Оценка субпопуляций лимфоцитов

Многопараметрический анализ в
проточной цитометри и
современные подходы к оценке
фенотипа различных
субпопуляций лимфоцитов.
Хайдуков С.В., д.б.н.
- Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина
и Ю.А. Овчинникова, РАН, Москва.
- ФГУ Федеральный Научно-Клинический Центр детской
гематологии, онкологии и иммунологии, МЗиСР РФ, Москва.
Семинар 5-7 октября 2011 г.
Хайдуков С.В.
Иммунный статус
Анализ иммунного статуса пациентов
определяют при помощи
иммунофенотипирования.
Иммунофенотипирование это
характеристика клеток при помощи
моноклональных антител или других зондов,
позволяющая судить об их типе и
функциональном состоянии по наличию того
или иного набора клеточных маркеров.
Хайдуков С.В.
Моноклональные
антитела
CD = The Cluster of Differentiation
Система классификации всех антител
против антигенов лейкоцитов человека.
Определяется на рабочих совещаниях
(последнее HLDA IX, 11-13 марта 2010 г.).
CD включает все клоны антител
распознающих одни и те же антигены
человека, но не их эпитопную
специфичность (сейчас 363 CD).
Хайдуков С.В.
Анергические Т клетки. Эти клетки
Т-клетки
Цитотоксические T клетки
генерируются после активации TCR в
отсутствие ко-стимулирующих сигналов,
это приводит к тому, что они не отвечают
на последующие стимулирующие
сигналы. Они являются функционально
бездействующими клетками и не в
состоянии пролиферировать или
продуцировать IL-2. Эта генерация
может быть важна для ухода от
аутоиммунного ответа.
CD8αα T клетки. Внутриэпителиальные
лимфоциты обнаруженные в кишечнике. Они
развиваются интра- или экстратимически.
Экспрессируют αβ или γδTCR. γδTCR+ клетки
продуцируют KGF, тогда как αβTCR+ клетки этого
не делают. Для для генерации и/или гомеостаза
им необходима β2 микроглобулин зависимая
экспрессия MHC класс I. Они могут обладать
регулирующий функцией за счет продукции IL-10
и TGF β.
γδT клетки
CD4+ αβ T клетки,
CD8+ αβ T клетки
Истощенные Т клетки.
Генерируются в ответ на хроническое
возбуждение TCR антигеном. Эти
клетки экспрессируют ингибирующие
рецепторы и обладают сниженной
продукцией эффекторных цитокинов.
Таким образом, они не в состоянии
повыситься эффективный
антивирусный иммунные ответы.
Хайдуков С.В.
NKT клетки
TH1,
TH2,
TH9,
TH17,
TH22,
TFH
Центральные Т клетки памяти,
Эффекторные T клетки памяти
TR1,
Натуральные Treg,
Индуцированные Treg
B-клетки
Mature B-cells (Bm)
Bm1
Bm2
Bm2’
Bm3
Bm4
Ранние Bm5
Bm5 памяти
В настоящее время существует две системы
классификации В-клеток, основанные на экспрессии
поверхностных маркеров:
1. CD19, CD5, CD27, IgD
2. CD19, IgD, CD38, D27
Хайдуков С.В.
B-клетки
Хайдуков С.В.
NK-клетки
Распределение
CD16 и CD56 при
анализе CD3-CD19клеток
периферической
крови
1. CD56bright CD16-;
2. CD56bright CD16dim;
3. CD56dim CD16-;
4. CD56dim CD16+;
5. CD56-CD16+.
Хайдуков С.В.
CDC-панель
FITC
IgG
CD45
CD3
CD3
CD3
CD3
Хайдуков С.В.
PE
IgG
CD14
CD19
CD4
CD8
CD56 (+/-CD16)
Контроль
Гэйт
T/B-клетки
T-хелперы
T-цитотоксические
NK-клетки
Наиболее часто используемая
панель для определения
иммунного статуса
FITC
IgG
CD45
CD3
CD3
CD3
CD3
CD3
Хайдуков С.В.
PE
IgG
CD14
CD19
CD4
CD8
CD56 (+/-CD16)
HLA-DR
Контроль
Гэйт
T/B-клетки
T-хелперы
T- цитотоксические
NK-клетки
актив. Т-кл.
Трехцветная панель
FITC
PE
PE-Cy5
Используется для:
CD3
HLA-DR
CD45
Мониторинг при
хронических
вирусных
заболеваниях (HIV,
CMV и т.д.)
Мониторинг при
трансплантации
Первичный и
вторичный
иммунодефициты
Аутоиммунные
заболевания
CD3
CD25
CD45
CD8
CD38
CD45
CD57
CD8
CD45
CD4
CD45RA
CD45
CD4
CD45RO
CD45
CD3
TcRαβ
CD45
CD3
TcRγδ
CD45
CD19
CD5
CD45
Хайдуков С.В.
Необходимо для стандартизации
анализа иммунофенотипа пациента.
¾ Стандартный забор, хранение и подготовка
образца для анализа.
¾ Стандартный
набор
анализируемых
маркеров (допускается расширение панели
моноклональных антител для более полной
характеристики исследуемого образца).
¾Стандартная
настройка
проточного
цитометра и протоколов анализа.
¾Стандартный анализ с использованием
контроля качества и контрольных сумм.
Хайдуков С.В.
Четырехцветная панель моноклональных
антител для определения иммунного статуса
FITC
1. IgG
2. CD19
3. CD16
4. CD8
5. CD4
7. CD45RA
8. TcR-αβ
9. CD4
PE
ECD (или APC)
PC5 (или PerCP)
IgG
IgG
CD45
изотипический контроль
CD5
CD27
CD45
В1, В2, В-клетки памяти
CD56
CD3
CD45
T-NK-клетки и субпопуляции NK-клеток
CD4
CD3
CD45
субпопуляции Т-клеток
CD25
HLA-DR
CD45
активированные Т хелперы
CD45RO
CD4
CD45
наивные и активированные Т хелперы, Т-клетки памяти
TcR-γδ
CD3
CD45
αβ- и γδ-Т-клетки
CD25
CD127
CD45
регуляторные Т-клетки
Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Российский Иммунологический Журнал, 2007, 1(10), 3-4, С. 20–30.
Хайдуков С.В., и др. Российский Иммунологический Журнал, 2008, 2(11), 1, С. 20–30.
Хайдуков С.В., и др. Медицинская иммунология, 2008, 10(2-3), C. 113-121
Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2009 Т. 11, № 2-3, стр. 227-238
Хайдуков С.В.
В-2
(CD19+CD5-)
CD19/CD5/CD27/CD45
Анализ В-клеток
В-1 – аутореактивный
клон (CD19+CD5+)
В-клетки памяти
(CD19+CD27+CD5-)
Хайдуков С.В.
CD19/CD5/CD27/CD45
Анализ В-клеток - В-клетки памяти
Изменение количества В
клеток памяти
В-клетки памяти
(CD19+CD27+CD5-)
Повышение
относительного уровня
В-клеток памяти
Множественный склероз
Ревматоидный артрит
Понижение
относительного уровня
В-клеток памяти
Первичные иммунодефициты
Синдром Шегрена
Хронической грануломатоз
Бактериальные инфекции
дыхательного тракта
Бактериальные инфекции
желудочно-кишечного трактата
Синдром
Шегрена
Норма
≥80%
Ревматоидный
артрит
60%
Наивные Вклетки
Хайдуков С.В.
Заболевание
В-клетки
памяти
Плотность экспрессии CD27
CD19/CD5/CD27/CD45
Анализ В-клеток – B-1
Пример: Аутоиммунный тиреоидит
До терапии
В процессе терапии
В-1 клетки (CD19+CD5+)
Хайдуков С.В.
Норма
Заболевания, при которых определение
относительного уровня В-1 клеток
является диагностически значимым.
Заболевание
1.Системная красная волчанка (СКВ)
2.Синдром Шегрена
3.Ревматоидный артрит
4.Инсулин-зависимый диабет
5.Аутоиммунный тиреоидит
6.Миастения
7.Неспецифический язвенный колит
8.Аутоиммунные поражения при инфекционных
заболеваниях (хламидиоз, синдром Рейтера,
бруцеллез и др.)
9.Другие заболевания, имеющие в своей основе
аутоиммунные механизмы
Хайдуков С.В.
Повышение
относительного
уровня В1
клеток
++++
++++
+++
+++
++++
+++
+++
+++
+?
Анализ В-1 и В-клетки памяти при
терапии Мабтерой
Хайдуков С.В.
Анализ NK-клеток
NKT клетки
CD16/CD56/CD3/CD45
Анализ по зоне CD45
NK-клетки
1 - CD16dim-to-negCD56bright - секретируют IFN-γ и другие цитокины,
имеют меньшую цитолитическую активность.
2 - CD16brightCD56dim - слабо секретируют цитокины, но обладают
высокой цитолитической активностью.
Хайдуков С.В.
Постоянно низкие активность и количество NK-клеток
Патологическое состояние
Ассоциированные симптомы и риски
Приобретенный или врожденный
иммунодефицит включая СПИД.
Синдром Чедиака-Хигасси.
Дефицит CD11/CD18 молекул
семейства клеточной адгезии.
Онкологические заболевания
Онкологические заболевания
связанные с наследственностью.
Лейкемия.
Х-связанный лимфопролиферативный синдром.
Рак молочной железы (при диагнозе).
Рак шеи и головы (до терапии).
Терапия цитостатиками.
Вирусная инфекция (цитомегаловирус, Эпштейна-Бар, герпес).
Другие вирусные и бактериальные
инфекции.
Аутоиммунные заболевания.
Высокий риск возникновения онкологии и
достаточно частые инфекционные заболевания.
Повышенный риск образования лимфом.
Увеличенная восприимчивость к вирусным
инфекциям.
Распространение метастазов.
Вероятность появления злокачественного образования выше нормального.
Предшествует рецидиву.
Повышенная чувствительность к вирусу ЭпштейнаБар.
Неблагоприятный прогноз.
Неблагоприятный прогноз.
Более высокая вероятность рецидива.
Более высокая частота, серьезность и продолжительность заболевания.
Более высокая частота, серьезность, и продолжительность заболевания.
Возможно более активное течение болезни, увеличенная частота инфекций.
Психические расстройства
Синдром дефицита NK-клеток.
Синдром хронической усталости.
Депрессия.
Хронический стресс.
Хайдуков С.В.
Усталость, сниженная восприимчивость,
лихорадка.
Повышенная утомляемость, апатичность,
увеличенная частота вирусных заболеваний.
Более серьезные признаки.
Неспособность справляться с ежедневными
проблемами, усталость .
По Whiteside et al., 1994
Постоянно высокие активность и
количество NK-клеток
Патологическое состояние
Ассоциированные симптомы и
риски
Лимфопролиферация NK-клеток
Хроническая пролиферация больших
гранулярных лимфоцитов (LGLпролиферация
LGL-лимфоцитоз, цитопения,
спленомегалия
Острая пролиферация больших
гранулярных лимфоцитов (LGLпролиферация
Встречается совместно с активной
лейкемией/лимфомой
Хайдуков С.В.
По Whiteside et al., 1994
NKT-клетки при различных заболеваниях (A. Balato et al., 2009)
Аутоиммунные патологии
Множественный склероз
Ревматоидный артрит
Системная красная волчанка
Воспалительные заболевания кишечника
Трансплантация
Кожа
Роговица
Клетки панкреатических островков
Печень
Сердце
Атеросклероз
Аорта
Аллергия
Аллергическая астма
Аллергический конъюнктивит
Инфекции
Бактерии (например, M. tuberculosis)
Паразитарные (например, leishmania)
Дрожжи (например, C. neoformans)
Вирусы (например, cytomegalovirus)
Опухоли
Солидные опухоли (например, рак
легкого)
Миелобластные опухоли (например,
множественная миелома)
Хайдуков С.В.
CD8/CD4/CD3/CD45
Цитотоксические Т-клетки
Анализ Т-клеток
CD4+CD8+ Т-клетки
(вышедшие из тимуса
недифференцированные
Т-клетки)
Т-клетки хелперы
Экспрессия CD8
на NK-клетках
Хайдуков С.В.
CD45RA/CD45RO/CD4/CD45
Анализ Т-клеток
Т-клетки памяти.
активированные Тклетки, Treg и T17
Наивные Т клетки
Хайдуков С.В.
Анализ Т-клеток
Анализ только по CD45+
Хайдуков С.В.
CD45RA/CD45RO/CD4/CD45
Анализ по CD4+ и CD45+
CD4/CD25/HLA-DR/CD45
Анализ активированных T
хелперов и цитотоксических
T-клеток
Анализ по зоне B
Активированные
Регуляторные Тклетки
Ранняя
активация
Хайдуков С.В.
Поздняя
активация
Treg играют важную роль в
иммуносупрессии и их изучают в
таких областях как:
•
•
•
•
Аутоиммунные заболевания,
Трансплантационная иммунология,
Противоопухолевый ответ
Иммуногомеостаз
Treg понижающие регуляторы
ПОЛЬЗА
•
Регулируют Т клеточный гомеостаз
• Предотвращают аутоиммунные заболевания
• Предотвращают аллергии
• Предотвращают гиперчувствительность
• Толерантность после трансплантации
• Предотвращают РТПХ
С ДРУГОЙ СТОРОНЫ
•
Снижают противоопухолевый иммунитет
• Снижают иммунитет к инфекциям
Хайдуков С.В.
CD4/CD25/CD127/CD45
Анализ регуляторных Т-клеток
Идентификация Treg - CD3+CD4+CD25brightCD127neg
Анализ по зоне CD3+CD4+
Анализ по зоне
лимфоцитов
Анализ по зоне CD3+CD4+
Регуляторные
Т-клетки
Хайдуков С.В.
Анализ Т-клеток
?
Хайдуков С.В.
CD8/CD4/CD3/CD45
TcR-αβ/TcR-γδ/CD3/CD45
Анализ Т-клеток
CD3highCD8dimTcR-γδ+ Т-клетки
CD3+CD8brightTcR-αβ+ Т-клетки
Хайдуков С.В.
Изменения относительного количества γδ-T-клеток при
различных заболеваниях и патологиях.
Изменение относительного
количества γδ-T-клеток
Повышение относительного
уровня γδ-T-клеток
Понижение относительного
уровня γδ-T-клеток
Хайдуков С.В.
Заболевание
Вирусные инфекции:
ВИЧ
Цитомегаловирус
Вирус Эпштейн-Бара
Бактериальные инфекции:
Туберкулез легких Mycobacterium
Легионеллез Legionella
Туляримия Francisella tularensis
Сальмонеллез Salmonella
Боррелиоз (болезнь Лайма) Borellia
Атопический дерматит (у детей)
Болезнь Крона
Болезнь Бехчета
Первичные иммунодефициты
Атопический дерматит (у взрослых)
Возрастное снижение относительного
уровня γδ-T-клеток
Инверсия соотношения T4/T8
- интерпретация
Острая вирусная инфекция
Хроническая вирусная инфекция
Гематологические нарушения
Первичные иммунодефициты
Аутоиммунные заболевания
Солидные опухоли
Хайдуков С.В.
Интервалы распределения фенотипов лимфоцитов
условно здоровых доноров (n = 362)
Тип клеток
Лимфоциты (CD45bright)
В-клетки (CD3-CD19+HLA-DR+)
В-1 клетки (CD19+CD5+)
В-2 клетки (CD19+CD5-)
В клетки памяти (CD19+CD5-CD27+)
NK (LGL) (CD3-CD16+CD56+)
NK цитолитические (от общих NK-клеток)
NK цитокин-продуцирующие (от общих NK-клеток)
Т-клетки (CD3+CD19-)
Т хелперы (CD3+CD4+)
Т цитотоксические (CD3+CD8+)
Т хелперы активированные/
памяти (CD4+CD45R0+)
Т хелперы наивные (CD4+CD45RА+)
αβ-Т клетки (CD3+αβ-ТсR+γδ-ТcR-)
γδ-Т клетки (CD3+γδ-ТcR+αβ-ТсR- )
Т-NK клетки (CD16+CD56+CD3+)
Т клетки актив. (HLA-DR+CD25+)
Регуляторные Т-клетки (CD4+CD25brightCD127neg)
Индекс соотношения (Тх/Тц)
% ПК
Абс.к-во кл/л
28 - 36
1,363-2,808 х 109
7 - 17
0,111-0,376 х 109
0,5 - 2,1
0,022-0,115 х 109
6,5 - 14,9
0,081-0,323 х 109
1,8 - 6,8
0,012-0,040 х 109
8 - 17
0,123-0,369 х 109
2,5 - 6,2
0,003 - 0,022 х 109
93,7 - 97,5 0,081-0,323 х 109
61 - 85
0,946-2,079 х 109
35 - 55
0,576-1,336 х 109
19 - 35
0,372-0,974 х 109
5 - 25
20 - 40
60,8 - 80,2
1,8 - 7,4
0,5 - 6
0,5 - 6
0,6 - 3,19
1,5 - 2,6
0,068-0,702 х 109
0,272-1,123 х 109
0,924-1,964 х 109
0,022-0,115 х 109
0,007-0,165 х 109
0,007-0,165 х 109
0,009-0,078 х 109
Опубликовано в: Хайдуков С.В., и др. Мед. иммунол., 2009, Т. 11, № 2-3, стр. 227-238
Хайдуков С.В.
Анализ активированных NKклеток
ααCD8+ NK-клетки
Хайдуков С.В.
Анализ активированных
T- и NK-клеток
CD16-CD56-CD8bright
CD8/CD38/CD3/CD45
CD16+CD56+CD8dim
CD16+CD56+CD8Активированные
NK клетки
Активированные
цитотоксические
Т клетки
Покоящиеся CD8
позитивные Т
клетки
Хайдуков С.В.
CD8/CD38/CD3/CD45
NK-клетки
Анализ по зоне B
Анализ по зоне D
Хайдуков С.В.
Анализ по зоне С
А
Б
В
Г
Двухпараметрические гистограммы распределения лимфоцитов,
полученные в результате многоцветного анализа периферической
крови условно здорового пациента (А), пациента с острой вирусной
инфекцией (Б) и пациентов с хроническим носительством ВИЧ (В, Г).
Хайдуков С.В.
СПАСИБО ЗА
ВНИМАНИЕ
Хайдуков С.В.