1. Диссертация Уласов И.В - Российский онкологический
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи УЛАСОВ ИЛЬЯ ВАЛЕНТИНОВИЧ РАЗРАБОТКА АДЕНОВИРУСНОГО ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛИОБЛАСТОМЫ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук По специальности 14.01.12. Онкология Научный консультант Доктор медицинских наук, профессор Барышников А.Ю. Москва 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................................................. 6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................................... 18 1.1. Перспективы применения онколитических векторов................................................................. 18 1.1.1. Введение ....................................................................................................................................... 18 1.1.2. Генная терапия как метод лечения опухолей головного мозга .............................................. 19 1.1.3. Молекулярные и структурные основы конструирования генно-инженерных векторов ..... 20 1.1.4. Литические вирусные векторы направленного действия: общие принципы ........................ 22 1.1.5. Онколитические векторы на основе вирусов животного происхождения ............................ 23 1.1.6. Онколитические векторы на основе генома вирусов человека .............................................. 25 1.2. Онколитические векторы в нейроонкологии .............................................................................. 29 1.2.1. Введение ....................................................................................................................................... 29 1.2.2. Молекулярные основы построения противоопухолевых онколитических векторов, применяемых в нейроонкологии ......................................................................................................... 30 1.2.3. Усиление направленной инфекции онколитических вирусов: связывание с клеточным рецептором и интернализация ............................................................................................................. 31 1.2.4. Транскрипционный контроль аденовирусной инфекции в глиомах ...................................... 33 1.2.5. Стратегии, повышающие противоопухолевый эффект вектора ............................................. 37 1.3. Роль сурвивина в диагностике и терапии глиобластомы человека ........................................... 39 1.3.1.Введение ........................................................................................................................................ 39 1.3.2. Общая характеристика и механизм действия ........................................................................... 41 1.3.3. Регуляция экспрессии белка сурвивина .................................................................................... 42 1.3.4. Клиническое значение экспрессии сурвивина для диагностики опухолей головного мозга ................................................................................................................................................................. 43 1.3.5. Терапевтические подходы таргетинга сурвивина .................................................................... 45 ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................................... 48 2.1. Клинический материал .................................................................................................................. 48 3 2.2. Клеточные линии............................................................................................................................ 48 2.2.1. Перевиваемые клеточные линии ............................................................................................... 48 2.2.2. Первичные линии клеток пациентов с диагнозом «глиобластома» ....................................... 49 2.2.3. Типирование клеток глиобластомы........................................................................................... 49 2.3. Химические реагенты .................................................................................................................... 50 2.4. Получение и характеристика аденовирусных векторов ............................................................. 51 2.4.1. Получение и характеристика аденовирусных векторов, дефектных по репликации ........... 51 2.4.2. Использование онколитических вирусов ONYX015 и ∆24 .................................................... 51 2.5. Титрование аденовирусных векторов .......................................................................................... 54 2.5.1. Определение оптической плотности вирусной суспензии...................................................... 54 2.5.2. Бляшкообразование..................................................................................................................... 55 2.5.3. Определение инфекционного титра методом окраски клеточного монослоя антителами против гексона аденовируса ................................................................................................................. 55 2.6. Биоинформатический анализ экспрессии генов с использованием баз данных TCGA, Oncomine и Rembrandt .......................................................................................................................... 56 2.7. Флуороцитометрический анализ клеточных популяций ........................................................... 56 2.7.1. Экспрессия клеточных рецепторов ........................................................................................... 56 2.7.2. Анализ аутофагии........................................................................................................................ 57 2.7.3. Анализ клеточного деления ....................................................................................................... 58 2.7.4. Детекция апоптоза с использованием антител против Аннексина ........................................ 58 2.7.5. Клеточное разделение с использованием FACS ...................................................................... 59 2.8. Количественный ПЦР .................................................................................................................... 59 2.8.1. Количественный ПЦР клеточных и вирусных мРНК .............................................................. 59 2.8.2. Количественный ПЦР клеточных микроРНК .......................................................................... 60 2.8.3. Количественный анализ экспрессии генов методом ПЦР в 96-луночном планшете (Array) ................................................................................................................................................................. 61 2.8.4. Количественный анализ экспрессии клеточных микроРНК методом ПЦР в 96-луночном планшете (miFinder Array-микрочип).................................................................................................. 61 4 2.9. Определение экспрессии клеточных и вирусных антигенов с помощью иммунофлуоресценции ......................................................................................................................... 62 2.9.1. Клетки глиобластомы ................................................................................................................. 62 2.9.2. Цитологический метод окрашивания клеток, имеющих фрагментацию ДНК ..................... 63 2.10. Определение клеточной цитотоксичности с помощью электронного микроскопа............... 63 2.11. Ангиогенез: формирование тубул .............................................................................................. 64 2.12. Анализ экспрессии ангиогенных факторов в клеточных лизатах ........................................... 64 2.13. Анализ экспрессии клеточных лизатов с помощью вестерн-блоттинга в ПААГ .................. 64 2.14. Определение токсичности реагентов in vitro окраской красителем трипановым синим ...... 65 2.15. Определение клеточной пролиферации и токсичности с помощью МТТ-реагента............. 66 2.15.1. Ингибирование пролиферации клеток вирусом ..................................................................... 66 2.15.2. Ингибирование пролиферации клеток в присутствии химиопрепаратов ........................... 66 2.16. Детекция поврежденных клеток в реакции клеточной цитотоксичности (LDH) .................. 67 2.17. Детекция поврежденных клеток с помощью окраски кристаллвиолетом .............................. 68 2.18. Инфекция клеточных культур in vitro ........................................................................................ 68 2.19. Тестирование цитотоксического действия реагентов in vivo .................................................. 69 2.20. Создание систем in vivo для тестирования терапевтических препаратов .............................. 70 2.20.1. Использование внутримозговой модельной системы глиобластомы человека .................. 70 2.20.2. Подкожная модель глиомы человека ...................................................................................... 71 2.21. Окрашивание тканевых срезов ................................................................................................... 71 2.21.1. Окрашивание срезов гематоксилин-эозином ......................................................................... 71 2.21.2. Иммуногистохимическое окрашивание тканей ..................................................................... 72 2.21.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание тканевых срезов ...................................................... 72 2.22. Статистический анализ ................................................................................................................ 73 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ...................................................................................... 74 3.1. Генная терапия – экспериментальный подход в лечении глиобластомы головного мозга .... 74 5 3.1.1. Роль белка фибера аденовируса в вирусной репликации, транскрипции и сборке вирусных вирионов ................................................................................................................................................. 83 3.1.2. Генетическое клонирование фибера аденовируса человека типа 3 в геном рекомбинантного вектора обеспечивает высокий уровень трансдукции клеток глиобластомы человека .................................................................................................................................................. 93 3.1.3. Сурвивин – активный компонент резистентности глиобластомы к терапии темозоломидом и ионизирующей радиацией ............................................................................................................... 100 3.2. Онколитический вирус CRAd-S-5/3 демонстрирует высокую избирательную токсичность по отношению к глиобластоме................................................................................................................ 110 3.2.1.Определение эффективности генно-инженерного препарата CRAd-S-5/3 с использованием внутримозговых моделей глиобластомы человека .......................................................................... 123 3.3. Способы усиления терапевтического эффекта онколитического вектора in vitro и in vivo . 127 3.3.1. Усиление вирусной репликации 3 CRAd-S-5/3 верапамилом .............................................. 127 3.3.2. Механизм клеточной смерти, вызываемой онколитическим вирусом CRAd-S-5/3 ........... 130 3.3.3. Применение тамоксифена, как индуктора аутофагии ........................................................... 149 3.3.4. Регуляция программируемой клеточной смерти клеточной микроРНК 7d ........................ 154 3.3.5. Использование стандартных методов лечения: ионизирующая радиация и темозоломид для усиления активности онколитического вектора........................................................................ 158 3.3.6. Влияние Р53 на цитотоксичность онколитического вируса в комбинации с темозоломидом ............................................................................................................................................................... 162 3.3.7. Роль Hh-GLI сигнальных путей резистентности к онколитическому вектору ................... 165 3.3.8. Использование CRAd-S-5/3 в качестве платформы для доставки генетического материала в клетки глиобластомы, резистентные для темозоломида и ионизирующей радиотерапии .......... 167 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .................................................................................... 177 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................................... 191 ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................. 194 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ ................................................... 197 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................... 199 6 ВВЕДЕНИЕ За последнее время смертность от онкологических заболеваний в мире значительно возросла. По статистике смертность от опухоли головного мозга занимает одно из лидирующих мест среди других типов роста неопластических клеток [14]. В последние годы в Европе и США в связи с прогрессом диагностических технологий увеличилась выявляемость опухоли головного мозга на ранней стадии. Как было отмечено, заболеваемость опухолью головного мозга по совокупному населению в Европе колеблется от 2 до 15 случаев на 100’000 населения в год [7, 21]. При этом количество заболевших мультиформной глиобластомой (терминальная стадия опухоли головного мозга, ГБМ) варьируется между 3.2-3.4 на 100 тыс населения [22], что сделало ГБМ второй по значимости диагносцированной опухолью головного мозга после менингиомы. По данным статистики в Российской Федерации с 1990 года наблюдается рост количества больных глиобластомой мозга с 3.2 до 4.2 на 100 тыс населения [1, 14]. Среди опухолей головного мозга мультиформная глиобластома (ГБМ) встречаются в большинстве случаев [2]. По сравнению с другими заболеваниями быстрое развитие болезни приводит к высокой летальности [17]. В последнее время было диагностировано больше случаев с ГБМ среди лиц мужского пола [7]. В целом, за период с 2005-2009 года 1-, 2,3-, 5-, и 10- летний уровень выживаемости был 35,7; 13,6; 7,8;4,7 и 2,3% соответственно, причем этот уровень сопоставим с уровнем выживания пациентов с опухолью поджелудочной железы [23]. Лечение глиобластомы представлено радиотерапией, хирургической резекцией и химиотерапией. Экономические затраты на лечение больных с ГБМ достаточно высоки. Так, в США затраты на содержание одного больного в клинике, а также стоимость лечения составляет порядка $55,000 США в год [23]. По данным статистики, в 2013г. совокупные затраты на лечение больных в США составили порядка 10 млрд. долл США. Несмотря на увеличение длительности 7 жизни пациентов, используя темодал, бевацизумаб и др, дальнейшая работа над этим вопросом крайне небходима [21]. В течение последних нескольких лет в Европе число заболеваний первичными астроцитомами, к которым и относят мультиформные глиобластомы, повышается. Так, по сравнению с 2000-2002 годами, наблюдается снижение числа случаев астроцитом у мужчин на 1%, но у женщин число случаев увеличилось в среднем на 4% [24]. В целом, несмотря на очевидную тенденцию заболеваний ГБМ к повышению в России [5], выживаемость пациентов остается в пределах 14.6 месяцев, тем самым, отражая отсутствие существенного прогресса в решении этой проблемы. За последние трансформировало 20 понятие лет развитие молекулярной нейропатологии о терапии мультиформной глиобластомы. Присутствие генетических и белковых биомаркеров позволило разделить глиобластомы на анапластические астроцитомы и глиобластомы. В то же время наличие 1p19q делеций, IDH1 мутаций, статус метилирования промотора гена, кодирующего О6-метилгуанинин-ДНК-метитрасфераза (MGMT) позволило оценить их прогностическую значимость [25]. В настоящее время известно, что пациенты с олигодендроглиомами, содержащие 1p19q делецию, имеют лучше шансы на продолжение жизни после терапии ионизирующей радиацией и алкилирущими агентами, чем без делеций [26, 27]. Другое исследование показало, что наличие мутаций в гене, контролирующем фермент изоцитрат дегидрогеназы (IDH 1 и 2) в глиомах низкого уровня и некоторых типах глиобластомы, имеет негативную корреляцию с выживаемостью пациентов [28, 29]. Еще одно исследование доказало, что метилирование MGMT прямо коррелирует с длительностью выживаемости пациентов, получавших химиотерапию [30]. Все эти исследования подтверждают присутствие прогностических генетических маркеров в тканях мультиформной глиобластомы. 8 Прогрессия глиобластомы сопровождается накоплением мутаций. В то время как вторичные глиобластомы, как правило, вырастают из глиом с низким уровнем дифференцировки, первичная глиобластома аккумулирует набор мутаций гена эпидермального фактора роста (94% всех глиобластом), инактивации фосфат и незин гомолога (PTEN), а также драйверов – мутаций в последовательности IDH1 и p53 [31, 32]. В настоящее время предложена классификация глиобластомы на основе генетической информации: все глиобластомы группируют между пронейральным, нейральным, классическим и мезенхимальным подтипами [33]. Хотя очевидная разница в выживаемости пациентов с различными подтипами установлена [34], эффективность терапии в зависимости от подтипа глиобластомы остается неясной. Как видно из научных публикаций, существующие генетические различия, характерные для глиобластом, важны для нашего понимания механизма глиомагенеза. В то же время присутствие внутри опухоли фенотипически и генотипически различных клеток [35] важно для прогрессии глиобластомы [19], тем самым, открывая новый горизонт по совершенствованию или созданию новых экспериментальных подходов в их лечении. Актуальность проблемы Опухоль головного мозга в структуре неопластических заболеваний человека занимает одно из последних мест, но выживаемость пациентов с этим заболеванием крайне невелика. В то время как в США из года в год наблюдается снижение числа регистрированных случаев с опухолями головного мозга [36], в Европе, наоборот, сохраняется тенденция к росту [37,38]. В России число больных с опухолью мозга также увеличивается на 1.1% в год. По величине прироста заболеваний предполагается, что это число будет и дальше неуклонно расти [5]. Бессимптомное начало и развитие опухоли головного мозга затрудняет диагностику, особенно на начальном этапе, и, соответственно, терапию этого заболевания. В силу появившихся значительных успехов в 9 нейровизуализационной диагностике неоплазмов головного мозга, главным способом лечения больных является применение хирургической резекции и радиои химиотерапии [5]. Однако, несмотря на значительные успехи в применении данных методов, выживаемость больных остается невысокой, главным образом вследствие невозможности удаления 100% опухоли хирургической резекцией [40], а также появления радио- и химио-резистентной популяции стволовых клеток опухоли. Таким образом, очевидна причина поиска новых и совершенствования старых методов лечения, а также развития диагностической базы с целью ранней диагностики злокачественных новообразований головного мозга у людей. На сегодняшний день в Европе и Российской Федерации неуклонный рост количества заболеваний мультиформной глиобластомой вызывает повышенный интерес к проблеме их изучения. Хотя причины возникновения таких быстрорастущих опухолей головного мозга остаются не до конца изученными, существует мнение, что травмы головного мозга, как и наличие генетических аберраций в клетках головного мозга, являются факторами, способствующими развитию астроцитом различной степени злокачественности. В последнее время к этиологическим факторам, активирующим появление неопластических клеток в головном мозге, также относят персистенцию онкогенных вирусов в организме. Во многом этому способствует сложившаяся в России и странах СНГ клиническая ситуация, благоприятная для увеличения количества таких хронических инфекций в результате роста числа случаев пересадки органов и излишнего применения иммуносупрессивных химиопрепаратов. Таким образом, разработка экспериментальных подходов, демонстрирующих высокую противоопухолевую и анти-глиомную активность, позволяющих контролировать рост неопластических клеток, является актуальной задачей для генной терапии. 10 Цели и задачи исследований Целью настоящего исследования является разработка, характеристика и экспериментальное тестирование аденовирусного генетического препарата для лечения опухоли головного мозга человека с использованием моделей глиобластомы человека in vitro, in vivо и ex vivo. Для достижения поставленной цели нами были поставлены и реализованы следующие задачи: 1. Охарактеризовать клетки опухоли головного мозга человека с позиции возможности терапии онколитическими векторами. 2. Оптимизировать структуру онколитического вектора для достижения максимальной цитотоксичности. 3. Установить механизм клеточной цитотоксичности в ответ на инфекцию онколитическим вектором. 4. усилении Изучить роль химиопрепаратов и ионизирующего излучения в антиглиомного потенциала генно-инженерной вирусной самореплицирующейся вакцины на основе генома аденовируса человека серотипа 5. 5. Определить алгоритм и механизм комбинированного лечения глиобластомы, используя онколитический вектор. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Результаты оценки роли белка фибера для амплификации рекомбинантных дефектных и онколитических аденовирусов. 2. Данные по сравнительному анализу аденовирусных систем, возможная причина дефектных по репликации. 3. Экспрессия резистентности сурвивина глиобластомы ионизирующей радиации. к человека терапии как темозоломидом (темодалом) и 11 4. Таргетинг СD46 аденовирусным вектором 5/3 под контролем промотора гена сурвивина человека обеспечивает высокий уровень трансдукции перевиваемых и первичных клеток глиобластомы человека как in vitro так и in vivo. 5. Вектор 5/3 служит платформой для доставки антисмысловых РНК. 6. Комбинация терапевтического вектора с экспериментальной терапией опухолей увеличивает цитотоксичность вируса. 7. Алгоритмы применения генетического генно-инженерного препарата в комбинации с экспериментальными химиопрепаратами. Научная новизна полученных результатов В настоящей работе впервые охарактеризована роль белка фибера аденовируса человека серотипа 5 в регуляции репликативного цикла. В результате проведенной работы показано, что цитоплазматическая локализация фибера негативно влияет на процессинг вирусных белков и сборку капсомеров. Также впервые доказано, что изменение локализации белка фибера нарушает процесс выделения инфекционных частиц из клетки. Несмотря на ядерную локализацию, функция белка фибера является аналогичной транскрипционным факторам, регулирующим экспрессию. В настоящей работе впервые предположено, что эволюционно консервативный фрагмент белка фибера (шафт и тейл) имеет разные сигналы ядерного транспорта в дополнение к находящемуся в N-терминальной части аминокислотной последовательности. В процессе исследования показано, что мультиформные глиобластомы человека, имеющие высокие пролиферативные и туморогенные свойства, могут быть использованы в качестве клеток-мишеней для терапии онколитическими аденовирусами. При выполнении настоящей работы была создана панель онколитических векторов, содержащих различные белки фибера аденовирусов человека для 12 направленной инфекции клеток глиобластомы человека. В то же время продемонстрировано, что именно модификация белка фибера 5/3 обеспечивает высокий уровень инфекции клеток глиобластомы. Инфекция таким вирусом индуцирует развитие программной клеточной смерти, содержащей элементы аутофагии и апоптоза. Впервые в рамках одного исследования проведен скрининг перевиваемых и первичных клеточных линий глиобластомы человека на предмет их чувствительности к инфекции онколитическим вирусом. Продемонстрирована высокая специфичность генно-инженерной самореплицирующейся вакцины на основе генома аденовируса человека серотипа 5 к гетерогенной опухоли головного мозга человека. Впервые на модели опухоли человека показано, что таргетная терапия опухоли головного демонстрирует мозга высокую онколитическим генно-инженерным цитотоксическую активность и вектором увеличивает выживаемость животных, имеющих глиобластому. С использованием модели ионизирующей радиации и химиотерапии были смоделированы условия применения генно-инженерной вакцины для экспериментальной терапии глиобластомы человека. Теоретическая и практическая значимость В результате проведенного исследования разработаны и предложены для внедрения в практику критерии выбора тактики лечения больных с мультиформной глиобластомой. Внедрение их в лечебную работу позволяет осуществить дифференцированный подход к тому или иному методу лечения данной категории больных в зависимости от различных факторов: присутствия вирусных онкогенов, вирусных первичных клеточных рецепторов и так далее. Определено молекулярное мультиформной глиобластомы. обоснование возникновения рецидивов 13 Разработаны оригинальная методика и рекомендации по применению множественной 4х-цветовой иммунофлуоресценции с использованием конкретной панели антител, позволяющие определить индивидуальный прогноз течения заболевания по одновременной окраске диагностическими маркерами и выработать индивидуальный план лечения пациента. Созданные биологические тест-системы на основе первичных клеток глиобластомы человека применяются для тестирования новых антиглиомных препаратов в Шведском медицинском центре (г.Сиэтл). Современные подходы в лечении глиобластомы предполагают применение основных принципов комбинированной таргетной терапии – одновременной терапии специфических экспериментальные мишеней. подходы, Несмотря возникновение на существующие резистентных популяций неопластических клеток влияет на эффективность использования стандартных методов лечения. В нашей работе мы предложили применять темодал и ионизирующую радиацию в комбинации с онколитическим вектором, что позволит обеспечить принцип целенаправленного ингибирования клеточных мишеней. Личный вклад автора Автору принадлежит концепция создания онколитического вектора на основе генома аденовируса типа 5 человека с использованием транскрипционных и трансдукционных модификаций генома и капсида вируса, а также стратегия изучения противоопухолевого эффекта с использованием клеточных линий глиом человека. Также автором обоснованы методические рекомендации по усилению терапевтического эффекта созданного онколитического аденовируса с использованием системы титрования химиопрепаратов, одобренных для лечения заболеваний человека различной этиологии. 14 Автор непосредственно проводил обработку и анализ данных, разрабатывал методические документы и осуществлял внедрение технологий и экспериментальных подходов с оценкой их эффективности. Все представленные в диссертационной работе научные результаты получены автором как лично, так и при его координации коллективами лабораторий экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей «НИИ ЭдиТо», нейроонкологии университета Чикаго, а также центров Генной терапии университета штата Алабамы в г. Бирмингеме, Центре передовых методов терапии опухолей головного мозга и Шведском медицинском центре в г. Сиэтл. Внедрение в практику Материалы диссертации легли в основу методических рекомендаций «Руководство по клонированию рекомбинантной ДНК, кодирующей иммуноген (ДНК-вакцина)» используемых для преподавательской деятельности кафедр ветеринарного профиля высших учебных заведений. Автор принял непосредственное участие в организации и проведении курсов повышения квалификации студентов и специалистов органов и организаций, осуществляющих ветеринарно-санитарный контроль в Российской Федерации, на базе кафедры Вирусологии Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии по теме: - «Использование аденовирусных векторов в современных подходах в лечении рака человека» в период 1999-2000 гг. Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на совместном заседании Центра генной терапии (GTC) Университета Алабамы в Бирмингеме (University of Alabama at Birmingham), лаборатории нейроонкологии Университета Чикаго (University of Chicago), Центре передовых методов терапии опухолей 15 головного мозга (Center for Advanced Brain Tumor Treatment) Шведского медицинского центра в г. Сиэтл «Cherry Hill»(Swedish Medical Center, Seattle), на заседании ученого совета Института Экспериментальной Диагностики и Биотерапии Опухолей «НИИ ЭдиТо», открытых семинарах Института системной биологии г. Сиэтл (ISB, Seattle, США), Центра рака Университета Чикаго в г. Чикаго (Comprehensive Cancer Center, The University of Chicago, Chicago, США), Центра низкомолекуярных лаборатории (ANL, материалов США) и (CNM) Аргонской лаборатории национальной Молекулярной генетики внутриклеточного транспорта, Института биологии гена (ИБГ, г. Москва, Россия) а также: - на 73-ом, 74-ом, 75-ом и 76-ом международных конгрессах ассоциации нейрохирургов США (г. Новый Орлеан, США, 2005; г. Сан-Франциско, США, 2006; г. Вашингтон, США, 2007; г. Чикаго, США, 2008; - на 8-ой, 10-ой, 11-ой, 14-ой и 15-ой международных конференциях Американского сообщества клеточной и генной терапии (ASGCT) (г. Сен- Луис, США, 2005; г. Сиэтл, США, 2007; г.Бостон, США, 2008; г. Сиэтл, США, 2011; г. Вашингтон, США, 2012); - на международной конференции Американского института онкологов США (г. Чикаго, США, 2006); - на 11-ой и 17-ой международных конференциях сообщества нейроонкологов (г. Орландо, США, 2006; г. Вашингтон, США, 2012); - на ежегодной международной конференции Американской ассоциации исследования рака (AACR) (г. Анахейм, США, 2005; г. Чикаго, США, 2012; г. Сан-Диего, США, 2014); - на научно-практической конференции с международным участием им. Чарлза Хиггинза университета Чикаго, г.Чикаго, США, 2005; - на ежегодной научной конференции лаборатории Колд Спринг Харбор «Cold Spring Harbor Gene Therapy» г. Колд Спринг Харбор, г.Нью-Йорк, 2005; 16 - на XIV и XV Российских онкологических конгрессах в Москве, 2010 и 2011гг; В завершённом виде диссертация была обсуждена и рекомендована к защите на заседании апробационной комиссии Ученого Совета НИИ ЭДиТо «Институт экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей» Российского онкологического центра им Н.Н. Блохина МинЗдрава РФ 23 Сентября 2015 года. Публикации По теме диссертации опубликовано 111 научных работ, из них 53 – в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата медицинских наук. Основные результаты и теоретические обобщения опубликованы в ведущих журналах, входящих в список ВАК, или индексируемых базами данных Web of Science и Scopus (Gene Therapy, Human Gene Therapy, Cancer Research, Journal of Molecular Medicine, Cancer Letters, Stem Cells, Br Journal of Cancer, International Journal of Oncology, Gancer Gene Therapy, Molecular Therapy, Journal of Neurosurgery, Биотерапевтический Журнал, Вестник РОНЦ и так далее). Автор принял участие в подготовке монографии «Gene and Viral Oncolytic Therapies for Malignant Glioma» под общей редакцией д-р. W.M. Gustafsson «New Gene Therapy and Cancer Research» (2008 г.), монографии «Targeted Therapies for Malignant Brain Tumors» под общей редакцией д-р. M. Ram «Pharmaceutical Perspectives of Cancer Therapeutics» (2009 г.), монографии «Gene Therapy For Malignant Glioma» под редакцией д-р. V.A. Erdman, G. Reifenberger, и J. Barciszewski «Therapeutic Ribonucleic Acids in Brain Tumors»»(2009 г.), монографии «Intracranial Glioma: Delivery of an Oncolytic Adenovirus» под редакцией-. M.A. Hyatt «Methods of Cancer Diagnosis, Therapy, and Prognosis: Brain Cancer» (2011 г.), монографии «Maintaining and Loading Neural Stem Cells for 17 Delivery of an Oncolytic Adenovirus to Brain Tumors» под редакцией д-р. D. Kirn, T.C. Liu и S. Thorne «Oncolytic viruses: Methods and Protocols «Methods in Molecular Biology» (2011 г.). Автор в качестве ведущего редактора, редактировал сборник научных статей выпуска «Glioma Stem Cells: Molecular, Diagnostic, and Therapeutci Approaches to Overcome Resistance to the Therapy» журнала Stem Cell International (Импакт фактор 2.8), а также также принял участие в создании базы данных атласа болезней (Brain Allen Institute, http:// glioblastoma.alleninstitute.org). Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 255 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, заключение, выводы, и список используемой литературы (503 источников, из которых 20 российских и 483 иностранных). Работа содержит 2 таблицы и 57 рисунков. 18 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Перспективы применения онколитических векторов 1.1.1. Введение Природа формирования опухолей человека до конца не изучена. Существует мнение, что накопление генетических абберраций в перерождающихся здоровых клетках влияет на пролиферацию здоровой ткани. Такие изменения запускают механизмы молекулярной перестройки клеточного аппарата, ведущие к активации клеточных путей и способствующие неконтролируемому клеточному делению и пролиферации [41-45]. В структуре онкологических заболеваний человека опухоли головного мозга занимают одно из последних мест, и лишь 1 % из них приходится на глиомы [46]. Но при этом почти 70% первичных случаев глиом представлены глиобластомой и, астроцитарными злокачественного опухолями, роста [47]. демонстрирующими Быстротекущее развитие высокие этих темпы опухолей, обусловленное накоплением мутаций/делеций в гене белка p53 (60% случаев), хромосомы 1q17 (70%) и гене эпидермального фактора роста (EGFR), сопровождается высокой смертностью пациентов всех возрастов [48], даже в случае применении комбинированных методов лечения [49, 50]. Таким образом, задача поиска новых, альтернативных методов лечения представляется крайне важной и клинически необходимой. Мультиформная глиома является одной из самых распространенных первичных опухолей головного мозга. Ежегодно в США регистрируется 20’000 новых случаев глиом [51] и, к сожалению, смертность среди пациентов с ГБМ доходит до 7’000 случаев в год. Несмотря на значительный прогресс в применении комбинированных методов лечения, выживаемость пациентов остается в пределах 16-20 месяцев [17], и менее 20% пациентов с диагнозом «глиобластома» выживают в течение 5 лет с момента диагностирования [52]. Хотя в литературе описано достаточное количество основополагающих и клинически 19 ориентированных экспериментов, направленных на улучшение эффективности общепринятых методов лечения, применение усовершенствованных методов лишь незначительно улучшает выживаемость. Исходя из этого, необходимость в поиске новых высокоэффективных методов является актуальной. 1.1.2. Генная терапия как метод лечения опухолей головного мозга Генная терапия представляет собой сравнительно новое направление в лечении опухолей головного мозга с помощью генно-инженерного вектора [53, 54]. Генно-инженерный вектор, использованный в качестве носителя генетической информации, позволяет селективно доставить генетический материал в клеткимишени [18, 55]. Для этого используется механизм вирусной инфекции что стало возможным благодаря клонированию рекомбинантной нуклеиновой кислоты (НК) в состав вирусной частицы. При этом высокий уровень продукции, встроенных в вирусный геном смысловых НК, позволяет получить значительный терапевтический эффект [56, 57]. Однако не только встроенная рекомбинантная нуклеиновая кислота (НК) приводит к увеличению специфичности онколитического вектора. Внесение дополнительных модификаций в структурные белки вирусного капсида, отвечающие за связывание вируса с клеткой, также повышает опухолеспецифичность вектора [15]. Терапия сильно васкуолиризованной опухоли, такой как глиобластома, представляется тяжелым испытанием. Золотыми стандартами в лечении этого заболевания являются хирургическая резекция, ионизирующая радиация и применение темозоломида (TMZ, темодал) (Рис. 2). В дополнение к этому используется бевацизумаб, что как было недавно показано, существенно пролонгирует выживаемость пациентов [58], но не спасает от возникновения рецидива глиобластомы. Согласно литературе, драйверами, вызывающими повторное появление опухоли, являются, например, активация mTOR [59, 60], и MMP2 [58]. Интересно, 20 что активация mTOR индуцирует клеточную аутофагию- механизм, отвечающий за выживаемость опухоли [61], и иммунный ответ [62]. Недавние публикации показывают, что стволовые клетки глиобластомы резистентны к химио [63] и радиотерапии [64]. В связи с этим можно предположить, что направленная инфекция стволовых клеток глиобластомы аденовирусным вектором может увеличить эффективность терапии. 1.1.3. Молекулярные и структурные основы конструирования генноинженерных векторов Одним из ключевых факторов, обеспечивающих целевое действие на опухолевые клетки, является экспрессия клеточных рецепторов на поверхности глиомных клеток. Чем больше первичного рецептора представлено на поверхности клетки, тем эффективнее вирусная инфекция. Нами и другими исследователями было показано, что клетки глиом высоко экспрессируют IL13alpha2 [56], CD46 [65], Syndecan-1 [66], CD80/86 [67], интегрин альфа 3/5 [68], NESTIN [69], но не экспрессируют Коксаки-аденовирусный рецептор (CAR). В последнем случае используются генно-инженерные возможности, позволяющие менять специфичность узнавания вирусом поверхностного рецептора. Новые подходы предусматривают клонирование рецептор-связывающих участков в состав вирусного белка, отвечающего за распознавание клетки вирусом (фибера аденовируса, гликопротеидов герпесвируса или вируса бешенства) или путем замены рецептор-связывающей области поверхностного белка на гомологичную, но принадлежащую другому вирусному серотипу [55, 70, 71]. 21 Рисунок 1 – Выживаемость ГБМ-пациентов при облучении ионизирующей радиацией и при комбинации ионизирующей радиации (RT) с темодалом (темозоломидом, TMZ) [72]) В литературе также описаны случаи таргетинга поверхностных молекул (онко-рецепторов) глиом HER2, UPAR, FGFR, EGFR с использованием модифицированных векторов на основе геномов аттенуированного вируса бешенства [73-77], а также вируса Сендай [78] и аденовируса [79-81]. В вышеуказанных случаях было отмечено, что поскольку в непатологических условиях вирус Сендай не инфицирует клетки, богатые рецепторами, такие как HER2, UPAR и др., таргетинг нового рецептора позволяет перенаправить вирусные частицы на альтернативный рецептор с высоким уровнем экспрессии на поверхности опухолевой клетки. Другим важным направлением в модификации вирусного генома является клонирование опухолеспецифического промотора в его состав [8]. Нежелательная токсичность, вызванная недостаточной аттенуацией вирусной частицы, существенно снижает эффективность применения генно-инженерных вакцин как in vitrо, так и in vivо [55, 82]. При этом направленная доставка терапевтических генов в опухолевые клетки является необходимым условием преодоления 22 нежелательной токсичности. Экспрессия терапевтических или вирусных генов под контролем ткане- или опухолеспецифического промотора снижает их токсичность для здоровых клеток при вирусной инфекции, а также повышает таргетинг вирусных генов в перерождающихся клетках и тканях [83]. Некоторые геномы вирусов, как например, геном аденовируса человека и животных, кодируют белки, отвечающие за аккумуляцию клеток в «S»-фазе клеточного цикла, и предотвращают возникновение апоптоза, как механизма антивирусной защиты. Клонирование промотора в состав аденовирусного генома, и управляющего транскрипцией ранних генов, позволяет существенно увеличить вирусную цитотоксичность. Прототипом для промотора являются гены, обеспечивающие высокий уровень транскрипции в клетках-мишенях и снижение или отсутствие таковой в клетках здоровой ткани. Для специфической экспрессии терапевтических генов в клетки опухолей головного мозга применяют следующие промоторы генов: сурвивин [83, 84], теломераза (Telomerase) [85, 86], тирозиназа (Tyrosinasе) [87], мидкайн (MK) [88], нестин (Nestin) [89], мусаши (Musashi) [90] и CXCR4 [57, 91]. 1.1.4. Литические вирусные векторы направленного действия: общие принципы Способность вирусов лизировать клетки предполагает их использование в качестве прототипов онколитических векторов [92-96]. Несмотря на широкий выбор векторов, вопрос выбора именно онколитического вектора для таргетинга глиом в литературе освещен недостаточно. В зависимости от сигнального пути, рецепторного статуса, и активности транскрипционных элементов «tumor on/normal tissue off» можно выбрать и сконструировать опухоле-специфичный вектор на основе практически любого вирусного генома, используя набор плазмид, кодирующих либо полноценный геном, либо фрагмент вирусного генома. Экспрессия клонированных смысловых нуклеиновых кислот (гены, 23 кодирующие цитокины, ангиогенеза) как про-апоптотические части вирусного молекулы репликационного или ингибиторы цикла усиливает опухолеспецифичность виротерапии [16]. Наличие большого количества вирусов различного происхождения с полностью изученной последовательностью их генома, позволяет использовать их в качестве носителей генетической информации. Возможность данных вирусов инфицировать различные типы клеток в зависимости от степени дифференцировки и, типа хозяев, расширяет границы использования этих векторов как генно-инженерных антиглиомных вакцин. 1.1.5. Онколитические векторы на основе вирусов животного происхождения Преимущество использования таких векторов лежит в том, что в крови человека отсутствуют антитела к вирусам животного происхождения. Ожидается, что такие векторы будут менее иммуногенными по сравнению с аденовирусами или герпесвирусами человека. С точки зрения молекулярной биологии, главным недостатком этой группы векторов является сниженная способность вирусов реплицироваться в клетках опухолей человека, в связи, с чем может быть понижена эффективность инфекции опухолевых клеток. В литературе отмечено, что вирус болезни Ньюкасла, вирус миксомы кроликов, коронавирус и парвовирус мышей являются основными вирусными векторами, используемыми в качестве противоопухолевых онколитических агентов. Вирус болезни птиц Ньюкасл (NDV) – представитель семейства парамиксовирусов, имеющих геном минус (-) РНК. Несмотря на практическую безвредность по отношению к человеку, кроме использования вирулентных штаммов, патогенных для человека, было отмечено, что вирус болезни птиц Ньюкасла реплицируется и накапливается в клетках нейробластомы человека и крыс [97, 98]. При этом эффективность накопления генома вируса в клетках опухолей в 10’000 раз выше, чем при вялотекущей инфекции здоровых клеток 24 человека. Цитолитическая активность аттенуированного парамиксовируса и его вакцинных штаммов AF2240 и V4UPM была задокументирована [95, 99, 100]. О существовании вируса миксомы кроликов было известно давно, но свойство этого вируса активно инфицировать клетки глиом человека было описано Lun X с соавт. [35], причем высвобождение активного вируса сопровождалось литическим разрушением опухолевых клеток U87 и U251. Интересно, что внутриопухолевая иньекция вируса миксомы или его аттенуированного варианта vMyx63KO, существенно продлевала выживаемость мышей, несущих ксенографты С6, U87 и U251 [101, 102]. В этих экспериментах было отмечено, что экспериментальные животные, получившие внутриопухолевую инъекцию онколитического вируса, демонстрировали 92% -ую выживаемость на протяжении 130 дней. Однако после выздоровления мышей исследователи обнаружили остаточную персистенцию вируса в головном мозге. Коронавирус гепатита мышей (MHV) в норме не инфицирует здоровые клетки человека [103]. Однако клонирование рецептор-связывающего участка эпидермального фактора роста (EGFR) не только позволило увеличить связывание коронавируса с поверхностью опухолевых клеток U87 in vitro и in vivo, но и привело к высокой терапевтической активности на ксенографтной модели глиомы человека. Несмотря на высокий уровень ингибирования, недостаточная аттенуация рекомбинантного коронавируса вызывала токсическое действие в здоровой ткани при внутриопухолевом введении вируса. Больший прогресс был достигнут с использованием парвовируса мышей. В 1976 году Linser с соавт. [39] впервые показали, что здоровые клетки головного мозга крыс являются пермиссивными для парвовируса. Позже было отмечено, что глиобластомы человека также поддерживают репликацию и накопление вируса [104]. При этом инфекция глиобластомы онкосупрессивным парвовирусом типа H-1, вызывала ингибирование роста перевиваемых опухолевых клеток и короткоживущих первичных культур глиом. Системная и внутриопухолевая иньекция вектора H-1 25 приводила к ингибированию роста глиомы, имплантированной в мозг крысы (модели RG-2 и U87). Недавние результаты с использованием интерназального введения вектора H-1PV также демонстрируют антиглиомный эффект парвовируса. 1.1.6. Онколитические векторы на основе генома вирусов человека Представители этой группы имеют разные структурные особенности, начиная с типа вирусного генома и заканчивая присутствием оболочки- все они способны лизировать клетки опухолей человека. Кроме того, было показано, что инфекция этими вирусами сопровождается активацией иммунного ответа у человека [11,12]. Парамиксовирусы (вирус везикулярного стоматита) и вирус бешенства, принадлежащий Цитопатические к семейству свойства Rabdovirus, этих вирусов имеют геном связаны минус с (-)РНК. формированием мультинуклеарных клеток, формирующих синцитии. Парамиксовирусы способны инфицировать опухолевые клетки, экспрессирующие первичный белок CD46. В литературе отмечено, что первичная и перевиваемая культура клеток медуллобластомы экспрессирует высокий уровень первичного рецептора для вируса бешенства [105], что способствовало существенному ингибированию глиом и медуллобластом вирусом бешенства in vitrо и in vivо [106]. Альфавирус Семлики, принадлежащий семейству Togaviridae, характеризуется наличием позитивного генома (+)РНК. Высокий уровень продукции частиц, а также увеличенная продолжительность экспрессии рекомбинантных РНК вируса Семлики не только способствовало эффективному инфицированию опухолевых клеток, но и их литическому разрушению [107]. Создание термоустойчивой формы вирусного вектора на основе генома вируса Семлики позволило использовать его в качестве вакцинного препарата для предотвращения опухолевого роста. Yamanaka с соавт. и позже Roche с соавт. [44, 26 45] отметили, что доставка интерлейкина 12 в составе самореплицирующегося вектора, увеличила выживаемость мышей с внутримозговой имплантированной опухолью 203- и RG2-. По данным Heikkila с соавт., внутривенная инокуляция нейротропного альфавируса VP7 позволила эффективно разрушить имплантированные глиомные клетки и продлить выживаемость голых мышей. Проводимые клинические испытания с использованием интерлейкин-12- модифицированного альфавектора вируса Семлики на пациентах с вторичной глиобластомой показали низкую токсичность и высокую репликативность генноинженерной вакцины [108]. Другим представителем вирусов человека с глиомолитическими свойствами является реовирус. Схожесть структурного состава поверхностного белка «сигма» с поверхностным белком «фибером» аденовируса, а также высокий уровень экспрессии сиаловой кислоты (вирусный первичный рецептор, детектируемый на перевиваемых и первичных опухолевых клетках глиом) позволяют использовать реовирус как инфицирующий агент. Недавно Wilcox с соавт., отметили, что реовирус реплицируется в клетках, где обнаружен высокий уровень активности протоонкогена RAS [109]. Отчасти это связано с тем, что RAS-сигнальный путь негативно подавляет состояние клеточной антивирусной защитной системы. Последующее тестирование реовируса как онколитического агента выявило его высокую способность инфицировать не только перевиваемые линии клеток глиом, но и опухолевые клетки, выделенные от пациентов [110]. Эксперименты in vivo на мышах и крысах с использованием подкожной и внутрицеребральной моделей глиом показали хороший терапевтический потенциал реовирусного вектора [111]. Похожие результаты были получены с использованием экспериментальных моделей медуллобластом [112] и лептоменингиальных метастазов опухоли грудных желез [113]. Применение оболочечных вирусов обусловлено большим размером их генома. Исследования показали, что присутствие областей, позволяющих вносить 27 делеции и мутации, позволяют создавать генно-инженерные вакцины на основе геномов вакцин вируса [114-116] и герпесвирусов [117-120]. В 1999г. группа исследователей из Университета Лома Линда, Калифорния заметила, что рекомбинантный изолят поксвируса вакцины recVV2 обладает уникальной способностью инфицировать клетки глиом C6 у крыс. В эксперименте in vivо было отмечено, что внутриопухолевая иньекция вируса осповакцины вызывала развитиие апоптоза и последующее ингибирование подкожно- имплантированной модели глиомы С6 [121]. Дальнейшая модификация генома вируса вакцины путем клонирования гена апоптозного регулятора – р53, а также цитокинов IL-2 и IL-12 давала аддитивный противоопухолевый эффект и in vivo [122, 123]. Другая группа исследователей из Франции сконструировала онколитический вектор на основе штамма Ancara и испытала его в лечении ортотопической модели глиомы U87. Как показывают результаты, опубликованные этой группой, комбинированный метод лечения в сочетании с терапией давал наибольший терапевтический эффект in vivo [124]. Недавнее сообщение Lun X с соавт. [56] подтверждает эффективность вектора вакцины как антиглиомного терапевтического агента. Так, внутриперитонеальная имплантация мышам и крысам онколитического вектора JX-594, кодирующего кДНК макрофагальный колониестимулирующий фактор (МФ-КСФ), вызывала разрушение внутримозговой опухоли GL261 у мышей и RG2 у крыс. Другим представителем группы оболочечных вирусов, используемых для виротерапии глиом, является герпесвирус. Геном герпесвируса человека типа 1 состоит из 152 тысяч пар нуклетиотидов, кодирует более 70 генов и позволяет производить генетические изменения в геноме. Удаление части генома или внесение мутаций позволяет клонировать терапевтические гены без потери способности вируса к репликации. Например, внесение обширной делеции в область UL39, кодирующую рибонуклеотидредуктазу, важную для синтеза вирусной ДНК, позволило получить рекомбинантный вирус, неспособный к 28 репликации в здоровых клетках и реплицирующийся в клетках, дефектных по белку p16 (клеточный опухолевый супрессор) [125, 126]. Было отмечено, что внесение мутации gamma-34 обеспечивало репликацию вектора в RAS-активных опухолевых клетках, включая клетки глиом. Дополнительная экспрессия интерлейкина антиглиомную 4, интерлейкина терапевтическую 10 или интерлейкина активность вектора 12 увеличивала [127-129]. Группа сотрудников из Университетов Алабамы и Чикаго сконструировала вариант 1716, демонстрирующий высокий антиглиомный потенциал in vitro, in vivo и на пациентах с метастатической болезнью [130]. Другой вектор, созданный на основе герпесвируса, является аттенуированным вариантом G207. Внесение одновременной делеции в локус гамма 34.5 и клонирование гена галактозидазы в локус ICP6, позволило предотвратить рекомбинацию и возвращение к дикому типу при инъекции и in vivo [131]. В последние десятилетия произошел значительный прогресс в понимании молекулярной биологии оболочечных аденовирусов [132]. Новая информация о цикле репликации, посттранскрипционных модификациях РНК, механизмах клеточного апоптоза [3] и защиты расширила наши знания о базовых принципах строения вирусной частицы и стратегии вирусного генома. Это позволило создать различные вирусные векторы для таргетинга опухолей астроцитарного ряда. Большинство рекомбинантных вирусных векторов были созданы на основе геномов человека серотипа аденовируса 5 [70, 81, 86, 133-135]. Его геном представлен ДНК размером 36 тыс. пар нуклеотидов, разделенных на ранние и поздние гены. Функция ранних вирусных белков заключается в переключении рибосом с синтеза клеточных на вирусные белки, а также в ингибировании клеточного иммунного ответа на вирусную продукцию. Среди продуктов ранних генов особое значение имеют протеины области Е1А, стимулирующие аккумуляцию клеток в S-фазе клеточного цикла, необходимого для вирусной 29 репликации. Для усиленной продукции этих белков используют ткане- или опухолеспецифические промоторные элементы [86, 136-138]. Активация сигнальных путей в опухолевых клетках позволяет применять модифицированные генно-инженерные вакцины, тем самым усиливая их специфичность по отношению к неопластическим. В процессе эволюции многие вирусные векторы научились преодолевать высокий уровень пролиферации глиом, ассоциированный с усиленной продукцией ингибиторов апоптоза – протоонкогенов Bcl-2 или RAS. Так же было показано, что внесение делеций в состав вирусного генома позволяет уменьшить зависимость репликации вирусных векторов от активности таких ключевых клеточных регуляторов как ретинобластома или р53. Так, внесение 24-аминокислотной делеции в область Е1А генома аденовируса блокирует зависимость репликации вируса от присутствия белка ретинобластомы [139], а делеция в области Е1В вирусного генома позволяет вирусу размножаться вне зависимости от уровня белка p53 в клетках [140, 141]. 1.2. Онколитические векторы в нейроонкологии 1.2.1. Введение Аденовирусы являются наиболее изученными векторами, используемыми в генной терапии. Еще в конце 1950г. Levy и Rowe заметили, что проходящий через фильтр агент способен инфицировать здоровые клетки [142, 143]. С тех пор развитие науки об аденовирусах позволило применять новые знания в создании аденовирусных векторов, инфицирующих опухолевые клетки. На день известно порядка нескольких тысяч публикаций об использовании более 100 векторов для направленной инфекции глиобластомы. Множество первичных рецепторов, служащих для интернализации аденовирусных частиц, обеспечивает инфекцию быстрорастущих клеток. Использование компетентных клеточных позволяет амплифицировать вирусные геномы в высоких титрах. систем 30 1.2.2. Молекулярные основы построения противоопухолевых онколитических векторов, применяемых в нейроонкологии Исследования клеточных сигнальных путей, лежащих в основе злокачественности глиобластомы, позволили увеличить специфичность вирусных векторов. Так в литературе были описаны генетические изменения в клинических образцах ГБМ, затрагивающие последовательности генов PTEN, p16INK4A, EGFR и р53 [144-146]. По данным Геномного Атласа Опухолей (TCGA, Cancer Genome Atlas) примерно 80% образцов ГБМ содержат изменения в последовательностях генов CDKN2A и Rb, регулирующих клеточную пролиферацию и выживаемость клеток [147, 148]. Другие данные показывают, что делеция в гене PTEN наблюдаются в ~50% случаев, амплификация EGFR детектирована только в 30% всех случаев, и еще меньше клинических образцов содержат мутации в генах р53 и IDH1 [149]. Впервые попытка создать антиглиомный самореплицирующийся вектор, специфичный к сигнальным путям активным в глиоме, была предпринята путем встраивания делеции в геном аденовируса, тем самым, ограничивая вирусную репликацию в здоровых клетках. Таким образом, был сконструирован ONYX105 или dl1520 для репликации в р53-дефектных опухолевых клетках [150] для индукции клеточной смерти в процессе вирусной репликации [151]. Однако, недавние исследования отметили, что dl1520 также реплицируется в здоровых клетках [13], тем самым демонстрируя механизм репликации вне зависимости от функционального статуса р53 в клетках [152, 153]. Другим кандидатом является ∆24 (вектор известный как dl922-947 или ONYX-838) самореплицирующийся вектор, созданный путем внесения 24аминокислотной делеции в состав ранней области аденовируса Е1А. В процессе вирусной инфекции продукты области Е1А связываются с клеточным белком ретинобластомы, тем самым, освобождая транскрипционный фактор E2F1. Ограничение деления клеток в фазе S стимулирует репликативную активность 31 вируса в клетках с аберрантным переходом G1-S [154]. Хотя здоровые клетки резистентны к инфекции ∆24, клетки глиобластомы человека U251 и U87 оказались чувствительными к инфекции вирусом как in vitrо, так и in vivо [155]. Дополнительная мутация E1B-55K, как было показано Gomez-Manzano с соавт. [122], позволила создать онколитический вирус с большим терапевтическим потенциалом, чем ∆24. Но данные Geoerger с соавт., показывают, что применение dl1520, ∆24, или двойного мутантного вируса CB1 в качестве монотерапии может быть ограничено в зависимости от агрессивности клеток [80]. Таким образом, для усиления терапевтического потенциала онколитических векторов, необходима дальнейшая модификация вирусных геномов. 1.2.3. Усиление направленной инфекции онколитических вирусов: связывание с клеточным рецептором и интернализация Целесообразность внесения модификации в геном или белковый состав аденовирусного капсида для повышения эффективности вектора является предметом нескончаемых споров между исследователями. Одним из оппонентов этого подхода является д-р. Freytag, который использует для терапии рака простаты немодифицированный вектор, «загруженный» «ТК «для комплексной терапии [156]. В отличие от клеток рака простаты, клетки глиобластомы человека содержат достаточно низкий уровень [157]124] первичного рецептора для аденовируса типа 5 (Коксаки-аденовирусный рецептор, Coxsackie adenoviral receptor, CAR), что снижает их чувствительность к инфекции аденовирусом этого типа. Поскольку большинство рекомбинантных векторов созданы на основе генома аденовируса типа 5, низкая экспрессия CAR может быть критична для эффективной трансдукции клеток вектором. Для усиления связывания вириона с клеткой-мишенью было предложено несколько стратегий. Известно, что все аденовирусы сгруппированы в 6 подсемейств, для каждого из которых характерно узнавание специфического 32 рецептора на поверхности клетки. Было показано, что для аденовирусов типа 3, 11 и 35, рецепторами узнавания клеток-мишеней являются десмоглеин 2 (DSG2) и CD46 Узнавание [158]. вирусом клетки-мишени обеспечивает фибер. Соответственно, замена рецептор-связывающего участка (кноб-домена) белкафибера одного серотипа другим и, узнающим альтернативный рецептор, позволит перенацелить вирусную частицу. В предыдущих публикациях Wohfahrt с соавт. [70], and Li с соавт. [159], продемонстрировали, что замена кноб- доменов на аналогичные от серотипа 35 существенно увеличивает инфекционную способность вируса по отношению к глиобластоме человека in vitrо и in vivо. Трансдукция клеток глиом аденовирусом типа 5 демонстрирует низкую эффективность в связи с отсутствием рецептора CAR на поверхности клеток глиом. Для перенацеливания на альтернативный рецептор, например интегрины, было предложено клонирование интегрин-связывающего участка- Арг-Гли-Асп (RGD-4C), позволяющее усилить взаимодействие вирусных частиц с интегринами αγ, расположенными на мембране глиомы [66]. Обеспечение трансдукции клеток с использованием первичных рецепторов интегрины, и транскрипционной модификации (использование промотора гена сурвивина человека [160], гена теломеразы [86], или делеции ∆24) усиливает токсичность аденовирусного вектора [138, 161-166]. Другим типом модификации, позволяющим перенацелить вирус на альтернативный рецептор, является клонирование рецептор-связывающего участка в С-терминальную часть фибера. Например, вируссодержащий полилизин в дополнение к интернализации фибера через рецептор CAR, связывается с рецепторами гепарансульфатами путем электростатического взаимодействия [66]. Zheng с соавт., идентифицировала рецептор для pK7-модифицрованного вектора. Оказалось, что ингибирование поверхностных молекул Синдекан-1 и перлекан антителами снижает эффективность инфекции pK7 вирусом на 30-50%. Wickham с соавт., были первыми, кто предложили клонировать полилизиновый мотив в С- 33 терминальную часть белка фибера, тем самым, обеспечивая связывание кнобдомена с CAR, гепаран-сульфатными рецепторами и интегринами, узнающимися пентоновым капсомером [167]. Несмотря на сильную эффективность связывания, специфичность вектора, имеющего модификацию pK7, снижена в силу присутствия гепарансульфатов на поверхности мышечных клеток, макрофагов, эндотелиальных клеток [167] и глиобластомы человека [168]. Данные, полученные Zheng с соавт. [66], Asuthkar с соавт. [169], Qiao с соавт. [170], and Phillips с соавт. [171, 172], показывают, что первичные клетки глиобластомы пациентов и перевиваемые клетки глиобластомы человека экспрессируют различное количество гепарансульфатов на своей поверхности. В дополнение к этому модификация pK7 демонстрирует высокий уровень трансдукции неопластических и здоровых клеток [173], включая рак кишечника [174], миобластомы [175] и глиомы [66]. В таком случае целесообразно использование опухолеспецифического промотора предлагает преимущество для трансдукции глиобластомы. Активность промотора гена сурвивина человека обеспечивает опухоле- и ткане-специфическую экспрессию E1A в глиомах [160], тем самым усиливая терапевтический эффект CRAd-S-pK7. Экспрессия EGFR была показана для 40-60% клинических образцов с глиобластомой [176]. Grill с соавт., впервые предложили использовать рецептор EGFR для инфекции клеток аденовирусом [177]. Автор использовал схему сложного вектора, экспрессирующего одноцепочечное антитело, узнающее рецептор EGFR и фрагмент рецептора CAR, связывающийся с кноб- доменом белка фибера. Позже были созданы варианты аденовирусов для направленной инфекции EGFRvIII-позитивных клеток глиобластомы [81]. 1.2.4. Транскрипционный контроль аденовирусной инфекции в глиомах Встраивание контролирующих элементов для вирусной транскрипции повышает специфичность CRAd к глиомам. Было показано, что нежелательная 34 токсичность по отношению к здоровой ткани может быть уменьшена путем клонирования промоторов или контролирующих участков микроРНК. Прототипом промотора является ген активный в опухолевых клетках, но при этом в клетках здоровых тканей. Одним из примеров является промотор сурвивина [83, 178, 179], чей ген активен в опухолевых клетках, резистентных к терапии [179]. В клетках глиом уровень сурвивина коррелирует с высокой активностью мРНК [160, 180]. Мидкайн (MK) экспресирующимся является геном MDK. гепарин-связывающим В процессе фактором онтогенеза и роста, воспаления, продуцируется рецептор Синдекан-1 для МК, тем самым, стимулируя клеточную пролиферацию, ангиогенез и фибринолиз в нескольких типах канцера, включая нейробластому и глиобластому. Поскольку Мидкайн вовлечен в пролиферацию опухолей, он является одним из объектов для генной терапии. Но вследствие высокой активности в нормальных клетках, таких как фибробласты и миобласты [181], специфичность МК-контролируемой экспрессии вирусных генов представляется противоречивой [88]. Промотор гена теломеразы человека (TERT) также активен в глиоме. Последние данные показывают, что более 85% различных канцеров, включая глиому, поддерживают активность промотора в опухолевых клетках. Недавняя пуликация Yokoyama с соавт. продемонстрировала активность ~450 п.н. промотора гена теломеразы в направленной инфекции клеток глиом U87, U373, U251 и первичной линии клеток глиобластомы MDC-01 [86] в составе вируса теломелизина. Однако, существуют данные, в частности научный доклад, сделанный Jafri с соавт., свидетельствующие, что, в силу своей гетерогенности лишь 26.1% клеток глиобластомы поддерживают активность промотора теломеразы [182, 183], тем самым, ограничивая его возможность использования в клинике. 35 Другое интересное исследование было проведено Hoffmann с соавт., целью которых было изучение специфичности промоторов глиомы, а также их возможной комбинации для усиления противоопухолевой токсичности онколитического вектора. Авторы изучили возможности промоторов генов VEGF, GFAP, FGF, Ki67, NESTIN, MК или в комбинации с энхансером/промотором SV40 [184]. На основании экспрессии репортера гена люциферазы они выделили промоторы MK, hTERT, VEGFдлинный, VEGFкороткий, Ki67, GFAP и E2F/SV40, обладающие наибольшей активностью в клетках глиобластомы человека D54, U251, и U87. Эксперимент in vitrо показал, что промотор гена GFAP обеспечивал репликацию вектора CRAd-5/35 в опухолевых клетках глиобластомы с различной скоростью пролиферации. По результатам анализа in vivо было высказано предположение, что транскрипционный контроль вирусной области Е1А промотором гена GFAP существенно пролонгировал выживаемость мышей с внутримозговыми ксенографтами человека U251. В дополнение к этому, эксперименты Horst с соавт. [137], показали, что и в быстро пролиферирующих клетках можно достичь высокой степени трансдукции опухолевых клеток вирусом под контролем GFAP-промотора, однако в силу гетерогенной структуры мультиформной глиобластомы результат может быть малоэффективным. Недавние результаты, полученные Zheng с соавт. [185], иллюстрируют, что замена промотора Е1А на промотор цитомегаловируса человека не усиливает специфичность аденовирусной транскрипции. При использовании неопластических клеток OE33 и OsACL, вирус под контролем промотора CMV показывал меньший уровень репликации в сравнении с вирусом, не содержащим этот промотор. Более того, отсутствие специфичности по отношению к фибробластам WI-38 подтверждает мнение, что СMV не является опухолеспецифичным. Схожие с этим результаты были получены совсем недавно [186, 187]. В настоящий момент существует мнение, подтвержденное экспериментально [188, 189], что ряд опухолей человека, включая опухоль 36 головного мозга [190-192] содержит вирусные продукты цитомегаловируса, такие как ДНК, РНК или вирусные гликопротеины. При этом персистенция СMV наблюдается в нормальных/ здоровых) клетках, тем самым предполагая присутствие вирусных транскриптов в них, а, значит, и активность главного позднего промотора CMV. Данные, полученные Bieler с соавт., показывают, что резистентные к терапии клетки глиомы экспрессируют высокий уровень белка YB-1 [193]. По данным литературы этот протеин выполняет функцию транскрипционного фактора, участвуя в трансляции и транскрипции [194, 195]. В процессе облучения UV лучами и химиотерапии, YB-1 транспортируется из цитоплазмы клетки в ядро, участвуя в восстановлении поврежденной ДНК [196, 197]. Авторами были созданы самореплицирующиеся вирусные конструкции под контролем YB-1 с целью экспрессии в химиорезизистентных клетках. Одним из таких являлся dl520 (E1A-13S), который был активен в опухолевых клетках глиом, резистентных к Иринотекану и Трихостатину А [193]. Последующая модель фибера, измененная путем внесения модификации и дополнительной делеции в область Е1В позволила получить Ad-Delo3-RGD, который демонстрировал усиленную репликацию в химиорезистентных опухолевых клетках [136]. Другая группа исследователей использовала возможность фосфорилированного Rb вызывать активацию транскрипционного фактора E2F1 в клетках глиобластомы [198]. Для того, чтобы ограничить транскрипцию аденовируса к глиоме, авторы клонировали элементы, регулирующие E2F1, в состав онколитического вектора [138]. Поскольку E2F1 регулирует активность [199] в быстро пролиферирующих клетках [200], остается неясной способность вируса инфицировать покоящиеся (quiescent) неопластические клетки. Возможность глиом экспресcировать набор микроРНК для супрессии своих собственных генов также используется в генной терапии. По данным литературы известно, что клетки глиом высоко экспресcируют клеточные микроРНК, такие 37 как -124, -128, -146B и 218 [201]. Таким образом, клонирование в геном аденовирусного вектора элементов микроРНК позволяет увеличить специфичность вектора, применительно к глиомам. 1.2.5. Стратегии, повышающие противоопухолевый эффект вектора 1.2.5.1. Модификация генома вируса с целью усиления вирусной токсичности Геном аденовируса кодирует ранние гены, которые транскрибируются перед репликацией ДНК, и поздние гены, транскрибирующиеся после репликации ДНК. Область аденовирусного генома Е3 кодирует продукты, обеспечивающие контроль за клеточным делением, развитием апоптоза и активацией вирусной репликации [202]. Эта область кодирует 7 белков, в том числе ADP (белок аденовирусной смерти, adenoviral death protein) вырабатываемый вирусом на поздней стадии инфекции [203] и ответственный за лизис клеток и высвобождение вирионов [204]. С целью усиления онколизиса аденовирусным вектором, Yun с соавт., создал онколитический вектор, содержащий делецию 55Kda-E1B, экспрессирующий ADP под контролем главного позднего промотора цитомегаловируса человека (CMV) [202]. В сравнительном эксперименте было отмечено, что терапевтический потенциал вируса, содержащего ADP, под контролем CMV превосходит потенциал не модифицированной версии вируса, не содержащей промотор CMV. 1.2.5.2.Активация вирусной токсичности в присутствии гипоксии Одним из недостатков применения аденовирусов является неравномерное распределение онколитического вектора в опухоли [205]. Было показано, что гипоксия снижает доставку питательных веществ в опухоль, тем самым ограничивая раcпространение вируса внутри опухолевой ткани [206]. Поскольку гипоксия стимулирует инвазию и пролиферацию глиомных стволовых клеток (ГСК) [207-209], направленная инфекция ГБМ посредством усиления вирусной 38 репликации в условиях гипоксии может увеличить терапевтический потенциал вируса. Использование чувствительных к гипоксии элементов – транcкрипционных факторов – позволяет опухолевым клеткам выживать путем активации пролиферации [210]. Таким образом, онколитический вектор, которому гипоксийные регуляторные элементы помогают реплицироваться в гипоксийных областях, может быть эффективным [208], что и было продемонстрировано Post с соавт. [211]. 1.2.5.3. Стратегия усиления или ослабления иммунного ответа в ответ на вирусную инфекцию Из литературы известно, что пациенты с глиобластомой демонстрируют высокую иммуносупресcию, в результате применения химиотерапии и ионизирующей радиации, активности стволовых клеток опухоли (ГСК) [212, 213]. Существует открытое обсуждение возможности усиления иммунного ответа для улучшения состояния пациентов. Недавние исследования Liikanen с соавт. [214], возобновили эту дискуссию о роли иммунной системы в онколизисе опухоли. В опытах с использованием иммунокомпетентных (с полноценным иммунным ответом) животных- хомяков было показано, что существующая иммуносупрессия не влияет на антивирусный иммунный ответ [215]. А недавняя публикация Klejin с соавт. [216], показала, что иммунный ответ на инъекцию Delta24-RGD играет роль в терапевтической эффективности. Еще одним из вариантов усиления активности онколитического вектора является вирусспецифическая доставка онколитического агента в опухоли с помощью стволовых клеток для снижения иммунного ответа на аденовирусные антигены. Доставка вирусных частиц к клеткам глиобластомы требует активации миграции стволовых клеток. Как было показано, глиома секретирует ангиогенные факторы и хемокины, такие как, TGF-β [217], PDGFβ [218], VEGF [219], которые заставляют мигрировать стволовые клетки в опухоль. В дополнение к этому стволовые клетки красного костного мозга усиливают распространение 39 онколитического вектора in vivо [220, 221], что существенно увеличивало выживаемость мышей с внутримозговыми ксенографтами [222] вне зависимости от способа введения стволовых клеток [217]. Схожая с этим стратегия была применена в контексте стволовых клеток HB1.F3.CD NSC, не содержащих антиген HLA класса I, но инфицированных вектором CRAd-S-pK7. Оказалось, что нейростволовые клетки демонстрировали терапевтический эффект, выраженный в пролонгации выживаемости мышей с интракраниальными опухолями как in vitrо, так и in vivо [57]. 1.3. Роль сурвивина в диагностике и терапии глиобластомы человека 1.3.1.Введение Опухоли головного мозга представлены как первичными, так и вторичными новообразованиями. Среди них выделяют глиомы, возникающие из клеток астроцитарного ряда и составляющие порядка 30% всех первичных опухолей головного мозга. По сравнительной классификации Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) астроцитомы с высокой степенью злокачественности (стадия 4, мультиформная глиобластома, ГБМ) представлены в половине клинических случаев. Как известно, коррелирует с низким уровнем степень выживаемости злокачественности глиом пациентов. Несмотря на существенный прогресс в этой области за счет применения антиглиомных терапевтических подходов, основанных на использовании хирургических методов, а также химио- и радиотерапии, эффективность имеющихся способов лечения опухолей головного мозга остается невысокой. Недавно была предложена концепция развития опухолей, базирующаяся на предположении, что гены регулируют ответ на внешнее воздействие. Согласно этой теории, высокая резистентность опухолей обусловлена набором генетических факторов, обеспечивающих нечувствительность к химиопрепаратам и 40 радиотерапии [223]. Таким образом, определение генов, регулирующих ответ опухоли на внешние стимулы и участвующих в невосприимчивости опухоли, является наиболее актуальной задачей. Апоптоз (или программированная гибель клеток) – это один из консервативных процессов саморазрушения органелл клетки в ответ на различные стимулы [224]. В основе этого процесса лежит удаление поврежденных клеток из организма. По данным литературы, для поддержания гомеостаза регуляция апоптоза, осуществляется хорошо организованными сигнальными путями, такими как AKT и NFкB. Это происходит с помощью белок-белкового взаимодействия или транскрипционного контроля за ингибиторами апоптоза, такими как, сурвивин [225]. 41 1.3.2. Общая характеристика и механизм действия Впервые возможность терапевтического ингибирования белка сурвивина на клетках опухолей головного мозга была представлена Shankar с соавт., в 2001 году [226]. Авторы осуществили доставку антисмысловых молекул к гену сурвивина в клетки олигодендроглиомы (TC620) и нейробластомы MSN, что привело к гибели части раковых клеток. Интересно, что добавление ингибитора апоптоза не влияло на количество погибших клеток. Таким образом, данные результаты свидетельствуют об участии белка сурвивина в выживаемости клеток, а также подтверждают роль этого белка в независимом от каспаз механизме клеточной смерти. Позже было установлено, что в опухолях белок сурвивин непосредственно связывается с каспазой типа 3 или 7, тем самым, ингибируя митохондриальный и независимый от каспаз апоптоз [227]. По другим данным присутствие белка сурвивина в слабо дифференцированных эмбриональных клетках, а также ассоциация его с микротрубочками позволяет говорить о данном белке не только как об ингибиторе апоптоза, но и как о регуляторе митоза и пролиферации [228, 229]. Выполняя двойную функцию, белок гена сурвивин имеет отличительные особенности в своей структуре. В то время как другие представители семейства ингибиторов апоптоза (ИАП) имеют несколько доменов (BIR), сурвивин имеет только один такой домен [230]. Кроме того, было показано, что фосфорилирование этого домена по треонину-48 ведет к ингибированию активности экспрессируемого геном белка, и, как следствие, усилению апоптоза. В физиологических условиях сурвивин не способен вызывать ингибирование апоптоза, однако в присутствии стресс-сигналов, он либо связывается с другими молекулами, ингибирующими апоптоз (XIAP), либо сам регулирует антиапоптотическую реакцию SMAC/DIABLO [231-233]). клетки посредством связывания с фактором 42 Формирование кровеносных сосудов важно для доставки кислорода и питания опухолей. Такой процесс поддерживает гомеостаз и обеспечивает опухолевый рост при участии ростовых факторов, выделяемых как самой опухолью, так и прилежащей тканью. Недавние исследования подтверждают полученные ранее данные о том, что экспрессия сурвивина усиливает продукцию ростовых факторов VEGF и FGF [234]. В таком случае повышенная экспрессия сурвивина приводила не только к увеличенной пролиферации клеток глиом, но и активировала их инвазию [235]. Таким образом, установлена связь между высоким уровнем сурвивина в клетках глиом, их подвижностью и кровоснабжением опухоли. 1.3.3. Регуляция экспрессии белка сурвивина Ген сурвивин кодируется хромосомой человека 17q25 и состоит из 3 интронов и 4 экзонов [236]. Альтернативный сплайсинг сурвивина продуцирует 5 форм мРНК: Survivin, Survivin 2B, Survivin 2a, Survivin 3B и Survivin deltaЕх3, однако роль каждого из них в глиомагенезе и регуляции апоптоза клетки до конца не изучена. В литературе предпринято несколько попыток выяснить не только значение экспрессии каждого из вариантов, но и установить корреляцию между уровнем мРНК каждой изоформы со степенью злокачественности глиом. Так, транскрипционная активность сплайсированных форм 2B и deltaEx3 была исследована методом ПЦР в реальном времени на примере 25 образцов опухолей головного мозга, включая первичные глиомы. В то время, как в доброкачественных образцах наблюдалась существенная экспрессия фракции 2В, в злокачественных образцах в большинстве случаев была обнаружена фракция deltaEx3 [237]. На молекулярном уровне экспрессия сурвивина осуществляется промотором. Помимо этого, недавние публикации показывают, что экспрессия сурвивина также контролируется эпигенетически. Впервые эпигенетический 43 статус промотора был установлен Yu с соавт. В своих исследованиях авторы отметили, что в клетках астроцитарного ряда промотор гена сурвивина не метилирован [238]. Однако недавние исследования, проведенные Acquati и соавт., опровергают это мнение и предполагают, что транскрипция гена сурвивина может регулироваться эпигенетически [239]. В частности, ими показано, что белок BMI1 осуществляет эпигенетическую регуляцию промотора гена сурвивина в стволовых клетках. Таким образом, по данным анализа, низкая экспрессия белка BMI1 обратно коррелирует с уровнем экспрессии белка сурвивина в клетках. В настоящее время установлено, что экспрессия сурвивина регулируется р53 [240242], NFkB [243], АКТ [244], STAT3 [245, 246] и сигнальными путями TOR/RAC [247, 248]. Недавние исследования Fortugno и соавт., и позже Ghosh и соавт., продемонстрировали, что молекулярные шапероны – белки теплового шока типа 60 и 90 также могут регулировать стабильность комплекса сурвивина и, как результат, апоптоза клетки [249, 250]. 1.3.4. Клиническое значение экспрессии сурвивина для диагностики опухолей головного мозга Как было показано выше, сурвивин вовлечен в сигнальные пути, регулирующие инвазивность, ангиогенез и пролиферацию опухолевых клеток. Отсюда следует, что предварительный скрининг клинических образцов на предмет экспрессии сурвивина имеет большое значение в ранней диагностике глиом. В 2002 году Das с соавт., а также Kajiwara с соавт., изучили экспрессию сурвивина в клетках первичной глиобластомы на уровне мРНК и белка [251, 252]. В настоящее время обнаружена экспрессия сурвивина в опухолях головного мозга, например, эпендиомах [253, 254], ганглиомах [255], питуитарных опухолях [256] и лимфомах [257]. Chakravarti с соавт., иммуногистохимически проанализировал экспрессию белка сурвивина в 92 парафиновых образцах глиом [258]. В этих исследованиях 44 была установлена прямая корреляция между иммунореактивностью сурвивина, прогрессией глиом, выживаемостью больных и обратная корреляция с уровнем проапоптотического белка каспазы 3. Принимая во внимание предполагаемую Chakravarti с соавт. локализацию сурвивина в ядре и цитоплазме, Xie с соавт., исследовали клиническое значение исследуемого белка. В этой работе была найдена позитивная корреляция между экспрессией сурвивина в цитоплазме клеток и размером опухоли у мультиформной глиобластомой [259]. Эти данные противоречили с данным, полученным Pan с соавт., которые не выявили корреляцию между экспрессией сурвивина в ядре, ни c возрастом пациентов (p=0.053), ни с общим состоянием онкологического больного по шкале Карновского (p=0.486) ни с полом (p=0.376) [260]. В то время, как ядерная фракция сурвивина положительно коррелировала со степенью злокачественности глиобластомы (p=0.005), смешанная экспрессия (в цитоплазме коррелировала с общей выживаемостью больных ГБМ [261, 262]. и ядре) 45 1.3.5. Терапевтические подходы таргетинга сурвивина В настоящее время накоплена значительная информация, подтверждающая этиологическую и диагностическую роль гена сурвивина в прогрессии глиом. Оценка патоморфологической роли сурвивина в развитии опухолей молочной железы, поджелудочной железы, а также глиом, показала терапевтическую значимость данного гена для прогрессии опухолей. В нейроонкологии, экспериментальные терапевтические подходы на основе гена сурвивин, можно разделить на иммунологические, генно-терапевтические и химиотерапевтические методы ингибирования роста глиом. Разработка иммунотерапевтических антисурвивиновых вакцин основывается на том, что организм пациентов с опухолями головного мозга может вырабатывать иммунный ответ на экспрессию белка сурвивин. Так, Soling с соавт продемонстрировал, что 11.9% и 8.6% исследуемых больных с диагностированной глиомой или менингиомой вырабатывают аутоантитела к белку сурвивину [263]. Дальнейшее картирование эпитопов привело к созданию и применению пептидов на основе белка сурвивин в создании дендритной вакцины против глиомы [264]. С использованием ортотопической сингенной модели глиомы GL261, выращенной в головном мозге мышей линии C57BL/6, и дендритной вакцины, были получены данные, свидетельствующие об активации цитотоксического иммунного ответа против опухоле-ассоциированного белка [265]. К группе таргетной терапии относится большинство химиопрепаратов, осуществляющих как непосредственное ингибирование гена сурвивина, так и ингибирование сигнальных молекул, регулирующих экспрессию данного белка. Одними из первых, кто заметил, что ингибирование такого гена приводит к появлению спонтанного апоптоза на опухолевых клетках, были Grossman и Nakayama с соавт. [266, 267]. На экспериментальных моделях опухолей головного мозга было показано, что синтетический ингибитор YM155 и целекоксиб снижают экспрессию сурвивина в клетках глиом [268, 269]. Однако было отмечено, что 46 окончание курса химиотерапии может сопровождаться ростом опухоли и появлением рецессированной опухоли [9] с новыми фенотипическими и генотипическими свойствами [270, 271]. Таким образом, применение нескольких химиопрепаратов, действующих на различные сигнальные пути, позволяет активировать проапоптотические механизмы клеточной смерти и увеличить сенсибилизацию опухоли к текущим терапевтическим методам. В этой связи стоит отметить результаты, полученные Fulda с соавт. [272]. Оказалось, что одновременное ингибирование сурвивина и индукция белка р21 препаратом ресвератролом, стимулировало клетки глиом к TRAIL-терапии. Похожий аддитивный эффект TRAIL-терапии наблюдался в комбинации с эпотилоном B[273] и 17AAG [274]. Другая группа исследователей предложила использовать в терапии глиом химический ингибитор клеточной трансглутамазы [275]. По мнению авторов, в экспериментах in vitro ингибитор трансглутамазы вызывал активацию AKT – сигнального пути и снижал экспрессию антиапоптотического гена сурвивина. Последующее введение этого ингибитора мышам, несущим подкожную модель глиомы DBT, способствовало усилению терапевтического эффекта препарата кармустина (BCNU). В дополнение к этому, недавние исследования, проведенные Kang с соавт., показывают, что ингибирование рецепторов, индуцирующих пролиферацию пероксисом в клетках А172 с помощью синтетического агониста циглитазона, вызывало независимую от каспаз клеточную смерть [276]. Как оказалось, на молекулярном уровне отсутствие расщепления гена каспазы 3 сопровождалось экспрессией реактивных форм кислорода (ROS) и ингибированием белков-ингибиторов апоптоза, включая сурвивин. Похожие результаты были получены в работах Jeong с соавт. [277], Sangeetha с соавт. [278], Yang с соавт.[279] и Johnson с соавт. [280]. Участие гена сурвивина в регуляции ангиогенеза, пролиферации и химиорезистентности привлекает повышенное внимание к этому гену как к потенциальной мишени для таргетной терапии. Поскольку применение 47 химиопрепаратов часто вызывает фенотипические и генотипические изменения в опухолях, ведущие к рекуррентности, разработка альтернативных методов терапии позволяет улучшить прогноз больных с глиомой. В настоящее время результаты исследований, представленые Temme с соавт., Hendrusck с соавт., Xu с соавт ., подтверждают мнение, что ингибирование мРНК сурвивина с помощью антисмыловых молекул, доставленных в клетку, может иметь терапевтическое значение [281-283]. Однако, несмотря на значительное ингибирование роста подкожной модели глиомы, выращенной на мышах, существующее ограничение по доставке антисмысловых молекул в каждую опухолевую клетку in vivo, может ограничить использование данного метода в клинической практике. Использование транскрипционной активности гена сурвивин для доставки терапевтических рекомбинантных нуклеиновых кислот было впервые продемонстрировано Kamizono с соавт. [284], и подтверждено нами [84, 180]. Применение промотора гена сурвивина человека, контролирующего экспрессию цитотоксических продуктов области аденовируса Е1А, усиливало онколитические свойства рекомбинантного аденовируса, а также его применение как антиглиомного терапевтического агента в качестве монотерапии, либо в комбинации с ионизирующей радиацией [285] или темозоломидом [286]. Несмотря на значительный прогресс в контроле вирусной инфекции, с помощью модификации поверхностных вирусных белков и глиомаспецифического промотора сурвивина, токсичность онколитического вируса для здоровых клеток продолжается оставаться проблемой. По-видимому, присутствие в геноме аденовируса дополнительных транскрипционных кластеров в инвертированных терминальных повторах способствует активации транскрипции вирусных мРНК, что вызывает нежелательную вирусную цитотоксичность здоровых клеток. В этой связи двойной контроль над уровнем экспрессии вирусных генов путем клонирования промоторов генов теломеразы и сурвивина может уменьшить нежелательную вирусную цитотоксичность здоровых клеток [287]. 48 ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Клинический материал Клинические образцы опухоли головного мозга человека и морфологически нормальной ткани головного мозга, полученной в результате резекции участка головного мозга у больных с эпилепсией, были получены в результате оперативных вмешательств. Всего проанализировано более 200 образцов от больных в патологической службе отделений нейроонкологии Университета Чикаго, штат Иллинойс, США и нейропатологии Центра передовых методов лечения опухолей головного мозга, Шведского Медицинского Центра, г. Сиэтл, США и Российского онкологического научного центра (Москва, Россия). Для анализа клеточной фракции мРНК использовали 50 образцов с диагнозом «глиобластома» и 20 образцов головного мозга от пациентов с эпилепсией. Отсутствие злокачественных образований в патологическом материале пациентов с диагнозом «эпилепсия» было подтверждено патологоморфологически. Средний возраст пациентов с опухолями головного мозга был 52.3±8.41. 2.2. Клеточные линии 2.2.1. Перевиваемые клеточные линии В данной работе были использованы следующие линии клеток: HEK293 (клетки почки эмбриона человека), 911 (клетки ретинобластомы человека) М59К, D54MG, D65 были получены от д-р. Zeng Zhu (Gene Therapy Center University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, США). A549 (клетки аденокарциномы легкого человека), глиобластома человека: U87, U118, и U373 (получены из Американской коллекции микроорганизмов, ATCC, Маннассас, США), клетки U251 получены от д-р. I. Ivankov (Mayo Сlinic, Rochester, США), N10 и KINGS (получены из японской коллекции клеточных линий, г. Токио, Япония). Клетки: 49 М59К, D54MG, D65, HEK293, U87, и U118 культивировали в МЕМ-среде, а A549, U251, N10 и Kings в МЕМ с двойным набором при температуре 37°С и 5% СО2. Питательные среды содержали 10% фетальную бычью сыворотку, инактивированную при температуре 56°С в течение 30 мин, 2 мM l глутамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 мкг/мл сульфата стрептомицина (Life Technologies, США). Клетки достигшие логарифмической фазы роста, пассировали в 24- и 96луночные планшеты («Costar»). Жизнеспособность клеток определяли по исключению красителя трипанового синего («ПанЭко», Россия). Подсчет клеток проводили в камере Горяева. 2.2.2. Первичные линии клеток пациентов с диагнозом «глиобластома» Первичные ограниченно перевиваемые (до 6 пассажа) линии клеток глиобластомы человека ГБМ 1-16 и 71 получены в Шведском медицинском центре/Центре Экспериментальной Терапии и Российском онкологическом научном центре. 2.2.3. Типирование клеток глиобластомы Тотальная мРНК была изолирована, с использованием Trizol (Invitrogen-Life Technologies, Grand Island, Нью-Йорк, США) и, очищена с использованием набора «RNeasy MinElute Cleanup» (Qiagen, США). Один микрограмм тотальной РНК был использован для получения 100 микролитров кДНК, с испрользованием набора «High Capacity cDNA Reverse Transcription» (Applied Biosystems, США). Для детекции 33 генов был проведен количественный ПЦР, и в каждом образце дельта Ст была нормализована к экспрессии GUS, используя 2−(Ct value of gene – Ct value of hGUS с помощью машины ABI PRISM 7900 HT и 33 taqman проб (Applied Biosystems). Условия для реакции были следующие: 95°C 10 мин, 40 циклов при 95°C 15 сек и 60°C 1 мин, используя ген GUS как внутренний контроль. Для каждого гена было получено среднее значение ct () и стандартное отклонение (). Подсчет (z) для 50 каждого из 33 генов в образце был произведен по формуле: zg = ctg – / g , где g панель из 33 генов. Три компонента 1.Мезенхимальный (M), 2.Пролиферативный-Классический (P) и 3. Пронейральный (N) были подсчитаны как среднее от z величины, принадлежащей соответствующим компонентам. M = (zg), где g компонент Мезенхимальный P = (zg), где g компонент Пролиферативный N = (zg), где g компонент Пронейральный В конце принадлежность к подтипам определяли по формуле[288]: Мезенхимальный M > P + 0.2, M > N + 0.2 Пролиферативный P > M + 0.2, P > N + 0.2 Пронейральный N > M + 0.2, N > P + 0.2 Пролиферативно-Мезенхимальный P > N + 0.2, M > N + 0.2, |P-M| < 0.2 Мезонейральный M > P + 0.2, N > P + 0.2, |N-M| < 0.2 Пролиферативно-Нейрональный P > M + 0.2, N > M + 0.2, |N-P| < 0.2 2.3. Химические реагенты Верапамил был получен из Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, США). В качестве растворителя для верапамила использовали диметильсульфоксид (ДМСО). Для тестов in vitrо использовали стоковый раствор, из которого готовили ряд десятикратных разведений в среде ДМЕМ. Темодал (Temozolomide), ингибитор клеточного белка р53 (PFTalpha), двухпроцентный водный раствор акридина оранжевого (Acridine Orange) и пропидиум иодида (PI, 1мг/мл) были получены из компании Sigma-Aldrich (St Luis, Mo, США). В качестве растворителя для темодала и ингибитора р53 использовали диметилсульфоксид (ДМСО) с целью получения 100µМ раствора темодала [286] и 20мМ раствора -PFTa (1000x раствор, [289]). 51 2.4. Получение и характеристика аденовирусных векторов 2.4.1. Получение и характеристика аденовирусных векторов, дефектных по репликации Дефектные по репликации аденовирусные Ad5/5GFP, Ad5/3GFP, Ad5/11GFP и Ad5/35GFP были описаны ранее [290, 291]. Данные векторы содержали ген GFP под контролем промотора CMV. Дефектный по репликации Ad5∆E1∆E3∆Fib был получен от д-р. Dan Von Seggern (Университет Лахойа, США) и содержал делецию в Е3, L5(фибер) и Е1(ген люциферазы под контролем промотора CMV) [292]. Дефектный по репликации RGD-luc, Pk7 Luc, Cav1Luc и Cav2Luc были предоставлены д-р. Zheng Zhu (GTC, UAB, США). 2.4.2. Использование онколитических вирусов ONYX015 и ∆24 Онколитический вирус ONYX015 был предоставлен д-р. David Ornelles (Wake Forrest University, США). Вирус ∆24 был получен от д-р. Juan Fueyo (MD Anderson Cancer Center, США). 2.4.3.1. Получение самореплицирующихся аденовирусных векторов CRAd-SpK7, CRAd-S-5/3, CRAd-S-RGD Для указанных исследований в качестве исходного материала была выбрана плазмида pAd.hSurvivin. Данная плазмида основана на pBluscriptSK+, производной от pBR322, и содержит последовательности аденовируса типа 5 с 1-й по 5788-ю пару оснований с делецией оснований 4357-3327. Вместо делеции Ad5 357-3327 введена транскрипционная кассета, состоящая из сигнала полиаденилирования, промотора гена сурвивина человека и полилинкера для клонирования рекомбинантных ДНК. Таким образом, получен типичный вектор, позволяющий клонировать терапевтические и рекомбинантные ДНК под контролем промотора гена сурвивина человека и не содержащий делеции генов 52 E1А и E1B Ad5. ДНК Ad5 была получена из коллекции клеток и организмов (АТСС). Один (1) мкг плазмиды pAd.hSurvivin, был обработан 20 единицами каждого из ферментов Spe 1 и Pme I в соответствии с рекомендациями производителя. Рестрикционные смеси были нанесены в лунки 1,0%-ного раздельных агаровых гелей и подвергнуты электрофорезу при 100 вольтах мощности в течение 2 часов. Рестрикционный фрагмент, соответствующий 3000 пар нуклеотидов, был выделен из геля при помощи смолы для экстракции ДНК. Рестрикционный фрагмент 3000 пар нуклеотидов, из плазмиды pAd.hSurvivin (1 мкг) смешивали в соотношении 3: 1 с ДНК векторов Ad5/3GFP, Аd5/5GFP, Ad5/11GFP, Ad5/35GFP (100 нг/мкг), полученных от д-р. Andre Lieber (University of Washington, Department Human Genetics) или Ad5/5-RGD, pvk50-pK7(оба получены от д-р. Давид Сuriel, Центр генной терапии (Университет Алабамы в Бирмингеме, Алабама, США) и добавляли к бактериальным клеткам Е.соli штамма Bj5183 перед электропорацией. Вслед за электропорацией к клеткам добавляли 500 микролитров бактериальной обогащенной среды и высевали по 50 микролитров на твердую питательную среду (LB-агар), обогащенную канамицином. По устойчивости к канамицину отбирали бактериальные колонии, которые инокулировали в 2-мл культур ростовой среды LВ для последующего подращивания в течение ночи при 37oC и при постоянном встряхивании. Из каждой бактериальной культуры была выделена плазмидная ДНК. Три четверти выделенной ДНК было обработано ферментом PacI (5 единиц на ДНК) в течение 2 часов для отбора "правильного" рекомбинанта, содержащего рестрикционные фрагменты PacI в 3627 и 31000 пар оснований. Три из 20 проверенных образцов содержали искомый рекомбинант. Один из данных клонов был использован для трансформации E.coli DH5-альфа, последующей инокуляции 1-литровой культуры в среде LB и выделения больших количеств плазмидной ДНК. После инкубации в течение ночи из 1-литровой культуры была выделена 53 ДНК с помощью колонок Qiagen согласно рекомендациям производителя. Полученная плазмида была обозначена pAd-CRAdS5/3. Для конструирования рекомбинантного аденовируса 40 мкг плазмиды pAdCRAdS5/3- линеаризовали 40 единицами рестриктазы Pac I, и десять (10) мкг рестрицированной pAd-CRAdS5/3 использовали для трансфекции приблизительно 10(6) клеток HEK293 с помощью липосомного набора для трансфекции клеток млекопитающих согласно рекомендациям производителя. Через десять (10) дней на трансфицированных клетках был виден цитопатический эффект, индуцированный аденовирусом. На 13-й день после трансфекции из клеток по стандартной методике (Graham and Prevec., 1991) выделяли ДНК и проводили рестрикционный анализ при помощи рестриктазы PacI. Экспрессию фибера, гексона экспрессирующего рекомбинантным аденовирусом, проверяли в реакции иммуноблоттинга с антителами 4D2 (Neomarkers, США). 2.4.3.2. Получение CRAd-S-5/3shMMP14 и CRAd-S-5/3shScrambled Геном самореплицирующегося вектора CRAd-S-5/3shMMP14, содержащий промотор U6 управляющий экспрессией антисмысловой РНК к металлопротеиназе (MMP14) человека, был получен в результате двухэтапного клонирования [293, 294], с использованием генома Ad5ΔE1/ΔE3/ΔF [295], описанного ранее и шаттл плазмиды Е1, содержащей аденовирусные гены Е1 под контролем промотора гена сурвивина человека [134, 296]. На первом этапе промежуточная плазмида Ad5ΔE1/ΔE3:U6Pr-shRNA MMP14, F5/3 была получена в результате гомологичной рекомбинации между вектором Ad5ΔE1/ΔE3/ΔF и Pac. I-обработанный шаттл плазмиды pShuttle-∆E3ADP-KanF,U6Pr-MMP14shRNA,F5/3, содержащей делецию в области Е3, кроме аденовирусных генов области E3A:12.5K и 11.6K – ADP. Этот вектор был получен из pShuttle-∆E3-ADP-Kan, F5/3 с помощью клонирования U6Pr-MMP14 shRNA даунстрим ADP вместо генов Е3, с использованием набора праймеров для ПЦР: 54 прямой GGAGCGTCGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAG3’; 5’ACAGGGTCGACAAGCTTGATCTTTCTTCTGCTTAGT3’ (обратный). Клонированный продукт был субклонирован в Sal-I сайт плазмиды pShuttle-∆E3ADP-Kan, F5/3 ниже Swa-I сайта, фланкирующего ген устойчивости к Канамицину (Kan). Этот вектор был описан как производный от вектора, описанного ранее Ono с соавт. [297]. Рекомбинантные клоны были проскриннированы и отобраны, впоследствии вектор Ad5ΔE1/ΔE3: U6Pr-MMP14shRNA,F5/3 был линеаризован по Pme I, сиквенирован и после линеаризации – Pac-I плазмиды были использованы для трансфекции HEK293, с помощью липофектамин 2000 реагента (Invitrogen-Life Technologies, Grand Island, NY, США). 2.5. Титрование аденовирусных векторов 2.5.1. Определение оптической плотности вирусной суспензии Теоретически аденовирусная частица содержит в себе порядка 87% белка и 13% ДНК. Концентрация вирионов измеряется спектрофотометрически при длине волны 260 нм в присутствии 0.1% раствора SDS, разделяющего белки и ДНК. В кювету спектрофотометра загружается 500 микролитров 0.1% SDS и снимаются показатели негативного контроля при 260 и 320 нм. Затем измеряются десятичные разведения вируса в объеме 500 микролитров, приготовленном на 0.1% растворе SDS последовательно при оптических плотностях 260 и 320 нм. При этом оптическая плотность раствора аденовируса должна находиться в пределах 0.11.0 оптических единиц. Концентрацию вирусных частиц определяли как среднее значение между двумя повторами по формуле: (оп (260)- оп (320) Х разведение Х 1.1X10(12) вирусных частиц, где оп – оптическая плотность при длине волны 260 и 320 нм. 55 2.5.2. Бляшкообразование Титрование рекомбинантных аденовекторов было произведено с использованием метода, описанного раннее [20, 298] и модифицированного нами. Клетки глиобластомы человека были выращены в 48-луночном планшете в концентрации 50’000 клеток на лунку. На следующий день клетки были инфицированы аденовирусами в дозе 10 инфекционных доз на клетку. Спустя двадцать четыре часа, клетки были трипсинизированы, промыты PBS и ресуспендированы в 100 мкл бессывороточной среды. После трехкратного размораживания или оттаивания клеточный лизат был центрифугирован, и 20 мкл было добавлено к 180 мкл бессывороточной среды, находящейся в каждой лунке (разведение минус 1). Вдальнейшем, серийные разведения шагом 1/10 и объемом 20 мкл были доведены до разведения минус 12 включительно. В течение 10 дней вирус инфицировал монослой НЕК293 и вирусный титр был определен на основе количества бляшек в соответствующем разведении, умноженном на 0.02 (Quantum Biotechnology, Карлсбад, Калифорния, США). 2.5.3. Определение инфекционного титра методом окраски клеточного монослоя антителами против гексона аденовируса Способности рекомбинантного вируса выделять вирионы были проанализированы, с использованием набора «Adeno-XTM Rapid Titer» (#pt3651-2, Clontech, США). Клетки линии НЕК293 были выращены в 24-луночных планшетах в концентрации 25,000 клеток на лунку. Серийные разведения рекомбинантного вируса, полученного после разрушения клеточных лизатов, были использованы для получения разведений, начиная с 10(-2). Пятьдесять микролитров вирусной суспензии были добавлены к каждой лунке, содержащей клетки для последующей инкубации в течение 48 часов. В назначенное время клетки были зафиксированы 100% метанолом, промыты PBS, после чего 1:1000 разведение первичных мышиных антител, узнающих гексон аденовируса серотипа 56 5, было добавлено в составе PBS. После 1-часовой инкубации клеток с антителами против гексона при температуре 37ºС монослой клеток был трехкратно промыт и вновь проинкубирован с вторичными пероксидаза-конъюгированными антителами, выращенными в крысе (разведение 1:500, приготовлено на PBS, содержащем 1% БСА). После одного часа инкубации клетки были промыты PBS и субстрат DAB был добавлен в разведении 1:10 к каждой лунке. Десять минут спустя DAB был заменен на PBS, после чего число коричневых позитивных клеток было подсчитано в монослое при увеличении микроскопа по формуле, предложенной компанией-производителем. 2.6. Биоинформатический анализ экспрессии генов с использованием баз данных TCGA, Oncomine и Rembrandt Зависимость выживаемости пациентов с опухолями головного мозга различной степени злокачественности от уровня экспрессии сурвивина, MMP14, CD46, САR, и DSG2 была изучена, с использованием баз данных TCGA (Геномный проект по исследованию опухолей, США, cancergenome.nih.gov), Oncomine (Университет штата Мичиган, США) и Rembrandt (Repository of Molecular Brain Neoplasia Data, Национальный Институт Рака, США, http://rembrandt.nci.nih.gov). 2.7. Флуороцитометрический анализ клеточных популяций 2.7.1. Экспрессия клеточных рецепторов Клеточный монослой был промыт PBS, и трипсинизированные клетки были ресуспендированы в PBS, содержащем 1% бычью сыворотку и 0,1% азида натрия, в концентрации 1х10(5) клеток на мл. Одинаковое количество клеток было проинкубировано с 1 мкг/мл антител, узнающих: рецептор CAR (клон RmcB, любезно предоставленный д-р. Joanne Douglas (Центр Генной Терапии, 57 Университет Алабамы в г. Бирмингем, США), CD46 (ab175096, Abcam, Cambridge, MA, США), Syndecan1/CD138 (NB100-64980, Novus Bio), Perlecan (NB600-583, Novus Bio), intregrin b3(MAB1920, Chemicon-Millipore, Billerica, MA, США), b5(AB1926, Chemicon-Millipore, Billerica, MA, США), av(MAB1876, ChemiconMillipore, Billerica, MA, США), DSG2 (#5180, Epitomics-Abcam) человека или изотопический контроль (Santa Cruz Biotechnology). Инкубация проводилась в течение 1 часа при температуре +4ºС Затем не связавшиеся антитела были отмыты путем трехкратного промывания клеток PBS. Далее, к клеткам был добавлен 1 мкг/мл вторичных антител, конъюгированных с FITC (антимышиный конъюгат, #554001, BD Bioscience- Pharmingen, Сан-Диего, США) или ALEXA 586 в PBS, содержащий 1% БСА. Спустя один час клетки были промыты излишним количеством PBS и проанализированы в проточной цитофлуориметрии, с использованием оборудования FACsARIA II (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, США). Процент клеток, экспрессирующих поверхностные рецепторы, был найден путем определения популяции клеток, не содержащих таргетный белок (негативный контроль) против популяции клеток, расположенных вне этой области. Соответствующее среднее значение интенсивности флуоресценции (mean to mean ratio) было определено для каждого образца против соответствующего негативного контроля. Для определения FITC- негативной популяции клеток в каждом образце клетки были проинкубированы с PBS, содержащим 1% бычьей сыворотки и только вторичными антителами. 2.7.2. Анализ аутофагии Анализ присутствия клеточных вакуолей с двухслойной мембраной был проведен с использованием акридина оранжевого (Acridene Оrange, АО). Клетки, обработанные химиопрепаратом или инфицированные вирусом в соответствующей концентрации, были трипсинизированы в определенное время и затем центрифугированы. Клеточный осадок был промыт дважды раствором PBS 58 (фосфатный буфер) и окрашен 2%раствором АО, затем зафиксирован в 70% этаноле перед окраской иодидом (PI, 50 мг/мл) в течение 4 часов. Анализ распространения клеток по фазам клеточного деления был осуществлен с помощью проточной цитофлуориметрии. Данные были получены по результатам анализа 10,000 клеточных событий. 2.7.3. Анализ клеточного деления Анализ клеточного деления был проведен с использованием пропидиум иодида (PI). Клетки, обработанные химиопрепаратом или инфицированные вирусом в соответствующей концентрации, были трипсинизированы в определенное время и затем центрифугированы. Часть клеточного осадка была дважды промыта раствором PBS, затем в течение 4 часов фиксировалась в 70% этаноле при температуре -20ºС, после чего окрашивалась смесью пропидиум иодида (PI, 50 mg/ml, 1000x раствор) и РНКаза (100 мг/мл, 10х раствор) при комнатной температуре на протяжении 30 мин. Анализ распространения клеток по фазам клеточного деления (G1, S, G2) был осуществлен с помощью проточной цитофлуориметрии и компьютерной программы FloJo. На первом этапе популяция живых клеток была выделена путем разделения клеток по их размерам (FSC) и гранулярности (SSC). На втором этапе изолированная популяция живых клеток была разделена по длине волны PЕ 575/26 и проанализирована с помощью платформы клеточного цикла. Данные были получены после анализа 10,000 клеточных событий. 2.7.4. Детекция апоптоза с использованием антител против Аннексина Клеточные линии были выращены в 6-луночном планшете в концентрации 2х10(5) клеток на лунку. На следующий день часть клеток была инфицирована вирусом (100 инфекционных доз на клетку). Не связавшийся вирус был удален, клетки были промыты PBS, после чего ростовая среда, не 59 содержащая/содержащая химиопрепарат, была добавлена к клеткам. Клетки были трипсинизированы в назначенное время (24, 48 или 72 часа после начала эксперимента), промыты PBS и окрашены реагентами из набора «Annexin V-FITC apoptosis» (#556419, BD Biosciences, г. Сан Диего, Калифорния, США) в соответствии с рекомендациями компании- производителя. Анализ клеток с потерянной в процессе раннего апоптоза асимметрией мембран был произведен с помощью оборудования FACscan (Becton Dickinson, г. Маунтин Вью, Калифорния, США) с последующим анализом данных проточной цитофлуориметрии с помощью программы CellQuest (Becton Dickinson). 2.7.5. Клеточное разделение с использованием FACS Клетки были разделены на основании типа флурохрома, использованного для мечения клеток. Исследуемые клетки трипсинизировали смесью трипсинверсен, трехкратно промывали холодным PBS, содержащим 0.1% ФБС и -20 мМ азида натрия (FACs буфер). Окраску клеток проводили антителами в концентрации 2 мкг/мл в течение 30 минут, после чего промытые PBS меченые клетки ресуспендировали в минимальном объеме. Разделение проводили с использованием оборудования FACsAria II. Полученные клетки после разделения по флуоресцентным маркерам смешивались со свежей порцией ростовой среды, содержащей противогрибковый антибиотик Fungizone. 2.8. Количественный ПЦР 2.8.1. Количественный ПЦР клеточных и вирусных мРНК Смеси клеточной и вирусной ДНК, а также РНК были экстрагированы из клеточного монослоя или тканевых срезов (5µ) с использованием наборов «DNeasy tissue Isolation» (Qiagen), «RNeasy mini» или реагента TRisol (Invitrogen- 60 Life Technologies, Grand Island, NY, США). Концентрация и качество выделенных ДНК и РНК были определены спектрофотометрически с помощью Nanodrop, а также с помощью Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies), как описано ранее [299]. Затем РНК была конвертирована в кДНК с помощью набора «iScriptTM cDNA synthesis» (#170-8890, Bio-Rad, Hercules, Ca, США). Для реакции количественного ПЦР были использованы «Syber GreenER Super Mix» (InvitrogenLife Technologies, Grand Island, NY, США) и амплификатор «OPTICON 2 Detection System» (Bio-Rad). Соотношение E1A или Е4 к количеству использованной в реакции ДНК, кДНК гена сурвивина, CXCR4, MK к клеточному кДНК гена GAPDH было определено в каждом образце. Последовательности праймеров были описаны нами ранее для E1A, E4, CXCR4, MK, GAPDH [83, 133] Все праймеры амплифицируют участки, соответствующие 15-230 пн. 2.8.2. Количественный ПЦР клеточных микроРНК Смеси клеточной микроРНК и РНК были экстрагированы из клеточного монослоя с использованием набора «RNeasy tissue» (Qiagen). Концентрация и качество выделенной общей РНК были определены спектрофотометрически с помощью Nanodrop, а также с сипользованием Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, Ca, США) как описано ранее [299]. Затем РНК была конвертирована в кДНК с помощью набора «iScriptTM cDNA synthesis» (#170-8890, Bio-Rad, Hercules, Ca, США). Для реакции количественного ПЦР были использованы набор «Syber GreenER Super Mix» (Invitrogen-Life Technologies, Grand Island, NY, США) и амплификатор «OPTICON 2 Detection System» (Bio-Rad, Hercules, Ca, США). Соотношение уровня клеточной микроРНК к уровню контрольной микроРНК (SNORD47) было определено для каждого образца. 61 2.8.3. Количественный анализ экспрессии генов методом ПЦР в 96-луночном планшете (Array) РНК контрольных и/или обработанных химиопрепаратом или вирусным агентом, была выделена набором «RNeasy Plus mini» (Qiagen). Качество выделенной РНК было установлено спектрофотометрически и с помощью «Agilent 2100 Bioanalyzer». Для определения уровня экспрессии 100 нг РНК было конвертировано в кДНК с помощью набора «RT2 First Strand» (Qiagen, США) и затем проанализировано в 96-луночном планшете, содержащем праймеры к проангиогенным факторам (array growth factors), генам, участвующим в реакции аутофагии (array autophagy) и апоптоза (array apoptosis). Сравнительная экспрессия клеточных антигенов была проведена после нормализации каждого из образцов к уровню контрольного гена GAPDH. Анализ экспрессии проводился программой для анализа результатов, предоставленной компанией-производителем. 2.8.4. Количественный анализ экспрессии клеточных микроРНК методом ПЦР в 96-луночном планшете (miFinder Array-микрочип) МикроРНК контрольных, обработанных химиопрепаратом или вирусным агентом клеток, находящихся в логарифмической фазе роста в количестве 100,000 клеток, была выделена набором «miRNeasy Mini» (Qiagen) согласно рекомендациям компании-производителя. Клеточная микроРНК из парафиновых срезов толщиной 10 микрон, была выделена набором «miRNeasy FFPE» (Qiagen), также в соответствии с рекомендациями компании-производителя. Качество выделенной РНК, обогащенной клеточной микроРНК, было установлено спектрофотометрически и с помощью «Agilent 2100 Bioanalyzer». Затем 25 нг РНК было транскрибировано в ДНК с помощью набора «miScript II RT» в объеме 20 мкл. Экспрессия клеточных микроРНК производилась в соответствии с протоколом компании Qiagen с использованием набора «miScript SYBR Green PCR» (также Qiagen), содержащим универсальный праймер к ДНК и смесь 62 компонентов «SYBR Green». Реакцию проводили в 96-луночном планшете, условия для циклирования были следующими: первоначальная активация при температуре 95ºС в течение 15 мин, 40 циклов реакции, после нормализации к уровню начинающихся с 94ºС денатурации 15сек, связывание при 55ºС в течение 30сек и достраивание при 70ºС в течение 30сек. Анализ распределения уровня экспрессии производили методом ∆∆СT клеточной микроРНК SNORD47 с помощью программы для анализа результатов количественного ПЦР, предоставленной компанией-производителем. 2.9. Определение экспрессии клеточных и вирусных антигенов с помощью иммунофлуоресценции 2.9.1. Клетки глиобластомы U87MG, U373MG, Kings, A172, U118MG, No. 10 и аденокарцинома яичников (HeLa) человека были выращены на обработанных полилизином покровных стеклах размером 24х24 в плотности 2х10(5) клеток на покровное стекло. На следующий день, клетки были промыты PBS и часть из них была трансфицирована 20 пМ антисмысловой РНК против белка человека Beclin-1 (BECN1, Santa Cruz Biotechnology, CA, США) в бессывороточной среде при температуре 37ºС. Два часа спустя клетки были инфицированы вирусом в различной множественности инфекции в течение 4 часов, после чего вируссодержащая среда была заменена на ростовую, содержащую 10% фетальной телячьей сыворотки. В назначенное время (24, 48 или 72 часа после начала эксперимента), клетки были промыты PBS, и в течение 30 мин фиксировались при комнатной температуре в растворе 4% формальдегида, приготовленного на PBS. Часть покровных стекол была проинкубирована с поликлональными антителами против белка сурвивина (RB-1629-P0, Lab Vision-Thermo Scientific Corp, США), клеточного Beclin-1 (клон H-300, Santa Cruz Biotechnology, США) и 63 аденовирусного E1A (клон M58, Lab Vision-Thermo Scientific Corp, США) или с изотопическими контролями (Santa Cruz Biotechnology, США). Спустя 1 час инкубации клетки с несвязавшимися антителами были трехкратно промыты PBS. Затем были добавлены вторичные антитела для определения белка сурвивина: FITC-конъюгированные IgG антикроличьи антитела (FI-1000, Vector Laboratories, Бюрлингам, Калифорния, США), FITC-конъюгированные IgG антимышиные антитела (FI-2020, Vector Laboratories, Бюрлингам, Калифорния, США) либо Texas-red конъюгированные антикроличьи антитела (TI-1000, Vector Laboratories Бюрлингам, Калифорния, США). Ядра клеток были окрашены 4,6-diamino-2phenylindol (DAPI, Sigma-Aldrige, Св Луис, Миссури, США). Фотографии были получены с помощью конфокального микроскопа и проанализированы с помощью программы (LAS AF, version 1.6.0. Microsystems) компании Leica. 2.9.2. Цитологический метод окрашивания клеток, имеющих фрагментацию ДНК TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling) был произведен согласно рекомендациям компании-производителя Roche (США) для набора «in situ cell death detection». 2.10. Определение клеточной цитотоксичности с помощью электронного микроскопа Клетки глиомы человека, выращенные при плотности монослоя 300,000 клеток на лунку и инфицированные/или не инфицированные вирусом, были специально приготовлены для анализа сканирующим электронным микроскопом. Срезы толщиной 600нм были проанализированы с помощью микроскопа Hitachi H7000. 64 2.11. Ангиогенез: формирование тубул 50 микролитров размороженного геля, содержащего экстраклеточный матрикс, было внесено в лунку 96-луночного планшета для дальнейшей полимеризации при температуре 37ºС в течение 1 часа. Затем к каждой лунке были добавлены 150 микролитров эндотелиальных клеток в концентрации 1x10(5) на 1% среде, содержащей фетальную бычью сыворотку. В течение 4-18 часов клетки были проанализированы в световом микроскопе с целью формирования «клеточных розеток», и среднее значение розеток в 3х лунках было занесено в таблицу. 2.12. Анализ экспрессии ангиогенных факторов в клеточных лизатах Для определения белков было использовано 500 микрограммов клеточного лизата, полученного путем трехкратного размораживания и оттаивания и измеренного с помощью реактива Брадфорда. 200 микрограммов клеточного лизата, осветленного низкоскоростным центрифугированием, было проинкубировано с мембраной, содержащей 24 антитела к ростовым факторам человека, участвующим в реакции ангиогенеза. Приготовление лизатов и последующая инкубация была произведена в соответствии с рекомендациями компании-производителя (RayBiotech, Inc., США). Детекцию экспрессии антигенов производили путем инкубации мембраны с биотин-конъюгированными вторичными антителами и стрептавидин-пероксидазным конъюгатом. Окраску проводили методом хемилюминесценции, и ответ был представлен как процент экспрессии белков по отношению к позитивному контролю. 2.13. Анализ экспрессии клеточных лизатов с помощью вестерн-блоттинга в ПААГ Клетки, выращенные в 6-луночном планшете, были обработаны химиопрепаратом и инфицированы онколитическим вирусом (ОВ, 5 ИЮ/мл) или 65 комбинацией химиопрепаратов в присутствии или отсутствии различных ингибиторов, таких, как PFTa (p53), Baf A1(Бафиломицин А), 3Ma (3methyladenine). 72 часа после начала эксперимента клетки были лизированы в буфере, содержащем 50мM HEPES, 0.15 M NaCl, 0.5% Nonidet P-40 и смесь протеиназных ингибиторов. Белковые фракции были исследованы в 10% ПААГгеле и перенесены на поливинилидин-дифлуорид-мембрану (PVDF, Bio-Rad, США). Мембраны были проинкубированы с первичными антителами p53 (клон DO-1), E1A (клон M58), pб2 (клон C-15), и Актин (клон с-2), все из компании Santa Cruz Biotechnology (США). Связанные первичные антитела были детектированы с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена Santa Cruz Biotechnology (США). Детекцию белковых фракций проводили с помощью реакции хемилюминесценции согласно инструкции к набору (Bio-Rad, Hercules, США). 2.14. Определение токсичности реагентов in vitro окраской красителем трипановым синим Для окраски использовали раствор 0.4% трипанового синего, приготовленного на PBS (pH=7.2). Исследуемые клетки трипсинизировали раствором трипсин-версен, центрифугировали при скорости 4,000 оборотов в минуту, промывали двукратно PBS. Для определения токсичности 0,1 мл раствора трипанового синего добавляли к 0,1 мл суспензии клеток, ресуспендированных в ростовой среде. Подсчет клеток велся в гематоцитометре при низком увеличении (10х). Подсчет клеток, содержащих голубую окраску, проводился по формуле: (N/4)X 2X10(4), где N – количество клеток, подсчитанных в 4 больших квадратах гематоцитометра, 2 – фактор разведения, 10(4) – фактор в пересчете на миллилитр клеточной суспензии. 66 2.15. Определение клеточной пролиферации и токсичности с помощью МТТ-реагента 2.15.1. Ингибирование пролиферации клеток вирусом Опухолевые клетки культивировали при температуре 37ºС в присутствии 5% СО2 в среде ДМЕМ, содержащей 2 мМ L-глутамина и 10% фетальной бычьей сыворотки (Atlanta Bio, Atlanta, США). Клетки, достигшие логарифмической фазы роста, пассировали в плоскодонных 96-луночных микропланшетах (Costar, США) по 5’000—6’000 клеток на лунку и инкубировали в указанных выше условиях в течение 24 часов перед добавлением тестируемого вещества. Для определения цитотоксичности клеточные линии были выращены в 96-луночном планшете, после чего к каждой лунке были добавлены или разведения химиопрепарата, или инфекционные частицы вирусов в разной множественности инфекции (ИЕ/мл) . Спустя 72 часа после инфекции к каждой лунке было добавлено 200 микролитров 3-(4,5-dimethylthiazol-2уl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, приготовленного на буфере (PBS) . Через 4 часа после инкубации при 5% CO2 и 37°C, к каждой лунке добавили 0,1 мл ДМСО для ингибирования метаболической реакции и разрушения формазана активно делящимися клетками. Оптическое поглощение было измерено при длине волны 540 нм. Жизнеспособность клеток в присутствии реагента (химиопрепарата или вируса) производили по исключению красителя трипанового синего (Fisher Scientific, США). 2.15.2. Ингибирование пролиферации клеток в присутствии химиопрепаратов Стоковые растворы ингибиторов Темозоломид, PFTa и GLI были приготовлены с использованием диметисульфоксида или деионизованной воды и впоследствии использованы для получения разведений. Разведения в широком диапазоне концентраций добавляли в лунки к смеси клеточной среды с клеточной 67 культурой и инкубировали в течение 72 ч. Диапазон концентраций химиопрепаратов варьировался от 10мг/мл до 10нг/мл. В контрольные лунки добавляли раствор ДМСО или деионизованную воду в том же объеме. Уровень клеточного метаболизма по окончании периода инкубации определяли с помощью стандартного МТТ-колориметрического метода (МТТ – 3-(4,5-диметилтиазол-2ил)-5-(3-кар боксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолиум). Оптическое поглощение окрашенных растворов диметилсульфоксида измеряли на планшетном фотометре «Multiskan MS» (Labsystem, Финляндия) при λ = 570 нм. Влияние тестируемых растворов соединений на жизнеспособность клеточной культуры оценивали по формуле: (Nо/Nк) × 100%, где No —оптическое поглощение в опытных пробах; Nк – оптическое поглощение в контроле. Для каждого химиопрепарата методом нелинейной регрессии рассчитывали ингибирующую концентрацию фермента в среде, которая вызывала снижение количества живых клеток на 50% (IC50). 2.16. Детекция поврежденных клеток в реакции клеточной цитотоксичности (LDH) Клетки глиобластомы человека в концентрации 1х10(4) клеток на лунку 96луночного плоскодонного планшета были выращены за 24 часа перед обработкой вирусом (множественность инфекции 100), химиопрепаратом или их комбинацией. После 4 часов адсорбции вируса в среде, содержащей 2% фетальную сыворотку, клетки были трехкратно промыты PBS, и ростовая среда, содержащая или не содержащая 10 µМ ингибитора каспаз z-VAD-FMK (#G7231, Promega, Wi, США) была добавлена к клеткам. Через семьдесят два часа после начала эксперимента уровень внутриклеточной лактадегидрогеназы (LDH), выделенной при поврежденной мембране, был измерен с помощью набора «CytoTox One homogeneous membrane Integrity Assay» (Promega, Wi, США). Высвобождение лактатдегидрогеназы из клеток сопровождается расщеплением 68 субстрата с последующим превращением ресазурина в ресоруфин. Реакция была остановлена добавлением раствора, содержащего ДМСО. Результаты были проанализированы при длине волны 560/590 нм и представлены, как процент цитотоксичности в эксперименте-контроле среды к максимуму токсичности в ответ на SDS обработку – контроль среды x100. 2.17. Детекция поврежденных клеток с помощью окраски кристаллвиолетом Опухолевые клетки глиомы/глиобластомы человека (U373MG, U87MG, No.10, А172, U118MG), а также неопухолевые первичные клетки астроцитов, полученные от взрослых доноров, были посеяны в 24- или 48-луночные планшеты при плотности 50,000 или 20,000 клеток на лунку. На следующий день клетки были инфицированы в течение 4 часов в дозе 1000, 100, 10, 1, 0.1 вирусных или 10, 1, 0,1 инфекционных частиц на клетку в присутствии поддерживающей среды (MEM), содержащей 1% фетальную бычью сыворотку. После адсорбции вируссодержащая среда была заменена на ростовую. В назначенное время клетки были зафиксированы 10% формальдегидом, приготовленном на PBS, с последующей окраской 1% раствором кристаллвиолета в течение 20 мин при комнатной температуре. Лунки с фиксированными клетками были трехкратно промыты проточной водой, высушены и сфотографированы с помощью фотоаппарата. 2.18. Инфекция клеточных культур in vitro В зависимости от цели эксперимента клетки глиом человека U87, A172, U118, U251, N10, Кings и первичные клетки глиомы человека, выделенные из образцов опухолей пациентов: ГБМ1, ГБМ2, 3, ГБМ4, ГБМ5, ГБМ6, ГБМ7, ГБМ8, ГБМ9, ГБМ10, ГБМ11, ГБМ12, ГБМ13, ГБМ14, ГБМ14, ГБМ15, ГБМ39, ГБМ41 были посеяны в 96-луночные планшеты (3,000 или 5,000 клеток на лунку), 24луночные планшеты (20,000, 30,000, или 50,000 клеток на лунку), 6-луночные 69 планшеты (100,000, 150,000, 200,000 или 250,000 клеток на лунку) за 24 часа перед инфекцией вирусом. На следующий день к каждой лунке была добавлена вируссодержащая среда для последующей инкубации в течение 1, 4 или 24 часов. Причем концентрация вирусных частиц, добавленных к клеткам, была подсчитана для каждого эксперимента (от 0.1 до 100 инфекционных частиц на клетку в объеме 50 мкл на лунку (96-луночный планшет), 500 мкл на лунку (24-луночный планшет) и 1,5 мл (6-луночный планшет). После адсорбции несвязанный вирус был трехкратно промыт PBS, и к каждой лунке была добавлена ростовая среда, содержащая смесь ампицилин/стрептомицин, 10%FBS или ростовые факторы для первичных клеток. 2.19. Тестирование цитотоксического действия реагентов in vivo В опытах использовали мышей-самок линии Balb/c массой тела 18–24 г разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» Минздрава России, которых содержали в виварии при естественном освещении на брикетированном корме и постоянном доступе к воде. Перед лечением мышей распределяли на группы (n 5– 13). Потенциальная цитотоксичность терапевтических агентов была изучена в случае внутримозгового введения химиопрепарата (5, 10 или 20 мкг/мл) или вирусного вектора (10(12), 10(10) или 10(8) вирусных частиц на инъекцию) в головной мозг исследуемых животных (голых мышей или камышовых крыс). После внутримозговой инокуляции терапевтических компонентов за животными проводилось наблюдение с целью выявления таких симптомов нейротоксичности как: гемипарезы, отказ от пищи и др., а также достоверное уменьшение массы тела (косвенный признак общей токсичности). Кроме того, на 1, 7, 21 и 42 дни после инъекции, мозг одного аутопсийного животного был исследован гистологически для определения реакции головного мозга на токсическое поражение. Выживаемость животных была определена по кривой выживаемости Каплан- 70 Мейер, как среднее значение в зависимости от концентрации вектора. По результатам всех исследований, была установлена максимальная толерантная доза (МТД) для каждого агента перед изучением его анти-опухолевого эффекта. 2.20. Создание систем in vivo для тестирования терапевтических препаратов 2.20.1. Использование внутримозговой модельной системы глиобластомы человека Мыши с дефектным иммунитетом (голые мыши, Nude mice) были получены из питомника РОНЦ, Charles River Laboratory (Чарльстон, Южная Каролина, США), Jackson Laboratory (Бар Харбор, Мэйн, США) и содержались в условиях вивария в соответствии с нормами биоэтики, принятым в Российском Онкологическом Центре (Москва) и Университете Чикаго (Чикаго, США). После интраперитонеальной кетамин/хелазин анестезии животные были помещены в стереотактическую рамку. В черепе было сделано отверстие для введения клеточной суспензии: U251 (25,000 клеток/ мышь), U87(50,000 клеток/мышь), ГБМ, либо аденовирусного вектора. Спустя 7 дней после развития опухоли и формирования кровеносных сосудов, мыши были равномерно распределены между группами для получения внутримозговой инъекции онколитического вируса (в дозе 100 инфекционных доз на клетку). Мышам контрольной группы вводили 3 мкл PBS в том же режиме. Оценку противоопухолевого эффекта проводили по химиопрепарата выживаемости по сравнению мышей с в присутствии контрольными вирусного группами. или Увеличение продолжительности жизни животных выражали в процентах, и для каждой группы была построена кривая выживаемости Каплан-Мейер. 71 2.20.2. Подкожная модель глиомы человека Суспензия CD133- позитивных 3x10(5) клеток линии U373 была инъецирована в верхнюю часть ноги. Через 8 дней после инъекции клеток, когда опухоль достигла в размере 100-150мм3, мыши были равномерно распределены между группами для получения внутриопухолевой терапевтической инъекции: 1,000 вирусных частиц CRAd-S-pK7 или комбинации CRAd-S-pK7 + ионизирующей радиации (2Грей), вируса AdWT, вируса AdWT + ионизирующей радиации (2Грей), или контроля PBS. Спустя 24 часа после вирусной инъекции часть мышей получила однократную дозу (2 Грей) ионизирующей радиации в гамма-излучателе (модель 143-45; JL Shepherd Associates). Прогрессия опухоли была установлена путем измерения диаметра и объема опухоли по формуле V = (x _ y _ z) / 2. Результаты получены на основании измерения 10 опухолей у 5 мышей в группе. 2.21. Окрашивание тканевых срезов 2.21.1. Окрашивание срезов гематоксилин-эозином Парафиновые срезы толщиной 5/10 микрон или ОСТ- фиксированные тканевые срезы толщиной 5/10 микрон были окрашены по стандартной методике. Распределение гематоксилин-эозиновой окраски устанавливали при 10-кратном увеличении, используя микроскоп Olimpus IX71 (США), соединенный с цифровой камерой Olimpus DP72 (США). Сканирование микрофотографий производили при 20-кратном увеличении с помощью Aperio ScanScope (Aperio, Vista, CA, США). Анализ сканирующих образцов проводили, используя программу ImageScope (Aperio, США). 72 2.21.2. Иммуногистохимическое окрашивание тканей Окраска проведена, как описано ранее [6]. Тканевые срезы толщиной 5-10 микрон были получены после фиксации в формалине образцов мозга мышей, содержащих опухолевые клетки. Ткань была окрашена гематоксилин-эозином. Для детекции аденовирусных антигенов E1A (клон M58, MS587-P1, Lab Vision,США), аденовирусного гексона (Virostat, Portland, США), и клеточных антигенов CD31 (клон MEC 13.3, BD Bioscience- Pharmingen, San-Diegeo, США), Ki-67 (клон M7187, DAKO, Klostrup, Дания), p53 (клон DO-1, Santa Cruz Biotechnology, Ca, США), срезы были последовательно проинкубированы с первичными антителами, а затем с набором Histostain (Zymed, Invitrogen-Life Technologies, Grand Island, NY, США) или EnVision system (Dako, Klostrup, Дания) в соответствии с рекомендациями производителей. 2.21.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание тканевых срезов Для определения ко-локализации MMP14 с CD11B, CD45 и OLIG2 восстановление антигена проводили в цитратном буфере с pH=6.0. Неспецифическое связывание было уменьшено с использованием набора «Background Buster» (Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY, США). Для блокировки эндогенной биотиновой активности был использован блокирующий набор «avidin/biotin» (Vector Laboratories, Burlingame, CA, США). После ингибирования была проведена последовательная инкубация тканевых срезов с антителами CD45 (DAKO Cytomation), MMP14 (Abcam, MA, США), и CD11B (Novus Biologicals, Littleton, Cо США). Вторичное антитело, меченное биотином (Vector Laboratories) было добавлено после добавления конъюгата, меченного Streptavidin или флуорохромом Alexa 594 (Life Technologies – Molecular Probes, Grand Island, NY, США). Для негативного контроля последовательность обработки была такая же, но вместо первичного антитела использовали изотипический контроль. Для усиления специфического сигнала применяли набор 73 ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, США) и ДАB (3,3’-diaminobenzamidine использовали как хромоген (Sigma, Saint Louis, MI, США). На последней стадии тканевые срезы были окрашены гематоксилин-эозином (Sigma- Aldrich, Saint Louis, MI, США), дегидрированы и покрыты Histomount (National Diagnostics, Atlanta, GA, США), содержащей DAPI. Белковую экспрессию наблюдали с использованием инвертированного микроскопа «Nikon Eclipse Ti-U»; микрофотографии были получены с использованием камеры «Nikon digital sight DS-Qi1Mc». 2.22. Статистический анализ Результаты представлены в виде стандартного значения ± стандартное отклонение. Статистический анализ был выполнен с использованием теста Стьюдента (программа SPSS 13.0, Чикаго, Иллинойс, США). Разница <0.05 означала существенное различие. Анализ общей выживаемости экспериментальных животных с глиобластомой проводили методом КапланаМайера. 74 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Генная терапия – экспериментальный подход в лечении глиобластомы головного мозга Средняя продолжительность жизни большинства пациентов с ГБМ в при комбинации хирургической резекции с ионизирующей радиацией и 5 циклами химиотерапии темозоломидом (темодалом) составляет 18,1 месяцев (Рис. 1). Для улучшения выживаемости применяются многие экспериментальные подходы. Одним из таких подходов является вирусная генная терапия, которая позволяет доставлять рекомбинантную ДНК в клетки-мишени, с использованием вирусного вектора. При этом использование онколитических векторов на основе генома аденовируса человека серотипа 5 позволяет задействовать такие сильные стороны аденовируса как: Возможность инфицировать широкий спектр опухолевых клеток человека и животных; Доставка рекомбинантных ДНК, позволяющая обеспечивать высокий уровень экспрессии трансгена инфицированными клетками; Экспрессия трансгенного продукта как результат аденовирусной репликации; Возможность доставлять высокоразмерные последовательности ДНК в клетки-мишени; Наличие разнообразия в выборе системы для создания аденовирусных векторов и последующих модификаций генома вируса; Отсутствие встраивания вирусной ДНК в геном инфицированной клетки; Несмотря на сильные преимущества, эффективная инфекция клеток-мишеней аденовирусом требует присутствия на их поверхности первичных рецепторов CAR (коксаки-аденовирусный рецептор) (Рис. 2). Ряд неопластических клеток, таких как клетки мультиформной глиобластомы и меланомы, экспрессируют на своей 75 поверхности ограниченное количество CAR [300]. Таким образом, потеря экспрессии белка CAR снижает эффективность применения аденовирусных векторов на основе генома серотипа человека 5. Рисунок 2 – Схема репликативного цикла аденовирусного вектора. На первом этапе вирусная частица связывается с первичным рецептором, что приводит к интернализации вириона. В результате последующей депротеинизации в цитоплазме высвобождается вирусная ДНК. ДНК транспортируется в ядро, где рибосомная РНК транскрибируется с образованием вирусных РНК Для увеличения специфичности инфекции аденовирусным вектором используют различные экспериментальные подходы (Рис. 3). Известно, что первичное связывание поверхностного белка фибера аденовируса с аденовирусным рецептором обеспечивает высокий уровень инфекции. Поиск клеточных молекул, содержащихся на поверхности клеток мишеней в высокой 76 плотности, может увеличить эффективность трансдукции опухолевых клеток аденовирусным вектором. Другим решением может быть использование альтернативного рецептора, позволяющее перенацелить аденовирусную частицу и предложить новый путь для интернализации вируса в клетку-мишень. Данный метод позволяет: Изменить тропизм вирусной частицы путем внесения модификаций в состав поверхностных белков аденовируса, отвечающих за клеточное узнавание; Увеличить специфичность трансдукции клеток-мишеней аденовирусным вектором; Снизить вероятность инфекции здоровых клеток организма рекомбинантным вектором; Обеспечить высокий уровень репликации аденовирусного вектора в неопластических клетках человека и животных; Рисунок 3 – Cхема: перенацеливание аденовирусной частицы на альтернативные рецепторы повышает таргетинг (направленную инфекцию) клеток мишеней. CAR – первичный аденовирусный рецептор. 77 Однако перенацеливание вирусной частицы на альтернативный рецептор предполагает внесение модификаций, позволяющих обеспечить высокий уровень узнавания альтернативного рецептора вирусным вектором. Одним из таких методов, подробнее описанных в главе 2, стала замена участка белка фибера или всего гена, отвечающего за связывание вирусной частицы с поверхностным рецептором. Для того, чтобы выбрать альтернативный рецептор на поверхности клеток глиобластомы человека, мы проанализировали научную литературу и изучили распределение известных поверхностных рецепторов для аденовирусов человека и животных разных серотипов. Мы предположили, что перенацеливание вирусного вектора с одного рецептора на другой, представленный в большем количестве на поверхности опухолевой клетки, путем замены рецептор-связывающего участка, позволит увеличить эффективность трансдукции неопластических клеток без потери функциональности вирусного вектора в процессе клонирования. В качестве альтернативы нами было предложено использовать поверхностные рецепторы десмоглеина 2 (DSG2) и CD46 для направленной инфекции клеток глиобластомы человека. В наших публикациях [55, 66, 67, 288, 301, 302] мы показали, что СD46 и DSG2 усиленно экспрессируются на поверхности опухолевых клеток глиобластомы. Более того, наши исследования [301] и ранние работы лаборатории д-р. Andre Liber (University of Washington, Seattle, Department of Human Genetics) показывают, что аденовирусы человека типа В (Аd3, Ad11, Ad35) узнают первичные рецепторы СD46 и DSG2 [303-305]. Для определения содержания в клинических образцах глиобластомы человека транскриптов CAR, СD46 и DSG2 нами были проанализированы образцы тканей пациентов с опухолями головного мозга, депонированных в базе данных TCGA. В ней содержится информация об экспрессии генов, детектируемой в первичных образцах пациентов с диагнозом «опухоль головного мозга» в различной стадии злокачественности: степень II, степень III и степень IV. 78 Рисунок 4 – Биоинформатический анализ транскрипции CD46, DSG2 и CAR в клетках глиобластомы человека с использованием клинической базы данных TCGA. Уровень экспрессии выражен в логарифмах с основанием 2. Здоровые клетки (Не опухолевая ткань, НБ), степень II (Астроцитома), степень III (Олигодендроглиома) и степень IV (ГБМ). Как представлено в таблице 1 и на Рис. 4, неопухолевая ткань (НБ) существенно выше экспрессирует CAR в сравнении с образцами, содержащими опухоли в степени II, III и IV. В тоже время в образцах, соответствующих олигодендроглиомам в стадии III, преобладала более сильная экспрессия для генов DSG2 и CD46. Самый высокий уровень экспрессии CD46 был обнаружен в неопластических клетках, соответствующих ГБМ. Чтобы подтвердить наши данные, мы произвели имуногистохимическое окрашивание первичных образцов, соответствующих опухолям головного мозга в степени II, III и IV, используя антитела против клеточных антигенов CAR, DSG2 и CD46. Предварительный иммунофлуоресцентный анализ позволил предположить, что клетки глиобластомы содержат больше CD46 и DSG2, чем здоровая, не опухолевая ткань. Эти данные были подтверждены биоинформатического анализа, представленными в Таблице 1. данными 79 Таблица 1 – Статистический анализ уровней экспрессии генов CD46, DSG2 и CAR(CXADR), представленных в Рис. 4. DSG2 CXADR CD46 217901_at 203917_at 207549_x_at Материал Неопухолевая ткань vs. Астроцитома (Степень II) 0.721633175 7.05087E-06* 0.659001322 0.597670986 0.002250223* 0.66637388 Неопухолевая ткань vs. Олигодендроглиома (Степень III) Неопухолевая ткань vs. ГБМ (Степень IV) 3.28659E-05 0.013941438* 0.002577406* Астроцитома (Степень II) vs. Олигодендроглиома 0.762906071 0.183756462 0.310145177 (Степень III) Астроцитома (Степень II) vs. ГБМ (Степень IV) 0.00022612* 0.001843546* 2.06494E-06* Олигодендроглиома (Степень III) vs. ГБМ 0.014616933 0.204193919 0.004939011 (Степень IV) Примечание: достоверность различий по сравнению с показателями была выявлена путем T-теста. 80 Рисунок 5 – Характеристика стволовых клеток по экспрессии маркеров стволовых клеток и первичных аденовирусных рецепторов CD46, DSG2 и СAR. Формирование нейросфер (А) и повышенная экспрессия SOX2 (Б) детектирована в первичных клетках, полученных от пациентов с диагнозом ГБМ. Микрофотографии: увеличение Х200, Шкала: 40 микрон. С помощью ПЦР в реальном времени, экспрессия SOX2 была детектирована в CD133-положительных клетках. Эксперимент проведен дважды в 3 повторах. Статистическая разница в экспрессии SOX2 между CD133-положительными и CD133-негативными клетками (#, ##, ###) показана с помощью теста Манна-Уитни (p<0.05); В) Анализ белковых фракций первичных клеток с мезенхимальным, пронейральным и пролиферативным подтипом. Перевиваемые клетки глиобластомы человека (A172, U87, U118, U251) и первичные линии клеток пациентов с диагнозом «мультиформная глиобластома» были выращены в бессывороточной среде, содержащей ростовые факторы (FGF, EGF и В27) для поддержания стволовых клеток. Антитела к белку GAPDH использовали в качестве контроля для нанесения равного количества белка в лунки геля. Мембраны с иммобилизованными белками инкубировали с антителами к DSG2, кластеру дифференцировки 46 (CD46), и Коксаки-аденовирусному рецептору (CAR). L – маркер молекулярного веса. В обоих случаях большинство клеток глиобластомы экспрессируют DSG2 и CD46. 81 По данным литературы известно, что стволовые клетки глиобластомы человека обеспечивают резистентность к терапии и вторичный рост глиобластомы [306-309]. Учитывая, что создание генно-инженерной векторной системы подразумевает высокую эффективность инфекции для всего спектра опухолевых клеток, было целесообразно изучить эффект направленной инфекции опухолевых стволовых клеток глиобластомы аденовирусными векторами. На первом этапе мы изучили экспрессию первичных клеток глиобластомы, выращенных в условиях поддерживающих их «стволовость», например, формирование нейросфер, экспрессия высокого уровеня маркера SOX2 и низкого – GFAP. Наши предварительные результаты свидетельствуют, что стволовые клетки, взятые для вестерн-блоттинга, формируют нейросферы и имеют высокий уровень экспрессии SOX2 (Рис.5 А и Б). По данным белкового анализа большинство первичных клеток ГБМ, позитивных по маркеру стволовых клеток CD133, экспрессируют десмоглеин 2 и CD46 (Рис. 5 В). Однако, белковый анализ, проведенный методом вестернблоттинга, не дает представления об экспрессии клетками DSG2 и CD46 на поверхности клеток, так как уровень экспрессии, видимый в реакции вестернблоттинга, может детектировать внутриклеточный белок. С этой целью часть первичных линий клеток была проанализирована методом проточной цитофлуориметрии (Таблица 2). Оказалось, что клетки глиобластомы человека, выделенные из опухолевых тканей пациентов с диагнозом «мультиформная глиобластома», и экспрессирущие высокий уровень поверхностного рецептора CD133 характеризуются высоким уровнем экспрессии DSG2 и CD46 на своей поверхности, что соотносится с результатами вестерн-блоттинга и биоинформатического анализа. По результатам, представленным в Рис. 5 и Таблице 2, перевиваемые и первичные клетки глиобластомы экспрессируют высокий уровень десмоглеина 2 и CD46. Таким образом, терапевтический таргетинг клеток глиобластомы 82 аденовирусными векторами, узнающими рецепторы глиобластомы человека десмоглеин 2 (DSG2) и CD46, может обеспечить высокую трансдукцию неопластических клеток головного мозга. Таблица 2 – Анализ экспрессии CD46, DSG2 и CAR (CXADR) на поверхности стволовых клеток глиобластомы (СD133-позитивных) и перевиваемой клеточной линии глиобластомы человека U251 Образец Поверхностный Первичные линии Перевиваемая линия рецептор ГБМ, степень 4 глиобластомы человека ГБМ1 ГБМ2 ГБМ3 CD80 0.51 20.5 0.54 1.82 CD86 2.85 55.6 0.15 14.9 CAR 35.3 0 0.32 6.9 CD46 22.5 61.5 61.1 18.2 DSG2 45.4 87.2 95.0 49.4 ανβ3 27.3 64.1 18.03 58.1 ανβ5 11.0 66.7 2.05 3.12 Примечание: уровень экспрессии определен U251MG методом проточной цитофлуориметрии против экспрессии белка, детектируемого с изотипическим контролем. 83 3.1.1. Роль белка фибера аденовируса в вирусной репликации, транскрипции и сборке вирусных вирионов Создание генно-инженерного рекомбинантного препарата на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, узнающего рецептор CD46, состоит из внесения трансдукционной (1) и транскрипционной (2) модификаций в вирусные частицы. Трансдукционная модификация необходима вирусной частице, поскольку первичное узнавание клетки- мишени происходит путем связывания белка фибера аденовирусного капсида с первичным рецептором клетки-мишени. Существующие плазмидные модели представляют собой перспективные системы для стабильного или транзиентного встраивания химерного белка фибера в состав капсомера пентона. Полученные рекомбинантные вирионы содержат, как правило, капсиды со встроенным фибером в тримерном состоянии. По данным литературы [310, 311], именно такая пространственная конфигурация фибера позволяет специфично связывать вирусную частицу с рецептором на поверхности клетки. С целью создания рекомбинантных векторов, узнающих молекулу рецептора CD46 на поверхности клеток мишеней, нами были использованы три различных подхода (Рис. 6). В первом, нами был клонирован белок фибера человека серотипа 3 в состав рекомбинантной плазмиды PDV67 под контролем главного промотора цитомегаловируса человека (CMV). Полученная плазмида получила название PDV67-Ad3Fiber. Затем клетки почки человека HEK293, стабильно экспрессирующие полноразмерный белок фибера аденовируса 3, были инфицированы рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5E1E3dFib(delFib). Примечательно, что этот вектор содержит стабильные делеции в областях Е1, заполненные геном люциферазы под контролем промотора цитомегаловируса человека, а области Е3-L5 содержат белок фибера и делецию ранних белков вируса, ответственные за подавление иммунного ответа и репликацию 84 аденовируса. Рекомбинантный аденовирус, транзиентно экспрессирующий фибер аденовируса человека 3 серотипа, был получен после двух раундов инфекции. Рисунок 6 – Схема получения DSG2/CD46-модифицированного вектора для терапии DSG2/CD46-позитивных клеток глиобластомы человека. Получение рекомбинантных аденовирусных векторов, дефектных по репликации и содержащих транзиентные (А, Б и В) и стабильные (Г) химеры белка фибера в составе вирусного вириона. Примечание: poly A – сигнал поли адениллирования, Amp – ген устойчивости к ампициллину, ori – старт репликации, ITR – инвертированные повторы, HEK293 – перевиваемая линия почки человека 293. Во втором случае мы использовали систему, полученную д-ром V. Kransykh (Центр Генной Терапии, Университет Алабамы в г. Бирмингем, США). В основе применения лежит использование 2 плазмид: трансфер-вектор и pAdEasy, 85 соответствующая полноразмерному геному аденовируса с делециями в области Е1 (репликация) и L5 (фибер) [312]. В составе трансфер вектора N-концевая и центральная части белка фибера были заменены на гомологичную часть из бактериофага Т4. В этом случае С-концевая часть фибера (кноб-домен), ответственная за связывание с поверхностью клетки-мишени белка фибера, была клонирована в С-концевую часть молекулы фибритина. Полученный вектор, содержащий слитый ген фибер-фибритин, была рекомбинирован с вектором pAdEasy с целью клонирования химеры в состав аденовирусного вектора. Амплификация вируса производилась в клетках HEK293, трансфицированных PDV67 (экспрессирует полноразмерный белок гена фибера человека типа 5), полученных от д-ра Von Seggern (Университет ла Хойа, США) и стабильно экспрессирующих полноразмерный ген фибера аденовируса типа 5 (HEK293PDV67) [313]. После нескольких раундов амплификации с использованием клеток, содержащих плазмиду PDV67, вирус был амплифицирован. При этом конечный продукт – дефектные по репликации вирионы, содержали как дикий тип аденовируса человека, так и рекомбинантный фибер-химеру (HEK293-PDV67) или только химеру фибера, содержащую домен связывающий рецептор CD46 (HEK293). Третья система была создана на базе рекомбинантной плазмиды Pneb.PK.FSP и рекомбинантной векторной системы pAdEasy. Клонирование участка гена, отвечающего за связывание с рецептором на поверхности клеток мишеней в составе трансфер-вектора Pneb.PK.FSP позволяет производить гомологичную полноценный рекомбинацию вирусный геном с плазмидой (делеция Е1 pAdEasy, содержит содержащей почти репортерный ген люциферазы под контролем главного промотора цитомегаловируса человека). В результате такой стратегии, рекомбинация позволяет клонировать фибер-химеру в состав генома рекомбинантного аденовируса человека. Полученный 86 рекомбинантный вирус содержит 12 фибер-химер в каждом из аденовирусных вирионов. Наши предварительные полноразмерного белка фибера результаты подтверждают, существенно увеличивает что наличие репликацию и высвобождение вирусных частиц в процессе амплификации. Однако остается неясным, как изменение локализации белка фибера может обеспечивать функциональную значимость и влиять на эффективность сборки вируса в клетках, стабильно экспрессирующих полноразмерный белок фибера. С этой целью мы удалили сигнал ядерного транспорта (Nuclear localization signal, NLS) и сигнал упаковки белка-фибера в составе аденовирусных капсомеров (penton-associated signal, PAS), используя точечный мутагенез плазмиды Pdv67 (Рис. 7). Предполагалось, что благодаря этим делециям, фибер аденовируса серотипа 5 будет способен тримеризоваться и накапливаться в цитоплазме, но не будет способен транспортироваться в ядро инфицированной клетки, и/или не будет способен встраиваться в капсомер пентона аденовирусного вириона. Для того, чтобы понять, как мутантный белок фибера будет влиять на репликативный цикл аденовируса в клетке, клеточная линия человека НЕК293 была трансфицирована плазмидами pPDV67, pPAS и pNLS. В результате иммунофлуоресцентного анализа было показано, что в отличие от белка фибера дикого типа 5, не содержащего мутацию, но равномерно распределенного в ядре, локализация PASи NLS- делетированных форм белка отличается от контроля наличием сильно выраженного цитоплазматического распределения, представленного на Рис. 8. 87 Рисунок 7 – Удаление сигналов ядерной локализации и упаковки фибера в вирусный капсомер не влияет на тримеризацию белка фибера, но влияет на его клеточную локализацию. А) Схема строения N-концевого участка белка фибера аденовируса человека типа 5. Участки, затрагивающие сигналы ядерной локализации (NLS, синий цвет) или упаковки в капсомер (PAS, красный цвет), были удалены в исходной плазмиде pPDV67 методом направленного мутагенеза с целью получения плазмид pNLS и pPAS; Б) Анализ белковых фракций клеток HEK293, трансфицированных плазмидами pPDV67, pNLS и pPAS, был проведен в денатурирующих/не денатурирующих условиях в ПААГ. Электрофоретические фракции были инкубированы с антителами (клон 4D2), узнающими тример и мономер белка фибера. Лунка 1 и 2: wt – аденовирус типа 5, 1.8х10(10) вирусных частиц на лунку не инкубированного/инкубированного в буфере Лаемли; лунка 3, 4 и 5: белок, полученный из клеток HEK293, трансфицированных плазмидами pPDV67, pNLS и pPAS, был нанесен в лунку геля соответственно; В) Клеточная локализация дикого и мутантных типов белка фибера аденовируса человека типа 5 была исследована методом иммунофлуоресценции с использованием антител к белку фибера человека (4D2, зеленый цвет). Ядра клеток выявляли DAPI (синий цвет). Клетки окрашивали по стандартной иммунофлуоресцентной методике. Увеличение 40х, шкала 50 микрон. 88 Рисунок 8 – Гомологичный анализ аминокислотных последовательностей белка фибера аденовируса собак типа 1 и 2, аденовируса человека серотипов 2, 3 и 5, проведенного с помощью алгоритма Clusсall. Данные результаты подтверждают высокую гомологию между фиберами аденовируса человека типов 2 и 5, и фиберами аденовируса собак типа 1 и 2. Предполагая, что такая локализация модифицированной формы белка фибера является результатом нарушения тримеризации, мы провели иммуноблоттинг (Рис. 7 Б и В). Данные наших экспериментов показывают, что внесение делеции в состав сигналов NLS или PAS влияет на локализацию мутантного фибера в клетках (Рис. 7Г), но не влияет на его тримеризацию. Остается открытым вопрос, как фибер управляет процессом накопления вирусных частиц в клетке. Это становится особенно актуальным, так как, по результатам аминокислотного анализа, между белками фибера человека серотипа 2, 3 и 5 наблюдается высокая гомология (Рис. 8). Данные, представленные на Рис. 7 предполагают, что ядерная локализация фибера влияет на этапы вирусной сборки и транскрипции вирусных мРНК, тем самым, предполагая его роль как транскрипционного фактора. По предположениям, высказанным Von Seggern с соавт. [313], накопление вируса в клеточной линии, экспрессирующей фибер, сопровождается накоплением высокого числа пустых инфекционных частиц. Поэтому, мы предположили, что белок фибера может регулировать экспрессию 89 белков сердцевины аденовируса, ответственных за сборку вирионов [314, 315]. В результате иммуноблоттинга выяснилось, что инфицирование клеток HEK293, стабильно экспрессирующих pNLS и pPAS приводит к накоплению белков сердцевины в аденовирусных вирионах по сравнению с вирусом Ad5E1E3dFib, выращенным в присутствии фибера дикого типа аденовируса человека серотипа 5 (Рис. 9А). Таким образом, данные белкового и количественного ПЦР, представленные нами на Рис. 9Б экспериментально подтверждают, что фибер важен для транскрипции, трансляции и созревания белков сердцевины. Влияние нарушения белка фибера на процессинг белков сердцевины и сборку вирионов было протестировано в реакции количественного ПЦР и высвобождения вирусных частиц. Если наше предположение, что нарушение созревания белков сердцевины происходит вследствие изменения клеточной локализации белка фибера верно, то можно ожидать нарушения сборки вирусных частиц в клетке. На Рис. 9Б рост вируса Ad5E1E3dFib в клетках, экспрессирующих мутантные формы белка фибера, сопровождается увеличенной продукцией белков сердцевины. Оказалось, что это увеличение прямо соотносится с повышенной экспрессией мРНК данных транскриптов. Поскольку экспрессия данных белков может влиять на процесс вирусной репликации и сборку вирусных частиц, мы провели анализ вирусной репликации и измерили накопление вирусных продуктов в присутствии дикого или мутантных форм фибера. 90 Рисунок 9 – Белок фибера аденовируса контролирует экспрессию вирусных белков сердцевины и влияет на сборку вирионов. А) Белковый анализ аденовирусных вирионов Ad5E3E1dFib, выращенных в присутствии фибера дикого типа (pPDV67), дефектного по сигналу ядерной локализации (pNLS) и сигналу ядерной упаковки (pPAS). Вирусные фракции собраны после амплификации вируса, очищенны в градиенте CsCl, сконцентрированы по белку, и 30 мкг тотального белка внесено в лунку 10% ПААГ. Иммуноблоттинг белковых фракций вирусов проведен с поликлональной сывороткой против белков аденовируса человека серотипа 5. «*»экспрессия промежуточных продуктов экспрессии белков сердцевины; Б-Г) Количественный анализ экспрессии белков сердцевины аденовируса (RT-PCR). Темные кружки – уровень неспецифической экспрессии; темные квадраты – вирионы Ad5E3E1dFib, полученные в присутствии плазмиды pPAS; светлый треугольник – вирионы Ad5E3E1dFib, полученные в присутствии плазмиды pNLS; темный треугольник – вирионы Ad5E3E1dFib, полученные в присутствии плазмиды pPDV67; Ось ординат – уровень мРНК в образцах поле нормализации к уровню внутреннего контроля (GAPDH). Ось абсцисс – дни после инфекции. Эксперимент проведен дважды в 3 повторах на каждый образец. «*»p<0.05. 91 По данным количественного ПЦР, представленным на Рис. 10А, экспрессия pPDV67 статистически значимо увеличивала уровень вирусной ДНК, детектируемой по количеству копий ДНК Е4. При этом экспрессия фибера дикого типа приводила к увеличению репликации вируса в 5,6 раза по отношению к клеткам, не экспрессирующим фибер. Схожие результаты были получены для линии клеток HEK293, трансфицированной вектором pPAS. С другой стороны, трансфекция клеток плазмидой pNLS приводила к еще большему накоплению вирусной ДНК по отношению к клеткам, трансфицированными pPDV67 и затем инфицированным Ad5E3E1dFib (p<0.05). Данные результаты могут свидетельствовать об увеличенной продукции вирионов. С целью проверки этого предположения нами был проанализирован супернатант от клеток, инфицированных Ad5E3E1dFib вектором после их трансфекции плазмидами pPDV67, pPAS или pNLS (Рис. 10). Трансфекция плазмидой pPDV67 увеличивала продукцию вирионов по отношению к контролю Ad5E3E1dFib в ~15,3 раза. В то же самое время титр Ad5E3E1dFib оказался сниженным в клетках, экспрессирующих мутантный фибер, особенно фибер-химеру с делецией в сигнале ядерного транспорта (~в 9 раз по отношению к титру в клетках HEK293PpDV67). Таким образом, полученные нами данные соотносятся с другими научными публикациями: Chee-Sheung с соавт. [316], и Falgout с соавт. [317]. Несмотря на разные подходы в решении поставленной задачи, полученные результаты показывают, что присутствие полноразмерного белка фибера, способного тримеризоваться и локализоваться в ядерном компартменте клеток, является ключевым фактором в формировании вирионов аденовируса. 92 Рисунок 10 – Эффект делеции сигнала ядерного транспорта и упаковки в капсомер белка фибера на репликативный цикл вектора Ad5E3E1dFib. А) Количественное определение вирусной ДНК после амплификации вирусного вектора Ad5E3E1dFib на клетках HEK293, экспрессирующих полноразмерный белок фибера дикого (pPDV67) и мутантного (pNLS и pPAS) типа аденовируса человека серотипа 5. Ось ординат – уровень вирусной ДНК после нормализации к количеству тотальной ДНК. Ось абсцисс – использованные контрольные и инфицированные клетки; Б) Титрование вирусных частиц Ad5E3E1dFib показывает, что нарушение клеточной локализации белка фибера приводит к накоплению вирусных частиц в инфицируемых клетках. Ось ординат – уровень вирусных прогенных частиц, детектируемых в супернатанте. Ось абсцисс – использованные контрольные и инфицированные клетки. Эксперимент проведен дважды в 3 повторах. Достоверность отличий между образцами была установлена с использованием теста Манна-Уитни * p<0,05. 93 3.1.2. Генетическое клонирование фибера аденовируса человека типа 3 в геном рекомбинантного вектора обеспечивает высокий уровень трансдукции клеток глиобластомы человека Чтобы проанализировать уместность использования каждой из 3 систем (см. Рис. 6), выбранных нами для получения аденовируса, экспрессирующего фибер серотипа 3, мы сконструировали вирусные векторы, содержащие или полноразмерный кноб-домен, или шафт-кноб белка фибера, содержащий рецептор-связывающий участок с рецептором CD46. Уровень экспрессии белковых химер фибера был подтверждён с помощью вестерн-блоттинга. Как показано на Рис.11А, векторы FF-кноб3, Ad-3кноб и defAd-5/3 экспрессируют различные фрагменты фибера аденовируса серотипа 3 в виде (не денатурирующие) условия. Это подтверждает, что каждая из предложенных систем способна экспрессировать фибер, соответствующий структуре фибера, встроенного в капсид аденовируса человека серотипа 3. Оказалось, что среди всех химерных конструкций FF-кноб3, Ad-3кноб и defAd-5/3, способствующих встраиванию химерного фибера в вирусные капсиды, defAd-5/3 обеспечивает высокий уровень трансдукции клеток глиобластомы по сравнению с другими векторами (Рис. 11Б), полученными с использованием других схем клонирования, и против AdWT-Luc (~2-5 раз). На следующем этапе мы выяснили, будет ли стабильно встроенная химера белка фибера 5/3 иметь высокий уровень трансдукции клеток глиобластомы человека по сравнению с другими модификациями, используемыми в научной литературе [139, 302, 318]. Для этого возможные модификации были клонированы в С-концевую часть белка фибера, или центральная и С-концевая части были одновременно заменены на соответствующие домены фибера другого серотипа аденовируса (Рис. 12А). 94 Рисунок 11. Сравнительный анализ экспрессии химерных белков фибера и эффективности трансдукции клеток глиобластомы человека аденовирусными векторами, дефектными по репликации. А) Иммуноблоттинг аденовирусных вирионов Ad-3кноб, Def-Ad5/3, FF-кноб3 и defAd-5/3 с использованием антител клона 4D2 против эпитопов тримерного белка фибера. Лунка 1 – Ad-3кноб, Лунка 2 – defAd-5/3, Лунка 3 – FF-кноб3; Б) Увеличенная продукция репортерного гена люциферазы была показана для вируса, стабильно экспрессирующего рекомбинантную химеру 5/3 в перевиваемых клетках глиобластомы D65MG и U118. Эксперимент был проведен два раза в 3х повторах.»*» или «#» p<0,05 статистическое значение было определено по отношению к экспрессии векторов FF-кноб3 или AdWT-Luc соответственно. 95 Рисунок 12 – 5/3 модификация обеспечивает высокий уровень трансдукции клеток глиобластомы человека. А) Схема возможных модификаций белка фибера 96 в составе дефектных рекомбинантных векторов. Название вирусных векторов изображено слева, в центре – рецептор-связывающий участок, клонированный в состав фибера аденовируса, справа – поверхностный рецептор, узнающий данную модификацию; Б) Схема инфекции клеток глиобластомы человека в данном эксперименте. Для инфекции клеток глиобластомы человека было использовано по 100 инфекционных частиц на клетку каждого вируса. Через 48 часов после инфекции измерялся уровень люциферазы; С) Уровень люциферазы после инфекции был нормализован по клеточному белку. Эксперимент был проведен дважды с 3 повторами на каждый вектор, и среднее значение было использовано для графика. Ось ординат – процент экспрессии люциферазы по отношению к уровню экспрессии люциферазы контрольным вектором. Ось абсцисс – использованные клеточные линии, инфицированные вирусом. В частности, 7 полилизин аминокислотные повторы (ККККККК), были клонированы в С-концевой домен белка фибера, а интегрин-связывающая последовательность была клонирована в HI-петлю фибера аденовируса типа 5, Сконцевые участки белка фибера аденовируса собак серотипа 1 и 2 были клонированы вместо соответствующего домена фибера аденовируса типа 5 [302]. В качестве контроля был использован рекомбинантный аденовирус, также дефектный по репликации, но имеющий полноразмерный фибер аденовируса человека серотипа 5. Все дефектные по репликации аденовирусные содержали репортерный ген люциферазы под контролем промотора цитомегаловируса человека (CMV). Далее вирусы в соответствующей дозе были использованы для инфекции перевиваемых клеток глиобластомы человека D65MG, D54MG и D59K. По данным литературы, эти клетки представляют весь спектр поверхностных молекул, которые в тоже время являются первичными рецепторами для модифицированных, встроенных в капсид белков фибера аденовируса. Спустя 48 часов после инфекции уровень люциферазы был измерен по стандартному методу 97 (Рис. 12 часть Б). Данные экспрессии после нормализации к общему количеству клеточного белка выражали как процент трансдукции, сравнимого с кнобом Ad5. Оказалось, что модификация Аd5/3 обеспечивала 1.5-15-кратное усиление трансдукции опухолевых клеток по сравнению с контрольным вектором, имеющим кноб Ad5. Эти результаты свидетельствуют, что среди модификаций фибера используемых в эксперименте, модификация фибера 5/3 приводит к усилению инфекции глиомных клеток аденовирусным вектором. Остается открытым вопрос: будет ли модификация фибера аденовируса 5/3 обеспечивать более высокий уровень инфекции клеток глиом в сравнении с химерами фибера 5/11 и 5/35, для которых поверхностная молекула CD46 также может являться одним из первичных рецепторов. При этом специфичность вирусной трансдукции зависит не только от того, как вирусы инфицируют клеткимишени, но и от того как здоровые клетки сопротивляются инфекции. Для изучения этого вопроса мы провели инфекцию первичных астроцитов. На Рис. 13 видно, что рекомбинантный аденовирус, содержащий модификацию 5/3, показывает наименьший уровень инфекции первичных астроцитов человека. При этом вектор Ad5/3GFP демонстрирует сниженный уровень (8.3±0.52) трансдукции астроцитов по сравнению с инфекцией контрольным вирусом Ad5/5GFP (25.3±2.8, p<0.05), Ad5/11GFP (57.3±5.8, p<0.01) и Ad5/35GFP (71.3±4.2, p<0.001). Можно сделать вывод, что 5/3 модифицированный вектор обеспечивает низкий уровень трансдукции здоровых клеток головного мозга человека. Впрочем, данные научных публикаций показывают, что присутствие CD46 не является условием, позволяющим полностью снизить токсичность вектора для здоровых клеток [55]. Оказалось, что присутствие транскрипционных областей в инвертированных терминальных повторах генома аденовируса человека типа 5, способных выполнять роль «мини-промоторов», модифицированного вектора 5/3 [319]. снижает избирательность инфекции 98 Рисунок 13 – Первичные астроциты человека демонстрируют низкий уровень инфекции для 5/3-модифицированного вектора. Первичные астроциты были инфицированы в дозе 100 инфекционных частиц на клетку и после 1 часа адсорбции не связавшийся вирус был удален. Спустя 48 часов после инфекции был измерен процент GFP-позитивных клеток. Ось ординат – процент GFPпозитивных клеток. Ось абcцисс – список вирусов. Эксперимент проведен дважды в 3 повторах, среднее значение было использовано для построения графика. Статистическая разница установлена с помощью непарного t – теста.* p<0.05 vs Ad5/5 GFP инфекции. Чтобы проверить уровень нейротоксичности компетентного вектора с модификацией фибера 5/3, мы инфицировали первичные астроциты человека в дозе 100 инфекционных единиц самореплицирующимися вирусами CRAd-5/3WT или AdWT (Рис. 14А). Как показано на рисунке, на превый день после инфекции вектор CRAd-5/3WT эффективно реплицируется в здоровых клетках головного мозга и демонстрирует сниженную экспрессию вирусных генов Е1А (934±52.8) против 7849±182 у контрольного вектора AdWT. Далее на 3 день данные векторы показывают схожую репликативную активность 8.23х10(7)±4.92x10(6) вирусных копий вектора AdWT vs 1.82х10(8) ±7.1х10(6) CRAd-5/3WT. При этом высокий уровень репликации сопровождается токсичностью клеток, представленной на 99 Рис.14Б (для вектора CRAd-5/3WT на третий день инфекции токсичность составляла 39.2±2.1% от общего числа клеток). Рисунок 14 – Онколитический вектор, имеющий модификацию 5/3 в белке фибера аденовируса, демонстрирует высокую нейротоксичность здоровых клеток (астроцитов). А) CRAd-5/3WT реплицируется в астроцитах. Количественный анализ вирусной репликации произведен на астроцитах, инфицированных контрольным вирусом (AdWT) и вирусом, узнающим клеточный рецептор CD46 (CRAd-5/3WT), путем подсчета количества копий вирусной Е4 после нормализации к 1 нг тотальной ДНК. Ось ординат – уровень вирусной ДНК после нормализации к уровню тотальной ДНК в пробе. Ось абсцисс – список вирусов; Б) Вирусная репликация CRAd-5/3WT приводит к клеточной токсичности, детектируемой в тесте пролиферации с использованием астроцитов. Эксперимент был проведен дважды в 5ти повторах, и среднее значение использовано для построения графика. Непарный t- тест * p<0.05 vs результатов контрольного вектора. Ось ординат – уровень токсичности в каждом из образцов. Ось абсцисс – список вирусов. 100 Таким образом, наши результаты свидетельствуют, что несмотря на изменение тропизма вируса путем перенацеливания вирусной частицы на рецептор CD46 уровень инфекции астроцитов оставался достаточно высоким для вектора CRAd-5/3WT. Известно, что клетки астроцитов экспрессируют на своей поверхности рецептор CD46 [320]. Сходные результаты были получены Mcquaid с соавт. [321], который проводил иммуногистохимический анализ ткани головного мозга пациентов антителами против CD46 и показал слабую экспрессию антигена в астроцитах лобной доли и гипоталамуса человека. В целом, присутствие CD46 может поддерживать инфекцию CD46-зависимого вектора и, тем самым, способствовать развитию нейротоксичности. Вероятно, данные результаты предполагают дальнейшую модификацию CRAd-5/3WT, которая смогла бы снизить токсичность 5/3специфичность. Одним из модифицированного таких видов вектора и может увеличить его служить использование опухолеспецифического промотора. 3.1.3. Сурвивин – активный компонент резистентности глиобластомы к терапии темозоломидом и ионизирующей радиацией Текущие химиотерапии, терапевтические хирургической подходы, резекции основанные и на радиотерапии применении увеличивают продолжительность жизни пациентов, но не предотвращают возникновение рецидива мультиформной глиобластомы. По данным литературы, стволовые клетки глиобластомы (ГСК) человека, отвечающие за прогрессию опухоли, обладают резистентностью к терапии [322, 323]. Использование онколитической виротерапии в терапии глиобластомы человека может быть направлено на таргетинг стволовых клеток глиобластомы человека в качестве адъювантной терапии для ионизирующей радиации и химиотерапии. Для этого мы изучили возможность использования 5/3-модифицированного вектора в контексте терапии 101 стволовых клеток глиобластомы человека, резистентных к стандартным методам лечения. Ранее мы показали, что CD46 экспрессируется на поверхности клетокмишеней, в том числе клеток опухоли пациентов, выращенных в условиях сохранения их стволовых свойств («стволовость», Рис. 5 и Таблица. 2). С целью усиления специфичности 5/3- модифицированного вектора нами было предложено изучить возможность использования промоторов генов, отвечающих за резистентность к терапии. Одним из важных подходов в изучении механизма резистентности к текущим терапевтическим подходам является исследование механизма резистентности, с использованием модельных систем. Так, Dahan с соавт., [324] показал, что первичные клетки глиобластомы человека в процессе наращивания в среде, содержащей EGF, FGF и B27 вырабатывают больше сурвивина, чем клетки, культивированные в дифференциальных условиях (Рис.15А). Причем, оказалось, что облучение клеток ионизирующей радиацией в ~3 раза усиливало экспрессию сурвивина в стволовых клетках в сравнении с его уровнем в активно пролиферирующихся клетках (p<0.05). Несмотря на существенные различия, остается открытым вопрос о роли и уровне сурвивина в тканях пациентов с первичной глиобластомой и их рецидивами. Как показало исследование Gurvenc с соавт., [325] (Рис.15Б), при рецидивах экспрессия белка сурвивина была значительно выше, чем при первичных опухолях. Таким образом, в силу повышенного уровня активности белка сурвивина, регулирующего клеточную реакцию на стресс и резистентность к терапии, клонирование промотора гена сурвивина в состав аденовирусной конструкции сможет обеспечить специфичность таргетинга резистентных клонов аденовирусным вектором. 102 Рисунок 15 – Ионизирующая радиация обеспечивает высокий уровень экспрессии сурвивина в стволовых клетках опухоли in vitro и in vivo. А) Уровень сурвивина в клетках, выращенных в присутствии питательной среды, содержащей телячью сыворотку или в клеточной среде, содержащей FGF, B27 и EGF был измерен в реакции количественного ПЦР (верх) или иммуноблоттинга (низ), с использованием специфических праймеров и антител к сурвивину человека [324]; Б) Распределение сурвивин-позитивных клеток в первичных образцах глиобластомы и их рецидивах проведено посредством иммуногистохимической окраски тканевых срезов. Результаты количественного анализа были проанализированы в 75 (непарные) и 10 (парные) образцах. Тест Манна-Уитни, p<0.05 между экспрессией в первичных образцах и рецидивах [325]. Целью второго подхода было изучение уровня экспрессии сурвивина в перевиваемых клетках глиом с помощью количественного ПЦР (Рис. 16А), иммуногистохимии тканевых срезов (Рис. 16Б), ксенографтов человека U87 и U251, выращенных в головном мозге мышей после терапии PBS (Рис. 16В) или 103 после применения комбинации темодала и ионизирующей радиации (Рис. 16Г). Результаты анализа клеток, представленные на Рис. 16 А и Б, дали возможность оценить дифференцированную экспрессию мРНК и белка гена сурвивина в клетках глиом. Для анализа уровня сурвивина in vivo, исследуемые клетки в объеме 3 мкл на инъекцию вводили в головной мозг голым мышам, используя стереотактическую рамку [17]. Через семь дней после инъекции мыши были равномерно распределены по группами, получившими терапию темодалом в комбинации с ионизирующей радиацией. Анализ экспрессии гена сурвивина в образцах головного мозга голых мышей, содержащих внутримозговые ксенографты человека U87, показал, что терапия темодалом в присутствии ионизирующей радиации приводит к индукции сурвивина (Рис. 16В). Поскольку в литературе отмечалось, что резистентностью к терапии клетки-носители маркера CD133 обладают [326-328], мы разделили первичные клетки мультиформной глиобластомы по уровню экспрессии маркера CD133. 15.2-26.2% от общего количества опухолевых клеток содержали маркер CD133 на своей поверхности (Рис. 17А). По мнению ряда авторов [329], у большинства больных с мультиформной глиобластомой наблюдается присутствие стволовых CD133позитивных клеток в интервале от 0.2 до 85% от общего количества, что связано с течением опухолевого процесса и выбором консервативного лечения. Несмотря на то, что процесс формирования, роста и прогрессирования мультиформной глиобластомы до конца не изучен, существуют публикации, показывающие, что наличие CD133 является негативным фактором прогноза выживаемости пациентов с опухолями головного мозга [330] и, в частности, глиобластомой [327, 331-333]. 104 Рисунок 16 – Анализ экспрессии гена сурвивина в первичных и перевиваемых опухолевых клетках in vitro и in vivo. А) уровень транскрипции гена сурвивина в перевиваемых клетках глиобластомы и медуллобластом человека. Обратную транскрипцию с последующей количественной ПЦР проводили, используя тотальную РНК, выделенную из 100’000 клеток и конвертированную в кДНК. Ось ординат – мРНК гена сурвивина после нормализации к внутреннему контролю (GAPDH); ось абсцисс – лизаты клеток. Иммуногистохимический анализ экспрессии сурвивина в перевиваемых клетках: глиобластомы мышей (GL261) и глиома человека (U87 и U251) (Б), in vivo внутримозговых ксенографтах U87 и U251 (В) и первичных клетках пациентов с диагнозом «мультиформная глиобластома», впоследствии получивших комбинацию темодала и ионизирующей радиации (Г). Б) Сурвивин экспрессируется в цитоплазме клеток глиобластомы человека (U87 и U251) и мышей (GL261). Полутонкие срезы, окраска гематоксилином и эозином. Увеличение Х200. Шкала: 100 микрон; В и Г) Окраска срезов ксенографтов U87 и парафиновых секций рецидивов глиобластомы человека проведена с использованием стандартной иммуногистохимической методики. Микрофотографии получены на микроскопе Leica при увеличении Х400 и шкале 50 микрон. Показана экспрессия гена сурвивина в ядре и цитоплазме опухолевых клеток. 105 Рисунок 17 – Экспрессия гена сурвивина в стволовых клетках мультиформной глиобластомы, несущих поверхностный рецептор CD133. А) Анализ экспрессии маркера стволовых клеток CD133 в образцах глиобластомы человека, проведенный методом проточной цитофлуориметрии. Уровень экспрессии белка CD133 был определен по отношению к изотипическому контролю. На рисунке указан процент АРС – меченых опухолевых клеток для первичных образцов ГБМ1, ГБМ2 и перевиваемой линии клеток глиобластомы человека U251; Б) Количественный анализ активности кандидатов-промоторов в первичных клетках глиобластомы человека, разделенных по уровню экспрессии маркера CD133 (CD133-позитивные и CD133-негативные). Соотношение экспрессии для генов CD133, BMI1, CXCR4, CMYC, MUSASHI, SOX2, SURVIVIN, NESTIN, OCT3, OLIG2 и NANOG в CD133-позитивных и CD133-негативных клетках было подсчитано для каждого образца и как среднее значение для группы, представленной 7 образцами опухолей (мультиформная глиобластома). Ось ординат – экспрессия каждого из генов была проанализирована в реакции количественного ПЦР. Ось абсцисс – список генов. 106 Активация клеточных программ в стволовых клетках глиобластомы имеет тенденцию к высокой активности промоторов [334-338]. Таким образом, можно предположить, что клонирование промотора, ген которого активен в стволовых клетках глиобластомы человека, в состав аденовирусного вектора позволит увеличить направленную инфекцию стволовых клеток. Недавние исследования показали, что в стволовых клетках активирована серия генов, отвечающих за резистентность к терапии [339] и «стволовость». В частности, при созревании CD133-позитивных клеток происходит накопление мРНК гена SOX2, а также трансактивация транскрипционных факторов, что приводит к усилению агрессивности клеток и их высокому уровню миграции и инвазии [340]. Аналогичные данные были получены на примере стволовых клеток медуллобластом человека [341]. Наряду с увеличением активности генов, отвечающих за клеточную резистентность, мы ожидали увидеть активацию генов, отвечающих за фенотипические и генотипические свойства стволовых клеток опухоли. Как и ожидалось, в нашем исследовании высокая экспрессия SOX2, OLIG2, CMYC соотносилась с низкой активностью гена нестин (NESTIN). Было показано, что ген белка сурвивина имел самую высокую активность среди исследуемых кандидатов-промоторов, что и подтвердили результаты, представленные на Рис. 17Б. Значительный интерес представляет экспериментальное исследование промотора для специфичности аденовирусной инфекции. В нашем опыте мы выявили, что в здоровых клетках головного мозга он не показывал высокую специфичность экспрессии в перевиваемых и в первичных клетках глиобластомы человека по отношению к активности промотора гена мидкайна (MK) (Рис. 18 части А и Б). Сравнимые с этими результаты мы наблюдали для промотора гена CXCR4, который был активен в основном в первичных линиях клеток глиобластомы и части перевиваемых опухолевых клеток, обладающих высокой инвазией и пролиферацией [342]. Причем, его активность в клетках U87, U118 и 107 U251 была в 11-18 раз больше аналогичной активности в здоровых клетках головного мозга. Среди трех промоторов наиболее высокая транскрипционная активность наблюдалась для промотора гена сурвивина человека. В низкопролиферирующих клетках, в противоположность к активности промоторов CXCR4 и MK, нами было отмечено в среднем 5-7-кратное увеличение уровня транскрипции сурвивина. В первичных же клетках уровень сурвивина был сравнительно высоким: в среднем 10-100 раз по отношению к активности промотора гена мидкайна человека. Рисунок 18 – Промотор гена сурвивина человека активен в перевиваемых (А) и первичных (Б) клетках мультиформной глиобластомы человека. Количественная экспрессия измерена путем использования специфических праймеров, узнающих мРНК гена сурвивина человека. мРНК экспрессия нормализована к уровню экспрессии клеточного GAPDH. Эксперимент произведен дважды в 3 повторах на образец. *p<0.05 vs экспрессии соответствующих транскриптов в здоровых клетках головного мозга; ГБМ5, ГБМ13, ГБМ15, ГБМ16, ГБМ17 – образцы первичной глиобластомы (ГБМ). НБ – образец головного мозга человека, не содержащий опухолевые клетки (данные иммуногистохимии). Ось ординат – уровень мРНК сурвивина человека после нормализации к уровню внутреннего контроля GAPDH. Ось абсцисс – исследуемые клеточные линии. 108 В дальнейшем нас интересовало, может ли клонированный вариант промотора гена сурвивина обеспечить высокий уровень экспрессии люциферазы в клетках глиобластомы человека. На основании того факта, что короткий вариант промотора гена сурвивина является более активным в клетках холангиосаромы человека [134], мы протестировали рекомбинантные вирусы с коротким (S-S) и длинным (S-L) вариантом промотора гена сурвивина человека (Рис. 19). Рисунок 19 – Схема строения рекомбинантных вирусов, содержащих длинные и короткие варианты промотора гена сурвивина человека. Короткий (~345 п.н., S-S) и длинный (~1200 п.н., S-L) вариант промотора были клонированы в состав рекомбинантного вируса (CRAd-S-S-RGD или CRAd-S-L-RGD), содержащего мотив «RGD» в петлях белка фибера. В качестве контроля использовались дефектный по репликации, но содержащий ген люциферазы под контролем короткого варианта промотора гена сурвивина человека (E1def) и дикий тип аденовируса человека (AdWT). 109 Рисунок 20 – Активности короткого и длинного промотора гена сурвивина в обеспечении специфичности и токсичности онколитического вектора. А) Микрофотографии клеточной линии U87, выросшей подкожно и получившей внутриопухолевую инъекцию вектора CRAdWT-S-L-RGD или CRAdWT-S-S-RGD в дозе 100 инфекционных единиц на клетку.*p<0.05, тест Манна-Уитни; Б и В) Сравнительная токсичность онколитических вирусов, имеющих 345 (короткий вариант) и 1200 (длинный вариант) пар нуклеотидов промотора гена сурвивина человека. 100, 10 и 1 инфекционных частиц были использованы для инфекции клеток глиобластомы человека U87, U251, A172 и #10. Через 10 дней после инфекции дефектным по репликации (E1def), S-L (длинная версия промотора гена сурвивина человека), S-S (короткая версия) и CRAdWT-RGD онколитическими вирусами клетки окрашены по методике, описанной в Материалах и методах; Б) Сравнительный анализ пролиферации самореплицирующихся вирусов CRAd-S-S-RGD и CRAd-S-L-RGD проведен с использованием метода встраивания тимидиновой метки в активно пролиферирующиеся клетки [343]. Реакция проведена через 3 дня после инфекции. Результаты проверены в 10 повторах, среднее значение ± стандартное отклонение использованы для построения диаграммы. Ось ординат – уровень тимидина, встроенного в клетки. Ось абсцисс – онколитические вирусы. Разница между CRAd-S-SRGD и CRAd-S-L-RGD * и **p<0.05 (Тест Манна-Уитни) для ГБМ1 и ГБМ2; В) Определение вирусной токсичности тестом с кристаллвиолетом на 10 день после инфекции клеток вирусами в различной концентрации. 110 Как представлено на Рис. 20 часть А (слева), внутриопухолевая инъекция онколитического вируса, содержащего промотор S-S, вызвала существенное снижение роста покожной модели глиобластомы человека U87 (справа, p<0.05). Сходные с этим различия в нарушении клеточной пролиферации мы наблюдали при инфекции первичных линий клеток глиобластомы ГБМ1 и ГБМ2 (Рис. 20 часть Б). По встраиванию тимидиновой метки в активно пролиферирующие клетки опухоли, нами было отмечено, что вектор S-S ингибировал рост этих клеток на 30-40% больше, чем онколитический вирус с длинной версией промотора (Рис. 20 часть В). Далее полученные рекомбинантные вирусы были протестированы на перевиваемых клетках глиобластомы. По окрашиванию кристаллвиолетом клеток, инфицированных аденовирусами, векторы S-S и S-L показывали сходную онколитическую активность в дозе 100 (U87 и U118) и 10 (A172) ИЕ/клетку. В то же время мы детектировали существенное (10x- кратное) увеличение цитотоксической активности для вектора S-S в клетках глиомы человека линий #10 и U251 по отношению к вирусу с более длинным вариантом промотора сурвивина. Таким образом, можно предположить, что клонирование короткого варианта промотора гена сурвивина может увеличить активность 5/3модифицированного вектора в клетках глиобластомы, особенно резистентных к терапии темодалом и ионизирующей радиацией. 3.2. Онколитический вирус CRAd-S-5/3 демонстрирует высокую избирательную токсичность по отношению к глиобластоме Для оценки способности промотора гена сурвивина контролировать экспрессию генов, в частности ген люциферазы, мы клонировали короткую версию промотора гена сурвивина человека в состав генома, дефектного по репликации аденовируса (Рис. 21А). Оказалось, что из трех тестируемых промоторов в клетках глиомы человека наиболее активен промотор гена сурвивина, но при этом его активность была ниже, чем у главного позднего 111 промотора цитомегаловируса человека (CMV) (Рис. 21 части Б и В). Интересно, что этот промотор не является опухолеспецифичным по отношению к глиобластоме, но обеспечивает высокий уровень трансдукции многих клеточных линий [344-347]. По данным, представленным на Рис. 21В, промотор гена сурвивина обеспечивает высокий уровень трансдукции первичных клеток пациентов с диагнозом «мультиформная глиобластома» (10-800 раз больше активности главного позднего промотора CMV). Следовательно, среди трех рассмотренных промоторов именно промотор гена сурвивина продемонстрировал одинаково высокую активность экспрессии люциферазы, тем самым, предполагая, что его клонирование позволит увеличить специфичность, и активность онколитического вектора по отношению к глиобластоме человека. Так как клетки глиобластомы высоко экспрессируют CD46, мы предположили, что одновременный таргетинг CD46 и транскрипционный контроль над экспрессией вирусных белков области Е1А коротким вариантом промотора гена сурвивина человека приведет к высокой специфичности онколитического вектора. На этом этапе, мы изучали возможность вектора CRAd-S-5/3, содержащего модификацию 5/3 в белке фибера (Рис. 22), демонстрировать принципиальные различия в вирусной токсичности и вирусной репликации в сравнении с рекомбинантными вирусами, имеющими дикий тип белка фибера, в дополнение к модификациям в С-концевом сегменте (CRAd-S-pK7), или петлях кноба (CRAd-SRGD). В качестве контроля были использованы рекомбинантный CRAd-S-WT, содержащий дикий тип белка фибера, и промотор гена сурвивина человека. 112 Рисунок 21 – Активность короткого минимального промотора гена сурвивина в составе дефектного по репликации аденовирусного вектора. А) Особенности строения 5’ конца области Е1 рекомбинантных аденовирусов. Промоторы генов сурвивина, СXCR4 и MK были клонированы в С-концевую часть для обеспечения транскрипционного контроля экспрессии гена люциферазы в процессе инфекции; Б) и В) Эффективность экспрессии люциферазы под контролем промотора гена сурвивина, CXCR4 или MK. 100 инфекционных частиц каждого вектора использовали для инфекции одинакового количества клеток, и спустя 48 часов после инфекции, определяли уровень люциферазной активности в каждом образце по методике, описанной в Материалах и методах. Среднее значение ± стандартное отклонение было использовано для построения диаграммы. Результаты теста были нормализованы к активности промотора цитомегаловируса человека (CMV). Ось ординат – активность аденовируса с сурвивиновым промотором в процентах от активности аденовируса с CMVпромотором. Ось абсцисс – исследованные клеточные линии. 113 Рисунок 22 – Структура рекомбинантных самореплицирующихся векторов, имеющих промотор гена сурвивина для контроля экспрессии продуктов транскрипции аденовируса. Чувствительный к радиации транскрипционный участок промотора гена сурвивина (S-S) человека управляет экспрессией ранних генов области Е1А. Кноб-участки белка фибера аденовируса человека 5 серотипа содержащие полилизиновые (ККККККК), RGD повторы, а также кноб-домена серотипа 3 были амплифицированы и клонированы методом гомологичной рекомбинации в ДНК рекомбинантного вируса путем замены соответствующего участка белка фибера серотипа 5. Полученные векторы получили название CRAdS-pK7, CRAd-S-RGD, CRAd-S-5/3. ITR – инвертированные терминальные повторы, Pa – сигнал полиаденилирования. Присутствие промотора гена сурвивина человека для контроля экспрессии аденовирусной области Е1 при наличии дикого типа фибера аденовируса типа 5 позволило изучить роль модификаций фибера RGD, pK7 и 5/3 в вирусной репликации и вирус-индуцируемой токсичности. Оказалось, что клонирование 114 всех трех модификаций существенно увеличило вирусную репликацию в клетках глиобластомы по отношению к контрольному вектору CRAd-S-WT в среднем в 200-500 раз (Рис. 23А, p<0,05). Особенно отмечено, что на 9й день вирусной репликации векторы: -и CRAd-S-pK7, и CRAd-S-5/3 демонстрируют высокий уровень репликации. Рисунок 23 – Вектор CRAd-S-5/3 показывает специфичность репликации в клетках глиобластомы. Количественный анализ вирусной репликации был проведен методом ПЦР в реальном времени, с использованием ДНК, выделенной из клеток глиобластомы (А) и срезов головного мозга человека (Б), инфицированных онколитическими вирусами. Эта ДНК была проанализирована на 1, 3 и 9 (А) или 1 и 3 дни после начала инфекции (Б). Ось ординат – количество вирусной ДНК после нормализации к общему уровню ДНК в исследуемой пробе. Ось абсцисс – исследуемые вирусы. «*», «**», «***» и «#»,»##» Статистическая разница между уровнем репликации CRAd-S-5/3 vs CRAd-S-pK7 в клетках глиобластомы человека (M58K и D65MG) и образцах здоровой ткани головного мозга человека (НБ1 и НБ2) (p<0.05). 115 Рисунок 24 – Клеточная токсичность онколитических вирусов, выявленная тестом с кристаллвиолетом и методом вирусного титрования. CRAd-S-5/3 показывает специфичную цитотоксичность в клетках глиобластомы человека (А) и низкую активность в первичных астроцитах человека (Б). Клетки были инфицированы вирусами в различной концентрации, и после 10 дней инкубации монослой клеток был окрашен кристаллвиолетом. Высвобождение вирусных частиц из инфекционных астроцитов было детектировано по формированию бляшек, как описано в Материалах и методах. Низкая токсичность CRAd-S-5/3 в астроцитах соответствует низкому уровню выделения дочерних вирусных частиц (В). Ось ординат – концентрация инфекционных частиц, выявленных в супернатанте. Ось абсцисс – дни после инфекции вирусами. CRAd-S-5/3 демонстрирует сниженную репликативную активность в первичных астроцитах человека в сравнении с активностью контрольного вектора AdWT. «*» Тест Манна-Уитни, р<0.05. 116 В отличие от репликации CRAd-S-pK7 в здоровых клетках головного мозга, CRAd-S-5/3 реплицируется довольно слабо. Так, при инфекции срезов головного мозга пациентов, не содержащих неопластические клетки, мы наблюдали 100кратное снижение репликации CRAd-S-5/3 по отношению к CRAd-S-pK7 (Рис. 23Б). Таким образом, наши данные свидетельствуют о преимуществах, которые несет модификация 5/3 фибера для избирательной репликации аденовируса в клетках глиобластомы. Для проверки взаимосвязи усиления репликации и избирательной токсичности, мы провели тесты на токсичность, специфичность вирусной инфекции, а также изучили возможность вируса усиленно выделять прогенные частицы из опухолевых клеток. В ходе теста на токсичность нами установлено, что CRAd-S-5/3 показывает наиболее сильную цитотоксичность на клеточных линиях глиом U87, M59K и D65. На клетках линии M59K цитотоксический эффект наблюдался при концентрации 1 инфекционная частица на клетку. Похожий эффект наблюдался для контрольного вируса AdWT. Как следует из данных, представленных на Рис. 24А, вектор CRAd-S-5/3 показывал ярко выраженную цитотоксичность, превышающую активность контрольного вектора в 100(U87) и 1000(D65) раз соответственно. Выраженная цитотоксичность наблюдалась для вектора CRAd-SRGD в дозе 10 инфекционных частиц на клетку (ИЕ/клетку). Несколько более слабый эффект был выявлен для одного из контрольных векторов AdWT, инфекция которым была токсичной для роста астроцитов в концентрации 100 ИЕ/клетку. Как следует из данных, представленных на Рис. 24Б, инфекция CRAdS-5/3 требовала в 10 раз больше вирусных частиц для достижения того эффекта, который демонстрировал AdWT при инфекции в 100 инфекционных доз на клетку. Сопоставимый с этим эффект мы наблюдали для инфекций CRAd-S-pK7 и CRAdWT-RGD. Полученные результаты коррелируют с данными титрования вирусных частиц, выделенных из инфекционных клеток. Оказалось, что вектор CRAd-S-5/3 показывал самый низкий уровень продукции вирионов, который был ~1000 раз 117 меньше активности CRAd-S-RGD, ~100 раз AdWT и ~5раз CRAd-S-pK7. Таким образом, благодаря отсутствию токсичности для астроцитов, а также выраженной цитотоксичности для неопластических клеток, CRAd-S-5/3 является эффективным инструментом против целого ряда клеточных линий глиобластомы. Для достижения данного эффекта вирусу CRAd-S-pK7 требовалось большее количество (от 10 до 100) инфекционных частиц, чем вирусу CRAd-S-5/3. В то время как, в клетках глиобластомы человека линии U251 активность всех четырех векторов являлась схожей в дозе 100 инфекционных единиц на клетку, контрольный вектор AdWT показывал самую высокую цитотокcичность против опухолевых клеток линии D54MG. По сравнению с активностью контрольного вектора, все три вектора: CRAd-S-5/3, CRAd-S-RGD и CRAd-S-pK7 – обладали цитотоксичностью, в 10 раз уступающей AdWT (Рис. 24Б). При этом уровень выделения дочерних вирусных частиц вектора CRAd-S-5/3 был наименьшим среди тестируемых конструкций (Рис. 24В). Поскольку поведение перевиваемых линий клеток может сильно отличаться от агрессивного поведения первичных линий клеток глиобластомы человека, выделенных от пациентов, мы также инфицировали первичные клетки в дозе 100 инфекционных единиц на клетку рекомбинантными вирусами CRAd-S-5/3, CRAd-S-RGD и CRAd-S-pK7. Как показывают наши результаты, наибольшая токсичность для CD133 позитивных клеток ГБМ1 была обнаружена для вирусов CRAd-S-RGD (44,24±3,42%) и CRAd-5/3(38,14 ± 2,06%) (Рис. 25). В линии ГБМ2, активность вектора CRAd-S-5/3 была несколько меньше по отношению к CRAd-S-RGD (72,42 ± 8,92%), и CRAd-5/3 (68,31 ± 5,09%, p<0.05). Сходный эффект ингибирования наблюдался для вектора CRAd-S-pK7. Исходя из наших результатов, можно сделать вывод, что модификация 5/3 демонстрирует более высокий уровень трансдукции, репликации и токсичности в сравнении с CRAd-S-pK7, одним из кандидатов для клинических испытаний в США. 118 Рисунок 25 – Ингибирование пролиферативной активности первичных стволовых клеток глиобластомы человека онколитическими вирусами на основе генома аденовирусов человека 5 серотипа. Онколитические вирусы, обеспечивающие экспрессию вирусных белков ранней области Е1А под контролем промотора сурвивина человека и содержащие модификации 5/3, pK7 или RGD в последовательности белка фибера, были использованы для инфекции первичных клеток глиобластомы человека (ГБМ 1 и 2). Клетки перед инфекцией были разделены на две популяции (CD133+, или CD133 позитивные; CD133-, или CD133-негативные), с использованием поверхностного маркера CD133. Токсичность экспериментальных вирусных конструкций, а также контрольных вирусов (AdWT, CRAd-RGDWT5 и CRAd-5/3) была исследована с помощью МТТтеста. Ось ординат – процент гибели клеток при терапии. Ось абсцисс – исследованные онколитические адновирусы. Эксперимент проведен дважды с 6 повторами на образец, среднее значение среди двух экспериментов было использовано для построения графика, и статистическая разница между AdWT и CRAd-S-5/3 была определена с использованием теста Манна-Уитни *p<0.05 vs AdWT. 119 На следующем этапе мы сравнили активность рекомбинантных вирусов, узнающих рецептор CD46 на поверхности клеток-мишеней, предполагая, что модификация 5/3 продемонстрирует более высокий уровень инфекции клетокмишеней в сравнении с другими вирусами. Поскольку аденовирусы типа 11 и 35 относятся к той же нозологической группе (Группа «В»), что и аденовирус тип 3, в которой CD46 является одним из рецепторов узнавания клеток- мишеней, мы изучили способность вирусных векторов инфицировать клетки глиом человека, используя рецептор CD46. Для выполнения этого эксперимента использовались плазмидные конструкции, охарактеризованные д-р A. Liber (University of Washington, Seattle, США). Эти плазмиды были использованы для получения векторных систем, дефектных по репликации, но содержащие ген зеленого белка. Аденовирус-содержащие конструкции 5/3, 5/11 и 5/35 AdEasy были котрансфицированы с плазмидой, содержащей ген сурвивина человека (Рис. 26). В процессе амплификации скрининга полученные образовавшихся рекомбинантные колоний вирусы и были последующей выделены и охарактеризованы. Результаты вирусной репликации, представленные на Рис. 27, показали, что в трех типах неопластических клеток (A172, U118 и U87) CRAd-S5/3 демонстрировал один из самых высоких темпов вирусной репликации, выявленный на 5 день вирусной инфекции. 120 Рисунок 26 – Схема строения онколитических векторов, узнающих поверхностный рецептор CD46. CD46 связывающий участок белка (кноб) фибера аденовируса серотипа 3, 11 и 35 был клонирован вместо фибера-домена аденовируса типа 5 в составе онколитического вектора, содержащего промотор гена сурвивина (S-S), управляющего частью генома Е1А. Вирус AdWT был использован в качестве контроля. CRAd-S-pK7 – один из кандидатов в клинические испытания в США. Этот вектор содержит полилизин-связывающие участки в белке фибера, позволяющие узнавать рецепторы гепарансульфата. 121 Рисунок 27 – Эффективность вирусной репликации в клетках глиобластомы человека. Количественный анализ вирусной репликации в перевиваемых клетках глиобластомы человека A172, U118, U251 и U87 был проведен методом ПЦР в реальном времени с использованием ДНК, выделенной из клеток глиобластомы на 1, 3 и 5 сутки после начала инфекции. Результаты представлены как количество копий Е4, нормированной на 1нг тотальной ДНК, выделенной из клеток. Ось ординат – количество вирусной ДНК после нормализации к 1 нг тотальной ДНК. Ось абсцисс – дни после инфекции. * статистическая разница в репликативной активности между CRAd-S-5/3, CRAd-S-5/11, CRAd-S-5/35, CRAd-S-WT и репликацией вектора AdWT была выявлена с помощью теста Манна-Уитни.»*» и»**» p<0.05 и p<0.001 соответственно. 122 Рисунок 28 – Противоопухолевая активность онколитических векторов в клетках глиобластомы человека. А) Схема анализа клеточной токсичности с использованием кристаллвиолета на 10ый день вирусной инфекции; Токсичность исследуемых онколитических вирусов, выявленная в клетках глиобластомы человека (Б) и первичных астроцитах человека (В). В сравнении с уровнем репликации CRAd-S-WT, CRAd-S-5/3 демонстрирует 10–1000 кратное увеличение репликации в зависимости от клеточных линий. В перевиваемых клетках глиом СRAd-S-5/3 показывал высокую токсичность, детектируемую в реакции с кристаллвиолетом, в 2 сильно пролиферирующих инвазивных линиях клеток в концентрации 0.1 и 10 инфекционных единиц на клетку (Рис. 28Б). В тесте на токсичность на астроцитах CRAd-S-5/3 требовал в 1000 раз больше вирусных частиц, по сравнению с активностью, продемонстрированную векторами CRAd-S-5/11, CRAd-S-5/35 и AdWT (Рис. 28В). В целом, среди группы В-модифицированных векторов CRAd-S-5/3 показывал наибольшую специфичность к клеткам глиом. 123 Дозолимитирующая токсичность онколитических векторов была определена на основании общей нейротоксичности и изменения физиологического состояния животных после внутримозговой инъекции. В ходе эксперимента in vivo внутриопухолевое введение 10 (12) доз онколитического вируса на животное не выявило каких-либо различий в физиологическом состоянии и поведенческой реакции мышей. При использовании как безтимусных мышей, так и иммунокомпетентных золотистых хомяков (с полноценным иммунным ответом), не было выявлено ни потеря массы тела животных, ни развитие нейрологических реакций. Таким образом, полученные результаты позволяют предположить, что онколитические вирусы, содержащие промотор гена сурвивина, не являются токсичными для экспериментальных животных. 3.2.1.Определение эффективности генно-инженерного препарата CRAd-S-5/3 с использованием внутримозговых моделей глиобластомы человека Для сравнительной оценки эффективности онколитических векторов мы тестировали противоопухолевый эффект на внутримозговых моделях глиобластомы человека. Несмотря на преимущества в использовании подкожных моделей глиобластомы для оценки терапевтического потенциала вирусов, необходимо учитывать роль уникального микроокружения головного мозга при формировании и прогрессии внутримозговой опухоли. В нашем эксперименте животным с экспериментальной глиомой U87 или U251 вводили внутрь опухоли 100 инфекционных единиц вектора CRAd-S-5/3 на вводимую клетку. В аналогичных дозах вводили генно-инженерные препараты вирусов CRAd-S-5/11, CRAd-S-5/35, или контрольные векторы CRAd-S-WT и AdWT. Из результатов, представленных на Рис. 29, следует, что в контрольной группе использовали 6 животных, из которых 1 погибло после инъекции опухолевых клеток. Злокачественные образования в процессе развития данного эксперимента были идентифицированы у мышей на 7 день. 124 Рисунок 29 – Медиана выживаемости мышей с внутримозговыми ксенографтами в зависимости от терапии онколитическими векторами. Терапия онколитическим вирусом была проведена на внутримозговых моделях глиобластом человека U87 (верхняя часть рисунка) и U251 (нижняя часть рисунка). На 7й день после инокуляции опухолевых клеток в головной мозг мыши были разделены на одинаковые группы (по 5 животных в группе) для внутриопухолевого введения PBS или векторов AdWT, CRAd-S-WT, CRAd-S-5/3, CRAd-S-5/11, CRAd-S-5/35 или CRAd-S-pK7 в дозе 100 инфекционных единиц на клетку. На рисунке представлены кривые выживаемости мышей для групп, получивших внутриопухолевую инъекцию PBS, AdWT, CRAd-S-wt, CRAd-S-5/3, CRAd-S-5/11, CRAd-S-5/35 (А) и PBS, CRAdS-5/3 и CRAd-pK7 (Б). Ось ординат – выживаемость мышей в каждой группе. Ось абсцисс – дни после имплантации опухолевых клеток в головной мозг мышей. Статистические различия были выявлены с помощью логарифмического рангового критерия. Вектор CRAd-S-5/3 продемонстрировал 50% выживаемость мышей на 51 и 49 дни после имплантации им клеток глиом человека U251 и U87 соответственно. 125 У экспериментальных животных, получивших инъекции онколитических векторов, потеря веса впервые замечена в группах мышей, которым вводили AdWT и CRAd-S-WT. В целом, средняя выживаемость мышей с внутримозговыми опухолями U87, и получивших внутриопухолевую инъекцию CRAd-S-WT, AdWT, CRAd-S-5/11 или CRAd-S-5/35, была практически одинаковой (в среднем достижение 50% процентной выживаемости наблюдалось на 36 день). Таким образом, можно предположить, что применение CRAd-S-WT, AdWT, CRAd-S-5/11 и CRAd-S-5/35 в разовой дозе 100 инфекционных частиц на клетку является неэффективной для увеличения выживаемости животных с ксенографтами U87 животных. В противоположность этому, применение CRAd-S-5/3 вызывало достоверное увеличение продолжительности жизни мышей (УПЖ)= 40% (p <0.05 против PBS). В ксенографтах U251 вектор CRAd-S-5/3 демонстрировал 50% выживаемость на 47 день после имплантации опухолей (p<0.05 против PBS). Такой же эффект наблюдался для внутримозговой инъекции вектора CRAd-S-5/35. Сравнение терапевтической активности СRAd-S-pK7 и CRAd-S-5/3 показало отсутствие достоверных отличий в увеличении выживаемости на внутримозговых моделях глиобластомы человека U87 и U251 (Рис. 29 Б). В обоих экспериментах после гибели животного в части образцов головного мозга мышей, получивших внутриопухолевое введение PBS, обнаружены крупные опухоли как результат полиферации клеток U87 и U251. Однако неопластические клетки глиобластомы человека обнаружены в тканевых срезах головного мозга только 3 и 2 погибших мышей после внутриопухолевой инъекции СRAd-S-pK7 и СRAd-S-pK7 соответственно. Как следует из наших результатов, терапия глиобластомы CRAdS-5/3 способствовала выживанию мышей. Далее, мы изучили, будет ли CRAd-S5/3 эффективно ингибировать пролиферацию первичных клеток глиобластомы человека, выделенных из опухолей пациентов. По данным нашего анализа (Рис. 30), в ГБМ2 10 инфекционных единиц CRAd-S-5/3 снижали пролиферацию опухолевых клеток, тогда как в ГБМ1 эта величина не превышала 30%. В 126 сравнении с CRAd-S-pK7, вирусу CRAd-S-5/3 требуется примерно в 100 раз меньше вирусных частиц для ингибирования роста клеток. В изолятах ГБМ4 и 5, CRAd-S-5/3 показывал сильную токсичность в дозе 10 инфекционных частиц на клетку (40-73% опухолевых клеток было чувствительно к инфекции вирусом). Рисунок 30 – Первичные клетки глиобластомы резистентны к вирусной инфекции онколитическим вирусом. Чувствительность опухолевых клеток к инфекции AdWT, CRAd-S-WT, CRAd-S-5/3, CRAd-S-5/11, CRAd-S-5/35 или CRAd-S-pK7 в различных концентрациях измерена на 5 день после инфекции с помощью теста МТТ. Эксперимент проведен дважды в 4 повторах на опыт. Ось ординат – кратность пролиферации по отношению к отрицательному контролю. Ось абсцисс – онколитичексие вирусы. Столбцы с черным, синим, зеленым и красным цветом соответствуют 0.01, 0.1, 1 и 10 множественности инфекции вируса на клетку. *p<0.05 vs CRAd-S-5/3 в дозе 10, 1 ИЕ/клетку (множественность инфекции), # p<0.05 vs CRAd-S-WT. 127 Таким образом, полученные результаты позволяют считать перспективным применение генно-инженерного препарата CRAd-S-5/3 для лечения глиобластомы человека. Особенно важно отметить статистически достоверное увеличение общей выживаемости мышей с внутримозговыми ксенографтами U87. Тем не менее несмотря на проведенную терапию, почти 50% мышей с внутримозговой глиобластомой погибают в течение первых 60 дней после инокуляции опухолевых клеток в головной мозг. Следовательно, необходимо дальнейшее усиление терапевтического потенциала генно-инженерного препарата. Одним из вариантов увеличения токсичности онколитических векторов является применение химиопрепаратов и ионизирующего излучения с целью увеличения их клинической перспективности. 3.3. Способы усиления терапевтического эффекта онколитического вектора in vitro и in vivo 3.3.1. Усиление вирусной репликации 3 CRAd-S-5/3 верапамилом Терапевтический эффект онколитического вектора зависит не только от способности селективно доставлять рекомбинантную ДНК в клетки-мишени, нарабатывать вирусные продукты, ограничивать клеточную пролиферацию, но и высвобождать прогенные частицы для инфекции близлежащих опухолевых клеток. Данные экспериментальных исследований показывают эффективность онколитических аденовирусов против многих перевиваемых клеток глиобластомы человека, однако предварительные результаты пока свидетельствуют, что длинный репликативный цикл может лимитировать использование векторов в терапии глиобластомы. Недавние результаты с использованием ингибиторов Pгликопротеидов показывают, что ссуществует возможность увеличить выход вирусных частиц из инфицированных клеток [348, 349]. Нами показано, что 128 верапамил в концентрации 1.42µМ и 14.2µМ (U251) (Рис. 31) снижает пролиферацию опухолевых клеток U87 и U251 на ~60 и ~87% соответственно. Рисунок 31 – Чувствительность перевиваемых клеток глиобластомы человека U87 и U251 к терапии верапамилом. 10-кратные разведения верапамила (начиная с 1.42µМ до 14.2 мМ) были использованы для определения клеточной токсичности. Эксперимент проведен дважды, используя 6 повторов на образец. Среднее значение для токсичности было использовано для построения графика. Использование верапамила в концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) 1.15µМ (U87) 8.35µМ (U251) в комбинации с CRAd-S-5/3 не оказывает существенного аддитивного ингибирующего эффекта в линии клеток U87 (Рис. 32). Однако экспозиция клеток глиобластомы человека линии U251, инфицированных онколитическими вирусами в дозе 100 инфекционных единиц на клетку, вызывает увеличение вирусной токсичности от комбинации с верапамилом с 15.2±1.2 до 50.3±1.67 (1 ИЕ/ клетку) и в дозе 10 ИЕ/ клетку 52.3±4.49 vs 81.3±3.82% погибших клеток. При этом в клетках U87, в которых не детктировано P-gp [350], схожего эффекта мы не наблюдали. Далее подвергнув клетки, инфицированные CRAd-S-5/3 в присутствии верапамила, действию 129 ионизирующей радиации, мы обнаружили увеличение продукции вирионов через 72 часа от начала эксперимента (Рис. 32 Б и В). Следовательно, можно предположить, что увеличение токсичности в присутствии верапамила может быть использовано в клинической практике. Рисунок 32 – Усиление клеточной токсичности онколитического вектора в присутствии ингибитора клеточных транспортеров верапамила. Ингибитор транспортеров ABC –верапамил- усиливает токсичность онколитического вируса в клетках U251, но не в U87, дефектных по P-gp. Пролиферационный тест в присутствии комбинации онколитического вируса CRAd-S-5/3 (100, 10, 1 и 0.1 вирусных частиц на клетку) и верапамила был определен методом реакции МТТ. Среднее значение ± стандартное отклонение было подсчитано на основании 6 повторов на каждый из опытных образцов. Для определения статистической разницы использовали тест Манна-Уитни. Ось ординат – процент выживаемости клеток. Ось абсцисс – список режимов (Верапамил и онколитический вирус CRAd-S-5/3 (ОВ); В) Верапамил усиливает выделение дочерних вирусных частиц из инфицированных клеток линии U251, содержащих P-gp. Эксперимент проведен дважды, и результаты одного представлены на рисунке. Вирусное титрование было проведено из клеточных суспензий на 24 и 72 день после начала инфекции клеток в 3 повторах каждый. Существенная разница была обнаружена между группами, инфицированными ОВ в присутствии инфицированными клетками после начала терапии. верапамила vs только 130 3.3.2. Механизм клеточной смерти, вызываемой онколитическим вирусом CRAd-S-5/3 Наш интерес к изучению механизма клеточной смерти, вызываемой терапевтическими агентами, связан с участием клеточной реакции. Во многих научных публикациях отмечено, что ответ клетки на действие раздражителя зависит от активации целого ряда сигнальных путей. В последнее время в клеточных экспериментах особое внимание уделяется индукции клеточной смерти, вызываемой онколитическими вирусами. Клеточные белки, ответственные за активацию и репрессию клеточной смерти, находятся в постоянном балансе для регулирования реакции клетки на внешние раздражители. Наши недавние исследования показали, что онколитический вирус на основе генома аденовируса типа 5, имеющий промотор гена сурвивина, контролирующий экспрессию ранних генов аденовируса, индуцирует апоптоз в клетках глиом (Рис. 33). По сравнению с активностью AdWT и AdRGD, мы детектировали увеличение экспрессии цитохрома С в клетках U87, инфицированных CRAd-S-RGD, что соответствовало большей экспрессии Е1А этим вектором. Позднее, нами было показано, что развитие апоптоза увеличивает цитотоксичность онколитического вируса CRAd-S-pK7 в клетках глиобластомы U87 in vivo [160]. При более детальном исследовании мы получили данные, что нарушение клеточного деления за счет накопления клеток в G2/M фазе (с 27 до 36.4%) сопровождается увеличением процента клеток, находящихся в стадии раннего апоптоза (с 9.2% до 32% в течение первых 72 часов инфекции) [180]. На молекулярном уровне нами было показано, что инфекция клеток глиом CRAd-SRGD вызывает слабую активацию транскрипции проапоптотических белков, таких как BIK (1.26-кратное против контроля) и BIM (2.26 против контроля) соответственно. Последующий анализ белковой экспрессии клеточных лизатов после инфекции онколитическими вирусами показал накопление общего BAD и отсутствие экспрессии фосфорилированной формы белка BAD. 131 Рисунок 33 – Экспрессия проапоптотических генов в клетках U87, инфицированных онколитическими векторами AdWT, AdRGD и CRAd-S-RGD. 50 мкг тотального белка было проанализировано в реакции вестерн-блоттинга. Мембраны с иммобилизованными белками были проинкубированы с антителами против белков аденовирусной области E1A, а также клеточных белков Суtochrome C, p53 и BAX. Лунка 1 – контрольные клетки линии U87; Лунка 2, 3 и 4 – клеточные лизаты линии U87, инфицированные самореплицирующимися онколитическими векторами AdWT, AdRGD и CRAd-S-RGD в дозе 100 ИЕ/клетку. Через 24 часа после инфекции клеточные фракции были проанализированы в ПААГ геле. Актин использовали в качестве контроля для нанесения белка в лунку геля. 132 Несмотря на индукцию общего цитохрома С, развитие апоптотической реакции по митохондриальному типу в клетках, инфицированных онколитическим аденовирусом, не наблюдалось. В поддержку этого утверждения говорит и отсутствие накопления расщепленной каспазы 3 класса в присутствии ингибитора Z-VAD-FMK. Таким образом, по нашим данным, совокупность клеточных реакций вызывает вирусную цитотоксичность, что приводит к клеточной смерти. Внутриклеточная активация сигнальных путей затрагивает, как правило, один из главных эффекторов клеточной реакции, ген AKT1 [351, 352]. В наших опытах, онколитический вирус под управлением промотора гена сурвивина человека активирует AKT1, что выражается в большей экспрессии фосфорилированной формы (pAKT) на 5 день вирусной инфекции. В литературе отмечено, что активация этого белка позволяет запустить клеточные программы, ответственные за выживаемость [353, 354], например, аутофагию (Рис. 34А). Как показано на Рис. 34 части Б и В, инфекция клеток глиобластомы человека онколитическим аденовирусом вызывает формирование двухмембранных вакуолей-аутофагосом, что коррелирует с индукцией и последующим развитием аутофагии. Нами получены результаты, согласно которым присутствие промотора гена сурвивина оказывает более сильное влияние на индукцию программируемой клеточной гибели при концентрации 100 инфекционных единиц на клетку [180]. Более того, оказалось, что ингибирование аутофагии путем транзиентной репрессии Beclin 1 мРНК снижает уровень аутофагосом, обнаруженных по встраиванию красителя акридина оранжевого, и, как следствие, общий терапевтический эффект онколитического вектора in vitro и in vivo [180]. Эти данные коррелируют с результатами, полученными Tong с соавт., [355] и Klein с соавт., [356], что подтверждает вклад аутофагии в проявлении вирусиндуцируемой токсичности. 133 Рисунок 34 – Индукция аутофагосом (А, Б) и конверсия маркера аутофагии LC3 in vivo (В) в ответ на репликацию онколитического вектора, содержащего промотор гена сурвивина человека. А) Схема развития аутофагии; Б) Экспрессия аутофагийных вакуолей в цитоплазме (электронные микрофотографии контрольных и инфицированных онколитическими аденовирусами клеток). Белые стрелки показывают на индукцию двухмембранных вакуолей, черные стрелки указывают на присутствие вирусных частиц в ядре инфекционных клеток. Шкала 2.5 Нм, увеличение x4060 или x8260; В) Иммуногистохимия тканевых образцов U87 внутримозговых ксенографтов, инфицированных вирусом или PBS (контроль) в реакции с антителами, узнающими маркер LC3-II. Шкала 10 микрон, увеличение Х400. 134 Механизм индукции аутофагии долгое время оставался неизученным, пока Rodriguez Rocha с соавт [357] сравнил индукцию аутофагии в ответ на инфекцию онколитическими векторами, содержащими частичные или полные мутации/делеции в составе Е1А/Е1B областей аденовирусов. По мнению автора, этот вирус не способен активировать аутофагию, что было детектировано в реакции конверсии клеточного белка LC3-II в LC3-I. В то же самое время наличие Е1В делеции способствовало развитию аутофагии. Следовательно, по мнению автора, развитие аутофагии зависит от присутствия Е1А области. Аутофагия-это катаболический процесс удаления патогенов и продуктов распада с помощью двухмембранных фагосом. Развитие аутофагии происходит в ответ на действие грибковых [358], бактериальных [359] и вирусных агентов [360, 361] и, по всей видимости, такая клеточная реакция является элементом клеточной защиты. Многие вирусные агенты, такие как HIV и цитомегаловирус (CMV) [362, 363], репрессируют развитие аутофагии, тем самым искусственно создают условия для вирусной персистенции [364, 365]. Как указано выше аденовирус кодирует вирусные продукты, активирующие аутофагию. Из них вирусная область Е1А, связываясь с клеточным белком ретинобластомы, активирует экспрессию транскрипционного фактора E2F1, что ведет к последующей активации LC3 и ATG5 [366]. В свою очередь, по последним данным, Е1В также область вызывает Beclin 1 зависимую активацию аутофагии. Принимая во внимание роль Е1А/Е1В в ингибировании активности Mre11, как часть комплекса Mre11-Rad50-NBS1 [367, 368], а также активацию экспрессии FADD путем усиления формирования комплекса с ATG5 [369], роль вирусных продуктов не ограничивается просто индукцией аутофагии. В противоположность функции белкам аденовирусной Е1 области белки Е4 области напротив ингибируют развитие аутофагии путем активизации mTOR сигнального пути для супрессии аутофагии через активность ULK1 [370, 371]. 135 По нашему предположению, если аденовирус кодирует гены, ответственные за индукцию аутофагии и за их репрессию, остается неясным роль аутофагии для аденовирусной токсичности. С этой целью инфекцию клеток глиобластомы человека (U87, U118 и первичной линии клеток глиомы пациента (ГБМ71) онколитическим вирусом CRAd-S-5/3, мы блокировали ингибиторами аутофагии Baf A1(ингибитор поздней фазы аутофагии, предотвращающий слияние аутофагосомы и лизосомы), а также 3Ma (ингибитор фосфатидилинозитол– киназы, PI3K), приводящий репрессию mTOR-сигнального пути. В качестве контроля нами использовалась линия клеток А549- модельные клетки в которых CRAd-S-5/3 был амплифицирован. В реакции пролиферации мы обнаружили, что действие на вирусную инфекцию ингибиторов аутофагии стимулирует клеточную пролиферацию (Рис. 35А) и снижает цитотоксичность вирусной инфекции, детектируемую в реакции высвобождения лактатдегидрогеназы из поврежденных клеток (LDH реакция) (Рис. 35Б). Это увеличение клеточной пролиферации составляет до 30% в образцах, инфицированных вирусом и затем обработанных ингибиторами по сравнению с только инфицированными клетками. Отсюда можно предположить, что mTOR является важным для вирусной инфекции и значительная часть вирусной цитотоксичности ассоциируется с развитием аутофагии. Химические ингибиторы, как правило, аттенуируют несколько сигнальных путей, что и было показано для 3Ма [372, 373]. Однако остается неясным: будет ли уровень аутофагии обратно коррелировать с выживаемостью клеток и существует ли возможная связь между CRAd-S-5/3, индукцией аутофагии и апоптозом [4]. 136 Рисунок 35 – Ингибирование аутофагии химическими блокаторами снижает чувствительность опухолевых клеток к инфекции CRAd-S-5/3. А) Пролиферация опухолевых клеток, инфицированных вирусом в присутствии химических ингибиторов аутофагии 3 Метиладенина (3Ма) и Бафиломицина А1(Baf A1) измерена в реакции МТТ. Среднее значение определено для каждого из образцов. Ось ординат – оптическая плотность. Ось абсцисс – список клеточных линий. Клеточная цитотоксичность измерена с помощью флуоресцирующего теста путем высвобождения фермента лактатдегидрогеназы (LDH). На рисунке представлены результаты изменения пролиферации и высвобождение лактатдегидрогеназы из клеток, обработанных онколитическим вирусом в присутствии/отсутствии 3 Метиладенина (3Ма) или Бафиломицина А1 (Baf A1). Среднее значение определено среди 5 повторов на образец. Тест Манна-Уитни, *p<0.05 vs экспрессии CRAd-S-5/3 (Онколитический вирус, ОВ). Ось ординат – уровень лактатдегидрогеназы. Ось абсцисс – список клеточных линий. 137 Как показывают наши результаты, представленные на Рис. 36А, на первый день после инфекции онколитический вирус индуцирует образование двухмембранных вакуолей в исследуемых клетках. В этот период, нами обнаружено, что примерно ~41% (A549), ~18%( U118) и ~19% (U87) клеток от их общего числа содержали вакуоли. К 3 дню инфекции этот уровень увеличивался до ~75, ~42 и ~63% соответственно. Однако, добавление к инфицированным клеткам ингибитора Baf А1 значительно снижало появление вирус-индуцируемых акридиноранжевых вакуолей (до 32% (A549) и 13% (U87), p<0.05). 3 Метиаденина (3Ма) на первый день после инфекции существенно аттенуировал формирование А549 и U118 клеток с вакуолями. Через 72 часа после инфекции присутствие 3Ма оказывало существенное ингибирование клеток с вакуолями, что выражалось в снижении этого показателя на 20 – 45% в зависимости от линии клеток. Чтобы подтвердить, что 3Ма существенно снижал развитие аутофагии нами был изучен уровень конверсии LC3 белка в клетках, инфицированных вирусом и после обработанных 3Ма или Baf A1. Как и ожидалось, присутствие 3Ма снижало LC3-II, уровень которого был значительно выше в инфицированных образцах, что свидетельствует об ингибировании развития аутофагии (Рис. 36Б). Нами выдвинуто предположение, что уровень апоптоза тоже должен измениться, так как аутофагия и апоптоз связаны друг с другом [374, 375]. Оказалось, что CRAd-S-5/3 вызывал индукцию апоптотических клеток, детектируемых по окраске с антителами, узнающими Annexin V. В наших результатах уровень Annexin V -позитивных клеток варьировал от 12,5 до 28% (Рис. 36В). Добавление 3Ма существенно снижало уровень апоптотических клеток с инвертированной мембраной с 12 до 3% (U87), 14 до 8% (U118) и с 28 до 13% (А549). В противоположность этому, добавление Рапамицина, индуктора аутофагии, увеличивало уровень апоптотических клеток. Оказалось, что уровень клеток с расщепленной каспазой на 10-30% было выше в клетках инфициованных вирусом в присутствии рапамицина по отношению к инфекции CRAd-S-5/3 вектором (Рис. 36Г). 138 Рисунок 36 – Аутофагия и апоптоз участвуют в CRAd-S-5/3 индуцируемой цитотоксичности. А) Уровень двухмембранных вакуолей в инфицированных клетках был обнаружен с помощью проточной цитофлуориметрии по встраиванию интеркалирующего красителя акридина оранжевого. Эксперимент был повторен дважды с 4 повторами на клеточную линию. Среднее значение акридин-позитивных клеток было определено для каждого образца на 1 и 3 дни инфекции онколитическим вектором в присутствии или отсутствии ингибиторов. 139 Статистическая разница была измерена с помощью теста Манна-Уитни.»*»p<0.05 vs уровня экспрессии в CRAd-S-5/3 инфицированных клетках. Ось ординатпроцент клеток, окрашенных акридином оранжевым. Ось абсцисс-дни после инфекции; Б) Анализ белковых фракций клеточных лизатов на предмет конверсии LC3-II в LC3-I, а также экспрессия клеточного p62 был произведен в ПААГ. Лунка 1 – контрольные клетки; Лунка 2 – клетки, обработанные Baf A1; Лунка 3 – клетки, обработанные 3Ма; 4 – клетки, инфицированные CRAd-S-5/3 (онколитический вирус); 5 и 6 лунки – клетки, инфицированные CRAd-S-5/3 (онколитический вирус) в присутствии 3Ма и Baf A1 ингибиторов аутофагии. Через 24 часа после инфекции клеточные фракции были проанализированы в ПААГ геле. Актин – использовали в качестве контроля для нанесения одинакового количества белка в лунку геля; В) Ингибитор 3Ма снижает уровень Annexin V позитивных инфицированных клеток. Присутствие 3Ма существенно снижает развитие апоптоза в ответ на инфекцию онколитическим вирусом. Статистическая разница была измерена с помощью теста Манна-Уитни.»*» p<0.05 vs уровня экспрессии в CRAd-S-5/3 инфицированных клетках. Ось ординат – процент Annexin V позитивных клеток. Ось абсцисс – список клеток; Г) Рапамицин – активатор mTOR сигнального пути увеличивает апоптотическую реакцию онколитического вируса по отношению к монотерапии вирусом. Статистическая разница была измерена с помощью теста Манна-Уитни.»*»p<0.05 vs уровня экспрессии в CRAd-S-5/3 инфицированных клетках. Ось ординат – процент каспаз позитивных клеток. Ось абсцисс – список клеточных линий. 140 Рисунок 37 – Аттенуация экспрессии гена Beclin 1 вызывает ингибирование пролиферации опухолевых клеток и снижает чувствительность к вирусной инфекции. А) Внутримозговая имплантация клеток глиобластомы человека с подавленной экспрессией Beclin 1 увеличивает выживаемость мышей (N=5 мышей в группе). Ось ординат – выживаемость мышей в группе. Ось абсцисс – дни после имплантации опухолевых клеток в головной мозг мышей. Лог-Ранк p тест, p<0.0001 по сравнению с контрольными клетками (U87shScrambled); Б) Нарушение клеточной пролиферации вызвано нарушением клеточного деления. Ингибирование Beclin 1 приводит к накоплению клеток в G1 фазе клеточного деления. Ось ординат – процент клеток, окрашиваемых красителем пропидийм 141 иодид. Ось абсцисс – список исследуемых клеток с контрольной shRNA и shBeclin. Манн-Уитни тест.»*»p<0.5 по сравнению с уровнем экспрессии в контрольных (shScrambled) клетках; В) Нарушение клеточной пролиферации сопровождается снижением индукциий аутофагии в ответ на инфекцию онколитическим вирусом. Анализ клеток, инфицированных CRAd-S-5/3, был произведен после окраски красителем акридин оранжевый (краситель аутофагосом) на 3ий день после инфекции контрольных клеток и клеток с подавленной экспрессией клеточного Beclin 1. Ось ординат – доля клеток, прокрашенных красителем акридином оранжевым. Ось абсцисс – список исследуемых клеток с контрольной shRNA и shBeclin. Статистическая разница была оценена с помощью теста Манна-Уитни.*p<0.05 по сравнению с уровнем экспрессии в контрольных, не инфицированных CRAd-S-5/3 (ОВ) клетках; Г) Нарушение индукции аутофагии в ответ на вирусную инфекцию прямо коррелировало с клеточной резистентностью к терапии онколитическими агентами. Для построения диаграммы использовалось среднее значение выживших клеток по МТТ тесту. Ось ординат – доля живых клеток. Ось абсцисс – исследованные онколитические вирусы. Статистическая разница была оценена с помощью теста Манна-Уитни.*p<0.05 по сравнению с долей живых клеток в контролях, инфицированных CRAd-S-5/3, AdWT или ONYX015 векторами; Наши результаты свидетельствуют, что присутствие химических агентов снижает аутофагию. Далее, мы использовали генетический подход и аттенуировали ген Beclin 1, участвующий в реакции аутофагии. Во-первых, мы изучали влияние сниженной экспрессии Beclin 1 на пролиферацию клеток. Как показано на Рис. 37А, внутримозговая имплантация клеток с пониженным уровнем экспрессией гена Beclin 1, не способна не только сформировать клеточные контакты в головном мозге мыши, но и прогрессировать внутри черепа мыши. Во-вторых, ингибирование аутофагии оказалась критичным также для 142 пролиферации клеток in vitro (Рис. 37Б). При этом, инфекция клеток дефектных по Beclin 1, онколитическим вирусом CRAd-S-5/3 снижает уровень двухмембранных вакуолей-аутофагосом (с 64% до 0.5%, Рис. 37В) и повышает уровень клеток, резистентных к аденовирусной инфекции (Рис. 37Г). В таком случае наблюдается нарушение клеточного цикла и накопление клеток в G1 фазе клеточного деления (с 55% до 88% в случае ингибирования экспрессии Beclin 1). Наши данные in vitro подтверждают, что снижение пролиферации коррелирует со снижением аутофагии (уровень акридин-позитивных клеток снижен на 60% по сравнению с уровнем в вирус-инфицированных клетках) и накоплением апоптотических клеток в поздних стадиях (расщепление белка каспазы 3 типа) клеточной смерти. Следовательно, полученные данные подтверждают, что индукция аутофагии в процессе инфекции онколитическим вектором является реакцией клеточной токсичности. 3.3.2.1. Присутствие онкогенного цитомегаловируса снижает чувствительность глиом к инфекции онколитическим вирусом В дальнейшем, мы изучали влияние аутофагии на репликативный цикл онколитического вектора CRAd-S-5/3, предполагая, что нарушение аутофагии может изменить репликативный цикл вектора. С этой целью изучили процесс выделения вирусных частиц из инфицированных клеток. Как показано на Рис. 38, подавление аутофагии нарушает выделение вирусных частиц в супернатант. При этом в нормальных условиях (U87) добавление химиотерапевтических агентов, усиливающих аутофагию (Рапамицин, Темодал), приводит к повышенному накоплению вируса на 3ий день амплификации (Рис. 38А) в среднем в 2 – 4 раза. С другой стороны, амплификация вируса в клетках в присутствии ингибиторов аутофагии снижает количество выделенного вируса при том (Рис. 38Б), что присутствие рапамицина, активатора аутофагии, увеличивает продукцию и выделение прогенных частиц. 143 Рисунок 38 – Влияние аутофагии на процесс выделения вирусных частиц. А) Активация аутофагии темодалом (TMZ) и рапамицином усиливает выделение вирусных частиц из инфицированных клеток (ОВ). Ось ординат – уровень инфекционных единиц в 1 мл (супернатанта или клеточной суспензии). Ось абсцисс-терапевтические режимы; Б) 3 Метиладенин (3Ма) снижает секрецию вирусных частиц CRAd-S-5/3 из амплифицированных клеток вследствие недостаточного развития аутофагии (подавление гена Beclin 1). Ось ординат – уровень инфекционных единиц в 1 мл супернатанта. Ось абсцисс – дни после инфекции.»*»p<0.05 по сравнению с титрами вируса, полученного в присутствии 3Ма, TMZ или Rapamycin. Эксперимент проведен дважды в 4 повторах. Среднее значение было использовано для построения диаграммы. 144 Таким образом, предполагается, что нарушение аутофагии приводит к нарушению выделения вирусных частиц. Подавление аутофагии посредством ингибирования экспрессии Beclin 1 также приводит к нарушению процесса выделения вирусных частиц. Мы амплифицировали вирус в контрольных и клетках дефектных по белку Beclin 1. Данные, приведенные на Рис. 38 предполагают, что нарушение высвобождения вирусных частиц приводит к накоплению вируса внутри клеток, что и показано на Рис. 39. Оказалось, что на 5 день амплификации CRAd-S-5/3 мы наблюдали 40-100 кратное увеличение количества вирусной ДНК в инфицированных клетках, подавленной экспрессией Beclin 1. Рисунок 39 – Накопление вирусных ДНК в клетках, дефектных по аутофагии. Количественный анализ вирусной репликации проведен на выделенной на 1, 3 и 5 дни из инфицированных клеток тотальной ДНК Количество вирусных копий было нормировано на 1 нг ДНК. Ось ординат – экспрессия вирусной ДНК, детектированной в реакции ПЦР в реальном времени. Ось абсцисс – дни после инфекции. *p<0.05 по сравнению с экспрессией в контрольных (U87Scrambled) клетках. Ингибирование гена Beclin 1 приводило к накоплению вирусной ДНК в клетках, инфицированных CRAd-S-5/3, ONYX015 и AdWT. p<0.05 (Манн-Уитни тест). 145 Интересен тот факт, что экспрессия вирусной Е1А вызывает индукцию аутофагии [356]. В дополнение к этому наши данные, представленные на Рис. 39 предполагают, что и аутофагия также нужна для выделения вирусных частиц из клетки. Таким образом, можно предположить, что инфекция клеток аденовирусом сопровождается активацией клеточных сигнальных путей, с целью сопротивления вирусной инфекции и выделения вирусных частиц из клетки, и предотвращения апоптоза. Для проверки этой гипотезы мы изучили возможность индукции цитотоксичности аденовирусом в клетках со сниженным или нарушением аутофагией. Рисунок 40 – Количественный анализ экспрессии генов, участвующих в регуляции аутофагии. Ось ординат – уровень экспрессии каждого из генов, детектированный методами ПЦР в реальном времени или ДНК-микрочипами и представленное как среднее значение среди двух образцов за вычетом уровня внутреннего контроля гена – GAPDH; Ось абсцисс – исследуемые образцы. Данные, опубликованные ранее, свидетельствуют, что нарушение аутофагии приводит к нарушению экспресии целой группы генов [376, 377], главным образом тех, которые или непосредственно контактируют с Beclin 1 или чья транскрипция зависит от накопления Beclin 1 в клетках. В наших экспериментах мы проанализировали влияние ингибирования экспресии гена Beclin 1 по экспрессии генов, участвующих в процессе аутофагии. Как и ожидалось (Рис. 40), 146 сниженная экспрессия UVRAG, p62 и ULK2 наблюдалась как по результатам эксперимента с ДНК-микрочипами так и по данным ПЦР в реальном времени, что лишний раз подтверждает роль этих генов в формировании/созревании аутофагосом и выделения аденовирусных частиц из инфицированных клеток. Рисунок 41 – Анализ белковых фракций в первичных клетках глиобластомы человека. Результаты экспрессии клеточных Beclin 1, ULK2, LC3, p62 и GAPDH белков были изучены методом иммуноблоттинга в реакции со специфическими антителами. 10 микрограмм тотального белка, выделенного из первичных клеток: ГБМ1, ГБМ2, ГБМ3, ГБМ4, ГБМ5, ГБМ6 и перевиваемой линии глиомы человека – LN229 было нанесено в лунку и клеточные лизаты были проинкубированы с антителами, узнающими Beclin 1, ULK2, LC3, p62 и GAPDH. Эксперимент проведен дважды и результаты одного эксперимента представлены на рисунке. Отсутствие экспрессии p62 в образцах ГБМ3 и ГБМ5 коррелирует с низкой экспрессией Beclin 1 и, как следствие, низким уровнем аутофагии в первичных клетках. 147 Мы также отметили, что некоторые первичные клетки глиобластомы оказались не чувствительны к инфекции CRAd-S-5/3 вируса, в силу снижения экспрессии Beclin 1 и других про-аутофагийных генов (Рис. 41), что предполагает в них нарушение процесса аутофагии, как одного из механизмов вирусной резистентности. В целом сниженный уровень аутофагии мы детектировали в 3 из 6 выборочных первичных линий глиом человека (ГБМ3, ГБМ5 и ГБМ6). Среди 6 первичных линий клеток, представленных на Рис. 41, ГБМ3 и ГБМ5 показывают сниженный уровень Beclin 1 по сравнению с другими клетками, тем самым в перспективе быть резистентными к аденовирусной инфекции. Мультиформная глиобластома является сильно гетерогенной опухолью. Одновременное присутствие в опухоли неопластических клеток разного подтипа, с разными активированными сигнальными путями, является сложностью для терапии и создает предпосылки для рецидива болезни. Наряду с известными факторами предрасполагающими к прогрессии глиом, наличие онкогенных вирусов также усиливает неконтролируемый рост клеток опухоли. В последнее время особое внимание в нейроонкологии приковано к трансформирующей роли цитомегаловируса человека и возможных путях терапии глиобластомя человека, развитие которых стимулируется цитомегаловирусом. Оказалось, что иммунотерапевтическая вакцинация к белку pp65 цитомегаловируса человека увеличивала выживаемость и продолжительность жизни не только мышей с интракраниальными глиомными ксенографтами [378], но и ГБМ пациентов [379]. Ввиду того, что отмечена роль цитомегаловируса в подавлении клеточного апоптоза, мы изучили роль онкогенного вируса в регуляции аутофагии. С этой целью, мы проанализировали первичные клетки глиобластомы человека на предмет экспрессии ими цитомегаловирусных антигенов методом иммуноблоттинга. 148 Рисунок 42 – Экспрессия цитомегаловируса человека нарушает аутофагию в клетках глиобластомы. А) и Б) Анализ экспрессии IE1/IE2, CMVpp65, p62 и LC3 белков был проведен в первичных образцах и перевиваемых клетках глиом человека линии LN229 после инфекции их цитомегаловирусом человека (5ИЕ/ клетку, штамм TOWNE) через 48 часов после инфекции (В). Антитела к GAPDH были использованы в качестве контроля для нанесения одинакового количества белка в лунку ПААГ геля. Эксперимент проведен дважды и результаты одного эксперимента представлены на рисунке; Г) Среднее значение CRAd-S-5/3 токсичности было взято для построения диаграммы, характеризующей чувствительность CMV-инфицированных и неинфицированных первичных клеток глиобластомы. Манн-Уитни тест p<0.05. 149 Было установлено, что ~50% (6 из 13) исследуемых линий содержат белковые продукты цитомегаловируса человека (IE1 и pp65), представленные на Рис. 42А. При этом уровень вирусной экспрессии соотносился со сниженным уровнем аутофагии, что выражается в накоплении клеточного 18кДа белка LC3-I (Рис. 42Б) и низкой чувствительностью к инфекции CRAd-S-5/3 (Рис. 42В, p=0.04). Ранее было показано, что тамоксифен ингибирует экспрессию цитомегаловируса в клетках миобластов артерии [380]. Таким образом, можно предположить, что тамоксифен, ингибируя цитомегаловирус, может потенцировать антиглиомный эффект CRAd-S-5/3 в клетках со сниженной аутофагией. 3.3.3. Применение тамоксифена, как индуктора аутофагии Мультиформная глиобластома является опухолью головного мозга с большой летальностью. Поэтому, применение терапевтических агентов, таких как темозоломид (темодал), на ранних этапах болезни позволяет уменьшить пролиферацию неопластических клеток и способствует выживаемости пациентов [381]. Однако не у всех пациентов курс темозоломида вызывает терапевтический эффект [382]. Более того, в литературе отмечено, что часть пациентов с диагнозом «глиобластома» и изначальной чувствительностью к алкилирующему агенту со временем демонстрируют резистентность к нему [383]. Механизм такой резистентности остается до конца не изученным, но существуют основания полагать, что чувствительность клеток к терапевтическому препарату может быть усилена путем ингибирования факторов медикаментозной резистентности, таких как анти-апоптотический белок сурвивин. В литературе показано, что кроме роли ингибитора апоптоза, сурвивин также регулирует реккурентность глиомы [324]. Таким образом, ингибирование сурвивина может предотвратить появление рецидивов глиомы и усилить противоопухолевый эффект. Более того недавние публикации дают основания полагать, что тамоксифен, антиэстрогенный препарат, подавляет трансляцию сурвивина [266, 150 384] и демонстрирует пролонгированный терапевтический эффект в клетках рака печени [385] и глиобластомы [386-389] человека. Следовательно, так как и ионизирующая радиация и темозоломид индуцируют экспрессию сурвивина на уровне мРНК и белка, экспрессия аденовирусных белков под контролем промотора гена сурвивина в присутствии тамоксифена сможет эффективно ингибировать рост резистентных клонов и вызывать специфическую токсичность. В таком случае ожидается, что снижение уровня трансляции сурвивина будет сопровождаться индукцией аутофагии [390-392]. С этой целью, клетки глиобластомы человека дефектные по гену Beclin 1 были инфицированы CRAd-S5/3 в присутствии тамоксифена (Рис. 43А). Мы выявили усиление аутофагии в комбинации CRAd-S-5/3+тамоксифен, что выражалось в увеличенной конверсии LC3-I в LC3-II (в среднем в 2-3 раза по отношению к контролю). Вместе с тем, как и ожидалось, совместная терапия клеток глиобластомы онколитическим вирусом и тамоксифеном, снижала экспрессию сурвивина и приводила к накоплению фофорилированной формы гистона Н2АХ (Рис.43. части Б и В), маркера двунитевых разрывов ДНК, c ~19.2% (CRAd-S-5/3) до ~58% (CRAd-S5/3+тамоксифен, p<0.05). Наши данные коррелируют с данными, опубликованными раннее Cheng с соавт. [393], который наблюдал усиление аутофагии и индукцию аутофагии-зависимого повреждения клеточной ДНК в случае ингибирования сурвивина специфическим ингибитором YM155. Как нами было отмечено, ингибирование аутофагии в следствии подалениия гена Beclin 1 уменьшало экспрессию гена UVRAG (см. Рис. 40). Однако недавние исследования установили, что мыши, дефектные по UVRAG, подвергаются преждевременному старению и развитию кардиомиопатии [394], таким образом можно предположить роль Beclin 1-UVRAG белков, отвечающих за аутофагию, в клеточном старении. 151 Рисунок 43 – Тамоксифен стимулирует аутофагию и усиливает цитотоксический эффект онколитического вируса в опухолевых клетках первичной глиобластомы. А) Анализ конверсии клеточного LC3-I в присутствии тамоксифена и онколитического CRAd-S-5/3 вируса методом иммуноблоттинга. Лунки: 1 – Контрольные клетки, 2 – Клетки, обработанные тамоксифеном, 3 – Клетки, трансдуцированные рекомбинантным вектором CRAd-S-5/3, 4 – Клетки, трансдуцированные рекомбинантным вектором CRAd-S-5/3 в присутствии тамоксифена. 10 микрограмм клеточных лизатов проанализированы в ПААГ, и проинкубированы с LC3 антителами. GAPDH использовали в качестве внутреннего контроля для нанесения образцов. Соотношение изоформ белка LC3-II к LC3-I подсчитано для каждого образца. Эксперимент проведен дважды и результаты одного представлены на рисунке; Б) Иммунофлуоресцентный анализ фосфорилированной формы гистона H2Ax в клетках, выращенных на стеклах и затем обработанных тамоксифеном и/или онколитическим CRAd-S-5/3 вирусом. Микрофотографии получены, используя микроскоп Leica с увеличением Х200. Шкала 40 микрон; С) Среднее значение фосфорилированной формы гистона H2AХ, подсчитанное для каждого образца, использовано для построения диаграммы. МаннУитни тест, p<0.05 по сравнению с экспрессией ядерного H2AХ в группе клеток, инфицированных CRAd-S-5/3. 152 Для определения взаимосвязи между реакцией клеток на подавление аутофагии, старение и резистентность к инфекции онколитическим вектором, выявляли активность β-галактозы в клетках глиобластомы человека, дефектных по Beclin 1. Оказалось, что большинство клеток с нарушенной экспрессией Beclin 1 являются позитивными по β-галактозе (Рис. 44А), предполагая их нахождение в состоянии первичного старения. Принимая во внимание, что онколитическому вирусу необходимо развитие аутофагии, развитие старения опухолевых клеток может тормозит инфекцию клеток в силу их резистентности. Поэтому преодоление этой резистентности позволит увеличить эффективность терапии онколитическим вирусом и предупредить возможный рецидив мультиформной глиобластомы. Таким образом, нами было принято решение оценить уровень клеточного старения (сенессенс) в клетках глиобластомы, инфицированных CRAd-S-5/3 вектором в присутствии/ отсутствия тамоксифена. Окрашивание первичных культур глиобластомы человека, обработанных тамоксифеном, на βгалактозу показало накопление красителя в цитоплазме (Рис. 44Б). Вместе с тем, добавление антиэстрогенного препарата к клеткам, инфицированными онколитическим вирусом, наоборот, снижал уровень старения, что выражалось в меньшей окраске β-галактозы, но усиленному ингибированию клеточной пролиферации (Рис. 44В) и клеточной смерти (Рис. 44Г). На основании наших результатов мы предложили возможность применения тамоксифена в терапии мультиформной глиобластомы. Промежуточные результаты клинических испытаний с использованием тамоксифена подтверждают его сравнительную безвредность и потенциальную перспективность применения в качестве монотерапии или в комбинации с онколитическим вирусом или темозоломидом [395]. 153 Рисунок 44 – Аттенуация гена Beclin 1 вызывает состояние раннего старения опухолевых клеток и резистентность к инфекции онколитическим вирусом. Ингибирование старения тамоксифеном или ингибитором опухолевого супрессора p53 усиливает эффект онколитического вируса. А) Опухолевые клетки глиобластомы контрольной линии U87shScrambled и стабильно аттенуированной линии U87shBeclin со сниженной экспрессией Beclin 1 после инфекции онколитическим вирусом CRAd-S-5/3. Увеличение Х200, шкала 100 микрон; Б) Химиотерапия глиобластомы тамоксифеном или ингибитором p53 увеличивает эффект онколитической генно-инженерной вакцины. МТТ анализ клеточной пролиферации в присутствии или отсутствии онколитического агента через 5 дней после инфекции клеток вирусом. Минимум 5 повторов на каждый образец использовано для построения диаграммы. Статистическая разница указана на рисунке для каждого из образцов. Существенная индукция клеточной токсичности наблюдалась для клеток с комбинированным лечением (Тамоксифен+Онколитический вектор) в сравнении с монотерапиями. Разницу p<0.05 считали статистически достоверной (Манн-Уитни тест) В) Денситометрический анализ соотношений белковых изоформ LC3-II к LC3-I белка (16кДа к 18кДа) в присутствии тамоксифена, онколитического вируса и их комбинации. Эксперимент проведен дважды, для построения диаграммы использовалось среднее значение. Разницу p<0.05 считали статистически достоверной (Манн-Уитни тест). 154 3.3.4. Регуляция программируемой клеточной смерти клеточной микроРНК 7d По данным лтературы вирусная инфекция клеток онколитическим вирусом сопровождается активацией клеточных сигнальных путей [396, 397]. В недавних публикациях была установлена тесная взаимосвязь Е1А экспрессии с уровнем аутофагии. Оказалось, что клеточные микроРНК miR-92, miR-18, miR-15, miR-93, miR-25, чувствительные к индукции аутофагии, были дифференциально регулированы в ответ на инфекцию онколитическим вирусом [398]. Также известен факт, что активность клеточного теломеразного промотора индуцирует экспрессию микроРНК7 [399, 400]. Эти результаты предполагают, что клеточные микроРНК являются необходимыми для развития клеточной токсичности и поддержания клеточного гомеостаза. Было отмечено, что несмотря на значительное разнообразие онколитических векторов многие рекомбинантные вирусы отличаются друг от друга способностью вызывать онколизис клеток-мишеней. В нашем эксперименте мы сравнили способности AdWT, ONYX015 и CRAd-S-5/3 вызывать лизис клток-мишеней через индукцию клеточных микроРНК. Предполагая, что CRAd-S-5/3 является более эффективным в контексте глиомной виротерапии, мы сравнили возможность индукции микроРНК 7d(Let-7d) как эффектора аутофагии. Сначала мы сравнили клеточную токсичность, вызываемую векторами in vitro и in vivo. Было показано, что CRAd-S-5/3 демонстрирует высокую цитотоксичность на клетках U118 в дозе 100 (~85% токсичность) и 10 (~65% токсичность) инфекционных единиц на клетку и на клетках U87 в дозе 10 ИЕ /клетку (~61%) (Рис. 45А). По нашим данным при концентрации 100 ИЕ на клетку AdWT и ONYX015 показывают сходную с CRAd-S-5/3 активность в U87 клетках. В in vivo эксперименте с использованием внутримозговой модели U87 глиобластомы человека, мы показали терапевтическую эффективность онколитического вектора CRAd-S-5/3 по сравнению с AdWT и ONYX015. Оказалось, что на 54 день после 155 внутримозговой имплантации опухоливыживаемость мышей в группе, получившей внутримозговую инъекцию онколитического вируса CRAd-S-5/3, была 40% по сравнению с 50% выживаемостю для групп AdWT и ONYX015 на 38ой день (Рис. 45Б). Чтобы установить, является ли пролонгированная выживаемость мышей в ответ на CRAd-S-5/3 инъекцию, результатом активации экспрессии клеточных микроРНК, нами проведен транскрипционный анализ индукции микроРНК в ответ AdWT, ONYX015 и CRAd-S-5/3 инфекцию (Рис. 46А). По нашим результатам, полученным и проанализированным с помощью программы компании Qiagen, все три вектора экспрессируют микроРНК 7d, участвующей в индукции клеточной аутофагии (Рис. 46Б). Причем, уровень микроРНК7d был самым высоким в клетках, инфицированных CRAd-S-5/3 (622±157.1) и наименьшим AdWT(12.5±1.34) (Рис. 47А). In vivo мы также наблюдали, что CRAd-S-5/3 индуцировал больше микроРНК 7d (12.5±3.56), что соответствовало высокому уровню аутофагии, детектированной в реакции иммуногистохимии с LC3-II антителами (Рис. 47Б). Таким образом, наши данные коррелируют с данными других исследователей, подтверждающие развитие аутофагии в ответ на инфекцию онколитическими аденовирусами in vitro и in vivo [135, 355, 356, 401, 402]. Несмотря на развитие аутофагии, как часть аденовирус- вызываемой клеточной цитотоксичности, активация выживаемости клетки в присутствии онколитического агента снижает эффективность применения вектора, как противоопухолевого агента. В этой связи было предложено изучить эффективность использования онколитического аденовируса в комбинации с текущими терапевтическими подходами, применяемыми в клинике, как например темодал, ионизирующая радиация и др. 156 Рисунок 45 – Сравнение клеточной токсичности онколитических векторов, с использованием модели глиобластомы человека in vitro и in vivo. А) Выживаемость опухолевых клеток в присутствии различных концентраций (100, 10, 1, 0.1 и 0.001) рекомбинантных вирусов AdWT, CRAd-S-5/3 и ONYX015. На диаграмме представлены результаты одного эксперимента. Ось ординат – процент выживаемости клеток после терапии вирусом. Ось абсцисс – исследуемые онколитические вирусы. «*»Т тест по сравнению с AdWT, p<0.05 и «&»Т тест vs ONYX015; Б) Кривая выживаемости Каплана-Мейера мышей с внутримозговой опухолью головного мозга U87, получивших инъекцию онколитическими векторами в дозе 100 единиц на клетку. Ось ординат – процент выживаемости мышей в каждой группе. Ось абсцисс – дни после имплантации. Логранговый критерий p<0.05 по сравнению с AdWT. 157 Рисунок 46 – Анализ экспрессии клеточных микроРНК, выявленных в ответ на инфекцию клеток онколитическими аденовирусами. ДНК-микрочип компании Qiagen был использован для обнаружения клеточных микроРНК в образцах клеток после инфекции. кДНК была транскрибирована и добавлена к соответствующим праймерам, смешанным с приготовленной смесью ПЦР. Все образцы были проанализированы в соответствии с рекомендациями компании-изготовителя. Представлены данные по экспрессии 80 микроРНК в клетках, инфицированных AdWT, ONYX015 или CRAd-S-5/3, и регулирующие клеточный апоптоз и аутофагию. Цветовая шкала соответствует уровню экспрессии отдельных микроРНК по отношению к контрольному образцу. Б) Диаграммы Венна, показывающие присутствие микроРНК 7d (let7d) в экспериментальных образцах с увеличенной или пониженной экспрессии let7d. 158 Рисунок 47 – Корреляция экспрессии микроРНК 7d с индукцией аутофагии онколитичеcкими вирусами. А) ПЦР в реальном времени вирус- индуцируемой микроРНК 7d в клеточных образцах и тканевых срезах внутримозговых ксенографтов U87 после инъекции онколитических векторов. Ось ординат – уровень микроРНК 7d после нормализации к уровню внутреннего контроля SNORD47. Ось абсцисс – эксперименты, проведенные in vitro и in vivo; Б) Индукция аутофагии, детектируемая в тканевых срезах интракраниальных ксенографтов U87, содержащих AdWT, ONYX015 или CRAd-S-5/3 после инкубации с антителами LC3-II. увеличение Х200, шкала 40 микрон. 3.3.5. Использование стандартных методов лечения: ионизирующая радиация и темозоломид для усиления активности онколитического вектора Выбор тактики терапевтического лечения мультформной глиобластомы в первую очередь связан с попыткой ограничить клеточную пролиферацию и инвазию. Недавние исследования показали, что гетерогенная опухоль глиобластомы содержит в своей среде клетки, обладающие инвазивными свойствами, и резистентностью к терапии [35, 403, 404]. Как было отмечено ранее, CD133- позитивные стволовые клетки глиобластомы активируют анти- апоптотическую программу, контролирующую резистентность не только к ионизирующей радиации, но и химиотерапии [322]. Таргетинг опухолевых клеток 159 онколитическим аденовектором является многообещающим подходом в преодолении клеточной резистентности к химиопрепаратам и ионизирующей радиации. В результате проведенных исследований мы установили, что промотор гена сурвивина человека активно транскрибируется в стволовых клетках глиобластомы, несущих поверхностный рецептор CD133 (см. Рис.17). Следовательно, можно предположить, что клонирование промотора гена сурвивина обеспечит активность рекомбинантного вируса преимущественно в стволовых клетках глиобластомы. Более того, наличие радиационно- индуцирующей области в составе короткой версии клонированного промотора гена сурвивина [405] делает аденовирусную транскрипцию зависимой от ионизирующей радиации (Рис. 26). Нами показано, что ионизирующая радиация модулирует активность промотора в составе онколитического вектора в клетках глиобластомы. Активация промотора приводит к увеличению вирусной цитотоксичности CRAd-S-5/3 в клетках глиом на 20-40% и, как следствие, активации вирусной репликации/транскрипции (от 2-10 раз) и усилению противоопухолевого эффекта (Рис. 48 А и Б). Более того, оказалось, что активация промотора гена сурвивина в составе онколитического вектора способна демонстрировать терапевтический эффект in vivo по сравнению с вектором, не содержащим этот промотор (AdWT) (Рис. 48 В и Г). Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что эффективность применения онколитического вектора многократно увеличивается, если контролировать вирусную транскрипцию ионизирующей радиации. промоторным Выявленная элементом, взаимосвязь чувствительным между к активностью онколитического вектора и уровнем ионизирующего облучения предполагает наличие комбинационных подходов (как генетических, так и с использованием химиопрепаратов), усиливающих цитотоксические свойства онколитического аденовируса in vitro и in vivo. 160 Рисунок 48 – Ионизирующая радиация увеличивает активность онколитического вектора, содержащего промотор гена сурвивина, в опухолевых клетках. Ионизирующая радиация (РТ) увеличивает токсичность (А и В) и репликацию (Б и Г) онколитического вектора под контролем промотора гена сурвивина человека. Выживаемость клеток, инфицированных онколитическим вирусом, в присутствии или отсутствии ионизирующей радиации была проведена in vitro (А) с помощью теста МТТ и in vivo (В) путем измерения объема опухолей. p<0.05, Логранковый критерий; Анализ вирусной репликации в ответ на ионизирующее излучение in vitro (Б) и in vivo (Г) был определен методом количественного ПЦР. Результаты реакции выражали как уровень копий Е4, детектируемых в 1 нг тотальной ДНК, инфицированных клеток.»*»p<0.05 по сравнению с уровнем в инфицированных клетках отсутствие радиации. Химиопрепараты находят широкое применение в клинике опухолей головного мозга. Высокий уровень резистентности неопластических клеток, обусловленный накоплением мутаций в составе генома клетки-мишени, вызывает 161 постоянную активацию клеточных генетических программ, снижающих эффективность противоопухолевых агентов [406, 407]. Темодал один из «золотых стандартов» химиотерапии, повсеместно применяется в лечении неоплазм головного мозга. В основе действия химиопрепарата темодал лежит активация различных механизмов клеточной смерти, включая аутофагию. Впервые индукцию аутофагии темодалом описал Kanzawa с соавт. [408], предполагая, что такая клеточная реакция лежит в основе цитотоксической реакции многих терапевтических агентов, включая онколитические векторы. Нами было показано, что темодал и онколитический вектор действуют аддитивно в контексте развития аутофагии [286]. С другой стороны, данные, представленные на Рис. 48 показывают, что наличие чувствительного к радиации промотора в составе генноинженерного вектора позволяет активировать вирусную репликацию, а, следовательно, и токсичность ионизирующим излучением [285]. В настоящее время существуют множество онколитических агентов, провоцирующих развитие аутофагии, которая сопровождается противоопухолевой активностью. Как и в случае применения монотерапии, нарушение клеточного деления, сопровождается активацией про- апоптотических генов таких как BAX [180, 409, 410] и NOXA [411]. Как было показано в нашем исследовании, при терапии темодалом, как и при использовании онколитического вектора, отмечалось увеличенное накопление двухмембранных вакуолей (аутофагосом), уровень которых был снижен после обработки ингибиторами Baf A1 и 3Ma. В экспериментах с использованием внутримозговой модели глиобластомы U87 мы продемонстрировали, что совместное применение онколитического аденовируса, содержащего промотор гена сурвивина человека, и внутриперитонеальной инъекции темодала, вызывает регрессию глиобластомы и пролонгированную выживаемость мышей с внутримозговой глиобластомой. На молекулярном уровне мы обнаружили, что активация аутофагии совместным введением 162 онколитического вируса и темодала приводит к активации экспрессии опухолевых супрессоров, что снижает эффективность терапии. 3.3.6. Влияние Р53 на цитотоксичность онколитического вируса в комбинации с темозоломидом Экспериментальные исследования, проведенные нами, показали, что не все перевиваемые клетки глиобластомы одинаково чувствительны к совместной терапии онколитическим вирусом. Идентификация генетических программ, руководящих клеточной резистентностью, является одним из направлений совершенствования терапевтических подходов. Онколитический вирус и темодал на молекулярном уровне вызывают индукцию аутофагии- клеточный стресс, который стимулирует дальнейшую злокачественность [375, 412]. Наряду с аберрантно активными драйверами прогрессии опухолей, такими, как cMyc и p53, может варьироваться клеточная чувствительность опухолей к химиопрепаратам [413-416]. В наших экспериментах мы обнаружили, что терапия глиобластомы темодалом и онколитическим вирусом стимулирует экспрессию p53 (Рис. 49). В литературе отмечено, что прогрессия глиобластомы сопровождается не только накоплением мутаций, но и нарушением клеточной дифференцировки, где одним из драйверов является клеточный p53 [417, 418]. Поскольку ранее было показано, что накопление мутаций в составе p53 ведет к инактивации белка и клеточной трансформации [419, 420], мы изучили, как ингибирование активности p53 увеличит терапевтический эффект от комбинации онколитического вируса и темодала. На Рис. 50А, темодал и онколитический вирус вызывают нарушение клеточного цикла. При этом мы наблюдали увеличение пропорции клеток, находящихся в стадии G2/M с 20% (ОВ, онколитический вирус) и 50% (Темодал) до 60.8% (Рис. 50Б). Дальнейшая инкубация с ингибитором p53 вызывает значительное увеличение погибших клеток: с 60.8 до 80% (Рис. 50В). 163 Рисунок 49 – Совместная терапия глиобластомы человека вызывает активацию тканевых супрессоров. А) Иммунофлуоресцентное исследование на клетках U87 токсичности и вирусной репликации совместной терапии онколитическим вирусом (ОВ) и темозоломидом (Темодал) с использованием TUNEL и иммунофлуоресценции с антителами против аденовирусной области Е1А. Контроль – не обработанные клетки; ОВ – клетки глиобластомы инфицированные вирусом CRAd-S-5/3 в дозе 10 ИЕ на клетку; Темодал – темозоломид в концентрации 100 µМ; Комбинация ОВ (100 ИЕ на клетку) и 100 µМ Темозоломида. Эксперимент проведен дважды и результаты 1 эксперимента представлены на рисунке, шкала 100 микрон, увеличение х10; Б) p53 активируется в ответ на комбинацию онколитического вектора и темодала (темозоломида). Клеточные лизаты получены после обработки клеток глиобластомы человека: темодалом (лунка 2), онколитическим вирусом (лунка 3) или их комбинацией (лунка 4) через 48 часов после начала терапии. 20 микрограмм тотального белка было разогнано в ПААГ, после чего мембрана с иммобилизованными белками последовательно проинкубирована с антителами против клеточного супрессора p53 и вирусного Е1А. Актин использован в качестве внутреннего контроля для нанесения клеточных лизатов в гель. 164 Рисунок 50 – Ингибирование клеточного p53 увеличивает токсичность комбинации онколитического вируса и темодала в клетках U87. Распределение популяций клеток по фазам клеточного деления, по встраиванию акридина оранжевого или токсичности представлено по данным проточной цитометрии (А) или по данным МТТ (Г). Анализ делали в трипликатах, статистическую разницу оценивали, используя tКритерий Стьюдента по отношению к монотерапии темодалом или онколитическим вектором. Ось абсцисс – распределение по фазам клеточного деления после окраски пропидиум йодидом, ось ординат – общее количество клеток. Ингибирование p53 усиливает клеточную токсичность (В) и индуцирует аутофагию (Г). ОВ – CRAd-S-5/3 онколитический вектор. Токсичность – МТТ-тест. Ось абсцисс – исследуемые образцы, ось ординат – процент токсичности. Эксперимент проведен дважды в 5 повторах, среднее значение использовано для построения графика; Г) Возрастание уровня аутофагии в опухолевых клетках установлено путем подсчета акридин-положительных клеток. Ось абсцисс – исследуемые образцы, ось ординат – процент акридин-положительных клеток . «*», «**», «***»p против обработанных ДМСО образцов. «#» и «##» статистическая разница между ОВ, Темодал и ОВ+Темодал в присутствии p53 ингибитора PFTa. 165 Нарушение клеточного деления сопровождается повышением клеточной токсичности с 40 до 60%. Поэтому мы предположили, что ингибирование супрессора p53 может увеличить реакцию клеточной смерти – аутофагию. Как и ожидалось, увеличение встраивания интеркалирующего красителя акридина оранжевого наблюдалось в образцах, получивших ингибитор p53-PFTa, TMZ и ОВ (Рис. 50Г). При этом статистическая разница наблюдалась по отношению к уровню в клетках, обработанных ТМZ и ОВ (p<0.05). В целом, можно предположить, что снижение активности p53 может быть использовано в клинической практике. 3.3.7. Роль Hh-GLI сигнальных путей резистентности к онколитическому вектору Впервые важность сигнального пути Хэджхог (Hh) была показана для Drosophila в процессе эмбриогенеза [421]. В настоящее время известно, что сигнальный путь Hh участвует в пролиферации и дифференцировке клеток путем регулирования транскрипционных факторов [422]. С этой целью, белки GLI переносятся через ядерную мембрану из цитозоля клетки, где они активируют транскрипцию генов, отвечающих за клеточное деление, ангиогенез и апоптоз [423]. Роль Hh была также продемонстрирована в созревании стволовых клеток опухолей, что может представлять интерес для экспериментальной терапии. В литературе отмечено, что базальная клеточная карцинома, рабдосаркома [424] и медуллобластома [425] содержат сигнальный путь Hh в активном состоянии за счет наличия соответствующих мутаций. В мультиформной глиобластоме Hh также является активированным, что подтверждено нами [426] и другими научными группами [427-430]. Наши данные [426] подтверждают мнение Clement с соавт. [428] о том, что ингибирование Hh циклопамином повышает чувствительность темодала по отношению к темозоломид-резистентным клонам глиобластомы человека. 166 Рисунок 51 – Ингибирование сигнального пути Хеджхог (HH) усиливает терапевтическую комбинацию онколитического вируса и темозоломида. Уровень токсичности определяли окраской трипановым синим клеток, обработанных/ необработанных100 ИЕ на клетку онколитического вектора CRAd-S-5/3, 100µM TMZ (темозоломида-темодала), HH inhibitor-Циклопамин (10µM) или их комбинации в течение 72 часов. Подсчет трипан-позитивных клеток проводили в гематоцитометре. В целом, в 2 экспериментах проанализировано 8 повторов на каждый образец, среднее значение ± стандартное отклонение было использовано для построения диаграммы. «*» Тест Манна-Уитни p<0.05 по сравнению с экспрессией онколитическим вирусом, «#» p<0.05 по сравнению с комбинацией ОВ+Темодал, ОВ+SHH ингибитор, и Темодал+HH ингибитор. 167 Эти результаты создают предпосылки для тестирования комбинации онколитический вектор+темозоломид [286], показывающий аддитивный эффект, с циклопамином. На Рис. 51 представлены наши данные о том, что терапия первичных клеток глиобластомы онколитическим вектором (100 ИЕ на клетку) и темозоломидом (100µМ) в присутствии циклопамина усиливало антиглиомный эффект комбинации темозоломид+онколитический вирус с 47.8±2.4% до 82.74±6.52% погибших клеток. 3.3.8. Использование CRAd-S-5/3 в качестве платформы для доставки генетического материала в клетки глиобластомы, резистентные для темозоломида и ионизирующей радиотерапии Использование химиотерапии и ионизирующей радиации в лечении глиобластомы зачастую не приносит существенного эффекта. В основе этого лежат первичные события, затрагивающие клеточные и генетические механизмы, способствующие развитию опухоли. В наших опытах было показано, что металлопротеиназа типа 14 (MMР14) активируется в ответ на терапию темодалом и ионизирующей радиацией [431]. Более того, иммуногистохимический анализ первичных образцов показал, что уровень белка MMР14 коррелирует с прогрессией глиом и одновременно влияет на выживаемость пациентов (Рис. 52 части А и Б). Используя метод генетической аттенуации гена MMР14, мы показали, что нарушение экспрессии этого гена влечет нарушение клеточного деления и клеточную пролиферацию. Имплантация клеток глиобластомы со сниженной экспрессией MMР14 увеличивает выживаемость мышей с внутримозговыми опухолями. Таким образом, предварительные результаты предполагают рациональность подавления экспрессии гена MMР14 в контексте применения темодал и ионизирующей радиации. 168 Рисунок 52 – Роль MMР14 в прогрессии глиом. А) Анализ экспрессии гена MMP14 в тканях пациентов с диагнозом «глиобластома» с использованием баз данных TCGA и Oncomime; (Б) Выживаемость пациентов с разным уровнем экспрессии MMP14 в тканях глиобластомы, депонированных в клинических базах данных Rembrandt (слева) и TCGA (справа). 3 группы пациентов, имеющих низкий (зеленый), высокий (красный) и промежуточный уровень экспрессии (желтый), а также 2 когорты пациентов, имеющие двукратное увеличение экспрессии или уменьшение. Анализ между когортами проведен с использованием логрангового критерия. НПК-нейральные стволовые клетки человека. 169 Для изучения эффекта ингибирования MMР14 в глиомах мы предложили использовать онколитический вирус, способный доставлять рекомбинантные ДНК для интерференции РНК. Как следует из результатов биоинформатического аналиа представленного на Рис 52В, экспрессия ММР14 снижает выживаемость пациентов как с глиомами (p=2E-8), так и с глиобластомой (p=0.025), поэтому MMP14 в перспективе может использоваться как прогностический маркер, а также как мишень для экспериментальных и терапевтических интервенций. Результаты наших исследований позволяют предположить, что высокий уровень MMП14 будет наблюдаться в опухолевых клетках OLIG2+/CD11B-/CD45-, что подтверждается присутствием MMП14 на поверхности опухолевых клеток глиом (Рис. 53). Далее мы изучали влияние инактивации MMР14 на ангиогенные и пролиферирующие свойства глиобластомы. Для этого была создана панель клеток глиобластомы человека линий U87 и U251, в которых экспрессия гена ММР14 была подавлена с помощью специфической siRNA. Результаты эксперимента был представлены на Рис. 54. Эффективность аттенуации определена методом вестерн-блоттинга. Оказалось, что shRNA4 на 40 и 30% соответственно снижает экспрессию MMР14 в U87 и U251 (Рис. 54А), поэтому в наших исследованиях мы использовали клетки, модифицированные shRNA4. В литературе широко обсуждалась роль MMР14 в клеточной пролиферации [431] и ангиогенезе [432-436]. Мы проанализировали уровень экспрессии проангиогенных факторов в контрольных клетках и клетках с аттениуированным MMР14. Оказалось, что интерференция МMР14 приводит к нарушению образования васкуляризации, измеренного нами в реакции формирования тубул (Рис. 54 части Б и В). В среднем от 8 до 22 раз наблюдалось снижение способности эндотелиальных клеток формировать розетки на поверхности матригеля. Эти данные соответствуют результатам белкового микрочипа, показывающим снижение MMР14 приводит к снижению VEGF (в 2 и 3 раза по отношению к контролю) и IL8 (в 9 и 2 раза соответственно) (Рис. 54Г). 170 Рисунок 53 – Колокализация MMР14 с OLIG2, CD11B, CD45. 4-фоновая иммунофлуоресценция первичной ткани ГБМ пациента с антителами к CD11B, CD45, OLIG2, MMР14 и ядерным красителем DAPI. Белые стрелки – популяции OLIG2+/CD11B-/CD45- (верхняя фотография) и OLIG2+/CD11B-/CD45, экспрессирующие MMР14 (нижняя фотография). Квадратами при значительном увеличении показана область с сигналами колокализации. Шкала 100 микрон, увеличение X400. 171 Рисунок 54 – Генетическая интерференция гена MMP14 снижает ангиогенез опухолевых клеток. А) Анализ белковых фракций контрольных клеток и клеток со сниженным уровнем MMP14; Микрофотографии (Б) и количественный анализ (В) формирования розеток в присутствии супернатанта контрольных клеток и клеток со сниженной экспрессией MMP14. Ось абсцисс – список стимулов. Ось ординат – обнаруженные тубулы (сумма с 10 микрофотографий). *T-тест p<0.01; Г) Ингибирование MMP14 лентивирусом снижает экспрессию IL8 и VEGF. Белковый микрочип использовали для анализа экспрессии про-ангиогенных факторов. Соотношение экспрессии каждого из ангиогенных факторов определяли к уровню в позитивном контроле среди двух образцов. Ось абсцисс – IL8 и VEGF. Ось ординат – % от положительного контроля. Терапия глиобластомы активирует клеточные программы, способствующие выживаемости опухоли в состоянии стресса. По последним литературным данным 172 ингибирование ангиогенеза бевацизумабом в присутствии онколитического вектора CRAd-S-pK7 увеличивает противоопухолевый эффект [58]. Другими исследователями было показано, что интерференция IL8 [437] и VEGF [438] также, как и доставка клеточного репрессора ZFP [439], является сильным аргументом для онколитической виротерапии за счет ингибирования ангиогенеза. Так как MMP14 является upstream-мишенью для ингибирования VEGF и IL8, мы предложили использовать онколитический вирус для доставки антисмысловых РНК к гену MMP14. Используя CRAd-S-5/3, мы сконструировали рекомбинантные векторы CRAd-S-5/3shScrambled и CRAd-S-5/3shMMP14 (Рис. 55 часть А). Согласно нашему анализу подавление ММР14 онколитическим вирусом CRAd-S5/3shMMP14 существенно (на 50-70%) ингибировало экспрессию MMP14 в клетках (Рис. 55Б), что приводило к снижению на 30-48% пролиферативной активности клеток глиобластомы человека (Рис. 55Г) и клеточной токсичности (Рис. 55Д). Оказалось, что в клетках с подавленным MMP14 репликативный цикл онколитического вируса не нарушался (Рис. 55. части Б и В). Так на 5 день инфекции клеток линии U251 мы наблюдали почти 1000-кратное усиление CRAdS-5/3shMMP14 по сравнению с активностью CRAd-S-5/3shScrambled. Методом ПЦР в реальном времени мы детектировали 100-кратное увеличение вирусной репликации по отношению к репликации контрольного вектора CRAd-S5/3shScrambled. В целом, нарушение клеточной пролиферации in vitro вместе с увеличением клеточной токсичности и вирусной репликации эффективно подавляло рост внутримозговой глиобластомы U251 in vivo у мышей (Рис. 56). В результате подавление MMP14 уменьшает экспрессию VEGF и IL8, что выражалось в меньшем формировании сосудов опухолей по сравнению с контролем. Таким образом, наши эксперименты показывают, как опытным путем можно преодолеть резистентность опухолевых клеток в ответ на действие темодала и ионизирующей радиации, что и было продемонстрировано на примере линии клеток U251. 173 Рисунок 55 – Эффективность онколитического вируса CRAd-S-5/3shMMP14 in vitro. А) Структура онколитических вирусов, содержащих антисмысловые РНК к ММР14 человека или контрольную РНК. Промотор гена сурвивина человека контролирует экспрессию ранней области аденовируса человека. Антисмысловая РНК к мРНК металлопротеиназа 14 (MMP14) или контрольная РНК были клонированы в состав района Е3 аденовируса, имеющего модификацию 5/3 белка фибера. ITR-инвертированные терминальные повторы; Б) Количественная обратная транскрипция – ПЦР для определения уровня накопления вирусной мРНК Е1А и клеточной мРНК MMP14 после инфекции контрольными вирусами или вирусами, содержащими антисмысловую ДНК к MMP14 человека. Эксперимент проведен дважды, в трех повторах. Ось абсцисс – исследуемые 174 образцы. Ось ординат – количество мРНК каждого гена (нормировка на мРНК актина). *p<0.05 по сравнению с экспрессией CRAd-S-5/3shScrambled; В) Уровень репликации CRAd-S-5/3shScrambled и CRAd-S-5/3shMMP14 в клетках U87. ПЦР в реальном времени был проведен на тотальной ДНК, выделенной из смеси супернатант-клеточный лизат с использованием специфических праймеров к области аденовируса Е4 человека серотипа 5. Эксперимент проведен дважды в трех повторах. Ось абсцисс – дни после инфекции клеток вирусами. Ось ординат – количество вирусной ДНК после нормализации к общему количеству ДНК. Статистическое различие было подсчитано для каждого временного интервала; Г) Ингибирование пролиферирующей активности глиом в присутствии онколитических вирусов. Эксперимент проведен дважды в 5ти повторах. Результат выражен как уровень пролиферации по отношению к CRAd-S-5/3. Ось абсцисс – исследуемые образцы. Ось ординат – оптическое поглощение клеток после нормализации к уровню лунок со средой; Д) Цитотоксичность опухолевых клеток U251 в присутствии векторов CRAd-S-5/3, CRAd-S-5/3shScrambled и CRAd-S-5/3shMMP14. На 10 день после инфекции монослой опухолевых клеток окрашивали кристалл виолетом. 175 Рисунок 56 – Эффект внутримозгового введения онколитических векторов CRAd-S-5/3, CRAd-S-5/3shScrambled и CRAd-S-5/3shMMP14 in vivo. А) Ингибирование роста ксенографтов U251 проводили при однократном внутриопухолевом введении вируса в дозе 100 инфекционных единиц на клетку. Кривая выживаемости КапланМейер построена для каждой из групп спустя 60 дней после начала эксперимента. Логранговый критерий p=0.042 по сравнению с CRAd-S-5/3shScrambled. Ось абсцисс – дни после имплантации опухолевых клеток, ось ординат – процент выживаемости. PBS – сплошная линия черного цвета, CRAd-S-5/3 – сплошная линия красного цвета, CRAdS-5/3shScrambled – пунктирная линия красного цвета, CRAd-S-5/3shMMP14 – сплошная линия синего цвета; Б) Иммуногистохимический анализ экспрессии ММП14, CD31 и VEGF. Белыми стрелками показаны окрашиваемые клетки. В) Анализ экспрессии плотности сосудов опухоли проводили по методике, описанной раннее [440] и выражали как число сосудов на мм2 тканевых срезов, используя программу Wimasis (Германия) для анализа образцов. Внутриопухолевая иньекция CRAd-S-5/3shMMP14 снижает формирование сосудов опухоли. Тест Манна-Уитни p<0.05. 176 Рисунок 57 – Алгоритм лечения больных ГБМ, содержащих вирусные онкогены. Система лечебных мероприятий должна строиться на основе предварительного скрининга присутствия вирусных онкогенов, таких, как цитомегаловирус человека (CMV) в тканях пациентов с диагнозом «глиобластома». Смысл такого подхода должен определять дальнейшую тактику лечения пациентов в зависимости от присутствия цитомегаловируса: применение противовирусной терапии в комбинации или темозоломид, ионизирующая радиация или онколитический вирус, либо онколитический вирус в комбинации с ионизирующей радиацией (в силу метилирования MGMT). Для предотвращения появления рецидивов глиобластомы после получения курса темозоломида и ионизирующей радиации мы предлагаем использовать разработанную генноинженерную вакцину против генов, контролирующих резистентность к терапии, например MMP14 (Рис. 57). 177 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Основной проблемой при создании эффективного лекарства против глиобластомы человека является агрессивная природа мультиформной глиобластомы, за счет неконтролируемой пролиферации клеток. Текущие «золотые стандарты» в лечении глиобластомы являются эффективными в краткосрочной перспективе, но до полного выздоровления пациентов не происходит. На молекулярном уровне ингибирование клеточной пролиферации сопровождается активацией клеточной выживаемости аутофагией [286, 441, 442] или усилением ангиогенеза [443-445], тем самым опухоль находит возможности «убежать от терапии». Таким образом, существующие методы лечения способны продлить жизнь пациентов с глиобластомой, но не полностью удалить опухоль из организма [446-449]. В связи с этим лекарство будущего должно не только эффективно ингибировать рост глиобластомы, но и разрушать неопластические клетки головного мозга, тем самым повышая эффективность существующих монотерапий. Специфичность и эффективность репликации в клетках глиом без повреждения здоровых клеток головного мозга привлекает внимание к CRAd как потенциальному терапевтическому противоопухолевому агенту. Однако применение немодифицированного CRAd не всегда оказывает желательный эффект. Гетерогенность глиобластомы и длинный репликативный цикл аденовируса от начала инфекции до момента выделения вирусных частиц могут быть главными проблемами, ограничивающими применение онколитического вектора в нейроонкологии. Таким образом, повышение эффективности трансдукции клетокмишеней аденовирусным вектором, путем узнавания рецептора, локализованного на поверхности глиобластомы различного происхождения, является одной из задач вирусной генной терапии. С другой стороны, присутствие в опухоли клеток с разными сигнальными путями, регулирующими поведение клеток, и их 178 резистентность к терапии, заставляет искать эффективный подход для экспериментальной инфекции агрессивных неопластических клеток. Направленная инфекция клеток глиобластомы аденовирусным вектором зависит от присутствия целого ряда условий, одно из которых – наличие первичного рецептора на поверхности клеток-мишеней. В результате проведенных исследований мы обнаружили, что клетки глиобластомы экспрессируют первичный рецептор CAR для аденовируса человека типа 5, но его уровень варьируется в зависимости от линии опухолевых клеток. Как оказалось, что первичные линии клеток экспрессируют меньше CAR, чем перевиваемые линии глиобластомы человека. Эти данные нашли подтверждение в работе Fuxe с соавт., которые показали, что первичные клетки менее чувствительны к инфекции аденовирусом типа 5 по причине сниженной экспрессии первичного рецептора CAR [157]. Другие исследования, проведенные Houri с соавт. показали, что клетки со сниженной экспрессией CAR являются более инвазивными, что связано с активностью фермента шеддазы (sheddase), удаляющего CAR с поверхности первичных клеток [450] протеолизом. Эти данные косвенно подтверждают наши результаты и свидетельствуют о том, что эффективная инфекция глиобластомы аденовирусным вектором должна использовать альтернативный рецептор. На сегодняшний день работы в области создания самореплицирующегося вектора ведутся в нескольких направлениях. Первое- это использование генетических механизмов опухолевой прогрессии для создания вирусного вектора, активного в большинстве глиом за счет повышения активности специфичных клеточных сигнальных путей. В этом случае происходит инфекция и здоровых клеток, но вирусная токсичность подавляется на стадии транскрипции. Яркими представителями этого являются аденовирусные вектора ONYX015 и ∆24. Вторым вариантом является использование промотора и/или клонирование модификации в белок фибера, что позволяет не только перенацелить вирусную частицу на альтернативный рецептор, но и обеспечить высокую селективность продукции 179 вирусных генов в опухолевых клетках. К этой группе принадлежит большинство известных векторов, используемых в онкологии. Исходя из анализа иммунного ответа, возникающего при вирусной репликации векторов [216], наиболее предпочтительным является трансдукционных модификаций использование [220]. Так, транскрипционных по данным и литературы, внутримозговая-внутриопухолевая инъекция CRAd-S-pK7 вызывает меньшую продукцию гамма-интерферона и сниженную продукцию вируснейтрализующих антител. Соответственно, последняя стратегия выглядит привлекательнее с точки зрения подавления иммунного ответа Для создания вирусного самореплицирующегося вектора необходимо использовать системы клонирования рецептор-связывающего участка в состав белка фибера, а также клонирования промоторной области гена, чей транскрипт активен преимущественно в опухолевых клетках. Такие системы уже давно созданы пионерами в области генной терапии: Von Seggren со соавт. [313], Dmitriev с соавт. и Kransykh с соавт. [312, 451-453]. Одним из преимуществ использования вышеназванных систем является применение пакующей линии клеток на основе HEK293, экспрессирующей белок гена фибера аденовируса человека 5 серотипа, и тем самым увеличивающей интенсивность вирусной амплификации. Несмотря на широкое применение таких компетентных клеток, оставалось непонятным, как белок фибер влияет на вирусный цикл. Чтобы ответить на этот вопрос, мы создали компетентные клетки, экспрессирующие дикий или мутантные формы белка фибера серотипа 5. Эти белки имели отличную от дикого белка фибера клеточную локализацию вследствие делеции сигнала ядерного транспорта или сигнала упаковки в капсомер. На снимках, полученных при помощи иммунофлуоресценции, видно, что в то время, как белок фибера с делетированным сигналом ядерного транспорта локализуется в цитоплазме, фибер с делецией в сигнале упаковки в пентон находится и в цитоплазме, и ядре. Изменение в локализации имеет значение для вирусного цикла аденовируса, 180 выращенного на клетках с мутантным или диким белком фибера. Оказалось, что выращивание вируса в клетках, содержащих дефектный по локализации белок фибера, сопровождается нарушением процесса упаковки вирусных частиц, выделения дочерних частиц. Это еще раз подчеркивает значимость экспрессии белка фибера в ядрах инфицированных клеток. Важность экспрессии белка фибера для наращивания дефектных по препликации рекомбинантных аденовирусов была отмечена в нескольких научных публикациях [292, 313, 454] наших коллег. Вопрос выбора первичного рецептора для связывания и интернализации онколитического вектора имеет большое значение. В наших работах мы предложили использовать CD46 по нескольким причинам: CD46 экспрессируется на поверхности глиобластомы как перевиваемых, так и первичных клеток глиобластомы человека. CD46 является известным рецептором для кноб-домена белка фибера аденовируса 3, 7 и 11 серотипа человека. Существующие аденовирусные системы позволяют клонировать рецептор- связывающую часть белка фибера в состав аденовирусной конструкции без потери функциональности фибера и полученного аденовирусного вектора. В данной работе мы изучили возможность применения трех различных систем получения химер белка фибера для эффективной инфекции клеток глиобластомы. Нами была создана панель дефектных по репликации аденовирусных векторов, содержащих репортерный ген люциферазы под контролем промотора CMV. Мы проанализировали способность векторов содержащих кноб-домен, слитый с фибритином бактериофага типа 4, транзиентно экспрессирующих белок фибера аденовируса человека типа 3 или стабильно клонированного фибера аденовируса человека типа 3 для изучения их способности обеспечивать высокий уровень трансдукции клеток глиобластомыобеспечивать высокий уровень трансдукции клеток глиобластомы, а также фибер-химеру. При помощи вестерн-блоттинга мы показали, что все 3 векторные системы продуцируют химерный фибер в составе 181 рекомбинантных векторов, причем нам удалось детектировать тримерный и мономерный фибер. Мы предположили, что наличие тримеризации химерного фибера позволит оценить эффективность трансдукции опухолевых клеток глиобластомы человека. Изучение использованием цитопатического панели действия дефектных по вируса репликации было проведено векторов, с имеющих репортерный ген люциферазы или GFP, под контролем опухоле-специфического или цитомегаловирусного промотора. Предварительно клетки были охарактеризованы нами на предмет их принадлежности к подтипам глиобластомы. Оказалось, что клеточные линии U251, U118, U87, A172 [288] также как и линия D54, ранее охарактеризованная Ge с соавт. [455], являются представителями мезенхимального подтипа глиобластомы. В то же время D65 и M59 являются более классическими. В сравнении с другими векторами, используемыми в эксперименте, инфекция клеток аденовирусным вектором, в котором центральная и С-концевая части белка фибера серотипа 5 заменены на аналогичную область белка фибера серотипа 3, приводила к высокой степени трансдукции. При этом вирус демонстрировал высокую специфичность по отношению к опухолевым клеткам и низкую по отношению к здоровым первичным астроцитам человека. Данные результаты позволили предположить, что модификация 5/3 обеспечит специфичность трансдукции онколитическим вектором, что и было протестировано в реакциях вирусной репликации и клеточной токсичности. Как и ожидалось, модификация 5/3 фибера онколитического вектора существенно ограничивала репликацию вируса и его токсичность по отношению к астроцитам. Раннее было показано [67], что вирус с модификацией 5/3 имел схожую эффективность связывания с клеткой, сравнимую с эффективностью вектора, имеющего модификацию 5/5. Исходя изтого, можно исключить предположение, что 5/3 модифицированные вирусные частицы проникают в клетку меньшем количестве по сравнению с модификацией 5/5. В целом, при равной 182 эффективности связывания в наших экспериментах мы наблюдали остаточную токсичность вектора 5/3 в силу экспрессии астроцитами первичного рецептора CD46 [320] [321]. Недавние исследования, проведенные Danс соавт. [456] и позже подтвержденные Xing с соавт. [457] показывают, что инвертированные повторы молекулы ДНК аденовируса коров (BadV3) и свиней (pAdV3) содержат транскрипционные участки. Вместе с тем существуют данные, подтверждающие наличие схожих участков с транскрипционной активностью в инвертированных повторах аденовируса человека типа 5 [319]. Это позволяет предположить, что в вирусе CRAd-5/3WT эффективность транскрипции вирусных ДНК может идти с промоторов инвертированных концевых повторов, тем самым, обеспечивая вклад в нежелательную вирусную цитотоксичность вектора. Мы предполагаем, что дальнейшая модификация усилит специфичность аденовирусной генно- инженерной вакцины. При выборе руководствовались клеточного данными опухолеспецифического литературы и собственных промотора мы исследований. Использование промоторов генов GFAP [458, 459], NESTIN [460], Mielin [461], MK [88], E2F1 [462], и Ki67 [184] в регуляции аденовирусной экспрессии позволяет повысить специфичность аденовирусных векторов к клеткам глиом. Авторы в этих публикациях использовали направленную инфекцию как первичных клеток, так и перевиваемых опухолевых клеток глиобластомы. Однако в контексте клинического применения было показано, что темодал и ионизирующая радиация эффективны против CD133-негативных клеток [307, 322]. Было бы клинически оправдано изучить гены, активные в резистентных клетках, и использовать промоторные области для конструирования онколитических векторов адъювантного действия. С целью таргетинга CD133-позитивных клеток, мы изучили экспрессию генов, контролирующих резистентность к темодалу и ионизирующей радиации. 183 Все кандидаты-промоторы были исследованы на предмет их активности в стволовых клетках глиобластомы, резистентных к терапии. Оказалось, что промотор сурвивина обладал самой высокой активностью в опухолевых клетках, что выражалось в высокой транскрипционной активности, высокой концентрации белка сурвивина в клетках глиобластомы и мышиных ксенографтах после терапии темодалом и ионизирующей радиацией. Существующие терапевтические подходы избирательно удаляли неопухолевые CD133-негативные клетки и активировали клеточные генетические программы резистентности в CD133-позитивных клетках. Таким образом, направленная инфекция резистентных к терапии опухолевых клеток экспериментальным вирусом под контролем промотора, активного в стволовых клетках опухоли, повысит активность онколитического вектора. Для контроля специфичности нами были использованы промоторы CXCR4 [342, 463465] и MK [88, 466], демонстрирующие активность в глиомах. Оказалось, что промотор гена сурвивина высоко активен в перевиваемых и первичных опухолевых клетках, что отчасти связано с резистентностью к терапии и высоким уровнем деления опухолевых клеток. Однако оставался неясным размер минимального промотора, который может контролировать вирусную экспрессию в опухолевых клетках. Недавние исследования Whyte с соавт. предположили, что активация экспрессии клеточных генов сильно отличается от активности генов в стволовых клетках [467]. Присутствие супер энхансеров создают условия для постоянной активации клеточных путей, приводящих к злокачественности опухолей [468]. Мы протестировали активности двух версий промотора гена сурвивина человека в составе онколитических векторов. По данным литературы, промоторы гена сурвивина размером ~0.4 и ~1.2 тыс пар нуклеотидов показали разную токсичность в клетках аденокарциномы легкого человека. Согласно этой публикации, короткая версия промотора обладала усиленной транскрипционной активностью по отношению к неопластическим клеткам, однако на опухолях глиом это сравнение не проводилось. В нашем опыте внутриопухолевое введение 184 онколитического вируса под контролем короткой версии промотора показывало незначительно больший эффект, что выражалось в замедлении роста подкожной модели U87 глиобластомы, ингибирования пролиферации первичных клеток, инфицированных CRAd-S-S-RGD и токсичности. Более того, в состав минимального промотора гена сурвивина человека входят сайты узнавания для таких транскрипционных факторов, как STAT3, sp1 и KLF5 [469]. Использование минимального по размеру промотора является предпочтительным для вирусной генной терапии, поскольку существуют ограничения по клонированию чужеродных генов в состав аденовирусного компетентного вектора. Таким образом, мы можем сказать, что использование минимального промотора гена сурвивина человека в комбинации с модификацией белка фибера 5/3 позволит создать вектор с новыми свойствами. Впервые возможность создания онколитического вируса с помощью генноинженерных методов была продемонстрирована Martuza с соавт. в 1991 [470]. Он предложил методику клонирования генов, повышающих вирусную цитотоксичность с одновременным удалением несущественных для репликации генов вируса. Первым онколитическим вектором, созданным по такому принципу, на основе генома аденовируса человека типа 5 и способным лизировать клетки глиом был ONYX015. Cohen с соавт. в своих экспериментах впервые предпринял попытку создать онколитический агент, модифицируя раннюю область аденовируса путем внесения делеции 55кДа (p55) в области аденовируса Е1В [471]. По замыслу авторов внесение таких изменений в геном должно было увеличить цитотоксичность вирусного агента. Несмотря на инактивацию вирусного белка p55 репликация ONYX015 вируса наблюдалась не только в злокачественных клетках, но и в здоровых клетках. Для создания онколитического вектора мы применили подходы, сочетающие в себе как транскрипционные, так и трансдукционные изменения, затрагивающие геном аденовируса типа 5. На первом этапе тестирования 185 созданного вектора мы показали, что онколитический вирус, узнающий первичный рецептор CD46, экспрессирует ранние гены Е1А под контролем промотора гена сурвивина человека. Сравнение активностей онколитических вирусов, содержащих промотор гена сурвивина человека и разные модификации в кноб-домене белка фибера (RGD, pK7, 5/11, 5/35) показало, что модификация 5/3 обеспечивает высокий уровень трансдукции глиом по сравнению с модифицированными векторами RGD и pK7, но уступает по специфичности вектору с модификацией 5/35. Однако в контексте нейротоксичности и специфичности инфекции неопластических клеток модификация 5/3 позволяет значительно снизить вирусную репликацию и, следовательно, токсичность для неопухолевых клеток (астроцитов). Как показывают наши исследования, уровень вирусной репликации зависит от способности вируса связываться с первичными рецепторами клетки. По данным наших пока неопубликованных экспериментов существует зависимость уровня вирусной репликации от количества вирусных частиц, связавшихся с клеткой-мишенью. Оказалось, что вирус с модификацией белка фибера 5/3 обладает более высоким уровнем связывания с клеткой, по сравнению с RGD- и pK7- модифицированными векторами, но более низким в сравнении с 5/11 и 5/35 векторами. Однако, в первичных линиях клеток онколитический вектор с 5/3 химерой фибера демонстрирует существенное ингибирование пролиферации первичных линий клеток глиобластомы больше, чем вирус с pK7 модификацией. В целом предварительные данные наших экспериментов показывают, что вирус с модификацией 5/3 в фибере является предпочтительным для направленной инфекции, как перевиваемых, так и первичных клеток глиобластомы. 186 Использование экспериментальных подходов для усиления антиглиомного эффекта онколитического вируса: клинические перспективы Развитие цитотоксической реакции в ответ на инфекцию вирусом сопровождается появлением феномена клеточной смерти. В литературе было отмечено, что вирусные векторы в зависимости от модификаций в геноме аденовируса, клеточной системы для продукции аденовируса и набора экспрессируемых рекомбинантных ДНК вызывают появление апоптотической реакции [472-478], развитие аутофагии [355, 356, 401, 479, 480] и митотической катастрофы [154, 481]. Хотя значение каждого из процессов, как превалирующего антиглиомного механизма, находится в стадии изучения, понимание механизма вирусной токсичности важно для попыток усиления терапевтического эффекта за счет сенсибилизации клеток химиопрепаратом или радиотерапией. Многие клеточные белки вовлечены в развитие различных типов клеточной смерти. Например, известно, что BCL2 является антиапоптотическим белком [482], с другой стороны BCL2 увеличивает выживаемость клеток и развитие аутофагии [483]. Таким образом, совместная активация клеточной смерти терапевтическим агентом и онколитическим вирусом может быть эффективной терапевтической стратегией против глиомы. Одним из потенциальных индукторов, который стимулирующих аутофагию, является верапамил. Верапамил представляет собой блокатор кальциевых каналов, имеющих высокую проницаемость через гипоталамо-гипофизарный барьер(ВВВ) [484]. Существуют данные, показывающие роль верапамила как ингибитора P-gp. Как было сказано ранее ингибитор L – кальциевого канала, ингибирует активности некоторых вирусов, таких как риновирус [485], филовирус [486] и герпес вирус тип 1[487]. Недавно, была продемонстрирована роль верапамила в усилении терапевтического эффекта онколитического вируса путем увеличения вирусной репликации и высвобождения вирусных частиц [348, 349]. При этом оказалось, 187 что высвобождение вирусных частиц не связано с прогрессией аутофагии. Мы показали, что линия U87 оказалась нечувствительной к действию верапамила в силу отсутствия функциональных кальциевых каналов. В то же время линия клеток U251, богатая кальциевыми каналами, показывает высокую чувствительность к действию верапамила и онколитического вируса, особенно в процессе облучения ионизирующей радиацией. Считается, что АВС транспортеры играют функциональную роль в сопротивлении ионизирующему излучению, и в нашем случае, мы впервые наблюдали комбинационный эффект от инфекции онколитическим вектором и верапамилом [488]. Несмотря на существенное усиление эффекта CRAd-S-5/3 в присутствии верапамила, было отмечено, что многие первичные клетки глиобластомы человека содержат мутации в генах ионных каналов [489], что вызывает постоянную активацию пролиферации [490, 491] и инвазии [492] опухолевых клеток. В тоже время низкая токсичность и высокая толерантность пациентов с эпилепсией к верапамилу [422] делают возможым его применение в нейроонкологической клинике в комбинации с онколитическим вектором. Долгое время считалось, что большинство терапевтических агентов вызывает апоптоз, как основной механизм клеточной смерти. Нами [180, 286, 493] и другими авторами [202, 400, 494-497] было показано, что, несмотря на присутствие активированных про-апоптотических молекул, таких, как BAX2, BIM, BIK CRAd-инфекция не вызывает каспазо-зависимого апоптоза [498]. Более того, многие терапевтические агенты, включая CRAd, индуцируют клеточную смерть посредством индукции аутофагии – консервативного процесса, характеризующегося формированием двухмембранных вакуолей при участии комплексов клеточных белков [499]. Как и апоптоз, аутофагия играет важную роль в развитии гомеостаза, а также клеточной реакции на внешние раздражители [500]. Долгое время оставалось малоизученным, что запускает аутофагию в ответ на действие онколитического вируса. В отсутствие реакции на внешние 188 раздражители аутофагия служит для выделения потенциально опасных компонентов жизнеобеспечения клеток, таких, как митохондрии, разрушенные белки в составе лизосомальных гранул. В ответ на экспрессию вирусных белков Е1, а также белков областей Е4 клетка отвечает индукцией аутофагии, тем самым стсимулируя высвобождение вирусных частиц из клеток [400]. Данные наших исследований [180] и других авторов [85, 166, 497] показывают, что выделение вирусных частиц снижается в случае ингибирования аутофагии. Как отмечалось ранее, клинические образцы пациентов с болезнью Альцгеймера содержат нарушения в формировании аутофагосом [501]. Позже Сhaumorcel c соавт. показали, что в первичных клетках глиобластомы наблюдается ингибирование аутофагии цитомегаловирусом [502]. Наши недавние исследования также подтверждают, что ингибирование аутофагии цитомегаловирусом наблюдается в первичных клетках глиобластомы [288]. Поскольку опухолевые клетки, инфицированные цитомегаловирусом, распределяюься внутри глиомы неравномерно мы предполагаем, что клеточная аутофагия будет наблюдаться не во всех клетках в силу гетерогенности. В дополнение к вышесказанному, оказалось, что клетки, дефектные по Beclin 1, представлены фенотипом, для которого характерно сенессенс – состояние репрограммирования опухоли, ассоциированное с ограничением пролиферации. Мы предполагаем, что в таком состоянии опухолевые клетки имеют ограниченную пролиферацию, сниженную аутофагию и секрецию проопухолевых факторов, то есть становятся более резистентными, чем не инфицрованые CMV. В таком виде клетки секретируют факторы, стимулирующие непролиферирующие клетки. Мы предложили для терапии данных клеток использовать тамоксифен, который не только уменьшает экспрессию белка цитомегаловируса 1Е1, но активирует аутофагию, что сенсибилизирует опухолевые клетки к терапии онколитическим вирусом. 189 Существующие возможности по созданию онколитического вектора ограничены биологией аденовируса. Использование одного онколитического аденовируса не подразумевает под собой быстрого противоопухолевого эффекта в силу его длинного репликативного цикла продолжительностью 48-72 часа, начинающегося от интернализации вируса в клетку и заканчивающегося выделением дочерних вирусных частиц. Поэтому существуют различные стратегии, позволяющие усилить противоопухолевый эффект в комбинации с антиглиомным препаратом, либо применяющиеся в клинической практике, либо находящиеся в стадии преклинической оценки. В основе многих антиглиомных подходов, таких как, использование ионизирующей радиации или химиопрепаратов, находится индукция апоптоза или аутофагии. Схожий механизм клеточной смерти был продемонстрирован онколитическим аденовирусом. Так, аддитивный антиглиомный эффект от комбинации ионизирующей радиации [285, 496], авастина [58], эверолимуса [164], цисплатина [163], дауробицина [163] и онколитического аденовируса был отмечен многими авторами. Другим способом усиления аутофагии является комбинация онколитического вируса с темодалом (TMZ) [86, 136, 163, 286, 503]. В литературе известно, что называемую помимо аутофагии темодал митотической катастрофой. вызывает Этот клеточную процесс смерть, характеризуется формированием клеток с поврежденной системой восстановления ДНК, а также активацией клеточных каспаз, как части митохондриального апоптоза. Однако считается, что митотическая катастрофа возникает в ответ на нарушение процесса разделения хромосом, который блокируется в одной из фаз клеточного деления. Последующие нарушения в организации веретена деления ведут к формированию полиплоидных клеток с измененным набором хромосом. При этом контроль за развитием митотической катастрофы осуществляют клеточные белки p53 и p21. Таким образом, ингибирование клеточных супрессоров p53 способствует токсичности, опосредованной темодалом. В наших экспериментах мы впервые 190 показали, что ингибирование p53 усиливает аутофагию и нарушает клеточную пролиферацию. В качестве заключения мы бы хотели отметить тот факт, что не позиционируем разработанный нами препарат как моновакцину. Разумеется, созданная нами генно-инженерная вакцина на основе онколитического аденовируса 5/3 не способна в одиночку оказать существенный терапевтический эффект против различного типа глиобластомы. Однако, используя своей работе различные экспериментальные модели (перевиваемые линии клеток глиом, первичные линии клеток пациентов с глиобластомами, внутримозговые модели глиобластомы мышей), мы постарались продемонстрировать преимущество использования генно-инженерной вакцины в комбинации с терапией темодалом, ионизирующей радиацией и хирургической резекцией. Мы надеемся, что в будущем доклинические испытания онколитического вируса будут проводиться по факту предварительного скрининга тканей пациентов с диагнозом «глиобластома» на присутствие цитомегаловируса и других онкогенных вирусов, что сможет послужить основанием для начала противовирусной терапии. 191 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В нашей работе была поставлена задача сконструировать генно-инженерный самореплицирующийся вектор, специфичный к клеткам глиобластомы и индуцирующий цитотоксичность неопластических клеток in vitro и in vivo. Текущие клинические испытания, проводимые в мире, и предварительные результаты, полученные в медицинской практике, позволили сделать выбор в пользу создания вектора на основе генома аденовируса человека для доставки рекомбинантной ДНК с целью терапевтической интервенции глиом. Однако применение самореплицирующегося генно-терапевтического препарата на основе генома аденовируса типа 5 без внесения дополнительных модификаций не отвечает критериям специфичности по отношению к неопластическим клеткам головного мозга. По нашим данным, использование рецептора CD46 и высокая активность промотора гена сурвивина позволяет многократно усилить специфичность вектора и снизить возможную нейротоксичность. Более того, данные сравнительного анализа рекомбинантных аденовирусов, узнающих CD46, позволяют предположить, что использование кноб-домена аденовируса типа 3 обеспечивает высокое связывание вириона с поверхностью клетки-мишени. Эффективность применения аденовирусных векторов зависит от чувствительности клетки к инфекции аденовирусным вектором. Как было показано, активация клеточных программ, таких, как стресс, обеспечивает реакцию клетки на внешнее воздействие, в том числе посредством усиления резистентности. Данные, представленные в нашем автореферате позволяют оценить возможные причины такого поведения клеток глиобластомы и предлагают пути их преодоления. К настоящему времени известна целая группа генов, известных как белки-супрессоры, контролирующие ответ клетки на внешнее воздействие в виде активации пролиферации, ангиогенеза, клеточного деления и общей экспериментальных резистентности. исследований Более того, предполагают оказалось, наличие что большего данные числа 192 химиопрепаратов, повышающих аденовирусную цитотоксичность и снижающих роль супрессоров опухоли. В результате оказалось, что применение ингибиторов р53, Хеджхог-сигнального пути и кальциевых каналов усиливает специфичность аденовирусного вектора, особенно в контексте первичных опухолевых клеток. Развитие клеточной цитотоксичности аденовирусными векторами влияет на их использование в качестве генно-инженерных векторов. По данным литературы и нашим данным, онколитический аденовирус под контролем промотора гена сурвивина индуцирует аутофагию и апоптоз. В настоящей работе показано, что, в сравнении с другими онколитическими векторами, CRAd-S-5/3 индуцирует значительное количество микроРНК7, которая активирует аутофагию. Эти результаты были позднее подтверждены данными других исследователей, которые свидетельствуют об активной роли индукторов аутофагии, таких, как микроРНК7d, аденовирусных белков области Е4, в активации аутофагии. Полученные данные вносят существенный вклад в развитие понимания молекулярного механизма аденовирусной цитотоксичности, что необходимо для моделирования вирусных векторов с усиленной токсичностью по отношению к неопластическим клеткам. Белковый анализ клеток первичных глиобластом чнловека показал, что сниженная экспрессия клеточных белков, таких, как Beclin-1, может вносить существенный вклад в регуляцию чувствительности неопластических клеток к аденовирусной инфекции. Было показано, что у пациентов с ГБМ, демонстрирующих сниженную экспрессию Beclin-1 в результате персистенции цитомегаловируса, эффективность инфекций клеток глиобластомы аденовирусом снижена. Установлено, что 58% тканей пациентов с диагнозом глиобластома содержат продукты экспресии цитомегаловируса человека. Поскольку развитие аутофагии было продемонстрировано для цитотоксичности многих противоопухолевых агентов, мы считаем важнейшей задачей повышение эффективности аутофагии параллельно с ингибированием персистенции 193 онкогенных вирусов. В нашей работе мы установили, что тамоксифен повышает аутофагию, тем самым усиливая противоопухолевый эффект вектора CRAd-S-5/3. При этом следует подчеркнуть практическое значение полученных данных, поскольку тамоксифен нашел свое применение в клинических испытаниях в США. 194 ВЫВОДЫ 1: Разработаны и продемонстрированы методические подходы к анализу чувствительности опухолевых клеток мультиформной глиобластомы к инфекции аденовирусным вектором на основе фрагментов геномов аденовируса человека различных серотипов. 2: Определена зависимость клеточной локализации белка фибера аденовируса от наличия мутаций в N-концевой части аминокислотной последовательности гена. Показано, что мутантная форма белка фибера, дефектная по сигналу ядерного транспорта, имеет цитоплазматическую и ядерную локализацию. 3: Впервые проведено сравнение эффективности накопления рекомбинантного аденовируса в присутствии поверхностного белка фибера аденовируса с различной клеточной локализацией. Продемонстрированы условия снижения инфекционности аденовирусных частиц. Определено, что аденовирус, выращенный в инфицированных клетках и содержащий мутантный фибер в цитоплазме, обладает сниженной инерционностью по отношению к опухолевым клеткам человека (в среднем 4-15 раз). 4: Впервые продемонстрировано, что клеточный мембранный рецептор CD46 является новой молекулой-мишенью для аденовирусной терапии глиобластомы. Проведен сравнительный анализ трансдукции клеток глиобластомы рекомбинантными аденовирусами, содержащими рецептор-связывающие участки к белку CD46 в составе кноб-домена белка фибера. Отмечено, что стабильное встраивание кноб-домена аденовируса человека серотипа 3 в составе фибера обеспечивало высокий уровень инфекции клеток глиобластомы человека (10-100 кратное увеличение) в сравнении с контрольным вектором AdWT. 5: С целью усиления специфичности экспрессии вирусных цитотоксичных белков области Е1А (транскрипционного подхода) проведен скрининг кандидатовпромоторов и показано преимущество применения промотора гена сурвивина 195 человека в контроле специфичности вирусной транскрипции. Комбинирование транскрипционного и трансдукционного подходов в создании генно-инженерного вектора позволило получить CRAd-S-5/3. Показано, что онколитический вектор CRAd-S-5/3 индуцирует антиглиомный терапевтический эффект in vitro и in vivo. 6: На перевиваемых и первичных клетках пациентов с диагнозом «мультиформная глиобластома» изучено действие 12 онколитических аденовирусных векторов. Показано, что эффективность ингибирования роста глиобластомы человека вектором CRAd-S-5/3 характеризуется высокой цитотоксичностью к опухолевым клеткам и повышением выживаемости мышей с глиобластомой человека. 7: Определен и охарактеризован процесс клеточной цитотоксичности, вызываемый в ответ на инфицрование онколитическим аденовирусом под контролем промотора гена сурвивина человека. Регистрация изменений в экспрессии клеточных белков зафиксировала появление смешанной клеточной реакции на основе апоптоза и аутофагии. 8: Определены клеточные белки и коротко-размерные РНК, приводящие к индукции аутофагии онколитическим вирусом в глиобластоме человека. Отмечено, что эффективность онколитического аденовектора зависит от уровня экспрессии микроРНК7d. Показано терапевтическое значение микроРНК7d при медикаментозной интервенции глиобластомы онколитическими аденовирусными векторами и химиопрепаратами. 9: Определены условия снижения уровня аутофагии в клетках глиобластомы человека. Показано, что персистенция цитомегаловируса в опухолевых клетках снижает экспрессию Beclin-1 и конверсию клеточного LC3-I в LC3-II. В случае снижения аутофагии в клинических образцах, был предложен комбинированный способ терапии клеток глиобластомы со сниженной аутофагией с помощью онколитического вектора в присутствии тамоксифена. 196 10: Проведена оценка чувствительности клеток, не инфицированных цитомегаловирусом, к терапии темодалом и ионизирующей радиации, и отмечена индукция генов, отвечающих за резистенцию к ним. 12: Комплексное применение химиопрепаратов темодал, ингибиторов p53, Lкальциевых каналов и, Хеджхог сигнального пути, расширяет возможности онколитической терапии и позволяет достичь пролонгированного терапевтического эффекта при минимальной нейротоксичности in vitro и in vivo. 13: Полученные данные позволяют рекомендовать генно-инженерный препарат на основе онколитического аденовируса CRAd-S-5/3 в качестве адъюванта на доклинические испытания. 197 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ТЕРМИНОВ CRAd – (conditional replicated adenovirus) самореплицирующийся аденовирус 5FU-5 – фторурацил Ад – аденовирус ГБМ – мультиформная глиобластома CD – кластер дифференцировки ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота РНК – рибодезоксинуклеиновая кислота дНТФ – дезоксинуклеотидтрифосфат кДНК – комплиметарная ДНК мРНК – матричная РНК ОТР – реакция обратной транскрипции ПААГ – полиакриламидный гель П.о. – пара оснований П.н. – пара нуклетидов ПКС – программируемая клеточная смерть ПЦР – полимеразная цепная реакция ЭДТА – этилендиаминтетраацетат натрия SDS – додецилсульфат натрия CMV – цитомегаловирус человека ЦПД – цитопатическое действие DAPI – 4,6-диамидин-2-фенилиндол DMEM – минимальная среда Игла, модифицированная ДульбеккоДельбекко GFP – ген зеленого белка HRP – пероксидаза хрена HSV1 – вирус простого герпеса типа 1 LB – среда Лурия-Бертани MEM – минимальная среда Игла 198 ОД – оптическсая плотность PBS – фосфатно-солевой буфер NDV – вирус болезни Ньюкасла CAR – Коксаки аденовирусный рецептор HER2 – эпидермальный фактор роста рецептора человека UPAR – рецептор урокиназы FGFR – рецептор фактора роста фибробластов PTEN – гомолог фосфатазы и тензин IDH – изоцитрат дегидрогеназа EGFR – рецептор эпидермального фактора роста MGMT – О-6-метилгуанин-ДНК метилтрансфераза VEGF – эндотелиальный фактор роста сосудов IAP – ингибитор апоптоза IL8 – интерлейкин 8 IL2 – интерлейкин 2 MTT –3-(4,5-диметил-2-тиазолил-)-2,5-дифенил-2н- бромид тетразолил LDH – лактат дегидрогеназа GLI-SHH – соник хеджхог сигнальный путь ОВ – онколитический вектор CRAd-S-5/3 199 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1 Злокачественные нообразования в 1996 (заболеваемость и смертность): Под ред . В.И.Чиссова, В.В. Старинского, Л.В. Ременника.-Москва, 1997. – С. 273. 2 Авцын, А.П. Биологические основы нейроонкологии. // Вестник РАМН. – 1993. -Т.7. – С.51-55. 3 Барышников, А.Ю. Программированная клеточная смерть/ А.Ю. Барышников, Ю. В Шишкин // Российский онкологический журнал. 1996. Т. 1. – C. 58–61. 4 Видяева, И.Г. / Изучение вирус-индуцированного апоптоза опухолевых клеток in vitro //И.Г. Видяева, Л.Н. Уразова, Т.И. Кузнецова //Сибирский Онкологический Журнал. – 2006. – Т.4, №20. – С. 37-40. 5 Горбунова, В.А. Темодал-новые возможности и перспективы лечения опухолей головного мозга // Фарматека. -2004. – Т18. – С. 15-20. 6 Каверина, Н.В. Влияние метилирования промотора KISS1 на подавление экспрессии гена в клетках рака молочной железы и его метастазов вголовной мозг/ Н.В. Каверина, И.В. Уласов, Д.Велш [и др.]// Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. – 2011. – Т.22.- №4. – С.17-23. 7 Карташев, А.В. Перспективы применения вирусоиммунотерапии как элемента комбинированного лечения злокачественных глиом головного мозга /А.В.Карташев, В.М.Виноградов, А.В.Поздняков [и др.]// Вопросы Онкологии. – 2010. –Т.56. -№3. – С.278-282. 8 Кашкин, К.Н. Опухолевая специфичность промоторов генов, участвующих в контроле клеточной пролиферации /К.Н. Кашкин, И.П. Чернов, Е.А. Стукачева [и др.]//Acta Naturae. – 2013. – Т.5.-№3. – 18. – С.83-87. 9 Олюшин, В.Е. Комплексная терапия злокачественных глиом головного мозга // Тезисы докладов VIII Всероссийского съезда рентгенологов и радиологов.– Челябинск.- 2001. – С. 37-38. 200 10 Погорелов, В.М./ Морфология апоптоза при нормальном и патологическом апоптозе // Гематология и трансфузиология. – 1995. – № 5. – С. 17–2. 11 Святченко, В. А. Онколитические аденовирусы в терапии злокачественных новообразований: современное состояние и перспективы / В. А. Святченко, М. В Тарасова, С. В Нетёсов., [и др.]// Мол. биол. 2012. Т. 46, – № 4. – С. 556–569 12 Святченко, В.А. Конструирование перспективного онколитичнксого вируса Ad2DEL на основе генома аденовируса 2-го серотипа/ В.А. Святченко, В.А. Терновой, Н.Н. Киселев [и др.]//Вестник НГУ.Серия: Биология и клиническая медицина. – 2013. – Т.11.-№3. – С.70-77. 13 Сергеев, А.Н. Возможность культивирования мутантного варианта Ade12 аденовируса на культуре клеток 293 / А.Н. Сергеев, В.А Петрищенко, О.В. Пьянков [и др.]// Вопросы вирусологии. – 2003.- № 6.- С. 30–3 14 Смирнова, З.С. Изучение отечественных противоопухолевых препаратов на экспериментальных опухолевых моделях / З.С Смирнова, А.С Халанский, Ю.В Родионова [и др.]// Российский Биотерапевтический Журнал. – 2004.-Т.3. – №3. С. 49-55. 15 Терновой, В.А. Конструирование перспективных онколитических рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих ген белка апоптина. / В.А. Терновой, М.В Святченко, М.В. Тарасова [и др.]//Вестник Томского государственного университета. Биология. – 2013. – Т.3.- №23. – С. 100–110. 16 Уразова, Л.Н. Онколитические вирусы в онкологии / Л.Н Уразова, Т.И Кузнецова // Сибирский Онкологический Журнал. – 2003. – Т.4. – №8. -С. 28-35. 17 Шевцов, М.А. Модели интракраниальной опухоли у животных в доклиничесой нейроонкологии /M.А. Шевцов, В.А. Хачатрян, А.В. Поздняков [и др. ]//Нейрохирургия и Неврология. – 2011. – Т.4. – №11. – С.20-31. 18 ответа Шмаров, М.М. Индукция протективного гетеросубтипического иммунного против вируса гриппа при иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами, экспрессирующими гемагглютинин вируса гриппа 201 H5/ М.М. Шмаров, Е.С Седова, Л.В Верховская [и др. ]// Acta Naturae. – 2010. – Т.2. – №1 (4). – С. 119–126. 19 Штефан, А.Ю. Эффективность тенипозида в химиолучевом лечении злокачественных глиом головного мозга/А.Ю. Штефан, Д.Д. Сакаева, Ф.Ф. Муфазалов// Российский Биотерапевтический Журнал. – 2011. – Т.4. №11. -С.3741 20 Шубладзе А.К. Краткий курс практической вирусологии / А.К. Шубладзе, С.Я Гайдамович // М.: Медгиз.- 1964.- C. 379. 21. Dolecek, T.A. CBTRUS statistical report: primary brain and central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2005-2009./ T.A. Dolecek// Neuro Oncol.- 2012. V.14,№ 5.-P. 1-49. 22. Zheng, T. Risk of brain glioma not associated with cigarette smoking or use of other tobacco products in Iowa./ T. Zheng, K.P. Cantor, Y. Zhang [et al.] //Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.- 2001.-V. 10, №4.-Р. 413-4. 23. Messali, A. R. A review of the economic burden of glioblastoma and the cost effectiveness of pharmacologic treatments./A. Messali, R. Villacorta, J.W. Hay.//Pharmacoeconomics.-2014.-V.32, №12.-Р. 1201-12. 24. Woods, L.M. Evidence against the proposition that "UK cancer survival statistics are misleading": simulation study with National Cancer Registry data./ L.M. Woods, M.P. Coleman, G. Lawrence [et al.] /BMJ.-2011.-V.342.-P. d3399. 25. Ahmed, R. Malignant gliomas: current perspectives in diagnosis, treatment, and early response assessment using advanced quantitative imaging methods./ R. Ahmed, M.J. Oborski, M. Hwang [et al.] /Cancer Manag. Res.- 2014.-V.6.-P. 149-70. 26. Bello, M.J. Allelic loss at 1p is associated with tumor progression of meningiomas./ M.J. Bello, J.M. de Campos, M.E. Kusak [et al.] //Genes Chromosomes Cancer.-1994.-V. 9, №4.-P. 296-8. 202 27. Reifenberger, J. Molecular genetic analysis of oligodendroglial tumors shows preferential allelic deletions on 19q and 1p./ J. Reifenberger, G. Reifenberger, L. Liu [et al.] //Am. J. Pathol.-1994.-V.145.-№5.-Р. 1175-90. 28. Hartmann, C. Patients with IDH1 wild type anaplastic astrocytomas exhibit worse prognosis than IDH1-mutated glioblastomas, and IDH1 mutation status accounts for the unfavorable prognostic effect of higher age: implications for classification of gliomas./ C. Hartmann, B. Hentschel, W. Wick [et al.] // Acta Neuropathol.-2010.V.120, №6.-P. 707-18. 29. Ichimura, K. Molecular pathogenesis of IDH mutations in gliomas./ K. Ichimura// Brain Tumor Pathol.-2012.-V.29, №3.-P. 131-9. 30. Hegi, M.E. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma./ M.E. Hegi, A.C. Diserens, T. Gorlia [et al.] // N. Engl. J. Med.-2005.V.352, №10.-P. 997-1003. 31. Olar, A. Biomarkers classification and therapeutic decision-making for malignant gliomas./ A. Olar, K.D. Aldape.// Curr. Treat. Options. Oncol.-2012.-V.13, №4.-P. 41736. 32. Ohgaki, H. Genetic pathways to primary and secondary glioblastoma./ H. Ohgaki, P. Kleihues.//Am. J. Pathol.-2007.-V.170, №5.-P. 1445-53. 33. Verhaak, R.G. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1./ R.G. Verhaak, K.A. Hoadley, E. Purdom [et al.] // Cancer Cell.-2010.-V.17, №1.-P. 98110. 34. Phillips, H.S. Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis./ H.S. Phillips, S. Kharbanda, R. Chen [et al.] // Cancer Cell.-2006.-V.9, №3.-P. 157-73. 35. Inda, M.M. Glioblastoma multiforme: a look inside its heterogeneous nature./ M.M. Inda, R. Bonavia, J. Seoane // Cancers (Basel).-2014.-V.6, №1.-P. 226-39. 203 36. Kohler, B.A. Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2007, featuring tumors of the brain and other nervous system./ B.A. Kohler, E. Ward, B.J. McCarthy [et al.] // J. Natl. Cancer Inst.-2011.-V.103, №9.-P. 714-36. 37. Wohrer, A. The Austrian Brain Tumour Registry: a cooperative way to establish a population-based brain tumour registry./ A. Wöhrer, T. Waldhör, H. Heinzl [et al.] // J. Neurooncol.-2009.-V.95, №3.-P. 401-11. 38. Ohgaki, H. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas./ H. Ohgaki, P. Kleihues.// J. Neuropathol. Exp. Neurol.-2005.-V.64, №6.-P. 479-89. 39. Ho, V.K. Changing incidence and improved survival of gliomas./ V.K. Ho, J.C. Reijneveld, R.H. Enting [et al.] // Eur J Cancer.-2014.-V.50, №13.-P. 2309-18. 40. Clarke, J. Epigenetic pathways and glioblastoma treatment./ J. Clarke, C. Penas, C. Pastori [et al.] // Epigenetics.-2013.-V.8, №8.-P. 785-95. 41. Fabbri, G. Genetic lesions associated with chronic lymphocytic leukemia transformation to Richter syndrome./ G. Fabbri, H. Khiabanian, A.B. Holmes [et al.] // J. Exp. Med.-2013.-V.210, №11.-P. 2273-88. 42. Meng, D. High expression of N-myc (and STAT) interactor predicts poor prognosis and promotes tumor growth in human glioblastoma./ D. Meng, Y. Chen, D. Yun [et al.] // Oncotarget.-2015.-V.6, №7.-P. 4901-19. 43. Ortiz, B. Loss of the tyrosine phosphatase PTPRD leads to aberrant STAT3 activation and promotes gliomagenesis./ B. Ortiz, A.W. Fabius, W.H. Wu [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2014.-V.111, №22.-P. 8149-54. 44. Yamada, D. Loss of Tsc1 accelerates malignant gliomagenesis when combined with oncogenic signals./ D. Yamada, T. Hoshii, S. Tanaka [et al.] // J. Biochem.-2014.V.155, №4.-P. 227-33. 45. Lin, N. Deletion or epigenetic silencing of AJAP1 on 1p36 in glioblastoma./ N. Lin, C. Di, K. Bortoff [et al.] // Mol. Cancer Res.-2012.-V.10, №2.-P. 208-17. 204 46. Wasserfallen, J.B. Cost of temozolomide therapy and global care for recurrent malignant gliomas followed until death./ J.B.Wasserfallen, S. Ostermann, S. Leyvraz [et al.] // Neuro Oncol.-2005.-V.7, №2.-P. 189-95. 47. Hofer, S. Molecular biology of high-grade gliomas: what should the clinician know?/ S. Hofer, E. Rushing, M. Preusser [et al.] //Chin. J. Cancer.-2014.-V.33, №1.-P. 4-7. 48. Haseley, A. Advances in oncolytic virus therapy for glioma./ A. Haseley, C. Alvarez-Breckenridge, A.R. Chaudhury [et al.] // Recent Pat. CNS Drug. Discov.-2009.V.4, №1.-P. 1-13. 49. Venur, V.A. Ahluwalia, Current medical treatment of glioblastoma./ V.A. Venur, D.M. Peereboom, M.S. Ahluwalia// Cancer. Treat. Res.-2015.-V.163.-P. 103-15. 50. Johnson, D.R. Medical management of high-grade astrocytoma: current and emerging therapies./ D.R. Johnson, E. Galanis // Semin. Oncol.-2014.-V.41, №4.-P. 511-22. 51. Modrek, A.S. Brain stem cells as the cell of origin in glioma./ A.S. Modrek, N.S. Bayin, D.G. Placantonakis // World J. Stem Cells.-2014.-V.6, №1.-P. 43-52. 52. Sant, M. Survival of European patients with central nervous system tumors./ M. Sant, P. Minicozzi, S. Lagorio [et al.] // Int. J. Cancer.-2012.-V.131, №1.-P. 173-85. 53. Kaufmann, J.K. Glioma virus therapies between bench and bedside./ J.K. Kaufmann, E.A. Chiocca // Neuro Oncol.-2014.-V.16, №3.-P. 334-51. 54. Lesniak, D.R. Predicting SA-I mechanoreceptor spike times with a skin-neuron model./ D.R. Lesniak, G.J. Gerling // Math. Biosci.-2009.-V.220, №1.-P. 15-23. 55. Nandi, S. A chimeric adenovirus with an Ad 3 fiber knob modification augments glioma virotherapy./ S. Nandi, I.V. Ulasov, C.E. Rolle [et al.] // J. Gene Med.-2009.V.11, №11.-P. 1005-11. 56. Ulasov, I.V. Novel recombinant adenoviral vector that targets the interleukin-13 receptor alpha2 chain permits effective gene transfer to malignant glioma. / I.V. Ulasov, M.A. Tyler, Y. Han [et al.] //Hum. Gene Ther.-2007.-V.18, №2.-P. 118-29. 205 57. Tyler, M.A. Neural stem cells target intracranial glioma to deliver an oncolytic adenovirus in vivo./ M.A. Tyler, I.V. Ulasov, A.M. Sonabend [et al.] // Gene Ther.2009.-V.16, №2.-P. 262-78. 58. Thaci, B. Anti-angiogenic therapy increases intratumoral adenovirus distribution by inducing collagen degradation./ B. Thaci, I.V. Ulasov, A.U. Ahmed [et al.] // Gene Ther.-2013.-V.20, №3.-P. 318-27. 59. Weiler, M. mTOR target NDRG1 confers MGMT-dependent resistance to alkylating chemotherapy./ M. Weiler, J. Blaes, S. Pusch [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2014.-V.111, №1.-P. 409-14. 60. Grzmil, M. Overcoming resistance to rapalogs in gliomas by combinatory therapies./ M. Grzmil, B.A. Hemmings // Biochim. Biophys. Acta.-2013.-V.1834, №7.P. 1371-80. 61. Fan, Q.W. Autophagy and Akt promote survival in glioma./ Q.W. Fan, W.A. Weiss // Autophagy.-2011.-V.7, №5.-P. 536-8. 62. Arnold, C.R. T cell receptor-mediated activation is a potent inducer of macroautophagy in human CD8(+)CD28(+) T cells but not in CD8(+)CD28(-) T cells./ C.R. Arnold, T. Pritz, S. Brunner [et al.] // Exp. Gerontol.-2014.-V.54.-P. 75-83. 63. Jamal, M.The brain microenvironment preferentially enhances the radioresistance of CD133(+) glioblastoma stem-like cells./ M. Jamal, B.H. Rath, P.S. Tsang [et al.] // Neoplasia.-2012.-V.14, №2.-P. 150-8. 64. Lemke, D. Primary glioblastoma cultures: can profiling of stem cell markers predict radiotherapy sensitivity?/ D. Lemke, M. Weiler, J. Blaes [et al.] // J. Neurochem.-2014.-V.131, №2.-P. 251-64 65. Ghali, M. Receptor (CD46)- and replication-mediated interleukin-6 induction by measles virus in human astrocytoma cells./ M. Ghali, J. Schneider-Schaulies // J. Neurovirol.-1998.-V.4, №5.-P. 521-30. 206 66. Zheng, S. Fiber-knob modifications enhance adenoviral tropism and gene transfer in malignant glioma./ S. Zheng, I.V. Ulasov, Y. Han [et al.] // J. Gene Med.2007.-V. 9, №3.-P. 151-60. 67. Ulasov, I.V. Targeting adenovirus to CD80 and CD86 receptors increases gene transfer efficiency to malignant glioma cells./ I.V. Ulasov, A.A. Rivera, Y. Han [et al.] // J. Neurosurg.-2007.-V.107, №3.-P. 617-27. 68. Tyler, M.A. Enhanced transduction of malignant glioma with a double targeted Ad5/3-RGD fiber-modified adenovirus./ M.A. Tyler, I.V. Ulasov, A. Borovjagin [et al.] // Mol. Cancer Ther.-2006.-V.5, №9.-P. 2408-16. 69. Guzman, G. Expression of entry receptor nectin-1 of herpes simplex virus 1 and/or herpes simplex virus 2 in normal and neoplastic human nervous system tissues./ G. Guzman, S. Oh, D. Shukla [et al.] // Acta Virol.-2006.-V.50, №1.-P. 59-66. 70. Wohlfahrt, M.E. A capsid-modified, conditionally replicating oncolytic adenovirus vector expressing TRAIL Leads to enhanced cancer cell killing in human glioblastoma models./ M.E. Wohlfahrt, B.C. Beard, A. Lieber [et al.] // Cancer Res.2007.-V.67, №18.-P. 8783-90. 71. Brouwer, E. Human adenovirus type 35 vector for gene therapy of brain cancer: improved transduction and bypass of pre-existing anti-vector immunity in cancer patients./ E. Brouwer, M.J. Havenga, O. Ophorst [et al.] // Cancer Gene Ther.-2007.V.14, №2.-P. 211-9. 72. Stupp, R. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma./ R. Stupp, W.P. Mason, M.J. van den Bent [et al.] // N. Engl. J. Med.2005.-V.352, №10.-P. 987-96. 73. Allen, C. Interleukin-13 displaying retargeted oncolytic measles virus strains have significant activity against gliomas with improved specificity./ C. Allen, G. Paraskevakou, I. Iankov [et al.] // Mol. Ther.-2008.-V.16, №9.-P. 1556-64. 207 74. Gambini, E. Replication-competent herpes simplex virus retargeted to HER2 as therapy for high-grade glioma./ E. Gambini, E. Reisoli, I. Appolloni [et al.] // Mol. Ther.-2012.-V.20, №5.-P. 994-1001. 75. Uchida, H. Effective Treatment of an Orthotopic Xenograft Model of Human Glioblastoma Using an EGFR-retargeted Oncolytic Herpes Simplex Virus./ H. Uchida, M. Marzulli, K. Nakano [et al.] // Mol. Ther.-2013.-V.21, №3.-P. 561-9. 76. Kamiyama, H.Herpes simplex virus 1 recombinant virions exhibiting the amino terminal fragment of urokinase-type plasminogen activator can enter cells via the cognate receptor./ H. Kamiyama, G. Zhou, B. Roizman // Gene Ther.-2006.-V.13, №7.P. 621-9. 77. Liu, T.C. Dominant-negative fibroblast growth factor receptor expression enhances antitumoral potency of oncolytic herpes simplex virus in neural tumors./ T.C. Liu, T. Zhang, H. Fukuhara [et al.] // Clin. Cancer Res.-2006.-V.12, №22.-P. 6791-9. 78. Hasegawa, Y. Urokinase-targeted fusion by oncolytic Sendai virus eradicates orthotopic glioblastomas by pronounced synergy with interferon-beta gene./ Y. Hasegawa, H. Kinoh, Y. Iwadate [et al.] // Mol.Ther.-2010.-V.18, №10.-P. 1778-86. 79. Gupta, V. Fibroblast growth factor-2-retargeted adenoviral vector for selective transduction of primary glioblastoma multiforme endothelial cells./ V. Gupta, W. Wang, B.A. Sosnowski [et al.] // Neurosurg Focus.-2006.-V.20, №4.-P. E26. 80. Geoerger, B. Expression of p53, or targeting towards EGFR, enhances the oncolytic potency of conditionally replicative adenovirus against neuroblastoma./ B. Geoerger, V.W. van Beusechem, P. Opolon [et al.] // J. Gene Med.-2005.-V.7, №5.-P. 584-94. 81. van Beusechem, V.W. Conditionally replicative adenovirus expressing a targeting adapter molecule exhibits enhanced oncolytic potency on CAR-deficient tumors./ V.W. van Beusechem, D.C. Mastenbroek, P.B. van den Doel [et al.] // Gene Ther.-2003.-V.10, №23.-P. 1982-91. 208 82. Kim, C.K. N-acetylcysteine amide augments the therapeutic effect of neural stem cell-based antiglioma oncolytic virotherapy./ C.K. Kim, A.U. Ahmed, B. Auffinger [et al.] // Mol. Ther.-2013.-V.21, №11.-P. 2063-73. 83. Ulasov, I.V. Comparative evaluation of survivin, midkine and CXCR4 promoters for transcriptional targeting of glioma gene therapy./ I.V. Ulasov, A.A. Rivera, A.M. Sonabend [et al.] // Cancer Biol. Ther.-2007.-V.6, №5.-P. 679-85. 84. Van Houdt, W.J. The human survivin promoter: a novel transcriptional targeting strategy for treatment of glioma./ W.J. Van Houdt, Y.S. Haviv, B. Lu [et al.] // J. Neurosurg.-2006.-V.104, №4.-P. 583-92. 85. Ito, H. Autophagic cell death of malignant glioma cells induced by a conditionally replicating adenovirus./ H. Ito, H. Aoki, F. Kühnel [et al.] // J. Natl. Cancer Inst.-2006.-V.98, №9.-P. 625-36. 86. Yokoyama, T. Autophagy-inducing agents augment the antitumor effect of telerase-selve oncolytic adenovirus OBP-405 on glioblastoma cells./ T. Yokoyama, E. Iwado, Y. Kondo [et al.] // Gene Ther.-2008.-V.15, №17.-P. 1233-9. 87. Ulasov, I.V. An oncolytic adenoviral vector carrying the tyrosinase promoter for glioma gene therapy./ I.V. Ulasov, A.A. Rivera, D.M. Nettelbeck [et al.] // Int. J. Oncol.2007.-V.31, №5.-P. 1177-85. 88. Kohno, S. Midkine promoter-based conditionally replicative adenovirus for malignant glioma therapy./ S. Kohno, K. Nakagawa, K. Hamada [et al.] // Oncol. Rep.2004.-V.12, №1.-P. 73-8. 89. Kambara, H. An oncolytic HSV-1 mutant expressing ICP34.5 under control of a nestin promoter increases survival of animals even when symptomatic from a brain tumor./ H. Kambara, H. Okano, E.A. Chiocca [et al.] // Cancer Res.-2005.-V.65, №7.-P. 2832-9. 90. Kanai, R. Enhanced therapeutic efficacy of oncolytic herpes vector G207 against human non-small cell lung cancer--expression of an RNA-binding protein, MСШАshi1, 209 as a marker for the tailored gene therapy./ R. Kanai, K. Eguchi, M. Takahashi [et al.] // J. Gene Med.-2006.-V.8, №11.-P. 1329-40. 91. Sonabend, A.M. Mesenchymal stem cells effectively deliver an oncolytic adenovirus to intracranial glioma./ A.M. Sonabend, I.V. Ulasov, M.A. Tyler [et al.] // Stem Cells.-2008.-V.26, №3.-P. 831-41. 92. Chan, W.M. Oncolytic myxoma virus: the path to clinic./ W.M. Chan, M.M. Rahman, G. McFadden // Vaccine.-2013.-V.31, №39.-P. 4252-8. 93. Paglino, J.C. Lu III parvovirus selectively and efficiently targets, replicates in, and kills human glioma cells./ J.C. Paglino, K. Ozduman, A.N. van den Pol // J. Virol.2012.-V.86, №13.-P. 7280-91. 94. Leske, H. Varicella zoster virus infection of malignant glioma cell cultures: a new candidate for oncolytic virotherapy?/ H. Leske, R. Haase, F. Restle [et al.] // Anticancer Res.-2012.-V.32, №4.-P. 1137-44. 95. Zulkifli, M.M. Newcastle diseases virus strain V4UPM displayed oncolytic ability against experimental human malignant glioma./ M.M. Zulkifli, R. Ibrahim, A.M. Ali [et al.] // Neurol. Res.-2009.-V.31,№1.-P. 3-10. 96. Aghi, M. Oncolytic herpes simplex virus mutants exhibit enhanced replication in glioma cells evading temozolomide chemotherapy through deoxyribonucleic acid repair./ M. Aghi, S. Rabkin, R.L. Martuza // Clin. Neurosurg.-2006.-V. 53.-P. 65-76. 97. Wagner, S. Combined treatment of pediatric high-grade glioma with the oncolytic viral strain MTH-68/H and oral valproic acid./ S. Wagner, C.M. Csatary, G. Gosztonyi [et al.] // APMIS.-2006.-V.114, №10.-P. 731-43. 98. Naujocks, G. Peripheral immunization against malignant rat glioma can induce effective antitumor immunity in the brain./ G. Naujocks, A. Schmitz, J. Schramm [et al.] // Int. J. Oncol.-1995.-V.6, №4.-P. 759-65. 99. Ali, R. Cytolytic effects and apoptosis induction of Newcastle disease virus strain AF2240 on anaplastic astrocytoma brain tumor cell line./ R. Ali, A. M. Alabsi, A.M. Ali [et al.] // Neurochem. Res.-2011.-V.36, №11.-P. 2051-62. 210 100. Alkassar, M.The combined effects of oncolytic reovirus plus Newcastle disease virus and reovirus plus parvovirus on U87 and U373 cells in vitro and in vivo./ M. Alkassar, B. Gärtner, K. Roemer [et al.] // J. Neurooncol.-2011.-V.104, №3.-P. 715-27. 101. Lun, X. Myxoma virus virotherapy for glioma in immunocompetent animal models: optimizing administration routes and synergy with rapamycin./ X. Lun, T. Alain, F.J. Zemp [et al.] // Cancer Res.-2010.-V.70, №2.-P. 598-608. 102. Barrett, J.W. Identification of host range mutants of myxoma virus with altered oncolytic potential in human glioma cells./ J.W. Barrett, L.R. Alston, F. Wang [et al.] // J. Neurovirol.-2007.-V.13, №6.-P. 549-60. 103. Verheije, M.H. Coronavirus genetically redirected to the epidermal growth factor receptor exhibits effective antitumor activity against a malignant glioblastoma./ M.H.Verheije, M.L. Lamfers, T. Würdinger [et al.] // J. Virol.-2009.-V.83, №15.-P. 7507-16. 104. Herrero, Y.C.M. Parvovirus H-1 infection of human glioma cells leads to complete viral replication and efficient cell killing./ M. Herrero Y Calle, J.J. Cornelis, C. Herold-Mende [et al.] // Int. J. Cancer.-2004.-V.109, №1.-P. 76-84. 105. Studebaker, A.W. Treatment of medulloblastoma with a modified measles virus./ A.W. Studebaker, C.R. Kreofsky, C.R. Pierson [et al.] // Neuro Oncol.-2010.-V.12, №10.-P. 1034-42. 106. Studebaker, A.W. Oncolytic measles virus prolongs survival in a murine model of cerebral spinal fluid-disseminated medulloblastoma./ A.W. Studebaker, B. Hutzen, C.R. Pierson [et al.] // Neuro Oncol.-2012.-V.14, №4.-P. 459-70. 107. Yamanaka, R. Alphavirus vectors for cancer gene therapy (review)./ R. Yamanaka./ Int. J. Oncol.-2004.-V.24, №4.-P. 919-23. 108. Ren, H. Immunogene therapy of recurrent glioblastoma multiforme with a liposomally encapsulated replication-incompetent Semliki forest virus vector carrying the human interleukin-12 gene--a phase I/II clinical protocol./ H. Ren, T. Boulikas, K. Lundstrom [et al.] // J. Neurooncol.-2003.-V.64, №1-2.-P. 147-54. 211 109. Wilcox, M.E. Reovirus as an oncolytic agent against experimental human malignant gliomas./ M.E. Wilcox, W. Yang, D. Senger [et al.] // J. Natl. Cancer Inst.2001.-V.93, №12.-P. 903-12. 110. Alloussi, S.H. All reovirus subtypes show oncolytic potential in primary cells of human high-grade glioma./ S.H. Alloussi, M. Alkassar, S. Urbschat [et al.] // Oncol. Rep.-2011.-V.26, №3.-P. 645-9. 111. Yang, W.Q. Efficacy and safety evaluation of human reovirus type 3 in immunocompetent animals: racine and nonhuman primates./ W.Q. Yang, X. Lun, C.A. Palmer [et al.] // Clin. Cancer Res.-2004.-V.10, №24.-P. 8561-76. 112. Yang, W.Q. Reovirus prolongs survival and reduces the frequency of spinal and leptomeningeal metastases from medulloblastoma./ W.Q. Yang, D. Senger, H. Muzik [et al.] // Cancer Res.-2003.-V.63, №12.-P. 3162-72. 113. Yang, W.Q. Reovirus as an experimental therapeutic for brain and leptomeningeal metastases from breast cancer./ W.Q. Yang, D.L. Senger, X.Q. Lun [et al.] //Gene Ther.-2004.-V.11, №21.-P. 1579-89. 114. Duggal, R.Vaccinia virus expressing bone morphogenetic protein-4 in novel glioblastoma orthotopic models facilitates enhanced tumor regression and long-term survival./ R. Duggal, U. Geissinger, Q. Zhang [et al.] // J. Transl. Med.-V.2013,№11.-P. 155. 115. Vaha-Koskela, M.J. Resistance to two heterologous neurotropic oncolytic viruses, Semliki Forest virus and vaccinia virus, in experimental glioma./ M.J. VähäKoskela, F. Le Boeuf, C. Lemay [et al.] // J. Virol.-2013.- V.87, №4.-P. 2363-6. 116. Lun, X. Efficacy and safety/toxicity study of recombinant vaccinia virus JX-594 in two immunocompetent animal models of glioma./ X. Lun, J. Chan, H. Zhou [et al.] // Mol. Ther.-2010.-V.18, №11,-P. 1927-36. 117. Duebgen, M. Stem cells loaded with multimechanistic oncolytic herpes simplex virus variants for brain tumor therapy./ M. Duebgen, J. Martinez-Quintanilla, K. Tamura [et al.] // J. Natl. Cancer Inst.-2014.-V.106, №6.-P.090. 212 118. Markert, J.M. A phase 1 trial of oncolytic HSV-1, G207, given in combination with radiation for recurrent GBM demonstrates safety and radiographic responses./ J.M. Markert, S.N. Razdan, H.C Kuo [et al.] // Mol Ther.-2014.-V.22, №5.-P. 1048-55. 119. Miao, L. The potential application of a transcriptionally regulated oncolytic herpes simplex virus for human cancer therapy./ L. Miao, C. Fraefel, K.C. Sia [et al.] // Br. J. Cancer.-2014.-V.110, №1.-P. 94-106. 120. Okemoto, K. DNA demethylating agents synergize with oncolytic HSV1 against malignant gliomas./ K. Okemoto, K. Kasai, B. Wagner [et al.] // Clin. Cancer Res.2013.-V.19, №21.-P. 5952-9. 121. Timiryasova, T.M. Antitumor effect of vaccinia virus in glioma model./ T.M. Timiryasova, J. Li, B. Chen [et al.] // Oncol. Res.-1999.-V.11, №3.-P. 133-44. 122. Chen, B. Evaluation of combined vaccinia virus-mediated antitumor gene therapy with p53, IL-2, and IL-12 in a glioma model./ B. Chen, T.M. Timiryasova, M.L. Andres [et al.] // Cancer Gene Ther.- 2000.-V.7, №11.-P. 1437-47. 123. Chen, B. Low-dose vaccinia virus-mediated cytokine gene therapy of glioma./ B. Chen, T.M. Timiryasova, P. Haghighat [et al.] // J. Immunother.-2001.-V.24, №1.-P. 4657. 124. Breton, E. In vivo preclinical low-field MRI monitoring of tumor growth following a suicide-gene therapy in an orthotopic mice model of human glioblastoma./ E. Breton, C. Goetz, J. Kintz [et al.] // C.R. Biol.-2010.-V.333, №3.-P. 220-5. 125. Andreansky, S.S. The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors./ S.S. Andreansky, B. He, G.Y. Gillespie [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1996.-V.93, №21.-P. 11313-8. 126. Andreansky, S. Evaluation of genetically engineered herpes simplex viruses as oncolytic agents for human malignant brain tumors./ S. Andreansky, L. Soroceanu, E.R. Flotte [et al.] // Cancer Res.-1997.-V.57, №8.-P. 1502-9. 213 127. Andreansky, S. Treatment of intracranial gliomas in immunocompetent mice using herpes simplex viruses that express murine interleukins./ S. Andreansky, B. He, J. van Cott [et al.] // Gene Ther.-1998.-V.5, №1.-P. 121-30. 128. Parker, J.N. Engineered herpes simplex virus expressing IL-12 in the treatment of experimental murine brain tumors./ J.N. Parker // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2000.V.97, №5.-P. 2208-13. 129. Shah, A.C. Serial passage through human glioma xenografts selects for a Deltagamma134.5 herpes simplex virus type 1 mutant that exhibits decreased neurotoxicity and prolongs survival of mice with experimental brain tumors/ A.C.Shah, K.H. Price, J.N. Parker [et al.] // J. Virol.-2006.-V.80, №15.-P. 7308-15. 130. Detta, A. Proliferative activity and in vitro replication of HSV1716 in human metastatic brain tumours./ A. Detta, J. Harland, I. Hanif [et al.] // J. Gene Med,-2003.V.5, №8.-P. 681-9. 131. Todo, T. Systemic antitumor immunity in experimental brain tumor therapy using a multimutated, replication-competent herpes simplex virus./ T. Todo, S.D. Rabkin, P. Sundaresan [et al.] // Hum. Gene Ther.-1999.-V.10, №17.-P. 2741-55. 132. Ulasov, I.V. Oncolytic adenoviruses: A thorny path to glioma cure./ I.V. Ulasov, A.V. Borovjagin, B.A. Schroeder [et al.] // Genes Dis.-2014.-V.1,№2.-P. 214-226. 133. Ulasov, I.V. Evaluation of E1A double mutant oncolytic adenovectors in anti- glioma gene therapy./ I.V. Ulasov, M.A. Tyler, A.A. Rivera [et al.] // J. Med. Virol.2008.-V.80,№9.-P. 1595-603. 134. Zhu, Z.B. Survivin promoter-based conditionally replicative adenoviruses target cholangiocarcinoma./ Z.B. Zhu, Y. Chen, S.K. Makhija [et al.] // Int. J. Oncol.-2006.V.29,№5.-P. 1319-29. 135. Rajecki, M. Mre11 inhibition by oncolytic adenovirus associates with autophagy and underlies synergy with ionizing radiation./ M. Rajecki, T. af Hällström, T. Hakkarainen [et al.] // Int. J. Cancer.-2009.-V.125,№10.-P. 2441-9. 214 136. Mantwill, K. YB-1 dependent oncolytic adenovirus efficiently inhibits tumor growth of glioma cancer stem like cells./ K. Mantwill, U. Naumann, J. Seznec [et al.] // J. Transl. Med.-2013.-V.11.-P. 216. 137. Horst, M. Targeting malignant gliomas with a glial fibrillary acidic protein (GFAP)-selective oncolytic adenovirus./ M. Horst, E. Brouwer, S. Verwijnen [et al.] //J. Gene Med.-2007.-V.9,№12.-P. 1071-9. 138. Alonso, M.M. ICOVIR-5 shows E2F1 addiction and potent antiglioma effect in vivo./ M.M. Alonso, M. Cascallo, C. Gomez-Manzano [et al.] // Cancer Res.-2007.V.67,№17.-P. 8255-63. 139. Stolarek, R. Robust infectivity and replication of Delta-24 adenovirus induce cell death in human medulloblastoma./ R. Stolarek, C. Gomez-Manzano, H. Jiang [et al.] // Cancer Gene Ther.-2004.-V.11,№11.-P. 713-20. 140. Geoerger, B. Potentiation of radiation therapy by the oncolytic adenovirus dl1520 (ONYX-015) in human malignant glioma xenografts./ B. Geoerger, J. Grill, P. Opolon [et al.] // Br. J. Cancer.-2003.-V.89,№3.-P. 577-84. 141. Shinoura, N. Highly augmented cytopathic effect of a fiber-mutant E1B- defective adenovirus for gene therapy of gliomas./ N. Shinoura, Y. Yoshida, R. Tsunoda [et al.] // Cancer Res/-1999.-V.59,№ 14.-P. 3411-6. 142. Rowe, W.P. Characterization of a factor formed in the course of adenovirus infection of tissue cultures causing detachment of cells from glass./ W.P. Rowe, J.W. Haertley, B. Roizman [et al.] // J. Exp. Med.-1958.-V.108,№5.-P. 713-29. 143. Levy, H.B. Biochemical changes in HeLa cells associated with infection by type 2 adenovirus./ H.B. Levy, W.P. Rowe, F.L. Snellbaker [et al.] // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.-1957.-V.96,№3.-P. 732-8. 144. Fenton, T.R. Resistance to EGF receptor inhibitors in glioblastoma mediated by phosphorylation of the PTEN tumor suppressor at tyrosine 240./ T.R. Fenton, D. Nathanson, C. Ponte de Albuquerque [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2012.V.109,№35.-P. 14164-9. 215 145. Rao, S.K. A survey of glioblastoma genomic amplifications and deletions./ S.K. Rao, J. Edwards, A.D. Joshi [et al.] // J. Neurooncol.-2010.-V.96,№2.-P. 169-79. 146. Lam, P.Y. Expression of p19INK4d, CDK4, CDK6 in glioblastoma multiforme./ P.Y. Lam, E. Di Tomaso, H.K. Ng [et al.] // Br. J. Neurosurg.-2000.-V.14,№1.-P. 28-32. 147. Kim, Y.H. Alterations in the RB1 pathway in low-grade diffuse gliomas lacking common genetic alterations./ Y.H. Kim, J. Lachuer, M. Mittelbronn [et al.] // Brain Pathol.-2011.-V.21,№6.-P. 645-51. 148. Nakamura, M. Retinoblastoma protein expression and MIB-1 correlate with survival of patients with malignant astrocytoma./ M. Nakamura, N. Konishi, S. Tsunoda [et al.] // Cancer.-1997.-V.80,№2.-P. 242-9. 149. Jha, P. Characterization of molecular genetic alterations in ГБМs highlights a distinctive molecular profile in young adults./ P. Jha, V. Suri, G. Singh [et al.] // Diagn. Mol. Pathol.-2011.-V.20,№4.-P. 225-32. 150. Parato, K.A. Recent progress in the battle between oncolytic viruses and tumours./ K.A. Parato, D. Senger, P.A. Forsyth [et al.] // Nat. Rev. Cancer.-2005.V.5,№12.-P. 965-76. 151. Libertini, S. Lovastatin enhances the replication of the oncolytic adenovirus dl1520 and its antineoplastic activity against anaplastic thyroid carcinoma cells./ S. Libertini, I. Iacuzzo, A. Ferraro [et al.] // Endocrinology.-2007.-V.148,№11.-P. 5186-94. 152. Geoerger, B. Oncolytic activity of the E1B-55 kDa-deleted adenovirus ONYX- 015 is independent of cellular p53 status in human malignant glioma xenografts./ B. Geoerger, J. Grill, P. Opolon [et al.] // Cancer Res.-2002.-V.62,№ 3.-P. 764-72. 153. Heise, C. ONYX-015, an E1B gene-attenuated adenovirus, causes tumor-specific cytolysis and antitumoral efficacy that can be augmented by standard chemotherapeutic agents./ C. Heise, A. Sampson-Johannes, A. Williams [et al.] // Nat. Med.-1997.V.3,№6.-P. 639-45. 216 154. Libertini, S. AZD1152 negatively affects the growth of anaplastic thyroid carcinoma cells and enhances the effects of oncolytic virus dl922-947./ S. Libertini, A. Abagnale, C. Passaro [et al.] // Endocr. Relat. Cancer.-2011.-V.18,№1.-P. 129-41. 155. Fueyo, J. A mutant oncolytic adenovirus targeting the Rb pathway produces anti- glioma effect in vivo./ J. Fueyo, C. Gomez-Manzano, R. Alemany [et al.] // Oncogene.2000.-V.19,№1.-P. 2-12. 156. Freytag, S.O., Barton K.N., Zhang Y. Efficacy of oncolytic adenovirus expressing suicide genes and interleukin-12 in preclinical model of prostate cancer./ S.O. Freytag, K.N.Barton, Y. Zhang.// Gene Ther.-2013.-V.20,№12.-P. 1131-9. 157. Fuxe, J. Expression of the coxsackie and adenovirus receptor in human astrocytic tumors and xenografts./ J. Fuxe, L. Liu, S. Malin [et al.] // Int. J. Cancer.-2003.V.103,№6.-P. 723-9. 158. Gaggar, A., Shayakhmetov D.M., Lieber A. CD46 is a cellular receptor for group B adenoviruses./ A. Gaggar, D.M. Shayakhmetov, A. Lieber // Nat. Med.-2003.- V.9,№11.-P. 1408-12. 159. Li, X. A fiber chimeric CRAd vector Ad5/11-D24 double-armed with TRAIL and arresten for enhanced glioblastoma therapy./ X. Li, Q. Mao, D. Wang [et al.] // Hum. Gene Ther.- 2012.-V.23,№6.-P. 589-96. 160. Ulasov, I.V. Survivin-driven and fiber-modified oncolytic adenovirus exhibits potent antitumor activity in established intracranial glioma./ I.V.Ulasov, Z.B. Zhu, M.A. Tyler [et al.] // Hum. Gene Ther.-2007.-V.18.№7.-P. 589-602. 161. Lamfers, M.L. Potential of the conditionally replicative adenovirus Ad5- Delta24RGD in the treatment of malignant gliomas and its enhanced effect with radiotherapy./ M.L. Lamfers, J. Grill, C.M. Dirven [et al.] // Cancer Res.-2002.V.62,№20.-P. 5736-42. 162. de Jonge, J. Therapeutic concentrations of anti-epileptic drugs do not inhibit the activity of the oncolytic adenovirus Delta24-RGD in malignant glioma./ J. de Jonge, L.M. Berghauser Pont, S. Idema [et al.] // J. Gene Med.-2013.-V.15,№3-4.-P. 134-41. 217 163. Holzmuller, R. YB-1 dependent virotherapy in combination with temozolomide as a multimodal therapy approach to eradicate malignant glioma./ R. Holzmüller, K. Mantwill, C. Haczek [et al.] // Int. J. Cancer.-2011.-V.129,№ 5.-P. 1265-76. 164. Alonso, M.M. Delta-24-RGD in combination with RAD001 induces enhanced anti-glioma effect via autophagic cell death./ M. M. Alonso, H. Jiang, T. Yokoyama [et al.] // Mol. Ther.-2008.-V.16,№3.-P. 487-93. 165. Lamfers, M.L. Differential effects of combined Ad5- delta 24RGD and radiation therapy in in vitro versus in vivo models of malignant glioma./ M.L.Lamfers, S. Idema, L. Bosscher [et al.] // Clin. Cancer Res.-2007.-V.13,№24.-P. 7451-8. 166. Jiang, H. Examination of the therapeutic potential of Delta-24-RGD in brain tumor stem cells: role of autophagic cell death./ H. Jiang, C. Gomez-Manzano, H. Aoki [et al.] //J. Natl. Cancer Inst.-2007.-V.99,№18.-P. 1410-4. 167. Wickham, T.J. Increased in vitro and in vivo gene transfer by adenovirus vectors containing chimeric fiber proteins./ T.J. Wickham, E. Tzeng, L.L. Shears 2nd [et al.] // J. Virol.-1997.-V.71,№11.-P. 8221-9. 168. Staba, M.J. Modifications of the fiber in adenovirus vectors increase tropism for malignant glioma models./ M.J. Staba, T.J. Wickham, I. Kovesdi [et al.] // Cancer Gene Ther.-2000.-V.7,№1.-P. 13-9. 169. Asuthkar, S. Irradiation-induced angiogenesis is associated with an MMP-9-miR- 494-syndecan-1 regulatory loop in medulloblastoma cells./ S. Asuthkar, K.K.Velpula, A.K.Nalla [et al.] // Oncogene.-2014.-V33,№15.-P. 1922-33. 170. Qiao, D., Meyer, K., Friedl A. Glypican 1 stimulates S phase entry and DNA replication in human glioma cells and normal astrocytes./ D. Qiao, K. Meyer, A. Friedl // Mol. Cell. Biol.-2013.- V.33,№22.-P. 4408-21. 171. Phillips, J.J. Novel therapeutic targets in the brain tumor microenvironment./ J.J. Phillips.// Oncotarget.-2012.-V.3,№5.-P. 568-75. 218 172. Phillips, J.J. Heparan sulfate sulfatase SULF2 regulates PDGFRalpha signaling and growth in human and mouse malignant glioma./ J.J. Phillips, E. Huillard, A.E. Robinson [et al.] // J. Clin. Invest.-2012.-V.122,№ 3.-P. 911-22. 173. Gonzalez, R. Increased gene transfer in acute myeloid leukemic cells by an adenovirus vector containing a modified fiber protein./ R. Gonzalez, R. Vereecque, T.J. Wickham [et al.] // Gene Ther.-1999.-V.6,№ 3.-P. 314-20. 174. Wirtz, S., Galle, P.R., Neurath, M.F. Efficient gene delivery to the inflamed colon by local administration of recombinant adenoviruses with normal or modified fibre structure./ S. Wirtz, P.R. Galle, M.F. Neurath // Gut.-1999.-V.44, №6.-P. 800-7. 175. Bouri, K. Polylysine modification of adenoviral fiber protein enhances muscle cell transduction./ K. Bouri, W.G. Feero, M.M. Myerburg [et al.] // Hum/ Gene Ther.1999.-V.10,№10.-P. 1633-40. 176. Arwert, E. Visualizing the dynamics of EGFR activity and antiglioma therapies in vivo./ E. Arwert, S. Hingtgen, J.L. Figueiredo [et al.] // Cancer Res/-2007.V.67,№15.-P. 7335-42. 177. Grill, J. Combined targeting of adenoviruses to integrins and epidermal growth factor receptors increases gene transfer into primary glioma cells and spheroids./ J. Grill, V.W. Van Beusechem, P. Van Der Valk [et al.] // Clin. Cancer Res.-2001.-V.7,№3.-P. 641-50. 178. Rosa, J. Survivin modulates microtubule dynamics and nucleation throughout the cell cycle./ J. Rosa, P. Canovas, A. Islam [et al.] // Mol. Biol. Cell.-2006.-V.17,№3.-P. 1483-93. 179. Altieri, D.C. Survivin, cancer networks and pathway-directed drug discovery./ D.C Altieri //Nat. Rev. Cancer.-2008.-V.8,№1.-P. 61-70. 180. Ulasov, I.V. Oncolytic adenoviral vectors which employ the survivin promoter induce glioma oncolysis via a process of beclin-dependent autophagy./ I.V.Ulasov, M.A. Tyler, Z.B. Zhu [et al.] // Int. J. Oncol.-2009.-V.34,№3.-P. 729-42. 219 181. Muramatsu, T. Midkine: a promising molecule for drug development to treat diseases of the central nervous system./ T. Muramatsu // Curr. Pharm. Des.-2011.V.17,№5.-P. 410-23. 182. Jafri, A.M. Presence of telomerase activity with undetectable p16 gene mutation in Malaysian patients with brain tumor./ A.M.Jafri, S. Sarina, P.J. George [et al.] // Med. J. Malaysia.-2004.-V.59,№4.-P. 480-5. 183. Kheirollahi, M. Telomerase activity in human brain tumors: astrocytoma and meningioma./ M. Kheirollahi, M. Mehrazin, N. Kamalian [et al.] // Cell. Mol. Neurobiol.-2013.-V.33,№4.-P. 569-74. 184. Hoffmann, D., Meyer, B., Wildner, O. Improved glioblastoma treatment with Ad5/35 fiber chimeric conditionally replicating adenoviruses./ D. Hoffmann, B. Meyer, O. Wildner // J. Gene Med.-2007.-V.9,№ 9.-P. 764-78. 185. Zheng, X. Adenoviral E1a expression levels affect virus-selective replication in human cancer cells./ X. Zheng, X.M. Rao, C. Snodgrass [et al.] //Cancer Biol. Ther.2005.-V.4,№11.-P. 1255-62. 186. Rots, M.G. An ex vivo human model system to evaluate specificity of replicating and non-replicating gene therapy agents./ M.G. Rots, M.G. Elferink, W.M. Gommans [et al.] // J. Gene Med.-2006.-V.8,№ 1.-P. 35-41. 187. Irving, J. Conditionally replicative adenovirus driven by the human telomerase promoter provides broad-spectrum antitumor activity without liver toxicity./ J. Irving, Z. Wang, S. Powell [et al.] // Cancer Gene Ther.-2004.-V.11,№3.-P. 174-85. 188. Harkins, L.E. Detection of human cytomegalovirus in normal and neoplastic breast epithelium./ L.E. Harkins, L.A. Matlaf, L. Soroceanu [et al.] // Herpesviridae.2010.-V.1,№1.-P. 8. 189. Taher, C. High prevalence of human cytomegalovirus proteins and nucleic acids in primary breast cancer and metastatic sentinel lymph nodes./ C.Taher, J. de Boniface, A.A. Mohammad [et al.] // PLoS One.-2013.-V.8,№2.-P. e56795. 220 190. Ding, D. Does the existence of HCMV components predict poor prognosis in glioma?/ D. Ding, S. Han, Z. Wang [et al.] // J. Neurooncol.-2014.-V.116,№3.-P. 51522. 191. Dos Santos, C.J. High prevalence of HCMV and viral load in tumor tissues and peripheral blood of glioblastoma multiforme patients./ C.J. dos Santos, L.M. Stangherlin, E.G. Figueiredo [et al.] //J. Med. Virol.-2014.-V.86,№11.-P.1953-61 192. Soroceanu, L. Human cytomegalovirus US28 found in glioblastoma promotes an invasive and angiogenic phenotype./ L. Soroceanu, L. Matlaf, V. Bezrookove [et al.] // Cancer Res.- 2011.-V.71,№21.-P. 6643-53. 193. Bieler, A. Novel three-pronged strategy to enhance cancer cell killing in glioblastoma cell lines: histone deacetylase inhibitor, chemotherapy, and oncolytic adenovirus dl520./ A. Bieler, K. Mantwill, T. Dravits [et al.] // Hum. Gene Ther.-2006.V.17,№1.-P. 55-70. 194. Hayakawa, H. Binding capacity of human YB-1 protein for RNA containing 8- oxoguanine./ H. Hayakawa, T. Uchiumi, T. Fukuda [et al.] // Biochemistry.-2002.V.41,№42.-P. 12739-44. 195. Izumi, H. Y box-binding protein-1 binds preferentially to single-stranded nucleic acids and exhibits 3'-->5' exonuclease activity./ H. Izumi, T. Imamura, G. Nagatani [et al.] // Nucleic Acids. Res.- 2001.-V.29,№5.-P. 1200-7. 196. Koike, K. Nuclear translocation of the Y-box binding protein by ultraviolet irradiation./ K. Koike, T. Uchiumi, T. Ohga [et al.] // FEBS Lett.-1997.-V.417,№3.-P. 390-4. 197. Gaudreault, I., Guay, D., Lebel, M. YB-1 promotes strand separation in vitro of duplex DNA containing either mispaired bases or cisplatin modifications, exhibits endonucleolytic activities and binds several DNA repair proteins./ I. Gaudreault, D. Guay, M. Lebel.// Nucleic Acids. Res.-2004.-V.32,№1.-P. 316-27. 221 198. Ueki, K. CDKN2/p16 or RB alterations occur in the majority of glioblastomas and are inversely correlated./ K. Ueki, Y. Ono, J.W. Henson [et al.] // Cancer Res.1996.-V.56,№1.-P. 150-3. 199. Parr, M.J. Tumor-selective transgene expression in vivo mediated by an E2F- responsive adenoviral vector./ M.J.Parr, Y.Manome, T. Tanaka [et al.] // Nat. Med.1997.-V.3,№10.-P. 1145-9. 200. Muller, H. Induction of S-phase entry by E2F transcription factors depends on their nuclear localization./ H. Müller, M.C. Moroni, E. Vigo [et al.] // Mol. Cell. Biol.1997.-V.17,№9.-P. 5508-20. 201. Yao, W. The application of multiple miRNA response elements enables oncolytic adenoviruses to possess specificity to glioma cells./ W. Yao, G. Guo, Q. Zhang [et al.] // Virology.-2014.-V. 458-459.-P. 69-82. 202. Yun, C.O. ADP-overexpressing adenovirus elicits enhanced cytopathic effect by induction of apoptosis./ C.O. Yun, E. Kim, T. Koo [et al.] // Cancer Gene Ther.-2005.V.12,№1.-P. 61-71. 203. Tollefson, A.E. The E3-11.6-kDa adenovirus death protein (ADP) is required for efficient cell death: characterization of cells infected with adp mutants./ A.E. Tollefson, J.S. Ryerse, A. Scaria [et al.] // Virology.-1996.-V.220,№1.-P. 152-62. 204. Tollefson, A.E. The adenovirus death protein (E3-11.6K) is required at very late stages of infection for efficient cell lysis and release of adenovirus from infected cells./ A.E.Tollefson, A. Scaria, T.W. Hermiston [et al.] // J .Virol.-1996.-V.70,№4.-P. 2296306. 205. Bilbao, R. A blood-tumor barrier limits gene transfer to experimental liver cancer: the effect of vasoactive compounds./ R. Bilbao, M. Bustos, P. Alzuguren [et al.] // Gene Ther/-2000.-V.7,№21.-P. 1824-32. 206. Ram, Z. Therapy of malignant brain tumors by intratumoral implantation of retroviral vector-producing cells./ Z. Ram, K.W. Culver, E.M. Oshiro [et al.] // Nat. Med.-1997.-V.3,№12.-P. 1354-61. 222 207. Mohyeldin, A., Garzon-Muvdi T., Quinones-Hinojosa A. Oxygen in stem cell biology: a critical component of the stem cell niche./ A. Mohyeldin, T. Garzon-Muvdi, A. Quinones-Hinojosa [et al.] // Cell. Stem. Cell.-2010.-V.7,№2.-P. 150-61. 208. Bar, E.E. Glioblastoma, cancer stem cells and hypoxia./ E.E Bar // Brain Pathol.- 2011.-V.21,№2.-P. 119-29. 209. Sgubin, D. Oncolytic herpes simplex virus counteracts the hypoxia-induced modulation of glioblastoma stem-like cells./ D. Sgubin, H. Wakimoto, R. Kanai[et al.] //Stem. Cells. Transl. Med.-2012.-V.1,№4.-P. 322-32. 210. Li, Z. Hypoxia-inducible factors regulate tumorigenic capacity of glioma stem cells./ Z. Li, S. Bao, Q. Wu [et al.] // Cancer Cel.-2009.-V.15,№6.-P. 501-13. 211. Post, D.E., Van Meir, E.G. A novel hypoxia-inducible factor (HIF) activated oncolytic adenovirus for cancer therapy./ D.E. Post, E.G. Van Meir.// Oncogene.-2003.V.22,№14.-P. 2065-72. 212. Authier, A. Enhanced immunosuppression by therapy-exposed glioblastoma multiforme tumor cells./ A. Authier, K.J. Farrand, K.W. Broadley [et al.] // Int. J. Cancer.-2015.-V.136,№11.-P:2566-78 213. Bloch, O. Gliomas promote immunosuppression through induction of B7-H1 expression in tumor-associated macrophages./ O. Bloch, C.A. Crane, R. Kaur [et al.] // Clin/ Cancer Res/-2013.-V.19,№ 12.-P. 3165-75. 214. Liikanen, I. Oncolytic adenovirus with temozolomide induces autophagy and antitumor immune responses in cancer patients./ I. Liikanen, L. Ahtiainen, M.L. Hirvinen [et al.] // Mol/ Ther.- 2013.-V.21,№6.-P. 1212-23. 215. Thomas, M.A. Immunosuppression enhances oncolytic adenovirus replication and antitumor efficacy in the Syrian hamster model./ M.A.Thomas, J.F. Spencer, K. Toth [et al.] // Mol. Ther.-2008.-V.16,№10.-P. 1665-73. 216. Kleijn, A. The in vivo therapeutic efficacy of the oncolytic adenovirus Delta24- RGD is mediated by tumor-specific immunity./ A. Kleijn, J. Kloezeman, E. TreffersWesterlaken [et al.] // PLoS One.-2014.-V.9,№5.-P. e97495. 223 217. Shinojima, N. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells./ N. Shinojima, A. Hossain, T. Takezaki [et al.] // Cancer Res.-2013.-V.73,№7.-P. 2333-44. 218. Hata, N. Platelet-derived growth factor BB mediates the tropism of human mesenchymal stem cells for malignant gliomas./ N.Hata, N. Shinojima, J. Gumin [et al.] // Neurosurgery.-2010.-V.66,№1.-P. 144-56. 219. Birnbaum, T. Malignant gliomas actively recruit bone marrow stromal cells by secreting angiogenic cytokines./ T. Birnbaum, J. Roider, C.J. Schankin [et al.] // J. Neurooncol.-2007.-V.83,№3.-P. 241-7. 220. Ahmed, A.U. Bone marrow mesenchymal stem cells loaded with an oncolytic adenovirus suppress the anti-adenoviral immune response in the cotton rat model./ A.U.Ahmed, C.E. Rolle, M.A. Tyler [et al.] // Mol. Ther.-2010.-V.18,№10.-P. 1846-56. 221. Hai, C. Application of mesenchymal stem cells as a vehicle to deliver replication- competent adenovirus for treating malignant glioma./ C. Hai, Y.M. Jin, W.B. Jin [et al.] // Chin. J. Cancer.-2012.-V.31,№5.-P. 233-40. 222. Yong, R.L. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells for intravascular delivery of oncolytic adenovirus Delta24-RGD to human gliomas./ R.L.Yong, N. Shinojima, J. Fueyo [et al.] // Cancer Res.-2009.-V.69,№23.-P. 8932-40. 223. Virrey, J.J. Increased survivin expression confers chemoresistance to tumor- associated endothelial cells./ J.J.Virrey, S. Guan, W. Li [et al.] // Am. J. Pathol.-2008.V.173,№2.-P. 575-85. 224. Dallaglio, K., Marconi, A., Pincelli, C. Survivin: a dual player in healthy and diseased skin./ K. Dallaglio, A. Marconi, C. Pincelli// J. Invest. Dermatol.-2012.V.132,№1.-P. 18-27. 225. Datta, S.R. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell- intrinsic death machinery./ S.R.Datta, H. Dudek, X.Tao [et al.] // Cell.-1997.-V.91,№2.P. 231-41. 224 226. Shankar, S.L.Survivin inhibition induces human neural tumor cell death through caspase-independent and -dependent pathways./ S.L. Shankar, S.Mani, K.N. O'Guin [et al.] // J. Neurochem.-2001.-V.79,№2.-P. 426-36. 227. Tamm, I. IAP-family protein survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas (CD95), Bax, caspases, and anticancer drugs./ I.Tamm, Y. Wang, E. Sausville [et al.] // Cancer Res.-1998.-V.58,№23.-P. 5315-20. 228. Altura, R.A. Nuclear expression of Survivin in paediatric ependymomas and choroid plexus tumours correlates with morphologic tumour grade./ R.A.Altura, R.S. Olshefski, Y. Jiang [et al.] // Br. J. Cancer.-2003.-V.89,№9.-P. 1743-9. 229. Sasaki, T. Expression of survivin, an inhibitor of apoptosis protein, in tumors of the nervous system./ T. Sasaki, M.B. Lopes, G.R. Hankins [et al.] //Acta Neuropathol/2002.-V.104,№1.-P. 105-9. 230. Kelly, R.J. Impacting tumor cell-fate by targeting the inhibitor of apoptosis protein survivin./ R.J. Kelly, A. Lopez-Chavez, D. Citrin [et al.] // Mol. Cancer.-2011.V.10.-P. 35. 231. Pfister, C. Evidence of ubiquitous in vivo and in vitro expression of pro-apoptotic Smac/DIABLO protein in meningioma cell lines./ C. Pfister, R. Ritz, E. Endemann [et al.] // Oncol. Rep.-2009.-V.21,№5.-P. 1181-8. 232. Verhagen, A.M. Identification of DIABLO, a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteins./ A.M.Verhagen, P.G. Ekert, M. Pakusch [et al.] //Cell.-2000.-V.102,№1.-P. 43-53. 233. Dohi, T. An IAP-IAP complex inhibits apoptosis./ T. Dohi, K. Okada, F. Xia [et al.] // J. Biol. Chem.-2004.-V.279,№33.-P. 34087-90. 234. Wang, P. Survivin promotes glioma angiogenesis through vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in vitro and in vivo./ P.Wang, H. Zhen, J. Zhang [et al.] // Mol. Carcinog.-2012.-V.51,№7.-P. 586-95. 225 235. Shi, D.G. Effect of RNA interference targeting-survivin on the invasiveness of human glioma cells in vitro./ D.G.Shi, Y. Fan, F. Zhu [et al.] // Nan. Fang. Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao.-2009.-V.29,№6.-P. 1156-8. 236. Ambrosini, G., Adida C., Altieri D.C. A novel anti-apoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphoma./ G. Ambrosini, C. Adida, D.C. Altieri// Nat. Med.1997.-V.3,№8.-P. 917-21. 237. Yamada, Y. Transcriptional expression of survivin and its splice variants in brain tumors in humans./ Y.Yamada, T. Kuroiwa, T. Nakagawa [et al.] // J. Neurosurg.-2003.V.99,№4.-P. 738-45. 238. Yu, J. Methylation profiles of thirty four promoter-CpG islands and concordant methylation behaviours of sixteen genes that may contribute to carcinogenesis of astrocytoma./ J. Yu, H. Zhang, J. Gu [et al.] //BMC. Cancer.-2004.-V.4.-P. 65. 239. Acquati, S. Epigenetic regulation of survivin by Bmi1 is cell type specific during corticogenesis and in gliomas./ S. Acquati, A. Greco, D. Licastro [et al.] // Stem. Cells.2013.-V.31,№1.-P. 190-202. 240. Mityaev, M.V. Functional significance of a putative sp1 transcription factor binding site in the survivin gene promoter./ M.V.Mityaev, E.P. Kopantzev, A.A. Buzdin [et al.] // Biochemistry (Mosc).-2008.-V.73,№ 11.-P. 1183-91. 241. Jung, J.E. Survivin inhibits anti-growth effect of p53 activated by aurora B./ J.E.Jung, T.K. Kim, J.S. Lee [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2005.V.336,№4.-P. 1164-71. 242. Mita, A.C. Survivin: key regulator of mitosis and apoptosis and novel target for cancer therapeutics./ A.C. Mita, M.M. Mita, S.T. Nawrocki [et al.] // Clin. Cancer Res.2008.-V.14,№16.-P. 5000-5. 243. Zhao, X. An NF-kappaB p65-cIAP2 link is necessary for mediating resistance to TNF-alpha induced cell death in gliomas./ X. Zhao, T. Laver, S.W. Hong [et al.] // J. Neurooncol.-2011.-V.102,№3.-P. 367-81. 226 244. Zhang, J., Lu Y., Pienta K.J. Multiple roles of chemokine (C-C motif) ligand 2 in promoting prostate cancer growth./ J. Zhang, Y. Lu, K.J. Pienta // J. Natl. Cancer Inst.2010.-V.102,№8.-P. 522-8. 245. Chen, F. Down-regulation of Stat3 decreases invasion activity and induces apoptosis of human glioma cells./ F. Chen, Y. Xu, Y. Luo [et al.] // J. Mol. Neurosci.2010.-V.40,№3.-P. 353-9. 246. Yu, L.J. Inhibition of STAT3 expression and signaling in resveratrol- differentiated medulloblastoma cells./ L.J.Yu, M.L. Wu, H. Li [et al.] // Neoplasia.2008.-V.10,№7.-P. 736-44. 247. Sommer, K.W. Inhibitor of apoptosis protein (IAP) survivin is upregulated by oncogenic c-H-Ras./ K.W.Sommer, C.J. Schamberger, G.E. Schmidt [et al.] // Oncogene.-2003.-V.22,№27.-P. 4266-80. 248. Vaira, V. Regulation of survivin expression by IGF-1/mTOR signaling./ V. Vaira, C.W. Lee, H.L. Goel [et al.] // Oncogene.-2007.-V.26,№19.-P. 2678-84. 249. Ghosh, J.C. Hsp60 regulation of tumor cell apoptosis./ J.C. Ghosh, M.D. Siegelin, T. Dohi [et al.] // J. Biol. Chem.-2008.-V.283,№8.-P. 5188-94. 250. Fortugno, P. Regulation of survivin function by Hsp90./ P. Fortugno, E. Beltrami, J. Plescia [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-V.100,№24.-P. 13791-6. 251. Kajiwara, Y. Expression of survivin in astrocytic tumors: correlation with malignant grade and prognosis./ Y. Kajiwara, F. Yamasaki, S. Hama [et al.] // Cancer.2003.-V.97,№4.-P. 1077-83. 252. Das, A. Expression of survivin in primary glioblastomas./ A. Das, W.L. Tan, J. Teo [et al.] // J. Cancer Res. Clin. Oncol.-2002.-V.128,№6.-P. 302-6. 253. Yeung, J.T. Increased expression of tumor-associated antigens in pediatric and adult ependymomas: implication for vaccine therapy./ J.T.Yeung, R.L. Hamilton, H. Okada [et al.] // J. Neurooncol.-2013.-V.111,№2.-P. 103-11. 227 254. Preusser, M. Survivin expression in intracranial ependymomas and its correlation with tumor cell proliferation and patient outcome./ M. Preusser, S. Wolfsberger, T. Czech [et al.] // Am. J. Clin. Pathol.-2005.-V.124,№4.-P. 543-9. 255. Rousseau, A. Survivin expression in ganglioglioma./ A. Rousseau, M. Kujas, A.M. Bergemer-Fouquet [et al.] // J. Neurooncol.-2006.-V.77,№2.-P. 153-9. 256. Wasko, R. Coexpression of survivin and PCNA in pituitary tumors and normal pituitary./ R. Wasko, J. Waligorska-Stachura, A. Jankowska [et al.] // Neuro. Endocrinol. Lett.-2009.-V.30,№4.-P. 477-81. 257. Karabatsou, K. Expression of survivin, platelet-derived growth factor A (PDGF- A) and PDGF receptor alpha in primary central nervous system lymphoma./ K. Karabatsou, P. Pal, S. Dodd [et al.] // J. Neurooncol.-2006.-V.79,№2.-P. 171-9. 258. Chakravarti, A. Quantitatively determined survivin expression levels are of prognostic value in human gliomas./ A. Chakravarti, E. Noll, P.M. Black [et al.] // J. Clin. Oncol.-2002.-V.20,№4.-P. 1063-8. 259. Xie, D. Expression of cytoplasmic and nuclear Survivin in primary and secondary human glioblastoma./ D. Xie, Y.X. Zeng, H.J. Wang [et al.] // Br. J. Cancer.2006.-V.94,№1.-P. 108-14. 260. Pan, Y. Nuclear expression of Survivin in glioma and its correlation to prognosis./ Y. Pan, W.H. Hu, D. Xie [et al.] // Ai Zheng.-2006.-V.25,№5.-P. 635-9. 261. Pan, Y. Nuclear and cytoplasmic expressions of survivin in glioma and their prognostic value./ Y. Pan, W.H. Hu, D. Xie [et al.] // Zhonghua. Yi. Xue. Za. Zhi.2007.-V.87,№5.-P. 325-9. 262. Saito, T. Survivin subcellular localization in high-grade astrocytomas: simultaneous expression in both nucleus and cytoplasm is negative prognostic marker./ T. Saito, M.T. Arifin, S. Hama [et al.] // J. Neurooncol.-2007.-V.82,№2.-P. 193-8. 263. Soling, A. Autoantibodies to the inhibitor of apoptosis protein survivin in patients with brain tumors./ A. Söling, E.M. Plugge, M. Schmitz [et al.] // Int. J. Oncol.2007.-V.30,№1.-P. 123-8. 228 264. Ciesielski, M.J. Antitumor cytotoxic T-cell response induced by a survivin peptide mimic./ M.J.Ciesielski, M.S. Ahluwalia, S.A. Munich [et al.] // Cancer Immunol. Immunother.-2010.-V.59,№8.-P. 1211-21. 265. Ciesielski, M.J. Therapeutic effect of a T helper cell supported CTL response induced by a survivin peptide vaccine against murine cerebral glioma./ M.J. Ciesielski, D. Kozbor, C.A. Castanaro [et al.] // Cancer Immunol. Immunother.-2008.-V.57,№12.P. 1827-35. 266. Nakayama, Y. Tamoxifen and gonadal steroids inhibit colon cancer growth in association with inhibition of thymidylate synthase, survivin and telomerase expression through estrogen receptor beta mediated system./ Y. Nakayama, H. Sakamoto, K. Satoh [et al.] // Cancer Lett.-2000.-V.161,№1.-P. 63-71. 267. Grossman, D. Expression of the apoptosis inhibitor, survivin, in nonmelanoma skin cancer and gene targeting in a keratinocyte cell line./ D. Grossman, J.M. McNiff, F. Li [et al.] // Lab. Invest.-1999.-V.79,№9.-P. 1121-6. 268. Lai, P.C. Novel survivin inhibitor YM155 elicits cytotoxicity in glioblastoma cell lines with normal or deficiency DNA-dependent protein kinase activity./ P.C. Lai, S.H. Chen, S.H. Yang [et al.] // Pediatr. Neonatol.-2012.-V.53,№3.-P. 199-204. 269. Zhou, R., Zhang L.Z., Wang R.Z. Effect of celecoxib on proliferation, apoptosis, and survivin expression in human glioma cell line U251./ R. Zhou, L.Z. Zhang, R.Z. Wang // Chin. J. Cancer.-2010.-V.29,№3.-P. 294-9. 270. Murakami, K. Two cases treated with trastuzumab as primary chemotherapy./ K. Murakami, H. Sakata, Y. Miyazawa [et al.] // Gan. To. Kagaku. Ryoho.-2007.V.34,№10.-P. 1683-7. 271. Yamasaki, T., Kikuchi, H. Three-dimensional analysis of regrowth pattern in recurrent supratentorial glioblastoma multiforme and anaplastic astrocytoma with special reference to prognosis./ T. Yamasaki, H. Kikuchi // Gan. No. Rinsho.-1989.V.35,№11.-P. 1261-71. 229 272. Fulda, S., Debatin K.M. Sensitization for tumor necrosis factor-related apoptosis- inducing ligand-induced apoptosis by the chemopreventive agent resveratrol./ S. Fulda, K.M. Debatin // Cancer Res.-2004.-V.64,№1.-P. 337-46. 273. Quick, Q.A. Epothilone B induces glioblastoma cell death via survivin down- regulation./ Q.A. Quick // Exp. Oncol.-2008.-V.30,№3.-P. 195-201. 274. Siegelin, M.D., Habel, A., Gaiser, T. 17-AAG sensitized malignant glioma cells to death-receptor mediated apoptosis./ M.D. Siegelin, A. Habel, T. Gaiser // Neurobiol. Dis.-2009.-V.33,№2.-P. 243-9. 275. Yuan, L. Tissue transglutaminase 2 inhibition promotes cell death and chemosensitivity in glioblastomas./ L.Yuan, K. Choi, C. Khosla [et al.] // Mol. Cancer Ther.-2005.-V.4,№9.-P. 1293-302. 276. Kang, D.W. Ciglitazone induces caspase-independent apoptosis through down- regulation of XIAP and survivin in human glioma cells./ D.W.Kang, C.H. Choi, J.Y. Park [et al.] // Neurochem. Res.-2008.-V.33,№3.-P. 551-61. 277. Jeong, J.C. Kaempferol induces cell death through ERK and Akt-dependent down-regulation of XIAP and survivin in human glioma cells./ J.C.Jeong, M.S. Kim, T.H. Kim [et al.] // Neurochem. Res.-2009.-V.34,№5.-P. 991-1001. 278. Sangeetha, S.R. Suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) induces growth arrest and apoptosis in pituitary adenoma cells./ S.R. Sangeetha, N. Singh, J.R. Vender.// Endocrine.-2009.-V.35,№3.-P. 389-96. 279. Yang, F. Sunitinib induces apoptosis and growth arrest of medulloblastoma tumor cells by inhibiting STAT3 and AKT signaling pathways./ F.Yang, V. Jove, H. Xin [et al.] // Mol. Cancer Res.-2010.-V.8,№1.-P. 35-45. 280. Johnson, M.D., O'Connell, M., Pilcher W. Lopinavir inhibits meningioma cell proliferation by Akt independent mechanism./ M.D. Johnson, M. O'Connell, W. Pilcher.// J. Neurooncol.-2011.-V.101,№3.-P. 441-8. 230 281. Hendruschk, S. RNA interference targeting survivin exerts antitumoral effects in vitro and in established glioma xenografts in vivo./ S. Hendruschk, R. Wiedemuth, A. Aigner [et al.] // Neuro. Oncol.-2011.-V.13,№10.-P. 1074-89. 282. Temme, A. Inhibition of malignant glioma cell growth by a survivin mutant retrovirus./ A. Temme, E. Herzig, B. Weigle [et al.] // Hum. Gene. Ther.-2005.V.16,№2.-P. 209-22. 283. Xu, R.X. Apoptosis of glioma cell line U251 induced by small interfering RNA targeting survivin./ R.X. Xu, Y.Y. Tu, X.D. Jiang [et al.] // Nan. Fang. Yi. Ke. Da. Xue. Xue. Bao.-2006.-V.26,№ 4.-P. 398-401. 284. Kamizono, J. Survivin-responsive conditionally replicating adenovirus exhibits cancer-specific and efficient viral replication./ J. Kamizono, S. Nagano, Y. Murofushi [et al.] // Cancer Res.-2005.-V.65,№12.-P. 5284-91. 285. Nandi, S. Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells./ S. Nandi, I.V. Ulasov, M.A. Tyler [et al.] // Cancer Res.2008.-V.68,№14.-P. 5778-84. 286. Ulasov, I.V. Combination of adenoviral virotherapy and temozolomide chemotherapy eradicates malignant glioma through autophagic and apoptotic cell death in vivo./ I.V. Ulasov, A.M. Sonabend, S. Nandi [et al.] // Br. J. Cancer.-2009.V.100,№7.-P. 1154-64. 287. Alekseenko, I.V. Activity of the upstream component of tandem TERT/survivin promoters depends on features of the downstream component./ I.V. Alekseenko, V.V. Pleshkan, E.P. Kopantzev [et al.] // PLoS One.-2012.-V.7,№10.-P. e46474. 288. Ulasov, I.V. Tamoxifen improves cytopathic effect of oncolytic adenovirus in primary glioblastoma cells mediated through autophagy./ I.V. Ulasov, N. Shah, N.V. Kaverina [et al.] // Oncotarget.-2015.-V.6,№6.-P.3977-87. 289. Xu, G.W., Mymryk, J.S., Cairncross, J.G. Pharmaceutical-mediated inactivation of p53 sensitizes U87MG glioma cells to BCNU and temozolomide./ G.W. Xu, J.S. Mymryk, J.G. Cairncross.// Int. J. Cancer.-2005.-V.116,№2.-P. 187-92. 231 290. Schroers, R. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors./ R. Schroers, Y. Hildebrandt, J. Hasenkamp [et al.] // Exp. Hematol.-2004.-V.32,№6.-P. 536-46. 291. Nilsson, M. Development of an adenoviral vector system with adenovirus serotype 35 tropism; efficient transient gene transfer into primary malignant hematopoietic cells./ M. Nilsson, J. Ljungberg, J. Richter [et al.] // J. Gene. Med.-2004.V.6,№6.-P. 631-41. 292. Von Seggern, D.J. A helper-independent adenovirus vector with E1, E3, and fiber deleted: structure and infectivity of fiberless particles./ D.J. Von Seggern, C.Y. Chiu, S.K. Fleck [et al.] // J. Virol.-1999.-V.73,№2.-P. 1601-8. 293. Chartier, C. Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli./ C. Chartier, E. Degryse, M. Gantzer // Journal. of Virol.-1996.-V.70,№7.-P. 4805-10. 294. He, T.C. A simplified system for generating recombinant adenoviruses./ T.C. He, S. Zhou, L.T. da Costa [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1998.-V.95,№5.-P. 250914. 295. San Martin, C. Localization of the N-terminus of minor coat protein IIIa in the adenovirus capsid./ C. San Martín, J.N. Glasgow, A. Borovjagin [et al.] // Journal of Molecular Biology.-2008.-V.383,№4.-P. 923-34. 296. Heise, C. An adenovirus E1A mutant that demonstrates potent and selective systemic anti-tumoral efficacy./ C. Heise, T. Hermiston, L. Johnson [et al.] // Nature Medicine.-2000.-V.6,№10.-P. 1134-9. 297. Ono, H.A. Noninvasive visualization of adenovirus replication with a fluorescent reporter in the E3 region./ H.A.Ono, L.P. Le, J.G. Davydova [et al.] // Cancer Res.2005.-V.65,№22.-P. 10154-8. 298. Fueyo, J. Preclinical characterization of the antiglioma activity of a tropism- enhanced adenovirus targeted to the retinoblastoma pathway./ J. Fueyo, R. Alemany, C. Gomez-Manzano [et al.] // J. Natl. Cancer. Inst.-2003.-V.95,№9.-P. 652-60. 232 299. Ulasov, I.V. Clinical significance of KISS1 protein expression for brain invasion and metastasis./ I.V. Ulasov, N.V. Kaverina, P. Pytel [et al.] // Cancer.-2012.V.118,№8.-P. 2096-105. 300. Huang, K.C. Impact of the coxsackie and adenovirus receptor (CAR) on glioma cell growth and invasion: requirement for the C-terminal domain./ K.C. Huang, M. Altinoz, K. Wosik [et al.] // Int. J. Cancer.-2005.-V.113,№5.-P. 738-45. 301. Ulasov, I.V. CD46 represents a target for adenoviral gene therapy of malignant glioma./ I.V. Ulasov, M.A. Tyler, S. Zheng [et al.] // Hum. Gene. Ther.-2006.-V.17,№5.P. 556-64. 302. Paul, C.P. Characterization of infectivity of knob-modified adenoviral vectors in glioma./ C.P.Paul, M. Everts, J.N. Glasgow [et al.] // Cancer Biol. Ther.-2008.-V.7,№5.P. 786-93. 303. Lu, Z.Z. Penton-dodecahedral particles trigger opening of intercellular junctions and facilitate viral spread during adenovirus serotype 3 infection of epithelial cells./ Z.Z. Lu, H. Wang, Y. Zhang [et al.] // PLoS Pathog.-2013.-V.9,№10.-P. e1003718. 304. Wang, H. Structural and functional studies on the interaction of adenovirus fiber knobs and desmoglein 2./ H. Wang, R. Yumul, H. Cao [et al.] // J. Virol.-2013.V.87,№21.-P. 11346-62. 305. Wang, H. Desmoglein 2 is a receptor for adenovirus serotypes 3, 7, 11 and 14./ H. Wang, Z.Y. Li, Y. Liu [et al.] // Nat. Med.-2011.-V.17,№1.-P. 96-104. 306. Okada, M. JNK contributes to temozolomide resistance of stem-like glioblastoma cells via regulation of MGMT expression./ M. Okada, A. Sato, K. Shibuya [et al.] // Int. J. Oncol.-2014.-V.44,№2.-P. 591-9. 307. Beier, D. Temozolomide preferentially depletes cancer stem cells in glioblastoma./ D. Beier, S. Röhrl, D.R. Pillai [et al.] // Cancer Res.-2008.-V.68,№14.-P. 5706-15. 308. Murat, A. Stem cell-related "self-renewal" signature and high epidermal growth factor receptor expression associated with resistance to concomitant chemoradiotherapy 233 in glioblastoma./ A. Murat, E. Migliavacca, T .Gorlia [et al.] // J. Clin. Oncol.-2008.V.26,№18.-P. 3015-24. 309. Svendsen, A. Expression of the progenitor marker NG2/CSPG4 predicts poor survival and resistance to ionising radiation in glioblastoma./ A. Svendsen, J.J. Verhoeff, H. Immervoll [et al.] // Acta Neuropathol.-2011.-V.122,№4.-P. 495-510. 310. Jakubczak, J.L. Adenovirus type 5 viral particles pseudotyped with mutagenized fiber proteins show diminished infectivity of coxsackie B-adenovirus receptor-bearing cells./ J.L. Jakubczak, M.L. Rollence, D.A. Stewart [et al.] // J. Virol.-2001.-V.75,№6.P. 2972-81. 311. Xia, D. Crystal structure of the receptor-binding domain of adenovirus type 5 fiber protein at 1.7 A resolution./ D.Xia, L.J. Henry, R.D. Gerard [et al.] // Structure.1994.-V.2,№12.-P. 1259-70. 312. Krasnykh, V. Genetic targeting of an adenovirus vector via replacement of the fiber protein with the phage T4 fibritin./ V. Krasnykh, N. Belousova, N. Korokhov [et al.] // J. Virol.-2001.-V.75,№9.-P. 4176-83. 313. Von Seggern, D.J. Complementation of a fibre mutant adenovirus by packaging cell lines stably expressing the adenovirus type 5 fibre protein./ D.J. Von Seggern, J. Kehler, R.I. Endo [et al.] .//J. Gen. Virol.-1998.-V.79,№ 6.-P. 1461-8. 314. Snijder, J.The cleaved N-terminus of pVI binds peripentonal hexons in mature adenovirus./ J. Snijder, M. Benevento, C.L. Moyer [et al.] // J. Mol Biol.-2014.V.426,№9.-P. 1971-9. 315. Ugai, H. Adenoviral protein V promotes a process of viral assembly through nucleophosmin 1./ H. Ugai, G.C. Dobbins, M. Wang [et al.] // Virology.-2012.V.432,№2.-P. 283-95. 316. Chee-Sheung, C.C., Ginsberg, H.S. Characterization of a temperature-sensitive fiber mutant of type 5 adenovirus and effect of the mutation on virion assembly./ C.C. Chee-Sheung, H.S. Ginsberg.// J. Virol.-1982.-V.42,№3.-P. 932-50. 234 317. Falgout, B., Ketner, G. Characterization of adenovirus particles made by deletion mutants lacking the fiber gene./ Falgout, B., Ketner G. // J. Virol.-1988.-V. 62,№2.-P. 622-5. 318. Ranki, T. A heparan sulfate-targeted conditionally replicative adenovirus, Ad5.pk7-Delta24, for the treatment of advanced breast cancer./ T. Ranki, A. Kanerva, A. Ristimäki [et al.] // Gene Ther.-2007.-V.14,№1.-P. 58-67. 319. Rauschhuber, C., Wolf, A., Ehrhardt, A. Transcriptional activity of inverted terminal repeats of various human adenovirus serotypes./ C. Rauschhuber, A. Wolf, A. Ehrhardt // J. Gen. Virol.-2011.-V. 92,№3.-P. 669-74. 320. Gordon, D.L.Human astrocytes express membrane cofactor protein (CD46), a regulator of complement activation./ D.L. Gordon, T.A. Sadlon, S.L. Wesselingh [et al.] // J. Neuroimmunol.-1992.-V. 36,№2-3.-P. 199-208. 321. McQuaid, S., Cosby, S.L. An immunohistochemical study of the distribution of the measles virus receptors, CD46 and SLAM, in normal human tissues and subacute sclerosing panencephalitis./ S. McQuaid, S.L. Cosby// Lab. Invest.-2002.-V.82,№4.-P. 403-9. 322. Bao, S. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response./ S. Bao, Q. Wu, R.E. McLendon [et al.] // Nature.-2006.V.444,№7120.-P. 756-60. 323. Hale, J.S. Cancer stem cell-specific scavenger receptor 36 drives glioblastoma progression./ J.S. Hale, B. Otvos, M. Sinyuk [et al.] // Stem Cells.-2014.-V. 32,№ 7.-P. 1746-58. 324. Dahan, P.Ionizing radiations sustain glioblastoma cell dedifferentiation to a stem- like phenotype through survivin: possible involvement in radioresistance./ P. Dahan, J. Martinez Gala, C. Delmas [et al.] // Cell. Death. Dis.-2014.-V.5.-P. e1543. 325. Guvenc, H. Impairment of glioma stem cell survival and growth by a novel inhibitor for Survivin-Ran protein complex./ H. Guvenc, M.S. Pavlyukov, K. Joshi [et al.] // Clin. Cancer Res.-2013.-V.19,№ 3.-P. 631-42. 235 326. Tamura, K. Expansion of CD133-positive glioma cells in recurrent de novo glioblastomas after radiotherapy and chemotherapy./ K. Tamura, M. Aoyagi, N Ando [et al.] // J. Neurosurg.-2013.-V.119,№ 5.-P. 1145-55. 327. Shibahara, I. The expression status of CD133 is associated with the pattern and timing of primary glioblastoma recurrence./ I. Shibahara, Y. Sonoda, R .Saito [et al.] // Neuro Oncol.-2013.-V.15,№9.-P. 1151-9. 328. Angelastro, J.M., Lame, M.W. Overexpression of CD133 promotes drug resistance in C6 glioma cells./ J.M. Angelastro, M.W. Lame // Mol. Cancer. Res.-2010.V.8,№8.-P. 1105-15. 329. Miconi, G. Immunophenotypic Characterization of Human Glioblastoma Stem Cells: Correlation with Clinical Outcome./ G. Miconi, P. Palumbo, S.R. Dehcordi [et al.] //. J. Cell. Biochem.-2015.-V.116,№ 5.-P.864-76 330. Raso, A. High levels of PROM1 (CD133) transcript are a potential predictor of poor prognosis in medulloblastoma./ A. Raso, S. Mascelli, R. Biassoni [et al.] // Neuro. Oncol.-2011.-V.13,№5.-P. 500-8. 331. Shibahara, I. Malignant clinical features of anaplastic gliomas without IDH mutation./ I. Shibahara, Y. Sonoda, T. Shoji [et al.] // Neuro. Oncol.-2015.-V.17,№ 1.-P. 136-44. 332. Kong, B.H. Prognostic value of glioma cancer stem cell isolation in survival of primary glioblastoma patients./ B.H. Kong, J.H. Moon, Y.M. Huh [et al.] // Stem. Cells. Int.-2014.-V.2014.-P. 838950. 333. Ardebili, S.Y. CD133/prominin1 is prognostic for ГБМ patient's survival, but inversely correlated with cysteine cathepsins' expression in glioblastoma derived spheroids./ S.Y. Ardebili, I. Zajc, B. Gole [et al.] // Radiol. Oncol.-2011.-V. 45,№ 2.-P. 102-15. 334. Cragle, C., MacNicol, A.M. Musashi protein-directed translational activation of target mRNAs is mediated by the poly(A) polymerase, germ line development defective2./ C. Cragle, A.M. MacNicol // J. Biol. Chem.-2014.-V.289,№20.-P. 14239-51. 236 335. Holmberg, J. Activation of neural and pluripotent stem cell signatures correlates with increased malignancy in human glioma./ J. Holmberg, X. He, I. Peredo [et al.] // PLoS One.-2011.-V.6,№3.-P. e18454. 336. Galatro, T.F. Differential expression of ID4 and its association with TP53 mutation, SOX2, SOX4 and OCT-4 expression levels./ T.F. Galatro, M. Uno, S.M. ObaShinjo [et al.] // PLoS One.-2013.-V.8,№ 4.-P. e61605. 337. Fan, X. Notch pathway inhibition depletes stem-like cells and blocks engraftment in embryonal brain tumors./ X. Fan, W. Matsui, L. Khaki [et al.] // Cancer Res.-2006.V.66,№15.-P. 7445-52. 338. Jiang, L. Bmi-1 promotes glioma angiogenesis by activating NF-kappaB signaling./ L. Jiang, L. Song, J. Wu [et al.] // PLoS One.-2013.-V. 8,№1.-P. e55527. 339. Ying, M. Regulation of glioblastoma stem cells by retinoic acid: role for Notch pathway inhibition./ M. Ying, S. Wang, Y. Sang [et al.] // Oncogene.-2011.-V.30,№31.P. 3454-67. 340. Aaberg-Jessen, C. Invasion of primary glioma- and cell line-derived spheroids implanted into corticostriatal slice cultures./ C. Aaberg-Jessen, A. Nørregaard, K. Christensen [et al.] // Int. J. Clin. Exp. Pathol.-2013.-V.6,№4.-P. 546-60. 341. Cox, J.L. Elevating SOX2 levels deleteriously affects the growth of medulloblastoma and glioblastoma cells./ J.L. Cox, P.J. Wilder, M. Desler [et al.] // PLoS One.-2012.-V. 7,№8.-P. e44087. 342. Gagliardi, F. The role of CXCR4 in highly malignant human gliomas biology: current knowledge and future directions./ F. Gagliardi, A. Narayanan, M. Reni [et al.] // Glia.-.2014.-V.62,№7.-P. 1015-23. 343. Yu, H.S.Melatonin inhibits the proliferation of retinal pigment epithelial (RPE) cells in vitro./ H.S.Yu, V. Hernandez, M. Haywood [et al.] // In. Vitro. Cell. Dev. Biol. Anim.-1993.-V.29A,№5.-P. 415-8. 237 344. Yaguchi, M. Characterization of the properties of seven promoters in the motor cortex of rats and monkeys after lentiviral vector-mediated gene transfer./ M. Yaguchi, Y. Ohashi, T. Tsubota [et al.] // Hum. Gene. Ther. Methods.-2013.-V.24,№6.-P. 333-44. 345. Dronadula, N. Construction of a novel expression cassette for increasing transgene expression in vivo in endothelial cells of large blood vessels./ N. Dronadula, L. Du, R. Flynn [et al.] // Gene Ther.-2011.-V. 18,№5.-P. 501-8. 346. Li, L.Y. Targeted hepatocellular carcinoma proapoptotic BikDD gene therapy./ L.Y. Li, H.Y. Dai, F.L. Yeh [et al.] // Oncogene.-2011.-V.30,№15,-P. 1773-83. 347. Boulos, S. Assessment of CMV, RSV and SYN1 promoters and the woodchuck post-transcriptional regulatory element in adenovirus vectors for transgene expression in cortical neuronal cultures./ S. Boulos, B.P. Meloni, P.G. Arthur [et al.] // Brain Res.2006.-V.1102,№1.-P. 27-38. 348. Gros, A. Verapamil enhances the antitumoral efficacy of oncolytic adenoviruses./ A. Gros, C. Puig, S. Guedan [et al.] // Mol. Ther.-2010.-V. 18,№5.-P. 903-11. 349. Koski, A. Verapamil results in increased blood levels of oncolytic adenovirus in treatment of patients with advanced cancer./ A. Koski, M. Raki, P. Nokisalmi [et al.] // Mol. Ther.-2012.-V.20,№1.-P. 221-9. 350. Carcaboso, A.M. Tyrosine kinase inhibitor gefitinib enhances topotecan penetration of gliomas./ A.M. Carcaboso, M.A. Elmeliegy, J. Shen [et al.] // Cancer Res.-2010.-V.70,№11.-P. 4499-508. 351. Shi, Q. Secreted protein acidic, rich in cysteine (SPARC), mediates cellular survival of gliomas through AKT activation./ Q. Shi, S. Bao, J.A. Maxwell [et al.] // J. Biol. Chem.-2004.-V.279,№ 50.-P. 52200-9. 352. Lu, J. Inhibition of serine/threonine phosphatase PP2A enhances cancer chemotherapy by blocking DNA damage induced defense mechanisms./ J. Lu, J.S. Kovach, F. Johnson [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-2009.-V.106, №28.-P. 11697702. 238 353. Schultz, C.R. Inhibition of HSP27 alone or in combination with pAKT inhibition as therapeutic approaches to target SPARC-induced glioma cell survival./ C.R. Schultz, W.A. Golembieski, D.A, King [et al.] // Mol. Cancer.-2012.-V.11.-P. 20. 354. Suzuki, Y.Higher pAkt expression predicts a significant worse prognosis in glioblastomas./ Y. Suzuki, K. Shirai, K. Oka [et al.] // J. Radiat. Res.-2010.-V.51,№3.-P. 343-8. 355. Tong, Y. Potent antitumor activity of oncolytic adenovirus expressing Beclin-1 via induction of autophagic cell death in leukemia./ Y. Tong, L. You, H. Liu [et al.] // Oncotarget.-2013.-V.4,№6.-P. 860-74. 356. Klein, S.R. C-Jun N-terminal kinases are required for oncolytic adenovirus- mediated autophagy./ S.R. Klein, S. Piya, Z. Lu [et al.] // Oncogene, 2015.-V.34, №41.P.5295-301. 357. Rodriguez-Rocha, H. Adenoviruses induce autophagy to promote virus replication and oncolysis./ H. Rodriguez-Rocha, J.G. Gomez-Gutierrez, A. GarciaGarcia [et al.] // Virology.-2011.-V.416,№ 1-2.-P. 9-15. 358. Kabbage, M., Williams, B., Dickman, M.B. Cell death control: the interplay of apoptosis and autophagy in the pathogenicity of Sclerotinia sclerotiorum./ M. Kabbage, B. Williams, M.B. Dickman // PLoS Pathog.-2013.-V.9,№4.-P. e1003287. 359. Wang, Y., Weiss L.M., Orlofsky A. Host cell autophagy is induced by Toxoplasma gondii and contributes to parasite growth./ Y. Wang, L.M. Weiss, A. Orlofsky// J. Biol. Chem.-2009.-V.284,№3.-P. 1694-701. 360. Yeganeh, B. Suppression of influenza A virus replication in human lung epithelial cells by noncytotoxic concentrations bafilomycin A1./ B. Yeganeh, S. Ghavami, A.L. Kroeker [et al.] //Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol.-2015.V.308,№3.-P. L270-86. 361. Ma, J. Avian influenza A virus H5N1 causes autophagy-mediated cell death through suppression of mTOR signaling./ J. Ma, Q. Sun, R. Mi [et al.] // J. Genet. Genomics.-2011.-V.38,№11.-P. 533-7. 239 362. Mo, J. Interplay of autophagy and apoptosis during murine cytomegalovirus infection of RPE cells./ J. Mo, M. Zhang, B. Marshall [et al.] // Mol. Vis.-2014.-V.20.-P. 1161-73. 363. Campbell, G.R., Spector, S.A. Inhibition of human immunodeficiency virus type- 1 through autophagy./ G.R. Campbell, S.A. Spector // Curr. Opin. Microbiol.-2013.V.16,№3.-P. 349-54. 364. Granato, M. Epstein-barr virus blocks the autophagic flux and appropriates the autophagic machinery to enhance viral replication./ M. Granato, R. Santarelli, A. Farina [et al.] // J. Virol.-2014.-V.88,№ 21.-P. 12715-26. 365. Granato, M. Hepatitis C virus present in the sera of infected patients interferes with the autophagic process of monocytes impairing their in-vitro differentiation into dendritic cells./ M. Granato, V. Lacconi, M. Peddis [et al.] // Biochim. Biophys. Acta.2014.-V.1843,№7.-P. 1348-55. 366. Polager, S., Ofir, M., Ginsberg, D. E2F1 regulates autophagy and the transcription of autophagy genes./ S. Polager, M. Ofir, D. Ginsberg // Oncogene.-2008.V.27,№ 35.-P. 4860-4. 367. Kuroda, S. Telomerase-dependent oncolytic adenovirus sensitizes human cancer cells to ionizing radiation via inhibition of DNA repair machinery./ S. Kuroda, T. Fujiwara, Y Shirakawa [et al.] // Cancer Res.-2010.-V.70,№22.-P. 9339-48. 368. Garcia-Garcia, A. E2F-1 lacking the transcriptional activity domain induces autophagy./ A. Garcia-Garcia, H. Rodriguez-Rocha, M.T. Tseng [et al.] // Cancer Biol. Ther.-2012.-V.13,№11.-P. 1091-101. 369. Pyo, J.O. Essential roles of Atg5 and FADD in autophagic cell death: dissection of autophagic cell death into vacuole formation and cell death./ J.O. Pyo, M.H. Jang, Y.K. Kwon [et al.] // J. Biol. Chem.-2005.-V.280,№21.-P. 20722-9. 370. O'Shea, C. Adenoviral proteins mimic nutrient/growth signals to activate the mTOR pathway for viral replication./ C. O'Shea, K. Klupsch, S. Choi [et al.] // EMBO J.-2005.-V.24,№6.-P. 1211-21. 240 371. Kim, J. AMPK and mTOR regulate autophagy through direct phosphorylation of Ulk1./ J. Kim, M. Kundu, B. Viollet [et al.] // Nat. Cell. Biol.-2011.-V.13,№2.-P. 13241. 372. Jiang, Y. Tetracycline inhibits local inflammation induced by cerebral ischemia via modulating autophagy./ Y. Jiang, J. Zhu, L. Wu [et al.] // PLoS One.-2012.V.7,№11.-P. e48672. 373. Lamoureux, F., Zoubeidi, A. Dual inhibition of autophagy and the AKT pathway in prostate cancer./ Lamoureux, F., Zoubeidi A. // Autophagy,-2013.-V.9,№7.-P. 111920. 374. Zhuang, W. Induction of autophagy promotes differentiation of glioma-initiating cells and their radiosensitivity./ W. Zhuang, B. Li, L. Long [et al.] // Int. J. Cancer.2011.-V.129,№11.-P. 2720-31. 375. Liu, W.M. Lyn facilitates glioblastoma cell survival under conditions of nutrient deprivation by promoting autophagy./ W.M. Liu, P. Huang, N. Kar [et al.] // PLoS One.-2013.-V.8,№8.-P. e70804. 376. He, S. PtdIns(3)P-bound UVRAG coordinates Golgi-ER retrograde and Atg9 transport by differential interactions with the ER tether and the beclin 1 complex./ S. He, D. Ni, B. Ma [et al.] //Nat. Cell. Biol.-2013.-V.15,№10.-P. 1206-19. 377. Matsunaga, K. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages./ K. Matsunaga, T. Saitoh, K. Tabata [et al.] // Nat. Cell. Biol.- 2009.-V.11,№4.-P. 385-96. 378. Schuessler, A. Autologous T-cell therapy for cytomegalovirus as a consolidative treatment for recurrent glioblastoma./ A. Schuessler, C. Smith, L. Beagle y [et al.] // Cancer Res.-2014.-V.74,№ 13.-P. 3466-76. 379. Mitchell, D.A. Tetanus toxoid and CCL3 improve dendritic cell vaccines in mice and glioblastoma patients./ D.A. Mitchell, K.A. Batich, M.D. Gunn [et al.] // Nature.2015.-V. 519,№7543.-P. 366-9. 241 380. Speir, E. Antioxidant effect of estrogen on cytomegalovirus-induced gene expression in coronary artery smooth muscle cells./ E. Speir, Z.X. Yu, K. Takeda [et al.] // Circulation.-2000.-V.102,№ 24.-P. 2990-6. 381. Mrugala, M.M., Adair, J., Kiem, H.P. Temozolomide: Expanding its role in brain cancer./ M.M. Mrugala, J. Adair, H.P. Kiem // Drugs. Today. (Barc).-2010.-V.46,№11.P. 833-46. 382. Low, S.Y. MicroRNA as potential modulators in chemoresistant high-grade gliomas./ S.Y. Low, Y.K. Ho, H.P. Too // J. Clin. Neurosci.-2014.-V. 21,№3.-P. 395400. 383. Prados, M.D. Future directions in the treatment of malignant gliomas with temozolomide./ M.D. Prados // Semin. Oncol.-2000.-V.27,№3.- Suppl 6.-P. 41-6. 384. Hong, S.E. S6K1 inhibition enhances tamoxifen-induced cell death in MCF-7 cells through translational inhibition of Mcl-1 and survivin./ S.E. Hong, E.K. Kim, H.O. Jin [et al.] // Cell. Biol. Toxicol.-2013.-V.29,№4.-P. 273-82. 385. Guo, R. Tamoxifen inhibits proliferation and induces apoptosis in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 via down-regulation of survivin expression./ R. Guo, Z. Huang, Y. Shu [et al.] // Biomed. Pharmacother.-2009.-V. 63,№5.-P. 375-9. 386. Harmalkar, M. Tamoxifen-Induced Cell Death of Malignant Glioma Cells Is Brought About by Oxidative-Stress-Mediated Alterations in the Expression of BCL2 Family Members and Is Enhanced on miR-21 Inhibition./ M. Harmalkar, S. Upraity, S. Kazi [et al.] // J. Mol. Neurosci.- 2015. V.57,№2.-P.197-202 387. He, W. Chemotherapeutic effect of tamoxifen on temozolomide-resistant gliomas./ W. He, R. Liu, S.H. Yang [et al.] // Anticancer Drugs.-2015.-V.26,№3.-P. 293-300. 388. Balca-Silva, J. Tamoxifen in combination with temozolomide induce a synergistic inhibition of PKC-pan in GBM cell lines./ J. Balça-Silva, D. Matias, A. do Carmo [et al.] // Biochim. Biophys. Acta.-2015.-V.1850,№4.-P. 722-32. 242 389. DI Cristofori, A. Continuous tamoxifen and dose-dense temozolomide in recurrent glioblastoma./ A. DI Cristofori, G. Carrabba, G. Lanfranchi [et al.] // Anticancer Res.-2013.-V.33,№8.-P. 3383-9. 390. de Medina, P., Silvente-Poirot, S. and Poirot, M. Tamoxifen and AEBS ligands induced apoptosis and autophagy in breast cancer cells through the stimulation of sterol accumulation./ P. de Medina, S. Silvente-Poirot, M. Poirot // Autophagy.-2009.V.5,№7.-P. 1066-7. 391. Cho, K.S. Induction of autophagy and cell death by tamoxifen in cultured retinal pigment epithelial and photoreceptor cells./ K.S. Cho, Y.H. Yoon, J.A. Choi [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.-2012.-V.53,№9.-P. 5344-53. 392. Liu, L. Tamoxifen reduces fat mass by boosting reactive oxygen species./ L. Liu, P. Zou, L. Zheng [et al.] // Cell. Death. Dis.-2015.-V.6.-P. e1586. 393. Cheng, S.M. YM155 down-regulates survivin and XIAP, modulates autophagy and induces autophagy-dependent DNA damage in breast cancer cells./ // Br. J. Pharmacol.-2015.-V.172,№1.-P. 214-34. 394. Song, Z. Essential role for UVRAG in autophagy and maintenance of cardiac function./ Z. Song, L. An, Y. Ye [et al.] // Cardiovasc. Res.-2014.-V.101,№1.-P. 48-56. 395. Patel, S. Phase I clinical trial assessing temozolomide and tamoxifen with concomitant radiotherapy for treatment of high-grade glioma./ S. Patel, S. DiBiase, B. Meisenberg [et al.] // Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys.-2012.-V.82,№2.-P. 739-42. 396. Homicsko, K., Lukashev, A., Iggo, R.D. RAD001 (everolimus) improves the efficacy of replicating adenoviruses that target colon cancer./ Homicsko, K., Lukashev A., Iggo R.D. // Cancer Res.-2005.-V.65,№15.-P. 6882-90. 397. Xiao, T. VEGI-armed oncolytic adenovirus inhibits tumor neovascularization and directly induces mitochondria-mediated cancer cell apoptosis./ T. Xiao, J.K. Fan, H.L. Huang [et al.] // Cell. Res.-2010.-V.20,№ 3.-P. 367-78. 243 398. Su, J.L. Downregulation of microRNA miR-520h by E1A contributes to anticancer activity./ J.L. Su, P.B. Chen, Y.H. Chen [et al.] // Cancer. Res.-2010.V.70,№12.-P. 5096-108. 399. Tazawa, H. Genetically engineered oncolytic adenovirus induces autophagic cell death through an E2F1-microRNA-7-epidermal growth factor receptor axis./ H. Tazawa, S. Yano, R. Yoshida [et al.] // Int. J. Cancer.- 2012.-V. 131,№12.-P:2939-50. 400. Tazawa, H., Kagawa, S., Fujiwara, T., Oncolytic adenovirus-induced autophagy: tumor-suppressive effect and molecular basis./ H. Tazawa, S. Kagawa, T. Fujiwara [et al.] // Acta. Med. Okayama.-2013.-V.67,№ 6.-P. 333-42. 401. Li, G.D. Telomelysin shows potent antitumor activity through apoptotic and non- apoptotic cell death in soft tissue sarcoma cells./ G.D. Li, H. Kawashima, A. Ogose [et al.] // Cancer. Sci.-2013.-V.104, № 9.-P. 1178-88. 402. Botta, G. Inhibition of autophagy enhances the effects of E1A-defective oncolytic adenovirus dl922-947 against glioma cells in vitro and in vivo./ G. Botta, C. Passaro, S. Libertini [et al.] // Hum. Gene. Ther.-2012.-V.23,№6.-P. 623-34. 403. Fine, H.A. New Strategies in Glioblastoma: Exploiting the New Biology./ H.A. Fine // Clin. Cancer. Res.-2015.-V.21,№ 9.-P.1984-8. 404. Chen, D., Tumor formation and drug resistance properties of human glioblastoma side population cells./ D. Chen// Mol. Med. Rep.,-2015.-V.11,№ 6.-P.4309-14. 405. Zhang, Y. An oncolytic adenovirus regulated by a radiation-inducible promoter selectively mediates hSulf-1 gene expression and mutually reinforces antitumor activity of I131-metuximab in hepatocellular carcinoma./ Y. Zhang, L. Fang, Q. Zhang [et al.] // Mol. Oncol.-2013.-V.7,№3.-P. 346-58. 406. Zhang, L.H. TRIM24 promotes glioma progression and enhances chemoresistance through activation of the PI3K/Akt signaling pathway./ L.H. Zhang, A.A.Yin, J.X. Cheng [et al.] // Oncogene.-2015.-V.34,№5.-P. 600-10. 244 407. Han, S. Exogenous IGFBP-2 promotes proliferation, invasion, and chemoresistance to temozolomide in glioma cells via the integrin beta1-ERK pathway./ S. Han, Z. Li, L.M. Master [et al.] // Br. J. Cancer.-2014.-V.111,№7.-P. 1400-9. 408. Kanzawa, T. Role of autophagy in temozolomide-induced cytotoxicity for malignant glioma cells./ T. Kanzawa, I.M. Germano, T. Komata [et al.] //Cell. Death. Differ.-2004.-V.11,№4.-P. 448-57. 409. Huang, X. Recombinant oncolytic adenovirus H101 combined with siBCL2: cytotoxic effect on uveal melanoma cell lines./ X. Huang, R. Jia, X. Zhao [et al.] // Br. J. Ophthalmol.-2012.-V.96,№ 10.-P. 1331-8. 410. Wang, G. E1B 55-kDa deleted, Ad5/F35 fiber chimeric adenovirus, a potential oncolytic agent for B-lymphocytic malignancies./ G. Wang, G. Li, H. Liu [et al.] // J. Gene. Med.-2009.-V.11,№6.-P. 477-85. 411. Savelyeva, I., Dobbelstein, M., Infection with E1B-mutant adenovirus stabilizes p53 but blocks p53 acetylation and activity through E1A./ I. Savelyeva, M. Dobbelstein // Oncogene.-2011.-V.30,№7.-P. 865-75. 412. Hu, Y.L. Hypoxia-induced tumor cell autophagy mediates resistance to anti- angiogenic therapy./ Y.L. Hu, A. Jahangiri, M. De Lay [et al.] // Autophagy.-2012.V.8,№6.-P. 979-81. 413. Li, X.N. Valproic acid induces growth arrest, apoptosis, and senescence in medulloblastomas by increasing histone hyperacetylation and regulating expression of p21Cip1, CDK4, and CMYC./ X.N. Li, Q. Shu, J.M. Su [et al.] // Mol. Cancer. Ther.2005.-V.4,№12.-P. 1912-22. 414. Koul, D. Antitumor activity of NVP-BKM120--a selective pan class I PI3 kinase inhibitor showed differential forms of cell death based on p53 status of glioma cells./ D. Koul, J. Fu, R. Shen [et al.] // Clin. Cancer. Res.-2012.-V.18,№1.-P. 184-95. 415. Janouskova, H. Integrin alpha5beta1 plays a critical role in resistance to temozolomide by interfering with the p53 pathway in high-grade glioma./ H. 245 Janouskova, A. Maglott, D.Y. Leger [et al.] // Cancer. Res.-2012.-V.72,№14.-P. 346370. 416. Blough, M.D. Effect of aberrant p53 function on temozolomide sensitivity of glioma cell lines and brain tumor initiating cells from glioblastoma./ M.D. Blough, D.C. Beauchamp, M.R. Westgate [et al.] // J. Neurooncol.-2011.-V.102,№1.-P. 1-7. 417. Jones, D.T. Adult grade II diffuse astrocytomas are genetically distinct from and more aggressive than their paediatric counterparts./ D.T. Jones, S.A. Mulholland, D.M. Pearson // Acta. Neuropathol.-2011.-V.121,№6.-P. 753-61. 418. Kaluza, J., Adamek D., Pyrich M. PCNA and protein P53 in recurrent supratentorial glial brain tumors: studies on correlation between morphology and tumor progression./ J. Kaluza, D. Adamek, M. Pyrich // Pol. J. Pathol.-1995.-V.46,№3.-P. 15561. 419. Munoz, D.M. Loss of p53 cooperates with K-ras activation to induce glioma formation in a region-independent manner./ D.M. Muñoz, T. Tung, S. Agnihotri [et al.] // Glia.-2013.-V.61, № 11.-P. 1862-72. 420. Zheng, H. Pten and p53 converge on c-Myc to control differentiation, self- renewal, and transformation of normal and neoplastic stem cells in glioblastoma. / H. Zheng, H. Ying, H. Yan [et al.] //Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol.-2008.-V.73.-P. 427-37. 421. Ingham, P.W. Hedgehog signaling: a tale of two lipids./ // Science.-2001.- V.294,№5548.-P. 1879-81. 422. Gupta, S., Takebe, N., Lorusso, P. Targeting the Hedgehog pathway in cancer./ S. Gupta, N. Takebe, P. Lorusso // Ther. Adv. Med. Oncol.-2010.-V.2,№4.-P. 237-50. 423. Platt, K.A., Michaud, J., Joyner, A.L. Expression of the mouse Gli and Ptc genes is adjacent to embryonic sources of hedgehog signals suggesting a conservation of pathways between flies and mice./ K.A. Platt, J. Michaud, A.L. Joyner // Mech. Dev.1997.-V.62,№2.-P. 121-35. 246 424. Tostar, U. Deregulation of the hedgehog signalling pathway: a possible role for the PTCH and SUFU genes in human rhabdomyoma and rhabdomyosarcoma development./ U. Tostar, C.J. Malm, J.M. Meis-Kindblom [et al.] //J. Pathol.-2006.V.208,№1.-P. 17-25. 425. Yauch, R.L. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma./ R.L.Yauch, G.J. Dijkgraaf, B. Alicke [et al.] // Science.2009.-V.326,№ 5952.-P. 572-4. 426. Ulasov, I.V. Inhibition of Sonic hedgehog and Notch pathways enhances sensitivity of CD133(+) glioma stem cells to temozolomide therapy./ I.V.Ulasov, S. Nandi, M. Dey [et al.] // Mol. Med.- 2011.-V.17,№ 1-2.-P. 103-12. 427. Dai, P. Sonic Hedgehog-induced activation of the Gli1 promoter is mediated by GLI3./ P. Dai, H. Akimaru, Y. Tanaka [et al.] // J. Biol. Chem.-1999.-V. 274,№12.-P. 8143-52. 428. Clement, V. HEDGEHOG-GLI1 signaling regulates human glioma growth, cancer stem cell self-renewal, and tumorigenicity./ V. Clement, P. Sanchez, N. de Tribolet [et al.] // Curr. Biol.-2007.-V.17,№ 2.-P. 165-72. 429. Chandra, V. Hedgehog signaling pathway is active in ГБМ with GLI1 mRNA expression showing a single continuous distribution rather than discrete high/low clusters./ V. Chandra, T. Das, P. Gulati [et al.] // PLoS One.-2015.-V.10,№3.-P. e0116390. 430. Biswas, N.K. Variant allele frequency enrichment analysis in vitro reveals sonic hedgehog pathway to impede sustained temozolomide response in GBM./ N.K. Biswas, V. Chandra, N. Sarkar-Roy [et al.] // Sci. Rep.- 2015.-V.5.-P. 7915. 431. Ulasov, I. The emerging role of MMP14 in brain tumorigenesis and future therapeutics./ I. Ulasov, R. Yi, D. Guo [et al.] //Biochim. Biophys. Acta.-2014.V.1846,№1.-P. 113-20. 247 432. Kumar, S. Antibody-directed coupling of endoglin and MMP-14 is a key mechanism for endoglin shedding and deregulation of TGF-beta signaling./ S. Kumar, C.C. Pan, J.C. Bloodworth [et al.] // Oncogene.-2014.-V.33,№30.-P. 3970-9. 433. Koziol, A. The protease MT1-MMP drives a combinatorial proteolytic program in activated endothelial cells./ A. Koziol, P. Gonzalo, A. Mota [et al.] // FASEB J.2012.-V.26,№11.-P. 4481-94. 434. Cork, S.M. A proprotein convertase/MMP-14 proteolytic cascade releases a novel 40 kDa vasculostatin from tumor suppressor BAI1./ S.M. Cork, B. Kaur, N.S. Devi [et al.] // Oncogene.-2012.-V.31,№50.-P. 5144-52. 435. Basile, J.R. MT1-MMP controls tumor-induced angiogenesis through the release of semaphorin 4D./ J.R. Basile, K. Holmbeck, T.H. Bugge [et al.] // J. Biol. Chem.2007.-V.282,№9.-P. 6899-905. 436. Ding, B.S. Endothelial MMP14 is required for endothelial dependent growth support of human airway basal cells./ B.S. Ding, K. Gomi, S. Rafii [et al.] // J. Cell. Sci.2015.-V.128,№16.-P. 2983-8 437. Yoo, J.Y. Short hairpin RNA-expressing oncolytic adenovirus-mediated inhibition of IL-8: effects on antiangiogenesis and tumor growth inhibition./ J.Y. Yoo, J.H. Kim, J. Kim [et al.] // Gene Ther.-2008.-V.15,№9.-P. 635-51. 438. Yoo, J.Y. VEGF-specific short hairpin RNA-expressing oncolytic adenovirus elicits potent inhibition of angiogenesis and tumor growth./ J.Y. Yoo, J.H. Kim, Y.G. Kwon [et al.] // Mol. Ther.-2007.-V.15,№2.-P. 295-302. 439. Kang, Y.A. Novel cancer antiangiotherapy using the VEGF promoter-targeted artificial zinc-finger protein and oncolytic adenovirus./ Y.A. Kang, H.C. Shin, J.Y. Yoo [et al.] // Mol. Ther.-2008.-V.16,№6.-P. 1033-40. 440. Ulasov, I. Inhibition of MMP14 potentiates the therapeutic effect of temozolomide and radiation in gliomas./ I. Ulasov, B. Thaci, P. Sarvaiya // Cancer. Med.-2013-V.2,№4.-P. 457-67. 248 441. Wu, C.Y., Guo X.Z., Li H.Y. Hypoxia and Serum deprivation protected MiaPaCa-2 cells from KAI1-induced proliferation inhibition through autophagy pathway activation in solid tumors./ C.Y. Wu, X.Z. Guo, H.Y. Li// Clin. Transl. Oncol.2015.-V.17,№3.-P. 201-8. 442. Fu, M.Y. Transforming growth factorbeta1 reduces apoptosis via autophagy activation in hepatic stellate cells./ M.Y. Fu, Y.J. He, X. Lv [et al.] //Mol. Med. Rep.2014.-V.10,№3.-P. 1282-8. 443. Carbonell, W.S. beta1 integrin targeting potentiates antiangiogenic therapy and inhibits the growth of bevacizumab-resistant glioblastoma./ W.S. Carbonell, M. DeLay, A. Jahangiri [et al.] // Cancer Res.-2013.-V.73,№10.-P. 3145-54. 444. Miletic, H. Anti-VEGF therapies for malignant glioma: treatment effects and escape mechanisms./ H. Miletic, S.P. Niclou, M. Johansson [et al.] // Expert. Opin. Ther. Targets.-2009.-V.13,№4.-P. 455-68. 445. Piao, Y. Glioblastoma resistance to anti-VEGF therapy is associated with myeloid cell infiltration, stem cell accumulation, and a mesenchymal phenotype./ Y. Piao, J. Liang, L. Holmes [et al.] // Neuro Oncol.-2012.-V.14,№11.-P. 1379-92. 446. Grabowski, M.M. Residual tumor volume versus extent of resection: predictors of survival after surgery for glioblastoma./ M.M. Grabowski, P.F. Recinos, A.S. Nowacki [et al.] // J. Neurosurg.-2014.-V.121,№5.-P. 1115-23. 447. Yong, R.L. Residual tumor volume and patient survival following reoperation for recurrent glioblastoma./ R.L. Yong, T. Wu, N. Mihatov [et al.] // J. Neurosurg.-2014.V.121,№4.-P. 802-9. 448. Peponi, E. Prognostic factors in glioblastoma patients managed with radiotherapy combined with temozolomide./ E. Peponi, I. Tourkantonis, I. Tasiou [et al.] // J. BUON.2014.-V.19,№ 3.-P. 718-23. 449. Mazaris, P. Key determinants of short-term and long-term glioblastoma survival: a 14-year retrospective study of patients from the Hermelin Brain Tumor Center at 249 Henry Ford Hospital./ P. Mazaris, X. Hong, D. Altshuler [et al.] // Clin. Neurol. Neurosurg.-2014.-V.120.-P. 103-12. 450. Houri, N., Huang, K.C., Nalbantoglu, J. The Coxsackievirus and Adenovirus Receptor (CAR) undergoes ectodomain shedding and regulated intramembrane proteolysis (RIP)./ N. Houri, K.C. Huang, J. Nalbantoglu //PLoS One.-2013.-V.8,№8.-P. e73296. 451. Krasnykh, V.N. Generation of recombinant adenovirus vectors with modified fibers for altering viral tropism./ V.N. Krasnykh, G.V. Mikheeva, J.T. Douglas [et al.] // J. Virol.-1996.-V.70,№10.-P. 6839-46. 452. Krasnykh, V. Characterization of an adenovirus vector containing a heterologous peptide epitope in the HI loop of the fiber knob./ V. Krasnykh, I. Dmitriev, G. Mikheeva [et al.] // J. Virol.-1998.-V.72,№3.-P. 1844-52. 453. Dmitriev, I. An adenovirus vector with genetically modified fibers demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus receptorindependent cell entry mechanism./ I. Dmitriev, V. Krasnykh, C.R. Miller [et al.] // J. Virol.- 1998.-V. 72,№12.-P. 9706-13. 454. Von Seggern, D.J. Adenovirus vector pseudotyping in fiber-expressing cell lines: improved transduction of Epstein-Barr virus-transformed B cells./ D.J. Von Seggern, S. Huang, S.K. Fleck [et al.] // J. Virol.-2000.-V.74,№1.-P. 354-62. 455. Ge, L. Differential glioma-associated tumor antigen expression profiles of human glioma cells grown in hypoxia./ L. Ge, A.N. Cornforth, N.T. Hoa [et al.] // PLoS One/2012.-V.7,№9.-P. e42661. 456. van Olphen, A.L., Mittal, S.K. A 72-bp internal deletion in the left inverted terminal repeat of the bovine adenovirus type 3 genome does not affect virus replication./ A.L. van Olphen, S.K. Mittal // Intervirology.-2002.-V.45,№3.-P. 188-92. 457. Xing, L., Tikoo S.K. Promoter activity of left inverted terminal repeat and downstream sequences of porcine adenovirus type 3./ L. Xing, S.K. Tikoo // Virus Res.2005.-V.109,№1.-P. 51-8. 250 458. Chen, J. A glial-specific, repressible, adenovirus vector for brain tumor gene therapy./ J. Chen, T. Bezdek, J. Chang [et al.] // Cancer Res.-1998.-V.58,№16.-P. 35047. 459. Vandier, D. Inhibition of glioma cells in vitro and in vivo using a recombinant adenoviral vector containing an astrocyte-specific promoter./ D. Vandier, O. Rixe, F. Besnard [et al.] // Cancer Gene. Ther.-2000.-V.7,№8.-P. 1120-6. 460. Kurihara, H. Glioma/glioblastoma-specific adenoviral gene expression using the nestin gene regulator./ H. Kurihara, A. Zama, M. Tamura [et al.] // Gene Ther.-2000.V.7,№8.-P. 686-93. 461. Shinoura, N. Adenovirus-mediated transfer of Fas ligand gene augments radiation-induced apoptosis in U-373MG glioma cells./ N. Shinoura, N. Yamamoto, A. Asai [et al.] // Jpn. J. Cancer. Res.-2000.-V.91,№10.-P. 1044-50. 462. Alonso, M.M. Expression of transcription factor E2F1 and telomerase in glioblastomas: mechanistic linkage and prognostic significance./ M.M. Alonso, J. Fueyo, J.W. Shay [et al.] // J. Natl. Cancer. Inst.-2005.-V.97,№21.-P. 1589-600. 463. Munson, J.M., Bellamkonda, R.V., Swartz, M.A. Interstitial flow in a 3D microenvironment increases glioma invasion by a CXCR4-dependent mechanism./ J.M. Munson, R.V. Bellamkonda, M.A. Swartz // Cancer Res.-2013.-V.73,№5.-P. 1536-46. 464. Tseng, D., Vasquez-Medrano, D.A., Brown, J.M. Targeting SDF-1/CXCR4 to inhibit tumour vasculature for treatment of glioblastomas./ D. Tseng, D.A. VasquezMedrano, J.M. Brown // Br. J. Cancer.-2011.-V.104,№12.-P. 1805-9. 465. do Carmo, A. CXCL12/CXCR4 promotes motility and proliferation of glioma cells./ A. do Carmo, I. Patricio, M,T, Cruz [et al.] // Cancer Biol. Ther.-2010.-V.9,№1.P. 56-65. 466. Kadomatsu, K. The midkine family in cancer, inflammation and neural development./ K. Kadomatsu // Nagoya. J. Med. Sci.-2005.-V.67, №3-4.-P. 71-82. 251 467. Whyte, W.A. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes./ W.A. Whyte, D.A. Orlando, D. Hnisz [et al.] // Cell.-2013.V.153,№2.-P. 307-19. 468. Hnisz, D. Super-enhancers in the control of cell identity and disease./ D. Hnisz, B.J. Abraham, T.I. Lee [et al.] // Cell.-2013.-V.155,№4.-P. 934-47. 469. Boidot, R., Vegran, F., Lizard-Nacol, S. Transcriptional regulation of the survivin gene./ R. Boidot, F. Vegran, S. Lizard-Nacol // Mol. Biol. Rep.-2014.V.41,№1.-P. 233-40. 470. Martuza, R.L. Experimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant./ R.L. Martuza, A. Malick, J.M. Markert [et al.] // Science.1991.-V.252,№5007.-P. 854-6. 471. Cohen, E.E., Rudin, C.M., ONYX-015. Onyx Pharmaceuticals./ Cohen, E.E., Rudin C.M. // Curr. Opin. Investig. Drugs.-2001.-V.2,№12.-P. 1770-5. 472. Yang, Y.F. Antitumor effects of oncolytic adenovirus armed with PSA-IZ- CD40L fusion gene against prostate cancer./ Y.F.Yang, S.Y. Xue, Z.Z. Lu [et al.] // Gene Ther.-2014.-V.21,№8.-P. 723-31. 473. Hirvinen, M. Immunological Effects of a Tumor Necrosis Factor Alpha-Armed Oncolytic Adenovirus./ M. Hirvinen, M. Rajecki, M. Kapanen // Hum. Gene. Ther.2015.-V.26,№3.-P.134-44. 474. Qi, Y. Preclinical pharmacology and toxicology study of Ad-hTERT-E1a- Apoptin, a novel dual cancer-specific oncolytic adenovirus./ Y. Qi, H. Guo, N. Hu [et al.] // Toxicol. Appl. Pharmacol.-2014.-V.280,№2.-P. 362-9. 475. Tong, Y. PI3K inhibitor LY294002 inhibits activation of the Akt/mTOR pathway induced by an oncolytic adenovirus expressing TRAIL and sensitizes multiple myeloma cells to the oncolytic virus./ Y.Tong, W. Zhu, X. Huang [et al.] // Oncol. Rep.-2014.V.31,№4.-P. 1581-8. 252 476. Zhou, X. Potent and specific antitumor effect for colorectal cancer by CEA and Rb double regulated oncolytic adenovirus harboring ST13 gene./ X. Zhou, G. Xie, S. Wang [et al.] // PLoS One.-2012.-V.7,№10.-P. e47566. 477. Xu, H.N. HCCS1-armed, quadruple-regulated oncolytic adenovirus specific for liver cancer as a cancer targeting gene-viro-therapy strategy./ H.N. Xu, W.D. Huang, Y. Cai [et al.] // Mol. Cancer.- 2011.-V.10.-P. 133. 478. Meng, H.T. Homoharringtonine acts synergistically with SG235-TRAIL, a conditionally replicating adenovirus, in human leukemia cell lines./ H.T. Meng, L. Li, H. Liu [et al.] //Acta Pharmacol. Sin.-2009.-V.30,№11.-P. 1529-36. 479. Schipper, H. Eradication of metastatic melanoma through cooperative expression of RNA-based HDAC1 inhibitor and p73 by oncolytic adenovirus./ H. Schipper, V. Alla, C. Meier [et al.] // Oncotarget.-2014.-V.5,№15.-P. 5893-907. 480. Kim, S.Y. The effectiveness of the oncolytic activity induced by Ad5/F35 adenoviral vector is dependent on the cumulative cellular conditions of survival and autophagy./ S.Y. Kim, S. Kang, J.J. Song [et al.] // Int. J. Oncol.-2013.-V.42,№4.-P. 1337-48. 481. Cherubini, G. E1B55K-deleted adenovirus (ONYX-015) overrides G1/S and G2/M checkpoints and causes mitotic catastrophe and endoreduplication in p53proficient normal cells./ G. Cherubini, T. Petouchoff, M. Grossi [et al.] // Cell. Cycle.2006.-V.5,№19.-P. 2244-52. 482. Guglielmotto, M. Abeta1-42 monomers or oligomers have different effects on autophagy and apoptosis./ M. Guglielmotto, D. Monteleone, A. Piras [et al.] // Autophagy.-2014.-V.10,№10.-P. 1827-43. 483. Lossi, L. Posttranslational regulation of BCL2 levels in cerebellar granule cells: A mechanism of neuronal survival./ L. Lossi, G. Gambino, F. Ferrini [et al.] // Dev. Neurobiol.- 2009.-V.69,№13.-P. 855-70. 484. Uchida, Y., Ohtsuki, S., Terasaki, T. Pharmacoproteomics-based reconstruction of in vivo P-glycoprotein function at blood-brain barrier and brain distribution of 253 substrate verapamil in pentylenetetrazole-kindled epilepsy, spontaneous epilepsy, and phenytoin treatment models./ Y. Uchida, S. Ohtsuki, T. Terasaki// Drug. Metab. Dispos.-2014.-V.42,№10.-P. 1719-26. 485. Gazina, E.V. Ion transport blockers inhibit human rhinovirus 2 release./ E.V.Gazina, D.N. Harrison, M. Jefferies [et al.] // Antiviral. Res.-2005.-V. 67,№2.-P. 98-106. 486. Gehring, G. The clinically approved drugs amiodarone, dronedarone and verapamil inhibit filovirus cell entry./ G. Gehring, K. Rohrmann, N. Atenchong [et al.] // J. Antimicrob. Chemother.-2014.-V. 69,№ 8.-P. 2123-31. 487. Cheshenko, N. Herpes simplex virus triggers activation of calcium-signaling pathways./ N. Cheshenko, B. Del Rosario, C. Woda [et al.] // J. Cell. Biol.-2003.V.163,№2.-P. 283-93. 488. Ingram, W.J. ABC transporter activity linked to radiation resistance and molecular subtype in pediatric medulloblastoma./ W.J. Ingram, L.M. Crowther, E.B. Little [et al.] // Exp. Hematol. Oncol.-2013.-V.2,№1.-P. 26. 489. Joshi, A.D. Sodium ion channel mutations in glioblastoma patients correlate with shorter survival./ A.D. Joshi, D.W. Parsons, V.E. Velculescu [et al.] // Mol. Cancer.2011.-V.10.-P. 17. 490. Cuddapah, V.A., Sontheimer, H. Molecular interaction and functional regulation of ClC-3 by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) in human malignant glioma./ V.A. Cuddapah, H. Sontheimer // J. Biol. Chem.-2010.-V. 285,№15.P. 11188-96. 491. Bordey, A., Sontheimer H., Trouslard J. Muscarinic activation of BK channels induces membrane oscillations in glioma cells and leads to inhibition of cell migration./ A. Bordey, H. Sontheimer, J. Trouslard // J. Membr. Biol.-2000.-V.176,№1.-P. 31-40. 492. Ding, X. Essential role of TRPC6 channels in G2/M phase transition and development of human glioma./ X. Ding, Z. He, K. Zhou [et al.] // J. Natl. Cancer. Inst.2010.-V.102,№14.-P. 1052-68. 254 493. Tyler, M.A., Ulasov, I.V., Lesniak, M.S. Cancer cell death by design: apoptosis, autophagy and glioma virotherapy./ M.A. Tyler, I.V. Ulasov, M.S. Lesniak // Autophagy.-2009.-V.5,№6.-P. 856-7. 494. Jiang, H. Human adenovirus type 5 induces cell lysis through autophagy and autophagy-triggered caspase activity./ H. Jiang, E.J. White, C.I. Ríos-Vicil [et al.] // J. Virol.-2011.-V.85,№10.-P. 4720-9. 495. Gomez-Manzano, C. Fueyo, J. Oncolytic adenoviruses for the treatment of brain tumors./ C. Gomez-Manzano, J. Fueyo // Curr. Opin. Mol. Ther.-2010.-V.12,№5.-P. 530-7. 496. Kim, J. Double E1B 19 kDa- and E1B 55 kDa-deleted oncolytic adenovirus in combination with radiotherapy elicits an enhanced anti-tumor effect./ J. Kim, P.H. Kim, J.Y. Yoo [et al.] // Gene Ther.- 2009.-V.16,№9.-P. 1111-21. 497. Jiang, H. Adenovirus's last trick: you say lysis, we say autophagy./ H. Jiang, E.J. White, C. Gomez-Manzano [et al.] // Autophagy.-2008.-V.4,№1.-P. 118-20. 498. Abou El Hassan, M.A. Conditionally replicating adenoviruses kill tumor cells via a basic apoptotic machinery-independent mechanism that resembles necrosis-like programmed cell death./ M.A. Abou El Hassan, I. van der Meulen-Muileman, S. Abbas [et al.] // J. Virol.-2004.-V.78,№22.-P. 12243-51. 499. Nagelkerke, A. Therapeutic targeting of autophagy in cancer. Part I: Molecular pathways controlling autophagy./ A. Nagelkerke, F.C. Sweep, A. Geurts-Moespot [et al.] // Semin. Cancer. Biol.-2015.-V. 31,№C.-P. 89-98. 500. Nikoletopoulou, V., Papandreou, M.E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system./ V. Nikoletopoulou, M.E. Papandreou, N. Tavernarakis // Cell. Death. Differ.-2015.-V.22,№ 3.-P. 398-407. 501. Salminen, A. Impaired autophagy and APP processing in Alzheimer's disease: The potential role of Beclin 1 interactome./ A. Salminen, K. Kaarniranta, A. Kauppinen [et al.] // Prog, Neurobiol,- 2013.-V. 106-107.-P. 33-54. 255 502. Chaumorcel, M. The human cytomegalovirus protein TRS1 inhibits autophagy via its interaction with Beclin 1./ M. Chaumorcel, M. Lussignol, L. Mouna [et al.] // J .Virol.-2012.-V. 86,№5.-P. 2571-84. 503. Kaliberova, L.N. CRAdRGDflt-IL24 virotherapy in combination with chemotherapy of experimental glioma./ L.N. Kaliberova, V. Krendelchtchikova, D.K. Harmon// Cancer. Gene. Ther.-2009.-V.16,№10.-P. 794-805.
