006940 Область изобретения

006940
Область изобретения
Данное изобретение относится к усовершенствованиям в терапии и профилактике остеопороза и
других заболеваний, характеризующихся разрежением костной ткани. Более конкретно, данное изобретение обеспечивает способ отрицательной регуляции лиганда остеопротегерина (OPGL) путем создания
возможности образования антител против OPGL в субъектах, страдающих от остеопороза или имеющих
риск страдания от остеопороза. Данное изобретение обеспечивает также способы получения модифицированного OPGL, применимого в этом способе, а также сам модифицированный OPGL. Данное изобретение включает также фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированный OPGL, а также
векторы, включающие эти фрагменты нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева и клеточные линии, трансформированные ими. Данное изобретение обеспечивает также способ идентификации аналогов OPGL,
которые применимы в способе данного изобретения, а также композиции, содержащие модифицированный OPGL или содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие аналоги OPGL.
Остеопороз является основной и растущей проблемой здоровья во всем мире. Он поражает, согласно оценке, общее количество 75 миллионов человек в Соединенных Штатах Америки, Европе и Японии.
Таким образом, остеопороз является наиболее обычным системным костным нарушением в индустриализованной части мира.
Остеопороз поражает одну из четырех постклимактерических женщин и большинство пожилых
людей, в том числе значительное число мужчин. Согласно оценке в 1984 году, стоимость лечения остеопороза в Соединенных Штатах Америки с 15 миллионами заболевших составляла 3,8 миллиарда долларов США ежегодно. При экстраполяции на стоимость во всем мире это составляет около по меньшей
мере 20 миллиардов долларов США.
Остеопороз представляет собой системное скелетное заболевание, характеризующееся низкой костной массой и микроархитектурной деградацией костной ткани, с последующим увеличением ломкости
костей и подверженности переломам. Хотя поражаются все кости, типичными и наиболее обычными
являются переломы позвоночника, запястья и бедра. Риск развития остеопороза увеличивается с возрастом и является более высоким у женщин, чем у мужчин. Его этиология, по-видимому, находится в механизмах, лежащих в основе чрезмерного усиления обычной потери костной массы, которая наблюдается
после менопаузы у женщин и имеет место во всех индивидуумах с увеличением возраста.
Максимум костной массы достигается в возрасте приблизительно 35 лет. После достижения этого
максимума костная масса снижается в течение всей жизни вследствие дисбаланса в ремоделировании
костей. Кости теряют как минеральный, так и органический матрикс, но сохраняют их основную организацию.
Кость состоит из минерализованного внеклеточного матрикса, состоящего из множества белков и
протеогликанов; причем основным компонентом является коллаген типа I. Инкрустирующим этот внеклеточный матрикс минералом является гидроксиапатит (Ca3(PO4)2Са(ОН)2). Кость непрерывно моделируется во время роста и развития и ремоделируется на протяжении всей жизни в ответ на физические и
химические сигналы.
Рост, развитие и поддержание кости представляют собой высокорегулируемые процессы, которые
на клеточном уровне включают в себя координированную регуляцию костеобразующих (остеогенных)
клеток (остеобластов) и резорбирующих (рассасывающих) кость клеток (остеокластов). Уровень костной
массы отражает баланс костеобразования (остеогенеза) и резорбции костей.
Остеобласты возникают из мезенхимных стволовых клеток и продуцируют костный матрикс во
время развития, после повреждения костей и во время нормального ремоделирования костей, котог рое
происходит на протяжении всей жизни. Остеокласты дифференцируются из гемопоэтических предшественников моноцитарномакрофагальной линии дифференцировки и резорбируют (рассасывают) костный
матрикс.
Дисбаланс функций остеобластов и остеокластов может приводить к скелетным нарушениям, характеризующимся увеличенной костной массой (остеопетроз) или уменьшенной костной массой (остеопороз).
Исследования остеопетроза в мутантных мышах показало, что генетические дефекты в развитии,
созревании и/или активации остеокластов ведут к уменьшенной резорбции костей и неизменно приводят
к тяжелому остеопетрозу (Marks, 1989). Несмотря на это, до сих пор относительно мало было известно о
растворимых факторах, которые действуют физиологически, регулируя развитие остеокластов.
Однако недавно были описаны и охарактеризованы два белка, которые участвуют в этой регуляции
(Simonet et al., 1997; Lacey et al., 1998). Эти два белка представляют собой остеопротегерин и лиганд остеопротегерина.
Остеопротегерин представляет собой новый секретируемый член семейства рецепторов фактора
некроза опухолей. In vitro, остеопротегерин блокирует остеокластогенез зависимым от дозы образом.
Трансгенные мыши, экспрессирующие остеопротегерин, обнаруживают общее увеличение плотности
костей (остеопетроз), связанное с уменьшением количества остеокластов. Введение рекомбинантного
остеопротегерина производит сходные эффекты в нормальных мышах и защищает против связанной с
овариэктомией потерей костной массы у крыс (Simonet et al., 1997). Кроме того, остеопротегерин-1-
006940
недостаточные мыши (мыши с нокаутом гена), хотя и являются нормальными при рождении, развивают
раннее появление остеопороза и кальцификацию артерий (Bucay et al., 1998). ЭТИ наблюдения в сильной
степени указывают на возможность того, что остеопротегерин блокирует дифференцировку остеокластов, основного, если не единственного типа резорбирующих кость клеток, что предполагает, что он может действовать в качестве гуморального регулятора резорбции костей. Остеопротегерин является объектом по WO 97/23614.
Высказывалась гипотеза, что остеопротегерин может проявлять его действие путем связывания с
фактором, стимулирующим развитие остеокластов, и нейтрализацией его, ингибируя таким образом созревание остеокластов (Simonet et al., 1997).
Лиганд остеопротегерина (OPGL) является новым членом семейства цитокинов, являющихся факторами некроза опухолей, которые существуют как в мембраносвязанной, так и в растворимой форме.
OPGL связывается с остеопротегерином с аффинностью связывания 4 нМ. In vitro, OPGL активирует
зрелые остеокласты и модулирует образование остеокластов из предшественников костного мозга в присутствии CSF-1. Было также продемонстрировано, что OPGL связывается с поверхностью клетокпредшественников остеокластов в обработанном CSF-1 костном мозге. Однако рецептор для OPGL на
этих гемопоэтических клетках-предшественниках является неизвестным. Рекомбинантный растворимый
OPGL является сильнодействующим индуктором резорбции костей in vivo (Lacey et al., 1998).
Описание OPGL
OPGL синтезируется в виде трансмембранного белка типа II, состоящего из 317 аминокислотных
остатков (человеческий, см. SEQ ID NO:2) или 316 аминокислотных остатков (мышиный, см. SEQ ID
NO:4 и 6). Сопоставление выстраиванием этих двух аминокислотных последовательностей показывает,
что идентичные аминокислотные остатки обнаруживаются в 87% гомологичных положений.
Аминокислотная последовательность OPGL содержит короткий цитоплазматический домен в Nконце с последующим предположительным трансмембранным участком между аминокислотными остатками 49 и 69. На основании его гомологии фактору некроза опухолей α было предположено, что внеклеточная часть OPGL состоит из двух доменов: участка ножки от аминокислотного остатка 70 до остатка
157 и активной лигандной части от аминокислотного остатка 158 до С-конца.
Наиболее близкородственным белком для OPGL является, по-видимому, индуцирующий апоптоз
цитокин TRAIL с менее чем 25% идентичных аминокислотных остатков. OPGL был также недавно клонирован в других контекстах и был назван TRANCE (Wong et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 25190-25194) и
RANKL, соответственно (Anderson et al., 1997, Nature 390: 175-179). Этот белок также известен как фактор дифференцировки остеокластов (ODF).
Несколько вариантов с N-концевыми делециями мышиного OPGL были экспрессированы в E. coli и
очищены. Эти варианты состояли из аминокислотных остатков 75-316, 128-316, 137-316 и 158-316, соответственно. Три наиболее коротких варианта имели одинаковую β-складчатую структуру согласно исследованиям кругового дихроизма, и все были способны связывать остеопротегерин. Хотя наиболее
важным является то, что эти три варианта были активными в тестах in vitro (Lacey et al., 1998).
Самый короткий вариант был исследован дополнительно. Подобно фактору некроза опухолей α,
этот вариант OPGL существует в виде тримера в растворе и образует комплексы 3:3 при инкубировании
с остеопротегерином. Было найдено, что аффинность связывания была равна 4 нМ. Этот вариант индуцирует существенные увеличения в содержании ионизированного кальция в крови (гиперкальциемию) в
мышах in vivo. Совместное введение остеопротегерина значимо уменьшает этот гиперкальциемический
эффект OPGL.
Самый длинный вариант (аминокислотные остатки 75-316) OPGL не связывался с остеопротегерином и не обладал никакой биологической активностью.
Во время конструирования N-концевых делеционных вариантов не был известен природный сайт
расщепления в OPGL. Экспрессия полноразмерного OPGL в фибробластах 293 человека приводила к
растворимому OPGL, начинающемуся с аминокислотного остатка 139 в мышином белке или с гомологичного аминокислотного остатка 140 в белке человека. Эти исследования экспрессии показали также,
что растворимый OPGL, образующийся при экспрессии в клетках человека, является гликозилированным. Это не является удивительным, так как, как мышиный, так и человеческий OPGL содержит три потенциальных сайта N-гликозилирования в С-концевом лигандном домене.
Концентрации остеопротегерина в крови и тканях неизвестны, но этот белок имеет существенную
биологическую активность при концентрации 1 нг/мл.
Биологическая активность OPGL
OPGL является сильным фактором дифференцировки остеокластов при объединении с CSF-1. Ни
один из этих компонентов по отдельности не способен индуцировать дифференцировку остеокластов из
клеток-предшественников.
OPGL является сильным активатором зрелого остеокласта. OPGL, сам по себе, активирует зрелые
остеокласты для резорбции кости. Наблюдали, что OPGL действует как фактор роста остеокластов или
фактор выживания остеокластов в этих экспериментах.
-2-
006940
Действие OPGL, по-видимому, не является видоограниченным, так как мышиный OPGL также индуцировал образование остеокластов в культурах мононуклеарных клеток периферической крови человека.
Цель изобретения
Целью данного изобретения является обеспечение новых терапий против состояний, характеризующихся избыточной резорбцией кости, таких как остеопороз. Следующей целью является разработка
аутовакцины против OPGL для получения нового способа лечения для остеопороза и для других патологических нарушений, включающих в себя избыточную резорбцию костей.
Краткое содержание изобретения
Авторы изобретения считают, что приведенная выше информация предполагает патофизиологическую роль OPGL. Полученное in vivo доказательство является частично косвенным или непрямым, но, по
мнению авторов, убедительным, особенно в сочетании с прямым доказательством.
Наблюдение, что инъекция в мышей рекомбинантного C-концевого домена OPGL приводит к тяжелой гиперкальциемии, по мнению авторов, непосредственно указывает на патофизиологическую роль.
Косвенное доказательство вытекает из результатов для остеопротегерин-дефектных мышей (мышей
с нокаутом гена), которые, хотя и являются нормальными при рождении, развивают раннее появление
остеопороза. Это свидетельствует о том, что удаление белка, который связывает OPGL и нейтрализует
его действия, приводит к остеопорозу. Авторы приходят к выводу, что наиболее вероятной причиной
этого является повышенное созревание остеокластов и повышенная активация остеокластов, вызываемые OPGL.
Две другие части непрямого доказательства заключаются в том, что как мыши, трансгенные в отношении остеопротегерина, так и мыши, инъецированные рекомбинантным остеопротегерином, развивают остеопетроз. Это указывает на то, что неестественно высокие уровни белка, который связывает
OPGL и нейтрализует его эффекты, приводят к остеопетрозу. На основании этого авторы делают вывод,
что причины этого лежат в сниженном созревании и сниженной активации, вызываемых нейтрализацией
OPGL.
Таким образом, авторы данного изобретения предлагают модель, в которой OPGL и остеопротегерин действуют в качестве положительного и отрицательного регуляторов развития остеокластов соответственно. Другими словами, OPGL стимулирует резорбцию кости, тогда как остеопротегерин ингибирует
резорбцию кости.
Таким образом, в отношении остеопороза OPGL мог бы рассматриваться как "патогенный агент",
стимулирующий резорбцию костей, которая в конце концов приводит к остеопорозу. Подобным образом,
остеопротегерин может рассматриваться как "терапевтический агент", который противодействует этому
"патогенному агенту" путем нейтрализации его действий.
Таким образом, авторы изобретения предлагают отрицательно регулировать дифференцировку/созревание/образование остеокластов и активацию остеокластов посредством in vivo образования антител, способных нейтрализовать OPGL, обеспечивая посредством этого безопасный и эффективный
способ лечения/ослабления и/или предупреждения остеопороза и других заболеваний, характеризуемых
избыточной скоростью резорбции кости, в сравнении со скоростью костеобразования.
Таким образом, в его самом широком смысле и наиболее общем объеме, данное изобретение относится к способу отрицательной регуляции in vivo активности лиганда остеопротегерина (OPGL) в животном, в том числе в человеке, причем этот способ предусматривает представление (презентацию) иммунной системе этого животного иммунологически эффективного количества - по меньшей мере одного полипептида OPGL или его субпоследовательности, которые были приготовлены таким образом, что иммунизация этого животного этим полипептидом OPGL или его субпоследовательностью индуцирует
продуцирование антител против полипептида OPGL; и/или по меньшей мере одного аналога OPGL, в
котором введена модификация в полипептид OPGL, которая приводит к тому, что иммунизация этого
животного этим аналогом индуцирует продуцирование антител против полипептида OPGL.
Наиболее привлекательным аспектом данного подхода является то, что, например, остеопороз может регулироваться периодическими, но не очень частыми иммунизациями, в противоположность терапевтическому подходу, который включает частое (например, ежедневное) введение остеопротегерина
или молекул, имеющих связывающую аффинность в отношении OPGL, аналогичную связывающей аффинности остеопротегерина. Ожидается, что 1-4 инъекции в год иммуногенной композицией будут достаточны для получения желаемого эффекта, тогда как введение остеопротегерина или других ингибиторов активности OPGL могло бы требовать ежедневных введений.
Данное изобретение относится также к аналогам OPGL, а также к фрагментам нуклеиновых кислот,
кодирующим подсерию этих аналогов. Частью данного изобретения являются также иммуногенные композиции, содержащие аналоги этих фрагментов нуклеиновых кислот.
Данное изобретение относится также к способу идентификации аналогов OPGL, а также к способу
получения композиции, включающей аналоги OPGL.
Наконец, данное изобретение относится к способу лечения остеопороза и других заболеваний, характеризующихся избыточной резорбцией костей, предусматривающему введение молекулы, не являю-3-
006940
щейся OPGL (обычно антитела), которая блокирует взаимодействие между OPGL и его рецептором на
клетках остеокластов.
Подробное описание изобретения
Определения
Далее, ряд терминов, используемых в данном описании и формуле изобретения, будут определены
и объяснены подробно для разъяснения границ и пределов данного изобретения.
Термины "Т-лимфоцит" и "Т-клетка" будут использоваться взаимозаменяемо для лимфоцитов тимусного происхождения, которые ответственны за различные клеточноопосредованные иммунные ответы, а также для активности лимфоцитов-хелперов в гуморальном иммунном ответе. Также термины "Влимфоцит" и "В-клетка" будут использоваться взаимозаменяемо для продуцирующих антитела лимфоцитов .
Термин "полипептид OPGL" обозначает здесь полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность обсужденных выше белков OPGL, полученных из людей и мышей, (или их укороченные варианты, имеющие существенное число общих В-клеточных эпитопов с интактным OPGL), но полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, идентичную аналогам этих двух белков, выделенным из других видов, также охватываются этим термином. Негликозилированные формы OPGL, которые
получают в прокариотической системе, также включены в границы этого термина, как и формы, имеющие различные параметры гликозилирования вследствие использования, например, дрожжей или других
эукариотических экспрессионных систем, не являющихся системами млекопитающих. Однако следует
отметить, что при использовании термина "полипептид OPGL" имеется в виду, что рассматриваемый
полипептид обычно является неиммуногенным при представлении животному, подлежащему лечению.
Другими словами, полипептид OPGL является "своим" (ауто)белком или является аналогом такого "своего" (ауто)белка, который в норме не будет индуцировать иммунный ответ против OPGL рассматриваемого животного.
"Аналог OPGL" представляет собой полипептид OPGL, который был подвергнут изменениям его
первичной структуры. Такое изменение может быть, например, в форме слияния полипептида OPGL с
подходящим партнером слияния (т.е. изменение в первичной структуре, включающее в себя исключительно С- и/или N-концевые добавления аминокислотных остатков), и/или оно может быть в форме инсерций, и/или делеций, и/или замен в аминокислотной последовательности полипептида OPGL. Этот
термин охватывает также производные молекул OPGL, см. обсуждение ниже модификаций OPGL.
Следует отметить, что применение в качестве вакцины для человека ксеноаналога (например, собачьего или свиного аналога) OPGL человека может предполагаться для получения желательного иммунитета против OPGL. Такое применение ксеноаналога для иммунизации является также рассматриваемой частью данного изобретения.
Термин «полипептид» в данном контексте предназначен для обозначения как коротких пептидов из
2-10 аминокислотных остатков, олигопептидов из 11-100 аминокислотных остатков, так и полипептидов
из более, чем 100, аминокислотных остатков. Кроме того, этот термин включает в себя также белки, т.е.
функциональные биомолекулы, содержащие по меньшей мере один полипептид; при содержании по
меньшей мере двух полипептидов они могут образовывать комплексы, быть ковалентно связанными или
могут быть не ковалентно связанными. Этот полипептид (полипептиды) в белке могут быть гликозилированными и/или липидированными и/или содержать простетические группы.
Термин «подпоследовательность» обозначает любой последовательный отрезок из по меньшей мере 3 аминокислот или, в случае нуклеотидных последовательностей, из по меньшей мере 3 нуклеотидов,
происходящих непосредственно из природно встречающейся аминокислотной последовательности или
нуклеотидной последовательности OPGL соответственно.
Термин "животное" в данном контексте обычно обозначает вид животного (предпочтительно млекопитающего), такой как Homo sapiens, Canis domesticus и т.д., а не только одно единственное животное.
Однако этот термин обозначает также популяцию таких видов животных, так как важно, что все индивидуумы, иммунизированные в соответствии со способом данного изобретения, несут, по существу, один и
тот же OPGL, что позволяет иммунизировать этих животных одним и тем же иммуногеном (иммуногенами). Если, например, генетические варианты OPGL существуют в отличающихся популяциях людей,
может быть необходимым использование различных иммуногенов в этих отличающихся популяциях,
чтобы суметь разрушить аутотолерантность в отношении OPGL в каждой популяции. Лицу с обычной
квалификацией в данной области будет понятно, что животное в данном контексте является живым существом, имеющим иммунную систему. Предпочтительно это животное является позвоночным животным, таким как млекопитающее.
Под термином "отрицательная (понижающая) регуляция in vivo активности OPGL" имеют в виду
уменьшение в живом организме числа взаимодействий между OPGL и его (неизвестным) рецептором
(или между OPGL и другими возможными биологически важными партнерами связывания для этой молекулы). Понижающая регуляция может быть получена посредством нескольких механизмов: из них
наиболее простым является простое блокирование активного сайта в OPGL посредством связывания антитела. Однако в объеме данного изобретения является также и то, что связывание антитела приводит к
-4-
006940
удалению OPGL поглощающими клетками (такими как макрофаги и другие фагоцитирующие клетки).
Выражение "осуществление представления (презентации) ... иммунной системе" предназначено для
обозначения того, что иммунную систему животного подвергают иммуногенной стимуляции контролируемым образом. Как будет видно из приведенного ниже описания, такая стимуляция иммунной системы
может выполняться различными путями, из которых наиболее важными являются вакцинация полипептидом, содержащим "фармакцины" (т.е. вакциной, которую вводят для лечения или ослабления развития
заболевания) или вакцинация содержащими нуклеиновую кислоту "фармакцинами". Важным результатом, который должен быть достигнут, является то, что иммунокомпетентные клетки в этом животном
противостоят этому антигену иммунологически эффективным образом, тогда как точный способ достижения этого результата является менее важным относительно идеи изобретения, лежащей в основе данного изобретения.
Термин "иммуногенно эффективное количество" имеет обычное значение, используемое в данной
области, т.е. количество иммуногена, способное индуцировать иммунный ответ, который в существенной степени связывает патогенные агенты, имеющие общие иммунологические свойства с этим иммуногеном.
При использовании выражения, что OPGL был "модифицирован", здесь имеется в виду химическая
модификация полипептида, который составляет каркас (скелет) OPGL. Такая модификация может быть,
например, производной (например, алкилированием) определенных аминокислотных остатков в последовательности OPGL, но, как будет понятно из приведенного ниже описания, предпочтительные модификации включают в себя изменения первичной структуры аминокислотной последовательности OPGL.
При обсуждении «аутотолерантности в отношении 0PGL» понятно, что, поскольку OPGL является
«своим» белком в подлежащей вакцинации популяции, нормальные индивидуумы в этой популяции не
развивают иммунный ответ против OPGL; однако, нельзя исключить того, что случайные индивидуумы
в популяции животных будут способны продуцировать антитела против нативного OPGL, например, как
части аутоиммунного нарушения. Во всяком случае, животное обычно будет аутотолерантным только в
отношении его собственного OPGL, но нельзя исключить, что аналоги OPGL, полученные из других видов животных или из популяции, имеющей отличающийся фенотип OPGL, могли бы также быть переносимыми указанным животным.
«Чужеродный Т-клеточный эпитоп» (или «чужеродный эпитоп T-лимфоцитов») представляет собой
пептид, который способен связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости MHC и
который стимулирует Т-клетки в видах животных. Предпочтительными чужеродными Т-клеточными
эпитопами в данном изобретении являются «смешанные» эпитопы, т.е. эпитопы, которые связываются с
существенной фракцией конкретного класса молекул MHC в виде или популяции животного. Известно
лишь очень ограниченное число таких смешанных Т-клеточных эпитопов, и они будут обсуждаться подробно ниже. Следует отметить, что, для того, чтобы иммуногены, которые используют в соответствии с
данным изобретением, были эффективными в по возможности большой фракции популяции животного,
может быть необходимо 1) встраивание нескольких чужеродных Т-клеточных эпитопов в один и тот же
аналог OPGL или 2) получение нескольких аналогов OPGL, причем каждый аналог имеет отличающийся
от других встроенный смешанный эпитоп. Следует отметить, что концепция чужеродных Т-клеточных
эпитопов включает в себя также применение криптических (замаскированных) Т-клеточных эпитопов,
т.е. эпитопов, которые получены из «своего» белка и которые проявляют иммуногенное поведение только в том случае, когда они существуют в выделенной форме, не являясь частью рассматриваемого «своего» белка.
«Чужеродный эпитоп Т-хелперного лимфоцита» (чужеродный Тн-эпитоп) является чужеродным Тклеточным эпитопом, который связывается на молекуле MHC Класса II и может быть представлен на
поверхности антигенпредставляющей (антигенпрезентирующей) клетки (АПК), связанной с молекулой
MHC Класса II.
«Функциональная часть» (био)молекулы в данном контексте обозначает часть этой молекулы, которая ответственна за по меньшей мере один из биохимических или физиологических эффектов, проявляемых данной молекулой. В данной области хорошо известно, что многие ферменты и другие эффекторные молекулы имеют активный сайт, который является ответственным за эффекты, проявляемые рассматриваемой молекулой. Другие части этой молекулы могут выполнять стабилизирующую или усиливающую растворимость роль и могут быть, следовательно, опущены, если эти цели не имеют отношения
к рассматриваемому вопросу в контексте определенного варианта данного изобретения. Например, можно использовать определенные цитокины в качестве модифицирующей части в OPGL (см. подробное
описание ниже), и в таком случае вопрос стабильности может быть не относящимся к делу, так как связывание с OPGL обеспечивает необходимую стабильность.
Термин «адъювант» имеет его обычное значение в области приготовления вакцин, т.е. он представляет собой вещество или композицию, которые 1) сами не способны вызывать специфический иммунный
ответ против иммуногена данной вакцины, но которые 2), тем не менее, способны усиливать иммунный
ответ против данного иммуногена. Или, другими словами, вакцинация только одним адъювантом не
обеспечивает иммунного ответа против иммуногена, вакцинация иммуногеном может индуцировать или
-5-
006940
может не индуцировать иммунный ответ против иммуногена, но объединенная вакцинация иммуногеном
и адъювантом индуцирует иммунный ответ против этого иммуногена, который является более сильным,
чем иммунный ответ, индуцируемый одним иммуногеном.
«Нацеливание» молекулы означает в данном контексте ситуацию, в которой молекула при введении
в животное будет появляться преимущественно в определенной ткани (тканях) или будет преимущественно связана с определенными клетками или типами клеток. Этот эффект может быть достигнут рядом
способов, в том числе путем приготовления этой молекулы в композиции, облегчающей нацеливание,
или путем введения в эту молекулу групп, облегчающих нацеливание. Эти вопросы будут подробно обсуждаться ниже.
«Стимуляция иммунной системы» обозначает, что вещество или рассматриваемая композиция проявляет общее, неспецифическое иммуностимулирующее действие. Ряд адъювантов и возможных адъювантов (таких как некоторые цитокины) обладают общей способностью стимулировать иммунную систему. Результатом использования иммуностимулирующего агента является увеличенная «бдительность»
иммунной системы, что означает, что одновременная или последовательная иммунизация иммуногеном
индуцирует значительно более эффективный иммунный ответ в сравнений с отдельным использованием
данного иммуногена.
Предпочтительные варианты отрицательной регуляции активности OPGL
Предпочтительно, чтобы полипептид OPGL, используемый в качестве иммуногена в способе данного изобретения, был модифицированной молекулой, в которой по меньшей мере одно изменение присутствует в аминокислотной последовательности OPGL, так как шансы получения всеобъемлюще важного разрушения аутотолерантности в отношении OPGL значительно облегчается таким образом. Следует
отметить, что это не исключает возможности применения такого модифицированного OPGL в композициях, которые дополнительно разрушают аутотолерантность против OPGL, например, в композициях,
содержащих адъюванты.
Было показано (в Dalum I. et аl., 1996, J. Immunol. 157: 4796-4804), что потенциально аутореактивные В-лимфоциты, узнающие «свои» белки, физиологически присутствуют в нормальных индивидуумах.
Однако для того чтобы эти В-лимфоциты были индуцированы для действительного продуцирования антител, реактивных с соответствующими "своими" белками, требуется помощь продуцирующих цитокины
Т-хелперных лимфоцитов (Тн-клеток или Тн-лимфоцитов). Обычно эта помощь не обеспечивается, так
как Т-лимфоциты обычно не узнают Т-клеточные эпитопы, происходящие из "своих" белков, при предоставлении антигенпредставляющими клетками (АПК). Однако путем обеспечения элемента "чужеродности" в "своем" белке (т.е. путем введения иммунологически значимой модификации), Т-клетки, узнающие этот чужеродный элемент, активируются при узнавании этого чужеродного эпитопа на АПК
(такой как, прежде всего, мононуклеарная клетка). Поликлональные B-лимфоциты (которые также являются АПК), способные узнавать "свои" эпитопы на модифицированном "своем" белке, также интернализуют этот антиген и затем представляют его чужеродный T-клеточный эпитоп (эпитопы), а активированные Т-лимфоциты впоследствии обеспечивают помощь в виде цитокинов этим реактивным против
"своих" антигенов поликлональным В-лимфоцитам. Поскольку антитела, продуцируемые этими поликлональными В-лимфоцитами, являются реактивными с различными эпитопами на модифицированном
полипептиде, в том числе теми, которые присутствуют также и в нативном полипептиде, индуцируется
антитело, перекрестно реагирующее с немодифицированным "своим" белком. В результате, можно заставить Т-лимфоциты действовать таким образом, как если бы популяция поликлональных Влимфоцитов узнавала полностью чужеродный антиген, тогда как на самом деле только встроенный эпитоп (эпитопы) является (являются) чужеродным(и) для данного хозяина. Таким путем индуцируются антитела, способные перекрестно реагировать с немодифицированными аутоантигенами.
Несколько способов модификации пептидного аутоантигена для достижения разрушения аутотолерантности известны в данной области. Таким образом, в соответствии с данным изобретением, эта модификация может включать в себя следующее:
вводят по меньшей мере один чужеродный Т-клеточный эпитоп, и/или
вводят по меньшей мере одну первую часть молекулы, которая осуществляет нацеливание модифицированной молекулы на антиген-представляющую клетку (АПК), и/или
вводят по меньшей мере одну вторую часть молекулы, которая стимулирует иммунную систему,
и/или
вводят по меньшей мере одну третью часть молекулы, которая оптимизирует представление (презентацию) модифицированного полипептида OPGL иммунной системе.
Однако все эти модификации должны выполняться при сохранении существенной фракции первоначальных эпитопов В-лимфоцитов в OPGL, так как в результате этого усиливается узнавание Bлимфоцитами нативной молекулы.
В одном предпочтительном варианте вводят ковалентно или нековалентно боковые группы (в форме чужеродных Т-клеточных эпитопов или вышеуказанных первой, второй и третьей частей). Это должно означать, что отрезки аминокислотных остатков, полученные из OPGL, дериватизуют без изменения
первичной аминокислотной последовательности или, по меньшей мере, без введения изменений в пеп-6-
006940
тидные связи между отдельными аминокислотами в этой цепи.
Альтернативный и предпочтительный вариант использует замену, и/или делецию, и/или инсерцию,
и/или добавление аминокислоты (которые могут достигаться при помощи рекомбинантных способов или
с использованием пептидного синтеза; модификации, включающие в себя более длинные отрезки аминокислот, могут давать слитые полипептиды). Одной из особенно предпочтительных версий этого варианта
является способ, описанный в WO 95/05849, который раскрывает способ отрицательной регуляции «своих» белков путем иммунизации аналогами «своих» белков, в которых ряд аминокислотных последовательностей был заменен соответствующим числом аминокислотных последовательностей, каждая из которых содержит чужеродный иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп, с сохранением в то же самое
время общей третичной структуры данного "своего" белка в этом аналоге. Однако для целей данного
изобретения достаточно, если эта модификация (будь то инсерция, добавление, делеция или замена) создает чужеродный Т-клеточный эпитоп и в то же самое время сохраняет существенное число B-клеточных
эпитопов в OPGL. Однако для получения максимальной эффективности индуцированного иммунного
ответа предпочтительно, чтобы в этой модифицированной молекуле была сохранена вся третичная
структура OPGL.
Следующая формула описывает конструкции OPGL, обычно охватываемые данным изобретением:
где OPGLe1-OPGLex обозначают x содержащих В-клеточный эпитоп подпоследовательностей OPGL, которые независимо являются идентичными или неидентичными и которые могут содержать или не содержать чужеродные боковые группы, х обозначает целое число >3, n1-nx обозначают х целых чисел >0
(по меньшей мере один из них >1), MOD1-MODx обозначают х модификаций, введенных между сохраненными В-клеточными эпитопами, и s1-sx обозначают х целых чисел >0 (по меньшей мере один из них
> 1, если в последовательности OPGL не введены боковые группы). Таким образом, при условии обычных функциональных ограничений в отношении иммуногенности этих конструкций, данное изобретение
делает возможными все типы пермутаций первоначальной последовательности OPGL и все типы модификаций в ней. Таким образом, в данное изобретение включены все модифицированные OPGL, полученные опущением частей последовательности OPGL, которые, например, проявляют побочные действия in
vivo, или опущением частей, которые обычно являются внутриклеточными и, следовательно, могут индуцировать нежелательные иммунологические реакции.
Сохранение существенной фракции В-клеточных эпитопов или даже всей третичной структуры
белка, который подвергают модификации, как описано здесь, может быть достигнуто несколькими путями. Одним из них является просто получение поликлональной антисыворотки, направленной против
OPGL (например, сыворотки, полученной в кролике) и после этого использование этой антисыворотки в
качестве тест-реагента (например, в конкурентном ELISA) против получаемых модифицированных белков. Модифицированные версии (аналоги), которые реагируют в той же самой степени с этой антисывороткой, что и OPGL, должны рассматриваться как имеющие одинаковую третичную структуру с OPGL,
тогда как аналоги, обнаруживающие ограниченную (но все еще значимую и специфическую) реактивность с такой антисывороткой, рассматриваются как сохранившие существенную фракцию исходных Вклеточных эпитопов.
Альтернативно, могут быть отобраны моноклональные антитела, реактивные с различающимися
эпитопами на OPGL, и использованы в качестве тест-панели. Этот подход имеет то преимущество, что
он делает возможным 1) картирование эпитопов OPGL и 2) картирование эпитопов, которые сохраняются в полученных аналогах.
Конечно, третьим подходом было бы выяснение трехмерной структуры OPGL или его биологически активного укороченного варианта (см. выше) и сравнение ее с выясненной трехмерной структурой
полученных аналогов. Трехмерная структура может быть выяснена при помощи рентгенографических
исследований и ЯМР-спектроскопии. Дополнительная информация относительно третичной структуры
может быть до некоторой степени получена из исследований кругового дихроизма, которые имеют то
преимущество, что требуют только наличия этого полипептида в чистой форме (тогда как рентгенография требует обеспечения кристаллизуемого полипептида, а ЯМР-спектроскопия требует обеспечения
изотопных вариантов этого полипептида) для получения полезной информации о третичной структуре
конкретной молекулы. Однако в конечном счете рентгенография и/или ЯМР являются необходимыми
для получения заключительной информации, так как круговой дихроизм может дать только косвенное
доказательство правильной трехмерной структуры посредством информации об элементах вторичной
структуры.
Один предпочтительный вариант данного изобретения использует множественные представления
(презентации) эпитопов B-лимфоцитов OPGL (т.е. формулы I, в которой по меньшей мере один Вклеточный эпитоп присутствует в двух положениях). Этот эффект может быть достигнут различными
путями, например просто получением слитых полипептидов, содержащих структуру (OPGL)m, где m
обозначает целое число >2, и затем введением обсуждаемых здесь модификаций в по меньшей мере одну
из этих последовательностей OPGL. Предпочтительно, чтобы введенные модификации включали по
меньшей мере одну дупликацию В-лимфоцитарного эпитопа и/или введение гаптена.
-7-
006940
Как упоминалось выше, введение чужеродного Т-клеточного эпитопа может быть выполнено введением, по меньшей мере, инсерции, добавления, делеции или замены одной аминокислоты. Конечно,
обычной ситуацией будет введение более чем одного изменения в аминокислотной последовательности
(например, инсерции или замены всего Т-клеточного эпитопа), но важной задачей, которая должна быть
достигнута, является то, что аналог OPGL при обработке антигенпредставляющей клеткой (АПК) будет
приводить к тому, что такой чужеродный Т-клеточный эпитоп будет представлен в контексте молекулы
MHC Класса II на поверхности этой АПК. Таким образом, если аминокислотная последовательность
OPGL в подходящих положениях содержит ряд аминокислотных остатков, которые могут быть также
обнаружены в чужеродном Тн-эпитопе, то введение Тн-эпитопа может быть выполнено обеспечением
остальных аминокислот этого чужеродного эпитопа посредством инсерции, добавления, делеции и замены аминокислот. Другими словами, необходимо ввести полный Тн-эпитоп путем инсерции или замены
для удовлетворения цели данного изобретения.
Предпочтительно, чтобы число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавлений было по
крайней мере 2, например, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 и 25 инсерций, замен,
добавлений или делеций. Кроме того, предпочтительно, чтобы число аминокислотных инсерций, делеций, замен или добавлений не превышало 150, и было, например, самое большее 100, самое большее 90,
самое большее 80 и самое большее 70. Особенно предпочтительно, чтобы число замен, инсерций, делеций или добавлений не превышало 60 и, в частности, это число не должно превышать 50 или даже 40.
Наиболее предпочтительным является число не более 30. Что касается добавлений аминокислот, следует
отметить, что они, когда полученная конструкция находится в форме слитого полипептида, часто значительно превышают число 150.
Предпочтительные варианты данного изобретения включают модификацию посредством введения
по меньшей мере одного чужеродного иммунодоминантного Т-клеточного эпитопа. Должно быть понятно, что вопрос иммунодоминантности Т-клеточного эпитопа зависит от рассматриваемого вида животного. В применении здесь, термин "иммунодоминантность" относится просто к эпитопам, которые в вакцинированном индивидууме/вакцинированной популяции индуцируют возникновение значимого иммунного ответа, но хорошо известным является тот факт, что Т-клеточный эпитоп, который является иммунодоминантным в одном индивидууме/одной популяции необязательно является иммунодоминантным в
другом индивидууме того же самого вида, даже хотя он может быть способным связывать молекулы
MHC-II в последнем упомянутом индивидууме. Таким образом, для целей данного изобретения иммунодоминантным T-клеточным эпитопом является Т-клеточный эпитоп, который будет эффективным в
обеспечении помощи Т-клеток при его присутствии в антигене. Обычно иммунодоминантные Тклеточные эпитопы имеют присущий им признак, заключающийся в том, что они будут, по существу,
всегда представлены в связанном с молекулой MHC Класса II виде, независимо от полипептида, в котором они появляются.
Другим важным моментом является вопрос МНС-рестрикции T-клеточных эпитопов. Обычно, природно встречающиеся Т-клеточные эпитопы являются МНС-рестриктированными, т.е. определенные
пептиды, составляющие Т-клеточный эпитоп, будут эффективно связываться только с подсерией молекул MHC Класса II. Это, в свою очередь, приводит к тому, что в большинстве случаев использование
одного специфического Т-клеточного эпитопа будет приводить к вакцинному компоненту, который эффективен только во фракции этой популяции, и, в зависимости от размера этой фракции, может возникать необходимость во включении большего числа Т-клеточных эпитопов в ту же самую молекулу или,
альтернативно, в получении мультикомпонентной вакцины, в которой эти компоненты представляют
собой варианты OPGL, которые отличаются друг от друга природой введенного Т-клеточного эпитопа.
Если МНС-рестрикция используемых Т-клеток является совершенно неизвестной (например, в ситуации, когда вакцинированное животное имеет слабо определенный состав MHC), фракция популяции,
охватываемая конкретной вакцинной композицией, может быть определена при помощи следующей
формулы:
где pi обозначает частоту встречаемости в популяции респондеров на i-й чужеродный Т-клеточный
эпитоп, присутствующий в этой вакцинной композиции, а n обозначает общее число чужеродных Tклеточных эпитопов в данной вакцинной композиции. Таким образом, вакцинная композиция, содержащая 3 чужеродных Т-клеточных эпитопа, имеющих частоты встречаемости ответов в популяции 0,8, 0,7
и 0,6, соответственно, дала бы 1 - 0,2 х 0,3 х 0,4 = 0,976, т.е. 97,6% этой популяции будут статистически
продуцировать МНС-II-опосредованный ответ на эту вакцину.
Приведенная выше формула неприменима в ситуациях, когда известны более или менее точные параметры МНС-рестрикции используемых пептидов. Если, например, определенный пептид связывается
только с молекулами MHC-II человека, кодируемыми HLA-DR-аллелями DR1, DR3, DR5 и DR7, то применение этого пептида вместе с другим пептидом, который связывает остальные молекулы MHC-II, кодируемые HLA-DR-аллелями, будет выполнять 100% охват в рассматриваемой популяции. Таким же
-8-
006940
образом, если этот второй пептид связывает только DR3 и DR5, добавление этого пептида вообще не
увеличит этого охвата. Если производить расчет ответа популяции на основе только МНС-рестрикции Тклеточных эпитопов в вакцине, фракция популяции, охватываемая конкретной вакцинной композицией,
может быть определена при помощи следующей формулы:
где ϕj обозначает сумму частот встречаемости в популяции аллельных гаплотипов, кодирующих
молекулы MHC, которые связывают любой из Т-клеточных эпитопов в вакцине и которые принадлежат к
j-му из 3 известных локусов HLA (DP, DR и DQ); практически сначала определяют, какие молекулы
MHC будут узнавать каждый T-клеточный эпитоп в данной вакцине, и после этого их распределяют в
соответствии с типом (DP, DR и DQ), а затем индивидуальные частоты встречаемости распределенных
аллельных гаплотипов суммируют для каждого типа, получая в результате ϕ1, ϕ2 и ϕ3.
Может встретиться случай, когда величина pi в формуле II превышает соответствующую теоретическую величину πi
где Vj обозначает сумму частот встречаемости в популяции аллель-ного гаплотипа, кодирующего
молекулы MHC, которые связывают i-й Т-клеточный эпитоп в вакцине и которые принадлежат к j-му из
3 известных локусов HLA (DP, DR и DQ) . Это означает, что в 1-πI этой популяции имеется частота респондеров Fостаточный-i = (pi-πi)/(1-πi). Таким образом, формула III может быть скорректирована таким образом, чтобы получить формулу V
где термин 1-Fостаточный-i принимают за нуль, если он является отрицательным. Следует отметить, что
формула V требует, чтобы все эпитопы были гаплотипом, картированным против идентичных наборов
гаплотипов.
Таким образом, при выборе Т-клеточных эпитопов для введения в аналог OPGL важно включать
всю известную информацию об этих эпитопах, которая является доступной: 1) частоту встречаемости
респондеров в популяции для каждого эпитопа, 2) информацию об МНС-рестрикции и 3) частоту встречаемости в популяции соответствующих гаплотипов.
Существует ряд природно встречающихся «смешанных» T-клеточных эпитопов, которые являются
активными в большой части индивидуумов видов животных или популяции животных, и их предпочтительно вводить в вакцину, уменьшая тем самым необходимость в очень большом количестве различных
аналогов OPGL в одной и той же вакцине.
Этот смешанный эпитоп согласно данному изобретению может быть природно встречающимся Тклеточным эпитопом человека, таким как эпитопы из столбнячного токсоида (например, эпитопы Р2 и
Р30), дифтерийного токсоида, гемаглюттинин вируса гриппа (НА) и антиген CS P. falciparum.
На протяжении последних лет был идентифицирован ряд других смешанных Т-клеточных эпитопов. В частности, были идентифицированы пептиды, способные связывать большую часть молекул HLADR, кодируемых различными аллелями HLA-DR, и все они являются возможными Т-клеточными эпитопами для введения в аналоги OPGL, используемые в соответствии с данным изобретением. Эпитопы,
обсуждаемые в следующих ссылках, включены в качестве ссылок: WO 98/23635 (Fraser IH et al., переуступленный The University of Queensland); Southwood S et al., 1998, J. Immunol. 160, 3363-3373; Sinigaglia F
et al., 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 27-47; Hammer J et al., 1993, Cell
74: 197-203 и Falk K et al., 1994, Immunogenetics 39: 230-242. Последняя ссылка также рассматривает лиганды HLA-DQ и -DP. Все эпитопы, перечисленные в этих 5 ссылках, являются соответствующими кандидатами природных эпитопов для применения в данном изобретении, так же как и эпитопы, имеющие
общие с ними мотивы последовательностей.
Альтернативно, эпитоп может быть любым синтетическим T-клеточным эпитопом, который способен связывать большую часть молекул MHC Класса II. В этом контексте, пептиды pan DR-эпитопа ("PADRE"), описанные в WO 95/07707 и в соответствующей статье Alexander J et al., 1994, Immunity 1: 751761 (оба описания включены здесь в качестве ссылки) являются представляющими интерес кандидатами
на эпитопы для использования в соответствии с данным изобретением. Следует отметить, что наиболее
эффективные пептиды PADRE, описанные в этих статьях, несут D-аминокислоты в С- и N-концах для
улучшения стабильности при введении. Однако данное изобретение нацелено прежде всего на включение соответствующих эпитопов в виде части модифицированного OPGL, которая должна впоследствии
отщепляться ферментативно в лизосомном компартменте АПК, чтобы сделать возможным представление (презентацию) в контексте молекулы MHC-II, и, следовательно, включение D-аминокислот в эпитопы, используемые в данном изобретении, является нецелесообразным.
Одним из особенно предпочтительных пептидов PADRE является пептид, имеющий аминокислот-9-
006940
ную последовательность AKFVAAWTLKAAA, или его иммунологически эффективная субпоследовательность. Этот эпитоп и другие эпитопы, имеющие такое же отсутствие МНС-рестрикции, являются
предпочтительными Т-клеточными эпитопами, которые должны присутствовать в аналогах OPGL в способе данного изобретения. Такие сверхразнородные эпитопы сделают возможными наиболее простые
варианты данного изобретения, в которых только один единственный модифицированный OPGL представляется иммунной системе вакцинированного животного.
Как упоминалось выше, модификация OPGL может также включать введение первой части молекулы, которая нацеливает модифицированный OPGL на АПК или В-лимфоцит. Например, первая часть
молекулы может быть партнером специфического связывания для поверхностного антигена, специфического для В-лимфоцитов, или для АПК-специфического поверхностного антигена. Многочисленные подобные специфические поверхностные антигены известны в данной области. Например, эта часть может
быть углеводом, для которого имеется рецептор на В-лимфоцитах или АПК (например, маннаном или
маннозой). Альтернативно, вторая часть может быть гаптеном. Фрагмент антитела, который специфически узнает поверхностную молекулу на АПК или лимфоцитах, может быть использован в качестве первой части молекулы (эта поверхностная молекула может быть, например, FCγ-рецептором макрофагов
или моноцитов, таким как FCγRI, или, альтернативно, любым другим специфическим поверхностным
маркером, таким как CD40 или CTLA-4). Следует отметить, что все эти являющиеся примерами нацеливающие молекулы могут быть использованы также в виде части адъюванта, см. ниже.
В качестве альтернативы или дополнения, для нацеливания модифицированного полипептида
OPGL на определенный тип клеток для достижения усиленного иммунного ответа, можно увеличивать
уровень отвечаемости иммунной системы путем включения вышеуказанной второй части молекулы, которая стимулирует иммунную систему. Типичными примерами таких вторых частей молекул являются
цитокины и белки теплового шока или молекулярные «наставники», а также их эффективные части.
Подходящими цитокинами для применения в соответствии с данным изобретением являются такие
цитокины, которые будут обычно функционировать также в качестве адъювантов в вакцинной композиции, т.е., например, интерферон γ (IFN-γ), интерлейкин 1 (IL-1), интерлейкин 2 (IL-2), интерлейкин 4 (IL4), интерлейкин 6 (IL-6), интерлейкин 12 (IL-12), интерлейкин 13 (IL-13), интерлейкин 15 (IL-15) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF); альтернативно, функциональной части молекулы цитокина может быть достаточно в качестве второй части. Что касается использования таких цитокинов в качестве адъювантных веществ, см. обсуждение ниже.
В соответствии с данным изобретением, подходящими белками теплового шока или молекулярными наставниками, используемыми в качестве второй части молекулы, могут быть HSP70, HSP90, HSC70,
GRP94 (также известный как gp96, сравните Wearch PA et al., 1998 Biochemistry 37: 5709-19) и CRT
(кальретикулин).
Альтернативно, второй частью молекулы может быть токсин, такой как листериолицин (LLO), липид А и термолабильный энетротоксин. Ряд микобактериальных производных, таких как MDP (мурамилдипептид), CFA (полный адъювант Фрейнда) и диэфиры трегалозы TDM и TDE, также являются
представляющими интерес возможностями.
Возможность введения третьей части молекулы, которая усиливает представление модифицированного OPGL иммунной системе, является также важным вариантом данного изобретения. В данной области описаны несколько примеров этого принципа. Например, известно, что якорь пальмитоиллипидирования в белке OspA Borrelia burgdorferi может быть использован таким образом, чтобы обеспечить полипептиды с аутоадъювантными свойствами (см., например, WO 96/40718) - по-видимому, липидированные белки образуют мицеллоподобные структуры с центральной частью, состоящей из якорных частей
липидирования этих полипептидов, а остальные части этой молекулы выступают из нее, что приводит к
множественным представлениям антигенных детерминант. Таким образом, использование этого и родственных подходов с использованием различных якорей липидирования (например, миристильной группы,
фарнезильной группы, геранилгеранильной группы, GPI-якоря и N-ацилдиглицеридной группы) составляет предпочтительные варианты данного изобретения, в частности, потому, что обеспечение такого
якоря липидирования в рекомбинантно получаемом белке является довольно простым и требует лишь
использования, например, природно встречающейся сигнальной последовательности в качестве партнера
слияния для модифицированного полипептида OPGL. Другой возможностью является использование
фрагмента C3d фактора комплемента С3 или самого фактора С3 (см. Dempsey et al., 1996, Science 271:
348-350 и Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462).
Альтернативным вариантом данного изобретения, который также приводит к предпочтительному
представлению множественных (например, по меньшей мере 2) копий важных районов эпитопов OPGL
иммунной системе, является ковалентное связывание OPGL, его субпоследовательности или вариантов с
определенными молекулами. Например, могут быть использованы полимеры, например, углеводы, такие
как декстран, см., например, Lees A et al., 1994, Vaccine 12: 1160-1166; Lees A et al., 1990, J. Immunol. 145:
3594-3600, но применимыми альтернативами являются также манноза и маннан. Интегральные мембранные белки, например, из E. coli и других бактерий, также являются применимыми партнерами конъюга- 10 -
006940
ции. Традиционные молекулы-носители, такие как гемоцианин фисуреллы (KLH), столбнячный токсоид,
дифтерийный токсоид и бычий сывороточный альбумин (БСА), также являются предпочтительными и
применимыми партнерами конъюгации.
Определенные зоны нативного OPGL, по-видимому, являются наиболее пригодными для проведения модификаций. Вследствие структурного родства OPGL с TNF-α и другими членами семейства факторов некроза опухолей, прогнозируется, что введения T-клеточных эпитопов или других модификаций в
зонах, определяемых положениями 170-192, 198-218, 221-246, 256-261 или 285-316 (нумерация аминокислот SEQ ID NO:4, 6 и 12), будут, наиболее вероятно, давать желательные результаты. Эти положения
относятся к мышиному OPGL - соответствующими положениями в молекуле человека являются 171-193,
199-219, 222-247, 257-262 и 286-317 (нумерация аминокислот SEQ ID NO:2).
Соображениями, обосновывающими эти выбранные зоны, являются а) сохранение известных и
предсказанных В-клеточных эпитопов, b) сохранение третичной структуры и т.д. Во всяком случае, как
обсуждалось выше, довольно легко подвергнуть скринингу набор модифицированных молекул OPGL,
которые были подвергнуты введению Т-клеточного эпитопа в различных положениях.
Поскольку наиболее предпочтительные варианты данного изобретения включают отрицательную
регуляцию OPGL человека, является, следовательно, предпочтительным, чтобы обсуждаемый выше полипептид OPGL был полипептидом OPGL человека. В этом варианте особенно предпочтительно, чтобы
полипептид OPGL человека был модифицирован заменой по меньшей мере одной аминокислотной последовательности в SEQ ID NO:2 (или в полипептиде, в котором Cys-221 в SEQ ID NO:2 был заменен
серином), по меньшей мере одной аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины и содержащей чужеродный Тн-эпитоп. Замещенные аминокислотные остатки выбраны из остатков
257-262, 289-303 и 222-243 в SEQ ID NO:2. Обоснование таких конструкций обсуждается подробно в
примерах.
Приготовление OPGL и модифицированных полипептидов OPGL
При осуществлении представления (презентации) полипептида OPGL или модифицированного полипептида OPGL иммунной системе животного посредством введения его этому животному, приготовление этого полипептида выполняется согласно принципам, общепринятым в данной области.
Приготовление вакцин, содержащих пептидные последовательности в качестве активных ингредиентов, обычно хорошо известно в данной области, как описано, например, патентами 4608251; 4601903;
4599231; 4599230; 4596792 и 4578770, все они включены здесь в качестве ссылок. Обычно такие вакцины
получают в виде инъекций, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; могут быть также
приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъецированием. Препарат может быть также эмульгирован. Активный иммуногенный ингредиент часто
смешивают с наполнителями, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активным ингредиентом. Подходящими наполнителями являются, например, вода, солевой раствор, декстроза, глицерин, этанол или т.п. и их комбинации. Кроме того, если желательно, вакцина может содержать
минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющий или эмульгирующий агенты,
забуферивающие рН агенты или адъюванты, которые повышают эффективность вакцин; см. подробное
обсуждение адъювантов ниже.
Эти вакцины обычно вводят парентерально, инъекцией, например, подкожно, внутрикожно, интрадермально, субдермально или внутримышечно. Дополнительные композиции, которые пригодны для
других способов введения, включают в себя суппозитории и, в некоторых случаях, пероральные, буккальные, сублингвальные (подъязычные), интраперитонеальные, интравагинальные, анальные, эпидуральные, спинальные и интракраниальные (внутричерепные) композиции. Для суппозиториев, традиционные связывающие вещества и носители могут включать, например, полиалкаленгликоли или триглицериды; такие суппозитории могут быть образованы из смесей, содержащих активный ингредиент в
диапазоне 0,5-10%, предпочтительно 1-2%. Пероральные композиции включают обычно применяемые
наполнители, такие как, например, имеющие фармацевтическую чистоту маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрий-сахарин, целлюлоза, карбонат магния и т.п. Эти композиции имеют форму растворов,
суспензий, таблеток, пилюль, капсул, композиций пролонгированного высвобождения или порошков и
содержат 10-95% активного ингредиента, предпочтительно 25-70%. Для пероральных композиций, холерный токсин является представляющим интерес партнером композиции (и также возможным партнером конъюгации).
Эти полипептиды могут быть приготовлены в виде вакцины в нейтральной форме или в виде солей.
Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли (образованные со свободными
аминогруппами пептида) и соли, образованные с неорганическими кислотами, такими как, например,
соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, минальная кислота, и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут
быть также произведены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия,
аммония, кальция или железа (III), и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин,
2-этиламиноэтанол, гистидин, прокаин и т.п.
Эти вакцины вводят способом, совместимым с дозированной композицией и в таком количестве,
- 11 -
006940
которое будет терапевтически эффективным и иммуногенным. Вводимое количество зависит от проходящего лечение субъекта, в том числе, например, от способности иммунной системы индивидуума устанавливать иммунный ответ, и желательной степени защиты. Подходящие диапазоны доз являются диапазонами порядка нескольких сотен микрограммов активного ингредиента на одну вакцинацию с предпочтительным диапазоном от приблизительно 0,1 до 2000 мкг (хотя обсуждаются даже более высокие количества в диапазоне 1-10 мг), такие как дозы в диапазоне от приблизительно 0,5 до 1000 мкг, предпочтительно в диапазоне от 1 до 500 мкг и, в частности, в диапазоне от приблизительно 10 до 100 мкг. Подходящие схемы для начального введения и бустер-дозы также являются вариабельными, но типичным является начальное введение с последующими инокуляциями или другими введениями.
Способ применения может широко варьироваться. Любой из общепринятых способов введения
вакцин является применимым. Эти способы включают в себя пероральное введение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентеральное введение
посредством инъекции или т.п. Доза вакцины будет зависеть от способа введения и будет меняться в соответствии с возрастом вакцинируемого лица и композицией антигена.
Некоторые полипептиды этой вакцины являются достаточно иммуногенными в вакцине, но для некоторых других иммунный ответ будет усиливаться, если эта вакцина дополнительно содержит адъювантное вещество.
Известны разнообразные способы достижения адъювантного эффекта в отношении вакцины. Общие принципы и способы подробно описаны в "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995,
Duncan E.S. Stewart-Tull (ed.), John Wiley & Sohns Ltd, ISBN 0-471-95170-6, а также в "Vaccines: New
Generation Immunological Adjuvants", 1995, Gregoriadis G. et al. (eds), Plenum Press, New York, ISBN 0-30645283-9, обе статьи включены здесь в качестве ссылок.
Особенно предпочтительно использовать адъювант, который может продемонстрировать облегчение разрушения аутотолерантности к аутоантигенам; действительно, это является существенным в случаях, когда в качестве активного ингредиента в аутовакцине используют немодифицированный OPGL.
Неограничительные примеры подходящих адъювантов выбраны из группы, состоящей из адъюванта иммунного нацеливания; иммуномодулирующего адъюванта, такого как токсин, цитокин, и микобактериальное производное; масляной композиции, полимера; образующего мицеллы адъюванта; сапонина; иммуностимулирующего комплексного матрикса (ISCOM-матрикса); частицы; DDA; алюминийсодержащих адъювантов; ДНК-адъювантов; γ-инулина и инкапсулирующего адъюванта. В общем, следует отметить, что приведенные выше описания, которые относятся к соединениям и агентам, применимым в качестве первой, второй и третьей частей молекулы в аналогах, относятся также mutatis mutandis (с соответствующими изменениями) к их использованию в адъюванте вакцины данного изобретения.
Применение адъювантов включает применение агентов, таких как гидроксид или фосфат алюминия
(квасцы), обычно используемые в виде 0,05-0,1-процентного раствора в забуференном солевом растворе,
смеси с синтетическими полимерами сахаров (например, Карбополом®), используемыми в виде 0,25%
раствора, возможной является также агрегация белка в вакцине тепловой обработкой температурами в
диапазоне между 70-101°C в течение периодов 30 с - 2 мин, соответственно, и также агрегация с использованием сшивающих агентов. Могут быть также использованы агрегация реактивацией обработанными
пепсином антителами (Fab-фрагментами) на альбумине, смешивание с бактериальными клетками, такими как С. parvum, или эндотоксинами или липосахаридными компонентами грамотрицательных бактерий, эмульгирование в физиологически приемлемых масляных носителях, таких как моноолеат маннида
(Aracel A), или эмульгирование с 20-процентным раствором перфторуглерода (Flusol-DA), используемым в качестве заменителя блокады. Предпочтительным является также смешивание с маслами, такими
как сквален и IFA.
В соответствии с данным изобретением DDA (диметилдиоктаде-циламмонийбромид) является
представляющим интерес кандидатом на адъювант, как и ДНК и γ-инулин, но также полный адъювант
Фрейнда и неполные адъюванты Фрейнда, а также сапонины Quillajа, такие как QuilA и QS21, являются
представляющими интерес кандидатами на адъювант, как и RIBI. Дополнительными возможностями
являются монофосфориллипид A (MPL), вышеупомянутые С3 и C3d и мурамилди-пептид (MDP).
Известно, что липосомные композиции также сообщают адъювантные эффекты, и, следовательно,
липосомные адъюванты являются предпочтительными в соответствии с данным изобретением.
Адъюванты типа матрикса, состоящего из молекулярного комплекса с иммуностимулирующими
свойствами, (ISСОМ®-матрикса), также являются предпочтительными в соответствии с данным изобретением, особенно потому, что было показано, что этот тип адъювантов способен положительно регулировать (повышать) экспрессию MHC Класса II антигенпредставляющими клетками (АПК).
ISСОМ®-матрикс состоит из (необязательно фракционированных) сапонинов (тритерпеноидов) из
Quillaja saponaria, холестерина и фосфолипида. При смешивании с иммуногенным белком полученная
состоящая из частиц композиция представляет собой то, что известно как ISCOM-частица, где сапонин
составляет 60-70% в/в, холестерин и фосфолипид 10-15% в/в и белок 10-15% в/в. Подробности, относящиеся к составу и применению иммуностимулирующих комплексов, могут быть, например, найдены в
- 12 -
006940
вышеуказанных учебниках, касающихся адъювантов, а также Morein B et al., 1995, Clin. Immunother. 3:
461-475, а также Barr IG and Mitchell GF, 1996, Immunol. and Cell Biol. 74: 8-25 (обе статьи включены
здесь в качестве ссылок) обеспечивают полезные инструкции для приготовления полных иммуностимулирующих комплексов.
Другой очень интересной (и, следовательно, предпочтительной) возможностью достижения адъювантного действия является применение способа, описанного в работе Gosselin et al., 1992 (включенной
здесь в качестве ссылки). Вкратце, представление соответствующего антигена, такого как антиген данного изобретения, может быть усилено конъюгацией этого антигена с антителами (или антигенсвязывающими фрагментами антител) против рецепторов Fcγ на моноцитах/макрофагах. В частности, было показано, что конъюгаты между антигеном и анти-FcγRI повышают иммуногенность для целей вакцинации.
Другие возможности включают применение нацеливающих и иммуномодулирующих веществ (inter
alia цитокинов), упомянутых выше в качестве кандидатов для первой и второй частей молекулы в модифицированных версиях OPGL. В этой связи, синтетические индукторы цитокинов, такие как поли I:С,
являются также возможными кандидатами.
Подходящие микобактериальные производные выбраны из группы, состоящей из мурамилдипептида, полного адъюванта Фрейнда, RIBI и диэфира трегалозы, такого как TDM и TDE.
Подходящие иммунонацеливающие адъюванты выбраны из группы, состоящей из лиганда CD40 и
антител CD40 или их специфически связывающих фрагментов (см. обсуждение выше), маннозы, Fabфрагмента и CTLA-4.
Подходящие полимерные адъюванты выбраны из группы, состоящей из углевода, такого как декстран, ПЭГ, крахмал, маннан и манноза; полимера-пластика и латекса, такого как гранулы латекса.
Еще одним представляющим интерес путем модуляции иммунного ответа является включение иммуногена OPGL (необязательно с адъювантами и фармацевтически приемлемыми носителями и наполнителями) в «виртуальный лимфатический узел» (VLN) (патентованное медицинское устройство, разработанное ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501). Это устройство (VLN)
(тонкотрубчатое устройство) имитирует структуру и функцию лимфатического узла. Введение VLN под
кожу создает участок стерильного воспаления с сильным увеличением цитокинов и хемоки-нов. T- и Вклетки, а также АПК быстро отвечают на сигналы опасности, перемещаются к воспаленному участку и
накапливаются в пористом матриксе VLN. Было показано, что необходимая доза антигена, требующаяся
для установления иммунного ответа на антиген, уменьшается при использовании VLN и что иммунная
защита, обеспечиваемая вакцинацией с использованием VLN, превосходила общепринятую иммунизацию с использованием RIBI в качестве адъюванта. Этот способ описан inter alia вкратце в Gelber С et al.,
1998, "Elicitation of Robust Cellular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immunogens Using
a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node", in: "From the Laboratory to the Clinic, Book of
Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, California".
Ожидается, что эта вакцина должна вводиться 1-6 раз в год, например, 1, 2, 3, 4, 5 или 6 раз в год,
индивидууму, нуждающемуся в таком лечении. Ранее было показано, что запоминающий иммунитет,
индуцированный путем применения предпочтительных аутовакцин в соответствии с данным изобретением, не является постоянным, и, следовательно, иммунная система требует периодической стимуляции
OPGL или модифицированными полипептидами OPGL.
Вследствие наследственной изменчивости, различные индивидуумы могут реагировать иммунными
ответами варьирующей силы на один и тот же полипептид. Таким образом, вакцина данного изобретения
может содержать несколько различных полипептидов для увеличения иммунного ответа, см. также приведенное выше обсуждение относительно выбора введений чужеродных Т-клеточных эпитопов. Вакцина
может содержать два или более полипептидов, где все из этих полипептидов являются определенными
выше полипептидами.
Таким образом, вакцина может содержать 3-20 различных модифицированных или немодифицированных полипептидов, например 3-10 различных полипептидов.
Вакцинация нуклеиновыми кислотами
В качестве альтернативы классическому введению вакцины на основе пептидов, способ вакцинации
нуклеиновыми кислотами (известный также как «иммунизация нуклеиновыми кислотами», «генетическая иммунизация» и «генная иммунизация») предоставляет ряд привлекательных признаков.
Во-первых, в противоположность подходу с традиционными вакцинами, вакцинация нуклеиновыми
кислотами не требует дорогостоящего крупномасштабного производства иммуногенного агента (например, в форме ферментации промышленного масштаба микроорганизмов, продуцирующих модифицированный OPGL). Кроме того, нет необходимости в разработке схем очистки и повторной укладки для иммуногена. И, наконец, поскольку вакцинация нуклеиновыми кислотами основывается на биохимическом
аппарате вакцинированного индивидуума для продуцирования продукта экспрессии введенных нуклеиновых кислот, ожидается, что будет иметь место оптимальный посттрансляционный процессинг этого
продукта экспрессии; это особенно важно в случае аутовакцинации, поскольку, как упоминалось выше,
значительная фракция первоначальных В-клеточных эпитопов OPGL должна сохраняться в модифици- 13 -
006940
рованной молекуле и поскольку В-клеточные эпитопы в принципе могут состоять из частей любой
(био)молекулы (например, углевода, липида, белка и т.д.). Таким образом, вполне возможно, что природные параметры гликозилирования и липидирования иммуногена могут быть важными для общей иммуногенности, и это лучше всего гарантируется при продуцировании иммуногена хозяином.
Таким образом, предпочтительный вариант данного изобретения предусматривает проведение
представления модифицированного OPGL иммунной системе путем введения нуклеиновой кислоты
(нуклеиновых кислот), кодирующей модифицированный OPGL, в клетки животного и получения в результате этого экспрессии in vivo этими клетками введенной нуклеиновой кислоты (нуклеиновых кислот).
В этом варианте, вводимой нуклеиновой кислотой является предпочтительно ДНК, которая может
быть в форме голой ДНК, ДНК, приготовленной с заряженными или незаряженными липидами, ДНК,
приготовленной в липосомах, ДНК, включенной в вирусный вектор, ДНК, приготовленной в виде препарата с облегчающим трансфекцию белком или полипептидом, ДНК, приготовленной в виде препарата с
нацеливающим белком или полипептидом, ДНК, приготовленной с агентами кальций-преципитации,
ДНК, связанной с молекулой инертного носителя, ДНК, инкапсулированной в хитине или хитозане, и
ДНК в виде препарата с адъювантом. В этом контексте следует отметить, что практически все рассмотрения, касающиеся использования адъювантов в приготовлении традиционных вакцин, применимы для
приготовления ДНК-вакцин. Таким образом, все приведенные здесь описания, относящиеся к применению адъювантов в контексте вакцин на основе полипептидов, относятся mautatus mutandis (с соответствующими изменениями) к их применению в технологии вакцинации нуклеиновыми кислотами.
Что касается путей введения и схем введения вакцин на основе полипептидов, которые были подробно описаны выше, они также являются применимыми для вакцин на основе нуклеиновых кислот данного изобретения, и все приведенные выше обсуждения, касающиеся способов введения и схем введения
для полипептидов, относятся mutatis mutandis (с соответствующими изменениями) и к нуклеиновым кислотам. К этому следует добавить, что вакцины на основе нуклеиновых кислот могут подходящим образом вводиться внутривенно и внутриартериально. Кроме того, в данной области хорошо известно, что
вакцины на основе нуклеиновых кислот могут быть введены с использованием так называемого генного
«ружья», и, следовательно, этот и эквивалентные способы введения рассматриваются как часть данного
изобретения. Наконец, сообщалось также, что применение VLN во введении нуклеиновых кислот давало
хорошие результаты, и, таким образом, этот конкретный способ введения является особенно предпочтительным.
Кроме того, нуклеиновая кислота (нуклеиновые кислоты), используемая в качестве агента иммунизации, может содержать участки, кодирующие 1-ую, 2-ую и/или 3-ю части молекулы, например, в форме
иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсуждаемые в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта охватывает наличие кодирующего участка
для аналога и кодирующего участка для иммуномодулятора в различных рамках считывания или, по
меньшей мере, под контролем разных промоторов. Посредством этого можно избежать того, что аналог
или эпитоп продуцируется в виде партнера слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть
использованы два отдельных нуклеотидных фрагмента, но это менее предпочтительно вследствие преимущества гарантированной коэкспрессии в случае присутствия обоих кодирующих участков в одной и
той же молекуле.
Таким образом, данное изобретение относится также к композиции для индукции продуцирования
антител против OPGL, причем эта композиция содержит фрагмент нуклеиновой кислоты или вектор
данного изобретения (см. обсуждение векторов ниже) и фармацевтически и иммунологически приемлемый наполнитель, и/или носитель, и/или адъювант, описанные выше.
При нормальных условиях, кодирующую вариант OPGL нуклеиновую кислоту вводят в форме вектора, в котором экспрессия находится под контролем вирусного промотора. В отношении более подробных обсуждений векторов в соответствии с данным изобретением, см. обсуждение ниже. Подробные
описания, касающиеся приготовления и применения вакцин на основе нуклеиновых кислот, также доступны, сравните Donnely JJ et al., 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 и Donnely JJ et al., 1997, Life Sciences 60: 163-172. Обе эти работы включены здесь в качестве ссылок.
Живые вакцины
Третьей альтернативой для проведения представления модифицированного OPGL иммунной системе является использование технологии живых вакцин. В вакцинации живыми вакцинами, представление иммунной системе выполняют введением животному непатогенного микроорганизма, который был
трансформирован фрагментом нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный OPGL, или вектором, содержащим такой фрагмент нуклеиновой кислоты, включенный в него. Непатогенный микроорганизм может быть любым подходящим ослабленным бактериальным штаммом (ослабленным посредством пассирования или посредством удаления патогенных продуктов экспрессии при помощи технологии
рекомбинантных ДНК), например Mycobacterium bovis BCG., непатогенные Streptococcus spp., E. coli,
Salmonella spp., Vibrio cholerae, Shigella, и т.д. Обзоры с описаниями приготовления известных в данной
области живых вакцин могут быть найдены, например, в Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 и Walker
- 14 -
006940
PD, 1992, Vaccine 10: 977-990, обе статьи включены здесь в качестве ссылок. В отношении подробностей
относительно фрагментов нуклеиновых кислот и векторов, используемых в таких живых вакцинах, см.
обсуждение ниже.
В качестве альтернативы бактериальным живым вакцинам, фрагмент нуклеиновой кислоты данного
изобретения, обсуждаемый ниже, может быть включен в невирулентный вирусный вакцинный вектор,
такой как штамм вируса коровьей оспы или любой другой подходящий поксвирус.
Обычно непатогенный микроорганизм или вирус вводят только один раз животному, но в некоторых случаях может быть необходимым введение микроорганизма более чем один раз, на протяжении
жизни для поддержания защитного иммунитета. Предполагается даже, что схемы иммунизации, такие
как описанные выше для вакцинации полипептидами, будут применимы при использовании живых или
вирусных вакцин.
Альтернативно, вакцинацию живыми или вирусными вакцинами комбинируют с предварительной
или последующей вакцинацией полипептидом и/или нуклеиновой кислотой. Например, можно выполнить первичную иммунизацию живой или вирусной вакциной с последующими последовательными бустер-иммунизациями с использованием подхода с полипептидом или нуклеиновой кислотой.
Микроорганизм или вирус могут быть трансформированы нуклеиновой кислотой (нуклеиновыми
кислотами), содержащей участки, кодирующие 1-ую, 2-ую и/или 3-ю части молекулы, например, в форме
иммуномодулирующих веществ, описанных выше, таких как цитокины, обсужденные в качестве применимых адъювантов. Предпочтительная версия этого варианта охватывает наличие кодирующего участка
для аналога и кодирующего участка для иммуномодулятора в различных рамках считывания или, по
меньшей мере, под контролем разных промоторов. Таким образом можно избежать того, что аналог или
эпитоп продуцируется в виде партнеров слияния с иммуномодулятором. Альтернативно, могут быть использованы два отдельных нуклеотидных фрагмента в качестве трансформирующих агентов. Конечно,
наличие 1-ой, и/или 2-ой, и/или 3-ей частей молекулы в одной и той же рамке считывания может обеспечить в качестве продукта экспрессии аналог данного изобретения, и такой вариант является особенно
предпочтительным в соответствии с данным изобретением.
Применение способа данного изобретения в лечении заболевания
Как должно быть понятно из приведенных выше обсуждений, обеспечение способа данного изобретения позволяет контролировать заболевания, характеризующиеся избыточной потерей костной массы. В
этом контексте, заболевание остеопороз является основной мишенью для способа изобретения, но разрежение кости, связанное со сложными переломами костей, также является возможной мишенью для
лечения/ослабления. Таким образом, важный вариант способа данного изобретения для отрицательной
регуляции активности OPGL предусматривает лечение, и/или профилактику, и/или ослабление остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией кости, причем этот способ предусматривает отрицательную регуляцию активности OPGL в соответствии со способом данного изобретения до такой степени, что скорость резорбции кости значимо уменьшается.
В данном контексте такое значимое уменьшение резорбции костей является по меньшей мере 3% в
сравнении с патологической скоростью, но рассматриваются более высокие проценты, такие как по
меньшей мере 5%, по меньшей мере 7%, по меньшей мере 9%, по меньшей мере 11%, по меньшей мере
13%, по меньшей мере 15% и по меньшей мере 17%, но ожидаются даже более высокие проценты, такие
как по меньшей мере 20%, или даже по меньшей мере 30%. Особенно предпочтительным является то,
что уменьшение резорбции костей приводит к инверсии баланса между костеобразованием и резорбцией
кости, т.е. то, что скорость костеобразования начинает превышать скорость резорбции костей. Конечно,
этот дисбаланс не должен сохраняться (так как это привело бы к остеопетрозу), но путем тщательного
контроля числа и иммунологического эффекта иммунизаций индивидуума, нуждающегося в лечении,
можно получить баланс на протяжении времени, который приводит к нетто-сохранению костной массы.
Альтернативно, если в индивидууме способ данного изобретения не может прекратить рарефикацию
костей, способ данного изобретения может (необязательно в комбинации с другими известными способами для снижения рарефикации костей у пациентов с остеопорозом) быть использован для получения
значимого уменьшения рарефикации костей, продлевая тем самым время, в течение которого достаточная костная масса присутствует в этом индивидууме.
Способы измерения скорости резорбции костей и костеобразования известны в данной области.
При помощи биохимических анализов можно оценивать скорость резорбции кости путем измерения
концентрации в крови определенных фрагментов коллагена типа I (см. WO 93/15107 и WO 94/14844).
Альтернативно, скорость разрежения костей может быть оценена физическими способами; характерные
описания в данной области способов для оценки костной массы при помощи неинвазивных, физических
способов могут быть найдены в WO 88/06862, WO 94/12855, WO 95/14431 и WO 97/00643.
Пептиды, полипептиды и композиции данного изобретения
Как понятно из вышеописанного, данное изобретение основывается на концепции иммунизации
индивидуумов против антигена OPGL для непосредственного получения уменьшенной активности остеокластов. Предпочтительным способом получения такой иммунизации является использование модифицированных версий OPGL с обеспечением посредством этого молекул, которые не были ранее описа- 15 -
006940
ны в данной области.
Авторы изобретения считают, что описанные здесь модифицированные молекулы OPGL являются
сами обладающими признаками изобретения, и, таким образом, важная часть данного изобретения относится к аналогу OPGL, который произведен из OPGL животного, в который введена модификация, результатом чего является то, что иммунизация животного этим аналогом индуцирует продуцирование
антител, реагирующих специфически с немодифицированным полипептидом OPGL. Предпочтительно,
характер этой модификации согласуется с типами модификаций, описанными выше при обсуждении
различных вариантов способа данного изобретения при использовании модифицированного OPGL. Таким образом, любое представленное здесь описание, касающееся модифицированных молекул OPGL,
является важным для цели описания аналогов OPGL данного изобретения, и любое из подобных описаний применимо mutatis mutandis (с соответствующими изменениями) к описанию этих аналогов.
Следует отметить, что предпочтительные модифицированные молекулы OPGL содержат модификации, обуславливающие полипептид, имеющий идентичность последовательности по меньшей мере
70% с OPGL или его субпоследовательностью с длиной по меньшей мере 10 аминокислот. Более высокие
идентичности являются предпочтительными, например, по меньшей мере 75% или даже по меньшей мере 80, 85, 90 или 95%. Идентичность последовательности для белков и нуклеиновых кислот может быть
рассчитана как (Nref - Ndif)⋅100/Nref, где Ndif обозначает общее число неидентичных остатков в двух последовательностях при сопоставлении и где Nref обозначает число остатков в одной из этих последовательностей. Таким образом, последовательность ДНК AGTCAGTC будет иметь идентичность последовательности 75% с последовательностью AATCAATC (Ndif=2 и Nref =8).
Данное изобретение относится также к композициям, применимым в применении способа данного
изобретения на практике. Таким образом, данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество полипептида OPGL, который является «своим» белком в животном, причем указанный полипептид OPGL готовят вместе с иммунологически приемлемым адъювантом, чтобы разрушить аутотолерантность животного в отношении полипептида OPGL,
причем эта композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый
разбавитель, и/или наполнитель, и/или носитель, и/или эксипиент. Другими словами, эта часть данного
изобретения относится к композициям природно встречающихся полипептидов OPGL, которые были
описаны в связи с вариантами способа данного изобретения.
Данное изобретение относится также к иммуногенной композиции, содержащей иммунологически
эффективное количество определенного выше аналога OPGL, причем указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически и иммунологически приемлемый разбавитель, и/или наполнитель,
и/или носитель, и/или эксипиент и необязательно адъювант. Другими словами, эта часть изобретения
относится к композициям модифицированного OPGL, по существу, описанного выше. Выбор адъютантов, носителей и наполнителей соответствует тому, что обсуждалось выше при описании приготовления
модифицированного и немодифицированного OPGL для применения в обладающем признаком изобретения способе отрицательной регуляции OPGL.
Эти полипептиды получают в соответствии со способами, хорошо известными в данной области.
Более длинные полипептиды обычно получают с использованием технологии рекомбинантных ДНК,
включающей введение последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аналог OPGL, в подходящий вектор, трансформацию подходящей клетки-хозяина этим вектором, экспрессию этой последовательности нуклеиновой кислоты, извлечение продукта экспрессии из клеток-хозяев или их культурального супернатанта и последующую очистку и необязательную дополнительную модификацию, например, повторную укладку или дериватизацию.
Более короткие пептиды предпочтительно получают при помощи хорошо известных способов синтеза пептидов в твердой или жидкой фазе. Однако недавний прогресс в этой технологии сделал возможным получение полноразмерных полипептидов и белков при помощи этих способов, и, таким образом, в
сфере действия данного изобретения находится также получение длинных конструкций при помощи
синтетических способов.
Фрагменты нуклеиновых кислот и векторы данного изобретения
Из приведенного выше описания должно быть понятно, что модифицированные полипептиды
OPGL могут быть получены при помощи технологии рекомбинантных генов, но также при помощи химического синтеза или неполного химического синтеза; две последние возможности являются особенно
предпочтительными, когда модификация состоит в связывании с белковыми носителями (такими как
KLH, дифтерийный токсоид, столбнячный токсоид и БСА) и небелковыми молекулами, такими как углеводные полимеры и, конечно, также в случае, когда модификация предусматривает присоединение боковых цепей или боковых групп к полученной из полипептида OPGL пептидной цепи.
Для цели технологии рекомбинантных генов и, конечно, также для цели иммунизации нуклеиновыми кислотами, фрагменты нуклеиновых кислот, кодирующие модифицированный OPGL, являются важными химическими продуктами. Таким образом, важная часть изобретения относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, который кодирует аналог OPGL, т.е. произведенный из OPGL полипептид, который
либо содержит природную последовательность OPGL, к которой присоединен или в которую встроен
- 16 -
006940
партнер слияния, либо произведенный из OPGL полипептид, в который был введен чужеродный Tклеточный эпитоп посредством инсерции и/или присоединения, предпочтительно посредством замены
и/или делеции. Фрагменты нуклеиновых кислот данного изобретения являются либо ДНК-, либо РНКфрагментами.
Фрагменты нуклеиновых кислот данного изобретения обычно встраивают в подходящие векторы
для образования клонирующих или экспрессирующих векторов, несущих фрагменты нуклеиновых кислот данного изобретения; такие новые векторы также являются частью данного изобретения. Подробности, касающиеся конструирования этих векторов данного изобретения, будут обсуждаться в контексте
трансформированных клеток и микроорганизмов ниже. Эти векторы могут, в зависимости от цели и типа
применения, быть в форме плазмид, фагов, космид, минихромосом или вируса, но также важным вектором является голая ДНК, которая экспрессируется лишь временно (транзисторно) в определенных клетках. Предпочтительные клонирующие и экспрессирующие векторы данного изобретения способны к автономной репликации, таким образом делая возможными высокие числа копий для целей экспрессии
высокого уровня или репликации высокого уровня для последующего клонирования.
Вектор данного изобретения в общих чертах содержит следующие признаки в направлении 5'→3' и
в функциональной связи: промотор для запуска экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты данного
изобретения, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид,
обеспечивающий секрецию (во внеклеточную фазу или, если возможно, в периплазму) или интеграцию в
мембрану полипептидного фрагмента, фрагмент нуклеиновой кислоты данного изобретения и необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую терминатор. При работе с экспрессирующими векторами в штаммах-продуцентах или клеточных линиях-продуцентах, для целей генетической стабильности трансформированных клеток предпочтительно, чтобы вектор при введении в клеткухозяина интегрировался в геном клетки-хозяина. В противоположность этому, при работе с векторами,
используемыми для выполнения экспрессии in vivo в животном (т.е. при использовании этого вектора
для ДНК-вакцинации), по причинам безопасности предпочтительно, чтобы этот вектор не был способен
интегрироваться в геном клетки-хозяина; обычно используют голую ДНК или неинтегрирующиеся вирусные векторы, выбор которых хорошо известен лицам с обычной квалификацией в данной области.
Векторы данного изобретения применимы для трансформации клеток-хозяев с целью получения
модифицированного полипептида OPGL данного изобретения. Такие трансформированные клетки, которые также являются частью данного изобретения, могут быть культивируемыми клетками или клеточными линиями, используемыми для размножения фрагментов нуклеиновых кислот и векторов данного
изобретения или используемыми для рекомбинантного получения модифицированных полипептидов
OPGL данного изобретения. Альтернативно, трансформированные клетки могут быть пригодными
штаммами живых вакцин, в которые был встроен фрагмент нуклеиновой кислоты (одна единственная
копия или множественные копии) таким образом, чтобы выполнять секрецию или интегрирование в бактериальную мембрану или клеточную стенку модифицированного OPGL.
Предпочтительные трансформированные клетки данного изобретения являются микроорганизмами,
такими как бактерии (такие как виды Escherichia [например, E. coli], Bacillus [например, Bacillus subtilis],
Salmonella или Mycobacterium [предпочтительно непатогенная, например, M. bovis BCG]), дрожжи (такие
как Saccharomyces cerevisiae), и простейшие. Альтернативно, трансформированные клетки получают из
многоклеточного организма, такие как клетка гриба, клетка насекомого, растительная клетка или клетка
млекопитающего. Наиболее предпочтительными являются клетки, полученные из человека, см. обсуждение клеточных линий и векторов ниже. Недавние результаты были многообещающими в отношении
применения коммерчески доступной клеточной линии Drosophila melanogaster (клеточной линии Schneider 2 (S2) и векторной системы, доступных из Invitrogen) для рекомбинантного получения полипептидов
в лаборатории заявителей, и, следовательно, эта экспрессионная система является особенно предпочтительной.
Для целей клонирования и/или оптимизированной экспрессии предпочтительно, чтобы трансформированная клетка была способна реплицировать фрагмент нуклеиновой кислоты данного изобретения.
Клетки, экспрессирующие этот фрагмент нуклеиновой кислоты, являются предпочтительными применимыми вариантами данного изобретения; они могут быть также использованы для лабораторного (небольшого масштаба) или крупномасштабного получения модифицированного OPGL или, в случае непатогенных бактерий, получения его в качестве вакцинных компонентов в живой вакцине.
При получении модифицированного OPGL данного изобретения с использованием трансформированных клеток, удобным, хотя далеко не необходимым, является то, что продукт экспрессии либо транспортируется из клеток в культуральную среду, либо переносится на поверхность трансформированной
клетки.
После идентификации эффективной клетки-продуцента, предпочтительным является установление
на ее основе стабильной клеточной линии, которая несет вектор данного изобретения и которая экспрессирует фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий модифицированный OPGL. Предпочтительно, эта
стабильная клеточная линия секретирует или несет аналог OPGL данного изобретения, облегчая тем самым его очистку.
- 17 -
006940
Обычно используют плазмидные векторы, содержащие репликон и регуляторные последовательности, произведенные из видов, совместимых с этой клеткой-хозяином, вместе с этими хозяевами. Вектор
обычно несет сайт репликации, а также маркерные последовательности, которые способны обеспечить
фенотипический отбор в трансформированных клетках. Например, E. coli обычно трансформируют с
использованием pBR322, плазмиды, полученной из видов E. coli (см., например, Bolivar et al., 1977).
Плазмида pBR322 содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину и, следовательно, обеспечивает легкое средство для идентификации трансформированных клеток. Плазмида pBR, или другая
микробная плазмида или фаг, должны также содержать, или быть модифицированы, чтобы содержать,
промоторы, которые могут быть использованы прокариотическим микроорганизмом для экспрессии.
Эти промоторы, наиболее часто используемые в рекомбинантной конструкции ДНК, включают в
себя промоторные системы B-лактамазы (пенициллиназы) и лактозы (Chang et al., 1978; Itakura et al.,
1977; Goeddel et al., 1979), и промоторную систему триптофана (trp) (Goeddel et al., 1979; EP-A-0 036
776). Хотя эти промоторы являются наиболее обычно используемыми, были обнаружены и использованы
другие микробные промоторы, и детали в отношении их нуклеотидных последовательностей были опубликованы, что позволяет работнику с квалификацией в данной области лигировать их функционально с
плазмидными векторами (Siebwenlist et al., 1980). Некоторые гены из прокариот могут быть экспрессированы эффективно в E. coli от их собственных промоторных последовательностей, что позволяет устранить необходимость присоединения другого промотора синтетическим способом.
Кроме прокариот, могут быть также использованы эукариотические микробы, такие как дрожжевые
культуры, и в этом случае промотор должен быть способен запускать экспрессию. Saccharomyces cerevisiae, или обычные хлебопекарные дрожжи, являются наиболее обычно применяемым среди эукариотических микроорганизмов, хотя ряд других штаммов являются обычно доступными. Для экспрессии в
Saccharomyces обычно используют, например, плазмиду YRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al.,
1979; Tschemper et al., 1980). Эта плазмида уже содержит ген trp1, который обеспечивает селектируемый
маркер для мутантного штамма дрожжей, неспособного расти в триптофане, например, ATCC № 44076
или РЕР4-1 (Jones, 1977). Присутствие trp1-повреждения в качестве характеристики генома этой дрожжевой клетки-хозяина обеспечивает затем эффективную среду для детектирования трансформации по росту
в отсутствие триптофана.
Подходящие промоторные последовательности в дрожжевых векторах включают промоторы для 3фосфоглицераткиназы (Hitzman et al., 1980) или других гликолитических ферментов (Hess et al., 1968;
Holland et al., 1978), таких как енолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа,
триозофосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа. В конструировании подходящих экспрессионных плазмид, последовательности терминации, связанные с этими генами, также лигируют в
экспрессионный вектор 3' (справа) от последовательности, которую желательно экспрессировать, для
обеспечения полиаденилирования мРНК и терминации.
Другие промоторы, которые имеют дополнительное преимущество транскрипции, регулируемой
условиями выращивания, представляют собой промоторный участок алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома С, кислой фосфатазы, расщепляющих ферментов, связанных с азотным метаболизмом, и вышеупомянутой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Любой плазмидный вектор, содержащий совместимый с дрожжами промотор, начало
репликации и последовательности терминации, является пригодным.
Кроме микроорганизмов в качестве хозяев могут быть также использованы культуры клеток, полученных из многоклеточных организмов. В принципе, любая такая клеточная культура является пригодной, независимо от того, является ли она культурой клеток позвоночных или клеток беспозвоночных
животных. Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных животных в культуре (культуре ткани) стало рутинной процедурой в последние годы (Tissue
Culture, 1973). Примерами таких применимых хозяйских клеточных линий являются клетки Vero и клетки HeLa, линии клеток яичника Китайского хомячка (CHO) и клетки W138, BHK, COS-7 293, Spodoptera
frugiperda (SF) (коммерчески доступные в виде полных экспрессионных систем из, inter alia, Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meriden, CT 06450, U.S.A. и из Invitrogen), и клеточные линии MDCK. В
данном изобретении особенно предпочтительной клеточной линией является S2, доступная из Invitrogen,
PO Box 2312, 9704 CH Groningen, The Netherlands.
Экспрессирующие векторы для таких клеток обычно включают (если необходимо) начало репликации, промотор, локализованный впереди экспрессируемого гена, вместе с любыми необходимыми сайтами связывания рибосом, сайтами сплайсинга РНК, сайтами полиаденилирования и последовательностями терминации транскрипции.
Для использования в клетках млекопитающих, регуляторные функции на экспрессирующих векторах часто обеспечиваются вирусным материалом. Например, обычно используемые промоторы часто
получают из вируса полиомы, аденовируса 2, и наиболее часто обезьяньего вируса 40 (SV40). Ранний и
поздний промоторы вируса SV40 являются особенного применимыми, так как оба эти промотора легко
получают из вируса в виде фрагмента, который также содержит начало репликации вируса SV40 (Fiers et
- 18 -
006940
al., 1978). Могут быть также использованы меньшие или большие фрагменты SV40 при условии, что
включена последовательность приблизительно 250 п.н., простирающаяся от HindIII-сайта в направлении
BglI-сайта, локализованного в начале репликации вируса. Кроме того, также возможно и часто желательно использование промотора или регуляторных последовательностей, обычно связанных с целевой генной последовательностью, при условии, что такие регуляторные последовательности совместимы с системами клетки-хозяина.
Начало репликации может быть обеспечено либо конструированием вектора таким образом, что он
включает в себя экзогенный участок начала репликации, такой, который может быть получен из SV40
или другого вируса (например, вируса полиомы, аденовируса, VSV, BPV), или он может быть обеспечен
механизмом репликации клетки-хозяина. Если вектор интегрирован в хромосому клетки-хозяина, последний механизм является часто достаточным.
Идентификация применимых аналогов OPGL
Специалисту в данной области должно быть понятно, что не все возможные варианты или модификации нативного OPGL будут обладать способностью индуцировать антитела в животном, которые являются перекрестно-реактивными с нативной формой. Однако нетрудно создать эффективный стандартный скрининг на модифицированные молекулы OPGL, которые удовлетворяют минимуму требований
для обсуждаемой здесь иммунологической реактивности. Таким образом, другая часть данного изобретения относится к способу идентификации модифицированного полипептида OPGL, который способен
индуцировать антитела против немодифицированного OPGL в видах животных, в которых немодифицированный полипептид OPGL является (неиммуногенным) «своим» (ауто) белком, причем этот способ
предусматривает
получение, посредством синтеза пептидов или способами генетической инженерии, набора взаимоотличающихся модифицированных полипептидов OPGL, в которых аминокислоты были добавлены,
вставлены, делетированы или заменены в аминокислотной последовательности полипептида OPGL вида
животного, с образованием таким образом аминокислотных последовательностей в этом наборе, которые
содержат Т-клеточные эпитопы, которые являются чужеродными для данного вида животного, или получение набора фрагментов нуклеиновых кислот, кодирующих набор взаимоотличающихся модифицированных полипептидов OPGL,
испытание членов этого набора модифицированных полипептидов OPGL или фрагментов нуклеиновых кислот на их способность индуцировать продуцирование антител этим видом животного против
немодифицированного OPGL, и
идентификацию и необязательно выделение члена (членов) этого набора модифицированных полипептидов OPGL, который значимо индуцирует продуцирование антител против немодифицированного
OPGL в этом виде, или идентификацию и необязательно выделение полипептидного продукта экспрессии, кодируемого членами набора фрагментов нуклеиновых кислот, который значимо индуцирует продуцирование антител против немодифицированного OPGL в этом виде животного.
В этом контексте, "набор взаимоотличающихся модифицированных полипептидов OPGL" представляет собой коллекцию неидентичных модифицированных полипептидов OPGL, которые, например,
были отобраны на основе обсужденных выше критериев (например, в сочетании с исследованиями кругового дихроизма, ЯМР-спектров и/или рентгенограмм). Этот набор может состоять всего лишь из нескольких членов, но предполагается, что этот набор может содержать несколько сотен членов.
Испытание членов этого набора может в конечном счете проводиться in vivo, но может быть использован ряд испытаний in vitro для сужения числа модифицированных молекул, которые будут служить цели данного изобретения.
Поскольку задача введения чужеродных Т-клеточных эпитопов заключается в поддержании Вклеточного ответа с помощью T-клеток, предварительным необходимым условием является индуцирование пролиферации Т-клеток модифицированным OPGL. Пролиферация Т-клеток может тестироваться
при помощи стандартизованных анализов пролиферации in vitro. Вкратце, из субъекта получают пробу,
обогащенную Т-клетками, и затем выдерживают в культуре. Культивируемые Т-клетки приводят в контакт с АПК этого субъекта, которые предварительно поглощали модифицированную молекулу и процессировали ее для представления ее Т-клеточных эпитопов. Пролиферацию Т-клеток подвергают мониторингу и сравнивают с подходящим контролем (например, с Т-клетками в культуре, контактированными с
АПК, которые процессировали интактный, нативный OPGL). Альтернативно, пролиферация может быть
измерена путем определения концентрации соответствующих цитокинов, высвобождаемых этими Тклетками в ответ на их узнавание чужеродных Т-клеток.
Получив результат о высокой вероятности того, что по меньшей мере один модифицированный
OPGL набора любого типа способен индуцировать продуцирование антител против OPGL, можно получить иммуногенную композицию, содержащую по меньшей мере один модифицированный полипептид
OPGL, который способен индуцировать антитела против немодифицированного OPGL в виде животного,
в котором этот немодифицированный OPGL является "своим" (ауто)белком, причем этот способ предусматривает смешивание члена (членов) набора, который значимо индуцирует продуцирование антител в
этом виде животного, которые являются реактивными с OPGL, с фармацевтически и иммунологически
- 19 -
006940
приемлемым носителем, и/или наполнителем, и/или разбавителем, и/или эксипиентом необязательно в
комбинации по меньшей мере с одним фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом.
Приведенные выше аспекты данного изобретения, относящиеся к испытанию наборов полипептидов, удобно проводить путем первоначального получения ряда взаимоотличающихся последовательностей нуклеиновых кислот или векторов данного изобретения, встраивания их в подходящие экспрессирующие векторы, трансформации подходящих клеток-хозяев этими векторами и экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот данного изобретения. Эти стадии могут сопровождаться выделением
продуктов экспрессии. Предпочтительным является получение этих последовательностей нуклеиновых
кислот и/или векторов при помощи способов, предусматривающих использование способа молекулярной
амплификации, такого как ПЦР, или посредством синтеза нуклеиновых кислот.
Другая часть данного изобретения относится к способу лечения, профилактики или ослабления заболеваний, характеризующихся избыточной резорбцией костей в животном, в том числе человеке, причем этот способ предусматривает введение этому животному эффективного количества по меньшей мере
одного вещества, отличающегося от остеопротегерина, которое блокирует стимулирующее действие
OPGL на активность остеокластов. Авторы изобретения считают, что в настоящее время такой подход
никогда не предполагался в данной области.
Предпочтительный вариант этой части данного изобретения включает применение OPGLспецифического антитела (поликлонального или моноклонального) или его специфически связывающего
варианта в качестве вещества, блокирующего стимулирующее действие OPGL. Предпочтительно, чтобы
это антитело было молекулой IgG или IgM, или чтобы специфически связывающий вариант был произведен из IgG или IgM. Удобно, чтобы специфически связывающий вариант этого антитела был Fabфрагментом, F(ab')-фрагментом, гуманизированным моноклональным антителом или его фрагментом
или ди- или мультимерным фрагментом антитела, таким как диатело (биспецифическая и димерная синтетическая, произведенная из антитела молекула, производимая Cambridge Antubody Technology).
Пример
Было решено клонировать или синтезировать кДНК, кодирующие мышиный и человеческий OPGL,
в укороченной версии, содержащей аминокислотные остатки 158-316 в случае мышей и остатки 159-317
в случае человека (номера соответствуют нумерации в последовательностях SEQ ID NO:2 и 4 соответственно). Поскольку эти укороченные версии проявляют биологическую активность, логичным является
направление аутоантител против этой части OPGL. Кроме того, этот подход "уменьшает" белки и, следовательно, ими становится легче манипулировать.
Синтетическая кДНК, кодирующая остатки 158-316 мышиного OPGL, была синтезирована путем
удаления субоптимальных кодонов Escherichia coli и Pichia pastoris из опубликованной последовательности. Кроме того, N-концевой гистидиновый маркер (тэг), часть сайта расщепления сигнальной последовательности альфа-фактора пола из Saccharomyces cerevisiae и сайты подходящих рестрикционных ферментов были включены в открытую рамку считывания (см. SEQ ID NO:7).
Эту кДНК, кодирующую мышиный OPGL дикого типа, клонировали в стандартный экспрессирующий вектор Escherichia coli (pTrc99a) с использованием рестрикционных ферментов BspI и HindIII и
стандартный клонирующий вектор (pBluescript KS+) с использованием рестрикционных ферментов SacI
и KpnI (с получением SEQ ID NO:9).
Экспрессия в клетках Escherichia coli приводила к приблизительно 30% рекомбинантного OPGL от
общего белка Escherichia coli. Этот белок повторно укладывали и очищали с использованием следующей
процедуры.
1. Клетки собирают центрифугированием.
2. Клетки ресуспендируют в забуференном фосфатом солевом растворе (ЗФР) и повторно центрифугируют.
3. Супернатант выбрасывают и клетки ресуспендируют в трех объемах (100 мМ
Трис[гидроксиметил]аминометангидрохлорид, 5 мМ дитиотреитол (ДТТ), 0,5 M NaCl, рН 8,0).
4. К клеткам добавляют 8 мкл 50 мМ ПМСФ и 80 мкл лизоцима (10 мг/мл) на грамм клеток и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин.
5. На каждый грамм осадка клеток добавляют 4 мг дезоксихлорной кислоты и эту суспензию инкубируют при 37°C, пока она не становится вязкой.
6. Добавляют 20 мкл ДНКазы (1 мг/мл) на грамм веса клеток и МgСl2 до 5 мМ и суспензию инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
7. Суспензию обрабатывают ультразвуком на льду до исчезновения вязкости.
8. После центрифугирования (20000 х g в течение 30 мин) осадок ресуспендируют в Н2О, повторно
центрифугируют и ресуспендируют в 3 мл 1 M мочевины на грамм веса клеток.
9. После центрифугирования (20000 х g в течение 30 мин) осадок ресуспендируют в 1 M гуанидингидрохлориде, 100 мМ Трис[гидроксиметил]аминометангидрохлориде, рН 7,5.
10. После центрифугирования (20000 х g в течение 30 мин) осадок ресуспендируют в 6 M гуанидингидрохлориде, 20 мМ 100 мМ Трис[гидроксиметил]аминометангидрохлориде, 5% этаноле, 1% бетамеркаптоэтаноле, рН 8,0, и перемешивают при 4°С в течение ночи.
- 20 -
006940
11. После центрифугирования (40000 х g в течение 1-4 ч) супернатант фильтруют и хранят при 20°C.
12. Солюбилизированные тела включения отделяют гель-фильтрационной хроматографией с использованием материала Superdex 200 (Pharmacia).
13. Фракции, содержащие рекомбинантный OPGL, объединяют и разбавляют до 1 мг/мл 1,5 M гуанидингидрохлоридом, 20 мМ трис[гидроксиметил]аминометангидрохлоридом, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.
14. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°C против 10 объемов 1,5 M гуанидингидрохлорида, 20 мМ трис[гидроксиметил]аминометангидрохлорида, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.
15. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°С против 10 объемов 1,0 M гуанидингидрохлорида, 20 мМ трис[гидроксиметил]аминометангидрохлорида, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.
16. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°С против 10 объемов 0,5 M гуанидингидрохлорида, 20 мМ трис[гидроксиметил]аминометангидрохлорида, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.
17. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°C против 10 объемов 20 мМ трис[гидроксиметил] аминометангидрохлорида, 150 мМ аргинина, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.
18. Этот материал диализуют в течение ночи при 4°C против 10 объемов 20 мМ
трис[гидроксиметил]аминометангидрохлорида, 150 мМ аргинина, 1 мМ ДТТ, рН 7,5.
19. Повторно уложенный материал лиофилизируют и хранят при -20°C.
Эффективность повторной укладки с использованием этой процедуры равна приблизительно 40%, а
чистота превышает 65%. Эта процедура очистки и повторной укладки все еще является предметом дальнейшего усовершенствования. Исследуется повторная укладка при иммобилизации и ферментативное
удаление гистидинового маркера (тэга) будет проводиться, по существу, как описано Pedersen et al., 1999.
Природа этого рекомбинантного белка была охарактеризована и подтверждена с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ, N-концевого секвенирования, аминокислотного анализа и масс-спектрометрии.
Проводится конструирование мутанта с заменой цистеина мышиного OPGL дикого типа (в котором
цистеин, соответствующий аминокислотному остатку в SEQ ID NO:4 заменен серином; ср. SEQ ID
NO:11 и SEQ ID NO:12). Это сделано для исключения потенциальных проблем стабильности в случае
очищенного рекомбинантного белка. Этот мутированный укороченный OPGL будет служить основой
для вакцинных конструкций в полной аналогии с приведенным ниже описанием, которое дается для
ДНК, имеющей последовательность SEQ ID NO:9. Далее, соответствующий Cys→Ser-мутант (где Cys221 является замененным) человеческого OPGL будет также получен для тех же самых целей.
Вакцинные молекулы конструируют сначала сравниванием или заменой введением либо эпитопа
Р2, либо эпитопа Р30 из столбнячного токсоида в выбранных положениях. Другие подходящие иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы могут быть использованы в более поздней стадии.
Выбранные положения для введения изменения выбирают на основе знания существующих или
предсказанных В-клеточных эпитопов и предсказанных элементов вторичной структуры нативной молекулы, а также с использованием сопоставлений с существующими трехмерными структурами TNFα
(1a8m.pdb) и лиганда CD40 (laly.pdb) для моделирования вторичной и третичной структуры внеклеточной части OPGL. Введение в мышиную молекулу будет иметь место в зонах, соответствующих аминокислотным остаткам 170-192, 198-218, 221-246, 256-261 и 285-316 (см. нумерацию аминокислот в SEQ ID
NO:4), тогда как введение в молекуле человека будет иметь место в зонах, соответствующих аминокислотным остаткам 171-193, 199-219, 222-247, 257-262 и 286-317.
В настоящее время четыре варианта мышиного OPGL были сконструированы и экспрессированы
рекомбинантно в Escherichia coli. ДНК, кодирующая mOPGL[158-316] P30[256-261], с N-концевым гистидиновым маркером (тэгом) (SEQ ID NO:13): ПЦР SEQ ID NO:9 проводили с использованием SEQ ID
NO:22 и 25 в качестве праймеров. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами SacII и KpnI и
затем очищали из агарозного геля. Вторую ПЦР с использованием SEQ ID NO:9 в качестве матрицы проводили с использованием праймера SEQ ID NO:26 и вектор-специфического праймера. Полученный
ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами KpnI и HindIII. Затем оба фрагмента лигировали с SEQ ID
NO:9 в pBluescript KS+, расщепленной SacII и HindIII. Для коррекции мутации одного основания в этой
конструкции проводили ПЦР с использованием этой конструкции в качестве матрицы с праймерами SEQ
ID NO:33 и 29. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами PstI + EcoRI, очищали в геле и
затем лигировали с ошибочной конструкцией, расщепленной PstI и EcoRI. Затем подтвержденную конструкцию (SEQ ID NO:13) переносили в рТrс99а с использованием рестриктаз BspHI и HindIII.
ДНК, кодирующая mOPGL[158-316]_P2[256-261], с N-концевым гистидиновым маркером (тэгом)
(SEQ ID NO:15): ПЦР проводили с использованием праймеров SEQ ID NO:27 и 28 без матрицы. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами PstI и EcoRI и затем очищали из агарозного геля. Затем полученный фрагмент лигировали с SEQ ID NO:9 в pBluescript KS+, расщепленной SacII и HindIII.
Затем подтвержденную конструкцию (SEQ ID NO: 15) переносили в рТrс99а с использованием рестриктаз BspHI и HindIII.
ДНК, кодирующая mOPGL[158-316]_P2[288-302], с N-концевым гистидиновым маркером (тэгом)
(SEQ ID NO:17): ПЦР SEQ ID NO:9 проводили с использованием праймеров SEQ ID NO:22 и 29. Полу- 21 -
006940
ченный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами PstI и BstBI и затем очищали из агарозного геля. Вторую ПЦР с использованием SEQ ID NO:9 в качестве матрицы проводили с использованием праймера
SEQ ID NO:30 и вектор-специфического праймера. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами BstBI и KpnI и затем очищали в геле. Затем оба фрагмента лигировали с SEQ ID NO:9 в pBluescript
KS+, расщепленной PstI и KpnI. Затем подтвержденную конструкцию (SEQ ID NO: 17) переносили в
рТrс99а с использованием рестриктаз BspHI и HindIII.
ДНК, кодирующая mOPGL[158-316]_P30[221-241], с N-концевым гис-тидиновым маркером (тэгом)
(SEQ ID NO:19): ПЦР SEQ ID NO:9 проводили с использованием праймеров SEQ ID NO:22 и 23. Полученный ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами SacII и KpnI и затем очищали из агарозного геля. Вторую ПЦР с использованием SEQ ID NO:9 в качестве матрицы проводили с использованием праймеров
SEQ ID NO:24 и 31. ПЦР-фрагмент расщепляли рестриктазами KpnI и EcoRI и затем очищали в геле. Затем оба фрагмента лигировали с SEQ ID NO:9 в pBluescript KS+, расщепленной SacII и EcoRI. Затем подтвержденную конструкцию (SEQ ID NO: 19) переносили в рТrс99а с использованием рестриктаз BspHI и
HindIII.
Экспрессия этих укороченных вариантов OPGL имела место в E. coli, давая более 20% общего белка для всех вариантов. Будет проводиться дальнейшее развитие вышеописанной процедуры очистки и
повторной укладки белка дикого типа (SEQ ID NO: 9). Эта процедура будет служить основой для разработки оптимальных процедур для каждого из этих вариантов. Повторная укладка с иммобилизацией этих
вариантных белков с использованием гистидинового маркера (тэга) представляет собой другой подход,
который продолжает разрабатываться.
Альтернативно, эти варианты могут быть непосредственно перенесены в экспрессирующие векторы
Pichia pastoris с использованием рестриктаз или другие дрожжевые экспрессионные системы с использованием ПЦР, если желательно гликозилирование. Следует отметить, что гликозилирование не является
необходимым для биологической активности in vivo OPGL. Можно также экспрессировать укороченный
OPGL в фибробластах 293 человека, как сообщалось в Lacey et al. Экспрессия в клетках насекомых будет
также принята во внимание (например, клеточная линия Schneider 2 (S2) и векторная система или клетка
Spodoptera frugiperda (SF) и векторные системы, обе доступные из Invitrogen).
Эти очищенные варианты будут использованы для получения антител в кроликах для последующего применения в качестве инструментов детектирования, так как не существуют коммерчески доступные
антитела. Кроме того, этот материал будет очень ценным инструментом в биологических анализах, необходимых для оценки аутовакцинных кандидатов. Получение этих антител будет проводиться с использованием стандартных способов, известных в данной области.
Отбор наилучших аутовакцинных кандидатов основан на оценке ингибиторной активности в анализах на созревание/активацию остеокластов in vitro или в анализе на остеопороз in vivo на модели животного. Применимые анализы и модельные системы описаны в литературе (например, в Lacey et al., Fuller
et al., и Simonet et al.).
Активность рекомбинантных белков будет анализироваться внутривенной инъекцией 100 мкл в неанестезированных самцов мышей Balb/C (0, 0,1 и 1,0 мг белка на кг веса мыши) и извлечением спустя
один час 125 мкл крови из большой глазной вены с использованием капиллярных трубочек, покрытых
насыщенным кальцием гепарином. Уровни кальция измеряют при помощи ICA2 (Radiometer, Denmark).
Очищенный и повторно уложенный рекомбинантный мышиный OPGL (SEQ ID NO:9) является реактивным в этом анализе, увеличивая уровни ионизированного кальция в кровотоке до 10%.
Аутовакцинные кандидаты будут, например, оцениваться с использованием аутовакцинации и последующего мониторинга ингибирования ими высвобождения ионизированного кальция в периферическую кровь при инъекции рекомбинантного mOPGL в мышей (как описано Burgess et al.).
Следует отметить, что в качестве альтернативы модифицированному OPGL, антиидиотипические
антитела, направленные против идиотипа антитела против OPGL, будут также служить в качестве применимых иммуногенов в объеме данного изобретения. Подобным образом, применение мимотипических
полипептидов, которые могут быть выделены, например, в системе фагового представления с использованием анти-OPGL или остеопротегерина в качестве улавливающего зонда, также рассматривается как
часть иммуногенов данного изобретения.
Список ссылок
1. Bucay, N. et al. (1998), Genes Dev. 12, 1260-1268.
2. Lacey, D. L. et al. (1998), Cell 93, 165-176.
3. Marks, S. C, Jr. (1989), Am. J. Med. Genet. 34, 43-53.
4. Simonet, W. S. et al. (1997), Cell 89, 309-319.
5. Fuller, K. et al. (1998), J. Exp. Med. 188, 997-1001.
6. Burgess, T. L. et al. (1999), J. Cell Biol. 145, 527-538.
7. Pedersen J et al. (1999) Protein Expr. Purif. 15, 389-400.
- 22 -
006940
Список последовательностей
- 23 -
006940
- 24 -
006940
- 25 -
006940
- 26 -
006940
- 27 -
006940
- 28 -
006940
- 29 -
006940
- 30 -
006940
- 31 -
006940
- 32 -
006940
- 33 -
006940
- 34 -
006940
- 35 -
006940
- 36 -
006940
- 37 -
006940
- 38 -
006940
- 39 -
006940
- 40 -
006940
- 41 -
006940
- 42 -
006940
- 43 -
006940
- 44 -
006940
- 45 -
006940
- 46 -
006940
- 47 -
006940
- 48 -
006940
- 49 -
006940
- 50 -
006940
- 51 -
006940
- 52 -
006940
- 53 -
006940
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Применение (а) полипептида OPGL животного или его фрагмента или (б) аналога OPGL, полученного из полипептида OPGL животного, в который введена модификация, приводящая к тому, что иммунизация животного указанным аналогом индуцирует образование антител против аутологичного полипептида OPGL, для получения фармацевтической композиции с целью отрицательной регуляции
OPGL в организме указанного животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или
других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.
2. Применение по п.1, отличающееся тем, что указанная модификация сохраняет существенное
число В-клеточных эпитопов OPGL и
в OPGL вводится по меньшей мере один чужеродный эпитоп Т-хелперного лимфоцита (Тн-эпитоп),
и/или
в OPGL вводится по меньшей мере одна первая структура, которая обеспечивает нацеливание модифицированной молекулы на антигенпредставляющую клетку (АПК) или В-лимфоцит, и/или
в OPGL вводится по меньшей мере одна вторая структура, которая стимулирует иммунную систему, и/или
в OPGL вводится по меньшей мере одна третья структура, которая оптимизирует представление
модифицированного полипептида OPGL иммунной системе.
3. Применение по п.2, отличающееся тем, что модификация предусматривает введение в качестве
боковых групп посредством ковалентного или нековалентного связывания с подходящими химическими
группами в OPGL или его фрагмент чужеродного Тн-эпитопа и/или первой, и/или второй, и/или третьей
структуры.
4. Применение по п.3, отличающееся тем, что модификация OPGL предусматривает замену, и/или
делецию, и/или инсерцию, и/или добавление аминокислот.
5. Применение по п.4, отличающееся тем, что модификация приводит к образованию слитого полипептида.
6. Применение по любому из пп.4 или 5, отличающееся тем, что замена, и/или делеция, и/или инсерция, и/или добавление аминокислот обеспечивает сохранение практически всей третичной структуры
OPGL.
7. Применение по любому из пп.1-6, отличающееся тем, что модификация включает удвоение по
меньшей мере одного B-клеточного эпитопа OPGL и/или введение гаптена.
- 54 -
006940
8. Применение по любому из пп.2-7, отличающееся тем, что чужеродный Т-клеточный эпитоп является иммунодоминантным у животного.
9. Применение по любому из пп.2-8, отличающееся тем, что чужеродный Т-клеточный эпитоп способен связываться с большой частью молекул MHC класса II.
10. Применение по п.9, отличающееся тем, что по меньшей мере один чужеродный Т-клеточный
эпитоп выбран из природного T-клеточного эпитопа и синтетических связывающих молекулы MHC
класса II пептидных последовательностей.
11. Применение по п.10, отличающееся тем, что природный Т-клеточный эпитоп выбран из эпитопа
столбнячного токсоида, такого как Р2 или Р30, эпитопа дифтерийного токсоида, эпитопа гемагглютинина вируса гриппа и эпитопа CS P. falciparum.
12. Применение по любому из пп.2-11, отличающееся тем, что первая структура является партнером
специфического связывания для специфического поверхностного антигена B-лимфоцита или для специфического поверхностного антигена АПК, таким как гаптен или углевод, для которого имеется рецептор
на В-лимфоците или на АПК.
13. Применение по любому из пп.2-12, отличающееся тем, что вторая структура выбрана из цитокина, гормона и белка теплового шока.
14. Применение по п.13, отличающееся тем, что цитокин выбран из интерферона γ (IFN-γ), лиганда
FMS-подобной тирозин-3-киназы (Flt3L), интерлейкина 1 (IL-1), интерлейкина 2 (IL-2), интерлейкина 4
(IL-4), интерлейкина 6 (IL-6), интерлейкина 12 (IL-12), интерлейкина 13 (IL-13), интерлейкина 15 (IL-15)
и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) или является их эффективным фрагментом, а белок теплового шока выбран из HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 кальретикулина
(CRT) или является их эффективным фрагментом.
15. Применение по любому из пп.2-14, отличающееся тем, что третья структура представляет собой
липидную группу, такую как пальмитоильная группа, миристильная группа, фарнезильная группа, геранил-геранильная группа, GPI-якорь и N-ацилдиглицеридная группа.
16. Применение по любому из пп.1-15, отличающееся тем, что полипептид OPGL или его фрагмент
модифицированы по любому из положений 170-192, или 198-218, или 221-246, или 256-261, или 285-316
любой из последовательностей SEQ ID NO: 4, 6 и 12.
17. Применение по любому из пп.1-15, отличающееся тем, что полипептид OPGL модифицирован
по любому из положений 171-193, или 199-219, или 222-247, или 257-262, или 286-317 последовательности SEQ ID NO: 2.
18. Применение по п.16 или 17, отличающееся тем, что модификация включает в себя замену по
меньшей мере одной аминокислотной последовательности по положению, определенному в п.16 или 17,
аминокислотной последовательностью равной или отличающейся длины, которая содержит чужеродный
Тн-эпитоп.
19. Применение по п.16 или 18, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность, содержащая чужеродный Тн-эпитоп, заменяет аминокислоты 256-261, и/или 288-302, и/или 221-241 последовательности SEQ ID NO: 4.
20. Применение по п.17 или 18, отличающееся тем, что аминокислотная последовательность, содержащая чужеродный Тн-эпитоп, заменяет аминокислоты 257-2 62, и/или 28 9-303, и/или 222-243 последовательности SEQ ID NO:2, при этом Cys в положении 221 может быть заменен на Ser.
21. Применение иммуногенной композиции, содержащей (а) иммунологически эффективное количество полипептида OPGL, аутологичного для животного, объединенного вместе с иммунологически
приемлемым адъювантом таким образом, чтобы нарушить аутотолерантность животного в отношении
полипептида OPGL, дополнительно содержащей фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или наполнитель, или (б) иммунологически эффективное количество аналога OPGL, охарактеризованного в любом из пп.1-20, и фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель и/или
наполнитель и необязательно адъювант, для получения фармацевтической композиции с целью отрицательной регуляции OPGL в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.
22. Применение фрагмента нуклеиновой кислоты, кодирующего OPGL, фрагмент OPGL или аналог
OPGL, охарактеризованные в любом из пп.1-20, для получения фармацевтической композиции с целью
отрицательной регуляции OPGL в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.
23. Применение вектора, содержащего фрагмент нуклеиновой кислоты, охарактеризованный в п.22,
для получения фармацевтической композиции с целью отрицательной регуляции OPGL в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.
24. Применение по п.23, отличающееся тем, что вектор способен к автономной репликации.
25. Применение по п.23 или 24, отличающееся тем, что вектор представляет собой плазмиду или
вирусный вектор.
26. Применение по любому из пп.23-25, отличающееся тем, что вектор содержит в направлении
- 55 -
006940
5'→3' в функциональной взаимосвязи, промотор для регуляции экспрессии фрагмента нуклеиновой кислоты, охарактеризованного в п.22, необязательно последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую лидерный пептид, обеспечивающий секрецию или интеграцию в мембрану полипептидного фрагмента, указанный фрагмент нуклеиновой кислоты и необязательно терминатор.
27. Применение по любому из пп.23-26, отличающееся тем, что вектор при введении в клеткухозяин необязательно интегрируется в геном клетки-хозяина.
28. Применение по п.26 или 27, отличающееся тем, что промотор регулирует экспрессию указанного фрагмента нуклеиновой кислоты в эукариотической клетке и/или прокариотической клетке.
29. Применение непатогенной трансформированной клетки, содержащей вектор, охарактеризованный в любом из пп.23-28, для получения фармацевтической композиции с целью отрицательной регуляции OPGL в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других
состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.
30. Применение по п.29, отличающееся тем, что указанный вектор способен реплицироваться в указанной клетке.
31. Применение по п.30, отличающееся тем, что трансформированная клетка является бактериальной клеткой.
32. Применение по п.31, отличающееся тем, что бактериальная клетка является клеткой Mycobacterium bovis BCG, Streptococcus spp., E. coli, Salmonella spp., Vibrio cholerae, и Shigella.
33. Применение по п.32, отличающееся тем, что трансформированная клетка способна секретировать или экспрессировать на своей поверхности OPGL, фрагмент OPGL или аналог OPGL, охарактеризованные в любом из пп.1-20.
34. Применение композиции, содержащей
фрагмент нуклеиновой кислоты, охарактеризованный в п.22, или вектор, охарактеризованный в любом из пп.23-28, в качестве активного ингредиента и
фармацевтически и иммунологически приемлемый носитель, и/или наполнитель, и/или адъювант
для получения фармацевтической композиции для индукции образования антител против полипептида
OPGL и для отрицательной регуляции OPGL в организме животного для лечения, профилактики или облегчения остеопороза или других состояний, характеризующихся избыточной резорбцией костей.
35. Способ идентификации модифицированного аналога OPGL, охарактеризованного в любом из
пп.1-20, способного индуцировать образование антител против аутологичного немодифицированного
OPGL в организме животного, предусматривающий
получение посредством пептидного синтеза или методов генной инженерии набора различающихся
между собой модифицированных полипептидов OPGL, содержащих добавления, инсерции, делеции или
замены аминокислот, обеспечивающие образование последовательностей, содержащих чужеродные Tклеточные эпитопы,
испытание составляющих набор модифицированных полипептидов OPGL на их способность индуцировать образование антител против немодифицированного OPGL в организме животного и
идентификацию и необязательно выделение составляющих набор модифицированных полипептидов OPGL, которые в значительной степени индуцируют образование указанных антител.
36. Способ идентификации модифицированного аналога OPGL, охарактеризованного в любом из
пп.1-20, способного индуцировать образование антител против аутологичного немодифицированного
OPGL в организме животного, предусматривающий
получение посредством пептидного синтеза или методов генной инженерии набора фрагментов
нуклеиновых кислот, кодирующих различные модифицированные полипептиды OPGL, содержащие добавления, инсерции, делеции или замены аминокислот, обеспечивающие образование последовательностей, содержащих чужеродные Т-клеточные эпитопы,
испытание составляющих набор фрагментов нуклеиновых кислот на их способность индуцировать
образование антител против немодифицированного OPGL в организме животного и
идентификацию и необязательно выделение полипептидных продуктов экспрессии, кодируемых
фрагментами нуклеиновых кислот, которые в значительной степени индуцируют образование указанных
антител.
37. Способ по п.36, отличающийся тем, что получение составляющих набора предусматривает получение различных последовательностей нуклеиновых кислот, каждая из которых является фрагментом
нуклеиновой кислоты, охарактеризованным в п.22, встраивание указанных последовательностей в подходящие экспрессирующие векторы, трансформацию подходящих клеток-хозяев указанными векторами
и обеспечение экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот с необязательным последующим
выделением продуктов экспрессии.
38. Способ по п.37, отличающийся тем, что последовательности нуклеиновых кислот и/или векторов получают посредством молекулярной амплификации, например, ПЦР, или путем синтеза нуклеиновых кислот.
39. Способ получения иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один модифицированный аналог OPGL, охарактеризованный в любом из пп.1-20, предусматривающий
- 56 -
006940
получение посредством пептидного синтеза или методов генной инженерии набора различающихся
между собой модифицированных полипептидов OPGL, содержащих добавления, инсерции, делеции или
замены аминокислот, обеспечивающие образование последовательностей, содержащих чужеродные Tклеточные эпитопы,
испытание составляющих набора на их способность индуцировать образование антител против немодифицированного OPGL в организме животного и
смешивание составляющих набора, которые в значительной степени индуцируют образование антител против немодифицированного OPGL в организме животного, с фармацевтически и иммунологически приемлемым носителем и/или наполнителем необязательно в комбинации по меньшей мере с одним
фармацевтически и иммунологически приемлемым адъювантом.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
- 57 -