельствует о повышении прочности их прикрепления к носителю. На поверхности носителя – ЗРШ была иммобилизована и смешанная культура лактобацилл, состоящая из всех трех штаммов. Оказалось, что бактерии хорошо адсорбируются на данном сорбенте, титр прикрепившихся клеток достигает 109 КОЕ/г. Однако, количество клеток штаммов Lactobacillus fermentum АК-2R было гораздо больше, чем Lactobacillus acidophilus AА-1 и Lactobacillus plantarum AР-1. Полученный биосорбент содержит 5,3х108 КОЕ/г клеток штамма АК-2R. Клетки двух остальных штаммов распределены поровну (2,5х108 КОЕ/г клеток штамма АА-1 и 2,2х108 КОЕ/г – АР-1). Следовательно, соотношение компонентов каждого вида составляет 2:1:1. Это может быть связано со 111 штаммовыми различиями поверхностных сайтов бактериальных клеток. Клетки на поверхности ЗРШ расположены в основном в виде микроколоний. Этот факт может иметь существенное значение, поскольку межбактериальное агрегирование, происходящее в микроколониях - начальный этап образования биопленок, в которых бактерии значительно лучше защищены от неблагоприятных воздействий [8-10]. В наших экспериментах таковым является кислая среда желудка, при транзите через который большая часть микробных клеток погибает. Для изучения чувствительности свободных и иммобилизованных клеток к такому стрессовому воздействию использовался желудочный сок, который был пoлучен при гастроскопии. Его добавляли к культуре лактобактерий в среде МРС-1, содержащей 109 клеток/мл и инкубировали в течение часа, после чего определяли количество выживших клеток. При воздействии желудочного содержимого на жидкий концентрат лактобактерий их биотитр (концентрация живых клеток) уменьшается на 4 порядка (рис. 1). Это означает, что при пероральном применении суспензии лактобактерий следует ожидать, что лишь незначительная часть их жизнеспособных клеток достигает толстого кишечника. По этой причине его следует рассматривать скорее как ценный продукт питания, богатый ферментами, витаминами, но не как лекарственный препарат, предназначенный для активной колонизации кишечника лактобациллами. Использование в экспериментах с «модельным желудком» не свободных, а иммобилизованных клеток лактобацилл выявило, что прикрепление микробных клеток на сорбент ЗРШ оказывает защитное действие в отношении желудочного сока. Количество жизнеспособных клеток в этом случае снижается лишь на порядок. Скорее всего, это связано с тем, что клетки, входящие в состав образованных на сорбенте микроколоний, лучше защищены от бактерицидных факторов и неблагоприятного действия окружающей среды, поскольку покрыты дополнительной общей мембраной [1]. Поэтому иммобилизованные пробиотики по устойчивости к воздействию желудочного сока значительно превосходят жидкий концентрат на основе свободных клеток микроорганизмов и могут беспрепятственно преодолевать «желудочный» барьер при их пероральном введении. Кроме того, их метаболитическая активность выше, поскольку в составе микроколоний и биопленок она контролируется на основе «Quorum sensing». Эта система носит такое название, поскольку она координирует работу генов, экспрессия которых происходит только при достижении определенной плотности микробной популяции (не менее 107 клеток/мл). Гены, кодирующие ферменты, обеспечивающие синтез лактобациллами таких антимикробных факторов как бактериоцины и микроцины, регулируются этой системой [1; 11]. Рисунок 1 - Влияние искусственной желудочной среды на жизнеспособность свободных и иммобилизованных клеток лактобацилл Активность пробиотиков, определяемую в условиях in vitro, принято оценивать по титру микробных клеток в препарате или уровне их физиологической активности. Поскольку важнейшей характеристикой эффективности пробиотического действия является антимикробная активность, представлялось целесообразным изучение влияния иммобилизации на этот показатель. Антагонистическую активность определяли после совместного культивирования комплекса иммобилизованных клеток лактобацилл (КИКЛ) в жидкой питательной среде MRС-5 в течение 24 часов в отношении трех тест-культур Salmonella typhimurium, Staphylococcus aureus и Candida albicans. Ингибирующий эффект препарата определяли по количеству выживших клеток тест-штаммов (% к их уровню при выращивании в питательной среде без пробиотиков). Для этого в систему вносили 1 мл взвеси лактобацилл в концентрации 108 КОЕ/мл, 1 г КИКЛ или 1 г сорбента без клеток. Их добавляли к 112 10 мл суспензии тест-штаммов (108 клеток/ мл) в среде MРС-5, то есть соотношение культур составляло 0,1:1,0 (табл.2). Таблица 2 – Антагонистическая активность комбинированного препарата при совместном культивировании с тест-организмами Вариант Количество жизнеспособных клеток тест-штаммов, % к контролю Salmonella Staphylococcus Candida albicans typhimurium 50-90 aureus S60 КАА88 КИКЛ 0,8±0,01 0,6±0,03 8,3±0,2 КСК 17,5±2,1 16,5±1,3 29,6±1,6 ЗРШ 67±2,6 70±4,6 72±5,3 Контроль 100 100 100 Примечание: КИКЛ - комплекс иммобилизованных клеток лактобацилл; КСК-комплекс свободных клеток; ЗРШ – зауглероженная рисовая шелуха. Видно, что комплекс из свободных клеток лактобацилл оказывает выраженное негативное действие на все 3 тест-культуры. В то же время и сам сорбент способен связывать до 28-33% клеток этих микроорганизмов. Поэтому при использовании комплекса иммобилизованных клеток лактобацилл происходит эффективное подавление роста тест-культур. Согласно стандартным требованиям, количество живых клеток тест-штаммов бактерий по истечении 24 часового совместного культивирования с лактобактериями не должно превышать уровень 2 % по сравнению с контролем. При определении антагонистической активности КИКЛ после его совместного культивирования с микроорганизмами – мишенями эта цифра многократно превышена, то есть, иммобилизованные клетки пробиотиков в условиях in vitro практически полностью подавляют рост и жизнеспособность данных тест-организмов. Таким образом, при сравнительной оценке устойчивости свободных и иммобилизованных клеток лактобацилл к желудочному соку были получены результаты, свидетельствующие о достаточно высокой устойчивости иммобилизованных бактериальных препаратов к бактерицидному действию биологических жидкостей, вероятно, это связано с протективным действием карбонизированного носителя. Кроме того, клетки, образующие микроколонии, лучше защищены от бактерицидных факторов и неблагоприятного действия окружающей среды, что может способствовать преодолению «желудочного» барьера при их пероральном введении. Иммобилизация клеток лактобацилл повышает их антагонистическую активность 1 Бондаренко В.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника как клинико- лабораторный синдром: современное состояние проблемы. - М., Гэотар-Медиа. - 2007. – С. 304-305. 2 Решетников В.И. Разработка лекарственных форм препаратов с иммунобиологической и сорбционной активностью //Фармация. – 2002. - №5. – С. 40-44. 3 Емуранов М.М., Шилина Ю.А., Рябикин Ю.А., Зашквара О.В., Шабанова Т.А., Бийсенбаев М.А., Мансурова Р.М., Мансуров З.А. Физико-химическое исследование углеродных материалов на основе нетрадиционного растительного сырья // Материалы 4 международного симпозиума «Физика и химия углеродных материалов. Наноинженерия». – Алматы, 2006. – С. 168-171. 4 Курдиш И.К. Взаимодействие микроорганизмов с твердыми материалами и его биотехнологическое значение // Микробиологический журнал. – 1999. - Т. 61, № 1. - С. 60-73. 5 Жубанова А.А., Шигаева М.Х. Иммобилизованные клетки микроорганизмов // Биотехнология. Теория и практика. 1997. - № 2. - С. 3-12. 6 Тихонова Л. С., Белоцерковский М. Ц. Повышение эффективности сорбции микроорганизмов на активированном угле при поляризации сорбента // Прикладная биохимия и микробиология - 1995. - Т. XXV, №2. - C. 184 - 187. 7 Дигель И.Э., Жубанова А.А. Прикрепительная иммобилизация клеток микроорганизмов // Биотехнология. Теория и практика. - 1997. - №4. - С. 3-9. 8 Волков М.Ю. Эффективные формы пробиотиков, иммобилизованных на природных адсорбентах // Пищевые ингридиенты. Сырье и добавки. – 2007. - № 1. – С. 48-51. 9 Dunne W.M.Jr. Bacterial adhesion; seen any good biofilms lately? // Clin. Microbiol. Rev. -2002. – Vol. 15. – P. 155-156. 10 Bhinu V.S. Insight into biofilm-associated microbial life. – J. Mol. Microbiol. – 2005. - Vol. 3. – P. 197-214. 11 Kuchma S.L., O’Toole G.A., Surface-induced and biofilm induced changes in gene expression // Curr. Opin Biotachnol. 2000. – Vol. 11. – P. 429-433. *** Жоғары температурада көміртектелінген күріш кебегін этанолмен өңдегенде оның сорбциялық қасиеті 8% жоғарылайды. Иммобилизенген лактобацилла клеткаларының қарын жəне өт сөліне тұрақты антагонистік бейсенділігі жоғары. 113 *** Etanol cultivation carbonized acid sorbent on the Rice Hush base prefer the sorbtion property in attidude Lactobacillus cells. Cells immobilization of Lactobacillus is elevate their stability to gastrict juise, and stimulate antagonistic activity. И.С. Савицкая, А.С. Кистубаева, М. Абдулжанова, Ж. Жумагалиева ПРИНЦИПЫ ОТБОРА ШТАММОВ ДЛЯ НОВОГО ЛАКТОСОДЕРЖАЩЕГО ПРОБИОТИКА (Казахский национальный университет им.аль-Фараби) В последние годы интенсивно развивается биотехнология пробиотиков – препаратов, используемых для коррекции и профилактики микроэкологических нарушений в желудочно-кишечном тракте человека и животных [1]. Поскольку, в кишечнике человека доминируют бифидобактерии и лактобациллы, большинство пробиотиков создается на основе этих бактерий [2]. Эффективность пробиотических препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в состав препарата [3]. Производственные бактерии должны обладать набором характеристик, позволяющих им конкурировать с патогенными и условно патогенными микроорганизмами. К ним относятся: апатогенность, антагонистическая активность, способность к адгезии и колонизации слизистой кишечника, активность кислотообразования, определенный уровень резистентности к соляной кислоте и желчи [4]. Повышение эффективности и расширение спектра биологической активности лактосодержащих пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые и взаимодополняющие штаммы [5]. Цель работы: сконструировать бактериальную композицию с учетом совместимости входящих в нее штаммов. Материалы и методы исследования Для составления бактериальных композиций использовали 10 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника 20 детей и взрослых обоего пола, не имеющих в анамнезе инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Антагонистическую активность исследовали методом отсроченного антагонизма в отношении стандартного набора тест-культур [6], а также гомоантагонизма – при совместном культивировании штаммов лактобацилл на плотной питательной среде [7]. Адгезивную активность определяли по способности штаммов агглютинировать агглютинировать эритроциты барана, морских свинок, человека IV(AB) и I(0) [8]. Для определения лектиноподобных структур использовали реакцию агглютинации с конкавалином А [9]. Результаты и обсуждение Ключевым критерием при первичном отборе пробиотических штаммов лактобацилл является уровень и спектр их антагонистической активности, который традиционно определяется методами штрихового посева, диффузионным, или отсроченного антагонизма. При этом не учитывается природа продуцируемых отбираемыми штаммами веществ, обладающим антагонистическим действием по отношению к организмам-мишеням. У различных видов молочнокислых бактерий описаны бактериоцины с высокой и микроцины – с низкой молекулярной массой, нарушающие проницаемость бактериальной мембраны, блокирующие белковый синтез, подавляющие репликацию ДНК, изменяющие мембранный потенциал клетки или нарушающие процессы деления клетки [10]. С нашей точки зрения, в качестве критерия отбора штаммов для включения в пробиотическую композицию, являющуюся микробиологической основой комплексных препаратов, следует проводить селекцию штаммов лактобацилл, синтезирующих микроцины с широким спектром антагонистической активности. Для их определения можно использовать метод агаровых слоёв – разновидность метода отсроченного антагонизма. Применяя его различные модификации, достаточно просто дифференцировать продукцию бактериоцинов с высокой молекулярной массой и микроцинов с низкой молекулярной массой. В первом случае на поверхность плотной среды наносят бляшками лактобациллы, которые после культивирования убивают парами хлороформа, затем наслаивают тесткультуру. Появление вокруг бляшки зоны отсутствия роста - положительный результат. Для индикации микроцинов на поверхность плотной среды с нанесенными, высохшими и обработанными в парах хлороформа бляшками, накладывают стерильный целлофан, а сверху на него наслаивают полужидкий агар с тест-культурой. Вокруг колоний, продуцирующих микроцины, появляются зоны 114 роста индикаторных штаммов [11]. Микроцинпродуцирующая активность выявлена у 10 штаммов (таблица 1). В антимикробном действии исследуемых штаммов имеется определенная специфичность, спектры антагонистической активности у разных штаммов далеко не всегда перекрываются. Так, штаммы АА-1 R, AI-17, LK-7 и AС-31 R больше ингибируют грамположительные бактерии, но не дрожжи. Штаммы AK-2R, АК-9, АА-9 и АП-4R максимально эффективны против грамотрицательных энтеробактерий. Штаммы АР-1, АП-4R, AK-2R и AI-17 оказывают негативное действие на дрожжевые грибки. Для того, чтобы совместить разные виды антагонистической активности, следовало составить композицию из нескольких штаммов. Для первичного скрининга пробиотических бактерий, большое значение имеет способность к адгезии, ведь именно это качество определяет возможность их приживления в организме хозяина. Наиболее универсальной моделью для изучения адгезии микроорганизмов являются эритроциты, поскольку гликофорин их поверхностного слоя идентичен гликокаликсу эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для микробных адгезинов [8]. Таблица 1 – Спектр антагонистического действия лактобацилл – продуценов микроцинов АА-1R АI-17 АA-9 АР-1R АП-4R АC-31R АС-1 AK-2R АК-9 LK-7 22±0,70 12±0,14 7±0,27 5,5±0,16 2±0,41 3,5±0,45 17±0,34 13±0,35 18±0,32 19±0,18 12±0,36 18±0,38 21±0,69 11±0,35 19±0,50 15±0,45 8±0,35 22±0,56 20±0,26 6±0,27 Антагонистическ ая активность в отношении штаммов Candida albicans Антагонистическ ая активность лактобацилл в отношении грамотрицательных энтеробактерий Штаммы Антагонистическ ая активность в отношении грамположительных аэробных бактерий Зоны задержки роста тест-микробов, мм (М±m) 3±0,11 5,5±0,21 4,5±0,14 10,5±0,16 7,5±0,17 4,5±0,18 2,5±0,09 7±0,55 3±0,07 3±0,19 Экзогенные лактобациллы способны прикрепляться к эпителиоцитам, создавая барьер, препятствующий адгезии и транслокации во внутреннюю среду патогенной и условно-патогенной флоры. Эта адгезия осуществляется за счет наличия у лактобацилл лектиноподобных структур, плотно связанных с клеточной стенкой [9]. Некоторые штаммы способны синтезировать слущивающиеся с поверхности клеток адгезиноактивные белки, которые блокируют и дезинтегрируют патогены, защищая таким образом макроорганизм от способных к транслокации кишечных бактерий [12]. В связи с этим, полагаем, что наилучшую композицию препарата может дать комбинация штаммовпродуцентов микроцинов, в которой одновременно будут присутствовать наряду со штаммами, несущими на своей поверхности слущивающийся адгезиноактивный белок, еще и штаммы, адгезивную активность которых определяют лектиноподобные структуры, плотно связанные с клеточной стенкой. Для определения последних у исследуемых штаммов использовали реакцию агглютинации с конкавалином А. Оказалось, что продукция белково-липотейхоевого комплекса присутствует у штамма AK-2R, принадлежащих к виду L.fermentum, а также у шаммов АР-1R и АП-4R вида L.plantarum. Выявлено также, что набор адгезинов у разных штаммов и видов лактобацилл, определяемый по способности культур агглютинировать эритроциты барана, морских свинок, человека IV(AB) и I(0) P+ вариабилен. Штамм LK-7 вида L.casei имел узкий спектр адгезинов – он умеренно агглютинировал только эритроциты барана. В то же время штаммы АА-1R и AI-17, относящиеся к виду L.аcidophilus активно агглютинировали все четыре вида эритроцитов. Проведенные исследования позволяют заключить, что в состав комплексного пробиотического препарата можно включать культуры с выраженной экспрессией разных типов адгезинов, но не 115 секретирующие лектинзависимый белок, и другой вариант лактобацилл, секретирующий во внешюю среду этот субстрат, но при этом проявляющий умеренную адгезивность в тесте с эритроцитами. Исходя из полученных данных, для дальнейшего отбора оставлено 5 штаммов. Cовмещение штаммов и композицию и их совместное культивирование может приводить к проявлению антагонизма не только по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям (гетероантагонизм или прямой антагонизм), но и к представителям других видов рода Lactobacillus, а иногда даже к отдельным штаммам в пределах одного вида. Такой вид активности в литературе принято называть гомоантагонизмом или изоантагонизмом [7]. Поэтому при конструировании комплексных пробиотических препаратов, следует учитывать биосовместимость штаммов, входящих в бактериальный консорциум. Оценку биосовместимости штаммов лактобацилл проводили путем одновременного совместного культивирования на плотной питательной среде, а также с использованием одного из вариантов метода отсроченного антагонизма. Результаты этих тестов суммированы в таблице 2. Таблица 2 – Биосовместимость штаммов лактобацилл при совместном культивировании на плотной питательной среде Штамм ы АА-1R АА1R АI17 АР1R __ АК2R LK7 + + + __ __ + + + + АI-17 __ АР-1R АК-2R + + __ __ + LK-7 + + + + По результатам экспресс-теста на биосовместимость выяснилось, что штамм L.acidophilus АI-17 несовместим со штаммами L.fermentum АК-2R, L. plantarum АР-1R и даже со штаммом того же вида L. acidophilus АА-1R. Судя по полученным в этом тесте результатам, АI-17 проявляет гомоантагонистическое действие в отношении всех используемых в эксперименте штаммов, кроме штамма LK-7. Поэтому для основы бактериальной композиции из двух представителей вида L. acidophilus был оставлен только штамм АА-1R. Из полученных в этом эксперименте данных видно, что все использованные в работе штаммы полностью совместимы друг с другом. Зона задержки роста или полностью отсутствует, или ее размер не превышает 2-3 мм. Исходя из этого, теоретически возможно составление 4-х разновидностей бактериальных композиций: №1 - АА-1R+ АР-1R+LK7+АК-2R; №2 - АА-1R + АР-1R+АК-2R; №3 - АА-12+ АР-1R+ LK7; №4 - АА-12+ АК-2R+ LK7. В микробиоценозе кишечника человека присутствуют представители трех таксономических групп лактобацилл: термобактерии или облигатные гомоферментативные лактобациллы (ОГОЛ), к которым относится вид L. acidophilus; стрептобактерии или факультативные гетероферментативные лактобациллы (ФГЕЛ), в эту группу входит вид L. plantarum и бетабактерии - облигатные гетероферментативные лактобациллы (ОГЕЛ). Лактобациллы L. fermentum и L.casei - среди составляющих эту группу видов. Комплексный препарат должен включать представителей всех физиологических групп. Примером является Казахстанский пробиотик «Плантафермин». Такой микроэкологический подход позволяет повысить эффективность пробиотикотерапии при дисбактериозах. Среди отобранных штаммов к группе ОГОЛ относится L.acidophilus АА-1R, Этот вид, как указывалось выше, составляет основу многих фармабиотиков. К группе ФГЕЛ относится штамм L.plantarum АР-1R, этот вид входит в состав широко известного препарата «Лактобактерин». Виды лактобацилл, такие как L.fermentum и L.casei, входящие в группу ОГЕЛ, в составе пробиотических препаратов используются значительно реже, хотя по своим метаболическим особенностям они имеют сходный путь метаболизма с бифидобактериями. Последнее выглядит достаточно привлекательно с точки зрения возможности замены бифидобактерий в комплексных препаратах на виды, входящие в группу ОГЕЛ, что может упростить производственный процесс, поскольку лактобациллы можно выращивать на одной питательной среде. Вместе с тем, используемые в работе штаммы, 116 принадлежащие к группе ОГЕЛ – LK-7 и АК-2R обладают схожими антагонистическими особенностями, поэтому представляется обоснованным включение в композицию лишь одного из этих двух штаммов. Таким образом, для разработки препарата предлагаются два варианта бактериального консорциума: №2 - АА-1R+АР-1R+АК-2R и №3 – АА-1R+АР-1R+LK7. Из этих двух композиций одну наиболее перспективную, используя при этом такую технологическию характеристику, как накопление биомассы. Уровень накопления биомассы является определяющим технологическим параметром, характеризующим культуру лактобактерий и влияющим на количество жизнеспособных клеток в дозе препарата. Для культивирования использовали казеиново-дрожжевую среду (КДС) традиционно применяемую в производстве лактосодержащих пробиотиков . Высокие ростовые качества казеиноводрожжевой среды объясняются рациональным подбором питательных веществ. Глубинное культивирование лактобактерий проводили при температуре (37±1)°С в условиях постоянного перемешивания, продолжительность культивирования составляла 10-12 ч. Доза вносимого инокулята составляла 10% от объема питательной среды. В процессе культивирования с помощью 10% раствора аммиака поддерживали рН среды на уровне 5,5-6,0. В качестве углеводной добавки использовали 40% раствор глюкозы. Оптическую плотность бактериальных культур в процессе роста определяли с помощью фотоэлектроколориметра (кювета-1 мм, длина волны – 540 нм), пробу бактериальной взвеси перед измерением разводили 0,9 % раствором натрия хлорида в соотношении 1:1. Оказалось, что накопление биомассы у штамма LK-7 значительно ниже, чем у остальных штаммов. В связи с этим для комплексного препарата была выбрана бактериальная композиция состоящая из штаммов AА-1R + AР-1R + АК-2R. При исследовании характера взаимоотношений между отдельными видами лактобацилл, входящих в состав комбинации для нового пробиотика, было установлено существование симбиоза между ними, выражавшееся в усилении антагонистической активности. Антагонистические свойства штаммов, входящих в комбинированный препарат исследовали с применением прямого совместного культивирования на плотной питательной среде (таблица 3). Таблица 3 - Антагонистическая активность пробиотической компоции Штаммы Зона задержки роста, мм Salmon Eschercihia Shigel Proteus Staphylococcus ella coli 157 la sonnei vulgaris 177 aureus typhimurium 177б S60 59-60 АА-1R 15±2,0 12±1,0 16±1,1 13±1,5 10±1,1 АР-1R 10±1,0 8±0,4 7±0,8 11±1,7 8±0,6 AK-2R 8±0,5 6±0,7 10±0,7 8±0,7 15±0,5 комплекс 17±2,2 15±0,9 16±1,2 15±0,9 18±1,6 Can dida albicans KAA-88 0 10±1,3 0 12±1,8 Использование штаммов в композиции увеличивало их антагонистическую активность против микроорганизмов-мишеней, кроме того, эта активность проявлялась теперь и в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных микроорганизмов. Комплекс способен подавлять также и грибки рода Candida. То есть объединение штаммов лактобацилл в консорциум позволяет расширить спектр биологической активности будущего препарата. В естественных средах обитания микроорганизмы находятся в условиях смешанных микробных популяций, где они вступают различного рода взаимоотношения друг с другом. Появляются данные, свидетельствующие о возможных изменениях адгезии микроорганизмов в этих условиях. Так, под влиянием одних микроорганизмов цитадгезия других может снижаться. Такое явление объяснимо либо формированием микробного барьера на поверхности клеток макроорганизма, либо конкуренцией за рецепторы для адгезинов. Иногда, наоборот цитадгезия микроорганизмов может усиливаться. Поэтому при создании бактериальных препаратов необходимо проведение исследований по изучению адгезивных свойств исследуемой комбинации лактобацилл в условиях смешанных микробных популяций. В работе использовали культуры стафилококков, сальмонелл, кандид и бифидобактерий. Исследования проводили параллельно при двух различных соотношениях лактобацилл и тест-культур 0,1:1; 1:1. В качестве контроля использовали суспензии отдельных микроорганизмов в концентрациях, соответствовавших их концентрации в опытном образце. Результаты по изучению адгезивных свойств 117 Контроль bifidum 701 1:1 Bifidobacterium Candida albicans Salmonella aureus thyphimurium 0,1:1 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Staphilococcus Средний показатель адгезивности исследуемой культуры лактобацилл в условиях смешанных микробных популяций представлены на рисунке 1. Рисунок 1 – Оценка адгезивных свойств тест-штаммов после культивирования с пробиотической композицией В смешанных популяциях лактобациллы существенно снижали цитадгезию стафилококков при всех изученных соотношениях. Так, например средний показатель адгезии стафилококков в контроле был равен 4,1 в опытных вариантах при соотношении лактобацилл и стафилококков 0,1:1; 1:1 он был равен 2,1; 1,0 соответственно. Аналогичные результаты были получены в смешанных популяциях лактобацилл и кандид. При соотношении изучаемых лактобацилл с кандидами в соотношении 0,1:1; 1:1 средний показатель цитадгезии кандид снижался от 2,7 до 0,9. Контроль, при этом составлял 4,5 единицы. Отметим, что СПА сальмонелл был равен 3, а в условиях смешанных популяций при соотношении лактобацилл и сальмонеллами 0,1:1; 1:1 этот показатель у данной тест-культуры снижался и был равен соответственно 2; 0,5. Цитадгезия бифидобактерий в смешанных популяциях оставалась на уровне контроля во всех изученных вариантах. Поскольку совместное применение трехкомпонентной пробиотической композиции снижает цитадгезию таких культур, как S.typhimurium, S.aureus и C.albicans, не изменяя при этом цитадгезии бифидобактерий, совместное использование штаммов в композиции позволяет существенно снижать адгезивные свойства патогенных и условно-патогенных бактерий. Таким образом, полученная пробиотическая композиция обладает биосовместимостью, а объединение штаммов лактобацилл в композизию позволяет расширить спектр и уровень их антагонистической активности. 1 Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Микрофлора человека и животных и ее функции. – Грантъ. - 1998. – Т.1. – 280 с. 2 Михайлова, Т.Л., Калинская Т.Ю., Румянцев В.Г. Биопрепараты и пищевые добавки в коррекции дисбактериоза // Рос. журн. гастроэнтерол, гепатол, колопроктол. – 1999. - Т.9, №3. - С. 67-70. 3 Ishibashi N., Yamazaki S. Probiotics and safety // Am. J. of Clin. Nutr. – 2001. – Vol. 73, № 2. – P. 465-470. 4 Dunne C., O`Mahony L., Murphy L. et al. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings // American Journals of Clinic Nutrition. – 2001. – Vol. 73, № 2. – P. 386-392. 5 Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы питания. – 1999. - №2. – С. 32-40. 6 Ганина В.И., Лысенко А.М., Гурьева Ю.В., Калинина Н.Ф. Изучение антагонистической активности и идентификация бифидобактерий и молочнокислых палочек, рекомендуемых для получения продуктов лечебнопрофилактического назначения и пробиотиков // Биотехнология. – 1999. – № 2. – С. 15-21. 7 Глушанова Н.А., Блинова А.И., Бахаева В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2004. - № 6. – С. 37-39. 8 Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лаб. дело. – 1986. - № 4. – С. 211-212. 9 Гизатулина С.С., Биргер М.О., Кулинич Л.И., Фиш Н.Г., Мазитова О.П., Бирюкова Н.В. Способ оценки состояния микрофлоры кишечника человека по количеству адгезивно-активных бактерий и типу адгезинов // ЖМЭИ. – 1991. – № 4. – С. 21-23. 10 Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // ЖМЭИ. – 2003. - № 3. – С. 109-113. 11 Parente E., Ricciardi A. Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1999. – Vol. 52. – P. 628-638. 118 12 Коваленко Н.К., Подгорский В.С., Касумова С.А. Адгезия молочнокислых бактерий к эпителию различных полостей организма человека // Микробиол. журн. – 2004. – Т. 66, №4. – С. 62-68. *** Биологиялық жəне технологиялық лактобацилла штаммдарының сəйкестілігі анықталады. Үш штаммнан құралатын композиция L.fermentum AK-2R, L.acidophilus AA-1, L.plantarum AP-1 жасалынды. Композицияға үш штамм кірді, олар антагонисттік бейсенділігімен ерекшеленеді. Пробиотикалық консорциум қабілеттілігін кеңейтеді. *** In the result of doing work has appointed determinant biological and technological compatibly of 3 lactobacillus strains. Was composed the composition of 3 lactobacillus strains: composition L.fermentum AK-2R, L.acidophilus AA-1, L.plantarum AP-1. Strains of which differentiated for antagonistic activity was extensions in composition. It extend spectrum of consortium probiotical effect. Р.К. Сыдыкбекова1, М.Т. Каргаева2, М.Х. Шигаева1, Т.Д. Мукашева1, Р.Ж. Бержанова1, Л.В. Игнатова1, Е.В. Бражникова2 РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ В ЦЕЛИННЫХ ПОЧВАХ РАВНИННОЙ ТЕРРИТОРИИ КАЗАХСТАНА (1 КазНУ им. аль-Фараби, факультет биологии и биотехнологии, кафедра биотехнология, 2НИИ проблем биологии и биотехнологии, г. Алматы.) В работе изучены распределение грамположительных бактерий в целинных почвах равнинной территории Казахстана. Видовая структура грамположительных бактерий основных типов почв Казахстана была разнообразна. Во всех типах почв доминировали представители бактерий рода Bacillus и Rhodococcus. В серобурых пустынных почв Казахстана доминировали виды Bас. megaterium, Bac mycoides, Rh. roseus. В бурой пустынной, светло и средне каштановых почвах в большом количестве обнаружены виды Bac. мegaterium и Rh. erythropolis, в темнокаштановой почве Bас. megaterium и Rh. equi, а в черноземах доминировали Rh. erythropolis, Rh. aetherevorans, Rh. Baikonurensis, Bас. мegaterium. Интерес к изучению микробных сообществ почв в значительной степени обусловлен их ролью в биогеохимических циклах элементов, сохранении питательных ресурсов в пределах экосистемы и формировании плодородия почв. Для того чтобы понять функционирование почвы как системы, необходимо знание, как количественной характеристики микробного сообщества, так и качественной, отражающей биоразнообразия почвенной микробиоты [1,2]. Традиционно, для характеристики состава микробных сообществ используются микробиологические методы, предполагающие получение чистых культур микроорганизмов с последующей микробиологической и биохимической характеристикой [3]. Почва — главный резервуар и естественная среда обитания микроорганизмов, в том числе бактерий. Большое число бактерий, представляющих обособленные группы характеризующихся различными типами метаболизма, было выделено в течение многих лет из различных почв. Среди почвенных бактерий наибольшее значение имеют грамположительные бактерии, которые активно участвуют в деструкции различных веществ и сохранении плодородия почв [4-6]. Исследование бактериального разнообразия разных типов почв, представляет интерес, как для фундаментальной микробиологии, так и для решения биотехнологических задач. Однако до сих пор нет целостной картины распределения бактерий в почвах на территории Казахстана. Поэтому целью нашей исследований явилось оценка распределения грамположительных бактерий в целинных почвах равнинной территории Казахстана. Материалы и методы исследование. Объектом исследования служили бактерий выделенные из разных типов почв Казахстана. Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств бактерий проводили общепринятыми методами, предложенными в руководствах [7]. Идентификацию проводили, используя определители для бактерий [8;9]. Результаты и обсуждение Распределение бактерий в пределах почвенного профиля имеет общий характер, состоящий в снижении плотности популяций по мере перехода от верхнего к нижним горизонтам. При переходе от верхнего к нижним горизонтам уменьшается не только численность бактерий, но и их таксономическое разнообразие. В бактериальном комплексе присутствуют, главным образом, родококки, бациллы и нокардии. В их распределении по различным типам почв отмечена следующая особенность: доминирующей группой являются грамположительные бактерии. Они представлены аэробными кокками и палочками родов Mycobacterium, Rhodococcus, Kocuria (Micrococcus), с преобладанием всех почвах споровых форм бактерий рода Bacillus. Биоразнообразие бактерий рода Bacillus, изолированных из различных почв представлено следующими видами: B. megaterium, Bacillus mycoides и Bacillus lentus (таблица 1, рисунок 1). 119 Bacillus megaterium Bacillus mycoides Bacillus lentus Рисунок 1 - Морфология клеток бактерий рода Bacillus По совокупности, полученных диагностических признаков на видовом уровне одним из распространенных видов спорообразующих бактерий рода Bacillus является вид Bас. megaterium, изолированный из различных почв Казахстана. Бактерии, относящие к виду Bac. mycoides, были выделены из серобурой пустынной, бурой пустынной светло-каштановой щебнистой почвы и чернозема южного. Выше названные представители рода Bacillus являются основными протеолитиками и это свидетельствуют о деструкции органического вещества белковой природы в почвах. Так же повсеместно, но в небольшом количестве были выделены бактерии Bac. lentus Были выделены культуры из различных типов почв, отнесенные к роду Rhodococcus. Бактерии рода Rhodococcus играют важную роль в процессах почвообразования, в обогащении биоценозов витаминами и другими физиологически активными соединениями. Учитывая их физиологобиохимические признаки, они отнесены к видам Rh. erythropolis, Rh. aetherevorans, Rh. baikonurensis (таблица 2, рисунок 3). Наибольшее количество представителей бактерий рода Rhodococcus встречалось на глубине 10 -20 см, и заметно уменьшалось на глубине 20-30 см. Среди них во всех почвах преобладали бактерии Rh. erythropolis, Rh. equi и Rh. roseus. К числу редко встречающихся видов относился Rh. ruber, который был обнаружен только в темнокаштановой, карбонатной почве, Акмолинской области, Ерейментауского района. Разнообразие бактерий рода Mycobacterium, выделенных из различных почв Казахстана, представлено следующими видами: Mycobacterium agri и Mycobacterium thermoresistible (рисунок 4, таблица 2). Таблица 1 - Распределение бактерий рода Bacillus в почвах различных типов Типы почв в % к общему числу родов бактерий Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus lentus megaterium mycoides mesentericus Серобурая пустынная, 15,2 8,2 2,3 Алматинская область Серобурая пустынная, 10,1 3,2 Карагандинская область Серобурая пустынная, 14,2 4,5 Жамбылская область Бурая пустынная, 11,2 5,6 2,1 Карагандинская область Светло-каштановая, щебнистая, 1,2 2,3 2,1 Карагандинская область Среднекаштановая, 2,3 1,8 Карагандинская обл. Темно-каштановая, карбонатная, 4,2 1,1 Акмолинская область, Жаркаинский район Темно-каштановая, карбонатная, 5,6 3,2 120 Акмолинская область, Ерейментауский район Чернозем обыкновенный, Северо-казахстанская область Чернозем обыкновенный, Акмолинская область, Зерендинский район Чернозем южный Костанайская область 2,4 - - - 5,2 4,5 - - 3,4 2,3 - - Во всех образцах в незначительном количестве обнаружены кокковидные бактерии, морфология которых не изменялась в зависимости от возраста культуры (рисунок 2). Они отнесены к роду Kocuria а по совокупности физиолого-биохимических признаков отнесены к видам: Kocuria rosea, Kocuria sp. и Kocuria sp. (рисунок 2, таблица 2 ). Kocuria rosea Kocuria sp. Kocuria sp. Рисунок 2 - Морфология клеток бактерий рода Kocuria Серобурая пустынная, Алматинская область Серобурая пустынная, Карагандинская область Серобурая пустынная, Жамбылская область Бурая пустынная, Карагандинская область Светло-каштановая, щебнистая, Карагандинская обл. Среднекаштановая, Карагандинская область Темно-каштановая, карбонатная, Акмолинская область, Жаркаинский район Темно-каштановая, Kocuria sp. Kocuria sp. Kocuria rosea Mycobacterium thermoresistible Mycobacterium agri Rh. baikonurensis Rhodococcus equi Rh. aetherevorans Rhodococcus erythropolis Таблица 2 - Распределение видов бактерий родов Rhodococcus,Mycobacterium и Kocuria в почвах различных типов Типы почв в % к общему числу родов бактерий 5,6 6,8 2,9 - 2,3 - 1,2 1,5 1,2 3,4 5,3 4,2 - 3,2 2,9 0,5 0,6 0,5 4,6 4,9 3,5 - - - 1,5 0,9 1,5 4,6 3,5 2,9 - - 2,4 0,6 0,6 0,9 3,9 2,9 4,2 - 1,7 - 0,9 0,3 1,1 2,3 1,9 7,2 - - - 1,1 1,2 0,9 2,9 1,2 2,9 - - - 0,6 0,5 0,9 4,2 3,9 4,6 3,2 2,1 - 0,3 1,5 0,6 121 карбонатная, Акмолинская область, Ерейментауский район Чернозем обыкновенный, Северо-казахстанская область Чернозем обыкновенный, Акмолинская область, Зерендинский район Чернозем южный, Костанайская область Rhodococcus erythropolis 7,2 4,6 3,9 - - 2,1 1,2 0,6 0,3 3,2 4,3 3,9 - - 1,8 1,5 0,9 1,2 6,8 4,9 4,6 - 1,2 1,6 1,2 1,1 0,9 Rh. aetherevorans, Rh. baikonurensis Рисунок 3 - Морфология клеток бактерий рода Rhodococcus Mycobacterium agri Mycobacterium thermoresistible Рисунок 4 - Морфология клеток бактерий рода Mycobacterium Согласно данным литературы, в почвах Казахстана наиболее часто встречаются представители рода Bacillus, Mycobacterium, Rhodococcus, Pseudomonas и Azotobacter [6]. Результаты наших исследований показали что, видовая структура грамположительных бактерий различалось по принципу доминирования. Во всех почвенных образцах доминировали представители бактерий рода Bacillus и Rhodococcus. По степени доминирования бактерий в почвенных образцах Казахстана можно выстроить следующий ряд: Bacillus → Rhodococcus → Kocuria → Mycobacterium. Таким образом, в серобурой пустынной почве доминировали виды Bас. megaterium, Bac mycoides, Rh. aetherevorans. В бурой пустынной, светло и средне каштановых почвах в большом количестве обнаружены виды Bac. megaterium и Rh. erythropolis, в темнокаштановой почве Bас. megaterium и Rh. baikonurensis, а в черноземах доминировали Rh. erythropolis, Rh. aetherevorans, Bас. мegaterium . 1. Структурно-функциональная роль почв и почвенной биоты в биосфере // Под ред. Г.В.Добровольского. М.: Наука, 2003. С. 364. 2. Полянская Л.М., Свешникова Л.М. Структура микробной биомассы окультуренных почв (на примере почв Владимирской области) // Перспективы развития почвенной биологии. М.: Изд-во МГУ, 2001. С. 249-265. 3. Гумеров В.М., Марданов А.В., Белецкий А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., раввин Н.В. Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов в источнике Заварзина, Калдера Узон, Камчатка // Микробиология, 2011. Т. 80. - № 2. – С. 258-265. 4. Заварзин Г.А. Изучение микробного разнообразия в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского // Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 598-612. 5. Bysov B.A., Dobrovolskaja Т.С, Chernjakovskaja T.F., Zenova G.M. Bacterial communities associated with soil diplopods // Pedobiologia. 40. 1996.I. 122 6. O.A. Нестеренко, Е.И. Квасников, Т.М. Ногина. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии / Киев: Наук, думка, 1985. -336 с.). 7. Практикум по микробиологии / А. И. Нетрусов, Е.А. - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 372с. 8. Bergey's manual of Systematic Bacteroilogy. Ist. ed . / Eds. A.Balows et al .- V1-4. Baltimore, 1984, 986 р. 9. Определитель Берджи / под. Ред. Дж.Хоулта, Н. Крига, П.Снита, Дж.Стейли, С.Уилльямса. М., Мир. 1997. 1, 2 Т. *** Жұмыста грам оң бактериялардың Қазақстанның жазық дала аймақтарының тыңайтылған топырақтарында таралуы зерттелген. Қазақстанның əртүрлі топырақтарында грам оң бактериялардың түрлік құрылымы əртүрлі болды. Барлық топырақтарда Bacillus жəне Rhodococcus туыстарының өкілдері басым болды. Қазақстанның сұрғылт топырақтарында Bас. megaterium, Bac mycoides, Rh. Aetherevorans басым болды. Шөлейттің қызыл-қоңыр топырағында, ашық жəне орташы қызғылт-сары топырақтарында Bac. мegaterium жəне Rh. erythropolis көп мөлшерде табылды, қызғылтқоңыр топырақтарда Bас. megaterium жəне Rh. baikonurensis, қара топырақтарда Rh. erythropolis, Rh. aetherevorans, Rh. baikonurensis, Bас. мegaterium басым болды. *** The article was studied the distribution of gram-positive bacteria in the virgin soils of the plains in Kazakhstan. The specific structure of gram-positive bacteria, the major soil types in Kazakhstan has been varied. In all types of soil bacteria, dominated by representatives of the genus Bacillus and Rhodococcus . In the gray-brown desert soils dominated by species of the Kazakhstan Bас. megaterium, Bac mycoides and Rh. aetherevorans. In the desert brown, light brown to medium soils in a large number of spesies found Bac. мegaterium и Rh. baikonurensis, and the black earth was dominated by Rh. erythropolis, Rh. aetherevorans, Rh. Baikonurensis, Bас. мegaterium. УДК 576.154.36 О.Н. Шемшура ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИТИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ У ГРИБОВ АНТАГОНИСТОВ (Институт микробиологии и вирусологии РГП «ЦБИ» МОН РК) В данной работе представлены результаты исследования хитинолитической штаммов микроскопических грибов, обладающих антагонистической активностью. активности наиболее активных Хитин, состоящий из остатков N-ацетил-B-D-глюкозамина, соединенный 1,4- B-связями, является одним из наиболее распространенных полисахаридов на нашей планете. Хитин входит в состав покровных тканей членистоногих, а также клеточных стенок грибов и бактерий [1]. Микопаразитическая активность грибов-антагонистов может быть обусловлена синтезом литических ферментов, способных к гидролизу клеточной стенки фитопатогенов и хитиновых покровов насекомых – вредителей. В связи с этим, наличие хитинолитической активности у исследуемых штаммов, можно использовать в качестве способов отбора перспективных культур микроорганизмов для биоконтроля за патогенами. Ранее была установлена антагонистическая активность для ряда штаммов микроскопических грибов в отношении различных патогенов и вредителей [3-7], а также ее взаимосвязь с синтезом биологически активных соединений, таких как алкалоиды [8-9], аминокислоты [10], ферменты [11]. Материалы и методы. В работе использованы грибы родов Penicillium (штаммы 947, 340, 7N), Aspergillus (штаммы 127, 6М, 140), Trichoderma (штаммы F-1, ANT, TX), Beauveria (штамм ВВ). Споры грибов смывали с агаровых сред в колбы объемом 100 мл со средой Чапека. Инкубировали в течение 4 суток, затем грибную массу гомогенизировали и переносили в колбы объемом 250 мл, содержащих по 150 мл среды Чапека, и культивировали в течение 17 суток. Мицелий разрушали замораживанием-оттаиванием, с последующим растиранием в ступке с кварцевым песком. Белки экстрагировали 0,1М фосфатным буфером (pH=7,1) в течение ночи при +40С. Экстракт отделяли фильтрованием с помощью бумажного и мембранного фильтров, насыщали сульфатом аммония до 65% и оставляли на ночь при +40С. Осадок (белки) отделяли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 минут, растворяли в дистиллированной воде и диализировали в течение ночи против 0,1М фосфатного буфера pH=7,1. Культуральную жидкость каждой пробы (по 120 мл) насыщали сульфатом аммония до 65% и оставляли на ночь при +40С для формирования осадка. Осадок отделяли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 20 минут, растворяли в дистиллированной воде и диализировали в течение ночи против 0,1М фосфатного буфера pH=7,1. В полученных ферментативных препаратах определяли белок по методу Лоури и др. [12] и хитинолитическую активность (по расщеплению коллоидного хитина и образованию N-ацетил-Dглюкозамина). 123 Также проведено исследование накопления хитиназы в культуральной жидкости, определен температурный оптимум и термостабильность хитиназы, выделенной из культуральной жидкости. Результаты и обсуждение. Из 10 исследуемых штаммов микроскопических грибов наибольшей хитинолитической активностью обладал штамм F-1, причем активность в культуральной жидкости значительно превышала таковую в мицелии. Кроме того, хитинолитическая активность выявлена у штаммов 7N и ANT(эндо- и экзохитиназы). У штаммов 340 и 5M хитиназа была обнаружена лишь в мицелии. Возможно, что при более длительном культивировании можно будет обнаружить и экзохитиназу. У остальных штаммов данный фермент не выявлен. Следует также отметить, что при длительном культивировании на среде Чапека, штаммы теряют свою способность вырабатывать хитиназу. Возможно, необходимо подобрать более подходящую среду, при культивировании на которой, грибы не будут терять своего свойства вырабатывать фермент. Исследована динамика накопления хитиназы в культуральной жидкости. Для исследования был взят штамм Trichoderma viride F-1, обладающий наибольшей хитинолитической активностью. Из литературы известно, что бактериальные клетки максимально синтезируют хитиназу на 4-7 сутки культивирования, а клетки актиномицетов на 1 сутки культивирования [2], наши исследования показали, что ферментный комплекс гриба Trichoderma viride F-1 накапливается в культуральной жидкости при длительном культивировании от 14 до 24 суток. При этом было установлено, что максимальное накопление фермента происходит на 22-е сутки роста гриба (в этот период удельная активность ферментного раствора составила 0,78 ед/мг, а активность в 1 мл – 0,74 ед), затем, начиная с 25 суток роста уровень фермента в культуральной жидкости значительно снижается (рис.1). 0 ,9 0 ,8 0 ,7 0 ,6 .т к а . д Е 0 ,5 Уд. акт. е д. /м г 0 ,4 0 ,3 0 ,2 0 ,1 0 12 14 16 18 20 22 25 У д .а кт . ед . /м г 26 0,1 7 0 ,2 1 0 ,34 0, 21 0 ,4 5 0 ,7 8 0 ,37 0, 24 Ак т . в 1 м л 0,1 4 0 ,2 7 0 ,25 0, 26 0, 8 0 ,7 4 0 ,51 0, 27 с утки Рисунок 1. Динамика накопления хитиназы в культуральной жидкости гриба Trichoderma viride F-1 Определение температурного оптимума хитиназы, выделенной из куьтуральной жидкости штамма F-1, показало, что он находится в пределах 40-500С. Увеличение температуры инкубации ведет к снижению активности ферментного раствора. При исследовании термостабильности хитиназы, выделенной из культуральной жидкости штамма F-1, исходная активность фермента в 1 мл составила 0,42 ЕД в 1 мл. Установлено, что хитиназа штамма F-1 относительно термолабильна, она теряет свою активность при температуре инкубации 700С, 800С за 15 мин и при температуре инкубации 500С, 600С за 45 мин (рис.3). Для сравнения, бактериальная хитиназа теряла свою активность на 45% при температуре 600С за 15 мин и полная инактивация фермента происходила за 3 часа [2]. Таким образом, наибольшая хитинолитическая активность отмечена у штамма гриба Trichoderma viride F-1, который характеризуется высоким антагонистическим действием на различные фитопатогены и вредители растений. Следовательно, наряду с другими физилогически активными 124 соединениями, хитиназа обуславливает потенциальные возможности гриба в биоконтроле за патогенными для сельскохозяйственных культур организмов. Полученные характеристики препарата хитиназы гриба Trichoderma viride F-1, позволят в дальнейшем разработать оптимальную схему его получения, очистки и проведения тестирований на фитопатогенах и вредителях растений. 1. Безбородов А.М., Решетилова Н.А., Тиунова Н.А. в-Глюканазы микроорганизмов// Прикладная биохимия и микробиология 1982.- Т.18. -В.6.- С.806-815. 2. Чигалейчик А.Г., Пириева Д.А. Внеклеточная хитиназа Aeromonas liquefaciens // Прикладная биохимия и микробиология. - 1976.- Т.12. - В.2. -С.238-242. 3. Бекмаханова Н.Е., Успанов А.К. Антибиотические свойства активных штаммов грибов, выделенных из ризосферы сахарной свеклы //Труды ИМиВ АН КазССР. – Алма-Ата. - 1986. - Т.30. - С. 61-68. 4. Успанов А.К., Тулемисова К.А., Бекмаханова Н.Е. Антагонизм и гиперпаразитизм триходермы к фитопатогенным грибам //Вестник АН КазССР. -1986. -№2. -С. 47-51. 5. Бекмаханова Н.Е., Шемшура О.Н. Скрининг высокоактивных штаммов-антагонистов, перспективных против возбудителей риса. Известия НАН РК, серия биологическая. - 1997. - № 1. - С. 7-10. 6. Бекмаханова Н.Е., Шемшура О.Н., Разживин А.А. Поиск и изучение перспективных штаммов грибов Триходерма, обладающих нематоцидными свойствами - Известия МН-АН РК, серия биологическая. - 1998. - № 4. - C. 41-44. 7. Шемшура О.Н., Бекмаханова Н.Е., Мазунина М.Н. Подбор питательных сред для усиления антагонистической активности микроскопических грибов // Биотехнологии – 2000. Тезисы докл.– Пущино. – 2000. – С.70 8. Бекмаханова Н.Е., Шемшура О.Н. Токсическое действие алкалоидов гриба Aspergillus niger 8 на паразитические нематоды. - Известия МН-АН РК, серия биологическая. - 1998. -№ 5-6. - С.34-40. 9. Bekmakhanova N.E., Shemshura O.N. Alcaloids of microscopic fungi for plant protection // thesis of poster declaration at the International conference “Bioactive Fungal Metabolites” – Impact and Exploitation” Wales Swansea (UK). - 2001. -P.49. 10. Шемшура О.Н., Бекмаханова Н.Е., Джакибаева Г.Т., Мазунина М.Н., Султанкулова К.Т. Синтез аминокислот и его взаимосвязь с антагонистической активностью микроскопических грибов // Известия МН-АН РК, серия биологическая. 2002. - №1. - С.84-90. 11. Шемшура О.Н., Джакибаева Г.Т., Бекмаханова Н.Е. Сравнительное изучение ферментативной способности штаммов-антагонистов из рода Trichoderma, Penicillium, Aspergillu. - Известия МН-АН РК, серия биологическая. - 1998. -№ 1. - С. 73-77. 12. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., et al. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951.V. 193. - №1. - P. 265-275. *** Берілген жұмыстың зерттеу нəтижесінде хитинологиялық белсенділігі жоғары микроскопиялық саңырауқұлақ ол антагонистік белсенділік қасиетке ие. *** This paper presents the results of the study chitinolytic activity of the most active strains of microscopic fungi having antagonistic activity УДК 635.21:632.3 О.Н. Шемшура, Н.Е. Бекмаханова, М.Н. Мазунина ИССЛЕДОВАНИЕ НЕМАТОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВЫХ ФРАКЦИЙ ГРИБА ASPERGILLUS SP. (Институт микробиологии и вирусологии РГП «ЦБИ» МОН РК ) Установлена нематостатическая активность белок содержащих компонентов гриба Aspergillus sp,. проявляющаяся в зимний период культивировании гриба. Определено содержание белка в исследуемых образцах и его аминокислотный состав. Мировые потери сельскохозяйственной продукции от нематод составляют в среднем 7-10%. В нашей стране ощутимый ущерб сельскому хозяйству наносят овсяная, картофельная, свекловичная, галловые и другие нематоды. В теплицах галловые нематоды могут вызывать до 50% потерь продукции томатов. Существующие в настоящее время подходы и методы защиты от нематод либо не обладают достаточной эффективностью, либо имеют ограничения, связанные с токсичностью применяемых химических нематоцидов. В последние годы значительно возрос интерес к фундаментальным исследованиям в области экспериментальной микологии, а также использованию продуктов синтеза микроскопических грибов в сельском хозяйстве, медицине, пищевой промышленности и др. отраслях народного хозяйства. В процессе эволюции растения, в том числе и микроскопические грибы, выработали механизмы, позволяющие им успешно противостоять неблагоприятным воздействиям, в том числе, различного 125 рода патогенным организмам. Важнейшими компонентами подавляющего большинства таких механизмов являются вещества белковой природы [1-5]. Целью данной работы явилось исследование нематостатических свойств белок содержащих компонентов, выделенных из мицелия микроскопического гриба Aspergillus sp. Материалы и методы В работе использовали микроскопический гриб Aspergillus sp. Культивирование гриба осуществляли в течение 5-ти суток на жидкой питательной среде глубинным способом в условиях качалки при температуре 280С. Состав питательной среды: (г/л): глюкоза – 50; пептон -10,0; соевая мука – 5,0; KNO3 -2,0; MgSO4.7H2O –0,5; CaCl2 – 0,1; вода дистиллированная pH –6,2. Мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием через бумажной фильтр. Для фракционирования белковых компонентов из мицелия использовали 2 метода: Baker F.E. e.a. (1947) и Boivin A., Mesrobeanu L. (1938) [6-7]. Cодержание белка в белковых пробах определяли методом Bradford, 1976 [8]. Аминокислотный состав белковых проб проводили методом газохроматографии (ГХ). Для исследования нематостатической активности белковых компонентов, выделенных из мицелия гриба Aspergillus sp. использовали нематоды Ditylenchus destrucnor. Компоненты, вызывающие гибель менее 50% нематод в течение 3-х суток, или действие их будет временным (нематоды после переноса в воду восстановят активность) отнесены к компонентам мягкого (нематистатического) действия. Результаты и обсуждение При фракционирование белковых компонентов различными методами получено 43 образца. Тестирование на нематодах Ditylenchus destrucnor белковых фракций показало, что большинство из них не оказывают никакого влияния на них. Нематостатическое действие отмечено у 2-х белковых фракций: М1 и М2, полученных по методу Буавена-Месробиана. Данные фракции были исследованы в отношении нематод при различных концентрациях. Результаты исследований представлены в таблице 1. Для белковой фракции М1 потеря активности нематод наблюдалась через 72 часа после обработки при всех концентрациях и составила от 12,8% до 56%, однако через 24 часа произошло частичное восстановление активности в варианте с концентрацией 50 мг/мл и полное восстановление активности при более низких концентрациях. Оставшиеся 47,6% неактивных нематод в варианте с концентрацией 50 мг/мл, после переноса в воду полностью восстановили свою активность. Для белковой фракции М2 через 72 часа после обработки все нематоды были активны. Только через 96 часов после обработки при концентрации 50 мг/мл отмечена потеря активности у 44,7% нематод. Очень слабое действие на нематоды оказывали концентрации 25 мг/мл и 10 мг/мл, при которых потеря активности составила 9,1% и 8,3% соответственно. Концентрации 10 мг/мл, 5 мг/мл, 2,5 мг/мл и 1 мг/мл на активность нематод никакого влияния не оказывали. При переносе неактивных нематод в воду наблюдалось полное восстановление их активности. При исследовании белковых образцов была выявлена зависимость нематостатической активности от культивирования гриба в различные сезоны. Оба белковых образца М1 и М2 проявляют нематостатическую активность в период культивирования гриба в зимний период. В весенний период активность присутствовала только у образца М1, которая полностью отсутствовала в летний период, в то время как образец М2, проявлял незначительную активность. В осенний период нематостатическая активность образца М1 была минимальной, а у образца М2 она полностью отсутствовала. На рисунке 1 показано сравнительное нематостатическое действие белковых образцов при одинаковой концентрации 50 мг/мл, полученных из мицелия в различные сроки роста гриба. На диаграмме видно, что образцы М1 и М2 влияют на активность нематод Ditylenchus destrucnor в большей степени в зимний период. Нематостатическое действие на Ditylenchus destrucnor полностью отсутствует у образца М1 в летний период и у образца М2 в весенний и осенний периоды роста гриба. Было установлено, что исследуемые образцы М1 и М2 представляют собой протеинполисахаридный комплекс, в котором содержание белка составило 12,5 мкг в 1 мг сухого вещества для М1 и 37,5 мкг в 1 мг сухого вещества для М2. Определён аминокислотный состав белковых компонентов М1 и М2 (Табл.1). 126 Рисунок 1. Изменение нематостатической активности белковых образцов гриба Aspergillus sp. в зависимости от сезонного роста гриба Таблица – 1 Аминокислотный состав белковых компонентов гриба Aspergillus sp. № п/п Наименование аминокислот Формулы аминокислот* 1 2 3 1 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Триптофан Лизин Аргинин 2 Гистидин Тирозин Фенилаланин Цистин Метионин Треонин Валин Изолейцин Лейцин Аланин Глицин С11Н12N2O2 H2N(CH2)4CH(NH2)CO2H NH=C(NH2)NH(CH2)3CH(NH2)CO2H 3 C3H3N2CH2CH(NH2)CO2H HOC6H4CH2CH(NH2)CO2H C6H5CH2CH(NH2)CO2H HOOCCH(NH2) CH2SSCH2CH(NH2) CO2H CH3SCH2CH2CH(NH2) CO2H CH3CH(OH)CH(NH2) CO2H (CH3)CHCH(NH2) CO2H CH3CH2CH(CH3)CH(NH2) CO2H (CH3)2CHCH2CH(NH2) CO2H С3Н7NО2 (NH2)CH2CO2H Концентрация аминокислот, мг/100 г М1 М2 42 60 74 85 80 76 4 5 64 75 35 44 72 69 12 20 32 62 60 90 55 98 28 58 68 112 следы 0 5 следы Газохроматографический анализ белковых фракций М1 и М2 показал: 1. Качественный состав фракций М1 и М2 не различается; 2. Наблюдаются незначительные расхождения в количественном содержании лизина, аргинина, гистидина, тирозина и фенилаланина в составе фракций М1 и М2; 3. В составе фракции М2 присутствуют примерно в 2 раза больше лейцина, валина, изолейцина, метионина, цистина по сравнению с фракцией М1; 4. В составе фракции М2 присутствуют примерно в 1,5 раза больше треонина и триптофана. 5. Фракция М2 содержит более высокие концентрации аминокислот. Таким образом, установлено, что нематостатическая активность обоих белок содержащих компонентов гриба Aspergillus sp. проявляется в зимний период культивировании гриба, при этом по содержанию белка, фракция М2 более чем в 2 раза превосходит фракцию М2 и содержит более высокие концентрации аминокислот. 1. Калунянц К.А., Дорохов В.В., Лосякова Л.С. и др. Направленный биосинтез ферментов микроорганизмами //Труды ВНИИ синтезбелок. М. 1974.- В.2. – С.220. 2. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высшая школа. – 1980. – С.272. 3. Караваева Н.Н., Садыходжаева Н.Г. Получение высоко устойчивого препарата протеолитического фермента гриба Torula thermophila при культивировании в ферментере //прикладная биохимия и микробиология. – 1985. – Т.21. -№1. – С.2427. 4. Антипова Л.В., Насонова Л.В. Исследование возможности получения белкового концентрата из кератинсодержащего сырья методом микробной ферментации //Тез.докл. 2 науч.-практ. Конф. «Разработка и внедрение безотходных технологий, использование вторичных ресурсов». Киров. -1998. – С.80-81. 127 5. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений// Успехи биологической химии. – 2002. - Т. 42. - С. 78-90. 6. Baker F.E., Sommer H., Mayer K.F. e.a. Antigenic structure of P. Pestis and the isolation of a crystalline.// Soc. exptl. boil. and med. – 1947. - T. 64. - № 6. - P. 139-141. 7. Boivin A., Mesrobeanu L. Recherches sur les antigenes soma-tigyes du bacolle typhigue // Compt. rev. soc. Boil. 1938. - T. 12. - № 1. - P. 9 - 11. 8. Bradford A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein during binding//Analytical Biochemistry. -1976.- Vol. 72. - P. 248-254 *** Немостатикалық ақуыздың белсенді компоненттері бар санырауқұлақ бекітілген. Aspergillus sp. Осы қыс мезгілі саңырауқұлақ дамуында көрінеді. Зерттеу барысында зерттелетін үлгілерде ақуыз құрамы жəне оның аминқышқыл құрамы табылған. **** Nematostatic activity of the protein containing components of the fungus Aspergillus sp. manifested in the winter cultivation was established. Protein content in the samples and its amino composition was determined. Г.Н. Чуркина МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ЮЖНЫХ ЧЕРНОЗЕМОВ В ПЛОДОСМЕННЫХ СЕВООБОРОТАХ (Научно-производственный центр зернового хозяйства им. А.И. Бараева) В статье приводятся результаты исследований по изучению влияния различных сельскохозяйственных культур на микробоценоз почвы южных черноземов в плодосменных севооборотах. Моно возделывание пшеницы и пшеницы по различным предшественникам в плодосменах вызывают высокое содержание азотсодержащих бактерий в почве, что характеризует в посевах этих культур интенсивность процессов минерализации органического вещества на южных черноземах. Наиболее интересными и до настоящего времени малоизученными являются проблемы, связанные с воздействием высших растений на микроорганизмы почвы. Поскольку растения не способны перемещаться в пространстве, то они должны обеспечить оптимальные условия для своего существования на одном месте: должны обладать способностью, защищаться, привлекать необходимых для их жизнедеятельности организмы, ликвидировать конкурентов, активизировать и регулировать некоторые процессы метаболизма с помощью других организмов, обитающих в почве. Микрофлора использует корневые выделения, как источники питания, поэтому их концентрация на поверхности корней снижается, что изменяет условия корневого питания растений. Метаболиты могут оказывать влияние на другие организмы, в том числе и на почвенную микрофлору, в виде ингибирования и токсического действия, в виде селекционирующего действия, в виде агентов, стимулирующих рост и развитие компонентов ризопланы и ризосферы, в виде индукторов морфогенеза у грибов и прокариот [1]. Плодосмен, в современном ресурсосберегающем земледелии предлагает не только строгое чередование зерновых культур, многолетних трав и пропашных культур с различными агрономическими, физиологическими свойствами, но и предусматривает обязательное наличие культур почвоулучшателей, размещение которых по наиболее благоприятным предшественникам способствуют высокой скорости разложения органических остатков, накоплению и использования питательных веществ [2,3]. Исходя из этого, целью проведенных исследований было определения влияния сельскохозяйственных культур по различным предшественникам в плодосменных севооборотах при ресурсосберегающих технологиях возделывания на формирование микробоценоза почвы южного чернозема и в целом на плодородие почвы. Тренинги и микробиологические анализы проводили в почвенных пробах, отобранных со стационаров с плодосменами и в посевах пшеницы по разным предшественникам. Полученные результаты анализов за период 2009-2011гг, показали, что при сравнении различных плодосменных севооборотов, высокая численность бактерий, ассимилирующих минеральные и органические формы азота, наблюдается в бессменных посевах пшеницы с применением удобрений и гербицидов (табл. 1). Таблица 1- Распространения почвенных микроорганизмов в посевах пшеницы по различным предшественникам в плодосменных севооборотах, млн./г почвы Плодосменные Бактерии, ассимилирующие Почвенные Целлюлозоразру севообороты различные формы азота микромицеты шающие микроорганизмы органический минеральный 128 Бессменная пшеница, без гербицидов и удобрений Бессменная пшеница с гербицидами Бессменная пшеница с гербицидами и удобрениями Пшеница по овсу Пшеница по кукурузе 2,1 7,8 6,8 86,6 1,8 7,6 7,1 99,0 2,8 13,4 4,3 99,1 2,1 2,4 8,7 12,1 6,0 6,8 108,9 96,8 В плодосменных севооборотах максимальное количество бактерий было в посевах пшеницы по кукурузе и составило 12,1 млн. при посеве пшеницы по овсу -8,7 млн. клеток в 1г почвы. Высокое содержание бактерий в почве под посевами этих культур характеризует интенсивность процессов минерализации органического вещества. В почвенных процессах накопление бацилл усиливает процессы, связанные с переработкой более трансформированного органического вещества, что в конечном итоге приводит к накоплению органического вещества (гумуса) в почве. Низкая численность бактерий отмечена при бессменном возделывании пшеницы без применения гербицидов количество бактерий здесь находится в диапазоне 7,6 и 7,8 млн. в одном грамме почвы. При бессменном возделывании пшеницы применение гербицидов и удобрений позволяет держать количество бактерий, участвующих в превращениях азота на постоянном и стабильном уровне. Их численность варьирует в пределах 2,8-13,4 млн. клеток в 1г почвы. По мере увеличения продолжительности бессменного возделывания пшеницы происходит уменьшение доли бактерий рода Pseudomonas, а в севооборотах Mycobacterium. Это свидетельствует о том, что в почве монокультуры разложение органического вещества находится на начальной стадии. Кроме того, отмечается некоторое уменьшение частоты встречаемости Bac. mycoides, Bac. idosus, что указывает на снижение темпов минерализации органических остатков в почве под бессменными посевами. Таким образом, бессменное возделывание приводит к уменьшению видового разнообразия бактерий в почве. Однако это выражается не в исчезновении каких-либо видов бактерий, а в уменьшении доли немногочисленных видов и возрастании удельного веса доминирующих штаммов микроорганизмов данной группы. В севооборотах с крупяными культурами лучшие условия для развития бактерий ассимилирующих азотные формы складываются при возделывании гречихи в трехпольном плодосменном севообороте (табл. 2). Таблица 2Численность почвенных микроорганизмов в посевах различных сельскохозяйственных культур в плодосменных севооборотах, млн./г почвы Плодосменные Бактерии, ассимилирующие различные Почвенные Целлюлозора севообороты формы азота микромицет зрушающие ы органический минеральный Гречиха-пшеницаячмень Просо-пшеница-ячмень Горох-пшеница-ячмень Ячмень-пшеница Житняк-люцерна Подсолнечникпшеница-пшеницаячмень 3,6 12,9 10,7 58,0 3,2 4,8 3,7 3,1 3,5 11,8 9,8 9,5 13,8 8,7 8,5 10,0 8,1 13,0 7,1 62,7 68,4 95,3 67,4 77,9 В посевах многолетних трав, биологические особенности корневой системы житняка и люцерны в большей степени стимулируют развитие бактерий, чем горох и подсолнечник. По видовому составу азотсодержащих микроорганизмов (на МПА и КАА) различий в севооборотах с различной ротацией не наблюдалось. В посевах пшеницы и других сельскохозяйственных культур в плодосменных севооборотах преобладают бактерии рода Pseudomonas, флюоресцирующие, пигментные и микобактерии (на КАА). В составе бацилл (на МПА) доминируют группы, ассимилирующие органические формы азота: Bac. Medaterium, Bac. Mesentericus и другие бактерии. Помимо указанного состава в биоценоз входят спорообразующие бактерии, большая часть которых преобладает в активной форме. Микроскопические грибы являются ксерофилами и способны развиваться в тех же условиях, 129 что и бактерии и актиномицеты. В почве развитие плесневых грибов обусловлено не только влажностью, но и поступлением органического вещества, аэрации и температурой. Поэтому эта группа микроорганизмов в большей степени, чем другие, сосредотачивается в пахотном слое. Большую роль в изменении численности микроскопических грибов играют антагонистические взаимоотношения с другими микробами в борьбе за источник питания. Микроскопические грибы способны разлагать в почве белковые соединения, разрушают углеродсодержащие вещества, растительные остатки, хотя по численному составу они занимают всего 0,1% от всего микробного населения. Часто в грибном комплексе встречаются фитопатогенные виды грибов, вызывающие заболевания сельскохозяйственных культур. Большое количество микроскопических грибов наблюдается в посевах житняка и люцерны, численность их составила 13,0 тыс. клеток в 1г почвы. При бессменном возделывании зерновых культур максимум плесневых грибов встречается при выращивании бессменной пшеницы, а применение удобрений и гербицидов в посевах подавляет развитие микромицетов. Выводы: Исследования, проведенные в течение 2009-2011 гг. в посевах сельскохозяйственных культур по различным предшественникам в плодосменах, показали, что высокая численность бактерий, ассимилирующих минеральные и органические формы азота, наблюдается в посевах гречихи и смеси трав житняка и люцерны в трехпольном зерновом севообороте. Максимальное количество этих бактерий было отмечено и при бессменном посеве пшеницы с применением удобрений и гербицидов. Высокое содержание азотсодержащих бактерий в почве под посевами этих культур характеризует интенсивность процессов минерализации органического вещества. Большое количество микроскопических грибов наблюдается в двухпольном севообороте при посеве житняка и люцерны. При бессменном возделывании зерновых культур максимум плесневых грибов встречается при выращивании бессменной пшеницы, а применение удобрений и гербицидов в посевах подавляет развитие микромицетов. Микроскопические грибы способны разлагать в почве белковые соединения, разрушают углеродсодержащие вещества, растительные остатки, но не всегда их высокое содержание положительный факт, так как в грибном комплексе встречаются фитопатогенные виды грибов, вызывающие заболевания сельскохозяйственных культур. Интенсивно в плодосменных севооборотах происходит разрушение целлюлозы растительных остатков, особенно при возделывании подсолнечника в четырехпольном севообороте. 1. Фрунзе Н.И. Почвенная микробная биомасса как резерв биогенных элементов // Агрохимия. 2005.- №9 - С.20-23. 2. Muir J.P. Dairy Compost, Variety, and Stand Age Effects on Kenaf Forage Yield, Nitrogen and Phosphorus Concentration, and Uptake// Agron. J. 2001. -N 93. -1169-1173. 3. Сазонов С.Н., Манучарова Н.А., Горленко М.В., Терехов А.В., Умаров М.М. Оценка микробиологического состояния дерново-подзолистой почвы, выведенной из сельскохозяйственного использования. //Почвоведение. 2004.- №3.С.373-377. БИОТЕХНОЛОГИЯ Г.Қ. Абай, А.К. Ерназарова., Г.К. Кайырманова ЛАСТАНҒАН АҒЫН СУЛАРДА КЕЗДЕСЕТІН ЦИАНОБАКТЕРИЯЛАРДЫ ЗЕРТТЕУ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті) Комуналды қалдықтармен ластанған Қаламқас кен орнының ағын суынан Phormidium жəне Oscillatoria туыстарына жататын 4 цианобактерия дақылдары бөлініп алынды. Осы цианобактериялардың қолайлы ортадағы клетка құрылымдары туралы мəліметтер көрсетілген. Ағын суларды тазалау əдістері ластағыштарды белсенді түрде ыдырата алатын микрофлораға негізделеді. Биологиялық тоғандарда микроорганизмдер колониялары суда еркін таралады. Ыдырау процестерін жүзеге асыру үшін қажетті оттегі су беті арқылы немесе фотосинтездеуші микроорганизмдер, балдырлар арқылы еніп, табиғи жолмен суда ериді. Ағын суларды тазалау тиімділігі фототрофты микроорганизмдері бар қосымша биологиялық тоғандар құру арқылы жүзеге асады. Цианобактериялар оксигенді жəне аноксигенді фотосинтез, гетеротрофты фотоассимиляция, молекулалық азотты бекіту, күкірт қосылыстарын тотықтыру, көптеген органикалық субстратты деструкциялау қабілеттіліктеріне жəне морфологиялық-биохимиялық, сонымен қатар физиологиялық 130 ерекшеліктеріне байланысты жер бетінде кеңінен таралған организмдер болып саналады. Бұл олардың эволюциясының бастапқы кезеңдерінде қоршаған ортаның əр түрлі жағдайларына бейімделу потенциалының жоғарылығын көрсетеді [1]. Қазіргі кезде қоршаған ортаны тазалауда микроорганизмдердің аралас дақылдарын қолдану кеңінен таралуда. Осындай қауымдастықтардың негізі ретінде цианобактерияларды қолдану деструкциялық процестерді жылдамдатып қана қоймай, əр түрлі микрофлорамен синтрофты қарымқатынасқа түсуіне байланысты жасанды, белгілі қасиеттерге ие қауымдастықтар құруға мүмкіндік береді. Цианобактериялардың əр түрлі ластағыштармен ластанған орталарда кездесуі жайлы көптеген зерттеушілер жұмыстарында келтірілген. Кейбір зерттеушілердің жүргізген зерттеулері бойынша ортаның ластану деңгейі көтерілген сайын цианобактериялардың да көбеюі артады [2, 3]. Цианобактериялардың морфологиялық өзгергіштіктерін зерттеу саласындағы көптеген зерттеу жұмыстары нəтижесінде «жергілікті популяция» термині пайда болған, яғни табиғи субстраттардан бөлініп алынған жəне дақылданатын табиғи популяция [4]. Себебі, əр ортаның ерекшеліктеріне байланысты цианобактериялардың түрі мен қасиеттері ерекшеленуі мүмкін. Соған байланысты жұмыстың мақсаты – ластанған орталардағы цианобактериялардың алуан түрлілігін зерттеу. Зерттеу əдістері мен материалдар Зерттеу объектісі ретінде – Қаламқас кен орнының маңындағы ауданның тазалау құрылғыларының ағын суы пайдаланылды. Ағын судың негізгі ластаушы көздері тұрмыстық – коммуналды қалдықтар болып келеді. Цианобактерияларды дақылдау үшін жəне қолайлы қоректік ортаны таңдау үшін Заррука, Громов №6 жəне BG-11 қоректік орталары қолданылды. Цианобактериялардың жинақ дақылы жəне альгологиялық таза дақылдарын алу жалпылама қабылданған əдістер арқылы жүзеге асырылды [5]. Цианобактериялардың идентификациялау үшін келесі анықтағышар қолданылды: Берги анықтағышы жəне Орта Азияның көк-жасыл балдырларының анықтағышы [6, 7]. Цианобактериялардың морфологиясын зерттеу үшін Leiсa DMLS 2500 қолданылды. Зерттеу нəтижелері Қаламқас кен орнының ағын суларының Заррука ортасындағы жинақ дақылынан цианобактериялардың 4 түрі бөлініп алынды: К1, К2, К3, К4. Осы цианобактериялардың қолайлы ортадағы клетка құрылымдары зерттелінді (сурет 1). К1 дақылының клеткасының трихомдарының түсі көк-жасыл, тік, жеке орналасқан, клетка мөлшері 2,2-3,3– 1,21-2,9 мкм жəне соңғы клеткалары майысып немесе үшкірленбей тік болып келеді. К2 дақылының морфологиялық ерекшеліктеріне моншақ тəріздес тізбектеліп бір түзудің бойында орналасқандығы жатады. Клетка мөлшерінің диаметрі 1,21-2,97 мкм. К3 дақылы морфологиясы бойынша трихомалары тік, клетка мөлшері 2,64-5-61 – 6,49-9,46 мкм, түсі - көк- жасыл, соңғы клеткалары - үшкірленген жəне ілмек тəрізденіп майысқан. Ал, К4 дақылының трихомдары көк-жасыл, соңғы клеткалары тік орналасқан, клетка мөлшері 2,3-4,9 - 1,6-2,7 (сурет 1). Цианобактериялардың бір түрінің табиғи популяциялары таралған ортасына байланысты құрылымдық-морфологиялық ерекшеліктерге ие болатыны белгілі, яғни экологиялық факторлардың əсерінен трихомдар құрылымы, колониялық шырыш тығыздығы, вегетативті клеткалар мен трихомдар пішінің өзгеруі мүмкін [1]. Бөлініп алынған цианобактериялық дақылдардың статикалық жағдайда құрылымын зерттеу кезінде алгологиялық таза К1 дақылы өсуінің алғашқы тəуліктерінде қатты түйіршік түзе қалыптасады. Түйіршіктің үлкеюіне байланысты цианобактерия клеткалары сұйықтық бетінде жұқа қабат түзе дамиды. К2 дақылы құрылымы алғашқында шашыраңқы, экспоненциалды кезеңде мақта тəрізденіп қалыптасады. К3 дақылының құрылымдық ерекшелігіне шар тəріздес өсінділер түзетіндігі жатады. Қабырғалық өсу байқалады. Статикалық жағдайда К4 дақылы өскен кезде сұйықтықта дөңгелек өсінді пайда болып, біркелкі перфорациялары бар жіпшелер түзіледі. Цианобактерияларды дақылдауда кездесетін қиыншылықтардың біріне белсенді дақылды алу ұзақтығы жатады. Клетканың барлық заттарын құру үшін цианобактерияларға қарапайым бейорганикалық қосылыстардың минимумы қажет: көмірқышқыл газы, азоттың ең қарапайым түрлері, минералды тұздар (фосфор, күкірт, магний, темір жəне микроэлементтер көздері), су. Белсенді цианобактериялды дақылдарды алуда қоректік ортада биогенді элементтердің оптималді мөлшерінің болуы негізгі фактор болып табылады. Кейбір зерттеушілердің мəліметтері бойынша цианобактариялардың көп түрлерін өсіру үшін Заррука ортасы қолайлы болып табылады. Алайда, 131 кейбір зерттеушілердің жұмыстарында Громова №6 жəне BG-11 орталарын қолдану кезінде жақсы нəтижелер алынған [8]. К1 К3 К2 К4 Сурет 1 - Цианобактериялардың морфологиялық ерекшеліктері Бөлініп алынған цианобактерияларға қолайлы қоректік орта таңдау мақсатымен дақылдар Заррука, Громова №6 жəне BG-11 қоректік орталарында өсіріліп, тəуліктік өзгерістері бақыланып, салыстырма жүргізілді. Зерттеу нəтижелері көрсеткендей, К1 жəне К2 дақылдарының өсуі үшін: BG11 жəне Заррука ортасы қолайлы болса, К3 дақылы үшін Громов ортасы қолайлы болып келеді. Бөлініп алынған дақылдардың морфологиялық жəне дақылдық қасиеттерін зерттеу негізінде анықтағыштар бойынша К1, К2 жəне К4 дақылдары Oscillatoria туысына, ал К3 дақылы Phormidium туысына жатқызылды. Көптеген зерттеушілер техногенді экожүйелерді зерттеу кезінде осы туыстардың цианобактериялары кеңінен кездесетіндігін атап кеткен [2, 9]. Сонымен, комуналды қалдықтармен ластанған Қаламқас кен орнының ағын суынан Phormidium жəне Oscillatoria туыстарына жататын 4 цианобактерия дақылдары бөлініп алынды. 1. Баулина О.И. Ультраструктурная пластичность цианобактерий. Автореф. канд.дис.биол.н. - М. 2005. – 20с. 2. Al Hasan R.H., Sorkhoh N.H., Al BaderD., Radwan S.S. Utіlіsatіon of hydrocarbons by cyanobacterіa from mіcrobal mats on oіly coasts of the Gulf. // Appl. Mіcrobіol. Bіotechnol. - 1994. - № 41. - Р. 615-619. 3. Батаева Ю.В., Дзерджинская И.С. Цианобактерии различных экологических ниш на территории с аридным климатом // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием. – М., 2010. - С.20. 4. Квитко К.В. О влиянии ультрафиолетого излучения на наследственную изменчивость хлореллы: автореф....канд. биол. наук. – Л.: ЛГУ, 1963. – 17 с. 5. Сиренко Л.А., Сакевич А.И., Осипов Л.Ф., Лукина Л.Ф. и др. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. - Киев: Наукова думка, 1975. -247с. 6. Определитель бактерии Берджи / Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уилльмса. Девятое издание. В двух томах. Том 1. - М., «Мир». - 2007. 512 с. 7. Музафаров А.М., Эргашев А.Э., Халилова С.Х. Определитель сине-зеленых водорослей Средней Азии. - Ташкент: Фан, 1987. – Т. 1-3. - С.3-405. 8. Becker E.W. Microalgae: biotechnology and microbiology. - 2008. - P. 293. 9. Сопрунова О.Б. Особенности функционирования альго-бактериальных сообществ техногенных экосистем: автореф. дисс. д-ра биол. наук. - М, 2005. – 47 с. 132 *** В данной работе приведены результаты выделения и идентифицирования по морфолого-культуральным особенностям 4 видов цианобактерий, выделенных из сточных вод вахтого района Каламкас. *** Results of isolation and identification by studying the morphological and cultural characteristics of four species of cyanobaсteria wastwater of the vakhty area Kalamkas are given in this work. О.А. Авксентьева, В.В. Жмурко ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПУТЕЙ МОРФОГЕНЕЗА IN VITRO ИЗОГЕННЫХ ПО ГЕНАМ PPD ЛИНИЙ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ TRITICUM AESTIVUM L. (Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина) Исследованы особенности различных путей морфогенеза in vitro (каллусогенез, прямой и непрямой морфогенез) изогенных по генам PPD линий озимой пшеницы сорта Мироновская 808. Определены оптимальные условия для изучаемых процессов, показана их зависимость от типа выбранного экспланта, состава среды и условий культивирования. Выявлены различия среди изогенных линий в размерах клеток каллусных тканей, скорости их формирования, проявлении морфогенетического потенциала. Показана способность генетической системы контроля фотопериодической чувствительности пшеницы in vivo детерминировать различные пути морфогенеза in vitro. Культура растительных клеток in vitro является уникальным инструментом для изучения фундаментальных проблем биологии. Морфогенетический потенциал растительной клетки в системах in vitro проявляется в более широком диапазоне, чем в природных условиях, благодаря эволюционно обусловленной у высших растений способности к тотипотентности [5,7,9]. Злаки, являясь важнейшими сельскохозяйственными культурами, представляют труднейший объект с точки зрения экспериментальной биотехнологии. Одной из причин, обусловливающих сложность получения каллусной ткани, как одного из путей морфогенеза in vitro, у злаков по сравнению с двудольными, является их неспособность к раневой реакции (образование раневого каллуса) [13]. У однодольных не описано образование каллуса в естественных условиях, что давало основание для заключения о невозможности получения тотипотентной каллусной ткани злаков на первых этапах развития метода культуры ткани in vitro [8]. В настоящее время успешно культивируются in vitro каллусы пшеницы, ячменя, кукурузы, риса и других представителей злаков [3,6,10,19]. Несмотря на большое количество исследований по морфогенезу злаков in vitro [16,17,19] многие вопросы этого уникального пути развития растений остаются нерешенными. В частности, малочисленны сведения о влиянии индивидуальных генов на проявление тотипотентности клеток in vitro на объектах с трудной регенерацией, к которым относятся злаки [4]. В связи с этим актуальной задачей является выявление роли конкретных генетических систем на способность растительных эксплантов к реализации различных морфогенетических программ при культивировании in vitro. На генетической модели, включающей сорт мягкой озимой пшеницы Мироновская 808 и его почти изогенные линии (near isogenic lines) по генам PPD (photoperiod), контролирующих степень фотопериодической чувствительности [11,12,20], ранее была показана детерминация ряда физиологобиохимических процессов: углеводного обмена, ростовой реакция и общей продуктивности [1,2,14,18]. Высказано предположение, что данная генетическая система также участвует в контроле процессов морфогенеза при культивировании изогенных линий in vitro[1]. Целью данной работы было исследование особенностей процессов каллусогенеза и морфогенеза in vitro набора почти изогенных по генам PPD линий и установление зависимости их индукции и динамики формирования от генотипа изолинии, модификаций состава среды культивирования и типа выбранного экспланта. Материалом исследований служили четыре генотипа озимой мягкой пшеницы (Triticum aestivum L.) – почти изогенные моногеннодоминантные линии по системе генов контроля фотопериодической чувствительности - PPD D1a, PPD В1a, PPD А1a и сорт Мироновская 808, рецессивный по всем трём генам [15,20]. Почти изогенные линии были получены бекроссированием на основе сорта Мироновская 808 в Селекционно-генетическом институте УААН [18] и любезно предоставленные нам для исследований. Для получения соматического каллуса в качестве эксплантов использовали зрелые зародыши, апикальные участки асептических корней и листовые экспланты. При использовании в качестве эксплантов зрелых зародышей семена стерилизовали 3% раствором NaОСl на протяжении 15 минут, затем трижды промывали стерильной дистиллированной водой, отставляли на сутки для проклевывания, после чего вычленяли зародыши и переносили их в чашки Петри на питательную среду Мурасиге и Скуга (МС) с полным набором макро- и микросолей, содержащую 0,7 % агара, 2,4– 133 Д – 2мг/л, 0,1 мг/л глицина и 10 мг/л AgNO3 [3,8]. Для использования апикальных участков корней и листовых эксплантов предварительно выращивали 4-5 дневные асептические проростки пшеницы на безгормональной среде МС в темноте при 25 ºС. Затем в асептических условиях вычленяли апикальные сегменты корней длиной 1-1,5 см, из колеоптеля вычленяли первичный лист, используя для культивирования его базальную часть размером 1-1,5 см и переносили их на среду МС для индукции первичного каллусогенеза. Экспланты культивировали при 26ºС в термостате в течение 14 дней. После образования первичного каллуса чашки Петри переносили в условия культивирования при освещенности 2 кЛк и 16-часовом фотопериоде. При исследовании процессов прямого морфогенеза in vitro использовали два типа эксплантов - зрелые зародыши и апикальные меристемы. Культивирование предварительно простерилизованного растительного материала проводили на безгормональной среде МС с полным набором макро- и микросолей с течение 5-7 суток при освещенности 2 Кл и 16-часовом фотопериоде. При изучении процессов непрямого морфогенеза in vitro соматический эмбриогенный каллус, полученный из зрелых зародышей, переносили на регенерационную среду, используя две модификации стандартной среды МС: 1) МС + 0,5 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л кинетина; 2) МС + 0,5 мг/л ИУК + 0,5 мг/л кинетина. Морфогенный каллус культивировали при 26ºС, освещенности 2 кЛк, 16-часовом фотопериоде в течение 1-1,5 месяца. Эффективность процессов морфогенеза in vitro: индукции каллусогенеза, прямого и непрямого морфогенеза (в процентах) определяли как отношение числа эксплантов, образовавших морфогенные структуры к исходному количеству культивируемых эксплантов. Приведенные результаты получены в 3-5 независимых сериях экспериментов, представленных не менее чем пятью чашками Петри или колбами (по 5-7 эксплантов в каждой). В таблицах приведены средние значения и их стандартные отклонения. Изучение эффективности индукции первичного каллусогенеза изогенных по генам контроля фотопериодической чувствительности линий пшеницы показало, что все исследуемые генотипы способны формировать каллус при использовании различных эксплантов: зрелых зародышей, апексов корней и листовых эксплантов (таблица 1). Таблица 1 - Частота каллусогенеза изогенных по генам PPD линий озимой пшеницы сорта Мироновская 808 при использовании разных типов экспланта, % Частота каллусогенеза, % Генотип Зрелые Апикальные Листовые изолинии* зародыши корни экспланты 74,0 ± 24,2 40,8±2,6 45,7±2,5 PPD D1a 98,5 ± 51,2 48,9±3,1 52,6±3,1 PPD B1a 62,9 ± 12,1 44,3±3,2 44,9±3,0 PPD A1a 90,3 ± 31,1 47,7±2,8 50,2±2,7 сорт М-808 П р и м е ч а н и е: * - указаны только доминантные гены Однако тип выбранного экспланта оказывает влияние на эффективность данного процесса. Зрелые зародыши являлись более эффективными эксплантами для получения первичного каллуса по сравнению с апикальными участками корней и листовыми эксплантами. Эффективность индукции каллусообразования при использовании апексов корней была минимальной и составляла 40,8 – 48,9 %, при использовании листовых эксплантов – 44,9 – 52,6 % и максимальной при использовании в качестве эксплантов зрелых зародышей – 62,9 – 98,5 %. Генотип изолинии также оказывал влияние на эффективность каллусогенеза. Независимо от типа выбранного экспланта самым высоким потенциалом каллусообразования характеризовалась изолиния PPD B1a и сорт, который полностью рецессивен по генам ppd, минимальными показателями характеризовались изолинии PPD A1a и PPD D1a. Изолиния PPD B1a проявляет максимальную степень фотопериодической чувствительности, что выражается в торможении темпов развития данной линии по сравнению с другими изолиниями [11,12]. Следовательно, тип экспланта определяет максимальные и минимальные показатели эффективности каллусогенеза и, возможно, оказывает влияние на генотипическую детерминацию данного процесса. При использовании различных эксплантов, нами установлены различия в типах и скорости формирования образовавшегося каллуса. Начало каллусогенеза при формировании каллусных тканей из асептических корней происходило быстрее всего - на 2-5 сутки со дня перенесения на среду культивирования. При использовании зрелых зародышей – на 7-10 сутки, дольше всех формировался каллус из листовых эксплантов – на 30-35 сутки. Различия зафиксированы также по степени 134 оводненности, плотности, цвету, наличию элементов дифференцировки и проявлению морфогенетического потенциала. Из асептических корней формировался сильно оводненный, рыхлый, почти прозрачный, слегка беловатый каллус. Из зрелых зародышей – плотный, менее оводненный, желтоватый каллус, характеризующийся наличием элементов дифференциации, что подтвердили микроскопические исследования. Такого же типа каллусная ткань - плотная и желтоватая формировалась при использовании в качестве эксплантов первичных листьев. При микроскопировании каллусной ткани различных изолиний нами были обнаружены типичные для злаков каллусные клетки – вытянутые, с закругленными концами, не плотно прилегающие друг к другу. Однако клетки различных изолиний имели свои морфологические особенности и различия по размерам. Под морфогенезом понимают образование и дифференциацию тканей и органов многоклеточными организмами [5]. Выделяют прямой и непрямой пути морфогенеза in vitro. Прямой соматический морфогенез представляет собой процесс формирования биполярной структуры с осью корень/стебель с закрытой независимой сосудистой системой из клеток экспланта без предварительной дедиффиренциации и стадии образования каллуса. Непрямой морфогенез включает обязательный этап формирования дедиффирицированной каллусной ткани с последующей индукцией образования соматических зародышей (предзародышей) и их развитием в биполярные структуры с осью корень/стебель [7,9]. В наших дальнейших исследованиях мы изучали эффективность различных путей морфогенеза in vitro в зависимости от генотипа исходной изолинии и типа выбранного экспланта. Изучение прямого морфогенеза in vitro показало, что выбор экспланта существенно влияет на эффективность процесса (табл.2). При использовании в качестве эксплантов зрелых зародышей показатели частоты морфогенеза в 3-5 раз выше, чем при использовании апексов стеблей. Однако влияние генотипа, независимо от абсолютных показателей морфогенеза, проявляется однотипно в случае использования и апексов, и зрелых зародышей в качестве эксплантов. Максимально эффективен процесс у изолиний PPD D1а и PPD A1a, минимален – у растений изолинии PPD B1a и сорта. В дальнейших исследованиях при изучении непрямого пути морфогенеза in vitro после образования каллусных тканей, сформированных из различных эксплантов и перенесения их на среду для индукции морфогенеза, нами показаны различия в морфогенетическом потенциале в зависимости от типов каллуса и генотипа исходной изолинии. Плотный, желтоватый морфогенный каллус, сформированный из зрелых зародышей, проявлял регенерационную способность. На 10-15 сутки культивирования на среде для регенерации были отмечены геммогенез – формирование колеоптелей и ризогенез – формирование корней. Морфогенез прозрачного, гомогенного, рыхлого каллуса, сформированного из асептических корней, проходил только по пути интенсивного ризогенеза – формирования корней. Многими исследователями отмечено, что такой тип морфогенеза не является регенерационно способным, т.е. в дальнейшем при культивировании невозможно формирование полноценных фертильных растений-регенерантов [3,6,13]. Исследование морфогенетического потенциала проводилось нами с использованием двух модификаций состава регенерационной среды. Наиболее оптимальной оказалась среда следующего состава: МС + 0,5 мг/л ИУК + 0,5 мг/л кинетина – показатели эффективности процесса были в среднем 1,5 раза выше, чем на регенерационной среде МС + 0,5 мг/л 2,4-Д + 0,5 мг/л кинетина. Влияние генотипа исследуемых изолиний на непрямой морфогенез проявлялось однотипно также, как и в случае прямого морфогенеза. Эффективнее всего морфогенез отмечен у изолиний PPD A1a, минимален – у растений изолинии PPD B1a. Таблица 2 - Эффективность морфогенеза изогенных по генам PPD линий озимой пшеницы сорта Мироновская 808 при использовании разных типов экспланта и модификаций регенерационной среды культивирования, % Морфогенез, % Генотип прямой непрямой изолинии * апексы зародыши МС + ИУК МС + 2,4 D 32,5 ± 2,3 77,78 ± 1,1 35,9 ± 0,7 22,0 ± 0,9 PPD D1a 12,5 ± 1,1 70,83 ± 1,5 26,2 ± 0,4 18,3 ± 0,5 PPD B1a 25,6 ± 1,9 75,00 ± 1,8 48,5 ± 0,9 30,0 ± 0,7 PPD A1a 18,75 ± 1,3 72,22 ± 1,3 33,1 ± 1,1 21,6 ± 0,8 сорт М-808 Примечание: * - указаны только доминантные гены Таким образом, независимо от пути морфогенеза (прямой или непрямой), независимо от типа выбранного экспланта, состава регенерационной среды влияние генотипа исследуемых изолиний 135 проявляется сходным образом. Следует отметить, что генотипическая детерминация процессов каллусогенеза и морфогенеза проявляется противоположно: максимальное стимулирования каллусогенеза у изолинии PPD B1a сопровождается минимальными показателями морфогенеза и наоборот. Исследуемые изолинии генетической системы PPD - контроля фотопериодической чувствительности пшеницы, определяющей разные темпы развития опытных растений в условиях in vivo, различаются по эффективности различных путей морфогенеза в условиях in vitro. Показано, что изолиния PPD B1a, характеризующаяся медленным развитием in vivo, в условиях in vitro проявляет максимальную способность к каллусогенезу. Изолинии PPD D1a и PPD A1a, которые обладают минимальной чувствительностью к фотопериоду и максимально быстрыми темпами развития in vivo, максимально эффективно проявляют морфогенетический потенциал и наиболее интенсивно развиваются и в условиях in vitro. Т.е. генетическая система контроля фотопериодической чувствительности пшеницы способна детерминировать различные пути морфогенеза опытных растений in vitro. Работа выполнена при поддержке Фонда фундаментальных, прикладных и поисковых исследований Харьковского национального университета имени В.Н Каразина: грант № 6-07, 8-09. 1. Авксентьева О.А., Жмурко В.В., Петренко В.А., Тищенко А.А. Эффекты генов VRN и PPD на процессы каллюсогенеза и морфогенеза в культуре in vitro // Геном рослин: Збірник наукових статей Y Міжнародної конференції, 13-16 жовтня 2008 р. (Україна). – Одеса, 2008. – С.39-42. 2. Авксентьєва О.А., Зубрич А.И., Жмурко В.В. Єффекты генов PPD на рост, развитие и обмен углеводов у изогенных линий пшеницы в условиях разной длины дня // Там же. – Одеса, 2008. – С.42-45. 3. Бавол А.В., Дубровная О.В., Лялько И.И. Регенерация растений из различных типов эксплантов мягкой пшеницы // Физиология и биохимия культ. растений. – 2008. – Т.40, №2. – С.150-156. 4. Евсеева Н.В., Ткаченко О.В., Лобачев Ю.В. Биохимическая оценка морфогенетического потенциала каллусных клеток пшеницы in vitro // Физиология растений. – 2007. – Т.54, №2. – С.306-311. 5. Журавлев Ю.Н., Омелько А.М. Морфогенез у растений in vitro // Физиология растений. – 2008. – Т.55, №5. – С.643664. 6. Круглова Н.Н., Зайнутдинова Э.М. Андроклинный каллус пшеницы в динамике развития: цитологогистологический анализ // Вестник Башкирского университета. – 2001. - №2 (1). – С.137-141. 7. Кунах В.А. Біотехнологія лікарських рослин. Генетичні та фізіолого-біохімічні основи. – К.: Логос, 2005. – 730 с. 8. Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – К.: Наукова думка, 1980. – 488 с. 9. Лутова Л.А. Биотехнология высших растений. – СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003. – 228 с. 10. Сидор Л.С., Орлов П.А. Регенерационный потенциал различных видов пшеницы, ржи и ячменя в культуре листовых эксплантов // Цитология и генетика. – 2005. – Т.40, №5. – С.28-34. 11. Стельмах А.Ф., Файт В.И., Мартынюк В.Р. Генетические системы типа и контроля скорости развития пшеницы // Там же. – 2000. – Т.34, №2. – С.39-45. 12. Файт В.И.. Стельмах А.Ф., Федорова В.Р. Начало включения и продолжительность экспрессии генов фотопериодической реакции у озимой пшеницы // Там же. – 2006. –Т.40, №2. – С.12-19. 13. Чеченева Т.Н. Изменчивость злаков в культуре in vitro и в процессе регенерации растений // Физиология и биохимия культ. растений. – 2006. – Т.38, №2. – С.163-175. 14. Avksentyeva O.A., Petrenko V.A., Tichenko A.A. and Zhmurko V.V. Callus initiation and morphogenesis in in vitro culture of isogenetic on gene type and zate of development in winter wheat lines // Annual Wheat Newsletter. –August 2008. – Vol.54. – P.150-152. 15. Mashashhiko T., Kenji K., Yasuki T. etc Genetic analysis of photoperiod response in wheat and its relation with the earliness of heading in southwestern part of Japan // Breading Science. – 2005, 55. – P.327-334. 16. Machii H., Mizuno H., Hirabayashi T., Li H., Hagio T. Screening wheat genotypes for high callus induction and regeneration capability from anther and immature embryo cultures // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1998. – V.53, №1.- P.6774. 17. Tyankova N.D., Zagorska N.A. Genetic control in vitro response in wheat (Triticum aestivum L.) // In Vitro Cell. Dev. Biol., Plant.–2001.–37, № 5 –P.524-530. 18. Stelmakh А.F. Genetic systems regulating flowering in wheat // Wheat: Prospects for Global Improvement. – 1998. Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands. – P.491-501. 19. Wang C., Wei Z. Embriogenesis and regeneration of green plantlets from wheat (Triticum aestivum L.) leafbase // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. - 2004. – V.77, №2. - P.149-153. 20. White W., Herndil M., Hunt L., Payne T. and Hoogenboom G. Simulation-Based analysis of effects of Vrn and Ppd loci on flowering in wheat // Crop Science. - 2008. – Vol.48. - P.678-687. *** The features of the different ways of morphogenesis in vitro (callus formation, direct and indirect morphogenesis) isogenic lines for genes PPD winter wheat varieties Mironovskaya 808. The optimal conditionsfor the studied processes, showing their dependence on the type ofexplant, media composition and cultivation conditions. The differencesamong isogenic lines in the size of the cells of callus tissue, the rate of their formation, the manifestation of morphogenetic potential. It is shown that the ability of the genetic control of photoperiodic sensitivityof wheat in vivo determine the various ways of morphogenesis in vitr 136 Ж.С. Алмаганбетов, С.А. Джокебаева, Р.У. Бейсембаева, С.Б.Оразова КӨК-ЖАСЫЛ МИКРОБАЛДЫРЛАРДЫҢ МУТУАЛИСТІК ТИПТІ ДИКУЛЬТУРАЛАРЫН АЙҚЫНДАУ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті) Көк-жасыл балдырлардың дикультуралары (A. laxa + T1 Anabaenopsis и Anabaenopsis sp. (Т1) + Sph.Zetterstedtii) жоғары өсу жылдамдығымен жəне монокультурамен салыстырғанда, биомассаны жоғары мөлшерде жинақтауымен сипатталады. Бұл микробалдыр түрлерінің арасындағы мутуалистік қарым-қатынастың пайда болуынан деп болжам жасалды. Метаболизмі ерекше альгофлора өкілдерінің адамға маңызды қосылыстарды түзуіне байланысты микробалдырлар биотехнологияның маңызды объектілеріне айналды. Микробалдырларды биологиялық белсенді қосылыстардың көзі ретінде зерттеу, олардың антимикробтық, антисаңырауқұлақтық, антивирустық, антибактерияльды, антигельминттік, цитотоксикалық, антиоксиданттық, фитореттеушілік жəне өсуді белсендендірушілік қасиеттерін анықтау үшін зерттелінеді [1]. Микробалдырлардың биологиялық белсенді метаболиттеріне каротиноидтар, пигменттер, аминқышқылдары, фитогормондар, экзополисахаридтер, май қышқылдары, витаминдер, стеролдар, аллелохимиялық қосылыстар жатады [2]. Микробалдырлардың клеткалары аталған қосылыстарға сапалық жəне сандық жағынан бай болып келеді [3]. Соңғы уақытта микробалдырларды пайдаланудың тағы бір аспектісі қызығушылық тудыруда. Бұл аллелохимиялық қосылыстар. Микробалдырлар мен балдырлар қатысатын аллелопатиялық қатынастар биологияда маңызды болып табылады. Осы организмдер арқылы түзілетін химиялық заттар олардың белгілі табиғи ортада бəсекелестік түрде таралуын қамтамасыз етеді /4/. Сондықтан да осы уақытқа дейін биоценоздағы серіктестер арасындағы түраралық байланыстарға мəн берілмеді. Дегенмен де түрлер арасындағы байланыстарды зерттеу жаңа жоғары белсенді табиғи қосылыстарды дайындаудың теориялық негіздерін жасауға мүмкіндік береді. Балдырлардың культивирленетін аралас (ассоциацияланған) популяцияларын түзу өсу реттегіштері мен өсімдіктерді қорғайтын заттарды алуда фототрофты культураларда биосинтетикалық процесстерді бағытты реттеудің эффективті құралдарының бірі болып табылады [5]. Ауылшаруашылық дақылдардың абиотикалық (төмен жəне жоғары температура, ылғалдылық жетіспеушілігі), сонымен қатар биотикалық факторларға (саңырауқұлақтық, вирустық, бактерияльды аурулар, арамшөптер) төзімділігін арттыру қазіргі заманғы өсімдік шаруашылығының басым мəселелерінің бірі болып табылады. Əртүрлі стресс факторларға ауылшаруашылық өсімдіктердің төзімділігін арттыру мен егіс түсімін арттыратын өсу стимуляторларының қолжетімді жəне болашағы мол көзі – балдырлар болып саналады [6]. Зерттеу əдістері мен материалдар Зерттеу объектісі ретінде биотехнология кафедрасының альгологиялық коллекциясындағы культуралардың ішінен көк жасыл балдырлардың 10 түрі алынды: Anabaena laxa, Anabaenopsis sp. (Т1 штамы), Anabaenopsis Arnoldii, Anabaena sp. (К штамы), Anabaena constricta, Nostoc sp. (К штамы), Stratonostoc gelatinosum, Sphaeronostoc Zetterstedtii, Sphaeronostoc coeruleum, Amorphonostoc paludosum. Түрлердің биосəйкестілігі Егоровтың модификацияланған əдісі арқылы анықталынды /7/. Агарлы ортаға микробалдыр түрлерін нүктелік əдіс бойынша отырғызылды. Бір апта өткеннен кейін микробалдырлардың колонияларының өсу белсенділігі бақыланды. Колониялардың өсуі бинокуляр арқылы бақыланды. Микробалдырлардың моно- жəне аралас дақылдарын өсіру үшін 5 мл Фитцджеральд ортасы бар 20 мл пробиркаларда 16 түрлі моно- жəне аралас дақылдарды өсірдік. Фитцджеральд ортасының құрамы (г/л): NaNO3 -0,496; K2HPO4 – 0,039; MgSO4*7H2O – 0,075; CaCl2 – 0,036; Na2CO3 – 0,020; Na2SiO3*9H2O – 0,058; Fe цитраты – 0,006; лимон қышқылы – 0,006; трилон Б – 0,001; микроэлементтер ерітіндісі – 0,008 мл. Зерттеуге алынған 7 монокультура: Anabaena laxa, Sphaeronostoc Zetterstettdi, Anabaenopsis sp. (T1), Anabaena sp. (K), Anabaena constricta, Anabaenopsis Arnoldii жəне Sphaeronostoc coeruleum. 9 түрлі дикультурадағы комбинациялар: A.laxa + Sph. Zetterstettdi, Sph.Zetterstettdi + Anabaenopsis sp. (T1), Anabaenopsis sp. (T1) + Anabaena sp. (K), Sph. Zetterstettdi + A.constricta, Sph. coereleum + A. constricta, A. laxa+ A. constricta, A.laxa + Anabaenopsis sp. (T1), Anabaenopsis Arnoldii + A. laxa жəне Anabaenopsis Arnoldii + Anabaena sp. (K). 16 түрлі жағдайдан 3 монокультура жəне 2 түрлі аралас комбинациялар алынды. Ең алдымен, дақылдарды культураға енгізбестен бұрын екі дақылдың алдын-ала бірдей тығыздықта инокуляттарын 137 дайындап алдық. Осы дақылдарды ламинар бокста моно- жəне аралас жағдайларына сəйкес культураларға енгізділді. Аралас культураларға əр түрдің инокуляттары 0,5:0,5 көлем қатынасында енгізілді жəне қиғаш жағдайда, 250С температурада люминостатта 10 тəулік бойы культивирленді. 3, 6 жəне 10 тəулік өткеннен кейін биомассаың өсу динамикасы анықталынды. Салыстыру үшін монокультураларды да жоғарыда аталған жағдайларда өсірдік. Өсу процесінің белсенділігі өсу коэффициенті (ӨК) бойынша анықталынды. 3, 6 жəне 10 тəулік өткен сайын микробалдырлардың биомассасы бар 6 мл культуралық сұйықтық алдын-ала салмағы тұрақтандырылған бюкстерде 1050С температурада құрғақ салмағы тұрақты мəнге жеткенше кептірілді. Екінші бюксте 1 мл инокулят аталған жағдайда кептірілді. Өсу көрсеткіші төмендегідей формула бойынша есептелінді /8/: Өсу коэффициенті = , мұндағы, М1-биомассаның соңғы құрғақ салмағы, М2-инокуляттың соңғы құрғақ массасы. Барлық тəжірибелер үш реттік биологиялық жəне аналитикалық қайталаныммен жасалды. Нəтижелер статистикалық түрде талданды. Зерттеу нəтижелері Микробалдырлар метаболизмі барысында көптеген биологиялық белсенді заттарды түзеді. Микробалдырлардың аралас культураларында биологиялық белсенді қосылыстар жоғары деңгейде түзіледі деп болжам жасалады. Бұл мəселені шешу үшін микробалдырлардың биосəйкестілігін анықтау керек. Жұмыс барысында 10 көк-жасыл микробалдырлардың биосəйкестілігі Егоровтың аралас культурадағы түрлердің биосəйкестілік биотестін қолданып зерттелінді. 10 түрдің биосəйкестілігін зерттеу нəтижесі 1-суретте көрсетілген. A.laxa жəне Sph.Zetterstedtii микробалдырлар комбинациясынан алынған нəтиже бинокуляр арқылы қаралды (сурет 2). Микробалдырлардың арасында трихомаларының өсуі жүзеге асқан, трихомалары бір-біріне бағытталып өскен жəне тығыз байланыста болды. Зерттеу барысында A.laxa + Sph.Zetterstedtii, A. laxa + T1 Anabaenopsis жəне Anabaenopsis sp. (Т1) + Sph.Zetterstedtii комбинацияларының арасында колониялар арасындағы өсу белсенді түрде байқалды. Зерттеу жұмысының екінші сатысында түрлер мен олардың дикультураларының ӨК анықтау үшін тəжірибе қойылды. Биосəйкестілік тəжірибесінің нəтижелері бойынша алынған 9 аралас микробалдырлар комбинацияларының ішінде A. laxa + T1 Anabaenopsis жəне Anabaenopsis sp. (Т1) + Sph.Zetterstedtii дикультуралар жоғары биосəйкестілігін көрсетті. Өсу көрсеткіші бойынша тəжірибеге комбинациялардың моно- жəне аралас дақылдары алынды. Сурет 1 - Микробалдыр түрлерінің биосəйкестілігін анықтауға арналған биотест Сурет 2 - Агарлы ортадағы микробалдырлардың бірігіп өсуі (х10 Аралас дикультураны 10 тəулік бойы өсіріп, 0, 3, 6 жəне 10 тəуліктен кейін биомассаның өсу көрсеткіші анықталды. Бақылау ретінде екі монокультураның өсу көрсеткіштері де анықталды (3сурет). A.laxa 3 күндік культурасының өсу коэффициенті 2,35±0,1 тең болды, Anabaenopsis sp. (Т1)1,83±0,02 тең. Қос дақылдағы көрсеткіштер біршама жоғары 2,78±0,26 болды. Монокультуралардың өсу көрсеткішін аралас дақылдармен салыстырсақ, A.laxa 18%-ға жəне Anabaenopsis sp. (Т1) 50%-ға дейін аралас дақылдан кем. Дақылдарды 6 тəулік культивирлеу барысында A.laxa-ның өсу коэффициенті 2,49±0,2–ке жетті, бұл көрсеткіш 3 тəулік көрсеткіштен 5%-ға артты. Anabaenopsis sp. (Т1) дақылының өсу көрсеткіші A.laxa дақылымен салыстырғанда анағұрлым төменірек, 6 тəуліктен кейін 1,90±0,2-ге тең болды. Қос 138 дақылдың көрсеткіші монокультураларға қарағанда, едəуір жоғары, 3,02±0,21–ге тең болды. Бұл қос дақыл көрсеткшінің A.lax-дан 21%-ға жəне Anabaenopsis sp. (Т1)-дан 58%-ға артқандығын көрсетеді. Өсу динамикасының көрсеткіштері 10 тəуліктік культураларда 3 жəне 6 тəулік культивирленгенге қарағанда жоғары болды. Монокультуралардың көрсеткіштері сəйкесінше Anabaena laxa-да 2,75±0,3 жəне Anabaenopsis sp. (Т1)-да 2,58±0,04, ал дикультураның өсу коэффициенті артты (3,88±0,5). Сурет 3 - A.laxa жəне Anabaenopsis sp. (Т1) дақылдардың өсу динамикасының көрсеткіштері Anabaenopsis sp. (Т1) жəне Sph.Zetterstedtii микробалдырларының жəне дикультураларының 10 тəулік өсу динамикасын зерттеу нəтижелері берілген (сурет 4). олардың Сурет 4 - Anabaenopsis sp. (T1) жəне Sph.Zetterstettdi дақылдарының өсу динамикасының көрсеткіштері Anabaenopsis sp. (Т1) микробалдырының өсу көрсеткіші 3, 6 жəне 10 тəулікте сəйкесінше 1,83±0,02, 1,90±0,21 жəне 2,58±0,04-ге тең болды. Культивирлеудің 6 тəулігінде құрғақ биомасса 3%ға, ал 10 күннен соң 40%-ға дейін артты. Sph.Zetterstedtii-нің өсу коэффициенті 3 тəуліктен соң 2,01±0,02. 6 тəулік культурада 2,74±0,16ға жетті. 10 тəуліктен кейін 2,84±0,06 болды, жалпы биомассаның құрғақ салмағы 41%-ға жоғарылады. Алынған түрлердің, яғни Anabaenopsis sp. (Т1) жəне Sph.Zetterstedtii бірігіп өсуінің көрсеткіштері барлық күндерде де монокультуралармен салыстырғанда жоғары екендігі анықталынды. Дикультуралардың өсу коэффициенттері 3, 6 жəне 10 тəулік аралықтарында 2,78±0,26, 3,02±0,21 жəне 3,88±0,5 болды. Дикультураны монокультураларымен салыстырсақ, дикультураның биомассасының құрғақ салмағы Anabaenopsis sp. (Т1)–дан 58%-ға жəне Sph.Zetterstedtii-дан 36%-ға жоғарылады. Сонымен, зерттеуге алынған микробалдырлардың өсу көрсеткіштері дикультураларда монокультураларымен салыстырғанда анағұрлым жоғары болды. Микробалдырлар аралас жағдайда биологиялық белсенді заттарды синтездеп, бір-біріне қолайлы жағдай туғыза отырып, бір-бірінің өсуін белсендендіруі мүмкін. 1. Kumar K., Lakshmanan A. and Kannaiyan S. Bioregulatory and therapeutic effects of blue green algae // Indian J. Microbiol. -2005. -vol. 43. -no. 1. -p. 9–16. 2. Краснянская Н.Б., Урунбаева Д., Чепенко Л.И. и др. Рост-стимулирующие метаболиты Nostoc muscorum // Биол. и биотехн. микроорганизмов. –Ташкент. -1989. –с.51-59. 139 3. Горюнова С. В. Синезеленые водоросли (биохимия, физиология, роль в практике). М.: Наука, 1969. – 300 с. 4. Nagle D.G. and Inderjit. Chemical Ecology of Plants: Allelopathy in Aquatic and Terrestrial Ecosytems. Switzerland: Verlag, 2002. 5. О.В. Бухарин, Е.С. Лобанова, Н.В. Немцева и др. Ассоциативный симбиоз. УрО РАН, Екатеринбург, 2007. –264с. 6. R. Prasannaa, A. Soodb, P. Jaiswala, S. Nayaka, V. Guptaa, V. Chaudhary, M. Joshia and C. Natarajan // Rediscovering Cyanobacteria as Valuable Sources of Bioactive Compounds. -Applied Biochemistry and Microbiology. – 2010. -Vol. 46. -No. 2. p.119–134. 7. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: МГУ-Наука,2004.- 525 с. 8. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике, Киев: Наукова думка, - 1975. –с.328. *** Установлено, что дикультуры синезеленых водорослей (A. laxa + T1 Anabaenopsis и Anabaenopsis sp. (Т1) + Sph.Zetterstedtii) характеризуются повышенной скооростью роста и накоплением биомассы по сравнению с монокультурами. Предпологается, что это связано с возникновением мутуалистических взаимоотношений между видами микроводорослей. *** It is found that blue-green algae dicultures (A.laxa + Anabaenopsis sp. T1 strain and Anabaenopsis sp. T1 strain + Sph.Zetterstedtii) are characterized by high growth and accumulation of biomass compared to monocultures. It is supposed that this is connected with the occurrence of mutualistic relationships between species of microalgae. Z. Alikulov, M. Myrzabaeva, T. Utupov, O. Babenko XENOBIOTIC TRANSFORMING ACTIVITY OF ANIMAL MOLYBDOENZYMES (The L.N.Gumiliev Eurasian National University, Astana) Most the attention to date in metabolism of drugs and foreign compounds has been focused on the microsomal monooxygenase system. This system plays an important role in the oxidation of aromatic carbocyclic compounds. However, the presence of the one ore more nitrogen atoms in the aromatic ring makes heterocyclic compounds also susceptible to oxidation via a second group of enzymes known as the “molybdenum hydroxylases”. These cytosolic enzymes, which include xanthine oxidase (XO, EC 1.2.3.2) and aldehyde oxidase (AO, EC 1.2.3.1), form a closely related group with similar molecular properties but differ some what in substrate specificity. Both enzymes are also involved in some physiological processes and also the metabolism of some endogenous compounds which may indicate their important roles in in vivo conditions [2]. These enzymes are metalloflavoproteins that catalyze both oxidation and reduction of a broad range of drugs and other xenobiotics indicating the importance of these enzymes in drug oxidation, detoxification and activation. Xanthine oxidoreductase (XOR) appears in two interconvertible forms xanthine dehydrogenase (XDH), and xanthine oxidase (XO). Xanthine oxidoreductase catalyzes the hydroxylation of hypoxanthine to xanthine and of xanthine to urate. Oxidative hydroxylation occurs at the molybdenum center. With XDH NAD+ is reduced; with XO molecular oxygen is reduced at the flavin center. Molybdenum-containing hydroxylases catalyze the hydroxylation of carbon centers using oxygen derived ultimately from water, rather than O2, as the source of the oxygen atom incorporated into the product, and do not require an external source of reducing equivalents. The relative importance of these two groups of oxidative enzymes is illustrated by comparing the in vitro oxidation of several bicyclic ring system. Naphtalene is oxidized via the microsomal monooxygenase system to an unstable epoxide intermediate which ultimately gives rise to a mixture of 1-naphtol and 2naphtol. However, naphthalene is not a substrate for the molybdenum hydroxylases. Quinoline, 1azanaphtalene, reacts not only with the microsomal enzyme system but also with aldehyde oxidase to give a number of mono- and dihydroquinolines with rabbit or rat liver fractions. As the number of N atoms in the molecule increases, the molybdenum hydroxylases play a more dominant role in the oxidative biotransformation of these compounds. Thus, quinazoline, 1,3-diazanaphtalene, is rapidly oxidized by both aldehyde oxidase and xanthine oxidase to quinazolin-4-one, whereas only small amounts of phenolic microsomal products can be detected. Furthermore, quinazolin-4-one is subsequently converted to quinazolin2, 4-dione by the molybdenum hydroxylases. Finally pteridine, 1,3,5,8-tetraazanaphtalene, is oxidized in vitro via the molybdenum hydroxylases only; xanthine oxidase converts it sequentially to pteridin-2,4,7-trione, whereas it is converted to pteridin-2,4-dione by aldehyde oxidase. The reason for the change in emphasis from microsomal oxidation of naphthalene to the molybdenum hydroxylase catalyzed attack of pteridine is due to the additive activating effect of each nitrogen atom toward nucleophilic attack of the ring system. The molybdenum hydroxylases catalyze a reaction which involves attack by a nucleophile. Therefore, oxidation normally occurs at the carbon atom adjacent to a ring nitrogen, 140 which is generally the most electropositive carbon. The oxygen atom incorporated into the substrate is ultimately derived from water. In contrast, the microsomal monooxygenase system catalyzes electrophilic attack involving molecular oxygen, and the carbons in the heterocyclic rings are deactivated toward electrophilic reagents. The two reactions can be presented thus [2]: RH + OH- aldehyde oxidase, xanthine oxidase ROH + 2e- + H+ RH + O2 + NADPH + H+ monooxygenases ROH + H2O + NADP+ The molybdenum hydroxylases function by being alternately reduced by the substrate (RH) and reoxidized by molecular oxygen (or NAD+) under physiological conditions. In addition to the two atoms of molybdenum, these enzymes also contain two molecules of FAD per mole of enzyme. Both superoxide anion and hydrogen peroxide are produced via either one-electron or two-electron transfer. These pathways can be illustrated by the following equation: FADH2 + 2O2 FAD + 2H+ + 2O2FADH2 + O2 FAD + H2O2 Reactions catalyzed by molybdoenzymes. AO and XO oxidize the oxidation of a wide range of heterocyclic compounds. Although the enzymes have similar molecular properties, their substrate specificities are quite different, with regard to both rate of oxidation and the position of attack. However, the role of these enzymes in the oxidation of drug-derived aldehydes has not been established. The investigation described the interaction of eleven structurally related benzaldehydes with guinea pig liver aldehyde oxidase and bovine milk xanthine oxidase, since they have similar substrate specificity to human molybdenum hydroxylases. The compounds under test included mono-hydroxy and mono-methoxy benzaldehydes as well as 3,4-dihydroxy-, 3-hydroxy-4-methoxy-,4-hydroxy-3-methoxy-, and 3,4-dimethoxy-benzaldehydes. In addition, various amines and catechols were tested with the molybdenum hydroxylases as inhibitors of benzaldehyde oxidation. The kinetic constants have shown that hydroxy-, and methoxy-benzaldehydes are excellent substrates for aldehyde oxidase with lower affinities for xanthine oxidase. Therefore, aldehyde oxidase activity may be a significant factor in the oxidation of the aromatic aldehydes generated from amines and alkyl benzenes during drug metabolism. In addition, amines acted as weak inhibitors, whereas catechols had a more pronounced inhibitory effect on the aldehyde oxidase activity. It is therefore possible that aldehyde oxidase may be critical in the oxidation of the analogous phenyl acetaldehydes derived from dopamine and noradrenaline. There are very few monocyclic substrates of these enzymes; pyridine and its diaza analogues, pyrimidine, pyrazine and pyridazine, do not react with the molybdoenzymes in vitro. However, some substituted pyridines and pyrimidines are metabolized, and these examples emphasize the difference in substrate specificity between the AO and XO. XO catalyses nitrite reduction to nitric oxide under anaerobic conditions [1]. The XO reducing substrate xanthine, NADH, triggered nitrite reduction to NO, and the molybdenum-binding XO inhibitor oxypurinol inhibited this NO formation, indicating that nitrite reduction occurs at the molybdenum site. Nitrite and reducing substrate concentrations were important regulators of XO-catalyzed NO generation. It is well known that in mammals including humans, NO is an important cellular signaling molecule involved in many physiological and pathological processes. XO-catalyzed nitrite reduction can be an important source of NO generation under ischemic conditions [5]. It was suggested that XO is an inducible enzyme and that treatment of mice with xanthine results in elevation of enzyme levels. Similarly, when phtalazine, a substrate of both molybdoenzymes, is administrated to rabbits an increase in the activity of each enzyme is observed. The “induced” AO differs from the control enzyme in some physico-chemical properties. It was also shown that that hydralazine, a substituted phtalazine, is an inhibitor of rabbit AO activity both in vivo and in vitro. XO activity is not altered by hydralazine. Interesting results are obtained when the carcinogen 2-acetylaminofluorene is administered to rats. XO activity increases, as does one isozyme of AO, however, the second isozyme is absent from induced liver. The molybdenum hydroxylases are widely distributed throughout the animal the plant and animal kingdoms. Two detailed studies comparing the occurrence of aldehyde oxidase and xanthine oxidase in more than 100 species have shown that these enzymes are present, either separately or together, in species as diverse as the sea anemone and man. Species differences in the levels of aldehyde oxidase are more pronounced than those of xanthine oxidase, with herbivores containing the highest levels of former enzyme. Aldehyde oxidase levels appear to be comparatively low in humans. Levels of both enzymes are high in mammalian liver although xanthine oxidase is present in similar concentrations in lactating mammary tissue and small intestine, and concentrated 1000-fold in bovine milk lipid globules. 141 Sulfite oxidase, (EC 1.8.3.1) third molybdoenzyme is an enzyme in the mitochondria of all eukaryotes. It oxidizes sulfite to sulfate and, via cytochrome c, transfers the electrons produced to the electron transport chain, allowing generation of ATP in oxidative phosphorylation. The recently discovered mammalian fourth molybdenum containing protein mARC1 is capable of reducing N-hydroxylated compounds. It was named mARC because the N-reduction of amidoxime structures was initially studied using this isolated mitochondrial enzyme. Upon reconstitution with cytochrome b(5) and b5 reductase, benzamidoxime, pentamidine, and diminazene amidoximes, N-hydroxymelagatran, guanoxabenz, and N-hydroxydebrisoquine are efficiently reduced. These substances are amidoxime/Nhydroxyguanidine prodrugs, leading to improved bioavailability compared to the active amidines/guanidines. Thus, the recombinant enzyme allows prediction about in vivo reduction of N-hydroxylated prodrugs. Furthermore, the prodrug principle is not dependent on cytochrome P450 enzymes [3]. All hitherto analyzed mammalian genomes harbor two mARC genes: molybdenum cofactor (Moco) sulfurase C-terminal domain MOSC1 and MOSC2. Proteins encoded by these genes represent the simplest eukaryotic molybdenum enzymes, in that they bind only the Moco. It is also suggested that they are members of a new family of molybdenum enzymes. mARC and its N-reductive enzyme system plays a major role in drug metabolism, especially in the activation of so-called "amidoxime-prodrugs" and in the detoxification of N-hydroxylated xenobiotics, though its physiological relevance is largely unknown [4]. Thus, molybdenum is an essential trace element for virtually all life forms. It functions as a cofactor for a number of enzymes that catalyze important chemical transformations in the global carbon, nitrogen, and sulfur cycles. At least 50 molybdenum-containing enzymes are now known in bacteria, plants and animals. Thus, molybdenum-dependent enzymes are not only required for the health of the Earth's people, but for the health of its ecosystems as well. Humans require very small amounts. Plants are common sources of molybdenum for animals and human. However, the amount of molybdenum in plants varies with how much is in the soil. Linxian is a small region in northern China where the incidence of cancer of the esophagus and stomach is very high (10 times higher than the average in China and 100 times higher than the average in the U.S. The soil in this region is low in molybdenum and other mineral elements, so dietary molybdenum is also low. Increased intake of nitrosamines, which are known carcinogens, may be one of a number of dietary and environmental factors that contributes to the development of gastroesophageal cancer in this population. Plants require molybdenum to synthesize nitrate reductase, a molybdoenzyme necessary for converting nitrates from the soil to amino acids. When soil molybdenum content is low, plant conversion of nitrates to nitrosamines increases, resulting in increased nitrosamine exposure for those who consume the plants. Adding molybdenum to the soil in the form of ammonium molybdenate may help decrease the risk of gastroesophageal cancer by limiting nitrosamine exposure. 1. Alikulov, Z. A.; L'Vov N, P.; Kretovich, V. L. 1980. Nitrate and nitrite reductase activity of milk xanthine oxidase. Biokhimiia. 45:1714-1718. (1980). 2. Beedham C. 1985. Molybdenum hydroxylases as a drug-metabolizing enzymes. Drug Metabolism Review. 16 (1-2): 119156. 3. Grünewald, S., Wahl, B., Bittner, F., Hungeling, H., Kanzow, S., Kotthaus, J., Schwering, U., Mendel. R.R., and B. Clement. 2009. The fourth molybdenum containing human enzyme mARC: cloning and reduction of N-dydroxylated structures. J. Med. Chem. 51, 8173 – 8177. 4. Havemeyer A., Lang J., Clement B. 2009. The fourth mammalian molybdenum enzyme mARC: current state of research. Drug Metabolism Reviews. Publisher Taylor & Francis. 123-134. 5. Li, H.T., Samouilov, A., Liu, X. P., and Zweier, J. L., Characterization of the magnitude and kinetics of xanthine oxidasecatalyzed nitrite reduction - Evaluation of its role in nitric oxide generation in anoxic tissues, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276, 24482-24489. Р.А. Алыбаева, Г.Ж. Билялова, А.Н. Кожахметова ОЦЕНКА УСТОЙЧИВОСТИ ГЕНОТИПОВ ПШЕНИЦЫ К СВИНЦУ И ЦИНКУ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТОЙ ТЕХНОЛОГИИ ЕЕ ВОЗДЕЛЫВАНИЯ (Казахский национальный университет им. аль-Фараби) В настоящей работе представлена оценка устойчивости к свинцу и цинку различных генотипов озимой пшеницы в лабораторных условиях. Проведенный скрининг позволил выявить устойчивые и чувствительные формы. Наиболее острая проблема, решение которой имеет практическое значение, является загрязнение тяжелыми металлами агроценозов вблизи крупных промышленных центров. Отдельные сорта различных видов продовольственных культур проявляют существенные различия по устойчивости к 142 действию почвенных загрязнителей[1,2]. Эти их свойства можно использовать в экологически чистом производстве, подбирая наиболее устойчивые формы, мало накапливающие тяжелые металлы, получать экологически безопасную продукцию. Металлоустойчивые формы также могут служить донорами при создании толерантных к загрязнителям сортов растений [2]. Восточно-Казахстанский регион характеризуется наличием большого числа техногенных загрязнителей, среди которых лидирующая роль принадлежит тяжелым металлам[3]. В связи с этим были исследованы различные генотипы озимой пшеницы, важной сельскохозяйственной культуры, для выявления металлоустойчивых видов с целью их дальнейшего использования в экологически чистом производстве и селекционном процессе. Предыдущие исследования были проведены на различных генотипах из мировой коллекции, в представленном исследовании были взяты генотипы из коллекции Восточно-Казахстанского НИИ сельского хозяйства (ВКНИИСХ). Эти генотипы представляют большой интерес, так как они районированы в регионе Восточного Казахстана. Таким образом, объектами исследования стали различные генотипы озимой пшеницы, районированные в регионе Восточного Казахстана: Сибинка, Булава, Мироновская 808, Минг-2, 116/271. Эксперименты были выполнены на 7-суточных проростках, выращенных на питательной смеси, содержащей 0,1мМ СаSO4, ионы Pb в концентрации 200 и 400 мг/л (в виде соли Pb (NO3)2) или ионы Zn в концентрации 200 и 400 мг/л (в виде соли ZnSO4). Измерение ростовых показателей проводилось общепринятыми методами. Индекс толерантности или коэффициент Уилкинса вычисляли по формуле: It=Ime/Ic, где Ime– прирост корней на растворе с исследуемым металлом, Iс- прирост корней на растворе без металла[4]. Исследование генотипов из коллекции ВКНИИСХ показало, что исследуемые генотипы по росту надземных органов при высокой концентрации свинца можно расположить следующим образом: Сибинка>Мироновская 808 > Булава >Минг-2 >Комсомольская 56 (рисунок 1). Hаиболее устойчивыми к действию свинца среди исследуемых генотипов можно считать проростки сортов озимой пшеницы Мироновская –808 и Сибинка, наиболее чувствительными - сорт Комсомольская 56. Коэффициент Уилкинса или индекс толерантности наибольший при низкой концентрации свинца у сортов Мироновской 808 и Сибинка, средние у сортов Комсомольская 56 и Булава, наименьший у сорта озимой пшеницы Минг-2. При высокой концентрации свинца наибольшие коэффициенты Уилкинса у сорта Мироновская 808 и Сибинка, средние у генотипов Комсомольская 56 и Булава и наименьший у Минг-2. По результатам исследования роста корней при различных концентрациях свинца в среде выращивания и индекса толерантности можно выделить сорта Мироновская 808 и Сибинка как генотипы с наиболее устойчивой корневой системой к неблагоприятному действию свинца. Длина корней уменьшалась в следующем порядке: Мироновская 808 >Сибинка> Булава > Минг2 > Комсомольская 56. Таким образом, судя по росту надземных органов, наиболее устойчивыми к действию свинца среди исследуемых генотипов можно считать сорта озимой пшеницы Мироновская –808 и Сибинка, наиболее чувствительным - сорт Комсомольская 56. см Проростки 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Мир-я 808 Минг- 2 Сибинка Ком-я 56 контроль Pb 200мг/л Pb 400мг/л Булава Генотипы:1-Мирон-я 808, 2-Минг-2, 3-Сибинка, 4-Комсом-я 56, 5Булава Рисунок 1 - Влияние свинца на формирование высоты проростков у различных генотипов пшеницы из коллекции ВКНИИСХ 143 Исследование генотипов из коллекции ВКНИИСХ показало, что по росту надземных органов при высокой концентрации цинка генотипы можно расположить следующим образом: Мироновская 808 >Сибинка> Булава > Комсомольская 56 > Минг-2 (рисунок 2). Рисунок 2 - Влияние цинка на формирование высоты проростков у различных генотипов пшеницы коллекции ВКНИИСХ Длина корней при этой концентрации цинка уменьшалась в следующем порядке: Булава >Мироновская 808 > Комсомольская 56 > Минг-2 >Сибинка. Судя по росту надземных органов, наиболее устойчивыми к цинку среди исследуемых видов можно считать сорта Мироновская 808 и Сибинка. Следует отметить, что корни растений сорта озимой пшеницы Булава были наиболее устойчивыми к действию цинка, наиболее чувствительными – сорта Сибинка. По результатам исследований можно сделать вывод, что по показателям роста надземных органов, наиболее устойчивыми к действию свинца среди исследуемых генотипов являются сорта озимой пшеницы Мироновская –808 и Сибинка, наиболее чувствительным - сорт Комсомольская 56. В отношении цинка, наиболее устойчивыми среди исследуемых генотипов также являются сорта Мироновская 808 и Сибинка. Наиболее чувствительными оказались проростки сортаМинг-2 и корни сорта Сибинка. Таким образом, судя по росту надземных органов, наиболее устойчивыми к действию обоих исследуемых металлов (свинцу и цинку) среди исследуемых генотипов можно считать проростки сортов озимой пшеницы Мироновская 808 и Сибинка. Наибольший интерес для нас представляет рост надземных органов,так как устойчивость надземных органов свидетельствует о том, что в надземные органы поступает малотяжелых металлов или успешно работают защитные механизмы связывания или другой их инактивации. Малое количество подвижных форм тяжелых металлов в надземных органах говорит о том, что в зерно, которое является товарной частью пшеницы, также поступление будет минимальным. 1. Ильин В.Б. Тяжелые металлы в системе почва-растение. – Новосибирск: Наука, 1991.-150 С. 2. Молчан И.М. Селекционно-генетические аспекты снижения содержания экотоксикантов в растениеводческой продукции // Сельскохозяйственная биология. -1996, № 1. - С.55-66. 3. Алыбаева Р.А. Оценка экологического состояния почв города Усть-Каменогорска // Вестник КазНУ, серия экологическая. -2007. -2 (21). - С.40-44. 4. Wilkins D.S. The measurement of tolerance to edaphic factors by means of root growth // New Phytol. 1978. V. 80. №3. Р. 623-633. *** Жұмыста зертханалық сабақта қыстық бидайдың əртүрлі генотиптерінің мырыш пен қалайыға төзімділігіне бағалау көрсетілген. Жүргізілген зерттеулер нəтижесінде төзімді жəне сезімтал түрлер алынды. *** In the present rabotepredstavlena sustainability assessment to lead and zinc with different genotypes of winter wheat in the laboratory. Screening revealed a stable and sensitive forms of. 144 Р.С. Аимбетов 1,2, А.К. Бисенбаев 1, Д.Д. Сарбасов 2 GLY-934 ОБЕСПЕЧИВАЕТ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РИКТОРА С SIN1. (1 Лаборатория молекулярной генетики НИИ проблем биологии и биотехнологии КазНУ им. альФараби, 2 The department of molecular and cellular oncology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX) mTOR (mammalian target of rapamycin) - важная киназа, находящаяся на пересечении сигнальных путей ростовых факторов и питательных веществ. Существуя в составе двух мультипротеиновых комплексов - mTORC1 и mTORC2 (mTOR complex 1/2) – данная киназа регулирует процессы клеточного роста и пролиферации. Нами установлено, что остаток Gly-934 одного из компонентов mTORC2 - риктора – играет ключевую роль в обеспечении его взаимодействия с белком Sin1. mTOR - это центральная киназа консервированного у всех эукариот сигнального пути. В клетках mTOR обнаруживается в виде двух комплексов - mTORС1 и mTORС2 [1, 2]. mTOR комплекс 1 (mTORC1), состоящий из mTOR, раптора и mLST8 передает сигналы, полученные от ростовых факторов и питательных веществ, на модуляторы белкового синтеза S6K и 4EBP1. Второй комплекс (mTORС2), помимо mTOR и mLST8, включает белки Sin1 и риктор. Комплекс mTORC2 предпочтительно фосфорилирует протеин киназы семейства AGC по сайтам гидрофобных мотивов, расположенных на С-конце [3]. Указанные особенности свойственны всем субстратам mTORC2, таким как Akt и PKC, а также SGK. Известно, что комплекс mTORС2 образуется путем независимого объединения гетеродимеров риктор/Sin1 и mTOR/mLST8. Формирование тетрамера риктор/Sin1/mTOR/ mLST8 является необходимым минимальным «ядром», определяющим киназные свойства mTORС2 [4]. Две работы, вышедшие в 2009 году, сообщают об идентичных фенотипах нематод C. elegans с мутированным риктором [5, 6]. В генетических скринингах, нацеленных на идентификацию мутантов с измененным запасом липидов, обе группы обнаружили ряд мутаций в единственном у C. elegans гомологе гена риктора rict-1, приводящих к увеличению жировой массы, уменьшению размеров тела и укорачиванию продолжительности жизни. В скрине, выполненном Soukas et al. [6], аллельные формы mg450 и mg451 гена rict-1 содержали нонсенс мутации. Мутанты, изолированные Jones et al. [5], содержали ранний преждевременный стоп кодона в аллеле ft7 и замену одной аминокислоты в аллеле mg360. Наблюдаемые фенотипы были реверсируемы трансгенной оверэкспрессией rict-1 дикого типа и фенокопировались РНКинтерференцией rict-1 и lst-8. Эти данные указывают на то, что перечисленные фенотипические отклонения с большей вероятностью относятся к нарушению работы mTORС2, чем к mTOR-независимым функциям риктора. Необходимо отметить, что нарушение функции mTORС2 в результате замены единственной аминокислоты в аллеле mg360 является любопытным фактом и требует дальнейшего исследования. На данный момент известно, что мутация, приводящая к фенотипическим отклонениям у C. elegans, связана с заменой Gly-1120 на глутаминовую кислоту [5]. Отдельный интерес представляет выявление консервативных аминокислот риктора в участке мутации, связанной с фенотипическими отклонениями у нематод. Материалы и методы Сайт-направленный мутагенез риктора. Все нуклеотидные замены проводились на фрагменте 400-1400 риктора посредством ПЦР с использованием соответствующих праймеров. По завершении амплификации наличие продуктов ПЦР требуемой длины проверялось методом агарозного гель-электрофореза. Наличие и отсутствие мутаций подтверждали секвенированием всей вставки. Все мутированные фрагменты субклонировали в полноразмерный риктор по сайтам рестрикции PacI/AgeI. Культура клеток млекопитающих. Клетки HEK293T культивировали в среде DMEM с 10% ФБС, пенициллин/стрептомицином и 20 мМ L-глутамином в 37°С с 5% содержанием СО2 в атмосфере. Плотность клеток позволяла свободное деление на протяжении всего эксперимента. Трансфекция HEK293T. Для трансфекции 1×106 клеток HEK293T высаживали на 6 см чашки в 3 мл среды DMEM с 10% ФБС за день до трансфекции. Трансфекцию клеток осуществляли методом кальциево-фосфатной преципитации: смешивали 1 мкг pRK5-myc-риктор и 400 нг pRK5-Sin1-V5 в dH2О до конечного объема 175 мкл; к этому объему добавляли 200 мкл 2хHBSS (280 мМ NaCl, 10 мМ KCl, 1.5 мМ Na2HPO4, 12 мМ декстрозы, 50 мМ HEPES, pH 7.1) и тщательно перемешивали. К полученной смеси медленно, по каплям, добавляли 25 мкл 2М CaCl2, перемешивая содержимое 145 пробирки носиком после каждой капли. Далее инкубировали смесь 30 мин при комнатной температуре для формирования преципитатов фосфата кальция и ДНК. После добавления полученного раствора ДНК и солей к HEK293T полученные преципитаты осаждались на монослой и поглощались клетками путем эндоцитоза. Питательную смесь меняли на следующий день. Лизис клеток проводили через 48 часов после трансфекции. Лизис клеток и иммунопреципитация. Все чашки помещали на лед, удаляли среду, промывали клетки холодным PBS и добавляли холодный буфер для лизиса (40 мМ HEPES (pH 7.5), 120 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10 мМ Na-пирофосфата, 10 мМ Na-глицерофосфата, 50 мМ NaF, 1% Triton X-100), содержащий набор ингибиторов протеаз (Roche). Объем буфера зависел от плотности клеточного слоя и диаметра чашки. Клетки соскабливали с поверхности чашки продольными движениями пластмассового шпателя, ресуспендировали клетки пипетированием и переносили суспензию в пробирки. Для повышения эффективности лизиса собранный лизат инкубировали 20 мин при 4°С на ротаторе. Растворимые фракции клеточных лизатов изолировали центрифугированием при 16,000 × g в течение 15 мин при 4°С. Для иммунопреципитации в очищенные лизаты, содержащие 1 мг тотального белка, вносили 4 мкг анти-myc антител с последующей инкубацией с ротацией в течение 90 мин при 4°С. Иммуноосаждение осуществляли 45 мкл 25% протеин G-агарозы (Pierce) (50% смолу смешивали с охлажденным PBS из расчета 1:1) в течение 1 ч при 4°С. По завершении инкубации осаждали смолу центрифугированием и удаляли супернатант. Смолу промывали четыре раза лизисным буфером. Остаточный объем буфера удаляли вакуумным отсосом через 25G иглу. К смоле добавляли 20 мкл 2Х буфера Лэммли для образцов и кипятили 5 мин при 95°С. Полученные образцы белков разделялись SDS-PAAGE, переносились на PVDF мембраны и анализировались методом Вестерн блоттинга. Сборка димера риктор/Sin1. 1×106 клеток HEK293T высаживали на 6 см чашки. На следующий день клетки 50-60% конфлюентности трансфецировали 1 мкг плазмиды pRK5-myc-rictor и 400 нг pRK5-Sin1-V5 методом осаждения ДНК фосфатом кальция. Через 24 ч инкубации меняли среду на свежую. Лизис клеток и иммунопреципитацию димеров осуществляли на второй день. Результаты и обсуждение Для выявления консервативных участков в аминокислотных последовательностях риктора нами было проведено множественное выравнивание полипептидов риктора человека, мышей, дрожжей и нематод. На рисунке 1 представлен участок полипептидной цепи риктора с высокой степенью эволюционной гомологии, окружающий сайт замены G1120E. Как видно из рисунка, мутированный у C. elegans глицин в положении 1120 (Gly-1120), является эволюционно консервированным остатком, соответствующим глицину в положении 934 (Gly-934) у человека и мышей. Рисунок 1 - Выравнивание ортологов риктора. Остаток Gly-1120 (Gly-934 у мышей и человека) консервирован среди эукариот (обведен красным пунктиром). I. C. elegans (F29C12.3), II. H. sapiens (AAS79796.1), III. M. musculus (NP_084444.3), IV. S. cerevisiae (DAA07754.1). Роль мутации G934E в составе риктора в функционировании сигнальной системы mTORС2 до настоящего момента не изучена. Не анализировано влияние мутации G934E на сборку, а также киназную активность mTORC2. В связи с этим для изучения роли мутации G934E в функционировании mTORС2 указанная аминокислотная замена была интродуцирована в кДНК риктора человека методом сайт-направленного мутагенеза. Также с целью изучения влияния типа аминокислот в положении 934 на работу комплекса mTORC2 была произведена замена Gly-934 на ряд других аминокислот (аспарагиновую кислоту, лизин, лейцин, глутамин), отличающихся своими электростатическими свойствами. 146 Как описано выше, для определения способности G934E-мутанта риктора связываться с Sin1 были созданы рекомбинантные конструкции с генами риктора и Sin1, клонированными в плазмидный вектор pRK5 в рамку считывания эпитопов myc и V5 соответственно (pRK5-myc-rictor и pRK5-Sin1V5). Для изучения взаимодействия мутантного риктора с белком Sin1 указанные рекомбинантные конструкции ко-трансфецировались в клетки HEK293T. Ко-трансфецированные рекомбинантыми конструктами pRK5-myc-rictor и pRK5-Sin1-V5 клетки HEK293T инкубировали в среде DMEM с 10% ФБС течение 48 часов. По истечении срока инкубации клетки лизировались и уровень экспрессии генов риктора и Sin1 определялся с помощью иммуноблоттинга белковых экстрактов с применением моноклональных антител к эпитопам myc и V5. В качестве отрицательного контроля использовали лизаты нетрансфецированных клеток. Результаты этих экспериментов показаны на рисунке 2. Из рисунка видно, что при использовании для трансфекции равного количества кДНК (1х) риктора дикого и мутантного типов наблюдался низкий уровень экспрессии мутантной формы по сравнению с диким типом. В связи с этим в целях оптимизации экспрессии мутантного риктора количество его кДНК, использованной для трансфекции, было увеличено в два (2х), четыре (4х) и пять раз (5х). По мере увеличения количества кДНК мутантной формы риктора наблюдается усиление ее экспрессии. Эквивалентная дикому типу экспрессия G934E-риктора в HEK293T наблюдалось при использовании пятикратного (5х) количества кДНК. Известно, что связанные риктор и Sin1 обуславливают взаимную стабильность [7]. Из рисунка 2 видно, что при низком уровне экспрессии мутантного риктора наблюдается одновременное понижение сигнала от Sin1. В связи с этим для приведения содержания Sin1 в клетках, трансфецированных мутантной формой риктора, к уровню Sin1 в клетках, трансфецированных риктором дикого типа, в отношении кДНК Sin1 были предприняты соответствующие оптимизационные меры. Рисунок 2 - Влияние мутации G934E на взаимодействие риктора с Sin1. 1х-5х – количество кДНК риктора и Sin1, использованное для трансфекции. Количество кДНК Sin1 для трансфекции было увеличено в два (2х), четыре (4х), пять (5х) раз. Уже при 2х увеличении был достигнут уровень экспрессии положительного контроля, а при 4х наступало насыщение, то есть при дальнейшем увеличении количества кДНК Sin1 существенного повышения экспресии не происходило. Таким образом, с помощью увеличения количества кДНК мутантного риктора и Sin1, использованного для ко-трансфекции HEK293T, нами была оптимизирована их экспрессия до уровня положительного контроля. Далее мы приступили непосредственно к изучению влияния глутаминовой кислоты в положении 934 в составе риктора человека на димеризацию последнего с белком Sin1. Для исследования роли Gly-934 во взаимодействии риктора и Sin1 мы проводили иммунопреципитацию G934E-формы риктора из лизатов HEK293T, ко-экспрессирующих мутантный риктор и Sin1, при помощи моноклональных антител к эпитопу тэга myc. Как видно из рисунка мутантная форма риктора ко-осаждается со значительно меньшим количеством Sin1 по сравнению с контролем. Полученные результаты указывают на то, что замена глицинового остатка в позиции 934 на глутаминовую кислоту в рикторе человека негативно влияет на способность последнего связыватся с Sin1. В результате множественного выравнивания кроме участка Gly-934 было обнаружено несколько других эволюционно консервированных аминокислот, в частности Leu-923 и Leu-943, для изучения 147 влияния на mTORC2 которых мы внедрили замены L923E и L934E в кДНК риктора человека (рисунок 1). Какова роль этих остатков в формиривании димера между риктором и Sin1? Для поиска ответа на данный вопрос консервированные остатки Leu-923 и Leu-943, отстоящие примерно на 10 аминокислот от Gly-934 в сторону N- и C-конца соответственно (см. рисунок 1), были заменены на отрицательно заряженные глутаминовые кислоты. Полученные мутантные формы кДНК-гена риктора были экспрессированы совместно с кДНК Sin1 в культуре HEK293T. Иммуноблоттинг тотальных белковых экстрактов из клеток, трансфецированными кДНК мутантного риктора показал, что оба мутанта, равно как и мутант G934E, проявили низкий уровень экспрессии в HEK293T. Для выравнивания уровней экспрессии всех компонентов была произведена оптимизация экспрессии мутантов путем увеличения количества ДНК, используемого для трансфекции, в пять раз, что отражено на рисунке 3. Результаты иммунопреципитации L923E- и L943E-форм риктора показали, что они, в отличие от мутанта G934E, оказались способны образовывать комплекс с Sin1. Было обнаружено лишь небольшое понижение качества формирования гетеродимера по сравнению с риктором дикого типа. Рисунок 3 - Влияние замен L923E и L943E на взаимодействие риктора с Sin1. 5х – количество кДНК риктора и Sin1, использованное для трансфекции. Три изученных до настоящего момента мутанта риктора (G934E, L923E, L943E) проявляли низкий уровень экспрессии. Известно, что точечные аминокислотные замены могут нарушать правильный фолдинг белков, дестабилизируя их и направляя по пути протеосомальной и/или лизосомальной деградации. Например, в случае мутантных рецепторов ЛПНП было показано, что замена единственной аминокислоты Cys-358 на тирозин приводит к нарушению пост-трансляционного созревания полипептидной цепи, усиливает лизосомальную деградацию рецептора и, в итоге, интерферирует с функциями поглощения ЛПНП клетками, приводя к гиперхолестеринемии. [8]. Результаты иммунопреципитации L923E- и L943E-форм риктора показали, что они, в отличие от мутанта G934E, оказались способны образовывать комплекс с Sin1. Было обнаружено лишь небольшое понижение качества формирования гетеродимера по сравнению с риктором дикого типа. Таким образом, три нами изученных мутанта риктора (G934E, L923E, L943E) проявляли низкий уровень экспрессии. Показано, что замена незаряженного остатка Gly-934 на отрицательно заряженную глутаминовую кислоту препятствует связыванию риктора с Sin1, тогда как такая же замена в случае Leu-923 и Leu-943 не влияет на взаимодействие этих белков. Данные результаты указывают на то, что аминокислотный остаток Gly-934 играет исключительно важную роль в формировании комплекса риктор-Sin1. Для дальнейшего исследования того, как мутация Gly-934 влияет на связывание риктора с Sin1, данный остаток был заменен на заряженные, полярные незаряженные (гидрофильные) и неполярные (гидрофобные) аминокислоты. В данном случае нас интересовало влияние аминокислот, отличающихся своими электростатическими свойствами, на формирование димера риктор/Sin1. В качестве отрицательно заряженной аминокислоты нами была выбрана аспарагиновая кислота. В качестве положительно заряженной - лизин. Для полярной незаряженной - глутамин. Для неполярной - лейцин. Электростатически мутация G934D представляет собой то же, что и G934E. Поэтому гипотетически данная замена будет обладать таким же эффектом на сборку риктор/Sin1. Лейцин, будучи неполярным, как и глицин, в положении 934 скорее всего будет повторять фенотип дикого 148 типа. Наибольший интерес представляют собой аминокислоты лизин и глутамин, влияние которых на димеризацию риктора с Sin1 с учетом имеющихся данных непредсказуемо. При анализе иммуноблотов тотальных экстрактов клеток, трансфецированных кДНК риктора дикого типа и его мутантными формами, было обнаружено, что замена Gly-934 на кислотную аспарагиновую кислоту или основной лизин фенокопирует мутацию G934E в том плане, что уровень их экспрессии снижен, а для ее оптимизации мы в пять (5х) раз увеличили количество кДНК G934D- и G934K-мутантов риктора и Sin1 (рис. 4). Иммунопреципитаты G934D- и G934K-мутантов риктора показали, что их взаимодействие с Sin1 ослаблено по сравнению с положительным контролем. Подобный эффект мутантов G934D и G934K говорит о том, что замена Gly-934 на заряженные аминокислоты препятствует связыванию риктора с Sin1. Следует отметить, что положительность и отрицательность заряда не играет в данном случае принципиального значения. Замена Gly-934 на неполярный лейцин, как и было предположено выше, не влияла ни на экспрессию риктора, ни на формирование им гетеродимера с Sin1. Рисунок 4 - Влияние типов аминокислот на взаимодействие риктор-Sin1. 1х, 5х – количество кДНК риктора и Sin1, использованное для трансфекции. В случае же полярного незаряженного глутамина было показано, что мутация G934Q проявляется как фенотип дикого типа. Иммуноблоттинг экстрактов из G934Q-трансфецированных клеток показал экспрессию, эквивалентную положительному контролю. Иммунопреципитаты данной мутантной формы риктора со-осадили такое же количество Sin1, что и дикий тип. Таким образом, приведенные данные показывают, что замена остатка Gly-934 на положительно или отрицательно заряженные, но не на незаряженные аминокислоты обладает значительным влиянием на риктор, нарушая его способность связываться с Sin1. 1. Loewith R., Jacinto E., Wullschleger S., Lorberg A., Crespo J.L., Bonenfant D., Oppliger W., Jenoe P., Hall M.N. Two TOR complexes, only one of which is rapamycin sensitive, have distinct roles in cell growth control // Mol Cell. - 2002. - Vol.10. - P.457– 468. 2. Chen C.-H., Shaikenov T., Aimbetov R., Peterson T.R., Bissenbaev A.K., Lee S.-W., Wu J., Lin H.-K., Sarbassov D.D. ER stress inhibits mTORC2 and Akt signaling through GSK-3β-mediated phosphorylation of rictor // Science Signaling. - 2011. Vol.4(161). - P.ra10. 3. Kannan N., Haste N., Taylor S.S., Neuwald A.F. The hallmark of AGC kinase functional divergence is its C-terminal tail, a cis-acting regulatory module // Proc Natl Acad Sci USA. - 2007. - Vol.104(4). - P.1272-7. 4. Sarbassov D.D., Guertin D.A., Ali S.M., Sabatini D.M. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the rictor-mTOR complex // Science. - 2005. - Vol.307. - P.1098–1101. 5. Jones K.T., Greer E.R., Pearce D., Ashrafi K. Rictor/TORC2 regulates Caenorhabditis elegans fat storage, body size, and development through sgk-1 // PLoS Biol. - 2009. - Vol.7. - P.0604-0615. 6. Soukas A.A., Kane E.A., Carr C.E., Melo J.A., Ruvkun G. Rictor/TORC2 regulates fat metabolism, feeding, growth, and life span in Caenorhabditis elegans // Genes Dev. - 2009. - Vol.23. - P.496-511. 7. Sarbassov D.D., Ali S.M., Kim D.H., Guertin D.A., Latek R.R., Erdjument-Bromage H., Tempst P., Sabatini D.M. Rictor, a novel binding partner of mTOR, defines a rapamycin-insensitive and raptor-independent pathway that regulates the cytoskeleton // Curr Biol. - 2004. - Vol.14. - P.1296–1302. 8. Martín de Llano J.J., Fuertes G., Andreu E.J., Puig O., Chaves F.J., Soutar A.K., Armengod M.E., Knecht E. A single point mutation in the low-density lipoprotein receptor switches the degradation of its mature protein from theproteasome to the lysosome // Int J Biochem Cell Biol. - 2006. - Vol.38(8). - P.1340-51. 149 *** mTOR (mammalian target of rapamycin) is an important hub kinase of growth factor and nutrient signaling. Functioning as a part of two distinct multiprotein complexes - mTORC1 and mTORC2 (mTOR complexes 1 and 2) – it regulates cell growth and proliferation. We have established that Gly-934 residue of mTORC2’s rictor plays a key role in maintaining rictor-Sin1 interaction. *** mTOR өсу факторлары мен қоректік заттардың сигналдык жуйесінің тоғысында орналаскан жəне mTORC1 жəне mTORC2 мультипротеиндік кешендерінін құрамына кіретін негізгі киназа болып табылады. Осы жұмыста mTORC2 кешеніндегі риктордың Gly-934 қалдығы риктор-Sin1 əсерлесуінде басты рөл ойнайтындығын көрсеттік. С.Ш. Асрандина, С.С.Кенжебаева, С.Д. Атабаева ҚҰРАМЫНДА КҮКІРТІ БАР ӨСУДІ РЕТТЕГІШ СИНТЕТИКАЛЫҚ РЕГУЛЯТОРЛАРДЫҢ БИДАЙДЫҢ ТҰЗДЫ ОРТАҒА ТӨЗІМДІЛІК ҚАСИЕТІНЕ ТИГІЗЕТІН ƏСЕРІ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті) Мақалада жаздық бидай «Жеңіс» сортының тұзды ортаға төзімділік қасиетіне құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10") тигізетін əсері көрсетілген. Агроөндірістік кешеннің дамуы еліміздегі азық-түлік қауіпсіздікті қамтамасыз етіп, экспорттық потенциалды дамытады. Осыған орай, республикамыздың аграрлық саласының бетпердесін анықтайтын бидай өндірісінің маңызы ерекше. Соңғы жылдары Қазақстанда төменгі сапалы астық мөлшерінің жоғарылауы байқалады. Оның басты себептеріне дəнді дақылдардың өсіру технологияларын дұрыс сақтамауы, ауыспалы егістіктің бұзылуы, қараусыз қалған егістік жерлерде қауіпті зиянкестердің көбеюі жəне карантинді арам шөптердің таралуы болып табылады. Сондай-ақ, республикамыздың бүгінгі таңдағы экологиялық, яғни қолайсыз климаттық жағдайларының (қуаңшылық, құрқақшылық, нөсер жауын, жел, боран т.б.) күннен күнге өршуі де астық сапасына теріс əсерін тигізуде. Осыған байланысты ғалымдар мен мамандардың алдында ауылшаруашылық дақылдардың қолайсыз факторларға толерантты түрлерін іздестіру; биологиялық төзімді түрлерінің физиологиялық, генетикалық жəне эпигенетикалық қасиеттерін терең зерттеу; молекулярлық жəне гендік инженерия жетістіктерін қолданып, белгілі бір факторға төзімді бидайдың жаңа сорттарын алу міндеттері қойылған. Бүгінгі таңда ауылшаруашылық практикасында өсімдіктердің өсіп дамуына əсер ететін физиологиялық ырықты заттардың, яғни өсу регуляторлардың маңызды роль атқаратындығы айқындалған. Бұл өсу регуляторлардың өсімдіктердің өсіп-даму процестеріне қолайлы əсер ететіндігімен түсіндіріледі. Кəзіргі таңдағы ауылшаруашылық ғылым саласында табиғаты фитогормондарға жатпайтын өсу регуляторлардың жаппай ашылуы орын алуда. Оның айғағы ретінде соңғы жылдары үлкен масштабта жүргізілген зерттеу жұмыстарының нəтижесінде химиялық жолмен синтезделіп алынған, өсімдікке көп жақты əсер ететін, табиғаты əр түрлі биологиялық ырықты өсу регуляторлары (эпин, крезацин, кавказ, эмистим т.б.) синтезделіп алынды. Бірқатар ТМД жəне шетел ғалымдары мен мамандардың жүргізіп отырған ізденістері нəтижесінде өсімдік шаруашылығында əр түрлі культуралардың өнімділігін жоғарылату жəне сыртқы ортаның қолайсыз (абиотикалық, биотикалық) факторларына төзімділігін арттыру мақсатында өсу регуляторларды қолдану мүмкіндігі мен олардың тиімділігі жан-жақты көрсетілген [1-5]. Əйтсе де, бүгінгі таңда өсу регуляторлардың өсімдікке тигізетін физиологиялық əсерлердің механизімдері мен заңдылықтары толық зерттелмеген əрі бұл проблема төңірегінде əлі де болса терең зерттеулерді талап етеді. Біздің зерттеу жұмысымыздың мақсаты бидай «Жеңіс» сортының тұзды ортаға төзімділік қасиетіне құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10") тигізетін əсерін зерттеу болып табылды. Зерттеу əдістері мен материалдар Зерттеу нысаны ретінде жаздық бидай «Жеңіс» сорты алынды. Бидайдың өну белсенділігін анықтау үшін тұқымдар Петри табақшаларында, температурасы 20-220С қараңғы термостатта 3-5 күн бойы өсірілді. Өскіндер арнайы кюветаларға көшіріліп, температурасы 23-250С жарық бөлмеде өсірілді. Зерттеу жұмысында бақылау варианты ретінде 0,1 µM CaSO4 ерітіндісі алынды. Бидайдың тұзға төзімділігіне синтетикалық өсу регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10") тигізетін əсерін анықтау мақсатында олардың төмендегідей концентрациялары алынды: 0,001%; 0,0001%; 0,00001%. Тұзды ортаны тудыру үшін NaCl 0,6%; 1,0% жəне 1,2 % ерітінділері қолданылды. Бидайдың өсу белсенділігін анықтау үшін 12 күндік өскіндер алынды. Зерттеу нəтижелері. Зерттеу нəтижесінде бидайдың өну қарқыны құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10") табиғаты мен концентрацияларынан тəуелді болды. Бақылау вариантына қарағанда 0,0001% Т-10 жəне 0,00001% Т-10" өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлар бидайдың өну қарқынын біршама (6,6 -13,3%) арттыратыны айқындалды. Өсуді реттегіш синтетикалық 150 регуляторларды өзара салыстырғанда 0,0001% Т-10 -ға қарағанда 0,00001% Т-10" қосылған ортада бидайдың өну белсенділігі едəуір жоғарғы (100 %) болатыны анықталды. Алайда Т-10" жоғарғы (0,001%; 0,0001%) концентрациялары бидайдың өну белсенділігін арттырмады. Бұл көрсеткіштер бақылау вариантынан біршама төмен болды. Т-10 барлық концентарциялары бидайдың өну қарқынын арттырмайтыны анықталды. Əсіресе Т-10 жоғарғы (0,001 %) концентрациясы бидайдың өнуін тежеп, ингибитр тəрізді əсер ететіні байқалды. Өсу регуляторлардың (Т-10, Т-10', Т-10") кейбір түрлері жəне олардың белгілі бір концентрациялары бидайдың тұзды ортаға (0,6 - 1,0 % NaCl) төзімділігін арттырып, оның өну белсенділігін жоғарылататыны байқалды. Мəселен, 0,6 % NaCl ерітіндісінде бидайдың өну белсенділігі 0,00001% Т-10 əсерінен 20 % артатыны, ал 1,0 % NaCl ерітіндісінде 0,0001% Т-10 əсерінен 10 % артатыны анықталды. Т-10" орташа концентрациясы (0,0001%) бидайдың тұзға (1% NaCl) төзімділігін арттырып, оның өну қарқынын 7 % жоғарыласа, ал Т-10' барлық концентрациялары бидайдың тұзға төзімділігін арттырмайтыны байқалды. Бидайдың өсу белсенділігі 12-ші тəулікте есепке алынды. Өскіндердің өсу параметрлері жəне биомассалары өлшенді. Зерттеу нəтижесінде бақылау вариантына қарағанда ортада NaCl мөлшері жоғарлаған сайын бидайдың өсу қарқыны соғұрлым тежелетіні байқалды. Барлық варианттарда (бақылау,тəжірибе) өскіндердің тамыр жүйелерінің даму қарқыны едəуір тежелетіні байқалды. Өскіндердің құрғақ биомассасының жинақталуы да осы заңдылыққа сəйкес болды. Бидайдың өсу белсенділігін құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлар (Т10, Т-10', Т-10") арттырмайтыны анықталды. Яғни, бақылау вариантымен салыстырғанда барлық тəжірибелік варианттарда бидайдың өсу қарқыны төмен болды. Əйтсе де тəжірибелік варианттарда өскен өскіндердің дұрыс өсіп-дамуы бақылау вариантында өскен өскіндерден қалыспады. Тəжірибелік варианттарды өзара салыстырғанда бидайдың өсу қарқынын Т-10 мен Т-10" төменгі (0,00001%), ал Т-10' ортаңғы (0,0001%) жəне төменгі (0,00001%) концентарциялары анағұрлым жоғарылататыны анықталды. Барлық тəжірибелік варианттарда өскіндердің тамыры мен жер үсті мүшелерінің құрғақ биомассаларының жинақталуы да осы заңдылыққа сəйкес болды. Т-10' жоғарғы концентрациясы бидайдың өсуін тежеп, ингибитрлік қасиетін танытты. Бидайдың тұзға төзімділігі ортадағы синтетикалық регуляторлардың табиғатынан жəне олардың концентрацияларынан тəуелді болды. Т-10 төменгі (0,00001%) концентрациясы ортаның тұздылығын (0,6-1,2% NaCl) тежеп, өскіндердің өсу қарқынын едəуір жоғарылататыны айқындалды (Сурет 1). T-10 0,00001%+1,2% NaCI T-10 0,00001%+1% NaCI T-10 0,00001%+0,6% NaCI T-10 0,0001%+1,2% NaCI T-10 0,0001%+1% NaCI T-10 0,0001%+0,6% NaCI T-10 0,001%+1,2% NaCI T-10 0,001%+1% NaCI T-10 0,001%+0,6% NaCI 1,2% NaCI 1% NaCI 0,6% NaCI 0 тамыр 5 10 15 20 25 см / өсімдік мүшесі жер үсті мүшелері Сурет 1 - Тұзды ортада бидайдың өсу қарқынына Т-10 тигізетін əсері Əсіресе 0,6 % NaCl əсерін тежеп, бақылау вариантымен салыстырғанда бидай өскіндерінің тамыры мен жер үсті мүшелерінің екі есе ұзарып өсуіне оптималды жағдай тудыратыны анықталды. Бидай өскіндерінің ылғал жəне құрғақ биомассаларының жинақталуы да осы заңдылыққа сəйкес болды. Яғни, Т-10 барлық төменгі концентрациялары бидайдың құрғақшылыққа төзімділігін арттырып, бидай өскіндерінің биомассаларының бақылау вариантына қарағанда жоғары мөлшерде жинақталуына қолайлы жағдай тудыратыны анықталды. 151 T-10′ 0,00001%+1,2% NaCI T-10′ 0,00001%+1% NaCI T-10′ 0,00001%+0,6% NaCI T-10′ 0,0001%+1,2% NaCI T-10′ 0,0001%+1% NaCI T-10′ 0,0001%+0,6% NaCI T-10′ 0,001%+1,2% NaCI T-10′ 0,001%+1% NaCI T-10′ 0,001%+0,6% NaCI 1,2% NaCI 1% NaCI 0,6% NaCI 0 тамыр 5 жер үсті мүшесі 10 15 20 см / өсімдік мүшесі Сурет 2 - Тұзды ортада бидайдың өсу қарқынына Т-10' тигізетін əсері Т-10' ортаңғы (0,0001%) концентрациясы бидай өскіндерінің 0,6 % NaCl тигізетін əсеріне төзімділігін арттырып, бидайдың өсу қарқынын едəуір арттыратыны байқалды. Сонымен қатар, Т-10' концентрациясы неғұрлым төмендеген сайын, соғұрлым бидай өскіндердің тамырларының қарқынды өсуі орын алатыны байқалды (сурет 2). T-10" 0,00001%+1,2% NaCI T-10" 0,00001%+1% NaCI T-10" 0,00001%+0,6% NaCI T-10" 0,0001%+1,2% NaCI T-10" 0,0001%+1% NaCI T-10" 0,0001%+0,6% NaCI T-10" 0,001%+1,2% NaCI T-10" 0,001%+1% NaCI T-10" 0,001%+0,6% NaCI 1,2% NaCI 1% NaCI 0,6% NaCI 0 тамыр 5 10 15 20 см/өсімдік мүшесі жер үсті мүшесі Сурет 3 - Тұзды ортада бидайдың өсу қарқынына Т-10" тигізетін əсері 0,6 % NaCl ортасында өскіндердің ылғал жəне құрғақ биомассаларының қарқынды жианқталуына Т-10' ортаңғы (0,0001%) концентрациясы қолайлы жағдай туғызды. Сондай-ақ, тұзды орталарда бидай тамырларының қарқынды өсуі мен ылғал жəне құрғақ биомассаларының қарқынды жинақталуына Т-10' төменгі (0,00001%) мөлшері оптималды болатыны анықталды. Т-10' жоғарғы мөлшері тұздылығы əр түрлі орталарда тамырлардың өсу қарқынын бірдей деңгейде тежейтіні байқалды. Бидайдың өсу қарқынына Т-10" оңтайлы əсері онша байқалмады. Əйтсе де, тұздылығы əр түрлі орталарда Т-10" жоғарғы концентарциясы бидай өскіндердің тамырларының ұзарып өсуіне едəуір ықпал ететіні байқалды. Ал Т-10" төменгі концентарциясы бидайдың 0,6-1,0 % NaCl əсеріне төзімділігін арттыратыны, ал Т-10" ортаңғы концентарциясы ортадағы тұздың мөлшері жоғарылаған сайын бидайдың төзімділігін тежейтіні анықталды (Сурет 3). Бидай өскіндерінің ылғал жəне құрғақ билмассаларының жинақталуы осы заңдылыққа сəйкес болады. 152 Қорыта айтқанда, бидай «Жеңіс» сортының өніп-өсу белсенділігі ортадағы NaCl мөлшерінен тəуелді болды. NaCl концентрациялары неғұрлым жоғарылаған сайын, бидайдың өніп-өсу қарқыны төмендейтіні анықталды. Құрамында күкірті бар өсуді реттегіш синтетикалық регуляторлардың Т10 ортаңғы (0,0001%) жəне Т-10" төменгі (0,00001%) концентрациялары бидайдың өну белсенділігін анағұрлым арттыратыны айқындалды. Ал бидайдың өсу қарқынын арттырмайтыны анықталды. Əйтсе де тəжірибелік варианттарда бидайдың өсіп-дамуы бақылау вариантында өскен өскіндерден қалыспады. Тəжірибелік варианттарды өзара салыстырғанда бидайдың өсу қарқынын Т-10 мен Т-10" төменгі (0,00001%), ал Т-10' ортаңғы (0,0001%) жəне төменгі (0,00001%) концентарциялары анағұрлым жоғарылататыны анықталды. Тұзды ортада Т-10 орташа жəне төменгі, ал Т10" төменгі концентрациялары бидайдың өну белсенділігін арттыратыны анықталды. Ал бидайдың өсу қарқынына Т-10 мен Т-10" төменгі, ал Т-10' ортаңғы жəне төменгі концентарциялары оптималды жағдай тудыратыны анықталды. 1. Громов, А.А. Эффективность регуляторов роста и биопрепаратов на озимой пшенице и просе / А.А. Громов, В.Б. Щукин, В.Н. Варавва // Земледелие.- 2005.- № 6.- С. 34-35. 2. Щукин, В.Б. Эффективность обработки семян озимой пшеницы физиологически активными веществами и биопрепаратами / В.Б. Щукин, А.А. Громов, Н.В.Щукина // Земледелие.- 2007.- № 6. – С. 32. 3. Шаповал О.А. Формирование урожая озимой пшеницы при обработке регуляторами роста // Плодородие. 2004 .№3(18). с. 16. 4. Тарасенко С.А., Дорошкевич Е.И., Тарасенко B.C. Влияние стимуляторов роста растений на урожай и качество сельскохозяйственных культур. Тез. док. VI Междунар, конференц. «Регуляторы роста и развития растений». -М.: Изд-во МСХА, 2001. с. 280. 5. Немченко В.В. Применение регуляторов роста для повышения устойчивости растений к неблагоприятным условиям произрастания. Тез. док. VI Междунр. конференц. «Регуляторы роста и развития растений». М.: Изд-во МСХА, 2001.-с. 263. *** В работе изучено влияние серосодержащих синтетических регуляторов роста (Т-10, Т-10', Т-10") на солеустойчивость яровой пшеницы сорта «Женис». Выявлены влияние регуляторов роста на прорастание, рост и развитие пшеницы в условиях засоления. *** In work influence synthetic regulators of growth (Т-10, Т-10 ', Т-10 ") on salt-endurance of spring wheat of a grade of "Zhenis"is studied. Influence of regulators of growth on germination, growth and and development of wheat in the conditions of salinization. С.Д. Атабаева, С.С. Кенжебаева. ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ ДЛЯ ФИТОРЕМЕДИАЦИИ (Казахский национальный университет им.аль-Фараби) В настоящей работе проведен обзор литературных данных последних лет о возможностях применения трансгенных растений для фитореммедиации почв, загрязненных тяжелыми металлами. Приведены данные литературы о возможности получения ряда растений-трансформантов, обладающих повышенной способностью аккумулировать во внутриклеточных структурах (преимущественно в вакуолях) и в межклеточном пространстве конъюгаты эндогенных соединений с токсикантами. Генноинженерные работы, направленные на повышение эффективности фиторемедиационных свойств раcтений, особенно интенсивно ведутся в течение последних лет. Манипуляция экспрессией фермента γ-глутамил-Цис-синтетазы, включающегося в синтез глутатиона и фитохелатинов, может быть отличным подходом для повышения устойчивости растений, так как фермент фитохелатинсинтаза не может являться лимитирующим фактором для синтеза фитохелатинов из-за конститутивной экспрессии в растениях и активированием присутствием металлов. Регуляция синтеза глутатиона способствует аккумуляции тяжелых металлов и увеличению устойчивости трансгенных растений. Приведены данные литературы о возможности использования гена фермента глутатион-Sтрансфераза для создания трансгенных растений. Фиторемедиация за последнее десятилетие из концептуального методологического подхода превратилась в экологически важную, конкурентоспособную коммерческую технологию для очистки окружающей среды от органических и неорганических токсичных соединений. Для разных фиторемедиационных приемов, используемых на практике, таких как фитоэкстракция, ризодеградация (совместное действие микроорганизмов и растений), фитодеградация, фитостабилизация, ризофильтрация и др., которые уже используются в практических целях, крайне важный фактор для успешной реализации этих технологий - наличие подходящих растений, активно усваивающих токсиканты. Эффективность процессов фиторемедиации в значительной степени определяется способностью самого растения усваивать и накапливать в клеточных структурах токсиканты. Прогресс, связанный с фиторемедиацией окружающей среды, загрязненной органическими токсикантами, по своей масштабности значительно превосходит аналогичные процессы, связанные с усвоением неорганических токсикантов и радионуклидов. Это объясняется долговременной селекцией подходящих для этого процесса растений, приспособленностью к конкретной почвенно-климатической 153 зоне, урожайностью, способностью накапливать большую биомассу, наличием соответствующих физиологических (способность к транспирации) и морфологических (развитая корневая система) характеристик, адаптацией к полевым условиям, наличием соответствующих ферментных систем и др. Указанные выше качества и, возможно, некоторые другие обусловливают усвоение и глубокую деградацию органических токсикантов растениями, т.е. именно ими определяется фиторемедиационный потенциал растений. В этом направлении достигнут вполне определенный прогресс клонированием генов. Уже получен ряд растений-трансформантов, обладающих повышенной способностью аккумулировать во внутриклеточных структурах (преимущественно в вакуолях) и в межклеточном пространстве конъюгаты эндогенных соединений с токсикантами. В этом направлении исследования интенсивно развиваются во многих странах мира [1]. Около двух десятков лет широко обсуждается возможность использования растений для очистки почв, грунтовых вод и водоемов от неорганических токсикантов. Судя по достигнутым результатам, несомненно, что фитоэкстракция тяжелых металлов в условиях in situ является наиболее дешевой, не затрагивающей структуры почвы технологией, которая все больше привлекает внимание как ученых, так и практиков-аграриев, а также экологов. В литературе описаны растения-трансформанты, характеризующиеся повышенной фитоэкстракционной способностью. Генно-инженерные работы, направленные на повышение эффективности фиторемедиационных свойств раcтений, особенно интенсивно ведутся в течение последних лет. Первые широкомасштабные полевые исследования были проведены в начале 2000 г. в США. Наиболее значимые работы по получению рекомбинантных растений, а их уже накопилось свыше 100, осуществлялись в разных направлениях. Предполагают, что фиторемедиация коммерциализировалась бы очень быстро, если поглощающая способность растений гипераккумуляторов, как T. caerulescens, трансформировалась к высокопродуктивной культуре, как Indian mustard (Brassica juncea) или кукуруза (Zea mays). Биотехнология была успешно применена для манипуляции процессами поглощения металлов и свойствами устойчивости у нескольких видов. Например, у табака (Nicotiana tabacum) увеличивалась устойчивость к металлу при экспрессии генов синтеза металлотионеинов и других металлсвязывающих белков. Для определения лимитирующих факторов для аккумуляции тяжелых металлов и устойчивости и для получения устойчивых трансгенных растений с повышенной способностью аккумулировать металлы, ген Escherichia coli gshii, кодирующий ГС, был активирован в цитозоле индийской горчицы [2]. Трансгенные растения накапливали значительно больше металла, чем дикий вид: концентрация Сd в надземных органах была выше на 25%. Тем не менее, эти растения показали повышенную устойчивость к Сd на стадии проростков и в стадии зрелости. Аккумуляция Сd и устойчивость коррелировала с уровнем экспрессии гена gshi. Обработанные кадмием растения содержали большее количество глутатиона, фитохелатины, тиолов, S и Са по сравнению с диким типом. Авторы пришли к выводу, что в присутствии Сd фермент (ГС) является лимитирующим фактором для биосинтеза глутатиона и фитохелатины. Сверхэкспрессия ГС является перспективной стратегией для производства растений с супер-способностями, необходимыми для фиторемедиации. Восстановленный глутатион GSH играет важную роль в защите растений от различных стрессов. Глутатион является не только субстратом для глутатион-S-трансферазы, нейтрализующей потенциально токсичные ксенобиотики [3], но также является восстановителем дегидроаскорбата [4]. Более того, GSH является предшественником фитохелатинов. Фитохелатины содержат высокий процент Цис-сульфгидрильных остатков, которые связывают и изолируют ионы в стабильных комплексах и индуцируются такими металлами, как Сd, во всех испытанных растениях [2, 5]. Глутатион синтезируется из составляющих его АК в 2 последовательностях, АТФ-зависимая реакция катализировалась γ-глутамил-Циссинтетазой (ГЦС) и γ-глутатион-синтетазой (ГС), соответственно. Фитохелатин-синтаза последовательно катализирует элонгацию (γ-Глу-Цис) n переносом γ -Глу-Цис-группы на глутатион или фитохелатины [6]. Манипуляция экспрессией ферментов, включающихся в синтез глутатиона и фитохелатинов, может быть отличным подходом для повышения устойчивости растений. Фермент фитохелатинсинтаза не может являться лимитирующим фактором для синтеза фитохелатинов из-за конститутивной экспрессии в растениях [7] и активированием присутствием металлов (рисунок). Гены, кодирующие ферменты, включающиеся в синтез глутатиона, являются более перспективными в этом отношении. Лимитирующей стадией для синтеза глутатиона в отсутствие металлов является реакция, катализируемая γ-глутамил-Цис-синтетазой, потому что активность этого фермента регулируется глутатионом путем обратной связи и зависит от доступности Цис. Сверхэкспрессия у E.coli гена gshi, кодирующего γ-глутамил –Цис-синтетазу повышал уровень глутатиона у тополя [4]. Более того, экспрессия у томата γ-глутамил –Цис-синтетазы может восстанавливать устойчивость глутатион-дефицитного мутанта арабидопсиса cad2. Тем не менее, сверхэкспрессия этого гена не повышала устойчивость к Cd дикого типа арабидопсиса. 154 В норме ГС не является лимитирующим фактором, так как содержание глутатиона не изменяется сильно вследствие невысокой концентрации фитохелатинов. Сверхэкспрессия гена E.coli gshii, кодирующего ГС, не увеличивала уровень глутатиона у тополя [8]. Тем не менее, в присутствии тяжелых металлов регуляция биосинтеза глутатиона подвергается значительным изменениям. Тяжелые металлы активируют фитохелатин-синтазу и таким образом индуцируют биосинтез фитохелатинов, в результате чего снижается уровень глутатиона [9]. Последовательно, путем обратной связи снимается ингибирование γ-глутамил-Цис-синтетазы глутатионом. Более того, экспрессия γ-глутамил-Циссинтетазы может повышаться тяжелыми металлами. Было продемонстрировано, что Cd увеличивает транскрипцию гена γ-глутамил-Цис-синтетаза и дезактивирует ГС. Происходит снижение глутатиона и аккумуляция его ингибируется γ-глутамил-Цис за счет снижения активности ГС [10]. Экспозиция корней кукурузы в присутствии Cd вызывала снижение содержания глутатиона и накопление γглутамил-Цистеина за счет снижения активности ГС. Поэтому ГС может стать лимитирующим фактором для биосинтеза глутатиона и фитохелатинов [11]. Сверхэкспрессия гена gshii может увеличить содержание глутатиона и синтез фитохелатинов (рисунок 1). В результате сверхэкспрессии гена E.coli gshii у индийской горчицы происходило увеличение содержания глутатиона и фитохелатинов, а также увеличивалась аккумуляция Cd и устойчивость растений. В корнях Cd-обработанных растений дикого типа содержание глутатиона было в 3 раза ниже, чем у контрольных растений за счет увеличения синтеза фитохелатинов. трансгенных растений по сравнению с диким типом. В тканях трансгенных растений содержание глутатиона было одинаковым у обработанных и необработанных растений, хотя уровень фитохелатинов в корнях и надземных органах трансгенных растений было в 2 раза больше, чем у дикого типа. Так как корни являются главным местом синтеза фитохелатинов, наблюдалось снижение глутатиона у дикого типа в корнях, но не в надземных органах. Кадмий увеличивал содержание тиоловых групп в корнях трансгенных растений в 10 раз и только в 3 раза в надземных органах, что является лучшим объяснением устойчивости трансгенных растений как результат увеличения синтеза фитохелатинов. Тяжелые металлы активирование Фитохелатин-синтаза активирование Биосинтез фитохелатинов Снижение содержания глутатиона Синтез глутатиона γ-глутамил-Циссинтетаза (ГЦС) γ-глутатион-синтетаза (ГС) Экспрессия гена gshi (ген γ-глутамил-Цис-синтетазы) Экспрессия гена gshii (ген γ-глутатион-синтетазы) Рисунок 1 – Схема регуляции синтеза фитохелатинов в растениях 155 Высокий уровень глутатиона в корнях у трансгенных растений обусловливал большую устойчивость к кадмию. Cd-ФХ комплексируется в вакуолях с сульфидными группами. Предполагают, что устойчивость к металлам может лимитироваться доступностью серы для Цис и синтезом сульфидов [12]. Уровень общей серы был в надземных органах выше у Кадмий значительно снижал концентрацию Са у диких и трансгенных растений, но сверхэкспрессия гена ГС уменьшала уровень снижения Са в надземных органах. В корнях содержание Са не сильно различалось у трансгенных растений и у дикого типа. Cd является блокиратором кальциевых каналов, мешает связыванию Са с кальмодулином, белком, который регулирует активность многих ферментов и клеточных процессов [13]. Увеличение уровня Cd-связанного пептида у трансгенных растений может снижать эффективность кадмия на взаимодействие с кальцием. Трансгенные растения накапливали больше Cd в надземных органах. Транслокация Cd из корней в надземные органы по ксилеме обеспечивалась транспирационным током [14]. Чем больше Cd связывается с фитохелатинами и запасается в вакуолях у трансгенных растений, тем меньше подвергаются разрушению жизненно важные биохимические и физиологические процессы. Это ведет к увеличению поверхности листьев, следовательно, большей аккумуляции Cd (как результат увеличения транспирации).Трансгенные растения поглощают больше кадмия из-за меньшего повреждения поверхности корней. Поглощение воды является первичным механизмом увеличивающим движение Cd по растению [12]. Высокий уровень фитохелатинов в корнях у трансгенных растений снижает негативный эффект Cd на поглощение воды. Итак, манипуляция экспрессией генов синтеза глутатиона может стать одним из подходов к увеличению фитоэкстракции тяжелых металлов и повышению устойчивости растений. Таким образом, регуляция синтеза глутатиона способствует аккумуляции тяжелых металлов и увеличению устойчивости трансгенных растений. Трансгенные растения позволяют увеличивать эффективность фитоэкстракции тяжелых металлов из загрязненных сред. Манипуляция экспрессией генов синтеза глутатиона может стать одним из подходов к увеличению фитоэкстракции тяжелых металлов и повышению устойчивости растений. Эффективным применением биотехнологии для восстановления окружающей среды является биоинженерия растений, способных улетучивать ртуть из почв, загрязненных метил–ртутью. Метилртуть, сильный неотоксикант, синтезируется на ртуть-загрязненных почвах. Для детоксикации этого токсина используют трансгенные растения арабидопсиса или табака. В них были экспрессированы гены merB и merA. В этих модифицированных растениях merB катализировал протонолиз углеродртути, связанный с генерацией Hg2+ в менее мобильный ртуть. Последовательно, merA превращает Hg (II) в Hg0 - летучий элемент, который выделяется в атмосферу. Хотя на западе регулирующие законы ограничивают использование модифицированных растений merB и merA, это исследование иллюстрирует огромный потенциал биотехнологии для восстановления окружающей среды. Относительно законов, ограничивающих использование улетучивания ртути Bizil с сотр. (1977) [цит. по 1] продемонстрировал, что растения с экспрессированными MerBpe (органомеркуриал-лиаза под контролем промотора растений) может быть использована для деградации метил-ртути и последовательно извлекать ионную форму ртути через экстракцию. Несмотря на преимущества биотехнологии, мало известно о генетике растений гипераккумуляторов. В частности, наследуемость подобных механизмов, как металл-транспорт и аккумуляция и устойчивость к металлам должны быть лучше поняты. R.Chaney предлагает использовать традиционные селекционные подходы для улучшения процессов фиторемедиации и возможно объединенных полевых тестов на металлустойчивость и поглощение тяжелых металлов в высоко продуктивность биомассы растений. Например, Е.Р.Brewer с сотр. (1997) генерировал соматические гибриды между T.caerulescens (Zn-гипераккумулятор) и Brassica napus (канола), полученный гибридной селекцией для Zn-устойчивости. Были получены гибриды с большой биомассой со сверхустойчивостью к цинку. Авторы прилагают усилия для сбора и коллекции гермоплазмы растений-аккумуляторов [цит. по 1]. Среди большого разнообразия растений, перспективных для фиторемедиации особое внимание заслуживает тополь (Рорulus), в силу мощной корневой системы, обладающий большой поглощающей способностью. Многообразные генно-инженерные модификации этого растения убеждают в целесообразности практического использования ряда полученных траисформантов. Одна из таких работ посвящена обогащению генома тополя бактериальным геном, кодирующим синтез γглутамицистеин синтетазы (ГЦС) (К.Ф. 6.З.2.2), которая служит ключевым ферментом в процессе биосинтеза глутатиона. Глутатион-S-трансфераза — широко распространенный в растениях фермент, который принимает участие как в нормальных метаболических процессах растительной клетки, так и в защите 156 растений от стрессовых ситуаций. Часто при создании трансгенных растений для фиторемедиации мишенью является ген именно этого фермента [цит. по 1]. Если попытаться представить, каким должно быть идеальное, с экологической точки зрения, растение, то, очевидно, картина выглядела бы следующим образом: такое растение, обладая длинной, хорошо развитой корневой системой и сильным транспирационным током, должно интенсивно образовывать биомассу, а эта растительная биомасса должна характеризоваться толерантностью по отношению к органическим и неорганическим токсичным соединениям. Кроме того, такое растение в обязательном порядке должно быстро образовывать конъюгаты и располагать соответствующим потенциалом (емкостью) для их складирования в клеточных структурах и апопласте [цит. по 1]. Краткий обзор генно-инженерных работ, проводимых в этой области, указывает на то, что в ряде случаев в трансгенных растениях отмечается существенное повышение детоксикационной способности. Об этом свидетельствует тот факт, что некоторые трансгенные растения отличаются повышенной способностью ассимиляции органических токсичных соединений и способностью поглощения тяжелых металлов. Очевидно, эти работы будут продолжены и в ближайшем будущем и, несомненно, результаты будут более существенными, с точки зрения их практической реализации. 1. Квеситадзе Г.И., Хатисашвили Г.А., Садунишвили Т.А., Евстигнеева З.Г. Метаболизм антропогенных токсикантов в высших растениях. – М.: Наука. 2005. – 197 с. 2. Zhu Y.L., Pilon-Smits E.A.H., Jouanin L., Terry N. Overexpression of glutatione cynthetase in Indian mustard enhances cadmium accumulation and tolerance // Plant Physiol. – 1999. – Vol. 119. – P. 73-80. 3. Foyer C.H., Haliwell B. The presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: a proposed role in ascorbic acid metabolism // Planta. - 1976. – Vol. 133. – P. 21-25. 4. Marrs K. The functions and regulation of glutathione S-transferases in plants // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1996. – Vol. 47. – P.127-158. 5. Zenk M.H. Heavy metal detoxification in higher plants: a review // Gene. – 1996. – Vol. 179. – P. 21-30. 6. Chen J., Zhou J., Goldsbrough P.B. Characterization of phytochelatin synthase from tomato // Physiol Plant. – 1997. – Vol. 101. – P. 165-172. 7. Steffens J.C. The heavy metal-binding peptides of plants // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1990. – V. 41. – Pp. 553-575. 8. Foyer C.H., Souriau N., Perret S., Lelandais M., Kunert K.J., Pruvost C., Jouanin L. Over-expression of glutathione reductase but not glutathione synthetase leads to increases in antioxidant capacity and resistance to photoinhibition in poplar trees // Plant Physiol. – 1995. – Vol. 109. – P. 1047-1057. 9. Schneider S., Bergmann L. Regulation of glutathione synthesis in suspension cultures of parsley and tobacco // Bot Acta. – 1995. – Vol. 108. – P. 34-40. 10. Rauser W.E., Schupp R., Rennenberg H. Cysteine, γ-glutamylcysteine and glutathione levels in maize seedlings. Distribution and translocation in normal and cadmium-exposed plants // Plant Physiol. – 1991. – Vol. 97. – P. 128-138. 11. Goldbrough P.B. Metal tolerance in plants: the role of phytochelatins and metallothioneins // Phytoremediation of Trace elements (Eds N.Terry, G.S.Banuelos). – Ann. Arbor. Press., Ann. Arbor, MI, 1998 – 386 p. 12. Cheung W.Y. Calmodulin: its potential role in cell proliferation and heavy metal toxicity // Fed. Proc. - 1984. – Vol. 43. – P. 2995-2999. 13. Marchiol L., Leita L., Martin M., Peressotti A., Zerbi G. Physiological responses of two soybean cultivars to cadmium // J. Environ. Qual. – 1996. – Vol. 25. – P. 562-566. 14. Petit C.M., van de Geijn S.C. In vivo measurements of cadmium (115 mM Cd) transport and accumulation in steams of intact tomato plants (Lycopersicon esculentum Mill). I. Long distance transport and local accumulation // Planta. – 1978. – Vol. 138. – P. 137-143. *** It was reviewed the literature in recent years about the potential use of transgenic plants to phytoremmediation soils contaminated by heavy metals. The possibility of obtaining a number of plant transformants with increased ability to accumulate in intracellular structures (mainly in the vacuoles) and in the intercellular space of conjugates of endogenous compounds with toxicants was shown. Genetic engineering research works to improve the metal accumulation ability of plants are conducting intensively , especially in recent years. Manipulation of the expression of enzymes like as γ-glytamyl -Cys-synthetase involved in the synthesis of glutathione and phytochelatins can be an excellent approach for improving plant resistance, as phytochelatins synthase enzyme may not be a limiting factor for the synthesis of phytochelatins by constitutive expression in plants. Regulation of glutathione synthesis promotes the accumulation of heavy metals and increase the tolerance of the transgenic plants. The possibility of using gene of the enzyme glutathione-S-transferase to create transgenic plants it was shown. *** Осы жұмыста соңғы жылдардың əдебиеттерін қолданып, трансгендік өсімдіктерді фиторемедиацияда қолдану мүмкіндіктері көрсетілген. Металл жинақтайтын қабілеті жоғары, металдарды клетканың ішіндегі органеллаларда /вакуольде/ жəне клетка аралық кеңістігінде токсиканттардың жəне эндогендік қосындылардың конъюгаттары түрінде жинақтайтын өсімдіктердің трасформанттарын алу мүмкіндіктері сипатталған. Соңғы жылдарда генді-инженерлік жұмыстар қарқынды жүріп жатыр. Глутатион мен фитохелатиндердің синтезіне қатысатын ферменттің γ-глутамил-Цис-синтетазаның гендерінің манипуляциясы өсімдіктердің ауыр металдарға тұрақтылығын жəне олардың металл жинақтайтын қабілетін жоғалатуға жол береді. Фитохелатинсинтазаның синтезінің гені шектейтін факторға жатпайды, себебі ол конститутивті болып келеді. Глутатион синтезінің реттелуі ауыр металдардың жинақталуына жəне тұрақтылығына əсер етеді. Трансгендік өсімдік алу үшін глутатион-S-трансфераза ферментін қолдану мүмкіндігі туралы əдебиеттер келтірілген. 157 Ж.М. Басыгараев, С.А. Ибрагимова, Ə.Е. Ережепов, Ж.Б. Тулегенова, Е.Т. Абылайханов ЦИТОКИНИН МЕДИАТОРЫНЫҢ ФИЗИОЛОГИЯЛЫҚ БЕЛСЕНДІЛІГІН БИОТЕСТ КӨМЕГІМЕН ЗЕРТТЕУ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті) Мақалада келтірілген мəліметтер бойынша қандай да болмасын биореттегішке ең алдымен биотест арқылы зерттеу жүргізу керек. Осы биотест арқылы биореттегішті реттегіштердің ішіндегі қай типті гормонға жататындығын анықтауға болады. Сол себептен біз цитокинин медиаторының өсімдіктерге əсерін бірнеше биотест арқылы зерттедік. Биотесттің көмегімен өсімдіктердің - апикальды доминанттылық əсерін жою. Барлық фитогормондардың ішінде тек қана цитокининнің əсерінен осы биотест орындалады. Апикальды доминаттылық - сабақтың ең ұшындағы бүршіктің болуымен сипатталады [1,2]. Бұл бүршік өсіп тұрған жағдайда ешқандай қосымша жапырақтар мен қосымша сабақтар негізгі сабақтан өсе алмайды. Егер жоғары ұшындағы бүршікті алып тастасақ фитогормондардың ішінде, тек қана цитокининнің əсерімен қосымша жапырақтар мен сабақтар пайда бола алады [3,4]. Осы биотестті жүргізу үшін біз 50 нг/мл цитокинин медиаторы бар ерітіндісімен паралонды ылғалдандырып, паралон кесегімен ұшындағы бүршігі алынған тірі өгейбұта өсімдігінің сабағын əр күн сайын, бір рет 1 апта мерзіміндеде сүртіп отырдық. Алынған нəтижелер 1-суретте көрсетілген. Суреттен көргендеріңіздей 2 апта ішінде жаңа екі қосымша сабақ пен жапырақтардың өскені байқалды. Қорыта келгенде, біздің зерттеуге алған биореттегішіміздің биотест арқылы физиологиялық қасиеттеріне қарап, цитокининдердің қатарына жатқызуға болатындығына көз жеткіздік. Біз жоғары сатыдағы өсімдіктерден алынған цитокинин медиаторына бірнеше рет биотест жасадық. Екінші жасаған тəжірибеміз ол өсімдіктерді тамырландыру биотесті. Тəжірибе жасау үшін біз келесі заттардың əсерін зерттедік. Өсімдіктерді тамырландыру үшін көп қолданылатын ауксин жəне физиологиялық өте активті жасанды цитокинин 6-бензилоаминопурин затын алдық жəне өнген бидайдан бөліп алынған цитокинин медиаторының əртүрлі концентрациясы алынды. Бірнеше рет жүргізілген тəжірибелік сынақтың нəтижесінде, көптеген өсімдіктердің ішінен біз жылдам жəне жақсы тамыр беретін өсімдікті тəжірибе арқылы таңдап алдық. Ол өсімдік құлақшалы сингониум Syngonium auritum өсімдігі. Құлақшалы сингониум Syngonium auritum басқа өсімдіктерге қарағанда бір жұма ішінде тамырлана алады. В А Е с к е р т у: Өгейбұта Euonymus verrucosa өсімдігінің апикальды басымдылығын жоюға биореттегіштің əсері. А – биореттегішпен 50 нг/мл сабағы өңделген, B - бақылау. Қолтық бүршігінен қосымша сабақ пен жаңа жапырақтардың өсуі сызықшамен көрсетілген. Тəжірибе мерзімі 2 жұма күніне 1 рет цитокинин медиаторы ерітіндісімен ұшындағы бүршігі алынған сабаққа əсер етілді. Cурет 1 - Өгейбұта Euonymus verrucosa өсімдігінің қосымша сабағы мен жапырақтарының дамуына цитокинин медиаторының əсері 158 Осы тəжірибені жүргізу үшін 5 вариант алынды. 1 - ші вариантқа су, 2 - ші 20 мкг/мл ИСҚ, 3 – вариантқа 6 - БАП (20 мкг/мл), 4 - ші вариантқа 10 нг/мл цитокинин медиаторы, 5-вариантқа 50 нг/мл цитокинин медиаторы, 6 - вариантқа 100 нг/мл цитокинин медиаторын қостық. Тамырландыруға əсер ететін заттардың əсерін 2-суреттен көруге болады. 1- суретте көрсетілген нəтижелерден төмендегідей қорытынды жасадық. Биореттегіштерге қатысты жүргізілген тəжірибелердің ішінде көп қолданылатын классикалық тамырландырушы агент болып табылатын ауксиннің əсерінен тек қана кішкентай қосымша тамырлардың көрінгені байқалды. Осындай нəтижені 6-БАП-тың əсерінен де байқауға болады. 10 нг/мл цитокинин медиаторында тамырдың өсуі байқалды, ал 50 нг/мл вариантында тамырлардың өсуі өте жоғары болды. Ал, 100 нг /мл алғанда ешқандай тамырлану байқалмайды. Е с к е р т у: Ауксиннің, 6-БАП-тың, цитокинин медиаторының əртүрлі концентрацияларының құлақшалы сингониум Syngonium auritum өсімдігінің жапырақ тақшаларын тамырландыруына əсері. 1 бақылау, 2 – ауксин (20 мкг/мл), 3 – 6 - БАП (20 мкг/мл), 4 - 10 нг/мл ЦМ өңделген, 5 - 50 нг/мл ЦМ өңделген, 6 - 100 нг/мл ЦМ өңделген. Алынған заттардың ертінділеріне құлақшалы сингониумның жапырағын 12 сағатқа малынды жəне жəй суға салынды. Тəжірибе мерзімі 7 күн. Cурет 2 - Ауксиннің, 6-БАП-тың, цитокинин медиаторының əртүрлі концентрацияларының құлақшалы сингониум Syngonium auritum өсімдігінің жапырақ тақшаларын тамырлануына əсері Осы салыстырмалы зерттеуден келесі қорытынды жасауға болады. Цитокинин медиаторының тамырландыру күші ауксинмен салыстырғанда əлдеқайда жоғары болды жəне цитокинин медиаторының оптимальды концентрациясы 50 нг/мл. Цитокинин медиаторының тамырландыру күші ауксин мен 6-БАП – қа қарағанда жоғары болды. Тағы бір көңіл аударатын жағдай цитокинин медиаторы ауксин мен 6-БАП-қа қарағанда 1000 есе аз мөлшерде əсер етеді. Цитокинин медиаторының əсер етуі жалпы фитогормондардың заңдылығына сəйкес ол фитогормондардың тым аз жəне тым көп мөлшері өсімдіктің өсуін тежейді. 1. Гильманов М.К., Фурсов О.В., Францев А.П. Методы очистки и изучения ферментов растений. - Алма-Ата: Наука, 1981. - С.91. 2. Гильманов М.К., Колдасова А.С., Шалахметова Г.А., Цветкова Б.М., Колдасова Ш.С. Методы изучения ферментного комплекта [МДГ+ГОАТ] осуществляющего необративные расщепление глютамата зерна пшеницы. – Алматы, 1999. - С.93-98. 3. Nakayama S., Kawasaki H., Kretsinger R. Evolution of EF-hand proteins. In: Carafoli E, Krebs J, editor. Calcium Homeostasis // Springer. – 2000. – P. 29–58 4. Oecking C., Eckerskorn C., Weiler E.W. The fusicoccin receptor of plants is a member of the 14-3-3 superfamily of eukaryotic regulatory proteins // FEBS Lett. – 1994. - Vol.352. – P.163–166. 159 Р.И. Берсимбай РОЛЬ ГЕНОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ИЗУЧЕНИИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ И ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ (Евразийский национальный университет им. Л.Н.Гумилева, Астана) Стремительные темпы развития современной генетики и выдающиеся достижения последних десятилетий, дали исключительно важную информацию не только для понимания фундаментальных основ жизни, но и быстро нашли практическое применение в фармакологии и медицине, сельском хозяйстве и экологии. На сегодняшний день технологии рекомбинантной ДНК и геномики широко используются в медицине и практически нет таких областей медицины, которые не были бы затронуты геномными исследованиями. Это привело не только к существенному возрастанию наших фундаментальных знаний о молекулярных основах болезней человека, но и способствовало развитию молекулярной медицины, где методы геномных технологий широко используются для профилактики, диагностики и лечения болезней[1]. Геномика предполагает изучение всего генома, включая картирование, секвенирование, аннотирование (обнаружение генов) и функциональный анализ. Первым существенным достижением в области технологий рекомбинантных ДНК стал метод молекулярного клонирования, создание транскрипционной карты и доступность всех генов. Геномные технологии позволили проводить: анализ экспрессии генов, анализ белковой экспрессии, анализ белковой структуры и их взаимодействий, анализ характера экспрессии и активности генов (использование методов мутагенеза и РНК-интерференции ), анализ последовательностей генов или целых геномов [2-4]. В организме большое количество генов должны работать вместе, чтобы координировать активность всех биологических процессов, протекающих в человеческом или любом другом организме. С этой точки зрения целью функциональной геномики является установление функции генов в широком масштабе с использованием новых производительных технологий [5]. Известно, что многие полигенные мультифакторные болезни человека обусловлены повреждениями генов, что гены определяют реакцию нашего организма на лекарства, на инфекцию, вызванную патогенными микроорганизмами, а также то, что гены влияют на нашу предрасположенность к болезням, которые во многом зависят от внешних условий. Бронхиальная астма (БА) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) являются заболеваниями мультифакториальной полигенной природы, риск формирования которых обусловлен взаимодействием большого количества генов с этиологически значимыми средовыми факторами. Общие генетические факторы, характерные для бронхиальной гиперреактивности могут участвовать в процессе развития как БА, так и ХОБЛ. Сегодня бронхиальной астмой страдает более 300 млн. жителей планеты. Распространенность её колеблется примерно от 1 % до 18 % населения в разных странах. Ежегодно во всем мире от астмы умирает примерно 250 000 человек и эти данные, как правило, не коррелируют с распространенностью [6]. Причиной заболеваемости и смертности от ХОБЛ в мире являются социальные и экономические факторы [7]. Инициирование воспалительного процесса в дыхательных путях при ХОБЛ совершается табачным дымом, различными поллютантами и газами. Известно, что около 90% пациентов с ХОБЛ – курильщики, а табачный дым, как известно, является важным фактором, инициирующим оксидативный стресс в легких. Распространенность, заболеваемость и смертность от ХОБЛ варьируют в зависимости от страны, в пределах групп стран, в прямой связи с распространением курения табака [8]. В целом популяционная распространенность ХОБЛ в мире составляет около 6% . Одним из важных направлений в геномных исследованиях в молекулярной медицине является выявление вариаций в последовательностях генов, ответственных за формирование индивидуальных реакций на влияние окружающей среды [9,10]. В патогенезе БА имеют место как иммунологические, так и неиммунологические механизмы. Они контролируются независимыми друг от друга генами, которые индуцируют развитие БА с иммунологическими и неиммунологическими факторами развития заболевания, объединенные общим патогенетическим звеном – выбросом медиаторов аллергии, оказывающих повреждающее действие на бронхи. Общеизвестно, что атопия рассматривается как иммунопатология, лежащая в основе формирования БА. В реализации атопических реакций особо важную роль играют интерлейкины: IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13, продуцируемые преимущественно Т-хелперами 2 типа (Тh-2) : IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13. Формирование воспаления, лежащего в основе аллергических реакций, связывают с преобладанием Тh-2 типа иммунного ответа (гуморального) над Тh-1 (клеточным) с соответствующей продукцией цитокинов. Используя «позиционный» и «кандидатный» подходы картирования генов распространенных 160 заболеваний установлено, что гены атопии (предрасположенность к гиперпроизводству IgE) и аллергических заболеваний (главным образом, бронхиальной астмы) расположены в основном в десяти участках генома человека. Показано сцепление «астмы» с пятью генными локусами, четыре из которых соответствуют гомологичным хромосомным областям, где локализованы гены кандидаты заболевания у человека:5q31, 6р21. 12q22-24, 17q12-22 [9]. Одним из большого количества медиаторов, участвующих в воспалительных процессах при БА и ХОБЛ, является провоспалительный цитокин TNFα. Ген TNFα локализован в пределах главного комплекса гистосовместимости III класса на коротком плече 6 хромосомы (6р21.3). Описано 12 полиморфизмов в промоторном регионе гена TNFα, обусловленных однонуклеотидными заменами. Известно, что сочетание определенных аллелей в генах TNFα приводит к повышению продукции TNFα и является фактором риска БА и ХОБЛ. Ферменты биотрансформации ксенобиотиков играют важную роль в патогенезе бронхолегочных заболеваний. Они участвуют в антиоксидантных реакциях и детоксикации внешнесредовых поллютантов, стимулирующих развитие воспалительного процесса в дыхательных путях. В развитии заболеваний органов дыхания наибольшее значение и вовлеченность имеют полиморфизмы генов глутатион-S-трансфераз - GSTM1, GSTТ1 и GSTР1. Глутатионовая антиоксидантная система эффективно защищает клетки от оксидативного стресса. Глутатион-S-трансферазы активно участвуя в детоксикации ксенобиотиков путем их коньюгации с глутатионом играют ключевую роль в обеспечении устойчивости клеток к перекисному окислению липидов, свободным радикалам, алкилированию белков и предотвращении поломок ДНК. Ген GSTM1 локализован на хромосоме 1 (1р13.3), ген GSTТ1 - на 22 хромосоме (22q11.2 и ген GSTР1 - на 11 хромосоме (11q13).). Полиморфизмы генов GSTM1 и GSTТ1 обусловлены наличием частичной или полной делеции, приводящей к нарушению синтеза соответствующего фермента. Полиморфизм гена GSTР1 обусловлен сочетанием двух диаллельных полиморфизмов гена: Ile105Val (5-й экзон) и Ala114Val (6-й экзон). Замена Ile105Val в аминокислотной последовательности GSTР1 приводит к изменению активности фермента. Таким образом, ХОБЛ и БА ассоциированы с хроническим воспалением, в формирование которого вовлечены цитокины, ферменты и множество других факторов (рецепторы цитокинов, хемокины, ростовые факторы, адгезионные молекулы). Учитывая общность ткани-мишени, а также вовлекаемых в патогенез этих заболеваний систем, исследования связи различных генотипов этих генов с патогенетически важными для БА и ХОБЛ качественными и количественными признаками, характеризующими состояние факторов иммунитета, позволит выявить их роль в развитии предрасположенности к этим заболеваниям. Нами проведены исследования по изучению ассоциации различных генотипов изучаемых генов с патогенетически важными для БА и ХОБЛ качественными и количественными признаками, характеризующими состояние факторов иммунитета и развитие предрасположенности к этим заболеваниям [11-13]. При анализе цитокинового профиля больных БА и ХОБЛ установлено повышение IL2, TNFα, IL-10 в сыворотке крови по сравнению с контролем. У больных бронхиальной астмой по соотношению цитокинов ИЛ-4/ ИНФ-, по сравнению с больными ХОБЛ определено преобладание функциональной активности Th2 лимфоцитов, что можно рассматривать как свидетельство относительного дефицита клеточно-опосредованного иммунного ответа. В сыворотке крови больных бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких было выявлено повышение уровня общего IgЕ без значимых межгрупповых различий. При оценке полиморфизма гена IL4 (-589T) у больных БА, ХОБЛ и здоровых людей установлена взаимосвязь IL-4-589T аллеля с астмой (χ2=6,12 при d.f.=1, p<0,05) и с ХОБЛ (χ2=10,88 при d.f.=1, p=0,001). При оценке полиморфизма G-308A гена ТNF–α у больных БА, ХОБЛ и контрольной группы выявлена статистически значимая ассоциация между аллелем -308A и БА (χ2=4,25 при d.f.=1, p=0,04). При анализе распределения генотипов GSTM1 и GSTT1 в выборке больных БА и контрольной группе установлено, что в группе больных БА нулевой генотип гена GSTM1 был у 32 человек (58,2%), нулевой генотип гена GSTT1 – у 23 человек (41,8%). При сравнении выборок больных БА с контрольной группой достоверных различий в частотах аллелей генов GSTM1 и GSTT1 выявлено не было (χ2=3,65 при d.f.=1, p=0,06 и χ2=0,7 при d.f.=1, p=0,4 соответственно). При изучении полиморфизма гена GSTP1 у больных БА и здоровых индивидов были выявлены статистически достоверные различия между генотипами Ile/Ile, Ile/Val и Val/Val. Анализ полиморфизма гена GSTP1 показал ассоциацию генотипа Val/Val c развитием БА (χ2=21,94 при df=1, р<0,05). Полученные результаты свидетельствуют в пользу большей подверженности лиц-носителей генотипов GSTM1 «-» и GSTТ1 «-» риску заболеть ХОБЛ. Величина OR при этом составила 13,15 и 2,86, соответственно. Анализ полиморфизма гена GSTP1 показал ассоциацию генотипа Val/Val c развитием ХОБЛ (χ2=18,12 при df=1, р<0,05). В сыворотке крови больных ХОБЛ установлено повышение общего IgЕ и интерлейкинов: IL-2, IL-4, TNF-α, IL-10. Одной 161 из причин повышения уровня иммуноглобулина Е и IL-4 у больных ХОБЛ может быть наличие частой встречаемости полиморфного варианта гена IL4. В процессе реализации II фазы биотрансформации при участии глутатион-S-трансфераз синтезируются лейкотриены С4 и D4, в реакции ацетилирования образуется фактор активации тромбоцитов (PAF). Как известно, LTC4 и LTD4 в комбинации с PAF играют ключевую роль в поздней фазе аллергического воспаления. Таким образом, генетический полиморфизм ферментов биотрансформации ксенобиотиков в связи с дисбалансом токсификации/детоксификации, увеличением продукции реактивных метаболитов может также приводить к повышению IL-4 и IgЕ. По данным проведенного исследования к БА подвержены лица, имеющие генотип Val/Val гена GSTР1 и генотип -308A гена TNF-α. При анализе цитокинового профиля больных БА установлено повышение IL-2, IL-4, TNF-α, IL-10 в сыворотке крови по сравнению с контролем. По соотношению цитокинов ИЛ-4/ ИНФ-, при сравнении с больными ХОБЛ определено преобладание функциональной активности Th2 лимфоцитов, что можно рассматривать как свидетельство относительного дефицита клеточно-опосредованного иммунного ответа. Выявление общих и специфичных для БА и ХОБЛ генетических и иммунологических маркеров является важным вкладом в понимание механизмов каждого из этих двух заболеваний. Определенные особенности иммунитета, ассоциированные молекулярно-генетическими предпосылками, свидетельствуют о наследственной детерминации патологических фенотипов. В заключение можно отметить, что в последние годы большое внимание уделяется идентификации генов, мутации которых вносят существенный вклад в предрасположенность к развитию мультифакторных полигенных бронхолегочных заболеваний. Информация, полученная в результате геномных исследований и анализа вариабельности ДНК человека позволит идентифицировать генетические варианты, определяющие предрасположенность к мультифакторным заболеваниям и ответ на лекарства, что открывает путь к персонализированной медицине, учитывающей генетические особенности пациентов. 1. Altshuler D., Daly M.,Lander E.S. Genetic mapping in human disease // Science.-2008.-V.322.-P.881-888. 2. Lander E.S. et al. TInitial sequencing and analysis of human genome // Nature.-2001.-V.409.-P.860-921. 3. Venter J.C.et al. The sequence of human genome //Science.-2001.-V.291.-P.1304-1351. 4. Antonarakis S.E., Chakravarti A., Cohen J.C., Hardy J. Mendelian disorders and multifactorial traits: the big divide or one for all //Nature Reviews Genetics.-2010.-V.11.-P.380-384. 5. McCarthy M.I., Abecasis G.R., Cardon L.R.,Goldstein D., Little J., Ioannidis J.P.A., Hirschorn J.N. Genome-wide association studies for complex traits: consensus,uncertainty and challenges //Nature Reviews Genetics -2008.-V.9.-N.5.-P.356-375 6. Global Initiative for Asthma (GINA) Report 2009. www.ginasthma.com. 7. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) Report 2008. www.gold.com. 8. Sandford A.J., Silverman E.K. Chronic obstructive pulmonary disease. 1: Susceptibility factors for COPD the genotype – environment interaction // Thorax.- 2002. -V. 57.- N.8.- P. 736-741. 9. Repari E., Sayers I., Wain L.V. et al. Genome-wide association study identifies five loci associated with lung function// Nature Genetics.-2010.-V.42.-N.1.-P.36-45. 10. Берсимбаев Р.И. Медицинская геномика: некоторые достижения и проблемы. // Вестник ЕНУ (серия естественных наук).-2009.- № 2.-С.128-134. 11. Берсимбай Р.И., Ещжанов Т.Е., Байгенжин А.К.Роль апоптоза иммунных клеток при атопической бронхиальной астме //Доклады НАН РК .-2009.- №5.-С.38-48. белков-регуляторов апоптоза 12. Акпарова А., Ещжанов Т.Е., Байгенжин А.К., Берсимбаев Р.И., Роль иммунокомпетентнвх клеток в развитии бронхиальной астме // Доклады НАН РК.- 2010.- №5.-С.76-82. 13. Yechshzhanov T.E., Akparova A.Y., Bersimbay R.I. Assosiation of xenobiotic detoxification enzymes gene polymorphism in predisposition to bronchial asthma and chronic obstructive pulmonary disease //Journal of Life Sciences.-2011.-V.5.-P.454-459. 162 Н.К. Бишимбаева, А.Е. Ережепов1, А.А. Шилманова, А. Нахимова, И.А. Сартбаева БИДАЙДЫҢ СОМАКЛОНДЫ ВАРИАНТТАРЫНЫҢ ТҰЗҒА ТӨЗІМДІЛІГІН ЗЕРТТЕУ (РГП «Өсімдіктер биологиясы жəне биотехнология институты» əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университет) Бидайдың Отан, Целинная 3С сорттарынан жəне гибридті линиясынан Г4 (Целинная 3С×Казахстанская 15) алынған 25 сомаклондық линияларына тұзға төзімділігіне жүргізілген скрининг бойынша төзімділігі жоғары формалар анықталды. Қоршаған ортаның маңызды факторларыныңы бірі тұздану болып табылады, тұздану дəнді дақылдардың өнімділігін айтарлықтай төмендетеді. Қазіргі таңда жердің 800 миллионнан астам гектары тұздану шарттарында орналасқан, оның көлемі жалпы жер көлемінің 6%-ын алып жатыр. Егістік алқаптарының жоғарғы қарқынмен тұздалуы жердің құнарлығының төмендеуіне алып келеді, ғалымдар болжамдарының нəтижесінде, 25 жылдың ішінде егістік алқаптарының өнімділігі 30%-ға төмендейді, ал 2050 жылға 50%-ға дейін төмендейді делінеді [1, 2]. Жыл сайын көптеген жерлерде өнімділіктің төмендеуі тұзданудың жоғарлауымен байланысты. Əлемдегі жер дақылдарының шамамен 25%-ы тұздылығы жоғары жерлерде өседі. Сомаклонды өзгергіштік – бұл ауыл шаруашылық дақылдарын жақсарту үшін генетикалық алуантүрлілікті жоғарылатудың қосымша көзі болып табылады [3]. Сомаклонды өзгергіштік негізінде күріштің сорттары жақсартылған жəне құрғақшылыққа [4], төмен температураға [5] жəне тұзға [6, 7, 8] төзімді формалар алынған. Сомаклонды вариабельділік жолымен туындаған өзгерістер əдеттегідей емес [6, 9, 10]. Дəстүрлі селекциялық əдістермен біріктіру өте қиын немесе мүмкін емес бір генотипте бірігіп келетін тез жетілетін жəне ұзынша келген [11], тез жетілетін жəне төмен температураға [9] төзімді сияқты белгілері бар сомаклонды варианттардың пайда болу жағдайлары белгіленген. Тұздылыққа төзімділікті жоғарылату мақсатында in vitro жағдайында іріктеуді қолдануға болады. Клетка культурасын модель ретінде қолданып in vitro жағдайында алынған сомаклонды өсімдіктердің тұзға жауабын зерттеу жəне төзімді линияларын іріктеу маңызы зор болып саналады [12]. Осы бағыттағы мəселені зерттеу ретінде бидайдың сомаклонды варианттарының тұзға төзімділікке скрининг жүргізу арқылы төзімді линияларын анықтау осы жумыстын мақсаты болды. Материалдар мен əдістер Бидайдың Отан жəне Целинная 3С сорттарынан жəне гибридті линиясынан Г4 (Целинная.3С ×Казахстаская15) алынған 25 сомаклондық линияларына (1-Отан 8.5 қылтанақты линия; 2-Отан №8.6.6 қылтанақты линия; 3-Отан №7.11 біркелкі линия; 4-Отан 2№23 (10.1.6) ірі жəне қызыл дəнді линия; 5-Отан 17(8.9); 6-Отан 17№6.5; 7-Отан №7.4 біркелкі линия; 8-Отан 2№23 (10.2.6) өте ірі, қызыл жəне шыны тəрізді дəнді линия, 9-Отан 1бақылау, 10-Отан 5 ақ дəнді линия; 11-Отан №8.5.11; 12-Отан №7.14 линия; 13-Отан №2 бақылау; 14-Отан 17 №6; 15-Отан №8.7.5 қылтанақты линия; 16Отан 17.2 дəн түсі сұр линия; 17-Отан №17 (9.8); 18-Отан 2 №23 (10.2.7) өте ірі дəнді линия.; 19-Отан №7 біркелкі линия; 20-Отан 2 №23 (10.1) қызыл дəнді жəне қысқа сабақты линия; 21-Отан 8.5.3 шыны тəрізді линия; 22-Отан 18.8 карликті линия; 23-Отан 8.7.1 қылтанақты линия; 24-Отан 9.2 ақ дəнді линия; 25-Целинная 3С R2 ерте пісіп жетілетін линия; 26-Целинная 3С R2 жатаған емес жəне ерте пісіп жетілетін линия; 27-Целинная 3С бақылау; 28-Г4 (Целинная 3С×Казахстанская 15) бақылау; 29-Г4 сомаклондық линия нөлдік мутациясымен) тұзға төзімділік бойынша скрининг жүргізілді. Ол үшін залалсыздандырылған жоғарыда аталған сомаклондық линиялардың əр қайсысынан 100 дəннен алып, 2 күн Петри табақшаларында дистилденген суға өндіруге қойылды, одан кейін дистилденген суы бар арнайы тəжірибелік табақшаларға көшірілді. 7 күннен кейін өсірілген бидай өскіндерінің жартысы бақылау үлгісі ретінде дистилденген суға қалдырылып, қалған 50 дəнді NaCl-дың 1,68% ерітіндісіне көшіріліп үш күн өсірілді [13]. Жалпы тəжірибе уақыты он күнге созылды. Бидай сомаклондық линияларының тұзға төзімділігі тамыр жəне өскіндер ұзындығы бойынша бақылау үлгілерімені салыстырылып анықталды. Алынған мəліметтерді статистикалық өндеу жəне диаграммаларды тұрғызу “Microsoft Excel”бағдарламасы бойынша жүргізілді. Алынған мəліметтердің сенімділігі Стьюдент критериі бойынша анықталды [14]. 163 Зерттеу нəтижелері Бидайдың Отан жəне Целинная 3С сорттарынан жəне гибридті линиясынан Г4 (Целинная.3С ×Казахстаская15) алынған 25 сомаклондық линиялардың тұзға төзімділігіне скрининг жүргізілді жəне келесідей нəтижелер алынды. Тамыр жүйесі бойынша. Тұзға төзімділікке скрининг жасау əдісі бойынша жүргізілген зерттеулер нəтижесінде сомаклондық формалардың тамыр жүйесі NaCl-дың жоғары концентрация (1,68%) əсеріне бақылаумен салыстырғанда едəуір төзімді болып табылды. Тамыр жүйесінің ұзындығы бақылаумен (су) тұзда өсірілген бастапқы Отан сортпен салыстырғанда 45,75%-ға дейін, ал оның сомаклондық варианттарында біразы 65%-ға жуық, ал орта мəнде тек қана 75-80%-ға дейін жетеді (сурет 1). Сонымен қатар, тамыр жүйесі бойынша төзімділігі жоғары формалар анықталды. Мысалы үшін, Отан №7.11, Отан №7.4 біркелкі линиялар; Отан 2№23 (10.2.7) өте ірі, қызыл жəне шыны тəрізді дəнді линия; Отан №7.14 линия; Отан 5 жəне Отан 9.2 ақ дəнді линиялар тамырының бақылаумен (су) салыстырғанда 91,74%-дан 96,34%-ға дейн жеткен. Тұзға төзімділігі бойынша тамырының өсуі өте жоғары – 102,84%-ға дейін жететін сомаклондық линиялар кездеседі (Отан 2 №23 (10.1) қызыл дəнді жəне қысқа сабақты линия, Отан №8.7.1 қылтанақты линия). Целинная 3С сортының тамыр жүйесінің өсуі (бақылау) 69,47%-ға дейін, ал оның сомаклонды линияларында бұл көрсеткіш (Целинная 3С R2, Целинная 3С R2 жатаған емес) 90,05-91,79%-ға дейін жеткен. Яғни, аталған сорттан алынған сомаклонды линиялардың тамырларының тұзға төзімділігі жоғары болды (сурет 1). Осы жұмыста сондай-ақ Г4 (Целинная 3С х Казахстанская 15) гибридті линия жəне одан алынған сомаклонды форманың тамырларының тұзға төзімділігі зерттелді. Нəтижесінде гибридті линияның өзі де (112,65%) жəне оның сомаклонды линиясы да (115,29%) жоғары деңгейде тұзға төзімді болып табылды (сурет 1). Жалпы, сомаклондық формалардың тамыр жүйесі NaCl-дың жоғары концентрациясына (1,68%) төзімділігі бастапқы сортпен салыстырғанда едəуір жоғары болып табылды. Кейбір түзда өсірілген формалар бақылаумен салыстырғанда (су) тамырдың өсуі 101,9%-дан 115,29%-ға дейін жеткенін көрсетті. Сабақ жүйесінің нəтижелері. Тұзға төзімділікке скрининг жасау əдісі бойынша жүргізілген зерттеулер нəтижесінде Отан сорты (бақылау) сабағының өсуі 68,5-69,35%-ға дейін жетті. Отан соттының 22 зерттелген сомаклонды линиялардың көбісінде (13 линия) стресс жағдайында сабақтардың өсуі 60-75%-ға дейін жеткен (Отан 8.5 қылтанақты линия, Отан №8.6.6 қылтанақты линия, Отан №7.11 біркелкі линия, Отан 2№23(10.1.6) өте ірі, қызыл жəне шыны тəрізді дəнді линия, Отан 17№6.5, Отан 5 ақ дəнді линия, Отан №8.5.11, Отан 17№6, Отан 17.2 дəн түсі сұр линия, Отан №17(9.8), Отан 2№23(10.2.7) өте ірі дəнді линия, Отан 2 №23(10.1), Отан 18.8 карликті линия (сурет 2). Сабақтарының төзімділігі бойынша бақылаудан жоғары көрсеткіштерге ие болған (80,6-90,5%) 6 линия анықталды - Отан 17(8.9) линия, Отан 2№23(10.2.6) өте ірі, қызыл жəне шыны тəрізді дəнді линия, Отан №7.14 линия, Отан 8.7.5 қылтанақты линия, Отан №7 біркелкі линия, Отан 8.5.3 шыны тəрізді линия. Целинная 3С сортының сабақтың түздағы өсуі бақылаумен (су) салыстырғанда 70,55%-ға дейін жетсе, ал оның сомаклонды линияларында бұл көрсеткіш (Целинная 3С R2 ерте пісіп жетілетін линия; Целинная 3С R2 жатаған емес жəне ерте пісіп жетілетін линия) 75,3-75,9%-ға дейін жеткен. Яғни, аталған сорттан алынған сомаклонды линиялардың тамырларының тұзға төзімділігі бастапқы сорттан кем болған жоқ. Целинная 3С сорттан алынған екі сомаклонды линияларды (Целинная 3С R2 ерте пісіп жетілетін линия; Целинная 3С R2 жатаған емес жəне ерте пісіп жетілетін линия) тұзға төзімді деп санауға болады (сурет 2). Гибридті линия Г4 (Целинная 3С х Казахстанская 15) жəне одан алынған сомаклонды форманың тамырларының тұзға төзімділігі зерттелді. Нəтижесінде гибридті линияның өзі жоғары деңгейде тұзға төзімді (сабағының өсуі 95% жетті), ал оның сомаклонды линиясы бақылау ретінде алынған гибридтті линиядан төмен (сабағының өсуі 82,02%) болып табылды (сурет 2). 164 Сурет 1 – Сомаклонды линиялардың өскінінің тамыр жүйесіне 1,68% NaCl ерітіндісінің əсері. Белгілер: 1-Отан 8.5 қылтанақты линия; 2-Отан №8.6.6 қылтанақты линия; 3-Отан №7.11 біркелкі линия; 4-Отан 2№23 (10.1.6) ірі жəне қызыл дəнді линия; 5-Отан 17 (8.9); 6-Отан 17№6.5; 7-Отан №7.4 біркелкі линия; 8-Отан 2№ 23 (10.2.6) өте ірі, қызыл жəне шыны тəрізді дəнді линия, 9-Отан 1бақылау, 10-Отан 5 ақ дəнді линия; 11-Отан №8.5.11; 12-Отан №7.14 линия; 13-Отан №2 бақылау; 14-Отан 17 №6; 15-Отан №8.7.5 қылтанақты линия; 16-Отан 17.2 дəн түсі сұр линия; 17-Отан №17 (9.8); 18-Отан 2 №23 (10.2.7) өте ірі дəнді линия; 19-Отан №7 біркелкі линия; 20-Отан 2 №23 (10.1) қызыл дəнді жəне қысқа сабақты линия; 21-Отан 8.5.3 шыны тəрізді линия; 22-Отан 18.8 карликті линия; 23-Отан 8.7.1 қылтанақты линия; 24-Отан 9.2 ақ дəнді линия; 25-Целинная 3С R2 ерте пісіп жетілетін линия; 26-Целинная 3С R2 жатаған емес жəне пісіп жетілетін линия; 27-Целинная 3С бақылау; 28-Г4 (Целинная 3С×Казахстанская 15) бақылау; 29-Г 4 сомаклондық линия нөлдік мутациясымен. 165 Сурет 2 – Сомаклонды линиялардың өскінінің сабақ жүйесіне 1,68% NaCl ерітіндісінің əсері. Белгілер: 1-Отан 8.5 қылтанақты линия; 2-Отан №8.6.6 қылтанақты линия; 3-Отан №7.11 біркелкі линия; 4-Отан 2№23 (10.1.6) ірі жəне қызыл дəнді линия; 5-Отан 17 (8.9); 6-Отан 17№6.5; 7-Отан №7.4 біркелкі линия; 8-Отан 2№ 23 (10.2.6) өте ірі, қызыл жəне шыны тəрізді дəнді линия, 9-Отан 1бақылау, 10-Отан 5 ақ дəнді линия; 11-Отан №8.5.11; 12-Отан №7.14 линия; 13-Отан №2 бақылау; 14-Отан 17 №6; 15-Отан №8.7.5 қылтанақты линия; 16-Отан 17.2 дəн түсі сұр линия; 17-Отан №17 (9.8); 18-Отан 2 №23 (10.2.7) өте ірі дəнді линия; 19-Отан №7 біркелкі линия; 20-Отан 2 №23 (10.1) қызыл дəнді жəне қысқа сабақты линия; 21-Отан 8.5.3 шыны тəрізді линия; 22-Отан 18.8 карликті линия; 23-Отан 8.7.1 қылтанақты линия; 24-Отан 9.2 ақ дəнді линия; 25-Целинная 3С R2 ерте пісіп жетілетін линия; 26-Целинная 3С R2 жатаған емес жəне ерте пісіп жетілетін линия; 27-Целинная 3С бақылау; 28-Г4 (Целинная 3С×Казахстанская 15) бақылау; 29-Г 4 сомаклондық линия нөлдік мутациясымен. 166 Жалпы, сомаклондық формалардың тамыр жүйесі NaCl-дың жоғары концентрациясына (1,68%) төзімділігі бастапқы сортпен салыстырғанда едəуір жоғары болып табылды. Селекцияға ендіріу үшін 1 гибрид жəне 14 сомаклонды формалар сұрыптап алынды, олар сабақ жəне тамыр жүйесі бойынша төзімділігі бастапқы сортпен (бақылау) бірдеу, немесе жоғарылау жəне өте жоғары: Отан сортының 11 сомаклонды линиясы (Отан №7.4 біркелкі линиялар; Отан 2№23 (10.2.7) өте ірі, қызыл жəне шыны тəрізді дəнді линия; Отан №7.14 линия; Отан 5 ақ дəнді линия, Отан 2 №23 (10.1) қызыл дəнді жəне қысқа сабақты линия, Отан №7.11 біркелкі линия, Отан 17(8.9) линия, Отан 2№23(10.2.6) өте ірі, қызыл жəне шыны тəрізді дəнді линия, Отан 8.7.5 қылтанақты линия, Отан №7 біркелкі линия, Отан 8.5.3 шыны тəрізді линия), Целинная 3С сортының 2 сомаклонды линиясы (Целинная 3С R2 ерте пісіп жетілетін линия; Целинная 3С R2 жатаған емес жəне ерте пісіп жетілетін линия), өте жоғары тұзға төзімді гибридті линия Г4 (Целинная 3С х Казахстанская 15) жəне оның нөлдік мутациясы бар Г4сомаклонды варианты. 1. Munns R. Genes and salt tolerance: bringing them together // New Phytologist. – 2005. – V. 167. – P. 645-663. 2 Sreenivasulu N., Grimm R., Wobus U., Weachke W. Differential response of antioxidant compounds to salinity stress in salt tolerant and salt sensitive seedlings of foxtail millet (Setaria italica) // Physiol. Plant., 2000. – V. 109. – P. 435-442. 3. Larkin P. J., Scowcroft W. R. Somaclonal variation – a novel source of variability from cell culture for plant improvement // Theor. And Appl. Genet. – 1981. – V.60. – № 4. – P. 197-214. 4. Adkins S.W., Kunanuvatchaidach R., Goodwin I.D. Somaclonal variation in rice – drought tolerance and other agronomic characters //Aust. J. Bot. – 1995. – V. 43. – P. 201-209. 5. Bertin P., Kinet J.M., Bouharmont J. Heritable chilling tolerance improvement in rice through somaclonal variation and cell line selection // Aust. J. Bot. – 1996. – V. 44. – P. 91-105. 6. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция /Отв. Ред. Глеба Ю.Ю. – Киев: Наукова Думка. – 1990. – 280 с. 7. Zhang G.Y., Guo Y., Chen S.L., Chen S.Y. RFLP tagging of a salt tolerance gene in rice // Plant Sci. – 1995. – V. 110. – P. 227-234. 8. Winicov I. Characterization of rice (Oryza sativa L.) plants regenerated from salt-tolerant cell lines // Plant Sci. – 1996. – V. 113. – P. 105-111. 9. Larkin P.J., Scowcroft W.R. Somaclonal variation – a novel source of variability from cell culture for plant improvement //Theor. And Appl. Genet. – 1981. – V. 60. – (4). – P. 197-214. 10. Муромцев Г.С., Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. – Москва: ВО «Агропромиздат». – 1990. – 384 с. 11. Кучеренко Л. Индуцированный морфогенез в культуре тканей риса и его использование для создания исходного селекционного материала /В кн.: Культура клеток растений и биотехнология. – М.: Наука. – 1986. – С.211-214. 12. Ahloowalia B. S. Somaclones of wheat regenerated from primordial leaf callus // Gen. Manipulat. Plant. Breed. Proc. Int. Symp., Berlin, Sept. 8-13. – 1985. – P. 577-579. 13. Терлецкая Н.В. Диагностика устойчивости мягкой пшеницы к засухе и солевому стрессу, моделируемым in vivo и in vitro //Биотехнология. Теория и практика. – Алматы, 2008. – №4. – C.64-70. 14. Лакин Г.Ф. Биометрия. – М.: Высшая школа. – 1990. – 352 с. *** В результате скрининга на солеустойчивость 25 сомаклональных линий пшеницы сорта Отан, Целинная 3С и гибрридной линии Г4 (Целинная 3С ×Казахстанская 15) были выявлены солеустойчивые формы. *** As the result of screening for salt tolerance of 25 somaclonal lines of wheat varieties Otan, Cellinnaya 3S and hybrid line H4 (Celinnaya 3S×Kazakhstanskaya 15) have been revealed the salt-resistant forms. А.В. Гончарова, Т.А. Карпенюк, Я.С. Цуркан УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИЕ МИКРООРГАНИЗМЫ АКТИВНОГО ИЛА КАК СОРБЕНТЫ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ (Казахский национальный университет им.аль-Фараби) Из активного ила выделены штаммы бактерий Pseudomonas sp. 409TA и дрожжей Candida sp. 410AT, способные хорошо размножаться в присутствии в среде высоких концентраций Cu2+ и Zn2+ , неприхотливые к питательным средам и обладающие способностью к использованию нефтепродуктов в качестве источников углерода и энергии. К многочисленным вредоносным для окружающей среды и человека воздействиям, относятся загрязнения водоемов промышленными и коммунально-бытовыми сточными водами, содержащими нефтепродукты и тяжелые металлы [1-3]. Применяемые в настоящее время системы и принципы очистки сточных вод весьма разнообразны и среди них едва ли не самое значительное место отведено 167 биологическим методам, так как биологическая очистка - это прежде всего деструкция чуждых природной среде соединений, осуществляемая безреагентным путем. Некоторые микроорганизмы активного ила, применяемого в сооружениях биологической очистки, способны накапливать и трансформировать металлы, углеводороды нефти и другие поллютанты в больших количествах, поскольку в ходе эволюции в них сформировались системы их поглощения, концентрирования и переработки [4,5]. Селекция в этом направлении позволит получить формы, активно аккумулирующие и трансформирующие поллютанты, отобрать штаммы, обладающие высокой емкостью и селективностью по отношению к данным загрязнителям, оценить возможность и целесообразность их применения для решения практических задач по очистке и доочистке промышленных растворов, сточных вод, загрязненных почв.и на их основе создавать перспективные препараты и системы для биоочистки.. Из агрессивной среды сооружений биологической очистки городских сточных вод нами были выделены штаммы бактерий Pseudomonas sp. 409TA и дрожжей Candida sp. 410AT, характеризующиеся высокой способностью к деградации углеводородов нефти и нефтепродуктов [6-8]. Они продемонстрировали способность размножаться в присутствии в среде культивирования высоких концентраций Cu2+ и Zn2+ (). Для оценки потенциала их практического использования при очистке сточных вод, загрязненных как нефтепродуктами, так и тяжелыми металлами, в модельных экспериментах нами были изучены процессы извлечения из растворов ионов Cu2+ и Zn2+ штаммами Pseudomonas sp. 409TA и Candida sp. 410AT. Материалы и методы исследований Объектами исследования послужили штаммы нефтеокисляющих микроорганизмов родов Pseudomonas и Candida - Pseudomonas sp. 409TA, Candida sp. 410AT, выделенные из активного ила очистных сооружений г.Алматы. В работе были использованы стандартные питательные среды [9-11]. Для приготовления растворов металлов использовали соли ZnCl2 и CuSO4*5H2O. В качестве источников углерода использовали дизельное топливо, нефть, глюкозу. Кинетику сорбции ионов тяжелых металлов изучали методом ограниченного объема [12,13]. Для проведения экспериментов рабочий показатель оптической плотности составлял 0,05 для клеток бактерий и дрожжей, что соответствует 0,45*106 кл/мл бактерий, 6*103 кл/мл дрожжей. Остаточное количество металла в супернатанте методом атомно-адсорбционной спектрометрии [14]. Содержание меди определяли комплексонометрическим методом в присутствии металлоиндикатора мурексида. Содержание цинка определяли комплексонометрическим методом в присутствии металлоиндикатора ксиленолового оранжевого [15]. Все эксперименты проводили в 3-5 кратной повторности. Статистическую обработку полученных результатов проводили методом [16]. Результаты и обсуждения: Изучение процессов извлечения ионов тяжелых металлов данными культурами из раствора (среда культивирования) было проведено с использованием следующих вариантов опыта:- суспензия бактерий - раствор металла;- суспензия дрожжей - раствор металла;- суспензия бактерий и дрожжей раствор металла по следующей схеме (риснок 1). В результате проведённых экспериментов было показано, что после внесения ионов меди к смыву, содержащему дрожжевые клетки, уже в течение первых десяти минут содержание ионов меди в исследуемом растворе значительно уменьшалось. Так, при добавлении к дрожжевым клеткам ионов меди в концентрации 0,5 г/л клетки поглощали 91,75%±0,4, что свидетельствует о том, что дрожжевые клетки способны к быстрому извлечению ионов меди из раствора за счет сорбции металла на своей поверхности. При внесении ионов меди в среду культивирования в концентрации 6 г/л дрожжевые клетки сорбировали 98,34%±1,4; а при внесении к смыву дрожжевых клеток ионов меди в концентрации 9 г/л, дрожжевые клетки сорбировали 99,44%±1,7. 168 Рисунок 1 - Изучение процессов извлечения ионов тяжелых металлов культурами При изучении сорбционной способности дрожжевых клеток по отношению к ионам цинка было показано: при добавлении цинка в концентрациях 0,01; 0,1; 0,2; 0,3 г/л клетки дрожжей сорбировали 93,6%±1,6; 96,3%±1,8; 99%±0,4; 99,023%±0,2 соответственно. Аналогичная серия экспериментов была проведена для клеток бактерий Pseudomonas sp. 409TA. При добавлении ионов меди в концентрации 0,25 г/л к смыву, содержащему бактериальные клетки, процент поглощения ионов составлял 91%±0,8. При концентрации ионов меди 0,9 г/л в смыве бактериальных клеток процент поглощения составлял 94,17%±2; а при концентрации ионов меди 9 г/л в смыве, содержащем бактериальные клетки, поглощающая способность доходила до 94,79%±1. При добавлении к суспензии клеток бактерий ионов цинка в концентрации 0,01 г/л процент извлечения иона металла составлял 93,5%±0,5. При увеличении концентрации цинка увеличивался процент поглощения цинка клетками бактерий, который доходил до 98,13%±0,2 при добавлении цинка в концентрации 0,3 г/л. Совместное культивирование клеток бактерий и дрожжей показало, что процент сорбирования меди при добавлении ее в концентрации 7,5 г/л составлял 99,19%±1,3; процент сорбирования цинка микроорганизмами при внесении в концентрации 0,3г/л к смыву клеток достигал 99,01%±0,4 (таблица 1). 169 Таблица 1 Поглощение ионов металлов консорциумом клеток Pseudomonas sp. 409TA и Candida sp. 410AT в течение 10 минут Исходная Исходная Объем ЭДТА 0,05 Количество Равновесная Количество концентра концентрация моль/л пошедшего сорбированного концентрация сорбированного ция соли соли металла, на титрование, мл металла, г/л металла,г/л металла,% металла, мг\10мл г/л Сульфат меди, CuSO4 0,1 1 0,6 0,089 0,011 88,75±2 0,5 5 2,2 0,459 0,041 91,75±1,9 0,9 9 3,1 0,842 0,058 93,54±1,7 2,5 25 6,55 2,377 0,123 95,09±1,5 4 40 2,92 3,945 0,055 98,62±1 7,5 75 3,25 7,439 0,061 99,19±1,3 Хлорид цинка, ZnCl2 0,01 0,1 0,64 0,0099 0,0001 95,4±0,6 0,1 1 3,7 0,097 0,003 97±1 0,2 2 2 0,198 0,002 98,8±0,3 0,3 3 2,9 0,297 0,003 99,01±0,4 Полученные данные свидетельствует о способности бактериальных и дрожжевых клеток к быстрой сорбции ионов меди и цинка из растворов. С увеличением концентрации ионов меди/цинка в среде в проверенном в эксперименте диапазоне процент сорбированного металла клетками бактерий Pseudomonas sp. 409TA и дрожжей Candida sp. 410AT возрастал. Совместное культивирование культур бактерий и дрожжей не уменьшало процента сорбции металлов из среды культивирования. Далее в работе изучалась кинетика поглощения ионов тяжелых металлов клетками бактерий Pseudomonas sp. 409TA и дрожжей Candida sp. 410AT. Для этого к смыву культуры дрожжей, содержему 60х102 клеток на мл. (соответствует оптической плотности 0,05) добавляли разные концентрации ионов меди и производили определение остаточного содержения ионов меди в растворе через заданные промежутки времени. Изучение кинетики поглощения ионов меди, показало, что при концентрации ионов меди 0,25 г/л в среде извлекающая способность дрожжевых клеток в течение первых десяти минут, составляла 91%±0,4; через 30 минут после контакта дрожжевые клетки поглощали 91%±0,35, а через 24 часа 93,25%±0,52. При добавлении более высоких концентраций ионов меди в среду, например, 7,5 г/л процент поглощения ионов через заданные интервалы времени 10 мин, 30 мин, 1 час, 24 часа составлял соответственно 98,81%±0,05; 99,03±0,05; 98,93±0,16; 99,08±0,12. Анализ результатов по кинетике сорбирования ионов цинка дрожжами показал, что: при добавлении ионов цинка в концентрации 0,01 г/л, клетки дрожжей сорбировали 87%±2,1 в течении 20 минут, 92,6%±1,6 в течении часа и 93,6%±1,9 через сутки культивирования. При добавлении цинка в большей концентрации – 0,2 г/л процент сорбирования был несколько выше и составлял 96,23±2; 95,58±1,7; 98,375±0,6; 99,034±0,7 через 20, 30, 60 минут и через 24 часа соответственно. Изучение кинетики извлечения ионов меди из среды культивирования культуры бактерий показало, что в первый час культивирования содержание металла в среде с клетками бактерий уменьшалось на 93,25%±1,6, через сутки клетки бактерий извлекали из среды культивирования до 94,75%±1,4 добавленных ионов меди (при концентрации внесенной меди 0,9 г/л). Увеличение концентрации внесенных ионов меди до 7,5 г/л вело к увеличению сорбирования их клетками бактерий. Так, в течение часа клетки сорбировали 99,2%±0,5, а через сутки - 99,28±0,3. Увеличение времени контакта бактерий с медью практически не влияло на сорбирующую активность. Сорбирующая способность бактерий при добавлении ионов цинка в концентрации 0,01 г/л через 20 мин составляла 81,6%±0,8; через 30 минут - 83,2%±1,3; через час - 91,04%±1,8; через сутки 99,8%±1,5. После контакта бактерий с цинком в концентрации 0,3 г/л в среде культивирования оставалось 7,6%±0,5; через 60 минут – 3,3%±1, а через сутки оставалось 2,87%±1,1 ионов цинка. Полученные данные свидетельствуют о том, что в системе клетки микроорганизмов - раствор соли металла уже в течение первого часа инкубирования достигается состояние равновесия. 170 В дальнейшем была проведена серия экспериментов по степени извлечения ионов меди и цинка живыми и мертвыми клетками бактерий и дрожжей. Время инкубации - 60 минут. Результаты опытов показали, что достоверной разницы в количестве извлеченного металла между живыми, прокипячёнными и проавтоклавированными клетками дрожжей нет. Так, живые клетки при концентрации ионов меди 0,1 г/л в течение часа сорбировали 91,51%±0,1; прокипяченные - 90,02%±1; проавтоклавированные - 90,89±1,1. При высокой концентрации ионов меди (7,5 г/л) живые, прокипяченные и автоклавированные клетки дрожжей сорбировали соответственно 98,88±0,4; 98,05±1,2; 97,67±1. Этот показатель характеризует клетки дрожжей Candida sp. 410AT, так же как и клетки бактерий Pseudomonas sp. 409TA как перспективные биосорбенты, способные в течение первых 10-30 минут контакта со средой, содержащей ионы меди или цинка в большом количестве поглощать их из среды (в пределах концентраций, изученных в приведенных экспериментах). Увеличение продолжительности контакта ионов тяжелых металлов с клетками бактерий Pseudomonas sp. 409TA и дрожжей Candida sp. 410AT не влияло на процент извлеченного металла. Способность клеток дрожжей Candida sp. 410AT и бактерий Pseudomonas sp. 409TA сорбировать ионы данных металлов была высока, поскольку при увеличении концентрации ионов металлов в среде, в течение часа в равной степени усиливалась поглощающая способность как живых, так и убитых разными способами клеток этих микроорганизмов. Эти данные свидетельствует о том, что культуры данных изолятов можно в дальнейшем использовать для очистки сточных вод, а также создавать биопрепараты на их основе, для очистки вод и водоемов от загрязнения тяжелыми металлами. 1. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры // Биотехнология. - 2005, № 1. - С. 42-50. 2. Fosso-Kankeu E., Mulaba-Bafubiandi A.F., Mamba B.B., Barnard T.G. Prediction of metal-adsorption behaviour in the remediation of water contamination using indigenous microorganisms // Journal of Enviromental Management, 2011. – V. 92. - Р. 2786-2794. 3. Силищев Н.Н. Микробиологические технологии в процессах ремедиации природных и техногенных объектов: Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. – Уфа, 2009. - 28 с. 4. Бакулин М.К., Кучеренко А.С., Алпашкин Р.И. Выделение и изучение прикладных свойств микроорганизмовдеструкторов // Мат. Всерос. научно-практической конференции «Наука-производство-технология-экология». – Киров, 2003. – Т. 3. – С. 78-79. 5. Барышникова Л.М., Грищенков В.Г., Аринбасаров М.У., Шкидченко А.Н., Боронин А.М. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. - Т. 37, № 5. – С. 542-548. 6. Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Бектурова А.Ж., Баубекова А.С., Жубанова А.А. Идентификация организмов биоценоза активного ила очистных сооружений г.Алматы // Вестник КазНУ. Серия биологическая. – Алматы, №4 (30), 2006, - С.86-90. 7. Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Бектурова А.Ж., Цуркан Я.С., Бражникова Е.В. Оценка углеводородокисляющего потенциала микроорганизмов активного ила очистных сооружений г. Алматы // Материалы международной научнопракт. конференции «Современные проблемы экологии и устойчивое развитие общества». Алматы, 2010, -С. 170-173. 8. Карпенюк Т.А., Гончарова А.В., Бражникова Е.В., Цуркан Я.С. Оценка физиолого-биохимического статуса микроорганизмов для создания препаратов по очистке почвенного покрова, природных и сточных вод от тяжелых металлов.// Проблемы биогеохимии и геохимической экологии. №1(12) -2010, -С. 5-7. 9. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. – М.: Изд-во МГУ, 1991. - С. 59 – 75. 10. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии. – М.: Изд-во МГУ, 1976. - С. 56 – 124. 11. Практикум по микробиологии / Под. ред. А.Н. Нетрусова. - М.: Academia, 2005. - С. 448- 597. 12. Салдадзе К.М., Копылова - Валова В. Д. Комплексообразующие иониты комплекситы. - М.: Химия, 1980. - 336 с. 13. Taoufik J., Zeroual Y., Moutaoakkil F. Aromatic hydrocarbons removal by immobilized bacteria (Pseudomonas sp., Staphylococcus sp.) in fluidized bed bioreactor // Ann. Microbiol. 2004. – V. 54, N 2. – P. 189-200. 14. Лапенко Л.А., Виленский М.Г. Метод атомно-абсорбционной спектрофотометрии в фоновом мониторинге тяжелых металлов // Мониторинг фонового загрязнения природной среды. - Вып.3. - Л.: Гидрометеоиздат, 1986. - С. 216-223. 15. Лейтес Е.А., Смагин В.П. и др. Практикум по аналитической химии: Учебное пособие. - Барнаул: Изд-во «Азбука», 2004. - 75 с. 16. Лакин Г.Ф. Биологическая статистика. – Минск: Высшая школа, 1990. – 230 с. 171 Б.C. Джолдыбаева, Н.А. Алтыбаева, А.К. Бисенбаев ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ ЭКЗОГЕННОЙ Н2О2 НА ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК АЛЕЙРОНОВОГО СЛОЯ ЗЕРНА ПШЕНИЦЫ (Казахский национальный университет им. аль-Фараби, НИИ Проблем биологии и биотехнологии) В данной работе показано, что в присутствии гибберелловой кислоты интактные алейроновые ткани обладают значительной способностью к утилизации экзогенно добавленной Н2О2 в течение первых 24 часов инкубации. Дальнейшее увеличения времени инкубации в присутствии ГК приводит к значительному снижению способности к утилизации экзогенно добавленной Н2О2. Напротив, обработанные абсцизовой кислотой интактные алейроновые ткани сохраняют способность к утилизации Н2О2 в течение всего времени инкубации. Действие ГК сопровождается максимальным снижением активности СОД. АБК в клетках алейронового слоя, возможно, задерживает генерацию О2• за счет усиления активности СОД. Наблюдается строгая корреляция между сроком наступления ПГК алейронового слоя, генерацией О2• и изменением активности СОД Радикалы кислорода являются продуктами клеточного метаболизма. Они в относительно большом количестве синтезируются в митохондриях, хлоропластах, пероксисомах и на плазматических мембранах. Супероксидные радикалы генерируются не только в процессе дыхания при выработке АТФ, но и при аутоокислении, когда молекулярный кислород присоединяется к разным окисляемым биомолекулам [1]. Высокой химической активностью отличается гидроксильный радикал – •ОН, образующийся в результате взаимодействия О2• с Н2О2 - наиболее стабильной формой восстановленного кислорода (цикл Хабера-Вейсса). Гидроксильный радикал почти мгновенно - в течение 7х10-10 секунд - вступает в реакции с белками, нуклеиновыми кислотами, липидами, разрушая клеточные структуры, способствуя образованию продуктов окисления - перекисей, альдегидов, кетонов [2]. В клетках растений имеются ферментативные системы, действие которых направлено как на продукцию АФК (НАДФН оксидаза, пероксидаза, оксалатоксидаза, ксантиноксидаза и др.), так и на интенсивный метаболизм АФК (супероксиддисмутаза, аспартатпероксидаза, каталаза и др.). Супероксиддисмутаза (СОД) катализирует реакцию дисмутации - взаимодействие двух супероксидных радикалов друг с другом, превращая токсичный О2• в менее токсичную Н2О2. Аскорбат пероксидаза (АПО) и каталаза катализируют реакцию дисмутации Н2О2 до Н2О [3-5]. Ранее нами выявлена гормональный характер регуляции внутриклеточного уровня радикалов кислорода в клетках алейронового слоя зерна пшеницы [6;7]. Показано, что гибберелловая кислота (ГК) усиливает, а природный антагонист этого фитогормона – абсцизовая кислота (АБК) наоборот снижает генерацию О2• и Н2О2 в клетках алейронового слоя зерна пшеницы. Зависит ли интенсивность метаболизма радикалов кислорода в клетках алейронового слоя зерна пшеницы от присутствия ГК и АБК в инкубационной среде? Насколько генерируемые радикалы кислорода влияют на жизнеспособность клеток алейронового слоя зерна пшеницы? Для выяснения этих вопросов нами были проведены специальные опыты по изучению действия экзогенно добавленного Н2О2 на жизнеспособность обработанных ГК и АБК клеток алейронового слоя зерна пшеницы. Для этого алейроновые слои инкубировали в течение 24, 48 и 72 часов, затем в инкубационную среду вносили различные дозы Н2О2 (0-350мМ) и через 60 минут анализировали жизнеспособность клеток алейронового слоя с помощью исключения метиленового синего. Как видно из данных приведенных на рисунке 1 и 2, не зависимо от продолжительности времени инкубации (24, 48 и 72 часа), обработанные АБК (5мкМ), алейроновые клетки проявили устойчивость к 60 минутному действию различных доз экзогенно добавленной Н2О2. Значительное снижение жизнеспособности клеток алейронового слоя обработанных АБК наблюдалась при дозе Н2О2 350 мМ. Ответ ГК - обработанных клеток алейронового слоя зерна пшеницы к различным дозам Н2О2 зависел от продолжительности присутствия ГК в инкубационной среде. Клетки алейронового слоя, инкубированные в присутствии ГК в течение 24 часов, оказались более устойчивыми почти ко всем исследуемым дозам Н2О2. Последующее увеличение времени инкубации алейроновой ткани с ГК (48 и 72 часа) сопровождалось значительным увеличением чувствительности клеток ко всем использованным дозам Н2О2 (рисунки 1 и 2). При этом необходимо отметить, что снижение жизнеспособности обработанных ГК клеток алейронового слоя в течение 72 часов наблюдалось и в отсутствии Н2О2 (рисунок 2). 172 А – инкубация алейроновой ткани в течение 24 часов; Б – инкубация алейроновой ткани в течение 48 часов; 1 - АБК (5 мкМ); 2 - ГК (1 мкМ). Рисунок 1 – Эффект различных доз экзогенной Н2О2 на жизнеспособность клеток алейронового слоя зерна пшеницы в зависимости от продолжительности присутствия ГК и АБК в инкубационной среде 1 – АБК (5 мкМ), 2-ГК (1мкМ) Рисунок 2 - Эффект различных доз экзогенной Н2О2 на жизнеспособность клеток алейронового слоя зерна пшеницы инкубированных в присутствии ГК и АБК в течение 72 часов Таким образом, существует строгая корреляция между изменением внутриклеточной концентрации АФК и радикал - метаболизирующей активностью (Н2О2) клеток алейронового слоя зерна пшеницы на фоне характерных для апоптоза фрагментации геномной ДНК [8; 9]. В присутствии ГК интактные алейроновые ткани обладают значительной способностью к утилизации экзогенно добавленной Н2О2 в течение первых 24 часов инкубации. Дальнейшее увеличения времени инкубации в присутствии ГК приводит к значительному снижению способности к утилизации экзогенно добавленной Н2О2. Напротив, обработанные АБК интактные алейроновые ткани сохраняют способность к утилизации Н2О2 в течение всего времени инкубации. Возможно, регуляция активности ферментов антирадикальной защиты являются ключевым звеном в определении внутриклеточного уровня АФК в клетках алейронового слоя зерна пшеницы. Можно предположить, различия в генерации О2• и Н2О2 временя действия ГК обеспечивается переходом О2• в Н2О2 за счет активации реакции катализируемой СОД. При этом следует отметить, что увеличение в клетке концентрации H2O2, образовавшейся в результате супероксиддисмутазной реакций, представляет для клетки не меньшую опасность, чем увеличение О2• из-за возможности образования •ОН. Поэтому необходима ее постоянная инактивация в реакции, катализируемой каталазой. Как отмечалось выше, одним из главных компонентов ферментативного звена системы утилизации АФК клеток является СОД. Более 80% активности СОД определяется в цитозоле, а остальные 20% - в органоидах, главным образом, в митохондриях. 173 Характерной особенностью клеток растений, отличающих их от клеток других организмов, является наличие всех трех изоформ. В клетках животных, фермент присутствуют только в виде CuZnСОД и MnСОД, а в клетках прокариот - FeСОД и MnСОД. В растениях существуют все три изоформы - CuZnСОД, FeСОД и MnСОД [10; 11]. Изоформы СОД отличаются разной чувствительностью к ингибиторам CN– и H2O2. Так, CuZnСОД ингибируется CN– и H2O2, FeСОД только H2O2, а MnСОД невосприимчива к обоим ингибиторам [10]. В связи с этим в последующих экспериментах с использованием KCN и H2O2 выявляли различные формы СОД алейронового слоя зерна пшеницы. Для этого белковые образцы до нанесения на дорожку, инкубировали в свежеприготовленном растворе 4мМ KCN или 5мМ H2O2 в течение 30 минут при температуре 40С. Затем белковые экстракты фракционировали с помощью нативного ПААГ электрофореза (рисунок 3). Ингибиторный анализ выявил одну белковую зону на ПААГ устойчивую как к KCN, так и H2O2 (MnCOD) и одну полосу с активность FeCOD (устойчивый к KCN, но чувствительный к H2O2). Присутствие в инкубационной среде H2O2 и KCN позволило выявить около 5 форм CuZnСОД (чувствительное к обоим ингибиторам). Рисунок 3 - Чувствительность изоферментов СОД алейронового слоя зерна пшеницы к ингибиторам КCN и H2O2 Таким образом, результаты этих экспериментов позволили выявить наличие в клетках алейронового слоя зерна пшеницы всех трех изоформ СОД (CuZnСОД , MnСОД и FeСОД). Сопоставление динамики изменения активности и степени генерации радикалов кислорода в ходе ПГК позволяет более или менее определенно судить о времени индукции и/или активации индивидуальных СОД, ответственных за утилизацию О2•. В связи с вышеизложенными данными, интересно было исследовать динамику изменения активации СОД в зависимости от времени инкубации (рисунок 4). А Б 3 ед. активности 2,5 2 24 1,5 48 72 1 0,5 0 K ГК АБК ГК+АБК П р и м е ч а н и е: А - изменение активности зоферментов СОД ; Б - изменение общей ферментатив-ной активности СОД. Рисунок 4 - Динамика изменения активности СОД алейронового слоя зерна пшеницы 174 Как видно из данных представленных на рисунке 4 А, в присутствии ГК активность изоферментов СОД алейронового слоя снижалось по мере увеличения времени инкубации. Значительный ингибирующий эффект ГК на активность СОД наблюдалось на 48 час после инкубации. После 72 часа инкубации видна только одна электроотрицательная белковая зона с активностью Cu/Zn-СОД. Анализ время зависимого эффекта АБК показал, что АБК усиливает активность всех внутриклеточных форм СОД независимо от продолжительности времени инкубации. Внесение АБК в дозе 5мкМ к инкубируемым в присутствии ГК алейроновым слоям полностью блокировало ингибирующий эффект ГК на активность внутриклеточных форм СОД. Эксперименты по количественному анализу активности СОД показали, что инкубация ткани алейронового слоя с ГК в дозе 1мкМ в течение 24 и 48 часов приводит к снижению активность СОД приблизительно на 73%, по сравнению с контролем (рисунок 4 Б). Присутствие ГК в инкубационной среде в течение 72 часов приводило к существенному снижению общей ферментативной активности СОД (рисунок 4 Б). Внесение к инкубируемым изолированным алейроновым тканям в течении 24, 48 и 72 часов АБК (5 мкМ) полностью снимало этот эффект ГК. При этом наблюдалось значительное увеличение активности СОД как по сравнению с контролем, так и действием только ГК. Внесение в инкубационную среду только АБК в дозе 5 мкМ приводило к существенному повышению общей ферментативной активности СОД в гомогенате в течение всего времени инкубации (рисунок 4 Б). Результаты указывают на фитогормональный характер регуляции генерации О2• и активности СОД алейронового слоя зерна пшеницы. Под действием ГК в клетках алейронового слоя зерна пшеницы происходит существенное увеличение содержания активных форм кислорода. Действие ГК сопровождается максимальным снижением активности СОД. АБК в клетках алейронового слоя, возможно, задерживает генерацию О2• за счет усиления активности СОД. Наблюдается строгая корреляция между сроком наступления ПГК алейронового слоя, генерацией О2• и изменением активности СОД [7]. 1. Harris C.M., Massey V. The oxidative half-reaction of xanthine dehydrogenase with NAD; reaction kinetics and steadystate mechanism // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272. - Р. 28335-28341. 2. Gechev T.S. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death // Journal of Experimental Botany. - 2010. - Vol. 61 (2). - Р. 473-482. 3. Kuk Y.I., Shin J.S., Burgos N., Hwang T., Han O., Cho B.H., Jung S., Guh J.O. Antioxidative enzymes offer protectionfrom chilling damage in rice plants // Crop. Sci. - 2003. - Vol. 43. - Р. 2109-2117. 4. Rauchova H., Vokurkova M. , Koudelova J.Developmental changes of erythrocyte catalase activity in rats exposed to acute hypoxia // Physiol. Res. - 2005. - Vol.54(5). - P.527-532. 5. Kvaratskhelia M., Winkel С., Thornclcy R. Purification and characterization of a novel class III peroxidase isoenzyme from tea leaves // Plant Physiology. - 1997. - Vol.114. - P.1237-1245. 6. Бисенбаев А.К. Роль активных форм кислорода и антиоксидантных ферментов в гормонально регулируемой гибели клеток алейронового слоя зерна пшеницы // Биотехнология Теория и практика. - 2005. - №4. -С. 142-149. 7. Bissenbaev A.K., Altybaeva N.A., Kolbaeva G.A. Role of reactive oxygen species and antioxidant enzymes in hormone regulating programmed cell death of wheat aleurone layer // Journal of Cell and Molecular Biology. - 2007. - Vol.6(1). - P. 41-48. 8. Бисенбаев А.К. Внутриклеточная локализация эндодезоксирибонуклеаз алейронового слоя зерна пшеницы// «Биотехнология Теория и практика». - 2005. - №4. - C. 137-141. 9. Бисенбаев А.К. Биохимические механизмы програмированной гибели клеток эндосперма зерна пшеницы // Материалы Международной научной конференции. «Актуальные проблемы науки и образования в области химии и биологии». - Алматы. - 2005. - C. 434-438. 10. Ogawa K., Kanematsu S., Asada K. Generation of superoxide anion and localuzation of CuZn-superoxide dismutase in vascular tissue of spinach hypocotyls: their association with lignification // Plant Cell Physiol. - 1997. - Vol. 38. - P. 1118-1126. 11. Wanders R.J.A., Denis S. Identification of superoxide dismutase in rat liver peroxisomes // Bopchim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol. 1115. - P. 259-262. *** Бұл жұмыста гиббереллин қышқылымен өңделген алейрон ұлпалары экзогенді қосылған Н2О2 алғашқы 24 сағатта ыдыратуға қабілеті жоғары екені көрсетілген. Инкубация уақытын əрі қарай жоғарылату нəтижесінде экзогенді қосылған Н2О2 ыдырату қабілеті төмендей түсетіндігі байқалады. Керісінше, абсциз қышқылымен өңделген алейрон ұлпалары Н2О2 ыдырату қабілеті барлық инкубация уақытында қалыпты сақталатындығын көрсетті. ГҚ-ның əсері тікелей СОД белсенділігінің төмендеуімен байланысты. Алейрон ұлпаларында АБҚ СОД белсенділігін жоғарылату нəтижесінде О2• түзілуін тежейді деген болжам бар. Алейрон қабатының ПКӨ басталу уақыты, О2• бөлініп шығуы жəне СОД белсенділігінің өзгеруі арасында қатаң корреляция сақталатыны көрінеді. *** In present work we show that an intact aleurone tissue in presence of gibberellic acid possesses a significant capacity of utilizing exogenous Н2О2 during first 24 hours of incubation. Subsequent increase of incubation time leads to dramatic attenuation of Н2О2 utilization. Conversely, abscisic acid-treated aleurones retain the Н2О2-utilizing capability throughout the whole incubation period. The effect of GA is coincident with maximal decrease in SOD activity. Supposedly, ABA retards a О2• generation in aleurone cells via activation of SOD. The strong correlation between the time of aleurone layer PCD onset, О2• generation and oscillation of SOD activity is observed. 175 Д.Б. Джусупова ВНЕДРЕНИЕ КУРСА «ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ» ДЛЯ ПОДГОТОВКИ В ВУЗАХ СПЕЦИАЛИСТОВ ЭКОЛОГОВ (Казахский национальный педагогический университет им.Абая) В статье рассмотрена роль дисциплины «Экологическая биотехнология» в подготовке специалистов экологов в ВУЗах, ее основные направления и актуальные задачи. Бурное развитие комплекса наук биологического профиля и расширение практической сферы их применения обусловлено в значительной степени социально-экономическими потребностями общества. Такие актуальные проблемы, стоящие перед человечеством ХХI века, как дефицит чистой воды и продуктов питания, загрязнение окружающей среды, недостаток сырьевых и энергетических ресурсов, необходимость развития новых средств диагностики и лечения заболеваний, не могут быть решены традиционными методами. Поэтому возникла острая необходимость в разработке и внедрении принципиально новых методов и технологий. Большая роль в решении комплекса этих проблем отводится биотехнологии, в рамках которой осуществляется целевое применение биологических систем и процессов в различных сферах человеческой деятельности /1/. В современной биотехнологии в соответствии со спецификой сфер ее применения целесообразно выделить ряд разделов: - пищевая биотехнология; - промышленная микробиология; - медицинская биотехнология; - технологическая биоэнергетика; - сельскохозяйственная биотехнология; - биогидрометаллургия; - инженерная энзимология; - клеточная и генетическая инженерия; - экологическая биотехнология. Перспективность и эффективность применения биотехнологических процессов в различных сферах человеческой деятельности – от получения пищи и напитков до воспроизводства экологически чистых энергоносителей и новых материалов – обусловлена их компактностью и одновременно крупномасштабностью, высоким уровнем механизации и производительности труда. Эти процессы поддаются контролю, регулированию и автоматизации. Биотехнологические процессы в меньшей степени загрязняют окружающую среду отходами и побочными продуктами, кроме того, они мало зависят от климатических и погодных условий, не требуют больших земельных площадей, не нуждаются в применении пестицидов, гербицидов и других чужеродных для окружающей среды агентов. Поэтому биотехнология в целом и ее отдельные разделы находятся на ряду наиболее приоритетных направлений научно-технического прогресса и являются ярким примером «новых технологий», с которыми связывают перспективы развития многих производств. Биологические технологии находятся в настоящее время в фазе бурного развития, но их уровень во многом определяется научно-техническим потенциалом страны. Все высокоразвитые страны мира относят биотехнологию к одной из важнейших современных отраслей, считая ее ключевым методом реконструкции промышленности в соответствии с потребностями времени, и принимают меры по стимулированию ее развития. Особое место и роль в комплексе наук биотехнологического профиля и биотехнологических процессов принадлежит экологической биотехнологии в связи с обострением проблем окружающей среды. Экологическая биотехнология – это специальное применение биологических систем и процессов для решения задач охраны окружающей среды и рационального природопользования. Эти процессы включают утилизацию сельскохозяйственных, бытовых и промышленных отходов, очистку стоков и газо-воздушных выбросов, деградацию ксенобитиков, получение эффективных и нетоксичных препаратов для борьбы с болезнями и вредителями культурных растений и домашних животных, а также создание альтернативных и безвредных для окружающей среды способов получения энергоносителей и добычи полезных ископаемых. Сегодня в ВУЗах Казахстана ведется подготовка специалистов всех экологических специальностей, в том числе подготовка педагогических и научных кадров. Перед высшей школой стоят новые задачи по дальнейшему совершенствованию подготовки специалистов в области экологии и охраны окружающей среды, а также расширению знаний по различным направлениям современной экологической науки. 176 Концептуальной основой экологического образования и воспитания следует рассматривать концепцию перехода Республики Казахстан к устойчивому развитию на 2007-2024 годы. Устойчивое развитие необходимо для достижения целей стратегии развития Казахстана до 2030 года. Для Казахстана переход к устойчивому развитию является насущной необходимостью. Экологическое образование предназначено развить и закрепить более совершенные стереотипы поведения людей, направленные на: - экономию природных ресурсов; - предотвращение загрязнения окружающей среды; - повсеместное сохранение естественных экосистем; - содействие проведению совместных природоохранных действий и осуществление единой экологической политики в государствах. «Экологическая биотехнология» является одной из основных дисциплин в подготовке будущих специалистов экологов, биологов, поскольку имеет большие возможности для формирования и развития экологических понятий и знаний для практической реализации путей решения проблем охраны окружающей среды и рационального использования природных ресурсов. Специфическое применение биотехнологических методов для решения проблем окружающей среды, таких как переработка отходов, очистка воды, почвы и воздуха, устранение загрязнений, составляет предмет экологической биотехнологии /2/. Экологическая биотехнология – это новейший подход к охране и сохранению окружающей среды при совместном использовании достижений биохимии, микробиологии, генетической инженерии, химических технологий. Цель дисциплины «Экологическая биотехнология» - показать основные направления и достижения современной биотехнологии в решении проблемы охраны окружающей среды и рационального использования природных ресурсов. Основные задачи дисциплины состоят в изучении принципов биотехнологической очистки сточных вод и газовых выбросов от загрязнителей, биотехнологии переработки и ликвидации твердых бытовых и про мышленных о тхо до в, полу чения биогаза и биотплива, определении ро ли биотехнологии в решении комплексных проблем сельского хозяйства, а также некоторых аспектов биогеотехнологии при добыче металлов из минерального сырья. В результате изучения данной дисциплины формируются теоретические знания: - об основных направлениях современной экологической биотехнологии как междисциплинарной области научно-технического прогресса; -об особенностях водных экосистем и их загрязнении широким спектром токсических веществ и роли биотехнологии в решении проблем охраны водных экологических с и с т е м , в ч а с т н о с т и о ч и с т к и с т о ч н ы х в о д о т о р г а н и ч е с к и х и неорганических загрязнителей; - о методах биологической очистки загрязненного воздуха; -о биотехнологических аспектах переработки и ликвидации промышленных и сельскохозяйственных отходов; -об использовании биотехнологии в решении некоторых проблем горнодобывающей промышленности по извлечению металлов из руд; -о комплексных проблемах по получению экологически чистых видов топлива - биогаза и биотоплива; - об эколого-биотехнологических альтернативах в сельском хозяйстве. Усвоению материалов предлагаемой дисциплины помогут знания, приобретенные студентами ранее при изучении дисциплин «Экология и устойчивое развитие», «Основы охраны природы», «Экология микроорганизмов, «Прикладная экология» и другие. Учебно-методический комплекс по дисциплине «Экологическая биотехнология», составленный с учетом многолетнего опыта научно-исследовательской работы автора в области экологической биотехнологии с использованием новейших достижений отечественных и зарубежных исследователей, включает основные структурные элементы: силлабус, тезисы лекций, карту учебно-методической обеспеченности дисциплины, планы и задания для проведения семинарских и практических занятий, СРСП и СРС, тестовые задания, глоссарий и т.д. Кредитная технология обучения предполагает использование интерактивных методов обучения, что безусловно способствует активизации самостоятельной работы студента в освоении учебной программы. Так, возросшая производительность персональных компьютеров сделала возможным достаточно широкое применение технологий мультимедиа /3/. В частности, на 177 занятиях (как лекционных, так и семинарских) широко используются компьютерные презентации. Компьютер оказывается и неоценимым помощником при обработке результатов студенческого рейтинга. Применение компьютерных технологий способствует интенсификации образовательного процесса в ходе изучения дисциплины «Экологическая биотехнология», а также способствует профессиональной подготовки будущего специалиста-эколога к самостоятельной практической деятельности. Следует также отметить, что экологическое образование включает поиск новых форм и методов активизации экологического образования студентов. Одним из многообразных путей достижения этой цели является привлечение студентов к исследовательской работе путем выполнения и написания курсовых и дипломных работ, темы которых связаны с биотехнологическими аспектами охраны окружающей среды. Актуальность выполняемых работ заключается в том, что большинство биотехнологических разработок прямо или косвенно связано с глобальными проблемами, стоящими перед современной цивилизацией, одной из которых является загрязнение окружающей среды. Эта проблема и пути ее решения с точки зрения биотехнологических подходов освящена в ряде дипломных работ студентов бакалавров и магистров по специальности «Экология». 1.Егоров Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии. – М., Академа, 2003. 2. Джусупова Д.Б. Технологии очистки природных и производственных сточных вод. – Алматы, 2006. 3. Карпенко М.П. Инновационные педагогические технологии в образовании - М., 2001. *** Мақалада «Экологиялық биотехнология пəнін жоғары оқу орындарының экология мамандықтарын дайындауды ендірі, оның негізгі бағыттары жəне өзекті мəселелері талданады. *** In article the discipline role «Ecological biotechnology» in preparation of experts of ecologists in High Schools, its basic directions and actual problems is considered. K. Sh. Davletova1 , A.Y. Yerezhepov2 BIOTECHNOLOGY: ACHIEVEMENTS AND CONSEQUENCES. (1 The International Academy of Business, Almaty, Kazakhstan, 2 al-Farabi Kazakh National University, Almaty, Kazakhstan) The development of new biological tools in the second half of the 20th century gave immense possibilities for genetic engineering and creating new organisms with desirable characteristics. New horizons emerged for agriculture, medicine and environmental area. More than twenty years have passed since the first genetically engineered organisms have been planted in Canada and the USA in the late 1980s. In this article we have analyzed achievements and consequences of the biotechnological applications in agriculture and environmental area. Genetic engineering in basic sciences The primary application of genetic engineering has been in the field of basic science for cloning key genes in order to understand their functions. Success in sequencing of individual genes allowed studying genes’ networks and signaling pathways and, eventually, the mechanisms of functioning of the living organism. Biomedical engineering has been applied to cure human diseases (gene therapy), sequencing of whole genomes of different species, and later cloning of animals and manipulations with stem cells. The Human Genome Project, officially started in 1990, was and completed in 2003, revealing key genes associated with at least 30 diseases. The first genetically modified organisms (GMO) have been used solely for basic biological research needs. The transgenic mice research has provided wide range of applied biomedical studies to understand signaling mechanisms and drug screening to treat different diseases. Plant genes encoding biologically active proteins and their specific regions have been studied to understand plant responses to biotic and abiotic stresses. The break though was made with sequencing Arabidopsis thaliana genome and using it as a model plant system for functional genomics studies. New techniques using so-called gain- and loss-of-function T-DNA mutants allowed to study gene’s function at the genetic and protein levels. Mutation of a single Arabidopsis gene can reveal the functional activity of a missing gene which could be then confirmed by producing of transgenic Arabidopsis plants over-expressing the gene of interest. Much has been done in this field to understand plants response to different pathogens, draught, salinity, extreme temperatures etc. The Arabidopsis model has been successfully used to understand oxidative stress network induced by pathogens and harsh environmental conditions. 178 Genetically Modified Organisms for agriculture Advanced approaches have been considered in agriculture for improvement of plant products’ qualities, their fortification with important nutrients, strengthening plants abilities to resist microbial and viral diseases. A number of GMO have been created for commercial use claiming that they will help to reduce the use of herbicides and pesticides. GM herbicide-resistant crops such as Roundup Ready crops (soy, corn, cotton, sugarbeets, alfalfa and canola) can survive spraying with Monsanto's Roundup herbicide, the most widely used deadly herbicide in the world. Recently, new GM herbicide-tolerant crops have been developed by Dow AgroSciences, which can resist the infamous herbicide 2,4-D, a major ingredient in the notorious Agent Orange chemical defoliant used during the Vietnam War [1]. The Agent Orange ingredient is linked to human diseases from cancer to immunosuppression, reproductive damage to neurotoxicity [2]. Another danger is that this leads to herbicide-resistant weeds. Indeed, the course of evolution has shown that new organisms via mutation have emerged to resist and survive. Andrew Kimbrell, director of the Center for Technology Assessment in Washington, believes, ''Biological pollution will be the environmental nightmare of the 21st century” [3]. “Biological pollution is an entirely different model, more like a disease. Is Monsanto going to be held legally responsible when one of its transgenes creates a superweed or resistant insect?” Genetically engineered crops that can resist pesticides produce their own pesticides. GM potato known as the New Leaf Superior was from Bacillus thuringiensis, the soil bacterium that produces the organic insecticide. Expression of its own Bt insecticide made it resistant from the Colorado potato beetle [3]. Interestingly, the Bt potato is classified as pesticides by the EPA. The quality such as insect- resistance is good only for commercial use but not for family farmers and is threatening for the environment and human health. Another, neither less threatening problem is the spread of artificially expressed genes from GM plants into the wild environment. Pollen of GM crops can pass herbicide resistance genes to weedy relatives, affect the evolution of pests and wildlife, and the food chains of the whole ecosystem. The latest news places the last drop in GM crops failure. Scientists at Purdue University demonstrated an adverse impacts of clothianidin, an insecticide used as a seed treatment on GM corn and other crops on honey bee health [4]. It was found in dead bees and in pollen collected by bees. Neil Carman, Ph.D., says: “US researchers have documented major adverse impacts from clothianidin seed treatments in corn on honey bee health.” “Because of the vital role played by honey bees in crop pollination, honey bee demise threatens the production of crops that produce one-third of American diets, including nearly 100 fruits and vegetables. The value of crops pollinated by bees exceeds $15 billion in the US alone.” Scientists warn that insertion of one gene can hardly affect the crops yield which is genetically controlled by a gene complex. Moreover, unpredicted challenges have revealed the complexity in the field of plant engineering. For example, the successful production of Bt corn. The bt toxin produced by these GM crops are far stronger than any found in nature, and are produced throughout the plant. Consuming of adulterated rapeseed oil in 1983 caused death of hundreds people in Spain [5]. The fact that the adulterated rapeseed oil was tested on rats indicates that testing procedures for genetically modified food including rodent tests are not safe and sufficient for humans. Scientists are concerned with the consequences that can arise in the future because of unpredictable genetic modification of the introduced gene at a single site or multiple sites of the plant genome referred to as pleiotropic effects causing various phenotypic changes. Safety Evaluation of Genetically Modified Foods of the Division of Food Chemistry and Technology and Division of Contaminants Chemistry [6] states, “Undesirable phenotypes may include, for example, poor growth, reduced levels of nutrients, increased levels of natural toxicants, etc. Pleiotropic effects occur in genetically engineered plants obtained with Agrobacterium-mediated transformation at frequencies up to 30%.” "Residues of plant constituents or toxicants in meat and milk products may pose human food safety problems. For example, increased levels of glucosinolates or erusic acid in rapeseed may produce a residue problem in edible products," writes Gerald B. Guest, Director of the Center for Veterinary Medicine [7]. Manipulations with viral genetic material have been investigated to create modified viruses such as cauliflower mosaic virus plants resistant to viral diseases. The unexpected consequences of such genetic manipulations are little known. Another warning appeal of scientists, farmers, and environmental activists is that genetic engineering without careful study can create unprecedented problems to our society. Precautious studies are required before taking a single step in this direction, otherwise living organisms as the products of some three billion years of evolution will be lost forever from the face of the Earth.” Dr. George Wald from Harvard University, the 1967 Nobel Laureate in Medicine, writes, “It is all too big and is happening too fast. So this, the central problem, remains almost unconsidered. It presents probably the largest ethical problem that science has ever had to face. Our morality up to now has been to go ahead without restriction to learn all that we can about nature. Restructuring nature was not part of the bargain. For going ahead in this direction may be 179 not only unwise, but dangerous. Potentially, it could breed new animal and plant diseases, new sources of cancer, novel epidemics” [8]. However, the Food and Drug Administration (FDA) officials do not share those concerns. The the Monsanto Director of Corporate Communications Phil Angell, states that "Monsanto should not have to vouchsafe the safety of biotech food. Out interest is in selling as much of it as possible.” [9]. GM plants resistant to commercial herbicides were first planted in Canada and the USA in the late 1980s. Since largescale commercial cultivation has been approved in the mid 1990s, the USA is the largest producer of GM crops in the world. Nowadays over 80% of global GMO production is limited to the USA, Canada, Brazil, and Argentina. The genetically modified (GM) plants have been promised to increase crops yield to fight poverty and hunger in the poorest countries of the third world. To increase crops yield farmers have to use more fertilizer, and pesticide which destroy soil, pollute the ground water, intoxicate food, and, eventually, threaten human health. Monsanto proclaimed that ‘'current agricultural technology is not sustainable” promising to create GM plants that can fight all environmental adversities themselves expressing endogenous genes with desired qualities. “Biotechnology is the single most promising approach to feeding a growing world population while reducing damage to the environment”, claims Phil Angell, the Monsanto Director of Corporate Communications [10]. How do Biotech companies help to developing countries? They oblige farmers to sign contract that they will not save, resell, or exchange seed. That means that every year the farmers have to buy the seeds again from Biotech companies. These cabal contracts put poor farmers from developing countries into dependence from Biotech firms and give a rise to a modern form of slavery. Loss of yield in India caused enormous debt and pushed farmers to commit suiside [11]. Unprecedentedly, India accused the US-based Biotech company Monsanto in biopiracy for stealing its indigenous eggplant in order to create GM vegetable without permission and thus violating India’s Biodiversity Act. Recent attempts to introduce GM rice to China have also failed [12]. Scientists are concerned that biotechnology cannot provide secure food and reduce poverty in the developing world [13]. Biofuel and environmental applications According to the U.S. Department of Energy fossil fuel-based consumption could be reduced by 30% by 2030. Rising demand for biofuel has produced new techniques such as ethanol production by genetically modified corn and soybean resistant to pests and drought. The GM maize (corn) was the only food crop in Europe allowed for cultivation. Greenpeace confirms the commercial failure of GM food in Europe, where seven EU countries have imposed ban on MON810 [14]. Of about 179 million hectares of the EU’s agricultural land, only about 0.06% was used in 2011 to grow GM food. The French government banned the insect-resistant MON810 maize (corn) in 2012 and beyond as being dangerous for health and the environment [15]. Recently, a new technology using genetically modifying Escherichia coli bacteria and algae for producing next-generation biofuels has been developed [16,17]. This strategy could lead to mass production of these harmless for the environment biofuels from E.coli and other microorganisms. New approaches reveal numerous possibilities for industrial for biotech applications such as production of biodegradable plastics and other environmental issues. The potential of biotechnology can be used to prevent and remove pollution and wastes. In particular, the hydrocarbon-degrading activities of the so-called hydrocarbonoclastic bacteria can be applied to clean oil spills [18]. More approaches are awaiting for application to maximize economic input through bio-degradable waste and by-products generation, and potentially energy-saving bio-processes. 1. K.Roseboro. Opposition grows to “Agent Orange” GM corn. The Organic and Non-GMO Report. February 1, 2012 2. Stop Agent Orange Frankencorn! See: http://www.organicconsumers.org/gelink.cfm 3. M. Pollan. “Playing God In the Garden”, The New York Times of October 25, 1998., p.4. 4. K. Roseboro. Study says insecticide used with GM corn highly toxic to bees. February 1, 2012. See: http://www.nongmoreport.com/articles/february2012/insecticideforGMcorntoxicbees.php 5. See: http://www.greenpeace.org/international/en/campaigns/agriculture/problem/genetic-engineering/ 6. The Supplemental Information "Points to Consider for Safety Evaluation of Genetically Modified Foods" of the Division of Food Chemistry and Technology and Division of Contaminants Chemistry (1991) 7. G.B. Guest. Memorandum to Dr. James Maryanski, Biotechnology Coordinator. Subject: "Regulation of Transgenic Plants - FDA Draft Federal Register Notice on Food Biotechnology", February 5, 1992. 8. G. Wald “The Case Against Genetic Engineering” in The Recombinant DNA Debate, Jackson and Stich, eds. P. 127-128 (Reprinted from The Sciences, Sept./Oct. 1976 issue) 9. M.Pollan. “Playing God In the Garden”, The New York Times of October 25, 1998., p.6. 10. P. Angell. The New York Times of November 15, 1998. 11. Monsanto, World's Largest Genetically Modified Food Producer, To Be Charged With Biopiracy In India. December 3, 2011. See: http://www.huffingtonpost.ca/2011/10/03/monsanto-india-biopiracy-farmers_n_992259.html 180 12. China says ‘no’ to genetically engineered rice. January 31, 2012. See: http://www.greenpeace.org/international/en/news/features/China-says-no-to-genetically-engineered-rice/ 13. M. A. Altieri and P.Rosset. Ten Reasons Why Biotechnology Will Not Ensure Food Security, Protect The Environment, And Reduce Poverty In The Developing World. The J. Agrobiotechnology and Economics. V 2, Number 3-4, Article 3. See: http://www.agbioforum.org/v2n34/v2n34a03-altieri.htm 14. Germany Bars Genetically Modified Corn. The New York Times. April 14, 2009. 15. France upholds ban on Monsanto GM maize. February 13, 2012. See: http:// www. reuters.com/article/2012/01/13/france-monsanto-idUSL6E8CD4GK20120113 16. ScienceDaily (Jan. 6, 2008). See: http:// www.sciencedaily.com/releases /2008/01/080106202952.htm 17. http://biomasshub.com/knowledge-center/topic-guides/algae-biofuel/ 18. Martins V.A.P. "Genomic Insights into Oil Biodegradation in Marine Systems". Microbial Biodegradation: Genomics and Molecular Biology. (2008). Caister Academic Press. *** Разработка новых биологических средств во второй половине XX века дает огромные возможности для генной инженерии и создания новых организмов с желательными характеристиками. Появились новые горизонты для сельского хозяйства, медицины и в экологической области. Более 20 лет прошло с тех пор, когда первые генетически модифицированные организмы были посажены, в конце 1980-х в Канаде и США. В данной статье мы анализируем достижения и последствия применения биотехнологии в сельском хозяйстве и экологической области. *** ХХ ғасырдың екінші жартысындағы жаңа биологиялық қосылыстарды жасау технологияларының дамуы гендік инженерия үшін жəне қажетті белгілерімен ерекшеленетін организмдерді дүниеге келтіруге үлкен мүмкіндіктер береді. Ауыл шаруашылығы, медицина жəне экология салалары үшін жаңа белестер ашылды. 1980 жылдардың соңында Канада мен АҚШта, генетикалық жетілдірілген алғашқы организмдердің алынғанынан бері 20 жылдан астам уақыт өтті. Аталмыш мақалада ауыл шаруашылығы мен экология салаларына биотехнологияның жетістіктерінің əсері мен оларды қолданудың салдары қарастырылады. Р.Б. Жакешбаева, С.И. Альмурзаева МҰНАЙМЕН ЛАСТАНҒАН ТОПЫРАҚТЫҢ АУЫЛШАРУАШЫЛЫҒЫНДА МАҢЫЗДЫ ӨСІМДІКТЕРГЕ ƏСЕРІН АНЫҚТАУ (Қ. Жұбанов атындағы Ақтөбе мемлекеттік университеті) Жұмыста əртүрлі концентрацияда мұнай жəне оның өнімдерімен ластанған топырақтағы ауылшаруашылығында маңызды өсімдіктердің өсуімен, олардың жерасты жəне жерүсті мүшелерінің дамуына, сонымен қатар мұнаймен ластанған топырақтың жəне сол топырақта өсірілген өсімдіктердің құрамындағы ауыр металдарға сараптама жүргізілді. Қазақстанның батыс өңірінде табиғатты негізгі техногенді ластаушылар мұнай жəне оның өнімдері болғандықтан бұл мəселе осы аймақта өзекті болып отыр. Қоршаған ортаны əртүрлі улы қосылыстармен, соның ішінде мұнай жəне оның өнімдерінен қорғау, төтенше маңызды, экологиялық мəселе болып отыр. Мұнайды құбырлар арқылы тасымалдау, мұнай саңылауларын бұрғылау кезінде, мұнайды өндіріс орнында өндіру кезінде жəне т.б. жағдайда қоршаған ортаның көмірсутектермен ластануы орын алады. Мұнай құбырларын салудың флористикалық құрамға əсерін зерттегенде мұнай құбырларын салудың жанама əсерлері негізінен көп сипаттамаға ие жəне топырақтың механикалық бүлінуі мен тамырлы өсімдіктердің түгелдей жойылуына əсер етеді [1,2]. Тəжірибе лабораториялық жағдайда, таза топырақты 1.5%, 3.0% жəне 6.0% концентрацияда шикі мұнаймен ластау арқылы жүргізілді. Топырақтың жалпы фитоуыттылығын Гродзинский А.М. ұсынған əдістеме арқылы анықтадық [3]. Ластанған топырақтың фитоуыттылығын бағалауға арналған сынақөсімдік ретінде: қара бидай мен бидайдың буданы Тритикале (Triticesecale №352), күздік қара бидай (Secale cereale), жергілікті (Triticum) бидай сорттары-«Оренбургская №10» жəне «Қарғалы №11», сонымен қатар далалық бидайық (Agropyron desertorum) өсімдіктері қолданылды. Мұнаймен ластанған топырақ жəне өсімдіктер құрамындағы ауыр металдардың концентрациясы атомды-адсорбциялық спектрометриялық əдіспен «ИСТ-ЭКО» ЖШС-нің зерттеу лабораториясында анықталды [4]. Мұнаймен ластанған топырақ пен өсімдіктердің химиялық құрамына зерттеу жүргізу кезінде төмендегідей нəтижелерге қол жеткіздік. Тритикале өсімдігі егілген топырақта қорғасынның мөлшері бақылаудың өзінде ШМК-дан 2 есе жоғары (2.15±0.906г/кг), өсу дəрежесі келесідей: 1.5%≤ бақылау ≤ 3.0% ≤ 6.0%. Мыстың топырақтағы концентрациясының жоғарылауы келесі ретпен жүрді: 3.0%≤бақылау ≤1.5%≤6.0% (2.3±0.644г/кг). Мырыштың мөлшері келесідей көрсеткішті көрсетеді: бақылау ≤ 3.0% ≤ 1.5% ≤ 6.0% (12.3±0.742 г/кг). Никельдің мөлшері: бақылау ≤1.5% ≤ 3.0% ≤ 6.0 (19.6±0.949г/кг) болады. Хром мөлшеріне ауылшаруашылық мақсатта пайдаланатын топыраққа ортақ ШМК бекітілмеген. Біздің тəжірибемізде хромның мөлшері төмендегідей: бақылау≤3.0%≤1.5%≤6.0% (9.12±0.443г/кг). Қара бидай егілген топырақ сынамаларында мұнай дозасы жоғарылаған сайын ауыр 181 металдардың жиналуы да сəйкесінше жоғарылай берді (ескеретін жайт, қорғасын 6,0%, мырыштың бақылау сынамасында жəне хром 1.5%-дық концентрациясында көрсеткіш керісінше). Қорғасынның өсу деңгейі төмендегідей ретпен жүрді: бақылау≤6.0%≤ 3.0%≤ 1.5% (2.0±0.091г/кг) . Мыстың мөлшері келесідей: бақылау ≤ 1.5% ≤ 6.0%≤ 3.0% (1.15±0.779 г/кг). Мырыш көлемі өсу реті бойынша: 1.5% ≤ 3.0% ≤ 6.0% ≤ бақылау (21.0±0.236г/кг). Никель концентрациясы келесідей ретпен орналасады: бақылау ≤ 1.5% ≤ 3.0% ≤ 6.0% (18.9±0.99г/кг). Топырақтағы хромның шоғырлануы келесідей: бақылау ≤3.0% ≤ 6.0%≤ 1.5%, (5.69±0.274г/кг). Бидайдың «Оренбургская №10» сорты бойынша қорғасынның өсу динамикасы келесідей болды: 3.0% ≤ бақылау ≤ 1.5% ≤ 6.0% (2.05±0.506г/кг). «Қарғалы №11» сорты үшін: бақылау ≤ 6.0%≤3.0% ≤ 1.5% (21.96±0.18г/кг). «Оренбургская №10» сорты егілген топырақтағы мыс мөлшері: бақылау ≤ 1.5% ≤ 3.0% ≤ 6.0% (1.03±0.968г/кг), «Қарғалы №11» сорты үшін: 3.0% ≤ 1.5% ≤ бақылау ≤ 6.0% (3.5±0.203г/кг) . Мырыш концентрациясының жоғарылау реті: «Оренбургская №10» сорты бақылау ≤ 1.5% ≤ 3.0% ≤ 6.0% (11.2±0.820г/кг), «Қарғалы №11» сорты үшін: 3.0% ≤ 6.0% ≤ 1.5% ≤ бақылау (17.8±0.418г/кг). Никель мөлшері барлық сынамаларда ШМК-дан жоғары болды, өсу реті бойынша:«Оренбургская №10» сорты бақылау ≤ 3.0% ≤ 1.5% ≤ 6.0% (16.8±0.595), «Қарғалы №11» сорты үшін: бақылау ≤ 1.5% ≤ 3.0% ≤ 6.0% (16.9±0.965г/кг). Топырақтағы хромның мөлшерінің өсу динамикасы келесідей: «Оренбургская №10» сорты үшін бақылау ≤ 3.0% ≤ 1.5% ≤ 6.0% (6.3±0.712г/кг) , «Қарғалы №11» сорты үшін 3.0% ≤ 1.5% ≤6.0% ≤ бақылау (8.99±0.093г/кг) . Далалық бидайық егілген топырақтағы қорғасын мөлшерін өсу ретімен қойсақ: 1.5% ≤ бақылау ≤ 6.0% ≤ 3.0% (1.4±0.926г/кг). Мыстың көрсеткіштері бойынша өсу реті келесідей: бақылау≤3.0%≤1.5%≤6.0% (1.14±0.706г/кг). Бақылаудың өзінде аталмыш өсімдік егілген топырақта мырыш 2 есе жоғары, көрсеткішті ретімен орналастырсақ: бақылау≤1.5%≤ 3.0%≤6.0% (8.4±0.959г/кг) . Никель мөлшері бақылауда ШМК-дан 55 есе жоғары болса, аталмыш метал концентрациясының өсу реті бойынша келесідей қоюға болады: 1.5% ≤ бақылау≤3.0%≤6.0 (22.3±0.884г/кг). Хром мөлшерін өсу реті бойынша келесідей орналастыруға болады: бақылау ≤3.0% ≤ 1.5% ≤ 6.0% (5.91±0.894) (1 кесте). Əртүрлі концентрацияда мұнаймен ластанған топырақта өскен өсімдіктердің құрамындағы ауыр металдардың мөлшеріне сараптама жасағанда келесідей нəтижелерге қол жеткіздік. Тритикале өсімдігі ауыр металдар мөлшері жағынан ШМК-дан жоғары топырақта өскенімен құрамындағы қорғасын көлемі бақылауда жəне 1.5% сынамада ШМК-дан төмен. Жоғарыда келтірілген мəліметтерге сай топырақта қорғасын мөлшері едəуір жоғары дəрежеде болғанмен өсімдіктің құрамында металдың мөлшері шектеулі нормадан жоғарыламаған, өсу ретімен келтірсек: бақылау≤1.5%≤3.0%≤6.0%. Мыстың мөлшері: бақылау ≤3.0%≤1.5%≤ 6.0%. Мырыштың мөлшері: 1.5%≤бақылау≤3.0%≤6.0%. Никельдің шоғарлануы бақылаудың өзінде ШМК-дан 3 есе жоғары болды. Көрсеткіштерді өсу ретімен орналастырғанда: бақылау≤3.0%≤1.5%≤6.0%. Хром концентрациясының жоғарылау деңгейі былайша орналасады: бақылау≤ 3.0%≤1.5%≤6.0%. Күздік қара бидай егілген топырақтағы қорғасынның мөлшері бойынша келесідей орналастыруға болады: 1.5%≤бақылау≤3.0%. Мыстың шоғырлануын жоғарылау ретімен орналастырсақ: 1.5 ≤бақылау≤ 3.0. Мырыштың концентрациясының арту реті: 1.5% ≤ 3.0% ≤ бақылау. Никель мөлшері бақылауда ШМК-дан 4.5 есе жоғары болды, көрсеткіштерді өсу ретімен орналастырсақ: бақылау ≤ 3.0% ≤ 1.5%. Қара бидайдың бақылау сынамасында хром келесідей: бақылау ≤1.5% ≤ 3.0%. Бидайдың «Оренбургская №10» жəне «Қарғалы №11» сорттары үшін қорғасынның өсу дəрежесі келесідей: бақылау ≤1.5% ≤ 3.0%. Мыстың өсу динамикасы «Оренбургская №10» сорты үшін бақылау ≤1.5% ≤ 3.0%, болса, «Қарғалы №11» сортында 1.5% ≤ 3.0% ≤ бақылау. Өсімдіктердегі мырышқа бекітілген ШМК 0.5 мг/кг, аталмыш металдың өсу ретімен былайша орналастыруға болады: «Оренбургская №10» сорты үшін бақылау ≤1.5% ≤ 3.0%, болса, «Қарғалы №11» сортында 1.5% ≤ бақылау ≤ 3.0%. Никель мөлшері бойынша өсу ретімен қойсақ «Оренбургская №10» сортында: бақылау ≤1.5% ≤ 3.0%, болса, «Қарғалы №11» сортында 1.5% ≤ бақылау ≤ 3.0%. Өсімдіктердегі хромның шоғырлануы: «Оренбургская №10» сорты үшін: 1.5% ≤ бақылау ≤3.0%, болса, «Қарғалы №11» сорты үшін 1.5% ≤ бақылау ≤ 3.0%. Далалық бидайық өсімдігінің құрамындағы қорғасынның өсу реті бойынша қойсақ: 3.0%≤бақылау≤1.5%. Мыс мөлшері: бақылау≤3.0%≤1.5%. Мырыштың бидайықта шоғырлануы: бақылау ≤1.5% ≤3.0%. Никель мөлшері бойынша- 1.5%≤ бақылау ≤3.0% болса, ал хром мөлшері: 3.0%≤ бақылау ≤ 1.5% болды (2 кесте). Тəжірибедегі топырақ құрамындағы ауыр металдардың мөлшері рұқсат етілген деңгейден өте жоғары көрсеткіш көрсеткеніне байланысты, топырақ жəне өсімдіктердің одан əрі қарай ластануына қарсы жедел шаралар қолдануды қажет етеді. Біздің жүргізген тəжірибеміздің нəтижесінде зерттеуге алынған сынақ-өсімдіктердің құрамында ауыр металдар ШМК-дан 10-80 есе жоғары деңгейдегі топырақта өссе де, вегетативті мүшелерінде олардың мөлшері ШМК-дан айтарлықтай дəрежеде ауытқымады. Тек ескере кететін жайт, мырыш пен 182 никель мөлшері өсімдіктерде ШМК-дан 4-7 есеге дейін артып отырды. Бұл жерде айта кетер жағдай, отандық жəне шетелдік тəжірибелердің нəтижелеріне шолу жасау арқылы В.Г. Минеев (1990ж) қабылдаған əртүрлі өсімдіктердегі элементтердің шектеулі жəне критикалық аумалы концентрациясының орташа дəрежесі өсімдіктерде кең диапазонда ауытқып отырады. Мысалы, Сrның критикалық ауытқу концентрациясы 1-2 мг/кг, Pb-10-20, ал Zn-150-200 мг/кг-ды құрайды [5]. Өзге авторлардың тəжірибелері мен біздің жүргізген зерттеулерді салыстыра келе ауылшаруашылық культураларының ауыр металдарды сіңіруі, яғни топырақ – тамыр шекарасында физиологиялық «барьері» бар екендігін анық байқауға болады 1. А.Киреева, Т.Р.Кабиров, И.Е.Дубовик. «Комплексное биотестирование нефтязагрязненных почв». Теоретическая и прикладная экология // Общественно-научный журнал, 2007. №1. 8с 2. Демина Т. А. Экология, табиғатты пайдалану,қоршаған ортаны қорғау: Нұсқаулық. - М.: Аспект Пресс, 1998ж. 4 б. 3. Гродзинский A . M . Аллелопатия растений и почвоутомление. - Киев: Наукова думка, 1991. - 430 с. 4. И.Ю. Пархоменко, В.Л. Таусон, В.И. Меньшиков Термическая атомно-абсорбционная спектроскопия как метод диагностики форм нахождения тяжелых металлов в объектах окружающей среды и минералах. 158-160с. 5. Босиева О.И., Плиева Е.А. Сборник научных трудов «Естествознание и гуманизм», 2006 год, Том 3, выпуск 3, под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Б.Ə. Жұмабаева, С.Қ. Тұрашева, Ұ.О. Абдықалықова «КАЗАХСТАНСКАЯ-10» БИДАЙ СОРТЫНЫҢ СОМАКЛОНДАРЫНЫҢ СЕЛЕКЦИЯЛЫҚ БЕЛГІЛЕРІН АНЫҚТАУ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті) «Казахстанская-10» бидай сортынан жетілмеген ұрық дақылдарынан алынған сомаклондарының сандық селекциялық белгілері зерттелінген. Селекциялық жұмыстар жəне оның тиімділігі қоршаған ортаның əр түрлі əсерлеріне төзімді бастапқы материалдардың болуымен жəне олармен селекциялық жұмыстар жүргізуіне байланысты.Сыртқы ортаның экстремальді жағдайлары – құрғақшылық, аптап ыстық, сортаңдану, суық жəне басқа да стресс факторлары біздің мемлекетіміздің байтақ жерінде өсетін өсімдіктерге кері əсерін тигізетіні бəрімізге мəлім. Олар едəуір түрде еліміздің экономикасы мен қор байлығын толықтыруға зиянын тигізіп, бағалы ауылшаруашылық дақылдардың өнімділігін төмендетеді. Сондықтан өсімдіктердің қолайсыз жағдайларға төзімділігін арттырудың тиімді жолдарын іздестіру жəне өңдеу – мемлекеттің маңызды міндеттерінің бірі болып табылады. Генетикалық өзгерістері бар каллус клеткаларынан регенерант өсімдігін шығару процесінде кейбір мутациялар регенеранттарға берілуі мүмкін. Көбінесе регенерант өсімдіктердің бастапқы донорлық өсімдіктерден айырмашылығы,олардасомаклондық өзгергіштік пайда болады. Қоректік ортаны үйлестіру арқылы жетілмеген ұрықтарды өсіріп, өміршең өсімдік алу арқылы өсімдіктің биіктігі, қылтанақтың ұзындығы, дəннің түсі, масақтың пішіні, белоктардың электрофорездік спектрі сияқты жəне т.б. белгілерін өзгертуге болады. Регенерант өсімдік сомаклондық мутант екендігін дəлелдеу үшін жыныстық жолмен көбейтетін түрлердің регенеранттарын өздігінен тозаңдандырып жəне тиісті будандастырулар арқылы генетикалық тексеруден өткізіледі[1]. Сомаклондық өзгергіштік əр түрлерге жататын көптеген өсімдіктерде байқалған. Əсіресе қызықтыратын астық тұқымдастарының сомаклондық варианттары, себебі олар жаңа сорттың бастапқы селекциялық материалы болып табылады. Біздің тəжірибеміздің алғашқы кезеңде бидай сорттарының жетілмеген ұрық дақылдарында каллусогенез жəне морфогенез үдерістері зертелінді. Зерттеу барысында қолданылған қоректік орталардың ішінде каллусогенез жəне морфогенездіарттыру үшін ең қолайлы орта Гамборг В5 табылды. Зерттеу нəтижелері каллусогенез жəне морфогенез жиілігі бойынша бидайдың генотипке жəне қоректік ортаға тəуелділігі айқын көрсетті. Зерттелінген сорттар арасында каллусогенез жиілігі бойынша ең жоғары көрсеткішті Казахстанская-10(99,3 % )генотипінде, ал салыстырмалы төменгі каллустар жиілігі Казахстанская-3 жəне Отан сорттарында (90-93 % аралығында)байқалды [2].Əр түрлі сорттардың каллус ұлпаларының өркен түзу қабілеті 15,5 %-тен (Қазақстан-10) жоғары аспайтыны анықталды.Алынған регенеранттар (Р0) онтогенездіңүш жапырақ сатысында: 2/3 қара топырақ, 1/2 құм, 2/4 қара шіріктен тұратын жəне алдын ала автоклавқа 900С залалсыздындырылғанқоспағаотырғызылды. Əдебиеттер бойынша [3]іn vitro жағдайында регенерант-өсімдікті регенерациялау арқылы өзгерген формаларын алуға болады. Бірақ соңғы жылдардағы зерттеулер көрсеткендей, барлық 183 өзгерістер тұқым қуаламайды, яғни сомаклондық линияларда тұқым қуалайтын жəне қуаламайтын өзгерістер кездеседі. Жұмыстың келесі сатысында алынған Казахстанская-10 сортының регенеранттарының (Р1) сандық белгілері зерттелініп, олардың өзгергіштігі талдауға алынды. Бұл жұмыста негізінен сомаклондық өзгерістердің тұқымқуалаушылық қасиеттеріне назар аударылды. Бидайдың Р1ұрпақтағы кейбір регенерант өсімдіктерде əр түрлі морфологиялық өзгерістер байқалды. Мысалы, бірнеше өсімдіктердің масағы тығыз емес, əрі олардан алынған дəн саны аз болды. Ал кейбір регенерант-өсімдіктер буынаралық ұзындығы бойынша жоғары өзгергіштікпен ерекшеленді. Бұл регенерант- өсімдіктердің дəн байланбауын жоғарлататын гормондық индуктор ретінде қолданылған гербицид 2,4-Д (дихлорфеноксисірке қышқылы) қолданғанға байланысты деп санайды [4]. Жалпы алынған сомаклондық өсімдіктердің негізі бақылаудан көп ауытқымады. Зерттелінген регенерант-өсімдіктердің морфологиялық жəне сандық белгілерімен өзгергені 12%, оның ішінде: тығыз емес масақ (2%), жартылай дəндері байланбаған өсімдік (3%), ұзын жəне қысқа бойлы өсімдіктер(7%)болды. Бірінші ұрпақта мұндай ауытқулар клеткалар дақылында өсу кезеңіндегі физиологиялық бұзылыстардың нəтижесі болуы да мүмкін. Масақ пішіннің өзгеруін кейбір ғалымдар Р.Г. Бутенко [5] көшпелі элементтердің тұрақсыздығынан деп есептейді. Сомаклон өсімдіктерінің морфологиялық өзгерістерімен қатар, түсімге жауапты сандық белгілері зерттелінді. Бидай түсіміне жауапты мына сандық белгілер: түп саны, масақ ұзындығы, масақтағы дəн саны, масақтан жəне бір өсімдіктен алынған дəннің салмағы жəне 1000 дəн салмағы зерттелінді. Өсімдік бойының ұзындығы бидайдың жатаған болмауына жауапты белгі болып табылады. Егісте фенологиялық бақылау жұмыстары үшін Р1-регенеранттары Казахстанская-10 сортының өзімен қатар егілді. 1-кестеде сомаклондық өсімдіктерінің биіктігі, бас масақтың ұзындығы, жоғары буынаралық ұзындық, өнімді түп саны көрсетілген. Зерттеу нəтижелері бойынша бақылау өсімдігінің биіктігінің орташа саны-101,26 см. Ал сомаклондардың биіктігінің орташа саны 106,35 см мен 69,58 см ортасын құрады. Масақтың орташа ұзындығы ең тұрақты белгі болып табылды, бақылаумен (11,6 см) салыстырғанда тек бір өсімдікте (N 3) бұл белгі 9,2 см-ге азайған. Алайда,бақылаумен (5,44%) салыстырғанда вариациялық коэффициент сомаклондар бойынша əлдеқайда үлкен (15,21%). Бұл олардың генетикалық əртүрлілігін көрсетеді. Ал, регенеранттардың жоғарғы бунаралық ұзындықтарын бақылаумен салыстырғанда үлкен айырмашылық жоқ,тек екі өсімдікте (N-1, 2) ұзындығы 41 см шамасын көрсеткен. Бір түптегі өсімдік саны бидай өнімділігін анықтайтын белгі болып табылады. Бұл белгі бойынша сомаклондардың орташа саны бақылаумен салыстырғанда өзгермеді, алайда тағы да вариациялық коэффициент бақылаумен салыстырғанда сомаклондарда үлкен айырмашылықты көрсетті. Ал бас масақтағы масақша саны мен дəн саны, бас масақтағы дəндердің салмағы, бір өсімдіктен алынған дəндер салмағы, бақылауға қарағанда сомаклондарда бір-екі көрсеткішке кеміген (1,2-сурет). Кесте 1 Қазақстан-10 сортының Р1сомаклондық регенеранттарының сандық белгілері Регенеранттар линия лары Өсімдік биіктігі, см Х±m сv Бас масақтың ұзындығы, см Х±m сv Жоғары буынаралық ұзындығы, см Х±m сv Бір түптегі өсімдік саны, дана Х±m сv Бақылау К-10 101,26±49 5,62 11,66±0,33 5,44 51,50±0,96 10,12 4,90±0,22 11 N-1 76,29±0,37 * 9,51 12,23±0,33 11,11 40,65±0,54* 15,17 4,21±0,43 29 N-2 82,68±0,38 * 69,58±0,37 ** 7,72 11,95±0,32 12,51 40,84±0,73* 14,25 4,33±0,51 25 10,5 6 9,20±0,28 11,52 40,74±0,42* 12,23 4,53±0,45 33 86,40±1,34 6,93 10,30±0,13 5,55 44,00±0,82* 8,34 4,10±0,14 15 N-3 N-4 184 N-5 108,15±1,5 7 6,48 11,80±1,36 10,51 51,80±1,36 11,78 4,25±0,33 28 N-6 104,20±1,1 6 4,77 10,55±0,34 13,02 50,90±1,25 10,35 5,00±0,18 13 N-7 97,22±1,6 9 7,4 0 10,61±0,3 8 N-8 96,67±1,49 5,98 11,60±0,31 10,20 51,13±0,98 7,46 5,00±0,24 18 N-9 106,35±1,3 4 5,65 11,85±0,35 13,21 54,50±0,69 5,69 4,90±0,20 15 N-10 96,62±1,44 5,26 11,82±0,25 12,11 54,30±0,48 5,79 4,51±0,21 17 15,21 52,39±2,00 15,21 4,22±0,30 24 Е с к е р т у: Арифметикалық орташа сан Х арқылы белгіленді. X – орта саны, см; m– орта санының қателігі;сv - өзгермелі нұсқа коэффицентінің қателігі. * p= 0,05 **p= 0,01 айырмашылық сенімді Сурет 1 - Казахстанская-10 сортының сомаклондарының: а) бас масақтағы дəндердің салмағы; ə) бір өсімдіктен алынған дəндер салмағы, мұнда бірінші қатарда бақылау өсімдіктері берілген Сурет 2 - Казахстанская-10 сортының сомаклондарының: а) бас масақтағы дəндер саны; ə) бас масақтағы масақшалар саны (мұнда бірінші қатарда бақылау өсімдіктері берілген) Мысалы, бір өсімдіктен алынған дəндер салмағы бақылаумен (7,0 г) салыстырғанда N-2 сомаклонында (4,9г) екі граммға дейін азайған.Осы өзгергерістердің вариациялық коэффициентін бақылаудың вариациялық коэфициентімен салыстырып көрсек (13,1%), онда сомаклондардың вариациялық коэффициентінің (13,1-32,0 %) арасында үлкен ауытқуы байқалады (3-сурет). 185 Бір өсімдіктен алынған дəндер санының вариациялық коэфициенті 35 30 В а р и а ц и ял ы қко эф и ц и е н т 25 20 15 10 5 0 13,1 Ба қыла у (13,1) ж əне сома клонда р Сурет 3 - Казақстан-10 сортының сомаклондарының бір өсімдіктен алынған дəндер санының вариациялық коэффициентінің ауытқу деңгейі Сонымен, сомаклон өсімдіктерінде пайда болған өзгерістер эпигенетикалық немесе модификациялық өзгергіштік болуы мүмкін. Оны анықтау үшін, бидай сомаклонының келесі ұрпақтарының сандық белгілерін талдау қажет. Р1-ұрпақтағы Қазахстанская-10 бидай сортының сомаклондық өсімдіктерінде морфологиялық жəне сандық белгілері бойынша өзгерістер байқалды. Зерттеу нəтижелері бойынша сомаклондардың биіктігінің орташа саны бақылаумен салыстырғанда 2530 см дейін ауытқыды. Ал масақтың орташа ұзындығы салыстырмалы тұрақты белгі болып табылды. Алайда вариациялық коэффициент бақылаумен (5,44%) салыстырғанда сомаклондарда əлдеқайда үлкен (15,21%) болды. Бұл сомаклондардың генетикалық əртүрлі табиғатынбайқатады. Зерттеу нəтижелерісомаклондар арасында бақылаумен салыстырғанда, кейбір өсімдіктердің түсімге жауапты белгілері бойынша сенімді айырмашылықтар көрсетті. Сонымен қатар,сомаклондардың ішінде, керісінше төменгі нəтижелер берген регенерантөсімдіктері де болды. Ал, СР-5 регенеранты болса, масақ салмағы мен бір өсімдіктен алынатын дəн саны бойынша дəлелді айырмашылықтар көрсетті. 1. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в сельскохозяйственной науке и практике// В кн.: Основы сельскохозяйственной биотехнологии Г.С.Муромцев, Бутенко Р.Г., Тихоненко Т.И., Прокофьев М.И. -М.: Агропромиздат, 1990 - С.179-187. 2. Жумабаева Б.А., Жунисбаева Ж..К. Морфогенез растений сорта пшеницы Казахстанская-10 // Материалы Международ. конф. «Современное состояние генетики в Казахстане», посвящ. 80-летию извест. учен. Ахматуллиной Н. Б.2010.- С. 88. 3.Терлецкая Н.В. Использование культуры тканей для селекции засухоустойчивых форм ячменя// Биотехнология. Теория и практика.- 1996.-№1. - С.64-71. 4. Шамина З.Б. Стратегия получения: мутантных штаммов клеток растений-продуцентов биологически активных веществ // Физиология растений, 1994, т. 41; с. 879-884. 5. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии в селекционном процессе// Материалы Всесоюзной конференции «Состояние и развитие сельскохозяйственной биотехнологии». Москва,-1986. - С.29-38. Д.А. Жусипова, Г.Ж. Абдиева, А.С. Жакипбекова, Г.С. Тансикбаева ЛАКТОБАКТЕРИЯЛАРДЫҢ БЕЛСЕНДІ ШТАМДАРЫ НЕГІЗІНДЕ СҮТҚЫШҚЫЛДЫ СУСЫН АЛУ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті, Алматы қаласы) Мақалада əртүрлі субстраттардан бөлініп алынған лактобактериялардың биотехнологиялық құнды қасиеттері зерттелініп, белсенді штамдар негізінде сүтқышқылды сусын алу əдісі қарастырылады. Тағам биотехнологиясы жоғары сапалы тағам өнімдерін алуға мүмкіндік беретін микробиологиялық жəне биохимиялық процестерге негізделеді. Тағам өндірісінің маңызды бір бағыты – емдік-профилактикалық қасиеттерге ие тағам өнімдерін өндіру болып табылады. Көптеген елдерде кейінгі жылдары құрамында лакто- жəне бифидобактериялары бар ферменттелген өнімдер кеңінен таралуда. Мұндай өнімдердің биологиялық емдік құндылығы тек олардың құрамына ғана емес, сонымен қатар тіршілікке қабілетті, патогенді жəне шартты - патогенді микроорганизмдерге антагонистік белсенділікке ие, асқазан-ішек жолдарында тіршілік етіп, қалыпты микрофлораны 186 қалыптастыруымен анықталады. Қазіргі кездегі адам организміне экологиялық факторлар мен стрестік жағдайлардың кері əсеріне байланысты халықты емдік жəне функциональдық тағамдық өнімдермен қамтамасыз ету үлкен мəселеге айналып отыр. Қазақстанда адам организмін сауықтыруға жəне емдік əсерге бағытталған тағамдық өнімдерді өндіру жеткіліксіз деңгейде болып отыр [1]. Сүтқышқыл бактериялар мен ашытқылардың биологиялық қасиеттеріне негізделген функциональдық шипалы сүттік тағамдар адамның күнделікті тамақтануында негізгі орын алатын жоғары биотехнологиялық өнімдер болып табылады. Сондықтан қазіргі кезде сүтқышқыл бактериялар мен ашытқылар тамақ биотехнологиясындағы микроорганизмдердің ең бағалы жəне құңды тобы болып табылады [2]. Көптеген сүт қышқыл өнімдерінің өндірісінде симбиотикалық консорциум немесе жеке штамдар негізіндегі ұйытқылар қолданылады. Симбиотикалық консорциумға мезофильді жəне термофильді стрептококтар, термофильді сүтқышыл таяқшалары, бифидобактериялар жəне т.б. кіреді [3]. Əртүрлі сүтқышқылды сусындардың соңғы уақыттарда ассортименттері кеңеюде жəне сусындар сапасының тұрақтылығына, ұйытқы құрамына микробиологиялық тұрғыдан баға беру жəне ұйытқы сапасының тұрақтылығына жауап беретін микроорганизмдердің таза штамдарын бөліп алумен қатар, олардың адам организміне тигізетін пайдалы биологиялық қасиеттерін зерттеудің мəні жоғары. Белсенді микроорганизмдерден жасалған ұйытқыны пайдалану, химиялық жəне органолептикалық қасиеттері тұрақты өнімді алуға мүмкіндік береді. Сондықтан жұмыстың мақсаты микробиология кафедрасының коллекциясынан алынған, биотехнологиялық маңызды қасиеттері зерттелінген лактобактериялардың белсенді штамдарынан жасалынған ұйытқылар негізінде сүтқышқылды өнім алу болып табылады. Зерттеу əдістері мен материалдар Жұмыста зерттеу объектісі ретінде микробиология кафедрасының коллекциясында ұзақ уақыт лиофильді кептіру əдісімен сақталған, əртүрлі субстраттардан бөлініп алынған Lactococcus lactis subsp. lactis МГ – 1, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis BM – 1, Lactococcus lactis subsp. lactis КГ – 4, Lactobacillus lactis subsp. cremoris КГ – 5 штамдары алынды. Зерттеуге алынған штамдардың сүтқышқылды сусын алуға қажетті қасиеттері (технологиялық құнды сүтті ұйыту белсенділігі, қышқыл түзу қарқындылығы, тест-дақылдар қатысында антагонистік қасиеті, антибиотикке сезімталдылығы, биологиялық сұйықтық - өттің, NaCl-дың əртүрлі концентрациясына тұрақтылығы) микробиологияның дəстүрлі əдістерімен зерттелінді [4]. Жоғарыда көрсетілген 4 штамды майсызданған сүтте 37°С температурада бір тəулік дақылдап, 3% көлемде əртүрлі қатынастарда сүтқышқылды сусындар жасалынды. 10 түрлі комбинациялық нұсқалар негізінде алынған сүтқышқылды өнімнің түзілуі зерттелінді. Зерттеу нəтижелері. Көптеген əдебиеттерде сүтқышқыл бактериялардың сүтті ұйыту уақытының ұзақтығын олардың белсенділігімен байланыстыратын мəліметтер көп кездеседі. Сондықтан біздің жұмысымызда да сүтқышқыл бактериялардың сүтті ұйыту белсенділігіне ерекше көңіл бөлінді. Лактобактериялардың сүтті алғашқы ұйыту уақытын анықтау үшін егілген материал дақылдау барысында бақыланып отырды. Алынған нəтижелер бойынша төрт дақылдың да сүтті алғашқы ұйыту белгілері 5-6 сағатта байқалып, 8-10 сағат аралығында жеткілікті мөлшерде ұйытып, бір тəуліктің ішінде сарысусыз, өте тығыз ұйытқы түзді. Қышқыл түзу қабілеті – сүтқышқыл бактериялардың өндірісте қолданылатын негізігі қасиеті. Сапалы сүтқышқылды сусын алу үшін сүтқышқылы бактерияларының қоректік ортада органикалық қышқылдарды жоғары мөлшерде түзуі маңызды екендігі ескерілді [1]. Əртүрлі субстраттардан бөлініп алынған сүтқышқыл бактериялардың қышқыл түзу белсенділігі майсызданған сүтте 17 сағат жəне 7 тəулік аралығында Тернер əдісімен анықталынды [3]. Жалпы, алынған штамдардың ішінде Lactococcus lactis subsp. lactis МГ – 1 қышқыл түзу энергиясы 143°Т, ал қышқыл түзу белсенділігінің шегі жоғары - 164°Т болды. Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis BM – 1 штамының қышқыл түзу энергиясы 112°Т, қышқыл түзу шегі 144°Т аралығында болатындығы анықталды. Lactococcus lactis subsp. lactis КГ – 4 штамының қышқыл түзу энергиясы 112°Т, қышқыл түзу шегі 141°Т болды. Lactobacillus lactis subsp. cremoris КГ – 5 штамының қышқыл түзу энергиясы 85°Т, қышқыл түзу шегі 144°Т аралығында болатындығы анықталды (сурет 1). Микроорганизмдер асқазан-ішек жолдарынан өткен кезде əртүрлі биологиялық факторларға ұшырайды. Бактерияларға асқазан – ішек жолының жоғары жағында лизоцим, қарында – тұз қышқылы, ішекте – өттің жоғары концентрациялары, сонымен қатар асқорыту ферменттері де əсер етеді. Сондықтан лактобактериялар ішекті колонизациялау үшін қышқылға, əртүрлі биологиялық 187 факторларға, өтке, антимикробты заттар мен ас қорытуға қатысатын ферменттерге тұрақты болуы қажет [1]. 2 00 1 50 1 00 50 0 0 24 48 72 96 1 20 1 44 1 68 L a cto co ccu s la ctis su b sp . la ctis К Г – 4 L a cto b a cillu s la ctis su b sp . crem o ris К Г – 5 L a cto co ccu s la ctis su b sp . la ctis М Г – 1 L a cto b a cillu s d elb ru eckii su b sp . la ctis B M – 1 Сурет 1 - Лактобактерияларының қышқыл түзу белсенділігі Жұмыс барысында NaCl мен өтке тұрақтылығын анықтау үшін, NaCl – дың 2, 4, 6% жəне өттің 20%, 30%, 40% концентрациялы гидролизденген сүт қоректік ортасы дайындап алынды. Алдымен NaCl-дың түрлі концентрациясына тұрақтылығы бір тəуліктен кейін (24 сағат), сонан соң екі тəуліктен кейін (48 сағат) анықталынды ( кесте 1). Кесте 1 - Лактобактериялардың NaCl жəне өттің əртүрлі концентрациясында өсуі Штамдар NaCl – дың концентрациясы, Өттің концентрациясы, % % 2% 4% 6% 20 % 30 % 40 % +++ ++ +++ + Lactococcus lactis– КГ-4 +++ ++ ++++ ++ Lactococcus сremoris– КГ-5 +++ ++ ++++ +++ ++ Lactococcus lactis МГ-1 +++ +++ ++ +++ ++ Lactobacillus delbrueckii ВМ-1 Ескерту: – өсу жоқ; + - нашар ; ++- жақсы; +++- өте жақсы Құрамында 2 жəне 4 % NaCl бар гидролизденген сүтте зерттелген төрт штамм да өте жақсы өскен. Ас тұзының 6 % концентрациясына Lactococcus lactis МГ-1, Lactococcus сremoris– КГ-5 нашар өссе, Lactococcus lactis– КГ-4 штамы төзімсіздік көрсетті, ал Lactobacillus delbrueckii ВМ-1 штамы қарқынды өскен. Lactobacillus delbrueckii ВМ-1 дақылы зерттелуге алынған NaCl – дың 2, 4, 6% барлық концентрациясында жақсы өскен, яғни олар NaCl –дың жоғары мөлшеріне басқа дақылдарға қарағанда төзімді екендігі анықталды. Əдебиеттердегі мəліметтер бойынша, осындай жағдайда қымыз, тұздалған капуста, ірімшік, сүзбе жəне өсімдік көздерінен бөлініп алынған штамдар жақсы өсуге қабілетті [6]. Сүт жəне сүт өнімдермен организмге енген лактобактериялардың жоғарыда айтылған сауықтыру қасиеттері, олардың асқазан – ішек жолдарының əртрүлі биологиялық сұйықтықтардың əсеріне төзімділігімен түсіндіріледі [7]. Сондықтан жұмыста сүтқышқыл бактериялар өттің əр түрлі 20%, 30%, 40% концентрацияларына тұрақтылығы зерттелінді. Зерттеу нəтижесінде Lactococcus lactis МГ-1 штамы өттің 20%, 30%, 40% барлық мөлшеріне жоғары төзімділік көрсетсе, Lactobacillus delbrueckii ВМ-1, Lactococcus сremoris– КГ-5, Lactococcus lactis– КГ-4 өттің 40% мөлшері қатысында өспеген. Жалпы зерттеліп отырған штамдардың өттің əтрүрлі концентрациясына төзімділігі айтарлықтай жоғары. Сүтқышқылдық өнімдер жəне пробиотикалық тағамдар мен препараттар өндіруде осындай штамдарды пайдалану үлкен нəтиже береді. Қорытындылай келсек бөлініп алынған сүтқышқыл бактериялардың дақылдары ас тұзының жəне өттің əр түрлі концентрацияларына төзімді болып келді. Мұны штамдардың өсу қарқындылығынан көруге болады. Қазіргі кезде биотехнологияның қажеттіліктерінің жоғарлауына, қоршаған ортаның экологиялық радиациялық фонының өзгеруі жəне практикада химиялық, цистостатикалық жəне гормонды препараттарды кеңінен қолдану қауіпсіз, тиімді антагонист – дақылдарды іріктеу жұмысында маңызы орасан зор. Сүтқышқыл 188 тест-дақыл өсуінің тежелу аймағының диаметрі (мм) бактериялар өздерінің жоғары резистенттілігін жоғарылатады [6]. антагонистік қабілетімен патогенді микроорганизмдерге 16 14 12 10 8 6 4 2 0 L.lactis МГ-1 штамдар Lb.delbruekii ВМ-1 Сурет 2 -Лактобактериялардың тест дақылдар қатынасындағы антагонистік белсенділігі Сүтқышқыл бактериялардың антагонистік белсенділігі агарлы блок əдісімен тест-дақылдың өсуін тежеу аймағының диаметрін өлшеу арқылы анықталды [4]. Тест - дақылдар ретінде St.aureus, S.typhimorium, Proteus 313, Protei 588, E.coli, Ps. aeruginosa микроорганизмдері алынды ( сурет 2). 2-суретте көрсетілгендей сүтқышқыл бактериялардың антагонистік қасиеттерін зерттеу нəтижесінде алынған төрт штамм да ( Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis BM – 1, Lactococcus lactis subsp. lactis КГ – 4, Lactobacillus lactis subsp. cremoris КГ – 5, Lactococcus lactis subsp. lactis МГ – 1 ) E.coli (8-9 мм), St.aureus (10-12 мм) тест-дақылдарына жоғары, Ps.aeruginosa (4 мм), S.tuphimorium (6-7 мм), Protei 588 (7-9 мм) дақылдарына орташа, Proteus 313 дақылына төмен (0-2мм) антагонистік белсенділік көрсетті. Зертханалық жағдайда ұйытқы дайындау үшін тек стерильді сүт, ал өндірістік ұйытқы алуда стерильді жəне пастерленген сүт қолданылады. Пастерленген жəне стерильді сүтті дер кезінде əрбір ұйытқыға оптимальді төменгі температураға дейін салқындатады. Стерильді сүтте лабораториялық немесе өндірістік ұйытқы негізінде өнім алу үшін сүт немесе кілегейге 1-3% мөлшерде, ал өндірістік ұйытқыны пастерленген сүтке 3-5% мөлшерде пайдаланады [8]. . Сүтқышқылды сусындардың органолептикалық қасиеттері сүтті өңдеу параметрлеріне, лактозаны сүт жəне спиртті ашыту қарқындылығына байланысты. Зертханалық жағдайда сүтқышқыл бактерияларының таза дақылдары негізінде сүтқышқылды сусын алу алу үшін Lactococcus lactis МГ-1, Lactobacillus delbrueckii ВМ-1, Lactococcus сremoris– КГ-5, Lactococcus lactis– КГ-4 штамдарының бір күндік дақылдары қолданылды. Оларды 9-10мл майсызданған сүті бар пробиркаларға стерильді жағдайда 0,1 мл-ден егіп, 37°C температуралы термостатта бір тəуліктік дақылды өсіріп алдық. Сүтқышқылды бактериялардың бір тəуліктік дақылдарын əртүрлі нұсқалық қатынастарда заласыздандырылған сүтке 3-5% көлемінде енгізіп, 37°C температуралы термостатқа 24 сағатқа қалдырамыз. 1. Lactococcus lactis МГ-1+ Lactobacillus delbrueckii ВМ-1 3% 2. Lactococcus lactis МГ-1+ Lactobacillus delbrueckii ВМ-1+ Lactococcus сremoris– КГ-5 3% 3. Lactococcus lactis МГ-1+ Lactococcus сremoris– КГ-5 3% 4. Lactococcus lactis МГ-1+ Lactococcus lactis– КГ-4 3% Жоғарыда көрсетілгендей лактобактериялардың 11 түрлі нұсқасы жасалынып, олардың органолептикалық қасиеттері қарастырылып, қышқыл түзу белсенділігі анықталды. Lactobacillus lactis subsp. cremoris КГ – 5, Lactobacillus delbrueckii lactis ВМ-1, Lactococcus lactis subsp. lactis МГ – 1 штамдары негізінде жасалған сүтқышқылды сусындардың нұсқасы іріктеліп алынып, мөлшердегі белсенді екендігі анықталды. Себебі бұл Lactobacillus lactis subsp. cremoris КГ – 5, Lactobacillus delbrueckii lactis ВМ-1, Lactococcus lactis subsp. lactis МГ – 1 сүтқышқыл бактериялар негізіндегі сусынның дəмі тəтті, иісі ароматты, түсі ақщыл-сары, консистенциясы біртекті, тұтынуға ыңғайлы. Бұл бактериялар негізінде балаларға арналған жəне диеталық өнімдер алуға болатындығын көрсетеді. Ал қалған Lactococcus lactis subsp. lactis КГ – 4 сүтқышқыл бактериялар негізіндегі сусындардың дəмі қышқылау, біртекті ұйымаған. Бұларды көбіне қышқыл сусындар, айран алуға қолдануға болады. 1. Комбинированная закваска на основе лакто- и бифидобактерий / М. Б. Данилов, Е. Д. Молчанова, И. Е. Муруев // Мол. пром. – 2001. - №7. – с. 37. 189 2. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Пробиотики и функциональное питание. М.: Издат. Грант, 2001. 3. Подгорский B.C., Коваленко Н.К. Продукты функционального питания на основе молочнокислых бактерий // 1-й Международный конгресс "Биотехнология — состояние и перспективы развития", Москва, октябрь 14—18, 2002 г. [Материалы]. —338 с. 4. Коваленко Н.К. Разработка продуктов функционального питания на основе молочнокислых бактерий и их практическое использование // Молоч. пром-сть. —2002. —№1. —22 с. 5. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии. Москва, 2005. 6. Гаврилова Н.Н., Лукашева Л.М., Горелова В.В. Антагонистическая активность молочнокислых бактерии в отношении возбудителей кишечных инфекции // Материалы III Всес.симпоз. Степногорск, 1991. 7. Шоқанов Н. К. Микробиология. — Алматы, 1996. 003. 8. Бондаренко В. М., Грачева Н.М., Мацулевич Т. В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. —Москва, 2 9. Чагаровский В.П., Жолкевская И.Г. Биологическая активность заквасочных культур, используемых в технологии получения кисломолочних продуктов с пробиотическими свойствами // Молоч. пром-сть. —2002. —№1. —С. 24—25. *** Изучены биотехнологически ценные свойства лактобактерии, выделенные из различных субстратов и на основе активных штаммов получены молочнокислый напиток. *** It is studied biotechnological valuable properties of Lactobacteria, allocated from various substrates and on the basis of active strains were received a lactic beverage. Б.К.Заядан, А.О.Отаров, Г.Б. Баймаханова, Г. Ораз, М. Кумар ИЗУЧЕНИЕ АЛЬГОФЛОРЫ РИСОВЫХ ПОЛЕЙ ШИЕЛИЙСКОГО РАЙОНА КЫЗЫЛОРДИНСКИЙ ОБЛАСТИ И ВЫДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИ ЧИСТЫХ КУЛЬТУР МИКРОВОДОРОСЛЕЙ И ЦИАНОБАКТЕРИЙ (КазНУ им. аль-Фараби, г.Алматы, Казахстан) На рисовых полях Шиелийского района Кызылординский области было обнаружено 47 видов и разновидностей водоролей, из них: эвгленовых – 1, зеленых – 10, сине-зеленых – 15, диатомовых – 21. Выделены 5 бактериологически чистых культур микроводорослей и цианобактерий и изучены их морфолого-культуральные свойства. Альгофлора рисовых полей Шиелийского райнона Кызылординский области до настоящего времени не изучалась. Перед нами стояли следующие задачи: исследовать видовой состав микроводорослей, выделить альгологически чистые культуры микроводорослей и цианобактерий. Цианобактерии играют большую роль в повышении плодородия почв путем фиксации атмосферного азота. Перспективность применения азотофиксирующих цианобактерий в земледелии связана с их участием в круговороте азота, который существенно влияет на урожайность высших растений. Цианобактерии наряду с другими почвенными организмами участвуют в создании гумусовых веществ почвы. Кроме того, многие виды цианобактерий, используемые для альголизации почв, оказывают фунгистатическое и фунгицидное действие. Положительный эффект инокуляции объясняется не только азотфиксирующей активностью цианобактерий, но и продуцированием ими биологически активных веществ и стимулирующим влиянием на гетеротрофные микроорганизмыазотфиксаторы, так, альголизация ячменя при оптимальных условиях влажности почвы дала прибавку урожая в вегетационных условиях опытов на 25-30%. [1, 2]. Целью данной работы было изучение альгофлоры рисовых полей Шиелийского орошаемого массива и выделение чистых бактериологических культур микроводорослей и цианобактерий. Перед нами стояли следующие задачи: Изучение альгофлоры почвы Шиелийского орошаемого массива Выделение альгологически и бактериологически чистых культур микроводорослей и цианобактерий из почвы Шиелийского орошаемого массива Материалы и методы Материалом для данной работы послужили пробы почв с микроводорослями, отобранные в весенний и летный период 2010 года. За истекший период нами был произведен отбор проб из рисовых полей ТОО «Каптагай» Шиелийского района. Рисовые поля Шиелийского орошаемого массивы расположены на 38 км от реки Сырдарии. Определение видового состава микроводорослей в пробах из различных водных экосистем проводили по методике Сиренко [3] с использованием следующих определителей: Определитель 190 пресноводных водорослей СССР, том 1-14, 1951; Определитель сине-зеленых водорослей Средней Азии, 1 - 3 том, 1987; Определитель протококковых водорослей Ср. Азии, том 1-2, 1988 [4, 5, 6]. Для получения накопительных культур одноклеточных протококковых водорослей использовали среды Прата и 04. Наряду с этими средами, использовали также среды Майерса, Тамия и Громова [7]. Для оценки активности водорослей использовались альгологически и бактериологически чистые формы. Результаты и их обсуждение Полевые наблюдения и сбор материала производили с мая по июнь 2011 г. с рисовых полей ТОО «Каптагай» Шиелийского района. В местах поступления воды из оросителя в чеки отмечено развитие в прикрепленном состоянии Stigeoclonium fasciculare, P. tenue. В основном обнаружены те виды, которые были отмечены в оросителях; к таким относятся следующие: Oscillatoria acutissima-редко в оросителях, Planctonica – единично в первых чеках;– Phormidium tenue – единично в первых чеках. Сине-зеленые водоросли встречались обильно, образуя пленки на листьях, стеблях риса и других водных растений. В составе пленок часто встречались: Merismopedia elegans, Micrpcystis pulverea, Gloeocapsa minuta, C. Turgida, Stranonostoc linkia (обильно), Anabaena variabilis, Cylindrospermum stagnale, Oscillatoria limosa, Spirulina major, Phormidium ambiguum. В одном и том же источнике производилось несколько отборов с различной глубины. Отобранные пробы были доставлены в лабораторию в течение нескольких часов после отбора, с соблюдением всех требований к перевозке отобранного материала. Доставленные образцы были немедленно рассеяны на предварительно приготовленные и проавтоклавированные питательные среды. Состав питательных сред подбирался заранее в соответствии с предполагаемым альгологическим составом образцов. Рассеянные образцы были помещены в термостат. Определение видового состава микроводорослей в пробах из различных водных экосистем проводили по методике Сиренко с использованием определителей. В май-июнь месяцы на рисовых чеках ТОО «Каптагай» Шиелийского района было обнаружено 47 видов и разновидностей водоролей, из них: эвгленовых – 1, зеленых – 10, сине-зеленых – 15, диатомовых – 21. Кроме разработки и рациональной организации производственной стороны массового культивирования микроводорослей, способствующей повышению их продуктивности, существенным является также использование для этих целей высокопродуктивных видов и штаммов микроводорослей. Большое значение приобретают работы по выделению из природы, получению селекционными методами высокоактивных форм водорослей и первичная оценка их продуктивности, которые по самому своему смыслу должны проводиться на различных зональных станциях, в различных климатических условиях. Особое значение приобретает тот факт, что необходима координация таких работ и их осуществление по единой методике, в сравнимых стандартных условиях. Культивирование новых штаммов требует создания при лабораторных испытаниях выделяемых и селекционируемых штаммов таких же условий, как и для интенсивного культивирования. Успех массового культивирования микроводорослей зависит от подбора высокопродуктивных и хозяйственно ценных штаммов и видов. Для проведения сравнительного изучения их в определенных условиях культивирования необходимо иметь, в коллекции культур большой набор альгологически и бактериологически чистых штаммов и видов микроводорослей. Нами из исследованных рисовых полях выделены 5 бактериологических чистых культур микроводорослей и цианобактерий, которые идентифицированы как представители родов Chlorella vulgaris R-1, Euglena viridis R-1, Anabaena sp.R-1, Spirulina majior R-1 и Oscillatoria tenuis R-1 . Изучены морфолого-культуральные свойства выделенных микроводорослей и цианобактерий: 1. Chlorella vulgaris R-1 Клетки средней величины –3,5-5 мкм в диаметре, иногда, особенно перед делением, размеры их увеличиваются до 7,5-8 мкм. Клетка обладает пиреноидами. Хорошо растет при температуре воздуха 18-30С на питательной среде 04.( Рисунок -1). 2. Euglena viridis R-1Клетки веретенообразные. Размер клеток 25-30 мкм по длине и 11-14 мкм по ширине. Образует овальные и круглые хроматофоры. В центре клетки имеется пироноид, окруженный мелкими парамиленными веществами, ниже пиреноида расположено шарообразное ядро. Клетки очень подвижны (Рисунок 2). 191 Рисунок 1- Chlorella vulgaris R-1 Рисунок 2 - Euglena viridis R-1 3. Spirulina majiorR-1 По систематическому положению относятся к цианобактериям, класс Hormogeneae, род Spirulina. Нитчатые. Клетки образуют правильные спирали. Трихомеры светлые, сине-зеленые, их диаметр 1-2 мкм, расстояние между спиралями 2,7-5 мкм. В основном, растут, образуя скопления на стенках посуды. Хорошо растут при температуре 250-300С в среде Заррука на свету. (Рисунок 3). Рисунок 3- Spirulina majior R-1 Рисунок 4- Oscillatoria tenuis R-1 4. Oscillatoria tenuis R-1 Трихомы синевато-зеленого цвета, прямые, у поперечных перегородок не перешнурованные, к концам не утонченные, длина больше ширины. Выделены на питательной среде Громова. Для культивирования используется среда Громова. Оптимальный рост происходит при температуре 250280С (Рисунок 4) 5. Anabaena sp.R-1- относится к группе цианобактерий, класс Hormogeneae, порядок Nostocales, род Anabaena. Трихомы одиночные, очень часто в клубках, состоят из шарообразных клеток, среди которых встречаются гетероцисты и реже акинеты. Трихомы своим строением очень напоминают трихомы ностока. Большей частью они спирально или кольцеобразно свернуты, реже прямые. Для культивирования используется среда Громова. Оптимальный рост происходит при температуре 250300С (Рисунок 5). Рисунок 5 - Anabaena sp.R-1 192 В дальнейшем, с целью проведение скрининга полученных бактериологически чистых культур цианобактерий по способности азотфиксации, все выделенные культуры сине-зеленых водорослей выращивали на среде М без добавления источника азота. Для этого изучалось влияние данного элемента на их динамику роста. Сине-зеленые водоросли играют большую роль в повышении плодородия почвы путем фиксации атмосферного азота. Из различных литературных данных известно, что при недостатке азота в среде у цианобактерий, не обладающих азотфиксирующей способностью возникает явление азотхлороза, характеризующееся резким снижением содержания хлорофилла и фикоцианина [8]. По результатам опыта из выделенных сине-зеленых культур водорослей ( Spirulina majior R-1, Anabaena sp.R-1, Oscillatoria tenuis R-1) наибольшая активность роста наблюдалась в культуре Anabaena sp.R-1. Динамика роста Anabaena sp.R-1 была аналогична динамике роста контроля (Рисунок 6). Рост клеток культур Spirulina majior R-1, Oscillatoria tenuis R-1 в безазотистой среде не наблюдался. Рисунок 6 - Влияние азота на динамику роста сине-зеленых водорослей Экспериментальные данные свидетельствуют о высокой продуктивности культуры Anabaena sp.R1 на питательной среде, без добавления азота, в то время как роста клеток Spirulina majior R-1, Oscillatoria tenuis R-1 в данных условиях не наблюдалось. Полученные результаты позволяют предполагать, о том, что культуры Anabaena sp.R-1 получают данный макроэлемент путем его связывания из атмосферы. 1. На рисовых полях Шиелийского района было обнаружено 47 видов и разновидностей водоролей, из них: эвгленовых – 1, зеленых – 10, сине-зеленых – 15, диатомовых – 21. 2. Выделены 5 бактериологически чистых культур микроводорослей: из зеленых Chlorella vulgaris R-1, Euglena viridis R-1, из сине-зеленых , Anabaena sp.R-1, Spirulina majior R-1 и Oscillatoria tenuis R-1 и изучены их морфолого-культуральные свойства. 3. Установлена способность к азотфиксации культуры Anabaena sp.R-1, на питательной среде М без азота. 1 Панкратова, Е.М. Конструирование микробных культур на основе синезелёной водоросли Nostoc paludosum Kьtz / Е.М. Панкратова, Р.Ю. Зяблых, А.А. Калинин, А.Л. Ковина и др. // Альгология. - 2004. - Т. 14. - № 4. – С. 445-458. 2 Заядан Б.К.. Фототрофты микроорганизмдер биотехнологиясы Монография. – Павлодар, `Brand print` 2010г. с. 432 3 Сиренко Л.А., Сакевич А.И., Осипов Л.Ф., Лукина Л.Ф. и др. Методы физиолого-биохимического исследования водорослей в гидробиологической практике. - Киев: Наукова думка, 1975. -247с. 4 Музафаров А.М., Эргашев А.Э., Халилова С.Х. Определитель сине-зеленых водорослей Средней Азии. - Ташкент: Фан, 1987. – Т. 1. - С.3-405. 5 Музафаров А.М., Эргашев А.Э., Халилова С.Х. Определитель сине-зеленых водорослей Средней Азии. - Ташкент: Фан, 1988. – Т.2. - С.406-815. 6 Царенко П.М. Краткий определитель хлорококковых водорослей Укр. ССР. – Киев: Наукова думка, 1990. – 208 с. 193 7 Заядан Б.К. Г. Өнерхан Микробалдырлардың таза дақылдарын бөліп алу жəне оларды белсенді өсріу тəсілдері Көкшетау 2008ж, 95б. 8 Pankratova, J.M. Designing of microbial binary cultures based on blue-green algae (Cyanobacteria) Nostoс paludosum Kьtz // International Journal on Algae. - 2004. – Vol.6. - N 3. – P.290-304. *** Кызылорда облысы Шиелі ауданының күріш алқабынан 47 балдырдың түрлері мен түр аралықтары анықталды жəне олардың ішінен: эвглененалар -1, жасыл балдыралар -10, көкжасыл балдырлар -15, диатомдар -21. Микробалдырлар мен цинобактериялардың 5 бактариалды таза дақылдары бөлініп алынып, олардың морфологиялық, дақылдандыру қасиеттері зерттелді. *** In the rice fields Shiely district of Kyzylorda region was found 47 species and varieties of algae, including: euglenophytes - 1, green - 10 blue-green - 15, diatom - 21. Identified five bacteriological pure cultures of microalgae and cyanobacteria, and studied their morphological and cultural properties. Т.А. Карпенюк, А.В. Гончарова, С.Б. Оразова , С.А .Джокебаева., Р.У. Бейсембаева ПОИСК МИКРОВОДОРОСЛЕЙ И МИКРООРГАНИЗМОВ, СИНТЕЗИРУЮЩИХ АРАХИДОНОВУЮ КИСЛОТУ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫЕ (Казахский национальный университет им.аль-Фараби) С использованием теста на чувствительность к ацетилсалициловой кислоте проведен скрининг на способность микроводорослей и микроорганизмов, выделенных из почв и водоемов Казахстана, синтезировать арахидоновую кислоту. Отобраны 4 штамма, имеющие перспективу практического использования для разработки биотехнологии получения арахидоновой кислоты. Большое значение для человека и сельско-хозяйственных животных имеют полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК). Они подвергаются биотрансформации окислительными ферментами, что приводит к образованию разнообразных низкомолекулярных регуляторов биологических процессов, протекающих в клетках, тканях и целостном организме [1,2]. Одной из наиболее важных ПНЖК является арахидоновая кислота (АК), которая выступает в роли непосредственного предшественника эйкозаноидов (простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов) – большого семейства высокоактивных соединений, обладающих необычайно широким спектром биологических эффектов. В 90-е годы были получены данные, позволяющие рассматривать арахидоновую кислоту и ее продукты в качестве системы вторичных посредников. Во многих случаях показано, что арахидоновая кислота и ее производные могут взаимодействовать с другими системами передачи информации в клетке, модулируя их сигналы. Арахидоновой кислоте приписывается важная роль в регуляции лигандрецепторных взаимодействий, активности ионных каналов и активности регуляторных ферментов (фосфолипазы С), аденилатциклазы, гуанилатциклазы, протеинкиназы С в качестве внутриклеточного мессенджера [3]. Арахидоновая кислота находит широкое применение в: фармакологии (предшественник различных лекарственных и профилактических препаратов, применяемых при заболеваниях сердечнососудистой системы, печени и др); косметической промышленности (средства по уходу за кожей); пищевой промышленности (обогащение различных продуктов питания, в том числе искусственных детских молочных смесей и др); сельском хозяйстве (высокоэффективный стимулятор роста и защитных реакций растений) и др. [4-6]. В организме АК человека и животных не синтезируется, поэтому основными источниками арахидоновой кислоты являются продукты, которые содержат фосфолипиды и ненасыщенные жирные кислоты. В настоящее время основным источником получения АК являются липидные экстракты из печени свиньи и других органов животных, что делает их крупномасштабное производство неэффективным (содержание АК составляет не более 0,2% в пересчете на сухую массу). В последние два десятилетия достигнуты определенные успехи в области биотехнологического получения АК с помощью низших грибов и морских водорослей. Однако, существующие на сегодняшний день 194 биотехнологии получения АК далеко несовершенны, поскольку ее выход в лабораторных условиях в лучших случаях составляет 13 г/л (Япония), а в среднем у различных исследователей около 6-10 г/л (Россия, США, Польша и др). В связи с этим актуальным является поиск и создание высокоэффективных продуцентов АК и разработка биотехнологических способов ее получения [7-9]. Целью настоящей работы является поиск высокоэффективных продуцентов АК среди микроорганизмов и микроводорослей. Материалы и методы: Объектами для отбора эффективных продуцентов арахидоновой кислоты (по биотесту на чувствительность к ацетилсалициловой кислоте (АСК) служили штаммы микроводорослей и микроорганизмов, выделенных из водоемов и почв Казахстана. Штаммы микроводорослей (Scenedesmus quadricauda, Chlorella sp. (T4), Chlorella sp. (Ч3), Chlorella sp. (E24), Oocystis rhomboideus, Spirulina platensis (532)), выделенные из пресных водоемов Казахстана, культивировали на 1,4% агаре, среде Фитцджеральд, среде 16 при температуре 280, 7-10 суток. Культуры микроорганизмов, выделенные из почв Казахстана, проб воды из акватории Каспийского моря культивировали на питательной среде МПА (мясо-пептонный агар). Посев суспензии микроорганизмов производили методом Коха в трёх повторностях. Чашки после посева ставили в термостат при температуре 28С, на 3 суток. Определение АСК - чувствительности проводили по методу Ерошина В.К. и др [10]. Метод основан на корреляции между уровнем синтеза арахидоновой кислоты и чувствительностью роста микроорганизмов к низким концентрациям - АСК (около 0,84 г/л). Концентрация АСК в среде культивирования составила 0,42-0,5 г/л; 0,84 г/л; 1,68 г/л. Для определения родовой принадлежности микроорганизмов, синтезирующих АК проводили изучение морфолого-культуральных (окраска по Граму, спорообразование, подвижность, форма клеток) и физиолого-биохимических признаков (тесты на каталазную, оксидазную, амилазную активности, кислото-образование и т.д.) по общепринятым методикам [11]. Результаты Арахидоновая кислота широко распространена в животных тканях. Однако ее выделение осложнено высокой чувствительностью к окислению, низким содержанием в указанных объектах, а так же присутствием ее совместно с другими полиеновыми кислотами, близкими по физикохимическим свойствам. Перспективность использования микроводорослей и микроорганизмов в качестве источника для получения арахидоновой кислоты (по сравнению с животными источниками) обусловлена быстрыми темпами роста культуры, возможностью совместного получения липидов и других классов биологически важных веществ (белков, углеводов, пигментов и др.). Однако, чтобы получение арахидоновой кислоты из микроводорослей и микроорганизамов было экономически целесообразным и более выгодным по сравнению с использованием традиционных источников, требуется поиск ее активных продуцентов, дальнейшее усовершенствование технологии извлечения арахидоновой кислоты из биомассы и т.д.. В работе представлены результаты скрининга коллекционных штаммов микроводорослей и микроорганизмов, выделенных из различных водоемов и почв Казахстана, проведенного с целью выявления среди них продуцентов арахидоновой кислоты, перспективных для разработки на их основе биотехнологического метода ее получения. Известно, что микроводоросли представляют собой огромный биологический ресурс, они находят применение в разных областях науки и технологии (фармакология, косметология, пищевая промышленность, с/х, производство биотоплива и т.д.). Представители различных видов микроодорослей различаются по содержанию насыщенных и ненасыщенных жирных кислот. Некоторые из них могут стать источником ненасыщенных жирных кислот, которые можно использовать в качестве пищевых и кормовых добавок, компонентов косметических и лечебных препаратов. К сожалению, в настоящее время среди 50000 известных видов микроводорослей только некоторые имеются в различных коллекциях, несколько сот видов изучены с точки зрения химического состава, свойств и только десятки выращиваются в промышленных масштабах (Chlorella, Scenedesmus, Spirulina Platensis и др.). Не исключением в этом плане является и Казахстан. Нами собрана и поддерживается коллекция микроводорослей, численность которой составляет более 30 альгологически и бактериологически чистых культур, проводится работа по их идентификации, подбору условий культивирования. Некоторые идентифицированные штаммы, представленные в 195 коллекции, были использованы для скрининга на способность синтезировать арахидоновую кислоту. Для этого рост и развитие микроводорослей исследовали в присутствии в среде разных концентраций АСК. АСК является необратимым ингибитором метаболизма арахидоновой кислоты, она ацетилирует Ser-530 простагландин Н синтазы и тормозит синтез простагландинов [1,11]. В настоящее время неспособность бактерий, грибов и дрожжей расти в присутствии АСК применяют в качестве критерия для отбора штаммов, синтезирующих метаболиты арахидоновой кислоты [12]. В чашки Петри заливали среду, после застывания делали 5 лунок. В лунки заливали суспензию микроводорослей с разной концентрацией аспирина. В 1 лунку - суспензию микроводорослей с 1,4 мг аспирина, 2 лунку - с 1,0 мг аспирина, 3 лунку – с 0,84 мг аспирина, 4 лунку - с 0,5 мг аспирина, 5 лунку - суспензию микроводорослей без аспирина. Чашки Петри оставляли в световых шкафах при температуре 280 на 7-10 суток. Затем измеряли диаметры (см) зоны ингибирования. Полученные результаты показали, что штаммы микроводорослей различаются по своей чувствительности к АСК. Наибольшее ингибирование роста отмечалось для штамма Scenedesmus quadricauda и Chlorella sp. (Ч3). В то же время при всех концентрациях АСК не наблюдалось ингибирование роста штамма Spirulina platensis (532). Штаммы Scenedesmus quadricauda и Chlorella sp.(E24) были отобраны нами в качестве перспективных для разработки технологии получения арахидоновой кислоты. а б Рисунок 1 - Влияние аспирина на рост (а) Chlorella sp. (Ч3 ) и (б) Scenedesmus quadricauda: 1 лунка – 1,4 мг аспирина, 2 лунка - 1,0 мг аспирина, 3 лунка – 0,84 мг аспирина,4 лунка - 0,5 мг аспирина, 5 лунка - без аспирина. Также был проведен поиск природного продуцента арахидоновой кислоты среди микроорганизмов, выделенных из почв Казахстана и проб воды из акватории Каспийского моря . Сравнительный анализ способности культур микроорганизмов расти при трех концентрациях АСК (0,42 г/л; 0,84 г/л; 1,68 г/л) в среде позволил отобрать 10 штаммов, среди которых 2 (обозначенные как Б-А и Б-В) обладали максимально выраженным селективным влиянием на их рост АСК в концентрации 0, 42 и 0,84 г/л (Рис.2). Колонии культуры Б-А Колонии культуры Б-В а б П р и м е ч а н и е: а – среда без АСК ( контроль ), б - среде с АСК в концентрации 0,84 г/л. Рисунок 2 - Влияние ацетилсалициловой кислоты на рост и развитие колоний Б-А и Б-В; 196 Ростовые процессы остальных культур микроорганизмов не изменялись при добавлении 0,84 г/л аспирина в среду культивирования. Для идентификации аспиринчувствительных культур было проведено морфологическое описание колоний, а также исследован ряд физиолого –биохимических показателей (таблица1,2). Таблица1-Морфологические признаки колоний культур продуцентов АК Диаметр Форма Консисте Профиль Цвет колонии, Объект колонии нция мм круглая, Б-А мягкая оранжевый 5 - 10 края плоский ровные круглая, слегка Б-В мягкая желтый 5-8 края выпуклый ровные Блеск и прозрачность блестящая непрозрачная блестящая непрозрачная На основании результатов исследования морфологии и физиолого-биохимических признаков, культуры микроорганизмов – продуцентов АК идентифицированы как бактерии рода Pseudomonas (Б А) и Bacillus (Б - В). Таблица 2 - Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, синтезирующих АК Признак Б-А Б-В Окраска по Граму ГГ+ Спорообразование + Подвижность подвижные подвижные Форма клеток палочки палочки Каталаза + + Оксидаза + Амилаза Окисление глюкозы (тест Хью-Лейвсона) ++ ++ Лецитиназа + Разжижение желатины + + Денитрификация Учитывая чувствительность выбранных микроорганизмов к АСК и их способность к синтезу арахидоновой кислоты эти культуры могут быть рекомендованы для дальнейших исследований. 1. Давлетбаев И.М. Биосинтез полиненасыщенных жирных кислот и их производных: Автореф. дис. к. б.н. – УФА, 2002. – 24 с. 2. Казимирко В.К., Мальцев В.И. Функции ненасыщенных жирных кислот в организме // Здоровье Украины. – 2004. №95 - С. 93-101. 3. Назаров П.Е., Мягкова Г. И., Гроза Н.В. Полиненасыщенные жирные кислоты как универсальные эндогенные биорегуляторы // Вестник МИТХТ. – 2009. - т.4. - №15. - С. 205-210. 4. Kuratko C., Arterburn L., Hoffman J.P , Nelson E.B Importance of arachidonic acid in long-chain polyunsaturated fatty acid–supplemented infant formula //American Journal of Clinical Nutrition, 2005, Vol. 82, No. 6, 1353-1354. 5. Ramwell P.W. Biologic Importance of Arachidonic Acid // Arch Intern Med. 1981;141(3):275-278. 6. Brash A.R. Arachidonic acid as a bioactive molecule // J Clin Invest. 2001;v.107 (issue 11): p. 1339–1345. 7. Сергеева М.Г., Варфоломеева А. Каскад арахидоновой кислоты// М.Народное образование, 2006.-256 с. 8. Zhu M., Yu L.J., Liu Z., Xu H.B. Isolating Mortierella alpine strains of hight yield of arachidonic acid // Letters in Applied Microbiology. - 2004. -V.39. - P.332-335. 9. Утегенова Г. А., Бейсембаева Р. У., Оразова С. Б., Цуркан Я.С., Калбаева А. М., Карпенюк Т.А., Гончарова А.В. Поиск продуцентов арахидоновой кислоты – субстрата для разработки биотехнологии получения простагландинов // Материалы международной заочной научно-практической конференции «Инновации и современная наука». Часть I. (12 декабря2011 г.). - Новосибирск: Изд. «Сибирская ассоциация консультантов», 2011. - С. 35-39. 10. Ерошин В.К., Дедюхина Э.Г., Чистякова Т.И., Желифонова В.П., Ботаст Р.Дж. Исследование синтеза арахидоновой кислоты грибами рода Mortierella: микробиологический метод селекции продуцентов арахидоновой кислоты // Микробиология. – 1996. - Т. 65. - №1. - С. 31-36. 11. Под ред. Егорова Н.С. Практикум по микробиологии - Москва: «Издательство Московского университета»,1976. 12. Vane J.R. Inhibition of action for aspirin-like drugs // Nature New Biology.- 1971- V.231- №23.- С. 232-235. 197 С.С. Кенжебаева, С.Ш. Асрандина, Г. Доқтырбай ЖАЗДЫҚ БИДАЙДЫҢ МУТАНТТЫ ФОРМАЛАРЫНА ҚҰРҒАҚШЫЛЫҚТЫҢ ƏСЕРІ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті, Алматы, Қазақстан) Жаздық бидайдың мутантты формаларына құрғақшылықтың əсерін физологиялық скрининг арқылы анықтау Дүние жүзлік егіншілікте жаздық бидайдың алатын орны ерекше. Бидайды ең ірі өндіруші елдер қатарына; Канада, Америка Құрама Штаттары, Ресей, Аргентина, Австралия, Мексика, Бразилия, ҚҚР, Индия, Франция, Италия жатады. Жаздық бидайдың өнімділігін жаксарту жолдарының бірі - жоғарғы өнімді сорттарды, мутантты формаларды құрастырып өндіріске енгізе отырып, олардың тиімді өндіру технологияларын жасау болып табылады. Сондықтан қазіргі уақытта дүние жүзінде бағалы сорттардан, формаларды алуға көп көңіл бөлуде жəне практикалық, теориялық негіздерін жетілдіруде [1,2]. Қазақстанда жаздық бидай егістік көлемі жағынан жəне астық жинаудан, Ресей Федерациясынан кейін екінші орынды иеленеді. Жаздық бидайдың сорттарын, мутантты формаларын шығару, анықтау селекцияда өте ұзақ процесс жəне ол уақытпен байланысты болып келеді. Қазіргі таңдағы селекциясының алдында, бұрынғымен салыстырғанда, көптеген мəселелер бар. Ол мəседелердің бірі құрғақшылыққа төзімді өсімдіктермен болған зерттеу жұмыстарын қарқынды жүргізу кезінде байқалады. Қазақстанның кейбір аймақтарында климаты құрғақ, шұғыл континентальды, жауын-шашынның аздығы жəне ауа райының құбылмалылығымен сипатталады. Бұл жағдайлар ең бірінші мынадай жағдайларға байланысты, Еуразия материгінің ортасында тұрған Қазақстан Атлантика мұхитынан өте алыс тұр, ал ол дымқылдандырудың ең негізгі көзі жəне орта Азияның шөлейт жерлерінің жақындығы да Қазақстандағы құрғақшылықты күшейтеді. Ол жақтан келетін ауа құрғақшылығы мен жоғары температурасымен белгілі. Жазғы мерзімде олар күшті құрғақшылықтың дамуына əсер етеді. Жыл сайынғы жауын-шашын мөлшерінің тым аз болуы, температураның жоғарлауы, сусыздану көрсеткішінің өрлеуіне байланысты құрғақшылықтың туындауы себеп болып отыр. Соңғы он жыл ішінде біздің құрғақшылыққа төзімді өсімдіктермен болған зерттеу жұмыстарымыз едəуір қарқынды жүргізілді. Себебі, ауыл шаруашылығында төзімді, мол өнімді алу бəсеке талабы болып табылады [3]. Өсімдіктің тамыр жүйесі суды сіңіру жылдамдығы транспирацияға қарағанда тез өтеді, соған байланысты өсімдіктер су тапшылығының зардабын шегеді. Бұндай жағдай тек қуаңшылықтың əсерінен емес, сонымен қатар топырақтың тұздылығының, төмен температураның əсерінен де болады. Бұл кезде дегидратация стресті “сусыз” өсімдікте жақсы жүреді, ал топырақта су мөлшері жеткілікті болса да дегидратация кезінде өсімдікке су тапшы болып жатады [4,5]. Қазіргі құрғақшылық кездегі ауыл шаруашылық өндірісінің маңызды мəселелерінің бірі, зерттеулер көрсеткендей, құрғақшылық пен шөлге айналған жерлер жыл сайын əлемдік масштабта ауыл шаруашылығына 42 млрд доллар шығын əкеледі екен. Құрғақшылық Қазақстанда бидай өнімділігінің жақсы дамуына аса қауіпті стрессті фактор болып табылады, құрғақшылық күрделі фактор ретінде үш компоненттерден тұрады: су тапшылығы (дегидратация), күн радияциясының интенсивтілігі, жоғары ауа температурасы - осы компонентердің ішінде өсімдіктердің су тапшылығына болған əсерін айта кетсек [6]. Су тапшылығы (дегидратация стрессі): Өсімдіктің тамыр жүйесі суды сіңіру жылдамдығы транспирацияға қарағанда тез өтеді, соған байланысты өсімдіктер су тапшылығының зардабын шегеді. Бұндай жағдай тек қуаңшылықтың əсерінен емес, сонымен қатар топырақтың тұздылығының, төмен температураның əсерінен де болады. Бұл кезде дегидратация стресті “сусыз” табиғаттың компоненті жəне өсімдікте жақсы жүреді, ал топырақта су мөлшері жеткілікті болса да дегидратация кезінде өсімдікке су тапшы болып жатады[7]. Су тапшылығы кезінде клеткаларда су құрамы өте аз болады жəне су тапшылығының əсерінен цитоплазмадағы иондардың концентрациясының ұлғаюы нəтижесінде құрылысы мен биополимерлердің функциялары өзгереді. [8]. Бидай өсімдіктері өсіп-даму кезеңдерінің əрбір уақытында, өнімді құрастырғанда, су факторына əр түрлі қарайды [9]. Бидайдың өнімділігін, сапасын, кейбір аурулар түріне, қоршаған орта факторларына - қолайсыз температураға, қуаңшылыққа, тұздылыққа төзімділігін арттыру қазіргі селекцияның басты мəселесі болып табылады. Сонымен қатар селекция жұмысының тиімділігі, дақылдың генетикалық зерттелуіне жəне оның өзгергіштік шегін кеңейту үшін, жаңа əдістерді қолданып, құнды селекциялық формаларды сұрыптап алуға негізделген. Селекцияда жергілікті сорттардан ең жақсысын сұрыптап алуға, содан кейін əлемдік бидай 198 үлгілеріне енгізуге жəне индукциялық мутагенезді қолдануға байланысты. Өсімдіктер селекциясында химиялық мутагенез будандастыру үшін алғашқы материалдың əртүрлілігін кеңейтуге арналған тəсіл ретінде қолданылады [10]. Селекцияда жасанды жолмен пайдалы мутацияларды алу тиімді болып келеді. Организмге əр түрлі физикалық жəне химиялық факторлармен əсер ету арқылы жаңа түрі өзгерген пайдалы мутацияларды аламыз. Селекция базасында физикалық немесе химиялық факторлармен, яғни мутагендік факторлармен əсер ету арқылы олардың мутациялық өзгергіштігін жоғарылатып, қажетсіз жəне пайдасы жоқ мутант түрлерін алып тастап, тек маңызды эталондарды таңдап, оларды жаңа түрлерінің алынуына пайдалануға болады [11]. Осыған байланысты өсімдіктердің тұзға төзімділігі жəне төзімділік қасиетін арттыруда көптеген ғалымдар бұл мəселелерді жан – жақты зерттеп келеді. Осы бағыттағы мəселені өсімдік шаруашылығында тұздың əр-түрлі концентрациясын алып, өсімдік сортына жүргізу арқылы үлкен практикалық зерттеу жұмыстары жүргізіліп келеді. Сонымен қатар тұздану өте күрделі стресс болып табылады, бірақ қазірге дейін стресс жағдайында өсімдіктердің организмінде бейімделгіштік процесі əлі толық зерттелмеген. Сондықтан да қазірге дейін өсімдіктердің тұзды стресс жағдайында төзімділігін толық зерттеу жұмыстарын, биотехнология, клеткалық селекция жəне генетикалық инженерия салаларында түрлі əдістері қажет болып табылады. Жұмыстың негізгі мақсаты индуцирленген физикалық мутагенез негізінде əр-түрлі гамма-сəулеcімен өңделген жаздық жұмсақ бидайдың жаңа мутантты формасын 0,01M CaCl2 да 7 тəулік өсіру негізінде құрғақшылықтың əсерін физологиялық скрининг əдісі арқылы анықталды. Ол үшін зерттеу обьектісі ретінде алынған Жеңіс жəне Алмакен бидай сорттарын жəне оларға қажетті ыдыстарды толықтай стерильдік жағдайдан откізіп, 0,01М CaCl2 концентрациясын дайындап оны толыктай стерильді жағдайдан откен бидай сорттарына петри табакшаларына екі қайталама бойынша отырғызылды. Кейін 0,01М CaCl2 концентрациясына отырғызылған Жеңіс жəне Алмакен бидай сорттарын 7 тəулік өсіру негізінде төмендегідей натижелерге қол жеткіздік. Сонымен бұл жаздық жұмсақ бидайдың жаңа мутантты формасын сəулеге түсiрудiң дозалары 100γ жəне 200γ негізінде 0,01M CaCl2 да 7 тəулік өсіругенде мутантты форманың ішінде Алмакен бидай сортының 100γ сəулелендіру дозасындағы мутантты формалары бақылаумен салыстырғанда жер асты мүшесінде өсу белсенділігі жоғары көрсетсішті көрсетті. Ал жеңіс бидай сортында 100γ сəулелендіру дозасындағы мутантты формалары бақылаумен салыстырғанда жер үсті мүшесінде өсу белсенділігі жоғары көрсетсішті көрсетті. Ал жеңіс бидай сортында 200γ сəулелендіру дозасындағы мутантты формалары бақылаумен салыстырғанда жер асты мүшесінде өсу қарқындылығы төмен болып шыкты, ал жер үсті мүшесі Осы көрсеткіштерді төмендегі 1-суреттен байқауымызга болады. Келесі 200γ негізінде 0,01M CaCl2 да 7 тəулік өсіругенде мутантты форманың ішінде Алмакен бидай сортының 200γ сəулелендіру дозасындағы мутантты формалары бақылаумен салыстырғанда жер асты мүшесінде өсу белсенділігі жоғары көрсетсішті көрсетті. 1суреттен байқағанымыздай бидай сорттарының 100γ сəулелендіру дозасындағы мутантты формаларын алмакен мен жеңіс бидай сорттарының жер үсті мүшесі мен салыстырғанда біршама төмен көрсеткішке ие болды. Яғни 100γ сəулелендіру дозасында өсу қарқындылығы Алмакен бидай сортында жоғары белсенділікке ие екендігіне көз жеткіздік. Ал Жеңіс пен Алмакен бидай сорттарның жер асты мүшесіндегі100γ сəулелендіру дозасындағы натижелерін салыстырсақ Алмакен бидай сортында өсу қарқындылығы жоғары болды. Осы көрсеткіштерді жоғарыдығы 1-суреттен байқауымызга болады. Сурет 1 - 7 күндік дегидратация кезіндегі бидайдың жер үсті жəне жер асты мүшелерінің ұзындықтары бойынша айырмашылығы 199 Төмендегі 2 суреттен анықталғаны жаздық жұмсақ бидайдың жаңа мутантты формасын сəулеге түсiрудiң дозалары 100γ жəне 200γ негізінде 0,01M CaCl2 да 7 тəулік өсіругенде мутантты форманың ішінде стрестің өсімдіктерге əсер ету кезі 7 күндік дегидратация, бұл кезде бидай генотиптерінің жер үсті жəне жер асты мүшелеріндегі биомассалар айырмашылығы айқын көрініс тапты. Алмакен бидай сортының 200γ жəне Жеңiс бидай сортының 200γ сəуле түсiру дозаларында жаңа мутантты формалары бақылаумен салыстырып қарағанда біршама жоғары болып шықты. Ал 100 γ сəулеге түсiрудiң дозаларында Жеңіс пен Алмакен бидай сорттарында биомасса көлемі жер асты мүшесінің құрғақ массасы жоғары болып шықты, ал сулы массасында төмен болды яғни бұл дегеніміз биомасса жер асты мүше тамырда жоғары белсенділікке ие болып саналады Сурет 2. 7 Күндік дегидратация кезіндегі бидай генотиптерінің массалар айырмашылығы Жоғарыдығы 2 суреттен байқағанымыздай жаздық жұмсақ бидайдың жаңа мутантты формасын сəулеге түсiрудiң дозалары 100γ жəне 200γ бидайдың Жеңіс жəне Алмакен сорттарында жер үсті мүшесі сабақта биомассаның жиналу қарқындылығы сулы массасы мен салыстырғанда құрғақ массада жоғары болып шықты. Ал сəулеге түсiрудiң дозалары 100γ жəне 200γ бидайдың Жеңіс жəне Алмакен сорттарында жер асты мүшесі тамырда биомассаның жиналу қарқындылығы сулы массасы мен салыстырғанда құрғақ массада жоғары болып шықты. Яғни өсімдіктің құрғақ массасында биомассаның жоғары сандық көрсеткішке ие болатындығына көзіміз жетті. 7 күндік дегидратация кезіндегі бидай генотиптерінің 200γ дозасында Алмакен мен Жеңіс бидай муттантты формалары салыстырмалы турде үлкен көрсеткіш көрсетті. Қорыта айтқанда скрининг арқылы бидайдың М2 мутантты формаларының ішінен жоғарыдағы нəтижелерге негізделе отырып, құрғақшылыққа төзімді формалары іріктеліп алынды. 1. Қалекенұлы.Ж. Өсімдіктер физиологиясы. Алматы: - Баспа, 2004. 347-451б 2. Sariyeva G.E., Kenjebaeva S.S., Ecophysiological approach of peroxidase activity and thermostability of cell- bound forms in wheat leaves of different morphology// Acta Botanica Hungarica. -2003.-V.45, № 3 – 4.P.399-407 3. Устинова Е.И. Цитологические данные мужской стерильности кукурузы // Цитология.-1961 4. Yamane K., Rhaman M.S. Pretreatven with antioxidants decreases the effects of salt stress on cboroplast ultrastructure in rice leaf segments // Plant Pruction Science. – 2004- #7. – P.292 – 300 5. Қазақ Энциклопедиясы 6. Палилова А.Н., Данков Т., Трубин Н.В. и др. Проблемы цитоплазматический мужской стерильности у растений. – Минск: Наука и техника, 1988. – 158с 7. Rhoades M.M. The cytoplasmic inheritanance of male sterility in Zea mays //J.Genet.-1933.Vol.27.-C71-93 8. Blum A. Plant breeding for stress environment. CRS Press, Bosa Raton, Florida – 1988. –P. 112-125 9. Chaves M.M (1991) Effects oF wanter deficits on carbon assimilation Journal of Exprimental Botany 42, 1-16. 10. Grichko V.Glicr B. (2000)Ethylene and flooding stress in plants. Plant physiology and Biochemistry 39, 1-9. 11. Bogdanova, Е.D., Epigenetical variation induced by nicotinic acid in Triticum aestivum L, Genetics 39 (9) (2003) 1221. *** С помощью лабороторных физиологических исследований установлено, что сорты Алмакен и Женис оказался наиболее засухоустойчивым по таким критериям, как интенсивность роста, накопление биомассы. *** The physiological characteristics, biomass accumulation and in different spring wheat genoty were investigated the result showed that almaken and zhenis had higer level of to tolerance to dehydration strees. 200 К.М. Кебекбаева, А.К. Джобулаева, Л.П.Треножникова, А. Хасенова ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АКТИНОМИЦЕТОВ СИНЕФИОЛЕТОВОЙ ГРУППЫ ПОСЛЕ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ (Институт микробиологии и вирусологии МОН РК, г. Алматы) В статье дан анализ жизнеспособности и биологической активности актиномицетов сине-фиолетовой группы СФ ИМВ 1, 15 после длительного хранения, подбор оптимальных условий биосинтеза. Актиномицеты, как известно, характеризуются сильно выраженной вариабельностью. Установлено, что их наследственная изменчивость подчиняется закону гомологических рядов. В популяциях любых видов актиномицетов наряду с основной формой, существуют сходные по ориентирным признакам параллельные ряды естественных форм: белые, олигоспоровые, аспорогенные, карликовые, нокардиоподобные. У пигментообразующих к ним прибавляются другие варианты. Ряды изменчивости у продуцентов биологически активных веществ возрастают за счет появления дополнительного отличительного свойства – биосинтеза антибиотиков. Степень проявления процесса изменчивости зависит от генетической природы организма и условий внешней среды. Существует много способов консервации культур: метод лиофилизации, хранение в физиологическом растворе, хранение на плотных питательных средах под слоем минерального масла, в почве и на шелковых нитях. Однако существуют убедительные доказательства необходимости строго индивидуального подхода при выборе того или иного способа хранения микробиологического материала в соответствии с его физиолого-биохимическими свойствами. Материалы и методы Жизнеспособность актиномицетов изучали посредством высева суспензий спор на– минеральный агар- 1 Гаузе, Чапека3, органический агар -2 Гаузе, картофельно-декстрозный агар, овсяный агар, пептонно-дрожжевой агар [1-2]. Активацию спор проводили в термостате, а также путем культивирования на роторном шейкере (180-200 об\мин) при температуре 28оС в течение 3-5 суток. Споровые взвеси высевали на агаровые среды и инкубировали в термостате при температуре 28оС в течение 14-21 суток. Выживаемость культур актиномицетов оценивали качественно, по наличию или отсутствию роста после высева споровых взвесей на соответствующие среды. Морфологию спороносцев изучали в световом микроскопе МБИ 6. Изучение культуральных признаков: цвета воздушного, субстратного мицелия и растворимых пигментов - проводили на 7, 14, 21 сутки роста культуры на диагностических средах. Для объективной оценки окраски использовали шкалу цветов А.С.Бондарцева [3]. Для получения спорового материала штаммы актиномицетов выращивали в течение 7-10 дней при температуре 28 0С на минеральном агаре 1 Гаузе и органическом агаре 2 Гаузе. Биосинтез антибиотиков осуществляли в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл в объеме среды 100 мл на круговой качалке (180-200 об/мин) при температуре 28оС в течение 72-96 часов. Антимикробную активность культуральной жидкости и ацетоновых экстрактов определяли стандартными методами: двукратных серийных разведений на питательном бульоне и диффузии в агар на питательном агаре. Для определения активности в отношении Candida albicans и Fusarium heterosporium использовали среду Сабуро. Спектры поглощения антибиотиков в УФ - и видимой областях света измеряли в бутаноле и 96 % этаноле на спектрофотометре “Ultrospec 2100 pro”. Результаты и обсуждение Объектами исследований являлись 2 штамма актиномицетов обладающих окраской воздушного и субстратного мицелия от синего до фиолетового цвета (СФ ИМВ 1, 15), заложенных на хранение в физиологическом растворе. Длительность хранения штаммов без пересева– 39 лет. Штамм СФ ИМВ-1 проявил жизнеспособность на всех испытанных средах. На минеральном агаре 1Гаузе рост слабый. Колонии мелкие, звездчатой формы, плоские, без воздушного мицелия. Субстратный мицелий белый, растворимый пигмент отсутствует. На органическом агаре 2 Гаузе рост хороший. Колонии мелкие, мягкой консистенции. Воздушный мицелий отсутствует, субстратный мицелий светло-коричневый, растворимый пигмент отсутствует. На пептонно-дрожжевом агаре рост хороший. Колонии неправильной формы, не опушенные, мягкой консистенции, складчатые. Субстратный мицелий светло-коричневый, растворимый пигмент отсутствует. 201 K. pneumoniae 444 S. aureus 209 P розово15,62 0 0 0 0 красный 0,125% светло3,88 0 0 0 0 кукурузная бордовый 1 Гаузе бледно- желтая светло1,07 0 0 0 0 фиолетовый 52\6 светло-желтая светло1,17 0 0 0 0 коричневый Чапека-3 с фиолетовая фиолетово2,02 15 14 100 80 глицерином синий Штамм СФ ИМВ 15 проявил высокую способность к восстановлению на минеральном агаре 1 Гаузе, агаре 3 Чапека и овсяном агаре. На минеральном агаре 1 Гаузе было обнаружено 4 типа колоний. На овсяном агаре все колонии округлой формы, плоские, со слегка приподнятым центром, хорошо опушенные. Отмечено присутствие двух типов колоний: На среде Чапека 3 было обнаружено 4 типа колоний. Все варианты штамма СФ ИМВ 15 были отсеяны в чистую культуру и изучены их антагонистические свойства методом агаровых блоков в отношении S. aureus 209 P. Диаметр зон подавления роста тест организма варьировал в пределах 12-20 мм. Наиболее высокую активность проявил вариант 4 (диаметр зоны подавления роста S. aureus 209 P 20 мм), образующий интенсивный синий пигмент на агаре 1 Гаузе. Антимикробная активность культуральной жидкости значительно зависит от присутствия синего пигмента и изменяется на испытанных средах от 40 до 400 ед\мл в отношении S. aureus 209 P. Наиболее высокая активность наблюдалась на синтетической среде Чапека-3 с глицерином. Данные по культуральным свойствам штамма СФ ИМВ 15, величине биомассы и антибиотической активности приведены в таблице 2. Соевая А 4 желтокоричневая темно- розовая K. pneumoniae 444 S. aureus 209 P На агаре 3 Чапека с глицерином рост хороший. Колонии округлой формы, плоские, хорошо опушенные. Воздушный мицелий светло-фиолетовый, субстратный мицелий фиолетовый, растворимый пигмент слабый, светло-фиолетовый. на овсяном агаре рост хороший, наблюдали присутствие двух типов колоний. 1) Колонии округлой формы, плоские с приподнятым центром, хорошо опушенные. Воздушный мицелий светло-фиолетовый, субстратный мицелий фиолетовый, растворимый пигмент слабый, светло-фиолетовый. 2) Колонии плоские, без воздушного мицелия, субстратный мицелий светло-коричневый, растворимый пигмент не образует. На основании изучения культуральных признаков на диагностических средах штамм СФ ИМВ 1 отнесен к серии Coerulescens. При росте штамма на синтетических и органических жидких средах наблюдали появление темно-синей окраски культуральной жидкости, которая варьировала в зависимости от состава среды. Антимикробная активность культуральной жидкости значительно зависит от присутствия синего пигмента. Активность наблюдалась на синтетической среде Чапека-3 с глицерином (100 ед\мл в отношении S. aureus 209 P). Данные по культуральным свойствам штамма СФ ИМВ 1, величине биомассы и антибиотической активности приведены в таблице 1. Таблица 1 - Культуральные свойства штамма СФ ИМВ 1 и антибиотическая активность культуральной жидкости штамма на различных питательных средах Наименование Окраска Окраска Вес Диаметр зоны Активность , среды культуральной мицелия биомасы, подавления ед\мл, в жидкости г\л роста, мм отношении 202 Чапека-3 глицерином светложелтая с синяя K. pneumoniae 444 52\6 S. aureus 209 P 0,125% кукурузная 1 Гаузе желтокоричневая светлокоричневая синяя K. pneumoniae 444 Соевая А 4 S. aureus 209 P Таблица 2- Культуральные свойства штамма СФ ИМВ 15 и антибиотическая активность на различных питательных средах. Наименование Окраска Окраска Вес Диаметр зоны Активность, среды культуральн мицелия биомассы подавления ед\мл, ой жидкости г\л роста, мм в отношении розово-красный 19.89 0 0 0 0 темно-розовый 7,37 0 0 0 0 темнокоричневый желтокоричневый синефиолетовый 3,5 14 10 40 10 0,63 0 0 0 0 2.83 22 16 400 80 На основании изучения культуральных признаков на диагностических средах штамм СФ ИМВ 15 отнесен к серии Coerulescens. Штамм СФ ИМВ 15 восстановлен по характерным для группы сине-фиолетовых актиномицетов культуральным признакам и величине антибиотической активности. Способ хранения в физиологическом растворе обеспечивает сохранение культуральных свойств актиномицетов сине-фиолетовой группы и, что особенно важно, сохранение их антимикробных свойств. 1. Гаузе Н.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов. М.: <Наука > , 1983, 245 с. 2. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. М.: «Агропромиздат”,1990,283 с. 3. Бондарцев А.С. Шкaла цветов. М.: АН СССР, 1954, 31 с. *** Мақалада көгілдір-күлгін топқа жататын СФ ИМВ 1, 15 актиномицеттердің ұзақ мерзімді сақтаудан кейінгі биологиялық белсенділіктері мен тіршілікке қабілеттілігін зерттеу туралы талдаулар көрсетілген. *** The analysis of viability and biological activity of actinomycetess of сине-фиолетовой group СF IMV 1 is given in the article, 15 after the protracted storage, selection of optimal terms of biosynthesis К.М. Кебекбаева ДЛИТЕЛЬНОЕ ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ В КОЛЛЕКЦИИ (РГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК, г. Алматы) В статье отражены результаты изучения влияния различных методов длительного культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях и поиск способов повышения их устойчивости. Поддержание микроорганизмов в жизнеспособном состоянии требует изучения и использования различных методов хранения и состава питательных сред. Используемые методы не всегда являются универсальными, так как различные группы микроорганизмов имеют различную устойчивость к методам консервации и работа в этом направлении имеет эмпирический характер. Исследования и поиск в этом направлении продолжается. В коллекции института микробиологии и вирусологии МОН РК поддерживаются микроорганизмы, относящиеся к различным систематическим группам. В числе штаммов есть перспективные (хлебопекарные, винные дрожжи) как для научных исследований, так и для 203 промышленных целей. Среди множества микроорганизмов, имеющих практическое значение, ведущая роль принадлежит молочнокислым бактериям, средой обитания которых является почва, растительные, молочные, и мясные продукты, кишечник человека и животных [1] . Материалы и методы В работе использовали штаммы бактерий : L. salivarius 8д, L. plantarum 34, L. brevis Б-3, L. fermentum 16, L. cellobiosus 20 и 7н. , хранившиеся с 1990 г в сублимационно высушен-ном состоянии и при периодических пересевах. Питательной средой для выращивания молочнокислых бактерий служила среда MRS. Штаммы винных дрожжей, сохраняемые под слоем вазелинового масла с 1979 года (Мускат 68(10), Апорт 199) выращивали на сусло, сусло-агаре. Выживаемость кормовых дрожжей рода Candida, сохраняемые под слоем вазелинового масла и хлебопекарных дрожжей проверяли на среде сусло-агар с 2% хлористым натрием. Результаты исследований Проверялась жизнеспособность лиофилизированных молочнокислых бактерий, при этом для реактивации использовали среду MRS с твином 80. Эта среда дает хорошие результаты при реактивации. Штаммы молочнокислых бактерий, имеющие палочковидную форму в этой среде меняют морфологические признаки, принимают кокковую форму. Первоначальная форма клеток восстановилась только у штамма Lactobacillus plantarum 34, после длительного культивирования на среде с кукурузным экстрактом. Было проверено влияние 2% NaCl. Добавление 2% NaCl увеличило срок жизнеспособности, но культура после длительного хранения развивалась только в жидкой среде. Из полученных данных можно сделать вывод: выращивание бактериальных культур на среде с 2% NaCl перед лиофилизацией повышает их устойчивость при хранении, среда MRS способствует накоплению биомассы. Кормовые дрожжи рода Candida, сохраняемые под слоем вазелинового масла жизнеспособны в течение 20 лет. У штамма Candida scottii Tул-1 наблюдается очень хороший вторичный рост, у Candida tropicalis 41- слабый. После реактивации в жидком сусле рост культуры хороший. После длительного хранения (без пересевов) хлебопекарных дрожжей, Saccharomyces cerevisiae под слоем вазелинового масла на сусло-агаре с 2% хлористого натрия у отдельных штаммов наблюдается вторичный рост: раса "Щелковская" и " А-21". Вторичный рост культуры также наблюдается у дрожжей Torulopsis candida при длительном хранении на сусло-агаре с NaCl под слоем вазелинового масла. Вариант, выделенный из этой колонии был более активен по сравнению с исходным. Эти данные говорят о том, что появление вторичного роста, продлевает сроки длительного хранение штаммов без пересевов. Проведены исследования по проверке жизнеспособности винных дрожжевых культур после длительного хранения в лиофилизированном состоянии. Установлено, что Saccharomyces vini 2(2), Мускат 68(10) жизнеспособны, активно сбраживают виноградный сок при 17,8% сахаристости за 5 дней. Штаммы винных дрожжей, сохраняемые под слоем вазелинового масла с 1979 года (Мускат 68(10), Апорт 199), также жизнеспособны и активны. Активность штаммов определялась в трубках Дунбара. Хлебопекарные штаммы «А-21», «Мутант 9», «Киргизия», хранившиеся в лиофилизированном состоянии с 1994 года жизнеспособны и активно сбраживают пивное сусло. При рассеве на твердую питательную среду и при микроскопировании не выявлено морфологических изменений. Микроскопирование показало, что культуры чистые, сохранили морфологические признаки. Все они были заложены на длительное хранение различными методами. Жизнеспособность стрептомицетов проверялась у штаммов, заложенных на длительное хранение без пересевов различными методами 20-30 лет назад. После реактивации на жидких питательных средах культуры рассевали на твердые среды в чашки Петри. У штаммов Streptomyces coelicolor ( 16,17,18) образование характерного пигмента в среду и небольшая антибиотическая активность ( аналогичная паспортным данным ) по отношению к вакцине Цинковского выявлена у одного штамма(17), сохраняемого под слоем вазелинового масла без пересевов с 1971 года. Остальные варианты этой культуры пигмент не образуют, колонии серебристо-серого цвета. Результаты по хранению штаммов Streptomyces представлены в табл.1. 204 Streptomyces sp. шт. 1321 Streptomyces antibioticus шт 25/ 779 Streptomyces coelicolor шт 17 Streptomyces coeruleo-fuscus шт 25/ 785 Streptomyces griseoruber шт 1618 Streptomyces roseoflavus var. roseofungini 1-68-100 Streptomyces Arai А-23/ 791 Streptomyces roseoflavus var.roseofungini шт. 1128 Streptomyces griseoruber шт. 306 1971 Чап.3 Чап.3 Чап.3 Чап.3 Чап.3 Гаузе 1 + + + + + + 1976 1978 Гаузе 1 Гаузе 1 + + 1976 Гаузе + 1978 1971 1978 + + + + + + Сухое хранение почва Вазелиновое масло Физиол.р-р Питательная. среда Год закладки на длительное хранение Таблица 1- Жизнеспособность штаммов Streptomyces после длительного хранения. Штаммы Способы хранения + + + + + + Из табл.1 видно, что для длительного (без пересевов) хранения этих штаммов благоприятны вазелиновое масло, физиологический раствор. Сухое хранение [2] (метод Кореняко) также сохраняет жизнеспособность штаммов. Стрептомицеты под слоем вазелинового масла могут сохраняться длительное время без пересевов. 1. Саубенова М.Г. Полисахариды дрожжевых организмов.- Алма-Ата.- 1976 - 82-83с. 2. Кореняко А.И. Способ сохранения актиномицетов в сухом состоянии. //Труды Института микробиологии АН СССР.- 1954.- №3.- С.221-223. *** Мақалада микроорганизмдерді зертханалық жағдайда дақылдаудың əртүрлі əдістердің əсері туралы зерттеулер жəне олардың төзімділігін жоғарылату əдістері туралы мəліметтер көрсетілген. **** The results of study of influence of different methods of the protracted cultivation of microorganisms in laboratory terms and search of methods of increase of their stability are reflected in the article . А.А. Кожалакова, А.А. Жубанова ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АБСОРБЕНТА НЕФТИ НА ОСНОВЕ ТОРФЯНОГО СФАГНОВОГО МХА (АО «Мангистаумунайгаз», г. Актау, КазНУ им. аль-Фараби, кафедра биотехнология) В данном сообщении приведены результаты исследования эффективности отношении очистки сточных вод, загрязненных нефтепродуктами. торфяного сфагнового мха в В результате интенсивной нефтедобычи, нефтепереработки, производственной и повседневной детельности человека, в мире ежегодно образуется миллионы тонн твердых бытовых и промышленных отходов, являющихся основным источником загрязнений и источником появления экологических проблем. Одним из наиболее опасных веществ, загрязняющих среду обитания, является нефть – сложнейшая система углеводородов различного строения и молекулярной массы, состоящая почти из 3000 ингредиентов, большинство из которых легко окисляемы. В настоящее время наиболее предпочтительным при очистке воды и почвы от нефтепродуктов является использование сорбентов, включающих в себя адсорбенты и абсорбенты. Абсорбенты на основе торфяного сфагнового мха представляют собой полностью натуральный, органический материал, содержащий в своих клетках гумусовую кислоту, которая является природным катализатором, способствующим расщеплению поглощенных углеводородов. 205 Целью работы явилось определение остаточного содержания нефтепродуктов в воде после обработки ее нефтью и абсорбентом на основе торфяного сфагнового мха торговой марки «BioMatrix Gold, Spill-Sorb». на месторождение Каламкас. Методика проведения работ: 1. Испытание проводится в помещении при температуре среды +10 - +200С. 2. Для проведения испытания изготавливаются 2 металлические емкости вместимостью 20 л. 3. Испытания проводятся в двух повторностях. 4. В емкость помещается водонефтяная эмульсия в количестве 10 л. 5. Проводится отбор проб воды с последующим определением в них содержания нефти. 6. В емкость с водонефтяной эмульсией добавляется сорбент согласно норме расхода. 7. Смесь перемешивается и через 40 секунд после добавки сорбента производится отбор проб воды для определения остаточного содержания в них нефтепродуктов. Норма расхода абсорбента рассчитана согласно емкости поглощения абсорбента по отношению к нефти, приведенной в паспорте абсорбента ПС 2160-001-79398193-2006. Согласно паспортным данным массовая емкость поглощения абсорбента для нефти плотностью 0,860 кг/м3 составляет 3,40 кг нп/кг сорбента и для нефти плотностью 0,950 кг/м3 – 3,96 кг нп/кг сорбента. Норма расхода абсорбента для нефти месторождение Каламкас плотностью в среднем 0,902 кг/м3 приведены в таблице №1. Таблица 1 - Норма расхода абсорбента Содержание нефтепродукта, Объем загрязнений, л Количества абсорбента, кг мг/л 10 50 0,15 10 60 0,18 10 70 0,21 10 80 0,24 10 90 0,26 10 100 0,29 10 200 0,59 10 300 0,88 10 400 1,18 10 500 1,47 Результаты и обсуждение Было отобрано по две пробы из каждой точки. Проба №1 – сточная вода, закачиваемая в пласт для поддержания пластовой воды с начальным содержанием нефтепродукта в среднем 107 мг/л с блочно-кустовой насосной станции (БКНС 8,9). Проба №2 – сточная вода, закачиваемая в пласт для поддержания пластовой воды с начальным содержанием нефтепродукта в среднем 132 мг/л из отстойника сточной воды ОВ-1/2 установки по подготовке сточной воды (УПСВ). Результаты анализа по содержанию нефтепродуктов в сточной воде приведены в следующей таблице №2. Таблица 2 - Концентрация нефтепродуктов в сточной воде № Место Рпри 200С, Содержание нефтепродукта Эффективность пробы отбора г/см3 очистки, % До обработки После обработки % мг/л % мг/л 1 БКНС-8,9 1,085 0,0099 107,2 0,0016 18,2 83 2 ОВ-1/2 1,081 0,0122 132,0 0,0030 32,5 75,4 Изучение сорбции абсорбента показало, что эффективность очистки сточной воды применяемым нами методом составляет 83 % и 75,4 %. Полученные в ходе исследований результаты позволяют использовать абсорбент для достижения минимальной концентрации нефтепродукта в сточной воде, закачиваемой в пласт для поддержания пластового давления с укорочением существующего процесса подготовки сточной воды. В дальнейшем необходимо оценить возможность использования адсорбента постоянно, т.е., не удаляя его из почвы после применения, осуществляя при этом контроль процесса биоразложения 206 (биоремедиации) нефтепродуктов, что позволит оценить ремедиационный потенциал абсорбента на основе торфяного сфагнового мха в отношении нефти. 1. Паспорт сорбента ПС 2160-001-79398193-2006. ООО «Терра-Экология. 2. Отчет исследований абсорбента «Канадиан Сфагнум Пит Мосс», Москва 2006г. 3. Заключение по абсорбенту «Канадиан Сфагнум Пит Мосс», Москва 2006г. 4. Программа работ по теме «Опытно-промышленные испытания по применению абсорбента «Canadian Sphagnum Peat Moss» для ликвидации замазученных грунтов и водных поверхностей» на объектах АО «КазТрансОйл», Алматы 2009г. 5. Экспертное заключение №028 от 09.12.2011г. о соответствии требованиям промышленной безопасности абсорбента для углеводородов и химикатов «Canadian Sphagnum Peat Moss» ТОО «Golden Age» на основании аттестата на право проведения работ в области обеспечения промышленной безопасности за № 0000976 от 10.02.2010г. *** Жұмыста мүтекзектің сфагнум мүгінің мұнай өнімдерімен ластанаған ағын суларды тазалаудағы эффективтілігі туралы зерттеу нəтижелері көрсетілген. *** There are results of investigation of effectivity of special natural sorbent in relation of clean of waste polluted oil products in this report. А.А. Курманбаев, Э.Р. Файзулина, О.Н. Ауэзова, Ж.А. Байгонусова, А.К. Саданов, Е.Ж. Шорабаев БИОРЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННОЙ ПОЧВЫ ИСПЫТАТЕЛЬНОГО ПОЛИГОНА ТОО «ЖЫЛЫОЙ-БОЛАШАК» АССОЦИАЦИЯМИ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ (РГП «Институт микробиологии и вирусологии» КН МОН РК) Изучена возможность очистки нефтезагрязненых почв испытательного полигона ТОО «ЖылыойБолашак» активными ассоциациями нефтеокисляющих микроорганизмов. Показано, что после их интродукции в почву увеличилось количество основных групп микроорганизмов. Степень деструкции нефти через один месяц составила 46.9% и 70.8%. Казахстан наращивает добычу и транспортировку нефти и газа. К 2015 году планируется утроить добычу нефти до 150 млн. т ежегодно и войти в десятку крупнейших нефтедобывающих стран мира. В настоящее время нефтяное загрязнение, как по масштабам, так и по степени токсичности для биоты природных сред, приобретает глобальный характер. Нефть и нефтепродукты вызывают отравление, гибель организмов и деградацию почв. Нефть, попадая в почву, вызывает значительные, порой необратимые изменения её свойств - образование битуминозных солончаков, гудронизацию, цементацию и т. д. Эти изменения влекут за собой ухудшение состояния растительности и биопродуктивности земель. В результате нарушения почвенного покрова и растительности усиливаются нежелательные природные процессы - эрозия почв, деградация [1, 2]. Естественное самоочищение природных объектов от нефтяного загрязнения - длительный процесс, поэтому исключительную актуальность приобретает проблема рекультивации нефтезагрязненных почв, в частности биоремедиация. Перспективной технологией очистки нефтезагрязненных почв считается внесение в почву различных комплексов микроорганизмов, отличающихся повышенной способностью к биодеструкции тех или иных углеводородных компонентов нефти и нефтепродуктов [3]. Методы исследования Объектами исследования послужили почвы, загрязненные нефтью, с испытательного полигона ТОО «Жылыой-Болашак» и биопрепараты на основе активных нефтеокисляющих бактерий. Испытывались две ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов: Первая ассоциация представлена бактериями - Micrococcus roseus 34, Micrococcus roseus 40, Rhodococcus erythropolis 7A; Вторая ассоциация состояла из бактерий и дрожжей: Rhodococcus erythropolis P29, Flavobacterium sp. 4 tol, Arthrobacter terregens П1, дрожжи Candida sp. ФС-К2. Полигон расположен в 40 км от г. Атырау, площадь участка 180 м2. Площадь делянок (5×4) 20 м2, между делянками устанавливали защитные полосы 0,5 м шириной. 207 В каждую делянку были внесены органоминеральные удобрения. В качестве органического удобрения использовали птичий помет в дозе 1-2 кг на м2, навоз 12 кг на м2. Минеральные удобрения внесены в виде аммиачной селитры, аммофоса и карбамида в дозе 25 г м2. Расположение вариантов опыта рендомизированное, повторность трехкратная. Для предотвращения вторичного загрязнения природных сред, почвы делянок изолировали от подстилающего грунта пластиковой пленкой высокой прочности. Почвы делянок рыхлили культиватором Р51016. В течение опыта обеспечивали оптимальную влажность почв периодическими поливами. Определение нефтепродуктов проводили по методике М 03-03-97 флуориметрическим методом на приборе «Флюорат - 02» [4]. Анализы проведены испытательной лабораторией ТОО «Аналитическая лаборатория по охране окружающей среды». Для учета микроорганизмов в почве использовались общепринятые методы, используемые в почвенной микробиологии [5]. Для определения общего микробного числа (ОМЧ) использовалась среда РПА, посевы культивировали в термостате при 28С в течение 2 суток. Выделение спорообразующих микроорганизмов проводили путем нагрева суспензий до 80°С и высевом на среду РПА. Для выделения грибов из почвы использовали питательную среду Чапека 3, культивировали в течение 14 суток при 28оС. Выявление и учет численности актиномицетов проводили высевом образцов на крахмал-аммиачный агар при 28-30 оС. Для оценки количества углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) использовали среду Ворошиловой-Диановой. В качестве единственного источника углерода в среду вносили нефть. Культивирование микроорганизмов проводили при 28оС в течение 14 суток. О развитии УОМ судили визуально по помутнению среды и изменению нефтяной пленки на поверхности среды. В РГП «Институт микробиологии и вирусологии» на основе консорциумов углеводородокисляющих микроорганизмов наработаны пастообразные биопрепараты, которые дважды были внесены в почву испытательного полигона. После внесения биопрепарата на основе нефтеокисляющих микроорганизмов почву увлажняли и рыхлили. Результаты исследований До внесения ассоциаций нефтеокисляющих микроорганизмов была исследована микрофлоры нефтезагрязненной почвы. Полученные данные свидетельствуют о невысоком уровне биогенности исходной почвы. Количество клеток основных групп микроорганизмов находилось в интервале 10-100 тысяч клеток в 1г почвы. Общее микробное число составило 5.0±0.1×105 КОЕ/г почвы, численность споровых бактерий – 1.9±0.6×104 КОЕ/г, актиномицетов – 1,8±0.6×104 КОЕ/г. Крайне невысокой была численность микромицетов (0.4±0.2×102 КОЕ/г) и УОМ –2.5×102 НВЧ кл/г. После проведения мероприятий по биоремедиации биогенность почвы повысилась (табл. 1). Таблица 1 Численность микроорганизмов в почве после биоремедиации Вариант опыта Численность микроорганизмов, КОЕ/г ОМЧ споровые контроль ассоциация 1 11.25±1.5×106 29.6±2.4×106 9.0±1.3 ×105 6.1±1.1×105 актиномицет ы 3.0±0.8×104 0.5±0.3×104 ассоциация 2 13.4±1.6×107 9.6±1.4×105 7.8±1.2×105 микромицет ы 2.1±0.6×103 3.2±0.8×103 4.5±0.9×103 УОМ* 7.0×103 1.1×104 1.1×105 *Примечание – для УОМ, НВЧ кл/г Анализ полученных данных показывает, что по всем вариантам опыта после обработки почвы биопрепаратами титр клеток возрос на 1 – 2 порядка. Наиболее активно микробиологические процессы протекали в почве при внесении ассоциации 2. В этом варианте отмечен наиболее высокий титр УОМ (105 кл/г), что свидетельствует об интенсивности проходящих процессов утилизации нефтяных углеводородов. Помимо микробиологического анализа был проведен химический анализ почвы на содержание нефти (табл. 2). 208 Таблица 2 - Содержание нефти в почвах по вариантам опыта Варианты опыта Содержание нефти в После обработки через Степень очистки почве до обработки 1 месяц, мг/кг почвы от нефти, % препаратами, мг/кг Контроль 16 000 12464 22.1 Консорциум 1 16 000 8496 46.9 Консорциум 2 16 000 4672 70.8 Из данных таблицы следует, что естественный процесс самоочищения почв от нефти при создании благоприятных условий привел к деструкции нефти на 22.1%. В почвах при внесении консорциумов 1 и 2 процесс очистки усилился до 47 и 71%. Наиболее эффективным оказался консорциум 2. Таким образом, результаты микробиологического и химического анализов нефтезагрязненных почв испытательного полигона ТОО «Жылыой-Болашак» показали, что внесение активных ассоциаций нефтеокисляющих микроорганизмов способствует более эффективной очистке почвы от углеводородов нефти и повышению ее биогенности. 1. Панин М.С. Химическая экология. – Семипалатинск: СГУ, 2002. – 852 с. 2. Кодина Л.А. Геохимическая диагностика нефтяного загрязнения почы /Сб. ст. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. – М.: Наука, 1988. – С. 76-81 3. Кураков А.В., Ильинский В.В., Котелевцев С.В., Садчиков А.П. Биоиндикация и реабилитация экосистем при нефтяных загрязнениях – М.: Графикон, 2006. – 336 с. 4. Методика выполнения измерения массовой доли нефтепродуктов в пробах почвы М 03-03-97. 5. Звягинцев Д.Г. Методы почвенной микробиологии и биохимии. Изд-во МГУ, 1991. С. 59 – 75. *** «Жылыой-Болашақ» ЖАҚ сынақ полигонындағы мұнаймен ластанған топырақты белсенді мұнай тотықтырушы микроорганизмдермен тазалау мүмкіншілігі зерттелді. Микроорганизмдерді топыраққа енгізгеннен кейін микроорганизмдердің негізгі топтарының саны жоғарылағаны көрсетілді. Мұнайдың ыдырау деңгейі бір айда 46.9% и 70.8% құрады. *** The possibility of cleaning contaminated soil test range LLP "Zhyly-Bolashak" active associations oxidizing microorganisms. It is shown that after their introduction into the soil increased the number ofmajor groups of microorganisms. The degree of degradation of oil in one month was 46.9% and 70.8%. Д. Қазыкен ГЕЛЬ ХРОМАТОГРАФИЯСЫМЕН mTOR КОМПЛЕКСТЕРІН БӨЛІП АЛУ (Л.Н. Гумилев атындағы Еуразия ұлттық университеті) mTOR жасушаның ішкі процестерінің реттеушілерінің бірі. mTOR сигнал жолы жасушалардың өсуі, көбеюі жəне зат алмасуы қатарлы физиологиялық процестеріндегі рөлі өте маңызды болып табылады. mTOR туралы жасалған зерттеулерің көптігіне қарамастан, оның қазірге дейін белгілі болған екі комплекстері mTORC1 жəне mTORC2-ге қатысты кейбір мəселелер, сонымен қатар mTOR-дың басқа комплекс түзу мүмкіндіктері əлі де толықтай зерттелмеген күйінде қалып отыр. Біздің зерттеу жұмысымызда қазірге дейін белгілі болған сүтқоректілердегі рапамициннің нысанасы болып табылатын mTOR сигнал жолының екі ақуыздық комплекісінен басқа, үшінші бір комплексті бар екендігі гел фильтрациялық хроматографиясы арқылы анықталды. Соңғы уақытта сүтқоректілердегі рапамициннің нысанасы болып табылатын mTOR ақуыз киназасы жасуша өсуін реттеуі жəне адамда ісік ауруларының пайда болуы жəне дамуындағы маңызды рөліне үлкен назар бөлінуде. Соңғы он жылдықта mTOR-дың функциясы жəне реттелуін түсіну үшін көп күш салынды. Ал, қазіргі негізгі көзқарас бойынша mTOR комплекстері жасушаның өсуі мен сақталуы секілді негізгі биологиялық процесстерді реттейді [1], сонымен қатар жасушаның өсу факторлары, қөректік заттар, энергия деңгейі жəне жасушалық стрессті қоса есептегенде жасушаның ішкі жəне сыртқы сигналдарын қамтиды [2]. mTOR-дың маңызын жақында ғана анықталған mTORмен байланысатын ақуыздар айқындап отыр. Қызық тудыратын бір жəйт сол - əртүрлі ақуыздармен байланысқанда, mTOR физиологиялық қызметі жағынан бір-біріне мүлдем ұқсамайтын əртүрлі комплекстер түзеді: mTORC1 жəне mTORC2 [3, 4]. Əрбір mTOR-комплекстерінің суббірлік композициялары олардың субстраттарының арнайылығын белгілейді [5]. mTORC1-дің субстраттары s6K1 жəне 4E-bP1мРНҚ-мен бірігіп, мРНҚ транслияциясының басталуын жəне ұзаруын реттеу арқылы ақуыз цинтезінің жылдамдығын контрольдайды [6, 7]. Рапамицинге сезімтал емес mTOR комплексі 209 (mTORC2) өсу факторларына тəуелді сигнал үшін өте маңызды болып табылады. mTORC2 комплексі AGC киназалары Akt, SGK1, PKC-лерді тікелей фосфорландыру арқылы активтендіреді. mTORC2 комплексі Akt арқылы жасушалардың тіршілігін сақтауын жақсартып, актин цитоскелетонының құралуына түрткі болады [8, 9]. Бұл жаңалықтар тек қана mTOR-дың жасушада атқаратын рөлін кеңейтіп қоймастан, оның үстіне реттеушілік қызметін де толықтай түсті. Сонымен, қазіргі таңда mTOR-дың сигналдық жолына бағытталған қатерлі ісікке қарсы дəрілерді табу жəне қолдануды тікелей меңгеру үшін оның негізгі молекулалық механизмін анық түсіну өте маңызды [10]. Біздің зерттеу жұмысымызда осы жасушадағы аса маңызды, ең үлкен сигнал жолдарының бірі болып табылатын mTOR сигнал жолының бұрын ашылған mTORC1 жəне mTORC2 комплекстерінен басқа үшінші комплексі ашылып, оның жасушадағы өте маңызды рөлі анықталды. Бұрынғы зерттеулерде mTORС1 мен mTOR2-нің екеуі де аффинді хроматографияны қолдану арқылы ашылған болатын [2]. TOR көп доменді, үлкен ақуыз болып, көптеген ақуыз-ақуыз байланыстарына медиатор болатындығы белгілі. Гель фильтрациялық хроматографиясын қолдана отырып оны бөліп алу барысында, оның күтілген өз молекулалық салмағынан анағұрлым үлкен салмаққа ие фракциядан табылды. Бұл көптеген зерттеу топтарының TOR-ды онымен байланысатын серіктерімен бірге бөліп алуға күш салуына себепкер болды. 2002 жылы Халлдың зерттеу тобы бастаушы зерттеулерінде алғаш рет KOG1, AVO1, AVO2, AVO3 (AVO1/2/3) and LST8 ақуыздарын қамтыған бірнеше TOR-мен байланысушы ақуыздарды ашытқы бактериясынан бөліп алды [11]. Бір ғажабы, TOR1 немесе TOR2-нің екеуі де KOG1 жəне LST8-бен байланысып рапамицинге сезімтал TORC1 комплексін түзе алады. Ал TOR2 AVO1/2/3 жəне LST8-бен байланысып, рапамицинге сезімтал емес TORC2 комплексін түзеді [4]. Сонымен бірдей уақытта Раптор да mTOR-мен байланысушы ақуыз ретінде табылды. Амин қышқылдары тізбегін сəйкестендіру нəтижесінде, Раптордың ашытқы бактериясындағы KOG1-дің сүтқоректілердегі гомологі екендігі анықталды. mTOR, Раптор жəне кейіннен табылған mLST8 ақуыздары бір-бірімен байланысып mTORC1 комплексін түзеді [3]. AVO3тің сүтқоректілердегі гомологы Риктор, mLST8 жəне гель фильтрациялық хроматографиясы арқылы анықталған, AVO1-дің сүтқоректілердегі гомологы Sin1 өзара байланысып mTORC2 комплексін құрайды [12, 13]. mTOR-дың бұл екі мулти-компонентті субкомплекстері құрылымдық, функциялық жəне төменгі ағындық субстраттары жағынан бір-біріне ұқсамайды [14, 15]. Біз өз зерттеуімізде mTOR комплекстерінің көлемін гель фильтрациялық хроматографиясы арқылы тексердік. mTORC1 мен mTORC2-нің екеуі де молекулалық салмағы шамамен 670 кДа айналасында болатын бірдей фракциялардан анықталды. MDA-MB-435 жасушаларынан алынған толық жасуша лизатын сефакриль S-500 гель хроматографиясынан өткізгеннен кейін mTOR, Раптор, Риктор антиденелерін қолдана отырып иммуноблоттинг талдауы жасалды. mTOR mTORC1 мен mTORC2-ден үлкен комплексті қамтыған фракциядан табылды. Сефакриль S-500 гель хроматографиясынан алынған 9 фракцияның молекулалық салмағы салыстырмалы кіші (670 кДа айналасында) 5 фракциясынан Раптор жəне Риктор ақуызы бірдей анықталса, молекулалық салмағы шамамен 1 мДа айналасында болатын алқашқы 4 үлкен фракциялардан табылмады, бірақ көп мөлшердегі mTOR-ді қамтыған көлемі үлкен бөлшектері бар фракцияны бөліп алдық. Бұл нəтиже mTOR-ды Раптормен (mTORC1) жəне Риктормен (mTORC2) ко-элюция арқылы бөліп алғандағы нəтижемен сəйкес келеді., Демек mTOR протеинқиназасы Раптор мен Риктордан басқа ақуыздармен байланысып, жалпы комплекстік молекулалық салмағы mTORC1 мен mTORC2-ден үлкен алып комплекс түзеді. 1. Sarbassov, D.D., Ali, S.M., Sabatini, D,M. Growing roles for the mTOR pathway. Current Opinion in Cell Biology (2005); 17: 596-603. 2. Yang, Q., Guan, K.L. Expanding mTOR signaling. Cell Res.(2007); 17: 666-681. 3. Kim, D.H., Sarbassov, D.D., Ali, S.M., et al. mTOR interacts with raptor to form a nutrient-sensitive complex that signals to the cell growth machinery. Cell (2002); 110:163-175. 4. Sarbassov, D.D., Ali, S.M., et al. Rictor, a novel binding partner of mTOR, defines a rapamycin-insensitive and raptorindependent pathway that regulates the cytoskeleton. Current Biology (2004); 14: 1296-1302. 5. Guertin, D.A., and Sabatini, D.M. Defining the role of mTOR in cancer. Cancer Cell (2007); 12: 9-22. 6. Guertin, D.A., Stevens, D.M., Thoreen, C.C., et al. Ablation in mice of the mTORC components raptor, rictor, or mLST8 reveals that mTORC2 is required for signaling to Akt-FOXO and PKC-alpha, but not S6K1. Dev Cell (2006); 11: 859-871. 7. Kim, D.H., Sarbassov, D.D., Ali, S.M., et al. GbL: a positive regulator of the rapamycin-sensitive pathway required for the nutrient-sensitive interaction between mTOR and raptor. Molecular Cell (2003); 11: 895-904. 8. Sarbassov, D.D., Ali, S,M, et al. Prolonged Rapamycin Treatment Inhibits mTORC2 Assembly and Akt/PKB. Molecular Cell (2006); 22: 159-168. 210 9. Jacinto, E., Loewith, R., et al. Mammalian TOR complex 2 controls the actin cytoskeleton and is rapamycin insensitive. Nat. Cell Biol. (2004); 6: 1122-1128. 10. Булгакова, О.В., Берсимбаев, Р.И., Сарбасов, Д.С. Регуляция mTOR сигнального пути. Материалы 15 международного курса Александра Холлендера: Взаимодействие генома и окружающей среды, генетическая токсикология (2009); C. 69-70. 11. Loewith, R., Jacinto, E., Hall, M.N. et al. Two TOR complexes, only one of which is rapamycin sensitive, have distinct roles in cell growth control. Mol. Cel (2002); 10: 457-468. 12. Yang Q., Inoki K., Ikenoue, T., Guan, K.L. Identification of Sin1 as an essential TORC2 component required for complex formation and kinase activity. Genes Dev (2006); 20: 2820-2832. 13. Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D.M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol (2011); 12: 21-35; 14. Берсимбай Р.И., Булгакова О.В., Омаров Р.Т., Сарбасов Д. Роль mTOR сигнальной системы в регуляции клеточных функтций. Доклады НАН РК (2010); 5, c. 82-90. 15. Bulgakova O.V., Shaikenov T., Bersimbay R.I., Sarbassov D.D. Purification of the mTOR complexes by affinity chromathography. Reports of the international conference: III Humboldt-Kolleg, Astana, Kazakhstan (2010); 45-46. *** mTOR is one of the central regulator of the cell. Targeting the mTOR pathway can impact physiological process including cell growth, proliferation and metabolism. mTOR is a unique target in cancer that may provide therapeutic benefit to patients with disease refractory to currently approved therapies. Therapeutic strategies combining mTOR inhibitors with other targeted therapies or cytotoxic agents may provide enhanced anticancer activity. However, a lot of efforts to study the mTORC1 and mTORC2 complexes and their functions have been done, but many questions about upstream signals and downstream effectors of mTORC2 and the possibility of mTOR to make other complex are still remains to be elucidated. In our study we found a new complex of mTOR by the corresponding to a bigger size than known two complexes by gel filtration chromatography. *** mTOR является одним из центральных регуляторов клетки. Ориентация mTOR пути может повлиять на физиологический процесс, в том числе рост клеток, распространение и обмен веществ. mTOR является уникальной мишенью в исследовании и лечении рака, который может обеспечить терапевтический эффект у пациентов с болезнью не восприимчивой к другим препаратам. Терапевтические стратегии, объединяющие mTOR ингибиторы с другой целевой терапией или цитостатическими агентами, могут обеспечить повышенную противоопухолевую активность. Тем не менее много усилий в деле изучения mTORC1 mTORC2 комплексов и их функции были выполнены, но многие вопросы о сигналах mTORC2 идущих вверх по течению и об эффекторах mTORC2 идущих вниз по течению и возможность mTOR создавать другие комплексы по-прежнему остается открытым. В нашем исследовании мы обнаружили с помощью гель-фильтрации новый комплекс mTOR, который представляет собой комплекс большего размера, чем известные два других комплексав. Н.Б. Қосманбетова, М.Н. Донбаева, А.С. Баубекова, А.А. Мелдебекова, Г.С. Конуспаева LACTOCOCCUS ACIDOPHILUS ЖƏНЕ LACTOCOCCUS PLANTARUM СҮТҚЫШҚЫЛДЫ БАКТЕРИЯЛАРЫМЕН ҰЙЫТЫЛҒАН ТҮЙЕ СҮТІНІҢ ФИЗИКА-ХИМИЯЛЫҚ ҚАСИЕТТЕРІНІҢ ӨЗГЕРУІ (Əл-Фараби атындағы ҚазҰУ, Алматы қаласы) Зерттеу барысында түйе сүтінен алынған сүтқышқылды өнімде С витаминінің мөлшерінің жоғары болуы ашу процесі нəтижесінде сүтқышқылды бактериялардың аскорбин қышқылын синтездей алуымен байланысты болатындығы анықталды. Халықтың тамақтану құрылымының өзгеруін ескере отырып, белоктық құнды өнімдерді алу мəселесі алдыға қойылып отыр. Соның ішінде сүт өнімдері ерекше орын алады. Сүтті арнаулы сүтқышқылды бактериялармен жəне ашытқылармен ұюту арқылы алынатын өнімде оның пайдалы қасиеттерін жоғарылататын белсенді заттар түзіледі. Ашыған сүтқышқылды өнімдердің төмен молекулалық заттары жылдам, əрі жақсы сіңіріліп қана қоймай, басқа тағамдардың қорытылуын жақсартады. Сүтқышқылды өнімдерде сүттің көптеген пайдалы заттары қорытуға ыңғайлы күйде болады: сүт микрофлорасының протеолитикалық ферменттері белоктарды ыдыратып, нəтижесінде олардың құндылығы мен қорытылу жылдамдығын жоғарлатады. Көп жылдық зерттеулердің нəтижесінде сүтқышқылды бактериялардың антагонистік қасиеті бар екені жəне шіру микрофлорасын тежей алатындығы анықталды [1,2]. Сонымен қатар сүтқышқылды өнімдердің химиялық, физикалық, органолептикалық сипаттамаларының өзгеруінде микроорганизмдердің негізінде жасалынған ұйытқылардың жəне олардың биохимиялық активтілігінің маңызы зор. Нəтижесінде микрофлораны таңдау арқылы сүтқышқылды өнімдердің пайдалы қасиеттерін арттыра отырып əртүрлі мақсатта қолданылатын сүтқышқылды өнімдерін алуға болады: диетикалық, функционалдық, пробиотикалық жəне т.б. 211 Біздің зерттеу жұмысымыздың мақсаты – түйе сүтін монодақылды ұйытқылармен ашыту процесі барысында ашытылған түйе сүтінің физико-химиялық қасиеттерін ашудың 6 күн аралығында анықтау. Зерттеу əдістері мен материалдар Зерттеу материалы ретінде Алматы облысы, Іле ауданы, Ақши ауылында орналасқан «ДəулетБекет» ЖШС-нен алнған түйе сүтінің үлгілері жəне ұйытқы ретінде зертханалық жағдайда шұбаттан бөлініп алынған сүтқышқылды бактериялардың ішінен ұйынды түзу қабілеті бойынша жоғары болған келесі дақылдар таңдап алынды: Lactococcus acidophilus жəне Lactococcus plantarum. Зерттеу барысында пастеризацияланбаған бастапқы түйе сүтінің көлеміне қатысты 2% ұйытқы қосылды. Түйе сүтін ашыту процесі 37°С-та термостатта жүргізілді. Алынған дақылдардың əсерін анықтау үшін физико-химиялық көрсеткіштерді анализдеу 2, 4, 6 күндерде жүргізілді. Бақылау үлгісі ретінде сүтқышқылды бактериялар қосылмаған түйе сүті болды. Бастапқы сүт, бақылау жəне ашытылған түйе сүті үлгілерінің физико-химиялық сипаттамалары анықталды: белок мөлшері, құрғақ заттың массалық үлесі, С витаминінің мөлшері, титрленетін қышқылдық, ацетоин-диацетил жəне диацетилдің түзілуі. Бастапқы сүттің сапасы «Лактан 1-4» сүт анализаторымен [3], құрғақ заттың массалық үлесін инертті толықтырғыш ретінде дəкені қолдану арқылы құрғақ заттың массалық үлесін анықтау əдісімен [4], белок концентрациясы Лоури əдісімен [5], С витамині оксидоредуктазалық əдіспен [6], титрленетін қышқылдық Тернер əдісімен [7], диацетил-ацетоин жəне диацетил сапалық реакциямен анықталды [8]. Нəтижелер мен талқылау Lactococcus acidophilus жəне Lactococcus plantarum дақылдарымен ашытылған түйе сүтінің құрғақ затының массалық үлесі, белок концентрациясы, ацетоин-диацетил, диацетилдың болу параметрлерінің сипаттамалары берілген (кесте 1). Кесте 1 - Lactococcus acidophilus жəне Lactococcus plantarum дақылдарымен ұйытылған сүтқышқылды өнімнің физико-химиялық көрсеткіштері Бақылау үлгісі № Көрсеткі Бастап Lactococcus Lactococcus штер қы acidophilus plantarum түйе 2 4 6 2 4 6 2 4 6 сүті күн күн күн күн күн күн Күн Күн күн 9,20± 9,63± 10,4± 8,71 9,06 9,81± 8,37 9,01 10,1 9,30 1 Құрғақ 0,42 0,89 0,46 ± ± 0,15 ± ± 5± ± заттың 0,18 0,21 0,16 0,82 0,02 0,19 массалық үлесі,% 2 Белок 93,0± 69,39± 66,07± 58,4 61,3 63,23± 59,4 52,8 63,7 57,5 концен1,52 29,8 2,15 9±2, 3±2, 2,24 3±2, 0± 0± 4± трациясы, 8 67 76 12,7 1,28 8,56 мг/л 3 Ацетоин+ + + + + + + + + диацетил 4 Диацетил Бастапқы жəне бақылау үлгілерінде құрғақ заттың массалық үлесі 2, 4, 6 күндердің барлығында дерлік дақыл қосылған сүтпен салыстырғанда жоғары болды, бірақ өзара бастапқы сүтте бақылауға қарағанда көбірек болып табылады. Ал Lactococcus acidophilus жəне Lactococcus plantarum дақылдарымен ашытылған сүттің құрғақ массасы 2-ші жəне 6-шы күнмен салыстырғанда 4-ші күнде жоғары көрсеткішті көрсетті. Алынған сүтқышқылды өнімдердің құрғақ затының жоғары көрсеткіші Lactococcus plantarum сүтқышқылды бактериясымен ашытылған сүтте анықталынды (10,15%) (кесте 1). Бұл түйе сүтінің жəне одан дайындалған сүтқышқылды өнімдердің жоғары майлылыққа ие екендігімен түсіндіріледі. Түйе сүтінің белок концентрациясы ашу процесінің күндеріне байланысты едəуір өзгеріске ұшыраған. Белок концентрациясының азаюы тек зерттелген дақылдар қосылған сүт үлгілерінде ғана емес, сонымен қатар дақыл қосылмаған бақылау үлгісінде сүттің спонтанды микрофлорасының əсерінен азайғанын көруге болады. Бақылау үлгісінде белок концентрациясының біртіндеп азайғаны байқалады, ал 6-шы күнде оның мөлшері бастапқы сүтпен салыстырғанда 11% құрады (93,0; 69,4; 66,1; 58,5 мг/л сəйкесінше). Сүтқышқылды бактериялар қосылған үлгілерде бастапқы 2 күнде белок концентрациясының азайғаны байқалған, яғни бұл сүтқышқылды бактериялар түзген сүт қышқылы əсерінен сүт белоктарының қышқыл коагуляциялануға ұшырауымен түсіндіріледі. 4-ші күнге қарай белок 212 концентрациясының жоғарылағаны байқалады (Lactococcus acidophilus үшін 93,0; 61,3; 63,2; 59,4; Lactococcus plantarum үшін 93,0; 52,8; 63,7; 57,5). Белоктардың денатурациялануынан кейін молекула аралық байланыстардың əсерінен белок түйіршіктері агрегирленеді, нəтижесінде көлемі ірілененіп коагуляцияланады. Дегенмен, ұйындының консистенциясы жұмсақ жəне гомогенді болып шықты. 6шы күнге қарай белок концентрациясы азайып, аз мөлшерде сарысу бөлінді жəне ұйындының жұмсарғаны байқалды. Белок мөлшерінің бастапқы шикізатпен салыстырғанда өзгеруі əртүрлі факторларға байланысты болады, атап өтсек сүтқышқылды бактериялардың протеолитикалық белсенділігі, белок құрамындағы казеиннің коагуляциялануы, т.б. Протеолиз процесі кезінде сүтте бастапқыда пептидтердің жəне аминқышқылдардың (аспарагин қышқылы, глицин, серин, глутамин қышқылы, треонин, тирозин, валин, фенилаланин, изолейцин) жинақталуы байқалады. Сүттегі белоктардың гидролизі сүтқышқылды бактериялардың клетка ішіндегі жəне клетка сыртындағы протеазалардың көмегімен жүзеге асып, сүтқышқылды бактериялардың протеолитикалық белсенділігі жоғары болады [3]. Белоктың құрамындағы казеин қышқылдың, тұздың жəне ферменттердің əсерінен коагуляцияланып, тұнбаға түседі. Казеиннің коагуляциялануы сүтқышқылды ашу кезінде түзілген сүт қышқылының əсерінен сүттің ұюына негізделеді [4,5]. Төрт көміртегі атомынан құралған диацетил мен ацетоин əртүрлі микроорганизмдердің метаболизмінің өнімдері болып табылады. Зерттеу жұмысының барысында таңдап алынған Lactococcus acidophilus жəне Lactococcus plantarum сүтқышқылды бактериялары өнімде ацетоин мен диацетил ароматтық заттарын түзе алатындығы анықталды. Ал осы сүт қышқылды бактериялардың диацетилдің өзін түзе алу қабілеті байқалмады (кесте 1). Ацетоин мен диацетил ароматтық заттары сүтқышқылды өнімге белгілі бір ароматты дəм, иіс беруге септігін тигізеді. Ал титрленетін қышқылдық пен С витаминінің мөлшерінің салыстырмалы түрдегі көрсеткішін диаграмма арқылы көруге болады (сурет 1-2). 1 суретте берілгендей 2 күні қышқылдың белсенді түзілуі байқалды, бұл белок концентрациясының төмендеу уақытымен тура келеді, нəтижесінде сүт белоктарының қышқыл коагуляциялануына əкелді. Ашу процесінің ұзақтығы көбейген сайын титрленетін қышқылдықтың мəні көбейе түсті. Ашудың 2-ші күнінде-ақ титрленетін қышқылдықтың мəні 250°Т- ге дейін жоғарылағаны көрінді. 4-ші күні титрленетін қышқылдық əлдеқайда жоғарылады жəне бақылау үлгісі мен Lactococcus plantarum-мен ашытылған сүттің титрленетін қышқылдықтары бірдей (359,3; 346 сəйкесінше), ал осылармен Lactococcus acidophilus-пен ашытылған сүтті салыстырғанда жоғары болып шықты (366; 355,6; 379,6 сəйкесінше). 60 350 50 С витамині, мг/л Титрленетін қышқылдық, °Т 400 300 250 200 150 100 40 30 20 10 50 0 0 2 күн 2 күн Бастапқы түйе сүті 4 күн Бақылау Lac.acidophilus 4 күн 6 күн 6 күн Бастапқы түйе сүті Lac.plantarum Сурет 1 – Ашудың 2, 4, 6 күндеріндегі түйе сүтінің титрленетін қышқылдығы Бақылау Lac.acidophilus Lac.plantarum \Cурет 2 – Ашудың 2,4,6 күндеріндегі түйе сүтінің С витамині мөлшері 2-суретте көрсетілгендей, 4-ші күні С витаминінің мөлшері жоғарылаған, бұл микроорганизмдер тіршілігі барысында, сонымен қатар кейін келе өздерімен пайдаланылатын С витаминін түзуге қабілетті екенін көрсетеді. Осылайша 6-шы күннен С витаминінің мөлшері азая түседі (бақылау үшін 39,1; Lactococcus acidophilus жəне Lactococcus plantarum үшін 43,4). Нармұратова М.Х. жəне басқалардың түйе сүтінің С витаминін зерттеу барысында оның мөлшері 245 мг/л-ден 181 мг/л-ге дейін ауытқыған. Ал көктем мезгілінде оның мөлшері 65 мг/л-ге дейін төмендеген. Ал шұбаттағы аскорбин қышқылының максималді мөлшері жаз мезгіліндегі үлгілерде көрінген: 261 мг/л, төмен мөлшері көктем мезгіліндегі үлгілерді байқалған: 68 мг/л. Яғни көктем мезгілінде түйе сүтінде С витаминінің мөлшерінің бірден төмендеп кетуі көктемгі авитаминозбен 213 байланысты, бұл уақытта түйелердің жайылымдық жерлері, азықтары аз мөлшерде болады. Алайда жаз мезгілінде жайылымдық жерлердің қайта жаңаруына жəне жем-шөптің мол болуына байланысты С витаминінің мөлшері максималді мəнге жетеді: 245 мг/л. Шұбаттың құрамындағы аскорбин қышқылының концентрациясы оның бастапқы түйе сүтіндегі мөлшеріне байланысты болады [6]. Сонымен жоғарыда келтірілген нəтижелермен салыстырар болсақ, зерттеуге алынған түйе сүтінде С витаминінің мөлшерінің төмендеп кетуі (39,1 мг/л) көктем мезгілімен, түйе малын күтіпбағылуымен, жасымен, азықтандыруымен байланыстыруға болады, яғни бұл көрсеткіш түйе сүтінің сапасының нашар екендігін көрсетпейді. Көктем мезгілінде азыққа мол жайылым жерлердің жəне сапалы, құнарлы жем-шөптің қоры басқа жыл мезгілдерімен салыстырғанда аз болады. Зерттеу барысында түйе сүтінен алынған сүтқышқылды өнімде С витаминінің мөлшерінің жоғары болуы ашу процесі нəтижесінде сүтқышқылды бактериялардың аскорбин қышқылын синтездей алуымен байланысты болатындығы анықталды. Зерттелген сүтқышқылды бактериялардың əрқайсысы сүттің физико-химиялық қасиеттеріне өзінше əсер етеді. Екі дақылдың да қышқыл, С витаминін түзу қабілеттеріне жəне протеолитикалық белсенділікке ие. Сонымен қатар сүтке аромат беретін диацетил-ацетоин заттарын түзеді.Бұл көрсеткіштерді талдай отырып, Lactococcus acidophilus жəне Lactococcus plantarum сүтқышқылды бактерияларын бір-бірінің қасиеттерін толықтыру үшін алдағы уақытты консорциум құру мақсатында қолданып, диеталық, профилактикалық, антибактериалдық, жалпы емдік қасиеті бар сүтқышқылды өнімдерді алуға болады. 1. Шарманов Т.Ш., Жангабылов А.К. Лечебные свойства кумыса и шубата. Алма-Ата:Гылым, 1991. - 176 с., с илл. 2. Рақымбай Р., Жолымбетова С. Биологические ценности верблюжьего и кобыльего молока: Физико-химические свойства и основные пищевые вещества // Валеология. Физвоспитание. Спорт. – 2002. - №11. – С. 26-31. 3. Лактан 1-4 ТУ 4215-002-01173145-97 құрылғысының паспорты. Ресей. 4. ГОСТ Р 51831-99. Продукты молочные. Йогурты. Общие технические условия. – М.: Госстандарт России, 1999. – 355 с. 5. Рогожин В.В., Рогожина Т.В. Практикум по биохимии молока и молочных продуктов. – Спб.: ГИОРД, 2008. – 224 с. 6. Инихов Г.С., Брио Н.П. Методы анализа молока и молочных продуктов. - М.: Пищевая промышленность, 1971. 423 с. 7. Охрименко О.В., Горбатова К.К., Охрименко А.В. Лабораторный практикум по химии и физике молока. – Спб.: ГИОРД, 2005. – 256 с. 8. Шидловская В.П. Органолептические свойства молока и молочных продуктов. Справочник. – М.: Колос, 2000. – 280 с. 9. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. - М.: Наука, 1975. - 384 с. 10. Богданов Е.А., Богданова Г.И. Производство цельномолочных продуктов. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Легкая и пищевая пром-сть,1982. – 200 с. 11. Степанова Л.И. Справочник технолога молочного производства. Технология и рецептура. В трех томах. Т.1. Цельномолочные продукты. – Спб: ГИОРД, 1999. – 384 с. 12. Нармуратова М.Х., Конуспаева Г.С., Мелдебекова А.А., Райымбек Г., Нармуратова Г.Х. Антибактериальные свойства верблюжьего молока (C.bactrianus, C. dromedarius, гибриды) и шубата // Биологические науки Казахстана. – 2010. №2. – С. 52-68. *** Changes in physical and chemical properties of camel milk fermented by monoculture Lactococcus acidophilus, Lactococcus plantarum strains were istudied. It was shown dynamics of milk parameters such as content of vitamin C, protein concentration, acidity during the fermentation for 6 days. *** В работе были исследованы изменения физико-химических свойств верблюжьего молока, сквашенного монокультурными штаммами Lactococcus acidophilus, Lactococcus plantarum. Показана динамика в процессе ферментации в течение 6-ти суток таких показателей молока, как содержание витамина С, концентрация белка, кислотность. Т.Б. Мусалдинов ВЛИЯНИЕ БИОПРЕПАРАТА «АЛЬГИН» НА ПОСЕВНЫЕ КАЧЕСТВА СЕМЯН И ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ К КОРНЕВОЙ ГНИЛИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (Институт микробиологии и вирусологии КН МОН РК, е-mail: tbmusaldinov@mail.ru) В настоящей работе экспериментально путем установлено, что предпосевная обработка семян сахарной свеклы боистимулятором Альгин повышает энергию прорастания и всхожесть семян. Индуцирует устойчивость корнеплодов сахарной свеклы к поражению некрозным и фузариозным заболеваниям, а также повышает полевую всхожесть семян на 3 дня раньше производственных посевов. В настоящее время против болезней сельскохозяйственных растений ведется поиск экологически чистых биологически активных веществ нового поколения. Применение регуляторов роста растений природного происхождения в агрофитоценозах призвано стимулировать энергию 214 прорастания, ускорение появления всходов растении и повышение устойчивости к болезням. Использование их приобретает особую важность в специфических климатических условиях Казахстана, характеризующихся почвами с невысокой биологической активностью, резкими температурными колебаниями. По данным многих авторов, природные и синтетические органические соединения в малых дозах активно влияют на обмен веществ в растениях, что приводит к видимым изменениям в их росте и развитии [1]. Среди микроорганизмов повышенный интерес представляют микроводоросли, которые широко распространены в природе и отличаются разнообразием форм. В них найден широкий спектр фитогормонов (индольной природы, ауксины, цитокинины и др.), способных оказывать регулирующее влияние на многие процессы роста, развития и корнеобразования растений. Они повышают резистентность и устойчивость растений к различным стрессовым факторам [2, 3, 4]. Целью наших исследований явилось, изучить влияние боистимулятора Альгина полученного с применением методов нанотехнологии из cуcпензионной культуры Сhlorella vulgaris sp4. на посевные качества семян сахарной свеклы сорта «Ялтушковский односемянный 30» и повышение их устойчивости к корневой гнили. Опыты по установлению эффективности действия биостимулятора «Альгина» проводились в лабораторных условиях в лаборатории физиологии и биохимии растении Института биологии и биотехнологии растении КН МОН РК. Полевые опыты по предпосевной обработке семян сахарной свеклы были проведены в производственных условиях на естественном инфекционном фоне серозема обыкновенного согласно методическим указаниям, на опытных полях Джамбульского областного филиала КазНИИЗР, с.Бесагаш, Джамбульского района. Варианты опыта и экспериментальные данные лабораторных и полевых исследовании приведены в таблицах 1 и 2. Из приведенных данных таблицы 1 видно, что предпосевная обработка семян сахарной свеклы биостимулятором Альгин не оказывает на них токсического влияния, а наоборот оказывает ростостимулирующее действие. Так в опытном варианте, где семена были обработаны боистимулятором Альгин, отмечено повышения энергии прорастания на 98%, тогда как в других вариантах опыта соответственно составило в контроле-1 - 65%, в контроле-2 - 75% , в варианте с янтарной кислотой - 93%. Лабораторная всхожесть семян на 7-е сутки в опыте составил- 100% , тогда как в контроле 1 - 70%, в контроле 2 - 85%, в варианте с янтарной кислотой - 97%. Таблица1 - Эффективность действия биостимулятора «Альгина» на посевные качества семян сахарной свеклы «Ялтушковский односемянный 30». Энергия Всхожесть Вариант опыта Количество прорастания семян на 7-е семян, шт. семян на 3-е сутки, % сутки, % 1. Контроль - сухие семена, без обработки. 100 65 70 2. Контроль - семена, замоченные 100 75 85 в дистиллированной воде. 3. Замочка семян в микроэлементах 100 90 95 (B, Zn, Mn, Cu) с концентрацией 0,03% 4. Замочка семян в янтарной кислоте 100 93 97 с концентрацией 0,05% (эталон). 5. Семена обработанные боистимулятором Альгин с 100 98 100 концентрацией 0,0000001%. Оценка эффективности предпосевной обработки семян сахарной свеклы боистимулятором Альгин в полевых условиях показало, что данный прием индуцирует устойчивость корнеплодов сахарной свеклы к поражению некрозным и фузариозным заболеваниям (Таблица.2). Так, лучшим вариантом оказался вариант с обработкой семян в биостимулятором Альгин, где распространенность фузариозных болезни составила 5,6% тогда как в двух контрольных вариантах соответственно - 56% и 61%. Интенсивность развития болезни в опыте составила - 3% против двух контрольных вариантов соответственно - 19% и 33%. Установлено, что предпосевная обработка семян биостимулятором Альгин увеличивает полевую всхожесть семян и способствует появлению всходов на 3 дня раньше обычных посевов,. 215 Таблица 2 - Эффективность обработки семян сахарной свеклы против болезней боистимулятором Альгин (полевой опыт, 2011г) Харктеристика болезни Варианты опыта Контроль 1 Контроль 2 Семена, замоченные сухие семена без биостимулятором семена замоченные в обработки. Альгин 0.0000001% дистилированной воде. некроз фузариоз некроз фузариоз некроз фузариоз Распространненость, % 56,98 76,7 61,03 57,5 43,3 5,56 Интенсивность 19,83 5,36 32,97 5,0 16,11 3,61 развития, % Таким образом, результаты исследований показали, что предпосевная обработка семян сахарной свеклы боистимулятором Альгин оказывает положительное влияние на их посевные качества семян. Отмечено повышение энергии прорастания в опыте на 98%, тогда как в контроле-1 - 65%, в контроле-2 - 75%, в варианте с янтарной кислотой - 93%. Лабораторная всхожесть семян на 7-е сутки в опыте составила - 100% , тогда как в контроле 1 - 70%, в контроле 2 - 85%, в варианте с янтарной кислотой - 97%. Данный прием индуцирует устойчивость корнеплодов сахарной свеклы к поражению некрозным и фузариозным заболеваниям. Так, в опытном варианте распространенность фузариозных болезни составила 5,6% относительно двух контрольных вариантов соответственно 56% и 61%. Интенсивность развития болезни в опыте составила-3% против двух контрольных вариантов соответственно 19% и 33%.%. Было установлено, что предпосевная обработка биостимулятором Альгин, увеличивает полевую всхожесть семян, а также способствует появлению всходов на 3 дня раньше обычных посевов. 1.Гамбург К. З., Дулаева О.Н., Муромцев Р.С. Регуляторы роста растений. - Колос. М, 1979. - С.90-104. 2.Кадырова Г.Х. Продуцирование ауксина цианобактериями //Узбекский биологический журнал. - 2004.-№4. - С.9-13 3.Музафаров А. М., Таубаев Т. Т. Культивирование и применение микроводорослей. - Ташкент, 1984. -130 с. 4.Таутс М. И., Семененко В. Е. Выделение и идентификация физиологически активных веществ индольной природы во внеклеточных метаболитах хлореллы //Доклады Академии наук СССР, 1971. - Том 198, № 4. - С. 970-973. УДК 633.2:581.1.035 С.К. Мухамбетжанов1, А.Е. Ережепов2, Б.Р. Кударов2, Д.А. Ережепов2 ВЫРАЩИВАНИЕ КОРМОВОГО ЗЛАКА BRACHIARIA SPP. В УСЛОВИЯХ IN VITRO (1 - Институт биологии и биотехнологии растений, 2 Казахский Национальный университет им. альФараби) Интродукция и введение в культуру новых, более урожайных форм и видов кормовых растений в настоящее время является весьма актуальной проблемой. Особенно это важно для Казахстана, где промышленное животноводство является одним из ведущих секторов экономики где, наряду с решением других задач, ведутся интенсивные поиски новых кормовых культур, отличающихся высокой урожайностью и высоким содержанием углеводов в корме. В этом отношении интерес представляют тропические злаки, обладающие рядом хозяйственно-ценных признаков: высокой урожайностью, отзывчивостью на удобрение и орошение, многоукосностью, многолетним циклом вегетации, засухо- и жароустойчивостью, устойчивостью к выпасу. Интродукция и введение в культуру новых, более урожайных форм и видов кормовых растений в настоящее время является весьма актуальной проблемой. Особенно это важно для Казахстана, где промышленное животноводство является одним из ведущих секторов экономики где, наряду с решением других задач, ведутся интенсивные поиски новых кормовых культур, отличающихся высокой урожайностью и высоким содержанием углеводов в корме. В этом отношении интерес представляют тропические злаки, обладающие рядом хозяйственно-ценных признаков: высокой урожайностью, отзывчивостью на удобрение и орошение, многоукосностью, многолетним циклом вегетации, засухо- и жароустойчивостью, устойчивостью к выпасу. Опыт многих стран (Аргентина, США, Япония), имеющих области сходные с нашими по природно-климатическим условиям показал, что одним из путей создания прочной кормовой базы является организация высокопродуктивных сеяных пастбищ, для чего необходимо проведение 216 интродукции и внедрение в производство наиболее урожайных тропических кормовых культур природной или искусственной селекции. Представители рода ветвянка (Brachiaria) широко распространенные в странах Африки, Южной Америки, Юго-восточной Азии, Индии и Пакистана кормовые злаки. Известно, что конечная продуктивность растений во многом зависит от хода протекающих в онтогенезе процессов в репродуктивной сфере, в частности, в женской генеративной системе где протекают основные эмбриологические процессы приводящие к формированию семян обеспечивающих генерацию последующих поколений. В пределах рода Brachiaria встречаются виды с амфимиктичным, апомиктичным и смешанным типом репродукции [1]. Хорошей модельной системой для исследования процессов роста и развития женского гаметофита, является культура изолированных завязей, которая позволяет в контролируемых условиях, варьируя отдельными параметрами, изменять направление процессов морфогенеза. Целью предпринятого исследования было выявление факторов влияющих на рост и развитие неоплодотворенных завязей Brachiaria в асептических условиях. Материалы и методы Материалом для исследований служили две апомиктичные тетраплоидные (2n=4x=36) линии B.decumbens Stapf (BRA 001058), B.brizantha A.Rich (Stapf) (BRA 000591) и две амфимиктичные диплоидные (2т=2х=18) линии B.ruziziensis German & Evrard (BRA 002747), B.brizantha (BRA 000281) [2, 3] из коллекции Национального центра исследований генетических ресурсов и биотехнологии (CENARGEN) Бразилии. В качестве эксплантов использовали неоплодотворенные завязи содержащие женские гаметофиты на разных стадиях развития выделенных из растений, находившихся на разных этапах онтогенеза по методике предложенной Araujo и др. [4]. В качестве основных, для культивирования завязей использовали питательные среды Мурасиге-Скуга (МС) и N6. На их фоне изучали действие различных фитогормонов ауксиновой (ИУК, НУК, 2,4-Д, МСРА, 2,4,5-Т) и цитокининовой (кинетин, зеатин, БАП) природы на образование каллусной ткани и регенерацию растений. Для индукции каллусогенеза использовали среды МС и N6 с добавлением в них 25-40 г/л сахарозы и различных комбинаций и концентраций ростовых регуляторов: 1 мг/л ИУК; 0,2-2,5 мг/л НУК; 0,5-5,0 мг/л 2,4-Д; 0,2-1,5 мг/л МСРА; 2,5 мг/л 2,4,5-Т и 0,1 мг/л кинетина. Культуральные сосуды с завязями помещали в термостат и инкубировали при температуре 22 оС в темноте, до образования первичного каллуса. Полученную каллусную ткань для индукции побегообразования переносили на среду содержащую соли макро- и микроэлементов по прописи МС, витамины по прописи Гамборга-Эвелега (В5), 0,1 мг/л НУК и 1-5 мг/л кинетина, зеатина и БАП. Для роста побегов и индукции у них ризогенеза, их пассировали на безгормональную среду с Ѕ макро- и микросолей по МС и комбинированную среду содержащую Ѕ макросолей по МС, микросоли по Хеллеру, витамины по Морелю. В обоих случаях, культивирование проводили при температуре 25 оС в условиях освещенности с 16 часовым фотопериодом. Полученные in vitro растения с хорошо развитыми корнями, извлекали из культуральных сосудов и переносили на почвенный субстрат. Результаты и их обсуждение Известно, что способность к индукции морфогенетических процессов в культуре неоплодотворенных завязей во многом определяется генотипом исходного материала. При этом было обнаружено, что растения с апомиктичным способом размножения более отзывчивы к росту и развитию in vitro по сравнению с видами размножающимися половым способом [5]. В наших исследованиях среди испытанных 4-х генотипов наибольшей способностью к индукции каллусогенеза и регенерации растений обладали завязи апомиктичной линии B.decumbens (BRA 001058). На средах (МС) и N6 частота индукции первичного каллуса была приблизительно одинаковой. Однако на среде МС в основном формировался неморфогенный каллус, тогда как на среде N6 индуцировалась морфогенная каллусная ткань. Оптимальной для индукции каллусогенеза явилась среда N6 содержащая 1,5 мг/л МСРА. Полученные первичные каллусы переносили на среду для стимулирования образования побегов. Внесение в среду 0,1 мг/л НУК, 2 мг/л кинетина и 5 мг/л БАП было наиболее эффективным для индукции геммогенеза. 217 Полученные побеги переносили на среды для регенерации растений. Из двух тестированных сред, наиболее оптимальной для этой цели, явилась среда с комбинированным составом. Регенеранты, с хорошо развитыми корнями, извлекали из пробирок и переносили в контейнеры с почвенной смесью, для адаптации к условиям закрытого грунта. Прошедшие первичную акклиматизацию растения пересаживали в почву и доращивали в полевых условиях до стадии созревания. Проведенный флоу-цитометрический анализ выявил, что из 11 растений регенерантов полученных из линии B.decumbens (BRA 001058) шесть были тетраплоидными, два – диплоидными и одно – октоплоидным. Таким образом, результаты проведенных исследований выявили зависимость регенерационных процессов в культуре неоплодотворенных завязей Brachiaria от генотипа исходных растений, минерального и гормонального состава питательной среды. 1. Miles J.W. Apomixis for cultivar development in tropical forage grasses // Crop Science, 2007. – Vol. 47. – P. 238-249. 2. Carneiro V.T., Dusi D.M., Oritz J.P. Apomixis: Occurrence, Applications and Improvements. In Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology. Vol.1. – Global Science Books, 2006. – P.564-571. 3. Dusi D.M., Alves E.R., Willemse M.T., Falcao R., Valle C.B., Carneiro V.T. Toward in vitro fertilization in Brachiaria spp. // Sexual Plant Reproduction. – 2010. – DOI 10.1007/s00497-010-0134-z (in print). 4. Araujo A.C., Mukhambetzhanov S.K., Pozzobon M.T., Carneiro V.T. Female gametophyte development in apomictic and sexual Brachiaria brizantha (Poaceae) // Revue de Cytologie et de Biologie Vegetales – Le Botaniste. – 2000. – Vol .23. – P. 13-28. 5. Alatorceva T.A., Tyrnov V.C. Comparative studying of the development of unpollinated ovaries of apo- and amphimictic lines of corn in vitro / Proc. Int. Symp. Apomixis in Plants: Problems and Outlooks. Saratov, 1994. – P.8-10. *** Introduction of and introduction to the culture of new, more productive forms and types of forage plants is now a very topical issue. This is especially important for Kazakhstan, where the livestock industry is one of the leading sectors of the economy where, in addition to other tasks carried out intensive searches for new fodder crops with a high yield and high in carbohydrates in the diet. In this regard, the interest is tropical grasses, have a number of agronomic traits: high productivity, responsiveness to fertilizer and irrigation, mnogoukosnostyu, long-term cycle of vegetation, drought-and heat-resistant, resistant to grazing. The aim of our study was to identify factors influencing the growth and development of unfertilized ovaries Brachiaria under aseptic conditions. The results of these studies have revealed the dependence of the regeneration processes in the culture of unfertilized ovaries of Brachiaria genotypes of the initial plant, mineral and hormonal composition of culture medium. *** Жемшөптік дақылдардың жаңа формалары мен түрлерін өсіру жəне интродукциялауды бүгінгі күннің аса өзекті мəселелерінің қатарына жатқызуға болады. Бұл Қазақстан үшін өте маңызды болып саналады, себебі республикада өнеркəсіптік мал шаруашылығы экономиканың жетекші секторларының бірі болып табылады, осы тұрғыда, басқа да міндеттерді шешумен қатар, жоғары өнімділігімен жəне құрамында көмірсуларының молдығымен ерекшеленетін мал азықтық дақылдардың жаңа түрлерін іздеу қарқынды деңгейде жүргізілуде. Бұл салада шаруашылық-бағалы белгілері бар тропикалық дəнді дақылдар қызығушылық тудырады: өнімділігі жоғары, тыңайтқыштар мен суғару жылдам əсер етеді, бірнеше рет орып алуға болады, вегетациялық циклі бірнеше жылға дейін созылады, құрғақшылық пен ыстыққа мал жайылуына төзімді. Ұрықтанбаған Brachiaria түйінінің асептикалық жағдайдағы өсуі мен дамуына əсер етуші факторларды табу зерттеу жұмыстарының мақсаты болып табылады. Зерттеулердің нəтижесінде ұрықтанбаған Brachiaria түйінінің регенерация процестері бастапқы өсімдіктің генотипіне, қоректік ортаның минералдық жəне гормоналдық құрамына байланысты болатындығы анықталды. А.А. Нуржанова, Ж.С. Жунусова, К. Кашкеев, М.Ш. Ермекова ФИТОРЕМЕДИАЦИОННЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ДИКОРАСТУЩИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ (РГП »Институт биологии и биотехнологии растений» КН МОН РК, Алматы, Казахстан) Представлены результаты оценки уровня загрязнения почвы вокруг недействующих хранилищ пестицидов, расположенных в Талгарском районе Алматинской области и способности толерантных видов растений к ремедиации загрязненных почв с целью улучшения среды обитания человека, животных и растений. Широкое применение пестицидов в сельскохозяйственной практике привело к тому, что все страны мира сталкиваются с проблемами отходов пестицидов. Согласно T. Bicki и A.Felsot [1] в США насчитывается 14 000 агрохимических предприятий по хранению, сбыту, смешиванию или применению пестицидов. Подобные предприятия имеются и во многих других странах. Состояние почвы, загрязненной пестицидами из-за разливов, неправильного хранения, ненадлежащего размещения смывов и контейнеров и накопления остатков, непригодных к применению химических 218 средств защиты растений становится актуальной проблемой не только в США [1], странах Европы, СНГ, но и в нашей Республике [2, 3]. В развитых странах эффективным способом ликвидации запасов непригодных пестицидов является их сжигание в специальных высоко-температурных печах [4]. Для развивающихся стран в связи с отсутствием специализирированной установки основной проблемой является ликвидация неиспользуемых и пришедших в негодность запасов пестицидов, а также рекультивация прилегающих участков [5]. По данным организации ООН по вопросам продовольствия и сельского хозяйства (FAO), в развивающихся странах в настоящее время накоплено около 100 000 тонн непригодных пестицидов, например, в Африке накоплено около 48 000 тонн запрещенных пестицидов и персистентных органических пестицидов [6]. В Казахстане в каждом районе имеется 5-20 старых хранилищ химических средств защиты растений несуществующего ныне объединения «Сельхозхимия». С развалом сельскохозяйственной инфраструктуры очень многие хранилища химических средств защиты растений, как и хранящиеся в них остатки препаратов, перешли в частное владение, либо оказались бесхозными. Как правило, остатки пестицидов на этих участках находятся в значительно более высоких концентрациях по сравнению с теми концентрациями (остатками), которые образуются в результате их регламентированного применения в сельском хозяйстве. При этом одним из основных объектов загрязнения является почва. В результате загрязнения снижается качество почв и ценность сельскохозяйственных угодий. Одним из наиболее серьезных аспектов этой проблемы является то, что поступившие в почву пестициды и продукты их трансформации поглощаются растениями и накапливаются в них в концентрациях, опасных для здоровья человека и животных. В связи с этим, для минимизации экологического риска на загрязненных территориях необходимо разработать технологии восстановления загрязненных почв. В настоящее время в индустриально развитых странах активно развиваются экономичные и мягкие технологии ремедиации почв, загрязненных ксенобиотиками, в основе которых лежит способность специально подобранных видов высших растений и ассоциированной с ними микробиоты поглощать и аккумулировать в своей биомассе загрязнители в количествах, значительно превышающих их содержание в среде произрастания. Впоследствии загрязненная фитомасса удаляется и утилизируется [7-9]. С экономической точки зрения фиторемедиция имеет преимущества перед «химическими» и «механическими» методами ремедиации почв, так как ее внедрение не предполагает крупных капиталовложений, и эксплуатационные расходы на реализацию данной технологии невелики. В данной статье представлены результаты выявления перспективных для использования в фиторемедиационных технологиях растений в условиях поликомпонентного загрязнения темно каштановой почвы пестицидами и удобрениями разного класса. В качестве индикатора загрязнителя использовали хлорорганические пестициды (метаболиты 2,4 ДДД, 4,4 ДДД, 4,4 ДДТ, 4,4 ДДЭ и изомеры -ГХЦГ, -ГХЦГ и -ГХЦГ), которые нами были выявлены в почве вокруг территорий бывших хранилищ пестицидов. Хотя эти пестициды представляют собой только часть устаревших пестицидов, они важны из-за их статуса, так как они отнесены согласно Стокгольмской конвенции к стойким органическим загрязнителям и представляют собой серьезную проблему для экологии и для здоровья человека. Для решения поставленной цели выполнены следующие задачи: – изучить уровень загрязнения почв вокруг недействующих хранилищ пестицидов; – выявить устойчивые к пестицидам виды растений; –оценить аккумуляционный и детоксикационный потенциал пестицидтолерантных видов. Для оценки уровня содержания пестицидов в почве вокруг недействующих хранилищ химических средств защиты растений, расположенные в поселках: «Бескайнар»,«Бельбулак», «КызылКайрат», 2-я бригада колхоза «Алматы», «Панфилова» и «Кайрат» Талгарского района Алматинской области с каждого экспериментального участка и контрольного участка были взяты почвенные образцы в 6-х кратной повторности, с горизонта 0-30 см. Содержание хлорорганических пестицидов в почве определяли с помощью стандартных методов, применяемых в Казахстане на хроматографе Цвет с использованием капиллярной колонки НР-5 и электронно-захватного детектора [10]. Для выявления толерантных видов растений, способных к аккумуляции или деградации пестицидов была изучена видовая насыщенность фитоценозов на 8-и территориях бывших хранилищ пестицидов, расположенных в Талгарском районе Алматинской области [11-13]. 219 Для изучения фиторемедиационного потенциала толерантных видов растений, произрастающих на территориях хранилищ пестицидов, определяли остаточное количество пестицидов в вегетативных органах и в ризосферной зоне, с помощью стандартных методов, применяемых в Казахстане на газожидкостном хроматографе «Цвет-500» с электронозахватным детектором [10]. Все экспериментальные данные статистически были обработаны общепринятыми методами [14], построение графиков, диаграмм проводили с использованием компьютерной программы “Microsoft Excel». При изучении химического состава почвы вокруг территории бывших хранилищ пестицидов установлено, что почва загрязнена хлорорганическими пестицидами, концен-трации которых превышали ПДК десятки раз (рисунок 1). Установлено, что метаболиты ДДТ (2.4’ДДЭ, 4,4’ДДЭ, 2.4’ДДТ, 4.4’ДДТ, 2.4’ДДД, 4.4’ДДД) и изомеры ГХЦГ(-ГХЦГ, -ГХЦГ, -ГХЦГ) широко рассредоточены вокруг недействующих складов химизации в Талгарском районе Алматинской области. Почва вокруг складов отличались между собой не только по количественному, но и по качественному составу метаболитов ДДТ изомеров ГХЦГ. По степени загрязненности почвы можно распределить в следующем порядке: Кызыл-Гайрар (до 91 ПДК) – 2-ая бригада Талгарского колледжа агробизнеса и менеджмента, Талгар (28 ПДК) племзавод «Алматы», им. Кунаева, Талгар (27 ПДК) – Бескайнар (9 ПДК) – Амангельды (ПДК). ПДК почвы 100 мкг/кг. В результате фитоценологических исследований, проведенных в различных очагах загрязнения, установлено, что наиболее распространенными сообществами, приуроченные к темно-каштановым почвам предгорной равнины являются разнотравно-коноплевые и злаково–разнотравные сообщества. По степени доминирования, аспекту, видовому составу, проективному покрытию, ярусности, обилию, размещениию вида в фитоценозе, встречаемости, фенологической фазе развития отдельных видов растений и жизненному состоянию в сезонной динамике выделили толерантные виды. Для ответа на вопрос, могут ли естественно заселенные виды на территориях недействующих хранилищ химизации, играть роль восстановителя загрязненных сайтов изучили способность растительного организма аккумулировать загрязнители среды и транслоцировать их из корневой системы в надземную часть. Изучение остаточных количеств ксенобиотиков в вегетативных органах растений необходимо, с одной стороны, для прогнозирования загрязнения и отрицательного воздействия их на живой организм, а с другой стороны, знание аккумуляционной и детоксикационной способности этих объектов позволяет использовать их в ремедиационных технологиях в конкретных почвенно-климатических условиях. Объектом исследования были 17 однолетних и многолетних видов Artemisia annua (полынь однолетняя), Artemisia dracunculu (полынь древовидный), Canabis ruderalis (конопля сорная), Amaranthum retroflexus (амаранта запрокинутая). Ambrosia artemisifolia (амброзия полынолистная), Xanthium strumarium (дурнишник обыкновенный). Glycyrrhiza glabra (солодка голая), Lactuca tatarica (латук татарский), Polygonum aviculare (горец птичий) Onopordon acanthium (татарник колючий), Necundo Nutt. (клен американский), Rubrum caesius (ежевика сизая) , Rumex confertus (щавель конский), Barbarea vulgaris (сурепка обыкновенная), Poa pratensis (мятлик луговой), Bromus tectorum (костер безостый), Cynadon dactilis (свинорой пальчатый). Отмечено, что степень аккумуляции для различных видов растений различна и является видовой особенностью растений: Artemisia annua до 252 ПДК, Xanthium strumarium до 78 ПДК, Ambrosia artemisiifolia до 55 ПДК, Artemisia dracunculu до 46 ПДК, Polygonum aviculare до 40 ПДК, Bromus tectorum до 22 ПДК, Cannabis ruderalis до 20 ПДК ( ПДК для растений 20 мкг/кг). Коэффициент биологического поглощения у вида A. artemisifolia в зависимости от условий среды варьировал от 0,5 до 2,4, A.annua от 0,8 до 1,2, а X.strumarium – от 0,9 до 2. Содержание пестицидов в вегетативных органах растений является количественным показателем. В связи с этим, с учетом биомассы и концентрации пестицидов в вегетативных органах, подсчитали, сколько пестицидов может аккумулировать из загрязненной почвы за один вегетационный период (от начало всходов до стадии цветения) одно растение. За счет повышения биомассы за один вегетационный период одно растение X. strumarium экстрагировал до 262 мкг, A. retroflexus – 18 мкг, Artemisia annua – 39 мкг и A. artemisfolia – 106 мкг. Одной из причин устойчивости растений к техногенным факторам является транспорт пестицидов из корневой системы в надземную часть через ксилему [15]. Поэтому, при разработке технологии фиторемедиации почв первостепенной задачей является поиск растений способных аккумулировать загрязнители среды в корневой системе, а затем транслоцировать их в надземную часть, т.е. растения с высоким коэффиентом траслокации. Значения коэффициента ближе к единице и выше показывают способность растений транслоцировать загрязнители в надземные органы. Среди изученных видов 4 вида (X.strumarium A.retroflexus, C. ruderalis и A artemisifolia), 220 произрастающие на загрязненной почве, обладали способностью транслоцировать пестициды из почвы через корневую систему в надземную часть. Коэффициент транслокации варьировал в пределах 0,40,6. Для выявления роли растений в процессе детоксикации пестицидов нами исследован характер накопления пестицидов в почве без растения и с растениями, с использованием закона сохранения массы для прослеживания судьбы всего исходного пестицидного материала. Детоксикация загрязненной почвы без растений Концентрация пестицидов в почве без растений после эксперимента ниже, чем до эксперимента. Например, содержание пестицидов в почве без растений до эксперимента относительно его массы составляло 1458200 мкг, а после эксперимента их количество снизилось до 1108232 мкг (76%), в почве без растений (таблица 1). Детоксикация загрязненной почвы с помощью растений. Выявлено, что одни виды увеличивают концентрацию пестицидов в около-корневой зоне, а другие, которые, наоборот, снижают. Так, снижение концентрации пестицидов в ризосферной зоне по сравнению с опытом без растений установлено для 3-х видов (Xanthium strumarium, Ambrosia artemisifolia, Artemisia annua). Так, в околокорневой зоне Artemisia annua – 1458200 мкг до 714518 мкг (51%). Предполагаем, что эти виды, как фитоаккумуляторы, уменьшают концентрацию пестицидов в ризосферной зоне. Корневая система этих видов способны извлекать пестициды из загрязненных почв и аккумулировать их в надземных органах. Таблица 1 - Фитоэкстракция, снижение пестицидов в ризосферной зоне и детоксикация пестицидов в исходной почве Снижение Детоксикация Вариант опыта Фитоэкстракция пестицидов в пестицидов в одного растения, ризосферной исходной мкг зоне, % почве, % Контроль без растений 76 24 26 81 19 Cannabis ruderalis 30 55 44 Xanthium strumarium 1,1 79 21 Amaranthus retroflexus 12 59 41 Ambrosia artemisifolia 23 51 49 Artemisia annua 44 42 58 Artemisia dracunculu 5 84 16 Barbarea vulgaris 10 82 18 Polygonum aviculare 2 90 10 Rumex confertus При определении содержания хлорорганических пестицидов в околокорневой зоне Barbarea vulgaris концентрация пестицидов, наоборот, увеличилось от 1458200 мкг до 1224888 мкг (84%). Аналогичные результаты были получены для Cannabis ruderalis, Amaranthus retroflexus Polygonum aviculare и Rumex confertus. Считаем, что они стабилизируют содержание загрязняющих веществ в почве на низком уровне, вероятно, за счет поглощения или осаждения их в околокорневой зоне, как фитостабилизаторы. Таким образом, растительность, сформировавшаяся в результате вторичной сукцессии на территориях бывших складских помещений, где хранились химические средства растений, обладает способностью к детоксикации пестицидов в исходной почве. Основными механизмами, обеспечивающими фиторемедиацию загрязненных пестицидами почв, являются фитостабилизация и фитоэкстракция. 1 Bicki T.J., Felsot A. S. Remediation of pesticide contaminated soil at agrichemical facilities. In Mechanisms of Pesticide Movement into Ground Wate, (Honeycutt, R. C. and D. J. Schabacker, Editors). – 1994. – Lewis Publishers, Boca Raton, FL. – P. 8199. 2 UNEP/ POPs/INC.5/1; IHPA estimates based on various sources: 22.11.2008 3 Методические рекомендации неправительственных организаций Российской федерации по проведению первичной инвентаризации устаревших и запрещенных к использованию пестицидов. http://www.ecoaccord.org. 4 Беспамятнов Г.П., Кротов Ю.А. Предельно-допустимые концентрации химических веществ в окружающей среде – Л.: Химия. – 1985. – 528 с. 5 Чмиль В.Д. Накопленные запасы непригодных пестицидов в Украине: тактика утилизации. Фиторемедиационные технологии – метод восстановления загрязненных пестицидами почв. Охрана и оптимизация окружающей среды. – К., 1990. – 256 с. 221 6 FAO Pesticide Disposal Series 2 "Prevention of accumulation of obsolote pesticide stocks", Provisional Guidelines, Rme, 1995. – 58 с. 7 Davis L.C., Castro-Diaz S., Zhang Q., Erickson L.E. Benefits of vegetation for soils with organic contaminants // J. Critical Reviews in Plant Sciences – 2002. – Vol. 5, № 21. – Р. 457-491. 8 Dowling D.N., Doty S.L., Improving phytoremediation through biotechnology // J. Curr. Opin. Biotechnol., – 2009. – Vol. 20. – Р. 204-206 9 Sophie Pascal-Lorber, François Laurent. Phytoremediation Techniques for Pesticide Contaminations // Alternative Farming Systems, Biotech, Drought Stress and Ecoll Fertilisation, Sustainable Agricul Reviews 6. – 2011. – Springer Science + Business Media. – P. 77-105. 10 Унифицированные правила отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов.– Алматы: Мин-во с/х РК, 1997. – 18 с. 11 Байтенов М.С.Флора Казахстана. – Алматы: Ғылым, 2001. – Т.1-2. – 450 с. 12 Тахтаджян А.Л.Система магнолиофитов. – Л.: Наука,1987. – 439 с. 13 Черепанов С.К.Сосудистые растения СССР. – Л.: Наука, 1981. – 509 с. 14 Рокицкий П.П. Биологическая статистика. – Минск: Вышэйшая школа, 1976. – 250 с. 15 Anderson T.A.,Kruger E.L.,Coats J.R. Enhanced degradation of a mixture of three herbicides in the rhizosphere of an herbicide-tolerant plant //Chemosphere.– 1994. – Vol. 28. – P. 1551-1557. *** Presented results about possible practical use of wild plants for phytotechnology of pesticide-contaminated soil. *** Өсімдіктердің табиғи түрлерін пестицидтармен ластанған топырақты фиторемедиациалау үшін қолдану мүмкіндіктері жөніндегі нəтижелер келтірілген. И.С. Савицкая, А.А. Жубанова, А.С. Кистаубаева, А.Б. Болекбаева АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ ЛАКТОБАЦИЛЛ - ПРОБИОТИКОВ (Казахский национальный университет им. аль-Фараби) Исследованные штаммы лактобактерий обладали различным типом и уровнем устойчивости к антибиотикам. Большинство штаммов оказались устойчивыми к канамицину, офлоксацину, ципрофлоксацину, тетрациклину, гентамицину, эритромицину. Устойчивость к фторхинолонам сохраняется после многократных пассажей в неселективных условиях. Для разработки новых препаратов пробиотического действия постоянно ведется поиск новых активных штаммов, отбор которых осуществляется по общепринятым в этой области исследований критериям. Это активное кислотообразование, высокая антагонистическая и адгезивная активность, устойчивость к антибиотикам [1]. Последнее связано с тем, что пробиотики в большинстве своем чувствительны к некоторым широко применяющимся в клинике антибактериальным препаратам, поэтому их использование совместно с антибиотиками считается неоправданным [2]. Для решения вопроса о возможности сочетанного применения пробиотиков и антибиотиков необходимо располагать сведениями о чувствительности к ним новых штаммов, на основе которых разрабатываются новые пробиотические препараты. В связи с этим, цель исследованийопределить спектр и генетическую природу антибиотикорезистентности штаммов лактобацилл. Материалы и методы В качестве объектов исследования использованы 12 новых штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника 40 детей и взрослых обоего пола, не имеющих в анамнезе инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Чувствительность лактобактерий к антибиотикам определяли методом серийных разведений [2]. Выделение плазмидной ДНК проводили методом, описанным Lee S.Y. [3]. Электрофорез препаратов плазмидной ДНК проводили в горизонтальном 0,7% агарозном геле. Элиминацию плазмидной ДНК осуществляли путем инкубации исследуемых штаммов в среде, содержащей бромид этидия или акрифлавин в субингибиторных концентрациях. Результаты и обсуждение Для получения информации о природной устойчивости штаммов лактобацилл к антибактериальным препаратам определяли спектр их лекарственной устойчивости с помощью метода серийных разведений для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) (таблица 1). Поскольку уровни чувствительности исследуемых штаммов к взятым антибиотикам сильно различаются, возникла определенная сложность с интерпретацией данных. Четких критериев для 222 отнесения того или иного штамма лактобацилл к чувствительным или резистентным не существует. В связи с этим эмпирически в качестве пограничных МПК были выбраны те концентрации из серии разведений препаратов, которые задерживали рост хотя бы одного из исследованных штаммов: для канамицина, тетрациклина – 50 мкг/мл, для цефазолина – 30 мкг/мл, для гентамицина, ципрофлоксацина, офлоксацина – 20 мкг/мл, для ампициллина, амоксициллина, эритромицина – 10 мкг/мл. Эти МПК встречаются и у других исследователей [2; 4]. Все исследуемые штаммы лактобацилл были одновременно устойчивы к нескольким препаратам. 5 штаммов: АА-1, AI-17, АК-5, АК-9 и АР-1 имели по 3 маркера антибиотикорезистентности. Штаммы АА-9 и АП-4 были устойчивы к четырем, штаммы АК-2, АР-5, АС-1, АС-31 к пяти, а штамм LK-7 обладал множественной устойчивостью сразу к 6 антимикробным препаратам (таблица 2). Таблица 1 Уровень антибиотикорезистентности штаммов лактобацилл Штамм МПК (мкг/мл) антибиотиков в отношении различных штаммов лактобацилл Аминогликозиды Km Gm -лактамы Ap Фторхинолоны Am Cip Тетрациклин Ofl Tc Це-фалоспор ины Cef АА-1 10 10 5 5 20 10 50 30 АА-9 5 20 10 2,5 10 5 50 10 AI-17 50 5 5 5 5 5 50 5 AK-2 50 20 10 2,5 20 20 20 10 AK-5 50 20 10 5 10 10 10 5 AK-9 50 10 2,5 5 20 5 50 20 AP-1 20 20 5 5 10 20 50 20 AP-5 10 10 10 10 5 10 50 10 AП-4 50 5 5 10 5 5 20 5 AC-1 50 20 10 5 10 5 50 10 AC-31 50 20 5 2,5 20 10 10 20 LK-7 50 20 2,5 10 10 20 20 10 Примечание: Km-канамицин,Gm-гентамицин, Ap-ампициллин, Am – амоксициллин, Cip – ципрофлоксацин, Ofl – офлоксацин, Tc – тетрациклин, Cef-цефазолин, Ery-эритромицин. Макр о-лиды Ery 5 10 10 2,5 5 5 5 10 5 10 10 10 Большинство штаммов оказались устойчивыми к следующим антибиотикам: (в убывающем порядке) канамицину (9 штаммов), гентамицину (8 штаммов), тетрациклину (устойчивость наблюдается также у 8 штаммов), эритромицину (6 штаммов), ампициллину и офл0ксацину (устойчивость к ним выявлена у 5 штаммов), ципрофлоксацину (4 штамма), амоксицилину (3 штамма) и только штамм АА-1 обладал резистентностью к цефазолину. Всего было выявлено 12 различных сочетаний маркеров устойчивости, т.е. каждый штамм имел индивидуальный спектр антибиотикорезистенности. Таблица 2 Спектр антибиотикорезистентности 12 штаммов лактобацилл Штамм Количество Фенотип устойчивости маркеров АА – 1 3 Cef Tc Cip AI – 17 3 Km Tc Ery AK – 5 AK – 9 AP – 1 3 3 3 Km Gm Ap Km Tc Cip Gm Tc Ofe AA – 9 АП - 4 4 4 Gm Ap Tc Ery Km Gm Am Ofe 223 AK - 2 5 Km Gm Ap Cyp Ofe AP – 5 AC – 1 AC – 31 5 5 5 Km Ap Am Tc Ery Km Gm Ap Tc Ery Km Gm Cyp Ofe Ery LK – 7 6 Km Gm Am Tc Ofe Ery Генетической основой антибиотикорезистентности являются мутации в собственной ДНК микроорганизмов или внедрение чужеродной, т.е., приобретение бактериями устойчивости к антибиотикам может иметь мутационую природу или детерминироваться приобретением плазмид резистентности. В последнем случае теоретически может происходить неконтролируемая передача плазмидных генов антибиотикорезистентности. В настоящее время микробиологи озабочены возможной ролью молочнокислых бактерий в распространении генов лекарственной устойчивости. Показана возможность передачи R-плазмид от диких и «пробиотических» культур лактобацилл различным видам грампозитивных бактерий в условиях in vitro и in vivo [1; 5]. Эти находки настораживают и требуют контроля стартерных культур молочнокислых бактерий, используемых для производства продуктов питания, на отсутствие «опасных» плазмид. Представляется целесообразным включение в препараты-пробиотики резистентных штаммов, устойчивость которых контролируется хромосомой. При исследовании антибиотикорезистенности 12 штамммов лактобацилл установлена высокая нестабильность этого признака. Так, при хранении штаммов в неселективных условиях спонтанная утрата одного или нескольких маркеров происходила уже после одного пассажа. Дополнительная обработка тестированных клонов этих штаммов с разным спектром резистенности кратковременным нагреванием 750С в течение 5 секунд) показала, что в этих условиях поисходит утрата устойчивости к химиопрепаратам (таблица 3). Таблица 3- Частота (в %) утраты маркеров антибиотикорезистенности у 12 штаммов лактобацилл после кратковременного воздействия повышенной температуры Маркер антибиотикорезистентности Штамм Km Gm Ap Am Cip Ofe Tc Cef Ery АА – 1 AI – 17 AK – 5 AK – 9 AP – 1 AA – 9 АП – 4 AK – 2 AP – 5 AC – 1 AC -31 LK – 7 55 44 68 37 58 100 37 100 47 100 66 33 100 93 53 100 68 89 96 45 72 83 - 58 67 100 0 0 0 0 - 0 0 0 0 0 77 75 55 88 100 92 100 100 0 - 88 55 73 100 38 76 Наиболее часто утрачивалась устойчивость к беталактамным препаратам, аминогликозидам тетрациклину и эритромицину. Выявленная нестабильность антибитикорезистентности лактобацилл к этим антибиотикам отмечается и другими авторами [5]. Этому можно найти объяснение, если предположить, что детерминанты устойчивости к этим антибиотикам имеют плазмидную локализацию, а к фторхинолонам и цефазолину – хромосомную. Это предположение нашло экспериментальное подтвержение. Нестабильность многих физиологических свойств промышленных штаммов лактобацилл может объясняться экстрахромосомной локализацией некоторых генов. При этом многие исследователи пытались связать конкретные фенотипические черты, характеристики с определенными плазмидами по факту соответствия одновременной утраты плазмиды и признака. Потеря плазмиды может произойти спонтанно или после соответствующей обработки (повышенная температура, акридиновый оранжевый, акрифлавин, бромид этидия, рифампицин). Например, у штамма L.fеrmentum, 224 изолированном из фекалий, обнаружены плазмиды, кодирующие устойчивость к тетрациклину и эритромицину. Основанием для подобного заключения явилась одновременная утрата тетрациклинрезистентности и плазмиды молекулярной массой 10 МД после обработки акрифлавином [5]. Выращивание при повышенной температуре или обработка бромидом этидия сопровождалась элиминацией плазмид с одновременной потерей устойчивости к бацитрацину, хлорамфениколу и олеандомицину [6]. При элиминации плазмид лактобациллы становились чувствительными к стрептомицину, неомицину, гентамицину, канамицину, террамицину, рифампицину, полимиксину, колистину [4]. При выборочном исследовании у четырех штаммов установлено наличие плазмидной ДНК. Штаммы АС-31 и АК-2 содержали по 3 плазмиды, у штамма АР-1 обнаружено по 2 полосы плазмидной ДНК и штамм АА-1 содержал одну плазмиду (рисунок 1). В соответствии с выявленными маркерами и данными электрофореза препаратов ДНК сравнивали уровни устойчивости к 9 антибиотикам у штаммов, содержащих плазмиды и их безплазмидных производных, которые были получены в результате воздействия этидиумбромида и акрифлавина. Данные этих экспериментов приведены в таблице 4. П р и м е ч а н и е: L.salivarius AC-31; 2- L.fermentum АК-2; 3-L.plantarum АР-1; 4- L.acidophilus АА-1; 5 –ДНК культур лактобацилл после элиминации Рисунок 1 – Плазмидный профиль штаммов лактобацилл плазмид Воздействие на указанные культуры классических факторов, приводящих к потере плазмид привело к одновременной утрате признаков устойчивости к гентамицину у штаммов L.salivarius AC31, L.plantarum АР-1 и L.fermentum АК-2, в то же время их плазмидный профиль свидетельствует о наличии во всех трех штаммах одинаковой по размеру плазмиды (рисунок 1), которая может содержать гены, контролирующие устойчивость к нему. Элиминация плазмид сопровождалась потерей резистентности к канамицину у штаммов L.salivarius AC-31 и L.fermentum АК-2 (они также имеют общую полосу плазмидных ДНК). Аналогичный результат был получен и для тетрациклина, т.е. потеря плазмид коррелировала с появлением чувствительности к этому антибиотику у ранее резистентных штаммов L.plantarum АР-1 и L.acidophilus АА-1. У этих культур также отмечено одновременное присутствие одной идентичной полосы. Кстати, по данным электрофореза в штамме L.acidophilus АА1 присутствует только 1 плазмида, но после ее утраты у этого штамма сохраняется резистентность к ципрофлоксацину и офлоксацину. Эти данные свидетельствуют в пользу предположения о локализации в плазмидах детерминант устойчивости в канамицину, гентамицину, тетрациклину, ампициллину и эритромицину. О таком расположении генов, определяющих устойчивость к этим антибиотикам, уже упоминалось ранее при исследовании плазмид у лактобактерий [2]. Сохранение резистентности к ципрофлоксацину, офлоксацину, и цефазолину у безплазмидных вариантов этих же штаммов говорит о возможном расположении данных детерминант в хромосоме. Для дополнительного подтверждения обнаруженного феномена проведена серия экспериментов по многократному пассированию указанных штаммов на селективных средах, содержащих данные антибиотики и без них. Результаты суммированы в таблице 5. Таблица 4 - Уровни антибиотикорезистентности штамммов, содержащих плазмиды и их безплазмидных производных МПК, мкг/мл Штаммы Вариант Km Gm Ap Cip Ofl Ery 225 AA - 1 AP - 1 AK - 2 AC - 31 исходный 10 10 5 20 10 5 + ЭБ +АФ 10 10 5 5 5 5 20 20 10 10 5 5 исходный 20 20 5 10 20 5 + ЭБ 20 5 5 10 20 5 +АФ 20 2,5 5 10 20 5 исходный 50 20 10 20 20 2,5 + ЭБ 10 5 5 20 20 2,5 +АФ 5 5 2,5 20 20 2,5 исходный 50 + ЭБ 10 5 5 20 10 5 +АФ 10 5 5 20 10 2,5 20 5 20 10 10 Таблица 5 - Антибиотикочувствительность штаммов, содержащих плазмиды после многократных пересевов на средах с антибиотиками и без них Присутствие Km Gm Ap Cip Ofl Ery Штаммы антибиотика в среде AA - 1 AP - 1 + S R S R S S – S S S R S S + S R S S R S – S S S S R S AK - 2 + R R R R R S AC - 31 – + S R S R S S R R R S S R – S S Примечание: R – резистентный; S – чувствительный. S R S S Оказалось, что в процессе неоднократных (20-30) пассажей на селективных средах с антибиотиками, все резистентные к ним культуры остаются таковыми. Однако, исключение антибиотика из ростовой среды приводит к спонтанной утрате маркеров резистентности к канамицину, гентамицину, ампициллину, тетрациклину, эритромицину. Устойчивость штаммов к антибиотикам ципрофлоксацину и офлоксацину сохраняется при повторных пересевах, даже когда все штаммы были свободны от плазмидной ДНК. Механизм бактерицидного действия фторхинолоновых препаратов последнего поколения ципрофлоксацина и офлоксацина связан с ингибированием двух жизненно важных для бактериальной клетки ферментов из группы топоизомераз – ДНК-гиразы (в большей степени) и топоизомеразы IV. Эти ферменты осуществляют конформационные изменения в молекуле бактериальной ДНК, необходимые для ее нормальной репликации ДНК. Гены обоих ферментов находятся на бактериальной хромосоме [7]. В связи с этим на первых этапах клинического применения фторхинолов полагали, что резистентность микроорганизмов к ним практически не будет развиваться. Основаниями для такого суждения были спецефический механизм антимикробного действия, быстрый бактерицидный эффект и отсутствие убедительных данных о плазмидном механизме передачи устойчивости для класса хинолонов [8]. Однако сейчас очевидно, что проблема антибиотикорезистентности в полной мере затрагивает и эту группу антибиотиков. Резистентность микроорганизмов к фторхинолам развивается медленно по типу хромосомной и связана с мутациями в генах, кодирующих ДНК-гиразу или 226 топоизомеразу IV. Уровень резистентности бывает более высоким при многоступенчатых мутациях. При этом резистентность развивается только к фторхинолам [9]. Приведенная информация находится в полном соответствии с полученными в работе данными и дает основание заключить, что резистентность штаммов лактобацилл к ципрофлоксацину и офлоксацину имеет хромосомную природу. 1 Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых. КМК Scientific Press: М. - 2003. – 220 с. 2 Лыкова Е.А. Антибиотиковая резистентность штаммов входящих в состав препаратов пробиотиков //ЖМЭИ. – 2000. - №2. - С. 64-66. 3 Lee S.Y., Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA // Biotechniques. – 1990. - Vol.9. - N6. - P. 676-979. 4 Козлова Е.В., Пивоваренко Т.В., Малиновская И.В., Аминов Р.И., Коваленко Н.К., Боронин А.М. Устойчивость к антибиотикам штаммов лактобацилл // Антибиотики и химиотерапия. – 1992. – Т.37. - №6. – С.12-15. 5 Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Панасенко В.И. Генетическая природа антибиотикорезистентности лактобацилл // Антибиотики и химиотерапия. – 1989. – Т.34. - №7. – С.539-545. 6 Тюрин М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл: Дис. … канд. мед. наук. - М., 1990. – 146 с. 7 Сидоренко С.В. Роль хинолов в антибактериальной химиотерапии. Механизм действия, устойчивость микроорганизмов, фармакинетика и переносимость// РМЖ. - 2003. - Т. 11. - №2. - С. 98-102. Яковлев В.П., Падейская Е.Н., Яковлев С.В. Ципрофлоксацин в клинической практике. М. - 2000. - 272с. Падейская Е.Н. Юбилейные даты высокоактивных антимикробных препаратов: ципрофлоксацин // Фарматека. - 2007. - №17. - С. 45-52. *** Зерттелген лактобактерия штамдары əртүрлі антибиотикке тұрақтылық қасиетімен анықталды. Көптеген штамдар канамицинге, офлоксацинге, ципрофлоксацинге, тетрациклинге, гентамицинге жəне эритромицинге тұрақтылық қасиетін көрсетті. Фторхинолонға тұрақтылық бірнеше пассажға дейін сақталады. *** Investigated strains of lactobacilli possessed various type and a level of stability to antibiotics. The majority of strains have appeared steady to canamicin, ofloxacin, ciprofloxacin, tetracycline, gentamycin and erythromycin. Stability to phtorhinolons is kept after repeated passages in not selective conditions. И.С. Савицкая, А.С. Кистубаева, М. Абдулжанова, Ж. Жумагалиева ПРИНЦИПЫ ОТБОРА ШТАММОВ ДЛЯ НОВОГО ЛАКТОСОДЕРЖАЩЕГО ПРОБИОТИКА (Казахский национальный университет им. аль-Фараби) В последние годы интенсивно развивается биотехнология пробиотиков – препаратов, используемых для коррекции и профилактики микроэкологических нарушений в желудочно-кишечном тракте человека и животных [1]. Поскольку, в кишечнике человека доминируют бифидобактерии и лактобациллы, большинство пробиотиков создается на основе этих бактерий [2]. Эффективность пробиотических препаратов определяется совокупностью биологических свойств штаммов, входящих в состав препарата [3]. Производственные бактерии должны обладать набором характеристик, позволяющих им конкурировать с патогенными и условно патогенными микроорганизмами. К ним относятся: апатогенность, антагонистическая активность, способность к адгезии и колонизации слизистой кишечника, активность кислотообразования, определенный уровень резистентности к соляной кислоте и желчи [4]. Повышение эффективности и расширение спектра биологической активности лактосодержащих пробиотиков может быть достигнуто за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных бактериальных композиций, включающих совместимые и взаимодополняющие штаммы [5]. Цель работы: сконструировать бактериальную композицию с учетом совместимости входящих в нее штаммов. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для составления бактериальных композиций использовали 10 штаммов лактобацилл, выделенных из кишечника 20 детей и взрослых обоего пола, не имеющих в анамнезе инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта. Антагонистическую активность исследовали методом отсроченного антагонизма в отношении стандартного набора тест-культур [6], а также гомоантагонизма – при совместном культивировании штаммов лактобацилл на плотной питательной среде [7]. Адгезивную активность определяли по 227 способности штаммов агглютинировать агглютинировать эритроциты барана, морских свинок, человека IV(AB) и I(0) [8]. Для определения лектиноподобных структур использовали реакцию агглютинации с конкавалином А [9]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Ключевым критерием при первичном отборе пробиотических штаммов лактобацилл является уровень и спектр их антагонистической активности, который традиционно определяется методами штрихового посева, диффузионным, или отсроченного антагонизма. При этом не учитывается природа продуцируемых отбираемыми штаммами веществ, обладающим антагонистическим действием по отношению к организмам-мишеням. У различных видов молочнокислых бактерий описаны бактериоцины с высокой и микроцины – с низкой молекулярной массой, нарушающие проницаемость бактериальной мембраны, блокирующие белковый синтез, подавляющие репликацию ДНК, изменяющие мембранный потенциал клетки или нарушающие процессы деления клетки [10]. С нашей точки зрения, в качестве критерия отбора штаммов для включения в пробиотическую композицию, являющуюся микробиологической основой комплексных препаратов, следует проводить селекцию штаммов лактобацилл, синтезирующих микроцины с широким спектром антагонистической активности. Для их определения можно использовать метод агаровых слоёв – разновидность метода отсроченного антагонизма. Применяя его различные модификации, достаточно просто дифференцировать продукцию бактериоцинов с высокой молекулярной массой и микроцинов с низкой молекулярной массой. В первом случае на поверхность плотной среды наносят бляшками лактобациллы, которые после культивирования убивают парами хлороформа, затем наслаивают тесткультуру. Появление вокруг бляшки зоны отсутствия роста - положительный результат. Для индикации микроцинов на поверхность плотной среды с нанесенными, высохшими и обработанными в парах хлороформа бляшками, накладывают стерильный целлофан, а сверху на него наслаивают полужидкий агар с тест-культурой. Вокруг колоний, продуцирующих микроцины, появляются зоны роста индикаторных штаммов [11]. Микроцинпродуцирующая активность выявлена у 10 штаммов (таблица 1). Таблица 1 – Спектр антагонистического действия лактобацилл – продуценов микроцинов Антагонистическ ая активность в отношении штаммов Candida albicans Антагонистическая активность лактобацилл в отношении грамотрицательных энтеробактерий Антагонистическая активность в отношении грамположительных аэробных бактерий Штаммы Зоны задержки роста тест-микробов, мм (М±m) АА-1R 22±0,70 12±0,36 3±0,11 АI-17 12±0,14 18±0,38 5,5±0,21 АA-9 7±0,27 21±0,69 4,5±0,14 АР-1R 5,5±0,16 11±0,35 10,5±0,16 АП-4R 2±0,41 19±0,50 7,5±0,17 АC-31R 3,5±0,45 15±0,45 4,5±0,18 АС-1 17±0,34 8±0,35 2,5±0,09 AK-2R 13±0,35 22±0,56 7±0,55 АК-9 18±0,32 20±0,26 3±0,07 LK-7 19±0,18 6±0,27 3±0,19 В антимикробном действии исследуемых штаммов имеется определенная специфичность, спектры антагонистической активности у разных штаммов далеко не всегда перекрываются. Так, штаммы АА-1 R, AI-17, LK-7 и AС-31 R больше ингибируют грамположительные бактерии, но не дрожжи. Штаммы AK-2R, АК-9, АА-9 и АП-4R максимально эффективны против грамотрицательных энтеробактерий. Штаммы АР-1, АП-4R, AK-2R и AI-17 оказывают негативное действие на дрожжевые грибки. Для того, чтобы совместить разные виды антагонистической активности, следовало составить композицию из нескольких штаммов. 228 Для первичного скрининга пробиотических бактерий, большое значение имеет способность к адгезии, ведь именно это качество определяет возможность их приживления в организме хозяина. Наиболее универсальной моделью для изучения адгезии микроорганизмов являются эритроциты, поскольку гликофорин их поверхностного слоя идентичен гликокаликсу эпителиальных клеток, на котором расположены рецепторы для микробных адгезинов [8]. Экзогенные лактобациллы способны прикрепляться к эпителиоцитам, создавая барьер, препятствующий адгезии и транслокации во внутреннюю среду патогенной и условно-патогенной флоры. Эта адгезия осуществляется за счет наличия у лактобацилл лектиноподобных структур, плотно связанных с клеточной стенкой [9]. Некоторые штаммы способны синтезировать слущивающиеся с поверхности клеток адгезиноактивные белки, которые блокируют и дезинтегрируют патогены, защищая таким образом макроорганизм от способных к транслокации кишечных бактерий [12]. В связи с этим, полагаем, что наилучшую композицию препарата может дать комбинация штаммов-продуцентов микроцинов, в которой одновременно будут присутствовать наряду со штаммами, несущими на своей поверхности слущивающийся адгезиноактивный белок, еще и штаммы, адгезивную активность которых определяют лектиноподобные структуры, плотно связанные с клеточной стенкой. Для определения последних у исследуемых штаммов использовали реакцию агглютинации с конкавалином А. Оказалось, что продукция белково-липотейхоевого комплекса присутствует у штамма AK-2R, принадлежащих к виду L.fermentum, а также у шаммов АР-1R и АП-4R вида L.plantarum. Выявлено также, что набор адгезинов у разных штаммов и видов лактобацилл, определяемый по способности культур агглютинировать эритроциты барана, морских свинок, человека IV(AB) и I(0) P+ вариабилен. Штамм LK-7 вида L.casei имел узкий спектр адгезинов – он умеренно агглютинировал только эритроциты барана. В то же время штаммы АА-1R и AI-17, относящиеся к виду L.аcidophilus активно агглютинировали все четыре вида эритроцитов. Проведенные исследования позволяют заключить, что в состав комплексного пробиотического препарата можно включать культуры с выраженной экспрессией разных типов адгезинов, но не секретирующие лектинзависимый белок, и другой вариант лактобацилл, секретирующий во внешюю среду этот субстрат, но при этом проявляющий умеренную адгезивность в тесте с эритроцитами. Исходя из полученных данных, для дальнейшего отбора оставлено 5 штаммов. Cовмещение штаммов и композицию и их совместное культивирование может приводить к проявлению антагонизма не только по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям (гетероантагонизм или прямой антагонизм), но и к представителям других видов рода Lactobacillus, а иногда даже к отдельным штаммам в пределах одного вида. Такой вид активности в литературе принято называть гомоантагонизмом или изоантагонизмом [7]. Поэтому при конструировании комплексных пробиотических препаратов, следует учитывать биосовместимость штаммов, входящих в бактериальный консорциум. Оценку биосовместимости штаммов лактобацилл проводили путем одновременного совместного культивирования на плотной питательной среде, а также с использованием одного из вариантов метода отсроченного антагонизма. Результаты этих тестов суммированы в таблице 2. Таблица 2 – Биосовместимость штаммов лактобацилл при совместном культивировании на плотной питательной среде Штаммы АА-1R АА-1R АI-17 __ АР-1R + АК-2R + LK-7 + АI-17 __ __ __ + АР-1R АК-2R + + __ __ + + + + LK-7 + + + + По результатам экспресс-теста на биосовместимость выяснилось, что штамм L.acidophilus АI-17 несовместим со штаммами L.fermentum АК-2R, L. plantarum АР-1R и даже со штаммом того же вида L. acidophilus АА-1R. Судя по полученным в этом тесте результатам, АI-17 проявляет гомоантагонистическое действие в отношении всех используемых в эксперименте штаммов, кроме штамма LK-7. Поэтому для основы бактериальной композиции из двух представителей вида L. acidophilus был оставлен только штамм АА-1R. Из полученных в этом эксперименте данных видно, что все использованные в работе штаммы полностью совместимы друг с другом. Зона задержки роста 229 или полностью отсутствует, или ее размер не превышает 2-3 мм. Исходя из этого, теоретически возможно составление 4-х разновидностей бактериальных композиций: №1 - АА-1R+ АР-1R+LK7+АК-2R; №2 - АА-1R + АР-1R+АК-2R; №3 - АА-12+ АР-1R+ LK7; №4 - АА-12+ АК-2R+ LK7. В микробиоценозе кишечника человека присутствуют представители трех таксономических групп лактобацилл: термобактерии или облигатные гомоферментативные лактобациллы (ОГОЛ), к которым относится вид L. acidophilus; стрептобактерии или факультативные гетероферментативные лактобациллы (ФГЕЛ), в эту группу входит вид L. plantarum и бетабактерии - облигатные гетероферментативные лактобациллы (ОГЕЛ). Лактобациллы L. fermentum и L.casei - среди составляющих эту группу видов. Комплексный препарат должен включать представителей всех физиологических групп. Примером является Казахстанский пробиотик «Плантафермин». Такой микроэкологический подход позволяет повысить эффективность пробиотикотерапии при дисбактериозах. Среди отобранных штаммов к группе ОГОЛ относится L.acidophilus АА-1R, Этот вид, как указывалось выше, составляет основу многих фармабиотиков. К группе ФГЕЛ относится штамм L.plantarum АР-1R, этот вид входит в состав широко известного препарата «Лактобактерин». Виды лактобацилл, такие, как L.fermentum и L.casei, входящие в группу ОГЕЛ, в составе пробиотических препаратов используются значительно реже, хотя по своим метаболическим особенностям они имеют сходный путь метаболизма с бифидобактериями. Последнее выглядит достаточно привлекательно с точки зрения возможности замены бифидобактерий в комплексных препаратах на виды, входящие в группу ОГЕЛ, что может упростить производственный процесс, поскольку лактобациллы можно выращивать на одной питательной среде. Вместе с тем, используемые в работе штаммы, принадлежащие к группе ОГЕЛ – LK-7 и АК-2R обладают схожими антагонистическими особенностями, поэтому представляется обоснованным включение в композицию лишь одного из этих двух штаммов. Таким образом, для разработки препарата предлагаются два варианта бактериального консорциума: №2 - АА-1R+АР-1R+АК-2R и №3 – АА-1R+АР-1R+LK7. Из этих двух композиций одну наиболее перспективную, используя при этом такую технологическию характеристику, как накопление биомассы. Уровень накопления биомассы является определяющим технологическим параметром, характеризующим культуру лактобактерий и влияющим на количество жизнеспособных клеток в дозе препарата. Для культивирования использовали казеиново-дрожжевую среду (КДС) традиционно применяемую в производстве лактосодержащих пробиотиков . Высокие ростовые качества казеиноводрожжевой среды объясняются рациональным подбором питательных веществ. Глубинное культивирование лактобактерий проводили при температуре (37±1)°С в условиях постоянного перемешивания, продолжительность культивирования составляла 10-12 ч. Доза вносимого инокулята составляла 10% от объема питательной среды. В процессе культивирования с помощью 10% раствора аммиака поддерживали рН среды на уровне 5,5-6,0. В качестве углеводной добавки использовали 40% раствор глюкозы. Оптическую плотность бактериальных культур в процессе роста определяли с помощью фотоэлектроколориметра (кювета-1 мм, длина волны – 540 нм), пробу бактериальной взвеси перед измерением разводили 0,9 % раствором натрия хлорида в соотношении 1:1. Оказалось, что накопление биомассы у штамма LK-7 значительно ниже, чем у остальных штаммов. В связи с этим для комплексного препарата была выбрана бактериальная композиция состоящая из штаммов AА-1R + AР-1R + АК-2R. При исследовании характера взаимоотношений между отдельными видами лактобацилл, входящих в состав комбинации для нового пробиотика, было установлено существование симбиоза между ними, выражавшееся в усилении антагонистической активности. Антагонистические свойства штаммов, входящих в комбинированный препарат исследовали с применением прямого совместного культивирования на плотной питательной среде (таблица 3). Таблица 3 - Антагонистическая активность пробиотической компоции Штаммы ella Salmon Eschercihia coli 157 Зона задержки роста, мм Shigel Proteus la sonnei vulgaris 177 230 Staphylococcus aureus Can dida АА-1R АР-1R AK-2R комплекс typhimurium 59-60 15±2,0 10±1,0 8±0,5 17±2,2 177б 12±1,0 8±0,4 6±0,7 15±0,9 S60 16±1,1 7±0,8 10±0,7 16±1,2 13±1,5 11±1,7 8±0,7 15±0,9 10±1,1 8±0,6 15±0,5 18±1,6 albicans KAA-88 0 10±1,3 0 12±1,8 Контроль bifidum 701 1:1 Bifidobacterium Candida albicans Salmonella aureus thyphimurium 0,1:1 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Staphilococcus Средний показатель адгезивности Использование штаммов в композиции увеличивало их антагонистическую активность против микроорганизмов-мишеней, кроме того, эта активность проявлялась теперь и в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных микроорганизмов. Комплекс способен подавлять также и грибки рода Candida. То есть объединение штаммов лактобацилл в консорциум позволяет расширить спектр биологической активности будущего препарата. В естественных средах обитания микроорганизмы находятся в условиях смешанных микробных популяций, где они вступают различного рода взаимоотношения друг с другом. Появляются данные, свидетельствующие о возможных изменениях адгезии микроорганизмов в этих условиях. Так, под влиянием одних микроорганизмов цитадгезия других может снижаться. Такое явление объяснимо либо формированием микробного барьера на поверхности клеток макроорганизма, либо конкуренцией за рецепторы для адгезинов. Иногда, наоборот цитадгезия микроорганизмов может усиливаться. Поэтому при создании бактериальных препаратов необходимо проведение исследований по изучению адгезивных свойств исследуемой комбинации лактобацилл в условиях смешанных микробных популяций. В работе использовали культуры стафилококков, сальмонелл, кандид и бифидобактерий. Исследования проводили параллельно при двух различных соотношениях лактобацилл и тест-культур 0,1:1; 1:1. В качестве контроля использовали суспензии отдельных микроорганизмов в концентрациях, соответствовавших их концентрации в опытном образце. Результаты по изучению адгезивных свойств исследуемой культуры лактобацилл в условиях смешанных микробных популяций представлены на рисунке 1. Рисунок 1 – Оценка адгезивных свойств тест-штаммов после культивирования с пробиотической композицией В смешанных популяциях лактобациллы существенно снижали цитадгезию стафилококков при всех изученных соотношениях. Так, например средний показатель адгезии стафилококков в контроле был равен 4,1 в опытных вариантах при соотношении лактобацилл и стафилококков 0,1:1; 1:1 он был равен 2,1; 1,0 соответственно. Аналогичные результаты были получены в смешанных популяциях лактобацилл и кандид. При соотношении изучаемых лактобацилл с кандидами в соотношении 0,1:1; 1:1 средний показатель цитадгезии кандид снижался от 2,7 до 0,9. Контроль, при этом составлял 4,5 единицы. Отметим, что СПА сальмонелл был равен 3, а в условиях смешанных популяций при соотношении лактобацилл и сальмонеллами 0,1:1; 1:1 этот показатель у данной тест-культуры снижался и был равен соответственно 2; 0,5. Цитадгезия бифидобактерий в смешанных популяциях оставалась на уровне контроля во всех изученных вариантах. Поскольку совместное применение трехкомпонентной пробиотической композиции снижает цитадгезию таких культур, как S.typhimurium, S.aureus и C.albicans, не изменяя при этом цитадгезии 231 бифидобактерий, совместное использование штаммов в композиции позволяет существенно снижать адгезивные свойства патогенных и условно-патогенных бактерий. Таким образом, полученная пробиотическая композиция обладает биосовместимостью, а объединение штаммов лактобацилл в композизию позволяет расширить спектр и уровень их антагонистической активности. 1 Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Микрофлора человека и животных и ее функции. – Грантъ. - 1998. – Т.1. – 280 с. 2 Михайлова, Т.Л., Калинская Т.Ю., Румянцев В.Г. Биопрепараты и пищевые добавки в коррекции дисбактериоза // Рос. журн. гастроэнтерол, гепатол, колопроктол. – 1999. - Т.9, №3. - С. 67-70. 3 Ishibashi N., Yamazaki S. Probiotics and safety // Am. J. of Clin. Nutr. – 2001. – Vol. 73, № 2. – P. 465-470. 4 Dunne C., O`Mahony L., Murphy L. et al. In vitro selection criteria for probiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings // American Journals of Clinic Nutrition. – 2001. – Vol. 73, № 2. – P. 386-392. 5 Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы питания. – 1999. - №2. – С. 32-40. 6 Ганина В.И., Лысенко А.М., Гурьева Ю.В., Калинина Н.Ф. Изучение антагонистической активности и идентификация бифидобактерий и молочнокислых палочек, рекомендуемых для получения продуктов лечебно-профилактического назначения и пробиотиков // Биотехнология. – 1999. – № 2. – С. 15-21. 7 Глушанова Н.А., Блинова А.И., Бахаева В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2004. - № 6. – С. 37-39. 8 Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лаб. дело. – 1986. - № 4. – С. 211-212. 9 Гизатулина С.С., Биргер М.О., Кулинич Л.И., Фиш Н.Г., Мазитова О.П., Бирюкова Н.В. Способ оценки состояния микрофлоры кишечника человека по количеству адгезивно-активных бактерий и типу адгезинов // ЖМЭИ. – 1991. – № 4. – С. 21-23. 10 Блинкова Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления // ЖМЭИ. – 2003. - № 3. – С. 109-113. 11 Parente E., Ricciardi A. Production, recovery and purification of bacteriocins from lactic acid bacteria // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1999. – Vol. 52. – P. 628-638. 12 Коваленко Н.К., Подгорский В.С., Касумова С.А. Адгезия молочнокислых бактерий к эпителию различных полостей организма человека // Микробиол. журн. – 2004. – Т. 66, №4. – С. 62-68. *** Биологиялық жəне технологиялық лактобацилла штамдарының сəйкестілігі анықталады. Үш штамнан құралатын композиция L.fermentum AK-2R, L.acidophilus AA-1, L.plantarum AP-1 жасалынды. Композицияға үш штамм кірді, олар антагонисттік белсенділігімен ерекшеленеді. Пробиотикалық консорциум қабілеттілігін кеңейтеді. *** In the result of doing work has appointed determinant biological and technological compatibly of 3 lactobacillus strains. Was composed the composition of 3 lactobacillus strains: composition L.fermentum AK-2R, L.acidophilus AA-1, L.plantarum AP-1. Strains of which differentiated for antagonistic activity was extensions in composition. It extend spectrum of consortium probiotical effect. Ж.С. Сайдсұлтанова, Л.Д. Галиева, Б.К. Тезекбаева, Д.А. Шарафутдинова, Н.П., Малахова БИДАЙДЫҢ КЛЕТКАЛЫҚ КУЛЬТУРАЛАРЫНДАҒЫ СУПЕРОКСИДДИЗМУТАЗА (СОД) ФЕРМЕНТІНІҢ БЕЛСЕНДІЛІК ДЕҢГЕЙІНЕ ҚОЛАЙСЫЗ ЖАҒДАЙЛАРДЫҢ ƏСЕРІ (М.А. Айтхожин атындағы молекулалық биология жəне биохимия институты) Жұмыста «Отан» жəне «Казахстанкая-10» бидай сорттарының R3/O, R11/K селективті линияларында СОД ферментінің белсенділік деңгейі жоғары температураның əсері маннитолдың əсерімен салыстырғанда жоғары болатындығын анықтадық. Сондай-ақ СОД антиоксидант – ферментінің белсенділігінің сараптамасын лабораториялық жағдайда бидайдың құрғақшылыққа төзімді линияларының селекциясында пайдалану мүмкіндігі қарастырылды. Антиоксиданттар тобына жататын супероксиддисмутаза (СОД) ферменті өсімдік клеткалары мен ұлпаларын тотықтандырғыштың əсерінен болатын бұзылудан қорғайтын жүйе компоненттерінің бірі болып саналады. СОД ферментінің белсенділік деңгейі құрғақшылық жəне температураның жоғарылауы сияқты жағымсыз факторлардың əсері кезінде өсімдіктің құрғақшылыққа төзімділігін көрсететін көрсеткіштердің бірі болып табылады. Осыған байланысты, біздің зерттеуіміздің мақсаты бидайдың селективті линияларының регенерант-өсімдіктеріндегі антиоксидант-фермент супероксиддисмутазаның белсенділік деңгейінің өзгеруін құрғақшылық жəне жоғары температура жағдайында бақылау болды [1, 2]. 232 Материалдар мен əдістер Жүргізілген зерттеу жұмыстарында бидайдың құрғақшылыққа төзімділік белгілері бойынша бірбіріне қарама-қарсы – орташа төзімді сорт «Отан» жəне стандарт ретінде «Казахстанская-10» сорттарының генотиптері пайдаланылды. Аталған сорттардың клеткалық линияларының селекциясы генетикалық өзгерген клеткаларды іріктеп алу принципі бойынша жүргізілді. Бидайдың бір-біріне кереғар сорттарының тозаңқабынан морфогенді каллус культуралары алынды. Алынған клеткалық культураларға in vitro жағдайында селекция жүргізілді. Іріктеліп алынған клеткалардан регенерант-өсімдіктер, яғни құрғақшылыққа төзімділік белгілері бар линиялар (R3/O, R11/K) алынды. Селективті агент ретінде маннитолдың оңтайландырылған 0,15М концентрациясы қолданылды Селекциядан өткен линиялардың 9 күндік суспензия культураларына, құрғақшылықтың негізгі факторлары болып табылатын жоғары температура (350 С) жəне жасанды осмотикалық стресс ретінде маннитолмен (0,15М) əсер еттік. Бақылау ретінде стрестік əсер алмаған суспензиялық культуралар қолданылды. Зерттеу жұмыстарына қажетті бидай суспензиялық культураларының нұсқалары стрестік əсер ету жағдайларынан кейін 24 сағат (1 тəулік), 72 сағат (3 тəулік), 168 сағат (7 тəулік), 288 сағат (12 тəулік) мезгілдік уақыттарында алынып отырды. Регенерант-өсімдіктердің қажетті нұсқалары 0,15М маннитолмен жəне температурамен (35 0С) əсер еткен соң 0,2,4,8,12,24 сағаттан (1 тəулік), 72 сағат (3 тəулік), 168 сағат (7 тəулік), 288 сағат (12 тəулік) мезгілдік уақыттарында алынды. Бақылау нұсқасы ретінде бастапқы материалдардың қалыпты жағдайда өсірілген регенерант-өсімдіктері пайдаланылды. Супероксиддисмутаза ферментінің белсенділігін анықтау үшін SOD Assay Activity Kit (Sigma Aldrich, АҚШ) жиынтығы қолданылды. Нəтижелер мен талдаулар Зерттеу нəтижесі бойынша температура жəне осмотикалық жасанды стресс əсері кезінде R3/O селективті линиясының суспензиялық клеткаларында СОД ферментінің белсенділігі 24 сағаттан кейін кенет көтеріліп, бақылау нұсқасымен салыстырғанда біршама жоғары көрсеткіштер көрсетті. Яғни, суспензиялық клеткалар стресске ұшырағанда, клеткадағы СОД ферменті белсенділігін тудырушы оттегінің белсенді формаларының құрамдық көбейюіне əкелетінін көрсетеді. 24 сағаттан соң R3/O линиясында маннитолдың əсерінен соң СОД ферментінің белсенділігі аздап төмендеп эксперимент соңына дейін сол деңгейде қалады. Аталған линияның клеткалық культурасында жоғары температура əсері кезінде СОД ферментінің деңгейі эксперимент басынан кенет көтерілді, ал 3 тəуліктен соң ең жоғарғы шектік нүктесін көрсетті (72 сағаттан соң). Зерттеу жұмысы барысында 7 тəуліктен соң супероксиддисмутаза ферментінің белсенділік деңгейінің көрсеткіші маннитолдың əсері кезіндегі көрсеткішпен теңелгенін байқадық. Құрғақшылыққа төзімділік белгісі төмен R11/K селективті линиясында жасанды осмотикалық қысыммен жəне жоғары температурамен стрестік əсер еткенде супероксиддисмутаза ферментінің белсенділік деңгейі алғашқы 24 сағаттан соң кенет көтерілетінін байқадық. Сондай-ақ, «Отан» сортының селективті линиясы R3/O-мен салыстырғанда маннитолдың əсері кезінде 3 тəуліктен соң (72 сағат) СОД ферменті өзінің белсенділігін біршама төмендетті. Бірақ та, 7 тəуліктен соң (168 сағат) суспензиялық клеткаларда СОД белсенділігі қайта көтеріліп, эксперимент соңына дейін сол деңгейде қалды. СОД ферментінің белсенділігі R11/K селективті линиясында жоғары температура əсері кезінде шектік нүктесіне 24 сағаттан соң жылдам көтеріліп, эксперимент соңына дейін қалыпты деңгейді көрсетті. Зерттеу жұмыстары кезінде байқағанымыздай, маннитолдың əсерімен салыстырғанда жоғары температураның əсерінен супероксиддисмутаза ферментінің белсенділік деңгейі біршама жоғарылайтынын анықтадық. Тəжірибелік жұмыстарымызда пайдаланылып отырған сорттардың бақылау нұсқасы ретіндегі линияларда СОД ферментінің белсенділігі біршама төмен, бірқалыпты деңгейде болды. Зерттеу жұмысымыздың барысында СОД ферментінің белсенділігін анықтау үшін бидайдың «Отан» жəне «Казахстанская-10» сорттарының селективтеу əдісімен алынған линияларының жəне калыпты жағдайда өсірілген регенерант-өсімдіктерінің 9 күндік өскіндерін пайдаландық. Орташа төзімді «Отан» бидай сортының селективті линиясының регенерант-өсімдіктеріне жасанды осмотикалық стресс пен жоғары температура əсері кезінде тəжірибе барысында СОД ферментінің белсенділігі алғашқы 2 сағатта жылдам көтерілетінін жəне бақылау нұсқасымен салыстырғанда жоғары болатынын байқадық. СОД ферментінің белсенділік деңгейі 2 сағаттан соң тез төмендеп, ал 8 сағаттан соң бақылау нұсқасындағы өсімдіктердің деңгейіне дейінгі көрсеткішке жетті. Тəжірибелік жұмысты жүргізу барысында 12 сағаттан соң СОД белсенділігі қайта жоғарылайды, бұдан 233 кейін 24 сағаттан соң фермент белсенділігінің жоғарылауының екінші шектік нүктесі байқалды. Бұл жағдайды өсімдіктің барлық бейімделу механизмдерінің іске қосылуымен түсіндіруге болады. 3 тəуліктен соң СОД белсенділігінің деңгейі кенет төмендеді жəне тəжірибе соңына дейін бақылау нұсқасы ретіндегі өсімдіктерде де белсенділік деңгейі салыстырмалы түрде бірқалыпты болып, қайта көтерілмеді. Құрғақшылыққа төзімділігі төмен «Казахстанская-10» бидай сортының селективті линияларының регенерант-өсімдіктеріндегі супероксиддизмутаза ферментінің белсенділігі «Отан» сортымен салыстырғанда тəжірибелік жұмыстың басталуынан 2 сағатқа кеш «іске қосылды». Алайда, 4 сағаттан соң тез көтерілгенін байқадық. Сынақ барысында 8 сағаттан соң СОД белсенділігінің төмендегені байқалды, ал бақылау нұсқасындағы өсімдіктерде бірқалыпты төмен көрсеткіштер байқалды. 12 сағаттан соң фермент белсенділігінің аздап көтерілгенін байқадық, тəулік өткен соң фермент белсенділігінің кенет көтерілген – екінші шектік нүктесін белгіледік. Сондай-ақ, жасанды стрестің əсерінен 72 сағаттан соң «Отан» сорты сияқты «Казахстанская-10» сортында да СОД ферментінің белсенділігі төмендейтінін жəне сол деңгейде қалатынын анықтадық. СОД ферментінің белсенділігі екі сорттың да селективті линияларының регенерант-өсімдіктерінде бақылау нұсқасымен салыстырғанда, жасанды стрестік жағдайлар кезінде біршама жоғары нəтижелер көрсетті. Екі линияны өзара салыстыра қарағанда, құрғақшылыққа төзімді R3/O линиясының регенерант-өсімдіктерінде СОД белсенділігі эксперимент басталғаннан аяғына дейін R11/K селективті линиясының клеткалық культураларымен салыстырғанда біршама жоғары болды. Жұмыс нəтижелері бойынша «Отан» жəне «Казахстанкая-10» бидай сорттарының R3/O, R11/K селективті линияларында СОД ферментінің белсенділік деңгейі жоғары температураның əсері маннитолдың əсерімен салыстырғанда жоғары болатындығын анықтадық. Сондай-ақ, СОД антиоксидант – ферментінің белсенділігінің сараптамасын лабораториялық жағдайда бидайдың құрғақшылыққа төзімді линияларының селекциясында пайдалану мүмкіндігі қарастырылды. Осылайша, тəжірибелік жұмыстар кезінде алынған нəтижелер бойынша, осмотикалық стресс пен құрғақшылық əсері кезінде бидай өсімдігінің əртүрлі өсу этаптарында СОД ферментінің белсенділігінің өзгеруі динамикасы бойынша көрсеткіштер толықтай зерттеліп, қарастырылды. Селективтеу əдісімен алынған R3/O, R11/K линияларының суспензиялық культуралары мен регенерант-өсімдіктерінде əдепкі кезден фермент белсенділігі жақсы байқалды, содан кейін тотықтыру стресі əсерінің уақытын ұзартқанда екі линияда да СОД белсенділігі төмендеп белгілі уақыт аралығында қайта жоғарылады. Бұл алынған селективті линиялар мен бақылау нұсқасы өсімдіктері мен антиоксидант – ферментінің белсенділігі араларындағы арақатынас айырмашылығының бар екенін көрсетеді. Құрғақшылық белгілері əртүрлі селективті линиялардың регенерант – өсімдіктеріндегі СОД ферментінің өзгерістерін бақылау кезінде алынған нəтижелерді талдай отырып, келесідей тұжырым жасалды, яғни, алынған R3/O жəне R11/K құрғақшылыққа төзімді линиялары бақылау нұсқасымен салыстырғанда СОД белсенділігінің біршама жоғары деңгейімен ерекшеленді, бұл дегеніміз біздің жұмыстарымыздың нəтижесінде алынған линияларда қорғаныс жүйесінің біршама жоғары деңгейде екенін жəне қоршаған ортаның стрестік жағдайларында тиімді қызмет атқаруына мүмкіндік беретін əрі оттегінің белсенді формаларын тежейтін белсенді клеткаларының жұмысымен ерекшеленеді. 1 Гирко В.С., Волощук С.И., Залисский А.А., Руденко Т.П. Оценка устойчивости пшеницы к действию культуральных фильтратов грибных патогенов в культуре незрелых зародышей // Сельскохозяйственная биология. - 1993. - № 1. - С.62-69. 2 Калашникова Е.А. Клеточная селекция растений на устойчивость к грибным болезням - Дисс. докт. биол. наук. - М., 2003. - С. 282. Д.Табыс, Р.У. Бейсембаева, Т.А. Карпенюк, А.В. Гончарова ТОПЫРАҚ МИКРООРГАНИЗМДЕРІН АРАХИДОН ҚЫШҚЫЛЫНЫҢ КӨЗІ РЕТІНДЕ ЗЕРТТЕУ (Əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті, биотехнология кафедрасы) Жұмыста Arthrobacter (4-1ГПД) и Mycobacterium (8-2ГПД) штамдарының арахидон қышқылын өндірушісі болатындығы жайлы зерттеу нəтижелері көрсетілген. Полиқанықпаған май қышқылдары биологиялық маңызды жүйелерде қажетті роль атқаратын органикалық заттар класы болып табылады. Жақынғы жылдарда жүргізген зерттеулер олардың тірі организмдегі функциясының кең спектрін ашты. Полиқанықпаған май қышқылдары клеткаларда, 234 ағзада өтетін процестердің төмен молекулалы реттегіштерінің түзілуіне əкелетін липооксигеназа немесе циклооксигеназалардың биотрнсформациясының алғы заты. Полиқанықпаған қышқылдары маңыздыларының бірі арахидон қышқылы болып табылады. Арахидон қышқылы простагландиндердің, лейкотриндердің жəне тромбоксандардың алғы заты ретінде қызмет атқарады [1]. Арахидон қышқылдары негізінен қолданылады: Фармокология (жүрек, қан-тамыр жүйесінің, бауыр ауыруларының əртүрлі емдік жəне алдын алу препараттарының алғы заты ретінде); косметика өндірісінде (F витаминінің негізінде тері күтіміне арналған құралдар алуда); тағам өнеркəсібі (əртүрлі азық түлік өнімдерін байыту, соның ішінде балаларға арналған жасанды сүт қоспалары т.б.); ауыл –шаруашылығы (өсімдіктердің өсуінің жəне қорғаныс реакциясының жоғары эффективті реттегіштері) т.б. Қазіргі күні арахидон қышқлылы биотехнологиялық жолмен алу қиындық тудыруда, ең жақсы зертханалық жағдайда алынған арахидон қышқылы шығымы 13г/л (Жапония), 6г/л (Ресей, АҚШ, Полша т.б.) осыған байланысты арахидон қышқылдары продуценттерін іздеу жəне құрастыру жəне солардың негізінде биотехнологиялық тиімді жолмен алу өзекті мəселе болып табылады [2]. Давлетбаев И.М. қатарлы зерттеушілер 840 тан аса саңырауқұлақ штамдарының скрингі жүргізіп, Mortierella alpina штамын арахидон қышқылының көзі ретінде өндіріске ұсынылды. Бұл штамның липидтер құрамындағы арахидон қышқылы мөлшері 55% болған [3]. Осыған негізделгенде, топырақ микроорганизмдерінің аспирин сезімтал штамдары арахидон қышқылының көзі ретінде болуы мүмкін. Бұл жұмыста топырақ микроорганизмдер скрингін жасап, аспирин сезімтал штамдарды табу көзделеді. Зерттеу əдістері Зерттеу нысандары ретінде 10 түрлі бактериялар штамдары, Pseudomonas (10-2гпд, 9-3 гпд, 2-5 гпд, 1-5 гпд ), Arthrobacter (4-1 гпд, 2-2 гпд), Mуcobacterium (8-2 гпд, 4-3 гпд,), Rhodococcus (1-1 гпд,3-2 гпд) мясо-пептон агарлы (МПА) ортада 370C термостатта өсіріледі. Барлық штамдар биотехнология кафедрасының банкынен алынды. Аспирин бар ортада топырақ микроорганизмдер скрингін жасау. Продуценттер скрингі үшін Ерошин В.К. ұсынған əдісі қолданылды [4]. Əр түрлі бактерия штамдары мясо-пептон агарлы (МПА) ортада өсіріледі. Ортаны дайындау барысында ортаға 3 түрлі концентрацияда (0,42г/л, 0,84г/л, 1,68г/л) аспирин қосылды. Орталар дайындалып автоклавтанады. Стерильді жағдайда орталар Петри табақшаларына құйылады. Орта қатқаннан кейін бактериялар штамдары егіледі. 3 тəулік бойы 370C термостатқа қойылып, бактерия штамдарының аспиринді ортада өсу деңгейі бақыланады. Контоль ретінде бактериялар тек қана МПА ортасында өсіріледі [4]. Микроорганизмдер өсуіне рН əсерін зерттеу. Бактериялар өсу деңгейіне рН əсерін зерттеу үшін МПА қоректік ортасының рН өлшенеді. Үш түрлі концентрациядағы (0,42г/л, 0,84 г/л, 1,68 г/л) аспирин қосылған орталардың рН тексеріледі жəне əрқайсы концентрацияның əсерінен өзгерген рН мөлшеріне тең етіліп əрбіреуіне контроль дайындалады, өсу деңгейі бақыланады. Мембраналық фракцияны алу. Бактерия клеткаларының мембраналық фракцияларын алу үшін сүйық ортада (МПБ ортасында) өсірілген бактериялар суспензиясы центрифугаланғаннан кейін (5000 айн./мин 15 минут) тұнба түседі. Тұнбаға 2-3 мл рН 8,2 трис-HCl құйылады, сұйық азотта (1960C) тез қатырылады да тез ерітіледі, бактериялар жасушалары жарылады, содан кейін 2-3 мл рН 8,2 0,1М трис-HCl қосылады. Суспензия 1-2 сағатқа 40С температураға қойылады. Мембраналық фракцияның пероксидазды белсенділігі зерттелінеді. Мембраналық фракцияның пероксидазды белсенділігін анықтау. Пероксидазды белсенділігін спектрофотометрлік əдіспен анықталынады. Реакциялық қоспаның құрамына мембраналық фракцияның суспензиясы (100 мкл), гваякол, гемин, сутегінің қос тотығын қосылып 0,1М pH 8,2 трис-HCI буфер ерітіндісімен 3мл-ге жеткізіледі. Содан кейін пероксидазды белсенділігін тетрагваякол мөлшеріне байланысты анықтаймыз. Тетрагваякол мөлшерін анықтау үшін толқын ұзындығы 470 нм-де ерітіндінің жұтылуы өлшенеді [5,6]. Мембраналық фракцияның пероксидазды белсенділігіне PGH -синтаза тежегіштерінің əсерін зерттеу. 100мкл мембраналық суспензиясына аспириннің немесе индометациннің əр түрлі мөлшерін (0-30 мМ) қосылып, 15 минут 370С инкубацияланады, содан кейін қоспаға гваякол, гемин, сутегінің қос тотығын (90мМ) қосып, пероксидазды белсенділігі спектрофотометрлік əдіс арқылы анықталады. 235 Зерттеу нəтижелері Бактериялардың аспириннің əсерінен өсу деңгейі зерттелінді, нəтижесінде аспириннің əр түрлі концентрациясында (0,42г/л, 0,84г/л, 1,68г/л) өсірілген Pseudomonas (10-2гпд, 9-3 гпд, 2-5 гпд, 1-5 гпд ), Arthrobacter (4-1 гпд, 2-2 гпд), Mуcobacterium (8-2 гпд, 4-3 гпд,), Rhodococcus (1-1 гпд,3-2 гпд) қатарлы бактерия штамдарын зерттеу барысында аспирин сезімтал штамдары анықталынды. Барлық штамдардың өсуі ортада 0,42г/л аспирин болғанда бактериялар өзгермей өседі. Аспириннің 1,68г/л концентрациясында өсу тежеледі. Сондықтан, аспириннің 0,84г/л концентрациясы штамдарға əсерінің негізгі белгісі ретінде алынады. Штамдардың аспириннің 0,84г/л концентрациясында өспеуі олардың аспиринге сезімтелдығына байланысты деп санаймыз (Сурет 1). Зерттелінген Pseudomonas барлық штамдарына, Arthrobacter (2-2 гпд), Rhodococcus (1-1ГПД) штамдарының өсуіне аспирин əсері байқалмады. Arthrobacter (4-1ГПД), Rhodococcus (3-2ГПД), Mуcobacterium (4-3ГПД), Mуcobacterium (8-2 ГПД) аспиринге сезімтал болады. тек МПА ортасында өскен бактериялар МПА ортасына 0,84 г/л АСПИРИН қосылған 1.1 Arthrobacter (4-1ГПД) штамының өсуіне аспириннің əсері МПА ортасында өскен МПА+0,84 г/л Аспирин бактериялар 1.2 Rhodococcus (3-2ГПД) штамының өсуіне аспириннің əсері МПА ортасында өскен бактериялар (МПА+0,84 г/л Аспирин) 1.3 Mуcobacterium (4-3ГПД) штамының өсуіне аспирин əсері тек МПА ортасында өскен МПА ортасына 0,84 г/л АСПИРИН бактериялар қосылған (МПА+0,84 г/л Аспирин) 1.4 Mуcobacterium (8-2 ГПД) штамының өсуіне аспирин əсері Сурет 1 - Аспириннің бактериялар штамдарының өсуіне əсері 236 МПА ортысының рН-ін (аспиринсіз) 6,5 жəне 6,2-ге дейін жеткізіліп, сəйкесінше аспирин қосылған орталардағы бактериялар өсуімен салыстыру жүргізілді. Нəтиже рН өзгеруі бактериялар өсуіне ешқандай əсері болмағанын көрсетті . Ферментативті зерттеулерді өткізуге қажет бактерия штамдарының жеткілікті көлемін алу үшін аспиринге жоғары сезімтал болған Mucobacterium (4-3ГПД, 8-2 ГПД), Rhodococcus (3-2ГПД), Arthrobacter (4-1ГПД) штамдары сұйық суспензия ортада (МПБ ортасы) 48 сағат үздіксіз тербелісте өсірілді. МПА ортасының аспирин мөлшері артқан сайын рН көрсеткіші төмендейді (қышқылданады) (Кесте 1). Сондықтан бактериялардың өсуіне рН мəнінің əсері тəуелділігн зерттелінді. Кесте 1 Аспирин қосылған орталардың рН мəні өзгерісі № МПА ортасы жəне ортадағы аспирин мөлшері рН мəні 1 Контоль (тек МПА ортасы) 7,4 2 МПА+0,42г/л аспирин 7 3 МПА+0,84г/л аспирин 6,5 4 МПА+1,68г/л аспирин 6,2 Əдебиет көздерінде келтірілгендей, арахидон қышқылының синтезіне жауапты негізгі ферментPGH-синтаза ядро, эндоплазмалық тор, Гольджий аппаратының мембраналарымен байланысқан түрінде болады. Сондықтан бактерия штамдарының мембраналық фракциясы бөлініп алынып пероксидазды белсенділігі зерттелінді. Арахидон қышқылы PGH-синтазаның негізгі субстраты, PGH-синтаза-ның пероксидазды жəне циклооксигеназды орталығы болады. PGH-синтаза пероксидазды белсенділігін анықтау үшін сутек қос тотығы субстрат ретінде пайдаланылады, PGH-синтазаның циклооксигеназды орталығы арахидон қышқылының орнына сутек қос тотығын қосқанда өзінің жұмысын тоқтатады, бұнда сутегінің қос тотығы PGH2- нің аналогы ретінде пайдаланылады. PGH-синтаза пероксидазды белсенділікті катализдейді: сутек қос тотығының қатысумен əр түрлі электрон қабылдағыштарды тотықтырады. Пероксидазды реакция PGH-синтазаның əсері механизімінің бір бөлігі болып табылады. Ол 15 гидрототық тобын тотықсыздандырып, PGG2-ді PGH2ге айналдырады. Реакция барысында пероксидазды белсенділігіне байланысты гваякол тетрагваяколға айналады, түзілген тетрагваяколдың мөлшеріне ерітіндінің жұтылу тығыздығы тура пропорционалды. Арнайы зерттеу жүргізү арқылы, мембранамен байланысқан ферменттік жүйенің пероксидазды белсенділігін анықталынды. Бактериялар штамдарының мембраналық фракциясының пероксидазды белсенділігі тетрагваякол мөлшерінің 30 минут аралығында түзілген түрінде көрсетеміз (Кесте 2). PGH-синтаза ферментінің ерекше тежегіштері болады. Атап айтсақ, аспирин, индометацин, аналгин т.б. Бұлар стероидты емес қабынуға қарсы бағытталған заттар болып табылады. Олар басқа пероксидазалардың белсенділігін тежемейді. [7]. Бактериялар клетка мембранасының пероксидазды белсенділігі PGH-синтазаға немесе басқа мембранамен байланысқан басқа ферменттерге байланысты ма, соны анықтау үшін Mуcobacterium ( 82ГПД), Arthrobacter (4-1ГПД), Rhodococcus (3-2ГПД) штамдарына мембранамен байланысқан пероксидазды белсенділігіне арнйы тежегіштер аспирин жəне индометацин əсері зерттелінді. Кесте 2 Мембранамен байланысқан ферменттік жүйенің пероксидақды белсенділігі Бактериялар штамдары пероксидазды белсенділігі Arthrobacter (4-1ГПД) штамы 0,430±0,06 Rhodococcus (3-2ГПД) штамы 0,321±0,07 Mуcobacterium (8-2 ГПД) штамы 0,720±0,05 Arthrobacter (4-1ГПД) штамының мембраналық фракциясының пероксидазды белсенділігі аспирин əсерінен толық тежелді (сурет 2). Arthrobacter (4-1ГПД) штамының пероксидазды белсенділігі 0,430±0,06 ға тең, аспирин қосқан кезде белсенділігі төмендеді. Аспирин мөлшері жоғарылаған сайын фермент белсенділігінің тежелуі жоғарылайды. Аспириннің концентрациясы 30 мМ болғанда толық тежелді. Алынған нəтиже Arthrobacter (4-1ГПД) штамының мембранасымен 237 байланысқан PGH-синтазаның бар болуы мүмкін екендігін көрсетеді. Индометацин əсерінен пероксидазды белсенділігі тежелмейді. Сурет 2 - Arthrobacter (4-1ГПД) штамының мембраналық фракциясының пероксидазды белсенділігіне аспирин жəне индометацин əсері Сурет 3 - Mycobacterium (8-2ГПД) штамының мембраналық фракциясының пероксидазды белсенділігіне аспирин жəне индометацин əсері Mycobacterium (8-2ГПД) штамының клетка мембранасының пероксидазды белсенділігі де аспириннің əсерінен тежеледі (сурет 3). Аспириннің əсеріне түспеген бактериялардың мембраналық фракциясының пероксидазды белсенділігі 0,720±0,05 тең, аспирин қосылғанда пероксидазды белсенділік 0,689±0,05 – 0 аралығында өзгерді. Аспирин концентрациясы жоғарылаған сайын мембраналық фракцияның пероксидазды белсенділігі төмендеген. Индометацин бұл штамға əсерін көрсете алмады. Rhodococcus (3-2ГПД) штамының мембраналық фракциясының пероксидазды белсенділігі аспирин əсерінен тежелмейді (сурет 4). 238 Сурет 4 - Rhodococcus (3-2ГПД) штамының мембраналық фракциясының пероксидазды белсенділігіне аспирин əсері Сонымен, Аспирин сезімтал Arthrobacter (4-1ГПД), Mycobacterium (8-2ГПД) штамдары арахидон қышқылының продуценттік көзі ретінде болуы мүмкін деп қорытындыланды. 1 Harrison K. Arachidonic acid’s Molecule http: //www. 3dchem. com/molecules. asp?ID=378# 2 Kenichi Higashiyama, Shigeaki Fujikawa, Enoch Y. Park, Sakayu Shimizu. Production of Arachidonic Acid by Mortierella Fungi// Biotechnol. Bioprocess Eng.- 2002.-7: 252-262. 3 Давлетбаев И.М., Петухова Н.И., Зорин В.В. Скрининг низших грибов – потенциальных продуцентов незаменимых полиненасыщенных жирных кислот.// Башкирский химический журнал – 2000. –Т.7.-№5.-С.40-42. 4 Ерошин В.К., Дедюхина Э.Г., Чистякова Т.И., Желифонова В.П., Ботаст Р.Дж. Исследование синтеза арахидоновой кислоты грибами рода Mortierella: микробиологический метод селекции продуцентов арахидоновой кислоты // Микробиология. - 1996- Т. 65- №1.- С. 31-36. 5 Malkowski M.G., Ginell S.L., Smith W.L. and Garavito R.M. The productive conformation of arachidonic acid bound to prostaglandin synthase // Scinece.-2002.-Vol.289.-p.1933-1937. 6 Варфоломеев С.Д., Мевх А.Т. Простагландины – молекулярные биорегуляторы. – М.: МГУ, 1985. – 308бет. 7 Vane J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs. Nat New Biol 1971;231:232-5. *** Экспериментальные исследования показали, что штамы Arthrobacter (4-1ГПД) и Mycobacterium (8-2ГПД) могут быть продуцентамы арахидоновый кислоты. *** The experimental research shows that, the aspirin sensitive Arthrobacter (4-1ГПД) and Mycobacterium (8-2ГПД) strains are maybe source of arachidonic asid. С.М. Тайпакова, А.Б. Жанаева, А.К. Бисенбаев КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ кДНК ЭНДО-Β-1,4-ГЛЮКАНАЗЫ ГРИБА ASPERGILLUS NIGER В E. coli И ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА (ДГП «Научно-исследовательский институт проблем биологии и биотехнологии» КазНУ им. альФараби, Алматы, Казахстан) Эндо-β-1,4-глюканаза (EG) является одним из ключевых ферментов целлюлазного комплекса, ответственного за гидролиз аморфных волокон целлюлозы. кДНК EG из гриба Aspergillus niger был клонирован в клетках Е. coli. Методика клонирования включала получение и амплификацию кДНК гена с помощью ПЦР со cпецифическими праймерами. Продукт ПЦР был клонирован в векторной плазмиде Е. coli под контролем промотора фага Т7. Показана экспрессия гена eng1 в клетках рекомбинантного штамма E. coli. Исследованы некоторые физико-химические свойства EG. Рекомбинантный белок обладал максимальной активностью при 500С и рН 6.0. В настоящее время основа процесса биоконверсии растительной биомассы состоит в ферментативном гидролизе целлюлозы до глюкозы с последующим сбраживанием ее в этанол или получении иных продуктов микробного синтеза [1]. Целлюлолитические ферменты применяются в форме мультиферментных композиций в составе премиксов к кормам животных и птиц для 239 деструкции не крахмальных полисахаридов. Целлюлазы также активно используется в качестве добавок к детергентам и моющим средствам. Кроме этого целлюлазы применяются для обработки текстильных изделий и материалов для биополировки трикотажа и изделий на основе хлопчатобумажных и смесовых тканей [2]. Широкое практическое применение целлюлолитических ферментов в определенной степени ограничивается их природой, поскольку целлюлазные препараты, полученные из природных штаммов, как известно, представляют собой комплекс различных ферментов, имеющих зачастую довольно низкие специфические активности. Кроме того, при реальном применении целлюлаз зачастую возникает необходимость использования больших количеств фермента, чтобы достичь желаемого результата. Продуктивность же природных штаммов целлюлолитических грибов и бактерий, во многих случаях, слишком мала для промышленного получения целлюлаз. В связи с этим клонирование генов, кодирующих целлюлаз и повышение экспрессии их генов с использованием сильных и регулируемых промоторов, а также изучение свойств целлюлолитических и сопутствующих им ферментов, является задачей, имеющей большое научное и практическое значение. Глубокая деструкция целлюлозы с образованием растворимых сахаров осуществляется под действием полиферментной системы целлюлаз, включающей в себя эндо-1,4-β-глюконазы (КФ 3.2.1.4), экзо-1,4-β-глюконазы (КФ 3.2.1.91), экзо-1,4-β-глюкозидазы (КФ 3.2.1.74) и целлобиазы (КФ 3.2.1.21). Свойства индивидуальных ферментов, а также их взаимодействие в составе целлюлазного комплекса определяют его эффективность при гидролизе целлюлозосодержащих субстратов [3]. Эндо-1,4-β-глюканазам пренадлежит важнейшая роль в действии полиферментных систем. Они первыми атакуют целлюлозу, гидролизуя внутренние β-1,4-гликозидные связи, удаленные от концов полимерной цепи целлюлозы (а так же лихенина, β-глюкана злаков, карбоксиметилцеллюлозы) с образованием целлоолигосахаридов и моно- ди- и трисахариды [1]. Ранее нами выделены кДНК гены целлобиогидролазы І и целлобиогидролазы ІІ гриба L. edodes с применением реакции обратной транскрипции (РОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР). Методом тандемной масс-спектрометрии с последующим поиском в белковых базах данных установлено принадлежность рекомбинантных белков 7-й и 6-й семействам гликозид-гидролаз. Показана экспрессия генов целлобиогидролаз CEL7A [4] и CEL6В [5] в клетках рекомбинантного штамма E. coli. В настоящей работе мы предлагаем результаты клонирования и экспрессии гена eng1 гриба Aspergillus niger в Е. сoli. Материалы и методы Материалы Ферменты рестрикции, T4 ДНК-лигаза и Tag ДНК-полимераза фирмы Fermentas Life Sciences (Германия). Плазмидную ДНК выделяли с использованием набора High Pure Plasmid Isolation Kit, фрагменты ДНК очищали набором Agarose Gel DNA Extraction Kit (Roche Diagnostics GmbH. Германия). Все другие химические вещества и реактивы были аналитически чистыми и поставлены Sigma-Aldrich Corp (США). Для экспрессии использовали вектор pET11d (Invitrogen, США). Штамм E. coli DH5a использовали для наработки плазмиды. Штамм E.coli Rosetta (DE3) (Invitrogen, США) использован для экспрессии рекомбинантной EG. Получение и амплификация кДНК гена с помощью ПЦР Разработку олигонуклеотидных праймеров для амплификации гена проводили на основе данных о первичной структуре кДНК eng1 гриба Aspergillus niger, имеющихся в электронной базе данных GenBank (GenBank регистрационный номер AF331518) [6]. Нуклеотидные последовательности этих праймеров приведены ниже: Dir 5’- CGCTCTAGATGAAGTTTCAGAGCACTC, Rev 5’GACCGGATCCTCAAAGATATGC CTCCAGG. Подчеркнутые нуклеотиды соответствуют сайтам рестрикции Xba1 и BamH1, соответственно. Конструирование рекомбинантной плазмиды и экспрессия белка Продукт ПЦР и вектор pET11d гидролизовали рестриктазами Xba1 и BamH1 по фланкирующим ген сайтам рестрикции при 37°C в соответствии с протоколом производителя. Продукты рестрикции лигировали с помощью Т4-лигазы при 4оС в течение ночи. Далее рекомбинантный вектор pET11d/eng1 был трансформирован в компетентные клетки E.coli Rosetta(DE3). Для переноса генетического материала использовался метод электропорации и ячейки фирмы Eurogentec на аппарате BioRAD Gene Pulser. Селекцию трансформантов проводили на чашках с LB в присутствии ампициллина. Несколько колоний, отобранных на селективной среде, в течении ночи выращивались в 20 мл LB-среды с 240 ампицилином в концентрации 200 мкг/мл при +37°C и 180 rpm. Затем ночная культура вносилась в большой объем LB-среды (1литр) с ампицилином (100 мкг/мл). При достижении культурой выращенной при температуре 30°C OD600 = 0.4-0.6, в среду был добавлен изопропил-тио-галоктозид (ИПТГ) в конечной концентрации 0,2мМ для индукции экспрессии рекомбинантного гена. Сбор бактерий осуществляли центрифугированием при 6000xg в течение 7 мин при +4°C. Осажденные клетки ресуспендировали в буфере для хранения (20мМ HEPES рН-7,6 c 40 мM NaCl) и лизировали соникированием в течение 20 секунд при мощности 14мА, до получения прозрачного лизата. Соникированная смесь центрифугировалась при 14 000хg в течение 10 мин для удаления клеточных остатков и надосадочная жидкость была использована в качестве источника рекомбинантного белка. О наличии индуцируемой экспрессии гена eng1 судили с помощью ДСН-ПААГ электрофореза, иммуноблотинга и определения активности фермента. Определение рН и температурных зависимостей активности белка Ферментативную активность определяли с использованием карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в качестве субстрата. Концентрацию восстанавливающих сахаров в растворе регистрировали спектрофотометрически методом Шомоди-Нельсона [7,8]. Определение рН-оптимума активности ферментов проводили измерением ферментативной активности в диапазоне значений рН от 4 до 9, с шагом 1 единиц рН. Для определения рН зависимости были использованы: натрий ацетатный буфер pH 4-6, натрий фосфатный буфер pH 7-8 и глицинный буфер pH 9.Изучение зависимости активности ферментов от температуры проводили измерением ферментативной активности при различных значениях температуры в диапазоне 30-70°С в рН-оптимуме действия ферментов. Результаты измерений отображали в единицах ферментативной активности. За единицу активности целлобиогидролазы принимали количество фермента, которое образует 1 мкМ восстанавливающих сахаров за 1 мин на 1 мг тотального белка. Содержание белка в образцах определяли по методу Бредфорда, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин (БСА) [9]. Для спектрофотометрических измерений использовали спектрофотометры PD-303UV фирмы «Apel». Результаты и обсуждения Для выделения гена кодирующей EG нами были конструированы две олигонуклеотидных праймера на основе данных о первичной структуре кДНК eng1 A. niger, имеющихся в электронной базе данных GenBank (GenBank регистрационный номер AF331518) [6]. С помощью ПЦР со специфическими праймерами на матрице рекомбинантной плазмиды YEpGAP/eng1 любезно предоставленной коллегами с Киотского университета (Kyoto University, Kitasiragawa, Kyoto, Japan был амплифицирован один фрагмент ДНК размером около 1000 п.н. (рис. 1). ПЦР-продукт обрабатывали рестриктазами XbaI и ВатHI по фланкирующим ген рестриктным сайтам и клонировали в обработанный теми же рестриктазами вектор pET11d, который обладает необходимыми для экспрессии генов сильным, lac индуцибельным, селективным промотором бактериофага Т7. Продукты рестрикции векторной ДНК и кДНК гена eng1 лигировали с помощью лигазы фага Т4. Полученный рекомбинантный вектор - pET11d/eng1 - трансформировали в E.coli. Клоны были секвенированы в обоих направлениях. Секвенирование нуклеотидной последовательности клонированного гена eng1 показало полное совпадение с нуклеотидной последовательностью eng1 A.niger опубликованной ранее [6]. М: ДНК маркер (п.н.); 1,2- ПЦР-продукты кДНК гена eng1 Рисунок 1- Электрофорез продукта ПЦР Поиск белков, гомологичных изучаемой эндоглюканазе, на основе транслированной нуклеотидной последовательности с помощью BLAST на веб-сайте NCBI, показал, что клонированный 241 кДНК ген eng1относится к 5А семейству гликозид-гидролаз. Гомологи EG найденные путем выравнивания аминокислотных последовательностей белка с ферментами, для которых известны их первичные структуры приведены в таблице 1. Как видно из данных, представленных в таблице 1, аминокислотная последовательность транслированная на основе нуклеотидной последовательности клонированного нами гена eng1 показывает высокую степень гомологии к известным грибным целлюлазам, относящимся к 5А семейству гликозид-гидролаз. Эти данные указывают на высокую степень гомологии аминокислотной последовательности клонированного нами гена eng1 известным грибным эндоглюконазам, относящимся к 5А семейству гликозид-гидролаз. Она на 99% идентична эндоглюканазе В гриба Aspergillus kawachii, на 80 % целлюлазе Neosartorya fischeri NRRL 181 и 74 % идентичность наблюдается эндоглюканазе Thermoascus aurantiacus var. levisporus. Таблица 1 Значения blastp анализа для eng1 кДНК гриба гриба A.niger Регистрационный Организм и ген Score E-value Идентич ность номер Genbank (%) 626 0.0 99% Endo-beta-1,4-glucanase B Aspergillus kawachii XP_001257866.1 Cellulase 491 6e-170 80% Neosartorya fischeri NRRL 181 446 AAL88714.2 Endo-beta-1,4-glucanase 6e-151 74% Thermoascus aurantiacus AAL33630.2 Endoglucanase 415 5e-140 68% Talaromyces emersonii Для подтверждения того, что ген eng1, кодирует эндогдюканазу, мы использовали экспресионный штамм E.coli. Rosetta (DE3). Штаммы E.coli Rosetta (DE3) созданы на основе штамма BL21 lacZY для увеличения экспрессии эукариотических белков, содержащих редко используемые E. coli кодоны. Эти штаммы содержат гены тРНК к следующим кодонам: AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA в устойчивых к хлорамфениколу плазмидах. Трансформация компетентных клеток E.coli продуктом лигирования вектора pET11d и ампликона eng1 гена A. niger дала более 38 колоний, среди которых 8 отдельных клонов были отобраны. Все выбранные колонии были проанализированы с помощью ПЦР и рестрикционного анализов на наличие рекомбинантных плазмид, несущих ген eng1. Плазмидная ДНК была выделена и очищена в соответствии с протоколом набора High Pure Plasmid Isolation Kit и обрабатывалась рестрицирующими эндонуклеазами XbaI и BamHI. Продукты рестрикции ДНК анализировали электрофорезом в 0,8% агарозном геле. Из рисунка 2A видно, что при рестрикции эндонуклеазами выщепляются фрагмент с длиной приблизительно 1 т.п.н., что соответствует длине eng1, и фрагмент в 5,7 т.п.н., соответствующий вектору. Q96WQ8 А Б А - Рестрикционный анализ рекомбинантной плазмиды pET11d/ eng1; Б - ПЦР анализ рекомбинантной плазмиды pET11d/ eng1; М: ДНК маркер; 1-4 клоны. Рисунок 2- Анализ клонов трансформированных pET11d/eng1 штаммов E.coli на наличие рекомбинантной плазмиды 242 С использованием ген специфических праймеров нами были проведены ПЦР анализ плазмидных ДНК, выделенных из трансформантов. Фрагмент, обнаруженный в результате агарозного гельэлектрофореза по длине соответствовала клонированному гену eng1 (рис. 2B), что указывает на то, что проанализированные колонии содержат плазмиды несущие соответствующий ген. В результате отбора мы идентифицировали пять клонов, несущих рекомбинантную плазмиду. Экспрессию гена eng1 в трансформированных клетках выявляли с помощью ДСН-ПААГ электрофореза, а также путем определения активности фермента. После индукции в присутствии ИПТГ в течение 4-12 часов клетки лизировали и белковые образцы были приготовлены для ДСН-ПААГ электрофореза, кипячением в 2x образцовом буфере. Данные ДСН-ПААГ электрофореза показали белковые полосы с молекулярной массой 30 кДа. Аналогичная белковая полоса не обнаруживалась в экстрактах клеток, несущих pET11d без вставки (рис. 3). M – Маркер; 1 – клеточный экстракт E. coli несущий пустой вектор pET11d; 2-3- клеточный экстракт E. coli несущий pET11d/eng1 после 12 h инд. с ИПТГ Рисунок 3- Экспрессия кДНК гена EG гриба A. niger в E. coli Известно, что для большинства известных в настоящее время ферментов определен оптимум рН и температуры, при которых они обладают максимальной активностью. А Б П р и м е ч а н и е: А - рН оптимум был определен при разных значениях рН (натрий ацетатный буфер (рН 4-6), натрий фосфатный буфер (рН 6-7) и глициновый буфер (рН 9)); Б - Температурный оптимум был определен в буфере с оптимальным значением рН. Рисунок 4 - Влияние рН и температуры на активность рекомбинантного белка EG Определение зависимости активности фермента от рН реакционной смеси проводили с использованием КМЦ качестве субстрата. Для этого экстракт E. coli несущий pET11d/eng1 после 12 ч индукции с ИПТГ инкубировали при 50 оС в течение 1 ч при различных рН. Результаты исследования показали, что рекомбинантный фермент проявляет оптимальную активность при рН 6. При этом необходимо отметить, что значительная активность сохранялась и при высоких значениях рН (рисунок 4A). Температурный оптимум этого фермента определяли путем инкубации реакционной смеси в 0,05М фосфатного буфера натрия (рН 6,0) в течение 1 ч при различных температурах (30-70 оС). 243 Результаты исследования показали, что рекомбинантный фермент проявляет оптимальную активность при 50 оС (рисунок 4B). 1.Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазое В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. МГУ, 1995. 2.Эрнст Л., Лаптев Г. Ферменты улучшают переваривание клетчатки // Животноводство России. -2006. -№10. -С. 36-38. 3.Miyamoto K. Renewable biological systems for alternative sustainable energy production // Food & Agriculture Org., -1997. 108p. 4.Taipakova S.M., Smailov B.B., Stanbekova G., Bissenbaev A. K. Cloning and expression of Lentinula edodes cellobiohydrolase gene in E. coli and characterization of recombinant enzyme // Journal of Cell and Molecular biology.-Turkey, 2011. -Vol. 9. -№1. -P.53-63. 5.Taipakova S.M., Stanbekova G., Ischenko A., Saparbaev M., Bissenbaev A.K Cloning and expression of Lentinula edodes cellobiohydrolase CEL6B gene in E. coli // International Journal of chemistry and biology. -2011. -№1.-С.19-26. 6. Hon J., Tamaki H., Akiba S., Yamamoto K., Kumagai H. Cloning of Gene Encoding a Highly Stable Endo-β-1,4-Glucanase from Aspergillus niger and Its Expression in Yeast // J. BIOSCI. BIOENG.- 2001.Vol. 92.-P. 434-441. 7. Nelson NJ. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of glucose // J Biol Chem. -1944. -Vol.153. –P. 375-380. 8. Somogyi M. Notes on sugar determination // J Biol Chem. -1952. –Vol.195. –P. 19-23. 9. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein using the principle of protein–dye binding // Anal Biochem. -1976. –Vol.72. –P. 248-252. *** EG enzymes are key components in fungal cellulase systems, and their functional activity is critical for hydrolysis of crystalline cellulose. The EG cDNA from A.niger was cloned into E. coli. The method of cloning consisted gene amplification with specific primers. The product of PCR was cloned into E. coli vector plasmid under control of T7 promoter. We showed expression of eng1 gene in E. coli recombinant strain and examined some properties of the recombinant protein. It showed maximal activity at 500C and pH 6.0 *** Эндо-β-1,4-глюканаза EGаморфты целлюлозаның гидролизіне жауапты целлюлазалық кешен ферменттерінің маңызды құрамдас бөлігі болып табылады. Aspergillus niger саңырауқұлағының EG кДНҚ молекуласы Е. coli клеткасында клондалды. Клондау əдісі сайт спецификалық праймерлерді қолдану арқылы ПТР əдісі көмегімен кДНК молекуласын амплификациялау арқылы жүзеге асырылды. ПТР өнімі Т7 фагы промоторы бақылауында pET11d векторында клондалды. E. Coli клеткасының рекомбинантты штаммында eng1 генінің экспрессиясы көрсетілді. ENG1-ның кейбір физико-химиялық қасиеттері зерттелді. Рекомбинантты белок 500 С жəне рН6.0 максималды белсенділік көрсететіні анықталды. Л.П. Треножникова, С.А. Айткельдиева, А.Х. Хасенова, С.Ш. Шакиев, Г.Д. Ултанбекова, А.К.Саданов ПЕРСПЕКТИВЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭКСТРЕМОФИЛЬНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В КАЗАХСТАНЕ (Институт микробиологии и вирусологии КН МОН РК) В работе изучены антагонистические свойства актиномицетов из солончаковых почв Алматинской области в нейтральных, соленых и щелочных условиях жизнедеятельности продуцентов. В течение долгого периода ученые изучали разнообразие микроорганизмов в наиболее привычной нейтральной среде, а также, их выделение, исследование их свойств и образование ими природных биологически активных веществ было связано с нейтральными условиями. С нейтральными условиями связано и открытие современных природных антибиотиков, широко используемых в медицине для лечения инфекций различных этиологий. Однако разнообразие природной среды на нашей планете дает возможность предположить существование иных типов взаимоотношений в экстремальных местообитаниях микроорганизмов. Широкое распространение резистентных возбудителей инфекций, «открытие» уже известных антибиотических веществ, заставляет расширять границы скрининга, меняя его методы и источники получения новых перспективных биологически активных веществ. Поэтому необычные природные субстраты, экстремальные экосистемы являются в настоящее время наиболее востребованными источниками исследования, именно из них можно ожидать выделения новых микроорганизмов с уникальными свойствами. Морская среда, почвы с высоким уровнем засоления и щелочности, активно исследуются 244 как источники получения новых вторичных метаболитов с антибактериальными и антифунгальными свойствами. Устойчивость микроорганизмов является причиной интенсификации поиска новых антибактериальных и антифунгальных агентов, как эффективного пути преодоления этого явления. Скрининг природных ингибиторов с абсолютно новой структурой и новыми мишенями действия является более предпочтительным по сравнению с созданием аналогов уже существующих лекарственных препаратов. Микроорганизмы из экстремальной среды обитания привлекают в последнее время особое внимание, так как, это наименее изученная и наиболее перспективная группа продуцентов новых биологически активных веществ [1-5]. Выделение и изучение продуцентов новых терапевтически ценных соединений с уникальными свойствами из экстремальных мест обитания является в настоящее время наиболее разрабатываемым направлением в современной фармацевтической индустрии. Без сомнения исследование экстремофильных микроорганизмов в биотехнологии связано с их огромным потенциалом. Образуемые ими молекулы обладают уникальными свойствами, которые открывают широкие возможности для разнообразного применения. Для коммерческого применения, помимо антибиотиков, большую роль играют ферменты, образуемые экстремофилами, особенно алкалофильными микроорганизмами. Использование экстремофилов в промышленности и медицине открывает новую эру в биотехнологии. В настоящее время из экстремофильных микроорганизмов уже получен ряд новых природных соединений индустриального значения, таких как антибиотики и ферменты. Новый антибиотик пироколл с антипаразитным и противоопухолевым действием получен из алкалофильного актиномицета [6]. Новое антимикробное соединение фаттивирацин получено из алкалофильного актиномицета Streptomyces microflavus [7]. Высокая антимикробная активность описана для ряда морских актиномицетов [8-10]. Ряд новых противоопухолевых антибиотиков, таких как чиникомицин, лайолламицин и салиниспорамид были также обнаружены в морских актиномицетах Streptomyces spp [11-15]. Казахстан, в отличие от многих стран, где активно проводится поиск экстремофилов для медицины и промышленности, обладает собственными уникальными природными ресурсами, которые могут быть источником перспективных продуцентов новых конкурентоспособных биологически активных веществ с уникальными свойствами. Почвенный покров и водные ресурсы республики Казахстан характеризуется большим разнообразием природных мест обитания для экстремофильных микроорганизмов (солончаки, солонцы, солоди, зоны промышленных разработок). Солонцы занимают на территории Казахстана около 40 млн. га, общая площадь солончаков составляет около 1 млн. га. Они различаются как по морфологическим признакам, так и по характеру засоления (хлоридные, сульфатные, содовые, смешанные). Большое разнообразие сред обитания для экстремофилов представляют водные ресурсы Казахстана: Каспийское, Аральское моря, озеро Балхаш и многочисленные засоленные озера, в которых минерализация воды может достигать до 335 г\л. В последнее время экстремальные местообитания микроорганизмов все чаще имеют антропогенное происхождение. Интерес для выделения микроорганизмов с необычными свойствами представляет также интенсивное развитие добывающей промышленности и наличие разнообразных промышленных разработок на территории Казахстана. Возможность использования собственных разнообразных экстремальных природных субстратов, открывает большие возможности для скрининга новых конкурентоспособных лекарственных веществ, что создаст основу для развития инновационной фармацевтической промышленности Казахстана. Данное направление является особенно приоритетным для Республики Казахстан, где отсутствует обеспечение биотехнологической промышленности собственными продуцентами антибиотиков, уже используемых в медицинской практике и продуцентами новых лекарственных препаратов. В Институте микробиологии и вирусологии МОН РК из солончаковых почв Алматинской области с высоким уровнем рН (9-10,5) получены 86 актиномицетов с галофильными и алкалофильными свойствами и изучено их антагонистическое действие против ряда условнопатогенных микроорганизмов (клинических штаммов метициллинрезистентных стафилококков, микрококков, E.coli). В результате отобраны 10 штаммов актиномицетов с высокими антагонистическими свойствами (Таблица 1). Таблица 1 - Антагонистические свойства актиномицетов из солончаковых почв Алматинской области в нейтральных, соленых и щелочных условиях жизнедеятельности продуцентов Номер Диаметр зоны подавления роста MRSA №3316, мм штамма Среда 1 Среда Среда Среда Среда 1 245 –нейтральная среда, рН 7,0 1 +5% NaCl, 1 + 1+ 0,5% + 1,0% рН 7,0 7,5% Na2CO3, рН Na2CO3 ,рН NaCl, рН 7,0 9,0 9,0 31/2 0 14 15 13 16 45/13 0 16 24 10 0 46/9 0 26 15 40 11бс 46/14 10бс 24 15 0 0 46/15 0 37 30 18бс 0 49/21 0 20 0 53/9 0 14 21 14 19 75/B 12 25 н\р н\р н\р 91/1 0 20 27 13бс 15 96/1 11 26 11 19 16 П р и м е ч а н и е: бс – бактериостатическое действие; н/р – отсутствие роста актиномицета на данной среде. Проявление высоких антагонистических свойств обеспечивалось при культивировании актиномицетов на средах с высоким уровнем хлорида натрия в среде (5% и более) или Na2CO3(0,51,0%) и высокими значениями рН>8. Все полученные штаммы экстремофильных актиномицетов представляют несомненный интерес для дальнейшего исследования, как возможные продуценты новых терапевтически ценных антибиотиков. Таким образом, исследование микробного разнообразия экстремальных экосистем Казахстана является актуальным и приоритетным для получения новых антимикробных соединений. Изучение антибиотиков, образуемых в гиперсоленых и высоко щелочных условиях жизнедеятельности продуцентов, позволит отобрать природные соединения с уникальными свойствами и разрабатывать их в Республике Казахстан. 1 Zhang L. Demain A.L. Natural Products. Drug Discovery and Therapeutic Medicine, 2005, 371 p., Humana Press Inc. 2. Basilio A., Gonzalez I., Vicente M. F., Gorrochategui J., Cabello A., Gonzalez A., Genilloud O. Patterns of antimicrobial activities from soil actinomycetes isolated under different conditions of pH and salinity. J. Appl. Microbiol., 2003, V.95, P.814. 3. Vasavada S. H., Thumar J. T., Singh S. P. Secretion of a potent antibiotic by salt-tolerant and alkaliphilic actinomycete Streptomyces sannanensis strain RJT-1. Current Science, 2006, V.91, #10, P.1393-1397. 4. Bommarius A.S., Riebel B.R. Biocatalysis. Isolation and Preparation of Microorganisms, 2004, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA 5. Rainey А., Oren A. Extremophiles, 35., 2006, 838p. Academic Press. 6. Dietera A., Hamm A., Fiedler H. P., Goodfellow M., Muller W. E., Brun R. Bringmann G. Pyrocoll, an antibiotic, antiparasitic and antitumor compound produced by a novel alkaliphilic Streptomyces strain. J. Antibiot., 2003, V.56, P.639–646. 7. Uyeda M. Metabolites produced by actinomycetes – antiviral antibiotics and enzyme inhibitors. Yakugaku Zasshi, 2004, 128, 469–479. 8. Fiedler H. P. et al. Marine actinomycetes as a source of novel secondary metabolites. Antonie Van Leeuwenhoek, 2005, V. 87, P.37–42. 9. Kokare C. R., Mahadik K. R., Kadam S. S. and Chopade B. A., Isolation, characterization and antimicrobial activity of marine halophilic Actinopolyspora species AH1 from the west coast of India. Curr. Sci., 2004, V.86, P.593–597. 10. Ellaiah P., Raju K. V., Adinarayan G., Prabhakar T., Premkumar J. Bioactive rare actinomycetes from indigenous natural substrates of Andhra Pradesh. Hind. Antibiot. Bull., 2002, V.44, P.17–24. 11. Li F. et al. Chinikomycins A and B; isolation, structure elucidation, and biological activity of novel antibiotics from a marine Streptomyces sp. isolate M045. J. Nat. Prod., 2005, V.68, P.349–353. 12. Manam R. R. et al., Lajollamycin, a nitro-tetraenespiro-beta-lactone-gamma-lactum antibiotic from the marine actinomycetes Streptomyces nodosus. J. Nat. Prod., 2005, V.68, P.240–243. 13. Maldonado L., Fenical W., Goodfellow M., Jensen P., Kauffman C., Ward A. Salinispora gen nov., sp. nov., Salinispora arenicola sp.nov., and S. tropica sp. nov., obligate marine actinomycetes belonging to the family Micromosporaceae\\ Internat.J. System. Appl. Microbiol., 2005, V.55, P.1759-1766. 14. Feling R., Buchanan G., Mincer T., Kauffman C., Jensen P., Fenical W. Salinisporamide A: A highly cytotoxic proteasome inhibitor from a novel microbial source, a marine bacterium of the new genus Salinispora\\ Angew. Chem. Int. Ed., 2003, V.42, P.355357. 15. Jensen P., Williams P., Oh D-C., Zeigler L., Fenical W. Species-specific secondary metabolite production in marine actinomycetes of the genus Salinispora\\ J. Appl. and Environ. Microbiol., 2007, V.73, P.1146-1152. *** антагонистік Жұмыста Алматы облысының соланчакты топырақтарынан бөлініп алған актиномицеттердің қасиеттері зерттелген. *** In this paper we studied the antagonistic properties of actinomycetesfrom saline soil in the Almaty region neutral saline and alkaline conditions of life of producers 246 Г.Д. Ұлтанбекова, А.Қ. Саданов, Н.Н. Гаврилова, Е.Ж .Шорабаев, М.А. Усикбаева ЖОҒАРЫ ӨНІМДІ АЗОТСІҢІРЕТІН КЕҢ СПЕКТРЛІ БЕЙІМДЕЛГІШ СИМБИОЗДЫ ӨСІМДІК-МИКРОБТЫ ЖҮЙЕНІ ТАҢДАП АЛУ ТЕХНОЛОГИЯСЫ (1 ҚР БҒМ РМК «Микробиология жəне вирусология институты», 2 «ГИРКАН» Ғылыми-өндірістік орталық» ЖШС, Атырау,3 əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті) Жоңышқаның түйнекті бактерияларынан кең спектрлі бейімделгіш жоғары өнімді азотсіңіретін симбиозды микробты-өсімдік жүйесі таңдап алынды. Жоңышқаның түйнекті бактерияларының əртүрлі экологиялық қолайсыз əсерлерге төзімділігі жəне жоңышқа мен симбиозды тіршілік ететін S. meliloti штамының стреске төзімділігі зерттелді . Ауылшаруашылықтың жақсы дамуы, мал азықтық қорының тұрақтылығына жəне дамуына тəуелді. Қазіргі кездегі мал азығының деңгейі малшаруашылығының тұтынуын қанағаттандырмайды, сондықтан жоғары сапалы өнімдерді өндіру өндірісін кеңейту біздің ең бірінші мақсат. Мал азығының қорын күшейту үшін бұршақ тұқымдасы өсімдігіне көңіл бөлу керек, себебі оларды өсіргенде құрамындағы азоттың көбеюінен көп жылдық өсімдіктердің азықтық құндылығы жəне өнімділігі артады. Бұршақ дақылды өсімдіктеріне жататын өсімдіктерді өсіру, азот тыңайтқыштарын қолдануын, нитраттардың кездесуін азайтады, ал қорытындылай келсек өте арзан, экологиялық таза жəне ақуыз мəселесін шешудің бір жолы болып табылады. Атмосфералық азоттың биологиялық сіңіруі, яғни атмосферадағы азотты сіңіру қабілеті бұршақ тұқымдасы өсімдіктерінің түйнекті бактерияларымен жүзеге асады. Өсімдік-микробты қатынаста ең тиімді биологиялық таза азотты сіңіру болып табылады. Симбиозды жүйе, атмосфералық азотты сіңіре алатын, оны өсімдік пайдалана алатын түрге айналдырып, сонымен қатар 400 əртүрлі органикалық құрылымдық байланыстар түзеді, минералды тыңайтқышты қолдануды, күрделі агротехниканы, пестицидтерді қажет етпейтін өзі бəрін қамтыған жүйе ретінде қарауды талап етеді. Симбиозды жүйеде, жоңышқа өсімдігінің түйнекті бактериялары Sinorhizobium meliloti өте өнімді, 1 га 4-6 т. шөп жəне 1 га 250 кг азот жинайды. Осындай азотсіңіргіш симбиозды өсіру, топырақтың құнарын арттырады, топырақты бастапқы қалпына келтіруге жəне сумен шайылған топырақтарды қалпына келтіруге себебін тигізеді. Болашақта мал азықтық қорды күшейтудегі экологиялық таза əдіс, кең спектрлі бейімделгіш штамдарымен инокулирленген бұршақ тұқымдастарын өсіру қажет. Бұл жобада жоңышқа галотолерантқа жататындықтан, құнарсыз топырақтарға жəне тұздылығы жоғары топырақтарға пайдалануға болатын, негізгі өсімдік болып табылады. Бұршақ тұқымдасының тіршілік қабілетін, абиотикалық стресс-əсері тұздануға бейімделген түйнекті бактериялар жоғарылатады. Сонымен қатар əртүрлі қолайсыз ортаға бейімделген штамдар түйнекті бактериялардың вируленттігін арттырады [1,2]. Микросимбионтты штамдар азотсіңіргіш қабілеті жоғары жəне стресске төзімді жүйе, əртүрлі агроклиматты жағдайда симбиозды тиімділігін сақтай алатын қабілетті штамдар болғандықтан, белсенді штамдарды бөліп алу алдағы мақсатқа енгізілді. Өсімдік микробты қатынасы мəселесі кең көлемде зерттелседе, жоғары өнімді симбиозды жүйені құрастыру бағытында əртүрлі агроэкологиялық жағдайда өсе алатын жоңышқаға зерттеулер толығымен жүргізілмеген. Сонымен бұл мақалада симбиозды өсімдік жүйесінің белсенді түйнекті бактериялары негізінде, мал шаруашылығында құнары жоғары азықтық ақуызды тұрақты алу үшін, топырақтың құнарын арттыру жəне қайта қалпына келтіруге, тіршілікке қолайлы жəне табиғи қорларды сақтауға негізделді. Жоңышқаның түйнекті бактерияларынан кең спектрлі бейімделгіш жоғары өнімді азотсіңіретін симбиозды микробты-өсімдік жүйесін таңдап алу технологиясы. Жоңышқаның түйнекті бактерияларының əртүрлі экологиялық қолайсыз əсерлерге төзімділігі жəне жоңышқа мен симбиозды тіршілік ететін S. meliloti штамының стресске төзімділігі анықталды. Жоңышқаның Түркістан-15 сұрыпының тамыр-ризобиальді жүйесінен бөліп алынған түйнекті бактериялардың коллекциясына зерттеулер жүргізілді. Зерттеуде осы аталған түйнекті бактериялардың ЛТ-1, ЛТ-2, ЛТ-3, ЛТ-4, ЛТ-5 штамдарынан ең белсенді стресске төзімді штамм таңдап алынды. Түйнекті бактерияларға зертханалық жағдайда стресс ретінде жоғары жəне төменгі температура, қоректі ортаның тұздылығын, қоректік ортаның қышқыл реакциясына зерттеулер жүргізіліп, осы бейімделгіш кең спектрлі штамдарымен жоңышқаны инокулирлеу. Симбиозды белсенділік, жоңышқаның 2 түрлі сұрыпты өсімдіктеріне зерттеулер жүргізілді. Жоңышқа өсімдіктері шаруашылық – құндылық сапасымен бағаланды (жасыл өнімінің артуы жəне ақуыздың құрамы). Абиотикалық қолайсыз орта əсерлерге төзе алатын қабілетті белсенді түйнекті бактериялар бөліп алынды. 247 Мақаланы қортындылай келсек, осы алынған ең белсенді штамдардың негізінде тұрақты жоғары өнім алу үшін, мал азығына қолдануға болатын экологиялық зиянсыз, жоңышқа өсімдігінің ақуызының сапасын арттыратын, жоғары сапалы экологиялық таза биологиялық препаратты өндіруге болады. 1. Лапинскас Э. Б. Эффективность инокуляции люцерны адаптированными к кислой почве штаммами Rhizobium // Агрохимия. - 2005. - №2. - С. 72-79. 2. Ултанбекова Г.Д., Саданов А.К., Шорабаев Е.Ж. Экологиялық факторлардың түйнекті бактериялар Bradyrhizobium japonicum штамдарының өнімділігіне əсері // Халықаралық ғылыми-практ. конф. «Қазіргі заманғы Арал өңірінің экологиялық жағдайы жəне оны шешу мəселелері». Қызылорда: 2011. С. 230-232. *** Симбиотическая система, сформированная растениями люцерны с клубеньковыми бактериями – одна из самых продуктивных, поскольку позволяет получать 4-6 т. сена на га и около 250 кг азота на га. Перспективным экологически чистым подходом для укрепления кормовой базы является выращивание люцерны инокулированными штаммами с широким спектром адаптации. *** The Study of the influence of biological preparation "Nitragin" on the base of shtumms S. meliloty for lucence seeds productivity and ecological condition of soil. М.Х. Шығаева1, С.З. Сағындықова2, А.Б. Дүйсекенова «СОФМАЙЯ» ШҰБАТ СУСЫНЫН ДАЙЫНДАУДЫҢ ҒЫЛЫМИ НЕГІЗІ ( Əл- Фараби атындағы ҚазҰУ, 2 Х. Досмұхамедов атындағы Атырау мемлекеттік университеті) 1 Жұмыста «СОФМАЙЯ» шұбат сусынын дайындаудың ғылыми негізін қарастыру үшін тест-культураларға полиштамды ашытқылардың антагонизмі жəне түйе сүтінен дайындалған сүт қышқылы сусындардың салыстырмалы органолептикалық көрсеткіштері туралы мəліметтер көрсетілген. Адам баласы өте ерте заманнан бері сүт қышқылы бактерияларының көмірсулардан сүт қышқылын түзу қасиетін сүт жəне өсімдік ферментациясы үшін қолданып келген. Бірнеше мың жылдар бойы бұл үрдіс ашытылатын субстратта кездесетін микроорганизм қатысында жүріп келген. Ұлттық тағам шұбаттының құрамындағы майда еритін А, D, E витаминдері бактериялар тіршілігі нəтижесінде түзіледі. Сонымен бірге адам организмінің зат айналымына қажетті фосфор, кальций, магний тұздарына бай болады. Олардың құрамында ас қорыту безіне секреторлық əсер ететін, ас қорытуды жақсартып, тағамды қорытуға қатысатын көміртегі диоксиді, сүт қышқылы, алкогольдің өте аз мөлшері болады. Шұбат қант диабетімен ауыратын, иммунитеті төмен адамдарға тигізетін пайдалы əсері мол. Сонымен бірге радиацияға қарсы дезактивациялық қасиет көрсетеді. Адам ағзасынан радионуклетидтерді шығарады. Сүт қышқылы тағамдарында тез қорытылатын, алмастырылмайтын амин қышқылдары жеткілікті мөлшерде болады. Антибиотиктерді қолданған жағдайда жойылған ішек микрофлорасын қалпына келтіру үшін сүт қышқылы тағамдарын қолдануға болады (Шығаева, Оспанова, 1987, Байжомартова жəне басқалары, 2001, Саубенова, Пузыревская жəне басқалары, 2002 ). Қызылша шырынының адам ағзасына тигізетін қолайлы əсері өте ерте кезден - ақ белгілі болған. Қызылша шырынында темір жəне фолий қышқылының болуы нəтижесінде қызыл қан түйіршіктеріндегі эритроциттердің пайда болуы жеделдеп, бұлшық еттерге оттегінің тасымалдануын жақсартады. Сонымен бірге, қызылша шырынын үнемі қолдану нəтижесінде, əсіресе атеросклероздың алғашқы сатысында есте сақтауды жақсартса, қызылша шырынындағы магнийдің көп мөлшері жүйке ауруына, ұйқы бұзылғанда, кенеттен жүйке жүйесіне ауыртпалық түскенде өте пайдалы. Қан тамырларын кеңейтіп, гипертониялық ауруға неғұрлым тиімді əсер ететін бірден-бір табиғи дəрі болып табылады. Əрине, қызылша шырынының таза өзін ішу өте қиын, əрі дəмсіз, сондықтан да оны басқа жеміс жидек шырындарымен, қышқыл сүт сусыны - шұбатпен қосуға болады. Сол себепті қызылша шырынына қышқылдық дəм беру, сапасын жақсарту мақсатында 47МСА жəне 67МСА сүт қышқылы бактериясының штамдарымен ферментацияланады. Қызылша шырыны төмендегідей əдіспен жасақталды: 248 1. Ас қызылшасын тазартып, шырын бөлгіш арқылы шырынын бөліп, сумен 1:1 немесе 1: 3 қатынасындай етіп сұйылтады. 2. Колбаларға құйып, 0,5атм. 20 минут залалсыздандырады. 3. 1:3-ке қатынсындай етіп таза сумен сұйылтылып залалсызданған ас қызылшасы шырынын салқындатып, сүт қышқылы бактерияларының 47МСА жəне 67МСА штамдарымен 20 сағат бойы ферментациялайды. 4. Ас қызылшасын тазалап, булап, ұсақтап турап, қыздырып, сүт қышқылы бактериясымен ашытады. 5. Сонан соң 5-30-40% мөлшерінде керегінше осы микроорганизмдермен таза ашытылған шұбатқа қосып дайындайды. Сүт қышқылы бактериясының 47МСА жəне 67МСА штамы патогенді емес, белсенді қышқыл түзуші екендігі анықталды. Целлобиозаны ыдырату қабілеті бар жəне E.coli, B.subtilis, B.mesentericus жəне басқа сапрофитті микроорганизмдерге антагонистік қасиет көрсетті. Адамның ішек микрофлорасын қалпына келтіріп, ішек жəне басқа да органдардың жұмысын жақсарту үшін ферментацияланған қызылша шырынын қосып дайындалған шұбаттың шипалық маңызын ескере отырып, “СофМайя” шұбат сусыны дайындалды. Зерттеу əдістері Зерттеу объектісі ретінде Атырау облысы Теңдік елді мекенінен алынған түйе сүті мен шұбат, шұбаттан бөлініп алынған: 47МСА жəне 67МСА сүт қышқылы бактерияларының штамдары жəне Saccharomyces cereviseae ашытқы саңырауқұлағының культурасы қолданылды. Тест-культураларға (E.coli, S.aureus, B.subtilis, M.rubrum, S.typhymirium, P.aerogunosa, M.citreum) қатысты антагонистік қасиет жалпыға танымал əдіспен жасалды. Шұбаттан бөлініп алынған 47МСА жəне 67МСА сүт қышқылы бактерияларының штамдары жəне Saccharomyces cereviseae ашытқы саңырауқұлағының культурасымен ашытқы дайындалып 2:1 қатынасындай мөлшерде қосылып, 28оС-та 12 сағат бойы ашытылады, сонан соң араластырыла отырып сүт қышқылы сусыны мен қызылша шырынының арақатынасы 3:1 қатынасындай мөлшерде қосады да, 30 минут бойы араластырады. рН 3,3 - 3,7-ге жеткенде залалсыздандырылған шыны ыдысқа құйылып, тығындалады. Зерттеу нəтижелері Сүт қышқылы бактерияларын сүттен жасалған сусындарды дайындауда қолдана отырып, көкөніс шырындарымен қосып дəмді сусындар жасау соңғы кезде қолданысын табуда. 750-800 см3 сиыр сүтіне 100-150 см3 көк-өніс шырынын, 3-5 г құм-секер қосып 30-50 см3 майсызданған сүтте ұйытылған сүт қышқылы ашытқысын құйса, ал түйе сүтінен “Бота” сусынын дайындалғанда 10-30% мөлшерде гомогенделген бидай дəнінің өскінінде өсірілген полиштамды мезофильді сүт қышқылы бактерияларымен түйе сүтіне қосып, ашытады (Чоманов, Витавская, 2001). Сиыр сүтінен бірнеше түрлі сусындар дайындайтыны бұрыннан белгілі, ал түйе сүтінен шұбаттан басқа жасалатын сусын түрлерін жоқ деуге де болады. Сондықтан да түйе сүтінен жасалатын сусындардың ассортиментін көбейту жəне асқазан жұмысын жақсарту мақсатында шұбаттан бөлініп 47МСА жəне 67МСА сүт қышқылы бактерияларының штамдары жəне Saccharomyces cereviseae ашытқы саңырауқұлағының культурасымен ашытқы дайындалып, сүт қышқылы сусыны мен қызылша шырынының арақатынасы 3:1 қатынасындай мөлшерде қосып араластырады. Нəтижесінде сапалы, ұлттық, шипалық қасиеті бар, биологиялық, қоректік жəне дəмді қызылша түстес бояуы бар “СофМайя” сусыны алынады. Түйе сүтінен дайындалған сусын 2-6оС температурада 2 апта, ал мұздатқышта 3-6 ай сақталады (мұздатқышта сақтағанда шыны ыдыс қолданылмайды); қызылша шырынымен бірге сəбіз, қырыққабат, томат, асқабақ шырындарын да қолдануға болатыны дəлелденді. Түйе сүтіннен қызылша шырынын қосып дайындалатын сусынды ашытуға қолданылған сүт қышқылы бактерияларының тест-культураларға қатысты антагонистік қасиеттері 1- кестеде көрсетілген. 1-кестеде 47МСА штамын жеке зерттегенде қалған екі вариантқа қарағанда тест организмдерге тигізетін əсерінің аздығы байқалды, M.rubrum - ге антагонистік қасиет көрсетпеді. Ең көп антагонистік қасиетті салыстырмалы түрде 47МСА жəне штамм 67МСА - қосылып дайындалған полиштамды ашытқы байқатты. 249 Кесте 1 - Тест-культураларға полиштамды ашытқылардың антагонизмі кейінгі, мм) Тест культуралар штамдар E.coli S.aure B.subti M.rub S.typhymiriu P.aerogunos us lis rum m a Штамм 47МСА 2±0,03 0 1±0,2 0 1,5±0,2 1±0,2 Штамм 67МСА 3±0,03 3±0,01 3±0,1 3±0,2 2,5±0,02 3±0,2 Штамм 47МСА жəне 67МСА 5±0,2 4±0,1 5±0,02 3±0,02 3±0,01 4±0,1 (3 тəуліктен M.citre um 2±0,2 3±0,2 5±0,1 Қызыл түсті қант қызылша шырынын қосып дайындаған “СофМайя” шұбат сусынының түйе сүтінен ақ түсті қант қызылшасымен дайындалған сүт қышқылы сусынымен салыстырмалы айырмашылығы 2-кестеде көрсетілген. Кесте 2 Түйе сүтінен дайындалған сүт қышқылы сусындардың салыстырмалы органолептикалық көрсеткіштері Процестің көрсеткіштері мен Сүт қышқылы сусындарын дайындау тəсілдері жүргізілу жағдайы СофМайя Ақ түсті қант қызылшасының шырынын қосқанда Органолептикалық қасиеттерінің көрсеткіштері Сүт қышқылы Дəмді, таза сүт қышқылды Дəмі Ақ сүт түстес Қызылша түстес солғын бояу Түсі Біртекті сұйықтың Біртекті сұйықтың Консистенциясы Сүттің түрі 2-6оС-та сақтауы Мұздатқышта Процестің ұзақтығы, сағ. Түйе сүті 2 апта 3-6 ай ~13 Түйе сүті 2 апта х ~15 Сонымен, сүт қышқылы ұлттық сусынының ассортиментін көбейтуде, органолептикалық, шипалық қасиеттерді жақсартуда, денсаулыққа пайдалы түйе сүтінен дайындалған “СофМайя” сусынының маңызды роль атқаратыны дəлелденді. Мұздатқышта 3-6 ай бойы сақтау арқылы шұбатты жəне оның сусынын шипа ретінде қолдануға болатыны анықталды. 1. Шигаева М.Х., Оспанова М.Ш. Микрофлора национальных кисломолочных напитков. Изд. «Наука». Алматы 1983.- 152с. 2. Гаврилова Н., Сагындыкова С.З. и др. “Способ получения напитка из свеклы для диетического питания” Патент РК № 135, 1993. 3. Чоманов У.Ч., Витавская А.В. “Способ приготовления кисломолочного напитка “Бота” Пред.патент РК № 9945, 2001. 4. Байжомартова М.М., Пузыревская О.М. Саубенова М.Г. Селекция устойчивой ассоциации молочнокислых бактерий и дрожжей для сбраживания верблюжьего молока // Сер.биолог. и мед. 2001, № 6, С.45-49. 5. Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Никитина Е.Т., Байжомартова М.М., Перспективы повышения качества и лечебно-профилактических свойств шубата // Вестник КазГУ. Серия биол. 2002, № 1, С.23 -28. 250 М.Х. Шығаева1, С.З. Сағындықова2, А.Б. Дүйсекенова2 ИЗУЧЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ ФАРША ИЗ ОСЕТРОВЫХ РЫБ (1 Əл- Фараби атындағы ҚазҰУ, 2 Х. Досмұхамедов атындағы Атырау мемлекеттік университеті) В работе исследованы молочнокислая флора рыбных продуктов, в том числе о рыбного фарша приготовленного из осетровых рыб Практическое применение молочнокислых бактерий обусловило повышенный интерес к этой группе микроорганизмов, что нашло своё отражение в большом количестве работ, посвящённых изучению биологии молочнокислых бактерий. Именно они имеют многовековую историю практического применения в различных сферах человеческой деятельности - молочной промышленности, биотехнологии, медицине, сельском хозяйстве, для разработки методов стабилизации, улучшения качества, увеличения ассортимента продуктов из частиковых и крупных осетровых рыб. Современный этап в изучении молочнокислых бактерий связан с решением ряда теоретических и практических задач. В первую очередь эта разработка новых подходов к созданию заквасок для различных отраслей пищевой промышленности. В этой области исследования направлены на получение стабильных многовидовых и полиштаммовых заквасок, обеспечивающих получение продуктов с нужным качеством и типом [1,2, 3]. Анализ показывает, что источниками выделения новых видов и штаммов являются, главным образом, производственные штаммы, коллекции культур, организм человека и животных. В Казахстане не изучены общая микрофлора, молочнокислая флора и антагонистические свойства молочнокислых бактерий рыбного фарша [4]. Материалы и методы исследования Из проб осетровых рыб, которые взяты из АО “ЖайыкБалық” были приготовлены фарш. Отбор проб и подготовка их анализа осуществляли по ГОСТу 26809. Пробы отбирались в стерильную посуду с притертой пробкой. Антагонистические свойства молочнокислых бактерий изучали на среде Богданова. Антагонистическую активность молочнокислых бактерий определяли методом лунок по отношению к разным тест- культурам: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Mycobacterium rubrum, Mycobacterium citreum, Staphylocосcus aureus, Staphylococcus albus, Salmonella tuphymurium. На активность кислотообразования штаммы исследовались по общепринятой методике (по методике Тернера) [4, 5]. Результаты исследования Нами исследованы молочнокислая флора рыбных продуктов, в том числе о рыбного фарша приготовленного из осетровых рыб. Объектами исследования служили образцы рыбного фарша приготовленного из осетровых (белуга) рыб. Для выделения микроорганизмов использовались стандартные среды. Выделенные микроорганизмы подверглись первичным классификациям по морфологическим и культуральным свойствам. В настоящее время выделены штаммы из фарша осетровых рыб приготовленных нами. Из рыбного фарша прямым высевом были выделены и определены 17 изолятов, а через накопительные культуры 16 изолята молочнокислых бактерий. Из них 15 штамма относятся кокковым, а 18 штамма относятся палочковидным формам. Изучены основные признаки (морфологические, культуральные, биохимические). В основном нами были использованы все среды, из них традиционно использовалась среда Богданова для выделения молочнокислых бактерий из рыбного (осетровых) фарша и определения общей численности. Все выделенные колонии были микроскопированы по общепринятой методике, в основном чаще встречались молочнокислые бактерии по морфологии-лактококки (парные, в виде цепочек) и лактобациллы. Проведены первичные классификации по морфологическим и культуральным свойствам. Выделенные штаммы белого цвета, росли глубинно, лишь некоторые поверхностно, формы в виде чечевицы, круглые, лодочкообразные. Края колонии в основном гладкие. Все выделенные штаммы Грамм положительные, каталаза отрицательные, из них желатину не разжижает лишь 5 штаммов. В основном у культур лактококков все колонии мелкие, точечные, бесцветные - 0,05-0,1 мм, среди них встречались крупные колонии белого цвета-0,3 мм, редко крупные колонии желтого цвета0,2 мм. 251 У культур лактобацилл все колонии белого цвета, в виде чечевицы или круглые формы- 0,2 -0,3 мм. На питательной среде с 1-3% солью росли все штаммы, на среде где содержит 6- 6,5 % NaCI, рост культур обнаружен лишь у 6. 52 штамма выделяли газ из глюкозы и хорошо росли на среде с 0,10,3% с метиленовой синью. Были исследованы рост выделенных микроорганизмов на питательной среде с содержанием рН9,2 и 9,6. Не наблюдались рост микроорганизмов на среде с содержанием рН – 9,6. Кроме этого, нами были исследованы выделенные штаммы на сбраживание углеводов. Так же у них исследовались на практически значимых признаков. Первоначально штаммы исследовались на активность кислотообразования. Активность кислотообразования выделенных штаммов молочнокислых бактерий из рыбного фарша приведены в таблице № 1. Из таблицы 1 видно, что штаммы молочнокислых бактерий на первые сутки составляли от 73 до 0 86 Т, тогда как на седмые сутки изменялся от 98 до 1600Т. Самая высокая кислотность наблюдалась на 4 штаммах (142-1600Т). Почти у всех штаммов кислотность молочнокислых бактерий на восьмые сутки уменьшалась. Таблица 1 - Активность кислотообразования молочнокислых бактерий выделенных из рыбного фарша. Штаммы Активность кислотообразования, 0Т, сутки 1 2 3 4 5 6 7 8 1 1 МСА/1- 7МСА/1 75 82 87 87 90 95 98 100 2 8МСА/1- 17 СА/1; 73 108 114 116 116 124 135 128 3 18 МСА/1-25 МСА/1; 86 110 112 118 137 151 160 142 4 26МСА/1-34МСА/1 84 100 108 109 119 125 116 142 Были проведены посевы на питательные среды Богданова с мелом, для определения кислотообразующих и не кислотообразующих культур. Кроме этого, нами были исследованы и определены антагонистическая активность этих культур. Далее нами были проведены работы по антагонистической активности выделенных культур рыбного фарша из осетровых рыб. Антагонистическая активность лактококков и лактобацилл на среде Богданова представлены в таблицах № 2. Таблица 2 - Антагонистическая активность лактококков выделенных рыбного фарша осетровых рыб Атырауской области Тест- культуры, диаметр подавления роста в мм Общее Bacillus Escheri Staphylo Staphylo Staphylo кол.-во Subtilis chia coli coccus coccus coccus культур aureus typhymurium albus 1 2 3 4 5 6 7 __4_ __5__ 11___ __4__ Lactococus 13±0,7 12±0,6 14±0,6 13±0,5 _4__ __13__ __7___ ___14___ 18 20±0,2 21±0,2 20±0,3 19±0,4 ___10__ __18__ 15±0,3 13±0,4 Lactobacterium ___11__ ___12__ ___9__ ___5__ 15±0,4 17±0,5 12±0,5 16±0,4 15 ___4__ ___7__ ___4___ ___8__ 20±0,2 20±0,3 20±1,2 21±1,2 ___15__ ___3___ ___2___ ___2___ 10±0,3 16+-0,8 14±0,6 15±0,3 1. П р и м е ч а н и е: числитель- количество культур; знаменатель- зоны угнетения роста в мм 252 В таблице 2, максимальные зоны проявлялись в отношении Staphylococcus typhymurium, Staphylococcus albus. В целом антагонистическая активность данных культур составляет 17-21мм. Таким образом, самая высокая кислотность молочнокислых бактерий наблюдалась на 4 штаммах (142-1600Т). В данном случае антагонистическая активность зависит не только от образования молочной кислоты, но и от вида культуры. 1 Банникова Л.А., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства. – М.: Агропромиздат, 1987.– 400 с. 2 Шалыгина А.М., Эрвольдер Н.Ю., Ганина В.И., Калинина Л.В. Биологическая ценность и антагонистическая активность функционального кисломолочного продукта //Молочная пром-сть. – 2000. - № 11. – С. 50-51. 3.Тулеуов Е.Т., Ахметова Н.К., Жакайбеков Б.М.,Ибраева М.С. Фарш для приготовления рыбных колбасных изделий// Казахстан Предпатент №7270 МПК А23L 1/325. 15.03.1999. 4 Сагындыкова С.З. Cүт қышқылы бактериялары мен ашытқы саңырауқұлақтарының негізгі қасиеттері жəне қолданылуы. – Алматы: Нұр, 2001. – 134с. 5 Сагындыкова С.З. Предотвращение болезни рыбного фарша молочно-кислыми бактериями //Объединенный научный журнал.- РФ, Москва.- 2004.- №21. – С.75-78 *** Жұмыста балық өнімдерінің, соның ішінде алабұға тұқымдас балықтан дайындалған фарштың сүтқышқылды микрофлорасы зертелінген. *** In this work the lactic flora of fish products, including fish mince prepared from sturgeon. НАНОТЕХНОЛОГИЯ УДК 620.3: 616.9: 616-002.5 M. K. Gilmanov1, S.M. Gilmanova2, S.O. Tutkyshbaev3, Kaster1, A.N. Begzat2 THE NEW NANOCAPSULES FOR SUCCESSFUL THERAPY OF SPINAL TUBERCULOSIS (1M.A. Aytkhozhin's Institute of Molecular Biology and Biochemistry; 2 al-Faraby’s Kazakh National University Department of biology and biotechnology; 3National Center for Problems of Tuberculosis) Our developed new nanocapsules very stable and never aggregate. These nanocapsules were loaded by four types antitubercular antibiotics. It was prepared the nanoointment by mixing loaded nanocapsules with lanoline. For the therapy of the spinal tuberculosis nanoointment was putted on the skin of the area of sick vertebras twice a day morning and evening. This kind of therapy accelerates the time of the curing and hundred times the quantity of the used antibiotics in comparison with traditional treatment. According to the United Nations and the World Health Organization, more than two billion people, equal to one third of the world’s total population, are infected with mycobacterium tuberculosis. One out of every ten of those people will have the active tuberculosis during his or her life 1 Unfortunately, this worldwide disease can not be controlled. It can be expected that success in fighting with this disease can be achieved by using methods of the nanomedicine. Nanomedicine is created by the fusion of nanotechnology and medicine. It is one of the most promising pathways for the development of new strategies of the therapy of serious and widespread disease such as: tuberculosis 2-4. One of the heaviest type of tuberculosis is the spinal tuberculosis, which often led to paraplegia5. The most promising method of nanomedicine for therapy of diseases are nanocarriers. Now there are two types of nanocarriers, first are natural nanocarriers and the second are polymer nanocarriers. The wellknown drug delivery system are lecithin liposomes. These lecithin liposomes have serious disadvantages, because they have very large sizes and they easily aggregate. That cause the dangerous of the blocking blood vessels. The polymer nanocapsules cause numerous immune and allergic reactions. Because of these disadvantages both types of the delivery systems haven't found wide application in practical medicine. In general they are used for experiments on animals and model systems 6-8. Thus, it is speaks about necessity to develop new nanocapsules from natural materials, which don’t have above mentioned disadvantages. The starting point of our investigation was our development of new effective methods of purification of phosphatidylinositol (PI) from plant materials. This method was protected by patent of US № 4,977,099 and by the patent of the Republic of Hungary №199 69110. In contrast to all other electroneutral phospholipids, PI has a negative charge. In this respect PI is very convenient for the construction of charged small liposomes, which were stable in buffer solution. We have developed the method of preparation of PI liposomes protected by the patent of the Republic of Kazakhstan 11. Our obtained PI liposomes not visible in optical microscope this indicates that their sizes less than one mkm. In this reason we named PI liposomes as nanocapsules. In contrast 253 to electroneutral the lecithin liposomes our nanocapsules thanks of their negative charge push each other and they never aggregate and never agglomerate. Our study shows that the nanocapsules are very stable in wide ranges of ph from 5 till 9 and temperature from -30 till +55. The nanocapsules can be stored without any changes for several years in sterile conditions. We also developed the effective method of the loading nanocapsules by different medicines. The principle of our method is in the next: the nanocapsule is opened in hydrophobic solution (95,6% ethanol) like a shell. Then nanocapsules are transferred to the hydrophilic solution (0.05M Tris-HCl buffer ph 7.4), they begin to close scooped the solution containing medicines. So, we have proposed the new method which provides a very high efficiency of loading the nanocapsules. This method protected by patent of the Republic of Kazakhstan №1704311. For preparation of nano ointment the nanocapsules were loaded by the next antitubercular antibiotics: isoniazid, rifampin, pyrazinamide and ethambutol. Then the solution with loaded nanocapsules were mixed in equal proportion with lanoline. The prepared nano ointment was used for the therapy of the spinal tuberculosis. In June 2009, one of the authors of this article Gilmanov Murat fell ill with spinal tuberculosis. In August 3, 2009 Gilmanov was happened paralysis of the bottom part of the body and legs – paraplegia, as a result of this disease, the infection destroys the 4-5th bone of vertebras, that leads to the destruction of spinal neural cord, as you can see on the photo (fig.1) of the magnetic resonance tomography of September 2, 2009. Fig.1. The tomography was carried out on magnetic resonance tomograph type 1.5Тл MAGNETOM Avanto “Siemens AG” ( Germany). The height of the vertebral bodies decreased, the bone of 4.-5. vertebras destructed and the space between them is filled with purulence. Spinal canal is narrowed between 4.-5. vertebras, with partial spinal cord compression due to epidural abscess up to 5 mm. Conclusion: MRT data spinal tuberculosis of 4.-5. vertebras complicated by epidural and paravertebral abscess at this level. On August 10, 2009, the epicystostoma was sewn to his urinary bladder. Then, Gilmanov received treatment at the clinic under the supervision of an experienced phthisiatrician, doctor Tutkishbaev C.O. in the National Centre for Problems of Tuberculosis (Almaty). The extract from the patient’s history is presented here. On September 9, 2009, Gilmanov Murat was admitted as a patient of the National Centre for Problems of Tuberculosis of the Republic of Kazakhstan (Almaty) in accordance with his diagnosis - tubercular spondylitis (spinal tuberculosis). By the decision №141 of September 10, 2009 of the medical commission the patient was recommended the therapy by tablets of the first-line antibiotics: isoniazid, rifampin, pyrazinamide and ethambutol. However, Gilmanov Murat refused to receive per oral treatment of these antibiotics. He decided to test thetherapyt by own nano ointments. For that Gilmanov’s colleagues prepared 4 types of nano ointments with four above mentioned antibiotics. From September 17, 2009 these ointments were rubbed on the skin in the area of sick vertebras in short intervals in the morning and in the evening everyday. After 50 days of this treatment the magnetic resonance tomography shows the improvement of the state of the damaged vertebras , as it shown at fig.2. 254 Fig.2. The tomography was carried out on magnetic resonance tomograph type 1.5Тл MAGNETO Avanto “Siemens AG” ( Germany). There is positive dynamics and disappearance of purulence. By November 20, 2009, after therapy by nano ointment, some neurological functions of several organs and legs of the patient were restored, and his epicystostoma was removed. By December 25, 2009 it was completely stopped applying the ointment on the spine of Gilmanov. Gilmanov was prescribed massage and physical exercises therapy. Considering clinical and roentgenological positive dynamics of the therapy, Gilmanov Murat was discharged from the Centre in the satisfactory condition on the 21-st of January, 2010. Thus, instead of 9 months of traditional therapy by tablets of antibiotics Gilmanov M.K. was full cured within 3 months by nanoointment therapy. After one year of the therapy Gilmanov M.K. had no relapse of spinal tuberculosis, and gradually were restored all motor functions of the legs. Therefore, our nanocapsules loaded by antitubercular antibiotics for therapy of tubercular spondylitis allow to reduce: the duration of the therapy three times and hundreds times the quantity of the used antibiotics. It’s clear by the next calculation under the traditional therapy Gilmanov must to take more than 4000 tablets of antibiotics (16 tablets everyday during 9months). For the therapy by our nanocapsules was spent only 20 tablets for preparation nanoointments for full time of the therapy. The very big advantage of the therapy of spinal tuberculosis by nano ointment is the absence of the toxic effects on other health organs. All this reduces several times the cost of treatment with a better therapeutic effect. Thus, our developed nanoointments are successful for therapy very serious disease - tuberculous spondilytis . Now our nanocapsules loaded by antitubercular antibiotics are testing for therapy of lung tuberculosis in the National Centre for Problems of Tuberculosis (Almaty). References 1. http://www.who.int/features/factfiles/tuberculosis/en/index.html 2. Almeida A. Tuberculosis of the spine and spinal cord European // Journal of Radiology. -2005.-№2. -P.193-201. 3. Storm M., Vlok G.J. Tuberculosis: A. Comprehensive Clinical Reference. - 2009. -503 p. 4. Ould-Slimane M.T., Lenoir C., Dauzac D., Breitel E., Hoffmann P., Guigui, Ilharreborde B. Clinical report, Odontoid process pathologic fracture in spinal tuberculosis // Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. -2010. - №1. - P. 80-84 5. Miller J. D. Pott's paraplegia today // The Lancet. -1995. - № 8970. - P. 264. 6. Bernardi A., Braganhol E., Jäger E., Figueiró F., Edelweiss M.I., Pohlmann A.R., Guterres S.S.,,Ana M.O. Battastini Indomethacinloaded nanocapsules treatment reduces in vivo glioblastoma growth in a rat glioma model // Cancer Letters. - 2009. - №1. - P. 53-63. 7. Zhang Y., Zhang W., Johnston A.H., Newman T.A., Pyykkö I., Zou J. Improving the visualization of fluorescently tagged nanoparticles and fluorophore-labeled molecular probes by treatment with CuSO4 to quench autofluorescence in the rat inner ear // Hearing research. - 2010. - № 1-2. - P. 1-11. 8. Çırpanlı Y., Allard E., Passirani C., Bilensoy E., Lemaire L, Çalış S and Benoit J.P. Pharmaceutical Nanotechnology Antitumoral activity of camptothecin-loaded nanoparticles in 9L rat glioma model // International Journal of Pharmaceutics. – 2011. - №1-2. - P. 201-206. 9. Gilmanov M.K., Dilbarcanova R., Sultanbaev B.E. Method for preparing phosphatidylinositol from vegetable matter. The Commissioner of patents and trademarks. Patent T 4,977,091 USA, December 11, 1990. 10. Gilmanov M.K., Dilbarcanova R, Sultanbaev B.E. Eljaras foszfatidilinozit eljallitasara biologiai anyagokbil // Magyar Koztarsasag orszagos talalmania hivatal szabadalmi okirat, VNR Patent #199691, Budapest, 06.03.1991., Publ. 16.07.91 11. Samenov N.A., Gilmanov M. K, Gilmanova S.M. The method of the loading of the liposomes. Patent of the Republic of Kazakhstan №17043. *** Разработанные нами нанокапсулы очень стабильны и не обладают способностью к агрегации. Эти нанокапсулы были загружены четырьмя видами противотуберкулезных антибиотиков. Была подготовлена наномазь путем смешивания загруженных нанокапсул с ланолином. Для лечения туберкулеза позвонков наномазь наносилась на кожу в области больных позвонков дважды в сутки утром и вечером. Этот вид терапии ускоряет время излечения четыре раза и количество используемых антибиотиков уменьшает в сотни раз по сравнению с традиционным лечением. *** Біз зерттеп шығарған нанокапсулалар өте тұрақты жəне бір-біріне жабыспайды. Төрт түрлі туберкулезге қарсы антибиотиктер осы нанокапсулаларға жүктелді. Жүктелген нанокапсулаларды ланолинмен араластыру арқылы нано май алынды. Омыртқалар туберкулезін емдеу үшін наномай тəулігіне екі рет таңертең жəне кешке ауру омыртқалар аймағындағы теріге жағылады. Емдеудің бұл əдісі дəстүрлі əдіске қарағанда емдеу уақытын 4 есе, ал қолданылатын антибиотиктердің мөлшерін 100 есе азайтады. 255 УДК: 541.183; 661.183 Ж.М. Жандосов, А.Р. Керимкулова, М.А. Бийсенбаев, З.А. Мансуров, А.А. Жубанова ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УГЛЕРОДНОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ АБРИКОСОВЫХ КОСТОЧЕК В ПРОЦЕССЕ ГЕМОПЕРФУЗИИ (Институт проблем горения, КазНУ им. аль-Фараби) Physico-chemical properties of carbonized apricot stones (AS-850) activated by steam for two hours at 850 C were investigated by different methods: SEM/EDAX, low-temperature nitrogen adsorption, methylene blue adsorption studies. The obtained material was tested as a sorbent with respect to blood toxicants in preliminary studies on hemoperfusion. The results indicated the prospect of the sorbent AS-850 to be used for blood purification form toxins, e.g.: maximal sorption degree reached 80% for alcohol and 62% for sodium barbiturate. В последнее время углеродные адсорбенты успешно используют в медицине для очистки крови от эндо- и экзотоксинов, для детоксикации желудочно-кишечного тракта и других целей. Как правило, свойства углеродных адсорбентов определяются свойствами исходного сырья и технологическими условиями их получения. При этом большое значение имеют характер пористой структуры, форма и размер гранул и их механическая прочность, от которых зависит сорбционная способность адсорбентов и возможная генерация угольных частиц в процессе эксплуатации. Учитывая тот факт, что угли из скорлупы орехов и косточек плодов обладают, как правило, гораздо большей прочностью по сравнению с древесными углями [1], ранее был разработан гемосорбент на основе косточкового активированного угля КАУ [2], который успешно прошел экспериментальную и клиническую апробацию и рекомендован к медицинскому применению. Как показали исследования, технология, разработанная в Институте проблем горения (ИПГ, КазНУ) на основе углей из растительного сырья, также обеспечивает получение адсорбентов медицинского назначения [3]. Материалы и методы исследований 1. Методика получения углеродного гемосорбента Углеродный материал АК-850 был изготовлен путём карбонизации абрикосовых косточек, дробления для получения фракции 1-2 мм и последующей активации водяным паром в течение двух часов при 850 C. После этого была проведена деминерализация раствором соляной кислоты и промывка до нейтральной среды. Сорбент был помещён в бутылки ёмкостью 250 мл по 175 г в каждую и залит физиологическим раствором (0,9% раствор хлорида натрия). 2 Методы исследования 2.1 Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ/EDAX). Исследования морфологии образцов проводились на микроскопе QUANTA 3D 200i (FEI, США) с ускоряющим напряжением 30 кВ. Для проведения локального анализа химического состава образца, микроскоп оборудован энергодисперсионным рентгеновским спектрометром EDAX, оснащенным полупроводниковым детектором с энергетическим разрешением 128 эВ (полимер, окошко d = 0,3 мм.). Электрический пучок фокусируется. 2.2 Определение удельной поверхности методом БЭТ по данным адсорбции азота. Информацию о микро/мезопористой текстуре (область от 17 до 3000 Ǻ) образца АК-850 получали методом низкотемпературной адсорбции азота на приборе ASAP-2400 («Micromeritics Instrument. Corporation», Norcross, GA, USA) после предварительной тренировки образцов, проводимой при 150 С и остаточном давлении менее 0,001 мм.рт.ст. Далее проводили измерения изотерм адсорбции азота при температуре жидкого азота 77К в диапазоне относительных давлений от 0,005 до 0,991 и их стандартную обработку по методу Barret-Joyner-Halenda (BJH) с применением условной модели цилиндрических пор с расчетом суммарной поверхности S и поверхности микропор S методом БЭТ, суммарного объема пор V ; объема микропор V ; среднего диаметра пор. 2.3 Исследования адсорбции метиленового голубого (МГ). Модельные растворы с необходимыми концентрациями красителя готовили путем последовательного разбавления исходного раствора с концентрацией 4000 мг/л. Навеску 0,1±0,001 г растертого в агатовой ступке угля переносили в стеклянную емкость вместимостью 100 мл, добавляли 25 мл раствора МГ, накрывали чашкой Петри и перемешивали в течение 20 минут на магнитной мешалке. Угольную суспензию переносили в пробирки и центрифугировали в течение 15 минут. Отбирали 5 мл осветлённого раствора для измерения оптической плотности, в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм на фотоэлектроколориметре с использованием синего светофильтра. По значению оптической плотности, используя градуировочный график, определяли остаточную концентрацию МГ в растворе. На основании результатов сорбции МГ на углеродном материале рассчитаны значения равновесной адсорбционной способности по формуле: 256 q e= (C 0 −C e )⋅V m По результатам экспериментов, в координатах Ce/qe-Ce построены изотермы адсорбции Лангмюра в линеаризованной форме, имеющей следующий вид: Ce Ce 1 = + q e q max K 1 q max где Се – равновесная концентрация МГ, мг/л; qe – адсорбционная способность в условиях равновесия, мг/г; KL – константа Лангмюра, л/мг; qmax – сорбционная емкость монослоя (максимальная адсорбционная способность), мг/г. Результаты и обсуждение 1 Синтез и физико-химические свойства сорбента АК-850. В данной работе для изучения процесса карбонизации и активации лигноцеллюлозных материалов была собрана установка, принципиальная схема которой приведена на рис. 1. 1– корпус сферического реактора; 2– активируемый материал ; 3– капилляр для подачи водяного пара; 4– термопара; 5– ось механического вращения; 6– выпускной патрубок Рис. 1 – Схема установки парогазовой активации углеродного материала Согласно ранее проведенным исследованиям в лаборатории углеродных наноматериалов Института проблем горения [4, 5, 6] было установлено, что карбонизацию абрикосовых косточек целесообразно проводить при температуре 800оС. Термодинамические расчеты показывают, что взаимодействие угля с водой протекает эффективно при температуре выше 800оС с образованием синтез-газа. Эмпирически были подобраны следующие условия парогазовой активации карбонизованных абрикосовых косточек: температура активации– 850оС, скорость подачи воды–100 мл/ч, и времени процесса– 2 часа. Активацию вели на установке, во вращающемся сферическом реакторе (рис. 1). Полученный материал АК-850 исследован при помощи энергодисперсионного элементного микроанализа, рис. 2. а б Рис. 2 - Энергодисперсионный рентгеновский микроанализ образца АК-850 (а), и снимок образца АК- 850 методом СЭМ (б), увеличение- x2400 Для разблокировки пор образец АК-850 был подвергнут деминерализации путем кипячения в растворе 0,33 М HCl с последующей отмывкой дистиллированной водой до нейтральной среды. При 257 этом, элементы зольного остатка, такие как Mg, Al, K и Ca растворяются и вымываются из получаемого сорбента. По данным адсорбции азота, удельная поверхность (SБЭТ) и общий объем пор (Vпор) для АК-850 составили 432 м2/г и 0,22 см3/г соответственно, а сорбционная емкость по метиленовому голубому составила 176,4 мг/г. Методом сканирующей электронной микроскопии определена морфология АК-850: на рис.2(б) приведен соответствующий снимок, из которого видно, что образец имеет упорядоченную структуру. Общий вид материала имеет выпуклости, канальную структуру макропор, характерную для карбонизованных абрикосовых косточек. Таким образом, текстурные и сорбционные свойства АК-850 предполагают наличие элементов наноразмерной морфологии: микро-, мезо- и макропор. 2 Применение сорбента АК-850 для элиминации токсикантов крови. Для проведения экспериментов по определению сорбционной способности АК-850 по отношению к возможным токсикантам крови, была собрана установка, принципиальная схема которой представлена на рисунке 4. Циркуляция через сорбент донорской крови с добавлением токсиканта, например этилового спирта, осуществлялась посредством работы перистальтического насоса вдоль магистралей, укрепленных на штативе. Пакет с донорской кровью, ёмкостью 450 мл, размещался поверх кровопроводящих магистралей. Исходные и конечные концентрации спирта в крови определены путем газожидкостной хроматографии в Республиканском токсикологическом центре и составили 10,69; 21,2 и 30,4 г/л– до сорбции, и 6,22; 6,04 и 6,08 г/л– после сорбции, а расчетные значения степени сорбции составили 41,8; 72,3 и 80,4% соответственно. Аналогичный эксперимент был проведен с барбитуратом натрия – лекарственным препаратом часто вызывающим передозировку. При начальной и конечной концентрации 414,94 нг/мл и 157,47 нг/мл, степень извлечения составила 62,05%. Рис. 4 - Гемодиализная установка для элиминации токсикантов из крови Заключение В данной работе получен углеродный адсорбент наноструктурной морфологии путем карбонизации абрикосовых косточек с последующей парогазовой активацией при 850 C и деминерализацией раствором соляной кислоты. Физико-химические свойства полученного материала исследованы методами низкотемпературной адсорбции азота, сканирующей электронной микроскопии, энергодисперсионного рентгеновского микроанализа; определена максимальная адсорбционная способность по метиленовому голубому. Проведены модельные сорбционные испытания в отношении токсикантов крови. Полученные результаты показали перспективность использования сорбента АК-850 для очистки крови от токсикантов: максимальная степень сорбции достигала 80% для спирта и 62% для барбитурата. 1. Кельцев Н.В. Основы адсорбционной техники. - М.: Химия, 1976. - 512 с. 2. Стрелко В.В., Кортвин Ю.В., Картель Н.Т. Структурно-сорбционные свойства активированных углей КАУ медицинского назначения// Журн.прикл. хим. - 1984. - Т. 57, - № 6. - С.1225-1230. 3. Углеродные наноструктурированные материалы на основе растительного сырья// Под ред. З.А.Мансурова. Алматы: Қазақ университеті. 2010. - C.207-274. 4. Mansurov Z.A., Zhylybaeva N.K., Ualieva P.S. and Mansurova R.M. Obtaining procedure and properties of the sorbents from plant raw material // Chemistry for Sustainable Development. -2002. –Vol. 10. - P. 321-328. 5. Mansurov Z.A. Some Applications of Nanocarbon Materials for Novel Devices // Gross R. et al (eds.). Nonoscale-Devices – Fundamentals.- Springer, 2006. - P. 355-368. 6. Мансурова Р.M. Углеродсодержащие композиции. Химия и химическая технология. Современные проблемы. Алматы: XXI век, 2001. - С. 152-175. 258 УДК: 541.183; 661.183 Ж.М. Жандосов СИНТЕЗ УГЛЕРОДНЫХ МАТЕРИАЛОВ ИЗ СКОРЛУПЫ ГРЕЦКИХ ОРЕХОВ ПУТЕМ КАРБНИЗАЦИИ В ПРИСУТСТВИИ ФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ (Институт проблем горения, КазНУ им. аль-Фараби) Тwo different carbons, namely CWS-P-500_1-1 and CWS -P-500_2-1, were prepared from walnut shells by H3PO4-activation at H3PO4/ precursor (wt/wt) impregnation ratio of 1:1 and 2:1 respectively in self-generated atmosphere for 1 hour at 500 ºC. Low-temperature nitrogen adsorption studies showed that the estimated specific surface area was at least 668 m2/g for CWS-P500_1-1 and 943 m2/g for CWS-P-500_2-1; however methylene blue batch adsorption studies results at equilibrium conditions, which fitted Langmuir model with high R2 values, showed that the maximal methylene blue monolayer capacity varies insignificantly and amounts to 592 mg/g for CWS-P-500_1-1 and 649 mg/g for CWS-P-500_2-1 respectively. These high values of adsorption capacity signify for potential application of the obtained sorbents in water purification processes. Углеродные адсорбенты находят широкое применение в различных процессах очистки от вредных примесей и рекуперации ценных веществ из жидких и газообразных сред. Активированные угли применяют в нефтеперерабатывающей, нефтехимической, винодельческой, масложировой и других отраслях промышленности, все шире их используют в медицине. Возобновляемым сырьём, которое уже находит широкое применение в промышленности, являются лигноцеллюлозные материалы: косточки различных плодов, а также скорлупа грецких орехов (СГО), которые являются отходами производства [1]. Необходимость в дешевых сорбентах, соответствующих требованиям производства (хорошая сорбционная емкость, регулируемые размеры и структура пор и т.д.), приводит к разработке новых способов получения сорбентов. Активированный уголь на основе растительного сырья является дешевым и легкодоступным сорбентом, отличающимся высокой пористостью, прочностью и возможностью многократного использования. В Институте проблем горения на протяжении многих лет проводятся исследования по технологии разработки углеродных наноструктурированных сорбентов на основе растительного сырья [2-5]. Материалы и методы исследований 1 Методика получения углеродного адсорбента. Углеродные материалы СГО-Р-500 были получены путём дробления и пропитки скорлупы грецких орехов раствором 70% фосфорной кислоты в необходимом массовом соотношении, с последующей прекарбонизацией в сушильном шкафу в течение 12 часов при 200 C. Полученную массу поместили в кварцевый реактор и карбонизовали в вертикальной цилиндрической печи снабженной термопарой, в течение 1 часа при 500 C, при ограниченном доступе воздуха. После этого была проведена отмывка сорбента дистиллированной водой от кислоты до нейтральной среды, путём многократного кипячения и декантации. Сорбент сушили в течение 12 часов при 105 C, взвешивали и определяли выход продукта. Первые порции раствора при отмывке от фосфорной кислоты концентрировали путём упаривания, определяли плотность и объем полученного раствора и рассчитывали процент возврата фосфорной кислоты. 2 Методы исследования 2.1 Метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ/EDAX). Исследования морфологии образцов проводились на микроскопе QUANTA 3D 200i (FEI, США) с ускоряющим напряжением 30 кВ. Для проведения локального анализа химического состава образца, микроскоп оборудован энергодисперсионным рентгеновским спектрометром EDAX, оснащенным полупроводниковым детектором с энергетическим разрешением 128 эВ (полимер, окошко d = 0,3 мм.). Электрический пучок фокусируется. 2.2 Определение удельной поверхности методом БЭТ по данным адсорбции азота. Информацию о текстуре образцов СГО-Р-500 получали методом низкотемпературной адсорбции азота на приборе СОРБТОМЕТР предназначенного для определения величины общей удельной поверхности мезо- и макропористых веществ и материалов методом тепловой десорбции газа-адсорбата методом БЭТ в соответствии с ГОСТ 23401-90. Диапазон измерения удельной поверхности- до 1000 м2/г. 2.3 Исследования адсорбции метиленового голубого (МГ). Модельные растворы с необходимыми концентрациями красителя готовили путем последовательного разбавления исходного раствора с концентрацией 4000 мг/л. Навеску 0,1±0,001 г растертого в агатовой ступке угля переносили в стеклянную емкость вместимостью 100 мл, добавляли 25 мл раствора МГ, накрывали чашкой Петри и перемешивали в течение 20 минут на магнитной мешалке. Угольную суспензию переносили в пробирки и центрифугировали в течение 15 минут. Отбирали 5 мл осветлённого раствора для измерения оптической плотности, в кюветах с расстоянием между рабочими гранями 10 мм на фотоэлектроколориметре с использованием синего светофильтра. По значению оптической плотности, используя градуировочный график, определяли остаточную концентрацию МГ в растворе. На 259 основании результатов сорбции МГ на углеродном материале рассчитаны значения равновесной адсорбционной способности по формуле: q e= (C 0 −C e )⋅V m По результатам экспериментов, в координатах Ce/qe-Ce построены изотермы адсорбции Лангмюра в линеаризованной форме, имеющей следующий вид: Ce Ce 1 = + q e q max K 1 q max где Се – равновесная концентрация МГ, мг/л; qe – адсорбционная способность в условиях равновесия, мг/г; KL – константа Лангмюра, л/мг; qmax – сорбционная емкость монослоя (максимальная адсорбционная способность), мг/г. Результаты и обсуждение В данной работе проведена активация предварительно прекарбонизованных с 70% фосфорной кислотой образцов скорлупы грецкого ореха в соотношении 1:1 и 2:1 (по массе, в пересчете на “чистые вещества”), окончательная карбонизация проводилась в реакторе с ограниченном доступом воздуха, но без подачи инертного газа, при температуре 500 Со. Время карбонизации 1ч, а соответствующие углеродные материалы, полученные с выходами 39% и 37% будут далее именоваться СГО-P-500_1-1 и СГО-Р-500_2-1 соответственно. По данным сканирующей электронной микроскопии, представленным на рис.1 (а, в), поверхность частиц образца СГО-Р-500_2-1 претерпела глубокие структурные изменения, в ходе карбонизации в присутствие фосфорной кислоты в сравнении с образцом СГО-Р-500_1-1, сохранившем упорядоченную макроканальную структуру характерную для исходного материала. а б в г Рис. 1 – СЭМ /EDX- анализ образца СГО-Р-500_1-1 (а, б) и СГО-Р-500_2-1 (в, г) 260 Элементный анализ образцов определен с помощью метода энергодисперсионного рентгеновского микроанализа (EDX), представленного на рис.1 (б, г) и являющимся дополнением к исследованиям методом сканирующей электронной микроскопии. Результаты элементного анализа, представленные в табл. 1, свидетельствует о наличии большого количества фосфора. Это косвенно свидетельствует о присутствии C-O-P связей (в составе ковалентно-связанных фосфатных групп), т.к. известно, что пирофосфорная кислота формирует эфирные связи в процессе химической активации лигноцеллюлозных материалов, встраиваясь в углеродную матрицу образующегося материала. В обоих образцах велико содержание углерода, что свидетельствует о достаточной глубине протекания карбонизации. Чем больше степень карбонизации, тем больше содержание углерода, меньше кислорода, и меньше выход продукта. Табл. 1. Текстурные параметры и элементный состав образцов СГО-Р-500 Образец SБЭТ, СЕ по МГ KL, R2 C, O, P, Выход, М2/г qmax л/г % % % % ,мг/г СГО-Р-500_1-1 648 592 11,3 0,9895 91,3 8,2 0,53 39 СГО-Р-500_2-1 943 649 40,3 0,9995 92,6 6,7 0,68 37 По данным адсорбции азота, представленным в табл. 1, приблизительная удельная поверхность SБЭТ образца СГО-Р-500_2-1 оказывается в полтора раза выше, чем образца СГО-Р-500_1-1. Однако адсорбционные исследования по метиленовому голубому, напротив, показывают сопоставимые значения сорбционных емкостей. а б Рис. 2 –Изотермы Лангмюра для МГ на СГО-Р-500_1-1(а) и СГО-Р-500_2-1(б) Оба изученных образца показали хорошее соответствие с моделью Лангмюра, предполагающей формирование мономолекулярного слоя на поверхности сорбента. Согласно расчетным данным, представленным в табл. 1 и на рис. 2, коэффициенты корреляции (R2) для СГО-Р-500_1-1 и СГО-Р-500_1-1 составили 0,9895 и 0,9995 соответственно. Высокие значения сорбционной емкости монослоя МГ (табл. 1) для обоих образцов также свидетельствуют о высокой мезопористости, т.к. известно, что молекула МГ доступна для пор диаметром более 1,5 нм. Кроме того, зная посадочную площадку и количество молекул МГ в монослое, можно также оценить удельную поверхность. Таким образом, согласно адсорбционным исследованиям, образцы является высокопористыми материалами с развитой удельной поверхностью. Заключение. Путем карбонизации скорлупы грецких орехов в присутствии фосфорной кислоты, были получены два различных углеродных материала: СГО-Р-500_1-1 и СГО-P-500_2-1, отличающимися соотношением пропитки– 1:1 и 2:1 соответственно. По данным низкотемпературной адсорбции азота, удельная поверхность образцов различается в 1,5 раза, тогда как адсорбционные исследования красителя метиленового голубого показали, что максимальная сорбционная емкость, полученная из линеаризованного уравнения Лангмюра, меняется незначительно и превышает 600 мг/г. Высокие значения сорбционной емкости полученных сорбентов предполагают эффективность их дальнейшего использования в процессах водоочистки. 1. Мансурова Р.M. Углеродсодержащие композиции. Химия и химическая технология. Современные проблемы. Алматы: XXI век, 2001. - С. 152-175. 2. Evaluation of synthetic conditions for H3PO4 chemically activated rice husk and preparation of honeycomb monoliths Jandosov J.M., Shikina N.V., Bijsenbayev M.A., Shamalov M.E., Ismagilov Z.R., Mansurov Z.A. Eurasian Chemico-technological journal. Almaty, 2009, V.11. -№3. – P. 245 – 252 261 3. Mesoporous Carbon-based Rhodium Catalysts for Benzene Hydrogenation, J. M. Jandosov, Z. A. Mansurov, M. A. Biisenbayev, Z.R.Ismagilov, N.V.Shikina, I.Z. Ismagilov, S .R. Konuspayev, M. Shaymardan, “Carbon2011”, July 24-29,2011, Conference in Shanghai,China, CD-Author index # 880 4. Mansurov Z.A. Some Applications of Nanocarbon Materials for Novel Devices // Gross R. et al (eds.). Nonoscale-Devices – Fundamentals.- Springer, 2006. - P. 355-368. 5.Углеродные наноструктурированные материалы на основе растительного сырья// Под ред. З.А.Мансурова. Алматы: Қазақ университеті. 2010. - C.207-274. УДК 615.9::574. 579.842.11 А.П. Зарубина1, Е.П. Лукашев1, Л.И. Деев1, И.М. Пархоменко1, А.Б. Рубин1, С.А. Шойынбекова2, О.Т. Жылқыбаев2, Н.Б. Кұрманкұлов3 ЛЮМИНИСЦЕНТТІ БАКТЕРИЯЛАРДЫҢ ТЕСТ-ЖҮЙЕЛЕРІН ПАЙДАЛАНЫП БІР ҚАБАТТЫ КӨМІРТЕКТІ НАНОТҮТІКШЕЛЕРДІҢ БИОЛОГИЯЛЫҚ ЭФФЕКТТЕРІН БИОТЕСТІЛЕУ (М.В. Ломоносов атындағы Мəскеу ұлттық университеті, Мəскеу қаласы, əл-Фараби атындағы Қазақ ұлттық университеті, Ə.Б. Бектұров атындағы химия ғылымдары институты) Табиғи люминисцентті Photobacterium leiognathi теңіз бактерияларының lux-опероны енгізіліп клондалған Escherichia coli K12 TG1 штаммының клеткаларына бір қабатты көміртекті нанотүтікшелердің əсері зерттелді. Атомды-күш микроскопы көмегімен нанотүтікшелер əсері динамикадағы бактерия клеткаларының морфологиясының өзгеруі анықталып, КТБ саны бойынша бақыланған клеткалардың тіршілікке қабілеттілігінің төмендегені тіркелді. Клеткалардың тіршілікке қабілеттілігінің төмендеуі мен морфологиялық бұзылуының алдында оттекті тұтыну жылдамдығы жəне бактериялар биолюминисценциясы интенсивтілігінің өзгеруі байқалды. Бұл бактериялардың тірі дақылдарын ғана емес, сонымен қатар стандартты лиофилді кептірілген «Эколюм» жүйесінің биосенсорларын пайдалану арқылы, кең қолданыстағы жəне ыңғайлы биолюминисценттік тестті наноматериалдардың бастапқы улылығын бағалаудың мүмкін екендігін көрсетеді. Сонғы жылдардағы наноматериалдардың биологиялық нысандармен əрекеттесуіне деген зерттеушілер қызығушылығының артуы, оларды қолдану мүмкіндігінің перспективасының зор екендігіне байланысты. Бірақ наноматериалдардың басқа заттардан өзге токсикологиялық қауіпті қасиеттері болуы мүмкін, сондықтан жаңа наноматериалдардың зиянды əсерін зерттеп, бағалаудың қажеттілігі өзекті мəселе болып табылады [1]. Көміртекті материалдар, əресе нанотүтікшелер биологияда, медицинада, күнделікті қолданыстағы жəне жоғары технологиялық өнімдер өндірісінде практикалық маңызға ие наноматериалдар болып табылады. Мұндай нанобөлшектер метанның, жанар майлардың, газдардың жану өнімдерінің құрамына қоршаған ортаға көп мөлшерде бөлінеді [1,2]. Бірақ олардың биологиялық жүйелерге əсері зерттелмеген деуге болады [3,4]. Алдынғы жасалған зерттеулерде біз бір қабатты көміртекті нанотүтікшелер бактериалды клеткалардың қою суспензиясына бактерицидті əсер ететінін анықтадық. Атомдық-күш микроскопиясы жəне комбинациялы шашырату спектрлерін үйлестіре отырып, бактериалды клеткалардың морфологиясының өзгеру сипаты сулы суспензияда шоғырланған бактерия клеткалар мен нанотүтікшелердің ірі агрегаттары пайда болған кезде байқалатындығы көрсетілді. Тазартылған жəне тазартылмаған нанотүтікшелердің бактерия клеткаларына əсерін салыстыра отырып, зерттеп, бактерицидты əсер олардың құрамынадағы қоспалардың болуына емес, тікелей нанотүтікшелерге байланысты деген тұжырым жасалды [5]. Kang S. əріптестерімен ұқсас морфологиялық өзгерістер байқаған [3]. Олар бактериалды клеткалар мен нанотүтікшелер агрегаттарының əрекеттесуін екі түрлі жағдайда зерттеді: Escherichia coli бактерияларын көміртекті нанотүтікшелермен тұзды ерітіндіде инкубациялау арқылы жəне миллисаңылаулы фильтрге жұқтырылған клеткаларға тазартылған көміртекті нанотүтікшелердің агрегаттарының əсерін салыстырды. Авторлар суспензияда дара нанотүтікшелердің клеткаларға іс жүзінде əсер етпейді деп есептейді. Біз бұл тұжырыммен келіспейміз, себебі дара нанотүтікшелердің цитотоксикологиялық əсері шектеулі критерийлермен бағаланған. Ұсынылып отырған жұмыста E. coli бактериясы суспензиясында жеке бір қабатты көміртекті нанотүтікшелердің жəне олардың ұсақ агрегаттарының бактерицидты əсері бағаланды. Мұнда клеткалардың тіршілікке қабілеттілігінің өзгерістері мен морфологиялық зақымдалуы ғана емес, сонымен қатар, олардың метаболизмін сипаттайтын көрсеткіштері: оттекті тұтыну қабілеті жəне бактериялар биолюминисценциясының интенсивтілігі зерттелді. Бұл жеке бір қабатты көміртекті нанотүтікшелердің цитотоксикологиялық əсерін анықтап қана қоймай, сонымен бірге наноматериалдардың улы қасиеттерінің мониторингінің перспективті əдісін ұсынуға мүмкіндік туғызды. 262 Нысандар мен зерттеу əдістері Зеттеу нысандары: люминисцентті Photobacterium leiognathi теңіз бактерияларының luxоперонымен клондалған Escherichia coli K12 TG1(plux) бактерияларының генді-инженерлі штаммы алынған. Штамм М.В. Ломоносов атындағы Мəскеу ұлттық университетінің биология факультетінің микробиология кафедрасының биологиялық белсенді қосылыстар зертханасында алынып, сонда сақталынуда жəне «Эколюм» тест-жүйесінің биолюминисцентті сенсоры ретінде қолданылып, түрлі заттардың улылығын бағалау үшін қолданылады [6]. Бір қабырғалы көміртекті нанотүтікшелер. Диаметрі 0.7–2 нм жəне ұзындығы бірнеше мкм бөлшектері бар нанотүтікшелер Ресей ғылым академиясының А.М. Прохоров атындағы жалпы физика институты жаратылыстану-ғылыми зерттеулер орталығының наноматериалдар спектроскопиясы зертханасында доға разряды əдісімен синтезделген [7]. Көміртектің басқа формалары жəне металдық катализаторлар қалдықтарынан арнайы химиялық əдістермен тазартылған нанотүтікшелер [8]. Тəжірибенің алдында стерилді дистилденген судағы көміртекті нанотүтікшелері ұнтағының суспензиясы ірі агрегаттарын бұзу үшін ультрадыбыспен бір сағат өңделді. Тəжірибе барысы: тəжірибеге 220 айналым/мин. əткеншекте 28°С-та терең жағдайда LBсорпасында өсірілген E. сoli бактериясының түнгі дақылы алынды. E. сoli бактериясының тығыздығын нефелометрия (к = 670 нм) əдісімен бағаланып, 1 мл-дегі клетка саны алдын ала құрастырылған калибрлеу қисығы бойынша анықталды. Бактерия суспензиясын 1 мл-лі конусты микроцентрифуга пробиркаларына 1 мл-ден құйып, центрифугада мин. бойы g жылдамдықпен айландыру арқылы тұнбаға түсірілді. Дайындалған E. сoli суспензиясы мен бір қабатты көміртекті нанотүтікшелерді, клетка мен нанотүтікшелер аяққы концентрациялары 1 мл сулы суспензияда 1·9 жəне мг болатындай етіп араластырылды. Бақылау үлгілері ретінде дистилденген суда өсірілген бактерия клеткалары алынды. Бақылау жəне тəжірибе үлгілерін (нанотүтікшелермен) 0,3 мл көлемде ( қайтара) «Vortex»-те араластырып, бөлме температурасында (20-21°С) 1, 2, 3 сағ., сонымен қатар 17 тəулік аралығында өсірілді. Инкубациядан кейін үлгілерді дистилденген сумен 1,5 мл-ге жеткізіп, араластырады жəне мин нанотүтікшелердің ірі агрегаттары жəне оларға жабысқан бактерияларды бөлу үшін 1000 g жылдамдықта центрифугағалайды. Зерттеу үшін ұсақ агрегаттары, жеке нанотүтікшелері жəне бактерия клеткалары бар тұнба бетіндегі сұйықтық алынды. Бактериялардың тіршілікке қабілеттілігі бактерия суспензиясын сұйылту əдісімен анықталды. Ол үшін 2, 3, 5 тəулік өсірілген бактерия суспензиясын агарланған LB қоректік ортада, 32°С-та 24 сағат инкубацияланады. Бақылау жəне тəжірибе үлгілерінде өскен биолюминисцентті колониялардың саны (колониятүзуші бірлік КТБ) анықталды. Бактерия клеткаларының морфологиясы жəне бір қабатты көміртекті нанотүтікшелердің əсері FemtoScan атомдыкүш микроскопының («Перспективті технологиялар орталығы», Мəскеу) көмегімен зерттелді. Сұйықтатылған бактерия клеткалардың суспензиясын ( мкл) слюданың жаңа сындырып алынған бетіне тамызып, мин жабық Петри табақшасында кептірілді. Зондтың үлгі беттеріне əсерін азайту үшін зерттеулер бөлме температурасы мен ылғалда, жартылай контактлі режимде жүргізілді. Үлгілерді дайындаудың бұл əдісі қойылған мəселеге сəйкес келеді, себебі, бұрынырақ бақылау препараттарында клеткалардың морфологиялары бірнеше ай бойы өзгермей сақталатындығы көрсетілген [9,10]. Кейбір тəжірибелерде Nanoscope III (Digital Instruments, АҚШ) атомды-күшті микроскобы қолданылған. Өлшемдер үзік түйісу режимінде жүргізілді. Алынған кескін FemtoScan Online бағдарламасы көмегімен өңделді. Дистилденген суда бактериялардың оттек тұтынуына нанотүтікшелердің əсерін полярография əдісімен Кларктың оттекті электродымен, AZ885 термометрімен жəне магнитті араластырғыш роторымен жабдақталған термостатты (25 оС) герметикалық кюветада анықталды. Вольт-амперлі қисықтарды жəне диффузиялық токтың шекті мəндерінің өзгерістерін (полярланған кернеуі – 0.69 B) тіркеу полярограф ПУ-, санды мультиметр M4660A жəне оның бағдарламасымен қамтамасыз ету арқылы жүзеге асырылды. Дистилденген суда 25оС-да еріген оттегі концентрациясын, тəжірибе уақытындағы атмосфералық қысымының мəнін ескере отырып, Генри сəйкестігі бойынша есептелінді. Бактериялардың 109 клеткаға шаққандағы оттегін тұтыну жылдамдығы нмоль О/мл/мин бойынша есептелді. Сəулелену интенсивтілігі жəне биосенсордың сəулелену интенсивтілігі үлгілердің токсикологиялық индексі бойынша анықталды [6]. Токсикологиялық индексі Т = 100-(I0 I)/ I0 формуласы бойынша есептелді, мұндағы I0 бактерия клеткаларының бақылаудағы, ал I тəжірибе үлгілеріндегі интенсивтілігі. 263 Оттегін тұтыну жылдамдығын, биолюминисценция интенсивтілігін, КТБ санын анықтау үшін жəне атомдық-күш микроскопы скандарын дайындау үшін қажетті сынамалары бір мезгілде, бірдей бақылау жəне тəжірибе бактерия суспензияларынан алынды. Бактериялардың өсуі жəне оларға бір қабатты көміртекті нанотүтікшелердің əсері «Биотокс» люминометрі көмегімен бағаланды. Тəжірибе нəтижелері жəне оларды талдау Бұл жұмыста бактериалды клеткалардың жекеленген бір қабатты көміртекті нанотүтікшелермен жəне олардың ұсақ агрегаттарымен əрекеттесуінің нəтижелері келтірілген. Таңдалған центрифугалау режимінде (g) бастапқы суспензия клеткаларының -ы, сонымен қатар бір қабатты көміртекті нанотүтікшелердің ірі агрегаттары тығыз қара тұнба түрінде шөгетінін 670 нм-дегі нефелометриялық өлшеу арқылы жəне супернатанттағы толқын ұзындығы 240370 нм-де жазылған жұтылу спектрі бойынша анықталған. Бұл кезде нанотүтікшелермен 16 тəулік аралығында əрекеттескен, бірақ олардың агрегаттармен байланыспайтын бактериялар суспензияда қалады. 1 сурет. Бір қабатты көміртекті нанотүтікшелермен инкубацияланған бактерия клеткаларының морфологиялық өзгерістері: а-бақылау; б-бір қабатты көміртекті нанотүтікшелермен өсірілген клеткалар Біз клеткаларда болатын (анықталған жəне төменде сипатталып жазылған) өзгерістерді жеке көміртекті нанотүтікшелердің жəне олардың тұнбаға түспейтін майда агрегаттарының əсерінен болады деп есептейміз. -суретте E. сoli бактериясы клеткаларының тəуліктен кейінгі бақылау суспензиясындағы (а) жəне көміртекті нанотүтікшелермен инкубацияланған (б) үлгілерінің атомдық-күш микроскопымен алынған мəліметтер келтірілген. Таяқша пішінді клеткалардың ұзындығы 22,5 мкм, ені ~1 мкм, биіктігі 250 ± 50 нм. Төсеніш бетіне инкубациялағанда нанотүтікше конгломераттарымен байланыспаған жəне центрифугалау кезінде тұнбаға түспеген бактериалды клеткалар жұқтырылды. Өсірілген бақылау жəне тəжірибе үлгілерін 4-тəулікте салыстырғанда, нанотүтікшелермен инкубацияланған бактериалды клеткалар морфологиясының қатты өзгергені анық көрінеді. Клеткалардың бет жағы деформацияланып, ішкі құрамы жартылай жойылады, нəтижесінде клетканың ортасында ойық пайда болады. Нанотүтікшелермен тəулік инкубацияланған клеткалардың ішіндегі нəрі ағып кетеді де, атомдық-күш микроскоптарындағы скандарда тек жаншылған клетканың қабықшасы ғана көрінеді. Бактериалды клеткалар морфологиясына тазартылған жəне тазартылмаған нанотүтікшелі материалдардың əсерлерінде айқын айырмашылық байқалған жоқ. 1 кесте. Бір қабатты көміртекті нанотүтікшелермен инкубацияланған бактерия клеткалардың тіршілікке қабілеттілігі (КТБ саны бойынша) Инкубация уақыты, 0 2 3 4 5 тəулік КТБ саны, мл бақылау 8,9×109 7,7×109 7,2×109 6,8×109 6,6×109 тəжірибе 4,8×109 5,2-108 3,8-108 3,7-108 Нанотүтікшелер бактерия клеткаларымен тікелей жанасқанда клетка қабырғасы мен мембранасын бұзады деп болжауға болады. Клеткалар морфологиясының бұзылуы нанотүтікшелердің бактерицидті əсерімен байланысты екендігін бактерия клеткалардың тіршілікке қабілеттілігінің көрсеткіштері дəлелдейді (-кесте). Бұл кестеден көрініп тұрғандай, аз көлемде конусты микроцентрифуга 264 пробиркаларында бөлме температурасында инкубацияланған жəне əрі қарай стационарлы жағдайда агар ортасында өсірілген бактериялардың титрі екінші тəулікте екі есе, ал үшінші тəулікте он есе азаяды. Сонымен, нанотүтікшелермен əрекеттескенде бактериялардың жойылуы атомдық-күш микроскопымен анықталған морфологиялық өзгерістердің алдында жүзеге асатындығы көрсетілді. Клетканың тіршілікке қабілеттілігінің төмендеуі жəне морфологиялық өзгерістерімен қатар, олардың оттекті тұтыну жылдамдығы мен биолюминисценциясының интенсивтілігінің өзгеруі де байқалды. Бақылау үлгілеріндегі жəне нанотүтікшелермен тəулік аралығында инкубацияланған клеткалардың оттекті тұтыну жылдамдықтарын салыстырғанда, соңғысының (нанотүтікшелі үлгілерде) оттекті тұтыну жылдамдығының төмендеуі бір тəуліктен кейін-ақ байқалды. Бактерияларды бір қабатты көміртекті нанотүтікшелермен тəулік инкубациялағанда, оттекті тұтыну жылдамдығы бақылау үлгілерімен салыстырғанда 36,6 % төмендейді. Əрі қарай, 56 тəуліктер аралығында ол көрсеткіш аса өзгермейді. Біз қолданып отырған сəулеленетін фенотипті E. сoli бактерия штаммынның биолюминисценциясы тəжірибені жүргізу жағдайында ұзақ уақыт тұрақты болатындығы, бір қабатты нанотүтікшелердің бактерия клеткасына əсерін бірнеше тəулік бойы бақылауға мүмкіндік берді. Нанотүтікшелермен инкубацияланған клеткалар биолюминисценциясы екі тəуліктен кейін күрт төмендесе, бұл клеткалардың айқын морфологиялық өзгерістері тек төрт тəуліктен кейін ғана пайда болатынын анықтадық (2-кесте). Бұл морфологиялық өзгерістер пайда болардың алдындағы биолюмиесценттік өшіру кезеңінде клеткалардың тіршілікке қабілеттілігі төмендейтінін КТБ тесті бойынша анықтадық. 2 кесте. Нанотүтікшелермен əрекеттескен бактериялардың биолюминисценциясы Бактерияларды инкубациялау Бактериялардың Регидратациядан кейінгі лиофилді уақыты, сағ. нативті клеткалары кептірілген бактериялар Токсикологиялық индекс (Т) 0 2 7 24 45 -100 48 56 52 72 73 81 * (T < 0) – сəулелену стимуляциясы байқалады, механизмі түсініксіз, токсикологиялық зерттеулерде үлгі токсикологиялық емес деп есептеледі [6]. Бактерия биолюминисценциясының интенсивтілігіне нанотүтікшелердің əсерін нативті клеткаларға жəне белгілі əдіспен регидратталған [6], лиофилді кептірілген, «Эколюм» биосенсорда қолданылатын бактерияларға зерттедік. Регидратталған бактериялардың қою суспензиясы бір қабатты көміртекті нанотүтікшелермен инкубацияланды, бұл суспензияның соңғы концентрациясы 19 клетка мен 0.2 мг нанотүтікшелерді құрайды. Біз олардың биолюминисценциясы бір тəуліктен кейін-ақ 4550 %-ға төмендейтінін анықтадық, ал нативті клеткаларда ондай өзгеріс 2 тəуліктен кейін ғана байқалған болатын (2 кесте). Бактериалды биолюминисценция негізіндегі тест-жүйелер ынғайлы, əрі экономикалық тиімді, ол алуан түрлі химиялық заттар мен олардың қоспаларының, сонымен қатар физикалық əсерлердің улылығын жедел бағалу үшін кеңінен қолданылады [11,12]. Биотестлеудің бұл əдісі өлшеудің қарапайымдылыңымен, жеделдігімен (үлгінің экспрессанализінің уақыты 530 мин құрайды), дəлдігімен, алынған мəндердің ұдайы қайталанатындығымен (тəжірибе қателігі 10 %-ға жуық), тестілеудің микрокөлемде жүргізілетіндігімен (0,11,0 мл), өзге тест-жүйелерімен алынған нəтижелермен корреляциясы бойынша ерекшеленеді [1416]. Бактерицидті эффектілердің əсерін зерттеу арқылы, бактериалды клеткалардың тіршілікке қабілеттілігі мен биолюминисценция арасында тікелей байланыс бар екендігі анықталды [17, 18]. Стандартты биосенсордың лиофилді кептірілген люминесцентті бактериялары ұзақ сақталады (жарты жылдан аса) жəне оларды қажет болса əртүрлі тесттерде пайдалануға болады [6, 11]. Бактериалды клеткаларды нанотүтікшелермен инкубациялаудың бастапқы кезеңінде-ақ оттегін тұтыну бойынша өзгерістері байқалады. Бір сағаттан кейін оттекті тұтынуы 2 есе өседі де, сағатта клеткалар мен нанотүтікшелердің əрекеттесуі қайта қалпына келеді (2 сурет). 265 2 Сурет. Бактериалды клеткалардың бір қабатты көміртекті нанотүтікшелермен инкубациялаудың бастапқы кезеңінде оттегін тұтынуының өзгеруі: К – бақылау, О – бір қабатты көміртекті нанотүтікшелермен инкубациялау Дəл осы уақытта, яғни оттекті тұтыну өскенде, биолюминисценция интенсивтілігі бақылаумен салыстырғанда 60 %-ға дейін төмендейді. Бұл ерте эффекттер қызметіне қатысатын тотықсызданған флавин үшін өзара бəсекелесетін биолюминесценция мен тыныс алу тізбектері реакцияларының қосарлануына нанотүтікшелердің əсер етуіне байланысты болуы мүмкін [1]. Бұл эффекттің механизмі əлі түсініксіз жəне қосымша зерттеуді талап етеді. Сонымен, бактериалды клеткалардың сулы суспензияларын бір қабатты нанотүтікшелермен инкубациялағанда бактериалардың бұзылатындығы анықталды. Бұл бір қабатты қабатты нанотүтікшелердің бактерицидті əсері бар, ол бактериалды клетка қабырғалары мен мембраналарын механикалық бұзады деп тұжырым жасауға мүмкіндік береді. Бактериалды клеткалардың оттекті тұтыну жылдамдығының динамикасы мен олардың биолюминисценциясының интенснвтілігі биохимиялық бұзылулар айқын морфологиялық өзгерістерге əкелетіндігін көрсетеді. Бұл наноматериалдардың бастапқы улылығын бағалау үшін нативті бактерия дақылдарына ғана емес, сонымен қатар стандартты лиофилді кептірілген «Эколюм» биосенсоры жүйесі үшін де кеңінен қолданылатын жəне ыңғайлы бактериялды люминесцентті тест жасауға мүмкіндік береді. 1. Козырев С.В., Якуцени П.П. // Нанотехнологии — панорама направлений. Российские нанотехнологии. - 2008. - Т. 3. - № 3—4. - С. 8—11. 2. Murr L.E., Bang J.J., Lopez D.A. // J. of Mater. Sci. - 2004. - V. 39. - E 2199-2204. 3. Kang S., Pinault M., Pfefferle L.D., Elimelech M. // Langmuir. - 2007. - V. 23. - №. 17. - P. 8670-8673. 4. Shvedova A.A, Castranova V. , Kisin E.R. // J. of Toxicology and Environmental Health, Part A. - 2003. - V. 66. - R 1909-26. 5. Образцова Е.А., Лукашев Е.П., Зарубина А.П., Пархоменко И.М, Яминский И.В. // Вестник Моск. Ун-та. Сер. № 3. Физика и астрономия. - 2009. - № 3. - С. 19-24. 6. Данилов В.С., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е., Соловьева Л.Н., Карташев Ф.В., Завильгельский Г.Б. // Вестник Моск. Ун-та. Сер. 16. Биология. - 2002. - № 3. - С. 20-24. 7. Obraztsova E.D., Bonard J.-M., Kuznetsov V.L. et al. // Nanostructured Materials. - 1999. - V. 12. - P. 56. 8. Terekhov S.V., Obraztsova E.D., Lobach A.S., Konov V.I. // Appl. Phys. - 2002. - V. 74. - P. 393-396. 9. Sokolov I.Y., Firtel M., Henderson G.S.J. // Vac Sci Technol. - 1996. - V. 14. - P. 674-678. 10. Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров. / Под ред. Яминского И.В. М.: Научный мир. - 1997. - С. 88. 11. Зарубина А.П., Мажуль М.М., Новоселова Л.А., Гапочка М.Г. // Сенсор. - 2005. - №3. - R 14-21. 12. Steinberg S.M., Poziomek E.J., Engelmann W.H., Rogers K.R. // Chemosphere. - 1995. - V. 30. - № 11. - P. 2155-2197. 13. Мажуль М.М., Завильгельский Г.Б., Зарубина А.П., Юдина Т.П., Данилов В.С. // Микробиология. - 1999. - Т. 68. - № 2. - С. 149-154. 14. Bulich A.A., Tung K.K., Scheibner G. // J. Biolum. Chemilum. - 1990. - V. 5. - № 2. - R 71-77. 15. Kaiser K.L. // Environ. Health Perspect. - 1998. - V. 106. - № 2. - R 583-591. 16. Данилов В.С., Ганшин В.М. // Сенсорные системы. - 1998. - Т. 12. - № 1. - С. 56-68. 17. Backhaus T., Grimme L.H. // Chemosphere. - 1999. - V. 38. - № 14. - R 3291-3301. 18. Jassim S.A.A., Ellison A., Denyer S.P., Stewart G.S.A.B. // Biolum. Chemilum. - 1990. - V. 5. - № 3. - P. 115-122. *** Изучено действие одностенных углеродных нанотрубок (ОУНТ) на клетки штамма Escherichia coli K12 TG1 с клонированным в него lux-опероном природных люминесцентных морских бактерий Photobacterium leiognathi. С помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) выявлены изменения морфологии бактериальных клеток в динамике действия ОУНТ, зарегистрировано снижение выживаемости клеток, контролируемое по числу КОЕ. Показано, что морфологическим нарушениям и снижению выживаемости клеток предшествовали изменения скорости потребления 266 кислорода и интенсивности биолюминесценции бактерий. Это позволяет предложить широко используемый и удобный биолюминесцентный тест для первичной оценки токсичности наноматериалов, используя не только живые культуры бактерий, но и стандартные лиофильновысушенные биосенсоры системы «Эколюм». *** The effect of a single-wall carbon nanotubes (carbon SWNT) on bacterial cells Escherichia coli K12 TG1 with cloned luxoperon of natural marine bacteria Photobacterium leiognathi was studied. Using atom force microscopy (AFM) bacterial cell morphological changes were revealed and cell viability decrease controlled by the number of colony-forming units was registered. It was shown that prior to these changes we can observe changes in the intensity of oxygen consumption and bacterial luminescence intensity. This allows to recommend well-known and easy-to-use bioluminescent test for initial testing of nanomaterial toxicity, using for this purpose living bacteria cultures as well as lyophilized biosensors «Ecolum». УДК 574.64 Б.К. Заядан*, Д.Н. Маторин**, К. Болатхан,*** А.К. Садвакасова,* А.А. Усербаева,* А.Ж. Балтабекова* ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА И ЗОЛОТА НА ПАРАМЕТРЫ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА МУТАНТОВ ЗЕЛЕНОЙ МИКРОВОДОРОСЛИ CHLAMYDOMONAS REINHARDTII DANG (* Казахский национальный университет имени аль-Фараби ** Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова *** Ийылдыз Технический Университет (Стамбул)) В данной статье представлена перспективность использования высокочувствительных мутантов Chlamydomonas reinhardtii для оценки токсикологического действия современных наноматериалов. Ключевые слова: Chlamydomonas reinhardtii Dang, наночастицы серебра, золота, флуоресценция хлорофилла, фотосинтез, биотестирование, экология. В настоящее время все возрастающее внимание во всем мире уделяется перспективам развития нанотехнологий. Использование нанотехнологий и наноматериалов бесспорно является одним из самых перспективных направлений науки и техники в XXI веке. Учитывая, что в перспективе ожидается тесный контакт человека и других биологических объектов с наноматериалами, изучение вопросов потенциальных рисков их использования представляется первостепенной задачей. В настоящее время для задач биомониторинга перспективным является применение методов измерения флуоресценции хлорофилла для выявления действия токсикантов на водоросли [1, 2, 3, 4]. Основой флуоресцентных методов является то, что хлорофилл, находящийся в фотосинтетических мембранах, служит своего рода природным датчиком состояния клеток водорослей. Достижения в изучении механизмов первичных процессов фотосинтеза выявили связь показателей флуоресценции хлорофилла с характеристиками состояния фотосинтетического аппарата фотосинтезирующих организмов [5, 6]. Энергия кванта света, поглощенного светособирающим комплексом, может быть превращена в энергию разделенных зарядов, которая используется в дальнейших реакциях фотосинтеза, либо потеряна путем излучения кванта флуоресценции или за счет рассеяния в тепло. Измерение соотношения интенсивности флуоресценции хлорофилла при насыщающем фотосинтез возбуждающем свете (Fm) и условиях, не вызывающих изменений состояния фотосинтетического аппарата (Fо), позволяет определить эффективность первичных процессов фотосинтеза, которая равна (Fm-Fо)/Fm=Fv/Fm. Эффективность первичных процессов фотосинтеза (Fv/Fm) представляет собой безразмерную энергетическую характеристику фотосинтеза, аналогичную коэффициенту полезного действия и не зависящую от видовой специфики организма [7]. Интенсивность флуоресценции Fо с высоким коэффициентом корреляции соответствует суммарному содержанию светособирающих пигментов фотосинтетического аппарата фитопланктона, и, соответственно, коррелирует с обилием клеток микроводорослей [8, 9]. Целью данной работы является выявление токсического эффекта наночастиц серебра и золота на клетки дикого и мутантных штаммов микроводорослей Chlamydomonas reinhardtii. Материалы и методы В работе использовались штамм дикого типа СС-124 и мутантные штаммы (устойчивый к эритромицену СС-79 и к норфлуразону Nfr -4) зеленой микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii из коллекции фототрофных микроорганизмов кафедры биотехнологии КазНУ им. аль- Фараби. Подсчет клеток в суспензии осуществляли под микроскопом в камере Горяева. Культирование водорослей 267 осуществляли в фотогетеротрофных условиях при температуре 25-280 С [10]. В работе исследованы препарат наносеребра [Ag] (средний радиус 40 нм), препарат коллоидного золота [Au] (средний радиус 25 нм). Измерения флуоресцентных показателей водорослей проводили на импульсном флуорометре WaterPAM (Walz, Германия). В адаптированных к темноте образцах регистрировали постоянную (Fо) и максимальную флуоресценцию (Fm ), а также относительный выход переменной флуоресценции (Fv/Fm ) у водорослей, который является мерой потенциальной квантовой эффективности фотосистемы 2 (ФС 2). Результаты и обсуждение В результате измерения обилия микроводорослей по F0 и состояния его фотосинтетического аппарата по Fv/Fm клеток C. reinhardtii в контроле и после добавления наночастиц серебра. В таблице 1 представлены результаты измерения обилия микроводорослей по F0 и состояния его фотосинтетического аппарата по Fv/Fm клеток C. reinhardtii в контроле и после добавления наночастиц серебра и золота (суточная инкубации). Видно, что наночастицы серебра у клеток дикого типа C. reinhardtii ингибируют как количество клеток, так и фотосинтетическую активность Fv/Fm. Мутантный штамм устойчивый к эритромицену СС-79 более чувствителен к действию наночастицы серебра. Подобные данные были получены и по действию повиалгола (медпрепарата, содержащего коллоидное серебро) на максимальный квантовый выход ФС 2 -Fv/Fm. Наночастицы золота увеличивали у клеток дикого типа Fo по сравнению с контролем. Однако у мутантов наблюдалось ингибирование Fo, особенно у мутанта устойчивый к норфлуразону Nfr -4). Мутант СС- 79 оказался более чувствителен к действию наночастиц золота по фотосинетической активности Fv/Fm. Эти данные показывают, что мутанты водорослей C. reinhardtii могут иметь разную чувствительность к токсикологическому действию наноматериалов. Видно, что наночастицы серебра у клеток дикого типа C. reinhardtii ингибируют как количество клеток, так и фотосинтетическую активность Fv/Fm. Мутант CC-79 более чувствителен к действию наночастицы серебра. Подобные данные были получены и по действию повиалгола (медпрепарата, содержащего коллоидное серебро) на максимальный квантовый выход ФС 2 -Fv/Fm. Эти данные показывают, что мутанты микроводорослей C. reinhardtii могут иметь разную чувствительность к токсикологическому действию наноматериалов. Таблица-1 Изменения параметров флуоресценции клеток C. reinhardtii в контроле и после добавления наночастиц серебра и золота (суточная инкубации) Наночастицы серебра, Обьекты Наночастицы золота,10-5 М 5х10-6 М Fv/Fm, Fo,% Fv/Fm,% Fo,% от % от от от контроля контроля контроля контроля CC-124 37 22 156 100 СС- 79 46 0 92 88 Nfr -4 30 15 62 103 Рисунок 1- Влияние наночастицы серебра на рост клеток дикого типа и мутантных штаммов Chlamydomonas reinhardtii Как видно из рисунка 1 в первые сутки инкубирования увеличивается рост клеток от 1 до 3,5 млн во всех культурах микроводорослей, кроме культуры мутантного штамма Nfr-4, обработанного наночастицами серебра. На вторые, третьи сутки наблюдается прирост биомассы до 4 млн кл/мл в контроле и до 2 млн кл/мл в культурах Nfr-4 и СС 124+Ag NO3. В варианте Nfr-4+AgNO3 к данному времени культивирования прирост биомассы составляет 1,5 млн кл/мл. Максимальный рост клеток 4, 4 млн кл/мл в культуре CC 124, взятом за контроль наблюдается на 8 сутки, а затем наблюдается 268 постепенное снижение роста до 4 млн кл/мл на 15 сутки. Прирост культур CC 124+AgNO3, Nfr-4 K на 8 сутки составляет 3 млн кл/мл, в варианте мутантная культура Nfr-4 +AgNO3 этот показатель равен 2 млн кл/мл. На 11 сутки эксперимента наблюдалось снижение роста в вариантах с мутантным штаммом, в то время как клетки дикого штамма CC 124 в варианте с добавлением AgNO3 продолжали расти до 3,5 млн. В последующие сутки инкубирования наблюдался рост у мутантных штаммов как обработанных серебром, так и необработанных, исключением является дикий штамм CC 124+AgNO3, его рост снижается до 3 млн. Таким образом, рост клеток мутантного штамма C. reinhardtii при добавлении наночастиц серебра был сравнительно ниже в отличие от штамма дикого типа. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что мутанты зеленой микроводоросли Chl. reinhardtii в сравнении с дикими штаммами более чувствительны к токсикологическому действию наноматериалов. Показано, что наночастицы серебра могут снижать скорость развития культуры микроводорослей Chlamydomonas reinhardtii и существенно изменять параметры флуоресценции хлорофилла, отражающие первичные процессы запасания световой энергии в фотосинтезе. Наблюдалось снижение квантового выхода фотохимического превращения световой энергии в фотосинтезе. У мутантов Chlamydomonas reinhardtii наблюдаются различия в чувствительности к наночастицам. Таким образом, согласно полученным результатам клетки штамма дикого типа Chlamydomonas reinhardtii CC-124 более устойчивы к присутсвию наноматериалов по сравнению с клетками мутантныых штаммов СС-79 и Nfr -4. Это означает, что при комплексной оценке действия наноматериалов на состояние живых организмов можно использовать в какчестве модельных объектов штамм дикого типа Chlamydomonas reinhardtii CC-124 и мутантные штаммы СС-79 и Nfr -4. Подводя итог можно предположить, что биотестирование с помощью микроводорослей может иметь практическую ценность для выявления как органических, так и неорганических загрязнителей. При этом использование высокочувствительных мутантов Chlamydomonas reinhardtii в оценке токсикологических действий современных наноматериалов является перспективным направлением системы биотестирования. 1. Vavilin D.V, Polynov V.A.,Matorin D.N., Venediktov P.S. The subletal concentrations of copper stimulate photosystem II photoinhibition in Chlorella pyrenoidosa // J. Plant Physiol. -1995. -V. 146 (5-6). -P. 609-613. 2. Маторин Д.Н., Погосян С.И., Смуров А.В. Оценка качества среды инструментальными методами с использованием фототрофных организмов. В учебном пособии. Биологический контроль окружающей среды. Биоиндикация и биотестирование. Под ред. Мелехова О.П, Егорова Е.И. - М.: Изд. Академия, 2007. - С. 243-246. 3. Brack W., Frank H. Chlorophyll a fluorescence: a tool for the investigation of toxic effects in the photosynthetic apparatus // Ecotoxicology and Environmental Safety. - 1998. - Vol.40. - №l-2. - P.34-41. 4. Schreiber U., Muller J., Haugg A., Gademann R. New type dual-channel PAM chlorophyll fluorometer for highly sensitive water toxicity biotest // Photosynth. Res. - 2002. - V. 74. - P. 317-330. 5. Antal T. K., Matorin D. N., Ilyash L. V., Volgusheva A. A., Osipov V. A.,. Konyuhov I. V.,Krendeleva T. E., Rubin A. B. Probing of photosynthetic reactions in four phytoplanktonic algae with a PEA fluorometer // Photosynthesis Research. - 2009, -V.102. –P. 67–76 6. Matorin D.N., Antal T.K., Ostrowska M., Rubin A.B., Ficek D. Chlorophyll fluorometry as a method for studying light absorption by photosynthetic pigments in marine algae // Oceanologia. - 2004.- V.46. -№4. - P.519-531. 7. Krause G.H., Weis E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics // Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. - 1991. - V.42. - P. 313-349. 8. Маторин Д.Н. Использование флуоресцентных методов измерения активности фотосистемы II при биомониторинге фитопланктона // Биофизика. - 2000. - Т.45/3. - С. 491-494. 9. Ostrowska M., Majchrowski R., Matorin D. N., Woźniak B. Variability of the specific fluorescence of chlorophyll in the ocean. Part 1. Theory of classical `in situ' chlorophyll fluorometry // Oceanologia. – 2000. - V.42(2). - P. 203-219. 10. Заядан Б.К., Экобиотехнология фототрофных микроорганизмов // Монография. –Алматы: «Арыс», 2011 г. – 380 с. *** Қазіргі заман наноматериалдарының улы əсерлерін бағалауға жоғарғы сезімтал Chlamydomonas reinhardtii мутант штамдарын пайдаланудың келешегіне мол деп қорытынды жасауға болады. *** We conclude that the use of highly sensitive mutants of C. reinhardtii may be promising for the assessment of the toxic effects of modern nanomaterials. 269 УДК 577.21 У.Е. Каиров1,3, А.Ю. Зиновьев2, Т.А. Карпенюк1, Е.М. Раманкулов3 ДНК-МИКРОЧИПЫ: ОТ ОСНОВ ТЕХНОЛОГИИ К АНАЛИЗУ ДАННЫХ (1Казахский национальный университет им. аль-Фараби, г. Алматы Казахстан, 2«Институт Кюри», г. Париж, Франция, 3РГП «Национальный центр биотехнологии РК», г. Астана, Казахстан) В статье приведены данные о технологиях создания и использования ДНК-микрочипов для изучения качественных и количественных характеристик генома и транскриптома при различных физиологических состояниях клеток и тканей. В настоящее время развитие биотехнологии и биомедицины тесно связано с реализацией новых подходов в постгеномных исследованиях. Благодаря возможности исследования ДНК и широкому скринингу генной активности с помощью новых методов, не только функциональная характеристика целых геномов, но и диагностика социально значимых заболеваний переходит на новый уровень, позволяющий дифференцировать симптоматически и морфологически неразличимые формы. Одним из таких инструментов является технология высокоплотных микрочипов (Рисунок 1). ДНК-микрочип – это структурированная матрица с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами, называемыми пробами, механически или in situ нанесенными на плоский и твердый субстрат в виде стекла или силикона [1-3]. Рисунок 1. Схема разновидностей микрочипов и их ассоциация с клеточными процессами В настоящее время, существуют четыре доминирующие компании по производству микрочипов (Affymetrix [6], Agilent Technologies [7], Illumina [8] и Roche Nimblegen [9]). Несмотря на то, что каждая компания использует различные методы производства микрочипов, принцип действия и механизм использования остается одинаковым. То есть, для отличия и разделения одного участка нуклеиновой кислоты используется реакция гибридизации нуклеиновых кислот. На основе этой реакции разработаны приложения с использованием микрочипов, которые включают такие подходы, как профилирование генной экспрессии [10], сравнительная геномная гибридизация [11], детекция полиморфизма единичного нуклеотида [12] и детекция взаимодействия между белком и нуклеиновой кислотой [13]. Основной принцип технологии микрочипов состоит в следующем: участки ДНК, РНК или белок (проба) наносятся на твердую основу (чип), выполненную из стекла, пластика или силикона [1-3]. Такой комплекс может выступать как специфический репортер для определения количества копий ДНК или для измерения экспрессии известного гена или количества белка. Пробы, как правило, 270 отбираются специфично с целью последующего количественного определения сигналов с исследуемых образцов. В случае ДНК или РНК проб, специфичность обеспечивается благодаря комплементарности между последовательностью пробы и исследуемой последовательностью, в случае белков – комплементарностью с соответствующим антителом. Пробы амплифицируют и размещают на микроскопическом участке чипа (ячейка). Затем, ДНК, РНК или белки выделяют из экспериментального образца и проводят гибридизацию на чипе. Если участок ДНК или РНК или белок представлен в образце, то произойдет фиксация с соответствующей пробой. Тысячи и даже миллионы таких ячеек на микрочипе, представляют собой высокопроизводительное средство для масштабного геномного скрининга. Разработки в области технологии микрочипов стремительно развиваются и регулярно описываются новые методы и возможности исследования геномов. Разнообразие микрочипов заключается в применении различных типов исследуемых источников, в использовании различных материалов для подложки чипа, в количестве проб на чипе, а также способе производства таких микрочипов. Методы производства микрочипов можно разделить на четыре основных категории: - in situ синтез проб с нуклеиновыми кислотами фотолитографным методом; - in situ синтез методом ink-jet или бесконтактной печати; - роботизированное нанесение пресинтезированных нуклеиновых кислот методами контактной или бесконтактной печати; - рандомизированное размещение пресинтезированных нуклеиновых кислот, прикрепленных к бусинам. В технологии, названной фотолитографией, используется набор светонепроницаемых масок для селективного блокирования или экспозиции света на участки с твердым субстратом (подложка). С помощью селективной экспозиции ультрафиолета проводят синтез нуклеиновых кислот или других молекул через направленные фотохимические реакции (Рисунок 2, адаптирован из [4]). Данную технологию в своих микрочипах GeneChips реализует компания Affymetrix. Олигонуклеотиды синтезируются посредством нескольких повторяемых этапов химических реакций. На первом этапе, подложка незащищена от ультрафиолетового света, который удаляет фотолабильные защитные группы на концах олигонуклеотидных проб. Только те олигонуклеотиды на подложке, которые не заблокированы светонепроницаемой маской, не защищены от ультрафиолетового света. Такие незащищенные участки подложки активируются для следующего этапа. Олигонуклеотиды на защищенных участках подложки остаются все еще неактивными. На втором этапе или реакции связывания, нуклеотидные мономеры с фотолабильными защитными группами наполняют твердую поверхность микрочипа. Мономеры вступают в реакцию только с незащищенными гидроксильными группами предыдущего этапа. На каждом цикле добавляется только один тип мономера A, T, G или С. Затем фотолитографная маска заменяется на другую маску для разблокирования следующей группы нуклеотидов, которая необходима для наращивания участков олигонуклеотидных проб. Избыток реагентов смывается после каждого этапа и процедура повторяется до тех пор, пока не будут синтезированы все пробы на микрочипе. Affymetrix микрочип обычно состоит из 25-мерных олигонуклеотидных проб (Рисунок 3). Каждый ген на Affymetrix микрочипе обычно состоит из множества проб, упорядоченных парами. Каждая пара состоит из двух олигонуклеотидных последовательностей, одна из которых комплементарна исследуемому транскрипту, называемая «PM – perfect match» проба точного соответствия и вторая «MM – mismatch» проба несоответствия. В «MM – mismatch» пробе тринадцатый нуклеотид изменен и отличается от последовательности в пробе точного соответствия. «MM – mismatch» проба используется для корректировки и дискриминации неспецифичной гибридизации, а также для оценки шума. Уровень экспрессии оценивается с использованием оцифрованных значений со всех проб для конкретного транскрипта или гена. Технология «ink-jet» была разработанную для печати красок или чернил на бумаге [12] и используется при производстве микрочипов компанией Agilent Technologies. В отличие от Affymetrix с фотолитографным олигонуклеотидным синтезом, Agilent использует модифицированную «ink-jet» технологию для доставки и разделения химических реагентов на стеклянный субстрат. Эта технология очень гибка в отличие от технологии с использованием масок. Несмотря на общие этапы реакций связывания и диссоциации, in situ химический синтез олигонуклеотидов по технологии Agilent, отличается от принципов производства компании Affymetrix. 271 Рисунок 2. Общее представление структуры микрочипа на примере Affymetrix GeneChip (адаптирован из [4]) Рисунок 3. Структура элементов микрочипа Affymetrix GeneChip (адаптирован из [4]) Во-первых, мономеры размещаются на определенных участках стеклянного субстрата с использованием чернильно-струйной технологии «ink-jet». На каждый участок наносится один из четырех предшественников нуклеотидов A, T, G или C. Размещенные предшественники вступают в реакцию с незащищенными сайтами связывания на растущем олигонуклеотиде. После реакции проводится смывание избытка мономеров. Затем субстрат помещается в раствор с кислотой для разблокирования последнего нуклеотидного предшественника, который был добавлен в течение последнего шага. Таким образом, олигонуклеотид активируется и становится готовым к добавлению следующей партии предшественников A, T, G или C с помощью чернильно-струйной печати «ink-jet». Используя данную технологию очень легко изменить олигонуклеотидную последовательность одной или всех проб на микрочипе. Гибкость «ink-jet» технологии позволяет создавать и модифицировать дизайн проб для интересующих генов. Метод создания микрочипов, называемый "BeadChips", используется компанией Illumina. Он основан на случайном распределении большого количества олигонуклеотидных проб на субстрате. В этом методе олигонуклеотидные пробы длиной 70 нуклеотидов синтезируются с применением 272 технологии Illumina Oligator, в которой используется центрифугирование для создания большого количества олигонуклеотидов [13,14]. Каждая олигонуклеотидная проба состоит из 50 нуклеотидов для исследуемого гена и 20 нуклеотидов для определения позиции бусины на микрочипе. Олигонуклеотиды, ковалентно связанные с силиконовыми бусинами, размещаются на субстрате с лунками. Бусины в случайном порядке распределяются по отдельным лункам на субстрате. Из-за случайности распределения проб на микрочипе, каждый созданный микрочип, имеет разную картину распределения и число олигонуклеотидных проб. В отличие от других микрочиповых платформ, в Illumina каждый микрочип уникален и перед использованием требует точного определения позиции каждой бусины. Для определения распределения бусин на матрице, каждый микрочип проходит серию реакций гибридизации для деконволюции распределения проб на субстрате [15]. В течение каждого этапа процесса, две флуоресцентные метки гибридизируют на матрице, экспонируют и затем удаляют с матрицы для следующей реакции гибридизации с другими наборами флуоресцентных меток. После очередной реакции, каждая проба имеет одно из трех состояний, основанных на последовательности двух меток, красный, зеленый или без цвета. С соответствующим набором флуоресцентных меток, спроектированных для 20-мерных последовательностей на пробах, становится возможной идентификация каждой бусины или пробы на матрице. Поскольку размещение проб уникально на каждом микрочипе Illumina, исключаются смещения и ошибки связанные с расположением проб на матрице (в центре или по краям). Каждая проба на каждой матрице также экспериментально тестируется в течение декодирования реакций гибридизации, которые дают дополнительную информацию о контроле качества для производства матриц и проб. Схема эксперимента с использованием микрочипов типична для различных платформ и производителей микрочипов и различается применением разных красителей, реагентики или типа микрочипа. Существуют две основные схемы проведения эксперимента для получения данных и их дальнейшего анализа (Рисунок 4). В двухцветном эксперименте (часть А), образцы РНК отбирают из исследуемой и контрольной выборок, отдельно метят флуорофорными красками и гибридизуют на одном ДНК-микрочипе, состоящем из специально подобранных гено-специфичных проб. Относительные уровни генных экспрессий в двух образцах рассчитываются путем измерения интенсивности свечения для каждой пробы. Вектор экспрессии для образца суммирует уровень экспрессии каждого гена в образце, полученном от одного пациента (в сравнении с контрольным образцом). Одноцветный анализ (часть Б), выполняется с использованием технологии GeneChip (Affymetrix). Меченые РНК из каждого биологического образца гибридизируют на отдельный микрочип, на котором нанесены геноспецифичные пробы. Уровень генной экспрессии оценивается измерением интенсивности гибридизации для серий, так называемых проб отличного соответствия (perfect match) и уровнем шума, измеряемого с помощью соответствующего набора проб несоответствия (mismatch). Уровни генной экспрессии, полученные для каждого образца, представляют собой вектор, суммирующий разницу между сигналом и шумом для каждого гена. Результаты эксперимента и дополнительная информация анализируются для интерпретации данных, кроме того, параллельно информация с необработанным данными об эксперименте может размещаться на серверах баз данных GEO, ArrayExpress и других [16,17]. Для понимания скоординированного эффекта множества генов, исследователям необходимо извлекать свойства из разнообразных наборов данных и уменьшать размерность, присущую измеренным данным. Кроме того, для поиска новых функциональных модулей, вовлеченных в генную регуляцию или сигнальные пути, необходимы мощные математические, статистические и вычислительные методы для дальнейшего моделирования и анализа данных (Рисунок 5). Таким образом, ДНК-микрочипы стали одними из самых полезных и наиболее применяемых инструментов в репертуаре ученого для изучения генома и его функциональных свойств. Микрочипы широко используются в медицине [18]. Важнейшая цель применения микрочипов – это улучшение клинического исхода путем адаптации терапии, основанной на молекулярных характеристиках заболеваний, например, таких как раковые [19,20]. Применение транскрипционных микрочипов и адекватных методов и подходов их анализа расширяет и дополняет наше понимание биологических процессов, протекающих в раковых клетках и дают ключи к получению новых методик для лечения онкологических заболеваний. 273 Рисунок 4. Блок-схема эксперимента с применением микрочипов. Рисунок 5. Модульная схема основных этапов микрочипового эксперимента, получения данных и типов анализа. 20. эжжжжэ УДК 543.544.152, 661.666.1, 544.723.21 А.Р. Керимкулова, Н.А. Султанова, М.К. Гильманов, З.А. Мансуров, Ж.А. Абилов, Г.Е. Жусупова, Г.Ш. Бурашева, Ж.М. Жандосов, Б.К. Ескалиева ПРИМЕНЕНИЕ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ УГЛЕРОДНЫХ АДСОРБЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ БИОМОЛЕКУЛ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТИТЕЛЬНЫХ СУБСТАНЦИЙ (Казахский национальный университет им. аль-Фараби) В статье отражены результаты физико-химических исследований по разработке наноструктурированных углеродных материалов из отечественного сырья. Были получены и испытаны микро-мезопористые углеродные сорбенты для хроматографии молекулярно-ситовых маркеров и исследована применимость углеродных сорбентов для разделения белково-липидного комплекса и лекарственных растительных субстанций. В последние десятилетия в ведущих странах мира наметилась отчетливая тенденция по увеличению в общем арсенале выпускаемых лекарственных средств доли растительных препаратов и к настоящему времени она достигает более 50 %, в то время как в нашей стране эта цифра крайне низка и колеблется в пределах от 5 % до 10 %. На территории Республики Казахстан сосредоточена уникальная флора, насчитывающая более 100 лекарственных растений, которые относятся к самовозобновляемому дикорастущему сырью и могут служить источником для получения на их основе малотоксичных, высокоэффективных лекарственных средств широкого спектра действия, не 274 вызывающих кумулятивных и аллергических реакций в организме, что особенно важно при длительном их использовании для лечения или профилактики различных заболеваний. Обеспечение населения медикаментами отечественного производства является одним из основных приоритетов социально-экономической политики правительства Республики Казахстан и действующей государственной программы импортозамещения. Для решения указанной глобальной государственной проблемы необходимо осуществлять отбор наиболее перспективных видов растений, произрастающих на территории Казахстана, с учетом их биоактивности, сырьевых ресурсов, целесообразности заготовки, степени сложности технологических процессов получения субстанций на их основе, исходя из экономических и экологических расчетов. При извлечении субстанций из растений с использованием при этом в качестве экстрагента водных растворов этилового спирта или же водных растворов ацетона извлекаются суммарные экстракты, содержащие в себе как гидрофобные, так и гидрофильные синергично действующие вещества. Для разделения и выделения индивидуальных соединений с целью стандартизации сырья и получаемых на его основе лекарственных средств используют, как правило, методы избирательной экстракции, препаративного бумажного и колоночного хроматографирования с применением в последнем случае различных сорбентов, таких как сеффадексы, силикагель, оксид алюминия, целлюлозу, силикат магния, ионообменные смолы, полиамид. Деление на сеффадексах возможно только для гидрофильных фракций природных веществ с применением для их элюирования воды и водных растворов ацетона. Силикагели различных марок и оксид алюминия применяют в основном для разделения гидрофобных фракций и они отличаются высокой адсорбцией природных гидрофильных веществ. Необходимо отметить, что наиболее удобным сорбентом из всех указанных, широко используемым для разделения различных групп полифенолов, является полиамид, который можно было бы отнести к универсальным сорбентам, так как именно при использовании данного сорбента можно элюировать вначале неполярные вещества, а затем перейти к получению элюатов, содержащих более полярные вещества. Однако недостатком данного сорбента является его невысокая емкость и малая эффективность для препаративного получения индивидуальных веществ, а также невозможность его повторного использования для хроматографического разделения.[1,2]. Все вышеперечисленные сорбенты производятся только за рубежом и являются дорогими, что указывает на необходимость производства сорбентов и, в первую очередь, созданные в Республике Казахстан, для снятия импортной зависимости в их приобретении. В связи с вышеизложенным, применение новых разработанных эффективных сорбентов отечественного производства для очистки и разделения суммы биологически активных соединений лекарственных растений является чрезвычайно актуальным и несомненно имеет большое научное и практическое значение, так как отвечает потребностям Казахстана в получении высокоэффективных лекарственных средств на базе собственного стандартизованного растительного сырья, введенного в официальную медицину и соответствующего по качеству требованиям Фармакопеи. В последнее время углеродные сорбенты находят широкое применение в различных процессах очистки от вредных примесей, рекуперации ценных веществ из жидких и газообразных сред; в медицине - для очистки крови от эндо- и экзотоксинов, для детоксикации желудочно-кишечного тракта и др. целей. Известны промышленные сорбенты на основе активных углей, которые получают из различных видов органического сырья: антрацита, торфа, древесины и продуктов ее переработки, материалов животного происхождения [3]. В Институте проблем горения КазНУ им. аль-Фараби проводятся исследования по разработке наноструктурируемых сорбентов, а в качестве сырья используются отходы производства рисовой шелухи, абрикосовых, виноградных косточек и скорлупа грецких орехов [4.5]. Целью исследования является экспериментальное обоснование эффективности применения новых разработанных отечественных наноструктурированных сорбентов, используемых для очистки и разделения субклеточной органеллы растительной клетки – сферосомы и основных групп биологически активных веществ (БАВ), выделяемых из промышленно значимых казахстанских лекарственных растений в виде сухих экстрактов. Наиболее важную информацию о структуре карбонизованного углеродного материала (КУМ) может дать сканирующая электронная микроскопия. Методом сканирующей электронной микроскопии были получены снимки образцов углеродного материала. Наиболее интересные результаты были получены при исследовании углеродного материала, карбонизованного при температуре 8000С, где наблюдается существенное разрыхление и появление многочисленных пор от 200 нм и менее. 275 Таким образом, было установлено, что углеродный материал, карбонизованный при температуре 8000С, имеет наиболее хорошо развитую структуру и пористость, которые придают гранулам УМ высокую прочность и увеличивают удельную поверхность. В соответствии с результатами физико-химических исследований, полученный углеродный сорбент имеет высокопористую структуру и множество ячеек и пустот, т.е. по этим характеристикам он соответствует сорбентам используемым в молекулярно ситовой хроматографии (МСХ). В связи со сказанным, в последующих экспериментах нами исследовалась возможность применения созданного нами углеродного сорбента для использования в МСХ. В качестве цветного маркера для МСХ мы взяли общепризнанные стандарты: 1- голубой декстран фирмы «Фармация» с молекулярной массой 2млн. г/моль, 2- пищевой краситель имеющий фирменное название «Sunset Yellow» (оранжево-желтый) с молекулярной массой 300 г/моль. Как показали результаты два цветных молекулярно-ситовых маркера хорошо разделились на хроматограмме. Голубой декстран вышел при V0=100 мл, а «Sunset Yellow» при Vt=350 мл. Соотношение V0 / Vt = 3,5, тогда как для классических углеводно-полимерных гелей это цифра не превышает двух единиц. Полученные результаты свидетельствуют о превосходных молекулярноситовых характеристиках исследуемого нами сорбента[6]. Также к очевидным приемуществам углеродного сорбента можно отнести следующее: - Ввиду наличия в сорбенте прочных наноуглеродных структур, он прекрасно выдерживает гидростатическое давление, и потому пригоден для препаративных, крупномасштабных разделений, что открывает перспективы применения их в промышленной биотехнологии. В то же время, необходимо отметить, что широко применяемые углеводно-полимерные гели – сефадексы и сефарозы легко атакуются грибками и микроорганизмами и поэтому срок их эксплуатации не превышает нескольких месяцев. Кроме того эти гели являются не прочными и слабыми, поэтому не пригодны для препаративного разделения и почти не применяются в широком индустриальном производстве. Таким образом, нами впервые разработан принципиально новый сорбент для молекулярноситовой хроматографии, который в настоящее время выпускается фирмой «Жалын» под названием «Нанокарбосорб». Сорбент отличается хроматографическими характеристиками, высокой механической прочностью и не атакуется грибками и микроорганизмами, т.е пригоден для широкого использования в биотехнологии. Следующей задачей исследования яви
