РОЛЬ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ-2, -4 И

УДК 612.94.017.1-053.1.083
РОЛЬ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ-2, -4 И -7
В ФОРМИРОВАНИИ ПОВЫШЕННОЙ
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АПОПТОЗУ Т-ЛИМФОЦИТОВ
ПУПОВИННОЙ КРОВИ НОВОРОЖДЕННЫХ
И.Е. Лебедева, И.Е. Рубцова, М.Ф. Никонова, Е.А. Грачева,
О.Н. Бабайкина, В.Ю Талаев
Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии
им. академика И.Н. Блохиной
В данной работе исследовались некоторые механизмы усиления апоптоза Т-клеток новорожденных. Показано, что интерлейкины-2, -4 и -7
уменьшают долю вступивших в апоптоз клеток в культурах с активированными Т-лимфоцитами практически всех обследованных, а ингибитор
продукции интерлейкинов — дексаметазон усиливает апоптоз только у
детей с высокими исходными значениями апоптоза в культурах. Полученные данные свидетельствуют о том, что дефицит ИЛ-2, -4 и -7 может
участвовать в усилении апоптоза лимфоцитов новорожденных, но не является единственным фактором, определяющим чувствительность лимфоцитов к апоптозу.
Ранее нами было показано, что мононуклеарные клетки пуповинной крови
(МНПК) части новорожденных отвечают на активацию входящих в их состав Тлимфоцитов массовой гибелью Т-клеток, сопровождающейся характерными для
апоптоза изменениями (Талаев и др., 1997). Одной из возможных причин массовой гибели Т-клеток пуповинной крови при активации может быть дефицит продукции интерлейкинов (ИЛ), обеспечивающих выживание и пролиферацию активированных Т-лимфоцитов (Amos et al., 1998; Mondino, Khoruts, Jenkins, 1996;
Soares, 1998). В данной работе исследовалось влияние интерлейкина-2 (ИЛ-2),
ИЛ-4 и ИЛ-7, на пролиферацию и апоптоз лимфоцитов новорожденных. Слабый
пролиферативный ответ Т-клеток на активацию и повышенная чувствительность
лимфоцитов к апоптозу чаще наблюдается у детей, рожденных матерями с патологически развивавшейся беременностью (Талаев, Лебедева, Талаева, 1999). В
связи с этим группа обследованных формировалась по наличию у матерей новорожденных следующих патологий и отклонений во время беременности: недоношенность; наличие в анамнезе выкидышей, мертворождений и преждевременных
родов и угроза прерывания данной беременности, потребовавшая стационарного
лечения; хронический и гестационный пиелонефрит; вирусные инфекции в ходе
беременности; анемия 2 и 3 степени; сочетанные гестозы. Объектом исследования
являлись МНПК 55 новорожденных. Обследованные дети имели срок внутриутробного развития от 27 до 40 недель. Масса новорожденных была от 980 г до
4350 г.
В качестве активатора Т-лимфоцитов использовали очищенные моноклональные антитела (МКА) ИКО-90 к молекуле CD3 (Медбиоспектр, Москва). В работе
использовались рекомбинантные человеческие ИЛ-2, -4 и -7 в конечных концен30
трациях 5, 5, и 10 нг/мл, соответственно (Sigma, USA). В качестве агента, подавляющего продукцию цитокинов, использовали натриевую соль фосфата дексаметазона (KRKA, Slovenia) в концентрации 0.4 мкг/мл. Пролиферацию клеток в
культурах МНПК оценивали по включению меченного тритием метилтимидина.
Результаты выражали в индексах стимуляции пролиферации (ИС — отношение
среднего значения пролиферации в импульсах в мин. в опытных и контрольных
культурах). Апоптоз оценивали по гиподиплоидной фракции клеток с помощью
проточной цитофлюориметрии окрашенных иодидом пропидиума клеток.
18
ИС
16
14
12
10
8
6
4
2
0
контроль
МКА к CD 3
IL-2
IL-2 + МКА
к CD3
IL-4
IL-4 + МКA
к CD3
IL-7
IL-7 + МКA
к CD 3
Рис. Влияние дексаметазона на пролиферативный ответ Т-клеток пуповинной крови
на активацию антителами к молекуле CD3 (1 мкг/мл), ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-7.
По оси ординат – ИС. Серые столбики – пролиферация клеток без дексаметазона,
черные столбики – с дексаметазоном (0.4 мкг/мл)
Обследованные дети были разделены на две группы по доле клеток в апоптозе
при активации Т-лимфоцитов антителами к CD3 в концентрации 1 мкг/мл. В первую группу вошли дети (N=25) с низким уровнем апоптоза в культурах МНПК к
48 часам культивирования. Доля гиподиплоидных клеток в культурах МНПК этих
детей была не более 20%, то есть не превышала средней концентрации гиподиплоидных клеток у 10 обследованных нами взрослых здоровых доноров
31
(21.8+3.8%). Во вторую группу вошли дети (N=30) с долей гиподиплоидных клеток в культурах более 20%.
Добавление ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-7 в культуры МНПК детей группы 2 вызывало
достоверное уменьшение размеров гиподиплоидной фракции клеток в культурах с
Т-лимфоцитами, активированными антителами к CD3 (табл. 1). Кроме того, ИЛ-4
уменьшал долю клеток в апоптозе в культурах неактивированных МНПК детей
группы 2. У детей группы 1 добавление ИЛ-2, -4 и -7 в культуры МНПК вызывало
небольшое, но статистически достоверное уменьшение доли клеток в апоптозе.
Следует отметить, что вызванное интерлейкинами уменьшение гиподиплоидной
фракции МНПК у обследованных детей носило практически обязательный характер. Уменьшение этого показателя под действием ИЛ-2 наблюдалось у 77.5% детей в культурах с не активированными Т-лимфоцитами и у 95% детей в активированных культурах. Под действием ИЛ-4 доля клеток в апоптозе уменьшалась у
89.7% детей в не активированных культурах, и у 846% детей — в активированных
культурах, а под действием ИЛ-7 — у 66.7% и у 83.3% детей, соответственно.
Таблица 1
Влияние ИЛ-2, -4 и -7 на размер гиподиплоидной
фракции МНПК новорожденных
Интерлейкины
Без ИЛ
ИЛ-2 (5 нг/мл)
ИЛ-4 (5 нг/мл)
Без ИЛ (для
теста с ИЛ-7)
ИЛ-7 (10 нг/мл)
Доля гиподиплоидных клеток, %
Группа 1
Группа 2
МКА к CD3
МКА к CD3
Без МКА к CD3
Без МКА к CD3
(1 мкг/мл)
(1 мкг/мл)
11.72+0.87
13.33+0.81
33.59+3.80
37.27+3.76
9.67+0.85
9.46+078 **
28.07+3.35
27.65+3.34 *
7.78+0.64 **
10.10+0.74 **
23.73+3.76 *
26.99+3.63 *
10.11+1.07
12.0+1.0
36.82+6.84
41.87+6.05
8.15+0.93 *
8.47+0.87 **
30.98+5.77 *
32.98+5.97 *
Данные представлены в виде М+m.
* Уменьшение гиподиплоидной фракции МНПК под действием ИЛ достоверно
при р < 0.05.
** При р < 0.005.
У всех детей группы 2 добавление дексаметазона вызывало увеличение гиподиплоидной фракции МНПК, активированных антителами к CD3 в концентрации
1 мкг/мл (табл. 2). Добавление ИЛ-2 или ИЛ-4 в культуры МНПК с антителами к
CD3 и дексаметазоном уменьшало долю клеток в апоптозе до уровня, определяемого в культурах без дексаметазона. В активированных и неактивированных
культурах МНПК детей группы 1 дексаметазон не вызвал статистически достоверных изменений доли клеток в апоптозе. Влияние дексаметазона на пролиферацию МНПК было оценено у 11 детей группы 1 и 8 детей группы 2, при этом различий в действии дексаметазона на пролиферацию между этими группами обнаружено не было. Средние значения ИС всех 19 обследованных приведены на рис.
Дексаметазон полностью отменял пролиферативный ответ Т-клеток на активацию
антителами к CD3, подавлял пролиферацию не активированных МНПК в присутствии ИЛ-2 и ИЛ-4. Введение ИЛ-2 в культуры с активированными Т-клетками и
32
Таблица 2
Влияние дексаметазона на размер гиподиплоидной фракции
МНПК новорожденных
Группы
Группа
1
Группа
2
МКА к
CD3,
мкг/мл
0
1.0
0
1.0
Дексаметазон,
мкг/мл
0
0.4
0
0.4
0
0.4
0
0.4
Доля гиподиплоидных клеток (%) при добавлении:
без интерлейкинов
9.0+1.2
10.50+1.2
11.13+1.42
12.42+1.72
25.76+4.45
27.67+6.46
28.61+2.78**
37.95+2.92**
ИЛ-2
(5 нг/мл)
7.25+1.51
7.5+1.14
7.67+1.0
8.27+0.95
24.23+3.58
25.44+3.15
25.73+3.32
25.44+3.15
ИЛ-4
(5 нг/мл)
5.31+0.79**
7.82+0.91**
7.14+0.9
8.45+1.54
17.3+1.58**
26.61+3.2**
23.95+2.72
26.61+3.2
ИЛ-7
(10 нг/мл)
7.21+1.58
8.77+1.88
7.82+1.5
9.36+1.93
24.51+3.82
30.36+2.69
22.97+3.85*
33.32+4.91*
Данные представлены в виде М+m.
* Увеличение гиподиплоидной фракции МНПК под действием дексаметазона достоверно
при р < 0.05.
** При р < 0.02.
дексаметазоном лишь частично восстанавливает пролиферацию. Добавление в
культуры активированных и неактивированных МНПК рекомбинантного ИЛ-7
полностью отменяло ингибирующее действие дексаметазона на пролиферацию.
Более того, дексаметазон увеличивал пролиферативный ответ МНПК, активированными антителами к CD3 и ИЛ-7. Различия средних значений пролиферации
были недостоверны, однако анализ индивидуальных результатов оценки пролиферации показал, что дексаметазон вызывал достоверное усиление пролиферации
культур с активированными Т-клетками у 31.6% детей. Такое неожиданное «ростовое» действие дексаметазона, по-видимому, объясняется следующим образом:
во-первых, ИЛ-7 является наиболее эффективным фактором роста Т-клеток новорожденных, заменяющим другие факторы роста, продукция которых подавляется
дексаметазоном, во-вторых, дексаметазон, наряду с цитокинами, стимулирующими рост Т-клеток, подавляет продукцию супрессорных факторов Т-лимфоцитами
или другими входящими в состав МНПК клетками. Это предположение подтверждается литературными данными: дексаметазон, в использованной нами концентрации, подавляет продукцию γ-интерферона и факторов некроза опухоли — цитокинов, способных подавлять пролиферацию Т-клеток, а ИЛ-7, в отличие от
ИЛ-2, поддерживает жизнеспособность и пролиферацию неактивированных наивных Т-клеток пуповинной крови и максимально усиливает пролиферацию активированных антигеном наивных Т-лимфоцитов новорожденных (Amos, 1998,
Soares et al., 1998, Webb, Foxwell, Feldmann, 1999). Такая потребность Т-клеток в
пуповинной крови новорожденных в ИЛ-7 роднит их с тимоцитами, ключевую
роль в развитии которых также играет ИЛ-7 (Grabstein, 1993).
Таким образом, показано, что добавление ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-7 уменьшало долю
вступивших в апоптоз клеток в культурах МНПК с активированными Т-клетками
практически всех обследованных новорожденных. Дексаметазон увеличивал долю вступивших в апоптоз клеток в культурах МНПК с активированными Т33
лимфоцитами у детей с высокими значениями апоптоза в культурах и не влиял на
апоптоз МНПК с низким исходным уровнем апоптоза в культурах. Полученные
нами данные свидетельствуют о том, что дефицит ИЛ-2, -4 и -7 может участвовать в усилении апоптоза в культурах МНПК новорожденных, однако не является
единственным фактором, определяющим чувствительность лимфоцитов новорожденных к программированной гибели.
Работа поддержана РФФИ — проект 98-04-48134.
ЛИТЕРАТУРА
Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Мазепа В.Н., Талаева Е.Б. Индуцированный активацией
апоптоз лимфоцитов крови новорожденных. Зависимость характера ответа от клинического состояния новорожденных // Иммунология, 1997. № 1. С. 47–50.
Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Талаева Е.Б. Связь патологии беременности с характером ответа на активацию Т-лимфоцитов пуповинной крови новорожденных // Педиатрия,
1999. № 5. С. 110–111.
Amos C.L., Woetmann A., Nielsen M., et al. The role of caspase 3 еnd Bcl-xL in the action
of interleukin 7 (IL-7): a survival factor in activated human T cells // Cytokine. 1998. V. 10(9).
P. 662–668.
Grabstein K.H., Waldshmidt T.J., Finkelman F.D. et al. Inhibition of murine B and T
lymphopoiesis in vivo by an anti-interleukin 7 monoclonal antibody // J. Exp. Med. 1993. V. 178.
P. 257–264.
Mondino A., Khoruts A., Jenkins M.K. The anatomy of T-cell activation and tolerance //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 2245–2252.
Soares M.V., Borthwick N.J., Maini M.K., et al. IL-7-dependent extrathymic expansion of
CD45RA+ T cells enablеs preservation of a naive repertoire // J. Immunol. 1998. V. 161(11).
P. 5909–5917.
Webb L.M, Foxwell B.M, Feldmann M. Putative role for interleukin-7 in the maintenance of
the recirculating naive CD4+ T-cell pool. // Immunology. 1999. V. 98 (3). P. 400–405.
34