автореферат Лебедевой А.М.
advertisement
На правах рукописи ЛЕБЕДЕВА Александра Михайловна ВЛИЯНИЕ ПРОДУКТОВ РАЗРУШЕНИЯ STREPTOCOCCUS PYOGENES НА ФУНКЦИИ МОНОНУКЛЕАРНЫХ ФАГОЦИТОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ИХ СПОСОБНОСТЬ К МИГРАЦИИ ИЗ КРОВЯНОГО РУСЛА В ОЧАГ ИНФЕКЦИИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2014 –2– Работа выполнена в Отделе иммунологии Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской Академии Медицинских Наук Научные руководители: Доктор медицинских наук, член-корр. РАН, профессор Ведущий научный сотрудник отдела иммунологии Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Медицины» Северо-Западного Отделения Российской Академии Медицинских Наук Фрейдлин Ирина Соломоновна Кандидат биологических наук Старший научный сотрудник отдела иммунологии Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Медицины» Северо-Западного Отделения Российской Академии Медицинских Наук Старикова Элеонора Александровна Официальные оппоненты: Доктор биологических наук, профессор Заведующий кафедрой микробиологии биолого-почвенного факультета СанктПетербургского Государственного Университета Пиневич Александр Васильевич Доктор биологических наук Ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Научно-Исследовательский Институт Акушерства и Гинекологии им. Д. О. Отта» Северо-Западного Отделения Российской Академии Медицинских Наук Соколов Дмитрий Игоревич Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр радиологии и хирургических технологий» Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита диссертации состоится «____» _________________ 2015 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.02 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного Отделения Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного Отделения Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д.12, или на сайте http://www.iemrams.spb.ru/russian/dissov02.htm Автореферат разослан «____» _____________________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Дыбан П.А. –3– ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Система мононуклеарных фагоцитов включает происходящие из единой стволовой клетки костномозговые предшественники – монобласты и промоноциты, циркулирующие в крови моноциты и тканевые макрофаги, имеющие сходную морфологию, цитохимические и функциональные характеристики (Фрейдлин И. С., 1984; van Furth et al., 1972). Мононуклеарные фагоциты обеспечивают защиту организма за счет своей фагоцитарной функции. Секретируемые макрофагами молекулы выполняют регуляторные функции и обеспечивают привлечение и активацию не только самих макрофагов, но и других защитных клеток (Тотолян и Фрейдлин, 2000). Для осуществления своих функций моноциты должны мигрировать из кровяного русла в очаг инфекции, минуя эндотелиальный барьер. Процесс мобилизации лейкоцитов в ткани состоит из этапов роллинга лейкоцитов по люминальной поверхности эндотелия, прочной адгезии к поверхности эндотелия и трансэндотелиальной миграции. На всех этих этапах основную роль играет взаимодействие моноцитов с эндотелиальными клетками выстилки сосудов (Cook-mills J.M., 2005, Guo et al., 2009, Imhof and AurrandLions, 2004, Johnson-Leger et al., 2000, Muller and Randolf, 1999, Herter and Zabrock, 2013, Фрейдлин И.С., 2006). При стрептококковых инфекциях мононуклеарные фагоциты первыми распознают консервативные структуры бактерий. Это приводит к активации защитных механизмов, в результате чего происходит фагоцитоз и разрушение бактерий. В крови накапливаются продукты, секретируемые живыми бактериальными клетками, а также продукты их деградации. Клетки крови и эндотелия сосудов становятся мишенями для этих факторов (Cook-mills and Deem, 2005, Kaur et al., 2010, Miettinen et al., 2008, Molinari and Chatwal, 1999, Pahlman et al., 2007). Одной из актуальных проблем иммунологии и клеточной биологии является конкретизация изменений свойств моноцитов и эндотелиальных клеток при их взаимодействии в условиях инфекции. В настоящее время достаточно хорошо изучено взаимодействие живых бактериальных клеток с мононуклеарными фагоцитами и эндотелиальными клетками (Nobbs et al., 2009, Pahlman et al., 2006, Pahlman et al., 2007, Nerlich et al., 2009, Sun et al., 2006, Cleveland et al., 1996). Менее изученным остается влияние продуктов деградации стрептококков на функции моноцитов крови и процессы их мобилизации из кровяного русла. Полученные результаты позволят конкретизировать механизмы действия продуктов разрушения S. pyogenes на свойства и функции мононуклеарных фагоцитов, определяющие их способность к миграции из кровяного русла в очаг инфекции. В условиях эксперимента мы моделировали разрушение стрептококков ультразвуковой дезинтеграцией с последующим центрифугированием и –4– стерилизующей фильтрацией, в результате чего получали супернатант, содержащий продукты разрушения стрептококков (СРС). Цель работы. Изучение влияния продуктов разрушения пиогенных стрептококков на функции мононуклеарных фагоцитов крови человека, определяющие их мобилизацию из кровяного русла в очаг инфекции in vitro. Решались следующие задачи: 1. Изучить характер влияния супернатанта разрушенных стрептококков на адгезионную и миграционную активности моноцитов крови человека и клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, а также на их миграцию через монослой эндотелиальных клеток in vitro; 2. Провести анализ механизмов влияния супернатанта разрушенных стрептококков на функции моноцитов крови человека и клеток ТНР-1, определяющие их способность к трансэндотелиальной миграции; 3. Оценить влияние супернатанта разрушенных стрептококков на экспрессию клетками фосфокиназ; 4. Оценить влияние супернатанта разрушенных стрептококков на экспрессию клетками адгезионных молекул; 5. Оценить влияние супернатанта разрушенных стрептококков на продукцию мононуклеарными лейкоцитами провоспалительных цитокинов. Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование влияния продуктов разрушения стрептококков на свойства и функции моноцитов, от которых зависит эффективность мобилизации клеток из кровяного русла в очаг инфекции. Показано, что влияние продуктов разрушения пиогенных стрептококков на свойства и функции моноцитов крови человека и клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, определяющие их трансэндотелиальную миграцию in vitro, не связано с изменением свойств эндотелиальных клеток, изменением экспрессии на них адгезионных молекул и активацией NFkB, а обусловлено изменением свойств самих мигрирующих клеток и активацией на них рецепторов, сопряженных с Gбелками. Впервые выявлено разнонаправленное действие продуктов разрушения стрептококков на миграционную активность моноцитов крови человека, зависящее от концентрации супернатанта. Также выявлены индивидуальные особенности ответа моноцитов крови отдельных доноров на влияние продуктов разрушения стрептококков. Впервые проведено сравнительное изучение влияния продуктов разрушения стрептококков на свойства моноцитов крови человека и клеток моноцитоподобной линии THP-1, которое позволило выявить разную чувствительность этих клеток к влиянию продуктов разрушения стрептококков. –5– Теоретическая и практическая значимость результатов работы. В результате проведенных исследований были получены новые данные о механизмах влияния продуктов разрушения S. pyogenes на свойства моноцитов крови человека и их трансэндотелиальную миграцию in vitro. Показано, что под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков происходит активация моноцитов крови, проявляющаяся усилением их адгезионной и миграционной активности. Результаты работы способствуют углублению представлений о механизмах влияния продуктов разрушения S. pyogenes на взаимодействие мононуклеарных фагоцитов крови человека с клетками эндотелия сосудов человека, а, следовательно, важны для развития представления о воспалительных процессах при стрептококковых инфекциях. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Продукты разрушения Streptococcus pyogenes серологической группы А (тип М22, штамм AL168) усиливают адгезионную и миграционную активности клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, а также их миграцию через монослой эндотелиальных клеток человека in vitro. 2. Продукты разрушения S. pyogenes усиливают адгезию моноцитов крови человека к эндотелиальным клеткам, но оказывают разнонаправленное действие на миграционную активность этих клеток, зависящее от концентрации супернатанта. 3. Эффект супернатанта разрушенных S. pyogenes на трансэндотелиальную миграцию моноцитов крови и клеток ТНР-1 связан с изменением свойств мигрирующих клеток и активацией на них рецепторов, связанных с G-белками. Реализация работы. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 4 статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010), на Межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии – междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010), на XIV Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011), на XI Международном Конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011), на Всероссийской конференции по онкологии «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2011), на 16й Международной школе-конференции Молодых Ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2012), на II Всероссийской научной конференции молодых ученых "Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия" (Санкт-Петербург, 2012), на V –6– международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2013), на Обществе Иммунологов в отделе Общей патологии и патофизиологии ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2013), на XIX международном симпозиуме, посвященном стрептококкам и стрептококковым заболеваниям (Аргентина, Буэнос Айрес, 2014). Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и включает 25 таблиц и 28 рисунков; состоит из введения, списка используемых сокращений, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (162 источника, из которых 148 на иностранных языках). МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ В работе использовались клетки перевиваемых линий ТНР-1 и EA.hy 926, а так же моноциты крови человека. EA.hy 926 – линия эндотелиальных клеток (ЭК) человека; получена путем гибридизации первичной линии клеток HUVEC с клетками перевиваемой линии карциномы легкого А-549, любезно предоставлена Dr. Cora-Jean C. Edgell (Университет Северной Каролины, США). По основным фенотипическим, морфологическим и функциональным характеристикам клетки линии EA.hy 926 схожи с эндотелиальными клетками макрососудов человека. После активации клетки экспрессируют ICAM-1, VCAM-1 и Еселектин и секретируют хемокины IL-8 и MCP-1 (Luscinskas et al., 2005). Клетки перевиваемой линии THP-1 были получены из периферической крови пациента с промоноцитарной лейкемией. Линия клеток ТНР-1 была любезно предоставлена профессором M. De Ley (Университет города Левена, Бельгия). Клетки экспрессируют β2-интегрины (Ronald et al., 2001), рецептор фракталкина (Umehara et al., 2001), рецептор ламинина, Fc-рецепторы и молекулы МНС II (Montuori et al., 1999). Под влиянием бактериальных продуктов способны секретировать TNFα, IL-1β, IL-8, MIP-1α,β (Harrison et al., 2005). Мононуклеарные лейкоциты выделяли из периферической крови условно здоровых доноров обоих полов в возрасте от 18 до 50 лет (Отделение переливания крови, Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. акад. И.П. Павлова). В качестве антикоагулянта использовали препарат гепарина. Разделение фракций гранулоцитов и мононуклеарных лейкоцитов проводили с помощью осаждения клеток на градиенте плотности фиколл-верографина. Клетки инкубировали при 370C во влажной атмосфере с 5% CO2. Отсутствие контаминаций контролировалось. Во всех экспериментах –7– жизнеспособность составляла не менее 95%. Супернатант разрушенных стрептококков (СРС) был приготовлен из Streptococcus pyogenes серологической группы А (тип М22, штамм AL168) сотрудником отдела Молекулярной Микробиологии ФГБУ «НИИ Экспериментальной Медицины» СЗО РАМН д.м.н. Л.А. Буровой. Данный штамм был предоставлен Dr. Lindahl (Отдел лабораторной медицины Лундского Универcитета, Лунд, Швеция). В экспериментах использовали СРС в разведениях 1:25-1:2000. Все исследуемые концентрации были нетоксичны для клеток. Для оценки интенсивности адгезии клеток линии ТНР-1 к монослою эндотелиальных клеток использовали метод, основанный на окраске внутриклеточного белка витальным флуоресцентным красителем carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). В некоторых случаях проводили 24-часовую преинкубацию в присутствии СРС только клеток ТНР-1, только ЭК или клеток обеих линий. Окрашенные клетки линии ТНР-1 вносили в лунки с монослоем ЭК. Одновременно вносили СРС и инкубировали 1 час. После инкубации и отмывки от неадгезировавших клеток, измеряли интенсивность флюоресценции с помощью спектрофлуориметра Fluoroskan Ascent FL (Termoelectron Corporation, США) при длине волны 485 нм. Для изучения механизмов влияния СРС на адгезионную активность клеток в отдельных экспериментах проводили предварительную 16-часовую инкубацию клеток линии ТНР-1 с токсином коклюша (100 нг/мл). Для оценки адгезионной активности моноцитов крови суспензию мононуклеарных лейкоцитов вносили в лунки, содержащие монослой ЭК. Одновременно вносили СРС и инкубировали в течение 1 часа. После отмывки от неадгезировавших клеток содержимое каждой лунки собирали в микропробирки. Оценку количества адгезировавших моноцитов проводили с помощью проточного цитофлуориметра Epics Altra («Beckman Coulter», США) с использованием моноклональных антител (мАт) против поверхностной молекулы CD14, меченых FITC. Результаты выражали в процентах от числа спонтанно адгезировавших клеток. В отдельных экспериментах проводили предварительную 4-часовую инкубацию ЭК с СРС. Для изучения миграции и трансэндотелиальной миграции (ТЭМ) моноцитов крови и клеток линии ТНР-1 использовали модифицированные камеры Бойдена (трансвеллы) с диаметром пор 8 мкм; трансвеллы помещали в лунки 24-луночного планшета. В верхние камеры трансвелл вносили суспензию клеток линии ТНР-1 или мононуклеарных лейкоцитов. В нижние камеры вносили культуральную среду (контроль) или среду с исследуемыми веществами и инкубировали 2 часа. Для оценки ТЭМ суспензию мононуклеарных лейкоцитов или клеток линии ТНР-1 вносили в верхние камеры трансвелл, содержащие монослой ЭК. Время инкубации –8– составляло 2,5 часа. Оценку количества мигрировавших клеток проводили с помощью проточного цитофлуориметра Navios («Beckman Coulter», США) с использованием мАт против CD14, меченых FITC (для выделения популяции моноцитов крови) и коммерческих наборов Flow-count Fluorospheres («Beckman Coulter», США). Результаты выражали в процентах от числа спонтанно мигрировавших клеток. Для исследования механизмов влияния СРС на миграционную активность клеток в отдельных экспериментах проводили предварительную 16-часовую инкубацию клеток ТНР-1 с токсином коклюша (100 нг/мл). Экспрессию поверхностных молекул на клетках оценивали методом проточной цитометрии с использованием мАт соответствующей специфичности. Время предварительной инкубации клеток с СРС составляло 2 часа. Результаты выражали средними значениями интенсивности флюоресценции (MFI). Концентрацию цитокинов TNFα, IL-6 и IL-8 в супернатантах определяли методом иммуноферментного анализа с помощью микропланшетного анализатора («Bio-Rad», США) и стандартных коммерческих наборов фирмы ООО «Цитокин». Анализ проводили согласно рекомендациям производителя. Время предварительной инкубации клеток с СРС составляло 2 часа. Оценку уровней фосфорилирования р38 МАР киназы и NFκB проводили методом проточной цитомерии с использованием мАт против фосфо-NFκB или фосфо-р38, мечеными AlexaFluor 488. Время предварительной инкубации клеток с СРС или РМА составляло 15 минут. После окончания инкубации клеточную суспензию фиксировали и пермеабилизировали с помощью IntraPrep fixation/permeabilisation Kit (Beckman Coulter, США). Результаты выражали средними значениями MFI. Оценку достоверности различий между средними значениями в контрольных и опытных выборках проводили методом однофакторного дисперсионного анализа; попарное сравнение средних проводили с использованием апостериорных критериев (критерий Тьюки и критерий Т3 Даннета) или критерием Стьюдента с помощью пакета программ Microsoft Office Excel 2003, IBM SPSS Statistics 20, STATISTICA 7.0. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Трансэндотелиальная миграция лейкоцитов in vivo представляет собой сложный, многоэтапный процесс. В данной работе изучалось влияние продуктов разрушения S. pyogenes на адгезию, миграцию и трансэндотелиальную миграцию моноцитов. Влияние продуктов разрушения стрептококков на функции клеток линии ТНР-1. Одним из этапов трансэндотелиальной миграции лейкоцитов является их адгезия к эндотелию. В наших экспериментах после часовой инкубации в присутствии СРС происходило усиление интенсивности адгезии –9– клеток THP-1 к эндотелиальным клеткам (рис. 1). Из данных литературы известно, что прочная адгезия является результатом взаимодействия β2интегринов (CD11a/CD18 и CD11b/CD18) и α4β1-интегринов (CD49d/CD29) на поверхности лейкоцитов с молекулами иммуноглобулинового суперсемейства ICAM-1, 2 и VCAM-1 на поверхности эндотелия (Weber et al., 1999; Herter and Zarbock, 2013; Lee et al. 2012). При этом СРС не оказывал влияния на экспрессию адгезионных молекул CD54, CD106 на поверхности эндотелиальных клеток и молекул CD162, CD49d, CD11b на клетках THP-1 при 2-часовой инкубации. Нельзя исключать, что адгезию эндотелиальных клеток и моноцитов в этих условиях опосредуют другие адгезионные молекулы – PECAM-1, CD99 и JAM. Под влиянием активационных стимулов эти молекулы из мест контактов эндотелиальных клеток выходят на апикальную поверхность и могут участвовать в адгезии лейкоцитов к эндотелию (Bardin et al., 2009). количество адгезировавших клеток, % 250 различия достоверны по сравнению с контролем (*** - p<0.001, ** - p<0.01). *** ** 200 ** 150 100 50 0 ПКС (1:25) (1:100) (1:50) супернатант разрушенных S. pyogenes Рисунок 1. Адгезия клеток ТНР-1 к эндотелиальным клеткам в присутствии супернатанта разрушенных стрептококков (Mean±StDev) Чтобы оценить вклад активации эндотелиальных клеток и клеток линии ТНР-1 в наблюдаемое усиление адгезии проводили предварительные 24-часовые инкубации клеток с СРС (рис. 2). количество адгезировавших клеток, % 200 ** ** ** 150 100 *** *** *** ** *** *** Преинкубации клеток с СРС (1:50): Черный – только ЭК; Серый – только клеток ТНР-1 Белый – независимая преинкубация и ЭК и клеток ТНР-1 различия статистически значимы по сравнению с контролем (*** - p<0.001, ** p<0.01). 50 0 ПКС (1:25) (1:50) (1:100) (Mean±StDev) супернатант разрушенных S. pyogenes Рисунок 2. Адгезия клеток ТНР-1 к эндотелиальным клеткам в присутствии супернатанта разрушенных стрептококков (с преинкубациями клеток). – 10 – In vivo экспрессия адгезионных молекул на клетках и продукция клетками хемокинов контролируется активацией транскрипционного фактора NFκB (Маянский и др., 2007; Weber et al. 1999). Распознавание консервативных структур бактерий клетками запускает каскад внутриклеточных реакций, приводящих к фосфорилированию NFκB и последующему изменению экспрессии адгезионных молекул (Маянский и др., 2007). В данной работе СРС не оказывал влияния на уровень экспрессии фосфо-NFκB клетками линии ТНР-1 и эндотелиальными клетками. Полученное нами усиление адгезии клеток ТНР-1 не было связано с изменением экспрессии адгезионных молекул на клетках. Миграция лейкоцитов в субэндотелиальное пространство осуществляется по градиенту концентраций хемоаттрактантов, роль которых могут выполнять компоненты бактерий (Johnston and Butcher, 2002). Проводили исследование хемоаттрактного действия продуктов разрушения S. pyogenes на клетки линии ТНР-1. Было показано повышение интенсивности миграции клеток под влиянием продуктов разрушения стрептококка (рис. 3). Процент мигрировавших клеток 750 *** 600 различия статистически значимы по сравнению с контролем (*** - p<0.001, ** - p<0.01). *** 450 300 ** 150 0 контроль 1:25 1:50 1:100 супернатант разрушенных S. pyogenes Рисунок 3. Миграционная активность клеток линии ТНР-1 под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков (Mean±StDev) Усиленная миграция клеток в присутствии СРС могла быть связана как с его хемоаттрактным действием (направленная миграция), так и с увеличением подвижности клеток (ненаправленная миграция). Для уточнения характера эффекта исследовали зависимость миграции клеток ТНР-1 от присутствия СРС в верхней и нижней камерах трансвелл (табл. 1). Результаты экспериментов показали, что СРС усиливает направленную миграцию клеток. Таким образом, СРС являлся хемоаттрактантом для ТНР-1. – 11 – Таблица 1. Зависимость супернатанта разрушенных трансвелл. Доля мигрировавших клеток, % (Mean±StDev) Культуральная среда Нижняя камера СРС 1:50 миграции клеток ТНР-1 от присутствия стрептококков в верхней и нижней камерах Верхняя камера Культуральная СРС 1:50 среда 100,00±16,76 96,49±44,32 n=9 n=4 629,47±261,45 251,60±43,93 n=5 *** n=4 *** *** - различия статистически значимы по сравнению с миграцией в культуральной среде (p<0.001). Несмотря на отсутствие изменений экспрессии адгезионных молекул и фосфо-NFκB, было отмечено значительное усиление трансэндотелиальной миграции клеток линии ТНР-1 в присутствии СРС (рис. 4). Процент мигрировавших клеток 500 *** *** 400 *** *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). 300 200 100 0 контроль 1:25 1:50 1:100 супернатант разрушенных S. pyogenes Рисунок 4. Трансэндотелиальная миграция клеток линии ТНР-1 под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков (Mean±StDev) В регуляции хемотаксиса и трансэндотелиальной миграции клеток участвуют сигналы от рецепторов, связанных с G-белками (GPCR). Их лигандами являются хемоаттрактные белки – хемокины, компоненты комплемента, компоненты бактерий. (Penela et al., 2014). На этапе роллинга и адгезии сигналинг от GPCR приводит к изменению конформации интегринов и повышению их афинности и авидности. Кроме того сигналы от GPCR опосредуют направленную миграцию лейкоцитов к базальной поверхности ЭК и далее во внеклеточном матриксе (Le et al., 2000; Penela et al., 2014). Так как супернатант разрушенных стрептококков проявлял свойства хемоаттрактанта в отношении клеток линии ТНР-1, мы провели ингибиторный анализ с токсином коклюша (рис. 5). – 12 – Блокирование сигнала от GPCR токсином коклюша полностью подавляло спонтанную и индуцированную влиянием СРС миграцию клеток ТНР-1 (рис. 5). Это значит, что и спонтанная, и индуцированная миграция этих клеток зависела от присутствия в системе хемоаттрактантов. Блокирование сигнальных путей от GPCR так же подавляло спонтанную и индуцированную адгезию клеток ТНР-1 к ЭК (рис. 5). Вероятно, связывание GPCR на клетках ТНР-1 с лигандами в составе СРС приводило к изменению конформации и повышению афинности β2интегринов на этих клетках. В таком случае взаимодействие интегринов на клетках ТНР-1 с конститутивно экспрессирующейся на эндотелиальных клетках молекулой ICAM-2 могло опосредовать прочную адгезию клеток ТНР-1 к эндотелию (Le et al., 2000). 500 А * # 120 *** 60 0 контроль *** В 400 200 ### ### 0 *** контроль *** СРС (1:50) Б *** 400 300 200 ### 100 ### *** 0 СРС (1:50) 600 Процент мигрировавших клеток Процент мигрировавших клеток Процент адгезировавших клеток 180 контроль *** СРС (1:50) Серый – интактные клетки ТНР-1, черный – клетки линии ТНР-1, преинкубированные с токсином коклюша (100 нг/мл) различия достоверны по сравнению с контролем (*** - p<0.001, * - p<0.05). различия достоверны по сравнению с соответствующим значением для интактных клеток ТНР-1 (### - p<0.001, ## - p<0.01, # p<0.05) Рисунок 5. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на интенсивность адгезии, миграции и трансмиграции клеток линии ТНР-1 (интактных и преинкубированных с токсином коклюша) (Mean±StDev) А – адгезия клеток; Б – миграция клеток; В – трансэндотелиальная миграция клеток. Преинкубация клеток линии ТНР-1 с токсином коклюша приводила к снижению спонтанной и индуцированной СРС трансэндотелиальной миграции этих клеток. Следовательно, трансмиграция клеток ТНР-1 также зависела от присутствия в системе хемоаттрактантов. Из литературы известно, что молекулы межклеточных контактов JAM могут связываться с – 13 – α4β1- и β2-интегринами (Fernandez-Borja et al., 2010). Можно предположить, что взаимодействие хемоаттрактантов в составе СРС с GPCR на ТНР-1 приводило к активации β1- и β2-интегринов. В этом случае связывание интегринов на клетках линии ТНР-1 с белками семейства JAM на эндотелиальных клетках опосредовало трансмиграцию клеток ТНР-1. Влияние продуктов разрушения стрептококков на функции моноцитов крови человека. В присутствии супернатанта разрушенных ультразвуком S. pyogenes наблюдалось статистически значимое усиление адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам по сравнению со спонтанной адгезией моноцитов (рис. 6). процент адгезировавших клеток 400 *** 300 *** 1. Адгезия в культуральной среде 2. Адгезия в присутствии СРС (1:50) 3. Адгезия к преинкубированному с СРС (1:50) монослою ЭК. 200 *** - различия достоверны по сравнению с контролем (p<0.001). 100 0 1 2 3 Рисунок 6. Адгезия моноцитов крови человека к монослою эндотелиальных клеток (Mean±StDev) Для оценки вклада эндотелиальных клеток и моноцитов в этот процесс изучали интенсивность их адгезии в тех же условиях, но после предварительной инкубации эндотелиальных клеток с исследуемыми веществами. Результаты экспериментов показали, что адгезия моноцитов к преинкубированному с СРС монослою эндотелиальных клеток не отличалась от адгезии клеток в присутствии СРС (рис. 6). Полученные данные позволяют предположить, что усиление адгезии моноцитов, вызванное СРС, не было связано с изменением свойств эндотелиальных клеток. В наших экспериментах в присутствии СРС экспрессия адгезионных молекул на эндотелиальных клетках не изменялась, а на моноцитах – менялась разнонаправленно. СРС не оказывал влияния на уровни экспрессии адгезионных молекул CD49d, CD29 и CD62L на поверхности моноцитов. При этом в присутствии СРС усиливалась экспрессия CD11b на этих клетках. Экспрессия CD162 под влиянием СРС на моноцитах достоверно снижалась. Также СРС не оказывал влияния на экспрессию фосфо-NFκB моноцитами и эндотелиальными клетками. Следовательно, как и в случае клеток ТНР-1, мы не могли объяснить усиление адгезии моноцитов к эндотелию изменением экспрессии адгезионных молекул на клетках. – 14 – В данном исследовании СРС усиливал экспрессию фосфо-р38 на моноцитах (с 0,91±0,24 до 1,40±0,36, p<0.01). Из литературы известно, что киназа р38 МАРК опосредованно регулирует процессы адгезии и трансмиграции лейкоцитов. Активация р38 МАРК повышает Е-селектинопосредованную адгезию лейкоцитов к клеткам, экспрессирующим Еселектин и ICAM-1 (Stadtmann et al. 2012; Herter and Zarbock, 2013). Результаты наших экспериментов свидетельствуют в пользу того, что под влиянием СРС происходит активация моноцитов, и фосфорилирование р38 МАРК может вносить вклад в усиление адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам. На миграцию моноцитов крови СРС оказывал разнонаправленное действие. В низких концентрациях наблюдалось достоверное усиление миграции моноцитов по сравнению с контролем. При повышении концентрации СРС эффект менялся на противоположный (рис. 8). Это говорит в пользу того, что в составе супернатанта разрушенных стрептококков присутствует фактор, проявляющий хемоаттрактантные свойства. Процент мигрировавших клеток 250 ** 200 *** ** 150 ** различия статистически значимы по сравнению с контролем (*** - p<0.001, ** - p<0.01). 100 50 0 контроль 1:50 1:500 1:1000 1:2000 супернатант разрушенных S. pyogenes Рисунок 8. Миграция моноцитов крови человека под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков (Mean±StDev). Согласно литературным данным, одно и то же вещество, в зависимости от концентрации, может оказывать разнонаправленное действие на миграцию лейкоцитов: в низких концентрациях может выступать в качестве хемоаттрактанта, а при высоких концентрациях – действовать как хеморепеллент (Huttenlocher and Poznansky 2008). Таким образом, можно предположить, что разнонаправленный эффект СРС на миграцию моноцитов крови в разных концентрациях связан с наличием в его составе подобного фактора. Следует отметить, что по интенсивности миграции моноцитов крови в присутствии СРС в разведении 1:50 доноры разделились на две группы. У 25% доноров миграция моноцитов к СРС в разведении 1:50 повышалась, в то – 15 – время как у 75% доноров миграция моноцитов в тех же условиях снижалась. Деление доноров на группы по миграции моноцитов в присутствии СРС можно объяснить различиями чувствительности моноцитов разных доноров к действующему веществу в составе СРС. Так как СРС проявлял хемоаттрактные свойства в отношении моноцитов крови, проводили ингибиторный анализ с токсином коклюша (рис. 9). Процент мигрировавших клеток 250 *** 200 # 150 *** - различия достоверны по сравнению с контролем (p<0.001). # - различия достоверны по сравнению с соответствующим значением миграционной активности интактных клеток (p<0.05). 100 50 0 Серый – интактные моноциты; черный– моноциты, инкубированные с токсином коклюша (100 нг/мл). контроль СРС (1:50) Рисунок 9. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на интенсивность миграции моноцитов крови (интактных и инкубированных с токсином коклюша) (Mean±StDev). Токсин коклюша снижал индуцированную СРС миграцию моноцитов крови до спонтанного уровня. Чувствительность к токсину доказывает, что влияние СРС на миграцию моноцитов было опосредовано взаимодействием GPCR на моноцитах с хемоаттрактантом в составе СРС. Принимая во внимание, что под влиянием СРС происходит усиление адгезии моноцитов крови к эндотелиальным клеткам и усиление их миграционной активности, парадоксальным представляется выявленное в данной работе подавление трансэндотелиальной миграции моноцитов в присутствии компонентов стрептококка в нижней камере (рис. 10). Это можно объяснить тем, что в используемой модели взаимодействия моноцитов и эндотелиальных клеток, в присутствии СРС могут секретироваться факторы, ингибирующие трансмиграцию моноцитов. Результаты, полученные в экспериментах по адгезии, миграции, экспрессии адгезионных молекул свидетельствовали об активации моноцитов крови человека под влиянием СРС, в то время как результаты трансэндотелиальной миграции демонстрировали ингибирующее действие СРС на функции этих клеток. Поэтому для уточнения характера влияния СРС на моноциты в дальнейших экспериментах мы изучали секрецию мононуклеарными лейкоцитами провоспалительных цитокинов. – 16 – Процент мигрировавших клеток 140 120 ** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.01). ** 100 80 60 40 20 0 контроль 1:50 1:100 1:500 1:1000 супернатант разрушенных S. pyogenes Рисунок 10. Трансэндотелиальная миграция моноцитов крови человека под влиянием супернатанта разрушенных стрептококков (Mean±StDev). В наших экспериментах СРС индуцировал секрецию провоспалительных цитокинов IL-6, IL-8 и TNFα мононуклеарными лейкоцитами крови (рис. 11). Нельзя исключать, что действие СРС на функции моноцитов может быть также связано с влиянием провоспалительных цитокинов, секретируемых клетками в этих условиях. *** Концентрация цитокина, пг/мл 2500 2000 TNFa IL-6 IL-8 *** - различия статистически значимы по сравнению с контролем (p<0.001). 1500 500 0 *** контроль *** СРС (1:50) Рисунок 11. Влияние супернатанта разрушенных стрептококков на секрецию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами (Mean±StDev). Также следует учитывать, что присутствующие в системе лимфоциты могут оказывать влияние на активацию моноцитов и выявленные изменения их функций в присутствии супернанта разрушенных стрептококков. Из литературы известно, что суперантигенные экзотоксины стрептококков активируют лимфоциты крови человека (Taylor et al., 2011, Chatellier and Kotb, 2000), индуцируют их пролиферацию (Eriksson and Norgren, 1999; Sriskandan et al., 1996) и продукцию цитокинов IL-6, IL-10, IL12 и IFN-γ этими клетками (Klinman et al., 1996; Taylor et al., 2011). – 17 – Заключение Мононуклеарные фагоциты обеспечивают защиту организма за счет своей фагоцитарной функции, кроме того секретируемые макрофагами молекулы цитокинов обеспечивают привлечение и активацию не только самих макрофагов, но и других защитных клеток (Тотолян и Фрейдлин, 2000). Для осуществления своих функций моноциты должны мигрировать из кровяного русла в очаг инфекции, через эндотелиальный барьер. На всех этих этапах мобилизации важную роль играет взаимодействие моноцитов с эндотелиальными клетками выстилки сосудов (Imhof and Aurrand-Lions, 2004, Johnson-Leger et al., 2000, Muller and Randolf, 1999, Herter and Zabrock, 2013, Фрейдлин И.С., 2006). При стрептококковых инфекциях это взаимодействие происходит в присутствии инфекционных агентов или продуктов их разрушения. В данной работе исследовалось влияние супернатанта разрушенных Streptococcus pyogenes (СРС) серологичекой группы А (тип М22, штамм AL168) на адгезионную и миграционную активность моноцитов крови человека и клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, а так же на их миграцию через монослой эндотелиальных клеток человека линии EA.hy 926 in vitro. Также изучалось влияние СРС на экспрессию клетками адгезионных молекул и стресс-киназ, на активацию рецепторов, связанных с G-белками, на секрецию провоспалительных цитокинов. Показано, что СРС стимулировал адгезионную и миграционную активность клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, усиливал трансэндотелиальную миграцию этих клеток; эффект СРС не был связан с изменением свойств эндотелиальных клеток, изменением экспрессии адгезионных молекул, а был обусловлен изменением свойств самих клеток ТНР-1 и активацией на них GPCR. СРС активировал моноциты крови человека через р38 МАР киназу, изменял экспрессию на них адгезионных молекул CD162 и CD11b и активировал рецепторы моноцитов, сопряженные с G-белками. Продукты деградации стрептококков также оказывали разнонаправленное влияние на этапы моблизации моноцитов: в присутствии СРС в некоторых концентрациях повышалась миграционная и адгезионная активность моноцитов, однако, снижалась их миграция через монослой эндотелиальных клеток. Под влиянием СРС происходила индукция секреции провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-8 мононуклеарными лейкоцитами крови. В ходе проведенных исследований были выявлены существенные различия в характере ответа клеток моноцитоподобной линии ТНР-1 и моноцитов крови человека на действие продуктов разрушения стрептококков. В отличие от трансмиграции клеток ТНР-1, трансэндотелиальная миграция моноцитов крови снижалась в присутствии – 18 – СРС. Различная чувствительность моноцитов крови и клеток ТНР-1 к к влиянию СРС может быть связана с разной концентрацией на этих клетках рецепторов к соответствующим компонентам в составе СРС. ВЫВОДЫ 1. Супернатант разрушенных Streptococcus pyogenes серологической группы А (тип М22, штамм AL168) оказывает стимулирующее влияние на адгезионную и миграционную активности клеток моноцитоподобной линии ТНР-1, а так же на их миграцию через монослой эндотелиальных клеток линии EA.hy 926 in vitro. 2. Наряду со стимулирующим эффектом продуктов разрушения стрептококков на адгезионную активность моноцитов крови человека выявлено зависимое от концентрации супернатанта разрушенных стрептококков разнонаправленное действие на интенсивность миграции этих клеток. 3. Эффект супернатанта разрушенных стрептококков на трансэндотелиальную миграцию моноцитов крови человека и клеток линии ТНР-1 не связан с изменением свойств эндотелиальных клеток, изменением экспрессии адгезионных молекул на клетках и активацией NFkB, а обусловлен изменением свойств самих мигрирующих клеток и активацией на них рецепторов, связанных с G-белками. 4. Продукты разрушения стрептококков активируют моноциты крови человека через р38 МАР киназу. 5. Супернатант разрушенных S. pyogenes оказывет стимулирующее действие на продукцию мононуклеарными лейкоцитами провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-8. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Старикова Э.А., Лебедева А.М., Актуреева Н.А., Бурова Л.А., Фрейдлин И.С. Механизмы усиления трансэндотелиальной миграции моноцитоподобных клеток ТНР-1 под влиянием компонентов пиогенного стрептококка // Медицинская иммунология. – 2013. – т. 15, № 5. – с. 457-464. 1. Старикова Э.А., Лебедева А.М., Бурова Л.А., Фрейдлин И.С. Изменения функциональной активности эндотелиальных клеток под влиянием лизата Streptococcus pyogenes // Цитология. – 2012. – т. 54, № 1. – с. 49-57. 2. Лебедева А.М., Старикова Э.А., Бурова Л.А., Фрейдлин И.С. Изменения активности адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам под влиянием компонентов Streptococcus pyogenes // Медицинская иммунология. – 2011. – т. 13, № 6. – с. 581-588. 3. – 19 – Фрейдлин И.С., Старикова Э.А., Лебедева А.М., Бурова Л.А. О роли Мпротеина из лизата Streptococcus pyogenes в процессах активации функций моноцитов // Российский иммунологический журнал. – 2011. – т. 5 (14), № 2. – с. 119-126. 4. Материалы конференций: Suvorov A., Starikova E., Lebedeva A., Aktureeva N., Sokolov A., Vlasenko A., Burova L., Freidlin I. Endothelial cells disfunction induced by Streptococcus pyogenes // Book of Abstracts of International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases. – 2014. – 0101. 5. Лебедева А.М. Влияние компонентов бактерий на процессы мобилизации моноцитов // Физиология и медицина. Высокие технологии, теория, практика. – 2013. – т. 1. – с. 57-59. 6. Лебедева А.М. Влияние супернатанта разрушенных ультразвуком Streptococcus pyogenes на миграцию моноцитов крови здоровых доноров // Медицинский академический журнал. Приложение. – 2012. – с. 393-394. 7. Лебедева А.М. Метод оценки адгезионной активности моноцитов крови и его использование для изучения влияния компонентов стрептококка на процесс адгезии // Биология – наука XXI века: 16-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. – 2012. – с. 234. 8. Лебедева А.М., Старикова Э.А., Бурова Л.А., Фрейдлин И.С. Компоненты Streptococcus pyogenes изменяют активность адгезии моноцитов к эндотелиальным клеткам // Медицинская иммунология. – 2011. – т. 13, № 45. – с. 321-322. 9. 10. Старикова Э.А., Лебедева А.М., Бурова Л.А., Фрейдлин И.С. Регуляция взаимодействия эндотелиальных клеток линии EA.hy. 926 и моноцитоподобных клеток линии ТНР-1 компонентами Streptococcus pyogenes // Российский аллергологический журнал. – 2011. – № 4, вып. 1. – с. 357-358. 11. Старикова Э.А., Лебедева А.М., Бурова Л.А., Фрейдлин И.С. Антиангиогенные свойства компонентов лизата Streptococcus pyogenes // Вопросы онкологии. Приложение. – 2011. – т. 57, № 2. – с. 60-61. 12. Старикова Э.А., Лебедева А.М., Бурова Л.А., Фрейдлин И.С. Влияние лизата Streptococcus pyogenes тип М22 на пролиферативную и миграционную активность эндотелиальных клеток // Российский аллергологический журнал. – 2010. – № 5, вып. 1. – с. 277-278. 13. Лебедева А.М., Старикова Э.А. Влияние лизата S. pyogenes на эндотелиальные клетки человека // Медицинский академический журнал. – 2010. – т. 10, № 5. – с. 144.
