Санкт-Петербургский Государственный Университет Кафедра
advertisement
Санкт-Петербургский Государственный Университет Кафедра цитологии и гистологии На правах рукописи АЙЗЕНШТАДТ АЛЕКСАНДРА АНДРЕЕВНА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ МЕЗЕНХИМНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГО ТКАНЕВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: д.б.н., Самойлович М. П. Санкт-Петербург 2015 Содержание Список сокращений…………………………………………………………..... 4 Введение………………………………………………………………………… 5 Глава 1. Обзор литературы…………………………………………................. 11 1.1 Выделение и культивирование МСК ……………………………….. 11 1.2. Иммунофенотипическая характеристика МСК …………………..... 15 1.3. Проявления функциональной активности МСК по отношению к Т-лимфоцитам…………………………………………………………….. 21 1.4. Проявления функциональной активности МСК по отношению к В-лимфоцитам………………………………….......................................... 27 1.5. Проявления функциональной активности МСК при аллергенспецифических реакциях лейкоцитов…………………………………… 30 1.6. Изменение функционального состояния МСК при их взаимодействии с компонентами иммунной системы………..…............ 32 Глава 2. Материалы и методы…………………………………………………. 37 2.1. Получение и культивирование МСК………………………………... 37 2.2. Культивирование В-клеточных линий ……………………………... 38 2.3. Дифференцировка МСК……………………………………………... 39 2.4. Морфологическая характеристика МСК…………………………… 39 2.5. Определение пролиферативной активности МСК ………………… 40 2.6. Иммунофенотипирование культур МСК………………………….. 40 2.7. Получение и активация клеток мононуклеарной фракции крови… 40 2.8. Выделение популяции В-лимфоцитов .......................……………..... 41 2.9. Сокультивирование МСК и клеток мононуклеарной фракции периферической крови……………………………………….... 41 2.10. Сокультивирование МСК и клеток линий Namalva либо U266..... 42 2.11. Оценка пролиферации лимфоцитов………………………………. 42 2.12. Иммунофенотипирование лимфоцитов…………………………… 43 2.13. Иммуноферментный анализ……………………………………….. 44 2.14. Оценка уровня продукции иммуноглобулинов …...……………… 44 2 2.15. Иммунофлуоресцентная микроскопия……………...…………….. 45 2.16. Статистическая обработка результатов…………………………… 46 Глава 3. Результаты………………………………………………..……........... 47 3.1. Особенности получения МСК из пупочного канатика……................. 47 3.2. Сравнение свойств МСК, культивируемых в нормоксии или в гипоксии………………................................................................................... 49 3.3. Ростовые характеристики и дифференцировка МСК…….................... 55 3.4. Иммунофенотип МСК………………………………………………….. 58 3.5. Проявления функциональной активности МСК при сокультивировании с лимфоидными клетками……………………………. 65 3.5.1. Изучение влияния МСК на Т-лимфоциты………………………...... 65 3.5.1.1. Влияние МСК на активацию Т-лимфоцитов………………. 66 3.5.1.2. Влияние МСК на пролиферацию Т-лимфоцитов………….. 68 3.5.2. Изучение влияния МСК на В-лимфоциты………..…........................ 69 3.5.2.1. Влияние МСК на пролиферацию В-лимфоцитов………….. 69 3.5.2.2. Тестирование функциональной активности МСК на лимфобластоидных и миеломных клетках………………………….. 73 3.5.3. Влияние МСК на аллерген-специфические реакции лейкоцитов при атопической гиперчувствительности…………………………………. 75 3.6. Влияние клеток мононуклеарной фракции и лимфоцитарных митогенов на функциональное состояние МСК ……………. …………... 82 3.6.1. Экспрессия Toll-подобных рецепторов на мембране МСК……... 82 3.6.2. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК при действии лимфоцитарных митогенов или при сокультивировании с лимфоидными клетками …………………………..…………………….. 84 Глава 4. Обсуждение……………...……………………………………………. 99 Выводы…….………………………………………………………..…………... 127 Благодарности………………………………………………………………….. 128 Список литературы…………………………………………………….............. 129 3 Список сокращений. ЛПС – липополисахарид МСК – мезенхимные стволовые клетки Тх1 - T-хелперы 1 типа Тх2 - T-хелперы 2 типа ФГА – фитогемагглютинин ФСР – фосфатно-солевой буфер ВcR – В-клеточный рецептор НLA-I - лейкоцитарный антиген человека I класса IL-4 – интерлейкин 4 IL-6 – интерлейкин 6 IL-10 – интерлейкин 10 INFγ – интерферон гамма МАРК – митоген-активируемые киназы NF-κB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells TcR – Т-клеточный рецептор TGFβ - Трансформирующий ростовой фактор бета TLR – Toll-подобный рецептор TNFα – фактор некроза опухоли альфа 4 Введение Мезенхимные стромальные недифференцированные зародышевого (стволовые) клетки, листка, клетки происходящие обладающие способностью (МСК) – это из мезодермального к самоподдержанию популяции и дифференцировке в клетки мезенхимного ряда (Deans et al., 2000; Rossant, 2001). Впервые МСК были описаны как клетки костного мозга с фибробластоподобной морфологией, культурального пластика дифференцироваться в способные и прикрепляться формировать адипогенном, колонии in хондрогенном к поверхности а vitro, и также остеогенном направлениях (Фриденштейн и др., 1968; Pittenger et al., 1999). В более поздних работах также была продемонстрирована способность МСК дифференцироваться в клетки эндотелия (Oswald et al., 2004), кардиомиоциты (Tokcaer-Keskin et al., 2009), нейроны и астроциты (Jori et al, 2005). В целостном организме МСК выполняют гомеостатические функции и служат для восполнения утраченных элементов кровеносных сосудов и опорно-двигательного аппарата, для заживления ран, для построения сосудистой сети плода и плаценты (Bielby et al., 2007; Glenn et al., 2014; Паюшина, 2015). Осуществление перечисленных функций МСК обеспечивается экспрессией генов, кодирующих широкий спектр адгезионных молекул, цитокинов, хемокинов и их рецепторов. Таким образом, МСК генетически детерминированы к процессам миграции, взаимодействия с другими клеточными элементами и межклеточным матриксом. При перемещении по сосудистому руслу и в интерстициальных пространствах МСК контактируют как с подвижными клетками (например, лейкоцитами), так и с резидентными элементами (эндотелиоцитами, фибробластами, межклеточным матриксом). Взаимодействия с ними требуют, реализации различных программ миграции, пролиферации и дифференцировки. 5 С этими свойствами, а также с возможностью культивирования МСК in vitro, связано их интенсивное изучение и применение в качестве основы для клеточной терапии различных заболеваний. В международной базе клинических испытаний на данный момент зафиксировано более 450 исследований с использованием МСК (https://clinicaltrials.gov). Результаты мета-анализа проводимых клинических исследований свидетельствуют об отсутствии серьезных побочных эффектов при введении МСК (Lalu et al., 2012). Несмотря на наличие многообещающих результатов доклинических и ограниченных клинических исследований, анализ действия МСК по сравнению с плацебо для большой выборки пациентов (III/IV фазы клинических испытаний) не дал однозначных результатов об эффективности их применения, в частности, для лечения реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) (Galipeau, 2013). Недостаточно высокая эффективность клинического применения МСК во многом обусловлена нехваткой знаний о свойствах МСК, а также неразработанностью методов предварительного тестирования клеток в соответствии с целями их использования. На сегодняшний день дискуссионными остаются вопросы о значимости различий в свойствах МСК, обусловленных характеристиками ткани, из которой были выделены клетки, а также индивидуальными особенностями донора биологического материала (Siegel et al., 2013; Rebelatto et al., 2008; Payne et al., 2013; Крылова и др., 2014). В течение более чем 30 лет после открытия основным источником материала для исследований МСК оставался костный мозг человека и лабораторных животных, но, начиная с конца 90-х годов 20 века, клетки с характеристиками, соответствующими МСК, были найдены в большинстве органов млекопитающих. Последнее время все больше внимания исследователей привлекают МСК, выделенные из жировой ткани (Zuk et al., 2002), из плаценты (Fukuchi et al., 2004) и ткани пупочного канатика (Wang et al., 2004; Covas et al., 2003). Логически МСК, находящиеся в столь разных с физиологической точки зрения нишах, должны были бы различаться набором важных биологических 6 характеристик. Тем не менее, при изучении МСК, выделенных из разных тканей, отмечали несомненное сходство между ними по экспрессии мембранных антигенов, по пролиферативному и дифференцировочному потенциалу (Musina et al., 2005; Vishnubalaji et al., 2012; Covas et al., 2008). Вместе с тем функциональные особенности МСК различного тканевого происхождения остаются малоизученными. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы в пределах одного исследования, с помощью стандартизованных методических приемов сравнить функциональные характеристики МСК, выделенных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика человека. В соответствии с указанной целью в работе были поставлены следующие задачи: 1. Получить первичные культуры МСК из костного мозга, жировой ткани и периваскулярного пространства пупочного канатика человека и сравнить их ростовые характеристики. 2. Сопоставить иммунофенотипичесикие характеристики МСК, выделенных из указанных источников. 3. Изучить функциональную активность МСК из разных источников в системах контактного сокультивирования с Т-лимфоцитами. 4. Исследовать проявления функциональной активности МСК по отношению к В-лимфоидным клеткам. 5. Изучить влияние МСК из разных источников на аллерген-специфические эффекторные реакции в модельной системе in vitro. 6. Оценить взаимодействии изменение с функционального иммунокомпетентными состояния клетками и МСК под при их влиянием лимфоцитарных митогенов. 7 Научная новизна Основной особенностью проведенного исследования является сопоставление морфо-функциональных свойств МСК различного тканевого происхождения с использованием набора методических приемов в стандартизованных экспериментальных условиях. Оценку морфологических, иммунофенотипических и ростовых характеристик проводили на большой выборке клеточных культур МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Это позволило сделать вывод о более высокой пролиферативной активности МСК пупочного канатика по сравнению с МСК костного мозга, а также выявить различия в экспрессии CD10, CD13, CD90 и CD105 на поверхности МСК в зависимости от их тканевого происхождения. Анализ функциональной активности МСК из разных источников в экспериментальных системах с использованием в качестве тест-объектов Т- и В-лимфоцитов, либо В-лимфоидных клеточных линий показал меньшую выраженность иммунмодулирующего действия МСК костного мозга, по сравнению с МСК жировой ткани и пупочного канатика. В модельных экспериментах in vitro было продемонстрировано супрессорное влияние МСК различного тканевого происхождения на аллерген-специфические реакции лимфоидных клеток. Кроме того, было показано, что МСК оказывают разнонаправленное действие на продукцию IL-4 в зависимости от стимулирующего агента, предъявляемого иммуннокомпетентным клеткам, и соответственно, типа иммунного ответа. Впервые проведено сопоставление изменения функционального состояния МСК под воздействием лимфоцитарных митогенов и стимулированных этими митогенами лимфоидных клеток. Были описаны эффекты прямого действия на МСК Т-лимфоцитарного митогена ФГА. 8 Теоретическая и практическая значимость работы Использование разных условий сокультивирования позволило определить параметры экспериментальных систем, которые являются значимыми для выявления различий в свойствах МСК, обусловленных индивидуальными особенностями доноров. Полученные данные могут быть использованы в качестве основы для создания алгоритмов контроля качества МСК конкретных пациентов/доноров, включающих в себя оценку функциональной активности этих клеток. Результаты работы свидетельствуют о том, что МСК пупочного канатика могут являться перспективным источником для клинического применения. Показано, что в этой нише МСК содержатся в большом количестве, сопоставимом с получаемым при выделении МСК из 50-70 мл костного мозга, либо из 3-5 мл жировой ткани. Количество жизнеспособных и пролиферирующих МСК, которые можно получить из образца пупочного канатика, зависит от величины временного промежутка между родами и началом обработки материала. Получение МСК из периваскулярного пространства проводили с помощью оптимизированной в ходе работы методики. Была создана и охарактеризована коллекция первичных культур МСК пупочного канатика, насчитывающая 60 образцов, которые могут быть использованы в клинической практике. Положения, выносимые на защиту 1. МСК, выделенные из пупочного канатика и жировой ткани, как основа для клеточной терапии, обладают рядом преимуществ по сравнению с МСК костного мозга. 2. Общим свойством всех МСК является их способность влиять на функциональную активность иммуномодулирующего лимфоидных действия МСК клеток, зависят но проявления от параметров экспериментальных систем. 9 3. МСК из костного мозга, пупочного канатика и жировой ткани способны ингибировать проявления ряда аллерген-специфических эффекторных реакции in vitro. 4. Взаимодействие МСК и клеток иммунной системы в присутствии лимфоцитарных митогенов сопровождается активацией в МСК сигнальных путей, опосредованных транскрипционным фактором NFkB Апробация работы Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на V Российской научно-практической конференции «Аллергические и иммунопатологические заболевания – проблема 21» (Санкт-Петербург, 2014), Международной научно-практической конференции «Регенеративная терапия и клеточные технологии» (Санкт-Петербург, 2013), Объединенном иммунологическом форуме (Н.Новгород, 2013). По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах из перечня ВАК РФ. Личный вклад автора Основная часть экспериментальной работы, планирование экспериментов, описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно. Измерения концентрации цитокинов методом ИФА осуществлялись соместно с Супильниковой О.В., что нашло отражение в соместных публикациях. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, изложение полученных результатов и их обсуждение, выводы и список литературы. Текст диссертации, сопровождается 54 рисунками и 6 таблицами. Список литературы содержит 297 источника, из них 281 на иностранном языке. 10 Глава 1. Обзор литературы 1.1. Выделение и культивирование МСК Впервые мезенхимные стволовые клетки были получены А.Я. Фриденштейном с коллегами в 1968 году в лаборатории иммуноморфологии в НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН из костного мозга морской свинки. Описанные клетки характеризовались фибробластоподобной морфологией и способностью образовывать колонии (Фриденштейн и др., 1968). Из тканей человека МСК были выделены в группе Caplan A.I (Syftestad et al., 1985). Сам термин «мезенхимные стволовые клетки» (mesenchymal stem cells) также впервые появился в работе Caplan с соавторами в 1991 году (Caplan et al., 1991). Затем в работе Pittenger c соавторами (1999) была описана способность МСК костного мозга дифференцироваться в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях, а также их высокая пролиферативная активность. Для МСК была показана способность к самоподдержанию популяции и дифференцировке, т.е. наличие признаков стволовых клеток. В последующие годы МСК были получены из жировой ткани (Zuk et al., 2002), плаценты (Fukuchi et al., 2004), пуповинной крови (Erices et al., 2000), пульпы зуба (Nagatomo et al., 2006), эндометрия (Земелько и др., 2011), периферической крови (Zvaifler et al., 2000), а также из пупочного канатика (Wang et al., 2004; Covas et al., 2003). МСК, полученные из неонатальных тканей – плаценты и пупочного канатика, привлекают все больше внимания исследователей. Прежде всего, это связано с возможностью получения биологического материала без инвазивных процедур и сопряженных с ними побочных эффектов. Впервые детальное описание клеток, полученных из пупочного канатика и их классификация как МСК (на основе соответствия фенотипа описываемых клеток фенотипу МСК, а также способности дифференцироваться в адипоциты, хондроциты и остеобласты) было проведено в работе Wang с соавторами (Wang et al., 2004). В дальнейшем была показана возможность получения МСК не только из 11 Вартонова студня (Wang et al., 2004), но и из периваскулярного пространства пупочной вены (Ennis et al., 2008), а также из амниотической мембраны (Mihu et al., 2009) (Рис.1.). Накоплены данные, свидетельствующие о том, что МСК, выделенные из разных регионов пупочного канатика, являются отдельными популяциями с пролиферативной (Conconi, 2011). пролиферативную одинаковым активностью МСК иммунофенотипом, и дифференцировочной Вартонова активность и но не студня имеют экспресcируют различной способностью более низкую панцитокератин и поверхностный антиген CD146, а МСК первиваскулярного пространства характеризуются высокой скоростью роста популяции in vitro и высоким уровнем экспрессии панцитокератина и CD146 (Carvalho et al., 2011). Кроме того, МСК из этих двух регионов отличаются по уровню продукции IL-6 и Flt3 (Xu et al., 2014). Рисунок 1.1. Схема строения пупочного канатика человека. Поэтому для последующей корректной интерпретации результатов необходимо учитывать методику выделения МСК. На данный момент существует более 10 описанных способов получения МСК из тканей пупочного канатика с различной степенью эффективности выделения (Baudin et al., 2007; Kim et al., 2013; Fong et al., 2010), которые заключаются в энзиматической обработке тех или иных участков пупочного канатика, либо его фрагментов целиком. 12 Одной из основных характеристик источника получения МСК является их содержание в исследуемой ткани. Известно, что МСК составляют порядка 0.001- 0.01% от общего количества мононуклеарных клеток, которые могут быть получены в ходе центрифугирования аспирата костного мозга на градиенте фиколла (Pittenger et al.,1999.). Из 1 г жировой ткани возможно получение 5 × 103 МСК (Fraser et al., 2006). В тоже время, данные о содержании МСК в периваскулярном пространстве пупочной вены на данный момент отсутствуют. Возможность получения терапевтически эффективной дозы МСК для их клинического применения напрямую зависит от пролиферативной активности и скорости старения клеток в условиях in vitro. Согласно литературным данным, пролиферативный потенциал МСК значительно различается между клетками, полученными из разных источников. Большинство авторов сходится во мнении, что МСК, выделенные из материала более молодых доноров, пролиферируют быстрее и способны пройти в культуре большее число пассажей (Siegel et al., 2013; Li et al., 2014). Поэтому МСК из неонатальных тканей (плацента, пупочный канатик, пуповинная кровь) могут обладать максимальной пролиферативной активностью, что и было продемонстрировано in vitro (Baksh et al., 2007). МСК костного мозга имеют максимальное время удвоения и способны пройти наименьшее количество пассажей по сравнению с МСК, полученными из пупочного канатика и жировой ткани (Baksh et al., 2007). Как известно, функционирование стволовых клеток, в том числе МСК, зависит от факторов их микроокружения, которые объединяют в понятие «ниша стволовых клеток». Данное понятие было предложено в 1978 г. R. Schofield (Schofield, 1978) и включает в себя совокупность факторов микроокружения стволовых клеток (газовый состав, межклеточные взаимодействия, состав межклеточного вещества, цитокиновый фон и др.), влияющие на пролиферацию, дифференцировку, выживаемость и функционирование стволовых клеток. Концентрация кислорода является одной 13 из важных характеристик ниши стволовых клеток. В классической для МСК нише – костном мозге – концентрация кислорода не превышает 6%, таким образом, in vivo МСК существуют в условиях гипоксии (Eliasson, Jonsson, 2010; Yin et al., 2006). В других тканях, из которых были получены МСК, концентрация кислорода также ниже, чем в атмосфере (Pasarica et al., 2009; Simon, Keith et al., 2008). Следовательно, культивирование в условиях гипоксии (пониженное содержание кислорода по сравнению с атмосферным, в пределах от 2 до 10%) является более физиологичным для МСК, чем культивирование в условиях нормоксии (содержание кислорода находится в районе 20% и соответствует содержанию кислорода в атмосфере). Доказательством такому представлению могут служить данные ряда авторов, свидетельствующие о том, что повышенное содержание кислорода по сравнению с физиологическими условиями (нормоксия) при культивировании МСК in vitro приводит к увеличению времени удвоения, ускорению старения клеток в культуре, замедлению пролиферации, а также повреждению ДНК (Grayson et al., 2007; Fehrer et al., 2007; Буравкова и др., 2009; Basciano et al., 2011). Концентрация кислорода при культивировании в условия гипоксии варьирует в работах разных авторов (Grayson et. al., 2007; Буравкова и др., 2009), но все больше подтверждений получает мнение, что оптимальная для культивирования МСК концентрация кислорода находится в пределах 4-7% (Буравкова и др., 2009; Fehrer et. al., 2007). Таким образом, культивирование МСК в атмосфере с пониженной концентрацией кислорода может рассматриваться как один из наиболее эффективных и простых подходов для повышения и поддержания пролиферативной активности МСК in vitro, в том числе, для последующего клинического применения (Haque et al., 2013). Поэтому анализ функциональной активности МСК в экспериментальных системах in vitro также целесообразно проводить в условиях гипоксии. 14 1.2. Иммунофенотипическая характеристика МСК Активное изучение МСК, выделенных из различных источников, привело к необходимости более точного описания МСК по сравнению с использованием только культуральных методов (морфология, способность к адгезии к культуральному пластику и колониеобразованию, дифференцировка в остеобласты, хондроциты и адипоциты). Трудность идентификации МСК как отдельного типа клеток заключается в отсутствии на их поверхности специфичных маркеров, по которым можно было бы однозначно определить МСК. Разными авторами был предложен достаточно большой список антигенов для фенотипирования МСК (Mafi et al., 2011). Минимальный набор маркеров для идентификации МСК, составленный Международным обществом клеточной терапии, включает в себя следующие антигены: CD73, CD90 и CD105 а также отсутствие маркеров гемопоэтических клеток CD34, CD45, CD14 (Horwitz et al., 2005). CD73 является 5'-нуклеотидазой, которая катализирует преобразование нуклеотидмонофосфатов в нуклеозиды. Кроме МСК, CD73 экспрессируется на лимфоцитах, эндотелиальных клетках, клетках гладкой мускулатуры, эпителиальных клетках, и фибробластах (Airas, et al., 1997; Strohmeier et al., 1997; Hashikawa et al., 2003; Tamajusuku et al., 2006). CD73 участвует в регуляции межклеточной адгезии, а также во взаимодействии с фибронектином и ламинином (Stochaj et al., 1989). CD90, также известный как Thy1, является гликозилфосфатидилинозитолсвязывающим белком и вовлечен в регуляцию межклеточного взаимодействия и взаимодействия с матриксом (Leyton, 2013; Rege, Hagood, 2005). Активация CD90 влияет на процессы миграции (в том числе трансэндотелиальной) (Saalbach, et al., 2005), онкогенной трансформации (Liu et al., 2004), пролиферации (Hagood, et al., 2002) и апоптоза (Fujita, et al., 1996). Одной из основных функций CD90 является участие в процессе активации Т-лимфоцитов (Haeryfar, Hoskin, 2004). На поверхности МСК плотность CD90 является 15 максимальной, по сравнению с другими маркерами (Siegel et al., 2013). Ранее экспрессия CD90 была описана для гематопоэтических стволовых клеток, лимфоцитов, фибробластов и нейронов (Craig et al., 1993; Rege, Hagood, 2006; Jurisic et al., 2010). Кроме того, высокий уровень экспрессии CD90 был показан для раковых стволовых клеток (Yang et al., 2008; He et al., 2012; Yan et al., 2013). Недавно на МСК жировой ткани мыши было показано, что клетки с более высоким способностью уровнем к экспрессии колониеобразованию CD90 и характеризуются остеогенной лучшей дифференцировке (Kawamoto et al., 2013). Кроме того, существуют данные о корреляции между иммуномодулирующей активностью МСК и уровнем экспрессии CD90 на их поверхности (Campioni et al., 2009). CD105 (эндоглин) - это мембранный гликопротеин I типа, который функционирует в качестве дополнительного рецептора для лигандов суперсемейства трансформирующего фактора роста бета (TGF-β), включая TGF-β1 и TGF -β3, активин А и BMP7 (Cheifetz, et al., 1992; ten Dijke et al., 2008). CD105 участвует в регуляции миграции и процессах реорганизации цитоскелета. Высокий уровень экспрессии CD105 наблюдается в местах воспаления, в сосудах, окружающих опухоль, а также сопровождает васкулогенез (Bernabeu et al., 2007). CD105 является одним из основных позитивных маркеров для идентификации МСК (Dominici et al., 2006). Однако популяции МСК могут быть гетерогенны по экспрессии данного маркера, причем уровень экспрессии CD105 коррелирует с их функциональной активностью (Rada et al., 2011; Aslan et al., 2006; Yu et al., 2010; Jiang et al., 2010; Levi et al., 2010). Ранее было показано, что доля CD105+ клеток в адгезионной фракции, полученной при выделении МСК, до 1 пассажа не превышает 61%, и повышается к 3 пассажу (Mitchell et al., 2006). Anderson с соавторами разделили МСК жировой ткани мыши на CD105+ и CD105- клетки, которые, по мнению авторов, являются отдельными субпопуляциями, обладающими различными свойствами. Для CD105- МСК была показана 16 лучшая дифференцировочная способность в адипогенном и остеогенном направлениях по сравнению с CD105+. Кроме того, CD105- МСК обладали более выраженным супрессорным действием на пролиферацию Т-лимфоцитов in vitro. При этом CD105- и CD105+ МСК характеризуются одинаковым пролиферативным потенциалом, способностью к колониеобразованию и уровнем экспрессии остальных поверхностных антигенов. Кроме того, длительное культивирование CD105+ клеток приводило к снижению его экспрессии, характерной и для всей популяции, в то время как CD105- МСК не меняли своего фенотипа и оставались CD105 - негативными. Уровень экспрессии CD105 повышался при добавлении в культуральную среду TGF-β1, но только на CD105+ МСК (Anderson et al., 2013). CD44 является рецептором гиалуроновой кислоты и представляет из себя ассоциированный с цитоскелетом (с белком анкирином) трансмембранный гликопротеин молекулярной массой 80 - 95 кДа. CD44 экспрессируется на поверхности различных типов клеток, включая Т- и В-лимфоциты, моноциты, макрофаги, гранулоциты, фибробласты. CD44 принимает участие во взаимодействии клеток с межклеточным веществом, а также в активации лимфоцитов и их миграции в лимфоузлы (Aruffo, et al., 1990). CD44 необходим для взаимодействия клеток стромы костного мозга (т.е. МСК) с предшественниками В-клеток, что является обязательным условием созревания последних. Экспрессия CD44 на поверхности МСК необходима для их миграции к месту повреждения (Herrera et al., 2007). В тоже время в первичной культуре МСК, полученной из костного мозга (как человека, так и мыши), присутствует популяция клеток, не экспрессирующих CD44, затем, в процессе культивирования, все клетки становятся CD44+ (Qian et al., 2012). НLA-I (MHC I) - лейкоцитарный антиген человека I класса (главный комплекс гистосовметимости). С помощью HLA-I осуществляется презентация белковых фрагментов Т-цитотоксическим клеткам, которые осуществляют лизис эффекторной клетки при распознавании чужеродных антигенов. 17 Молекулы HLA также выступают в качестве лигандов для KIR (killer-cell immunoglobulin-like receptors) на естественных киллерах (ЕK) (Farag et al., 2002). HLA-I необходимы для защиты клеток от лизиса естественными киллерами, одной из основных функций которых является разрушение опухолевых клеток, у которых снижена или отсутствует экспрессия HLA-I («положительное» распознавание) (Ruggeri et al., 2001). Таким образом, уровень экспрессии HLA-I на поверхности МСК может быть существенной характеристикой при их аллогенной трансплантации, значительно влияющей на иммуногенность и выживаемость МСК, а значит и на эффективность клеточной терапии. Было показано, что МСК экспрессируют на своей поверхности HLA-I (Le Blanc et al., 2003). При этом в части работ упоминается об относительно низком уровне экспрессии HLA-I (Newman et al., 2009, Franquesa et al., 2012), однако прямых свидетельств этому утверждению не приводится. В работе Crop с соавторами было убедительно продемонстрировано, что МСК характеризуются относительно высоким по сравнению с другими типами клеток уровнем экспрессии мРНК HLA-I (Crop et al., 2010). Уровень экспрессии HLA-I на МСК повышается в присутствии INFγ (Klyushnenkova et al., 2005; Isa et al., 2010; Crop et al., 2010). В качестве дополнительных маркеров для иммунофенотипирования МСК могут быть использованы CD10 и CD13. CD 10 (неприлизин, нейтральная эндопептидаза) является цинк-зависимой мембрано-связанной металлопротеазой, которая расщепляет ряд гормонов пептидной природы, включая глюкагон, энкефалин, субстанции Р, нейротензин, окситоцин и брадикинин. CD10 участвует в регуляции ряда физиологических процессов, таких как миграция, клеточная адгезия, апоптоз и пролиферация. С одной стороны, CD10 обладает внеклеточной энзиматической активностью, на чем основано его ауто- и паракринное действие. С другой стороны, CD10 вовлечен в ряд внутриклеточных сигнальных путей. В частности, CD10 инактивирует провоспалительные пептиды, вовлеченные в регуляцию иммунной системы и ассоциированные с аутоиммунными 18 заболеваниями. Например, CD10 гидролизует IL-1β, продукция которого повышена у пациентов с остеоартритом и ревматоидным артритом (Karlsson et al., 2008). CD10 вовлечен в активацию опосредованной киназой фокальных контактов клеточной адгезии, ингибируя миграцию клеток, действуя при этом опосредовано и независимо от своей каталитической активности (Sumitomo et al., 2005). На МСК жировой ткани было показано, что доля клеток, экспрессирующих CD10, сильно варьирует от образца к образцу и снижается в процессе культивирования c 2 по 10 пассаж. По данным Siegel с соавторами, культуры МСК костного мозга гетерогенны по экспрессии данного маркера. В среднем, на первом пассаже, доля CD10+ клеток составляла 84.2% ± 11.7%. При этом, авторы наблюдали прямую корреляцию между уровнем экспрессии CD10 и эффективностью адипогенной дифференцировки (Siegel et al., 2013). CD13 (аминопептидаза N) был первоначально идентифицирован в качестве маркера миелоидной лейкемии и нормальных гематопоэтических клеток миелоидного происхождения (Mina-Osorio, 2008). CD13 является экзопептидазой и обеспечивает фермент-зависимое расщепление биологически активных пептидов (Gros et al., 1985) и высвобождение концевых аминокислот (McClellan, Garner, 1980), участвуя таким образом в реализации разнообразных биологических процессов. CD13 может функционировать как рецептор для некоторых вирусов (Yeager et al., 1992), в качестве молекулы адгезии (MinaOsorio et al., 2008) и регулятора ангиогенеза (Bhagwat et al., 2001). Активация CD13 индуцирует запуск сигнального пути, приводящего к реорганизации цитоскелета и усилению межклеточной адгезии, регулируя, таким образом, миграцию клеток (Mina-Osorio et al., 2008; Subramani et al., 2013). На МСК мыши было показано, что экспрессия CD13 или ее отсутствие не влияет на пролиферативную способность клеток, а также их способность дифференцироваться в адипогенном и остеогенном направлениях. На модели тяжелой травматической ишемии конечностей авторы показали, что введение МСК, не экспрессирующих CD13, не приводит к терапевтическому эффекту, в отличие от CD13+ МСК. Также in vitro было показано, что отсутствие 19 экспрессии CD13 негативно сказывается на способности МСК к адгезии к молекулам внеклеточного матрикса, что опосредовано снижением фосфорилирования киназы фокальных контактов (Rahman et al., 2013). В качестве негативных маркеров при иммунофенотипировании МСК также принято использовать (трансмембранный CD34 сиуломуцин, экспрессирующийся на гемопоэтических стволовых клеток) CD45 (общий лейкоцитарный антиген, является основным гликопротеином мембраны лимфоцитов), CD117 (рецептор фактора стволовых клеток SCF, экспрессируется на гематопоэтических стволовых клетках) и CD14 (маркёр моноцитов и макрофагов). При этом необходимо учитывать, что иммунофенотип МСК in vivo и in vitro может значительно различаться (Lv et al., 2014). Например, в ряде работ было показано, что в МСК жировой ткани до культивирования и на ранних пассажах существуют популяции CD34+ клеток. При дальнейшем субкультивировании доля таких клеток не превышает 2-4% (Gimble et al., 2007; Yoshimura et al., 2006;). Таким образом, культуры МСК могут быть геторогенны по экспрессии даже тех антигенов, которые иммунофенотипирования. наиболее Кроме часто того, используются важной для их характеристикой иммунофенотипа МСК является уровень экспрессии антигена, который определяется по интенсивности флуоресценции клеток, его экспрессирующих. Уровень экспрессии служит отражением плотности изучаемого антигена на поверхности МСК и может быть связан с их функциональным состоянием и иметь существенное значение при терапевтическом применении. До сих пор не получено однозначного ответа на вопрос о сходстве или различии иммунофенотипа МСК, полученных из разных источников. По мнению большинства авторов, МСК выделенные из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика обладают сходным иммунофенотипом по большинству маркеров. При этом, в основном, имеется в виду доля клеток в популяции, экспрессирующих тот или иной маркер. В тоже время описаны 20 иммунофенотипические различия между культурами МСК из разных источников (Zuk et al., 2002). Более того, было показано наличие зависимости уровня экспрессии антигенов на поверхности МСК костного мозга от возраста и пола доноров. Так, плотность антигенов CD90, CD106, CD140b, CD146, CD166 и CD274, экспонированных на поверхности отдельных клеток, было выше в культурах, полученных от молодых доноров по сравнению с культурами от пожилых доноров. При этом не было показано корреляции между возрастом и морфологическими (размер клеток), а также кинетическими характеристиками (скорость деления) МСК (Siegel et al, 2013). С другой стороны, не меньшее влияние могут оказывать условия культивирования МСК, в частности, степень конфлюентности и пассаж, на котором находится культура, а также концентрация кислорода в процессе культивирования (Halfon et al., 2010). Таким образом, учитывая разницу в протоколах культивирования и дизайна экспериментов, пока нельзя сделать вывод, что оказывает наибольшее влияние на фенотип МСК: условия культивирования или характеристики источника МСК. Тем не менее, наличие зависимости характеристик МСК от тканевой принадлежности и условий культивирования обязывает исследователей проводить тщательное описание используемых в работе культур МСК, особенно для их клинического применения. 1.3. Проявления функциональной активности МСК по отношению к Тлимфоцитам Одним из наиболее активно изучаемых свойств МСК является их способность оказывать влияние на функциональную активность клеток иммунной системы. Показано, что МСК способны взаимодействовать практически со всеми компонентами иммунной системы, включая факторы врожденного и приобретенного иммунитета (Рис.1.2.). 21 Рисунок 1.2. Схема взаимодействия МСК и клеток иммунной системы. Цитировано по Ben-Ami с соавторами, 2011. Впервые способность иммунокомпетентных клеток МСК влиять была показана на на функцонирование примере подавления пролиферативной активности Т-лимфоцитов в присутствии МСК (Bartholomew et al., 2002; Di Nicola et al., 2002). В ходе дальнейших многочисленных исследований получены данные, что МСК могут воздействовать на процессы, происходящие на каждом из этапов Т-клеточного ответа. МСК способны модулировать активацию Т-лимфоцитов (Le Blanc et al., 2004, Андреева и др., 2013), которая предшествует и сопровождает последующие изменения их функционального состояния. Активация Тлимфоцитов является результатом сигнального каскада в ответ на связывание антигена с комплексом TcR (T-клеточный рецептор) и CD3, а также с костимуляторными молекулами. Этот процесс сопровождается экспрессией на поверхности клеток ряда молекул, названных маркерами активации. Выделяют ранние и поздние маркеры активации Т-лимфоцитов. 22 Наиболее ранним маркером активации Т-лимфоцитов является СD69 – он начинает экспрессироваться в течение первых 4 часов после контакта с антигеном (D’Ambrosio et al., 1993). CD69 относится к лектинам C типа и был изначально описан как костимуляционная молекула Т-клеточной активации и пролиферации (Ziegler et al., 1994), стимулирующая продукцию IL-2 и его рецептора (CD25) (Testi et al., 1989), а также TNF-α в Т-лимфоцитах (Santis et al., 1992). В последующие годы были получены данные, согласно которым, в зависимости от факторов микроокружения, CD69 может функционировать также как регуляторная молекула. При этом основным механизмом является индукция синтеза TGFβ, происходящая вследствие активации CD69 (Esplugues et al., 2003). TGFβ способен ингибировать дифференцировку Т-хелперов в Тхелперы 1 типа или 2 типа в зависимости от факторов микроокружения (Holter et al., 1994), подавлять продукцию IgA В-клетками (Gorelik et al., 2002; Cazac, Roes, 2000). Как костимуляционная молекула CD69 функционирует, если характер ее экспрессии носит кратковременный и индуцибельный характер. Постоянно экспрессирующийся CD69 оказывает ингибирующее действие на реализацию эффекторных функций Т- и В-лимфоцитов. Например, при активации CD69 происходит снижение продукции провоспалительных цитокинов IL-17 и IFNγ (Sancho et al., 2003; Radulovic et al., 2012; Martín et al., 2010). В связи с этим уровень экспрессии CD69 может иметь важное физиологическое значение при разрешении воспалительной реакции либо в процессе хронического воспаления. В работах разных групп исследователей было показано как стимулирующее (Ramasamy et al., 2008; Saldanha-Araujo et al., 2012), так и ингибирующее влияние МСК на экспрессию ранних маркеров активации Т-лимфоцитов, включая CD69 (Groh et al., 2005; Le Blanc et al., 2004; Cappellesso-Fleury et al., 2010). С одной стороны расхождение в результатах может быть объяснено методическими причинами: активированные Т-лимфоцитов преимущественно прикреплены к поверхности МСК (Quaedackers et al., 2009), за счет чего они практически не обнаруживаются среди клеток в супернатанте, который чаще 23 всего используют для анализа субпопуляционного состава лимфоцитов. Более важным представляется анализ изменения содержания CD69+ в присутствии МСК в зависимости от параметров экспериментальных систем, включая время от предъявления стимулирующего агента и начала сокультивирования, а также природы стимулирующего агента. Поздним маркером активации Т-лимфоцитов является HLA-DR молекула главного комплекса гистосовместимости II класса, которая начинает экспрессироваться через 24-48 часов после контакта со стимулирующим агентом. Молекула HLA-DR вовлечена в процесс презентации антигена, и активированные Т-лимфоциты, начинающие экспрессировать поздние маркеры активации, в том непрофессиональные числе HLA-DR, могут антиген-презентирующие функционировать клетки, как дополнительно усиливая иммунный ответ (Ebert et al.,, 2005). Относительное содержание HLADR+ Т-лимфоцитов в крови здоровых доноров не превышает 5,8% (Хайдуков и др., 2009). Повышение содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих поздний маркер активации HLA-DR, сопровождает течение иммунопатологических процессов различной этиологии. Например, значительное повышение содержания CD3+ HLA-DR+ клеток было показано у пациентов с болезнью Крона (Alkim et al., 2012), а также с атопическим дерматитом (Antunez et al., 2006) и атопической бронхиальной астмой (Corrigan et al., 1990). В экспериментальных системах in vitro наблюдали, что МСК могут подавлять индуцированное ФГА или антителами к CD3 и CD28 увеличение содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR (Буравкова и др., 2011; Kronsteiner et al., 2011). Не смотря на наличие разногласий относительно влияния МСК на процессы активации Т-лимфоцитов, подавление их пролиферации в смешанной культуре с МСК являестся хорошо известным и подробно описанным феноменом. Ингибирование пролиферации Т-лимфоцитов не имеет иммунологических ограничений и наблюдается в смешенной культуре как с аутологичными, так и 24 с аллогенными МСК (Krampera et al., 2003). Кроме того, МСК одинаково эффективно подавляют пролиферацию как CD4+, так и CD8+ Т-лимфоцитов, а также антиген-специфичных Т-лимфоцитов и Т-клеток памяти (Le Blanc et al., 2004, Krampera et al., 2006). В присутствии МСК снижается экспрессия циклина D, что приводит к остановке клеточного цикла активированных Т-клеток на G1 фазе (Glennie et al., 2005). Реализация иммуносупрессивного действия МСК на Т-лимфоциты осуществляется с помощью паракринных факторов, а также в результате прямого межклеточного взаимодействия между ними. На роль ключевых медиаторов, участвующих в этом процессе, предложено несколько биологически активных веществ: простагландин Е2 (ПГЕ2), оксид азота (NO), TGFβ, белок хемотаксиса моноцитов 1 (МСР-1/CCL2), лейкоцитарный антиген человека G (HLA G), индоламин-2,3-диоксигеназа (ИДО) (English et al., 2009; Selmani et al., 2008; Sarkhosh et al., 2003; Nasef et al., 2006). Супрессивное действие МСК не распространяется на Т-регуляторные клетки. Более того, было показано, что МСК, наоборот, стимулируют пролиферацию и повышают выживаемость этой субпопуляции Т-лимфоцитов (Casiraghi et al., 2008; Selmani et al., 2008; Frazier et al., 2014). На данный момент считается, что иммуномодулирующее действие МСК может быть частично опосредовано усилением функциональной активности и/или увеличением численности Т-регуляторных клеток (Burr et al., 2013). Как известно, Т-регуляторные клетки обладают иммуномодулирующими свойствами. В частности, Т-регуляторные клетки способны подавлять пролиферацию и функционирование CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов, регулировать дифференцировку Т-хелперов, а также дендритных клеток (Bestard et al., 2007; Shevach et al., 2009). Изначально Т-регуляторные клетки человека были описаны, как популяция Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+ (Iellem et al., 2001). Затем в качестве основного гена, регулирующего развитие и функционирование Т-регуляторных клеток, был идентифицирован FOXP3 (Fontenot, et al., 2003). Кроме того, признаком Трегуляторных клеток наравне с экспрессией FOXP3 является низкий уровень 25 экспрессии CD127 (альфа-цепь рецептора IL-7) в клетках с фенотипом CD4+CD25+, поскольку FOXP3 взаимодействует с промотором гена, кодирующего CD127, блокируя, таким образом, его экспрессию (Liu et al., 2006). Было показано, что аллогенные МСК могут индуцировать приобретение Т-лимфоцитами (CD4+) фенотипа Т-регуляторных клеток (Tobin et al., 2013). Полученные в результате такого сокультивирования Т-регуляторные клетки проявляют супрессорное действие и после удаления МСК (Gonzalez-Rey et al., 2010). Формирование популяции Т-регуляторных клеток может обеспечить пролонгированный эффект иммунопатологическими системного введения МСК процессами, поскольку, время пациентам циркуляции с Т- регуляторных клеток в кровяном русле значительно больше, чем МСК. Хотя большинство исследований, посвященных анализу влияния МСК на Т-лимфоциты, проводили с использованием МСК, выделенных из костного мозга, в последние несколько лет значительно увеличилось количество работ, в которых анализируются МСК из других источников (Strioga et al., 2012). В ряде исследований проявления функциональной активности МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика по отношению к компонентам иммунной системы были описаны как в целом сходные (Yoo et al., 2009; Najar et al., 2010). В более поздних публикациях указывается на различия в проявлениях иммунномодулирующих свойств МСК из разных источников. Большинство авторов сходятся во мнении, что МСК из костного мозга обладают менее выраженным действием, чем МСК жировой ткани (Melief et al., 2013; Ribeiro et al., 2013). Проявления функциональной активности МСК пупочного канатика изучены наименее полно, кроме того, в исследованиях использовали клетки, полученные только из Вартонова студня (Ribeiro et al., 2013; Li et al., 2014), но не из других регионов пупочного канатика. Результаты немногочисленных исследований на эту тему находятся в противоречии друг с другом относительно оценки выраженности иммуномодулирующих свойств МСК пупочного канатика при их сравнении с МСК костного мозга. Была показана как более высокая интенсивность иммуносупрессорного действия 26 МСК пупочного канатика (Li et al., 2014), так и сниженная (Ribeiro et al., 2013) по сравнению с МСК костного мозга, а также отсутствие различий в эффектах оказываемых МСК из этих двух источников (Yoo et al., 2009). При этом основным и иногда единственным критерием сравнения служила степень подавления митоген-индуцированной пролиферации Т-лимфоцитов, в то время как влияние МСК из разных источников на процессы активации Т-лимфоцитов и дифференцировки Т-хелперов остается практически не изученным. 1.4. Проявления функциональной активности МСК по отношению к Влимфоцитам Характер взаимодействия МСК с В-лимфоцитами описан менее полно по сравнению с Т-лимфоцитами. Большинство исследований, посвященных данной теме, были проведены только на МСК костного мозга, кроме того, имеющиеся сведения о влиянии МСК на В-лимфоциты противоречивы. В работе 2006 года было показано подавление пролиферации Влимфоцитов, изолированных методом иммуномомагнитной сепарации (Corcione et al., 2006). Максимальное ингибирование пролиферации Влимфоцитов наблюдали при равном соотношении МСК и В-клеток, но при уменьшении количества МСК (соотношение 1:5 и 1:10) антипролиферативный эффект пропадал. При этом не было показано подавления экспрессии HLADR, CD80, CD86, или CD40 на В-лимфоцитах. Позже снижение пролиферативной активности под воздействием МСК наблюдали на Влимфоцитах, полученных из селезенки, не только при контактном сокультивировании (Che et al., 2012), но и при сокультивировании с использованием полупроницаемой мембраны для устранения прямого межклеточного контакта между компонентами смешанной культуры (Asari et al., 2009). В последнем случае это выражалось не в полном подавлении пролиферации, а в уменьшении доли клеток, вступающих в митоз. В некотором противоречии c описанными выше исследованиями находится работа Krampera с соавторами (2006), в которой было показано, что подавление МСК 27 пролиферации изолированных из периферической крови В-лимфоцитов осуществляется только при добавлении экзогенного IFNγ – цитокина, который продуцируют Т-лимфоциты, натуральные киллеры, но не В-лимфоциты. Необходимость наличия Т-лимфоцитов и непосредственного контакта между ними и МСК для подавления пролиферации и дифференцировки В-клеток также продемонстрировали Rosado с соавторами (2015). Эти данные могут свидетельствовать об отсутствии прямого влияния МСК на В-лимфоциты, что, однако, требует дополнительного изучения. Согласно, результатам нескольких групп исследователей, в присутствии МСК происходит снижение уровня продукции иммуноглобулинов В-клетками (Corcione et al., 2006, Che et al., 2012). Кроме того, наблюдали подавление дифференцировки В-лимфоцитов в плазматические клетки и снижение их способности к хемотаксису во вторичные лимфоидные органы в ответ на два основных хемокина (CXCL12 и CXCL13) (Corcione et al., 2006). С другой стороны, существуют работы, описывающие стимулирующее действие МСК на В-лимфоциты. Было показано, что МСК индуцируют пролиферацию и дифференцировку В-клеток (Traggiai et al., 2008), а также повышают секрецию иммуноглобулинов (Rasmusson et al., 2007). Согласно обзору В.Б. Климовича (2014), данные о супрессорном действии МСК человека в экспериментальных моделях in vitro получены в 9 работах, о стимулирующем – в 6, а разнонаправленное - наблюдали в трех исследованиях. То есть при описании функциональной активности МСК по отношению к Влимфоцитам в разных экспериментальных системах были получены противоположные результаты. Предполагается, что это обусловлено различием в протоколах экспериментов (Franquesa et al., 2012). Влияние тканевой принадлежности МСК на пролиферацию и функциональную активность В-лимфоцитов также практически не изучено. Однако В-клетки и их предшественники имеют различное функциональное состояние в костном мозге, в периферической крови или в периферических лимфоидных органах. Хорошо известно, что в костном мозге В-лимфоциты 28 проходят антигеннезависимую дифференцировку до стадии незрелой В-клетки. При этом обязательным условием является их взаимодействие с клетками стромы костного мозга, которые представлены, в том числе, МСК. Это взаимодействие осуществляется как за счет межклеточного контакта (на ранних стадиях дифференцировки), так и в результате действия паракринных факторов (IL-17), секретируемых стромальными клетками или МСК (Рис.1.3.) (Ройт, Бростофф, 2000). Рисунок 1.3. Взаимодействие В-лимфоцитов с МСК в костном мозге в ходе дифференцировки В-лимфоцитов. Цит. по «The Immune system» (Parham, 2009). Таким образом, можно говорить, что одной из функций МСК костного мозга in vivo является поддержание антигеннезависимой дифференцировки В-лимфоцитов. Антигензависимая дифференцировка происходит в периферических лимфоидных органах и определяется в первую очередь взаимодействием с антигеном. Важным этапом антигензависимой дифференцировки явяется пролиферация В- лимфоцитов. Дифференцировка на поздних стадиях регулируется в основном паракринными факторами, которые продуцируют различные типы клеток, среди которых могут быть и МСК (Lim et al., 2010). Поэтому источник получения МСК и В-лимфоцитов, а также стадия их дифференцировки может значительно влиять на модальность взаимодействия МСК и В-лимфоцитов. 29 В качестве информативной тест-системы для оценки влияния МСК различной тканевой принадлежности на функциональную активность Влимфоцитов могут быть использованы клеточные линии, соответствующие Вклеткам на разных стадиях созревания. Например лимфобластоидная линия Namalva является потомком клона В-клеток, трансформированных на ранней стадии созревания, клетки данной линии продуцируют IgM (Guy et al., 1987). Миеломная линия U266 была получена из плазматических клеток, в которых трансформация произошла после активации гена, кодирующего синтез эпсилон-цепи IgE (Nilsson, 1971; Hardy, Hayakawa, 2001). Преимуществом использования клеточных линий является стабильная пролиферация и конститутивная продукция иммуноглобулинов (Ig) разных классов (AméThomas et al., 2007; Bocelli-Tyndall et al., 2007). 1.5. Проявления функциональной активности МСК при аллерген- специфических реакциях лейкоцитов. Считается, что МСК в основном ингибируют реакции, опосредованные Тхелперами 1 (Batten et al., 2006; Lu et al., 2009) и Т-хелперами 17 (Ghannam et al., 2010). В многочисленных исследованиях in vitro было показано, что МСК подавляют пролиферацию, активацию и дифференцировку CD4+ T-клеток в условиях, обеспечивающих дифференцировку в направлении T-хелперов 1 или T-хелперов 17 (Luz-Crawford et al., 2013). На различных моделях Тх1зависимых заболеваний (Gonzalez et al., 2009; Madec et al., 2009; Fiorina et al, 2009), а также в ходе проведения клинических испытаний применения МСК для лечения болезни Крона также были получены подтверждения существования такого феномена (Forbes et al., 2014). При этом предполагается непрямой механизм супрессивного действия МСК на Тх1 через подавление презентации антигена дендритными клетками и формирование популяции Трегуляторных клеток (Boumaza et al., 2009; Gonzalez et al., 2009). В тоже время, на моделях заболеваний, связанных с преимущественной дифференцировкой Т-хелперов в Т-хелперы 2 типа (Тх2), также наблюдали 30 снижение интенсивности проявления патологических реакций после введения МСК. Например, введение аллогенных или аутологичных МСК костного мозга мышам с Tх2-опосредованным аллергическим воспалением дыхательной системы приводило к подавлению воспаления, и сопровождалось ингибированием продукции цитокинов IL-13 и IL-4, выделяемых Тх2, а также блокированием продукции IgE (Kavanagh, Mahon, 2011; Goodwin et al., 2011). При моделировании на мышах бронхиальной астмы было установлено, что внутривенное введение сингенных МСК из костного мозга (Nemeth et al., 2010), аллогенных эмбриональных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) снижало интенсивность проявлений заболевания (Ogulur et al., 2014). Подобный позитивный эффект наблюдали также в ксеногенной системе при трансплантации сенсибилизированным мышам МСК, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (Sun et al., 2012). Описано ослабление реакций на пищевые и ингаляционные аллергены у пациентов, получивших в ходе ограниченных клинических испытаний трансплантацию культивированных аутологичных МСК костного мозга (Гранов и др., 2005). На основе данных, полученных in vivo, можно предположить, что одними из основных параметров, которые изменяются под воздействием МСК, являются титры IL4 и IgE. IL-4 стимулирует дифференцировку Т-хелперов в Т-хелперы 2-го типа (Li-Weber, Krammer, 2003), поддерживает пролиферацию В-лимфоцитов и стимулирует продукцию IgE, играя, таким образом, существенную роль в реализации аллергической реакции (Paul et al., 1991; Schmidt-Weber, 2012). В то же время практически не изучены механизмы, которые лежат в основе наблюдаемых изменений. В качестве медиаторов были предложены TGFβ (Nemeth et al., 2010) и оксигеназа гемма-1 (Li et al., 2013). При этом все накопленные данные были получены на МСК, выделенных из костного мозга, а действие МСК из других источников на компоненты аллергических реакций не изучено. 31 1.6. Изменение функционального состояния МСК при их взаимодействии с компонентами иммунной системы Известно, что иммуномодулирующее действие МСК не проявляется постоянно и является результатом изменения их функциональной активности под действием сигналов или медиаторов (INFγ, IL-1β и TNFα), поступающих от иммуннокомпетентных клеток (Krampera et al., 2006; Prasanna et al., 2010). Для описания этого феномена были введены термины лицензирование («licensing») или праймирование («praiming») МСК (Waterman et al., 2010; English, 2013). Предполагается, что одним из центральных механизмов, участвующих во взаимодействии МСК с клетками иммунной системы является активация сигнальных путей, опосредованных Toll-подобными рецепторами (TLR). TLR играют важную роль в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета, обеспечивая распознавание патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), включающих в себя липиды, липопротеины, белки и нуклеиновые кислоты широкого спектра бактерий, вирусов, паразитов и грибов (Manicassamy et al., 2009; Kawai et al., 2010), а также паттернов, ассоциированных с сигналами опасности (danger-/damage-associated molecular patterns, DAMPs): внутриклеточные стимулы (белок теплового шока 70 (Asea et al., 2000), домен А фибронектина (Okamura et al., 2001), мочевая кислота (Liu-Bryan et al., 2005), человеческий дефенсин-3 (Funderburg et al., 2007) и др). На данный момент идентифицировано 11 TLR человека. В ряде работ было показано, что МСК конститутивно экспрессируют мРНК TLR с 1 по 9 (Optiz et al., 2009; RomieuMourez et al., 2009). Недавно была предложена концепция, описывающая существования двух субтипов МСК, названных по аналогии с классификацией макрофагов: провоспалительные МСК1 и иммуносупрессорные МСК2, поляризация между которыми происходит в ответ на взаимодействие специфических лигандов с TLR (Waterman et al., 2010; Romieu-Mourez et al., 2009). В своей работе Waterman с соавторами (2010) показали, что стимуляция TLR3 приводит к 32 повышению продукции IL-4, CCL10, CCL5, а TLR4 – к продукции провоспалительных факторов: IL-6 и IL-8. В качестве агонистов для TLR4 использовали LPS и INFγ, а для TLR3 – poly(I:C), с которыми МСК инкубировали не более часа за 1-2 суток до анализа. Субтипы МСК, описанные выше, возникали только при индукции соответствующими агонистами Tollподобных рецепторов, и их не наблюдали одновременно в одной культуре. Конститутивная экспрессия TLR3 в МСК показана в нескольких исследованиях. В клетках обнаруживаются мРНК TLR3 (Raicevic et al., 2012; Chen et al., 2013), а также методами проточной цитофлуорометрии доказано присутствие в клетках экспрессированного белка (Chen et al., 2013). Активация TLR3 в результате взаимодействия с двухцепочечной РНК (dsRNA) приводит к активации сигнальных путей, опосредованных адаптерным белком TRIF (TIR domain-containing adaptor inducing IFN-b) и одним из транскрипционных факторов – IRF3 или NF-κB (Gauzzi et al., 2010), что схематично представлено на Рис.1.4. Рисунок 1.4. Схема сигнальных каскадов, связанных с TLR3 (Цит. по Gauzzi et al., 2010). 33 В то же время результаты разных групп исследователей расходятся в оценке экспрессии TLR4 в МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. При анализе мРНК МСК, полученных из разных источников, был показан достаточно высокий уровень экспрессии TLR4 (Opitz et al., 2009; Chen et al., 2013). Методом проточной цитофлуорометрии продемонстрировано, что TLR4 присутствует только на поверхности МСК, полученных из костного мозга и жировой ткани (Raicevic et al., 2011). Напротив, в работе Chen c соавторами (2013) наблюдали достаточно высокий уровень экспрессии TLR4 в МСК пупочного канатика. Данные Romieu-Mourez с соавторами свидетельствуют об отсутствии экспрессии TLR4 на поверхности МСК костного мозга (RomieuMourez et al., 2013). Таким образом, вопрос об уровне экспрессии, по крайней мере, TLR4 на поверхности МСК различного тканевого происхождения является спорным. Уровень экспрессии TLR3 и TLR4, а также их изменение в зависимости от факторов микроокружения является признаком способности МСК распознавать широкий спектр лигандов, присутствующих в местах воспаления или повреждения тканей. Передача сигнала от TLR4 осуществляется по MyD88-зависимому сигнальному пути, который включает в себя рекрутирование MyD88, что приводит к активации каскада MAPK и транслокации транскрипционного фактора NF-κB (Meylan et al., 2006), либо по MyD88-независимому пути через TRIF, который также приводит к активации МАР-киназ и транскрипционных факторов NF-κB и IRF (interferon-responsive factors) (O’Neill, Bowie, 2007). В сигналинге от TLR4, в отличие от TLR3, участвует TRAM (Trif-related adaptor molecule) (Takeda, Akira, 2005) (Рис.1.5.). 34 Рисунок 1.5. Схема сигнальных каскадов, связанных с TLR4 (Цит. по Zeuner et al., 2015). Таким образом, при активации TLR3 и TLR4 запускается ряд сигнальных каскадов, приводящих к связыванию с ДНК транскрипционного фактора NFκB, в также АР-1, IRF3, регулирующих транскрипцию различных биологически активных факторов (Akira S., Takeda K., 2004). NF-κB – регулирующий транскрипционный на генетическом противовоспалительных фактор уровне плейотропного работу, как про- действия, так и факторов (Ghosh, Karin, 2002, Greten et al., 2007; www.NF-κB.org). NF-κB был впервые выделен из В-лимфоцитов мыши и описан как регулятор гена легкой κ-цепи (nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells) (Sen, Baltimore, 1986). Транскрипционный фактор NF-κB – это семейство (RelA) , RelB и c-Rel, цитоплазматических существующих в белков, виде р50 , р52 , р65 гомодимеров и гетеродимеров (O’Dea, Hoffmann, 2010). Наиболее распространенной формой NF-κB является гетеродимер субъединицы р65 с субъединицей р50 или р52 (Vallabhapurapu, Karin, 2009; Chen et al., 1998). Димеры в не активированном состоянии существуют в цитоплазме в комплексе с белком IκB (inhibitory 35 subunit from NF-κB), который маскирует сигнал ядерной локализации, препятствуя, таким образом, импорту в ядро (Hayden, Ghosh, 2008). В семейство IκB входит несколько белков (IκBα, IκBβ, IκBγ/p105, IκBδ/p100, IκBε), имеющих анкириновые повторы для связывания с Rel доменом NF-κB. Активация NF-κB заключается в фосфорилировании (по остаткам серина в положении 32 и 36 в N-концевой части молекулы), убиквитинизации и последующей деградации IκB в протеосоме (Scherer et al., 1995), в результате чего, димер высвобождается и транслоцируется в ядро, где происходит связывание со специфическими последовательностями. Фосфорилирование IκB осуществляется IκB киназным комплексом (IKK), состоящим из субъединиц IKKα и IKKβ c каталитической активностью и регуляторной субъединицы IKKγ/ NEMO (NF-κB essential modulator) (Karin et al., 2000). В свою очередь, фосфорилирование IKK может осуществляться различными киназами семейства MAPKKК (Mitogen-activated protein kinases kinases kinases) при связывании соответствующих лигандов с TLR (Рис. 1.4. и 1.5.), с членами суперсемейства рецептора TNFα (TNFR superfamily) (Basak, Hoffmann, 2009), Т- и В-клеточными рецепторами (TCR и BCR), комплексом CD40/RANK. Таким образом, транслокация NF-κB является одним из ключевых моментов функционирования сигнальных путей, опосредованных этим транскрипционным фактором, необходимым для связи внеклеточных стимулов и активации транскрипции специфических генов-мишеней. Работа сигнальной системы, связанной с NF-κB, регулируется, в том числе кинетическим механизмом, т.е. от времени и продолжительности активации NF-κB зависит и сигнальный путь, который активирован и, соответственно, результирующий ответ (Covert et al., 2005). Например, TNFα –индуцированный сигналинг ослабевает в течение 8 часов, а ЛПС вызывает более длительную активацию NF-κB (O’Dea, Hoffmann, 2010). Поэтому время транслокации NF-κB в ядро может являться важной характеристикой изменения функционального состояния клеток в ответ на тот или иной стимул. 36 Глава 2. Материалы и методы 2.1. Получение и культивирование МСК МСК выделяли из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Необходимым условием получения биологического материала было наличие информированного согласия доноров. Костный мозг получали в ходе пункции подвздошной кости у здоровых доноров (25 человек), проводимой по стандартной методике. Аспират костного мозга разделяли центрифугированием (400 g, 30 мин) на градиенте фиколла с плотностью 1,077 г/мл (Биолот, Россия). Фракцию мононуклерных клеток собирали на границе фаз, промывали раствором фосфатно-солевого буфера (ФСР), после чего вносили в полную питательную среду (Advanced Mesenchymal Stem Cells Media, HyClone, Новая Зеландия) c добавлением 20% заменителя сыворотки (Hyclone, Новая Зеландия) и высевали во флаконы (площадь 75 см2, плотность 100 тыс. кл/см2). Через 3 дня проводили смену среды для удаления неприкрепившихся клеток. Образцы подкожной жировой ткани объемом 2-4 мл были получены от 13 здоровых доноров в ходе липоэктоми с наружной поверхности бедра по стандартной методике. Ткань извлекали из контейнера с транспортной средой, механически измельчали, затем инкубировали при 37оС в 0,2 % растворе коллагеназы (тип I, Sigma-Aldrich, США) в ФСР. Диссоциированные клетки отмывали от фермента центрифугированием (400 G, 10 мин) и высевали во флаконы при плотности 100–400 тыс. кл/см2. Смену среды проводили также через 72 ч. Пупочные канатики получали при неосложненных родах. Транспортировку из родильных домов г. Санкт-Петербурга осуществляли в стерильном контейнере с 1% раствором смеси пенициллина, стрептомицина и фунгизона в физиологическом растворе. Для выделения клеток промывали пупочную вену последовательно 0,02% Версеном и 0,2% раствором коллагеназ I и IV типа (Sigma-Aldrich, США) в ФСР. После этого один конец пупочного канатика клеммировали и заполняли пупочную вену раствором коллагеназы, затем 37 клеммировали со второй стороны и инкубировали в течение 20 мин при 37оС (первая ферментация). Затем пупочную вену промывали 2-3 раза ФСР. Полученную взвесь клеток в ФСР центрифугировали (400 G, 10 мин), ресуспендировали в полной питательной среде и высевали во флаконы при плотности 100–400 тыс кл/см2. При этом большинство эксплантированных клеток составляли клетки эндотелия пупочной вены. После первой ферментации пупочную вену снова заполняли раствором коллагеназ, как описано выше, и инкубировали в течение 40 мин при 37 0С (вторая ферментация). После второй ферментации повторяли те же процедуры, что и после первой ферментации. В полученной в результате этого суспензии практически не содержалось клеток эндотелия сосудов. Всего было проанализировано 78 культур МСК, полученных из пупочного канатика. При достижении 70-80 % конфлюентности монослоя МСК, вне зависимости от источника их получения, пересевали при плотности 1000 кл/см2 и культивировали в полной питательной среде с 10 % заменителя сыворотки. В экспериментах использовали культуры на 2-3 пассаже, достигшие 60-70% конфлюентности, если не указано иное. МСК культивировали при 37оС в атмосфере 5% СО2 и 20% (условия нормоксии) или 5% (условия гипоксии) О2 с использованием мультигазовых инкубаторов (BBD 6220, Thermo Scientific, США) с возможностью подачи азота. 2.2. Культивирование В-клеточных линий В работе были использованы линии клеток Namalva и U266, полученные из Коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Клетки выращивали в среде IMDM с добавлением 7% сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия). 38 2.3. Дифференцировка МСК При изучении способности МСК к адипогенной дифференцировке к культурам, достигшим 70-80% конфлюэнтности, добавляли 0,2 мМ индометацина, 0,5 мМ дексаметазона и 1 мкМ изобутилметилксантина (“Sigma”). При смене среды каждые 3-4 сут использовали ростовую среду, содержавшую 10 мкМ инсулина (“Sigma”). Присутствие адипоцитов в культурах МСК выявляли через 3 нед окрашиванием жировым красным О (“Bio-Optica”). В качестве контроля использовали МСК тех же образцов и пассажей, культивированные в стандартной ростовой среде без добавления дифференцировочных стимулов. Остеогенную дифференцировку МСК индуцировали при достижении 6070% конфлюэнтного монослоя, добавляя к ростовой среде 0,1 мкМ дексаметазона, 0,2 мМ 2-фосфо-аскорбиновой кислоты и 10 мМ глицерол-2фосфата (“Chemicon”). Результаты оценивали через 2-3 нед по окрашиванию отложений кальция в остеоцитах ализариновым красным С (“Chemicon”). Контролем служили МСК тех же эксплантаций и пассажей, культивированные в стандартной ростовой среде. Дифференцировку клеток в хондрогенном направлении производили с использованием Chondrogenesis коммерческой Differentiation среды Kit для (Gibco) дифференцировки согласно StemPro® рекомендованному протоколу. 2.4. Морфологическая характеристика МСК Морфологическую характеристику МСК проводили с помощью программы CapturePro v2.8.8. при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового инвертированного микроскопа Axiovert 40C, оснащенного системой анализа изображения Progress CT3 (Zeiss, Германия). Определение среднего размера клеток проводили для МСК, снятых 39 с подложки во время пассирования культуры, с помощью автоматического клеточного счетчика Beckman Coulter (США). 2.5. Определение пролиферативной активности МСК Количество и жизнеспособность МСК определяли с помощью автоматического клеточного счетчика Beckman Coulter (США). Среднее время удвоения популяции Td расчитывали по формуле Td=(log22)*t/(log2(Nt/N0)), где t – время прироста популяции, Nt – количество клеток через время t, N0 – исходное количество клеток. 2.6. Иммунофенотипирование культур МСК Поверхностные маркеры мезенхимных стволовых клеток выявляли с помощью меченных флуорохромами антител против CD34, CD45, CD90, CD105, CD73, цитофлуориметре инструкцией CD13, FC500 CD10, CD44, (Beckman производителя. Для CD14, Coulter, этого CD117 США) культуры в на проточном соответствии МСК с снимали последовательно 0,02% раствором Версена и 0,25% раствором трипсина. Действие раствора трипсина останавливали внесением ФСР с 10% заменителя сыворотки. Полученную суспензию дважды отмывали ФСР и суспендировали в 200 мкл ФСР для последующего анализа на проточном цитофлуориметре. Анализ полученных данных проводили с помощью программного обеспечения СХР. 2.7. Получение и активация клеток мононуклеарной фракции крови В исследовании использовали образцы венозной крови 8 здоровых доноров, а также 16-ти доноров-добровольцев, в анамнезе которых были зафиксированы клинические проявления атопический дерматит, гиперчувствительности (аллергический острая гастроэнтерологические крапивница, ринит, расстройства, атопическая бронхиальная астма, анафилаксия). В 4-х случаях реакции развивались после приема пищевых продуктов, в 3-х – после 40 применения лекарственных препаратов, в остальных – после контакта с бытовыми и с пыльцевыми аллергенами (4 и 5 случаев соответственно). Все доноры в момент сбора образцов крови находились в состоянии ремиссии и не имели клинических проявлений аллергических реакций. Полученные образцы гепаринизированной крови наслаивали на градиент фиколла (ρ=1,077, Биолот, Россия), центрифугировали (400 G, 7 мин) и собирали лейкоцитарную фракцию, которую после отмывания в ФСР, суспендировали в ростовой среде RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Н.Зеландия). Клеточный состав лейкоцитарной фракции определяли с помощью гематологического анализатора Beckman-Coulter ACT Diff2 (США). 2.8. Выделение популяции В-лимфоцитов из образцов мононуклеарной фракции крови. Получение популяции В-лимфоцитов (CD45+CD19+) проводили с помощью иммунномагнитной сепарации с использованием парамагнитных частиц, покрытых антителами к CD19 (CD19 MicroBeads), колонок MS (MS Column), и сепаратора MiniMACS™ (Miltenyi Biotec, Германия) согласно инструкции производителя. По данным проточной цитофлуорометрии, чистота выделения фракции В-лимфоцитов составляла 97,5 ±1,9 %. 2.9. Сокультивирование МСК и клеток мононуклеарной фракции периферической крови МСК рассевали в ячейки 6-луночного планшета по 30 тыс кл/см2, через 24 ч в те же ячейки вносили равное количество клеток лейкоцитарных фракций. Также использовали соотношения МСК и клеток мононуклеарных фракций 1:10 и 1:100. Растворы аллергенов, либо ЛПС (до конечной концентрации 10 нг/мл), либо ФГА (до конечной концентрации 10 нг/мл) вносили одновременно с началом сокультивирования МСК и клеток лейкоцитарных фракций. Сокультивирование проводили в среде RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Н.Зеландия). 41 После сокультивирования МСК и клеток мононуклеарной фракции в течение предусмотренного задачей эксперимента времени (3 ч, 24 ч или 72 ч) из лунок отбирали всю культуральную среду с неприкрепленными клетками и центрифугировали (5 минут, 400 G). Полученный концентрат клеток мононуклеарной фракции анализировали методом проточной цитофлуорометрии, а культуральную среду переносили в новые пробирки для иммуноферментного анализа концентрации цитокинов и иммуноглобулинов. Затем, чтобы учесть в анализе клетки мононуклеарной фракции, которые прикрепились к МСК, лунки дважды промывали ФСР, центрифугировали (5 мин, 400G) и полученный осадок объединяли с полученным раннее концентратом клеток из соответствующей лунки. Все эксперименты были поставлены в 3-4 повторностях на 3 культурах МСК из каждого источника. 2.10. Сокультивирование МСК и клеток линий Namalva либо U266 МСК рассевали в лунки 6-ти луночного планшета в концентрации 10 или 60 тыс кл/см2 в зависимости от требуемой плотности культуры. Перед началом сокультивирования c помощью инвертированного микроскопа оценивали степень конфлюентности МСК. Через сутки в лунки с МСК вносили клетки линии Namalva либо линии U266 в равно соотношении с МСК. Сокультивирование в обоих случаях проводили в среде IMDM с добавлением 7 % сыворотки эмбрионов коров (Hyclone, Новая Зеландия) в течение 72 ч. Контролем служили клетки линий Namalva и U266, культивируемые без МСК. Все эксперименты были поставлены в 3-4 повторностях на 3 культурах МСК из каждого источника. 2.11. Оценка пролиферации лимфоцитов Определение количества делений лимфоцитов проводили с помощью окраски витальным красителем карбоксифлуоресцеин сукцинимидным эфиром (Carboxyfluorescein succinimidyl ester – CFSE) и оценивали по редукции его флуоресценции методом проточной цитометрии после сокультивирования с 42 МСК. Для этого перед сокультивированием с МСК клетки мононуклеарной фракции или В-лимфоциты окрашивали красителем CFSE. Для окрашивания 1×106 клеток мононуклеарной фракции ресуспендировали в 1 мл культуральной среды RPMI-1640 и добавляли CFSE до конечной концентрации 5 μM. Затем суспензию инкубировали 5 мин в темноте при комнатной температуре. Реакцию окрашивания останавливали путем добавления охлажденной до +4 оС полной культуральной среды RPMI-1640 с последующими повторным центрифугированием (400g, 5 мин). После проведения окрашивания осадок клеток ресуспендировали в полной культуральной среде RPMI-1640, добавляли стимулирующий агент (ФГА для стимуляции пролиферации Т-лимфоцитов, ЛПС – В-лимфоцитов) и вносили в лунки, содержащие МСК, либо без МСК (контроль). После окончания культивирования лимфоциты собирали, отмывали и ресуспендировали в 200 мкл ФСР для анализа на проточном цитометре по стандартной методике (Suva D. et al., 2007). Все эксперименты были поставлены в 3-4 повторностях на 3 культурах МСК из каждого источника. 2.12. Иммунофенотипирование лимфоцитов С помощью проточной цитофлуорометрии выявляли популяции Bлимфоцитов (CD19+), естественных киллеров (CD3-, CD16+, CD56+), Тлимфоцитов (CD3+, CD4+), активированных Т-лимфоцитов (CD3+, HLA-DR+), а также регуляторных Т- клеток (CD3+, CD4+, CD127low) и Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации (CD3+, CD69+). Клетки окрашивали меченными флуорохромами антителами в течение 20 минут в темноте при комнатной температуре. Использовали реагенты фирмы Beckman Coulter, США. Анализ выполняли на проточном цитофлуориметре FC500 с длиной волны лазерного излучения 488 нм и программным обеспечением CXP в соответствии с инструкцией производителя (Beckman Coulter, США). 43 2.13. Иммуноферментный анализ Определение концентрации IgE и цитокинов IL-4, IL-10, IL-6 в культуральной среде проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Для этого по окончанию сокультивирования МСК и лимфоцитов отбирали культуральную среду, отмечали ее объем и количество клеток. Собственно для анализа использовали 100 мкл. Постановку реакции проводили с помощью коммерческих наборов (Вектор-Бест, Россия) согласно инструкции производителя. Измерение оптической плотности выполняли на планшетном спектрофотометре Anthos 2020 или Мультискан FC. Для качественного определения рассчитывали значение критической оптической плотности (границы между положительным и отрицательным результатами) по формуле, указанной в инструкции. Для количественного определения концентрации строили калибровочную кривую согласно инструкции. 2.14. Оценка уровня продукции иммуноглобулинов в В-клеточных линиях Оценку уровня продукции иммуноглобулинов проводили с помощью проточной цитофлуорометрии с окраской иммуноглобулинов меченными флуоресцеином моноклональными антителами. Для детекции IgE в клетках линии U266 использовали антитела E-5D4, для определения IgM в клетках линии Namalva – 2В9 (антитела получены в лаборатории гибридомной технологии ФГБУ РНЦРХТ). Cбор клеток линий Namalva или U266 после сокультивирования с МСК проводили по той же схеме, что и клетки мононуклеарной фракции. Затем клетки последовательно отмывали, фиксировали ледяным ацетоном в течение 10 мин, пермеабилизовали 0,1%ным раствором тритона Х-100 на ФСР (15 мин при комнатной температуре) и окрашивали соответствующими моноклональными антителами в течение 10 минут в темноте при комнатной температуре. Измерения проводили с помощью проточного цитофлуориметра FC500 (Beckman Coulter, США) в соответствии с инструкцией производителя. 44 2.15. Иммунофлуоресцентная микроскопия МСК высевали в концентрации 10 тыс кл/см2 в лунки 6-ти луночного планшета, на дно которых, помещали покровные стекла. Сокультивирование с клетками мононуклеарной фракции проводили, как описано выше, в течение 30, 60, 90, 180 мин или 24 ч в присутствии ФГА (10 нг/мл), ЛПС (10 нг/мл) или соответствующего анамнезу донора периферической крови аллергена. После окончания сокультивирования, удаляли культуральную среду и неприкрепленные клетки и однократно промывали стекла ФСР. Затем клетки фиксировали 3,7% раствором формалина в ФСР (Sigma, США) в течение 10 минут, после чего пермеабилизировали мембрану клеток в течение 8 минут 0,1% раствором Triton-X100 (Sigma, США). Для определения локализации субъединицы р65/RelA транскрипционного фактора NF-κB в МСК препараты последовательно инкубировали с первыми кроличьими поликлональными антителами против р65 субъединицы NF-кВ (Abcam, США) в течение 45 мин и вторыми антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa 488 (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика; Abcam, США) в течение 60 мин с трехкратной промывкой 0,1 % Tween в ФСР после каждой инкубации. Для выявления структуры актинового цитоскелета распластанных клеток проводили окраску родамин-фаллоидином (Sigma, USA) 10 мин при 37°С. В качестве заключающей среды использовали Prolong Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen, США). Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа AxioScope A1 (Zeiss, ФРГ). Для возбуждения флуоресценции использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм для FITС, HeNe лазер с длиной волны 543 нм для родамин-фаллоидина. Применяли раздельное сканирование для сигнала FITC (флуоресценция в области 500-530 нм) и CY3 (флуоресценция в области 580-640 нм) (Romijn et al., 1999). Совмещение двух сигналов FITC и CY3 (Merge) проводили с помощью компьютерной программы Axiovision Rel 4.8. 45 2.16. Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ “Excel” для WinXP и Graph Pad Prism 5.0. В качестве характеристик использовали среднее и стандартное отклонение. В экспериментах по изучению влияния МСК на аллерген-специфические реакции лейкоцитов оценивали межгрупповые различия U критерия Манна-Уитни при выбранном уровне значимости с помощью p< 0,05. Для сравнения результатов сокультивирования были использованы средние значения интенсивности флуоресценции в относительных единицах (Хсредн). 46 Глава 3. Результаты 3.1. Особенности получения МСК из пупочного канатика В ходе работы было получено и проанализировано 78 культур МСК из периваскулярного пространства пупочной вены пупочного канатика. Благодаря проведенной нами оптимизации методики выделения клеток из этой ниши возможно получение чистой популяции МСК, лишенной или с минимальной примесью эндотелиоцитов, которые удаляются при первом пассировании. В среднем, эффективность получения МСК после 1 пассажа составляет 3,1 млн (с минимумом – 0,7 и максимумом – 5,4) на каждые 10 см длины пупочного канатика. Учитывая, что описанные культуры МСК получали из периваскулярного пространства пупочной вены, значимой характеристикой является именно длина образца пупочного канатика, а не его вес. Размер образцов пупочного канатика в среднем составлял 20 см (минимальный размер – 7 см, максимальный – 40 см). Таким образом, после 1 пассажа из одного образца пупочного канатика в среднем можно получить порядка 6 млн МСК. Аналогичное количество МСК можно получить из 50-70 мл костного мозга, либо из 3-5 мл жировой ткани. Количество жизнеспособных и пролиферирующих МСК, которые можно выделить из образца пупочного канатика, зависит от величины временного промежутка между родами и началом обработки материала. Если данный интервал составляет менее 7 часов, то среднее количество МСК после 1 пассажа составляет – 3,85 млн на каждые 10 см пупочного канатика. При увеличении временного интервала эффективность выделения МСК значительно снижается (Рис.3.1). 47 Количество клеток, млн 6 5 4 3 2 1 0 2-7ч 8-14ч 15-19ч 20-25ч Рисунок 3.1. Зависимость среднего количество МСК от временного промежутка между родами и обработкой материала. По оси ординат – среднее количество МСК после 1 пассажа в млн клеток в пересчете на 10 см образца пупочного канатика. Также была выявлена зависимость количества МСК от пола новорожденного. Среднее количество МСК после 1 пассажа в пересчете на 10 см было выше при обработке пупочных канатиков новорожденных мужского пола (41 образец) по сравнению с пупочными канатиками новорожденных Количество клеток, млн. женского пола (37 образцов) (Рис.3.2.). 6 5 4 3 2 1 0 жен муж Рисунок 3.2. Среднее количество МСК, выделенных из образцов пупочного кантика новорожденных женского (жен) и мужского (муж) пола. По оси ординат – среднее количество МСК в млн клеток в пересчете на 10 см образца пупочного канатика. 48 Дополнительно проанализировали 8 культур МСК, полученных при родах четырех пар разнополых близнецов. В трех парах наибольшее количество МСК было получено из образца пупочного канатика, соответствующему новорожденному мужского пола. Для пары близнецов № 3 различия в количестве МСК между образцами не были выявлены. (Рис.3.3.) Количество, млн 4 муж 3,5 жен 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1 2 3 4 Рисунок 3.3. Количество МСК, выделенных из образцов пупочных кантиков четырех пар близнецов. По оси ординат – количество МСК в млн клеток в пересчете на 10 см образца пупочного канатика, по оси абсцисс – номер пар близнецов. В тоже время количество МСК не зависело от возраста роженицы и срока гестации (37-41 неделя). Таким образом, можно говорить о высоком содержании МСК в периваскулярном пространстве пупочного канатика. Эффективность получения МСК из пупочного канатика сильно варьирует между образцами, и, в первую очередь, зависит от временного интервала между родами и началом обработки материала. 3.2. Сравнение свойств МСК, культивируемых в нормоксии или в гипоксии Для выбора схемы культивирования мы провели серию собственных экспериментов по сравнению характеристик МСК при культивировании в условиях нормоксии (концентрация кислорода 20%) и гипоксии (5%). В качестве критериев для сравнения использовали время удвоения популяции, 49 иммунофенотип (оценивали на 3 пассаже) и морфологические характеристики МСК (размер и форма клеток). Сравнение характеристик МСК при культивировании в условиях нормоксии и гипоксии проводили для 5 культур костного мозга, 4 культур жировой ткани и 7 культур пупочного канатика. По морфологическим характеристикам популяция МСК является гетерогенной, вне зависимости от источников получения. Морфологию клеток оценивали на 2-7 пассаже при степени конфлюентности 60-75%. В начале культивирования в популяции обычно присутствуют фибробласто-подобные клетки размером 25-60 мкм, а также вытянутые веретеновидные клетки с линейными размерами 50-100 мкм. После 3 пассажа в популяции появляются более крупные клетки (100 - 250 мкм) полигональной формы с большим количеством отростков (Рис.3.4.). А Б Рисунок 3.4. МСК полигональной формы с отростками (отмечены стрелками) в культурах, полученных из жировой ткани (А, интерференционноконтрастная микроскопия) и костного мозга (Б, световая микроскопия). Культивирование в условиях нормоксии, 3 пассаж. Шкала – 50 мкм. Культивирование в условиях гипоксии не приводило к существенному изменению морфологических характеристик МСК (Рис.3.5.)., но сказывалось на соотношении клеток с перечисленными выше типами морфологии. 50 20% 5% 1 2 3 Рисунок 3.5. Общий вид культур МСК, полученных из костного мозга (1), жировой ткани (2) и пупочного канатика (3) при культивировании в условиях нормоксии (20%) и гипоксии (5%). Темные округленные клетки – МСК, находящиеся на стадии митотического деления. Шкала – 100 мкм. 51 В условиях гипоксии снижается содержание крупных клеток полигональной формы в популяции МСК (Рис.3.6). Средние размеры МСК при культивировании в гипоксических условиях меньше, чем при культивировании с 20% кислорода (Таблица 3.1.). Средние размеры МСК, полученных из костного мозга, достоверно выше по сравнению с МСК из жировой ткани и пупочного канатика. Рисунок 3.6. Соотношение МСК с различной морфологией в культурах, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, при культивировании в условиях нормоксии (20%) и гипоксии (5%). Результаты представлены для культур, находящихся на 3 пассаже. По оси ординат – относительное содержание клеток. Таблица 3.1. Средний размер МСК (мкм) костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, после культивирования в условиях гипоксии и нормоксии Источник МСК Костный мозг нормоксия Жировая ткань гипоксия нормоксия Пупочный канатик гипоксия нормоксия гипоксия Средний 18,5 ± 1,1* 18,2 ± 0,9# 15,1 ± 1,3*# 17,8 ± 0,8# 16,1 ± 1,25*# размер МСК 22,2 ± 1,4 в суспензии *- достоверные отличия по сравнению с показателями для нормоксии, # - достоверные отличия по сравнению с МСК костного мозга. 52 При сравнении доли живых МСК в культуре при культивировании в условиях нормоксии и гипоксии также не было выявлено достоверно значимых отличий (Таблица 3.2.). Таблица 3.2. Жизнеспособность МСК 2-го пассажа при культивировании в условиях гипоксии и нормоксии. Представлено среднее количество живых клеток (7AAD-) ± стандартное отклонение Источник МСК Доля 7AAD негативных клеток в культуре Костный мозг Жировая ткань гипоксия нормоксия гипоксия 91,2 ± 7,3 81,8 ± 10,3 90,3 ± 6,9 нормоксия 88,5 ± 9,9 Пупочный канатик гипоксия нормоксия 89,2 ± 7,6 83,4 ± 5,9 Для всех проанализированных культур МСК не было выявлено достоверно значимых различий экспрессирующих между CD90, иммунофенотипом CD105, CD44, МСК СD10, CD13, (доля клеток, CD73+, и не экспрессирующих CD45, CD34, CD117, CD14) при культивировании в условиях нормоксии и в условиях гипоксии (см. Главу 3.2.). Пролиферативная активность МСК повышалась при культивировании в условиях гипоксии по сравнению со стандартными условиями, что выражалось в уменьшении времени удвоения популяции (Рис.3.7). Низкая концентрация кислорода при культивировании также способствовала увеличению длительности поддержания пролиферативной активности in vitro, то есть, возрастало количества пассажей, в течение которых МСК пролиферирровали. Такая закономерность была показана для всех проанализированных культур МСК вне зависимости от источника их получения. Таким образом, пониженное содержание кислорода (5%) в газовой среде при культивировании оказывало стимулирующее действие на пролиферативную активность МСК из всех источников при сохранении их морфологических характеристик. Дальнейшее изучение функциональной активности МСК проводили при культивировании в условиях гипоксии. 53 250 время удвоения, ч А 200 150 100 50 0 2 3 4 5 6 7 пассаж культивирования 250 Б время удвоения, ч 200 150 100 50 0 2 3 4 5 6 7 8 9 пассаж культивирования 250 В время удвоения, ч 200 150 100 50 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 пассаж культивирования Рисунок 3.7. Среднее время удвоения популяции МСК, полученных из костного мозга (А), жировой ткани (Б) и пупочного канатика (В), при их культивировании в условиях гипоксии (светло-серые столбцы) и нормоксии (темно-серые столбцы). Указано стандартное отклонение. 54 3.3 Ростовые характеристики и дифференцировка МСК Для сравнительной характеристики пролиферативной активности МСК, полученных из разных источников, проанализировали 12 культур МСК костного мозга, 7 культур жировой ткани и 30 культур пупочного канатика. Возраст доноров костного мозга составлял от 21 года до 80 лет (46,2 ± 15,8), жировой ткани – от 37 до 90 лет (59 ± 20,4). В качестве критерия для сравнения пролиферативной активности использовали время удвоения численности популяций МСК. Наибольшее время удвоения популяции было характерно для культур МСК, полученных из костного мозга. Время удвоения популяции МСК костного мозга было достоверно выше на всех пассажах по сравнению с МСК, полученными из других источников (P < 0,05). Пролиферация 4 из 12 культур МСК костного мозга сохранялась в течение 6 пассажей, остальные культуры пролиферировали 7 пассажей. После этого пролиферация прекращалась, большинство клеток в культуре были крупными (более 250 мкм) и имели полигональную форму, с неровными краями и множеством отростков. В течение 7-10 дней после прекращения пролиферации наблюдали массовое открепление клеток от культурального пластика и значительное увеличение доли погибших клеток. На данной стадии отмечали гибель культуры и ее утилизировали. Время удвоения популяции МСК, полученных из жировой ткани и пупочного канатика, было схожим при культивировании до 6 пассажа. При дальнейшем культивировании (после 7 пассажа включительно) время удвоения популяции было достоверно выше (P<0,05) для МСК жировой ткани, по сравнению с МСК пупочного канатика. Из 7 культур МСК жировой ткани 4 прекратили пролиферировать после 7 пассажа, 2 – после 8 пассажа и клетки одной из культур пролиферировали в течение 9 пассажей. Пролиферативная активность МСК пупочного канатика сохранялась в течение максимального количества пассажей по сравнению с МСК, полученными из костного мозга и жировой ткани. 22 культуры МСК пупочного 55 канатика пролиферировали до 8 пассажа включительно, 5 культур – до 9 и 3 культуры – до 10 пассажа (Рис.3.8) Время удвоения популяции МСК пупочного канатика для проанализированных культур было практически одинаковым на 3-5 пассажах, но с 6 пассажа существенно различалось между культурами, полученными от разных доноров (от 52 до 194 часов). костный мозг жировая ткань пупочный канатик 200 время удвоения, ч 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 2 3 4 5 6 7 8 пассаж культивирования 9 1 10 Рисунок 3.8. Среднее время удвоения популяций МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Указано стандартное отклонение. Таким образом, пролиферативным МСК костного потенциалом из мозга всех обладали минимальным проанализированных культур. Пролиферативная активность МСК, полученных из жировой ткани и пупочного канатика была культивировании сходной на снижалась ранних более пассажах, резко у а МСК при дальнейшем жировой ткани. Пролиферативная активность МСК пупочного канатика сохранялась в течение наиболее длительного времени. Минимальное (относительно других пассажей для одной культуры) время удвоения для МСК вне зависимости от источника их получения наблюдали на 3 пассаже. В связи с этим, в последующих экспериментах использовали культуры на 2-4 пассажах. МСК, полученные из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика обладали способностью к дифференцировке в адипогенном, остеогенном и 56 хондрогенном направлениях. Анализ способности к дифференцировки проводили на 3 пассаже. При исследовании способности МСК к дифференцировке через 3 сут после добавления в среду адипогенных стимулов в культурах появлялись клетки, содержащие липидные включения. После 2 недель культивирования такие клетки присутствовали во всех исследованных образцах (Рис.3.9.). При культивировании МСК в среде, содержавшей факторы индукции остеогенной дифференцировки, после 11-х суток клетки начинали формировать минерализированный матрикс, количество которого постоянно увеличивалось (Рис.3.9.). Культивирование МСК в среде для хондрогенной дифференцировки в течение 7 дней приводило к появлению в популяции клеток, экспрессирующих коллаген 2 типа (Рис.3.10). Через 2 недели более 60% МСК в культурах, полученных из костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика, окрашивались альциановым синим (Рис.3.9.) (Пиневич и др., 2014). Рисунок 3.9. Вид культур МСК жировой ткани через 2 недели культивировании в стандартной культуральной среде (А) и в среде, содержащей хондрогенные (Б, окрашивание альциановым синим), адипогенные (В, окрашивание жировым красным О) и остеогенные стимулы (Г, окрашивание ализариновым красным С). Световая микроскопия. 57 Рис.3.10. Экспрессия коллагена II типа, как маркер дифференцировки клеток в хондрогенном направлении. Зеленым отмечены антитела к коллагену II и вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa-488, синим – ядра клеток, окрашенные DAPI. Флуоресцентная микроскопия. Масштабный отрезок – 5 мкм. Спонтанная дифференцировка в среде без добавления дифференцировочных стимулов не была показана для всех культур МСК (Пиневич и др., 2014). 3.4. Иммунофенотип МСК Одной из основных характеристик МСК является их иммунофенотип. Нами было проведено сравнение иммунофенотипа 78 первичных культур МСК, полученных из 25 образцов костного мозга (возраст доноров от 21 года до 80 лет (44,3 ± 17,9)), 13 образцов жировой ткани (возраст доноров от 37 до 90 лет (51,4 ± 22)) и 32 образцов пупочного канатика здоровых доноров. Анализ проводили на 2 и 3 пассаже, определяя следующие поверхностные антигены: CD90+, CD105+, CD44+, СD10, CD13, CD73+, CD45, CD34-, CD117, CD14. Все культуры на момент анализа находились в логарифмической фазе роста, конфлюентность культуры была в пределах 50 – 75%. Процентное содержание клеток, положительных по экспрессии поверхностных антигенов CD90, CD105, CD44, CD73, и отрицательных по экспрессии CD45, CD34, CD117, CD14, в культурах МСК, полученных из разных источников, было схожим и превышало 90%, что указывает на однородность всех проанализированных культур по экспрессии этих антигенов (Айзенштадт и др., 2014). Наибольшая вариабельность наблюдалась по 58 экспрессии CD13 (аминопептидаза N) и CD10 (нейтральная эндопептидаза) в культурах МСК пупочного канатика на втором пассаже. При дальнейшем культивировании (начиная с 3 пассажа) CD10 и CD13 экспрессировали 83 ± 10% и 71 ± 12,5 клеток, соответственно (Таблица 3.3.). На рисунке 3.11. приведен пример иммунофенотипа культуры МСК пупочного канатика № 0714000044 на 2 пассаже. Таблица 3.3. Доля клеток, экспрессирующих указанные поверхностные антигены в культурах МСК (2 пассаж), полученных из разных источников. Источник Пупочный канатик МСК гипоксия нормоксия Антиген СD90+ 99,2 ± 0,5 98 ± 0,8 CD 105+ 99,7 ± 0,2 CD 73+ 99,3 ± 0,7 CD 10+ Жировая ткань гипоксия Костный мозг нормоксия гипоксия нормоксия 99,3 ± 0,4 99 ± 0,2 99 ±0,4 98,6 ± 1,4 99,2 ± 0,4 99 ± 0,8 99,5 ± 0,3 99,3 ± 0,5 98,7 ± 1,1 99,4 ± 0,5 98,2 ± 0,6 99,1 ± 0,4 90 ± 6,2 94,5 ± 5 57,8 ± 17,1 52,3 ± 16,5 81 ± 13,5 75,8 ± 19,2 98 ± 0,9 86,3 ± 7,1 CD 13+ 34,6 ± 14,5 39,7 ± 10,9 97,3± 2,1 90,5 ± 5,6 96,1 ± 1,9 92,4 ± 6,3 CD 44+ 99 ± 0,9 99 ± 0,6 99,8 ± 0,05 98,7 ± 0,4 97.5 ± 2,3 98,2 ± 0,8 HLA-ABC 99,5 ± 0,2 98,8 ± 1 99,8 ± 0,1 99,7 ± 0,3 99,2 ± 0,1 99,4 ± 0,4 CD 45- 3 ± 2,4 1,7 ± 1,2 2,5 ± 1,2 1,9 ± 1,3 1,9 ± 1,6 2,4 ± 2,2 CD14- 3,8 ± 3,5 3 ± 3,1 2,4 ± 1,6 2,5 ± 1,9 1,5 ± 0,8 1,1 ± 0,1 CD117- 4,2 ± 3,8 5,9 ± 4,6 1,8 ± 0,5 2,3 ± 1,1 1,1 ± 0,4 0,7 ± 0,6 CD34- 2,1 ± 1,8 2,8 ± 2 3,4 ± 2,1 3,2 ± 2,6 3,1 ± 2,8 2,7 ± 1,7 Полужирным шрифтом выделены маркеры, по которым выявлены достоверные различия между МСК из разных источников 59 Рисунок 3.11. Гистограммы, отражающие иммуннофенотип культуры МСК пупочного канатика 0714000154. Изотипический контроль – пунктирные линии. По оси абсцисс — интенсивность флюоресценции (отн. ед.), по оси ординат — число событий. МСК всех проанализированных культур экспрессировали HLA I. Уровень экспрессии оценивали по показателю средней интенсивности флуоресценции, зависящий от плотности изучаемого антигена на поверхности клеток. Уровень экспрессии HLA I был одинаковым для культур МСК, полученных из костного мозга, пупочного канатика и жировой ткани (Рис.3.12.). 30 25 5050 MFI, отн.ед Хсредн, отн. ед. Хсредн, отн. ед. 6060 20 40 40 1530 30 1020 20 10 105 00 0 костный костный мозг мозг Рисунок жировая жировая ткань ткань 3.12. пупочный пупочный канатик канатик Средняя интенсивность флуоресценции МСК, экспрессирующих HLA I, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Указано стандартное отклонение. 60 Проводили сравнение данного показателя между культурами МСК жировой ткани и лимфоцитами периферической крови, полученными от одних и тех же доноров (3 здоровых донора). Эксперименты были поставлены в двух повторностях для каждого донора с использованием МСК на 2 и 3 пассажах. Было показано, что средняя интенсивность флуоресценции МСК и лимфоцитов периферической крови, экспрессирующих HLA I, практически не отличается (Рис.3.13.). А 30 Б MFI (HLA I-FITC), отн.ед. 25 20 15 10 5 0 HLA I-FITC МСК лимфоциты Рисунок 3.13. Уровень экспрессии HLA I на МСК и лимфоцитах периферической крови. А - Гистограмма интенсивности флуоресценции МСК жировой ткани (гистограмма с серым фоном) и лимфоцитов периферической крови (черная линия), экспрессирующих HLA I. Пунктирная линия – изотипический контроль. Б – Средняя интенсивность флуоресценции МСК и лимфоцитов периферической крови. Указано стандартное отклонение. Также изменение интенсивности экспрессии HLA I на поверхности МСК анализировали при сокультивировании МСК с ФГА- или ЛПС- активированными аллогенными лимфоцитами, либо при добавлении к культуре провоспалительного цитокина TNFα. Эксперименты проводили на 3 культурах МСК, полученных из костного мозга, 3 - из жировой ткани и 3 - из пупочного канатика. 61 При сокультивировании МСК с лейкоцитарной фракцией периферической крови здоровых доноров в присутствии ФГА средняя интенсивность флуоресценции возрастала в 2 раза (на 114,6 ± 43 %). В смешанной культуре с лейкоцитами в присутствии ЛПС уровень экспрессии HLA I увеличивался на 61,1 ± 22 %. При сокультивировании с лейкоцитами в отсутствии стимулирующего агента изменений в уровне экспрессии HLA I на поверхности МСК не наблюдали. Аналогично, в отсутствии лейкоцитов, стимулирующие агенты (как ЛПС, так и ФГА) не вызывали смещения интенсивности флуоресценции. Добавление к культуре МСК только одного провоспалительного цитокина TNFα также приводило к усилению экспрессии HLA I на поверхности МСК. При этом значения средней интенсивности флуоресценции увеличивались в 3 раза (в среднем на 226,7 ± 38 %) (Рисунок 3.14.). Рисунок 3.14. Изменение средней интенсивности флуоресценции культур МСК, экспрессирующих HLA I (MFI), полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, в присутствии митогенов (ЛПС и ФГА), либо TNFα, либо при сокультивировании с интактными лейкоцитами или митогенактивированными лейкоцитами. По оси ординат отложены изменения MFI относительно значений в контроле, принятых за 100%. Указано стандартное отклонение. * – достоверные различия от контроля при р<0,05. 62 Повышение уровня экспрессии HLA I происходило на клетках всех культур МСК, вне зависимости их тканевого происхождения. Во всех проанализированных культурах более 99% клеток экспрессировали антиген СD90, но уровень экспрессии различался в МСК, полученных из разных источников. Средняя интенсивность флуоресценции в культурах МСК, полученных из костного мозга составляла 48,3 ± 26, жировой ткани – 109 ± 48, а пупочного канатика – 123,5 ± 51 (Рис. 3.15.). Максимальные значения были получены для двух культур МСК пупочного канатика (Хсредн = 238 и 254), в то время как минимальные – для культуры МСК костного мозга (Хсредн = 13,4). Рисунок 3.15. А. Средняя интенсивность флуоресценции культур МСК, экспрессирующих антиген CD90, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Указаны стандартные отклонения. * – достоверные различия при р<0,05. Б. Интенсивность флуоресценции клеток, экспрессирующих антиген CD90, в трех культурах МСК, полученных из костного мозга (зеленый цвет), жировой ткани (желтый цвет) и пупочного канатика (синий цвет). Пунктирная линия – изотипический контроль. Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом сходный иммунофенотип. Исключением является показатель средней интенсивности флуоресценции клеток, экспрессирующих CD90. Оценка средней интенсивности флуоресценции показала достоверные отличия в уровне 63 экспрессии CD90 между МСК костного мозга, по сравнению с МСК пупочного канатика и жировой ткани. Различий в уровне экспрессии CD90 на поверхности МСК пупочного канатика и жировой ткани выявлено не было. МСК, выделенные из разных источников, могут отличаться по уровню экспрессии CD105. Средняя интенсивность флуоресценции МСК пупочного канатика, является достаточно постоянной в различных культурах и, в среднем, составляет 14,9±6,8. В тоже время была показана значительная разнородность культур МСК жировой ткани и костного мозга, полученных от разных доноров (Рис.3.16). Индивидуальная вариабельность культур МСК костного мозга и жировой ткани, затрудняет определение влияния тканевого происхождения клеток на экспрессию CD105. Рисунок 3.16. Средняя интенсивность флуоресценции МСК из разных источников, экспрессирующих антиген CD105. Указаны стандартные отклонения. Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом сходный иммунофенотип, но существуют различия в экспрессии CD10, CD13, CD105 и CD90. 64 3.5. Проявления функциональной активности МСК при сокультивировании с лимфоидными клетками Для оценки функциональной активности МСК из разных источников использовали экспериментальную модель, в которой изучали влияние МСК на лимфоидные клетки при их сокультивировании. В качестве тест-объектов (или эффекторных клеток) выступали аллогенные клетки мононуклеарной фракции периферической крови доноров, полученной выделением на ступенчатом градиенте фиколла и имеющей клеточный состав, представленный на Рис.3.18. Рисунок 3.17. Усредненные данные о клеточном составе мононуклеарной фракции периферической крови после ее выделения на градиенте фиколла на основе анализа 24 образцов. Клетки мононуклеарной фракции стимулировали ФГА, либо ЛПС, которые являются митогенами для Т- и В-лимфоцитов, соответственно. Для определения характера влияния МСК на функциональную активность В-лимфоцитов проводили сокультивирование МСК с В-лимфоидными клеточными линиями и с популяцией В-лимфоцитов, полученной с помощью иммунномагнитной сепарации. Отдельная серия экспериментов была посвящена изучению действия МСК на клетки мононуклеарной фракции в присутствии специфического аллергена. 65 3.5.1. Изучение влияния МСК на Т-лимфоциты 3.5.1.1. Влияние МСК на активацию Т-лимфоцитов Для анализа влияния МСК на активацию Т-лимфоцитов оценивали изменение доли Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации – СD69 и поздний маркер активации - HLA-DR через 3 и 72 ч после добавления митогена (ФГА). Определение количества активированных Т-лимфоцитов проводили при сокультивировании с МСК клеток мононуклеарной фракции периферической крови 5 здоровых доноров. В результате инкубации клеток мононуклеарной фракции с ФГА в течение 3 ч происходит увеличение содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации CD69. Сокультивирование интактных клеток мононуклеарной фракции с МСК приводило к усилению экспрессии СD69 на поверхности Т-лимфоцитов. Источник получения МСК не сказывался на степени активации лимфоцитов. Внесение ФГА в смешанную культуру аддитивно увеличивало количество Т-лимфоцитов, экспрессирующих СD69. При сокультивировании с МСК костного мозга доля СD3+СD69+ среди CD3+ клеток составляла 36,4±3 %, с МСК жировой ткани - 32,3±3,1% и 35,4±2,4 % при сокультивировании МСК пупочного канатика (Рис.3.18). Воздействие ФГА в течение 72 часов на клетки мононуклеарной фракции приводит к увеличению содержания Т лимфоцитов, экспрессирующих поздний маркер активации HLA-DR, в среднем в 2,5 раза. Сокультивирование не стимулированных клеток с МСК не приводит к изменению экспрессии HLADR на поверхности Т-лимфоцитов. Более того, в смешанной культуре с МСК воздействие ФГА не вызывает увеличение доли СD3+HLA-DR+ клеток. (Рис.3.19.). 66 МНК костный мозг жировая ткань пупочный канатик CD69+ Т-лимфоциты, % 45 *# 40 *# 35 *# 30 25 20 * * * * 15 10 5 0 без стимула Рисунок 3.18. Содержание ФГА Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD69, относительно общего количества Т-лимфоцитов. Голубые столбики – показатель в мононуклеарной фракции; светло-серые – при сокультивировании с МСК костного мозга; темно-серые – жировой ткани; исчерченные - пупочного канатика. * - данные, достоверно отличные от контроля (мононуклеарная фракция без стимула), # - данные, достоверно отличные от показателей в мононуклеарной фракции без сокультивирования с МСК в присутствии ФГА, (Р<0,05). МНК костный мозг жировая ткань пупочный канатик HLA-DR+ Т-лимфоциты, % 20 * 18 16 14 12 10 # 8 # # 6 4 2 0 без стимула ФГА Рисунок 3.19. Cодержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR, относительно общего количества Т-лимфоцитов. Обозначения те же, что и на Рис. 3.17. Таким образом, МСК оказывали противоположное влияние на содержание Т-лимфоцитов, несущих ранний и поздний маркеры активации, стимулируя экспрессию СD69, но подавляя индуцированную ФГА экспрессию HLA-DR. 67 3.5.1.2. Влияние МСК на пролиферацию Т-лимфоцитов Проявление функциональной активности МСК оценивали по их влиянию на пролиферативную активность ФГА–активированных Т-лимфоцитов в составе клеток мононуклеарной фракции. Пролиферацию Т-лимфоцитов определяли по снижению интенсивности флуоресценции при разведении флуоресцентной метки CFSE в популяции живых (7AAD-) Т-лимфоцитов (CD45+CD3+) c помощью проточной цитофлуорометрии. Для всех культур МСК была показана способность подавлять ФГАстимулированную пролиферацию Т-лимфоцитов. Антипролиферативное действие МСК носило дозозависимый характер и было максимальным при равном соотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции (Рис.3.20.). При соотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции 1:1 и 1:10, МСК из разных источников одинаково эффективно подавляли пролиферацию Т лимфоцитов. При соотношении 1:100, МСК из костного мозга, снижали долю поделившихся Т лимфоцитов на 14± 5,1 %, в то время как МСК из жировой А Доля поделившихся клеток, % ткани и пупочного канатика на 30± 4 % и 27±3,7 % соответственно (Рис.3.20.). 100 90 костный мозг Б жировая ткань пупочный канатик 80 70 60 * 50 40 * 30 20 * 10 * * * * * 0 МНК контроль 1:1 1:10 1:100 Рисунок 3.20. А. Пример диаграммы распределения стимулированных ФГА Тлимфоцитов по интенсивности флуоресценции CFSE при их сокультивировании с МСК пупочного канатика в соотношении 1:1 (1) и без сокультивирования (2). Б. Доля поделившихся Т-лимфоцитов при сокультивировании ФГА-стимулированных клеток мононуклеарной фракции с МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика и без сокультивирования (контроль). По оси абсцисс – соотношение МСК и клеток мононуклеарной фракции. *–данные, достоверно отличные от показателей в контроле. 68 Таким образом, МСК различного тканевого происхождения не отличались по выраженности антипролиферативного действия на Т-лимфоциты при соотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции равном 1:1 и 1:10. При увеличении количества клеток мононуклеарной фракции (соотношение 1:100), МСК, полученные из пупочного канатика и жировой ткани, подавляют пролиферацию Т-лимфоцитов более эффективно, чем МСК костного мозга. 3.5.2. Изучение влияния МСК на В-лимфоциты 3.5.2.1. Влияние МСК на пролиферацию В-лимфоцитов Для оценки влияния МСК на пролиферацию В-лимфоцитов выполнили две серии экспериментов – МСК сокультивировали с клетками мононуклеарной фракции периферической крови (здоровых доноров) либо с выделенными из них с помощью иммуномагнитной сепарации В-лимфоцитами. Сокультивирование проводили в течение 72 часов в присутствии ЛПС. Пролиферацию клеток оценивали по снижению интенсивности флуоресценции при разведении флуоресцентной метки CFSE в популяции живых (7AAD-) В-лимфоцитов (CD45+CD19+) с помощью проточной цитофлуорометрии. В первой серии проводили сокультивирование МСК с клетками мононуклеарной фракции в соотношении 1:1, 1:10 и 1:100, при этом соотношение МСК и В-лимфоцитов в среднем было приближено к 20:1, 2:1 и 1:5 соответственно, поскольку на В-лимфоциты приходилось порядка 5% от общего числа клеток в мононуклеарной фракции (Рис.3.17.). МСК, полученные блокировали из разных ЛПС-стимулированную источников, одинаково пролиферацию эффективно В-лимфоцитов при равном соотношении МСК и лейкоцитов. При соотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции 1:10 доля поделившихся В-лимфоцитов также снижалась, но менее выражено (Рис.3.21). 69 А Доля поделившихся клеток, % Ряд1 100 костный мозг жировая ткань пупочный канатик Б 80 60 * 40 * 20 Интенсивность флуоресценции CFSE, отн.ед. * * * 0 контроль МНК 1:1 1:10 Рисунок 3.21. А. Пример диаграммы распределения стимулированных ЛПС лимфоцитов по интенсивности флуоресценции CFSE при их сокультивировании с МСК пупочного канатика в соотношении 1:10 (1) и без сокультивирования (2). Б. Доля поделившихся В-лимфоцитов при сокультивировании ЛПС-стимулированных клеток мононуклеарной фракции с МСК костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика, и без сокультивирования (контроль). По оси абсцисс – соотношение МСК и клеток мононуклеарной фракции. * –данные, достоверно отличные от показателей в контроле. При соотношении МСК и лейкоцитов равном 1:100 степень подавления пролиферации В-лимфоцитов различалась для индивидуальных образцов МСК. (Рис.3.22). 70 контроль * * * * * * Рисунок 3.22 Доля поделившихся В-лимфоцитов при сокультивировании ЛПС-стимулированных клеток мононуклеарной фракции с культурами МСК костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика (+МСК) в соотношении 100 к 1, по сравнению с ЛПС-стимулированными клетками мононуклеарной фракцией без сокультивирования (контроль). По оси ординат доля поделившихся В-лимфоцитов относительно общего количества Влимфоцитов. * - достоверные отличия от показателя в мононуклеарной фракции. Во второй серии экспериментов проводили сокультивирование МСК с популяцией В-лимфоцитов, выделенной с помощью иммуномагнитной сепарации. Соотношение МСК и В-лимфоцитов составляло 10:1, 1:1 или 1:10 при чистоте популяции В-лимфоцитов более 95%. Было показано, что МСК подавляют пролиферацию В-лимфоцитов только при соотношении клеток в культуре 1:1 (Рис.3.23). При увеличении доли МСК (соотношение МСК и В-лимфоцитов равное 10:1) не происходило подавление пролиферации В-лимфоцитов, а в части экспериментов количество клеток прошедших серию удвоений возрастало (2 культуры МСК жировой ткани, и 1 культура МСК пупочного канатика) (Рис.3.23.Б.). При соотношении МСК и В-лимфоцитов равном 1:10 МСК также не вызывали снижения пролиферативной активности В-лимфоцитов. (Рис.3.23.). 71 Рисунок 3.23. А. Доля поделившихся ЛПС-стимулированных В-лимфоцитов при их сокультивировании с МСК из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, по сравнению с ЛПС-стимулированными В-лимфоцитами без сокультивирования (контроль). Обозначения те же, что на Рис 3.21. Б. Интенсивность флуоресценции в CFSE В-лимфоцитах при их сокультивировании с МСК жировой ткани в соотношении 10:1 (2) и без сокультивирования с МСК (1). Во всех поставленных экспериментах МСК не снижали жизнеспособность клеток мононуклерной фракции и отдельно В-лимфоцитов, что было показано с помощью окраски 7ААD. (Табл. 3.4.). Таблица 3.4. Жизнеспособность В-лимфоцитов и клеток мононуклеарной фракции при сокультивировании с МСК из различных источников и в контроле 81 ± 10 МСК костного мозга 79 ± 6,5 МСК жировой ткани 89 ± 8,7 МСК пупочного канатика 84 ± 7,3 77,5 ± 9 73 ± 8,2 78 ± 6 70 ± 11 Жизнеспособные Контроль Клетки мононуклеарной фракции, % В-лимфоциты, % Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой зависимости характера влияния МСК на В-лимфоциты от условий постановки эксперимента, в первую очередь от наличия в смешанной культуре других иммунокомпетентных клеток, а также соотношения МСК и лимфоцитов. Индивидуальная вариабельность влияния культур МСК на пролиферацию Влимфоцитов проявляется только в смешанной культуре МСК и мононуклеарной фракции при их соотношении 1:100. 72 3.5.2.2. Тестирование функциональной активности МСК на лимфобластоидных и миеломных клетках Принимая во внимание неоднородность полученных результатов при анализе влияния МСК на пролиферацию В-лимфоцитов, для оценки воздействия МСК на продукцию иммуноглобулинов В-лимфоцитами в качестве эффекторных клеток были выбраны В-клеточные линии Namalva и U266. В экспериментах использовали МСК 3-4 пассажей из костного мозга (2 культуры), жировой ткани (2 культуры) и пупочного канатика (3 культуры), находившиеся в фазе логарифмического роста (30-60% конфлуентности) или в стационарной фазе (100% конфлуентности). МСК костного мозга не оказывали влияния на содержание внутриклеточного IgM в клетках линии Namalva. Уровень IgM при этом соответствовал контрольным значениям вне зависимости от состояния конфлюентности монослоя МСК (Рис. 3.24.) Рисунок 3.24. Уровень внутриклеточного IgM в клетках линии Namalva при сокультивировании с МСК в экспоненциальной или стационарной фазах роста. Группы столбиков: 1 – МСК, полученные из костного мозга, 2 – МСК из жировой ткани, 3 – МСК из пупочного канатика. Белые столбики – контроль. Серые столбики – культуры МСК в стационарной фазе роста (100%), черные столбики – культуры МСК в логарифмической фазе роста (30–60%). На гистограммах указано стандартное отклонение. * – значения, достоверно отличные от контроля (р<0,05). 73 Достоверное увеличение содержания IgM наблюдали при сокультивировании клеток Namalva с МСК жировой ткани. МСК из пупочного канатика также вызывали увеличение уровня IgM. Культуры МСК пупочного канатика и жировой ткани, находящиеся в логарифмической или в стационарной фазах роста, стимулировали синтез IgM одинаково эффективно. Действие МСК, пролиферирующих или покоящихся, было одинаковым. Таким образом, МСК из разных источников при контактном сокультивировании с клетками Namalva, либо не влияли на содержание цитоплазматического IgM, либо вызывали его увеличение (Айзенштадт и др., 2014). МСК костного мозга, также не оказывали влияния на уровень продукции IgE клетками линии U266. МСК из жировой ткани и пупочного канатика усиливали продукцию IgE, если находились в фазе логарифмического роста. Культуры МСК, прекратившие пролиферацию вследствие достижения 100%ного монослоя, оказывали слабое подавляющее действие на накопление IgE. Таким образом, при сокультивировании с миеломными клетками U266, пролиферирующие МСК могут оказывать стимулирующее действие на накопление IgE, тогда как МСК в стационарной фазе проявляют ингибирующий эффект (рис. 3.26.). Рисунок 3.25. Уровень внутриклеточного IgE в клетках линии U266при сокультивировании с МСК в экспоненциальной или стационарной фазах роста. Обозначения те же, что и на Рис.3.25. 74 Таким образом, МСК могут по-разному влиять на продукцию Ig лимфобластоидными и миеломными клетками в зависимости от источника получения и фазы роста культуры МСК. МСК из костного мозга здоровых доноров, вне зависимости от фазы роста культур, не влияли на синтез IgM и IgE. МСК жировой ткани и пупочного канатика на лимфобластоидные клетки оказывали стимулирующее действие. В тоже время при сокультивировании МСК с миеломными клетками наблюдали как подавление, так и стимулирование продукции IgE. Стимулирование накопления IgE миеломными клетками происходило при сокультивировании с МСК жировой ткани и пупочного канатика в логарифмической фазе роста, а МСК пупочного канатика в стационарной фазе роста наоборот подавляли продукцию IgE (Айзенштадт и др., 2014). 3.5.3. Влияние МСК на аллерген-специфические реакции лейкоцитов при атопической гиперчувствительности. Функциональную активность МСК изучали в экспериментах, в которых моделировали одно из звеньев эффекторной фазы аллергических реакций, а именно изменение состояния культивируемых клеток сенсибилизированного организма при повторном контакте с аллергеном. Клетки мононуклеарной фракции были получены из образцов периферической крови 16 доноров с проявлениями гиперчувствительности в анамнезе. Клетки мононуклеарных фракций после выделения на градиенте фиколла содержали наряду с лимфоцитами моноциты и гранулоциты, т.е. все клеточные типы, которые ответственны за появление изменений, наблюдаемых при культивировании в присутствии аллергенов (Табл. 3.5.). Увеличение выборки было обусловлено гетерогенностью группы обследованных доноров по типу сенсибилизирующего аллергена, формам и тяжести клинических проявлений атопической гиперчувствительности. 75 Таблица 3.5. Клеточный состав лейкоцитарных фракций, выделенных из крови доноров, сенсибилизированых в отношении специфических аллергенов Номер донора 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Лимфоциты, % 69,8±2 75±4 71,4 ± 1 79 ±4 85,7 ±5 87,2±8 85,6 ± 4 78±4,5 77,9±3 75,8±7 73±2 80±4 69,5±5 81±0,7 77,2±1 67,3±6 Аллерген пыльца березы шерсть и эпителий кошки рыба креветки рыба креветки амброзия полыннолистная шерсть кошки цитрусовые пенициллин лидокаин пыльца березы перхоть кошки тополь горчица пенициллин Моноциты, % 4 ±2 8,9 ±2 9 ± 0,5 10 ±3 6 ± 0,5 5,7 ±2 8,1 ± 5 9 ±2 9,6 ±2 9,3 ±4 8 ±2 8,9 ±2 7,7 ±1 10 ±0,5 6,8 ±2 11,7 ±2 Гранулоциты ,% 25,7±2 16 ±3 19,6 ±1 11 ±3 8,3 ±4 7,1 ±5,5 6,3 ±1 13 ±3 12,5 ±3 14,9 ±3 19 ±3 11 ±3 23 ±6 9 ±0,5 16 ±3 21 ±3 Воздействие аллергенов на клетки мононуклеарной фракции не вызывало достоверно значимого изменения доли CD69+ Т-лимфоцитов. Увеличение содержания активированных Т-лимфоцитов в присутствии аллергена происходило только в смешанной культуре клеток мононуклеарной фракции с МСК (Рис.3.26.) (Айзенштадт и др., 2015). МНК костный мозг жировая ткань пупочный канатик CD69+ Т-лимфоциты, % 25 * 20 * * * 15 * * 10 5 0 без стимула Рисунок относительно 3.26. Содержание общего аллерген Т-лимфоцитов, количества экспрессирующих Т-лимфоцитов. Указано CD69, стандартное отклонение. Обозначения те же, что и на Рис. 3.19. 76 Рост содержания Т-лимфоцитов, несущих поздний маркер активации (HLA-DR+), в ответ на воздействие аллергена наблюдали в 13 образцах мононуклеарной из 16. Через 72 часа культивирования мононуклеарной фракции с аллергеном количество HLA-DR+ Т-лимфоцитов возрастало в 1,5-3 раза. В смешанной культуре с МСК усиления экспрессии HLA-DR не происходило. В тех образцах, где инкубация с аллергеном не вызвала изменения содержания активированных Т-лимфоцитов (Образцы № 6, 7 и 10), присутствие МСК также не оказывало влияния на данный показатель (Рис. 3.27.). * Рисунок 3.27. Содержание активированных (CD3+ HLA-DR+) Т-лимфоцитов после культивирования клеток мононуклеарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из различных источников в присутствии аллергенов. * - данные, достоверно отличные от контроля (Р<0,05). Таким образом, аллогенные МСК вне зависимости от присутствия аллергена вызывают повышение доли Т-лимфоцитов экспрессирующих CD69+ клеток. Однако МСК относительного предотвращают содержания, вызванное HLA-DR+ аллергеном Т-лимфоцитов. увеличение Влияние МСК, полученных из разных источников, было сходным (Айзенштадт и др., 2015). Сокультивирование клеток мононуклеарных фракций с МСК из разных источников приводило к росту относительного содержания регуляторных Тлимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+CD127low, в то время как само 77 присутствие аллергена в среде клеток мононуклеарной фракции влияния на их численность не оказывало. При сокультивировании с МСК пупочного канатика доля регуляторных Т-лимфоцитов увеличивалось в среднем на 34 % (мин – 13 %, макс – 59 %). В опытах с МСК из костного мозга прирост этого показателя составлял 31 % (мин – 13 %, макс – 53 %), а при использовании МСК жировой ткани – 30 % (мин – 14 %, макс – 48 %) (Рис.3.28.) (Айзенштадт и др., 2015). * * * Рис.3.28. Содержание регуляторных Т-лимфоцитов (CD4+CD25+CD127low) среди клеток мононуклеарных фракций после их культивирования в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из различных источников в присутствии аллергенов. По оси ординат – относительное содержание Т-регуляторных клеток. * - данные, достоверно отличные от контроля (Р<0,05). При этом МСК не оказывали влияния на соотношение основных популяций лимфоцитов: Т- и В-лимфоцитов, естественных киллеров. Соотношение Тхелперов и Т-цитотоксических клеток также не менялось при сокультивировании с МСК, вне зависимости от источника их получения. Формирование популяции регуляторных Т-лимфоцитов в присутствии МСК сопровождалось повышением концентрации IL-10 в культуральной среде смешанных культур. При сокультивировании клеток мононуклеарной фракции с МСК пупочного канатика концентрация IL-10 возрастала практически в три раза (на 190%) по сравнению с контролем, а МСК костного мозга или жировой ткани - на 40% и 75%, соответственно (Рис.3.29). 78 Концентрация IL-10, пг/мл 45 * 40 35 * 30 * 25 20 15 10 5 0 костный мозг контроль жировая ткань Рис. 3.29. Изменение содержания пупочный канатик IL-10 в культуральной средепупочный при канатик сокультивировании клеток мононуклеарной фракции с МСК костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика в присутствии аллергена. Контроль – интактные лимфоциты. Указано стандартное отклонение. * - данные, достоверно отличные от контроля (Р<0,05). Присутствие аллергенов в среде культивирования индуцировало достоверное увеличение концентраций IL-4. Сокультивирование клеток мононуклеарной фракции с МСК блокировало вызванный аллергеном рост концентрации IL-4 (Рис.3.30) (Айзенштадт и др., 2014). * Рисунок 3.30. Концентрация IL-4 в среде после культивирования клеток мононуклеарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из разных источников в присутствии аллергенов. * - данные, достоверно отличные от контроля (Р<0,05). 79 Для двух доноров не было показано статистически значимых отличий между интактными и стимулированными аллергеном лимфоцитами, а также в варианте сокультивирования с МСК (Образцы № 6 и 7). МСК из костного мозга, жировой ткани или пупочного канатика блокировали продукцию IL-4 с одинаковой эффективностью. В тоже время, при воздействии ФГА на клетки мононуклеарной фракции, сокультивирование с МСК приводило к незначительному увеличению концентрации IL-4 в культуральной среде в экспериментах с материалом всех доноров (Рис.3.31). Концентрация IL-4, пг/мл 4,5 * 4 3,5 *# 3 *# *# * 2,5 МНК костный мозг жировая ткань пупочный канатик 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 контроль Рисунок 3.31. аллерген Содержание ФГА IL-4 в культуральной жидкости при сокультивировании клеток мононуклеарной фракции с МСК из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика в присутствии аллергенов или ФГА. * данные, достоверно отличные от контроля (мононуклеарная фракция без стимула) (Р<0,05). По оси ординат – концентрация IL-4 (нг/мл). Таким образом, МСК предотвращали увеличение концентрации IL-4 при стимулировании лимфоцитов аллергеном, но не подавляли продукцию IL-4 в присутствии ФГА. То есть, характер влияния МСК на уровень продукции IL-4 зависит от стимулирующего агента, предъявляемого иммуннокомпетентным клеткам. 80 Инкубация с аллергеном приводила к достоверному увеличению концентрации IgE. Рост концентрации IgE в присутствии аллергена не наблюдали при сокультивировании клеток мононуклеарной фракции с МСК (Рис.3.32). МСК, полученные из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, оказывали сходное влияние на содержание IgE. * Рисунок 3.32. Концентрация IgE в среде после культивирования клеток мононуклеарных фракций в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из разных источников в присутствии аллергенов. * - данные, достоверно отличные от контроля (Р<0,05). Таким образом, все культуры МСК блокировали индуцированное аллергеном увеличение концентрации IgE в смешанной культуре с клетками мононуклеарной фракции (Айзенштадт и др., 2015). Суммируя результаты представленные в данном разделе, можно сделать вывод, что отличия в проявлении иммуносупрессорных свойств МСК различного тканевого происхождения проявляются только в части экспериментальных систем. Они проявлялись при анализе влияния МСК на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов (при низкой концентрации МСК относительно эффекторных клеток), продукцию иммуноглобулинов В- клеточными линиями, а также изменение концентрации IL-10. МСК из 81 костного мозга имели менее выраженное влияние, чем МСК полученные из пупочного канатика и жировой ткани. 3.6. Влияние клеток мононуклеарной фракции крови и лимфоцитарных митогенов на функциональное состояние МСК Изменение функционального состояния МСК оценивали по уровню экспрессии TLR3 и TLR4, характеру внутриклеточного распределения NF-κB с помощью методов проточной цитофлуорометрии и иммуноцитохимии. Для этого МСК культивировали совместно с клетками мононуклеарной фракции, активированными лимфоцитарными митогенами (ФГА или ЛПС). Контролем служили монокультуры МСК, которые инкубировали с ФГА или с ЛПС. Все эксперименты проводили в двух повторностях на 3 культурах МСК из каждого источника, полученных от разных доноров. 3.6.1. Экспрессия Toll-подобных рецепторов на мембране МСК Уровень экспрессии TLR3 и TLR4 на поверхности МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, исследовали методом проточной цитофлуорометрии с использованием показателя средней интенсивности флуоресценции. МСК конститутивно экспрессируют TLR3. При сравнении культур МСК жировой ткани и лимфоцитов периферической крови, полученных от одних и тех же доноров (3 здоровых донора) было показано, что уровень экспрессии TLR3 на поверхности МСК выше, чем на поверхности лимфоцитов (CD45+) (Рис.3.33). Рисунок 3.33. Гистограмма интенсивности флуоресценции МСК костного мозга (черная линия) и лимфоцитов периферической крови (гистограмма с серым фоном), экспрессирующих TLR3. Пунктирная линия – изотипический контроль. 82 Было продемонстрировано индуцибельное усиление экспрессии TLR3 на поверхности МСК. флуоресценции Наибольшее МСК, увеличение экспрессирующих средней TLR3, интенсивности наблюдали при их сокультивировании с клетками мононуклеарной фракции в присутствии лимфоцитарных митогенов: ФГА или ЛПС - на 105±22 % и 120±35%, соответственно. Воздействие ЛПС на монокультуру МСК приводило к увеличению интенсивности флуоресценции МСК, экспрессирующих TLR3, на 29,5±11,3 %. Уровень экспрессии TLR3, а также степень его изменения не зависели от источника МСК. (Рис.3.34.) 35 костный мозг жировая ткань пупочный канатик 30 * MFI, отн.ед. 25 * * 20 15 * * * * * * 10 5 0 Контроль контроль Рисунок ФГА ФГА 3.34. ЛПС ЛПС Средняя МНФ МНК МНФ+ФГА МНФ+ЛПС МНК+ФГА МНК+ЛПС интенсивность флуоресценции МСК, экспрессирующих TLR3 в присутствии митогенов (ЛПС либо ФГА), либо при сокультивировании с интактными (МНФ) или митоген-активированными клетками мононуклеарной фракции (МНФ+ФГА или МНФ+ЛПС). Указано стандартное отклонение. * – достоверные различия от контроля при р<0,05. МСК, полученные из разных источников, характеризуются уровнем экспрессии TLR4 (Рис.3.35), который был трудно детектируемым с помощью проточной цитофлуорометрии. Экспрессия TLR4 не изменялась при воздействии митогенов, а также в процессе сокультивирования с клетками мононуклеарной фракции (Рис.3.35). 83 КМ ЖТ Средняя интенсивность флуоресценции, отн.ед. А 1,2 1 Б 0,8 0,6 0,4 0,2 0 контроль Контроль Рисунок ФГА ФГА 3.35. ЛПС ЛПС А. клетки МНК МНФ клетки МНК клетки МНК МНФ+ФГА МНФ+ЛПС Гистограмма +ФГА +ЛПС интенсивности флуоресценции МСК (полученных из костного мозга - КМ, ПК жировой ткани – ЖТ и пупочного канатика – ПК), экспрессирующих TLR4; Б. Средняя интенсивность флуоресценции МСК из всех источников, экспрессирующих TLR4. Обозначения как на Рис. 3.34 Таким образом, уровень экспрессии TLR3 и TLR4 на поверхности МСК не зависит от их тканевого происхождения. Аналогично, характер изменения уровня экспрессии TLR3 и TLR4 был сходным у культур МСК из разных источников. 3.6.2. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК при действии лимфоцитарных митогенов или при сокультивировании с лимфоидными клетками В интактных МСК NF-κB находится в цитоплазме и не обнаруживается в ядре. Как видно транскрипционного из фактора микрофотографии частично (рис.3.38.), солокализованы субъединицы с элементами 84 актинового цитоскелета, в частности располагаются вдоль актиновых стрессфибрилл. Рисунок 3.36. Распределение транскрипционного фактора NF-κB в интактных МСК. Красным отмечены структуры актинового цитоскелета, окрашенные родамин-фаллоидином (RhPH), зеленым – антитела к субъединице p65 и вторые антитела, конъюгированные с флуорохромом Alexa-488, синим – 85 ядра клеток, окрашенные DAPI. Флуоресцентная микроскопия. Масштабный отрезок – 10 мкм. В первой серии экспериментов МСК инкубировали с ЛПС либо с ФГА в течение 5, 15, 30, 60, 180 мин и 24 ч. Транслокация транскрипционного фактора NF-κB в ядро происходила через 30 минут после воздействия ЛПС (Рис.3.37.) во всех клетках. Изменение локализации NF-κB не сопровождалось перестройками актинового цитоскелета во все периоды наблюдения. Рисунок 3.37. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК при инкубации с ЛПС в течение 30 мин. Масштабный отрезок – 5 мкм Обозначения те же, что на Рис. 3.36. 86 После 24 часов инкубации с ЛПС локализация NF-κB в ядре МСК сохранялась в 82,1 ± 7% клеток (Рис.3.37.). Alexa488 DAPI Alexa488 RhPh Рисунок 3.37. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК при инкубации с ЛПС в течение 24 ч. Масштабный отрезок – 5 мкм. Обозначения те же, что на Рис. 3.38. Воздействие ФГА также вызывало транслокацию NF-κB в ядро МСК. Изменение локализации транскрипционного фактора происходило в течение 30 минут во всех клетках. Воздействие ФГА также приводило к изменению морфологии МСК: на поверхности мембраны клеток формировались выпячивания. (Рис.3.38.). После 24 часов инкубации с ФГА ядерная локализация NF-κB сохранялась в 58,6 ± 19 % МСК 87 Рисунок 3.38. Локализация транскрипционного фактора NF-κB в МСК при инкубации с ФГА в течение 30 мин. Масштабный отрезок – 5 мкм. Обозначения те же, что на Рис. 3.36. Во второй серии экспериментов локализацию NF-κB в МСК анализировали в смешанной культуре с клетками мононуклеарной фракции периферической крови. Контактное сокультивирование МСК с интактными лимфоцитами не индуцировало транслокацию NF-κB в МСК (Рис.3.39). 88 Рисунок 3.39. Распределение NF-κB в МСК при контактном сокультивировании с интактными клетками мононуклеарной фракции в течение 90 мин. Обозначения те же, что на Рис. 3.38 При контактном сокультивировании МСК и активированных митогеном (ФГА или ЛПС) клеток мононуклеарной фракции через 30 минут NF-κB обнаруживали в ядре в 35 ± 4,3% популяции МСК (Рис. 3.40.). 89 4 1 2 3 1 2 3 Рисунок 3.40. Распределение NF-κB в МСК при контактном сокультивировании с лейкоцитами в присутствии ЛПС в течение 30 мин. Стрелками показаны лимфоциты на поверхности МСК. 1,2 – ядра МСК, в которых завершилась транслокация NF-κB в ядро, 3,4 – ядра МСК, в которых NF-κB локализован преимущественно в цитоплазме. Обозначения те же, что на Рис. 3.36. Процесс транслокации NF-κB в ядро во всех клетках завершался не менее чем через 60-90 минут (Рис.3.41.). 90 Рисунок 3.40. Распределение NF-κB в МСК при контактном сокультивировании лейкоцитами в присутствии ФГА в течение 90 мин. Стрелкой показан лимфоцит на поверхности МСК. Обозначения те же, что на Рис. 3.36. При исключении прямого межклеточного контакта между МСК и клетками мононуклеарной фракции (сокультивирование с использованием полупроницаемых мембран) скорость транслокации NF-κB в присутствии ЛПС или ФГА снижалась еще более значительно, чем это происходило при непосредственном клеточном контакте. На сроках менее 3 часов транскрипционный фактор NF-κB был локализован только в цитоплазме. При дальнейшем культивировании (4, 6, 12 часов) перераспределение NF-κB происходило только в части клеток (доля клеток, в которых произошла транслокация NF-κB, варьировала между экспериментами, но не превышала 91 60%). Процесс транслокации завершался (т.е. NF-κB был локализован в ядре более чем 90% клеток) спустя 24 часа культивирования (Рис.3.41.). Рисунок 3.41. Распределение NF-κB в МСК при сокультивировании с лейкоцитами в присутствии ЛПС при использовании полупроницаемых мембран при разной длительности культивирования. Обозначения те же, что на Рис. 3.36. Перераспределение NF-κB в МСК происходило одинаково во всех проанализированных культурах МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани, и пупочного канатика. Временные интервалы, в которые наблюдали транслокацию NF-κB, также были схожими для всех культур МСК. Таким образом, воздействие ЛПС, который является митогеном для Влимфоцитов, а также лигандом TLR4, вызывает транслокацию NF-κB в ядро МСК. Аналогичный процесс наблюдали при инкубации с ФГА – митогеном Тлимфоцитов. Этот процесс происходит как в отсутствии иммуннокомпетентных клеток, так и в смешанной культуре. При сокультивировании с активированными ЛПС или ФГА клетками мононуклеарной фракции транслокация NF-κB в МСК происходила значительно позже. Для проверки предположения о том, что в этом случае 92 транслокация NF-κB индуцирована цитокинами, продуцируемыми активированными лимфоцитами, локализацию NF-κB в МСК анализировали при воздействии TNFα. Импорт транскрипционного фактора в ядро МСК наблюдали через 30 минут после внесения TNFα в культуральную среду. Ядерная локализация NF-κB в МСК сохранялась в течение 4 часов, после чего NF-κB обнаруживался преимущественно в цитоплазме клеток (3.42). Рисунок 3.42. Распределение NF-κB в МСК при инкубации с TNFα. Обозначения те же, что на Рис. 3.38. Транслокация NF-κB в ядро МСК сопровождалась повышением концентрации IL-6 в культуральной среде МСК в присутствии ЛПС, либо при сокультивировании с клетками мононуклеарной фракции в течение 24ч. МСК конститутивно продуцируют IL-6, причем его концентрация в культуральной среде различалась для образцов, полученных от разных доноров (Рис. 3.43). Была показана индивидуальная вариабельность уровня продукции IL-6, не связанная с источником получения культур. 93 2 Концентрация ИЛ-6, пг/мл 250 7 3 200 5 9 6 4 8 150 1 100 50 0 костный мозг жировая ткань пупочный канатик Рисунок 3.43. Средние значения концентрации IL-6 в кондиционной среде при культивировании культур МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика. Цифры над столбиками – номера культур. Указано стандартное отклонение. Добавление ФГА в культуральную среду МСК (вне зависимости от источника получения культуры) не приводило к значительному увеличению концентрации IL-6. Воздействие ЛПС индуцировало повышение концентрации IL-6 в культуральной среде монокультуры МСК, в среднем, в 6,2 ± 1,3 раз. Сокультивирование МСК и клеток мононуклеарной фракции без добавления митогенов не вызывало изменения концентрации IL-6. Воздействие ФГА на смешанную культуру клеток мононуклеарной фракции с МСК костного мозга приводило к 25-кратному (25,2±2) увеличению концентрации IL-6 по сравнению с монокультурой МСК и 13 – кратному (12,9±1,6) – по сравнению с клетками мононуклеарной фракции в присутствии ФГА. Аналогично, в смешанной культуре с МСК жировой ткани концентрация IL-6 возрастала в 39±8,5 и 23±7 раз, а с МСК пупочного канатика – в 27,5±6 и 13±5,6 раз. Наибольший рост продукции IL-6 был показан для культур МСК, полученных из жировой ткани (Рис.3.44.). 94 Рисунок 3.44. Концентрации IL-6 в среде при культивировании МСК, костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика в присутствии митогенов (ЛПС либо ФГА), либо при сокультивировании с интактными (МНФ) или митоген-активированными клетками мононуклеарной фракции (МНФ+ФГА и МНФ+ЛПС). Указано стандартное отклонение. * – достоверные различия от контроля при р<0,05. Степень изменения концентрации IL-6 в смешанной культуре МСК, полученных из разных источников и клеток мононуклеарной фракции при воздействии ЛПС по сравнению с монокультурами МСК или клетками мононуклеарной фракции суммированы в Таблице 3.6. 95 Таблица 3.6. Средняя кратность увеличения концентрации IL-6 в культуральной среде в смешанной культуре МСК и клеток мононуклеарной фракции (МНК) при стимуляции ЛПС по сравнению интактными МСК и стимулированными ЛПС МСК или клетками мононуклеарной фракции Источник МСК Средняя кратность увеличения концентрации IL-6 по сравнению с: МСК под интактными МНК под воздействием МСК воздействием ЛПС ЛПС 319 ± 35* 45 ± 6,3* 10 ± 3* 630 ± 60* 60 ± 9,5* 21 ± 4,4* 370 ± 56* 45,8 ± 5,5* 14 ± 3* Костный мозг Жировая ткань Пупочный канатик * – достоверные различия при р<0,05 Воздействие TNFα на МСК также приводило к увеличению продукции IL-6 (Рис.3.45). Наибольший рост продукции IL-6 был показан для культур МСК, полученных из жировой ткани. костный мозг жировая ткань пупочный канатик Концентрация IL-6, пг/мл 4500 * 4000 * 3500 3000 * 2500 2000 1500 1000 500 0 контроль TNFα Рисунок 3.45. Изменение концентрации IL-6 в среде при культивировании МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика в присутствии TNFα. Указано стандартное отклонение. * – достоверные различия от контроля при р<0,05. Таким образом, увеличение продукции IL-6 происходило в смешанной культуре МСК и клеток мононуклеарной фракции в присутствии как ЛПС, так и ФГА. Менее выраженное повышение концентрации IL-6 наблюдали при 96 воздействии ЛПС на монокультуру МСК. Воздействие ФГА на монокультуру МСК не приводит к значимому увеличению концентрации IL-6, не смотря на то, что индуцирует транслокацию транскрипционного фактора NF-κB в ядро. Описанные процессы происходили во всех образцах МСК, но степень изменения продукции IL-6 отличалась в МСК, полученных из разных источников. Локализацию NF-κB и продукцию IL-6 в МСК анализировали также в условиях смешанной культуры со стимулированными специфическими аллергенами клетками проявлениями мононуклеарной гиперчувствительности. фракции В крови течение пациентов всего с процесса сокультивирования (временные точки 10, 30, 60, 120, 180 минут и 24 часа), транскрипционный фактор NFkВ был локализован в цитоплазме МСК (Рис.3.46.). Рисунок 3.46. Локализация NF-κB в МСК при сокультивировании с лейкоцитами в присутствии аллергена в течение 90 мин. Обозначения те же, что на Рис. 3.36. Транслокация NFkВ в ядро МСК в данной экспериментальной модели показана не была. Изменение концентрации IL-6 также не происходило. При 97 этом проанализированные культуры МСК ингибировали проявления аллергенспецифических эффекторных реакций в условиях in vitro, как описано выше. Таким образом, изменение функционального состояния МСК при их сокультивировании с аллерген-активированными лимфоцитами не сопровождается ядерным импортом транскрипционного фактора NFκB. 98 Глава 4. Обсуждение В соответствии с поставленной целью было проведено изучение ростовых и иммунофенотипических характеристик МСК, выделенных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика человека, а также были проанализированы проявления их функциональной активности в разных экспериментальных системах. МСК могут быть выделены из нескольких участков пупочного канатика, из которых наиболее часто используемыми являются Вартонов студень и периваскулярное пространство пупочной вены. МСК, полученные из этих ниш, являются двумя отдельными популяциями с различными свойствами (Ishige et al., 2009; Carvalho et al., 2011). Нами впервые было проведено исследование МСК периваскулярного пространства пупочной вены пупочного канатика на большой выборке образцов, что позволило выявить некоторые характеристики, оказывающие влияние на эффективность получения клеток. Основным фактором является временной промежуток между родами и моментом начала обработки пупочного канатика. Кроме того, количество МСК полученных из образцов пупочного канатика новорожденных мужского пола было в среднем выше, чем женского. Периваскулярное пространство пупочной вены характеризуется достаточно высокой концентрацией МСК - из одного образца пупочного канатика возможно получение МСК в количестве, сопоставимом с получаемым при выделении МСК из 50-70 мл костного мозга, либо из 3-5 мл жировой ткани. Получение жизнеспособных и пролиферирующих МСК из пупочного канатика возможно даже после длительной транспортировке (более 12 часов) биологического материала, что делает возможным создание биобанков культур МСК, полученных из данного источника. Учитывая, что in vivo МСК существуют в условиях гипоксии, исследование характеристик МСК в свете их потенциального клинического применения также целесообразно проводить при пониженном содержании кислорода. В ходе серии предварительных экспериментов по выбору условий 99 культивирования было показано, что культивирование МСК из разных источников в условиях гипоксии приводит к повышению их пролиферативного потенциала. При этом морфологические характеристики клеток не изменяются, что соответствует полученным ранее данным (Буравкова и др., 2011; Hoch, Leach, 2014) МСК, выделенные из пупочного канатика, обладают большей пролиферативной активностью, чем МСК костного мозга. Аналогичные результаты были получены ранее (Baksh et al., 2007). Кроме того, были показаны различия в пролиферативной активности между МСК пупочного канатика и жировой ткани, которые, однако, возникали только при длительном культивировании – МСК пупочного канатика дольше сохраняли способность пролиферировать (до 10 пассажа) и на поздних пассажах (с 6 пассажа) характеризовались меньшим временем удвоения популяции, чем МСК жировой ткани. При этом МСК из всех источников имели в целом сходные морфологические дифференцироваться характеристики в остеогенном, и обладали хондрогенном способностью и адипогенном направлениях. Таким образом, периваскулярное пространство пупочной вены является нишей, из которой может быть получено значительное количество МСК с высоким пролиферативным потенциалом. Такое свойство может быть весомым преимуществом при выборе МСК пупочного канатика для клинического применения. Культуры МСК, полученные из разных источников, характеризовались в целом одинаковым содержанием клеток, несущих МСК-ассоциированные маркеры, за исключением CD10 и CD13. CD10 вовлечен в активацию клеточной адгезии, опосредованной киназой фокальных контактов, таким образом, негативно влияя на способность клеток к миграции (Sumitomo et al., 2005). Согласно нашим результатам, в культурах МСК пупочного канатика присутствует популяция клеток, не экспрессирующих CD10, относительное содержание которых существенно 100 выше, чем среди МСК, выделенных из костного мозга и жировой ткани. Значительное количество МСК пупочного канатика, не экспрессирующих CD10, наблюдали вне зависимости от концентрации кислорода при культивировании. В тоже время в работе Farias с соавторами упоминается, что все МСК пупочного канатика экспрессируют данный маркер (Farias et al., 2011). Гетерогенность популяции по экспрессии CD10 была так же показана для культур МСК костного мозга, но при культивировании в условиях нормоксии. При этом авторы наблюдали прямую корреляцию между уровнем экспрессии CD10 и эффективностью адипогенной дифференцировки (Siegel et al., 2013). По нашим данным, в результате культивирования в условиях гипоксии CD10+ клетки в культурах МСК жировой ткани и костного мозга составляют более 80% и 90% популяции, сооответственно. Активация CD13 также как и CD10 может приводить к усилению клеточной адгезии (Mina-Osorio et al., 2008; Subramani et al., 2013). МСК костного мозга и жировой ткани являются однородными по экспрессии CD13 (Musina et al., 2005; Vishnubalaji et al., 2012), что было подтверждено и в нашем исследовании. По данным ряда авторов, в культурах МСК пупочного канатика более 90% клеток экспрессируют CD13 (Panepucci et al., 2004; Weiss et al., 2006; Ishige et al., 2009). Однако в цитируемых исследованиях иммунофенотипирование проводили для небольшого количества культур МСК пупочного канатика. Кроме того, для анализа использовали МСК на 3, 4 или даже 8 пассаже. Нами было показано, что МСК пупочного канатика на втором пассаже гетерогенны по экспрессии CD13, при этом доля CD13+ клеток, сильно варьировала между разными культурами. Учитывая вовлеченность CD10 и CD13 в регуляцию процессов миграции и клеточной адгезии, гетерогенность МСК пупочного канатикапо экспрессии этих антигенов может быть существенной при системном введении МСК, эффективность которого во многом зависит от способности МСК к миграции. Все МСК в культурах, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, экспрессируют CD90. При этом МСК костного мозга 101 характеризовались более низкими значениями средней интенсивности флуоресценции МСК, экспрессирующих CD90, по сравнению с МСК из других источников, что свидетельствует о различной плотности изучаемого антигена на поверхности клеток в зависимости от их тканевого происхождения. Ранее различия в уровне экпрессии CD90 на поверхности МСК из разных источников, были показаны на примере культур, выделенных из субэпикардиальной и подкожной жировой ткани (Крылова и др., 2014). Существуют данные, свидетельствующие о том, что низкая экспрессия CD90 на поверхности МСК коррелирует со снижением их иммуносупрессорной активности, что, возможно, опосредовано снижением продукции неклассического антигена HLA-G и IL-10 (Campioni et al., 2009). Аналогично, в нашей работе при сокультивировании МСК костного мозга с клетками мононуклеарной фракции была показана меньшая концентрация IL10, чем в смешанных культурах с МСК жировой ткани или пупочного канатика, что может быть косвенным свидетельством меньшей выраженности иммуносупрессорных свойств МСК из этого источника. Высокий уровень экспрессии CD90 в МСК пупочного канатика может быть частично связан с возрастом донора биологического материала. Так, в работе Siegel с соавторами была показана обратная зависимость уровня экспрессии CD90 от возраста донора (Siegel et al., 2013). Однако данное объяснение не подходит для МСК жировой ткани, поскольку возраст доноров жировой ткани составлял от 46 до 90 лет. Кроме того, культуры МСК пупочного канатика характеризовались максимальной внутригрупповой дисперсией показателей интенсивности флуоресценции CD90. При этом не удалось выявить корреляцию уровня экспрессии с каким-либо параметром в анамнезе роженицы (возраст, срок гестации, наличие гипоксии плода и т.д.), либо в процедуре выделения клеток (временной интервал между родами и выделением клеток, свойства пупочного канатика). Таким образом, была показана зависимость уровня экспрессии CD90 на поверхности МСК от их тканевого происхождения. 102 МСК пупочного канатика в отличие от МСК костного мозга и жировой ткани были однородны по экспрессии CD105. Ранее различия в уровне экспрессии CD105 были показаны также для МСК костного мозга и жировой ткани (Rada et al., 2011; Aslan et al., 2006; Jiang et al., 2010; Levi et al., 2010). МСК пупочного канатика при этом характеризуются постоянным, но достаточно низким уровнем экспрессии CD105. Кроме того, на МСК, полученных из пуповинной крови человека, было показано, что снижение экспрессии CD105 наблюдается в ходе дифференцировки клеток в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлениях (Jin et al., 2009). При иммунофенотипировании культур МСК отдельно анализировали уровень экспрессии HLA I класса. Ранее было показано, что МСК экспрессируют HLA I класса (Le Blanc et al., 2006), но в ряде статей упоминается низкий уровень экспрессии HLA I в качестве одной из характеристик фенотипа МСК (Климович, 2014; Newman et al., 2009; Franquesa et al., 2012), однако экспериментального подтверждения данному факту найти не удалось. Напротив, наши результаты свидетельствуют о том, что МСК, полученные из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, экспрессируют HLA I класса практически на том же уровне, что и лимфоциты периферической крови. Это согласуется с работой Crop с соавторами, в которой высокий (по сравнению с другими типами клеток) уровень экспрессии HLA I был продемонстрирован с помощью микрочипов (Crop et al., 2010). Наши данные были получены с использованием поликлональных антител к белкам, которые кодируются генами системы HLA I класса всех трех локусов – А, В и С. Ранее также методом проточной цитофлуорометрии было показано, что МСК жировой ткани и костного мозга конститутивно на достаточно высоком уровне экспрессируют гены локуса A, при этом практически не экспрессируют HLA-B (Isa et al., 2010). Значение данного факта требует дальнейшего изучения. Нами впервые методом проточной цитофлуорометрии было продемонстрировано повышение уровня экспрессии HLA I на поверхности 103 МСК при сокультивировании МСК с ФГА- или ЛПС-активированными аллогенными лимфоцитами, либо при добавлении к культуре МСК провоспалительного цитокина TNFα. Ранее слабое усиление экспрессии HLA-I на поверхности МСК костного мозга наблюдали при воздействии ЛПС, которое однако, не оказывало влияния на взаимодействие МСК и ЕК (Giuliani et al., 2014). В упоминавшейся выше работе Crop с соавторами возможность индуцибельного увеличения уровня экспрессии HLA I была показана только на уровне транскрипции. Уровень экспрессии возрастал в 6 или в 2 раза при воздействии провоспалительных цитокинов (TNFα, INFγ, IL-6) или после сокультивирования с ФГА-активированными лимфоцитами соответственно. При этом иммунофенотипически авторами было показано отсутствие изменений в уровне экспрессии HLA I на поверхности МСК в обоих случаях (Crop et al., 2010). Таким образом, МСК различного тканевого происхождения характеризуются восоким уровнем экспрессии HLA I класса, который может индуцибельно возрастать. Усиление экспрессии HLA I на поверхности МСК может сказываться на характере их взаимодействия с ЕК, поэтому уровень экспрессии HLA I является существенной характеристикой при аллогенной трансплантации МСК, способной повлиять на иммуногенность и выживаемость МСК, а значит и на эффективность клеточной терапии. Таким образом, на большой выборке образцов было показано, что МСК пупочного кантика обладают значительно более высокой пролиферативной активностью по сравнению с МСК костного мозга. Различия в пролиферативной активности между МСК пупочного канатика и жировой ткани не так существенны и наблюдаются только на поздних пассажах. При этом сравнение иммунофенотипа МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, проведенное в данной работе, свидетельствует о сходстве между клетками, полученными из разных источников, за исключением экспрессии CD10, CD13, CD90 и CD105. 104 Для сравнения функциональной активности МСК из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика было использовано несколько экспериментальных систем, в которых в качестве тест-объектов выступали Тили В-лимфоциты, а также В-клеточные линии. Это позволило определить те условия, в которых проявляются общие свойства всех МСК, а также выявить параметры, при которых оказываются значимыми индивидуальные особенности культур МСК, выделенных от разных доноров. Согласно существующим в литературе данным, МСК могут влиять на процессы, происходящие на каждом из этапов Т-клеточного ответа: при активации Т-клеток, пролиферации и осуществления эффекторных функций. Полученные нами результаты свидетельствуют о достоверном увеличении содержания Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD69, в присутствии МСК. При оценке влияния МСК на содержание CD69+ Т-лимфоцитов необходимо учитывать время между проведением анализа и моментом воздействия стимула на лимфоциты. Это связано с тем, что экспрессия CD25 и CD69 не только сопровождает процесс активации Т-лимфоцитов (Mardiney et al., 1996), но и является признаком регуляторного фенотипа Т-клеток (Sakaguchi et al., 2008; Han et al., 2009). Более того, все изученные на данный момент маркеры Т-регуляторных клеток также являются маркерами активации Тлимфоцитов (Corthay, 2009). Возможно, действие МСК на процессы активации и приобретения регуляторного фенотипа Т-лимфоцитами является разнонаправленным, что может затруднять интерпретацию полученных данных, поскольку эти процессы могут идти одновременно. Имеющиеся литературные данные были получены в ходе анализа содержания CD69+ Тлимфоцитов, который проводили не менее, чем через 24 часа после начала сокультивирования и предъявления Т-лимфоцитам стимулирующего агента (Ramasamy et al., 2008; Saldanha-Araujo et al., 2012; Буравкова и др., 2014). Поэтому, возможно, авторы наблюдали не усиление активации Т- лимфоцитов, а приобретение ими регуляторного фенотипа под действием МСК. В нашей работе содержание Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD69, 105 проводили на более ранних сроках (3 часа), соответствующих пику экспрессии CD69 в качестве раннего маркера активации (Hamann et al., 1993). Таким образом, в первую очередь оценивали действие МСК на экспрессию CD69, функционирующего в качестве костимуляционной молекулы. Если исходить из данного предположения, то МСК не оказывают негативного действия на раннюю активацию Т-лимфоцитов, а, наоборот, ее стимулируют. С одной стороны, нельзя исключать, что даже на таких ранних сроках Тлимфоциты начинают приобретать регуляторный фенотип. Однако, возможно, ранняя активация Т-лимфоцитов под влиянием МСК является необходимым последних, условием участвуя в реализации процессе иммунносупрессивного их «лицензирования». действия Механизмы, задействованные при данных процессах, требуют дальнейшего изучения. При более длительном взаимодействии МСК с эффекторными клетками (72 ч) наблюдали блокирование ФГА-индуцированного увеличения Тлимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR, которые могут дополнительно усилить иммунный ответ на поздних стадиях. Ранее снижение доли HLA-DR+ Т-лимфоцитов в смешанной культуре с МСК было показано в случае активации Т-лимфоцитов антителами к CD3 и CD28 (Kronsteiner et al., 2011) и ФГА (Буравкова и др., 2011). Снижение содержания HLA-DR+ Тлимфоцитов может быть косвенным свидетельством возможности применения МСК из всех источников для лечения ревматоидного артрита, острой РТПХ и ряда других заболеваний, которые сопровождаются увеличением доли HLA-DR+ Т-лимфоцитов. Таким образом, МСК разнонаправлено действуют на экспрессию ранних и поздних маркеров активации на поверхности активированных Т-лимфоцитов, Это может быть признаком чувствительности проявления функциональной активности МСК в зависимости от фазы иммунного ответа и факторов микроокружения. В тоже время, сравнение МСК, полученных из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика, показывает, что характер и 106 выраженность влияния МСК на экспрессию маркеров активации Тлимфоцитов не зависит от источника получения МСК. Одним из наиболее часто используемых показателей функциональной активности МСК по отношению к иммуннокомпетентным клеткам является подавление пролиферации Т-лимфоцтов в присутствии МСК, что было показано во многих работах (Di Nicola et al., 2002; Duffy et al., 2011). В настоящей работе основной задачей изучения влияния МСК на ФГАстимулированную пролиферацию Т-лимфоцитов было определить, все ли проанализированные культуры МСК облают способностью к подавлению пролиферативной активности Т-лимфоцитов, и влияет ли источник получения МСК на выраженность наблюдаемого эффекта. Различия в проявлении функциональной активности МСК в данной экспериментальной модели наблюдали только при низкой концентрации МСК относительно эффекторных клеток. При соотношении 1:100, МСК костного мозга обладали менее выраженным супрессорным действием по сравнению с МСК жировой ткани и пупочного канатика. Ранее сокультивирование МСК и эффекторных клеток проводили при соотношении не меньше, чем 1:18 (Di Nicola et al., 2002; Yoo et al., 2009; Ribeiro et al., 2013). Соответственно и значительных различий в супрессивной активности по отношению к пролиферации Тлимфоцитов выявлено не было. Хотя в работе Krampera с соавторами отсутствие супрессорного действия МСК костного мозга на пролиферацию Тлимфоцитов было показано при соотношении ниже 1:10 (Krampera et al., 2006). Однако в клинической практике не используется количество МСК, после введение которого, соотношение МСК и лимфоцитов было бы приближено к 1:1 или 1:10. Таким образом, учитывая дозозависимость влияния МСК на пролиферацию Т-лимфоцитов и наличие влияния индивидуальных характеристик культур МСК (в том числе, источника получения) на взаимодействие МСК и Т-лимфоцитов, представляется важным анализировать культуры МСК для клинического применения в данном тесте с использованием различных соотношений МСК и лимфоцитов – от 1:1 до 107 1:100 или меньше. Такое тестирование может быть особенно важным, если предполагается использование МСК для лечения иммунопатологических состояний. Возможно, анализ супрессорного действия МСК на пролиферацию Т-лимфоцитов должен быть включен в систему контроля качества МСК в процессе подготовки культур для клинического применения. Наибольшую вариабельность функциональной активности МСК из разных источников наблюдали в экспериментальных системах с использованием в качестве эффекторных клеток В-лимфоцитов или В-клеточных линий. Причем, изменяемые параметры по-разному влияли на характер взаимодействия МСК и В-лимфоцитов, в зависимости от источника получения МСК, а также индивидуальных характеристик культур. Определяющим фактором является соотношение МСК и лимфоцитов: МСК вне зависимости от источника получения подавляли пролиферацию Влимфоцитов при равном соотношении МСК и клеток мононуклеарной фракции. При уменьшении доли МСК супрессивное действие МСК костного мозга, в отличие от МСК жировой ткани и пупочного канатика, было выражено слабо. Изучение изменения ЛПС-индуцированной пролиферации В-лимфоцитов в составе мононуклеарной фракции при сокультивировании с МСК в соотношении экспериментальная 100 модель, к 1 может позволяющая быть выявить использовано как индивидуальные особенности проявления функциональной активности отдельных культур МСК. Таким образом, при данных условиях сокультивирования действие МСК на В-лимфоциты, как и на Т-лимфоциты, носит дозозависимый характер и при снижении доли МСК зависит, в том числе, от характеристик МСК. Кроме того, при анализе влияния МСК на В-лимфоциты важным параметром экспериментальной модели было наличие других иммуннокомпетентных клеток. Наши данные свидетельствуют о том, что при отсутствии других иммуннокомпетентных клеток супрессивное влияние МСК на ЛПС-индуцированную пролиферацию В-лимфоцитов менее выраженно по 108 сравнению с сокультивированием с клетками мононуклеарной фракции. В качестве объяснения этому феномену могут служить полученные недавно данные о том, что подавление пролиферации В-лимфоцитов МСК опосредовано Т-лимфоцитами (Rosado et al., 2015). Хотя результаты, приведенные в цитируемой работе, представляются убедительными, они находятся в противоречии с полученными ранее (Corcione et al., 2006; Nan Che et al., 2012), а также нашими данными. Однако если такое объяснение соответствует действительности, то можно предположить, что при степени чистоты фракции В-лимфоцитов порядка 95% среди клеток могут оставаться Т-лимфоциты, незначительное количество которых, тем не менее, может повлиять на конечный результат. С другой стороны, при сокультивировании выделенных с помощью иммунномагнитной сепарации В-лимфоцитов с МСК, в части экспериментов (две из трех культур МСК жировой ткани и одна их трех культур МСК пупочного канатика) наблюдали стимуляцию пролиферации В-лимфоцитов, что также свидетельствует о зависимости характера влияния МСК на пролиферации В-лимфоцитов от характеристик культур МСК. Согласно литературным данным, также характер взаимодействия МСК и Влимфоцитов может предъявляемого зависеть В-лимфоцитам, от природы стимулирующего принадлежности агента, В-лимфоцитов к субпопуляциям В1а, В1b или В2-клеток и стадии дифференцировки В-клеток (Климович, 2014). Вариабельность действия МСК по отношению к В-лимфоидным клеткам, в зависимости от стадии их дифференцировки была показана при использовании в качестве тест-объектов клеток лимфобластоидных (Namalva) и миеломных (U266) линий по изменению уровня продукции иммуноглобулинов в них. Использованная в работе линия Namalva, полученная из коллекции клеточных культур ИНЦ РАН является сублинией, которая отличается от других сублиний относительно высоким содержанием внутриклеточного IgM и низким уровнем секретируемого IgM (Самойлович и др., 2010). Судя по этим признакам, эта 109 сублиния относится к числу тех, которые представляют собой зрелые Bлимфобласты. Клетки линии U266 - соответствуют зрелым плазматическим клеткам. Усиление продукции внутриклеточного IgM в клетках линии Namalva, наблюдали только в присутствии МСК, полученных из жировой ткани и пупочного канатика, но не костного мозга. МСК костного мозга также не изменяли уровень продукции IgE в миеломных клетках U266, в отличие от МСК из других источников (Айзенштадт и др., 2014). Возможно, лимфоидные клетки, представляющие разные стадии дифференцировки, могут стимулировать МСК различного тканевого происхождения к выработке разных цитокинов и ростовых факторов. Этот аспект взаимодействия МСК и Bлимфоидных клеток остается наименее изученным и требует дальнейших исследований. Использование использования такой клеточных относительно линий с стандартизованной постоянной (за счет пролиферацией и конститутивной продукцией иммуноглобулинов) экспериментальной модели позволило определить дополнительные параметры, влияющие на проявление функциональной активности МСК. Например, факторы, стимулирующие накопление IgE миеломными клетками, продуцировали только пролиферирующие МСК. Представленные результаты могут объяснять ряд имеющихся в литературе противоречий, касающихся способности МСК влиять на продукцию Ig клетками B-лимфоидного ряда. В частности, расхождения в оценке действия МСК жировой ткани на содержание Ig в клетках Namalva и U266 с данными, описанными ранее (Самойлович и др., 2013), могут быть связаны с различиями в фазах роста культур МСК, численном соотношении МСК и лимфоидных клеток, а также в сроках сокультивирования. Исходя из имеющихся литературных данных и наших результатов, можно сделать вывод о мультифакториальности процесса реализации иммуномодулирующего действия МСК на В-лимфоциты. Это, возможно, является отражением того, что в данном случае влияние МСК может быть как стимулирующим, так и супрессивным, что, в свою очередь необходимо для 110 реализации гомеостатических функций МСК в отношении иммунокомпетентных клеток. В ходе наших исследований было показано, что МСК костного мозга имеют ряд недостатков для клинического применения. Кроме таких негативных моментов, как необходимость инвазивной процедуры для получения костного мозга и низкого содержания МСК в нем, наши результаты свидетельствуют о сниженной функциональной активности МСК костного мозга, по сравнению с клетками из других источников, что может затруднять получение достаточного для применения количества клеток. Это является потенциально значимым при системном введении МСК. Кроме того, эффективность применения МСК костного мозга может быть снижена за счет меньшей иммуносупрессорной активности. Например, пролиферация Т- и В-лимфоцитов не изменяется под действием МСК костного мозга, если в смешанной культуре они находятся в низкой концентрации. Это, возможно, также связано со сниженной экспрессией CD90 и меньшей продукцией IL-10 в МСК костного мозга относительно клеток из других источников. Параллельно, в использованных экспериментальных моделях было показано, что функциональная активность МСК пупочного канатика относительно лимфоидных клеток сходна с МСК жировой ткани. Кроме различий, обусловленных источником получения культур МСК, были выявлены индивидуальные особенности функционирования клеток. МСК, выделенные из биологического материала разных доноров, оказывали различное действие на пролиферативную активность В-лимфоцитов – как в присутствии других иммунокомпетентных клеток, так и при сокультивировании с популяцией В-лимфоцитов, выделенных методом иммуномагнитной сепарации, в зависимости от соотношения взаимодействующих клеточных популяций. Функциональную активность МСК также изучали в экспериментах, в которых моделировали одно из звеньев эффекторной фазы аллергических 111 реакций, а именно изменение состояния культивируемых клеток сенсибилизированного организма при повторном контакте с аллергеном. Рецепция аллергена обеспечивается в этом случае специфическими антителами класса IgE, которые либо встроены в мембраны В-лимфоцитов в виде В-клеточного IgE-рецептора (Wu et al., 2014), либо фиксированы на поверхности эозинофилов, базофилов или тучных клеток посредством высокоаффинного Fc-рецептора (Stone et al., 2010). В-лимфоциты отвечают на связывание аллергена продукцией IgE, а клетки гранулоцитарного ряда синтезом IL-4, который в свою очередь стимулирует формирование субпопуляции активированных Т-лимфоцитов. Согласно общепринятому представлению, при разделении клеток периферической крови на фиколле лимфоциты и моноциты задерживаются в верхнем слое градиента, а гранулоциты вместе с эритроцитами оказываются в нижней фракции (Noble et al., 1968). Анализ клеточного состава мононуклеарных фракций, полученных в настоящей работе, показал, что в выделенных популяциях наряду с лимфоцитами присутствовали моноциты и гранулоциты, т. е. все клеточные типы, которые ответственны за появление сдвигов, наблюдаемых при культивировании в присутствии аллергенов. Следует отметить, что группа обследованных доноров была достаточна гетерогенной по типу сенсибилизирующего аллергена, формам и тяжести клинических проявлений атопической гиперчувствительности. Кроме того, отличия касались состава мононуклеарной фракции, в частности процентного содержания гранулоцитов – одних из ключевых участников эффекторного звена аллергических реакций. Тем не менее, в целом изменения состояния клеток мононуклеарной фракции при контакте с аллергенами были достаточно однородными: во всех случаях наблюдали продукцию IgE и IL-4, в большинстве опытов происходил рост численности популяции активированных Т-клеток. В трех образцах (№ 6, 7 и 10) реакции лейкоцитов на внесение в культуру аллергена проявлялись в появлении в культуральной среде IgE и IL-4, но роста численности активированных Т-лимфоцитов в этих пробах не было. 112 Возможно, в указанных случаях темп дифференцировки был замедлен, и накопления клеток к моменту прекращения культивирования не произошло. Проявления иммуномодулирующей активности МСК, полученных из разных источников, в отношении лейкоцитов доноров-аллергиков оказались однозначными. В ходе экспериментов было установлено, что аллогенные МСК предотвращали увеличение относительного содержания Т-лимфоцитов, несущих маркер поздней активации HLA-DR. Увеличение экспрессии маркеров активации лимфоцитов (CD25, CD71, HLA-DR) рассматривают как один из показателей обострения атопических заболеваний, причем уровень экспрессии HLA-DR связывают с тяжестью заболевания (Antúnez et al., 2006; GemouEngesaeth et al., 2002). Полученные результаты согласуются с описанными ранее (Буравкова и др., 2011; Kronsteiner et al., 2011). Сокультивирование клеток мононуклеарных фракций с МСК из разных источников приводило к росту количества регуляторных Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+CD127low, в то время как добавление алларгена в культуральную среду клеток мононуклеарной фракции не оказывало влияния на их численность. Повышение выживаемости и пролиферация Т- регуляторных клеток под влиянием МСК является хорошо описанным феноменом (English et al., 2009, 2013; Duffy, 2011) и рассматривается как один из основных мезханизмов, опосредующих иммуносупрессорное действие МСК. В первую очередь это было показано для Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+CD25+FOXP3 в смешанной культуре МСК и иммуннокомпетентных клеток здоровых доноров. При использовании в качестве тест-объектов клеток мононуклеарной фракции крови пациентов с аллергией на пылевого клеща подобного эффекта не наблюдали (Kapoor et al., 2012). Расхождения могут быть обусловлены индивидуальными особенностями доноров. В частности, в нашей работе изначальное количество Т-регуляторных клеток и степень его изменения в присутствии МСК варьировала в образцах от разных доноров (Айзенштадт и др., 2015). Это хорошо видно при индивидуальном 113 представлении данных по каждому из доноров клеток мононуклеарной фракции (Рис.4.1.). Рис.4.1. Содержание регуляторных Т-лимфоцитов (CD4+,CD25+,CD127low) относительно Т-клеток в составе мононуклеарных фракций после их культивирования в ростовой среде (контроль), или в среде с аллергенами (аллерген), или при сокультивировании с МСК из различных источников в присутствии аллергенов. По оси абсцисс – номера образцов. Звездочки с горизонтальными отрезками находятся над данными, достоверно отличными от контроля (Р<0,05). Различия также могут быть связаны с выбором маркеров для идентификации Т-регуляторных клеток (Klein et al., 2010). Аналогично с результатами нашей работы формирование популяции Т-регуляторных клеток с фенотипом CD4+CD25+CD127low наблюдали при сокультивировании МСК и клеток мононуклеарной фракции пациентов с обострением бронхиальной астмы (Li et al., 2013). Согласно современным представлениям, снижение количества и (или) функциональной активности Т-регуляторных клеток может влиять на развитие аллергической патологии (Akdis et al., 2005). Например, сниженное количество регуляторных Т-клеток было показано у пациентов с бронхиальной астмой и аллергическим ринитом (Ling et al., 2004). С другой стороны, повышение доли CD4+CD25+FOXP3+ Т-регуляторных клеток наблюдали в образцах 114 периферической крови пациентов с атопическим дерматитом, при этом была установлена положительная корреляция между количеством Т-регуляторных клеток, индексом SCORAD (Scoring of atopic dermatitis, Kunz et al., 1997) и содержанием эозинофилов (Ito et al., 2009). Снижение функциональной активности Т-регуляторных клеток может быть компенсировано увеличением их численности (Zhang et al., 2014). Таким образом, действие МСК при аллергии может быть опосредовано индуцированным ими увеличением численности Т-регуляторных клеток. Сокультивирование с МСК также приводило к повышению концентрации IL-10, что может служить одним из возможных механизмов описанного выше снижения доли Т-лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR. Ранее, на Тлимфоцитах толстой кишки было показано, что IL-10 снижает экспрессию HLA-DR и CD86 на T-лимфоцитах (Ebert et al., 2005). Кроме того, IL-10 вызывает снижение экспрессии B7 и HLA-DR на профессиональных антигенпрезентентирующих клетках (Braunstein et al., 1997). Таким образом, увеличение концентрации IL-10 ингибирует процесс презентации антигена. IL-10 синтезируется рядом клеток иммунной системы – регуляторными Т- и В-лимфоцитами, дендритными клетками, Т-хелперами 17 и 2 типа (Kubo, Motomura, 2012). Поэтому в смешанной культуре сложно идентифицировать вклад какого-либо одного типа клеток в наблюдавшееся увеличение концентрации IL-10. Однако само по себе повышение содержания этого цитокина с плейотропным иммуносупрессивным действием (Moore et al., 2001) является важным следствием сокультивирования с МСК. Степень изменения концентрации IL-10 в смешанной культуре МСК и клеток мононуклеарной фракции зависела от источника получения культуры МСК. Максимальные значения концентрации IL-10 были получены при сокультивировании с МСК пупочного канатика, а минимальные – с МСК костного мозга, что совпадает с уровнем экспрессии CD90. 115 МСК блокировали инициированную инкубацией с аллергенами продукцию IL-4 и IgE. Данные, полученные нами in vitro (Айзенштадт и др., 2015), соответствуют результатам исследований, описывающих иммуномодулирующее действие МСК в животных моделях, где было также показано снижение концентрации/продукции как IL-4, так и IgE в периферической крови или бронхо-альвеолярном лаваже при введении МСК (Nemeth et al., 2010; Kavanagh, 2011; Goodwin et al., 2011; Abreu et al., 2013; Cho et al., 2014). С другой стороны, ранее было описано увеличение концентрации IL4 in vitro в присутствии МСК при активации Т-лимфоцитов форболмиристат ацетатом (ФMA) (Laranjeira et al., 2015). Кроме того, повышение продукции IL-4 под воздействием МСК было показано на животных моделях Тх1опосредованных заболеваний, например в модели рассеянного склероза (Bai et al., 2009), острой реакции трансплантат против хозяина (Lim et al., 2014), острого панкреатита (Meng et al., 2013). В нашей работе незначительное увеличение концентрации IL-4 в присутствии МСК было показано in vitro при сокультивировании МСК и клеток мононуклеарной фракции в присутствии ФГА. Таким образом, согласно анализу литературных данных, а также наших результатов, МСК оказывают разнонаправленное действие на продукцию IL-4 в зависимости от стимулирующего агента, предъявляемого иммуннокомпетентным клеткам и соответственно типа иммунного ответа. В случае смещения баланса Тх1/Тх2 в сторону Тх1-опосредованного типа иммунного ответа, МСК приводят к увеличению продукции IL-4, в сторону Тх2 – уменьшению. Возможно, именно концентрация IL-4 является одним из факторов, модулирующих характер проявления функциональной активности МСК. В работе Nemeth K. c соавторами были получены данные, свидетельствующие об активации STAT6-сигнального пути в МСК в ответ на связывание IL4 и/или IL-13 c рецептором IL-4 (IL4R) (Nemeth et al., 2010), в результате возрастает продукция TGFβ. Взаимодействие TGFβ с соответствующим 116 рецептором на поверхности Т-лимфоцитов приводит к подавлению их дифференцировки в Тх2 (Holter et al., 1994). Как было описано выше, продукция TGFβ также может быть вызвана активацияей CD69 на поверхности Т-лимфоцитов. На основе приведенных литературных данных и наших результатов можно предположить, что взаимодействие МСК и компонентов аллергических реакций может быть описано схемой, представленной на Рис.4.2. Рисунок. 4.2. Схема взаимодействия МСК и иммуннокомпетентных клеток при аллергической реакции. АПК – антигенпрезентирующая клетка. Таким образом, МСК, возможно, участвуют в поддержании баланса Тх1/Тх2, нарушение которого является причиной различных иммунопатологических процессов. Соответственно, изменение концентрации IL-4 в культуральной среде в смешанной культуре клеток мононуклеарной 117 фракции и МСК может быть важным показателем чувствительности действия МСК к типу иммунного ответа на активированные тем или иным стимулом иммуннокомпетентные клетки. Наши результаты, полученные при анализе локализации NF-κB в МСК также могут быть косвенным свидетельством того, что лабильность их иммуномодулирующего действия обусловлена активацией в МСК различных сигнальных путей под воздействием соответствующих медиаторов, продуцируемых иммуннокомпетентными клетками. Нами было показано, что взаимодействие МСК с аллерген-активированными клетками мононуклеарной фракции, в отличие от митоген-активированных клеток, не сопровождалось транслокацией NF-κB в ядро МСК. Не было показано зависимости проявления функциональной активности МСК при аллерген-специфических эффекторных реакциях в условиях in vitro от их тканевого происхождения. Для оценки изменения функционального состояния МСК в ходе их взаимодействия с иммунокомпетентными клетками и под влиянием лимфоцитарных митогенов оценивали уровень экспресси Toll-подобных рецепторов 3 и 4, а также локализацию транкрипционного фактора NF-κB в МСК. Согласно нашим и литературным данным, МСК характеризуются достаточно высоким уровнем экспрессии TLR3. Например, в работе RomieuMourez с соавторами (2009) показано, что уровень экспрессии мРНК TLR3 в МСК сопоставим с таковым в макрофагах. Аналогично, в нашей работе уровень экспрессии TLR3 на МСК жировой ткани превышал таковой в лимфоцитах. Экспрессия TLR3 провоспалительного в МСК окружения, может что возрастать при ранее наблюдали воздействии в присутствии провоспалительных цитокинов (Raicevic et al., 2011; Chen et al., 2013). Нами аналогичный эффект был продемонстирован в смешанной культуре МСК с 118 активированными митогенами лимфоцитами. При этом в исследовании Raicevic с соавторами индуцибельное увеличение экспрессии TLR3 (в присутствии провоспалительных цитокинов) описано только на МСК костного мозга и жировой ткани, но не пупочного канатика. Таким образом, был сделан вывод о тканевой специфичности МСК из разных источников (Raicevic et al., 2011). Однако в нашей работе не было отмечено отличий в уровне экспрессии TLR3 в МСК различного тканевого происхождения. Расхождения могут быть объяснены тем, что мы получали МСК из периваскулярного пространства пупочной вены, а в цитируемом исследовании – из Вартонова студня. Известно, что МСК из периваскулярного пространства отличаются от получаемых из Вартонова студня как в плане пролиферативного и дифференцировочного потенциалов, так и по их иммуномодулирующим свойствам (напр. Carvalho et al., 2011). Кроме того, на свойства МСК в значительной мере могут влиять условия культивирования. Также увеличение уровня экспрессии TLR3, хотя и не столь значительное, мы наблюдали при культивировании МСК в присутствии ЛПС. ЛПС не является лигандом TLR3, но может стимулировать экспрессию TLR3 через TLR4-MyD88-IRAK-TRAF6NF-κB-зависимый сигнальный путь (Pan et al., 2011). В отличие от TLR3 уровень экспрессии TLR4 на поверхности МСК вне зависимости от их тканевого происхождения был трудно детектируемым с помощью метода проточной цитофлуорометрии. Это противоречит данным Opitz с соавторами (2009) и Chen с соавторами (2013), свидетельствующим о высоком уровне экспрессии TLR4, но соответствует результатам, полученным в других лабораториях (Romieu-Mourez et al., 2013; Raicevic et al., 2011). При этом и в цитируемых работах, и в нашем исследовании не наблюдали индуцируемого увеличения уровня экспрессии TLR4. Влияние TLR3 и TLR4 на проявляение функциональной активности МСК по отношению к иммуннокомпетентным клеткам до конца не понятно. В частности, на примере изменения пролиферативной активности Т-лимфоцитов, разными группами авторов было показано, что под воздействием лигандов 119 TLR4 происходит снижение (Liotta et al., 2008; Raicevic et al., 2011; Waterman et al., 2010; van den Berk et al., 2010) или повышение (Opitz et al., 2009; Tomic et al., 2011) иммуносупрессорной активности МСК. Аналогично, противоречивые данные получены о влиянии активации TLR3: усиление иммуносупрессивных свойств описано, как минимум, в четырех исследованиях (Chen et al., 2013; Opitz et al., 2009; Waterman et al., 2010; Tomic et al., 2011), обратный эффект – в двух (Liotta et al., 2007; Raicevic et al., 2011), отсутсвие влияния лигандов TLR3 – в работе Lombardo c соавторами (2009). Единичные работы посвящены влиянию TLR-опосредованного сигналинга на взаимодействие МСК с ЕК (добавление лигандов TLR3 и 4 препятствует лизису МСК ЕК) (Giuliani et al., 2013) и с В-лимфоцитами (воздействие на МСК лигандов TLR4 приводит к увеличению экспрессии фактора активации В-лимфоцитов, BAFF) (Yan et al., 2014). При сопоставлении результатов, полученных в разных работах, значимыми могут быть различия в уровне экспрессии TLR3 в МСК под воздействием провоспалительных цитокинов на эти клетки или при сокультивировании их с иммунокомпетентными клетками. Дополнительными источниками противоречий в результатах могут быть вариации в постановке экспериментов (соотношение клеток, концентрации лигандов и т.д.), а также индивидуальные различия доноров биологического материала (Romieu-Mourez et al., 2009). Несмотря на существующие в литературе разногласия, во всех исследованиях было показано, что культуры МСК являются однородными по экспрессии TLR3 и TLR4. Не было описано присутствия двух или более популяций МСК, которые можно было бы отличить по уровню экспрессии этих рецепторов. Таким образом, субтипы МСК, описанные в работе Waterman c соавторами (2010), соответствующими по-видимому, лигандами возникают только что свою TLR, в при индукции очередь может свидетельствовать о том, что субтипы МСК – это их функциональные состояния, возникающие при «лицензировании» клеток. 120 Передача сигнала от TLR осуществляется по нескольким сигнальным путям, которые связаны с транскрипционным фактором NF-κB (Takeda, Akira, 2005). Согласно, нашим результатам, транслокация NFκB в ядро происходит в МСК из всех источников при взаимодействии с клетками мононуклеарной фракции, активированными митогенами, а также под влиянием непосредственно лимфоцитарных митогенов: ЛПС и ФГА. ЛПС является классическим лигандом TLR4, способным активировать NF-κB- опосредованный сигнальный путь (Takeda, Akira, 2005). Для митогена Тлимфоцитов ФГА также не так давно была показана возможность связывания с TLR4 (Unitt et al., 2011). Воздействие и ЛПС, и ФГА приводило к транслокации транскрипционного фактора NF-κB в ядро МСК уже через 30 минут после их добавления в культуральную среду. Ядерный импорт NF-κB в МСК под воздействием ЛПС сопровождался увеличением концентрации IL-6 в культуральной среде, а инкубация с ФГА не вызывала значимого увеличения концентрации IL-6, не смотря на транслокацию транскрипционного фактора в ядро. Повышение концентрации IL-6 при воздействии ЛПС на МСК происходило во всех проанализированных культурах, вне зависимости от источника получения. Однако, в МСК пупочного канатика, увеличение экспрессии IL-6 было менее значительным по сравнению с МСК костного мозга и жировой ткани. Экпрессия IL-6 регулируется транскрипционными факторами NF-IL6 (Akira et al., 1992) и NF-kB (Novotny et al., 2008). Ранее значительное увеличение экспрессии IL-6 в МСК в ответ на воздействие ЛПС было показано в нескольких работах (Giuliani et al., 2014; Romieu-Moures et al., 2009; Dorronsoro et al., 2014). В упоминавшейся выше работе Raicevic наблюдали, что инкубация с ЛПС стимулировала продукцию IL-6 в МСК костного мозга и жировой ткани, но не в МСК пупочного канатика (Raicevic et al., 2011). Различия, возможно также, обусловлены использованием МСК из разных регионов пупочного канатика. 121 С одной стороны, наблюдаемый эффект является ожидаемым, т.к. активация TLR4-NFkB-сигнальных путей под влиянием ЛПС - хорошо известный факт, но, с другой стороны, как было описано выше, TLR4 на поверхности МСК является трудно-детектируемым с помощью проточной цитофлуорометрии, что свидетельствует об очень низкой плотности этого рецептора на поверхности МСК. Кроме того, известно, что связыванию ЛПС с TLR4 предшествует взаимодействие ЛПС с CD14, который является корецептором TLR4 (Park, Lee, 2013). Этот этап является необходимым для функционирования сигнального пути, особенно при низких концентрациях ЛПС (Zeuner et al., 2015). МСК из всех источников характеризуются отсутствием экспрессии CD14 на их поверхности, что мы также наблюдали на проанализированных культурах. Возможно, аффинитет связывания TLR4 c ЛПС может быть высоким и, поэтому, такой уровень экспрессии TLR4 является достаточным для активации соответствующих сигнальных путей под действием ЛПС. Также наличие CD14 является критичным при низких концентрациях ЛПС (1 нг/мл), а в нашей работе ЛПС использовали в относительно высокой концентрации – 10 нг/мл. Кроме того, в качестве корецептора TLR4 при воздействии ЛПС могут функционировать CD44 и CD36, тирозин киназа Lyn (Płociennikowska et al., 2015). В свою очередь ФГА, видимо, обладает меньшей эффективностью связывания с TLR4, чем ЛПС. Кроме того, ФГА частично может взаимодействовать с гетеродимером TLR2/6 (Unitt et al., 2011), который также экспрессируется в МСК (Grote et al., 2013). То есть, ЛПС и ФГА различаются по характеру взаимодействия с Toll-подобными рецепторами МСК, что проявлялось в наших экспериментах в разном влиянии на морфологию клеток и уровень продукции IL-6. Кроме того, ЛПС, в отличие от ФГА, был способен усиливать экспрессию TLR3. Таким образом, прямое воздействие лимфоцитарных митогенов на МСК способно индуцировать в них активацию сигнальных каскадов, приводящих к 122 транслокации NF-kB в ядро, что является необходимым условием для транскрипции генов, регулируемых этим транскрипционным фактором. Это может быть одним из вероятных объяснений расхождения результатов, полученных in vitro при сокультивировании МСК с имммунокомпетентными клетками, активированными различными стимулами, а также с данными о процессах, происходящих в МСК под воздействием отдельных провоспалительных цитокинов. Скорее всего, роль, которую МСК могут играть в месте воспаления является намного более сложной, чем представлялось ранее. Учитывая динамический контроль клеточного ответа, опосредованного NFκB (Covert et al., 2005), важным было сопоставить сроки транслокации NF-κB в ядро МСК при их сокультивировании с активированными клетками мононуклеарной фракции по сравнению с добавлением в среду только митогенов. Согласно нашим данным, в смешанной культуре транслокация NFκB в МСК происходит на более поздних сроках по сравнению с воздействием лимфоцитарных митогенов на монокультуру МСК: временной интервал в первом случае на 30-60 мин больше, чем во втором. Возможно, в смешанной культуре МСК и клеток мононуклеарной фракции часть молекул стимулирующего агента (митогенов) сначала взаимодействует с лимфоцитами, приводя к экспрессии в них провоспалительных цитокинов, которые в свою очередь действуют на МСК, либо влияя на межклеточные взаимодействия между ними и имммунокомпетентными клетками. Одним из цитокинов, активирующим NF-κB-опосредованный сигнальный путь, может быть TNF-α (English et присутствующим al., 2007), который на поверхности связывается с TNFR1, МСК (Dorronsoro et al., 2014). В подтверждение этому, импорт транскрипционного фактора NF-κB в ядро МСК мы наблюдали через 30 минут после начала воздействия TNFα. Процессы активации NF-κB-опосредованных сигнальных путей непосредственно под действием лимфоцитарных митогенов и под влиянием медиаторов, выделяемых иммунокомпетентными клетками, могут идти 123 параллельно. Свидетельством такому предположению может являться наблюдение о том, что в части популяции МСК в смешанной культуре транслокацию NF-κB наблюдали на ранних сроках. Кроме того, при сокультивировании с активированными митогеном клетками мононуклеарной фракции ядерная локализация NF-κB в МСК сохранялась в течение 24 ч, что существенно превышает время транслокации под влиянием TNFα. TNFα вызывает кратковременный пик активности IKK, и TNFα-индуцированная активация NF-κB завершается в течение примерно 8 часов. В наших экспериментах ядерная локализация NF-κB в МСК сохранялась в течение 4 часов после воздействия TNFα, затем NF-κB обнаруживался преимущественно в цитоплазме клеток. Напротив, ядерная локализация NF-κB в результате активации TLR сохраняется на более поздних сроках, чем при активации TNFR. Это происходит за счет экспрессии генов цитокинов, которые обеспечивают положительную обратную связь, усиливая, таким образом, позднюю активацию IKK (Werner et al., 2008). Концентрация IL-6 в присутствии как ЛПС, так и ФГА, была значительно выше в смешанной культуре МСК и клеток мононуклеарной фракции по сравнению с активированными этими митогенами монокультурами. При этом, видимо, происходило увеличение продукции IL-6 и в МСК, и в иммунокомпетентных клетках, но не только под действием митогенов, а и как результат взаимного влияния компонентов смешанной культуры. Описанные процессы наблюдали при анализе всех образцов МСК, но наибольшее увеличение продукции IL-6 происходило при сокультивировании с МСК жировой ткани. Приведенные выше данные являются возможным объяснением различий в профилях экспрессии МСК, полученных при сокультивировании МСК с активированными лимфоцитами и под воздействием отдельных провоспалительных факторов, которые они синтезируют (Crop et al., 2010). Транслокация NF-κB в МСК не происходила при их сокультивировании с интактными клетками мононуклеарной фракции, что может служить 124 косвенным подтверждением компонентов осуществления иммунной ими необходимости системы, т.е. поступления «лицензирования» иммуномодулирующих свойств. сигнала от МСК для Однако следует упомянуть исследование Dorronsoro c соавторами (2014), в котором ядерная транслокация NF-κB в МСК была показана при их сокультивировании с неактивированными Т-лимфоцитами, которые были выделены с помощью иммунномагнитной сепарации. В этом случае активация лимфоцитов могла произойти в процессе выделения Т-лимфоцитов из мононуклеарной фракции. При этом в смешанной культуре МСК и активированных Т-лимфоцитов (стимуляцию Т-лимфоцитов проводили частицами, покрытыми антителами против CD3/СD28 и IL-2) авторы наблюдали транслокацию уже через 30 минут после начала сокультивирвоания. Также наши данные отличаются от полученных в исследовании Chen c соавторами, которые наблюдали транслокациию NF-κB при воздействии ЛПС на МСК не ранее, чем через 2 часа (Chen et al., 2013). Таким образом, сроки транслокации NF-κB могут изменяться в зависимости от условий постановки эксперимента, иллюстрируя пластичность проявления функциональной активности МСК в зависимости от параметров экспериментальных систем. Дополнительным фактором, влияющим на сроки транслокации NF-κB, согласно нашим данным, является наличие прямого межклеточного контакта между МСК и иммунокомпетентными клетками. Необходимость межклеточного контакта для реализации иммуномодулирующих свойств МСК до сих пор является дискуссионным вопросом. По итогам анализа литературы, можно заключить, что ведущую роль в реализации иммуномодулирующего действия МСК играют растворимые паракринные факторы (Meisel et al., 2004; Sato et al., 2007; Jones et al., 2008; Yañez et al., 2010), но наличие физического контакта между МСК и лимфоцитами дополнительно модулирует наблюдаемые эффекты (Quaedackers et al, 2009). Вероятно, в отсутствии межклеточного контакта, в МСК активируются другие сигнальные пути по сравнению прямым взаимодействием МСК и иммуннокомпетентных клеток. 125 Этот аспект межклеточных взаимодействий с участием МСК практически не изучен. Таким образом, показано, что проявление функциональной активности МСК по отношению к компонентам иммунной системы зависит от ряда факторов. Учитывая лабильность взаимодействия МСК и эффекторных клеток, можно говорить о том, что многочисленные данные, накопленные в литературе на данный момент, могут рассматриваться не как противоречащие, а как дополняющие друг друга. Поэтому использование различных экспериментальных систем, как in vitro, так и in vivo, при исследовании функциональной активности МСК является необходимым для эффективного и безопасного применения МСК в клинической практике. При этом для максимальной результативности клеточной терапии необходима разработка функциональных тестов для культур МСК в зависимости от нозологии, при которой будет осуществляться их применение. Подобные тесты необходимо проводить с клеточным материалом конкретного пациента, для которого планируется такое лечение. 126 Выводы 1. Из периваскулярного пространства пупочного кантика и жировой ткани можно получить МСК в большем количестве и с более высоким пролиферативным потенциалом, чем из аспирата костного мозга. 2. Культуры МСК из костного мозга, жировой ткани и пупочного канатика сходны по морфологическим признакам, обладают одинаковым содержанием клеток, несущих МСК-ассоциированные маркеры, за исключением CD10 и CD13, но отличаются по уровню экспрессии CD90. 3. Модулирующее действие МСК на Т-лимфоциты является общим свойством МСК, выделенных дозозависимом экспрессии из разных подавлении раннего источников, пролиферации маркера активации, которое проявляется Т-лимфоцитов, а также в стимуляции блокировании индуцированного увеличения экспрессии позднего маркера активации Тлимфоцитов. 4. Проявления функциональной активности МСК в экспериментальных моделях с использованием в качестве тест-объектов В-лимфоидных клеток зависит от ряда факторов, таких как соотношение МСК и эффекторных клеток, присутствие в смешанной культуре других иммунокомпетентных клеток, стадия дифференцировки В-клеток, а также источник получения и фаза роста культуры МСК. 5. При моделировании эффекторной фазы аллергических реакций in vitro аллогенные МСК вне зависимости от тканевого происхождения блокируют индуцированную аллергенами продукцию IgE и IL-4 и предотвращают увеличение относительного содержания Т-лимфоцитов, несущих поздний маркер активации HLA-DR. 6. Под влиянием лимфоцитарных митогенов, а также в ходе взаимодействия МСК с иммунокомпетентными клетками, активированными этими митогенами, в МСК происходит изменение функционального состояния, которое проявляется в транслокации транскрипционного фактора NFkB и изменении уровня экспрессии TLR3. 127 Благодарности. Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю Марине Платоновне Самойлович за неоценимую помощь на всех этапах работы. Большую благодарность выражаю Александру Борисовичу Смолянинову , без которого было бы невозможно проведение данного исследования. Хочу выразить глубокую признательность Владимиру Борисовичу Климовичу за плодотворное обсуждение результатов и мудрые советы при написании диссертации. Также хотелось бы поблагодарить весь коллектив ООО «Покровский банк стволовых клеток» за всестороннюю поддержку и создание условий для выполнения работы, особенно Хрупину А.С., Золину Т.Л., Александрову Л.В., Багаеву В.В. и Супильникову О.В. Отдельно благодарю Енукашвили Н.И. за ценные комментарии к тексту диссертации. Выражаю благодарность Савинцеву А.М. и Адылову Ш.Ф. за предоставление образцов жировой ткани и костного мозга. Искреннюю благодарность выражаю Пинаеву Г.П. , Кропачевой И.В. и Бобкову Д.Е. за обучение основным подходам при работе с клеточными культурами. В завершение благодарю свою семью за понимание и поддержку. 128 Список литературы. 1. Айзенштадт А.А., Иванова Н.А., Багаева В.В., Смолянинов А.Б., Самойлович М.П., Климович В.Б. Внутрикличеточные иммуноглобулины в линиях Namalva и U266 при сокультивировании с мезенхимными клетками // Цитология – 2014. – Т. 56. – № 2. – С. 117-121. 2. Айзенштадт А.А., Супильникова О.В., Смолянинов А.Б. Влияние мезенхимных стволовых клеток на продукцию IL-4 и IgE активированными аллергеном лимфоцитами. // Вестник СЗГМУ им. И.И. Мечникова – 2014. – Т. 6. – С. 43-48. 3. Айзенштадт А.А., Супильникова О.В., Багаева B.B., Смолянинов А.Б., Самойлович М.П., Климович В.Б. Влияние мезенхимных стволовых клеток на аллерген-специфические реакции лейкоцитов при атопической гиперчувствительности // Цитология – 2015. – № 3. – Т. 57. – С. 197-203. 4. Андреева Е.Р., Андрианова И.В., Бобылева П.И., Горностаева А.Н., Буравкова Л.Б. Фенотипическая характеристика лимфоцитов человека после взаимодействия с мезенхимальными стромальными клетками //Физиология человека – 2013. – № 5. – С. 93–98. 5. Буравкова Л.Б., Гринаковская О.С., Андреева Е.Р., Жамбалова А.П., Козионова М.П. Характеристика мезенхимных стромальных клеток из липоаспирата человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода //Цитология. – 2009. – Т. 51. – №. 1. – С. 5-11. 6. Гранов А.М., Жаринов Г.М., Зверев О.Г., Некласова Н.Ю., Агафонова М.В., Климович В.Б. Способ лечения аллергических заболеваний //Патент РФ № № 2250773 - 2005. 7. Земелько В.И., Гринчук Т.М., Домнина А.П., Арцыбашева И.В., Зенин В.В., Кирсанов А.А., Бичевая Н.К., Корсак В.С., Никольский Н.Н. Мультипотентные мезенхимные стволовые клетки десквамированного эндометрия. Выделение, характеристика и использование в качестве фидерного слоя для культивирования эмбриональных стволовых линий человека //Цитология. – 2011. – Т. 53. – №. 12. – С. 919-929. 8. Климович В.Б. Иммуномодулирующая активность стромальных (стволовых) клеток //Медицинская иммунология. – 2014. – Т. 16. – №. 2. – С. 107-126. 9. Кругляков П.В., Лохматова Е.Л., Климович В.Б., Зарицкий А.Ю. Мезенхимные стволовые клетки и иммунопатологические состояния организма // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. – 2006. – Т. 1. – №. 3. – С. 36-41 129 10. Крылова Т.А., Быстрова О.А., Худяков А.А., Малашичева А.Б., Моисеева О.М., Зенин В.В., Мартынова М.Г. Сравнительные характеристики стволовых клеток, изолированных из подкожной и субэпикардиальной жировой ткани //Цитология. – 2014. – Т. 56. – №. 3. 11. Пиневич А.А., Самойлович М.П., Шашкова О.А., Вартанян Н.Л., Полысалов В.Н., Киселева Л.Н., Карташев А.В., Айзенштадт А.А., Климович В.Б. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток при раке молочной железы // Клеточные технологии в биологии и медицине – 2014. – Т.2. – С.84-91. 12. Ройт A., Бростофф Дж //Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ.-М.: Мир. – 2000. 13. Самойлович М.П., Пиневич А.А., Вартанян Н.Л., Климович В.Б. Продукция IgM и J-цепи B-лимфобластоидными клеточными линиями //Клеточные культуры. Информационный бюллетень. – 2010. – Т.25. – С. 15-24. 14. Самойлович М.П., Пиневич А.А., Шашкова О.А., Вартанян Н.Л., Киселева Л.Н., Климович В.Б. Влияние мезенхимных стромальных клеток на рост Bклеточных линий и синтез ими иммуноглобулинов //Цитология. – 2013. – Т.55. – №.1. – С.45-51. (Samoylovich M.P., Pinevich A.A., Shashkova O.A., Vartanian N.L., Kiseleva L.N., Klimovich V.B. The influence of mesenchymal stromal cells on B-cell line growth and immunoglobulin synthesis //Cell and Tissue Biology. – 2013. – Т. 7. – №. 3. – С. 227-234.). 15. Фриденштейн А.Я., Петракова К.В., Куролесова А.И., Фролова Г.П. Клетк и предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантантов костного мозга. //Цитология. – 1968. – Т. 5. – №. 557. – С. 67. 16. Хайдуков С.В., Зурочка А.В. Тотолян А.А., Черешнев В.А. Основные и малые популяции лимфоцитов периферической крови человека и их нормативные значения (методом многоцветного цитометрического анализа) //Медицинская иммунология. – 2009. – Т. 11. – №. 2-3. – С. 227238. 17. Abreu S.C., Antunes M.A., de Castro J.C., de Oliveira M.V., Bandeira E., Ornellas D.S., Diaz B.L., Morales M.M., Xisto D.G., Rocco P.R. Bone marrow-derived mononuclear cells vs. mesenchymal stromal cells in experimental allergic asthma //Respiratory physiology & neurobiology. – 2013. – V. 187. – №. 2. – P. 190-198. 18. Airas L., Niemelä J., Salmi M., Puurunen T., Smith D.J., Jalkanen S. Differential regulation and function of CD73, a glycosyl-phosphatidylinositol– 130 linked 70-kD adhesion molecule, on lymphocytes and endothelial cells //The Journal of cell biology. – 1997. – V. 136. – №. 2. – P. 421-431. 19. Akira S., Isshili H., Nakajima T., Kinoshite S., Nishio Y., Natsuka S., Kishimoto T. Regulation of Expression of the Interleukin 6 Gene: Structure and Function of the Transcription Factor NF-IL6 //Ciba Foundation Symposium 167-Polyfunctional Cytokines: IL-6 and LIF. – John Wiley & Sons, Ltd., 1992. – С. 47-67. 20. Akdis M., Blaser K., Akdis C. A. T regulatory cells in allergy: novel concepts in the pathogenesis, prevention, and treatment of allergic diseases //Journal of allergy and clinical immunology. – 2005. – Т. 116. – №. 5. – С. 961-968. 21. Akira S., Takeda K. Toll-like receptor signalling //Nature reviews immunology. – 2004. – Т. 4. – №. 7. – С. 499-511 22. Alkim C., Balci M., Alkim H., Dağli U., Parlak E., Tezel A., Ulker A. The importance of peripheral immune cells in inflammatory bowel disease //Turk J Gastroenterol. – 2007. – V. 18. – №. 2. – P. 82-88. 23. Amé-Thomas P., Hajjami H.M.-E., Monvoisin C., Jean R., Monnier D., CauletMaugendre S., Guillaudeux T., Lamy T., Fest T., Tarte K. Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis //Blood. – 2007. – V. 109. – №. 2. – P. 693-702. 24. Anderson P., Carrillo-Gálvez A.B., García-Pérez A., Cobo M., Martín F. CD105 (endoglin)-negative murine mesenchymal stromal cells define a new multipotent subpopulation with distinct differentiation and immunomodulatory capacities //PloS one. – 2013. – V. 8. – №. 10. – P. e76979. 25. Antúnez C., Torres M.J., Mayorga C., Corzo J.L., Jurado A., Santamaría-Babi L.F., Vera A., Blanca M. Cytokine production, activation marker, and skin homing receptor in children with atopic dermatitis and bronchial asthma //Pediatric allergy and immunology. – 2006. – V. 17. – №. 3. – P. 166-174. 26. Araki H., Yoshinaga K., Boccuni P., Zhao Y., Hoffman R., Mahmud N. Chromatin-modifying agents permit human hematopoietic stem cells to undergo multiple cell divisions while retaining their repopulating potential //Blood. – 2007. – V. 109. – №. 8. – P. 3570-3578. 27. Aruffo A., Stamenkovic I., Melnick M., Underhill C.B., Seed B. CD44 is the principal cell surface receptor for hyaluronate //Cell. – 1990. – V. 61. – №. 7. – P. 1303-1313. 131 28. Arthur A., Zannettino A., Gronthos S. The therapeutic applications of multipotential mesenchymal/stromal stem cells in skeletal tissue repair //Journal of cellular physiology. – 2009. – V. 218. – №. 2. – P. 237-245. 29. Asari S., Itakura S., Ferreri K., Liu C.P., Kuroda Y., Kandeel F., Mullen Y. Mesenchymal stem cells suppress B-cell terminal differentiation //Experimental hematology. – 2009. – V. 37. – №. 5. – P. 604-615. 30. Asea A., Rehli M., Kabingu E., Boch J.A., Bare O., Auron P.E., Stevenson M.A., Calderwood S.K. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70 role of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 //Journal of Biological Chemistry. – 2002. – V. 277. – №. 17. – P. 15028-15034. 31. Aslan H., Zilberman Y., Kandel L., Liebergall M., Oskouian R.J., Gazit D., Gazit Z. Osteogenic Differentiation of Noncultured Immunoisolated Bone Marrow-Derived CD105+ Cells //Stem Cells. – 2006. – V. 24. – №. 7. – P. 1728-1737. 32. Aust L., Devlin B., Foster S.J., Halvorsen Y.D., Hicok K., du Laney T., Sen A., Willingmyre G.D., Gimble J.M. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates //Cytotherapy. – 2004. – V. 6. – №. 1. – P. 7-14. 33. Bai L., Lennon D.P., Eaton V., Maier K., Caplan A.I., Miller S.D., Miller R.H. Human bone marrow‐ derived mesenchymal stem cells induce Th2‐ polarized immune response and promote endogenous repair in animal models of multiple sclerosis //Glia. – 2009. – V. 57. – №. 11. – P. 1192-1203. 34. Baksh D., Yao R., Tuan R.S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow //Stem cells. – 2007. – V. 25. – №. 6. – P. 1384-1392. 35. Basak S., Hoffmann A. Crosstalk via the NF-κB signaling system //Cytokine & growth factor reviews. – 2008. – V. 19. – №. 3. – P. 187-197. 36. Bartholomew A., Sturgeon C., Siatskas M., Ferrer K., McIntosh K., Patil S., Hardy W., Devine S., Ucker D., Deans R., Moseley A., Hoffman R. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitroand prolong skin graft survival in vivo. //Experimental hematology. – 2002. – V. 30. – №. 1. – P. 42-48. 37. Basciano L., Nemos C., Foliguet B., de Isla N., de Carvalho M., Tran N., Dalloul A. Long term culture of mesenchymal stem cells in hypoxia promotes a genetic program maintaining their undifferentiated and multipotent status //BMC cell biology. – 2011. – V. 12. – №. 1. – P. 12. 132 38. Batten P., Sarathchandra P., Antoniw J.W., Tay S.S., Lowdell M.W., Taylor P.M., Yacoub M.H. Human mesenchymal stem cells induce T cell anergy and downregulate T cell allo-responses via the TH2 pathway: relevance to tissue engineering human heart valves. //Tissue engineering. – 2006. – V. 12. – №. 8. – P. 2263-2273. 39. Baudin B., Bruneel A., Bosselut N., Vaubourdolle M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells //Nature protocols. – 2007. – V. 2. – №. 3. – P. 481-485. 40. Ben-Ami E., Berrih-Aknin S., Miller A. Mesenchymal stem cells as an immunomodulatory therapeutic strategy for autoimmune diseases //Autoimmunity reviews. – 2011. – V. 10. – №. 7. – P. 410-415. 41. Béné M.C. Immunophenotyping of acute leukaemias //Immunology letters. – 2005. – V. 98. – №. 1. – P. 9-21. 42. van den Berk L.C., Jansen B.J., Siebers-Vermeulen K.G., Roelofs H., Figdor C.G., Adema G.J., Torensma R. Mesenchymal stem cells respond to TNF but do not produce TNF //Journal of leukocyte biology. – 2010. – V. 87. – №. 2. – P. 283-289. 43. Bernabeu C., Conley B.A., Vary C.P.H. Novel biochemical pathways of endoglin in vascular cell physiology //Journal of cellular biochemistry. – 2007. – V. 102. – №. 6. – P. 1375-1388. 44. Bestard O., Cruzado J.M., Mestre M., Caldés A., Bas J., Carrera M., Torras J., Rama I., Moreso F., Serón D., Grinyó J.M. Achieving donor-specific hyporesponsiveness is associated with FOXP3+ regulatory T cell recruitment in human renal allograft infiltrates //The Journal of Immunology. – 2007. – V. 179. – №. 7. – P. 4901-4909. 45. Bhagwat S.V., Lahdenranta J., Giordano R., Arap W., Pasqualini R., Shapiro L.H. CD13/APN is activated by angiogenic signals and is essential for capillary tube formation //Blood. – 2001. – V. 97. – №. 3. – P. 652-659. 46. Bianco P., Gehron R.P. Marrow stromal stem cells //J.Clin.Invest. – 2000. – V.105. – P. 1663-1668. 47. Bielby R., Jones E., McGonagle D. The role of mesenchymal stem cells in maintenance and repair of bone //Injury. – 2007. – V. 38. – №. 1. – P. S26-S32. 48. Bocelli-Tyndall C., Bracci L., Spagnoli G., Braccini A., Bouchenaki M., Ceredig R., Pistoia V., Martin I., Tyndall A. Bone marrow mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) from healthy donors and auto-immune disease patients reduce the proliferation of autologous-and allogeneic-stimulated lymphocytes in vitro //Rheumatology. – 2007. – V. 46. – №. 3. – P. 403-408. 133 49. Boumaza I., Srinivasan S., Witt W.T., Feghali-Bostwick C., Dai Y., GarciaOcana A., Feili-Hariri M. Autologous bone marrow-derived rat mesenchymal stem cells promote PDX-1 and insulin expression in the islets, alter T cell cytokine pattern and preserve regulatory T cells in the periphery and induce sustained normoglycemia //Journal of autoimmunity. – 2009. – V. 32. – №. 1. – P. 33-42. 50. Braga M., Quecchia C., Cavallucci E., Di Giampaolo L., Schiavone C., Petrarca C., Di Gioacchino M. T regulatory cells in allergy //International journal of immunopathology and pharmacology. – 2010. – V. 24. – №. 1 Suppl. – P. 55S64S. 51. Braunstein J., Qiao L, Autschbach F, Schürmann G, Meuer S.. T cells of the human intestinal lamina propria are high producers of interleukin-10 //Gut. – 1997. – V. 41. – №. 2. – P. 215-220. 52. Burr S.P., Dazzi F., Garden O.A. Mesenchymal stromal cells and regulatory T cells: the Yin and Yang of peripheral tolerance&quest //Immunology and cell biology. – 2013. – V. 91. – №. 1. – P. 12-18. 53. Campioni D., Rizzo R., Stignani M., Melchiorri L., Ferrari L., Moretti S., Russo A., Bagnara G.P., Bonsi L., Alviano F., Lanzoni G., Cuneo A., Baricordi O.R., Lanza F. A decreased positivity for CD90 on human mesenchymal stromal cells (MSCs) is associated with a loss of immunosuppressive activity by MSCs //Cytometry Part B: Clinical Cytometry. – 2009. – V. 76. – №. 3. – P. 225-230. 54. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells //Journal of orthopaedic research. – 1991. – V. 9. – №. 5. – P. 641-650. 55. Cappellesso-Fleury S., Puissant-Lubrano B., Apoil P.A., Titeux M., Winterton P., Casteilla L., Bourin P., Blancher A. Human fibroblasts share immunosuppressive properties with bone marrow mesenchymal stem cells //Journal of clinical immunology. – 2010. – V. 30. – №. 4. – P. 607-619. 56. Carvalho M., Teixeira F.G., Reis R.L., Sousa N., Salgado A.J. Mesenchymal stem cells in the umbilical cord: phenotypic characterization, secretome and applications in central nervous system regenerative medicine //Current stem cell research & therapy. – 2011. – V. 6. – №. 3. – P. 221-228. 57. Casiraghi F., Azzollini N., Cassis P., Imberti B., Morigi M., Cugini D., Cavinato R.A., Todeschini M., Solini S., Sonzogni A., Perico N., Remuzzi G., Noris M. Pretransplant infusion of mesenchymal stem cells prolongs the survival of a semiallogeneic heart transplant through the generation of regulatory T cells //The Journal of Immunology. – 2008. – V. 181. – №. 6. – P. 3933-3946. 58. Castonguay R., Werner E.D., Matthews R.G., Presman E., Mulivor A.W., Solban N., Sako D., Pearsall R.S., Underwood K.W., Seehra J., Kumar 134 R., Grinberg A.V. Soluble endoglin specifically binds bone morphogenetic proteins 9 and 10 via its orphan domain, inhibits blood vessel formation, and suppresses tumor growth //Journal of Biological Chemistry. – 2011. – V. 286. – №. 34. – P. 30034-30046. 59. Cazac B.B., Roes J. TGF-β receptor controls B cell responsiveness and induction of IgA in vivo //Immunity. – 2000. – V. 13. – №. 4. – P. 443-451. 60. Che N., Li X., Zhou S., Liu R., Shi D., Lu L., Sun L. Umbilical cord mesenchymal stem cells suppress B-cell proliferation and differentiation //Cellular immunology. – 2012. – V. 274. – №. 1. – P. 46-53. 61. Chen F.E., Huang D.B., Chen Y.Q., Ghosh G. Crystal structure of p50/p65 heterodimer of transcription factor NF-κB bound to DNA //Nature. – 1998. – V. 391. – №. 6665. – P. 410-413. 62. Chen D., Ma F., Xu S., Yang S., Chen F., Rong L., Chi Y., Zhao Q., Lu S., Han Z., Pang A., Han Z. Expression and role of Toll-like receptors on human umbilical cord mesenchymal stromal cells //Cytotherapy. – 2013. – V. 15. – №. 4. – P. 423-433. 63. Cheifetz S., Bellon T., Cales C., Vera S., Bernabeu C., Massague J., Letarte M. Endoglin is a component of the transforming growth factor-beta receptor system in human endothelial cells //Journal of Biological Chemistry. – 1992. – V. 267. – №. 27. – P. 19027-19030. 64. Cho K.S., Park M.K., Kang S.A., Park H.Y., Hong S.L., Park H.K., Yu H.S., Roh H.J. Adipose-Derived Stem Cells Ameliorate Allergic Airway Inflammation by Inducing Regulatory T Cells in a Mouse Model of Asthma //Mediators of inflammation. – 2014. – V. 2014. 65. Conconi M.T., Di Liddo R., Tommasini M., Calore C., Parnigotto P.P. Phenotype and differentiation potential of stromal populations obtained from various zones of human umbilical cord: an overview // The Open Tissue Eng Regen Med J. – 2011. – V. 4. – P. 6-20. 66. Corcione A., Benvenuto F., Ferretti E., Giunti D., Cappiello V., Cazzanti F., Risso M., Gualandi F., Mancardi G.L., Pistoia V., Uccelli A. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions //Blood. – 2006. – V. 107. – №. 1. – P. 367-372. 67. Corrigan C.J., Kay A.B. CD4 T-lymphocyte activation in acute severe asthma: relationship to disease severity and atopic status //American Review of Respiratory Disease. – 1990. – V. 141. – №. 4. – P. 970-977. 68. Corthay A. How do regulatory T cells work? //Scandinavian journal of immunology. – 2009. – V. 70. – №. 4. – P. 326-336 135 69. Covas D.T., Panepucci R.A., Fontes A.M., Silva W.A. Jr, Orellana M.D., Freitas M.C., Neder L., Santos A.R., Peres L.C., Jamur M.C., Zago M.A. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts //Experimental hematology. – 2008. – V. 36. – №. 5. – P. 642-654. 70. Covert M.W., Leung T.H., Gaston J.E., Baltimore D. Achieving stability of lipopolysaccharide-induced NF-κB activation //Science. – 2005. – V. 309. – №. 5742. – P. 1854-1857. 71. Craig W., Kay R., Cutler R.L., Lansdorp P.M. Expression of Thy-1 on human hematopoietic progenitor cells //The Journal of experimental medicine. – 1993. – V. 177. – №. 5. – P. 1331-1342. 72. Crisan M., Chen C.W., Corselli M., Andriolo G., Lazzari L., Péault B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs //Annals of the New York Academy of Sciences. – 2009. – V. 1176. – №. 1. – P. 118-123. 73. Crop M.J., Baan C.C., Korevaar S.S., Ijzermans J.N., Pescatori M., Stubbs A.P., van Ijcken W.F., Dahlke M.H., Eggenhofer E., Weimar W., Hoogduijn M.J. Inflammatory conditions affect gene expression and function of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells //Clinical & Experimental Immunology. – 2010. – V. 162. – №. 3. – P. 474-486. 74. D’Ambrosio D., Trotta R., Vacca A., Frati L., Santoni A., Gulino A., Testi R. Transcriptional regulation of interleukin-2 gene expression by CD69-generated signals //European journal of immunology. – 1993. – V. 23. – №. 11. – P. 29932997. 75. Das M., Bouchey D.M., Moore M.J., Hopkins D.C., Nemenoff R.A., Stenmark K.R. Hypoxia-induced proliferative response of vascular adventitial fibroblasts is dependent on G protein-mediated activation of mitogen-activated protein kinases //Journal of Biological Chemistry. – 2001. – V. 276. – №. 19. – P. 15631-15640. 76. Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses //Experimental hematology. – 2000. – V. 28. – №. 8. – P. 875-884. 77. DelaRosa O., Dalemans W., Lombardo E. Toll-like receptors as modulators of mesenchymal stem cells //Frontiers in immunology. – 2012. – V. 3. 78. ten Dijke P., Goumans M.J., Pardali E. Endoglin in angiogenesis and vascular diseases //Angiogenesis. – 2008. – V. 11. – №. 1. – P. 79-89. 79. Di Nicola M., Carlo-Stella C., Magni M., Milanesi M., Longoni P.D., Matteucci P., Grisanti S., Gianni A.M. Human bone marrow stromal cells suppress T136 lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli //Blood. – 2002. – V. 99. – №. 10. – P. 3838-3843. 80. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D., Deans R., Keating A., Prockop D., Horwitz E. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement //Cytotherapy. – 2006. – V. 8. – №. 4. – P. 315-317. 81. Dorronsoro A., Ferrin I., Salcedo J.M., Jakobsson E., Fernández-Rueda J., Lang V., Sepulveda P., Fechter K., Pennington D., Trigueros C. Human mesenchymal stromal cells modulate T-cell responses through TNFα-mediated activation of NF-κB //European journal of immunology. – 2014. – V. 44. – №. 2. – P. 480488. 82. Duffy M.M., Ritter T., Ceredig R., Griffin M.D. Mesenchymal stem cell effects on T-cell effector pathways //Stem Cell Res Ther. – 2011. – V. 2. – №. 4. – P. 34. 83. Ebert E.C., Mehta V., Das K.M. Activation antigens on colonic T cells in inflammatory bowel disease: effects of IL-10 //Clinical & Experimental Immunology. – 2005. – V. 140. – №. 1. – P. 157-165. 84. Eliasson P., Jönsson J.I. The hematopoietic stem cell niche: low in oxygen but a nice place to be //Journal of cellular physiology. – 2010. – V. 222. – №. 1. – P. 17-22 85. English K., Barry F.P., Field-Corbett C.P., Mahon B.P. IFNγ and TNF-α differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells //Immunology letters. – 2007. – V. 110. – №. 2. – P. 91-100. 86. English K., Ryan J.M., Tobin L., Murphy M.J., Barry F.P., Mahon B.P. Cell contact, prostaglandin E2 and transforming growth factor beta 1 play nonredundant roles in human mesenchymal stem cell induction of CD4+ CD25 Highforkhead box P3+ regulatory T cells //Clinical & Experimental Immunology. – 2009. – V. 156. – №. 1. – P. 149-160. 87. English K. Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation //Immunology and cell biology. – 2013. – V. 91. – №. 1. – P. 19-26. 88. Ennis J., Sarugaser R., Gomez A., Baksh D., Davies J.E. Isolation, characterization, and differentiation of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) //Methods in cell biology. – 2008. – V. 86. – P. 121-136. 89. Erices A., Conget P., Minguell J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood //British journal of haematology. – 2000. – V. 109. – №. 1. – P. 235-242. 137 90. Erdös E.G., Skidgel R.A. Neutral endopeptidase 24.11 (enkephalinase) and related regulators of peptide hormones //The FASEB journal. – 1989. – V. 3. – №. 2. – P. 145-151. 91. Esplugues E., Sancho D., Vega-Ramos J., Martínez C., Syrbe U., Hamann A., Engel P., Sánchez-Madrid F., Lauzurica P. Enhanced antitumor immunity in mice deficient in CD69 //The Journal of experimental medicine. – 2003. – V. 197. – №. 9. – P. 1093-1106. 92. Farag S.S., Fehniger T.A., Ruggeri L., Velardi A., Caligiuri M.A. Natural killer cell receptors: new biology and insights into the graft-versus-leukemia effect //Blood. – 2002. – V. 100. – №. 6. – P. 1935-1947. 93. Farias V.A., Linares-Fernández J.L., Peñalver J.L., Payá Colmenero .JA., Ferrón G.O., Duran E.L., Fernández R.M., Olivares E.G., O'Valle F., Puertas A., Oliver F.J., Ruiz de Almodóvar J.M. Human umbilical cord stromal stem cell express CD10 and exert contractile properties //Placenta. – 2011. – V. 32. – №. 1. – P. 86-95. 94. Fehrer C., Brunauer R., Laschober G., Unterluggauer H., Reitinger S., Kloss F., Gülly C., Gassner R., Lepperdinger G. Reduced oxygen tension attenuates differentiation capacity of human mesenchymal stem cells and prolongs their lifespan //Aging cell. – 2007. – V. 6. – №. 6. – P. 745-757. 95. Fiorina P., Jurewicz M., Augello A., Vergani A., Dada S., La Rosa S., Selig M., Godwin J., Law K., Placidi C., Smith R.N., Capella C., Rodig S., Adra .CN., Atkinson M., Sayegh M.H., Abdi R. Immunomodulatory function of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimental autoimmune type 1 diabetes //The Journal of Immunology. – 2009. – V. 183. – №. 2. – P. 993-1004. 96. Fong C.Y., Subramanian A., Biswas A., Gauthaman K., Srikanth P., Hande M.P., Bongso A. Derivation efficiency, cell proliferation, freeze–thaw survival, stem-cell properties and differentiation of human Wharton’s jelly stem cells //Reproductive biomedicine online. – 2010. – V. 21. – №. 3. – P. 391-401. 97. Fontenot J.D., Gavin M.A., Rudensky A.Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+ CD25+ regulatory T cells //Nature immunology. – 2003. – V. 4. – №. 4. – P. 330-336. 98. Forbes G.M., Sturm M.J., Leong R.W., Sparrow M.P., Segarajasingam D., Cummins A.G., Phillips M., Herrmann R.P.. A phase 2 study of allogeneic mesenchymal stromal cells for luminal Crohn's disease refractory to biologic therapy //Clinical Gastroenterology and Hepatology. – 2014. – V. 12. – №. 1. – P. 64-71. 138 99. Franquesa M., Hoogduijn M.J., Bestard O., Grinyó J.M. Immunomodulatory effect of mesenchymal stem cells on B cells //Frontiers in immunology. – 2012. – V. 3. 100. Fraser J.K., Wulur I., Alfonso Z., Hedrick M.H. Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology //Trends in biotechnology. – 2006. – V. 24. – №. 4. – P. 150-154. 101. Frazier T.P., McLachlan J.B., Gimble J.M., Tucker H.A., Rowan B.G. Human Adipose-Derived Stromal/Stem Cells Induce Functional CD4+ CD25+ FoxP3+ CD127− Regulatory T Cells Under Low Oxygen Culture Conditions //Stem cells and development. – 2014. – V. 23. – №. 9. – P. 968-977. 102. Fukuchi Y., Nakajima H., Sugiyama D., Hirose I., Kitamura T., Tsuji K. Human placenta-derived cells have mesenchymal stem/progenitor cell potential //Stem cells. – 2004. – V. 22. – №. 5. – P. 649-658. 103. Funderburg N., Lederman M.M., Feng Z., Drage M.G., Jadlowsky J., Harding C.V., Weinberg A., Sieg S.F. Human β-defensin-3 activates professional antigen-presenting cells via Toll-like receptors 1 and 2 //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2007. – V. 104. – №. 47. – P. 18631-18635. 104. Fujita N., Kato Y., Naito M., Tsuruo T. A novel anti-Thy-1 (CD90) monoclonal antibody induces apoptosis in mouse malignant T-lymphoma cells in spite of inducing bcl-2 expression // International journal of cancer. – 1996. – V. 66. – №. 4. – P. 544-550. 105. Galipeau J. The mesenchymal stromal cells dilemma—does a negative phase III trial of random donor mesenchymal stromal cells in steroid-resistant graftversus-host disease represent a death knell or a bump in the road? //Cytotherapy. – 2013. – V. 15. – №. 1. – P. 2-8. 106. Gauzzi M.C., Del Cornò M., Gessani S. Dissecting TLR3 signalling in dendritic cells //Immunobiology. – 2010. – V. 215. – №. 9. – P. 713-723.. 107. Gemou-Engesaeth V., Masao Toda M.K., Hamid Q., Halvorsen S., Groegaard J.B., Corrigan C.J. Expression of activation markers and cytokine mRNA by peripheral blood CD4 and CD8 T cells in atopic and nonatopic childhood asthma: effect of inhaled glucocorticoid therapy //Pediatrics. – 2002. – V. 109. – №. 2. – P. e24-e24. 108. Ghannam S., Pene J., Torcy-Moquet G., Jorgensen C., Yssel H. Mesenchymal stem cells inhibit human Th17 cell differentiation and function and induce a T regulatory cell phenotype //The Journal of Immunology. – 2010. – V. 185. – №. 1. – P. 302-312. 139 109. Ghosh S., Karin M. Missing pieces in the NF-κB puzzle //Cell. – 2002. – V. 109. – №. 2. – P. S81-S96. 110. Gimble J.M., Katz A.J., Bunnell B.A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine //Circulation research. – 2007. – V. 100. – №. 9. – P. 1249-1260. 111. Giuliani M., Bennaceur-Griscelli A., Nanbakhsh A., Oudrhiri N., Chouaib S., Azzarone B., Durrbach A., Lataillade J.J. TLR ligands stimulation protects MSC from NK killing //Stem Cells. – 2014. – V. 32. – №. 1. – P. 290-300. 112. Glenn J.D., Whartenby K.A. Mesenchymal stem cells: Emerging mechanisms of immunomodulation and therapy //World journal of stem cells. – 2014. – V. 6. – №. 5. – P. 526. 113. Glennie S., Soeiro I., Dyson P.J., Lam E.W.F., Dazzi F. Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells //Blood. – 2005. – V. 105. – №. 7. – P. 2821-2827. 114. Gnecchi M., Zhang Z., Ni A., Dzau V.J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy //Circulation research. – 2008. – V. 103. – №. 11. – P. 1204-1219. 115. Goodwin M. Sueblinvong V., Eisenhauer P., Ziats N.P., LeClair L., Poynter M.E., Steele C., Rincon M., Weiss D.J. Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells inhibit Th2-mediated allergic airways inflammation in mice //Stem Cells. – 2011. – V. 29. – №. 7. – P. 1137-1148. 116. Gonzalez-Rey E., Gonzalez M.A., Varela N., O’Valle F., Hernandez-Cortes P., Rico L., Buscher D., Delgado M. Human adipose-derived mesenchymal stem cells reduce inflammatory and T cell responses and induce regulatory T cells in vitro in rheumatoid arthritis //Annals of the Rheumatic Diseases. – 2010. – V. 69. – №. 01. – P. 241-248. 117. Gonzalez M.A., Gonzalez-Rey E., Rico L., Buscher D., Delgado M. Adiposederived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by inhibiting inflammatory and autoimmune responses //Gastroenterology. – 2009. – V. 136. – №. 3. – P. 978-989. 118. Gorelik L., Constant S., Flavell R.A. Mechanism of transforming growth factor β–induced inhibition of T helper type 1 differentiation //The Journal of experimental medicine. – 2002. – V. 195. – №. 11. – P. 1499-1505. 119. Grayson W.L., Zhao F., Bunnell B., Ma T. Hypoxia enhances proliferation and tissue formation of human mesenchymal stem cells //Biochemical and biophysical research communications. – 2007. – V. 358. – №. 3. – P. 948-953. 140 120. Greten F.R. Arkan M.C., Bollrath J., Hsu L.C., Goode J., Miething C., Göktuna S.I., Neuenhahn M., Fierer J., Paxian S., Van Rooijen N., Xu Y., O'Cain T., Jaffee B.B., Busch D.H., Duyster J., Schmid R.M., Eckmann L., Karin M. NFκB is a negative regulator of IL-1β secretion as revealed by genetic and pharmacological inhibition of IKKβ //Cell. – 2007. – V. 130. – №. 5. – P. 918931. 121. Groh M.E., Maitra B., Szekely E., Koç O.N. Human mesenchymal stem cells require monocyte-mediated activation to suppress alloreactive T cells //Experimental hematology. – 2005. – V. 33. – №. 8. – P. 928-934. 122. Gros C., Giros B., Schwartz J.C. Identification of aminopeptidase M as an enkephalin-inactivating enzyme in rat cerebral membranes //Biochemistry. – 1985. – V. 24. – №. 9. – P. 2179-2185. 123. Grote K., Petri M., Liu C., Jehn P., Spalthoff S., Kokemüller H., Luchtefeld M., Tschernig T., Krettek C., Haasper C., Jagodzinski M. Toll-like receptor 2/6dependent stimulation of mesenchymal stem cells promotes angiogenesis by paracrine factors //Europ Cells Mater. – 2013. – V. 26. – P. 66-79. 124. Guy K., Middleton P.G., Steel C.M. Variant sublines of the human B-lymphoma cells Namalwa are at different stages of differentiation //Immunology. – 1987. – V. 61. – P. 383-386. 125. Hagood J.S., Mangalwadi A., Guo B., MacEwen M.W., Salazar L., Fuller G.M. Concordant and Discordant Interleukin-1–Mediated Signaling in Lung Fibroblast Thy-1 Subpopulations //American journal of respiratory cell and molecular biology. – 2002. – V. 26. – №. 6. – P. 702-708. 126. Hamann J., Fiebig H., Strauss M. Expression cloning of the early activation antigen CD69, a type II integral membrane protein with a C-type lectin domain //The Journal of Immunology. – 1993. – V. 150. – №. 11. – P. 4920-4927. 127. Han Y., Guo Q., Zhang M., Chen Z., Cao X. CD69+ CD4+ CD25− T cells, a new subset of regulatory T cells, suppress T cell proliferation through membrane-bound TGFβ1 //The Journal of Immunology. – 2009. – V. 182. – №. 1. – P. 111-120. 128. Halfon S., Abramov N., Grinblat B., Ginis I. Markers distinguishing mesenchymal stem cells from fibroblasts are downregulated with passaging //Stem cells and development. – 2010. – V. 20. – №. 1. – P. 53-66. 129. Hardy R.R, Hayakawa K. B cell development pathways //Annu. Rev. Immunol. – 2001. – V.19. – P.595-621. 130. Hashikawa T., Takedachi M., Terakura M., Saho T., Yamada S., Thompson L.F., Shimabukuro Y., Murakami S. Involvement of CD73 (ecto-5′141 nucleotidase) in adenosine generation by human gingival fibroblasts //Journal of dental research. – 2003. – V. 82. – №. 11. – P. 888-892. 131. Haque N., Rahman M.T., Abu Kasim N.H., Alabsi A.M. Hypoxic culture conditions as a solution for mesenchymal stem cell based regenerative therapy //The Scientific World Journal. – 2013. – V. 2013 132. Hayden M.S., Ghosh S. Shared principles in NF-κB signaling //Cell. – 2008. – V. 132. – №. 3. – P. 344-362. 133. Han Y., Guo Q., Zhang M., Chen Z., Cao X. CD69+ CD4+ CD25− T cells, a new subset of regulatory T cells, suppress T cell proliferation through membrane-bound TGF-β1 //The Journal of Immunology. – 2009. – V. 182. – №. 1. – P. 111-120. 134. He J., Liu Y., Zhu T., Zhu J., Dimeco F., Vescovi A.L., Heth J.A., Muraszko K.M., Fan X., Lubman D.M. CD90 is identified as a candidate marker for cancer stem cells in primary high-grade gliomas using tissue microarrays //Molecular & Cellular Proteomics. – 2012. – V. 11. – №. 6. – P. M111. 010744. 135. Herrera M.B., Bussolati B., Bruno S., Morando L., Mauriello-Romanazzi G., Sanavio F., Stamenkovic I., Biancone L., Camussi G. Exogenous mesenchymal stem cells localize to the kidney by means of CD44 following acute tubular injury //Kidney international. – 2007. – V. 72. – №. 4. – P. 430-441. 136. Hoch A.I., Leach J.K. Concise review: optimizing expansion of bone marrow mesenchymal stem/stromal cells for clinical applications //Stem cells translational medicine. – 2014. – P. sctm. 2013-0196. 137. Holter W., Kalthoff F.S., Pickl W.F., Ebner C., Majdic O., Kraft D., Knapp W. Transforming growth factor-β inhibits IL-4 and IFNγ production by stimulated human T cells //International immunology. – 1994. – V. 6. – №. 3. – P. 469-475. 138. Horwitz E.M., Le Blanc K., Dominici M., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F.C., Deans R.J., Krause D.S., Keating A. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement //Cytotherapy. – 2005. – V. 7. – №. 5. – P. 393-395. 139. Iellem A., Mariani M., Lang R., Recalde H., Panina-Bordignon P., Sinigaglia F., D'Ambrosio D. Unique chemotactic response profile and specific expression of chemokine receptors CCR4 and CCR8 by CD4+ CD25+ regulatory T cells //The Journal of experimental medicine. – 2001. – V. 194. – №. 6. – P. 847-854. 140. Isa A., Nehlin J.O., Sabir H.J., Andersen T.E., Gaster M., Kassem M., Barington T. Impaired cell surface expression of HLA-B antigens on mesenchymal stem cells and muscle cell progenitors //PloS one. – 2010. – V. 5. – №. 5. – P. e10900. 142 141. Ishige I., Nagamura-Inoue T., Honda M.J., Harnprasopwat R., Kido M., Sugimoto M., Nakauchi H., Tojo A. Comparison of mesenchymal stem cells derived from arterial, venous, and Wharton’s jelly explants of human umbilical cord //International journal of hematology. – 2009. – V. 90. – №. 2. – P. 261269. 142. Ito Y., Adachi Y., Makino T., Higashiyama H., Fuchizawa T., Shimizu T., Miyawaki T. Expansion of FOXP3-positive CD4+ CD25+ T cells associated with disease activity in atopic dermatitis //Annals of Allergy, Asthma & Immunology. – 2009. – V. 103. – №. 2. – P. 160-165. 143. Jiang T., Liu W., Lv X., Sun H., Zhang L., Liu Y., Zhang W.J., Cao Y., Zhou G.. Potent in vitro chondrogenesis of CD105 enriched human adipose-derived stem cells //Biomaterials. – 2010. – V. 31. – №. 13. – P. 3564-3571. 144. Jin H.J., Park S.K., Oh W., Yang Y.S., Kim S.W., Choi S.J. Down-regulation of CD105 is associated with multi-lineage differentiation in human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells //Biochemical and biophysical research communications. – 2009. – V. 381. – №. 4. – P. 676-681. 145. Jori F.P., Napolitano M.A., Melone M.A., Jori F.P., Napolitano M.A., Melone M.A., Cipollaro M., Cascino A., Altucci L., Peluso G., Giordano A., Galderisi U. Molecular pathways involved in neural in vitro differentiation of marrow stromal stem cells //Journal of cellular biochemistry. – 2005. – V. 94. – №. 4. – P. 645-655. 146. Jones B.J., McTaggart S.J. Immunosuppression by mesenchymal stromal cells: from culture to clinic //Experimental hematology. – 2008. – Т. 36. – №. 6. – С. 733-741. 147. Jurisic G., Iolyeva M., Proulx S.T., Halin C., Detmar M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium //Experimental cell research. – 2010. – V. 316. – №. 17. – P. 2982-2992. 148. Kapoor S., Patel S.A., Kartan S., Axelrod D., Capitle E., Rameshwar P. Tolerance-like mediated suppression by mesenchymal stem cells in patients with dust mite allergy–induced asthma //Journal of Allergy and Clinical Immunology. – 2012. – V. 129. – №. 4. – P. 1094-1101. 149. Karin M., Ben-Neriah Y. Phosphorylation meets ubiquitination: the control of NF-κB activity //Annual review of immunology. – 2000. – V. 18. – №. 1. – P. 621-663. 150. Karlsson C., Brantsing C., Egell S., Lindahl A. Notch1, Jagged1, and HES5 are abundantly expressed in osteoarthritis //Cells, tissues, organs. – 2007. – V. 188. – №. 3. – P. 287-298. 143 151. Kavanagh H., Mahon B.P. Allogeneic mesenchymal stem cells prevent allergic airway inflammation by inducing murine regulatory T cells //Allergy. – 2011. – V. 66. – №. 4. – P. 523-531. 152. Kawamoto K., Konno M., Nagano H., Nishikawa S., Tomimaru Y., Akita H., Hama N., Wada H., Kobayashi S., Eguchi H., Tanemura M., Ito T., Doki Y., Mori M., Ishii H. CD90-(Thy-1-) high selection enhances reprogramming capacity of murine adipose-derived mesenchymal stem cells //Disease markers. – 2013. – V. 35. – №. 5. – P. 573-579. 153. Kawai T., Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors //Nature immunology. – 2010. – V. 11. – №. 5. – P. 373-384. 154. Kim D.W., Staples M., Shinozuka K., Pantcheva P., Kang S.D., Borlongan C.V. Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications //International journal of molecular sciences. – 2013. – V. 14. – №. 6. – P. 11692-11712. 155. Klein S., Kretz C.C., Krammer P.H., Kuhn A. CD127low/-and FoxP3+ expression levels characterize different regulatory T cell populations in human peripheral blood // J. Invest Dermatol. – 2010. – V. 129. – P. S21-S21. 156. Klyushnenkova E., Mosca J.D., Zernetkina V., Majumdar M.K., Beggs K.J., Simonetti D.W., Deans R.J., McIntosh K.R. T cell responses to allogeneic human mesenchymal stem cells: immunogenicity, tolerance, and suppression //Journal of biomedical science. – 2005. – V. 12. – №. 1. – P. 47-57. 157. Krampera M., Glennie S., Dyson J., Scott D., Laylor R., Simpson E., Dazzi F. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naïve and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide // Blood. – 2003. – V. 101. – P. 3722-3729. 158. Krampera M., Cosmi L., Angeli R., Pasini A., Liotta F., Andreini A. Santarlasci V., Mazzinghi B., Pizzolo G., Vinante F., Romagnani P., Maggi E., Romagnani S., Annunziato F. Role for Interferon-γ in the Immunomodulatory Activity of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells //Stem cells. – 2006. – V. 24. – №. 2. – P. 386-398. 159. Kronsteiner B., Wolbank S., Peterbauer A., Hackl C., Redl H., van Griensven M., Gabriel C. Human mesenchymal stem cells from adipose tissue and amnion influence T-cells depending on stimulation method and presence of other immune cells //Stem cells and development. – 2011. – V. 20. – №. 12. – P. 2115-2126. 144 160. Kubo M., Motomura Y. Transcriptional regulation of the anti-inflammatory cytokine IL-10 in acquired immune cells //Frontiers in immunology. – 2012. – V. 3. 161. Kunz B., Oranje A.P., Labrèze L., Stalder J.F., Ring J., Taïeb A. Clinical validation and guidelines for the SCORAD index: consensus report of the European Task Force on Atopic Dermatitis //Dermatology. – 1997. – V. 195. – №. 1. – P. 10-19. 162. Laffón A., Garcia-Vicuna R., Humbria A., Postigo A.A., Corbi A.L., de Landazuri M.O., Sanchez-Madrid F. Upregulated expression and function of VLA-4 fibronectin receptors on human activated T cells in rheumatoid arthritis //Journal of Clinical Investigation. – 1991. – V. 88. – №. 2. – P. 546. 163. Lalu M.M., McIntyre L., Pugliese C., Fergusson D., Winston B.W., Marshall J.C., Granton J., Stewart D.J. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): a systematic review and meta-analysis of clinical trials //PLOS one. – 2012. – V. 7. – №. 10. – P. e47559. 164. Laranjeira P., Pedrosa M., Pedreiro S., Gomes J., Martinho A., Antunes B., Ribeiro T., Santos F., Trindade H., Paiva A. Effect of human bone marrow mesenchymal stromal cells on cytokine production by peripheral blood naive, memory and effector T cells //Stem cell research & therapy. – 2015. – V. 6. – №. 1. – P. 3. 165. Le Blanc K., Rasmusson I., Gotherstrom C., Seidel C., Sundberg B., Sundin M., Rosendahl K., Tammik C., Ringden O. Mesenchymal stem cells inhibit the expression of CD25 (interleukin_2 receptor) and CD38 on phytohaemagglutinin activated lymphocytes // Scandinavian journal of immunology. – 2004. – V. 60. – №. 3. – P. 307-315. 166. Le Blanc K., Tammik C., Rosendahl K., Zetterberg E., Ringdén O. HLA expression and immunologic propertiesof differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells //Experimental hematology. – 2003. – V. 31. – №. 10. – P. 890-896. 167. Levi B., Wan D.C., Glotzbach J.P., Hyun J., Januszyk M., Montoro D., Sorkin M., James A.W., Nelson E.R., Li S., Quarto N., Lee M., Gurtner G.C., Longaker M.T. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor β1 (TGFβ1) signaling //Journal of Biological Chemistry. – 2011. – V. 286. – №. 45. – P. 39497-39509. 168. Leyton L. Thy-1-interacting molecules and cellular signaling in cis and trans //International review of cell and molecular biology. – 2013. – V. 305. – P. 163. 145 169. Li J., Zhuan-sun Y.X., Wen B., Wu H., Huang F.T., Ghimire H.B., Ran P. X.. Human mesenchymal stem cells elevate CD4+CD25+CD127low/-regulatory T cells of asthmatic patients via heme oxygenase-1 //Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology. – 2013. – V. 12. – №. 3. – P. 228-235. 170. Li Y., Charif N., Mainard D., Bensoussan D., Stoltz J.F., de Isla N. Donor's age dependent proliferation decrease of human bone marrow mesenchymal stem cells is linked to diminished clonogenicity //Bio-medical materials and engineering. – 2014. – V. 24. – P. 47-52. 171. Li-Weber M., Krammer P.H. Regulation of IL4 gene expression by T cells and therapeutic perspectives //Nature Reviews Immunology. – 2003. – V. 3. – №. 7. – P. 534-543. 172. Lim J.H., Kim J.S., Yoon I.H., Shin J.S., Nam H.Y., Yang S.H., Kim S.J., Park C.G. Immunomodulation of delayed-type hypersensitivity responses by mesenchymal stem cells is associated with bystander T cell apoptosis in the draining lymph node //The Journal of Immunology. – 2010. – V. 185. – №. 7. – P. 4022-4029. 173. Lim J.Y., Park M.J., Im K.I., Kim N., Jeon E.J., Kim E.J., Cho M.L., Cho S.G. Combination cell therapy using mesenchymal stem cells and regulatory T-cells provides a synergistic immunomodulatory effect associated with reciprocal regulation of TH1/TH2 and th17/treg cells in a murine acute graft-versus-host disease model //Cell transplantation. – 2014. – V. 23. – №. 6. – P. 703-714. 174. Ling E.M., Smith T., Nguyen X.D., Pridgeon C., Dallman M., Arbery J., Carr V.A., Robinson D.S. Relation of CD4+ CD25+ regulatory T-cell suppression of allergen-driven T-cell activation to atopic status and expression of allergic disease //The Lancet. – 2004. – V. 363. – №. 9409. – P. 608-615. 175. Liotta F., Angeli R., Cosmi L., Filì L., Manuelli C., Frosali F., Mazzinghi B., Maggi L., Pasini A., Lisi V., Santarlasci V., Consoloni L., Angelotti M.L., Romagnani P., Parronchi P., Krampera M., Maggi E., Romagnani S., Annunziato F. Toll-Like Receptors 3 and 4 Are Expressed by Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells and Can Inhibit Their T-Cell Modulatory Activity by Impairing Notch Signaling //Stem cells. – 2008. – V. 26. – №. 1. – P. 279-289. 176. Liu W., Putnam A.L., Xu-Yu Z., Szot G.L., Lee M.R., Zhu S., Gottlieb P.A., Kapranov P., Gingeras T.R., Fazekas de St Groth B., Clayberger C., Soper D.M., Ziegler S.F., Bluestone J.A. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells //The Journal of experimental medicine. – 2006. – V. 203. – №. 7. – P. 1701-1711. 146 177. Liu A.Y., Roudier M.P., True L.D., Heterogeneity in primary and metastatic prostate cancer as defined by cell surface CD profile //The American journal of pathology. – 2004. – V. 165. – №. 5. – P. 1543-1556. 178. Liu-Bryan R., Pritzker K., Firestein G.S., Terkeltaub R. TLR2 signaling in chondrocytes drives calcium pyrophosphate dihydrate and monosodium urate crystal-induced nitric oxide generation //The Journal of Immunology. – 2005. – V. 174. – №. 8. – P. 5016-5023. 179. Lombardo E., DelaRosa O., Mancheño-Corvo P., Menta R., Ramírez C., Büscher D. Toll-like Receptor–Mediated Signaling in Human Adipose-Derived Stem Cells: Implications for Immunogenicity and Immunosuppressive Potential //Tissue Engineering Part A. – 2008. – V. 15. – №. 7. – P. 1579-1589. 180. Luz-Crawford P., Kurte M., Bravo-Alegría J., Contreras R., Nova-Lamperti E., Tejedor G., Noël D., Jorgensen C., Figueroa F., Djouad F., Carrión F. Mesenchymal stem cells generate a CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells //Stem cell research & therapy. – 2013. – V. 4. – №. 3. – P. 65. 181. Lu X., Liu T., Gu L., Huang C., Zhu H., Meng W., Xi Y., Li S., Liu Y. Immunomodulatory effects of mesenchymal stem cells involved in favoring type 2 T cell subsets //Transplant immunology. – 2009. – V. 22. – №. 1. – P. 5561. 182. Lv F.J., Tuan R.S., Cheung K., Leung V.Y. Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells //Stem cells. – 2014. – V. 32. – №. 6. – P. 1408-1419. 183. Madec A.M., Mallone R., Afonso G., Abou Mrad E., Mesnier A., Eljaafari A., Thivolet C. Mesenchymal stem cells protect NOD mice from diabetes by inducing regulatory T cells //Diabetologia. – 2009. – V. 52. – №. 7. – P. 13911399. 184. Mafi P., Hindocha S., Mafi R., Griffin M., Khan W.S. Suppl 2: Adult Mesenchymal Stem Cells and Cell Surface Characterization-A Systematic Review of the Literature //The open orthopaedics journal. – 2011. – V. 5. – P. 253. 185. Manicassamy S., Pulendran B. Modulation of adaptive immunity with Toll-like receptors //Seminars in immunology. – Academic Press, 2009. – V. 21. – №. 4. – P. 185-193. 186. Martín P., Gómez M., Lamana A., Cruz-Adalia A., Ramírez-Huesca M., Ursa M.A., Yáñez-Mo M., Sánchez-Madrid F. CD69 association with Jak3/Stat5 proteins regulates Th17 cell differentiation //Molecular and cellular biology. – 2010. – V. 30. – №. 20. – P. 4877-4889. 147 187. Mardiney M., Brown M.R., Fleisher T.A. Measurement of T-cell: CD69 expression A rapid and efficient means to assess mitogen- or antigen-induced proliferative capacity in normals//Cytometry. – 1996. – V.26 – P.305-310. 188. McClellan J.B., Garner C.W. Purification and properties of human intestine alanine aminopeptidase //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Enzymology. – 1980. – V. 613. – №. 1. – P. 160-167. 189. Meisel R., Zibert A., Laryea M., Göbel U., Däubener W., Dilloo D. Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine 2, 3-dioxygenase–mediated tryptophan degradation //Blood. – 2004. – V. 103. – №. 12. – P. 4619-4621. 190. Melief S.M., Zwaginga J.J., Fibbe W.E., Roelofs H. Adipose tissue-derived multipotent stromal cells have a higher immunomodulatory capacity than their bone marrow-derived counterparts //Stem Cells Transl Med. – 2013. – V. 2. – №. 6. – P. 455-463. 191. Meng H.B., Gong J., Zhou B., Hua J., Yao L., Song Z.S. Therapeutic effect of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells in rat severe acute pancreatitis //International journal of clinical and experimental pathology. – 2013. – V. 6. – №. 12. – P. 2703. 192. Meylan E., Tschopp J., Karin M. Intracellular pattern recognition receptors in the host response //Nature. – 2006. – V. 442. – №. 7098. – P. 39-44. 193. Mihu C.M., Rus Ciuca D., Soritau O., Susman S., Mihu, D. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from the amniotic membrane //Rom J Morphol Embryol. – 2009. – V. 50. – №. 1. – P. 73-77. 194. Mina-Osorio P. The moonlighting enzyme CD13: old and new functions to target //Trends in molecular medicine. – 2008. – V. 14. – №. 8. – P. 361-371. 195. Mitchell J.B., McIntosh K., Zvonic S., Garrett S., Floyd Z.E., Kloster A., Di Halvorsen Y., Storms R.W., Goh B., Kilroy G., Wu X., Gimble J.M. Immunophenotype of Human Adipose-Derived Cells: Temporal Changes in Stromal-Associated and Stem Cell–Associated Markers //Stem cells. – 2006. – V. 24. – №. 2. – P. 376-385. 196. Musina R.A., Bekchanova E.S., Sukhikh G.T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues //Bulletin of experimental biology and medicine. – 2005. – V. 139. – №. 4. – P. 504-509. 197. Nagatomo K., Komaki M., Sekiya I., Sakaguchi Y., Noguchi K., Oda S., Muneta T., Ishikawa I. Stem cell properties of human periodontal ligament cells //Journal of periodontal research. – 2006. – V. 41. – №. 4. – P. 303-310. 148 198. Najar M., Raicevic G., Boufker H.I., Kazan H.F., De Bruyn C., Meuleman N., Lagneaux L. Mesenchymal stromal cells use PGE2 to modulate activation and proliferation of lymphocyte subsets: Combined comparison of adipose tissue, Wharton’s Jelly and bone marrow sources //Cellular immunology. – 2010. – V. 264. – №. 2. – P. 171-179. 199. Nilsson K. Synthesis and secretion of IgE by an established human myeloma cell line //Clin. Exp. Immunol. – 1971. – V. 9. – P. 785-793. 200. Moore K.W., de Waal Malefyt R., Coffman R.L., O'Garra A. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor //Annual review of immunology. – 2001. – V. 19. – №. 1. – P. 683-765. 201. Nasef A., Chapel A., Mazurier C., Bouchet S., Lopez M., Mathieu N., Sensebé L., Zhang Y., Gorin N.C., Thierry D., Fouillard L. Identification of IL-10 and TGF-β Transcripts Involved in the Inhibition of T-Lymphocyte Proliferation During Cell Contact With Human Mesenchymal Stem Cells //Gene expression. – 2006. – V. 13. – №. 4-5. – P. 217-226. 202. Nassiri F., Cusimano M.D., Scheithauer B.W., Rotondo F., Fazio A., Yousef G.M., Syro L.V., Kovacs K., Lloyd R.V. Endoglin (CD105): a review of its role in angiogenesis and tumor diagnosis, progression and therapy //Anticancer research. – 2011. – V. 31. – №. 6. – P. 2283-2290. 203. Nemeth K., Keane-Myers A., Brown J.M., Metcalfe D.D., Gorham J.D., Bundoc V.G., Hodges M.G., Jelinek I., Madala S., Karpati S., Mezey E. Bone marrow stromal cells use TGFβ to suppress allergic responses in a mouse model of ragweed-induced asthma //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 2010. – V. 107. – №. 12. – P. 5652-5657. 204. Newman R.E., Yoo D., LeRoux M.A., Danilkovitch-Miagkova A. Treatment of inflammatory diseases with mesenchymal stem cells //Inflammation & AllergyDrug Targets (Formerly Current Drug Targets-Inflammation & Allergy). – 2009. – V. 8. – №. 2. – P. 110-123. 205. Noble P.B., Cutts J.H., Carroll K.K. Ficoll flotation for the separation of blood leukocyte types //Blood – 1968. – V.31. – P.66-73. 206. Novotny N.M., Markel T.A., Crisostomo P.R., Meldrum D.R. Differential IL-6 and VEGF secretion in adult and neonatal mesenchymal stem cells: role of NFkB //Cytokine. – 2008. – V. 43. – №. 2. – P. 215-219. 207. O'Dea E., Hoffmann A. The regulatory logic of the NF-κB signaling system //Cold Spring Harbor perspectives in biology. – 2010. – V. 2. – №. 1. – P. a000216. 149 208. Ogulur I., Gurhan G., Kombak F.E., Filinte D., Barlan I., Akkoc T. 2014. Allogeneic pluripotent stem cells suppress airway inflammation in murine model of acute asthma //International immunopharmacology. – 2014. – V. 22. – №. 1. – P. 31-40. 209. Okamura Y., Watari M., Jerud E.S., Young D.W., Ishizaka S.T., Rose J., Chow J.C., Strauss J.F. The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4 //Journal of Biological Chemistry. – 2001. – V. 276. – №. 13. – P. 1022910233. 210. O'Neill L.A.J., Bowie A.G. The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling //Nature Reviews Immunology. – 2007. – V. 7. – №. 5. – P. 353-364. 211. Opitz C.A., Litzenburger U.M., Lutz C., Lanz T.V., Tritschler I., Köppel A., Tolosa E., Hoberg M., Anderl J., Aicher W.K., Weller M., Wick W., Platten M. Toll-Like Receptor Engagement Enhances the Immunosuppressive Properties of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells by Inducing Indoleamine-2, 3-dioxygenase-1 via Interferon-β and Protein Kinase R //Stem Cells. – 2009. – V. 27. – №. 4. – P. 909-919. 212. Oswald J., Boxberger S., Jorgensen B., Feldmann S., Ehninger G., Bornhuser M., Werner C. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro //Stem cells. – 2004. – V. 22. – №. 3. – P. 377-384. 213. Pan Z.K, Fisher C., Li J.D., Jiang Y., Huang S., Chen L.Y.. Bacterial LPS upregulated TLR3 expression is critical for antiviral response in human monocytes: evidence for negative regulation by CYLD //International immunology. – 2011. – V.23. – P. 357–364. 214. Panepucci R.A., Siufi J.L., Silva W.A. Jr., Proto-Siquiera R., Neder L., Orellana M., Rocha V., Covas D.T., Zago M.A. Comparison of gene expression of umbilical cord vein and bone marrow–derived mesenchymal stem cells //Stem cells. – 2004. – V. 22. – №. 7. – P. 1263-1278. 215. Parham P. The immune system. – Garland Science, 2009. 216. Park B.S., Lee J.O. Recognition of lipopolysaccharide pattern by TLR4 complexes //Experimental & molecular medicine. – 2013. – V. 45. – №. 12. – P. e66. 217. Pasarica M., Sereda O.R., Redman L.M., Albarado D.C., Hymel D.T., Roan L.E., Rood J.C., Burk D.H., Smith S.R. Reduced adipose tissue oxygenation in human obesity evidence for rarefaction, macrophage chemotaxis, and inflammation without an angiogenic response //Diabetes. – 2009. – V. 58. – №. 3. – P. 718-725. 150 218. Paul W.E. Interleukin-4: a prototypic immunoregulatory lymphokine //Blood. – 1991. – V. 77. – №. 9. – P. 1859-1870. 219. Payne N.L., Sun G., McDonald C., Layton D., Moussa L., Emerson-Webber A., Veron N., Siatskas C., Herszfeld D., Price J., Bernard, C.C. Distinct immunomodulatory and migratory mechanisms underpin the therapeutic potential of human mesenchymal stem cells in autoimmune demyelination //Cell transplantation. – 2013. – V. 22. – №. 8. – P. 1409-1425. 220. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells //science. – 1999. – V. 284. – №. 5411. – P. 143-147. 221. Płóciennikowska A., Hromada-Judycka A., Borzęcka K., Kwiatkowska K. Cooperation of TLR4 and raft proteins in LPS-induced pro-inflammatory signaling //Cellular and Molecular Life Sciences. – 2015. – V. 72. – №. 3. – P. 557-581. 222. Pohl D., Andrýs C., Borská L., Fiala Z., Hamaková K., Ettler K., Krejsek J. Serum level of a soluble form of endoglin (CD105) is decreased after Goeckerman's therapy of psoriasis //Acta Medica (Hradec Kralove). – 2011. – V. 54. – №. 2. – P. 59-62. 223. Prasanna S.J., Gopalakrishnan D., Shankar S.R., Vasandan A.B. Proinflammatory cytokines, IFNγ and TNFα, influence immune properties of human bone marrow and Wharton jelly mesenchymal stem cells differentially //PLoS One. – 2010. – V. 5. – №. 2. – P. e9016. 224. Qian H., Le Blanc K., Sigvardsson M. Primary mesenchymal stem and progenitor cells from bone marrow lack expression of CD44 protein //Journal of Biological Chemistry. – 2012. – V. 287. – №. 31. – P. 25795-25807. 225. Quaedackers M.E., Baan C.C., Weimar W., Hoogduijn M.J. Cell contact interaction between adipose-derived stromal cells and allo-activated T lymphocytes //European journal of immunology. – 2009. – V. 39. – №. 12. – P. 3436-3446. 226. Rada T., Reis R.L., Gomes M.E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential //Stem Cell Reviews and Reports. – 2011. – V. 7. – №. 1. – P. 64-76. 227. Radulovic K., Manta C., Rossini V., Holzmann K., Kestler H.A., Wegenka U.M., Nakayama T., Niess J.H. CD69 regulates type I IFN-induced tolerogenic signals to mucosal CD4 T cells that attenuate their colitogenic potential //The Journal of Immunology. – 2012. – V. 188. – №. 4. – P. 2001-2013. 151 228. Raicevic G., Najar M., Stamatopoulos B., De Bruyn C., Meuleman N., Bron D., Toungouz M., Lagneaux L. The source of human mesenchymal stromal cells influences their TLR profile as well as their functional properties //Cellular immunology. – 2011. – V. 270. – №. 2. – P. 207-216. 229. Rahman M.M., Subramani J., Ghosh M., Denninger J.K., Takeda K., Fong G.H., Carlson M.E., Shapiro L.H. CD13 promotes mesenchymal stem cell-mediated regeneration of ischemic muscle //Frontiers in physiology. – 2013. – V. 4. 230. Ramasamy R., Tong C.K., Seow H.F., Vidyadaran S., Dazzi F. The immunosuppressive effects of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells target T cell proliferation but not its effector function //Cellular immunology. – 2008. – V. 251. – №. 2. – P. 131-136. 231. Rasmusson I., Le Blanc K., Sundberg B., Ringdén O. Mesenchymal stem cells stimulate antibody secretion in human B cells //Scandinavian journal of immunology. – 2007. – V. 65. – №. 4. – P. 336-343. 232. Rebelatto C.K., Aguiar A.M., Moretão M.P., Senegaglia A.C., Hansen P., Barchiki F., Oliveira J., Martins J., Kuligovski C., Mansur F., Christofis A., Amaral V.F., Brofman P.S., Goldenberg S., Nakao L.S., Correa A. Dissimilar differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, and adipose tissue //Experimental Biology and Medicine. – 2008. – V. 233. – №. 7. – P. 901-913 233. Rege T.A., Hagood J.S. Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration, apoptosis, adhesion, migration, cancer, and fibrosis //The FASEB journal. – 2006. – V. 20. – №. 8. – P. 1045-1054. 234. Ribeiro A., Laranjeira P., Mendes S., Velada I., Leite C., Andrade P., Paiva A. Mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix, adipose tissue and bone marrow exhibit different capability to suppress peripheral blood B, natural killer and T cells //Stem Cell Res Ther. – 2013. – V. 4. – №. 5. – P. 125. 235. Rosado M.M., Bernardo M.E., Scarsella M., Conforti A., Giorda E., Biagini S., Cascioli S., Rossi F., Guzzo I., Vivarelli M., Dello Strologo L., Emma F. Locatelli F., Carsetti R. Inhibition of B-cell proliferation and antibody production by mesenchymal stromal cells is mediated by T cells //Stem cells and development. – 2015. – V. 24. – №. 1. – P. 93-103. 236. Rossant J. Stem cells from the mammalian blastocyst. //Stem cells. – 2001. – V. 19. – №. 6. – P. 477-482. 237. Romieu-Mourez R., François M., Boivin M.N., Bouchentouf M., Spaner D.E., Galipeau J. Cytokine modulation of TLR expression and activation in mesenchymal stromal cells leads to a proinflammatory phenotype //The Journal of Immunology. – 2009. – V. 182. – №. 12. – P. 7963-7973. 152 238. Ruggeri L., Capanni M., Martelli M.F., Velardi A. Cellular therapy: exploiting NK cell alloreactivity in transplantation //Current opinion in hematology. – 2001. – V. 8. – №. 6. – P. 355-359. 239. Ryan J.M., Barry F.P., Murphy J.M., Mahon B.P. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection //Journal of Inflammation. – 2005. – V. 2. – №. 1. – P. 8. 240. Saalbach, A., Wetzel A., Haustein U.F., Sticherling M., Simon J.C., Anderegg U. Interaction of human Thy-1 (CD 90) with the integrin αvβ3 (CD51/CD61): an important mechanism mediating melanoma cell adhesion to activated endothelium //Oncogene. – 2005. – V. 24. – №. 29. – P. 4710-4720. 241. Sakaguchi S., Yamaguchi T., Nomura T., Ono M. Regulatory T cells and immune tolerance //Cell. – 2008. – V. 133. – №. 5. – P. 775-787. 242. Saldanha-Araujo F., Haddad R., Farias K.C., Souza Ade P., Palma P.V., Araujo A.G., Orellana M.D., Voltarelli J.C., Covas D.T., Zago M.A., Panepucci R.A. Mesenchymal stem cells promote the sustained expression of CD69 on activated T lymphocytes: roles of canonical and non-canonical NF-κB signalling //Journal of cellular and molecular medicine. – 2012. – V. 16. – №. 6. – P. 1232-1244. 243. Santis A.G., Campanero M.R., Alonso J.L., Tugores A., Alonso M.A., Yagüe E., Pivel J.P., Sánchez-Madrid F. Tumor necrosis factor-α production induced in T lymphocytes through the AIM/CD69 activation pathway //European journal of immunology. – 1992. – V. 22. – №. 5. – P. 1253-1259. 244. Sancho D., Gómez M., Viedma F., Esplugues E., Gordón-Alonso M., GarcíaLópez M.A., de la Fuente H., Martínez-A C., Lauzurica P., Sánchez-Madrid F. CD69 downregulates autoimmune reactivity through active transforming growth factor-β production in collagen-induced arthritis //Journal of Clinical Investigation. – 2003. – V. 112. – №. 6. – P. 872. 245. Sarkhosh K., Tredget E.E., Karami A., Uludag H., Iwashina T., Kilani R.T., Ghahary A. Immune cell proliferation is suppressed by the nterferon-γ-induced indoleamine 2, 3-dioxygenase expression of fibroblasts populated in collagen gel (FPCG) //Journal of cellular biochemistry. – 2003. – V. 90. – №. 1. – P. 206217. 246. Sato K., Ozaki K., Oh I., Meguro A., Hatanaka K., Nagai T., Muroi K., Ozawa K. Nitric oxide plays a critical role in suppression of T-cell proliferation by mesenchymal stem cells //Blood. – 2007. – Т. 109. – №. 1. – С. 228-234. 247. Scherer D.C., Brockman J.A., Chen Z., Maniatis T., Ballard D.W. Signalinduced degradation of I kappa B alpha requires site-specific ubiquitination //Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1995. – V. 92. – №. 24. – P. 11259-11263. 153 248. Schofield R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell //Blood cells. – 1977. – V. 4. – №. 1-2. – P. 7-25. 249. Selmani Z., Naji A., Zidi I., Favier B., Gaiffe E., Obert L., Borg C., Saas P., Tiberghien P., Rouas-Freiss N., Carosella E.D., Deschaseaux F. Human leukocyte antigen-G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required to suppress T lymphocyte and natural killer function and to induce CD4+CD25highFOXP3+ regulatory T cells //Stem cells. – 2008. – V. 26. – №. 1. – P. 212-222. 250. Shevach E.M. Mechanisms of foxp3+ T regulatory cell-mediated suppression //Immunity. – 2009. – V. 30. – №. 5. – P. 636-645. 251. Schmidt-Weber C. B. Anti-IL-4 as a new strategy in allergy //Chemical immunology and allergy. – 2012. – V. 96. – P. 120. 252. Sen R., Baltimore D. Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences //cell. – 1986. – V. 46. – №. 5. – P. 705-716. 253. Seeberger K.L., Dufour J.M., Shapiro A.M., Lakey J.R., Rajotte R.V., Korbutt G.S. Expansion of mesenchymal stem cells from human pancreatic ductal epithelium //Laboratory investigation. – 2006. – V. 86. – №. 2. – P. 141-153. 254. Siegel G., Kluba T., Hermanutz-Klein U., Bieback K., Northoff H., Schäfer R. Phenotype, donor age and gender affect function of human bone marrowderived mesenchymal stromal cells //BMC medicine. – 2013. – V. 11. – №. 1. – P. 146. 255. Simon M.C., Keith B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function //Nature reviews Molecular cell biology. – 2008. – V. 9. – №. 4. – P. 285-296. 256. Song J., Aumüller G., Xiao F., Wilhelm B., Albrecht M. Cell specific expression of CD10/neutral endopeptidase 24.11 gene in human prostatic tissue and cells //The Prostate. – 2004. – V. 58. – №. 4. – P. 394-405. 257. Strioga M., Viswanathan S., Darinskas A., Slaby O., Michalek J. Same or not the same? Comparison of adipose tissue-derived versus bone marrow-derived mesenchymal stem and stromal cells //Stem cells and development. – 2012. – V. 21. – №. 14. – P. 2724-2752. 258. Stochaj U., Dieckhoff J., Mollenhauer .J, Cramer M., Mannherz H.G. Evidence for the direct interaction of chicken gizzard 5′-nucleotidase with laminin and fibronectin //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. – 1989. – V. 992. – №. 3. – P. 385-392. 154 259. Stone K.D., Prussin C., Metcalfe D.D. IgE, mast cells, basophils, and eosinophils //J. Allergy Clin. Immunol. – 2010. – V.125. – P.73—80. 260. Strohmeier G.R., Lencer W.I., Patapoff T.W., Thompson L.F., Carlson S.L., Moe S.J., Carnes D.K., Mrsny R.J., Madara J.L. Surface expression, polarization, and functional significance of CD73 in human intestinal epithelia //Journal of Clinical Investigation. – 1997. – V. 99. – №. 11. – P. 2588. 261. Subramani J., Ghosh M., Rahman M.M., Caromile L.A., Gerber C., Rezaul K., Han D.K., Shapiro L.H. Tyrosine phosphorylation of CD13 regulates inflammatory cell–cell adhesion and monocyte trafficking //The Journal of Immunology. – 2013. – V. 191. – №. 7. – P. 3905-3912. 262. Sumitomo M., Shen R., Nanus D.M. Involvement of neutral endopeptidase in neoplastic progression //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. – 2005. – V. 1751. – №. 1. – P. 52-59. 263. Sun Y.Q., Deng M.X., He J., Zeng Q.X., Wen W., Wong D.S., Tse H.F., Xu G., Lian Q., Shi J., Fu Q.L. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Mesenchymal Stem Cells Prevent Allergic Airway Inflammation in Mice //Stem Cells. – 2012. – V. 30. – №. 12. – P. 2692-2699. 264. Syftestad G.T., Caplan A.I. Effects of osteoinductive bone matrix extracts on the transition of mesenchymal cells into chondrocytes // Dev.Biol. – 1985. – V.104. – P.348-356. 265. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity //International immunology. – 2005. – V. 17. – №. 1. – P. 1-14. 266. Tamajusuku A.S., Carrillo-Sepúlveda M.A., Braganhol E., Wink M.R., Sarkis J.J., Barreto-Chaves M.L., Battastini A.M. Activity and expression of ecto-5′nucleotidase/CD73 are increased by thyroid hormones in vascular smooth muscle cells //Molecular and cellular biochemistry. – 2006. – V. 289. – №. 1-2. – P. 65-72. 267. Testi R., Phillips J.H., Lanier L.L. T cell activation via Leu-23 (CD69) //The Journal of Immunology. – 1989. – V. 143. – №. 4. – P. 1123-1128. 268. Tobin L.M., Healy M.E., English K., Mahon B.P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4+ T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease //Clinical & Experimental Immunology. – 2013. – V. 172. – №. 2. – P. 333-348. 269. Tokcaer-Keskin Z., Akar A.R., Ayaloglu-Butun F., Terzioglu-Kara E., Durdu S., Ozyurda U., Ugur M., Akcali K.C. Timing of induction of cardiomyocyte differentiation for in vitrocultured mesenchymal stem cells: A perspective for 155 emergencies. //Canadian journal of physiology and pharmacology. – 2009. – V. 87. – №. 2. – P. 143-150. 270. Tomic S., Djokic J., Vasilijic S., Vucevic D., Todorovic V., Supic G., Colic M. Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists //Stem Cells and Development. – 2010. – V. 20. – №. 4. – P. 695-708. 271. Trask O. J. Nuclear factor kappa B (NF-κB) translocation assay development and validation for high content screening. – 2004. 272. Traggiai E., Volpi S., Schena F., Gattorno M., Ferlito F., Moretta L., Martini A. Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Induce Both Polyclonal Expansion and Differentiation of B Cells Isolated from Healthy Donors and Systemic Lupus Erythematosus Patients //Stem Cells. – 2008. – V. 26. – №. 2. – P. 562-569. 273. Trubiani O., Di Primio R., Traini T., Pizzicannella J., Scarano A., Piattelli A., Caputi S. Morphological and cytofluorimetric analysis of adult mesenchymal stem cells expanded ex vivo from periodontal ligament //International journal of immunopathology and pharmacology. – 2004. – V. 18. – №. 2. – P. 213-221. 274. Unitt J., Hornigold D. Plant lectins are novel Toll-like receptor agonists //Biochemical pharmacology. – 2011. – V. 81. – №. 11. – P. 1324-1328. 275. Vallabhapurapu S., Karin M. Regulation and function of NF-κB transcription factors in the immune system //Annual review of immunology. – 2009. – V. 27. – P. 693-733. 276. Vishnubalaji R., Al-Nbaheen M., Kadalmani B., Aldahmash A., Ramesh T. Comparative investigation of the differentiation capability of bone-marrow-and adipose-derived mesenchymal stem cells by qualitative and quantitative analysis //Cell and tissue research. – 2012. – V. 347. – №. 2. – P. 419-427. 277. Waterman R.S., Tomchuck S.L., Henkle S.L., Betancourt A.M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype //PloS one. – 2010. – V. 5. – №. 4. – P. e10088. 278. Wang H.S., Hung S.C., Peng S.T., Huang C.C., Wei H.M., Guo Y.J., Fu Y.S., Lai M.C., Chen C.C. Mesenchymal stem cells in the Wharton's jelly of the human umbilical cord //Stem cells. – 2004. – V. 22. – №. 7. – P. 1330-1337. 279. Weiss M.L., Medicetty S., Bledsoe A.R., Rachakatla R.S., Choi M., Merchav S., Luo Y., Rao M.S., Velagaleti G., Troyer D. Human umbilical cord matrix stem 156 cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson's disease //Stem cells. – 2006. – V. 24. – №. 3. – P. 781-792. 280. Werner S.L., Kearns J.D., Zadorozhnaya V., Lynch C., O'Dea E., Boldin M.P., Ma A., Baltimore D., Hoffmann A. Encoding NF-kappaB temporal control in response to TNF: distinct roles for the negative regulators IkappaBalpha and A20 // Genes Dev. – 2008. – V. 22. – P. 2093-2101. 281. Wu L.C., Zarrin A.A. The production and regulation of IgE by the immune system //Nat. Rev. Immunol. 2014. – V.4. – P. 247—259. 282. Xu M., Zhang B., Liu Y., Zhang J., Sheng H., Shi R., Chen H. The immunologic and hematopoietic profiles of mesenchymal stem cells derived from different sections of human umbilical cord //Acta biochimica et biophysica Sinica. – 2014. – C. 100. 283. Yeager C. L., Ashmun, R. A., Williams, R. K., Cardellichio, C. B., Shapiro, L. H., Look, A. T., Holmes, K. V.. Human aminopeptidase N is a receptor for human coronavirus 229E. – 1992. – V.357. – P. 420-422. 284. Yan H., Wu M., Yuan Y., Wang Z.Z., Jiang H., Chen T. Priming of Toll-like receptor 4 pathway in mesenchymal stem cells increases expression of B cell activating factor //Biochemical and biophysical research communications. – 2014. – V. 448. – №. 2. – P. 212-217. 285. Yan X., Luo H., Zhou X., Zhu B., Wang Y., Bian X. Identification of CD90 as a marker for lung cancer stem cells in A549 and H446 cell lines //Oncology reports. – 2013. – V. 30. – №. 6. – P. 2733-2740. 286. Yañez R., Oviedo A., Aldea M., Bueren J. A., Lamana M.L. Prostaglandin E2 plays a key role in the immunosuppressive properties of adipose and bone marrow tissue-derived mesenchymal stromal cells //Experimental cell research. – 2010. – Т. 316. – №. 19. – С. 3109-3123. 287. Yang Z.F., Ho D.W., Ng M.N., Lau C.K., Yu W.C., Ngai P., Chu P.W., Lam C.T., Poon R.T., Fan S.T. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer //Cancer cell. – 2008. – V. 13. – №. 2. – P. 153-166. 288. Yin T., Li L. The stem cell niches in bone //Journal of Clinical Investigation. – 2006. – V. 116. – №. 5. – P. 1195. 289. Yoo K.H., Jang I.K., Lee M.W., Kim H.E., Yang M.S., Eom Y., Lee J.E., Kim Y.J., Yang S.K., Jung H.L., Sung K.W., Kim C.W., Koo H.H. Comparison of immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from adult human tissues //Cellular immunology. – 2009. – V. 259. – №. 2. – P. 150-156. 157 290. Yoshimura K., Shigeura T., Matsumoto D., Sato T., Takaki Y., Aiba-Kojima E., Sato K., Inoue K., Nagase T., Koshima I., Gonda K. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates //Journal of cellular physiology. – 2006. – V. 208. – №. 1. – P. 64-76. 291. Yu G., Wu X., Dietrich M.A., Polk P., Scott L.K., Ptitsyn A.A., Gimble J.M. Yield and characterization of subcutaneous human adipose-derived stem cells by flow cytometric and adipogenic mRNA analyzes //Cytotherapy. – 2010. – V. 12. – №. 4. – P. 538-546. 292. Zaher W. Harkness, L., Jafari, A., Kassem, M. An update of human mesenchymal stem cell biology and their clinical uses //Archives of toxicology. – 2014. – V. 88. – №. 5. – P. 1069-1082. 293. Zhang H., Kong H., Zeng X., Guo L., Sun X., He S. Subsets of regulatory T cells and their roles in allergy //Journal of translational medicine. – 2014. – V. 12. – №. 1. – P. 125. 294. Zeuner M., Bieback K., Widera D. Controversial Role of Toll-like Receptor 4 in Adult Stem Cells //Stem Cell Reviews and Reports. – 2015. – P. 1-14. 295. Ziegler S.F., Ramsdell F., Alderson M.R. The activation antigen CD69 //Stem cells. – 1994. – V. 12. – №. 5. – P. 456-465. 296. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells //Molecular biology of the cell. – 2002. – V. 13. – №. 12. – P. 4279-4295. 297. Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G., Edwards C.J., Moss J., Burger J.A., Maini R.N. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals //Arthritis research. – 2000. – V. 2. – №. 6. – P. 477-488. 158
