Стимуляция активности опухолевого супрессора р53
advertisement
На правах рукописи ЗАХАРОВА Наталья Ильинична Стимуляция активности опухолевого супрессора р53 протимозином альфа 03.01.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на Факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова. Научный руководитель: доктор химических наук Евстафьева Александра Георгиевна Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Копылов Алексей Михайлович доктор биологических наук, профессор Рубцов Петр Михайлович Ведущая организация: Научно-исследовательский институт канцерогенеза ГУ РОНЦ имени Н.Н.Блохина РАМН Защита состоится «17» июня 2011 года в 12-00 на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Автореферат разослан «17» мая 2011 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А.Крашенинников ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние годы, пожалуй, ни один белок не изучался так интенсивно, как опухолевый супрессор р53. За треть века с момента его открытия р53 было посвящено более 50 тысяч научных работ, и их число неуклонно продолжает расти. Повышенное внимание к р53 определяется, прежде всего, тем, что он является ключевым регуляторным белком клетки, транскрипционным фактором, который активируется в ответ на различные клеточные стрессы, включая генотоксический стресс, и играет важную роль в защите от рака. Будучи «стражем целостности генома», р53 определяет дальнейшую судьбу клетки – произойдет ли остановка клеточного цикла для преодоления последствий стрессового воздействия или включится механизм программируемой клеточной смерти. Объектом наших исследований также является жизненно важный белок позвоночных протимозин альфа (ПроТα). ПроТα - это мультикопийный ядерный белок, относящийся к интереснейшему классу природных неструктурированных белков. Оказалось, что даже такой относительно простой белок является многофункциональным, способным участвовать в самых разнообразных процессах жизни и смерти клеток. Традиционно ПроТα считается онкобелком, он ускоряет клеточную пролиферацию и защищает клетки от апоптоза. Однако, неожиданно было обнаружено, что ПроТα стимулирует транскрипционную активность опухолевого супрессора р53, и таким образом, потенциально способен к проявлению анти-онкогенной активности. Онкобелки и онкосупрессоры иногда обладают дуалистическими функциями, в разных системах проявляя либо онкогенную, либо анти-онкогенную активность. Настоящая работа посвящена выяснению молекулярного механизма, с помощью которого онкобелок протимозин альфа стимулирует р53-зависимую транскрипцию. Понимание механизмов функционирования таких белков необходимо как для выяснения всех путей регуляции активности опухолевого супрессора р53, так и для создания рациональных способов диагностики онкологических заболеваний и антираковой терапии. Цели исследования: Целью настоящей работы было изучение механизмов стимуляции активности протимозином альфа опухолевого супрессора р53. Научная новизна и практическая значимость. В ходе данной работы обнаружено, что в клетках человека линий HeLa, HEK293, но не в HCT116 эктопическая экспрессия ПроТα стимулирует транскрипцию, регулируемую опухолевым супрессором р53. Когда мы получили эти данные, это был 1 совершенно новый, неописанный в литературе результат. Однако, вскоре была опубликована статья Кобаяши с соавт., в которой представлены аналогичные данные о стимуляции протимозином α активности опухолевого супрессора р53 в ряде клеточных линий, включая H1299, Saos-2, HepG2, A549, HEK293 и U2OS. При этом стимуляция р53регулируемой транскрипции отсутствовала в клетках HCT116, что совпадает с полученными нами результатами. В клетках HeLa исследования в работе Кобаяши с соавт. не проводились; механизм стимуляции активности р53 при повышении уровня ПроТα остался невыявленным. В работе Кобаяши с соавт. было показано, что этот механизм связан с рекрутированием гистоновых ацетилтрансфераз к р53-зависимым промоторам с последующим ацетилированием р53. Однако, ПроТα активирует транскрипцию не на всех, а на избранных промоторах. В частности, ПроТα стимулирует р53-зависимую транскрипцию, но не влияет на E2F- и Myc-зависимую транскрипцию. Механизм избирательного действия ПроТα на транскрипцию с разных промоторов оставался неясным и требовал дальнейшего изучения. Поэтому мы исследовали этот механизм, используя в качестве клеточной модели линию HeLa, в которой эффект ПроТα был наиболее выраженным. В настоящей работе впервые картирован участок ПроТα, ответственный за усиление р53-зависимой транскрипции. Им оказался центральный «кислый» район ПроТα наряду с NLS, расположенным в С-концевой области. Центральный район протимозина альфа ответственен за его взаимодействие с гистоном Н1. В 2008 году появились интересные данные о том, что гистон Н1 является специфическим ингибитором р53-зависимой транскрипции за счет прямого взаимодействия с р53 на промоторах его генов-мишеней. На основании этого мы предложили гипотезу, в соответствии с которой ПроТα может стимулировать р53регулируемую транскрипцию путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса с р53. В рамках тестирования этой гипотезы в диссертации впервые показано, что: (1) рекомбинантный ПроТα вытесняет р53 из его комплекса с гистоном Н1 in vitro; (2) эндогенный ПроТα интерферирует с взаимодействием гистона Н1 с р53 в лизатах клеток HeLa; (3) стимуляция р53-зависимой транскрипции протимозином альфа в клетках HeLa коррелирует со способностью этого белка взаимодействовать с гистоном Н1; (4) эктопическая экспрессия гистона Н1 специфически подавляет стимулирующий эффект ПроТα на р53-зависимую транскрипцию; (5) увеличение уровня ПроТα в клетке приводит к уменьшению количества гистона Н1, связанного с р53-зависимым промотором. Перечисленные результаты подтвердили предложенный 2 нами новый механизм стимуляции транскрипционной активности р53 путем вытеснения протимозином альфа гистона Н1 из репрессорного комплекса с р53. В данной работе также впервые показано, что при снижении уровня ПроТα происходит заметное снижение экспрессии тирозиновой протеинкиназы JAK1. Активация JAK1 протимозином альфа представляет большой интерес для выявления механизма иммуностимулирующего действия ПроТα, а также для теоретического обоснования его противоопухолевой активности при использовании в генной терапии. Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи. Материалы работы были представлены на международных конференциях «Ломоносов-2006» (Москва, 2006), «Ломоносов-2009» (Москва, 2009), «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), «Геномика и биология клетки» (Москва, Звенигород, 2010). Структура и объем работы. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 57 рисунками и 2 таблицами. Библиографический указатель включает 175 цитированных работы. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Влияние уровня протимозина альфа на транскрипционную активность опухолевого супрессора р53 В нашей лаборатории было показано, что протимозин альфа (ПроТα) участвует в регуляции ответа клетки на окислительный стресс. Он вытесняет транскрипционный фактор Nrf2 из комплекса с репрессором Keap1, тем самым активируя Nrf2 и позволяя ему накапливаться в ядре и индуцировать экспрессию генов антиоксидантных белков. В клетке существует другая транскрипционная система, p53-Mdm2, схожая с системой Nrf2-Keap1. Мы предположили, что активность онкосупрессора р53 может регулироваться протимозином α подобно тому, как ПроТα действует в системе Nrf2Keap1. Чтобы проверить эту гипотезу, мы изучили, как влияет изменение уровня ПроТα в клетках человека на р53-регулируемую транскрипцию. Повышение концентрации ПроТα в клетке было достигнуто с помощью эктопической экспрессии. Для снижения внутриклеточного уровня ПроТα использовали метод интерференции РНК. Для тестирования р53-зависимой транскрипции сконструировали репортерную плазмиду p53RE-luc, в которой ген люциферазы светлячков (luc) встроен под контроль р53-регулируемого промотора (рис. 1). 3 p21 ConA RGC Рис.1. Схема репортёрной плазмиды. р53-RE – участки ДНК, с которыми взаимодействует белок р53: элемент из области промотора гена ингибитора циклин-зависимых протеинкиназ (р21), консенсусная последовательность (СonA), элемент из кластера рибосомальных генов (RGC). Рcmv – цитомегаловирусный промотор; luc – ген люциферазы светлячков. 6 (P53-RE)8 Pcmv luc p53-RE-luc 1.1. Влияние суперпродукции протимозина α на уровень и активность p53 С целью изучения влияния сверхпродукции ПроТα на трансактивирующие свойства р53 протимозин α человека продуцировали в клетках HCT116, HeLa и HEK293 с использованием полученной ранее в нашей лаборатории плазмиды рНМ-ProTα. Внутриклеточную концентрацию ПроТα оценивали, воспользовавшись способностью этого белка оставаться в водной фазе при фенольной экстракции. Выделенные из трансфицированных клеток частично очищенные препараты ПроТα анализировали методом электрофореза (рис. 2Б). Количество клеточной тРНК служило внутренним контролем равного нанесения образцов. Было подтверждено, что в трансфицированных клетках уровень ПроТα существенно превышает уровень эндогенного белка (рис. 2Б). А Рис.2. Активация р53-зависимого репортёрного гена протимозином α. А. Изменение люциферазной активности, нормированной на β-галактозидазную активность, при эктопической экспрессии ПроТα (2) по сравнению с контрольными клетками (1). Нормированная люциферазная активность контрольных клеток принята за единицу. Б. Суперпродукция протимозина α в клетках HeLa. Частично очищенный ПроТα, выделенный из лизатов клеток, трансфицированных pHMПроТα (2) или пустым вектором pHM-B (1). К – рекомбинантный ПроТα (3 мкг). Приведён фрагмент 8% ПААГ, содержащего 7М мочевину, окрашенного метиленовым синим. Б тРНК ПроТα K 1 2 Оказалось, что сверхпродукция ПроТα в клетках HeLa стимулирует экспрессию р53-зависимого репортерного гена (рис. 2А). При этом экспрессия используемого для нормировки репортерного гена lacZ, находящегося под контролем конститутивного промотора во второй репортерной плазмиде рНМ-lacZ, существенно не менялась. Было показано, что увеличение активности р53 в клетках, суперэкспрессирующих ПроТα, 4 зависит от уровня продукции ПроТα и достигает максимального значения, превышающего в 4.2+/-0.8 раза активность р53 в контрольных клетках (рис. 2А). В клеточной линии HEK293 протимозин α также стимулировал экспрессию р53зависимого репортерного гена, но эффект был менее сильным, в то время как в клетках линии HCT116 этот эффект вообще не наблюдался (не показано). Оценку влияния внутриклеточного уровня ПроТα на количество р53 в клетке проводили методом иммуноблотинга. р53 47 р21 26 47 актин 1 Рис.3. Эктопическая экспрессия протимозина α приводит к увеличению уровня р53 в клетках HeLa. Иммуноблоты лизатов клеток HeLa, суперпродуцирующих ПроТα (2) или контрольных (1), с антителами анти-р53 (верхняя панель), анти-р21 (центральная панель), анти-актин (нижняя панель). Слева указаны положения маркёров молекулярной массы (кДа). 2 В клетках HeLa с суперпродуцированым ПроТα количество р53 возрастало по сравнению с его количеством в контрольных клетках, при этом параллельно увеличивался уровень одной из транскрипционных мишеней р53, ингибитора циклин-зависимых киназ р21, тогда как количество актина, используемого как контроль равного нанесения образцов, было неизменным (рис. 3). Следовательно, при повышении внутриклеточной концентрации ПроТα в клетках HeLa происходит возрастание уровня р53, коррелирующее с возрастанием его транскрипционной активности. 1.2. Влияние подавления экспрессии ПроТα с помощью интерференции РНК на транскрипционную активность опухолевого супрессора р53 С целью изучения влияния уровня эндогенного ПроТα на трансактивирующие свойства р53 уровень протимозина α человека в клетках HeLa был снижен методом интерференции РНК. Мы создали конструкцию pLS-siRNA33-53, кодирующую интерферирующую РНК, гомологичную участку 33-53 мРНК ПроТα, на основе лентивирусного вектора. С помощью этой конструкции получили лентивирусные частицы, ими инфицировали клетки HeLa, после чего проводили селекцию клеток с интегрированной в хромосому экспрессионной кассетой с помощью пуромицина. Внутриклеточный уровень ПроТα в отселектированных клетках детектировали с помощью электрофоретического анализа (рис. 4Б), также было оценено количество мРНК ПроТα с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР (рис. 4В). Оказалось, что внутриклеточная концентрация ПроТα в этих клетках снижена по сравнению с 5 контрольными клетками, инфицированными пустым лентивирусным вектором (рис. 4Б). Аналогичная картина наблюдается и с мРНК ПроТα (рис. 4В). Таким образом, клеточная линия с пониженным уровнем ПроТα была получена. Эти клетки трансфицировали репортерными плазмидами и измеряли базальную транскрипцию p53-зависимого репортерного гена. Оказалось, что при снижении концентрации ПроТα в клетке уменьшается транскрипционная активность эндогенного р53 (рис. 4А). Этот эффект оказался не очень сильным, но статистически значимым. Следовательно, эксперименты по интерференции РНК подтверждают результаты, полученные с помощью эктопической экспрессии ПроТα. Внутриклеточный уровень ПроТα оказывает влияние на активность р53 в клетках HeLa. А K Б 1 2 В 1 2 тРНК ПроТα п ПроТα п ГАФД Рис.4. Специфичная к протимозину α интерференция РНК приводит к снижению экспрессии р53зависимого репортёрного гена. А. Люциферазная активность, нормированная на β-галактозидазную активность, в клетках HeLa, инфицированных пустым лентивиручным векторм (1) или вектором, кодирующим siRNA к ПроТα (2), и трансфицированных репортерными плазмидами p53-RE-luc и pHM-lacZ. Б. Частично очищенный ПроТα, выделенный из лизатов клеток HeLa, инфицированных пустым лентивирусным векторм (1) или вектором, кодирующим siRNA к ПроТα (2). К – рекомбинантный ПроТα (0,5 мкг). Приведён фрагмент 8% ПААГ, содержащего 7М мочевину, окрашенного метиленовым синим. В. Электрофорез в агарозном геле продуктов ОТ-ПЦР с праймерами, специфичными к кДНК протимозина α (верхняя панель), и с праймерами, специфичными к кДНК глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФД), в качестве контроля (нижняя панель). В качестве матрицы использовали кДНК, полученную после обратной транскрипции суммарной РНК, выделенной из клеток HeLa, инфицированных пустым лентивирусным векторм (1) или вектором, кодирующим siRNA к ПроТα (2). 6 2. Исследование механизма стабилизации и активации опухолевого супрессора р53 протимозином альфа Итак, ПроТα стимулирует р53-зависимую генную экспрессию и приводит к повышению внутриклеточной концентрации р53 в клетках карциномы шейки матки человека HeLa. Так как в клетках HeLa регуляция р53 не зависит от Mdm2, наше исходное предположение, что ПроТα может разрушать комплекс р53-Mdm2 и, таким образом, стимулировать р53-зависимую транскрипцию, было маловероятным. Для изучения механизма активации опухолевого супрессора р53 протимозином альфа был его пост- проанализирован ряд возможных путей активации р53 в клетках. 2.1. Роль пост-трансляционного фосфорилирования р53 Стабилизация и активация р53 часто являются следствием трансляционных модификаций. Так, при генотоксическом стрессе происходит каскад фосфорилирований р53 по остаткам серина и треонина, причем ключевой модификацией является фосфорилирование по Ser15. С целью проверки роли фосфорилирования в стабилизации р53 при повышении уровня ПроТα в клетках HeLa с суперпродукцией ПроТα оценивали уровень фосфорилированного по Ser15 р53 с помощью специфических к этой модификации антител (рис. 5). Рис.5. Эктопическая экспрессия протимозина α не приводит к увеличению уровня фосфорилированного по Ser15 р53 в клетках HeLa. Иммуноблоты лизатов клеток HeLa, суперпродуцирующих ПроТα (Р) или трансфицированных пустым вектором (В), с антителами анти-рр53 (Ser15) (верхняя панель), анти-р53 (центральная панель), антиактин (нижняя панель). В качетстве контролей использовали лизаты клеток HeLa, обработанных доксорубицином (Dox) и без обработки (С). В то время как в клетках HeLa, обработанных индуктором генотоксического стресса доксорубицином, удалось детектировать достаточно интенсивную полосу фосфорилированного по Ser15 белка р53 (рис. 5), в клетках с эктопической экспрессией ПроТα этой модификации обнаружено не было. С помощью антител, узнающих Nконцевой эпитоп р53, показано, что уровень р53 в том же самом образце превышает его уровень в контрольных клетках, трансфицированных пустым вектором. Следовательно, механизм активации р53 при повышении внутриклеточной концентрации ПроТα отличается от механизма его активации при ответе на генотоксический стресс. При помощи аналогичных опытов мы исследовали фосфорилирование р53 по остатку Ser392. Известно, что эта модификация усиливает способность р53 к образованию 7 тетрамера, а также его ДНК-связывающие свойства. Однако, возрастания количества фосфорилированного р53 при повышении уровня ПроТα в клетках HeLa обнаружено не было. Следовательно, ПроТα способствует активации р53 по какому-то иному механизму. 2.2. Роль р14 ARF в активации р53 При экспрессии онкобелков нарушение взаимодействия р53 с Mdm2 обуславливается повышением экспрессии белка p14 ARF, который связывает и тем самым ограничивает количество свободного Mdm2, что приводит к стабилизации и накоплению р53. Несмотря на то, что в клетках HeLa регуляция р53 посредством Mdm2 сведена к минимуму, интересно было посмотреть, не меняется ли уровень экспрессии p14 ARF при увеличении уровня ПроТα в клетке. Иммуноблотингом со специфичными к p14 ARF антителами показано, что количество p14 ARF в клетках с суперпродукцией ПроТα не возрастает (рис. 6). Рис.6. Эктопическая экспрессия протимозина α не приводит к увеличению уровня p14 ARF в клетках HeLa. Иммуноблоты лизатов клеток HeLa, суперпродуцирующих ПроТα (Р) или трансфицированных пустым вектором (В), с антителами анти-ARF (верхняя панель), анти-актин (нижняя панель). Следовательно, влияние ПроТα на транскрипционную активность р53 не связано с участием p14 ARF в этом процессе. 2.3. Гипотеза о стабилизации р53 протимозином альфа путем защиты от деградации в 20S протеосомах Защита р53 от убиквитин-независимой деградации в системе 20S протеасом осуществляется с помощью ферментов NQO1 и NQO2, которые непосредственно взаимодействуют с белком р53 и стабилизируют его. Ингибитор NQO1 дикумарол и ингибитор NQO2 резвератрол нарушают связывание соответствующих ферментов с р53, что приводит к деградации р53. Экспрессия NQO1 находится под контролем регуляторного элемента ARE, с которым связывается транскрипционный фактор Nrf2. Так как ПроТα взаимодействует с белком Keap1, ингибитором Nrf2, он может регулировать внутриклеточный уровень NQO1. Чтобы выяснить, не участвует ли эта система в регуляции р53 при изменении внутриклеточного уровня ПроТα, тестировали влияние дикумарола на транскрипцию р53регулируемого репортерного гена при эктопической экспрессии ПроТα. Оказалось, что дикумарол примерно в одинаковой степени 8 понижает как базальный, так и стимулированный протимозином α уровень р53-зависимой транскрипции. При этом степень активации р53 протимозином α существенным образом не меняется (рис. 7). Рис.7. Влияние дикумарола на транскрипцию р53-регулируемого репортерного гена при эктопической экспрессии ПроТα. Изменение люциферазной активности, нормированной на β-галактозидазную активность, при эктопической экспрессии ПроТα в клетках HeLa, обработанных дикумаролом. Цветом обозначены: светло-серым – клетки, трансфицированные пустым вектором; темно-серым - клетки с суперпродукцией ПроТα. Аналогичными экспериментами было показано, что ингибитор NQO2 резвератрол не оказывает существенного влияния на базальный и активированный протимозином α уровень экспрессии р53-регулируемого репортерного гена. На основании полученных результатов можно сделать вывод, что активация р53 при повышении внутриклеточной концентрации ПроТα не опосредована предотвращением его деградации в 20S протеасомах посредством NQO1 и NQO2. 3. Локализация структурных детерминант протимозина альфа, ответственных за активацию р53 Для того, чтобы понять механизм стимуляции активности р53 протимозином альфа, мы картировали участок в ПроТα, ответственный за усиление транскрипции р53регулируемого репортерного гена. 3.1. Роль сигнала ядерной локализации В клетках HeLa было исследовано влияние эктопической экспрессии ряда делеционных и точечных мутантов по С-концевой части ПроТα на транскрипцию р53зависимого репортерного гена (рис. 8). Оказалось, что делеция десяти С-концевых остатков значительно снижала способность ПроТα(1-99) активировать р53-зависимую транскрипцию (рис. 9). Так как в результате делеции ПроТα теряет С-концевой фрагмент, содержащий блок KKQK104, являющийся частью двухчастного сигнала ядерной локализации (NLS), вероятной причиной наблюдаемого эффекта является нарушение активного транспорта ПроТα в ядро. 9 Рис.8. Схема точечных и С-концевых делеционных мутантов ПроТα. Серым цветом выделена область ПроТα, обогащенная дикарбоновыми аминокислотными остатками. NLS – сигнал ядерной локализации T-антигена вируса SV40. Степень активации р53 оценена значками: (+) – более 75%, (-) – менее 25% относительно степени активации полноразмерным ПроТα. Чтобы убедиться в правильности этого заключения, было проведено два эксперимента. Во-первых, в клетках HeLa был продуцирован мутант ПроТα K87E, у которого мутация внесена в другой блок основных аминокислотных остатков K87R, входящий в двухчастный NLS ПроТα. Активный транспорт в ядро этого мутанта ПроТα нарушен, но С-концевой пептид (100-109) не изменен по сравнению с белком дикого типа. Оказалось, что мутация K87E также снижает способность ПроТα активировать р53зависимую транскрипцию (рис. 9). Следовательно, на С-конце ПроТα находится детерминанта, необходимая для его стимулирующего действия на р53-зависимую генную экспрессию, – сигнал ядерной локализации. Рис.9. Влияние точечных мутаций и С-концевых делеций в ПроТα на его способность активировать р53-регулируемый репортерный ген. Клетки HeLa были трансфицированы смесью репортерных плазмид р53RE-luc (0.15 мкг), pHM-lacZ (0.25 мкг) и 1,6 мкг плазмиды для экспрессии указанных производных ПроТα. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люциферазной активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции. 10 Во втором эксперименте в клетках продуцировали ПроТα(1-99), к N-концу которого был присоединен NLS Т-антигена вируса SV40 (TNLS). Оказалось, что такой химерный белок активирует р53-зависимый репортер почти так же эффективно, как контрольный полноразмерный ПроТα с присоединенным к N-концу NLS Т-антигена вируса SV40 (рис. 9). Это указывает на то, что на С-конце протимозина альфа расположена только одна детерминанта, важная для активации р53-зависимой транскрипции, - сигнал ядерной локализации. 3.2. Роль взаимодействия протимозина альфа с Keap1 Недавно при скрининге клонотеки siRNA было обнаружено, что экспрессия siRNA, специфичной к мРНК белка Keap1, приводит к активации р53-зависимой транскрипции в клетках HeLa. Следовательно, можно было предположить, что Keap1 функционирует как один из ингибиторов р53, например, за счет его способности направлять белки на протеасомную деградацию. Так как Keap1 взаимодействует с ПроТα, повышение внутриклеточного уровня ПроТα должно приводить к уменьшению концентрации свободного Keap1 и, как следствие, к активации р53. Чтобы проверить, не является ли это механизмом наблюдаемой нами стимуляции экспрессии р53-зависимого репортера протимозином α, в клетках HeLa был продуцирован двойной мутант ПроТα E44,50G, который потерял способность взаимодействовать с белком Кеар1. Однако, оказалось, что мутации E44,50G не уменьшают способности ПроТα стимулировать экспрессию р53зависимого репортерного гена (рис. 9). Следовательно, взаимодействие ПроТα с Keap1 не играет роли в наблюдаемой нами стимуляции р53-зависимой транскрипции. 3.3. Роль N-концевой части протимозина альфа Чтобы тестировать роль N-концевой части ПроТα в стимуляции р53-зависимой транскрипции, в клетках HeLa были продуцированы мутанты ПроТα с N-концевыми и внутренними делециями (рис. 10). Рис.10. Схема мутантных форм ПроТα с N-концевыми и внутренними делециями. Серым цветом выделены области ПроТα, обогащенные дикарбоновыми аминокислотными остатками. Черным цветом выделен гексагистидиновый тэг и эпитоп X-press, закодированные в векторе. Степень активации р53 оценена значками: (+) - более 75%, (-) - менее 25% относительно степени активации полноразмерным ПроТα. 11 В отличие от С-концевой делеции, удаление N-концевой части протимозина не препятствовало его способности активировать р53-зависимую транскрипцию. Так, ПроТα (32-109) с делецией 31 N-концевых аминокислоты сохранил способность активировать экспрессию р53-регулируемого репортерного гена (рис. 11). Рис.11. Влияние делеции N-конца ПроТα на его способность активировать р53регулируемый репортерный ген. Клетки HeLa были трансфицированы смесью репортерных плазмид р53RE-luc (0.15 мкг), pHMlacZ (0.25 мкг) и 1,6 мкг плазмиды для экспрессии указанных белков. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люциферазной активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции. Чтобы протестировать роль фрагмента ПроТα (32-51) в активации р53, были сконструированы два мутанта с короткими внутренними делециями в этой области, ПроТα Δ(33-43) и ПроТα Δ(44-51). Оказалось, что оба мутанта сохранили способность активировать экспрессию р53-регулируемого репортерного гена (рис. 12). Рис.12. Влияние делеции в N-концевой области ПроТα на его способность активировать р53-регулируемый репортерный ген. Клетки HeLa были трансфицированы смесью репортерных плазмид р53RE-luc (0.15 мкг), pHM-lacZ (0.25 мкг) и 1,6 мкг плазмиды для экспрессии указанных белков. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люциферазной активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции. Таким образом, делеции в N-концевой половине ПроТα не влияют на его способность активировать p53-зависимую транскрипцию. 3.4. Роль центральной области протимозина альфа Центральная часть ПроТα представляет собой «кислый» блок, состоящий в основном из остатков дикарбоновых аминокислот. Её роль в стимуляции р53-зависимой транскрипции изучали с помощью мутантов, содержащих внутренние делеции (рис. 13). 12 Рис.13. Схема мутантных форм ПроТα с делециями в центарльной «кислой» области. Серым цветом выделены области ПроТα (и паратимозина), обогащенные дикарбоновыми аминокислотными остатками. Черным цветом выделен гексагистидиновый тэг и эпитоп X-press, закодированные в векторе. Степень активации р53 оценена значками: (+) - более 75%, (-) - менее 25%, (-/+) - 25-75% относительно степени активации полноразмерным ПроТα. Удаление пятнадцати аминокислотных остатков, расположенных в центральной области протимозина α, Δ(53-67), привело к частичному снижению, а удаление всей центральной «кислой» области Δ(32-81) - к практически полному исчезновению способности ПроТα активировать экспрессию р53-регулируемого репортерного гена (рис. 14). Рис.14. Влияние делеции в центральной области ПроТα на его способность активировать р53регулируемый репортерный ген. Клетки HeLa были трансфицированы смесью репортерных плазмид р53REluc (0.15 мкг), pHM-lacZ (0.25 мкг) и 1,6 мкг плазмиды для экспрессии указанных белков. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люциферазной активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции. На основании полученных данных можно предположить, что центральный район ПроТα, состоящий из отрицательно заряженных аминокислотных остатков Glu и Asp, наряду с интактным двухчастным NLS, расположенным в С-концевой области, отвечает за способность этого белка стимулировать р53-зависимую транскрипцию. Чтобы проверить возможность активации р53-зависимой транскрипции посредством блоков дикарбоновых аминокислотных остатков, мы продуцировали в клетках HeLa другой белок, содержащий подобные «кислые» последовательности и двухчастный NLS, паратимозин. Оказалось, что паратимозин также способен активировать экспрессию р53-зависимого репортерного гена (рис. 15), причем примерно в той же степени, что и ПроТα. 13 Рис.15. Влияние паратимозина на активность р53-регулируемого репортерного гена. Клетки HeLa были трансфицированы смесью репортерных плазмид р53RE-luc (0.15 мкг), pHMlacZ (0.25 мкг) и 1,6 мкг плазмиды для экспрессии указанных белков. Для негативного контроля использовали пустой вектор рНМ-В (вектор). Приведены значения нормированной люциферазной активности клеточных лизатов через 40 часов после трансфекции. Итак, результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что центральный «кислый» район ПроТα наряду с NLS, расположенным в С-концевой области, отвечает за способность этого белка стимулировать р53-зависимую транскрипцию. 4. Роль гистона Н1 в регуляции активности р53 протимозином α Известно, что центральная «кислая» область ПроТα, ответственная за стимуляцию р53-зависимой транскрипции, вовлечена также во взаимодействие с гистоновыми ацетилтрансферазами и гистонами, в частности, с линкерным гистоном Н1. Гистон Н1 долгое время считался глобальным репрессором транскрипции. Однако, более новые данные свидетельствуют о том, что гистон Н1 регулирует экспрессию далеко не всех, а только некоторых генов, и в частности, генов-мишеней р53. Показано, что один из субтипов гистона Н1, гистон Н1.2, вместе с набором клеточных белковых кофакторов образует репрессорный комплекс, который связывается с р53 и ингибирует р53зависимую транскрипцию. По-видимому, при этом происходит прямое взаимодействие гистона Н1 с р53, блокирующее опосредованное гистоновыми ацетилтрансферазами CBP/р300 ацетилирование хроматина на р53-зависимых промоторах. ПроТα не взаимодействует напрямую с р53, однако способен связываться с гистоном Н1, который, в свою очередь, взаимодействует с р53 и подавляет его транскрипционную активность. К тому же в нашей лаборатории было показано, что ПроТα и р53 взаимодействуют с одним и тем же С-концевым доменом гистона Н1, что свидетельствует о возможной конкуренции ПроТα и р53 за связывание с гистоном Н1. Следовательно, ПроТα мог бы стимулировать р53-зависимую транскрипцию путем разрушения репрессорного комплекса р53-гистон Н1. Было решено проверить эту гипотезу экспериментально. 4.1. ПроТα диссоциирует комплекс р53-гистон Н1 С целью проверить, может ли ПроТα вытеснять гистон Н1 из комплекса с р53, был применен метод GST pull-down assay. Рекомбинантный гистон Н1 слитый с глутатион-S- 14 трансферазой (GST) продуцировали в бактериальных клетках и выделяли аффинной хроматографией на глутатион-сефарозе (рис. 16). Рис.16. Электрофоретический анализ рекомбинантного гистона Н1 слитого с глутатион-S-трансферазой (GST), выделенного из бактериальных клеток. Электрофоретический анализ в ДСН-ПААГ иммобилизованных на глутатион-сефарозе GST и GST-H1, гель окрашивали красителем Кумасси. Связанный с глутатион-сефарозой белок инкубировали с содержащим р53 клеточным лизатом. Внутриклеточный уровень р53 в клетках HeLa был повышен посредством обработки доксорубицином. Количество связавшегося р53 анализировали иммуноблотингом с использованием соответствующих антител. Оказалось, что p53 связывается только с GST-H1, но не с GST (рис. 17). При этом количество p53, связанного с иммобилизованным гистоном Н1, возрастало при деплетировании ПроТα с помощью специфичных антител из лизата клеток, используемого в качестве источника р53 (рис. 17А, сравнить дорожки 4 и 2). И напротив, добавление экзогенного ПроТα приводило к диссоциации комплекса гистон Н1p53 (рис. 17А, дорожка 5). Б А Рис.17. Взаимодействие p53-гистон H1 зависит от уровня ПроТα в клеточном лизате. А. Иммобилизованные на глутатион-сефарозе GST-H1 (2, 4, 5) или GST (1, 3) инкубировали с лизатом клеток HeLa, обработанных доксорубицином (лизат HeLa/Dox), или аналогичным лизатом с деплетированным ПроТα (лизат (- ПроТα)). После интенсивных промывок связавшиеся со смолой белки анализировали иммуноблотингом с антителами к p53. В опыте по конкуренции рекомбинантный ПроТα (10 мкг) был добавлен к лизату с деплетированным ПроТα (5). 6, 7 - 15% аликвоты соответствующих лизатов. Б. Электрофоретический анализ частично очищенных препаратов ПроТα, выделенных из лизатов клеток HeLa или лизатов после деплетирования ПроТα. Приведен фрагмент 8% денатурирующего ПААГ, окрашенного метиленовым синим. На рисунке обозначены положения клеточной тРНК и ПроТα. тРНК, присутствующая в препарате, служит контролем равного нанесения образцов на гель. Чтобы проверить, действительно ли ПроТα может вытеснять р53 из сформированного комплекса гистон Н1-p53, связанный с матриксом комплекс был обработан рекомбинантным ПроТα. Количество перешедшего в раствор и оставшегося связанным со 15 смолой р53 анализировали иммуноблотингом. ПроТα дозозависимо диссоциировал р53 из комплекса с гистоном Н1 в полном соответствии с нашими предположениями (рис. 18). При обработке комплекса буфером связывания в элюатах были обнаружены только следовые количества р53. Рис.18. ПроТα вытесняет р53 из комплекса р53-гистон Н1. Иммобилизованный комплекс р53-гистон H1 инкубировали с указанными количествами ПроТα в 30 мкл буфера связывания в течение 1 часа при 6ºC. Количество p53, элюированного в раствор (Диссоциированный) и оставшегося связанным со смолой (Связанный с H1), анализировали иммуноблотингом с антителами к р53. Эти данные указывают на то, что ПроТα конкурирует с р53 за связывание с гистоном Н1 и что эндогенный ПроТα может ингибировать образование комплекса р53-гистон Н1 в суммарном клеточном лизате. В подтверждение этой гипотезы в нашей лаборатории с помощью делеционного мутагенеза ПроТα было показано, что укороченные белки ПроТα(52-109) и ПроТα(1-82), способные эффективно взаимодействовать с гистоном Н1, как и полноразмерный ПроТα, эффективно вытесняли р53 из комплекса с гистоном Н1, тогда как укороченный ПроТα(1-52), неспособный взаимодействовать с гистоном Н1, этим свойством не обладал. Таким образом, центральная «кислая» область ПроТα, содержащая аминокислотные остатки 52-82, действительно отвечает за взаимодействие с гистоном Н1. Следовательно, только способный взаимодействовать с гистоном Н1 протимозин альфа вытесняет р53 из комплекса с гистоном Н1 (рис. 19). Рис.19. ПроТα и его мутанты, способные взаимодействовать с гистономН1, вытесняют р53 из комплекса р53-гистон Н1. Схематическое изображение мутантных форм ПроТα. Серым выделена область ПроТα, обогащенная остатками дикарбоновых аминокислот. Сигнал ядерной локализации (NLS) выделен черным. 4.2. Стимуляция р53-зависимой транскрипции коррелирует со способностью ПроТα взаимодействовать с гистоном Н1 Как было показано ранее, суперпродукция ПроТα человека в клетках HeLa стимулирует экспрессию р53-зависимого репортерного гена. Чтобы выяснить, какую роль 16 в этом играет взаимодействие ПроТα-гистон Н1, были сконструированы два новых делеционных мутанта ПроТα, отличающиеся по способности взаимодействовать с гистоном Н1, и было исследовано влияние этих мутантов на р53-зависимую транскрипцию. Рис.20. Схема делеционных мутантов ПроТα, использованных в экспериментах. Серым цветом выделена область ПроТα, обогащенная дикарбоновыми аминокислотными остатками. Сигнал ядерной локализации (NLS) выделен черным. Так как за взаимодействие с гистоном Н1 отвечает центральная часть ПроТα (ак 5282), исследовали необходимость этого фрагмента для стимуляции р53-зависимой транскрипции и его достаточность (в сочетании с двухчастным NLS, ак 87-104). Делеционный мутант ПроТα ∆(7-51), почти полностью лишенный N-концевой половины белка, но содержащий центральную «кислую» область и NLS (рис. 20), стимулировал р53-зависимую транскрипцию так же, как и полноразмерный ПроТα (рис. 21). Рис.21. Влияние удаления N-концевой половины на способность ПроТα активировать p53-регулируемый репортерный ген. Люциферазная активность лизатов клеток HeLa после трансфекции репортерными плазмидами и либо пустым вектором (вектор), либо плазмидами, экспрессирующими ПроТα Δ(751) или ПроТα с His-тэгом. Напротив, ПроТα ∆(53-81) с делетированным центральным «кислым» участком (рис. 20) терял способность активировать р53 (рис. 22). Рис.22. Влияние удаления центральной области на способность ПроTα активировать p53-регулируемый репортерный ген. Люциферазная активность лизатов клеток HeLa после трансфекции репортерными плазмидами и либо пустым вектором (вектор), либо плазмидами, экспрессирующими ПроТα или ПроТα Δ(53-81). Таким образом мы можем сделать вывод о том, что стимуляция р53-зависимой транскрипции коррелирует со способностью ПроТα взаимодействовать с гистоном Н1. 17 4.3. Эктопическая экспрессия гистона Н1 предотвращает стимуляцию р53-зависимой транскрипции протимозином альфа Если стимулирующий эффект ПроТα на р53-регулируемую транскрипцию зависит от его взаимодействия с гистоном Н1, ведущего к диссоциации репрессорного комплекса р53-Н1, то эктопическая экспрессия гистона Н1 должна препятствовать этому эффекту. Это предсказание проверяли с помощью р53-зависимого репортера. Гистон Н1 с тэгом Хpress экспрессировали в клетках HeLa. Как и ожидалось, суперпродукция ПроТα стимулировала экспрессию р53-регулируемого репортерного гена. В то же время коэкспрессия гистона Н1 с ПроТα, как оказалось, дозозависимо подавляла этот эффект ПроТα (рис. 23). Рис.23. Влияние эктопической экспрессии гистона H1 на стимулированную протимозином α p53зависимую транскрипцию. Люциферазная активность лизатов клеток HeLa после трансфекции смесью репортерных плазмид, 1.1 мкг либо pHM-ПроТα (столбики темно-серого цвета), либо пустого вектора (столбики светло-серого цвета), и указанными количествами pHM-H1.0. Эктопическую экспрессию гистона Н1.0 с Xpress-эпитопом анализировали имммуноблотом с антителами, специфичными к Xpress. На активированную доксорубицином транскрипцию р53-регулируемого репортерного гена влияние эктопической экспрессии гистона Н1 оказалось незначительным. Это свидетельствует о том, что супрессирующий эффект гистона Н1, по-видимому, специфичен для стимулирующего активность р53 действия ПроТα. Следует отметить, что эктопическая экспрессия гистона Н1 снижала также базальный уровень транскрипции р53-регулируемого репортера, причем примерно в той же степени, что и понижение уровня ПроТα методом интерференции РНК (рис. 24). Рис.24. Эктопическая экспрессия гистона H1 снижает базальный уровень транскрипции р53регулируемого репортера в той же степени, что и понижение уровня ПроТα методом интерференции РНК. Люциферазная активность лизатов клеток HeLa после трансфекции смесью репортерных плазмид и либо пустым вектором (вектор), либо плазмидой, экспрессирующей гистон H1.2 (гистон H1) и лизата клеток HeLa с пониженным методом интерференции РНК уровнем ПроТα, трансфицированных смесью репортерных плазмид (ПроТα siRNA). 18 Это косвенно свидетельствует в пользу предположения, что эндогенный ПроТα вовлечен в повышение базального уровня р53-зависимой транскрипции за счет диссоциации репрессорного комплекса с гистоном Н1. Полученные результаты свидетельствуют о том, что уровень стимуляции р53регулируемой транскрипции протимозином альфа зависит от внутриклеточной концентрации гистона Н1 и подтверждают модель, в соответствии с которой ПроТα усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса р53-гистон Н1. 4.4. Влияние увеличения уровня ПроТα в клетке на количество гистона Н1 на р53зависимом промоторе Следующим шагом стала проверка того, что предполагаемое вытеснение протимозином α гистона Н1 из супрессорного комплекса с р53 действительно происходит в живой клетке на промоторах р53-зависимых генов. Для этого нужно было детектировать гистон Н1, связанный с хроматином, и сравнить его количества на р53-зависимом промоторе при суперпродукции ПроТα и без нее. Для решения этой задачи мы воспользовались методом иммунопреципитации хроматина (ChIP - Chromatin Immuno Precipitation). Количество р53-узнающих участков ДНК в преципитатах с антителами к гистону Н1.2 сравнивали при помощи ПЦР «в реальном времени» с использованием специфичных праймеров к участку связывания р53 из промотора его гена-мишени р21 (p21-p53RE1). Оказалось, что увеличение уровня ПроТα в клетке приводит к статистически достоверному уменьшению количества гистона Н1.2 связанного с фрагментами ДНК, содержащими р53-зависимый промотор (рис. 25). p21-p53RE1* - + 18S рДНК - + ПроТα Рис.25. Увеличение уровня ПроТα приводит к снижению количества гистона Н1.2 на р53-зависимом промоторе. Количественную оценку связывания гистона H1.2 с р53-узнающим элементом промотора гена CDKN1A (p21-р53RE1) или с участком ДНК, кодирующим рибосомную 18S РНК (18S рДНК) в клетках HeLa, суперпродуцирующих ПроТα или контрольных, проводили методом ChIP с последующей ПЦР «в реальном времени». * - разница статистически достоверна по критерию Стьюдента (P value 0.0003). Количество гистона Н1.2, связанного с контрольным, кодирующим 18S рРНК, участком хроматина, также было снижено при суперпродукции ПроТα, но эффект был менее выраженным и недостоверным (рис. 25). 19 Эти опыты указывают на то, что повышение уровня ПроТα в клетке может приводить к вытеснению некоторой фракции гистона Н1 с самых разных участков хроматина. Важно, что вытеснение протимозином α гистона Н1, связанного с р53-зависимым промотором, показано достоверно. Специфичность действия ПроТα в данном случае не определяется тем, что ПроТα диссоциирует гистон Н1 только с р53-узнающих участков ДНК (это, видимо, не соответствует действительности). Она определяется тем, что вытеснение протимозином α гистона Н1 с р53-зависимых промоторов должно приводить к разрушению репрессорного комплекса, и, как следствие, активации транскрипции геновмишеней р53, но не влияет на транскрипцию большинства других генов. Таким образом, результаты метода ChIP подтверждают гипотезу о том, что ПроТα усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса р53-гистон Н1 на промоторах р53-зависимых генов. 4.5. Модель стимуляции протимозином α транскрипционной активности р53 На основании полученных результатов мы предлагаем модель, в соответствии с которой ПроТα усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса р53-гистон Н1 (рис. 26). Рис.26. Предполагаемая модель усиления транскрипционной активноси р53 протимозином α путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного косплекса р53-гистон Н1. Эта модель хорошо согласуется с данными Кобаяши с соавт., что механизм стимулиующего эффекта ПроТα включает рекрутирование гистоновых ацетилтрансфераз CBP/р300 к промоторам генов-мишеней р53. Ранее было показано, что репрессорный комплекс гистона Н1 ингибирует опосредованное р300 ацетилирование хроматина; 20 предполагается, что роль гистона Н1 состоит в связывании регуляторных факторов, которые предотвращают р53-зависимое рекрутирование СВР/р300 к промоторам. Следовательно, частичное удаление гистона Н1 с р53-регулируемых промоторов протимозином альфа может восстанавливать связывание СВР/р300 с промоторами, ведущее к ацетилированию р53 и стимуляции р53-зависимой транскрипции. Можно предположить возможную биологическую роль такого регуляторного механизма. Известно, что экспрессия р53-зависимых генов регулируется на многих уровнях, одним из многочисленных способов такой регуляции служит подавление транскрипции репрессорным комплексом гистона Н1. Так как риск раковой трансформации особенно велик для активно пролиферирующих клеток, в таких клетках предпочтительно держать р53 в дерепрессированном состоянии для возможности быстрой активации р53 при поступлении тревожного сигнала. Возможно, высокий уровень ПроТα в активно пролиферирующих клетках обеспечивает частичное освобождение р53 от репрессии гистон Н1-содержащим комплексом. 5. Экспрессия тирозиновой протеинкиназы JAK1 зависит от уровня протимозина α в клетках HeLa Был проведен дифференциальный анализ транскрипции генов человека на микроматрицах при суперпродукции ПроТα в клетках линии HeLa и при снижении его уровня посредством РНК интерференции. Для этого использовались клеточная линия с пониженной методом интерференции РНК экспрессией ПроТα и клеточная линия с суперпродукцией ПроТα, полученная в нашей лаборатории с помощью лентивирусного вектора pLCMV-ПроТα-neo. Контрольные клеточные линии для обоих случаев были инфицирована «пустым» лентивирусным вектором. Уровень ПроТα в этих клеточных линиях оценивали с помощью электрофоретического анализа частично очищенных препаратов ПроТα (рис. 27). Рис.27. Сверхпродукция ПроТα и специфичная к ПроТα интерференция РНК в клеточных линиях, используемых для дифференциального анализа транскрипции генов человека на микроматрицах. Электрофоретический анализ частично очищенных препаратов ПроТα, выделенных из лизатов клеток, инфицированных пустым лентивирусным вектором pLCMV-neo (1), вектором pLCMV-ПроТα-neo для экспрессии ПроТα (2), вектором pLS-siRNA33-53 для экспрессии siRNA (4), пустым лентивирусным вектором pLS-Lpw (5). На дорожке 3 нанесен рекомбинантный ПроТα (0,5 мкг) в качестве маркера. Приведен фрагмент 8% ПААГ, содержащего 7М мочевину, окрашенного метиленовым синим. Положения клеточной тРНК и ПроТα указаны. 21 Выделенная из каждой клеточной линии суммарная РНК была далее использована для получения соответствующих зондов, которые гибридизовали с микрочипами Affymetrix в специализированной лаборатории. Каждая микроматрица содержала 54 тысячи последовательностей, соответствующих почти полному набору генов человека, причем некоторые гены были представлены двумя или более последовательностями. Для каждого гена сравнивали сигналы от опытного и контрольного зондов после соответствующей нормировки. Учитывая величины этих эффектов и степень их достоверности, был отобран ряд генов-кандидатов для дальнейшего исследования. Самым достоверным и интересным из выявленных кандидатов нам представляется Janus kinase 1 (JAK1). JAK1 – это тирозиновая протеинкиназа, компонент клеточного сигнального пути JAK-STAT. Этот путь передачи сигналов определяет клеточный ответ на действие цитокинов и факторов роста и играет ключевую роль в выборе дальнейшего пути клетки, регулируя процессы пролиферации, дифференцировки или апоптоза. Выявленные с помощью микрочиповой технологии эффекты влияния уровня ПроТα на экспрессию JAK1 были проверены с помощью метода ПЦР «в реальном времени». Было показано, что при снижении уровня ПроТα происходит заметное снижение экспрессии JAK1 (рис. 28), тогда как при суперпродукции ПроТα достоверных изменений обнаружено не было. Эти результаты подтверждают данные, полученные с помощью микрочипов. Рис.28. Снижение уровня ПроТα приводит к снижению уровня мРНК JAK1 в клетках HeLa. Из клеток HeLa, с пониженным методом интерференции РНК уровнем ПроТα (столбики темно-серого цвета) и контрольных (столбики светло-серого цвета), выделяли суммарную РНК, с помощью обратной транскрипции получали кДНК. Приведена количественная обработка результатов ПЦР «в реальном времени» с праймерами, специфичными к мРНК ПроТα и к мРНК JAK1. Активация JAK1 протимозином альфа представляет большой интерес для выявления механизма иммуностимулирующего действия ПроТα, а также для теоретического обоснования его противоопухолевой активности при использовании в генной терапии. 22 ВЫВОДЫ 1. Эктопическая экспрессия ПроТα стимулирует, а снижение уровня ПроТα с помощью интерференции РНК, наоборот, подавляет транскрипцию, регулируемую опухолевым супрессором р53. 2. Центральный «кислый» район ПроТα наряду с сигналом ядерной локализации, расположенным в С-концевой области, отвечает за способность этого белка стимулировать р53-зависимую транскрипцию. 3. ПроТα усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса р53-гистон Н1. 4. При снижении уровня ПроТα происходит снижение экспрессии протеинкиназы JAK1 в клетках HeLa. 23 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Захарова Н.И., Соколов В.В., Рудько В.В., Мельников С.В., Вартапетян А.Б., Евстафьева А.Г. Влияние протимозина альфа и его мутантов на активность опухолевого супрессора р53.// Молекулярная биология. – 2008 – Т. 42, № 4 - С. 673-684. 2. Захарова Н.И., Соколов В.В., Суворова А.А., Шиау А.-Л., Ву Ч.-Л., Евстафьева А.Г. Протимозин альфа взаимодействует с С-концевым доменом гистона Н1 и диссоциирует комплекс гистона Н1 с опухолевым супрессором р53.// Молекулярная биология. – 2011 – Т. 45, № 4 - С. 675-685. 3. Захарова Н.И. Влияние протимозина альфа на экспрессию р53-зависимых генов.// XIII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006». – Сборник тезисов - Секция «Биоинженерия и биоинформатика» - 12-15 апреля 2006 – С. 15. 4. Соколов В.В., Суворова А.А., Захарова Н.И. Получение клеточных линий с суперпродукцией и нокдауном протимозина альфа; исследование влияния протимозина альфа на чувствительность клеток к окислительному стрессу.// XVI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». – Сборник тезисов - Секция «Биоинженерия и биоинформатика» - Подсекция «Биоинформатика» - 14-17 апреля 2009 – С. 24. 5. Захарова Н.И., Соколов В.В., Суворова А.А., Евстафьева А.Г. Механизм стимуляции р53-зависимой транскрипции протимозином альфа.// 14 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века». – Сборник тезисов - Секция «Молекулярная биология» — 19-23 апреля 2010 - С. 371-372. 6. Захарова Н.И., Суворова А.А., Соколов В.В., Евстафьева А.Г. Роль гистона Н1 в стимуляции р53-зависимой транскрипции протимозином альфа.// IV Международная школа по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки». – Сборник тезисов – 29 ноября - 3 декабря 2010 – С. 89-90. 24
