1 003740 2 Настоящее изобретение относится к при

1
Настоящее изобретение относится к применению LAG-3, а в более общем смысле - лигандов молекул МНС класса II или МНС-IIподобных лигандов в качестве адъювантов для
вакцин,
с
целью
бустинга
антигенспецифичного иммунного ответа, равно как и к
применению LAG-3 в качестве терапевтического средства в иммунотерапии злокачественных
опухолей.
В настоящее время установлено, что белки,
кодируемые участком МНС (главный комплекс
гистосовместимости) класса II, вовлечены во
многие стороны иммунных реакций, включая
взаимодействие между различными типами
лимфоидных клеток, таких как лимфоциты и
антигенпрезентирующие клетки. Различные
исследования также продемонстрировали, что и
другие механизмы, не связанные с участием
молекул CD4, участвуют в проявлении эффекторной функции Т-хелперов.
Ген активации лимфоцитов-3 (LAG-3),
экспрессируемый CD-4 и СВ8-позитивными
активированными Т-клетками человека, равно
как и инактивированными клетками NK, кодирует состоящий из 503 аминокислот полипептид, относящийся к мембранным белкам I типа,
включающий четыре внеклеточных иммуноглобулиноподобных домена (IgSF) [1], являющийся
лигандом молекул МНС класса II [2]. Анализ
этой аминокислотной последовательности позволил выявить отчетливые сегменты идентичности по сравнению с аминокислотными последовательностями, обнаруживаемыми в соответствующих участках CD4, хотя общий уровень
гомологии аминокислотных последовательностей CD4 и LAG-3 человека практически не
превосходит контрольный уровень (примерно
20%-ная идентичность последовательностей
полипептидов). Также имеется несколько внутренних участков гомологии последовательностей в молекуле LAG-3 между доменами 1 (D1)
и 3 (D3), равно как и между доменами 2 (D2) и 4
(D4): это подтверждает, что LAG-3 эволюционировал так же, как и CD4, по пути дупликации
соответствующих генов, при том, что предковой
являлась структура с двумя доменами IgSF [1].
Кроме того, гены LAG-3 и CD4 локализованы
очень близко друг к другу в дистальной части
короткого плеча хромосомы 12 [3]. Таким образом, гены (и белки) LAG-3 и CD4 могут быть
определены как "двоюродные братья" в составе
суперсемейства
иммуноглобулиноподобных
белков [2].
Как и CD4, LAG-3 человека включает Igподобные внеклеточные домены, при том, что в
доменах 2 и 4 имеются мотивы WxC; однако,
отличием от CD4 является присутствие дополнительной выпетленной последовательности в
составе 1-го домена (распознаваемой моноклональным антителом 17В4) и цитоплазматического богатого пролином мотива (ЕР-повторы) в
составе LAG-3 человека (hLAG-3). Недавно ген
003740
2
активации лимфоцитов-3 мыши (mLAG-3) был
клонирован и был обнаружен приблизительно
70%-ный уровень гомологии с hLAG-3: в частности, имеется тот же богатый пролином цитоплазматический "хвост".
Антигенспецифичная стимуляция CD4позитивных Т-клеточных клонов в присутствии
моноклонального антитела против LAG-3 приводит к усилению клеточной пролиферации и
выработки цитокинов [5]. Была подтверждена
регуляторная роль hLAG-3 в активации CD4несущих Т-лимфоцитов за счет перекрестного
связывания молекул МНС класса II, экспрессируемых Т-клетками, с химерными белками
LAG-3/Ig [6]. Взаимодействие между LAG-3 и
молекулами МНС класса II подавляет сигналы,
передаваемые молекулами МНС класса II, экспрессируемыми
CD4-позитивными
Тлимфоцитами (ослабление пролиферации клеток и выработки цитокинов): это подтверждает,
что и LAG-3, и МНС класса II являются эффекторными молекулами механизма негативной
регуляции иммунных ответов, опосредуемых Тхелперными лимфоцитами. Для химерного белка hLAG-3/Ig было показано связывание чужеродных молекул МНС класса II (мыши и обезьяны). Кроме того, предполагается, что mLAG-3
опосредует позитивный сигнал в эффекторных
клетках: на это указывает то, что трансгенные
мыши, несущие нулевую мутацию в гене LAG3, характеризуются нарушением в пуле клеток
NK [7].
Линии опухолевых клеток мышей, методами генной инженерии измененных таким образом, чтобы экспрессировать мембранные
(В7.1, В7.2, CD95L и др.) или секретируемые
молекулы (интерлейкин-2, интерлейкин-12 и
др.), часто используют в исследованиях иммунных ответов или противоопухолевых проявлений. Такой подход показывает, что многие опухолевые клетки являются потенциально антигенными [9] и становятся иммуногенными тогда, когда они экспрессируют какие-либо молекулы. Полученные в эксперименте у мышей
опухоли классифицируют как иммуногенные
тогда, когда после однократной инъекции сингенным мышам нереплицирующихся клеточных
вакцин эти мыши вырабатывают эффективный
иммунный ответ против последующих летальных воздействий. Опухоли, которые не обеспечивают сохранения такой остаточной иммуногенности, определяются как слабоиммуногенные или неиммуногенные.
Противоопухолевые иммунные ответы, в
первую очередь, опосредуются Т-лимфоцитами
[12]. Недавние исследования подтвердили дефицит в презентировании антигенов и прилигровании Т-клеток, что создает проблемы для
практического воплощения идеи универсальной
противоопухолевой вакцины. Действительно,
было установлено, что трансфекция опухолевых
клеток генами, кодирующими различные цито-
3
кины, такие как IL-2, IL-4, IL-12 или GM-CSF,
или генами, кодирующими ко-стимуляторные
молекулы, такие как В7, не только приводит к
первичному отторжению модифицированных
клеток, но и часто обеспечивает защитный иммунитет против последующих воздействий немодифицированными опухолевыми клетками
[13].
Функциональные антигенпрезентирующие
клетки (АРС) способны принимать, процессировать и презентировать антиген Т-лимфоцитам
в контексте ко-стимуляторных сигналов, необходимых для активации Т-лимфоцитов, что
приводит к оптимальному презентированию
антигена. В частности, достоверно установлено,
что позитивные по молекулам МНС класса II
дендритные клетки играют принципиальную
роль в процессировании и презентировании антигенов в иммунной системе. Заявители высказали гипотезу, в соответствии с которой опухолевая иммуногенность должна возрастать, если
опухоль удастся модифицировать так, чтобы
она непосредственно направляла АРС организма-хозяина, такие как макрофаги и дендритные
клетки. Действительно, было сообщено о том,
что перекрестное связывание молекул МНС
класса II, специфически экспрессируемых такими клетками, с использованием моноклонального антитела или суперантигена, опосредует сигналы, приводящие к выработке TNFα и IL-12
[14, 15]. Ранее было сообщено, что ген активации лимфоцитов-3 (LAG-3), находящийся в составе локуса CD4 [1, 6], кодирует белок, который связывается с молекулами класса II главного комплекса гистосовместимости человека и
мыши с большим уровнем аффинности по сравнению с CD4 [17, 6].
Заявители настоящего изобретения исследовали, может ли экспрессия hLAG-3, CD4 человека (hCD4) и mLAG-3 на трех МНС класса
II-положительных опухолях мыши (слабоиммуногенная саркома МСА-205 и неиммуногенная
аденокарцинома TS/A+RENCA) опосредовать
иммунный ответ таким образом, чтобы отторгать опухоль у мыши с индуцированием системного иммунитета.
В результате заявители установили, что
LAG-3 человека или мыши в случае его экспрессии в виде мембранного белка в линии клеток солидной опухоли или в случае его инокуляции мышам в виде растворимого белка индуцирует формирование иммунитета к наиболее
злокачественным опухолям мыши. Иммунитет
оказался зависимым от Т-лимфоцитов и антигенспецифичным.
Авторы также исследовали роль CD4 и обнаружили, что CD4 человека (hCD4) также индуцирует системный противоопухолевый ответ.
Индуцированный иммунитет, как было установлено, опосредуется Т-лимфоцитами, поскольку такой же противоопухолевый ответ был
выявлен у мутантных мышей линии "nude", у
003740
4
которых из-за аплазии гипофиза отсутствуют Тлимфоциты.
Противоопухолевый эффект был также
обнаружен, когда были использованы различные линии опухолевых клеток, проявляющих
различные варианты собственной иммуногенности, равно как и различные линии мышей, экспрессирующих различные гены комплекса
МНС.
Кроме того, индуцируемые белками hLAG3 и hCD4 эффекты были обнаружены тогда, когда линии опухолевых клеток, экспрессирующих hLAG-3 и hCD4, были инъецированы в отличающемся участке по сравнению с местом
исходной инокуляции у линий опухолевых клеток дикого типа.
Далее, системное введение растворимого
hLAG-3 напрямую индуцирует подавление роста опухоли in vivo.
Все обозначенные выше результаты показывают, что LAG-3 и CD4 способны обусловливать антигенспецифичный, опосредуемый Тлимфоцитами иммунный ответ и могут быть
использованы в иммунотерапии с целью предотвращения развития злокачественных опухолей в популяциях, характеризующихся соответствующим риском или, в более общем смысле,
для любых иммунотерапевтических целей, которые основываются на антигенспецифичном,
опосредованном Т-клетками иммунном ответе, а
также показывают, что LAG-3 также применим
в качестве средства для подавления роста опухоли in vivo.
Далее заявители продемонстрировали, что
растворимый LAG-3 в случае введения одновременно с антигеном, по отношению к которому вырабатывается иммунный ответ, способен
функционировать в качестве вакцинного адъюванта.
Такое проявление может быть объяснено
улучшением презентирования данного антигена
специальными АРС (дендритными клетками и
макрофагами), расположенными под кожей, что
опосредуется молекулами МНС класса II.
Следовательно, поскольку индукция CD8+Т-клеточного иммунитета вовлечена в вирусные
(например, ВИЧ-инфекция, гепатит или герпес)
и внутриклеточные паразитарные и бактериальные (например, проказа, туберкулез) инфекции
и злокачественные опухоли, LAG-3 может быть,
в частности, использован для терапевтической
вакцинации против патогенных агентов, связанных с этими заболеваниями, равно как и для
лечения злокачественных опухолей.
В соответствии с одним из аспектов настоящее изобретение касается использования
лиганда молекул МНА класса II и лигандов подобных молекул для производства лекарственного средства, предназначенного для профилактики или лечения патологических состояний,
вовлекающих антигенспецифичный иммунный
ответ, предпочтительно антигенспецифичный,
5
опосредуемый
Т-лимфоцитами
иммунный
ответ.
В первом варианте молекулой, связывающейся с МНС класса II, является белок LAG-3,
равно как и его производные, способные связываться с лигандом LAG-3, входящим в МНС.
В контексте настоящего изобретения под
производными LAG-3 подразумеваются мутанты, варианты и фрагменты LAG-3, а именно
растворимые фрагменты LAG-3, которые сохраняют способность самого LAG-3 связываться с молекулами МНС класса II.
Таким образом, могут быть использованы
следующие формы LAG-3:
- полный белок LAG-3;
- растворимый фрагмент полипептида
LAG-3, включающий, по крайней мере, один из
четырех
внеклеточных
иммуноглобулиноподобных доменов, а именно растворимая часть
LAG-3, включающая внеклеточный сегмент,
протяженный от 23-й аминокислоты до 448-й
аминокислоты последовательности LAG-3,
представленной в заявке на выдачу патента
Франции № 90-00-126;
- фрагмент LAG-3, включающий по сути
полные первый и второй домены;
- фрагмент LAG-3, включающий по сути
полные первый и второй домены или все четыре
домена, такие, которые определены в международной патентной заявке WO 95/30750, такой
фрагмент как:
- мутантный вариант растворимого LAG-3
или его фрагмент, включающий внеклеточные
домены D1 и D2, включающие:
- замену аминокислоты по одному из следующих положений:
73-е положение, в котором аргинин заменен на глутаминовую кислоту;
75-е положение, в котором аргинин заменен на аланин или глутаминовую кислоту;
76-е положение, в котором аргинин заменен на глутаминовую кислоту; или сочетание
одной или нескольких таких замен;
30-е положение, в котором аспарагиновая кислота заменена на аланин;
56-е положение, в котором гистидин
заменен на аланин;
77-е положение, в котором тиразин заменен на фенилаланин;
88-е положение, в котором аргинин заменен на аланин;
103-е положение, в котором аргинин
заменен на аланин;
109-е положение, в котором аспарагиновая кислота заменена на глутаминовую кислоту;
115-е положение, в котором аргинин
заменен на аланин;
или делеция участка, находящегося между
54-м и 66-м положениями, или сочетание двух
или большего числа таких замен.
003740
6
Такие мутантные варианты описаны в
PNAS (Proc. Natl. Acad. Sci. USA - июнь 1997
[4]);
- или физиологический вариант LAG-3,
включающий растворимый белок с молекулярной массой 52 кДа при наличии в нем доменов
D1, D2 и D3.
LAG-3, а именно, hLAG-3 или производные, такие которые были определены выше,
могут быть введены в качестве рекомбинантных
составляющих, экспрессирующих такие молекулы, например, в составе трансфицированных
клеток или рекомбинантных вирусов.
Однако, в соответствии с предпочтительным вариантом белок, связывающийся с молекулами МНС класса II, а именно LAG-3, или их
производные, вводят в свободном виде, а именно в растворимой форме, путем системного введения, например, с помощью подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекций.
Лекарственное средство в соответствии с
настоящим изобретением может быть использовано в качестве вакцины для профилактики заболеваний, связанных с антигенспецифичным
иммунным ответом, предпочтительно с опосредованным Т-лимфоцитами иммунным ответом.
В этом случае его вводят вместе с подходящим наполнителем наряду с одним или несколькими антигенами, против которого (которых) формируется данный иммунный ответ.
Антиген может быть инактивированным или
ослабленным инфекционным началом или очищенным антигеном, например полученным методами конструирования рекомбинантных белков, таким как антиген инфекционного агента
или опухолевый антиген, которые предпочтительно способны обусловливать опосредованный Т-лимфоцитами иммунный ответ.
Вакцина может быть использована для
предотвращения возникновения у субъекта инфекционного заболевания, такого как вирусное,
бактериальное или паразитарное заболевание,
если соответствующий инфекционный агент
обусловливает формирование специфичного
иммунного ответа, предпочтительно иммунного
ответа, опосредованного Т-лимфоцитами.
Вакцина может быть использована для лечения пациента от инфекционного заболевания,
такого, которое упоминалось выше, связанного
с опосредованным Т-лимфоцитами иммунным
ответом, а именно иммунным ответом, опосредованным CD8-позитивными Т-клетками.
Примеры заболеваний, связанных с формированием опосредованного Т-лимфоцитами
иммунного ответа, представлены в нижеследующей таблице.
7
Тип патогена
Вирусы
Возбудитель
Заболевания
ВИЧ
ВИЧ-инфекция
HBV, HCV
Гепатиты
HSV, CMV,
HHV
Саркома Капоши,
отторжения при
трансплантациях
Листериоз
ВнутриклеListeria
точные бактерии
Mycobacteria
Внутриклеточные
паразиты
003740
Plasmodium и
т.д.
Онкогены и
т.д.
Проказа, туберкулез
Малярия
Большинство карцином, меланом,
лейкозов
В этих случаях антиген распределяется по
клеткам и соответствующие пептиды загружаются на молекулы МНС класса I и презентируются на поверхности таких клеток, где
они распознаются CD8-несущими Т-клетками.
Данные, полученные заявителями, показывающие, что молекулы LAG-3/Ig индуцируют эффективный Т-клеточный иммунный ответ у животных и стимулируют незрелые дендритные
клетки и макрофаги in vitro, отчетливо подтверждают, что белок LAG-3 является адъювантом
Т-клеток в ситуациях, когда он взаимодействует
с молекулами МНС класса II на специальных
клетках АРС.
Вакцина может быть также использована
для защиты субъекта от злокачественной опухоли, причем как солидной опухоли, так и
лейкоза.
Также вакцина может быть использована
для лечения пациента от злокачественной опухоли.
В этом случае белок, связывающийся с молекулами МНС класса II, а именно LAG-3, вводят субъекту (реципиенту) подкожно или внутрикожно или в форме назального аэрозоля наряду с одним или несколькими антигенами, способными обусловливать иммунный ответ, предпочтительно опосредованный Т-лимфоцитами
иммунный ответ. Антиген может быть пептидом, липопротеином, рекомбинантным белком
или молекулой ДНК, кодирующей такие антигены.
Противоопухолевая вакцина может быть
привита в популяциях, характеризующихся рисками, которые определяют генотипически (профилактическая вакцина), или пациентам (лечебная вакцина), у которых имеется опухоль или
имеется высокая степень риска ее рецидива после хирургического вмешательства.
Если вакцина используется в качестве
стандартной (профилактической) вакцины или
8
лечебного препарата, она может быть введена в
виде "голой" плазмиды [19], включающей последовательность ДНК, кодирующей LAG-3,
предпочтительно помещенную под контроль
сильного промотора.
Также предпочтительным является наличие в составе плазмиды ДНК, кодирующей антиген, по отношению к которому формируется
иммунный ответ.
Еще в одном своем аспекте настоящее изобретение касается использования LAG-3 в качестве лекарственного средства, предназначенного для проведения противоопухолевой иммунотерапии у пациентов, у которых развилась злокачественная опухоль.
В этом случае LAG-3 предпочтительно
вводят в виде свободного белка LAG-3 или его
производного вместе с фармацевтически приемлемым наполнителем, предпочтительно в виде
растворимого производного в соответствии с
тем, как оно было охарактеризовано выше.
LAG-3 может быть введен путем внутриопухолевой инъекции или с помощью системной инъекции, например, подкожно, внутривенно или внутримышечно.
Нижеследующие примеры характеризуют
активность LAG-3 и CD4 в связи с профилактикой или лечением патологических состояний,
вовлекающих опосредованный Т-лимфоцитами
иммунный ответ.
Для лучшего понимания настоящего изобретения можно обратиться к прилагающимся
фигурам, на которых:
фиг. 1 показывает средний размер опухолей у мышей C57BL/6, зараженных опухолевыми клетками МСА-205 дикого типа (МСА WT),
опухолевыми клетками МСА-205, трансфицированными hCD4 (МСА hCD4), опухолевыми
клетками
МСА-205,
трансфицированными
hLAG-3 (МСА hLAG-3);
фиг. 2 показывает результаты (средний
размер опухолей), полученные после повторной
стимуляции тех же мышей опухолевыми клетками МСА дикого типа в минимальной опухолеродной дозе;
фиг. 3 показывает результаты (средний
размер опухолей), полученные после повторной
стимуляции тех же мышей сторонней линией
опухолевых клеток МС38;
фиг. 4 показывает результаты (средний
размер опухолей), полученные при использовании другой линии мышей (BALB/c) и другой
линии опухолевых клеток (TS/A) как дикого
типа (TS/A дикий тип), так и трансфицированных hCD4 (TS/A hCD4) или hLAG-3 (TS/A
hLAG-3);
фиг. 5 показывает результаты (средний
размер опухолей), полученные на существующих опухолях, на которые воздействовали различными дозами клеток МСА, экспрессирующих hLAG-3;
9
фиг. 6 показывает результаты (средний
размер опухолей), полученные с использованием растворимого LAG-3, вводимого наряду с
клетками МСА (МСА wt - дикий тип; МСА wt +
25 мкг LAG-3 и МСА wt + 250 мкг LAG-3); фигура сбоку от рамки фиг. 6 отображает долю
мышей, у которых развилась опухоль;
фиг. 7 и 8 показывают данные об экспрессии LAG-3 на мембране инфильтрующихся в
опухоль лимфоцитов (TILs у пяти пациентов
(Р1-Р5), у которых имеется карцинома почечных клеток (RCC));
фиг. 9 демонстрирует отторжение hLAG-3позитивных опухолевых клеток, опосредуемое
CD8-позитивными лимфоцитами.
А: FACS-анализ (с помощью клеточного
флуоресцентного сортера) экспрессии CD8 инфильтрующимися в опухоли лимфоцитами
(ИОЛ) у контрольных мышей (МСА-205 дикого
типа) по сравнению с ИОЛ мышей варианта
МСА-205 + hLAG-3. В: CD8-позитивные Тлимфоциты участвуют в контроле роста опухоли TS/A hLAG-3. Мышам внутрибрюшинно
инъецировали 200 мкг очищенного CD4- или
CD8-специфичного моноклонального антитела в
дни -3, -2, -1, +4 и +8. Опухолевые клетки TS/A
дикого типа или TS/A hLAG-3 (MTD) были инъецированы подкожно в 0-й день. Данные показаны как средние ± среднее квадратичное отклонение (s.е.) по 5 мышам в каждой группе
отдельного эксперимента. Эти эксперименты
были проведены в двух повторностях и были
получены сходные результаты. С: Увеличенная
активность противоопухолевых CTL у мышей,
которые проявляют отторжение клеток hLAG3/TS/A. Мышам вводили подкожные трансплантаты 50 тыс. клеток hLAG-3/TS/A, а затем проводили их повторную стимуляцию на 30-й день
с использованием 250 тысяч исходных клеток
TS/A. Селезенки были взяты на 60-й день жизни
безопухолевых мышей и спленоциты культивировали в течение 6 дней с отмеченными клетками-мишенями, которые были облучены. Цитолитическая активность в отношении отмеченных клеток-мишеней была протестирована в
стандартном 4-часовом тесте с выходом радиоактивного хрома-51 при различных соотношениях "эффектор:мишень" (Е:Т). Показаны результаты эксперимента на двух особях мышей.
Эти эксперименты были осуществлены в двух
повторностях на 4 особях и были получены
сходные результаты;
фиг. 10 показывает данные (средний размер опухоли) по мышам (20 особей линии
C57BL/6), которым трансплантировали клетки
MTD, сингенных опухолевым клеток МСА-205,
которым проводили однократное введение вакцины, содержащей LAG-3/Ig. На 6-й день были
сформированы 4 группы по 5 мышей, которым
проводили однократное подкожное введение
вакцины (200 мкл). Антиген привносили жестко
облученными (100 Гр) клетками МСА-205.
003740
10
Эксперименты, иллюстрирующие данные
примеры, были проведены с использованием
следующих материалов и методов.
Материалы и методы
1. Линии опухолевых клеток.
Использованные линии опухолевых клеток, позитивные по классу I и негативные по
классу II МНС, были такими: слабо иммуногенная, индуцированная метилхолантреном
линия саркомных клеток МСА-205 (сингенная
мышам линии C57BL/6 Н-2b); иммуногенная
линия клеток почечной карциномы RENCA и
неиммуногенная линия клеток недифференцированной спонтанной аденокарциномы молочной железы TS/A (обе сингенны мышам линии
BALB/c Н-2d). Линия клеток карциномы толстой
кишки МС38 (сингенная мышам линии
C57BL/6) были использована в экспериментах
по повторной стимуляции в качестве контрольной опухоли. Клетки поддерживали при 37°С во
влажной атмосфере воздуха при 10% СО2 в полной среде (культуральная среда RPMI-1640 с
добавлением глутамина, пирувата натрия, пенициллина и стрептомицина, 10% освобожденной
от эндотоксинов околоплодной сыворотки теленка и 0,05 мМ 2-β-меркаптоэтанола). Для экспериментов по иммунному окрашиванию и в
экспериментах in vivo клетки отбирали из соответствующих культуральных емкостей с фосфатным буфером, содержащим 1 мМ ЭДТА.
Перед проведением подкожной инъекции клетки промывали трижды холодным фосфатным
буфером (1х) и ресуспендировали в том же буфере. Клетки не культивировали на протяжении
более двух недель.
2. Мыши
Самки мышей линии C57BL/6 в возрасте 6
или 8 недель были приобретены в фирме
IFFRA-CREDO Lab. (Lyon, Франция). Самки
мышей линии BALB/c в возрасте 4 или 8 недель
были приобретены в фирме JANVIER Lab.
(Франция). Все мыши содержались в условиях,
свободных от конкретных патогенов. Самки
мышей линии "nude" были приобретены в виварии Institut Gustave Roussy и содержались в защищенной микросреде.
3. Генетические конструкции
кДНК hLAG-3, mLAG-3 и hCD4 были клонированы в вектор, несущий ген гигромициновой резистентности (клонирующими сайтами
являлись XbaI-сайт для hLAG-3 и hCD4 и XhoIсайт для mLAG-3), помещая под контроль промотора SRα [18]. В качестве негативного контроля использовали клонирование кДНК hLAG3 в противоположной ориентации. Все линии
опухолевых клеток (2,5 млн. клеток) использовали для трансфекции путем электропорации с
использованием устройства Eurogentec (Бельгия): клетки МСА-205 при 200 В, клетки TS/A и
RENCA при 300 В, при сопротивлении 1500
мкФ и неограниченном сопротивлении шунта.
11
Трансфектантов селектировали в присутствии
гигромицина-В (Sigma): трансфектанты МСА205 при концентрации 100 мкг/мл, а трансфектанты клеток RENCA и TS/A при 200 мкг/мл.
Резистентные
клетки,
экспрессировавшие
трансфицированные молекулы, были идентифицированы с использованием цитофлуориметра
Elite (Coulter, Hialeah, FL, США) и клонированы
путем ограничивающего разведения. В данном
анализе использовали лучший клон для каждой
из конструкций в случае каждой линии опухолевых клеток.
4. Цитофлуориметрический анализ
Резистентные клетки, экспрессирующие
трансфицированные молекулы, были окрашены
путем непрямой иммунофлуоресценции с использованием насыщающих количеств очищенных или взятых из асцитной жидкости моноклональных антител. Вначале клетки инкубировали с моноклональными антителами: 17В4 (антитело, специфичное в отношении hLAG-3) [2],
ОКТ4 (антитело, специфичное в отношении
hCD4), использовавшаяся в качестве негативного контроля преиммунная сыворотка кролика
(обозначалась как PIS) и иммунная сыворотка
кролика к mLAG-3 (обозначена как IS). Экспрессию молекул классов I и II МHС мыши на
опухолях выявляли с использованием следующих моноклональных антител: 34-1-2S - в отношении Н-2 Kd и D2; 28-8-6S - в отношении Н2 Kb и Db; 14-4-4S (в отношении Еd); М50114 (в
отношении IA и IE).
Затем клетки промывали и инкубировали с
соединенной с FITC (флуоресцинизотиоцианат)
козьей антимышиной сывороткой (GAM Coulter) или соединенной с FITC козьей антикроличьей сывороткой (GAR Southern Biotechnologies Inc.). Для анализа присутствия инфильтрующихся клеток или восполнения клеток на
периферии опухоли некоторые мыши были забиты, а их опухоли размацерированы. Клетки
окрашивали путем прямой иммунофлуоресценции с использованием 17B4-FITC или следующих моноклональных антител (Pharmingen):
анти-mCD4-РЕ (L3T4), анти-mCD8 (Ly-2 и
Ly3.2), анти-mNK (2В4) и анти-mCD22 (Lyb8.2). Клетки отсортировывали с использованием
цитофлуориметра Elite (Coulter).
Позитивные клеточные линии затем клонировали путем ограничивающего разведения
LAG-3-позитивных или СD4-позитивных клонов, а полученные клоны были заморожены для
проведения дальнейшего анализа.
Для создания растворимых молекул LAG-3
внеклеточные домены в составе hLAG-3 и
mLAG-3 были присоединены к Fc-сегментам
иммуноглобулинов hIgG1 и mIgG2a в соответствии с описанным ранее [6]. Итоговые рекомбинантные белки - hLAG-3/Ig и mLAG-3/Ig были получены в клетках СНО и очищены на
колонках с протеином А.
5. Эксперименты с опухолями in vivo
003740
12
5.1. Достижение роста опухолей и вакцинация
Внедрение линий опухолевых клеток было
осуществлено подкожно с использованием минимальной опухолеродной дозы (МОД) 20 тысяч клеток на 1 мышь для линии МСА-205, 50
тысяч клеток для линии TS/A и 100 тысяч клеток для линии RENCA, - или с использованием
5-кратной МОД. Мышам, у которых не развивалась опухоль в течение 30 дней после проведения инъекции, проводили повторную стимуляцию исходной линией опухолевых клеток (5кратная МОД). Клетки МС38 (карцинома толстой кишки) были использованы в количестве
100 тысяч для индукции контрольной опухоли у
мышей линии C57BL/6, которые отторгали опухоль TS/A. Опухолевые клетки инъецировали
согласованным по возрасту, ранее не подвергавшимся каким-либо подобным воздействиям
мышам линии C57BL/6 и BALB/c.
Рост опухолей контролировали 2-3 раза в
неделю путем измерения двух линейных параметров опухоли (перпендикулярных друг к другу) с использованием штангенциркуля. В день
проведения анализа опухоли in vivo клетки анализировали цитофлуориметрически и ставили
тест на пролиферацию in vitro.
5.2. Модели лечения опухолей
В 0-й день линии опухолевых клеток дикого типа были инокулированы подкожно в левый
бок (МОД) . В 0-й, 3-й или 6-й день LAG-3позитивные опухолевые клетки инъецировали в
правый бок (МОД или 5-кратная МОД) с целью
определения противоопухолевого действия на
нетрансфицированные клетки, расположенные в
удаленной части тела. Рост опухолей контролировали так же, как это было описано выше.
5.3. Для цитометрического анализа мышей
инокулировали подкожно 5-кратной МОД опухолевых клеток в соответствии с описанным
выше. На 8-й день опухоли размецерировали и
тестировали с использованием моноклональных
антител CD3-PE, CD4-PE, CD8-PE, CD80-FITC,
CD86-FITC, 2В4-РЕ (клетки NK), CD22-PE (Вклетки) или hLAG-3-FITC с использованием
цитофлуориметра Elite (Coilter).
5.4. Для истощения лимфоцитов мышам
внутрибрюшинно вводили 200 мкг очищенного
[18] анти-СD4 (YTS 191.1.2) или анти-СD8 (YTS
169.4.2.1) моноклонального антитела в дни -3,
-2, -1, +4 и +8. Опухолевые клетки дикого типа
или hLAG-3-TS/A были инокулированы подкожно на 0-й день (МОД). Цитофлуориметрический анализ контрольных мышей, получавших
такие дозы моноклональных антител, показал
более чем 95%-ную редукцию маркерной мишени в селезенке (данные в заявку не включены).
6. Исследования in vitro
Для тестирования цитотоксичности были
сформированы опухольспецифичные кратковременные культуры CTL на основе смешанной
13
лимфоцитарной культуры опухолевых клеток.
Вкратце, 30 млн. спленоцитов были отобраны
на 30-й день у мышей, которые отторгли образовавшиеся опухоли. Эти клетки были простимулированы 3 млн облученных исходных опухолевых клеток в полной среде в течение 4 дней
и затем добавляли 50 ед./мл рекомбинантного
интерлейкина-2 человека (Cetus) на 2 дня. Эффекторные функции спленоцитов были протестированы на 6-й день в стандартном 4-часовом
тесте на выход радиоактивного хрома-51 (при
соотношении "эффектор:мишень" от 25:1 до
200:1) против помеченных клеток-мишеней,
аутологичных опухолевых клеток, сторонней
саркомной линии Н-2d WEHI-164 и NKчувствительной клеточной линии YAC. Эффективность лизиса в трех повторностях была подсчитана как {[разность вредних экспериментального
и
спонтанного
излучений
в
имп/мин]/[разность средних максимального и
спонтанного излучений в имп/мин]}х100. Авторы определяли лизис как специфичный тогда,
когда был лизис мышиных спленоцитов, отторгавших опухолевые клетки, за вычетом лизиса
внеэкспериментальных спленоцитов мыши.
Результаты
Пример 1. Поверхностная экспрессия
hCD4, hLAG-3, mLAG-3 и молекул МНС с линиях опухолевых клеток.
Трансфицированные опухолевые клоны
были окрашены в соответствии с описанным в
разделе 2.2 и проанализированы с целью сравнения уровней экспрессии hCD4, hLAG-3 и
mLAG-3. В данном анализе использовали для
каждой из конструкций по одному клону, показавшему наилучшие результаты. Среди линий
опухолевых клеток наивысший уровень молекул
МНС класса I экспрессировали клетки TS/A, а
наименьший уровень экспрессии молекул МНС
класса I - клетки МСА-205. Каких-либо существенных различий в уровне экспрессии молекул
МНС класса I при сравнении исходных и трансфицированных клонов опухолевых клеток обнаружено не было.
Пример 2. Формирование опухолевых моделей и вакцинация: сравнение действия hCD4 и
hLAG-3.
Данные эксперименты были проведены с
целью определения опухолеродности клеток
после их трансфицирования: клетками МСА205, TS/A, как показано на фиг. 1 и 4, и RENCA.
Индукция противоопухолевого иммунитета
LAG-3-позитивной опухоли сравнивали с исходными линиями опухолевых клеток.
Клетки МСА-205, TS/A и RENCA дикого
типа эффективно пролиферировали в случае,
когда их подкожно имплантировали либо сингенным мышам линий C57BL/6 и BALB/c, либо
мутантным мышам nude/nude. Опухолевые
клетки, проявлявшие стабильную трансфицированность клонами hLAG-3 в обратной ориентации, определенную в процессе гигромицино-
003740
14
вого отбора, характеризовались сходными параметрами роста.
Животные, которым вводили МСА-LAG-3,
отторгали опухоль. Животные, которым вводили MCA-CD4, проявляли низкую интенсивность
роста опухоли по сравнению с животными, которым вводили клетки МСА дикого типа. Две
особи (из 5) полностью отторгали опухоль (фиг.
1).
Сходные результаты были получены в
анализе mLAG-3 (данные в заявку не
включены).
Эти результаты указывают на то, что эктопическая экспрессия hLAG-3, mLAG-3 и hCD4
повышает иммуногенность линии саркомных
клеток МСА и предотвращает образование опухоли у МСА-трансфектанта, т.е. она обусловливает формирование иммунитета против злокачественной опухоли у мыши.
Сходные результаты были получены в
анализе опухолевых клеток TS/A у мышей линии BALB/c (фиг. 2).
Сходные результаты также были получены
при анализе опухолевых клеток RENCA у сингенных мышей линии BALB/c.
Таким образом, противоопухолевое действие выявляется:
- в различных линиях мышей, экспрессирующих разные гены главного комплекса гистосовместимости (МНС);
- при использовании различных линий
опухолевых клеток (проявляющих разный уровень собственной иммуногенности - TS/A <
МСА).
Мыши линии "nude" (nu/nu) были инокулированы опухолевыми клетками МСА дикого
типа, МСА hLAG-3 и МСА hCD4: рост трансфектантов характеризовался сходными параметрами.
Это подтверждает тот факт, что системный, долговременный, опухольспецифичный,
обусловливаемый молекулами hLAG-3 или
hCD4 иммунитет является опосредуемым Тлимфоцитами [которые отсутствуют у мышей
"nude"].
Мышам, которые ранее были инокулированы клетками МСА дикого типа, МСА pLAG-3
и МСА hCD4 и спустя 30 дней не характеризовались развитием опухоли, проводили повторную стимуляцию (1-кратную) 5-кратной дозой
МОД опухолевых клеток или сторонней линией
клеток МС38 карциномы толстой кишки.
Полученные результаты показаны на фиг.
2 и 3.
После повторной стимуляции рост МСА
дикого типа оказался замедленным у выживающих животных, которым вводились клетки
МСА LAG-3 и клетки МСА CD4 (фиг. 2).
Никакой из этих эффектов не был обнаружен у мышей, повторно простимулированных
сторонними опухолевыми клетками МС38 (фиг.
3).
15
Это указывает на то, что эктопическая экспрессия и hLAG-3, и hCD4 обладает адъювантоподобным действием и индуцирует долговременный антигенспецифичный иммунитет по
отношению к исходному немодифицированному типу опухоли.
Пример 3. Лечение опухолей МСА-205 дикого типа у мышей C57BL/6 с использованием
МСА hLAG-3.
В этом эксперименте были использованы
три группы по пять особей в каждой из них.
Каждую группу инокулировали в один бок
клетками МСА дикого типа, а через 3 дня - либо
клетками МСА дикого типа (группа 1), клетками МСА hLAG-3 в количестве 200 тысяч клеток
(группа 2), либо клетками МСА hLAG-3 в количестве 1 млн. клеток (группа 3).
Размер исходной опухоли измеряли в каждой группе особей в течение 30 дней. Данные
приведены на фиг. 5.
Инъекция клетками МСА hLAG-3 задерживала рост опухоли в дозозависимом режиме.
Этот эксперимент подтверждает наличие
системного эффекта LAG-3 в отношении роста
опухоли и указывает на то, что LAG-3 представляет собой лекарственное средство, действующее в отношении опухолей плотных тканей.
Пример 4. Лечение опухолей МСА-205 дикого типа у мышей C57BL/6 с использованием
растворимого LAG-3.
Три группы по пять мышей в каждой были
одновременно инокулированы клетками МСА
дикого типа, суспендированными либо в фосфатном буфере (группа 1), либо в фосфатном
буфере, содержащем растворимый белок LAG-3
человека (shLAG-3 D1D4) в количестве либо 25
мкг (группа 2), либо 250 мкг (группа 3).
Размер опухолей измеряли в каждой группе на протяжении 30 дней.
Полученные данные представлены на фиг.
6.
Введение hLAG-3 D1D4 индуцировало замедление роста опухоли в зависимом от дозы
режиме.
Полученные данные показывают, что системное введение растворимого hLAG-3 напрямую обусловливает подавление роста опухоли
in vivo.
Пример 5. Экспрессия LAG-3 in vivo на
поверхности опухолевых лимфоцитов (TIL) человека, инфильтрующихся в карциному почечных клеток (RCC).
В организме человека LAG-3 экспрессируется в тканях (например, в воспаленных вторичных лимфоидных органах), но не на поверхности моноядерных клеток циркулирующей крови
(РВМС) [3], причем даже таких как активированные in vivo РВМС, позитивные по антигенам
CD25 и CD69. На более высоком уровне LAG-3
экспрессирован на поверхности активированных, ограниченных по классу I MHC, СD8позитивных клетках по сравнению с ограничен-
003740
16
ными по классу II MHC, CD4-позитивными
клетками [3], а индукция экспрессии LAG-3 интерлейкином-12 или еще более мощным сочетанием интерлейкинов [IL2 + IL12] оказывается
более существенной на клетках CD4+ по сравнению с клетками CD4+. Белок LAG-3 является
слабо экспрессирующимся активационным антигеном как in vitro, так и in vivo, и иногда бывает затруднительно оценить количественно и
качественно параметры флуоресцентного мечения свежеприготовленных опухолевых тканей.
Поскольку LAG-3 может взаимодействовать с
антигенпрезентирующими клетками опухолей
человека, позитивными по молекулам МНС
класса II, заявители оценивали его экспрессию в
группе опухолей, для которых известна ассоциированность с Т-лимфоцитами, с применением иммуногистохимических методик (процедура АРААР). Экспрессия LAG-3 была обнаружена во всех тестированных инфильтрующихся
опухолевых лимфоцитах (TIL), включая 5 меланом, 10 почечных аденокарцином и 7 βклеточных лимфом.
Восемь пациентов были обследованы по
экспрессии LAG-3 в инфильтрующихся опухолевых лимфоцитах в случаях наличия карциномы почечных клеток.
В экспериментах с цитофлуориметрическим тестированием были использованы размацерированные опухолевые ткани. Экспрессия
LAG-3 была исследована в популяции лимфоцитов, определяемой по ее размеру и степени
гранулярности. Погибшие клетки были исключены из анализа после их выявления с помощью
окрашивания йодистым пропидием. Клетки TIL
положительно окрашивались моноклональным
антителом 17В4, специфичным в отношении
эпитопа в составе внеклеточной петли полипептида LAG-3.
Полученные результаты представлены на
фиг. 7 для пациентов Р1-Р3 и на фиг. 8 для пациентов Р4 и Р5.
Для всех пациентов этой группы был выявлен сдвиг пика флуоресценции, что указывает
на связывание антитела 17В4 на поверхности
этих лимфоцитов.
Таким образом, у всех пациентов клетки
TIL действительно экспрессировали LAG-3 при
наличии существенной доли (30%) RCC-TIL у
независимых пациентов.
Во всех выборках для СD3-позитивных Тлимфоцитов было обнаружено экспрессирование LAG-3 (в пределах 11-48%) при большем
уровне экспрессии и Т-лимфоцитов CD8+.
С другой стороны, моноядерные клетки
периферической крови были негативными по
LAG-3 у этих же пациентов: это показывает, что
экспрессия LAG-3 на поверхности лимфоцитов
является процессом, родственным Т-клеточной
активации в опухолях.
Более того, при использовании теста ТИФА (твердофазный иммуноферментный анализ)
17
было показано, что высокие концентрации (около 1 нг/мл) растворимого LAG-3 обнаруживаются в крови раковых больных.
Эти данные показывают, что белок LAG-3
является молекулой, вовлеченной в естественно
встречающийся противоопухолевый ответ у
человека, и, соответственно, подтверждает применение LAG-3 в бустинге иммунологического
контроля за опухолевыми клетками у человека.
Пример 6. Опосредование первичного отторжения CD8-позитивными Т-лимфоцитами.
Отторжение трансфектантов МСА-205
hLAG-3 и TS/A hLAG-3 было зависимым от Тлимфоцитов, поскольку отторжение вовсе не
наблюдалось у дефицитных по Т-клеткам ("безтимусных") мышей nu/nu. После инъекции 5кратной МОД таких клеток опухоли по 10 мм в
диаметре образовывались на 8-й день: размацерированные опухолевые клетки и инфильтрующиеся в опухоль лимфоциты анализировали
методом FACS. Опухоли дикого типа, равно как
и трансфектанты по LAG-3, оказывающиеся
исходно негативными по антигенам CD80 и
CD86, сохраняли негативность по этим поверхностно-клеточным маркерам после инокуляции,
в то время как LAG-3 стабильно выявлялся в
опухолях hLAG-3 при использовании моноклонального антитела 17В4, специфичного по отношению к LAG-3 (данные в заявку не включены). В 8-дневных опухолях-эксплантантах доля
CD8-позитивных клеток составила примерно
31% в опухолях МСА-205 hLAG-3 по сравнению с 4% в опухолях МСА-205 (фиг. 9а), в то
время как никаких различий не было выявлено
при анализе наборов клеток CD4+, В или NK.
Сходные результаты были получены в анализе
опухолей TS/A (данные в заявку не включены).
Наконец, относительный вклад CD4- и СD8позитивных Т-лимфоцитов в формирование
противоопухолевого ответа был проанализирован путем истощения мышей по этим клеточным комплексам. Как показано на фиг. 9b, введение СD8-специфичного моноклонального антитела в момент инокуляции дозой МОД hLAG3/TS/A предотвращает отторжение опухолевых
клеток hLAG-3/TS/A. Участие CD4-позитивных
хелперных Т-лимфоцитов подтверждается конкретным эффектом, наблюдаемым при использовании моноклонального антитела, специфичного в отношении CD4 (фиг. 9b).
Пример 7. Усиление опухольспецифичного
CTL-ответа действием hLAG-3.
Для дальнейшего выяснения механизма
противоопухолевой активности LAG-3 авторы
оценивали воздействие этого белка на образование цитотоксических Т-лимфоцитов (клеток
CTL), способных уничтожать неиммуногенные
клетки TS/A. Спленоциты были собраны у мышей, которым имплантировали опухоль hLAG3/TS/A и которые были способны отторгать
опухолевые клетки дикого типа при 5-кратной
дозе МОД в экспериментах по повторной сти-
003740
18
муляции, и были повторно простимулированы
in vitro на 6 дней облученными клетками TS/A.
Активность клеток CTL была определена в
спленоцитах мышей, которым были имплантированы опухолевые клетки hLAG-3 (фиг. 9с), в
то время как спленоциты животных, вообще
еще не вовлекавшихся в эксперимент, не проявляли цитотоксической активности совсем (данные в заявку на включены). Активность CTL,
по-видимому, оказывается селективной в отношении неиммуногенных клеток TS/A, поскольку сингенные саркомные клетки WEHI, равно
как и NK-чувствительные клетки YAC, не лизировались (фиг. 9с).
Пример 8. Лечение сформировавшихся
опухолей.
Авторы изобретения показали, что контроль за ростом опухоли может быть обеспечен
путем использования растворимой молекулы
LAG-3, берущейся в качестве вакцинного адъюванта. Однократная инъекция смеси антигена
(облученные опухолевые клетки) наряду с бустерным фактором (mLAG-3/Ig - 1 мкг или 0,1
мкг) оказывается эффективной (фиг. 10).
Предполагается, что in vivo молекулы растворимого LAG-3 могут передавать сигнал
клеткам островков Лангерганса (или любым
антигенпрезентирующим клеткам, находящимся
в вакцинном сайте) через молекулы класса II
главного комплекса гистосовместимости (МНС)
об эффективном "включении" СD8-позитивных
Т-лимфоцитов.
Библиография
[1] Triebel et al., 1990, J. Exp. Med., 171,
1393-1405.
[2] Baixeras et al., 1992, J. Exp. Med., 176,
327-337.
[3] Huard et al., 1994, Immunogenetics, 39,
213.
[4] Huard et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91, 5744-5749.
[5] Huard et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24,
3216-3221.
[6] Huard et al., 1996, Eur. J. Immunol., 26,
1180-1186.
[7] Migazaki et al., 1996, Science, 272, 408.
[8] Angevin et al., 1997, Intern., J. Cancer,...
[9] Lurquin et al., 1992, Cell, 71, 1093.
[10] Takebe et al., 1988, J. Mol. Cell. Biol., 8,
466.
[11] Cosgrove et al., 1991, Cell., 66, 1051.
[12] Restifo N.P. & Wunderlich J.R., 1995,
"Biology of Cellular Immune Responses: Biological Therapy of Cancer", eds. V.DeVita, S.Hellman
& S.Rosenberg, Lippincott, Philadelphia, pp. 3-37.
[13] Pardoll D.M., 1995, Annu. Rev. Immunol., 13, 399-415.
[14] Wade W.F., Davoust J., Salamero J., Andre P., Watts Т.Н., Cambier J.C., 1993, Immunol.
Today, 14, 539-542.
19
[15] Koch F., Stanzl U., Jennewein P., Janke
K., Heufler C., Kampgen E., Romani N., Schuler
G., 1996, J. Exp. Med., 184, 741-746.
[16] Bruniquel D., Borie N., Triebel F., 1997,
Immunogenetics, 47, 96-98.
[17] Huard В., Prigent P., Tournier M. ,
Bruniguel D., Tribel F., 1995, Eur. J. Immunol., 25,
2718-2721.
[18] McKinney M.M. & Parkinson A., 1987,
J. Immunol. Methods, 96, 271-273.
[19] Tighe H., Corr M., Roman M., Raz E.,
1998, Immunol. Today, 19, 89-96.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение лиганда МНС класса II,
способного усиливать антигенспецифичный
иммунный ответ, в сочетании с антигеном, способным индуцировать указанный антигенспецифичный иммунный ответ, для производства
лекарственного средства, предназначенного для
профилактики или лечения патологических состояний, связанных с индукцией и усилением
антигенспецифичного иммунного ответа, где
лиганд МНС класса II представляет собой LAG3 или производное, мутантную форму или растворимый фрагмент LAG-3, полученные, как
указано в описании.
003740
20
2. Применение по п.1, отличающееся тем,
что указанный антигенспецифичный иммунный
ответ представляет собой опосредованный Тклетками иммунный ответ.
3. Применение по п.2, отличающееся тем,
что опосредованный Т-клетками иммунный ответ опосредован CD8+ Т-клетками.
4. Применение по п.3, отличающееся тем,
что состояния, связанные с CD8+ Т-зависимым
клеточным иммунитетом, представляют собой
инфекционные заболевания.
5. Применение по п.4, отличающееся тем,
что инфекционные заболевания представляют
собой вирусные, паразитарные или бактериальные заболевания.
6. Применение по п.1, отличающееся тем,
что указанное лекарственное средство используется для лечения злокачественной опухоли.
7. Применение по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что растворимые фрагменты
LAG-3 выбраны из группы, состоящей из фрагментов D1-D2 и D1-D4 LAG-3.
8. Применение по п.1, отличающееся тем,
что указанное лекарственное средство применяется для противораковой иммунотерапии.
Фиг. 3
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 4
21
003740
22
Фиг. 9А
Фиг. 5
Фиг. 9В
Фиг. 6
Фиг. 7
Фиг. 9С
Фиг. 8
Фиг. 10
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6