Изучение клеточных и молекулярных механизмов
advertisement
Дьяконова В.А.1, Бураков В.В.2, Шаронов Г.В.3, Пинегин Б.В.1 1 ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России», Москва, 2МГУ им. М.В. Ломоносова, 3 ИБХ им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Изучение клеточных и молекулярных механизмов взаимодействия иммуномодулятора полиоксидония с клетками иммунной системы человека* ПРОВЕДЕНО ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИММУНОМОДУЛЯТОРА ПОЛИОКСИДОНИЯ (ПО) С ЛЕЙКОЦИТАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO, А ТАКЖЕ ПУТЕЙ АКТИВАЦИИ ДАННЫХ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПОЛИОКСИДОНИЯ. МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ УСТАНОВЛЕНО, ЧТО СВЯЗЫВАНИЕ ФИТЦ-ПО ПРОИСХОДИТ В БОЛЬШЕЙ СТЕПЕНИ С МОНОЦИТАМИ И НЕЙТРОФИЛАМИ И В МЕНЬШЕЙ (СЛАБЕЕ В 7-8 РАЗ ПО ОТНОШЕНИЮ К МОНОЦИТАМ) — С ЛИМФОЦИТАМИ. ИЗУЧЕНИЕ ПРОНИКНОВЕНИЯ ФИТЦ-ПО В КЛЕТКУ МЕТОДОМ ЛАЗЕРНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ КОНФОКАЛЬНОЙ ЦИТОСПЕКТРОМЕТРИИ ВЫЯВИЛО, ЧТО ФРАКЦИЯ ФИТЦ-ПО МЕНЕЕ 5 КД СПОСОБНА ПРОНИКАТЬ И В КЛЕТКИ ФАГОЦИТАРНОГО РЯДА И В ЛИМФОЦИТЫ. ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПО, МЕЧЕНОГО КОЛЛОИДНЫМ ЗОЛОТОМ, С ПОМОЩЬЮ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ ПОКАЗАНО, ЧТО ПРЕПАРАТ ПОГЛОЩАЕТСЯ МОНОЦИТАМИ И НЕЙТРОФИЛАМИ ПУТЕМ ЭНДОЦИТОЗА. АНАЛИЗ ОДНОГО ИЗ АКТИВАЦИОННЫХ МАРКЕРОВ КЛЕТКИ, ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО СА2+, ПРОВЕДЕННЫЙ С ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ КРАСИТЕЛЕМ FLUO-3, ВЫЯВИЛ, ЧТО ПО НЕ ИНДУЦИРУЕТ МОБИЛИЗАЦИЮ СА2+ ИЗ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ДЕПО. ИЗУЧЕНИЕ НАРАБОТКИ Н2О2 ВНУТРИ КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ ИНДИКАТОРА ДИХЛОРФЛУОРЕСЦЕИНА ПОКАЗАЛО, ЧТО ПОЛИОКСИДОНИЙ ДОСТОВЕРНО ПОВЫШАЕТ УРОВЕНЬ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ Н2О2, ОДНАКО НЕ СТОЛЬ ИНТЕНСИВНО, КАК ПРИ СТИМУЛЯЦИИ КЛЕТОК ФОРБОЛМИРИСТИЛ АЦЕТАТОМ, ЧТО СВИДЕТЕЛЬСТВУЕТ ОБ УЧАСТИИ Н2О2 В ПРОЦЕССАХ АКТИВАЦИИ КЛЕТКИ ПРИ ИНДУКЦИИ ИММУНОМОДУЛЯТРОМ. Полиоксидоний (ПО) — это иммуномодулирующий препарат, который уже на протяжении семи лет успешно применяется при лечении вторичных иммунодефицитных состояний [1,2,6,11], характеризующихся хроническим рецидивирующим течением и устойчивостью к адекватной этиотропной терапии. Также ПО применяется при лечении острых инфекционных процессов [12], благодаря сочетанию иммуномодулирующих свойств с детоксикационными, антиоксидантными и мембранопротекторными свойствами. Полиоксидоний является нетоксичным, водорастворимым биодеградируемым синтетическим полимером. С химической точки зрения — это сополимер N-оксид 1,4-этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида со средней молекулярной массой 100 кД. Препарат создан в ГНЦ — Институте иммунологии МЗ РФ коллективом авторов Петровым Р.В., Хаитовым Р.М., Некрасовым А.В., Аттаулахановым Р.И., Пучковой Н.Г. и Ивановой А.С. [8, 9]. Данная статья посвящена изучению действия полиоксидония на клетки иммунной системы на клеточно-молекулярном уровне. В наши задачи входило исследовать в зависимости от дозы и времени степень связывания ПО с клетками периферической крови человека и рассмотреть пути активации клеток-мишеней под действием иммуномодулятора. * По материалам журнала «ИММУНОЛОГИЯ» № 3, 2004 Материалы и методы Выделение лейкоцитов на желатине. В силиконизированную пробирку с 4 мл гепаринизированной крови добавляли 2 мл 3% желатины на фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с pH 7,4 , инкубировали в течение 10-15 минут при 37°С для осаждения эритроцитов. Далее лейкоциты, полученные из надосадочной жидкости, двукратно отмывали в ФСБ. Приготовление полиоксидония, меченого флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ, «Sigma»). Синтез полиоксидония (ПО), меченого ФИТЦ (Ф-ПО), проводили по методике, описанной Goding J.W. [25] в 0,1 М растворе бикарбоната натрия. Затем осуществляли диализ смеси в мембранных трубках («Spectrapor», m w cutoffe ~3.500) против воды с восьмикратной сменой диализной жидкости. Диализные воды не содержали ФИТЦ, на что указывало отсутствие поглощения при λ=494 нм. Это говорит о полном связывании компонентов в результате реакции. Далее препарат Ф-ПО был лиофильно высушен. На 1 мг ПО в конъюгате Geo Mean 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 0 100 200 мон нейтр 500 1000 2000 конц Ф-ПО ( мкг/мл ) лимф приходится 20 мкг ФИТЦ. Рис. 1 Зависимость доза – эффект интенсивности свечения (Geo Mean) Ф-ПО Оценка взаимодействия лейкоцитов с полиоксидонием. Клеточ- (100 – 2000 мкг/мл) на лейкоцитах (3 ч инкубации) ную взвесь, доведенную до 2*106 клеток/мл, инкубировали при 37°С с Ф-ПО пяти различных концентраций (100, 200, 500, 1000 и 2000 мкг/мл) от 1 до 5 ч. Реакцию ставили в круглодонном 96- бранной фракцией Ф-ПО в концентрации 300 мкг/мл в течение луночном планшете по 100 мкл клеточной суспензии и Ф-ПО. 60 минут при 37°С. После инкубации из взвеси удаляли эрит- После завершения инкубации несвязавшийся с лейкоцитами Ф- роциты лизирующим раствором на 0,15 М хлориде аммония ПО отмывали буфером ФСБ. Для лучшей детекции на проточном («Реахим») и двукратно отмывали в ФСБ. Каплю суспензии клеток цитометре моноцитов, клеточная суспензия была дополнительно переносили на предметное стекло и давали клеткам осесть. помечена фикоэритриновыми анти-CD14-антителами в течение Измерения под микроскопом проводили путем непосредс- 15 минут при комнатной температуре в темноте. Несвязавшиеся твенной иммерсии объектива в каплю с суспензией клеток. анти-CD14-АТ отмывали ФСБ. Затем лизировали эритроциты 200 мкл Микрофлуоресцентные измерения проводили с помощью охлажденного лизирующего раствора на 0,15 М хлориде аммония микроспектрометра OMARS-89 («DILOR») с использованием («Реахим»), лейкоциты осаждали и отмывали ФСБ. Анализ образцов 60-кратного водо-иммерсионного объектива c числовой проводили с помощью проточного цитофлуориметра FACSCalibur апертурой 1,2 («Olympus»). Спектральное разрешение состав- с аргоновым лазером с длинной волны 488 нм в программе ляло 0,8 нм, а пространственное разрешение в направлении «CellQuest». По двум параметрам (переднее (FSC) и боковое (SSC) оптической оси ~4 мкм. Для возбуждения флуоресценции светорассеивание) в окне Dot Plot выделяли 3 облака клеток – мо- использовался аргоновый лазер («Spectra Physics»), 488 нм ноциты, нейтрофилы и лимфоциты, для которых анализировали с мощностью на образе ~15 мкВт. среднюю геометрическую интенсивности флуоресценции (Geo Внутриклеточную концентрацию флуоресцентно меченого Ф- Mean) по каналу FL-1. ПО определяли путем поточечного сканирования цитоплазмы Лазерная сканирующая конфокальная цитоспектрометрия. Оценка клеток с конфокальной фильтрацией сигнала и последующим способности Ф-ПО проникать в различные клетки проводилась выделением спектра ФИТЦ. Образец облучали сфокусированным для двух фракций Ф-ПО. Фракции были получены фильтрацией лазерным лучом в выбранных точках. Испускаемый флуоресцен- исходного раствора Ф-ПО (2 мг/мл в ФСБ) через мембрану для кон- тный сигнал после конфокальной фильтрации регистрировали центрирования растворов белков массой более 5 кДа («Millipore»). в виде спектра. В результате такого измерения получали набор Фракция Ф-ПО менее 5 кДа (< 5 кДа) являлась фракцией, прошедшей спектров флуоресценции в определенных точках, который через мембрану после однократной фильтрации. Вторая фракция впоследствии разлагали на линейную комбинацию спектров Ф-ПО более 5 кДа (>5 кДа ) — это фракция, оставшаяся на мем- сравнения. Коэффициенты такого разложения характеризуют бране после двухкратного фильтрования исходного раствора вклад каждого из спектров сравнения в интегральный сигнал Ф-ПО. При этом высокомолекулярная фракция содержала около флуоресценции в измеренной точке. В качестве спектров срав- 50% от исходного количества флуорофора, а низкомолекулярная нения использовали спектр фонового клеточного сигнала в от- около 25%. Концентрацию Ф-ПО в обеих фракциях оценивали сутствии Ф-ПО и спектр флуоресценции от раствора Ф-ПО в ФСБ. по флуоресценции метки, полагая, что метка распределилась Для каждой измеренной клетки рассчитывался коэффициент между фракциями пропорционально содержанию активного накопления Ф-ПО (К) — отношение интегральной интенсив- вещества. ности внутриклеточной флуоресценции Ф-ПО (усредненной по Лейкоцитарную взвесь, выделенную на желатине и доведенную 4-10 внутриклеточным спектрам флуоресценции) к интегральной до концентрации 2*106 клеток/мл, инкубировали в ФСБ с вы- флуоресценции Ф-ПО в инкубационной среде. Представлен- ные в работе данные по накоплению фракций Ф-ПО в клетках представляют собой значения, усредненные по 20–40 клеткам. В основе данного подхода лежат разработанные и успешно опробованные ранее методики [22-24]. К (Ф-ПО > 5 кДа) К (Ф-ПО < 5 кДа) Фагоциты <0,0015 0,019 ± 0,08 Лимфоциты <0,001 0,011 ± 0,04 Подготовка образцов для электронно-микроскопического исследования. Для работы использовали комплекс коллоидного Таблица 1. Коэффициенты накопления (K) фракции Ф-ПО > 5 кД золота и полиоксидония (Au-ПО) (ПО 200 мкг/мл, коллоидное и фракции Ф-ПО < 5 кД в лейкоцитах периферической крови. золото HAuCl4 («Sigma», 10 нм): 30 ионов золота на одну молекулу ПО). Лейкоцитарную взвесь, выделенную на желатине и доведенную до концентрации 6*106 клеток/мл, инкубировали с Au-ПО в равных объемах в течение 60 минут при 37°С. Реакцию проводили в цитометрических пробирках в объеме 2 мл. После инкубации из взвеси удаляли эритроциты лизирующим раствором на 0,15 М хлориде аммония («Реахим») и двукратно отмывали в ФСБ. Далее клетки осаждали центрифугированием при 200g 5 мин, супернатант удаляли и фиксировали клетки в 2 мл 2,5%-ого глутарового альдегида («Merck») на ФСБ в течение 2 ч при 4°С. Затем аккуратно удаляли глутаральдегид, заменяя его 2 мл 1% раствора четырехокиси осмия («Sigma»), сохраняя предыдущие условия инкубации на холоду. Далее дегидратировали материал, проводя его по спиртам возрастающей крепости по стандартной методике. Последняя инкубация перед заливкой — в 3-х сменах ацетона в течение 30 мин. Заливка в эпоновую заливочную смесь («Serva») проводилась также по стандартной методике. Затем некоторое время материал выдерживали в чистой заливочной смеси и помещали в заливочные емкости. Полимеризация проводилась в течение 1 суток при 37°С и 2 суток при 60°С. Ультратонкие срезы приготовляли на ультратоме LKB-IV, контрастировали водным уранилацетатом, а также цитратом свинца по Рейнольдсу и изучали в электронном микроскопе Jeol-100B. Оценка продукции внутриклеточного кальция лейкоцитами. Продукцию внутриклеточного кальция (Са2+) лейкоцитами периферической крови оценивали с помощью проточной цитометрии, используя краситель Fluo-3 [15]. Для оценки влияния полиоксидония на внутриклеточный Са2+ использовали 100 мкл лейковзвеси, доведенной до концентрации 2*106 клеток/мл по нейтрофилам фосфатно-солевым буфером. Удалив эритроциты Рис. 2. Везикулы с Au-ПО в моноците. Микрофотографии электронно-микро- лизирующим раствором на 0,15 М хлориде аммония («Реахим») скопического исследования. А — фагоцит с двумя везикулами, содержащими ПО и двукратно отмыв в 700 мкл ФСБ, чистые лейкоциты в обьеме (200 мкг/мл), меченый коллоидным золотом. В — увеличенная микрофотогра- 50 мкл инкубировали с Fluo-3 в концентрации 3 мкМ в течение фия моноцита (A): везикула с золотом, отмеченная стрелкой 30 минут при 37°С. Реакцию ставили в цитометрических пробирках. После инкубации лейкоциты осаждали, затем двукратно отмывали в 500 мкл теплого ФСБ и 500 мкл теплого раствора в течение 10 мин при 37°С. В качестве жидкости, омывающей Хенкса. Повторную инкубацию проводили в 500 мкл теплого заборную иглу цитометра, использовали «optimized sheath fluid раствора Хенкса в течение 30 минут при 37°С. Для установле- FACSFlow», являющуюся забуференным солевым раствором ния кальциевого равновесия по окончании инкубации пробы [33]. Принцип идентификации внутриклеточного Са2+ основан оставляли еще на 30 минут при 37°С, добавляя по 500 мкл на захвате клеткой ацетоксиметил эфирной формы красителя теплого раствора Хенкса. В качестве критерия работы системы Fluo-3 с дальнейшим отщеплением эфира цитоплазматическими использовали классический стимулятор внутриклеточного Са2+ эстеразами, приводящим к образованию Са2+-чувствительной кальциевый ионофор А23187 в концентрации 1 мкг/мл, который, формы красителя. На экран выводили окно Dot Plot по двум пара- как и ПО (200 мкг/мл), добавляли в пробы непосредственно метрам FL1 и время в секундах. Детекцию фоновой (спонтанной) во время анализа на цитометре. Анализ образцов проводили продукции Са2+ проводили в течение 2,5 мин, затем вносили ПО с помощью проточного цитометра с использованием про- или кальциевый ионофор А23187 и наблюдали стимулированную граммного обеспечения «CellQuest». Измерение проводили продукцию внутриклеточного Са2+ нейтрофилами и лимфоцита- Рис. 3 Захват комплексов коллоидного золота (А) с полиоксидонием (200мкг/мл) — Au-ПО, — фагоцитом периферической крови. В – увеличение нейтрофила (А): стрелкой показаны частицы коллоидного золота.. ми в течение следующих 8 минут. Данные по моноцитам не снимались, поскольку А В С D в Са -содержащей среде эти клетки хо2+ рошо залипают на пластик. Оценка продукции внутриклеточной перекиси водорода (Н2О2). Перекись водорода определяли с помощью дихлорфлуоресцеина диацетата (ДХФ-ДА) («Sigma») [14,20]. Реакцию ставили в 96-луночных круглодонных планшетах. Для постановки теста лейкоциты, доведенные до концентрации 2*10 6 клеток/мл по нейтрофилам, инк убировали в объеме 100 мкл с 5мкМ ДХФ-ДА в присутствии 5 мМ азида натрия при 37°С в течение 20 минут. Затем вносили равный объем ФСБ с тестируемыми дозами полиоксидония, в контроле – ФСБ. После 60-минутной инкубации с полиоксидонием при 37°С клетки осаждали центрифугированием при 200g 1 мин., эритроциты удаляли лизирующим раствором (200 мкл на лунку) на 0,15 М хлориде аммония («Реахим»), лейкоциты однократно отмывали и ресуспендировали в 400 мкл ФСБ для анализа на проточном цитометре. В качестве критерия работы Рис. 4 Детекция внутриклеточного Са2+ с помощью красителя Fluo-3 под действием Са2+-ионофора А23187 системы использовали классический в концентрации 1 мкг/мл (А – нейтрофилы, В – лимфоциты) и полиоксидония – 200 мкг/мл (С – нейтрофилы, стимулятор фагоцитов форболмиристил D – лимфоциты) в течение 10 минут. ацетат (ФМА, «Sigma»), который добавляли в дозе 100 нг/мл за 30 минут до окончания инкубации. Результаты и обсуждение Анализ образцов проводили на проточном цитофлуори- На первых этапах изучения механизма действия полиок- метре. Нефлуоресцирующий ДХФ-ДА внутри клетки после сидония было установлено, что клетками-мишенями им- гидролиза диацетатной группы окисляется перекисью водо- муномодулятора являются подвижные макрофаги тканей, рода. Оценивали среднюю геометрическую интенсивности циркулирующие фагоциты крови, а также оседлые фагоциты флуоресценции дихлорфлуоресцеина (ДХФ), образуемого в ретикуло-эндотелиальной ткани [10]. В данной работе перед результате этой реакции и излучающего в зеленой области нами была поставлена задача в первую очередь изучить сте- спектра (GeoMean). пень взаимодействия ПО с клетками периферической крови vitro. Для этого был использован метод проточной цитометрии, который позволяет визуально выделить из лейкоцитов периферической крови три популяции клеток: нейтрофилы, моноциты и лимфоциты, а также изучить степень связывания препарата, меченого флуоресцентным красителем, с этими клетками. С помощью ФИТЦ-меченого ПО (Ф-ПО) было выяснено, что иммуномодулятор взаимодействует со всеми популяциями лейкоцитов, однако с разной степенью интенсивности. Оказалось, что ПО наиболее интенсивно связывается с моноцитами и нейтрофилами и значительно хуже — с лимфоцитами. Была измерена средняя геометрическая интенсивности свечения Ф-ПО (GeoMean), отражающая степень Интенсивность свечения ДХФ , GeoMean человека (лимфоцитами, моноцитами и нейтрофилами) in 90 77,5* 80 70 60 62,7 56,7 62,6 50 40 30 20 10 0 12,1 11,2 2,3 2,7 13,3 ПО 100 ПО 250 нейт р мон лимф от 1 до 5ч в диапазоне концентраций от 100 до 2000 мкг/мл. 2,8 2,8 Конт роль взаимодействия препарата с клеткой, в течение каждого часа 14,2* ПО 500 К третьему часу инкубации при увеличении концентрации Рис. 5 Влияние полиоксидония (100, 250 и 500 мкг/мл) на уровень синтеза Ф-ПО от 100 до 2000 мкг/мл интенсивность свечения Ф-ПО внутриклеточной перекиси водорода, оцениваемой по флуоресценции ДХФ для моноцитов возрастала от 141 ± 26,4 до 474,3 ± 75,7 отн. (GeoMean) (n=15). Здесь и в табл.2-4 : * - р < 0,05 по сравнению с контролем (без ед. (p < 0,01). GeoMean у нейтрофилов была ниже на 10-20 % полиоксидония) и составила от 109,1 ± 21,3 до 386,5 ± 74,8 отн. ед. соответсменьше в среднем в 7-8 раз по сравнению с моноцитами и в 6-7 раз по сравнению с нейтрофилами (от 16,4 ± 2,5 до 32 твенно (p < 0,01). Свечение препарата для лейкоцитов было ФМА 65,0 ± 13,6; p < 0,05). По графику доза-эффект (рис.1) видно, что взаимодействие полиоксидония с клетками имело линейный При статистической обработке данных был выявлен некоторый полиоксидоний Events дозозависимый характер. разброс в интенсивности свечения Ф-ПО, т. е. в связывании препарата с клетками различных доноров. Отсюда возникает контроль предположение, не является ли причиной этого разброса индивидульная чувствительность к взаимодействию с иммуномодулятором. Известно, что действие иммуномодуляторов может зависеть от индивидуальной чувствительности. Так, крови [5]. Есть предположение о том, что индивидуальная 0 например, показана корреляционная зависимость между эффективностью действия нуклеината натрия и группами 100 101 102 FL1-H 103 чувствительность к действию иммуномодуляторов находится Рис. 6 Цитофлуорограмма ДХФ-теста. Влияние полиоксидония (500 мкг/мл) под генетическим контролем, который может реализоваться на уровень внутриклеточной Н2О2 в нейтрофилах периферической крови через действие множества факторов, например, экспрессию доноров. ФМА в дозе 100 нг/мл 104 специальных рецепторных структур для иммуномодуляторов на различных иммунокомпетентных клетках, для продуктов деградации иммунокорригирующих средств, через активность Следующим этапом работы явилось изучение того, что проис- разных систем организма, обеспечивающих деградацию им- ходит с препаратом, после взаимодействия ПО с лейкоцитами: муномодуляторов и т.д. [7]. Вероятно, именно с этим связано проникает ли он в цитозоль клетки или остается на поверх- отсутствие до настоящего времени более точных сведений, ности, многоточечно взаимодействуя с цитоплазматической касающихся генетических структур контроля эффективности мембраной. Для решения этой задачи нами были использованы действия таких препаратов. методы конфокальной цитоспектрометрии и электронной Изучение взаимодействия Ф-ПО с лейкоцитами во времени микроскопии. показало, что в течение первых трех часов инкубации свечение Первая методика за счет конфокальной фильтрации сигнала Ф-ПО возрастало для всех трех популяций лейкоцитов в ис- позволяет регистрировать флуоресценцию из определенного следуемом диапазоне концентраций. К четвертому и пятому объема внутриклеточного пространства, подавляя сигналы часу инкубации Geo Mean практически не изменилась, что флуорофоров с поверхности клетки и/или из внеклеточного говорит о том, что взаимодействие полиоксидония с клет- пространства. Анализ внутриклеточных спектров флуорес- ками проходит в течение первых часов, достигая максимума ценции дает возможность наиболее корректно учесть вклад к трем часам. в измеряемый сигнал флуоресценции, не связанной с иссле- дуемым препаратом, в частности, собственной клеточной сканирующей конфокальной цитоспектрометрии подтверж- флуоресценции, а также следить за изменениями в состоянии дает именно последнее предположение. Таким образом, оба флуорофора внутри клеток и определить внутриклеточную подхода к изучению проникновения ПО в клетку дополняют концентрацию красителя. Так, с помощью лазерной скани- и уточняют друг друга. рующей конфокальной цитоспектрометрии установлено, После контакта вещества с клеткой-мишенью происходит что фракция Ф-ПО > 5 кД практически не проникает в клетки ее стимуляция с запуском каскада активационных путей, (табл. 1). Интенсивность флуоресценции этой фракции внутри приводящих к функциональным перестройкам: продви- клеток находится на пределе детекции прибора. Анализ про- жение в другую фазу клеточного цикла, повышение или никновения фракции < 5 кД в клетки показал, что эта фракция снижение секреторной активности, переход в апоптоз и др. проникает в фагоциты и в лимфоциты намного интенсивнее, Процесс активации лейкоцитов состоит из двух этатапов: чем фракция > 5 кД (табл. 1). При этом внутриклеточные спек- праймирование и запуск. Праймирование определяется тры флуоресценции фракции < 5 кД идентичны спектру этой как процесс, приводящий к активации протеинкиназы фракции в ФСБ. Отметим, что максимум спектра флуоресцен- С (ПКС) без мобилизации кальция, т.е. как неполный сигнал. ции Ф-ПО сдвинут на 4 нм в голубую область по сравнению Дальнейшее воздействие активационного агента завершает с максимумом спектра свободного флуоресцеина в клетках, формирование сигнала путем мобилизации Са2+ с участием что исключает возможность ошибки в идентификации про- инозитолтрифосфата [13]. Также активация клетки может исхождения внутриклеточного флуоресцентного сигнала. проходить и за счет одновременной индукции и Са2+ и ПКС. Коэффициент накопления фракции Ф-ПО < 5 кД в фагоцитах Кальций — важная внутриклеточная передаточная молекула составил 0,019 ± 0,08 , а в лимфоцитах в среднем в 1,7 раза для таких реакций лейкоцитов, как хемотаксис и дегрануля- меньше — 0,011 ± 0,04. Таким образом, полученные нами ция. Увеличение концентрации кальция в цитозоле служит результаты указывают на то, что в фагоциты и лимфоциты спо- необходимым и достаточным стимулом для экзоцитоза, собна проникать преимущественно фракция полиоксидония и возможно, для хемотаксиса и фагоцитоза, но не для ды- < 5 кД, хотя и с невысокой эффективностью. хательного взрыва, для которого главным передаточным Другой метод, использованный нами для выяснения вопроса механизмом является активация ПКС [3]. Т.е. существует локализации ПО по отношению к клетке — это электрон- и кальций-независимый путь активации клетки, для кото- ная микроскопия, в которой в качестве индикатора часто рого достаточны фоновые уровни внутриклеточного Са2+. используется коллоидное золото. С помощью электрон- Так, форболмиристил ацетат (ФМА), мощный стимулятор ной микроскопии возможна детекция препарата, меченого «дыхательного взрыва» в фагоцитах, опосредует свой сигнал коллоидным золотом, в клеточных срезах, за счет резкого через активацию ПКС [36], которая способствует открытию контрастирования в цвете частиц золота по отношению кальциевого насоса, выкачивающего Са2+ из клетки [35, 39], к содержимому клетки. Так, золотом метят белки, рецепторы, снижая его содержание в клетке. углеводы, биологически активные вещества, фармаколо- В результате проведенных исследований по влиянию полиок- гические препараты с целью определения их локализации сидония на продукцию внутриклеточного кальция с помощью внутри клетки [21,38], ультраструктурных изменений, влия- проточной цитометрии, используя флуоресцентный краситель ния на физиологические процессы, в том числе механизмы Fluo-3, нами было выявлено, что иммуномодулятор не вызы- эндоцитоза [32] и апоптоз [18]. вает активации мобилизации Са2+ из внутриклеточных депо При проведении электронномикроскопического изучения лока- и/или пассивного тока Са2+ в клетку (рис. 4). Таким образом лизации ПО, молекулы которого связаны в комплексе с частицами ставится под сомнение ранее выдвинутое предположение коллоидного золота (Au-ПО) было обнаружено, что Au-ПО может о том, что полиоксидоний может вызвать открытие кальцие- располагаться как на поверхности фагоцитов (нейтрофилов вых каналов для входа двухвалентного иона. Можно сделать и моноцитов), так и внутри них. Внутриклеточная локализация предположение о том, что полиоксидоний активирует клетку Au-ПО обнаруживается в мелких одномембранных везикулах кальций-независимым путем через активацию ПКС или каль- (рис.2). Количество частиц золота, находящихся в везикуле, ций-зависимым путем, но после воздействия праймирующего колебалось от 3-4 до 8 шт. Чаще всего везикулы с золотом рас- агента. По первой версии после активации ПКС должен быть полагались вблизи ядра, что предположительно может говорить активирован «дыхательный взрыв» в клетке, сопровождаю- о транспортировке вещества к нему. щийся мощным выбросом активных форм кислорода. Однако Также был зафиксирован момент захвата цепочки из частиц были полученны данные, описанные ниже, показывающие, коллоидного золота нейтрофилом с поверхности клетки, кото- что Н2О2 под действием ПО вырабатывается в небольших корый отображен на рис. 3. Можно предположить, что в фагоциты личествах, что никак не похоже на «респираторный взрыв». полиоксидоний попадает путем активного транспорта, т.е. Вероятно, действие иммуномодулятора опосредуется через эндоцитозом. Частицы коллоидного золота были также обнару- праймирующего агента, который будет запускать активацию жены на поверхности лимфоцитов, но не было зафиксировано ПКС, и после дальнейшего воздействия иммуномодулятора ни одного случая с их внутриклеточной локализацией. Что начнется мобилизация Са2+ внутри клетки. может говорить о том, что ПО не проникает в лимфоциты, либо Известен другой маркер активации лейкоцитов — это внут- проникает, но в небольших количествах. Методика лазерной риклеточная Н2О2. Для детекции активных форм кислорода в клетке используют различные флуорохромы, флуоресцентные регулирует транскрипцию генов, продукты которых отвечают свойства которых проявляются только после взаимодействия за развитие воспаления и иммунный ответ, продукцию NO, с этими радикалами непосредственно в цитоплазме клетки. репликацию вирусов, межклеточные взаимодействия, про- В качестве индикатора внутриклеточной Н2О2 в данной рабо- лиферацию, апоптоз и т.д. [28]. Выявлено, что Н2О2 запускает те использовали ДХФ-ДА, который изначально не обладает синтез VEGF (vascular endothelial growth factor) макрофагальной флуоресцирующими свойствами. После пассивной диффузии культурой U937 [17]. Н2О2 также задействована в активации флуорохрома в клетку под действием внутриклеточных эсте- фосфолипазы С-γ1, которая опосредованно регулирует кле- раз происходит гидролиз диацетатной группы. В присутствии точную пролиферацию и дифференцировку через индукцию пероксидазы ДХФ окисляется перекисью водорода, приобре- вторичных мессенджеров — диацилглицерола и инозитол-3- тая флуоресцирующие свойства [31]. С помощью проточной фосфата, ведущих к активации ПКС и мобилизации Ca2+ [37]. цитометрии оценивалась интенсивность флуоресценции ДХФ На культуре легочных человеческих фибробластов (HLF) по которой можно судить об интенсивности наработки Н2О2 показано, что стимуляция этих клеток TGF-β1 приводит к тран- в отдельно взятой клетке. Было показано, что полиоксидоний зиторному повышению Н2О2, вызывающую мобилизацию Ca2+ усиливает интенсивность флуоресценции ДХФ (GeoMean) после из внутриклеточных депо, с дальнейшей активацией MAPK часовой инкубации во всех лейкоцитах, в том числе и лимфо- (mitogen-activated protein kinase), AP-1 и в конечном итоге цитах (рис.5). Отметим, что по сравнению с ФМА, классическим приводит к экспрессии гена ИЛ-6 [29]. индуктором «кислородного взрыва», который вызывал деся- Таким образом, полиоксидоний после проникновения в клеткитикратное усиление флуоресценции (данные не показаны), ПО мишени (моноциты и нейтрофилы), активирует их, повышая демонстрировал не столь существенное повышение GeoMean внутриклеточную Н2О2, которая, по-видимому, в свою очередь (рис.6). В дозе 500 мкг/мл препарат показывает статистически активирует транскрипционный фактор NF-κB, участвую- достоверное увеличение уровня Geo Mean по нейтрофилам щий в регуляции синтеза цитокинов. Вследствие этого под и моноцитам. Так, Geo Mean контрольных нейтрофилов равна действием полиоксидония происходит усиление синтеза 56,7±24,0, в присутствии полиоксидония — 77,5±33,5 (p<0,05), провоспалительных цитокинов ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНО-α [4]. Также моноцитов — соответственно 11,2±5,7 и 14,2±5,3 (p<0,05). полиоксидоний стимулирует киллинг бактерий фагоцитами В среднем продукция Н2О2 нейтрофилами и моноцитами по- периферической крови после часовой инкубации с иммуно- вышается на 40%, лимфоцитами — незначительно, но также модулятором как у доноров, так и у больных хронической возрастает (на 20%). гранулематозной болезнью. Предположительным механизмом Работы авторов [29, 30, 37] по изучению продукции актив- активации бактерицидной функции считается активация О2- ных форм кислорода за последние годы показывают, что независимых механизмов киллинга. Возможно, стимуляция небольшое увеличение уровня Н2О2 является ключевым для внутриклеточного киллинга стафилококка связана с акти- активации ряда сигнальных молекул и имеет не меньшее вацией NO-зависимого пути гибели бактерий [19]. NO имеет биологическое значение, чем феномен «респираторного большое значение для киллинга Mycobacterium tuberculosis, взрыва». Доказано участие Н2О2 в процессе активации NF- Plasmodium falciparum и других патогенных микроорганиз- κB — ядерного транскрипционного фактора [26, 28, 30]. NF-κB мов [16, 27, 34]. ЛИТЕРАТУРА 1. Аверкиев В.Л., Тарасенко В.С., Латышева Т.В., Аверкиева Л.В. 6. Лусс Л.В., Некрасов А.В., Пучкова Н.г., Бхардварж А., Бхардварж Коррекция иммунологических нарушений у больных с панкре- Л.А Роль иммуномодулирующей терапии в общеклинической онекрозом. // Иммунология. – 2002. – № 6. – с. 356-359. практике. // Иммунология. – 2000. – № 5. – с. 34-39. 2. Аршинова С.С., Пинегин Б.В., Стаханов В.А., Симонова А.В., Ма- 7. Манько В.М., Петров Р.В., Хаитов Р.М. Иммуномодуляция: история, зуров Д.В., Голубева Н.М., Перевезенцева Е.О. Иммуномодулятор полиоксидоний в комплексной терапии больных туберкулезом легких. // Иммунология. – 2001. – № 3. – с. 35-40. 3. Дейл М.М., Формена Дж. К. Руководство по иммунофармакологии. – М;1998. –с.39. 4. Дьяконова В.А, Климова С.В., Ким К.Ф., Пинегин Б.В. Продукция цитокинов под действием полиоксидония in vitro. // Иммунология. – 2002. - № 6. - с. 337-340. 5. Земсков А.М., Земсков В.М., Караулов А.В., и др. Иммунная реактивность и генетические маркеры крови. – М., 1999. тенденции развития, современное состояние и перспективы. // Иммунология. – 2002. – № 3. – с. 132-138. 8. Некрасов А.В., Пучкова Н.Г., Иванова А.С. и др. Производное поли1,4-этиленпиперазина, обладающее иммуномодулирующей, противовирусной и антибактериальной активностью. Пат. РФ № 2073031, 1997. 9. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Некрасов А.В. и др. Полиоксидоний — иммуномодулятор последнего поколения: итоги трехлетнего клинического применения. // Алл. аст. и клин. иммунол. – 1999. – №3. – с.3-6. 10. Пинегин Б.В., Сараф А.С. Отечественный иммуномодулятор 26. Hensley K., Robinson K.A., Gabbita S.P., Salsman S., Floyd R.A., «Полиоксидоний»: механизм действия и клиническое применение. – Reactive oxygen species, cell signaling, and cell injury. // Free Radical ГНЦ-Институт иммунологии МЗ РФ, ООО “ИММАФАРМА”. – 2000. Biology & Medicine. – 2000. – V.28. – N10. – P. 1456-1462. 11. Романова А.В., Латышева Т.В., Применение полиоксидония в 27. Jagannath C., Actor J.L., Hunter R.L. Induction of nitric oxide in комплексной терапии больных с тяжелой формой бронхиаль- human monocytes and monocyte cell lines by Mycobacterium ной астмы. // Иммунология. – 2002. – № 6. – с. 372-376. tuberculosis// Nitric Oxide: Biology and Chemistry. – 1998. – V.2– 12. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Современные иммуномодуляторы: N.3– P.174-186. основные принципы их применения. // Иммунология. – 2000. – 28. Janssen-Heininger Y.M., Poynter M.E., Baeuerle P.A., Recent advances N5. – с.4-8. towards understanding redox mechanisms in the activation of 13. Ярилин А.А. Основы иммунологии: Учебник. – М.: Медицина, 1999. nuclear factor κB. // Free Radical Biology & Medicine. – 2000. – 14. Bass D.A., Parce J.W., Dechaitelet L.R., Szejda P., Seeds M.C., Thomas M. V.28. – N9. – P. 1317-1327. Flow cytometric studies of oxidative product formation by neurtophils: 29. Junn E., Lee K., Ju H., Han S., Im J., Kang H., Lee T., Bae Y., Ha K., Lee Z., a graded response to membrane stimulation// J Immunol. – 1983. – Rhee S., Choi. Requirement of hydrogen peroxide generation in TGF- V.130. – N4. – P.1910-1917. 15. Burchiel S.W., Edwards B.S., Kuckuck F.W., Lauer F.T., Prossnitz E.R., Ransom J.T., Sclar L.A. Analysis of free intracellular calcium by flow cytometry: multiparameter and pharmacological applications. // Methods. – 2000. - №21. – p. 221-230. 16. Chiwakata C.B., Hemmer C.J., Dietrich M. High levels of inducible nitric oxide synthase mRNA are associated with increased monocyte counts in blood and have a beneficial role in plasmodium falciparum malaria. // Infection and Immunity. – 2000. – V.68. – N.1. - P.394-399. 17. Choo M., Hunt T., Hussain M. Hydrogen peroxide stimulates macrophage vascular endothelial growth factor release// Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. – 2001. – V.280. – P.H2357-H2363. 18. Cornelissen M, Philippe J, De Sitter S, De Ridder L. Annexin V expression β1 signal transduction in human lung fibroblast cells: involvement of hydrogen peroxide and Ca2+ in TGF-β1-induced IL-6 expression// J. of Immunol. – 2000. – V.165. – P.2190-2197. 30. Kamata H., Manabe T., Oka S., Kamata K., Hirata H. Hydrogen peroxide activates IkappaB kinases through phosphorilation of serine residues in the activation loops// FEBS Lett. – 2002. – V.519(13). – P.231-237. 31. Model M.A, KuKuruga M.A. et al. A sensitive flow cytometryc method for measuring the oxidative burst // J. of Immunol. Meth.- 1997. – Vol.202. – P.105-111. 32. Montaner LJ, da Silva RP, Sun J, Sutterwala S, Hollinshead M, Vaux D, Gordon S. Type 1 and type 2 cytokine regulation of macrophage endocytosis: differential activation by IL-4/IL-13 as in apoptotic peripheral blood lymphocytes: an electron microscopic opposed to IFN-gamma or IL-10. // J Immunol. – 1999. – V.162. – evaluation. //Apoptosis. – 2002. - V7 -№1. – P.41-7. №8. – P.4606-13. 19. Dambaeva SV, Mazurov DV, Golubeva NM, D’yakonova VA, Pinegin 33. Ormerod M.G. Flow cytometry. – Oxford. – University press, 2000. BV, Khaitov RM. Effect of Polyoxidonium on the Phagocytic Activity 34. Rich E.A., Torres M., Sada E., Finegan C.K., Hamilton B.D., Toossi of Human Peripheral Blood Leukocytes. Russ J Immunol, 2003 Z. Mycobacterium tuberculosis (MTB)-stimulated production of Apr;8(1):53-60. nitric oxide by human alveolar macrophages and relationship of 20. Eeden S.F., Klut M.E., Walker B.A.M., Hogg J.C. The use of flow cytometry to measure neutrophil function // J. of Immun. Meth. – 1999. – V.232. – P.23-43. 21. Falleni A, Trincavelli ML, Macchia M, Salvetti F, Hamdan M, Calvani nitric oxide production to growth inhibition of MTB. // Tuber Lung Dis. – 1997. – V.78. – N.5-6. – P.247-255. 35. Schondorf M, Bidlingmaier F, von Ruecker AA. Protein kinase C regulates IL-8 and fMLP induced cytoplasmic Ca2+ increase in F, Gremigni V, Lucacchini A, Martini C. A(1) adenosine receptors human granulocytes by receptor modulation measurements by in human neutrophils: direct binding and electron microscope flow cytometry. // Biochem Biophys Res Commun. – 1993. – V.197.– visualization. // J Cell Biochem. – 1999. – V.75. – №2. – P.235-44. №2. – P.549-55. 22. Feofanov A., Charonov S., Fleury F., Kudelina I., and Nabiev I. 36. Spagnoli A, Spadoni GL, Sesti G, Del Principe D, Germani D, Quantitative Confocal Spectral Imaging Analysis of Mitoxantrone Boscherini B. Effect of insulin on hydrogen peroxide production Within Living K562 Cells: Intracellular Accumulation and Distribution by human polymorphonuclear leukocytes. Studies with of Monomers, Aggregates, Naphtoquinoxaline Metabolite and Drug- monoclonal anti-insulin receptor antibodies, and an agonist Target Complexes. // Biophys. J. – 1997. - v. 73, 3328-3336. 23. Feofanov A., Charonov S., Kudelina I., Fleury F., and Nabiev I. and an inhibitor of protein kinase C. // Horm Res. – 1995. – V.43. – №6. – P.286-93. Localization and Molecular Interactions of Mitoxantrone Within 37. Wang X.-T., McCullough K., Wang X.-J., Carpenter G., Holbrook N. Living K562 Cells as probed by Confocal Spectral Imaging Analysis.// Oxidative stress-induced phospholipase C-γ1 activation enchances Biophys. J. - 1997. - v. 73, 3317-3327. cell survival // J. of Biol. Chem. – V.276. – N.30. – P.28364-28371. 24. Galanina O., Feofanov A., Tuzikov A. B., Rapoport E., Crocker P. 38. Yang DH, Tsuyama S, Ohmori J, Murata F. Sulfated glycosaminoglycans R., Grichine , Egret-Charlier M., Vigny , Pendu J. Le and Bovin N. V. in guinea pig neutrophils studied by use of cationic colloidal gold. // Fluorescent Carbohydrate Probes for Cell Lectins // Spectrochimica J Histochem Cytochem. – 1999. – V.47. – №7. – P.881-8. Acta. - 2001. - v. 57, 2285-2296. 39. Zhang J, Kaupke CJ, Yousefi S, Cesario TC, Vaziri ND. Flow cytometric 25. Goding J.W. Conjugation of antibodies with fluorochromes: investigation of neutrophil activation pathways by n-formyl-Met- modification to the standard methods. // J Immunol Methods. – Leu-Phe and phorbol myristate acetate. // Biol Cell. – 1995. – V.84. – 1976. – V.13. – N.3-4. - P.215-26. №3. – P.147-53.
