Multiple forms of the proliferating cell nuclear antigen
advertisement
Нарыжный Станислав Николаевич Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA): координатор клеточных функций в норме и патологии Гатчина 2010 2 Оглавление Список сокращений 5 Введение 13 Глава 1. PCNA в протеоме (базы данных на основе 2DE) Основные выводы 20 25 Глава 2. PCNA и протеом при клеточной пролиферации Основные выводы 26 39 Глава 3. PCNA и канцерогенез 3.1. Белковые профили нормальных и раковых клеток Основные выводы 40 40 45 Глава 4. Количественные аспекты Основные выводы 46 47 Глава 5. Пост-трансляционные модификации PCNA 5.1. Убиквитинирование и SUMO-илирование 5.1.1. Протеолиз PCNA является убиквитин-зависимым 5.1.2. Низкомолекулярные фрагменты PCNA являются результатом действия протеосом 5.1.3.Протеолиз PCNA in vitro может происходить во время изоэлектрофокусирования 5.1.4. Протеолиз PCNA является убиквитин-зависимым 5.1.5. Правильная структура PCNA жизненно важна для клеточных функций 5.1.6. Убиквитинирование PCNA может быть механизмом переключения работы полимераз 5.2. Фосфорилирование 5.2.1. PCNA не фосфорилирован in vivo 5.3. Ацетилирование 5.3.1. PCNA может быть ацетилирован in vivo 5.3.2. Субклеточная локализация изоформ PCNA в контексте клеточного цикла 5.3.3. Ацетилирование и деацетилирование PCNA может происходить с помощью ацетилазы р300 и деацетилазы HDAC 5.3.4. Ацетилированный PCNA имеет большее сродство к ДНК полимеразам, чем деацетилированный Основные выводы 48 53 53 Глава 6. Структура PCNA 6.1. Мономеры PCNA образуют тример в виде кольца 6.2. PCNA млекопитающих организован в виде двойного тримера 56 58 58 61 62 64 67 70 74 75 79 79 84 84 84 86 3 6.2.1 Аминокислотные остатки Arg-5 и Lys-110 являются критическими для формирования двойного тримера PCNA 95 6.2.2. Образование двойного тримерного комплекса PCNA существенно для деления и выживаемости клеток млекопитающих 100 6.2.3. Только двойной тример, но не одиночный тример может одновременно взаимодействовать с ДНК полимеразой дельта и CAF1 102 6.2.4. Функциональная модель PCNA млекопитающих 105 Основные выводы 108 Глава 7. Взаимодействия PCNA 7.1. Структурные аспекты взаимодействий PCNA 7.1.1. Репликация ДНК 7.1.2. Репарация ДНК 7.1.3. Контроль клеточного цикла, выживаемость 7.1.4. Сборка хроматина и когезия хроматид 7.1.5. Транскрипция 7.1.6. Другие разнообразные функции 7.1.7. Гликолиз 7.1.8.Взаимодействующие с PCNA белки, обнаруженные Фар-Вестерном 7.1.9. Локализация PCNA 7.1.10. Активность ферментов гликолиза и PCNA Основные выводы 110 112 116 127 129 132 147 150 151 Глава 8. Заключение 172 Глава 9. Материалы и методы исследования Реагенты Антитела Клетки, клеточные культуры и клеточные экстракты Плазмиды Синхронизация по клеточному циклу Сортировка клеток (fluorescence-activated cell sorting, FACS) Мечение in vivo Субклеточное фракционирование Клеточная трансфекция Выделение PCNA хроматографией и электрофорезом Сшивки формальдегидом Одномерный электрофорез (SDS-PAGE) Нативный электрофорез Голубой нативный электрофорез (BNPAGE) Двумерный электрофорез (2DE) Окрашивание белков и сушка гелей Иммуноосаждение Перенос на мембрану Окрашивание мембран 175 175 176 177 179 180 183 183 184 184 186 187 187 189 190 190 191 194 194 195 156 165 168 170 4 Иммунодетектирование Голубой сухой Вестерн “Классический”Вестерн-блот Фар-Вестерн Моделирование Иммуноокрашивание клеток Белки и ферменты Масс-спектрометрия Список литературы 195 195 197 198 199 199 200 201 203 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 1433E_HUMAN (здесь и далее используется написание для входа в базу знаний UniProtKB), белок 14-3-3 эпсилон 1433S_HUMAN, белок 14-3-3 сигма 1433B_HUMAN, белок 14-3-3 бета/альфа 184B5, эпителиальные клетки молочной железы человека 2DE (two dimensional electrophoresis), двумерный электрофорез белков ATФ, аденозин трифосфат АДФ, аденозин дифосфат ATM_HUMAN (ataxia-telangiectasia mutated kinase), киназа, мутированная при атаксии телангектозии ATR_HUMAN (ataxia-telangiectasia- and Rad-3-related kinase), киназа, родственная киназам АТМ и Rad3 ACTB_HUMAN (actin beta), актин бета человека ANXA2_HUMAN (annexin A2), аннексин A2 человека ANXA1_HUMAN (annexin A1), аннексин A1 человека ALDOA_HUMAN (aldolase A), альдолаза A человека 5 ACN (ацетонитрил), ацетонитрил ААА+ (ATPases Associated with various cellular Activities), АТФазы, участвующие в различных клеточных активностях BrdU (bromodeoxyuridine), бромодезоксиуридин БСА, бычий сывороточный альбумин BAZ1B_HUMAN (Bromodomain adjacent to zinc finger domain protein 1B), фактор транскрипции синдрома Вильямса человека BL (back loop), петля на обратной стороне PCNA BNPAGE (Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis), голубой нативный электрофорез в полиакриламидном геле C4 ZipTip, наконечник для микропипетки с микроколонкой обратной фазы С4 CUL2_HUMAN (cullin-2), куллин-2 человека Cdk (cyclin-dependent kinase), циклин зависимая киназа C-конец, карбоксильное окончание аминокислотной последовательности CH60_HUMAN (chaperonin 60), белок теплового шока человека с массой 60 кДа, митохондриальный предшественник CALR_HUMAN (calreticulin), калретикулин человека, предшественник CAF-1 (chromatin assembly factor), фактор сборки хроматина COF1_HUMAN (coffilin-1), кофилин-1 человека СНО (Chinese hamster ovary) cells, клетки яичников китайского хомячка CAH2_HUMAN (carbonic anhydrase 2), угольная ангидраза 2 человека CDN1A_HUMAN (Cyclin-dependent kinase inhibitor 1А), циклин-зависимый ингибитор киназы 1А (белок р21) человека 6 ChIP-assay (chromatin immunoprecipitation assay), иммуноосаждение хроматина CL (central loop), центральная петля на лицевой стороне PCNA дАТФ, дезоксиаденозин трифосфат дЦТФ, дезоксицитидин трифосфат дГТФ, дезоксигуанозин трифосфат дНТФ, дезоксирибонуклеотид фосфат DNMT1 (DNA methyl transferase 1), ДНК цитозин метилтрансфераза 1 ДТТ, дитиотриитол ДНК, дезоксирибонуклеиновая кислота DNA-PK (DNA-dependent protein kinase), ДНК-зависимая протеин киназа D. melanogaster ( Drosophila melanogaster), Дрозофила меланогастер EP300_HUMAN (E1A binding protein p300), белок p300 человека ECO1 (Establishment of cohesion protein 1), N-ацетилтрансфераза, участвующая в когезии хромосом EF1A2_HUMAN (Elongation factor 1-alpha 2), фактор элонгации 1 альфа 2 человека ИЭФ, изоэлектрофокусирование EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), этилендиамин тетра ацетат E. coli (Escherichia coli), кишечная палочка EF1B_HUMAN (elongation factor 1B), фактор элонгации 1-бета человека ENOA_HUMAN (Alpha-enolase A), альфа-энолаза А FACS (fluorescence-activated cell sorting), сортировка клеток проточной флуориметрией FBS (fetal bovine serum), бычья фетальная сыворотка 7 FEN-1 (flap structure-specific endonuclease-1), структурно-специфическая эндонуклеаза 1 FAT (factor acetyl transferase), фактор ацетил трансфераз FRAP (fluorescence recovery after photobleaching), восстановление флюоресценции после обесцвечивания HAT (histone deacetylase), гистон деацетилаза GFP (green fluorescent protein), зеленый флюоресцирующий белок GFP-PCNA (green fluorescent protein), зеленый флюоресцирующий белок, объединенный с PCNA GST (glutathione S-transferase), глютатион S-трансфераза GCR (gross chromosomal rearrangement), массовые хромосомные перестановки YFP (yellow fluorescent protein), желтый флюоресцирующий белок ГТФ, гуанозин трифосфат G3P_HUMAN (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), глицеральдегид-3фосфат дегидрогеназа человека GRP78_HUMAN (78 kDa glucose-regulated protein), предшественник регулируемого глюкозой белка человека массой 78 кДа HNRH1_HUMAN (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H), гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин Н человека HMEC (human mammary epithelial cells), эпителиальные клетки молочной железы человека Hs578Bst (Homo Sapiens 578 Breast), эпителиальные бессмертные нормальные клетки молочной железы человека 8 HDAC (Histone deacetylase), гистон деацетилаза HSP7C_HUMAN (Heat shock cognate 71 kDa protein), человеческий белок с массой 71 кДа, родственный белкам теплового шока HS90B_HUMAN (Heat shock protein 90-beta), человеческий белок теплового шока с массой 90 кДа HEPES (N-[2-hydroxyethyl]-piperazine-N‟-[2-ethanesulphonic acid]), N-[2гидроксиэтил]-пиперазин-N '- [2-этансульфонной кислоты] HMG (high-mobility group), группа белков высокой подвижности IPG (immobilized polycrylamide gel), иммобилизованный полиакриламидный гель IPG – буфер, буфер для иммобилизованного полиакриламидного геля IP (immunoprecipitation), иммуноосаждение IDCL (interdomain connecting loop), петля, соединяющая внутренние домены PCNA ICBP90 (inverted CCAAT box binding protein 90) – белок 90, связывающийся с обратным доменом CCAAT K2C7_HUMAN (Keratin, type II cytoskeletal 7), человеческий кератин 7, тип II K2C8_HUMAN (Keratin, type II cytoskeletal 8), человеческий кератин 8, тип II K1C17_HUMAN (Keratin, type I cytoskeletal 17), человеческий кератин 17, тип I кДа, килодальтон LDS (lithium dodecyl sulfate), додецилсульфат лития LDHA_HUMAN (L-lactate dehydrogenase A chain), лактат дегидрогеназа А человека MDHM_HUMAN (Malate dehydrogenase, mitochondrial precursor), малат дегидрогеназа человека, митохондриальный предшественник MDA-MB468, эпителиальные раковые клетки молочной железы человека 9 MDA-MB231, эпителиальные раковые (аденокарцинома) клетки молочной железы человека MCF-7 (Michigan Cancer Foundation -7) эпителиальные раковые (breast ductal carcinoma) клетки молочной железы человека MCF10A (Michigan Cancer Foundation 10А), эпителиальные нераковые клетки молочной железы человека с отдельными свойствами раковых клеток MG132 (MyoGenetics), протеосомный ингибитор, Z-Leu-Leu-Leu-aldehyde carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal MDM2_HUMAN (mouse double minute 2), E3 убиквитин-протеин лигаза человека Mdm2 MALDI TOF (matrix assisted laser deionization time of flight), матричная лазерная десорбционная ионизационая времяпролетная масс-спектрометрия MAPK (mitogen-activated protein kinase), митоген-активируемая протеин киназа MMS (methyl methanesulfonate), метил метан сульфонат MYH (MutY homolog DNA glycosylase), ДНК гликозилаза, гомолог MutY MPG (Methylpurine-DNA glycosylase), ДНК-3-метиладенин гликозилаза MEGM (Mammary Epithelial Growth Medium), ростовая среда для эпителиальных клеток молочных желез NER (nucleotide excisssion repair), эксцизионная репарация нуклеотидов NAD+ (nicotinamide adenine dinucleotide (oxidized form), никотинамид аденин динуклеотид (окисленная форма) NADH (nicotinamide adenine dinucleotide (reduced form), никотинамид аденин динуклеотид (восстановленная форма) 10 N-terminus (amino terminus), амино-конец полипептидной цепи NPM_HUMAN (nucleophosmin), нуклеофосмин (нюматрин, B23) NLS (nuclear localization signal), сигнал ядерной локализации PBS (phosphate buffer saline), фосфатно-солевой буфер pEGFPCNA, плазмида для экспрессии комбинированного белка GFP и PCNA PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), фенилметилсульфонилфосфат PARP (Poly(ADP-ribose) polymerase), поли (АДФ-рибоза) полимераза РЕТ (positron emission tomography), позитронная томография PCNA (proliferating cell nuclear antigen), ядерный антиген пролиферирующих клеток PIP (PCNA-interacting peptide), взаимодействующий с PCNA пептид PIP-бокс, аминокислотная последовательность, взаимодействующая с PCNA PC10, моноклональные антитела к PCNA (PC10 - номер клона) PKC (protein kinase C), протеин киназа С PGK1_HUMAN (Phosphoglycerate kinase 1), фосфоглицерат киназа 1 человека PRDX1_HUMAN (Peroxiredoxin-1), пероксиредоксин-1 человека PRDX2_HUMAN (Peroxiredoxin-2), пероксиредоксин-2 человека PRDX6_HUMAN (Peroxiredoxin-6), пероксиредоксин-6 человека PDIA1_HUMAN (Protein disulfide-isomerase А1), протеин дисульфит изомераза человека, предшественник PPIA_HUMAN (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A), пептидил-пролил цис-транс изомераза А человека PGK1_HUMAN (Phosphoglycerate kinase 1), фосфоглицерат киназа 1 человека 11 PGAM1_HUMAN (Phosphoglycerate mutase 1), фосфоглицерат мутаза 1 человека pI (isoelectric point), изоэлектрическая точка PMF (peptide mass fingerprint), дактилоскопия по массе пептидов PVDF (Polyvinylidene Fluoride), поливинилидин флюорид P53_HUMAN, белок p53 человека PBS (phosphate buffer saline), фосфатно солевой буфер ПТМ, пост-трансляционные модификации RSSA_HUMAN (40S ribosomal protein SA), белок SA из 40S рибосом RFC (replication factor C), репликативный фактор С РНК, рибонуклеиновая кислота RPA (replication factor A), репликативный фактор А ROA2_HUMAN, гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины A2/B1 SCL (sarcolectin), сарколектин SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier), маленький похожий на убиквитин белок S. pombe (Schizosaccharomyces pombe), делящиеся дрожжи S. cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae), дрожжи из рода сахаромицетов, размножающиеся почкованием SDS (sodium dodecyl sulphate), додецилсульфат натрия SDS-PAGE, одномерный электрофорез в полиакриламидном геле с SDS STMN1_HUMAN (stathmin 1), статмин 1 человека SET_HUMAN, белок SET человека SV40 (simian virus 40), обезьяноподобный вирус 40 TEMED (Tetramethylethylenediamine), тетраметилэтилендиамин 12 TLS (translesion synthesis), синтез в обход повреждений TBA1B_HUMAN (tubulin alpha-1B), тубулин человека, альфа-1B цепь TBB5_HUMAN (tubulin beta), тубулин человека, бета цепь TCTP_HUMAN (translationally-controlled tumor protein 9), трансляционноконтролируемый белок 9 опухоли человека TPMI_HUMAN (tropomiosin), тропомиозин альфа-1 TPM3_HUMAN (tropomiosin), тропомиозин альфа-3 TGS буфер (Tris Glycine SDS), Трис- глициновый буфер с SDS TPIS_HUMAN (Triosephosphate isomerise), триосефосфат изомераза TFA (Trifluoroacetic acid), трифторуксусная кислота TSA (trichostatin A), трихостатин А (ингибитор гистон деацетилазы) UV-light (ultraviolet light), ультрафиолетовый свет XP (xeroderma pigmentosum), ксеродерма пигментозиум UHRF1 (ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains 1) UDSFE (upside-down stopped-flow electrofractionation), дискретное электрофракционирование с переворотом Введение Белки являются основными участниками почти всех клеточных процессов, поэтому их поведение на молекулярном уровне лежит в основе механизмов, определяющих процессы клеточной жизнедеятельности. Функции и механизмы работы белков внутри клетки напрямую зависят от их локализации, количества и качества. Под 13 качеством подразумевается правильная (нативная) структура белков, а также возможность динамики этой структуры. Динамика обеспечивается различными механизмами, в первую очередь пост-трансляционными модификациями и межмолекулярными взаимодействиями (белок-белок, белок-ДНК, белок-РНК и т.д.). Если раньше оценить масштаб этих динамических изменений не было технических возможностей, то с приходом эры протеомики появились его первые оценки. Последние данные показывают, что в среднем каждый белок подвержен 6-7 модификациям, а количество обнаруженных партнеров растет лавинообразно с повышением чувствительности методик их обнаружения (Xenarios, Rice et al. 2000; Bader, Betel et al. 2003; Mann and Jensen 2003; Walsh, Garneau-Tsodikova et al. 2005; Stumpf, Thorne et al. 2008). Вслед за термином “протеомика” для того, чтобы более детально манипулировать взаимодействиям, стали данными появляться по такие белковым термины, модификациям как и их “интерактомика”, “фосфопротеомика”, “гликопротеомика” и т.д. Непрерывно продуцируемый огромный объем информации привел к востребованности биоинформатики и многочисленных баз данных (Xenarios, Rice et al. 2000; Bader, Betel et al. 2003), а в конечном итоге – к образованию новой научной дисциплины, системной биологии (Ideker, Galitski et al. 2001; Liu 2005). Центральным подходом в системной биологии является объединение взаимодействующих друг с другом клеточных компонентов (белков) в многочисленные сети, образующие функциональные модули, а вся совокупность этих взаимодействий, характерная для каждого объекта, носит название “интерактома”(Sanchez, Lachaize et al. 1999). Желание описать и вместить живой объект в рамки компьютерных технологий привело к созданию множества программ, 14 различным образом манипулирующих и “визуализирующих” имеющуюся информацию о белковых взаимодействиях (Ju, Park et al. 2003; Batagelj and Brandes 2005; Iragne, Nikolski et al. 2005; Klammer, Roopra et al. 2008; Minguez, Gotz et al. 2009; Fung, Wilkins et al. 2010). Возможность получения такой информации в большом объеме позволила создавать интерактомы даже на уровне целого организма (Ito, Tashiro et al. 2000; Uetz, Giot et al. 2000; D'Alessandro, Righetti et al. 2010). Некоторые белки отличаются особенно повышенным количеством партнеров и выглядят на картах интерактомики, как объединяющие центры или хабы (hubs). В зависимости от характера белок-белковых взаимодействий хабы подразделяются на две категории: “центры вечеринок” (party hubs), где взаимодействие происходит со многими партнерами одновременно, и “центры свиданий” (date hubs), когда взаимодействие с разными партнерами происходит в разных местах и в разное время (Han, Bertin et al. 2004). Так как для “центров вечеринок” характерно образование неких белковых комплексов, уровни их экспрессии и их партнеров должны коррелировать во времени тех процессов, где они задействованы. Наоборот, в случае “центров свиданий” такая корреляция отсутствует. Наиболее известными хабами являются, например, такие белки с разнообразными функциями, как актин, 14-3-3 или р53 (Collavin, Lunardi et al. 2010). Анализ последствий, вызванных нарушениями в сети белок-белкового взаимодействия, позволил предложить некую модель организации протеома из отдельных модулей или биологических процессов. Каждый модуль регулируется через “центр вечеринок”, в то время как “центры свиданий” организовывают весь протеом, связывая отдельные модули. Например, в случае дрожжей, “центр свиданий“ калмодулин связывает четыре разных биологических модуля: 1) катионовый 15 гомеостаз, 2) упаковка и стабилизация белков, 3) отпочкование, полярность клеток и образование филаментов, 4) эндоплазматический ретикулум. А такие “центры вечеринок“, как Sec17, Sec22 и Vti1, все функционируют внутри модуля “эндоплазматический ретикулум”. Весь протеом является более чувствительным к нарушениям в работе date hubs, чем party hubs (Han, Bertin et al. 2004). Внутри модуля “репликация ДНК” особенно выделяется ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA, proliferating cell nuclear antigen) (Рис.1). Как будет видно из дальнейшего изложения, PCNA является хабом, причем хабом с широкими функциями, который может координировать не только отдельный модуль, но и взаимодействие многих модулей. Основные физико-химические параметры PCNA (изоточка, масса, антигенные свойства) хорошо сохранились при эволюции (Celis, Bravo et al. 1984), что предполагает жизненно важную роль этого белка в клеточном метаболизме. Сама по себе история открытия и изучения PCNA заслуживает особого внимания и может служить образцом того, как исследования в самых разных областях могут в конечном итоге пересечься. Изначально этот белок был открыт Миячи (Miyachi) в 1978 году по наличию антител к нему у пациентов с аутоиммунным заболеванием “системная красная волчанка” (systemic lupus erythematosus) (Miyachi, Fritzler et al. 1978). Чуть 16 Рис. 1. Визуализация сети белок-белковых взаимодействий, вовлеченных в репликацию ДНК. (А) увеличенная область центра вечеринок (party hub). (В) увеличенная область соединения хабов CDC6 и PCNA. (С) увеличенная область хаба PCNA. Белки, которые образуют закрытые петли с PCNA, отмечены красным цветом. (Fung, Wilkins et al. 2010). Опубликовано с разрешения редакции журнала Proteomics. позднее Браво и Целис (Bravo and Celis), используя двумерный электрофорез высокого разрешения (2DE), обнаружили белок, экспрессия которого менялась в течение клеточного цикла (Bravo and Celis 1980). Вполне логично они дали ему название циклин (Bravo, Fey et al. 1981; Bravo and Macdonald-Bravo 1987). Дальнейшее изучение показало связь этого белка с репликацией ДНК. Белок показывал характерное перераспределение в ядрах, находящихся в фазе репликации ДНК (S-фаза), и совпадал по локализации с меткой, бромдезоксиуридином, 17 используемым для детектирования репликации ДНК (Bravo, Fey et al. 1981; Celis, Bravo et al. 1984; Bravo and Macdonald-Bravo 1987). Позднее было показано, что PCNA и циклин являются одним и тем же белком (Mathews, Bernstein et al. 1984). Более того, существенный фактор для ДНК репликации вируса SV40 (simian virus 40) in vitro также был идентифицирован как PCNA (Tan, Castillo et al. 1986; Prelich, Tan et al. 1987). Так как затем название “циклин” стало использоваться для другого класса белков, PCNA/циклин сейчас обычно называют просто PCNA. Дальнейшие биохимические и генетические исследования на дрожжах показали, что PCNA функционирует при репликации ДНК как фактор, необходимый для процессивного синтеза ДНК полимеразой дельта (Bauer and Burgers 1990; McAlear, Howell et al. 1994; Ayyagari, Impellizzeri et al. 1995). Структурный анализ, выяснивший, что PCNA организован в виде кольца, которое может быть нанизано на ДНК, дал огромный толчок к изучению функций PCNA. Такое кольцо, охватывающее ДНК, может быть использовано как скользящая скрепка для многих ДНК полимераз, в первую очередь ДНК полимераз дельта и эпсилон, а также, как связывающий фактор для других белков (Krishna, Kong et al. 1994; Fukuda, Morioka et al. 1995; Gulbis, Kelman et al. 1996; Schurtenberger, Egelhaaf et al. 1998; Bowman, O'Donnell et al. 2004; Sakurai, Kitano et al. 2005), многие из которых участвуют в репликации ДНК, репарации ДНК, а также в контроле клеточного цикла. Кроме того, в длинном списке белков, взаимодействующих с PCNA, есть также и белки, участвующие в организации хроматина, транскрипции и других разнообразных процессах. На сегодняшний день можно определенно говорить о том, что PCNA является своего рода платформой, которая устанавливается на ДНК и координирует многие реакции во время 18 репликации или репарации ДНК (Tsurimoto 1998; Tsurimoto 1999; Stucki, Stagljar et al. 2001; Naryzhny, Zhao et al. 2005; Naryzhny 2007) (Рис. 2). Однако в клетке – в нуклеоплазме, а также цитоплазме – присутствует большое количество PCNA, который функционирует и без взаимодействия с ДНК (Bravo and Macdonald-Bravo 1987; Tanno and Taguchi 1999; Maga and Hubscher 2003). Надо сказать, что этот аспект деятельности PCNA практически не изучен, в первую очередь из-за того, что основное внимание в исследованиях уделяется его роли в координации процессов, происходящих при репликации и репарации ДНК. До сего времени этот свободный PCNA рассматривался например как резервный пул, ждущий своей очереди на доставку в хроматин. Однако многочисленные опубликованные и неопубликованные наблюдения указывают на то, что PCNA может функционировать не только в виде нанизанного на ДНК тора, но и в связи с другими клеточными структурами или же даже в свободном виде (Vriz, Lemaitre et al. 1992; Tanno and Taguchi 1999; Grzanka, Skok et al. 2000; Ino and Chiba 2000; Naryzhny and Lee 2001; Morrow, Tung et al. 2004). Нарушение белок-белковых взаимодействий может приводить к возникновению различных заболеваний, включая раковые. Поэтому изучение взаимодействующих партнеров и анализ белковых сетей, образованных белокбелковыми взаимодействиями, представляет собой важный инструмент в диагностике заболеваний, выяснении механизма их возникновения и развития, а также эффективности тех или иных терапевтических подходов (Mayer 1999; Houtman, BardaSaad et al. 2005; Терентьев А.А 2009). PCNA, как белок-хаб, координирующий как отдельные модули, так и их взаимодействие, представляется одним из важных исследований объектов для такого рода исследований. 19 3’ 5’ Topo MCM2-7 primer A DN po lα cdt1 c 10 mcm dc45 GINS RPA FEN1 DNA DNA primer ligase po DNA RFC PCNA pol δ lε PCNA PCNA 1 CAF 1 CAF primer P300 5’ 3’ Topo 5’ 3’ Рис. 2. Схематическое изображение координации работы белков при репликации ДНК млекопитающих. Для упрощения показана репликативная вилка, образующаяся при расплетании двунитевой нити ДНК хеликазным комплексом МСМ2-7 – Cdc45 – GINS с помощью топоизомеразы. В реальности реплицируется хроматин (нуклеопротеид) (см. Рис.41б). ДНК полимеразы дельта и эпсилон закреплены на ДНК с помощью PCNA и ведут синтез, соответственно, на 20 запаздывающей и лидирующей нитях ДНК. На запаздывающей нити также работают ДНК полимераза альфа/праймаза и факторы, вовлеченные в созревание фрагментов Оказаки. Показаны и другие факторы, вовлеченные в инициацию репликации (RPA, сdt1, mcm10) и сборку хроматина (CAF1, P300). RFC производит загрузку и разгрузку PCNA на ДНК, связываясь с PCNA в положении, которое на рисунке занимают ДНК полимеразы. Глава 1. Место PCNA в протеоме (2DE базы данных) Впервые PCNA на двумерным электрофорезе (2DE) “появился” в 1980 году, когда Браво и Целис (Bravo and Celis) провели анализ синтеза белка в зависимости от времени клеточного цикла клеток HeLa (Bravo and Celis 1980; Bravo, Fey et al. 1981). Позднее было организовано несколько разных баз данных на основе двумерных электрофоретических карт (Celis, Gromov et al. 1996). Положение PCNA разного происхождения на некоторых из этих карт было определено (Mathews, Bernstein et al. 1984; Morris and Mathews 1989; Celis, Dejgaard et al. 1990; Celis and Olsen 1994; Okuzawa, Franzen et al. 1994; Naryzhny and Lee 2001; Naryzhny and Lee 2004). В опубликованных базах данных PCNA присутствует на таких картах в виде одного пятна. Например, в базе данных SWISS-2DPAGE на сервере ExPasy (Expert Protein Analysis System) с адресом http://au.expasy.org/ch2d/ на карте белков клеток HepG2 PCNA можно найти как пятно с координатами (pI4.62, Mw 35905) (Рис.3) (Sanchez, Lachaize et al. 1999; Gasteiger, Gattiker et al. 2003). Автором данной монографии был проведен более детальный анализ положения PCNA на двумерной карте, полученной после разделения белков раковых клеток (MDA-MD468) (Рис.4). Интересно то, что большинство белков, расположенных близко к PCNA и присутствующих на разных 2DE картах в разной пропорции, отвечают за ведение, образно говоря, “домашнего 21 хозяйства” клетки. В частности здесь широко представлены тропомиозины и разные формы белков семейства 14-3-3 (Рис.4). Рис. 3. Двумерная (2DE) карта белков из клеток гепатобластомы HepG2 (HEPG2_HUMAN), и положение на ней PCNA. Получено из базы данных Expasy.org, http://au.expasy.org/ch2d/ (Gasteiger, Gattiker et al. 2003). 22 Рис. 4. Двумерная карта (2DE) белков эпителиальных раковых клеток MDAMB468 и положение на ней PCNA(Naryzhny 2008). (A) Клеточные белки (0.4 мг) были разделены 2DE (рН 3-10, 13см – первое направление, 10% SDS-PAGE, 13 см – второе направление) и окрашены Кумасси R350. Идентификацию белков проводили дактилоскопией по массе пептидов (MALDI TOF, Waters), полученных обработкой трипсином белка, содержащегося в кусочках геля (белковые пятна) (Naryzhny and Lee 2007). Обозначены белки: актин (ACTB_HUMAN), альдолаза A (ALDOA_HUMAN), гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины A2/B1 (ROA2_HUMAN), аннексин A2 (ANXA2_HUMAN), аннексин A1 (ANXA1_HUMAN), статмин (STMN1_HUMAN), альфа-энолаза А (ENOA_HUMAN), кератин 7, тип II (K2C7_HUMAN), кератин 8, тип II (K2C8_HUMAN), кератин 17, тип I (K1C17_HUMAN), глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (G3P_HUMAN), пероксиредоксин-1 (PRDX1_HUMAN), пероксиредоксин-2 (PRDX2_HUMAN), пероксиредоксин-6 (PRDX6_HUMAN), калретикулин, предшественник (CALR_HUMAN), белок, родственный белкам теплового шока, с массой 71 кДа (HSP7C_HUMAN), белок теплового шока HSP 90бета (HS90B_HUMAN), предшественник регулируемого глюкозой белка с массой 78 кДа (GRP78_HUMAN), белок теплового шока, митохондриальный предшественник, с массой 60 кДа (CH60_HUMAN), тубулин, альфа-1B цепь (TBA1B_HUMAN), тубулин, бета цепь (TBB5_HUMAN), протеин дисульфит изомераза, предшественник (PDIA1_HUMAN), пептидил-пролил цис-транс изомераза А (PPIA_HUMAN), кофилин-1 (COF1_HUMAN), опухолевый белок 9, контролируемый через трансляцию (translationally-controlled tumor protein 9, TCTP_HUMAN), статмин 1 23 (STMN1_HUMAN), фосфоглицерат киназа 1 (PGK1_HUMAN), белок SET (SET_HUMAN). (B) Показана увеличенная область той же 2DE карты вокруг PCNA. Тропомиозин альфа-1 (TPMI_HUMAN, 4.69/32700), тропомиозин альфа-3 (TPM3_HUMAN, 4.68/32800), 14-3-3 белок эпсилон (1433E_HUMAN, 4.63/29300) 143-3 белок сигма (1433S_HUMAN, 4.69/27900), 14-3-3 белок бета/альфа (1433B_HUMAN, 4.76/28082), фактор элонгации 1-бета (EF1B_HUMAN, 4.5/24900), нуклеофосмин (нюматрин, B23) (NPM_HUMAN, 4.64/32700). Опубликовано с разрешения журнала Cell Mol Life Sci. Так как изоэлектрическая точка (pI) и молекулярная масса или вес (Mw) являются фундаментальными физико-химическими параметрами любого белка, их правильная оценка очень важна. Изначально масса PCNA была определена денатурирующим электрофорезом, SDS-PAGE, равной 36 кДа (Bravo and Celis 1980; Bravo, Fey et al. 1981; Bravo and Celis 1985), хотя его теоретическая масса равна примерно 30 кДа. Это несоответствие могло бы быть результатом посттрансляционных модификаций. Известно, что некоторые белки мигрируют не совсем нормально в SDS-PAGE из-за непропорционального связывания SDS (вследствие повышенного содержания гидрофобных аминокислот) или очень сильного положительного заряда, как, например, гистоны. Большой процеит содержания аминокислоты (а точнее иминокислоты) пролина, как в случае с р53, реальная масса которого равна 43.7 кДа, может, , также повлиять на миграцию белка в SDS-PAGE. В этом случае причиной, по-видимому, являются структурные искажения, вносимые данной аминокислотой в полипептидную цепь. Использование гелей с разной пористостью, может иногда решить эту проблему и позволить более точно оценить массу белка. Действительно, PCNA мигрирует в виде одной полосы в районе 36 кДа при использовании 12-20%-ных полиакриламидных гелей (Bravo, Fey et al. 1981; Mathews, Bernstein et al. 1984; Bravo and Celis 1985), но в районе 30 кДа, то есть 24 близко к теоретическим значениям, при использовании 8–9%-ных гелей (Naryzhny, Desouza et al. 2006). На 2DE (Рис. 4) PCNA обычно детектируется как одно пятно, как и было изначально опубликовано (Bravo, Fey et al. 1981). Однако более высокое разрешение и чувствительность позволяют обнаружить дополнительные, сдвинутые по изоточкам, сателлитные пятна (Рис.5) (Mathews, Bernstein et al. 1984; Celis and Olsen 1994; Okuzawa, Franzen et al. 1994; Naryzhny and Lee 2003). Основное (мажорное, М) пятно PCNA соответствует полипептиду с pI 4.57 и массой 30 кДа. Эти числа почти с точностью соответствуют теоретическим параметрам PCNA, указывая на то, что большая часть PCNA не модифицирована (Naryzhny and Lee 2007). Наличие множества дополнительных пятен, детектированных с помощью Вестерн-блота, говорит о возможности присутствия различных модификаций (см. далее Глава 5. Пост-трансляционные модификации PCNA). Основные выводы (1) Анализ белков двумерным электрофорезом (2DE) указывает на то, что основная (мажорная) форма PCNA млекопитающих располагается на 2DE-карте в точке, соответствующей теоретическим физико-химическим параметрам PCNA, и, возможно, не модифицирована. (2) Наличие множества минорных, модифицированных форм PCNA указывает на то, что модификации PCNA являются очень динамичными и короткоживущими событиями, и/или очень малая часть PCNA вовлечена в процессы, где необходимы данные модификации PCNA. 25 Рис. 5. Многочисленные пятна, соответствующие изоформам PCNA, могут быть выявлены с помощью 2DE высокого разрешения и повышенной чувствительности. Иммуноокрашивание проводили с использованием анти-PCNA антител PC10 после 2DE и перевода белков на мембрану Immobilon-P. A, M, B, T и D обозначают соответственно “кислую”, мажорную, “щелочную”, тримерную и димерную формы PCNA. U1 и U2 обозначают убиквитинированные формы мономера PCNA. H – кластер продуктов гидролиза PCNA, образованных под действием протеосом (Naryzhny and Lee 2003). (A) 2DE (pH 4–7, 13 см –первое направление, 10% SDS-PAGE, 13 см – второе направление). (B) 2DE (pH 4–5, 18 см – первое направление, 10% SDS-PAGE, 13 см –второе направление). 26 Глава 2. PCNA и протеом при клеточной пролиферации Белковые профили делящихся и покоящихся клеток Клетки эукариот начинают готовиться к репликации ДНК задолго до начала S-фазы (Pardee 1989). Например, белки предрепликативного комплекса связываются с ДНК/ хроматином в местах инициации репликации ДНК (ориджинах) уже в ранней стадии фазы G1. В середине G1-фазы активируются циклин D-зависимые протеин киназы (например, Cdk2 и Cdk4), а в конце G1-фазы – циклин Е зависимые киназы (Cdk2) (Sherr 1994). Увеличение экспрессии циклин А зависимой киназы совпадает с началом, а уменьшение - с концом S-фазы (Sherr 1994). Регуляция активности разных Cdk по клеточному циклу включает в себя не только синтез и деградацию циклинов, но и связывание ингибиторов Cdk, таких как p21 и p27. В дополнение специфическое фосфорилирование и дефосфорилирование как циклинов, так и Cdk является критическим для активности Cdk (Shackelford, Kaufmann et al. 1999). То есть функционирование этих белков напрямую связано с уровнем их экспрессии, локализацией и пост-трансляционными модификациями. Как следует из его названия и многочисленных публикаций (proliferating cell nuclear antigen), основные функции PCNA связаны с клеточной пролиферацией и репликацией ДНК. Как уже отмечалось в предыдущей главе, Браво и Целис (Bravo and Celis) первыми обнаружили связь PCNA с клеточным делением, когда провели анализ синтеза белка в зависимости от времени клеточного цикла (Bravo and Celis 1980). Используя мечение метионина серой [35S] с последующим разделением белков двумерным электрофорезом (2DE) и детектированием их флюорографией, удалось оценить положение 700 полипептидов из клеток HeLa. Для получения синхронных 27 клеточных популяций они использовали метод синхронизации с помощью слабого адгезивного контакта митотических клеток с поверхностью ростовых чашек и возможность их механического отделения (легкое встряхивание) в ростовую среду. (Terasima and Tolmach 1963). Далее эти клетки собирали, опять высевали на чашки и давали пройти последующие стадии деления. Длительность фазы G1 была 11.7 часов, S-фазы – 8.8 часов и G2-фазы вместе с митозом (М-фазой) – 4 часа. Весь клеточный цикл составлял 24.5 часов. Белки метили в разных фазах деления, помещая клетки в начале стадии в среду, содержащую [35S]метионин. Клетки инкубировали в такой среде 30 мин и дольше, затем собирали, и белки анализировали с помощью 2DE. Интересно то, что все обнаруженные полипептиды присутствовали во всех фазах клеточного цикла, а разница была только на уровне величины синтеза. То есть, белковых пятен, детектируемых только в определенной фазе клеточного цикла, обнаружено не было (Bravo and Celis 1980). Количественная оценка 99 самых мажорных полипептидов показала, что большинство из них синтезируется с одинаковой скоростью во всех фазах клеточного цикла. Вариабельность показали альфа- и бета-тубулин (повышение в 2-3 раза в М-фазе на фоне одинакового уровня в G1-, S-, G2- фазах), виментин (снижение в 2 раза М-фазе на фоне одинакового уровня в G1-, S-, G2- фазах) и несколько других неидентифицированных белков. Особое внимание привлек белок с молекулярным весом в 36000 (IEF 49), уровень которого был более чем в 2 раза повышен в S-фазе и составлял примерно 0.01% от общего количества белка в клетке (Bravo and Celis 1980). В данной статье этот полипептид фигурировал как IEF49, в следующей 28 публикации этих авторов получил название “циклин”, ну а сейчас мы его знаем как PCNA (Bravo, Fey et al. 1981; Mathews, Bernstein et al. 1984). Чтобы яснее представить общую картину протеома при переходе клеток от стадии покоя (фаза G0) к стадии деления (особенно репликации ДНК, S-фазе) и место в этой картине PCNA (уровень экспрессии, локализация, модификации), автор данной монографии использовал систему синхронизации по клеточному циклу клеток яичника китайского хомячка (CHO клетки) с дальнейшим анализом белков. Изначально экспрессия белков в разных фазах клеточного цикла (от G0- к S-фазе) была проанализирована с помощью одномерного электрофореза и Вестерн-блота (Рис.6). Как видно на Рис.6, циклин А не детектируется в клетках, находящихся в фазе покоя, G0 (после продолжительного голодания по изолейцину), но обнаруживается примерно через 10 часов после выхода из G0, когда клетки уже подходят к границе фаз G1 и S (G1/S). Его уровень близок к максимуму после 14 часов роста в полной среде, содержащей афидиколин (Аф на Рис.6), после выхода из G0-фазы, когда большинство клеток находится в начале S-фазы. Максимального уровня экспрессии циклин А достигает в течение 2 часов после снятия блокировки афидиколином, когда начинается активная репликация хромосом (S2 на Рис.6B и 6C). Эти данные хорошо согласуются с ранее опубликованными данными по регуляции экспрессии циклина А в течение клеточного цикла (Walker and Maller 1991; Sherr 1994). Похожая картина наблюдается и с другим регулятором клеточного цикла, протеин киназой Cdk1, которая также не детектируется в СНО клетках, синхронизированных в G0-фазе клеточного цикла (Рис.6). Но уровень Cdk1 достаточно высок уже после 6 часов и достигает максимума после 10 часов выхода 29 A B 1N 2N Cyclin A PCNA +14h Количество клеток Cdk1 +10h Actin +6h G0 +2 +4 +6 +8 +10 +12 Aph S2 S4 S6 C Aph 120 actin 100 G0 80 PCNA 60 ДНК Cdk1 Cyclin A 40 20 0 G0 +2 +4 +6 +8 +10 +12 Aph S2 S4 S6 Рис. 6. Определение уровня циклина A, PCNA и Cdk1 в клетках CHO в течение клеточного цикла. Клетки CHO вначале были синхронизированы в фазе G0 путем 45-часовой инкубации в лишенной изолейцина среде, содержащей 10%-ную диализованную эмбриональную коровью сыворотку (FBS), после чего помещены на 14 часов в полную среду, содержащую афидиколин (Aph). В течение этого 14часового периода клетки проходили фазу G1 и достигали начала S фазы. (A) Анализ продвижения по клеточному циклу с помощью проточного цитофлюориметра. Указано время после того, как клетки, остановленные на границе G1/S фаз инкубацией с афидиколином, были переведены в полную среду без ингибитора. (B) 30 Вестерн блот анализ RIPA экстрактов клеток CHO (10 мкг белка на дорожку) (Материалы и методы). CHO клетки были остановлены вначале в G0 фазе, как описано выше, и запущены в клеточный цикл инкубацией в полной среде, содержащей 2мкг/мл афидиколина. Номера внизу (2–12) показывают время после остановки в G0 фазе. S2-S6 показывают время в S фазе, когда клетки, остановленные афидиколином на старте S фазы, были переведены в полную среду без ингибитора. (C) Количество белка в разных фазах цикла, определенное Вестерн блотом (B), показаны условные единицы, полученные при измерении оптической плотности с использованием программы Image-Master VDS (Amersham Pharmacia Biotech). Опубликовано с разрешения редакции журнала Electrophoresis. из G0-фазы, когда циклин А только начинает детектироваться. Эти данные согласуются с моделью, где основные функции Cdk1 приходятся на середину G1фазы, а циклина А - на фазу репликации ДНК (S-фазу). Интересно, что значительное количество PCNA обнаруживается в СНО клетках, остановленных в фазе G0 (Рис.6). Общий уровень PCNA увеличивается примерно только в 2 раза, когда клетки входят в цикл деления, и остается на этом же уровне все время (Рис.7). Так как PCNA является одним из необходимых белков, участвующих в репликации ДНК, его сравнительно постоянный уровень в течение клеточного цикля является несколько неожиданным. Более детально функционирование и роль PCNA может прояснить клеточное фракционирование. Как видно на Рис.7, уровень PCNA в цитоплазме остается одинаковым в течение всего клеточного цикла и даже в фазе покоя G0. 31 Рис. 7. Определение уровня циклина A, PCNA и Cdk1 в субклеточных фракциях клеток CHO в течение клеточного цикла. (A) SDS-PAGE белковых фракций (CF, NEF, CMF и NMF) с последующим иммунодетектированием (Вестерн блот), используя антитела к PCNA (PCNA), циклину А (cyclin A), Cdk1 (Cdk1) или актину (actin). На каждую дорожку наносили 4 мкг белка (кроме СВ, где было 10 мкг). G1 и S обозначают соответственно образцы из клеток, находившихся в середине G1 (6 часов в G1) и середине S фазы (4 часа в S фазе). (B) Относительное количество каждого белка, детектированного Вестерн блотом (A) определялось с помощью программы ImageMaster VDS, как описано в подписях к Рис.6. Опубликовано с разрешения редакции журнала Electrophoresis. 32 Однако следует особо подчеркнуть то, что в экстрактах ядра, хроматина и ядерном матриксе этот уровень значительно отличается в разных фазах клеточного цикла. Например, уровень PCNA в образцах ядерного матрикса был очень низким в фазе G0, но значительно повышен и постоянен, начиная с середины фазы G1. А в образцах экстрактов ядер и хроматина уровень PCNA был очень низким до середины фазы G1, достигая максимальных величин на границе G1/S фаз (Рис.7). Для получения более полной картины белковых изменений в зависимости от клеточного цикла был проведен анализ двумерным электрофорезом (2DE) как всех клеточных белков (протеом), так и отдельных субклеточных фракций (Рис. 8-11). После разделения в 2DE белки в гелях окрашивали серебром, гели сканировали и полученные картины анализировали, используя специальную программу (Melanie 3, GeneBio, Geneva, Switzerland). Количество белка в отдельных пятнах оценивали в соответствии с их относительным объемом (% V от общего белка) и сравнивали в образцах из разных фаз клеточного цикла (Рис.7, Табл.1). Величины в Табл.1 являются средними значениями как минимум двух экспериментов. Среди 1200 проанализированных 9 белков показали изменение уровня экспрессии в 2-3 раза в Sфазе по сравнению с фазой G0 (Табл.1). Причем эти изменения были уже заметны в фазе G1, но достигали максимума в S-фазе. Среди пятен мажорных белков (выше 0.2% от суммарного белка) с пониженной экспрессией в S-фазе обнаруживается белок p58 (58 кДа, pI 4.8), виментин (Westwood, Church et al. 1987; Champion, Arnott et al. 1999). Серия (цепочка) из четырех белков с массой в 68 кДа и pI 6.2–6.3 (p68a– d), исходя из своих параметров и положения на карте, скорее всего, представляет ламин В. 33 Название белка PCNA Р37 (тропомиозин 1) Р26 (тимидин киназа) Р40а Р40в Р58 (виментин) Р47 Р48 Р68(a-d) (ламин В) Локализация G0 фаза S фаза S/G0 Общий экстракт Цитозол Ядерный экстракт Ядерный матрикс Общий экстракт Цитозол Ядерный экстракт Ядерный матрикс 0.051 0.047 0.021 0.002 0.030 0.00014 0.0131 - 0.067 0.050 0.059 0.024 0.072 0.00065 0.0612 - 1.30 1.08 2.78 12.2 2.37 4.6 4.67 - Общий экстракт Цитозол Ядерный экстракт Ядерный матрикс Общий экстракт Цитозол Ядерный экстракт Ядерный матрикс Общий экстракт Цитозол Ядерный экстракт Ядерный матрикс Общий экстракт Цитозол Ядерный экстракт Ядерный матрикс Общий экстракт Цитозол Ядерный экстракт Ядерный матрикс Общий экстракт Цитозол Ядерный экстракт Ядерный матрикс Общий экстракт Цитозол Ядерный экстракт Ядерный матрикс 0.001 0.0223 0.024 0.022 0.022 0.013 0.124 0.066 0.036 0.028 0.030 0.033 0.091 0.093 0.032 0.029 0.073 0.081 0.006 0.012 0.014 0.013 0.009 0.082 0.041 0.013 0.009 0.016 0.010 0.074 0.051 0.017 0.021 71.9 74.2 Таблица 1. Количественная оценка пятен, показанных на Рис. 4-9. 0.51 0.61 0.6 0.69 0.66 0.62 0.35 0.35 0.52 0.32 0.81 0.55 0.54 0.73 34 Рис. 8. 2DЕ белковые профили клеточных экстрактов после окрашивания серебром. СНО клетки ресуспендировали в буфере для образца, белки разделяли в 2DE и окрашивали серебром (см. Материалы и Методы) “As”, “G0”, и “S” обозначают клеточные экстракты, полученные из несинхронизированных клеток, синхронизированых в G0, или в середине S-фазы. В случае образцов G0 и S показаны только области геля, содержащие белки, существенно изменяющие экспрессию в клеточном цикле. Соответствующая область на панели “As” отмечена квадратом. Опубликовано с разрешения редакции журнала Electrophoresis. 35 Следующие 4 белка (пока неизвестных) также в разной степени понижают экспрессию в S-фазе (Табл.1): два белка массой в 40 кДа с изоточками (pI) 6.4 и 6.5 (p40a, p40b), а также белок p47 (47 кДа, pI 6.4) и p48 (48 кДа, pI 6.3). Три белка явно повышают экспрессию в S-фазе по сравнению с фазой G0. Наиболее сильно выражено это у белка p26 (26 кДа, pI 6.7). Уровень его очень низок в G0, но весьма высок в делящихся клетках (разница в 70 раз, Табл.1). Другой белок, р37 (37 кДа, pI 4.5), с низким уровнем в G0-фазе, постепенно повышает свой уровень экспрессии при переходе от G1- к S-фазе (до пяти раз). Уровни экспрессии белков и их локализация были оценены также и в отдельных субклеточных фракциях. Так, белки p40a, p40b, p47 и p48 с пониженной экспрессией при переходе клеток к делению в основном обнаруживаются в цитозольной фракции (Рис.9). Белок p26, сильно экспрессированный в S-фазе, также локализован в цитозоле (Рис.9). По этим параметрам он весьма напоминает цитоплазматическую тимидин киназу (Littlefield 1966; Bello 1974). Анализ распределения PCNA в разных субклеточных фракциях с помощью 2DE (Рис.8–11) подтвердил данные одномерного Вестерн-блота (Рис.6 и Рис.7) и позволил более точно оценить уровень PCNA. Во фракции ядерного матрикса количество PCNA увеличивается до 12 раз в период перехода от фазы G0 к середине S-фазы. Высокий уровень четырех белков с массой в 68 кДа (pI 6.2–6.3) обнаруживается как в цитозоле, так и в ядерном матриксе клеток, находящихся в G0фазе (Рис.9 и Рис.11). Однако, когда клетка переходит к S-фазе, их уровень в цитозольной фракции понижается драматически (Рис.9), но только незначительно во фракции ядерного матрикса (Рис.11). 36 Рис. 9. Белковые профили образцов цитозола СНО клеток. Белки цитозола из асинхронных или находящихся в фазе G0 или S клеток СНО разделяли двумерным электрофорезом и окрашивали серебром (см. Материалы и Методы). Опубликовано с разрешения редакции журнала Electrophoresis. 37 Рис. 10. Окрашенные серебром белковые профили ядерных экстрактов СНО клеток. Образцы получали, следуя протоколу по выделению ядер с использованием дигитонина, разделяли двумерным электрофорезом и окрашивали серебром (см. Материалы и Методы). Опубликовано с разрешения редакции журнала Electrophoresis. 38 Рис. 11. Окрашенные серебром белковые профили ядерного матрикса (NMF) клеток CHO. Образцы получали, разделяли двумерным электрофорезом и окрашивали серебром (см. Материалы и Методы). Опубликовано с разрешения редакции журнала Electrophoresis. Таким образом, эта группа белков (скорее всего ламины В) регулируется не только посредством изменения общего уровня экспрессии в течение клеточного цикла, но и через локализацию. Интересно, что белок p26, уровень которого наиболее сильно 39 изменяется по циклу, был обнаружен в основном в цитозоле (Рис.9 и Рис.10). Это показывает, что белок p26 не участвует напрямую в регуляции экспрессии генов или репликации хромосом, хотя его экспрессия явно коррелирует с клеточным циклом. Основные выводы (1) Значительные изменения в белковых профилях синхронизированных клеток CHO возникают, когда клетки переходят из состояния покоя (G0) в стадию деления (G1). Дальнейший переход от G1- к S-фазе в основном приводит к количественному увеличению этих изменений. (2) Среди проанализированных белков (примерно 1200) наиболее драматические изменения были обнаружены у белка p26 (26 кДа, pI 6.7). Уровень этого цитозольного белка очень низок в покоящихся клетках (G0), но существенно взрастает у делящихся клетках (~70-кратное увеличение). Поэтому p26 (тимидин киназа) может быть использован как биомаркер клеточной пролиферации. Ядерный белок p37 (37 кДа, pI 4.5) (тропомиозин 1) увеличивает экспрессию в 5 раз при переходе клеток в S фазу. Уровни белков p40a, p40b, p47, p48, и p68a–d (ламин В) понижаются в 2-3 раза при переходе от G0- к S-фазе. (3) Уровень Cdk1 значительно увеличивается в середине G1-фазы и достигает пика в конце G1. Циклин A начинает детектироваться в конце G1-фазы, и его количество драматически увеличивается в начале S-фазы, после чего не меняется до конца Sфазы. Эти два белка обнаруживаются только в цитозоле и ядерном экстракте, но не в хроматине или ядерном матриксе. 40 (4) Общий уровень PCNA в клетках CHO увеличивается только в два раза во время перехода от G0- к G1- и далее к S-фазе. Причем уровень PCNA в цитоплазме довольно высок и не меняется по фазам цикла (см. 7.1.10. Локализация PCNA) Однако уровень его в хроматине и ядерном матриксе возрастает до 12 раз при переходе от G0- к S-фазе. Следовательно, важным механизмом регуляции PCNA является его транспорт в места функционирования. Следует отметить, что PCNA аккумулируется в ядерном матриксе в середине фазы G1 еще до того, как перейти в хроматин на границе фаз G1/S, что указывает на возможное участие PCNA не только в синтезе, но и в преинициации синтеза ДНК. Глава 3. PCNA и канцерогенез 3.1. Белковые профили нормальных и раковых клеток Как видно на Рис.12, первичные эпителиальные клетки (HMEC) и две линии бессмертных нераковых клеток (Hs578Bst и 184B5) имеют очень низкий уровень PCNA. И наоборот, линии раковых клеток (MDA-MB468, MDA-MB231 и MCF-7) показывают уровень PCNA в 5-6 раз выше, чем “нормальные” клетки (Рис.12). Эти данные указывают на прямую связь клеточной трансформации и повышенного уровня PCNA, хотя следует сказать, что и некоторые бессмертные клеточные линии 41 A 1 2 3 4 5 6 7 8 Actin PCNA B Volume, A.U. 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 1 2 3 4 5 6 7 8 Cell sample Рис. 12. Первичные и бессмертные нераковые клетки обычно имеют низкий уровень PCNA (Naryzhny and Lee 2007). (A) Клеточные экстракты из несинхронных клеточных популяций, находящихся в логарифмической фазе роста (конфлуэнция 60–70%) были проанализированы в SDS–PAGE с последующим Вестерн-блотом, как указано в Материалах и Методах. Двадцать микрограмм белка наносили на каждую дорожку 10%-ного геля (дорожки 1–8; MDA-MB468, MCF10A, MDA-MB231, Hs578Bst, HMEC, 184B5, MCF-7, CHO). После SDS–PAGE и белкового переноса на мембрану Immobilon P, PCNA детектировали с помощью антител PC10 (Santa Cruz) в разведении 1:2000 и вторичных антител (Sigma– Aldrich) в разведении 1:10000. В качестве контроля та же мембрана была обработана кроличьими антителами к актину (Sigma–Aldrich Canada Ltd.), 1:1000, и вторичными козьими анти-кроличьими антителами (Sigma–Aldrich), 1:10000. Интенсивность сигнала в каждой полосе определяли, используя программу Phoretix 2D (Nonlinear Inc, USA). Опубликовано с разрешения редакции FEBS Lett. 42 также показывают высокий уровень экспрессии PCNA (MCF10A и CHO, Рис. 12). С другой стороны, количество PCNA (как минимум в диапазоне тех количеств, которые присутствуют в данных клетках) не является лимитирующим фактором, определяющим скорость пролиферации клеток. Почти у всех вышеупомянутых клеток эта скорость практически одинакова, и время удвоения количества клеток равно примерно 30 часам, за исключением клеток СНО (19 часов). По-видимому, повышенная скорость деления клеток СНО связана с какими-то иными причинами, а не с PCNA, так как его уровень в этих клетках такой же, как и у клеток MDAMB468, MDA-MB231 или MCF-7, которые имеют меньшую скорость пролиферации (Рис.12). Более того, клетки СНО, стабильно экспрессирующие GFP-PCNA, делятся с такой же скоростью, что и родительские клетки СНО, хотя суммарное содержание PCNA (PCNA вместе с GFP-PCNA) в них повышено в 2 раза. Все вышеупомянутые клетки далее были проанализированы на предмет присутствия каких либо специфических для раковых клеток изоформ PCNA. Вначале был проанализирован широкий спектр изоточек, для 2DЕ были использованы полоски геля с иммобилизованным градиентом рН широкого диапазона, 3-10 (Рис.13А). Данные, полученные после 2DE и последующего Вестерн-блота с использованием моноклональных антител к PCNA, PC10, показали присутствие во всех клеточных линиях только “кислой” формы PCNA (pI~4.6). Однако никаких “очень щелочных” форм PCNA (pI~9.0) не обнаруживается ни в одном образце, включая первичные 43 A B kDa 105 MCF7 75 50 MB468 30 MCF10A MCF7 MB231 MB468 Hs578Bst MCF10A HMEC MB231 Hs578Bst 184B5 HMEC 184B5 CHO CHO PCNA PCNA pH 3 10 pH 4.52 4.57 4.62 Рис. 13. PCNA из первичных, бессмертных и раковых клеток детектируется одинаковым образом с помощью 2DЕ(Naryzhny and Lee 2007). (A) Клетки лизировали в буфере для образца (0.2 мг белка для одного разделения) и разделяли в 2DЕ, используя IPG полоски (7см, pH 3–10) в первом направлении и пластину 10%-ного геля (8.5 х 8.5 см) - во втором направлении. (В) 2DE более высокого разрешения и чувствительности. Разделяли 0.5 мг белка в IPG полоске (18см, pH 4– 5) в первом направлении. Далее от полоски отрезали 8 см, соответствующих местоположению PCNA и проводили второе направление в таком же геле, что использовали в (А) (cм. Материалы и Методы). Далее PCNA детектировали Вестерн-блотом, используя антитела PC10. Опубликовано с разрешения редакции FEBS Lett. 44 GE5 6 (0.200) Cn (Cen,2, 75.00, Ht); Sb (99,96.00 ); Sm (SG, 2x3.00); Cm (3:13) 1230.67 100 TOF LD+ 1.08e4 1875.04 Asp-N 1231.68 % 1877.04 1232.68 930.54 1878.04 1245.74 1559.78 1267.74 1491.89 931.54 1186.68 1761.97 1918.14 0 2274.45 2275.45 2196.12 2276.46 2466.36 2536.38 2672.43 2423.32 3121.67 3183.74 3369.99 3185.75 3477.14 3806.41 3975.72 FD9 13 (0.433) Cn (Cen,2, 75.00, Ht); Sb (99,96.00 ); Sm (SG, 2x3.00); Cm (4:17) 100 TOF LD+ 2.65e4 932.51 1 MFEARLVQGS ILKKVLEALK DLINEACWDI SSSGVNLQSM DSSHVSLVQL 51 TLRSEGFDTY RCDRNLAMGV NLTSMSKILK CAGNEDIITL RAEDNADTLA 101 LVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPE QEYSCVVKMP SGEFARICRD 151 LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNI KLSQTSNVDK EEEAVTIEMN 201 EPVQLTFALR YLNFFTKATP LSSTVTLSMS ADVPLVVEYK IADMGHLKYY 251 LAPKIEDEEG S Trypsin 1405.58 % 975.45 1293.66 1406.59 1513.70 1261.64 1 MFEARLVQGS ILKKVLEALK DLINEACWDI SSSGVNLQSM DSSHVSLVQL 51 TLRSEGFDTY RCDRNLAMGV NLTSMSKILK CAGNEDIITL RAEDNADTLA 101 LVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPE QEYSCVVKMP SGEFARICRD 151 LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNI KLSQTSNVDK EEEAVTIEMN 201 EPVQLTFALR YLNFFTKATP LSSTVTLSMS ADVPLVVEYK IADMGHLKYY 251 LAPKIEDEEG S 1584.80 1796.83 2015.00 2409.22 2466.15 2016.00 1692.84 1798.83 2076.95 2209.80 2468.14 2706.11 985.67 1238.59 0 2928.292991.25 FB7manual 9 (0.298) Cn (Cen,2, 75.00, Ht); Sb (99,96.00 ); Sm (SG, 2x3.00); Cm (3:18) TOF LD+ 6.55e3 1513.70 1293.67 100 Lys-C 1514.70 1 MFEARLVQGS ILKKVLEALK DLINEACWDI SSSGVNLQSM DSSHVSLVQL 51 TLRSEGFDTY RCDRNLAMGV NLTSMSKILK CAGNEDIITL RAEDNADTLA 101 LVFEAPNQEK VSDYEMKLMD LDVEQLGIPE QEYSCVVKMP SGEFARICRD 151 LSHIGDAVVI SCAKDGVKFS ASGELGNGNI KLSQTSNVDK EEEAVTIEMN 201 EPVQLTFALR YLNFFTKATP LSSTVTLSMS ADVPLVVEYK IADMGHLKYY 251 LAPKIEDEEG S % 1294.67 900.51 1515.71 1295.67 901.51 991.55 1315.65 1535.70 2409.19 1537.71 1702.69 1000 1200 1400 1600 1800 2466.13 2468.13 2846.73 2890.34 3020.46 2365.70 0 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3318.55 3234.58 3320.55 3200 3400 3447.82 3600 3745.52 3924.09 m/z 3800 Рис. 14. Масс-спектрометрия указывает на то, что основная часть PCNA не модифицирована in vivo (Naryzhny and Lee 2007). Очищенный рекомбинантный PCNA человека или белки клеток MDA-MB468, HMEC, CHO разделяли в 2DE высокого разрешения (18cm, pH 4–5 – первое направление и 10%-ный гель - второе). После разделения гель окрашивали Кумасси R350, пятна, соответствующие PCNA, вырезали и проводили белковую дактилоскопию (см. Материалы и Методы). Полученные спектры анализировали программами Mascot, ProteinProspector, FindPept и FindMod (http://au.expasy.org/tools/). Последовательности PCNA, которые были детектированы, показаны на врезках. Приведены типичные спектры, получаемые при обработке разными протеазами. Опубликовано с разрешения редакции FEBS Lett. линии и клетки MDA-MB468. Затем изоформы PCNA были проанализированы двумерным электрофорезом более высокого разрешения (ИЭФ узкого диапазона, pH 4–5, и большой длины, 18 см). Как видно на Рис.13В, PCNA во всех проанализированных клеточных линиях имеет 3 изоформы одной массы, но с разными изоточками (pI 4.52, 4.57 и 4.62). Мажорная (4.57) форма была далее 45 проанализирована с помощью масс-спектрометрии, которая не выявила в ней никаких различий между нормальными и раковыми клетками (Рис.14). Таким образом, было показано отсутствие специфических раковых или нормальных форм PCNA, описанных ранее в лаборатории Малкаш (Malkas) (Bechtel, Hickey et al. 1998; Malkas, Herbert et al. 2006). Более того, метод белковой дактилоскопии показал практически идентичность рекомбинантного PCNA и эндогенного PCNA человека (нормальные или раковые клетки, мажорная форма, Рис.13). Причем использование различных протеаз дало возможность перекрыть всю последовательность PCNA детектированными на масс-спектрометре пептидными фрагментами (Рис.14). Так как только техническая модификация (алкилирование цистеина) была обнаружена в этих фрагментах, было сделано заключение, что мажорная форма представляет собой в основном немодифицированный PCNA. Это заключение хорошо согласуется с тем, что изоточка мажорной формы, pI 4.57, точно совпадает с теоретической изоточкой PCNA. Основные выводы (1) Масс-спектрометрический анализ подтвердил, что в клетках человека PCNA находится в основном (примерно 80%) в немодифицированном виде. (2) Клеточная трансформация сопровождается значительным увеличением (до 6 раз) количества PCNA без появления каких-либо его дополнительных форм. 46 Глава 4. Количество PCNA в клетке Изначально PCNA был обнаружен как белок, чья экспрессия менялась в течение клеточного цикла (Bravo and Celis 1980; Bravo, Fey et al. 1981). Более того, позднее он стал использоваться как маркер клеточной пролиферации (van Diest, Brugal et al. 1998). Таким образом, количество PCNA в клетке является объектом особого внимания, особенно в контексте клеточной трансформации (Garrels and Franza 1989; Garrels, Franza et al. 1990; Celis and Olsen 1994). Хотя при переходе клеток от G0- к S-фазе клеточного цикла изменение уровня PCNA может быть значительным (Almendral, Huebsch et al. 1987; Jaskulski, Gatti et al. 1988), в случае непрерывно делящихся клеток уровень PCNA изменяется только в 2-3 раза, что отражает соответствующую степень изменения транскрипции PCNA мРНК (Morris and Mathews 1989; Baserga 1991; Naryzhny and Lee 2001). Интересно, что в процессе клеточного старения уровень PCNA значительно не меняется, хотя скорость клеточного деления драматически падает, особенно в последней фазе старения (Tanno, Ogihara et al. 1996). В раковых клетках очень часто отмечается повышенный уровень PCNA, и поэтому в некоторых случаях этот уровень даже используется как прогностический маркер (Morell-Quadreny, Clar-Blanch et al. 1998; Czyzewska, Guzinska-Ustymowicz et al. 2004). Анализ клеточных культур показал, что раковые клетки имеют значительно более высокий уровень PCNA, чем нормальные клетки даже в том случае, где они имеют одинаковую скорость деления (Naryzhny and Lee 2007). Интересно то, что в течение всего клеточного цикла клетки содержат 47 большое количество, так сказать “свободного”, то есть не связанного с хроматином, PCNA. Даже в S-фазе только малая часть PCNA (20-30%) напрямую вовлечена в репликацию ДНК и обнаруживается в ДНК-репликативных фабриках (фокусах) (Bravo and Macdonald-Bravo 1987). Стабильность PCNA не меняется в течение клеточного цикла. Период полураспада PCNA, измеренный в делящихся клетках HeLa, равен 8 часам, что соответствует полураспаду большинства клеточных белков (Morris and Mathews 1989). В клетках 3T3 этот параметр оказался еще выше - 20 часов (Bravo and Macdonald-Bravo 1987). Количество PCNA составляет 0.06-0.08% от общего количества белка, присутствующего в клетке (Bravo and Celis 1982; Tanno, Ogihara et al. 1996). В пересчете на молекулы это дает 500000 полипептидов (мономеров) на трансформированную (нормальную) клетку, где молярное отношение актин / PCNA равно примерно 200/1. В трансформированных клеточных линиях это количество уже равно 4000000 полипептидов (мономеров) на клетку, и отношение актин / PCNA падает примерно до 20/1 (Celis and Olsen 1994; Naryzhny and Lee 2007). Основные выводы (1) Количество PCNA в делящихся клетках (особенно раковых) значительно превышает их потребность в PCNA при репликативном синтезе ДНК. (2) Повышенный уровень PCNA в раковых клетках, по-видимому, связан не с клеточной пролиферацией и синтезом ДНК, а с какими-то иными функциями. 48 Глава 5. Пост-трансляционные модификации PCNA 5.1. Пост-трансляционные модификации Фундаментальное различие между геномикой и протеомикой заключается в том, что последняя имеет дело с пост-трансляционными модификациями (ПТМ) белков, областью совершенно недоступной для геномики. На сегодняшний день известно несколько сотен ПТМ, включая такие, как фосфорилирование, гликозилирование, ацетилирование, АДФ-рибозилирование, убиквитинирование и т.д. (Yan, Packer et al. 1998; Mann and Jensen 2003). Любая пост-трансляционная модификация полипептида приводит в разной степени к изменению его заряда и/или массы. Так как 2DE как раз и разделяет полипептиды на основании заряда (в первом направлении) и массы (во втором направлении), то любая модификация будет вести к образованию дополнительного пятна на белковой двумерной карте. Все определяется только степенью разрешения и чувствительностью детектирования этих пятен. Так, для первого направления (ИЭФ) разрешение можно повысить, сужая диапазон рН и увеличивая длину геля. Использование больших градиентных гелей хорошо работает для повышения разрешения во втором направлении (SDSPAGE). Таким образом, наличие не одного, а множества пятен на двумерном геле (2DE), соответствующих одному и тому же белку (полипептидной цепи), позволяет подозревать наличие у этого белка пост-трансляционных модификаций (ПТМ). В этом смысле двумерный электрофорез белков высокого разрешения является одним из наилучших из известных до сего времени методов анализа белков. Причем, что очень важно, можно всегда количественно оценить каждую модификацию на 49 предмет ожидаемого сдвига пятна по заряду и массе. В комбинации с массспектрометрией такой подход на сегодняшний день является исключительно продуктивным. Наиболее типичными и бросающимися в глаза примерами являются цепочки пятен на двумерной карте, которые отражают наличие множественных модификаций одного типа на одном и том же полипептиде. Причем, даже исходя из конфигурации цепочек можно с большой долей вероятности судить о характере этих модификаций. Например, фосфорилирование или ацетилирование изменяет заряд белка, сдвигая его pI в кислую сторону, практически не меняя массы. Из-за этого образуются горизонтальные цепочки пятен. АДФ-рибозилирование в дополнение к сдвигу по заряду еще и существенно увеличивает массу полипептида, из-за чего цепочка пятен приобретает характерный изгиб вверх и в кислую сторону. Гликозилирование увеличивает массу полипептида, часто весьма значительно. И в зависимости от полярности присоединяемых сахаров меняет (в случае кислых сахаров) или не меняет (в случае нейтральных сахаров) изоточку (pI). То есть, в первом случае цепочка пятен будет иметь направление снизу вверх со смещением в кислотную область, а во втором – вертикально снизу вверх. Во всех этих случаях единичная модификация все-таки не очень сильно изменяет физико-химические параметры белка, и пятно, соответствующее модифицированному полипептиду, будет находиться близко от немодифицированного (правда, это расстояние будет еще зависеть и от разрешения и размеров используемого двумерного геля). Поэтому наличие в геле только очень далеко расположенных друг от друга пятен без промежуточных форм, идентифицированных, как принадлежащих одному и тому же белку, говорит о том, что они могут быть продуктами разного сплайсинга или же 50 даже продуктами разных генов, но с большой степенью гомологии (Dralyuk, Brudno et al. 2000; Thanaraj, Stamm et al. 2004; Venables 2004). Для специфического детектирования различных модификаций в настоящее время имеется обширный технический арсенал, начиная с радиоактивной метки, антител, специфических красителей и заканчивая масс-спектрометрией. Как уже было сказано, PCNA изначально обнаруживался иммунологически в виде одного пятна - в районе теоретических значений pI (~4.6), но несколько большей массы (~36кДa вместо ~30 кДа). Только иногда выявлялось сателлитное пятно – той же массы, но с несколько более кислым pI (Mathews, Bernstein et al. 1984; Celis and Olsen 1994; Okuzawa, Franzen et al. 1994). Однако более высокие разрешение и чувствительность позволяют обнаружить дополнительные пятна (Рис. 15) (Naryzhny and Lee 2003). При использовании антител к PCNA PC10 детектируются более чем 20 пятен на 2DE. В дополнение к А-, М- и В-формам, которые были ранее проанализированы (смотри выше), видны пятна, представляющие пептиды PCNA, имеющие резко отличные от теоретических величины физико-химических параметров PCNA (pI, Mw). Были также использованы и другие специфические к PCNA антитела, поликлональные С20 (антиген - С-конец PCNA, АА240-259). Как видно на Рис.15, профили обнаруженных пятен в основном совпадают, что указывает на специфичность их детектирования. Белки, соответствующие пятнам T (возможно тример) и D (возможно димер) имеют те же, что и основная форма PCNA, изоточки (pI). Их присутствие в денатурирующих условиях 2DE объясняется, по-видимому, образованием цистеин - цистеин сшивок между отдельными полипептидами PCNA 51 в процессе электрофореза даже в присутствии ДТТ (Herbert, Galvani et al. 2001). Большое количество пятен представляет пептиды, меньшие по размеру, чем интактный полипептид PCNA. Наиболее логичным объяснением их присутствия является эндопротеолиз PCNA, причем очень специфический, так как картина протеолиза PCNA клеток китайского хомячка и человека практически одинакова (Рис.16). Это указывает на сходство метаболизма PCNA в разных клетках млекопитающих. Мажорное (М) пятно PCNA соответствует полипептиду с массой в Рис. 15. Множественные формы PCNA специфически детектируются при 2DЕ высокого разрешения. Асинхронные клетки CHO лизировали в буфере для образца (см. Материалы и Методы) и белки (200 мг) разделяли в 2DE (13 cм, pH 4–7 - первое направление и 11%-ный гель, SDS-PAGE 14х14 см, - второе направление). Далее белки анализировали Вестерн-блотом, используя антитела к PCNA, РС10 (A) или C-20 (B). A, M, B, T и D обозначают “кислую”, мажорную, “щелочную”, тримерную и димерную формы PCNA. U1 и U2 – убиквитинированные формы мономера PCNA. 52 30 кДа и изоточкой, pI, 4.57. Эти данные соответствуют теоретическим параметрам PCNA, указывая на то, что большая часть PCNA не модифицирована посттрансляционно (Naryzhny and Lee 2007). Минорные пятна образуются из-за изменений в заряде или молекулярной массе и отражают степень модификации PCNA (Naryzhny and Lee 2003; Naryzhny, Desouza et al. 2006). Причем надо иметь в Рис. 16. Разделение PCNA и его фрагментов высокоразрешающим 2DE. Клеточные белки клеток CHO (A) и MDA-MB231 (B) разделяли двумерным электрофорезом (первое направление - IEF, pH 4.0–5.0, 18 см, второе направление 11%-ный SDS-PAGE, пластины геля 14х14 см). Для второго направления отрезали полоски IPG длиной в 13 см, соответствующие диапазону pН 4.3–5.0. Вестерн-блот анализ проводили с использованием антител PC10. Опубликовано с разрешения редакции журнала Proteomics. 53 виду, что эти модификации могут быть биологическими (фунциональными) или техническими, то есть возникшими при анализе образца. В частности, многочисленные фрагменты PCNA (Рис.15) образуются при протеолизе во время 2DE, и могут быть исключены добавлением протеосомного ингибитора MG132 или тиомочевины (Castellanos-Serra and Paz-Lago 2002; Naryzhny and Lee 2003; Naryzhny and Lee 2007). Необходимо однако отметить, что данный протеолиз имеет место также и in vivo (правда в гораздо меньшей степени, и его обнаружение требует более чувствительных методов) (Naryzhny and Lee 2003; Yamamoto, Kimura et al. 2004). То есть возможно он все-таки выполняет какую-то биологическую функцию. Убиквитинирование PCNA является другой, хорошо документированной модификацией, которая ведет к появлению на двумерной карте пятен, соответствующих полипептидам большей массы (~40 кДа) и более щелочной изоточки, pI, (~5.0) (Fig.5). 5.1.1. Убиквитинирование и SUMO-илирование Убиквитинирование - это обратимая пост-трансляционная модификация, присутствующая только у эукариот, при которой полипептид убиквитин (изначально названный ubiquitous immunopoietic polypeptide, что означает повсеместно распространенный полипептид, стимулирующий иммунную систему), содержащий 76 аминокислот (UBIQ_HUMAN, pI 6.56 и Мw 8565), ковалентно присоединяется к эпсилон-аминогруппе лизина белка-мишени посредством изопептидной связи. Значение слова убиквитин имеет латинское происхождение, означающее присутствующий повсеместно. Соответственно убиквитин широко 54 распространен в клетках эукариот. Ключевыми компонентами убиквитина являются его С-конец и наличие семи лизиновых остатков (Рис.17). Пептид очень консервативен и его последовательности у человека и дрожжей совпадают на 96%. MQIFVKTLTGKTITLEVEPS DTIENVKAKI QDKEGIPPDQ QRLIFAGKQL EDGRTLSDYN IQKESTLHLV LRLRGG 1 6 11 27 29 33 48 63 K33 N-конец K29 K11 K63 K27 K6 K48 С-конец UBIQ_HUMAN ( pI 6.79, Mw 8564.47) Рис.17. Аминокислотная последовательность и структура убиквитина. Структура получена из белковой базы данных (PDB). Использован файл 1UBI, который был открыт в программе Swiss-Pdbviewer 4.0.1. Сверху показана последовательнось убиквитина человека (гомология 100% с убиквитином из других млекопитающих и 96% с убиквитином из дрожжей), а снизу приведены его физико-химические параметры (изоточка и масса). 55 Белки SUMO намного более разнообразны, сильно отличаются у разных организмов, но большинство содержит ~100 аминокислот и имеет массу ~12 кДа. Интересно то, что хотя гомология у них с убиквитином очень слабая, третичная структура практически совпадает. Убиквитин может быть присоединен к белку в виде одной молекулы (моноубиквитинирование), нескольких отдельных молекул к разным лизинам (множественное убиквитинирование), или же в виде полимерной цепочки нескольких молекул к одному лизину (поли-убиквитинирование). Так как убиквитин содержит 7 лизинов (Рис.17), то его цепочки могут быть образованы через связь по любому из них (Peng, Schwartz et al. 2003; Kim, Kim et al. 2007; Xu and Peng 2008), а также через N-конец (Kirisako, Kamei et al. 2006). Правда, из-за того, что изначально были обнаружены только полимеры, связанные через лизин в 48 положении (К48), то их называют типичными, а все остальные - атипичными (Ikeda and Dikic 2008). Связывание убиквитина происходит через последовательное участие трех ферментов. Вначале первый из них, убиквитин активирующий фермент (Е1), связывается с убиквитином и передает его переносчику убиквитина (Е2). Далее Е2 связывается с убиквитин лигазой (Е3), которая делает сшивку, образуя изопептидную связь Сконцевого глицина убиквитина с лизином на молекуле мишени. Обратную реакцию осуществляют специфические деубиквитинирующие ферменты, которые могут удалять убиквитин из белков и расщеплять цепи поли-убиквитина. SUMO пришивается на белок похожим на убиквитин образом, только требует других ферментов в роли Е1,Е2 и Е3 (Johnson 2004). Причем пришивка осуществляется с помощью Е2, и в принципе Е3 для этого не нужен. Но все-таки in vivo для более эффективной пришивки SUMO на многие субстраты Е3 зачем то необходим (Johnson 56 2004). Наиболее известной функцией убиквитина является метка им белков для специфического протеолиза. Для того, чтобы быть узнанными и гидролизованными 26S-протеосомами, типичный, то есть сшитый через К48, полимер поли-убиквитина должен содержать как минимум 4 мономера (Xu and Peng 2008). Помимо этого, убиквитинирование играет важную роль во многих других процессах, включая клеточное деление, дифференцировку, трансдукцию сигналов, транспорт белков, их локализацию и контроль качества белков (Ikeda and Dikic 2008). SUMO-илирование также широко распространено, как и убиквитинирование, и его роль может быть самой разнообразной. Например, одна из наиболее известных связана с транспортом белков из цитоплазмы в ядро, как в случае с RanGAP1 (фермент, активирующий фактор ядерного импорта, Ran) (Mahajan, Delphin et al. 1997; Matunis, Wu et al. 1998; Pichler, Gast et al. 2002), другая роль касается регуляции транскрипции, где SUMOилирование чаще всего приводит к репрессии генов. Причем эта репрессия происходит за счет рекрутирования ремоделирующих факторов, вроде гистон деацетилазы HDAC1, как в случае с гистоном Н4 (Shiio and Eisenman 2003). 5.1.2. Низкомолекулярные фрагменты PCNA являются результатом действия протеосом Протеосомный распад PCNA может быть частью общего процесса самоуничтожения, происходящего в апоптозных клетках, или же связан с функционированием PCNA in vivo. А возможно, верны оба этих предположения. Для ответа на эти вопросы PCNA из клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, а также находящихся в апоптозе, был проанализирован c 57 помощью 2DE и иммунодетектирования (Рис.18). Как следует из полученных данных, клетки, находящиеся в фазе покоя (G0) или в процессе апоптоза, не содержат большого количества фрагментов PCNA. Однако образцы, взятые из делящихся клеток (S- или G2-фаза), содержат большое количество продуктов протеолиза PCNA. Эти данные указывают на связь протеолиза PCNA с его функционированием в фазах S и G2. Рис. 18. Различный гидролиз PCNA под действием протеаз Клетки CHO синхронизировали в стадии покоя (G0) с помощью инкубации в минимальной среде без изолейцина (A). Синхронизированные клетки затем запускали в клеточный цикл инкубацией их в полной среде (В - 3 часа инкубации, ранняя G1-фаза, или С – 14 часов инкубации, граница G1/S). Как альтернатива, клетки в G0-фазе инкубировали 14 часов в полной среде, содержащей мимозин (200 мкг/мл) или афидиколин (2 мкг/мл). Результаты получались такие же, как показанные на панеле C. Клетки, синхронизированные на границе G1/S инкубацией с мимозином, переводили в полную среду и инкубировали в ней в течение 4 часов (середина S-фазы; D) или 10 часов (граница G2/M; E). (F) Апоптозные клетки. (G) Клетки в S-фазе, лизированные и прокипяченые в LDS-буфере. (H) Добавление коктейля ингибиторов протеаз, включая ингибитор протеосом MG132 (0.1 мМ) при приготовлении образцов и регидратации IPG геля. Образцы анализировали в 2DE с последующим Вестерн-блотом, используя антитела PC10. Опубликовано с разрешения редакции журнала Proteomics. 58 Однако если S-фазные клетки были лизированы и прогреты при 100°C в буфере с LDS, или же протеосомный ингибитор MG132 был добавлен при получении образцов, протеолиз не наблюдался. Причем присутствие PMSF и других протеазных ингибиторов (ингибиторный коктейль, Roche Diagnostics), не влияющих на протеосомы, не сказывается на протеолизе, указывая на то, что он является протеосом-специфическим. Протеолиз 5.1.3. PCNA in vitro может происходить во время изоэлектрофокусирования (ИЭФ) Хотя результаты 2DE с последующим Вестерн-блотом и длительной экспозицией указывают на то, что в небольшой степени протеолиз наблюдается и in vivo, очевидно, что основная его часть происходит in vitro уже после лизиса клеток (Рис.16). Чтобы детально выяснить, когда происходит протеолиз, образцы белков инкубировали разное время при 37°C и анализировали Вестерн-блотом. Как видно на Рис.19, протеолиз наблюдается после определенного инкубационного периода при 37°С, но не при 4°С. Следует отметить, что профили протеолиза всегда очень похожи, указывая на то, что гидролиз является специфическим, причем идет в основном с N-конца. На это указывают и профили протеолиза, полученные после 2DE с последующим иммунодетектированием двумя разными анти-PCNA антителами, PC10 (антиген - АА 111–125) и C-20 (антиген - C-конец PCNA) (Рис.15). Причем результат одинаков, независимо от того, как белковые образцы наносятся на гель, - в процессе его регидратации или после. То есть протеолиз 59 PCNA в основном происходит во время изоэлектрофокусировки (но не регидратации), которая идет при 20°C и, как минимум, 6 часов. 5.1.4. Протеолиз PCNA является убиквитин-зависимым То, что гидролиз PCNA является убиквитин-зависимым, указывает присутствие убиквитинированых форм PCNA при распаде PCNA (U1,U2, Рис.5 и Рис.15). Рис. 19. PCNA в лизате клеток, находящихся в S фазе, подвергается протеолизу при инкубации образца при 37°C, но не при 4°C. Образцы, полученные из клеток CHO обработкой лизирующим буфером для 2DE (см. Материалы и Методы) инкубировали разное время (1 – 0 мин, 2 – 2 мин, 3 – 30 мин, 4 – 60 мин) при 37°C. Затем образцы кипятили и анализировали Вестерн-блотом, используя антитела PC10. Опубликовано с разрешения редакции журнала Proteomics. Так как белки клеточного цикла часто регулируются через убиквитин зависимый протеолиз, автором данной монографии была проанализирована возможность 60 убиквитинирования PCNA. Изначально было обнаружено, что два белка массой в 42 кДа (pI 4.85 и 4.90) детектируются при 2DE-анализе с последующим иммунодетектированием антител к PCNA, РС10 (U1 и U2 на Рис.20). Рис. 20. Убиквитинирование PCNA. Два идентичных геля, полученных после 2DE, были проанализированы Вестерн-блотом, используя убиквитинспецифические, P4D1, (А) или PCNA-специфические антитела, РС10, (B). Для подтверждения совпадения положения сигналов от PCNA и от убиквитина, мембраны А и В были повторно иммуноокрашены (только поменяв местами антитела), предварительно сняв первый сигнал обработкой мембран SDS-буфером (2% SDS, 1% ДТT, 60 mM Трис pH 6.8) (см. Материалы и Методы). Стрелки указывают положение моно-убиквитинированной формы PCNA (та же, что и U1 на Рис.14). M – мажорная форма PCNA. Опубликовано с разрешения редакции журнала J.Biol.Chem. 61 Рис. 21. PCNA с нарушенной структурой вызывает апоптоз и гидролизуется в клетке через убиквитин-зависимый механизм. Клетки CHO были трансфецированы нормальным вектором, GFP-PCNA (A), а также мутантным (точечная замена R5A) (B), или же другим мутантным (делеция АА173-183) (C). Снимки сделаны через 36 часов после трансфекции на флюоресцентном микроскопе Zeiss Axiovert 100 (x50). (D) Белки, экстрагированные из образца, показанного на (C), были проанализированы с помощью 2DE с последующим Вестерн-блотом, используя анти-GFP антитела (B2, SantaCruz). Чтобы подтвердить то, что белки в 42 кДа являются коньюгатом PCNA и убиквитина, 2DE и Вестерн-блот анализ были повторены с использованием антиPCNA (PC10) и анти-убиквитин (P4D1) моноклональных антител. Как ожидалось, были обнаружены пятна, окрашивающиеся как анти-PCNA, так и анти-убиквитин антителами (стрелка на Рис.20). Положение коньюгата PCNA-убиквитин на двумерной (2DE) карте и вычисленные физико-химические параметры (pI/Mw) очень близки к теоретическим величинам, которые можно рассчитать, используя программу на протеомном сервере Expasy (www.expasy.ch/tools/pi_tool.html). То, что коньюгат PCNA-убиквитин весьма стабилен, объясняет, как минимум частично, 62 почему протеолиз PCNA идет при высокой концентрации мочевины и детергента во время изоэлектрофокусировки (ИЭФ). 5.1.5. Правильная структура PCNA жизненно важна для клеточных функций Классический механизм протеосомного протеолиза PCNA через поли- убиквитинирование обнаруживается в экспериментах по трансфекции клеток вектором, экспрессирующим GFP-PCNA (Рис.21). Исходя из них следует, что повышенный уровень PCNA в клетке (даже в виде GFP-PCNA) не влияет на ее жизнеспособность (Рис.21А). Однако присутствие в клетке PCNA с нарушением четвертичной структуры, вызванным внесением мутаций (точечная замена лизина на аланин в 5 положении, R5A, или же делеция АА173-183), приводит к апоптозу (Рис.21В и С). Причем дальнейший анализ этих апоптозных клеток с помощью 2DE и Вестерн-блота выявляет поли-убиквитинирование GFP-PCNA и его протеолиз (Рис.21D). В данном случае интересно то, что контроль качества не проходит и вызывает катастрофические для клетки последствия не только PCNA, имеющий большую делецию (АА173-183), но и PCNA всего лишь с одной аминокислотной заменой (R5A). О роли данной аминокислоты в структуре PCNA можно узнать в дальнейшем изложении (см. 6.2.1 Аминокислотные остатки Arg-5 и Lys-110 являются критическими для формирования двойного тримера PCNA). 5.1.6. Убиквитинирование PCNA может быть механизмом переключения работы полимераз 63 Функциональная роль убиквитинирования и SUMO-илирования PCNA в дрожжах была впервые показана Хеге с соавторами (Hoege et al) (Hoege, Pfander et al. 2002). Они обнаружили, что Rad6-зависимая репарация ДНК у дрожжей S. cerevisiae связана с дальнейших убиквитинированием публикаций, и PCNA. Множество модификации, позволило SUMO-илированием касающихся этой сформулировать изящную модель функционирования PCNA, как переключателя полимераз при репликации поврежденной ДНК. Согласно этой модели после того, как ДНК полимераза встречает повреждение ДНК, и процесс репликации ДНК останавливается, PCNA моно-убиквитинируется по лизину 164 (K164) с помощью белков Rad6 (Е2 связывающий фермент) и Rad18 (белок, связывающийся с однонитевой ДНК и, возможно, узнающий повреждения) (Bailly, Lauder et al. 1997). Далее моно-убиквитинированный PCNA работает как переключатель, меняя репликативную полимеразу на полимеразы, обходящие повреждения, такие как Rad30 или Rev1, которые имеют связывающие сайты как с PCNA, так и с убиквитинином, и, соответственно, большее сродство к убиквитинированному PCNA (Stelter and Ulrich 2003; Kannouche, Wing et al. 2004; Watanabe, Tateishi et al. 2004; Bienko, Green et al. 2005; Garg and Burgers 2005). Эта репаративная система является склонным к ошибкам ответвлением Rad6 зависимого репаративного пути. Как альтернатива PCNA может быть полиубиквитинирован (через К63) по тому же лизину (К164). Помимо Rad6 и Rad18, для этой модификации требуется E2 гетеродимер Mms2-Ubc13 и E3 Rad5 (Ulrich and Jentsch 2000; Hoege, Pfander et al. 2002). Поли-убиквитинирование PCNA обеспечивает безошибочную репарацию, которая, по-видимому, сопровождается переключением матрицы на вновь 64 синтезированную цепь ДНК сестринской хроматиды (Xiao, Chow et al. 2000; Zhang and Lawrence 2005). Предполагается, что SUMO-илирование PCNA происходит постоянно в S-фазе (Hoege, Pfander et al. 2002) и является механизмом, защищающим репликативную вилку от ненужных случаев рекомбинации (Papouli, Chen et al. 2005; Pfander, Moldovan et al. 2005). SUMO-илированый PCNA рекрутирует хеликазу Srs2, которая ингибирует рекомбинацию, разрушая микрофиламенты Rad51 (Krejci, Van Komen et al. 2003; Veaute, Jeusset et al. 2003). За счет этого ингибирования в случае встречи повреждений ДНК начинается Rad6зависимая репликация, а не Rad52-зависимая рекомбинация. SUMO-илирование PCNA идет по двум сайтам, в основном – по лизину 164 (К164) и требует активности SUMO E3-лигазы Siz1, и в меньшей степени – по лизину 127 (К127) (консенсус сайт для SUMO-илирования), где нет необходимости в E3-лигазе (Hoege, Pfander et al. 2002; Pfander, Moldovan et al. 2005). Важная роль данных модификаций PCNA в репарации повреждений ДНК подчеркивается тем фактом, что их дерегуляция приводит к массовым хромосомным перестановкам (GCR), сопровождающим многие виды рака (Motegi, Kuntz et al. 2006). 5.2. Фосфорилирование Если убиквитинирование PCNA показано очень четко, то природа других модификаций, которые ведут к сдвигу его изоточки, pI, пока еще однозначно не выяснена. Хотя и были опубликованы данные о нескольких разных модификациях, часть из них весьма противоречива и требуют дальнейшего подтверждения (Prosperi, Scovassi et al. 1994; Simbulan-Rosenthal, Rosenthal et al. 1998; Naryzhny and 65 Lee 2004). Одним из таких примеров является фосфорилирование. Данная реакция обратима и катализируется ферментами протеин-фосфокиназа (фосфорилирование) и фосфатаза (дефосфорилирование). У эукариот обычно модифицируются аминокислоты серин, треонин или тирозин, а у прокариот еще и основные аминокислоты гистидин, аргинин или лизин. Ковалентное присоединение полярной фосфатной группы (PO4) к гидрофобным аминокислотам может обратить гидрофобные участки белка в гидрофильные, вызывая сильные конформационные изменения в его структуре. Фосфорилирование/дефосфорилирование может активировать или деактивировать многие ферменты и рецепторы, и играет важную роль во множестве клеточных процессов, таких, например, как передача сигнала, регуляция ферментативных активностей, транспорт или протеолиз. Их нарушение может привести к таким заболеваниям, как рак или диабет. Почти 30% всех белков являются в той или иной степени фосфопротеинами (Hayduk, Choe et al. 2004; Lim 2005). Действительно, при фосфорилировании нейтральные гидроксильные группы на сериновых, треониновых или тирозиновых аминокислотах замещаются на отрицательно заряженные фосфаты с рК около 1.2 и 6.5. Таким образом, при рН ниже 5.5 фосфат добавляет один отрицательный заряд, при рН 6.5 – 1.5 отрицательных заряда, а при рН выше 7.5 – два отрицательных заряда. Это ведет к соответствующему сдвигу изоточки белка в кислую сторону. На двумерном геле данный процесс выглядит, как сдвиг соответствующего пятна в сторону анода (если белок полностью фосфорилирован по какому-то одному сайту). Если же имеется несколько таких сайтов, то в случае их частичного фосфорилирования наблюдается цепочка пятен, соответствующих белкам практически одной массы, но с разными 66 изоточками. При этом интенсивность окрашивания каждого пятна говорит о количестве данной фосфорилированной формы белка. Ранее было показано существование различных “видов” PCNA, что могло бы быть связано с его разными функциями (Mathews, Bernstein et al. 1984; Bravo and Macdonald-Bravo 1987; Morris and Mathews 1989). Более того, как было описано в предыдущей главе, двумерный электрофорез высокого разрешения (2DE) и иммуноблотный анализ показывает наличие, как минимум, трех изоформ PCNA одной массы, но с разными изоточками: “кислая “ (А), мажорная (М) и “щелочная” (В) (Naryzhny and Lee 2003). Разные формы PCNA могли бы быть результатом посттрансляционых модификаций. Есть публикации, в которых говорится о том, что и PCNA может быть фосфорилирован, а также метилирован или же АДФрибозилирован (Prosperi, Scovassi et al. 1994; Simbulan-Rosenthal, Rosenthal et al. 1998; Hayduk, Choe et al. 2004; Hoelz, Arnold et al. 2006; Wang, Nakajima et al. 2006). В свое время Браво и Целис (Bravo и Celis) не нашли подтверждений фосфорилированию PCNA (Bravo and Celis 1985). Однако все же нужно упомянуть то, что имеется несколько публикаций в поддержу того, что PCNA может быть фосфорилирован (Prosperi, Scovassi et al. 1994; Hayduk, Choe et al. 2004; Wang, Nakajima et al. 2006). Более того, в одной из таких работ даже приводятся доказательства того, что фосфорилирование по Tyr211 необходимо для стабильности PCNA (Wang, Nakajima et al. 2006). Как будет видно из дальнейшего изложения, при детальном анализе данной ситуации такое заключение не находит подтверждения. 67 5.2.1. PCNA не фосфорилирован in vivo Чтобы окончательно прояснить вопрос с фосфорилированием, автор данной монографии использовал широкий спектр экспериментальных подходов, включая изотопную метку in vivo, иммуноосаждение, иммуноблот в комбинации с двумерным электрофорезом высокого разрешения (2DE). Данные, приведенные ниже, четко указывают фосфорилируется, но на другие то, что млекопитающих PCNA модификации, в частности in vivo не ацетилирование, метилирование и окисление могут быть связаны с функционированием PCNA. Рис. 22. Анализ PCNA с использованием антител к фосфопептидам указывает на то, что PCNA не фосфорилирован in vivo. (А), белки клеток китайского хомячка (CHO) были разделены двумерным электрофорезом (первое направление pH 4.0–7.0, 7-см, второе направление - 11%, гель, 8 х 8см), перенесены на PVDF мембрану и иммуноокрашены, используя смесь анти-фосфосерин, антифосфотреонин, и анти–фосфотирозин антител. (В), Та же самая мембрана была затем обработана моноклональными анти-PCNA (PC10) антителами. Стрелка указывает положение PCNA. Опубликовано с разрешения редакции журнала J.Biol.Chem. Белки асинхронной популяции клеток яичника китайского хомячка (CHO) разделяли двумерным электрофорезом (2DE), переносили на PVDF мембрану и 68 иммуноокрашивали, используя смесь антител к фосфосерину, фосфотреонину, и фосфотирозину (Рис.22А). Ту же самую мембрану дополнительно обрабатывали моноклональными анти-PCNA (PC10) антителами (Рис.22В). PCNA, идентифицированный с помощью PC10 (стрелка на Рис.22В), не дает сигнала при использовании антител к фосфопротеинам (стрелка Рис.22А), указывая на то, что PCNA клеток китайского хомячка не фосфорилирован. Рис. 23. Анализ меченных in vivo белков показывает, что PCNA не фосфорилирован. Белки клеток, метаболически меченные [32P]ортофосфатом, были разделены двумерным электрофорезом (первое направление - pH 3.0–10.0, 13см, второе направление - 11% SDS-PAGE, гель13х13см). Гель был окрашен серебром, высушен (A) и экспонирован на рентгеновскую пленку (B). A1 и B1, увеличенные области, содержащие PCNA. Стрелки указывают положение PCNA. Опубликовано с разрешения редакции журнала J.Biol.Chem. 69 Рис. 24. Комплексный анализ с помощью метки in vivo, иммунопреципитации и Вестерн-блота показывает, что PCNA не фосфорилирован in vivo. (A) и (A1), белки, экстрагированные из клеток, метаболически меченых [32P]ортофосфатом, подверглись иммуноосаждению с использованием антител PC10. Иммунопреципитат разделяли двумерным электрофорезом (первое направление pH 3.0–10.0, 13см, второе направление - 11%-ый SDS-PAGE, гель 14х14см). Гель окрашивали серебром (А1), высушивали и экспонировали на рентгеновскую пленку (А). В и В1 – тот же иммунопреципитат разделяли двумерным электрофорезом более высокого разрешения (первое направление, pH 4.0–5.0, 18см, второе направление - 11%-ный SDS-PAGE, гель14х14см). Затем белки переносили на PVDF мембрану, которую сначала экспонировали на рентгеновскую пленку (В) а затем иммуноокрашивали антителами к PCNA, PC10 (В1). Обведенные зоны на А и А1 обозначают положение PCNA. Стрелка указывает на положение M-формы PCNA. Круг на В1 показывает положение фосфопротеина, обозначенного незакрашенной стрелкой на В. Опубликовано с разрешения редакции журнала J.Biol.Chem. 70 Чтобы окончательно прояснить вопрос с фосфорилированием PCNA, были проанализированы белки из клеток, которые были метаболически мечены с помощью [32P]ортофосфата (Рис.23). После разделения белков и окрашивания серебром, положение PCNA было идентифицировано (стрелка на Рис.23А1). Тот же самый гель был высушен и экспонирован на рентгеновскую пленку (Рис.23В). Аналогично данным, показанным на Рис.22, следов фосфорилирования PCNA обнаружено не было (стрелка на Рис.23В1). Для большей уверенности и повышения чувствительности анализа, PCNA был иммуноосажден с помощью анти-PCNA моноклональных антител PC10. Иммуноосажденные белки были разделены двумерным электрофорезом, окрашены серебром, а гель высушен (Рис.24А1) и экспонирован на рентгеновскую пленку (Рис.24А). Четко видно, что PCNA не фосфорилирован (стрелка на Рис.24А). Однако заметно, что близко к PCNA находится фосфопротеин (незакрашенная стрелка, А и А1). Хотя относительное количество этого белка мало, уровень фосфорилирования его очень высокий. Чтобы полностью исключить отношение этого белка к PCNA, был проанализирован иммунопреципитат PC10 антител в режиме максимально высокого разрешения 2DE (первое направление, pH 4.0–5.0, 18-см IPG полоска; второе направление, 11% SDSPAGE, 14х14-см гель). Белки были перенесены на PVDF мембрану, которая затем вначале была экспонирована на рентгеновскую пленку (Рис.24В), а затем иммуноокрашена с помощью антител к PCNA, PC10 (Рис.24В1). И опять фосфорилирования PCNA обнаружено не было (стрелка на Рис.24В). Как и в случае 2DE более низкого разрешения (незакрашенная стрелка на Рис.24А), присутствие фосфопротеина (33 кДа, pI 4.47) очевидно (незакрашенная стрелка на Рис.24В). Этот 71 фосфопротеин, который не дает сигнала с PC10, немного меньше и “кислее”, чем Aформа (34 кДа, pI 4.52) или M-форма (34 кДа, pI 4.57) PCNA. Однако он осаждается вместе с антителами против PCNA (по-видимому, взаимодействует с ним), и вполне может быть принят за фосфорилированный PCNA при анализе электрофорезом невысокого разрешения. Это, по-видимому, и является причиной того, что в нескольких работах делается вывод о фосфорилировании PCNA. Однако, суммируя вышеизложенные данные, можно определенно сказать, что PCNA не фосфорилирован in vivo. 5.3. Ацетилирование Ацетилирование играет важную роль в регуляции разнообразных клеточных функций (Kouzarides 2000; Jenuwein and Allis 2001; Eberharter and Becker 2002; Milutinovic, Zhuang et al. 2002). Причем эта реакция может быть двух типов. Одна это ацетилирование N-конца, является необратимой и происходит во время трансляции белков. Ферментативное ацетилирование N-концов полипептидной цепи наблюдается у ~50% дрожжевых белков и 80-90% белков эукариот, но очень редко у бактерий. Функции этой модификации не совсем понятны. Другая модификация это обратимое ацетилирование эпсилон аминогруппы лизина внутри полипептидной цепи. Так, ацетилирование и деацетилирование лизиновых остатков в районе Nконцов гистонов H2A, H2B, H3 и H4, образующих октамеровый кор нуклеосом, является частью механизма регуляции генов. Как было предположено, они играют роль гистонового кода, сигнализируя об активации определенных областей хроматина для транскрипции (Strahl and Allis 2000; Pugh 2004). Эти реакции катализируются ферментами с гистон ацетил трансферазной (HAT) или гистон 72 деацетилазной (HDAC) активностями. Хотя следует заметить, что эти ферменты могут ацетилировать и деацетилировать и негистоновые белки тоже, например факторы транскрипции, такие как p53, E2F1, EKLF (Sadoul, Boyault et al. 2008). Правда, в таком случае эти ферменты принято называть фактор ацетил трансферазами (FAT). Так как при физиологическом рН лизиновые остатки являются катионами, то N-ацетилирование снимает с них положительный заряд. Это изменение заряда сказывается на белок-белковом и на белок-ДНК взаимодействии. Так, в случае факторов транскрипции ацетилируемые лизины находятся в областях, близких к ДНК-связывающим доменам, и их ацетилирование, по-видимому, повышает взаимодействие с ДНК и активирует транскрипцию (Kouzarides 2000). Однако следует заметить, что в случае белков HMG1 их ацетилирование в ДНКсвязывающей области наоборот блокирует связывание с ДНК (Kouzarides 2000). Для таких белков, как факторы транскрипции, шапероны, белки цитоскелета, ацетилирование/деацетилирование играет важную регуляторную роль, аналогичную фосфорилированию/дефосфорилированию (Glozak, Sengupta et al. 2005). Причем часто возможны механизмы пересечения и взаимной регулировки при передаче сигнала за счет последовательных реакций этого типа, а также и других реакций, таких как метилирование, убиквитинирование или SUMO-илирование (Yang and Seto 2008). Например в случае р53 баланс ацетилирования и убиквитинирования одних и тех же лизиновых остатков является контролем времени жизни р53 и, соответственно, контролем транскрипции генов. экспрессии, контролируемых этим фактором 73 Еще следует добавить, что ацетилирование также используется клеткой для динамических структурных изменений. Например ацетилирование/деацетилирование тубулинов является частью механизма сборки и разборки микротрубочек (Schulze, Asai et al. 1987). Рис. 25. PCNA ацетилирован in vivo. (A) и (A1), белковые экстракты клеток, метаболически меченые [3H]Na-ацетатом, разделяли в 2DE (первое направление IEF, pH 4.0–7.0, 7-см, второе направление - 11%-ный SDS-PAGE, гель 8.5х8.5см). Белки затем переносили на PVDF мембрану, которую экспонировали на рентгеновскую пленку в течение 4 месяцев (A). Затем ту же мембрану иммуноокрашивали антителами PC10 (A1). (B) и (B1), белки, иммуноосажденные антителами PC10, разделяли в 2DE (первое направление - IEF, pH 4.0–7.0, 13см, второе направление - 11%-ный SDS-PAGE, гель 14х14см) с последующим Вестернблотом, используя антитела к ацетилированным белкам (Novus Biologicals) (B) или к PCNA, PC10 (B1). Стрелки указывают положение PCNA. Опубликовано с разрешения редакции журнала J.Biol.Chem. 74 5.3.1. PCNA может быть ацетилирован in vivo Для выяснения вопроса об ацетилировании PCNA, внутриклеточные белки были вначале метаболически мечены in vivo добавлением [3H]ацетата натрия в ростовую культуру, а затем разделены двумерным электрофорезом (2DE) и переведены на PVDF-мембрану Immobilon-P. Далее, мембрана была сначала проэкспонирована на рентгеновскую пленку в течение 4 месяцев (Рис.25A), а затем иммуноокрашена с использованием анти-PCNA антител РС10 (Рис.25A1). Использование одной и той же мембраны позволило идентифицировать PCNA среди 3 H-меченых (ацетилированных) белков (стрелка на А панели). Рис. 26. 2DE высокого разрешения в комбинации с Вестерн-блотом выявляет три изоформы PCNA, различающиеся степенем ацетилирования. Ядерные экстракты CHO клеток инкубировали 12 часов при 4°C без обработки (Control), в присутствии гистон децетилазы HDAC1 (HDAC1), или с 20 мМ ацетил-CoA плюс 0.05 мкМ TSA (Acetyl-CoA _TSA). Затем каждый образец анализировали двумерным электрофорезом, 2DE (первое направление - pH 4.0–7.0, 13см, второе направление - 11%-ный SDS-PAGE, гель14х14см) с последующим Вестерн-блотом, используя антитела РС10. Опубликовано с разрешения редакции журнала J.Biol.Chem. 75 Чтобы получить дополнительные доказательства, белки были осаждены антителами РС10 и проанализированы двумерным электрофорезом с последующим Вестернблотом, используя антитела к ацетилированным пептидам (Рис. 25B) и к PCNA (Рис. 25B1). Полученные результаты находятся в согласии с данными эксперимента с меткой in vivo, приведенными на Рис. 25А1, А2, и четко указывают на то, что PCNA может быть ацетилирован. Чтобы определить статус ацетилирования трех основных форм PCNA (А, М, В), белки были обработаны гистон деацетилазой (HDAC1) или ингибитором деацетилаз TSA с добавлением субстрата для ацетилирования ацетилСоА. Обработка HDAC1 ведет к увеличению количества В-формы (Fig. 26, HDAC1), в то время как ацетил-CoA плюс TSA – к уменьшению количества В-формы и возрастанию количества А - и М-форм (Fig. 26, нижняя панель). Эти данные указывают на то, что А- и М-формы, соответственно, высоко и средне ацетилированы, а В-форма деацетилирована. 5.3.2. Субклеточная локализация изоформ PCNA в контексте клеточного цикла Уровень PCNA в различных субклеточных фракциях и в зависимости от положения клетки в клеточном цикле был нами детально проанализирован (Naryzhny and Lee 2001). 76 Рис. 27. Определение уровня PCNA в разное время клеточного цикла и распределение изоформ PCNA в различных субклеточных фракциях. (A) Анализ положения клеток в клеточном цикле с помощью проточной цитометрии. Клетки CHO были синхронизированы в фазе G0 голоданием по изолейцину в течение 45 часов (G0). Затем клетки были переведены в полную среду, содержащую 200 мМ мимозин, в которой те проходили фазу G1, но останавливались на границе G1/S (G1/S). (A) Числа, показанные слева, - время выхода клеток после G1/S остановки. (B) Белки из разных субклеточных фракций клеток, синхронизированных в фазах G0, G1, G1/S, и S (8 часов после удаления мимозина) были проанализированы SDS-PAGE с последующим иммунодетектированием антителами PC10. (C) Анализ общих белков (WCE) или белков из отдельных субклеточных фракций асинхронных клеток CHO с помощью 2DE и иммунодетектирования антителами PC10. Опубликовано с разрешения редакции журнала J.Biol.Chem. Как видно на Рис.27В, уровень PCNA в ядерном экстракте (NEF, nuclear extract fraction), хроматине (CMF) и ядерном матриксе (NMF) меняется в течение клеточного цикла, в то время как в цитозольной фракции (CF) остается сравнительно постоянным. Уровень PCNA значительно повышен в NMF, начиная с 77 середины G1 фазы, а в NEF начиная с границы фаз G1/S (Рис. 27В, NMF и NEF). Однако наиболее драматическое увеличение количества PCNA (до 7 раз) наблюдается в хроматиновой фракции (CMF) на границе фаз G1/S (Рис. 27В, CMF). В совокупности эти данные говорят о том, что в середине G1-фазы PCNA сначала транспортируется в ядерный матрикс, а затем, когда начинается репликация ДНК (граница фаз G1/S), переходит из ядерного матрикса в хроматин. Также был проверен и уровень модификации PCNA в разных фракциях. Как видно на Рис. 27С, только M-форма присутствует в цитоплазме, но значительное количество A-формы обнаруживается во фракциях ядерного экстракта, хроматина и ядерного матрикса (NEF, CMF и NMF). Интересно то, что B-форма присутствует только в ядерном экстракте (NEF) и на уровне сравнимом с уровнем М-формы. В совокупности это позволяет предположить, что А- и М-формы напрямую участвуют в ДНК репликации, а В-форма – нет. Относительный уровень А-формы, хоть и не намного, но выше в хроматиновой фракции по сравнению с ядерным матриксом. Чтобы напрямую определить, имеет ли статус ацетилирования PCNA отношение к клеточному циклу, уровень модификации PCNA был проанализирован в покоящихся и делящихся клетках. Как видно на Рис.28, клетки, остановленные в фазе G0 голоданием по изолейцину, имеют очень низкий уровень форм А и В (45 h without ileu). Небольшое количество А- и В-форм присутствует, по-видимому, из-за наличия небольшой популяции S–фазных клеток (Рис.28, верх левой панели). Если запустить клеточный цикл переводом клеток в полную инкубационную среду, то после 18 часов более 60% клеток находятся в S-фазе. Это совпадает с повышенным уровнем А- и В-форм PCNA (Рис.28, 18 h-MEM). И наоборот, если клетки 78 синхронизовать в G1-фазе (инкубация в полной среде, содержащей 0.5 µМ TSA) , в них присутствует очень мало А- и В-форм (Рис.28, 18-h MEM + TSA). Хотя в среду добавлен только ингибитор деацетилирования, А-форма тоже присутствует в очень Рис. 28. А- и В-формы PCNA имеют отношение к переходу клеток в S-фазу. Клетки СНО, синхронизированные в G0 фазе инкубацией (45 часов) в среде, лишенной изолейцина, были переведены в полную инкубационную среду (МЕМ) и инкубированы в ней в течение 18 часов в присутствии или отсутствие 0.5 мкМ TSA. Далее клетки были проанализированы проточным цитофлюориметром (левая панель), а клеточные белки разделены двумерным электрофорезом высокого разрешения (первое направление - ИЭФ, рН 4.0-5.0, 18см, второе направление SDS-PAGE, гель 14х14см) с последующим детектированием антителами PC10 (правая панель). Опубликовано с разрешения редакции журнала J.Biol.Chem. малом количестве (Рис.28, нижняя панель), что очень похоже на ситуацию с PCNA в G0-фазе (Рис.28, верхняя панель). 79 Рис. 29. Ацетилирование может быть важным для взаимодействия PCNA с ДНК полимеразой дельта и ДНК полимеразой эпсилон. (A) Ацетилаза p300 и деацетилаза HDAC1 взаимодействуют с PCNA. Белки иммуноосаждали (IP), используя антитела PC10. Осадки, а также экстракты до (Pre-IP) и после (post-IP) осаждения, анализировали Вестерн-блотом, используя анти-PCNA (PC10), антиp300 и анти-HDAC1 антитела. (IB) Иммуноблот. (B) Комплекс PCNA, деацетилированный HDAC1 менее активен в ДНК полимеризации, чем обработанный TSA. Клеточный экстракт деацетилировали (обрабатывали HDAC1) 12 часов при 4°C (дорожка 4) или 0.5 мкМ TSA (дорожка 5) перед иммуноосаждением и Вестерн-блотом. (C) Комплексы PCNA иммуноосаждали из ядерного экстракта (NEF), используя антитела PC10. Реакцию ДНК полимеризации, катализируемую иммунопреципитатом, на поли (дА) матрице с праймером (дТ)12–18 (Amersham Biosciences) проводили по методу Подуста (см. Материалы и Методы) после того, как образцы обрабатывали ацетил-CoA (70 мМ) плюс TSA (0.5 мкМ) (белые квадраты) или HDAC1 (черные квадраты) в течение 30 мин при комнатной температуре. Опубликовано с разрешения редакции журнала J.Biol.Chem. 80 5.3.3. Ацетилирование и деацетилирование PCNA может происходить с помощью ацетилазы р300 и деацетилазы HDAC Чтобы определить ферменты, ответственные за ацетилирование и деацетилирование PCNA, белки клеточного экстракта были иммуноосаждены с антителами к PCNA (РС10), и иммунопреципитат был проанализирован Вестерн-блотом, используя антитела к HDAC1 и p300. Как видно на Рис.29А, HDAC1 эффективно осаждается вместе с PCNA (дорожка 1), указывая на то, что этот фермент может быть ответственен за деацетилирование PCNA. Фактор транскрипции с ацетилазной активностью р300 также осаждается вместе с PCNA (Рис. 29A, дорожка 1). Таким образом, эти результаты позволяют предположить, что PCNA может быть ацетилирован ацетилазой р300 и деацетилирован деацетилазой HDAC1. Этот вывод согласуется с данными эксперимента in vitro, представленными на Рис.26. Ацетилирование PCNA с помощью p300 возможно необходимо для репликации ДНК, так как фибробласты с генотипом p300 (-/-) не способны вести синтез ДНК (Hasan, Hassa et al. 2001). 5.3.4. Ацетилированный PCNA имеет большее сродство к ДНК полимеразам, чем деацетилированный Чтобы выяснить насколько ацетилирование PCNA влияет на его способность взаимодействовать с ДНК полимеразами, иммунопреципитат, полученный осаждением анти-PCNA антителами РС10 из клеточных экстрактов, обработанных 81 деацетилазой HDAC1 или ингибитором деацетилаз, TSA, был проанализирован Вестерн-блотом с использованием антител к ДНК полимеразам. Оказалось, что PCNA, обработанный деацетилазой HDAC1, проявляет намного меньшее сродство к ДНК полимеразе дельта или ДНК полимеразе бета, чем образец, обработанный TSA (Рис. 29В, дорожки 4 и 5). Эта разница в сродстве особенно заметна в случае деацетилированного PCNA и ДНК полимеразы дельта (Рис. 29В, дорожки 4 и 5 на средней панели). Таким образом, ацетилирование и деацетилирование PCNA играют важную роль в его связывании с ДНК полимеразами и соответственно - в репликации ДНК. Кроме того, репликация ДНК была протестирована in vitro с использованием комплексов PCNA, иммуноосажденных из ядерных экстрактов (NEF), которые были обработаны деацетилазой HDAC1 или ацетил-CoA плюс TSA. Как следует из Рис. 28С, образцы, обработанные HDAC1 (то есть деацетилированные), проявляют значительно более низкую ДНК полимеразную активность, чем те, которые обработаны ацетил-CoA плюс TSA. Эти результаты также согласуются с тем, что ацетилирование PCNA важно для репликации ДНК. Суммируя вышеизложенное, можно предположить, что PCNA в виде Mформы занимает положение на ядерном матриксе, близкое к сайтам инициации ДНК репликации, в промежуток времени с середины до конца G1 фазы (Рис.27). Следует отметить, что пре-репликативные комплексы уже сформированы на сайтах инициации ДНК репликации в это время (Takisawa, Mimura et al. 2000). Кроме того, эти сайты инициации вместе со связанными с ними пре-репликативными комплексами физически ассоциируют и фракционируются с ядерным матриксом (Dijkwel and Hamlin 1988). При инициации репликации PCNA загружается на 82 хроматин тоже в виде М-формы, так как она является доминирующей, как в хроматиновой фракции (CMF), так и во фракции ядерного матрикса (NMF) (Рис.27С). А- и В-формы, по-видимому, каким-то образом связаны ДНК репликацией, возможно загрузкой/разгрузкой PCNA на хроматин, так как они отсутствуют в цитоплазме, но присутствуют в ядерном экстракте, хроматине и ядерном матриксе (Рис. 27). Следует заметить, что повышенный уровень В-формы отмечен в ядерном экстракте (Рис. 27С). Так как В-форма не проявляет большого сродства к ДНК полимеразам бета и дельта (Рис. 29В), она точно не может участвовать в репликации ДНК. Можно, таким образом, заключить, что М-форма PCNA участвует в синтезе ДНК, а А- и В-формы образуются в процессе снятия PCNA с ДНК или его загрузки и являются его промежуточными формами. Например, недавно было показано, что ацетилирование PCNA по лизину 14 (K14) может быть инициировано УФ-облучением и ведет в конечном итоге к деградации PCNA (Yu, Cai et al. 2009). Авторы цитируемой работы делают вывод, что ацетилирование PCNA по лизину 14 (K14) приводит к конформационным изменениям в PCNA и диссоциации комплекса PCNA с MTH2, который важен для стабильности PCNA. Нарушение этого комплекса ведет к деградации PCNA и в принципе может быть использовано как стратегия для ингибирования злокачественных опухолей (Yu, Cai et al. 2009). Таким образом, полученные данные показали, что PCNA не фосфорилирован in vivo (Naryzhny and Lee 2004). Однако ацетилирование и деацетилирование могут объяснить сдвиг PCNA по заряду и образование дополнительных пятен (Naryzhny and Lee 2004). При этом фактор транскрипции p300 и гистон деацетилаза HDAC1 83 могут быть ответственны, хотя бы частично, за ацетилирование и деацетилирование PCNA. Однако вероятность того, что эти изоформы (A-, B- пятна, Рис. 15) содержат еще и другие модификации, такие как окисление или метилирование в настоящий момент исключать нельзя. В частности, метилирование является модификацией, которая может привести к сдвигу изоточки, pI, в щелочном направлении (B-пятно). Следует указать, что возможность наличия этой модификации у PCNA уже была показана (Hoelz, Arnold et al. 2006). Изоточка мажорной формы (M) точно соответствует теоретическим параметрам PCNA (pI 4.57), то есть пятно представляет в основном немодифицированную форму PCNA. Однако имеется и вероятность того, что часть белка в M-пятне содержит одновременно две модификации. Одна модификация образует A-форму (ацетилирование или окисление, сдвиг pI -0.05), а другая ведет к B-форме (метилирование, сдвиг pI +0.05). При одновременном наличии двух таких модификаций общий заряд белка не изменится и полипептид будет иметь все ту же изоточку - pI 4.57. Основные выводы (1) Среди возможных функциональных модификаций PCNA пока наиболее достоверно подтверждено убиквитинирование. (2) Убедительно показано отсутствие фосфорилирования PCNA in vivo. Утверждение же о том, что фосфорилирование PCNA имеет место, более того функционально и необходимо для его стабильности (Wang, Nakajima et al. 2006) не выдерживает строгой проверки (Naryzhny and Lee 2004). 84 (3) Имеется ряд доказательств об ацетилировании PCNA и его участии в репликации ДНК и в стабилизации комплексов PCNA с другими белками. (4) Другие модификации PCNA, такие, например, как окисление и метилирование показаны, но изучены еще недостаточно. Глава 6. Структура PCNA 6.1. Мономеры PCNA образуют тример в виде кольца Первичная структура PCNA очень мало изменилась в течение эволюции, и его аминокислотные последовательности у человека и крысы отличаются только в четырех из 261 аминокислот. Как было показано с помощью кристаллографии и малоуглового нейтронного рассеивания, PCNA организован в тороидальную структуру (Рис.30) (Krishna, Kong et al. 1994; Gulbis, Kelman et al. 1996; Schurtenberger, Egelhaaf et al. 1998; Ellison and Stillman 2001). Такая кольцевая организация характерна и очень похожа у факторов типа “скользящей скрепки”, необходимых для процессивного синтеза ДНК у бактериофагов, археи и эукариотов (Ellison and Stillman 2001; Majka and Burgers 2004). Например, белковые структуры PCNA у Saccharomyces cerevisiae и у человека практически совместимы и совпадают по всем ключевым элементам, хотя их аминокислотные последовательности имеют только 35% гомологии. Каждый мономер PCNA состоит из двух доменов, которые прочно соединяются друг с другом посредством бета структур, образованных на границе между доменами (Krishna, Kong et al. 1994; Gulbis, Kelman et al. 1996). Три мономера в свою очередь соединяются также через 85 взаимодействие анти-параллельных участков бета листов (ßD2 в одной молекуле и ßI1 в другой), что приводит к образованию 8 амид-карбоксил водородных связей на границе межмолекулярного взаимодействия (Рис.30) (Krishna, Kong et al. 1994; Gulbis, Kelman et al. 1996). В дополнение образуется гидрофобное ядро, где Рис. 30. Схематическая диаграмма мономера PCNA (A) и структурная модель тримера PCNA (B, C). Стрелки указывают интердоменную петлю (AA118-135), IDCL, центральную петлю (AA41-44), CL, C-конец (AA254-261), CT, петлю обратной стороны (AA184-195), BL. Также показан пептид p21, связанный с мономером PCNA. упакованы вместе A2 спираль одной молекулы и B1 спираль другой молекулы PCNA (Krishna, Kong et al. 1994). Конечная структура тримера PCNA имеет внешний диаметр ~80Å, внутренний диаметр ~34Å и толщину ~30Å. Хотя общий суммарный заряд PCNA отрицательный, его внутренняя поверхность заряжена положительно вследствие присутствия остатков лизина и аргинина (10 на субъединицу). Это предполагает, что отрицательно заряженная ДНК может проходить через кольцо без электростатического отталкивания (Krishna, Kong et al. 86 1994; Gulbis, Kelman et al. 1996). Кольцо PCNA имеет явно выраженные “переднюю” и “обратную” стороны: передняя часть включает в себя междоменную петлю (IDCL, 118LMDLDVEQLGIPEQEYSC135), связывающую N- и C-концы каждого мономера, а обратная часть содержит несколько петель, которые соединяют анти-параллельные ß участки и выступают в окружающую среду (например, ßD2ßE2 и ßH1-ßI1) (Krishna, Kong et al. 1994). Причем PCNA взаимодействует с белками-партнерами практически только через переднюю сторону. Взаимодействия в области обратной стороны обнаружено не было. 6.2 PCNA млекопитающих организован в виде двойного тримера Как уже было описано выше, результаты экспериментов, проведенных с помощью кристаллографии и нейтронного рассеивания при малых углах, показали, что PCNA организован в тороидальную структуру (Рис.30) (Krishna, Kong et al. 1994; Gulbis, Kelman et al. 1996; Schurtenberger, Egelhaaf et al. 1998; Ellison and Stillman 2001). Однако ряд косвенных данных свидетельствовал о том, что тор PCNA является не просто тримером, а двойным тримером (Henderson, Wiegand et al. 2000). Изначально, чтобы получить информацию о белковых взаимодействиях PCNA, автор данной монографии проанализировал эндогенный PCNA с помощью обычного SDS PAGE. Как и ожидалось, только мономер с массой в 33 кДа был обнаружен в 12% денатурирующем геле (Рис.31А, 0 мин). Однако после предварительной обработки клеток 1.5% формальдегидом PCNA обнаруживается в 87 области 33, 100 и 200 кДа. Причем четко прослеживается кинетика перехода Рис. 31. PCNA клеток млекопитающих существует в виде двойного тримера. (A) Человеческие раковые клетки MDA-MB231, находящиеся в PBS, были обработаны 1.5%-ным формальдегидом в течение 10, 20, 30, 60 или 180 мин. Далее, образцы были проанализированы SDS-PAGE и Вестерн-блотом с использованием моноклональных антител к PCNA, РС10. “M,” “T” и “DT” обозначают соответственно мономер, тример и двойной тример PCNA. (B, C) 2DE анализ показывает, что мономер, тример и двойной тример PCNA имеют одну и ту же изоточку, pI (4.57). (D) Сшитый двойной тример PCNA (180 мин на панели A) был хроматографически очищен и его положение (пик I) относительно не сшитого рекомбинантного PCNA (пик II) при гель фильтрации на колонке S200 было проанализировано. На вставке - с помощью SDS-PAGE и окрашивания серебром показана степень чистоты очистки препаратов PCNA. 1 – рекомбинантный PCNA, 2 – сшитый PCNA. Обозначения по осям, x - объем элюируюшего буфера, у – интегральная оптическая плотность (IOD) PCNA, детектированная на Вестернблоте. детектирования PCNA от одной полосы в области 33 кДа до практически одной полосы в области ~200 кДа (Рис.31А, 90 мин). Дальнейшее увеличение времени сшивки формальдегидом (до 3 часов) не дало никаких дополнительных комплексов тяжелее 200 кДа (Рис.31А, 180 мин), прямо указывая на то, что детектируемый комплекс PCNA образован специфически и имеет определенную структуру, а не является неспецифическим конгломератом. Эксперименты со сшивками на клеточных экстрактах оказались более эффективными и показали практически те же 88 результаты, что и с интактными клетками. Чтобы выяснить возможное участие других белков (помимо PCNA) в образовании 200-кДа комплексов, были проведены эксперименты с двумерным электрофорезом. Как видно на Рис.31В, уже после 20 мин обработки формальдегидом в дополнение к 33 кДа существенно присутствие белков с массой в 100 и 200 кДа, и практически все молекулы PCNA образованы в 200-кДа комплекс, когда экстракт был обработан 90 мин (Рис.31С). Следует отметить, что 100- и 200-кДа комплексы имеют точно такую же изоточку (pI), что и мономер PCNA (4.57). То есть с очень большой долей вероятности можно говорить, что они содержат только молекулы PCNA, и, учитывая его молекулярную массу, 100-кДа комплекс представляет собой гомо-тример, а 200-кДа – двойной гомотример. Чтобы перевести все тримеры в двойные тримеры, необходимо достаточно длительное время сшивки. Возможно, это вызвано тем, что двойной тример PCNA находится в динамическом состоянии, и необходимый контакт между аминокислотами, обеспечивающий сшивку, возможен не все время. По-видимому, это является одной из причин того, что в кристаллографических экспериментах обнаруживается только тример PCNA (Krishna, Kong et al. 1994; Gulbis, Kelman et al. 1996). Таким образом, в этих экспериментах сшивки PCNA с другими белками не наблюдается. Объясняется это, по-видимому, тем, что все молекулы PCNA находятся в клетке в виде двойных тримеров, где лизиновые и аргининовые остатки находятся в положениях, удовлетворяющих условиям сшивки формальдегидом (не далее 2Å друг от друга). С другой стороны, таких условий для сшивки между этими остатками в PCNA и в PCNA-связывающих белках не имеется. Тем более что большинство PCNA-связывающихся белков взаимодействуют с PCNA через 89 гидрофобную ложбину, образованную центральной петлей (41DSSH44) и петлей, соединяющей внутренние домены (121LDVEQLGIPEQE132), ни одна из которых не содержит аргинин или лизин (Tsurimoto 1999). Таким образом, не следует ожидать сшивки PCNA с другими белками формальдегидом, даже зная, что такие взаимодействия имеют место in vivo. Чтобы окончательно подтвердить, что 200-кДа PCNA комплекс не содержит других белков, были проведены эксперименты по kDa 1 2 3 4 5 200 150 67 DT Рис. 32. Анализ комплексов PCNA неденатурирующим электрофорезом. Двойной тример PCNA, а также белковые маркеры были проанализированы нативным электрофорезом (см. Материалы и Методы). Показаны алкоголь дегидрогеназа (150 кДа) – дорожка 1, БСА (67 кДа) – дорожка 2, бета-амилаза (200 кДа) – дорожка 3, сшитый эндогенный двойной тример PCNA человека – дорожка 4, хроматографически очищенный рекомбинантный PCNA человека – дорожка 5. Дорожки 1–3 были окрашены Кумасси R350, дорожки 4,5 – иммуноокрашены антителами к PCNA, PC10 (Вестерн-блот). DT - указывает положение двойного тримера PCNA. Опубликовано с разрешения редакции журнала Biochem Cell Biol. обработке формальдегидом очищенного PCNA. Высокой степени чистоты PCNA был получен с использованием хроматографических очисток на Sephacryl S200, 90 UnoQ, и Superdex 200 10/300 GL, как описано в Материалах и Методах (Рис.31D). Cшивка нативного PCNA 1.0%-ным формальдегидом уже через 15 мин ведет к образованию тримеров и двойных тримеров (Рис.32B, дорожка 4). Массспектрометрический анализ дал возможность более точно определить молекулярную массу всех комплексов PCNA, которая для мономера, димера, тримера и двойного тримера равна, соответственно, 29.3, 58.6, 87.4 и 174.9 кДа (Naryzhny, Desouza et al. 2006). Исходя из того, что молекулярный вес мономера PCNA человека равен 28768, полученные данные очень близко согласовываются с теоретическими расчетами. Здесь необходимо отметить, что в отличие от результатов, полученных масс спектрометрией, размеры двойного тримера PCNA, определенные с помощью нативного электрофореза и гель фильтрации, не отличаются большой точностью (Рис. 31, 32). Более того, они даже вводят в заблуждение, так как дают очень заниженные величины (около 150 кДа). Связано это с тем, что реально разделение белков в этих методах происходит на основании не длины макромолекул, которая пропорциональна их массе, а максимального размера (так называемый радиус Стокса) нативно структурированного комплекса. Парадоксально то, что но в случае кольца PCNA этот размер практически одинаков у тримера и двойного тримера. Одинарное кольцо (тример) имеет размеры 80Å на 30 Å, а двойное (двойной тример) – 80 Å на ~60 Å. То есть поведение при гельфильтрации и нативном электрофорезе и того и другого кольца определяется одним и тем же размером в 80 Å. Что касается поведения в растворе, то в отличие от 91 A B C D E F kDa 250 160 DT T 105 D 75 50 35 30 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Рис. 33. Четвертичная структура PCNA не стабильна при хранении в буфере, содержащем глицерин. Образцы PCNA, полученные с использованием различных процедур, были проанализированы Вестерн-блотом без предварительной обработки (дорожки 1, 3, 5 и 7) или же после обработки 1.5%-ным формальдегидом (PBS, 20 мин при комнатной температуре, дорожки 2, 4, 6, 9, 11). (A) Клеточные экстракты бактерий (BL21DE3), трансформированных вектором pT7hPCNA. (B) Хроматографически очищенный PCNA (1 мкг). (C) Хроматографически очищенный PCNA после хранения в 50% глицерине с PBS при 4C. (D) Хроматографически очищенный PCNA был ресуспендирован в буфере для электрофореза с LDS и подвергнут электрофорезу без сшивок и без кипячения. В пять раз больше PCNA (5 мкг) было нанесено на эту дорожку по сравнению с другими дорожками (A–C). (Е,F) PCNA, очищенный с помощью денатурирующего электрофореза (SDS-PAGE), был ренатурирован (см. Материалы и Методы) путем последовательного диализа к нескольким буферам, причем в случае (F) последняя стадия (диализ к 50% глицерину в PBS) не проводилась. 92 нативного PCNA, PCNA, очищенный с помощью денатурирующего электрофореза (SDS-PAGE), образует двойные тримеры чрезвычайно неэффективно (Рис.33E и F). Более того, он образует много неспецифических конгломератов при сшивках (обратите внимание на размывы на Рис.33E). Кроме этого следует заметить, что в отличие от нативного PCNA, PCNA, полученный с помощью SDS-PAGE, дает 60 ДT 50 % 40 30 20 T 10 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH Рис. 34. Структура тримера и двойного тримера PCNA наиболее стабильна при pH 6.8. Для определения зависимости стабильности четвертичной структуры PCNA от рН, образцы хроматографически очищенного PCNA были ресуспендированы в 0.1 М PIPES буфере с разными pH, и затем обработаны 1.5%-ным формальдегидом (20 мин при комнатной температуре). Далее образцы были проанализированы Вестерн-блотом с использованием антител PC10. Каждая полоса, представляющая тример (T), или двойной тример (ДT) была количественно оценена с помощью денситометрии. Стабильность структур тримера или двойного тримера отражена в процентах оптической плотности (ось Y) соответствующей полосы к общей оптической плотности нанесенного белка. Опубликовано с разрешения редакции журнала Biochem Cell Biol. 93 большое количество димеров после ренатурации (Рис.33E, F). Это говорит о том, что PCNA очень сложно вернуться в нативную форму (двойной тример) после денатурации, особенно когда шапероны и другие дополнительные факторы отсутствуют при ренатурации. Это еще раз подтверждает, что нативная конформация очень важна для формирования двойного тримера PCNA. Стабильность трехмерных структур PCNA, очень сильно зависит от рН. Тример, как и двойной тример, наиболее стабилен при рН 6.8, но чрезвычайно нестабилен при рН ниже 5.5 или выше 8.5 (Рис.34). Причем рН-зависимость у двойного тримера выражена сильнее, чем у тримера, подтверждая предыдущие выводы о более прочном взаимодействии внутри тримера, чем между тримерами. Использование сшивки очищенного PCNA формальдегидом позволило более детально изучить стабильность двойного тримера PCNA. Как показано в Таблице. 2, PCNA, тример и двойной тример наиболее стабильны в фосфатном буфере (РВ, рН 7.2) независимо от добавления NaCl (до 1 М). Это указывает на то, что ионное взаимодействие между двумя тримерами не столь важно для стабильности двойного тримера. Также не имеют особого значения разные концентрации MgCl2 (1–10 мМ), АТФ (0.5-2.0 мМ) или даже Тритона Х100 (до 5.0%) (Табл. 2). Так как добавление EDTA (1-10 мМ) также не оказывает влияние на стабильность тримера или двойного тримера, следует, что ионы Mg вообще не нужны для стабильной четвертичной конформации PCNA. Формирование двойного тримера, но не тримера, понижается в 2 раза в 0.1М Трис буфере или в 0.2М мочевине. Возможно это связано просто с конкуренцией аминогрупп Триса или мочевины за взаимодействие с формальдегидом. Однако 50%-ная сахароза также понижает в 2 раза образование двойного тримера при 94 Состав буфера Фосфатный буфер (PB), pH 7.2 PBS PB +1M NaCl PB + MgCl2 (1-10 мM) PB + EDTA (1-10 мM) PB + ATP (0.5-2 мM) PB + DTT (10 мM) PB + Тритон X100 (1-5%) Лимонный буфер (pH 7.2), 0.1M Ацетатный буфер (pH 7), 0.1M HEPES Tris буфер, 0.1М Мочевина, 0.2 М SDS, 0.02% PB + глицерин (50%) PB (после осаждения сульфатом аммония) PB + PEG 6000 (10%) PIPES буфер Сахароза (50%) Количество детектируемого двойного тримера (DT) (PB - 100 %) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 50 50 0 20 0 Количество детектируемого тримера (T) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 60 30 50 100 60 50 100 100 Таблица 2. Стабильность четвертичной структуры PCNA в разных условиях. сшивках формальдегидом. Здесь можно предположить, что расстояние (не больше 2Å) между тримерами несколько меняется из-за присутствия молекул сахарозы, не давая возможности для сшивки формальдегидом. Очень важно отметить, что 0.02%ный SDS почти полностью дестабилизирует двойной тример, не влияя на тример (Табл.2). По аналогии с сахарозой, 50%-ный глицерин или 10%-ный PEG значительно понижают стабильность четвертичной структуры PCNA (Рис.33). Также негативно сказывается и наличие стадии осаждения сульфатом аммония при очистке PCNA (одна из наиболее популярных стадий при выделении белков!). Хотя механизмы дестабилизации структуры PCNA вышеуказанными факторами неизвестны, их следует учитывать при очистке PCNA и анализе его структуры. 95 6.2.1 Аминокислотные остатки Arg-5 и Lys-110 являются критическими для формирования двойного тримера Для дальнейшего изучения двойного тримера PCNA в клетках млекопитающих, был использован объединенный белок GFP-PCNA, который экспрессируется в CHO клетках, трансфецированных вектором pEGFPCNA (Leonhardt, Rahn et al. 2000). Ранее было показано, что GFP-часть такого белка не мешает формированию функционального тримера PCNA (Leonhardt, Rahn et al. 2000). В согласии с этими данными объединенный белок, GFP c PCNA человека, экспрессированный в CHO клетках, ведет себя аналогично эндогенному PCNA в экспериментах по сшивкам (Рис.35A и B). Аналогично предыдущим публикациям (Leonhardt, Rahn et al. 2000) объединенный белок GFP-PCNA и в нашем случае локализован в местах репликации (фокусах) (Рис.35C). Для дальнейшей характеризации GFP-PCNA был проведен 2DE с последующим иммуноокрашиванием анти-PCNA антителами PC10. Как было описано ранее, эндогенный PCNA детектируется в виде трех отчетливых изоформ (Рис.35D, где M, A и B являются соответственно мажорной (pI 4.57), “кислой” (pI 4.52), и “щелочной” (pI 4.62) изоформами). Объединенный GFP-PCNA белок также содержит три четкие изоформы (Рис.35D, обозначенные как M*, A*, и B*), которые практически идентичны трем эндогенным изоформам за исключением молекулярной массы (~66 кДа) и изоточек (pI, соответственно, 5.0, 4.95, и 5.05). Этот сдвиг по массе и заряду объясняется вкладом GFP. Как ожидается, 30минутная сшивка клеточных экстрактов формальдегидом приводит к 96 Рис. 35. Эктопически экспрессированный в клетках млекопитающих GFPPCNA ведет себя аналогично эндогенному PCNA. (A) Клеточные экстракты CHO клеток, трансфецированные GFP-PCNA, были проанализированы в SDS-PAGE с последующим иммуноокрашиванием анти-GFP антителами. (B) 2DE сшитого клеточного экстракта с последующим иммуноокрашиванием антителами к PCNA. M – мономер, T – тример, D – двойной тример , * – GFP-PCNA комплексы (относительное количество эндогенного PCNA намного ниже, чем GFP-PCNA в данном эксперименте). (C) CHO клетки со стабильной экспрессией GFP-PCNA (CHO S-линия) под флуоресцентным микроскопом Zeiss Axiovert 100 (увеличение x315). Обратите внимание на локализацию GFP-PCNA в репликативных фокусах. Опубликовано с разрешения редакции журнала J. Biol.Chem. 97 детектированию тримеров и двойных тримеров эндогенного PCNA (Рис.35E, T и DT, соответственно). Подобным же образом GFP-PCNA также формирует тримеры и двойные тримеры (Рис.35E, T* и DT*, соответственно). В полном согласии с данными, показанными на Рис.31A, мономеры и комплексы имеют одинаковые pI (Рис.35E), опять же указывая на то, что другие белки не участвуют в формировании тримеров и двойных тримеров объединенным белком GFP-PCNA. Для картирования точных точек контактов между тримерами внутри двойного тримера был проведен анализ формирования комплексов с помощью внесения мутаций на поверхности PCNA. Для этого было получено несколько векторов pEGFPCNA, несущих точечные и делеционные мутации в определенных местах PCNA. Как анти-GFP, так и анти-PCNA (PC10) антитела были использованы при иммуноокраске для того, чтобы отличить мутантные GFP-PCNA белки от эндогенных PCNA. Следующие мутации никак не влияли на образование, как тримеров, так и двойных тримеров: K13A, K14A, K254A (Рис.36A), K20A, K80A, K117A, K191A, K240A, и K248A. Следует заметить, что Lys-13 и Lys-20 находятся внутри тримерного кольца PCNA, в то время как Lys-117 и Lys-254 – на его передней поверхности. Все остальное сайты мутации находятся на обратной стороне тримера PCNA. Дальнейший мутационный анализ идентифицировал Arg-5 и Lys-110 как два критических аминокислотных остатка, участвующих в формировании стабильного двойного тримера при сшивках формальдегидом (Рис.36A, дорожки 8 и 10). 98 Рис. 36. Arg-5 и Lys-110 являются точками контакта между тримерами в дуплете PCNA. (A) Образцы, полученные из клеток CHO, трансфецированных нормальным (WT) или мутантным вектором pGFPCNA (на верхней панели), были проанализированы SDS-PAGE с последующим иммуноокрашиванием анти-GFP антителами (показано) или PC10 (не показано). Показаны лизаты без сшивок (дорожки 1, 3, 5, 7, 9, и 11) или с 30мин сшивками (дорожки 2, 4, 6, 8, 10, и 12). Обратите внимание, что R5A (дорожка 8), K110A (дорожка 10), и R5A/K110A двойные мутанты (не показано) способны формировать триммер, но не двойной тример. DT* и T* обозначают, соответственно, двойной тример и тример GFPPCNA. Короткие синтетические пептиды, соответствующие аминокислотным последовательностям в области Arg-5 и Lys-110, ингибируют формирование двойного тримера, в то время как пептиды, соответствующие передней части тримера PCNA - нет. Гипотонические экстракты клеток CHO инкубировались с пептидами в разных концентрациях в течение 10 мин на льду перед сшивками. Пептид 1, 251LAPKIEDEEG260 (передняя часть); пептид 2, 1MFEARLVQGSIL12 (область Arg-5); пептид 3, 104EAPNQEKV111 (область Lys-110). Финальная концентрация каждого пептида была 0.1 мг/мл (дорожки 3, 6, и 9), 0.3 мг/мл (дорожки 4, 7, и 10), или 1.0 мг/мл (дорожки 5, 8, и 11). Опубликовано с разрешения редакции журнала J. Biol.Chem. 99 Далее была проанализирована возможность синтетических пептидов ингибировать образование двойного тримера. Как видно на Рис.36В, синтетические пептиды, представляющие участки (1MFEARLVQGSIL12) PCNA, или расположенные Lys-110 в районе (104EAPNQEKV111), Arg-5 ингибируют формирование двойного тримера, в то время как пептид (251LAPKIEDEEG260), соответствующий аминокислотной последовательности в С-конце (локализована в передней части тримера), - нет. Кроме того, ни один из этих пептидов не ингибировал полученными формирование путем тримера мутационного (Рис.36B). анализа В согласии (Рис.36A), эти с данными, результаты подтверждают, что остатки Arg-5 и Lys-110 являются существенными точками контакта между тримерами в двойном тримере PCNA. В дополнение интересно отметить, что ингибирование образования двойного тримера вышеуказанными пептидами было эффективно только в гипотоническом буфере, содержащем 15 мМ NaCl (Рис.36B), и не было эффективным в клеточных экстрактах, содержащих 150 мМ NaCl. Это говорит о том, что PCNA существует в виде двойного тримера, который хотя и динамичен, но все же не может быть легко разрушен при физиологических солевых условиях синтетическими пептидами. 6.2.2. Образование двойного тримерного комплекса PCNA существенно для деления и выживаемости клеток млекопитающих Чтобы взглянуть на последствия нарушения формирования двойного тримера в клетках млекопитающих, CHO клетки были трансфецированы векторами, 100 кодирующими дикий тип или же PCNA с двойной мутацией R5A/K110A (следует напомнить, что аминокислотные последовательности PCNA у человека и хомячка отличаются только по 3 аминокислотам). Оказалось, что ~5 и 35% клеток, трансфецированных, соответственно, диким или мутантным вектором проявляют так называемый округлый фенотип через 24 часа после трансфекции (Рис.37A и B). Через 48 часов их содержание уже, соответственно, 10 и 70%. Анализ с помощью проточного цитофлюориметра показал, что округлые клетки в случае трансфекции мутантным вектором находятся в фазе G0/G1 и умирают через несколько дней. Однако большинство округлых клеток, наблюдаемых при трансфекции нормальным вектором, являются обычными митотическими клетками и не умирают при дальнейшем культивировании. Конструкции с одиночными мутациями R5A или K110A показали такой же эффект, как и двойные мутанты, R5A/K110A (Рис.21). Эти данные в совокупности с данными, представленными на Рис.34 указывают на то, что Arg-5 и Lys-110 являются существенными аминокислотными остатками для формирования двойного тримера PCNA, что в свою очередь очень важно для клеточного роста и выживаемости. 101 Рис. 37. Двойной тример PCNA, но не отдельный тример, может одновременно связаться с CAF-1 и ДНК полимеразой дельта. Клетки CHO были трансфецированы нормальным вектором PCNA, pEGFPCNAL2 (A) или его R5A/K110A мутантом (B). Фото сделано через 24 часа после трансфекции с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Axiovert 100. (C) Комплексы PCNA из экстрактов клеток, трансфецированных нормальным вектором, и иммуноосажденные антителами PC10 были вторично иммуноосаждены (IP) антителами к ДНК полимеразе дельта. Иммунопреципитат был проанализирован Вестерн-блотом. Иммуноокрашивание (без снятия антител) одной и той же мембраны было проведено в последующем порядке: анти-CAF-1 (p150 субъединица) антитела (дорожка 1), анти-полимераза дельта (p125 субъединица) антитела (дорожка 2), PC10 (дорожка 3) антитела. Образец на дорожке 4 был иммуноокрашен только вторичными антителами. (D–F) Белковые экстракты из клеток CHO, трансфецированных нормальным вектором (дорожки 1, 3, 5, 7, 9, и 11) или мутантом R5A/K110A (дорожки 2, 4, 6, 8, 10, и 12) были сразу проанализированы Вестерн-блотом (дорожки 1, 2, 5, 6, 9, и 10) или подвергнуты иммунопреципитации с использованием анти-CAF-1 (p150 субъединица) антител (дорожки 3, 4, 7, 8, 11, и 12). (D–F) Образцы, иммуноокрашенные анти-CAF-1 (p150 субъединица) антителами, антителами к ДНК полимеразе дельта (p125 субъединица), или антителами PC10. PCNA, эндогенный PCNA. GFP-PCNA, эктопически экспрессированный GFP-PCNA (нормальный или мутантный). Опубликовано с разрешения редакции журнала J. Biol.Chem. 102 6.2.3. Только двойной, но не одиночный, тример может одновременно взаимодействовать с ДНК полимеразой дельта и CAF-1 Передняя часть PCNA тримера может взаимодействовать со многими белками, включая ДНК полимеразу дельта и CAF-1 (Jonsson and Hubscher 1997; Loor, Zhang et al. 1997; Warbrick 2000; Paunesku, Mittal et al. 2001; Ohta, Shiomi et al. 2002). Ранее предполагалось, что обратная сторона могла бы участвовать в регуляции различных функций PCNA через взаимодействие с другими регуляторными белками (Fukuda, Morioka et al. 1995). Однако на сегодняшний день нет никаких доказательств того, что какие-то белки связываются с тримером PCNA через его обратную сторону. Модель двойного тримера “спина-к-спине” объясняет, почему белки не взаимодействуют с обратной стороной тримера PCNA. Более того, наличие двух передних сторон в одном двойном тримере PCNA позволяет ему одновременно связываться с двумя разными белками и “координировать” различные функции, такие как репликацию ДНК, репарацию ДНК и контроль клеточного цикла (Naryzhny, Zhao et al. 2005). Чтобы проверить возможность PCNA одновременно связывать ДНК полимеразу дельта и CAF-1, автор данной монографии использовал иммуноосаждение хроматина (ChIP-assay). Согласно этому анализу PCNA, CAF-1 и ДНК полимераза дельта связываются с хроматином недалеко друг от друга. Чтобы определить, действительно ли ДНК полимераза дельта и CAF-1 могут одновременно взаимодействовать с PCNA, клеточный экстракт клеток, экспрессирующих GFPPCNA, был обработан ДНКазой 1 и подвергнут имуноосаждению антителами РС10, пришитыми к агарозным шарикам. Затем иммуноосажденные вместе с PCNA белки 103 были диссоциированы с этих шариков и подвергнуты вторичному иммуноосаждению с использованием антител к ДНК полимеразе дельта. Конечный преципитат, представляющий собой комплекс PCNA с ДНК полимеразой дельта, был проанализирован с помощью SDS-PAGE и последующего иммуноокрашивания антителами анти-CAF-1 (Рис.37C, дорожка 1), анти-ДНК полимераза дельта (дорожка 2), и анти-PCNA, PC10 (дорожка 3). Полученные результаты говорят, что PCNA – ДНК полимеразный комплекс содержит также и CAF-1 (Рис.37C, дорожка 3), подтверждая то, что ДНК полимераза дельта и CAF-1 могут одновременно взаимодействовать с PCNA. Чтобы усилить доказательства наличия такого взаимодействия, мы сравнили связывание в случае нормального и мутантного PCNA. CAF-1 комплексы были осаждены с помощью моноклональных антител к p150 субъединице CAF-1 и с использованием клеток, трансфецированных нормальным или мутантным (R5A/K110A) вектором. Затем эти комплексы были проанализированы Вестерн-блотом, используя антитела против ДНК полимеразы дельта (р125 субъединица), CAF-1 (p150 субъединица) или PCNA (PC10). Идентичность детектируемых полос была подтверждена сравнением иммуноокрашивания полных клеточных экстрактов (Рис.37, D–F, дорожки 1, 2, 5, 6, 9, 10) и иммунопреципитатов (дорожки 3, 4, 7, 8, 11, 12). Как ожидалось, субъединица CAF-1, р150, присутствует в общем клеточном экстракте и иммунопреципитате, полученном из клеток, трансфецированных нормальным или мутантным по PCNA вектором (Рис.37D, дорожки 1–4). Существенно то, что комплекс CAF-1, иммуноосажденный из клеток трансфецированных нормальным PCNA, также содержит ДНК полимеразу дельта (Рис.37E, дорожка 7). И наоборот, 104 комплекс CAF-1, иммуноосажденный из клеток, трансфецированных R5A/K110A мутантным вектором, не содержит ДНК полимеразу дельта (Рис. 37E, дорожка 8), хотя и нормальный PCNA и R5A/K110A мутант, очевидно, имеют одинаковое сродство к CAF-1 (Рис.37F, дорожки 11и 12). Таким образом, следует, что тример PCNA может связываться с ДНК полимеразой дельта или с CAF-1, но не с обоими одновременно. Так как нормальный PCNA может образовывать комплекс “спина к спине” из двух тримеров, он одновременно может связаться с ДНК полимеразой дельта и CAF-1. Однако мутант R5A/K110A, по-видимому, такого комплекса образовать не может и соответственно не может одновременно связать ДНК полимеразу дельта и CAF-1. Этот набор данных вместе с данными, приведенными на Рис.37C подтверждает, что нормальный PCNA, но не мутант R5A/K110A, образовывает двойной тример PCNA. Важно заметить, что хотя тример PCNA содержит 3 идентичных сайта для PCNA-связывающихся белков, взаимодействие каждого конкретного белка (комплекса) происходит на конкурентной основе за счет других взаимодействующих с PCNA белков (Fukuda, Morioka et al. 1995; Chuang, Ian et al. 1997; Moggs, Grandi et al. 2000; Matsumiya, Ishino et al. 2002). По-видимому, это происходит потому, что один белок (комплекс) при взаимодействии оккупирует большую часть передней поверхности тримера PCNA, как например, хорошо видно в случае с ДНК лигазой 1 (Pascal, O'Brien et al. 2004). ДНК полимераза дельта и CAF-1 образуют достаточно большие комплексы и состоят из, соответственно, четырех (p125, p60, p50, и p12) и трех субъединиц (p150, p60, и p48). Таким образом, следует вывод, что один тример PCNA не может физически взаимодействовать одновременно и с ДНК полимеразой дельта и с CAF-1. 105 6.2.4. Функциональная модель PCNA млекопитающих Петля ßD2ßE2 образовывает структуру, напоминающую ручку, которая выступает на поверхности обратной стороны тримера PCNA (Krishna, Kong et al. 1994). Формальдегид является гомобифункциональным сшивающим амины агентом, требующим, чтобы расстояние между сшиваемыми аминокислотами было не больше, чем 2Å (Orlando 2000). Поэтому для того, чтобы обеспечить тесный контакт Arg-5 на одном тримере с Lys-110 на другом, петля ßD2ßE2 должна найти углубление на другом тримере PCNA. Таким образом, достаточно близкий контакт между Arg-5 и Lys-110 должен достигаться через замыкание двух тримеров PCNA посредством петель и ложбин. В согласии с этой идеей топологический анализ с использованием программы Hex 4.2 показал, что стыковка двух тримеров может произойти если два тримера, расположенных симметрично напротив друг друга, немного повернуть так, что петля ßD2ßE2 (Fig.38B, L) одного тримера попадает в ложбину другого тримера, образованную вокруг ßA1 (аминокислоты 9–20, GSILKKVLEALK), ßB2 (аминокислоты 209–211, LRYLNFFTKATPL), ßH2 (аминокислоты 235–241, LVVEYKI), и ßI2 (254GHLKYYL). (Fig. 38B, *). При этом Arg-5 одного тримера и Lys-110 другого тримера оказываются достаточно близко друг к другу для того, чтобы быть сшитыми формальдегидом. В свое время Хендерсон и соавторы (Henderson et al), изучая PCNA в модельной системе Drosophila melanogaster, предположили, что результаты их генетических экспериментов могут быть объяснены, если предположить, что два тримера PCNA образуют комплекс “спина-к-спине” (Henderson, Wiegand et al. 2000). Наши данные, основанные на химических сшивках и мутагенезе, подтвердили, что PCNA в 106 Рис. 38. Близкий контакт между Arg-5 (R5) и Lys-110 (K110) обеспечивается через замок петли ßD2ßE2 одного тримера в канавке, образованной ßA1, ßB2, ßH2, и ßI2 другого тримера. (A) Вид спереди и сзади тримеров PCNA был получен с помощью программ RasMol и Swiss-PDB Viewer, и файла 1AXC.pdb из банка белковых структур PDB (Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Затем тримеры PCNA были показаны в положении “спина к спине”, используя PhotoEditor и PowerPoint, чтобы показать точки контакта сбоку (нижняя часть A). Для простоты показаны только две из 6 контактных точек. (B) Контактное положение показано с использованием slab mode программы RasMol Version 2.7.2.1. L и * являются, соответственно, петлей ßD2ßE2 и канавкой вокруг ßA1, ßB2, ßH2, и ßI2 (Krishna, Kong et al. 1994). клетках млекопитающих находится в виде двойного тримера, и аминокислоты Arg5 и Lys110 играют ключевую роль в его формировании и детектировании (Naryzhny, Zhao et al. 2005; Naryzhny, Desouza et al. 2006). Более того, модель структуры двойного тримера PCNA “спина к спине” дает основание предполагать, что многие клеточные функции, такие как эпигенетический контроль, ДНК метилирование и ДНК репарация тесно связаны с ДНК репликацией через дуплетный комплекс 107 PCNA (Naryzhny 2007). Однако до сих пор еще не все понятно с присутствием двойного тримера PCNA в репликативной вилке. Основной вопрос вызывает посадка PCNA на 3‟ конец ДНК репликативным фактором RFC (Majka and Burgers 2004). Так как кристаллическая структура RFC вместе с PCNA тримером (но не двойным тримером) была определена (Bowman, O'Donnell et al. 2004), это означает, что все посаженные на ДНК тримеры должны быть в одной пространственной ориентации (Ellison and Stillman 2001; Majka and Burgers 2004). Объяснить эту ситуацию могло бы то, если бы было показано, что RFC способен раскрывать кольцо двойного тримера PCNA и загружать его на ДНК. Таким образом, практически все молекулы PCNA в клетке млекопитающих могут быть химически сшиты формальдегидом и обнаружены в виде двойного тримера (Naryzhny, Zhao et al. 2005; Naryzhny, Desouza et al. 2006). Интересно то, что химическая сшивка PCNA формальдегидом не ведет к образованию двойного тримера в дрожжах (неопубликованное наблюдение автора монографии), хотя дрожжевой PCNA содержит ту же пару Arg и Lys в 5 и 110 позиции (только в обратной комбинации, Lys5 и Arg110), и общий вид структуры PCNA в дрожжах и человеке практически одинаков. Причина может быть чисто техническая, например расстояние между этими остатками в дрожжах может быть немного больше, чем позволяет сшить формальдегид. Другое объяснение может быть в том, что организация PCNA в виде двумерного тримера является свойством только высших эукариот, где требуется более усложненная сеть взаимодействий с PCNA. В заключение следует заметить, что структура двойного кольца не является особым свойством PCNA. Многие прокариотические и эукариотические белки 108 имеют схожую структуру. Среди них можно отметить глютамин синтетазу (Yamashita, Almassy et al. 1989), АТФ-сульфуралазу (Ullrich, Blaesse et al. 2001), комплекс MCM (Costa, Pape et al. 2006), хеликазу большой Т-антиген SW40 (Li, Zhao et al. 2003), мейоз-специфическую ДНК рекомбиназу (Dmc1, гомолог RecA/Rad51) (Kinebuchi, Kagawa et al. 2004), шаперонины GroEL (Rye, Burston et al. 1997), Сpn60 (Ferrer, Lunsdorf et al. 2004), а также протеазу Clp (Gribun, Kimber et al. 2005). Интересно то, что многие из этих белков не имеют никаких функций, требующих взаимодействия с ДНК. Основные выводы (1) Первичная структура PCNA очень консервативна и отличается у разных видов высших эукариот только по нескольким аминокислотам. Эта разница в отношении низших эукариотов (дрожжи) гораздо выше (40%), однако третичные структуры PCNA из высших и низших эукариотов почти идентичны. (2) Наиболее хорошо изученной третичной структурой PCNA является структура кольца, имеющего явно выраженную лицевую и обратную стороны. Причем взаимодействие PCNA с белками-партнерами обеспечивается через гидрофобную ложбину на лицевой стороне, образованную двумя петлями и С-концом. Кольцо может также охватывать и скользить по двунитевой ДНК, взаимодействуя с ней своим положительным зарядом, размещенным на внутренней окружности тримера. (3) Четвертичная структура PCNA имеет вид двойного кольца, в котором кольца (тримеры) взаимодействуют обратными сторонами. Таким образом, лицевые стороны остаются открытыми для взаимодействия с другими белками (Рис.39). 109 Рис. 39. Разные уровни организации PCNA. (A) Аминокислотная последовательность PCNA человека. Петля, соединяющая внутренние домены, IDCL (118LMDLDVEQLGIPEQEYSC135), центральная петля, CL (41DSSH44), Cконец, C (254KIEDEEGS261) показаны красным цветом; петля обратной стороны, BL (184QTSNVDKEEEAV195), показана розовым цветом. (B) Трехмерная структурная модель мономера PCNA (показана цепь E из файла 1AXC, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). IDCL, CL, C показаны красным; BL розовым. Спиральные области (αA1, αB1, αA2, αB2) розовые и бета структуры (ßA1, ßB1, ßC1, ßD1, ßE1, ßF1, ßG1, ßH1, ßI1, ßA2, ßB2, ßC2, ßD2, ßE2, ßF2, ßG2, ßH2, ßI2) желтые. (C) Организация тримера PCNA (1XC) показана спереди. (D) Вид сбоку. (E) Модель двойного тримера PCNA (Naryzhny 2007). IDCL, CL, C показаны красным; BL - розовым. (4) Структура PCNA очень динамична и чувствительна к различным факторам, применяемым при выделении этого белка. В частности, негативно сказывается использование осаждения сульфатом аммония и высоких концентраций глицерина. 110 (5) Двойной тример PCNA с симметричной структурой является практически идеальной двухсторонней платформой, которая может скользить по ДНК и взаимодействовать одновременно с разными белками, координируя разные процессы, происходящие на ДНК. (6) Структуру двойного кольца имеют многие белки, причем некоторые из них функционируют и без взаимодействия с ДНК. Глава 7. Взаимодействия PCNA Взаимодействие с различными белками-партнерами является важным и основным механизмом различных клеточных функций PCNA. Можно предположить, что клетки млекопитающих используют PCNA для более разнообразных клеточных функций, чем одноклеточные организмы из-за гораздо более сложной клеточной организации. В подтверждение этому поиск по литературным источникам и базам данных приводит к длинному списку белков, взаимодействующих с PCNA. Этот список включает в себя белки репликации ДНК, репарации ДНК, контроля клеточного цикла, ремоделирования хроматина, эпигенеза, когезии хроматид, транскрипции и других разнообразных функций (Tsurimoto 1999; Naryzhny 2008). То есть, определенно вырисовывается роль PCNA как хаб-белка, причем обладающего свойствами как хаба вечеринок (party hub), так и хаба свиданий (date hub). Имеющиеся базы данных белковых взаимодействий позволяют представить графическую картину многочисленных взаимодействий PCNA. В частности, на Рис.40 показана одна из таких диаграмм, генерированная программой STRING 8 (Jensen, Kuhn et al. 2009). 111 Рис. 40. Сеть взаимодействий PCNA человека (получено на веб-сайте http://string.embl.de//) 112 7.1. Структурные аспекты взаимодействий PCNA PCNA может взаимодействовать с белками партнерами посредством гидрофобной выемки на лицевой стороне, образованной центральной петлей (CL, 41DSSH44), Cконцом (CT, 254KIE257) и междоменной петлей (IDCL, 118LMDLDVEQLGIPEQEYSC135). Предполагается, что связывание идет на конкурентной основе, хотя в принципе каждый тример PCNA содержит три идентичных сайта для связывания (Naryzhny, Zhao et al. 2005). Большинство взаимодействующих с PCNA белков содержат единообразный мотив, называемый PIP-бокс, последовательность типа QXX(L/M/I)XX(F/Y)(F/Y), указывая на то, что эти белки связываются с одним и тем же местом на PCNA (Табл.3) Пептид с PIPбоксом закручен в специфическую спираль типа 310 (отличную от альфа спирали или бета листа) и действует как гидрофобная затычка, вставляемая в гидрофобный карман, образованный IDCL, CL и CT (Fig. 36) (Gulbis, Kelman et al. 1996). Не все взаимодействующие с PCNA белки имеют канонический PIP-бокс. Взаимодействие с PCNA может происходить и через PIP-похожую последовательность типа QLXLF, которая есть у хроматинового фактора CAF-1 (chromatin assembly factor), ДНК полимеразы бета или p50 субъединицы ДНК полимеразы дельта (Dalrymple, Kongsuwan et al. 2001). Присутствие еще более короткой последовательности, называемой KA мотивом, как было показано, также может обеспечивать взаимодействие PCNA с различными белками (Xu, Zhang et al. 2001). Более того, некоторые белки взаимодействуют с PCNA даже без наличия какого либо из этих мотивов (Hasan and Hottiger 2002; Milutinovic, Zhuang et al. 2002; Prosperi 2006). Но скорее всего и в этих белках будут обнаружены еще какие-то другие 113 аминокислотные последовательности, способные образовывать гидрофобную затычку типа спирали 310 Так недавно было показано существование совсем нового мотива, ответственного за взаимодействие с PCNA - [KR]-[FYW]-[LIVA]-[LIVA][KR] (Gilljam, Feyzi et al. 2009). Так как авторы цитируемой работы впервые обнаружили этот мотив у деметилазы hABH2 (human AlkB homologue 2), то назвали его APIM (AlkB homologue 2 PCNA-interacting motif). Авторы доказали функциональность данного мотива, показав, что его отсутствие необходимо для взаимодействия hABH2 с PCNA. Более того, всего лишь короткий пептид из 10 аминокислот, содержащий APIM и пришитый к YFP, способен связываться с PCNA и влиять на клеточные функции (Gilljam, Feyzi et al. 2009). Поиск по базам данных выявил наличие, как минимум 226 белков, имеющих APIM, причем некоторые из них, такие как ДНК-лигаза I или топоизомераза II α, имеют также и PIP-бокс (Gilljam, Feyzi et al. 2009). Хотя и есть вероятность, что некоторые белки связываются с PCNA в каком-то ином месте, а не в гидрофобной выемке на его лицевой стороне, до сего времени известен только один такой случай, где было показано, что N-конец, представленный альфа-спиралью внутри PCNA, образует сайт связывания для циклина D (Matsuoka, Yamaguchi et al. 1994; Maga and Hubscher 2003). Ингибитор циклин-зависимой киназы или p21 (CDN1A_HUMAN) взаимодействует с PCNA сильнее остальных белков в соответствии со своей ролью “тормоза“, блокирующего доступ ДНК полимеразы дельта к PCNA (Gartel, Serfas et al. 1996; Maga and Hubscher 2003). Имея к PCNA самые высокие аффинные свойства, p21 может также конкурировать с репликативным фактором С (RFC) и ингибировать погрузку PCNA на ДНК in vitro. Удивительно то, что при низком SwissProt/TrE MBL UniProt обозначение Название Последовательнос ть P38936 CDN1A_HUMAN QTSMTDFY P28715 ERCC5_HUMAN P26358 DNMT1_HUMAN Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 (p21) DNA repair protein complementing XP-G cells, (ERCC-5) DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1, (Dnmt1) MCMT P06746 Q9H211 Q07864 DPOLB_HUMAN DNA polymerase beta CDT1_HUMAN DPOE1_HUMAN Q9Y253 POLH_HUMAN CDT1 protein DNA polymerase epsilon catalytic subunit A DNA polymerase eta B7Z780 B7Z780_HUMAN P39748 O14757 FEN1_HUMAN CHK1_HUMAN Q9BSL1 UBAC1_HUMAN P02545 LMNA_HUMAN P12887 P20585 UNG_YEAST MSH3_HUMAN P52701 MSH6_HUMAN P35251 RFC1_HUMAN P18858 DNL1_HUMAN O42130 Q02880 TOP2A_CHICK Q14191 WRN_HUMAN P09874 PARP1_HUMAN Q5FWF5 ESCO1_HUMAN Q5TBB1 pI / Mw 8.69 / 18119 114 QLRIDSFF 5.13 / 133108 QTTITSHF 7.99 / 183165 QRIGLKYF QRRVTDFF VTYNGDFF 9.01 / 38177 9.08 / 45568 5.98 / 261518 Q-TLESFF 8.74 / 78413 cDNA FLJ61612, highly similar to DNA polymerase iota Flap endonuclease 1, (FEN1) Serine/threonine-protein kinase Chk1 E3 ubiquitin-protein ligase subunit KPC2 Lamin-A/C70 kDa lamin Renal carcinoma antigen NY-REN-32 Uracil-DNA glycosylase, UNG DNA mismatch repair protein Msh3, MSH3 KKGLIDYY 5.58 / 74386 QGRLDDFF VKRMTRFF 8.80 / 42593 8.50 / 54419 QTNMRDFQ 4.82 / 45338 QSRIRIDS 6.57 / 74139 QTTIEDFF QAVLSRFF 8.30 / 127440 DNA mismatch repair protein MSH6 / MutS-alpha 160 kDa subunit / G/T mismatch-binding protein / GTBP / GTMBP / p160 Replication factor C subunit 1, Activator 1 subunit 1, RF-C 140 kDa subunit, Rfc1 DNA ligase 1 / Polydeoxyribonucleotide synthase [ATP] 1 QSTLYSFF 6.50 / 152786 MDIRKFF 9.38 / 128255 QVCLYAFD 5.49 / 101736 DNA topoisomerase 2-alpha DNA topoisomerase 2-beta QDILKEFF QDILKEFF 8.90 / 175000 8.82 / 174385 Werner syndrome ATP-dependent helicase Poly [ADP-ribose] polymerase 1 / PARP1 / ADPRT / NAD(+) ADPribosyltransferase 1 / Poly[ADP-ribose] synthetase 1 N-acetyltransferase ECO1 / Establishment of cohesion protein 1 / Chromosome transmission fidelity protein 7 QWKLLRDF QIILSHFE QDLIKMIF 5.96 / 162495 QAPLMCYS 9.27 / 94982 RNH2B_HUMAN Ribonuclease H2 subunit B KSIDTFF 9.19 / 35138 Q00987 MDM2_HUMAN QMIVLTYF 4.60 / 55232 Q99741 CDC6_HUMAN E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2, p53-binding protein Mdm2, Oncoprotein Mdm2 Cell division control protein 6 homolog CDC6-related protein QDVLYTLF 9.64 / 62720 TOP2B_HUMAN 8.99 / 112953 Таблица 3. Белки, взаимодействующие с PCNA и имеющие PIP-бокс QXX(L/M/I)XX(F/Y)(F/Y), где X – любая аминокислота. SwissProt/TrEM BL UniProt обозначение Q13415 ORC1_HUMAN O43929 ORC4_HUMAN Q7L014 DDX46_HUMAN P08107 Q07817 HSP71_HUMAN B2CL1_HUMAN P36776 LONM_HUMAN P16870 Q93100 CBPE_HUMAN KPBB_HUMAN Q16566 KCC4_HUMAN P26045 PTN3_HUMAN P52209 6PGD_HUMAN Q08499 PDE4D_HUMAN P0C869 PA24B_HUMAN P47928 ID4_HUMAN Q9Y5R6 DMRT1_HUMAN P36955 PEDF_HUMAN Q99965 ADAM2_HUMAN Q92752 TENR_HUMAN O75923 DYSF_HUMAN P78509 RELN_HUMAN Q9UKL4 CXD2_HUMAN Q8NB66 UN13C_HUMAN P51787 KCNQ1_HUMAN Q96PR1 KCNC2_HUMAN O75694 NU155_HUMAN Q00325 MPCP_HUMAN Q9UGQ3 GTR6_HUMAN Q14916 NPT1_HUMAN P54368 OAZ1_HUMAN Q96PK2 MACF4_HUMAN Название Последовательность консенсус QXX(L/M/I)XX(F/Y)(F/Y 115 ) QDIMYNLF 9.34 / 97349 origin recognition complex, subunit 1 (Orc1) origin recognition complex, subunit 4 (Orc4) Probable ATP-dependent RNA helicase DDX46, DEAD box protein 46 Heat shock protein 70Ab Bcl-2-like protein 1 (Bcl2-L-1) Apoptosis regulator Bcl-X Mitochondrial ATP-dependent protease Lon (LONP) Carboxypeptidase E Phosphorylase b kinase regulatory subunit beta Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV Protein-tyrosine phosphatase H1 (PTP-H1) 6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating (PGD) cAMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase 4D, (DPDE3) Cytosolic phospholipase A2 beta (cPLA2-beta) DNA-binding protein inhibitor ID-4 negative regulation of transcription Doublesex- and mab-3-related transcription factor 1 ( DMRT1) Pigment epithelium-derived factor (PEDF), Serpin-F1 Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 2 (ADAM 2) Fertilin subunit beta Tenascin-R (TN-R) pI / Mw QTLLYNLF 6.80 / 51222 QTALTGYQ 9.33 / 117362 QKLLQDFF 5.48 / 70052 4.86 / 26049 WGRIVAFF QGKILCFY LESFSERK QDDMTSFY RDALSDFF QQLLDDFH 6.01 / 106489 5.03 / 53150 6.50 / 124884 5.60 / 51925 LDDFFK 6.58 / 103989 6.80 / 53140 DRIMEEFF 5.31 / 91115 AGRIAEFF 5.64 / 88065 QCDMNDCY 8.69 / 16622 QGRAGGFG 7.54 / 39473 KTSLEDFY 5.97 / 46342 QPRLDPFF 5.77 / 82457 QNGQTDFF 4.71 / 149548 5.44 / 237295 5.55 / 388416 8.95 / 36092 Dysferlin, Dystrophy-associated fer-1like protein Reelin Extracellular matrix serine protease Gap junction delta-2 protein,Connexin-36 Protein unc-13 homolog C, Munc133 vesicle maturation during exocytosis Potassium voltage-gated channel subfamily KQT member 1 Potassium voltage-gated channel subfamily C member 2 Voltage-gated potassium channel Kv3.2 nucleoporin 155kD (NUP155) QIRIKLWFGLS Phosphate carrier protein, mitochondrial hosphate transport protein Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 6, Glucose transporter type 6 or 9 Sodium-dependent phosphate transport protein 1 Ornithine decarboxylase antizyme Microtubule-actin cross-linking factor 1, isoform 4 QHGLRHFY QEGISRFY QEGMTALY (Mouse) QGRVYNFL 5.64 / 250911 9.88 / 74698 QPRMWALF 8.24 / 70225 QLKITTFKI EEGLNAFY 5.78 / 155199 9.45 / 40094 QIESFF 8.90 / 54539 AGQLSDFF 8.89 / 51131 QLRADHVFI 7.12 / 25405 QDTLQAMF 5.20 / 670150 QEGTATLY 116 Таблица 4. Потенциальные PCNA–связывающие белки, аминокислотные последовательности, похожие на PIP-бокс. имеющие соотношении (примерно 1:1), p21 может даже стимулировать погрузку PCNA на ДНК, а ингибирование начинается только при очень высоком соотношении p21/PCNA (большем чем 10:1) (Podust, Podust et al. 1995). Можно предположить, что взаимодействие p21 с PCNA вначале частично дестабилизирует структуру PCNA, что помогает RFC открыть и загрузить PCNA на ДНК. При более высокой пропорции p21 блокирует все сайты связывания на PCNA и уже исключает взаимодействие RFC с PCNA. Поиск потенциальных партнеров PCNA, которые содержат PIP-бокс или схожие последовательности выявил большое количество потенциальных кандидатов (Табл.4) (Paunesku, Mittal et al. 2001). Причем многие взаимодействующие с PCNA белки принадлежат к группам белков, не связанных ни с репликацией ДНК, ни с репарацией ДНК, ни с хроматиновой организацией, поднимая вопрос о том, что действительно ли эти взаимодействия имеют место in vivo? Если же это все- таки происходит, то изучение данных взаимодействий может выявить новые аспекты роли PCNA, в частности, и функционирования белков в целом. 7.1.1. Репликация ДНК (Табл.5) Репликация ДНК млекопитающих является чрезвычайно сложным и многостадийным процессом. В клеточном цикле, который продолжается в среднем 24 часа, собственно на репликацию отведено до 10 часов (S-фаза), не говоря уже о том, что подготовка к ней начинается практически уже сразу после завершения 117 очередного деления (М-фаза) и продолжается в течение всей фазы G1. Множество участвующих в этом процессе белков поддерживает его чрезвычайную организованность, обеспечивая точное копирование всех хромосом, причем только один раз в течение клеточного цикла. Репликация начинается на специальных участках в хромосомах (ориджинах). Если в дрожжах S. cerevisiae эти участки кодируются специальными последовательностями ДНК (ARS), то в высших эукариотах (и даже дрожжах S. pombe) они, по-видимому, организуются специальными структурами хроматина и наследуются эпигенетически. Механизм репликации ДНК состоит из следующих стадий – узнавание ориджина, сборка пререпликативного комплекса, активация хеликазы, загрузка реплисомы (репликативного комплекса), синтез ДНК (элонгация), завершение синтеза (терминация) и разделение хромосом. Причем правильная последовательность этих стадий обеспечивается регуляторным аппаратом клеточного цикла, в первую очередь фосфорилированием и дефосфорилированием. Точность же процесса контролируется посредством специальных контрольных, чек-пойнт (check-point), механизмов, обеспечивающих превентивные меры в случае стрессовых воздействий или повреждений ДНК. Подготовка клетки к очередному раунду деления начинается уже в фазе G1 с узнавания сайтов инициации специальным комплексом ORC (origin recognition complex), содержащим 6 белков (ORC1, ORC2, ORC3, ORC4, ORC5, ORC6) в равной стехиометрии. Этот комплекс изначально был обнаружен у дрожжей S.cerevisiae по их способности специфически 118 # Обозначение в базе Swiss-Prot Название белка/синоним Теоретичес кие pI/ Mw Ссылка 1 PCNA_HUMAN Proliferating cell nuclear antigen / PCNA / Cyclin 4.57 / 28768 (Fukuda, Morioka et al. 1995; Naryzhny, Zhao et al. 2005) 2 DNL1_HUMAN DNA ligase 1 / Polydeoxyribonucleotide synthase [ATP] 1 5.49 / 101736 3 DPOD1_HUMAN 6.64 / 123631 4 DPOD3_HUMAN DNA polymerase delta catalytic subunit / DNA polymerase delta subunit p125 DNA polymerase subunit delta-3 / DNA polymerase subunit delta p66 5 6 DPOD4_HUMAN Q6GQH3_XENLA CDT1_HUMAN RFA1_HUMAN DNA polymerase subunit delta-4 / DNA polymerase subunit delta p12 DNA replication factorCdt1 / Double parked homolog / DUP 6.29 / 12433 9.83 / 69530 9.91 / 60413 6.92 / 68138 (Levin, Bai et al. 1997; Montecucco, Rossi et al. 1998) (Xu, Zhang et al. 2001) (Ducoux, Urbach et al. 2001) (Li, Xie et al. 2006) (Arias and Walter 2006) (Ohta, Shiomi et al. 2002) (Ohta, Shiomi et al. 2002) (Montecucco, Rossi et al. 1998) 7 8 9 DPOE_YEAST RFC3_HUMAN RFC1_HUMAN 10 RFC2_HUMAN 11 Replication protein A 70 kDa DNA-binding subunit / RP-A / RF-A / Replication factor-A protein 1 / Single-stranded DNA-binding protein / p70 DNA polymerase epsilon, catalytic subunit A / DNA polymerase II subunit A 9.38 / 51400 5.98 / 261518 Replication factor C subunit 1 / Replication factor C large subunit / RF-C 140 kDa subunit / Activator 1 140 kDa subunit / Activator 1 large subunit / A1 140 kDa subunit / DNA-binding protein PO-GA Replication factor C subunit 2 / Replication factor C 40 kDa subunit / RF-C 40 kDa subunit / RFC40 / Activator 1 40 kDa subunit / A1 40 kDa subunit 9.38 / 128255 RFC3_YEAST RFC3_HUMAN Replication factor C subunit 3 / Replication factor C 38 kDa subunit / RFC38 / Activator 1 38 kDa subunit / A1 38 kDa subunit / RF-C 38 kDa subunit 6.07 / 38204 12 RFC4_YEAST RFC3_HUMAN Replication factor C subunit 4 / Replication factor C 37 kDa subunit / RF-C 37 kDa subunit / RFC37 / Activator 1 37 kDa subunit / A1 37 kDa subunit 9.16 / 36149 13 RFC5_HUMAN 6.72 / 38497 14 FEN1_HUMAN 15 KCD13_HUMAN 16 PDIP2_HUMAN Replication factor C subunit 5 / Replication factor C 36 kDa subunit / RF-C 36 kDa subunit / RFC36 / Activator 1 36 kDa subunit / A1 36 kDa subunit Flap endonuclease 1 / Flap structure-specific endonuclease 1 / FEN-1 / Maturation factor 1 / MF1 / hFEN-1 / DNase IV BTB/POZ domain-containing protein KCTD13 / Polymerase deltainteracting protein 1 / TNFAIP1-like protein Polymerase delta-interacting protein 2 / 38 kDa DNA polymerase delta interaction protein / p38 17 TOP1_HUMAN DNA topoisomerase 1 9.33 / 90726 18 TOP2A_CHICK TOP2A_HUMAN MCM10_YEAST MCM10_HUMAN Q5TCJ4_HUMAN DNA topoisomerase 2 Minichromosome maintenance protein 10 / Protein DNA43 Protein MCM10 homolog / HsMCM10 Lamin A/C 8.90 / 175000 8.82 / 174385 9.67 / 65815 8.96 / 98183 6.13 / 53250 21 Q5TCJ2_HUMAN LMNA_HUMAN Lamin A/C / 70 kDa lamin / Renal carcinoma antigen NY-REN-32 6.57 / 74139 22 LMNB1_HUMAN Lamin-B1 5.11 / 66408 23 RNH2B_HUMAN Ribonuclease H2 subunit B 9.19 / 35138 19 20 6.04 / 39157 8.80 / 42593 6.77 / 36357 8.80 / 42033 Таблица 5. PCNA-связывающиеся белки участвующие в репликации и репарации ДНК. (Bowman, O'Donnell et al. 2004) (Bowman, O'Donnell et al. 2004) (Bowman, O'Donnell et al. 2004) (Ohta, Shiomi et al. 2002) (Warbrick, Lane et al. 1997) (He, Tan et al. 2001) (Liu, RodriguezBelmonte et al. 2003) (Loor, Zhang et al. 1997) (Niimi, Suka et al. 2001) (Das-Bradoo, Ricke et al. 2006) (Shumaker, Solimando et al. 2008) (Shumaker, Solimando et al. 2008) (Shumaker, Solimando et al. 2008) (Chon, Vassilev et al. 2009) 119 связываться с ACS (ARS consensus sequence A/TTTTAT/CA/GTTTA/T) (Bell and Stillman 1992; Stillman 2005). Белки ORC эволюционно консервативны, но у высших эукариот их способность связываться специфически с последовательностями ДНК утеряна. Это еще раз указывает на отсутствие у этих организмов специфической последовательности ДНК в ориджинах. Правда, ORC высших все-таки предпочтительнее связываются с А-Т богатыми последовательностями ДНК (Chuang and Kelly 1999; Kong and DePamphilis 2001; Vashee, Cvetic et al. 2003). Возможно это отражает тот факт, что повышенное содержание А и Т в ориджинах облегчает раскручивание ДНК (Natale, Umek et al. 1993; Nieduszynski, Knox et al. 2006). Таким образом, все еще неясно, как у большинства организмов происходит взаимодействие ORC с хроматином. Даже у S.cerevisiae одно только наличие ACS еще недостаточно для ее взаимодействия с ORC. Большинство ACS не функционирует как ориджины (Xu, Aparicio et al. 2006). Из обнаруженных там 12000 ACS используется только ~300 (Nieduszynski, Knox et al. 2006). Следовательно, скорее всего ORC узнает специфическую структуру хроматина, закодированную эпигенетически, но не последовательность ДНК. Другой аспект данной проблемы связан с тем, что репликация ДНК не стартует одновременно во всех ориджинах, а следует некой временной программе, по которой ориджины активируются по очереди в течение всей S-фазы (Raghuraman, Brewer et al. 1997; Raghuraman, Winzeler et al. 2001). Программа эта закладывается еще в ранней стадии фазы G1, так называемой временной точке “timing decision point” (Li, Chen et al. 2001). Там же происходит загрузка комплекса МСМ 120 (хеликаза) белками Cdc6 и Cdt1 с образованием пре-репликативного комплекса, или же, другими словами, ориджины “получают лицензию на репликацию “, которая в свою очередь инициируется двумя протеин-киназами – Cdk и Ddk, которые активируют хеликазу и загружают реплисому. Причем повторная инициация репликации в одном и том же месте исключается тем, что загрузка МСМ возможна только в G1-фазе и блокирована в S-, G2- и M-фазе. Иными словами, получение лицензии на репликацию и активация репликации невозможны в пределах одной фазы клеточного цикла (Nasmyth 1996). Большинство ORC субъединиц принадлежит к семейству ААА+ (ATPases Associated with various cellular Activities) АТФаз (Neuwald, Aravind et al. 1999). АТФ необходим для связывания ORC с ориджинами, принятия ими специфической конформации и последующей загрузки МСМ. Шесть субъединиц ORC образуют кольцеобразную структуру, которая принимает еще более правильную форму кольца при взаимодействии с Cdc6, который в свою очередь имеет гомологию с одной из субъединиц ORC, а именно с Orc1. Более того, у архиа имеется только один белок, совмещающий функции Orc1 и Cdc6 - Orc1/Cdc6 (Barry and Bell 2006). По форме и по размеру это кольцо ORC очень напоминает комплекс МСМ (Adachi, Usukura et al. 1997; Fletcher, Bishop et al. 2003; Kubota, Takase et al. 2003; Pape, Meka et al. 2003; Gomez-Llorente, Fletcher et al. 2005). Такое структурное соответствие подразумевает, что эти два кольца могли бы взаимодействать своими плоскими поверхностями. Другими белками, взаимодействующими с гексамером МСМ, являются Cdc45 и GINS. Слово GINS произошло из аббревиатуры японского произношения чисел 5,1,2,3 (Go, Ichi, Nii, San), которые у дрожжей присутствуют в 121 названиях четырех составляющих GINS субъединиц Sld5, Psf1, Psf2, and Psf3. Все вместе они (МСМ, Cdc45, GINS) образуют так называемый комплекс, обладающий хеликазной активностью и отвечающий за продвижение реплисомы (replisome progression complex) по репликативной вилке (Aparicio, Ibarra et al. 2006). Интересно то, что GINS имеет кольцевую структуру, очень напоминающую структуру PCNA, и кроме того стимулирует активность ДНК полимеразы епсилон (Shikata, Sasa-Masuda et al. 2006). То есть, казалось бы, он мог играть роль PCNA на лидирующей нити ДНК. Однако GINS просто физически не способен это делать, так как имеет внутреннее отверстие недостаточно большое для того, чтобы через него проходила нить ДНК (Choi, Lim et al. 2007). Еще одним белком, необходимым для загрузки МСМ, является Cdt1 (Bell and Dutta 2002). Предполагается, что загрузка происходит через взаимодействие комплекса Cdt1-МСМ с комплексом ORC-Cdc6-ориджин (Randell, Bowers et al. 2006). Затем Cdt1 и Cdc6 диссоциируют, и гидролиз АТФ комплексом ORC завершает процесс загрузки МСМ (Speck, Chen et al. 2005; Randell, Bowers et al. 2006; Speck and Stillman 2007). Как уже было ранее отмечено, этот процесс идет в фазе G1 и в S-фазе невозможен благодаря нескольким механизмам. Один из них обеспечивается специальным белком геминином (geminin) (McGarry and Kirschner 1998; Gonzalez, Tachibana et al. 2006; Kerns, Torke et al. 2007), который связывается с Cdt1 и ингибирует его взаимодействие с МСМ (McGarry and Kirschner 1998). Другой возможный механизм связан с экспортом Cdc6 из ядер или его деградацией (Jallepalli, Brown et al. 1997; Drury, Perkins et al. 2000; Pelizon, Madine et al. 2000; Delmolino, Saha et al. 2001). Кроме того, регуляция возможна и через деградацию Cdt1 после завершения 122 инициации. И здесь неожиданно обнаружилась роль PCNA, который координирует эту деградацию (Senga, Sivaprasad et al. 2006). На N-конце Cdt1 содержится сигнал деградации, который активируется в S-фазе или при возникновении повреждений ДНК. Причем активация зависит от взаимодействия Cdt1 с PCNA через PIP мотив. Деградация включает убиквитинирование Cdt1 на N-конце и идет через Cul4 и Ddb1, компоненты Е3 убиквитин лигазы. До этого времени, наиболее хорошо описанной функцией PCNA являлось его участие в синтезе ДНК (элонгации) в качестве скользящей скрепки, удерживающей ДНК полимеразу и позволяющей ей вести непрерывный (процессивный) синтез. Вклад PCNA в этот процесс является до сего времени наиболее изученным (Johnson and O'Donnell 2005; Moldovan, Pfander et al. 2007). Сравнение процессов элонгации ДНК у E. coli, фагов и эукариот показало, что функционально и структурно аппарат репликации ДНК очень консервативен (Kuriyan and O'Donnell 1993). Скользящая по ДНК “скрепка” присутствует во всех этих системах и повышает эффективность индивидуальных полимераз в синтезе протяженных цепей ДНК. Например, бета-субъединица E. coli и PCNA являются представителями скользящих по ДНК “скрепок” в прокариотах и эукариотах, соответственно, и способны специфически стимулировать своих специфических партнеров – ДНК полимеразу III и ДНК полимеразу дельта. Скрепки имеют характерную форму кольца, охватывающего двойную цепь ДНК и свободно скользящего по ней в обоих направлениях (Krishna, Kong et al. 1994; Gulbis, Kelman et al. 1996), что стабилизирует связанные с ним ДНК полимеразы на ДНК матрице. Периодическая загрузка/разгрузка кольца PCNA на запаздывающей нити, а также лидирующей нити ДНК, обеспечивается АТФ-зависимым 123 шаперонин-подобным фактором репликации C (RFC), гетеропентамерным AAA+ белковым комплексом, состоящим из субъединиц RFC1, RFC2, RFC3, RFC4 и RFC5 (Majka and Burgers 2004). Этот арко-подобный комплекс действует по типу, схожему с завинчиванием крышки (Bowman, O'Donnell et al. 2004), открывая кольцо PCNA и загружая его на ДНК. За счет стабилизации PCNA ДНК полимераза дельта или эпсилон непрерывно реплицирует лидирующую цепь ДНК в 5‟-3‟ направлении, где исправление ошибок обеспечивает корректорская 3‟-5‟ экзонуклеаза (Kunkel and Bebenek 2000). Запаздывающая же нить ДНК реплицируется прерывистым образом, с образованием коротких фрагментов Оказаки (Okazaki) и последовательным участием ДНК полимеразы альфа, флап эндонуклеазы (flap structure-specific endonuclease-1, FEN-1), и ДНК полимеразы дельта. ДНК лигаза I сшивает фрагменты Оказаки между собой. FEN-1 и ДНК лигаза взаимодействуют с PCNA через PIP-бокс, и взаимодействие экзонуклеазы FEN-1 с PCNA даже стимулирует ее активность (Jonsson, Hindges et al. 1998; Montecucco, Rossi et al. 1998; Tom, Henricksen et al. 2001). Топологические проблемы, возникающие на ДНК (сцепление и суперскручивание) вследствие движения репликативной вилки, решаются путем действия топоизомераз I и II, которые тоже могут связываться с PCNA (Loor, Zhang et al. 1997; Niimi, Suka et al. 2001). То есть, PCNA работает как движущаяся платформа не только для ДНК полимераз, но и как станция взаимодействия для факторов участвующих или сопутствующих ДНК репликации (Maga and Hubscher 2003; Naryzhny, Zhao et al. 2005). При этом организация в виде двойного кольца идеально подходит для такой функции. Две симметричные площадки для белкового взаимодействия, 124 направленные в противоположные стороны на реплицирующейся ДНК позволяют PCNA одновременно участвовать в синтезе ДНК и других процессах, таких как ремоделирование хроматина или метилирование ДНК (Naryzhny, Zhao et al. 2005; Naryzhny 2007). Понимание многих деталей данного механизма работы PCNA еще отсутствуют, так как процесс репликации ДНК млекопитающих чрезвычайно динамичен и сложен. Известно, что машины репликации ДНК организованы в специальные ядерные фабрики (фокусы, foci), что было продемонстрировано с помощью использования специальной метки (Nakamura, Morita et al. 1986; Nakayasu and Berezney 1989; van Dierendonck, Keyzer et al. 1989; Fox, Arndt-Jovin et al. 1991; O'Keefe, Henderson et al. 1992). Соответственно эти фокусы получили название репликативных фокусов (РФ). Каждый фокус или фабрика включает в себя много репликативных машин, или реплисом, состоящих из многих ферментов и дополнительных белков, необходимых для дупликации хроматина в каждой, отдельно взятой репликативной вилке, стартующей со своего сайта инициации (ориджина) (Jackson and Pombo 1998; Berezney, Dubey et al. 2000). Из-за очень большого размера и плотной упаковки генома млекопитающим необходимо примерно 4х103 ориджинов, которые инициируются в разное время в течение Sфазы. Причем это достаточно четко проявляется в морфологии - распределении РФ во время S-фазы, которая по этому распределению делится на раннюю, среднюю и позднюю S-фазу (Nakayasu and Berezney 1989). Визуально это выглядит следующим образом – в ранней S-фазе РФ имеют примерно одинаковый малый размер и распределены примерно одинаково по всему объему ядра, в средней Sфазе их количество становится меньше, но размер больше, причем не 125 пропорционально по всем РФ, и большая их часть обнаруживается на ядерной периферии. В поздней S-фазе размер РФ, которые присутствуют в основном внутри ядра, становится еще больше, но количество еще меньше. Анализ с использованием электронного а также деконволюционного микроскопа показал, что увеличенные в размере РФ, видимые в средней и поздней S-фазе, на самом деле состоят из РФ меньшего размера, такого же, как и РФ, видимые в ранней S-фазе (Leonhardt, Rahn et al. 2000; Koberna, Ligasova et al. 2005). Что касается PCNA, то его распределение внутри ядра во время S-фазы практически совпадает с РФ. Пространственное распределение РФ, как и PCNA, по-видимому обеспечивается через взаимодействие со специальными структурными белками (ядерным матриксом) (Kennedy, Barbie et al. 2000; Anachkova, Djeliova et al. 2005). Эти белки ядерного матрикса включают ламины, гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины, актин, виментин и нюматрин (B23) (Gerner, Holzmann et al. 1998). Важно отметить то, что PCNA обнаруживается в препаратах ядерного матрикса (Gerner, Holzmann et al. 1998). Вполне вероятно, что это происходит благодаря тому, что PCNA может связываться с ламинами через расположенный на их C-конце консервативный мотив (Ig-fold) (Shumaker, Solimando et al. 2008). Использование метки ДНК и белков показало, что при репликации ДНК как бы протягивается через реплисому, которая в свою очередь в течение этого процесса остается связанной с ядерным матриксом. Более того, хотя общая картина РФ претерпевает изменения в течение S-фазы, отдельные фокусы не двигаются, не делятся и не сливаются друг с другом. А их координированная сборка и разборка происходят непрерывно, но не синхронно (Leonhardt, Rahn et al. 2000). Изучение динамики поведения 126 флуоресцентного PCNA (GFP-PCNA) показало, что новые РФ образуются рядом с уже существующими РФ посредством косвенного механизма, названного эффектом домино (Sporbert, Gahl et al. 2002). Более того, сравнение локализации меченых нуклеотидов и GFP-PCNA показало, что при появлении GFP-PCNA в прилегающем к предыдущему РФ новом РФ происходит отделение вновь синтезируемой ДНК от репликативной машины (реплисомы) (Sporbert, Gahl et al. 2002; Sadoni, Cardoso et al. 2004). Так как реплисома состоит из многих белков, не обязательно все из которых постоянно входят в этот белковый комплекс, возникает вопрос об их динамике и взаимной подвижности. Относительно PCNA известно то, что вне S-фазы он довольно свободно диффундирует в нуклеоплазме, но с началом репликации ДНК обнаруживается плотно связанным с РФ с очень низкой вероятностью выхода в свободное состояние (Sporbert, Gahl et al. 2002). Время его кругооборота, измеренное с помощью FRAP измеряется минутами. Это очень долго и означает, что PCNA остается ассоциированным с репликативной машиной в течение синтеза и созревания многих фрагментов Оказаки (Sporbert, Gahl et al. 2002). Так, репликативная вилка в клетках млекопитающих синтезируется в среднем со скоростью 1.7 кб в минуту (Jackson and Pombo 1998). Так как длина одного фрагмента Оказаки 180-200 нуклеотидов, то для его синтеза требуется примерно 6 сек. То есть в минуту получается 10 фрагментов Оказаки. Каждый РФ содержит в среднем 10 репликативных вилок (Jackson and Pombo 1998; Ma, Samarabandu et al. 1998). То есть в нем синтезируется 100 фрагментов Оказаки в минуту, и соответственно, если бы каждый раз на очередной фрагмент Оказаки загружался новый PCNA, то их потребовалось бы тоже 100. Однако же этого не 127 происходит, что означает многократное использование одного и того же кольца PCNA, посаженного на ДНК, для многочисленных раундов реакций, идущих на репликативной вилке. Причем это происходит на фоне очень интенсивной динамичности остальных участников. Например, кругооборот RPA34, белка, участвующего в инициации репликации ДНК, измеренный с помощью FRAP, измеряется несколькими секундами (Sporbert, Gahl et al. 2002). То же самое касается лигазы 1 и эндонуклеазы Fen1 (Sporbert, Gahl et al. 2002; Solovjeva, Svetlova et al. 2005). Эксперименты с двойным FRAP, где одновременно замеряли кругооборот различных белков, показали, что ДНК лигаза 1 и экзонуклеаза FEN-1 замещаются в РФ буквально через несколько секунд после обесцвечивания. В случае PCNA на это уходит несколько минут, что в очередной раз подтверждает его роль стабильной платформы и координатора процессов, идущих при репликации ДНК (Sporbert, Domaing et al. 2005). С другой стороны это указывает и на чрезвычайную динамичность репликативного аппарата (реплисомы). Предыдущие модели подразумевали некие стабильные комплексы. Например, предполагалось, что ДНК лигаза 1, FEN-1 и PCNA образуют некий стехиометрический комплекс с отношением 1: 1: 1 и действуют синхронно на репликативном сайте (Chen, Chen et al. 1996). 7.1.2.Репарация ДНК (Табл. 6) Репарация ДНК это процесс, где многие детали участия PCNA уже детально изучены. нескольких Например, подробная информация дана в недавно опубликованных обзорах (Friedberg, Lehmann et al. 2005; Moldovan, Pfander et al. 128 2007). Многочисленные пути репарации повреждений ДНК включают в себя и синтез ДНК, который обеспечивается ДНК полимеразами совместно с PCNA. Это означает, что машина репликации ДНК должна быть достаточно гибкой, чтобы работать в нормальной и в стрессовой ситуации. Причем PCNA способен координировать различные реакции и может быть вовлечен не только в регуляцию синтеза ДНК. В случае эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) PCNA связывается с эндонуклеазой XP-G посредством PIP-бокса, расположенного на Cконце, что возможно позволяет PCNA координировать эксцизию и синтез ДНК (Gary, Ludwig et al. 1997). Схожая ситуация имеет место и в случае эксцизионной репарации оснований, где практически все вовлеченные факторы (урацил-ДНК гликозилаза 2; ДНК-3-метиладенин гликозилаза, MPG; эндонуклеаза III похожий белок 1, NTH1) взаимодействуют и стимулируются PCNA, указывая на регулирующее участие PCNA в процессе. Урацил-ДНК гликозилаза 2 (Cyclin-O), ДНК лиаза 2 (APEX2) и ДНК полимераза бета содержат PIP-бокс, в то время как ДНК гликозилаза (MPG) содержит обратный PIP-бокс (Otterlei, Warbrick et al. 1999; Ko and Bennett 2005; Xia, Zheng et al. 2005). Другие факторы, такие как NTH1 или XRCC1, также взаимодействуют с PCNA, но не через PIP-бокс (Fan, Otterlei et al. 2004; Oyama, Wakasugi et al. 2004). Репликация в обход повреждений и репарация допущенных ошибок также включает одну из сторон работы PCNA, которая не так давно была обнаружена и описана в привлекательной модели переключателя с участием убиквитинирования PCNA (Hoege, Pfander et al. 2002; Friedberg, Lehmann et al. 2005; Moldovan, Pfander et al. 2007). Согласно этой модели в результате повреждения ДНК или остановки репликативной вилки PCNA моно- или 129 полиубиквитинируется по консервативному остатку К164. Важно то, что моноубиквитинирование PCNA запускает путь ошибочной репарации ДНК посредством синтеза в обход повреждений (translesion synthesis, TLS), в то время как полиубиквитинирование необходимо для репарации без ошибок (error-free mode of bypass repair) (Moldovan, Pfander et al. 2007). Целое семейство TLS полимераз было описано и показано, что они специфически взаимодействуют с PCNA через PIP-бокс и убиквитин-связывающий домен (Kannouche and Lehmann 2004; Kannouche, Wing et al. 2004; Bienko, Green et al. 2005). К тому же TLS полимеразы могут быть сами моноубиквитинированы (Bienko, Green et al. 2005; Guo, Tang et al. 2006), что может служить отрицательным переключателем, исключающим их взаимодействие с PCNA (Bienko, Green et al. 2005; Moldovan, Pfander et al. 2007). В добавление интриги нужно добавить, что PCNA может взаимодействовать с E3 убиквитин лигазой и запускать ее активность (Hu and Xiong 2006). A TLS, вызванный моноубиквитинированием PCNA, вовлечен не только в репликацию в обход повреждений (bypass replication), но и в процесс гипермутаций иммуноглобулиновых генов (Arakawa, Moldovan et al. 2006). 7.1.3. Контроль клеточного цикла, выживаемость (Табл.7) Уровень PCNA осциллирует по клеточному циклу, что может быть связано с участием PCNA в контроле клеточного цикла. Это участие возможно обеспечивается посредством взаимодействия с циклинами и циклин зависимыми киназами. Такие взаимодействия могут быть независимыми от аппарата репликации 1 Обозначение в базе Swiss-Prot APEX2_HUMAN 2 APEX1_HUMAN 3 3MG_HUMAN 4 ERCC5_HUMAN 5 6 DPOLB_HUMAN CCNO_HUMAN 7 PRKDC_HUMAN 8 EXO1_HUMAN 9 GA45A_HUMAN 10 GA45B_HUMAN 11 GA45G_HUMAN 12 KU70_HUMAN 13 KU86_HUMAN 14 PAF_HUMAN 15 16 MSH2_HUMAN MSH3_HUMAN 17 MSH6_HUMAN 18 # Название белка/синоним DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase 2 / Apurinic-apyrimidinic endonuclease 2 / AP endonuclease 2 / APEX nuclease 2 / APEX nuclease-like 2 / AP endonuclease XTH2 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) lyase / AP endonuclease 1 / APEX nuclease / APEN / Protein REF-1 DNA-3-methyladenine glycosylase / 3-methyladenine DNA glycosidase / ADPG / 3-alkyladenine DNA glycosylase / N-methylpurine-DNA glycosylase DNA-repair protein complementing XP-G cells / Xeroderma pigmentosum group G-complementing protein / DNA excision repair protein ERCC-5 DNA polymerase beta Cyclin-O / Uracil-DNA glycosylase 2 / UDG2 / Cyclin-like uracil-DNA glycosylase Теоретическ ие pI/ Mw 8.65 / 57400 Ссылка 8.33 / 35554 (Dianova, Bohr et al. 2001) (Xia, Zheng et al. 2005) 9.65 / 32863 5.19 / 133329 9.01 / 38177 9.43 / 35352 DNA-dependent protein kinase catalytic subunit / DNA-PK catalytic subunit / DNA-PKcs / DNPK1 / p460 Exonuclease 1 / hExo1 / Exonuclease I / hExoI 6.75 / 469089 Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 alpha / DNA-damage-inducible transcript 1 / DIT-1 Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 beta / Negative growth regulatory protein MyD118 / Myeloid differentiation primary response protein MyD118 Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 gamma / Cytokine-responsive protein CR6 / DNA-damage-inducible transcript 2 ATP-dependent DNA helicase 2 subunit 1 / ATP-dependent DNA helicase II 70 kDa subunit / Lupus Ku autoantigen protein p70 / Ku70 / 70 kDa subunit of Ku antigen / Thyroid-lupus autoantigen / TLAA / CTC box-binding factor 75 kDa subunit / CTCBF / DNA-repair protein XRCC6 ATP-dependent DNA helicase 2 subunit 2 /ATP-dependent DNA helicase II 80 kDa subunit / Lupus Ku autoantigen protein p86 / Ku86 / Ku80 / 86 kDa subunit of Ku antigen / Thyroid-lupus autoantigen / TLAA / CTC box-binding factor 85 kDa subunit / CTCBF / CTC85 / Nuclear factor IV /DNA-repair protein XRCC5 PCNA-associated factor / p15PAF / Overexpressed in anaplastic thyroid carcinoma 1 / OEATC-1 / Hepatitis C virus NS5A-transactivated protein 9 / HCV NS5A-transactivated protein 9 DNA mismatch repair protein Msh2 / MutS protein homolog 2 DNA mismatch repair protein Msh3 / Divergent upstream protein / DUP / Mismatch repair protein 1 / MRP1 DNA mismatch repair protein MSH6 / MutS-alpha 160 kDa subunit / G/T mismatch-binding protein / GTBP / GTMBP / p160 4.36 / 18336 WRN_HUMAN Werner syndrome ATP-dependent helicase 5.96 / 162495 19 TDT_HUMAN 8.55 / 58437 20 21 MUTYH_HUMAN SRS2_YEAST DNA nucleotidylexotransferase / Terminal addition enzyme / Terminal deoxynucleotidyltransferase / Terminal transferase A/G-specific adenine DNA glycosylase / MutY homolog / hMYH ATP-dependent DNA helicase SRS2 22 PRKDC_HUMAN 6.75 / 469088 23 PARP1_HUMAN 24 25 RAD18_YEAST RAD18_HUMAN RAD5_YEAST 26 POLI_HUMAN DNA-dependent protein kinase catalytic subunit / DNA-PK catalytic subunit / DNA-PKcs / DNPK1 / p460 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 / PARP-1 / ADPRT / NAD(+) ADPribosyltransferase 1 / Poly[ADP-ribose] synthetase 1 E3 ubiquitin-protein ligase RAD18 / Postreplication repair E3 ubiquitinprotein ligase RAD18 / hHR18 / RING finger protein 73 DNA repair protein RAD5 / Radiation sensitivity protein 5 / Revertibility protein 2 DNA polymerase iota 27 POLK_HUMAN DNA polymerase kappa 8.42 / 98809 28 DPOLL_HUMAN DNA polymerase lambda 7.96 / 63482 29 DPOLQ_HUMAN DNA polymerase theta 6.57 / 197597 30 POLH_HUMAN DNA polymerase eta 8.74 / 78413 31 NTHL1_HUMAN Endonuclease III-like protein 1 9.72 / 34389 32 XRCC1_HUMAN DNA-repair protein XRCC1 / X-ray repair cross-complementing protein 1 6.02 / 69525 33 ALKB2_HUMAN Alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase alkB homolog 2/ Alkylated DNA repair protein alkB homolog 2, Oxy DC1 9.68 / 29322 8.59 / 94103 4.33 / 17818 4.26 / 17121 6.23 / 69712 130 (Tsuchimoto, Sakai et al. 2001) (Gary, Ludwig et al. 1997) (Kedar, Kim et al. 2002) (Muller-Weeks and Caradonna 1996; Otterlei, Warbrick et al. 1999) (Ohta, Shiomi et al. 2002) (Dzantiev, Constantin et al. 2004) (Hall, Kearsey et al. 1995) (Hall, Kearsey et al. 1995) (Azam, Vairapandi et al. 2001) (Balajee and Geard 2001) 5.55 / 82573 (Ohta, Shiomi et al. 2002) 9.85 / 11986 (Yu, Huang et al. 2001; Simpson, Lammerts van Bueren et al. 2006) 5.58 / 104743 8.30 / 127455 (Clark, Valle et al. 2000) (Kleczkowska, Marra et al. 2001) (Clark, Valle et al. 2000) (Kleczkowska, Marra et al. 2001) (Lebel, Spillare et al. 1999) (Ibe, Fujita et al. 2001) 6.50 / 152786 8.99 / 60069 8.86 / 134306 8.99 / 113083 7.53 / 55230 7.17 / 56194 5.98 / 134002 6.37 / 80346 (Parker, Gu et al. 2001) (Papouli, Chen et al. 2005) (Ohta, Shiomi et al. 2002) (Frouin, Maga et al. 2003) (Hoege, Pfander et al. 2002) (Hoege, Pfander et al. 2002) (Haracska, Johnson et al. 2001) (Haracska, Unk et al. 2002) (Maga, Villani et al. 2002) (Haracska, Johnson et al. 2001) (Kannouche, Wing et al. 2004) (Oyama, Wakasugi et al. 2004) (Fan, Otterlei et al. 2004) (Gilljam, Feyzi et al. 2009) 131 Таблица 6. PCNA-связывающиеся белки, участвующие в репарации ДНК ДНК, образуя четвертичный комплекс PCNA – Cdk – циклин D – p21 (Xiong, Zhang et al. 1992; Xiong, Zhang et al. 1993; Zhang, Xiong et al. 1993), или же могут быть локализованы в реплисоме, как в случае Cdk2-циклин A, который образует комплекс с PCNA и фосфорилирует RFC и DNA лигазу (Koundrioukoff, Jonsson et al. 2000), или же фосфорилирует FEN-1, что ведет к ее диссоциации (Henneke, Friedrich-Heineken et al. 2003). Среди белков регуляции клеточного цикла p21 (CDN1A_HUMAN) известен как ключевой регулятор функций PCNA (Dotto 2000). N-конец (AA17-24) p21 отвечает за связывание и ингибирование циклин зависимых киназ (Cdk), а C-конец содержит PIP последовательность, позволяющую p21 эффективно связываться с PCNA и конкурентным образом блокировать контакт других взаимодействующих с PCNA белков (Gary, Ludwig et al. 1997; Warbrick, Lane et al. 1997; Ducoux, Urbach et al. 2001). Соответственно, p21 может эффективно остановить репликацию ДНК и обеспечить переключение на репарацию ДНК. Однако все еще является загадкой то, как блокируя репликативный синтез, p21 однако позволяет вести репаративный синтез. Возможно это регулируется посредством специфического протеолиза p21 (Smith, Ford et al. 2000; Adimoolam, Lin et al. 2001) или через его фосфорилирование (Scott, Morrice et al. 2000). Циклин D1 является другим интересным кандидатом на роль негативного регулятора PCNA в клеточном цикле. Балдин (Baldin) и соавторы показали, что обычно циклин D1 локализован в ядрах, но пропадает из них в S-фазе клеточного цикла (Baldin, Lukas 132 et al. 1993). Они предположили, что взаимодействие циклина D1 с PCNA исключает возможность того связываться с репликативным комплексом (Baldin, Lukas et al. 1993). Интересно в этой связи напомнить, что семейство циклинов D взаимодействует с PCNA отличным от всех остальных белков образом (Matsuoka, Yamaguchi et al. 1994; Maga and Hubscher 2003). Другой механизм регуляции PCNA по клеточному циклу возможен на уровне транскрипции, где регуляция идет под контролем p53 (Saifudeen, Marks et al. 2002). Следует добавить, что PCNA сам может быть вовлечен в механизм контроля стабильности p53, так как p53 и его негативный регулятор Mdm2 имеют PIP- боксы и могут связываться с PCNA (Banks, Wu et al. 2006). 7.1.4. Сборка хроматина, эпигенезис и когезия хроматид (Табл.8) Процесс дупликации генетического материала у эукариотов - это не просто репликация ДНК, но репликация хроматина, который несет генетическую и эпигенетическую информацию (Polo and Almouzni 2006). В процессе движения репликативной вилки хроматин подвергается разборке и немедленно собирается на двух дочерних нитях ДНК. Специальный гистоновый шаперон CAF-1 (chromatin assembly complex) доставляет гистоны на реплицирующуюся ДНК, используя взаимодействие с PCNA через PIP- бокс, расположенный на большой субъединице комплекса (субъединица А у CAF-1 или Cac1 у дрожжей). Подобным образом PCNA-зависимое связывание CAF-1 было показано и в местах нуклеотидной эксцизионной репарации (NER) или во время репликации в обход повреждений # 1 Обозначение в базе Swiss-Prot RAD9A_HUMAN Название белка/ синоним Теоретичес кие pI/ Mw 5.41 / 42547 Ссылки 7.13 / 34359 8.38 / 34095 (Koundrioukoff, Jonsson et al. 2000) (Kawabe, Suganuma et al. 2002) (Saha, Chen et al. 1998; Watanabe, Pan et al. 1998) (Gonzales, Goldsworthy et al. 1998; Saha, Chen et al. 1998) (Koundrioukoff, Jonsson et al. 2000) (Koundrioukoff, Jonsson et al. 2000) (Ando, Kawabe et al. 2001) (Koundrioukoff, Jonsson et al. 2000) (Xiong, Zhang et al. 1992; Matsuoka, Yamaguchi et al. 1994) (Xiong, Zhang et al. 1992; Matsuoka, Yamaguchi et al. 1994) (Xiong, Zhang et al. 1992; Matsuoka, Yamaguchi et al. 1994) (Frouin, Montecucco et al. 2002) (Koundrioukoff, Jonsson et al. 2000) (Zhang, Xiong et al. 1993; Waga, Hannon et al. 1994) (Stanyon, Liu et al. 2004; Scorah, Dong et al. 2008) (Szepesi, Gelfand et al. 1994) 2 CDC2_SCHPO CDC2_HUMAN Cell cycle checkpoint control protein RAD9A / DNA repair exonuclease rad9 homolog A / hRAD9 Cell division control protein 2 homolog/ p34 protein kinase / Cyclindependent kinase 1 / CDK1 3 MPIP3_HUMAN M-phase inducer phosphatase 3 / Dual specificity phosphatase Cdc25C 6.34 / 53365 4 CDC6_HUMAN Cell division control protein 6 homolog / CDC6-related protein / p62(cdc6) / HsCDC6 / HsCDC18 9.64 / 62734 5 CDK6_HUMAN Cell division protein kinase 6 / Serine/threonine-protein kinase PLSTIRE 6.02 / 36938 6 CCNA1_HUMAN Cyclin - A1 4.99 / 52358 7 CCNA2_HUMAN Cyclin - A2 6.10 / 48537 8 CCNB1_HUMAN G2/mitotic-specific cyclin-B1 7.09 / 48337 9 CCNA_HUMAN G1/S-specific cyclin-A 10 CCND1_HUMAN G1/S-specific cyclin-D1 4.97 / 33729 11 CCND2_HUMAN G1/S-specific cyclin-D2 5.06 / 33067 12 CCND3_HUMAN G1/S-specific cyclin-D3 6.66 / 32520 13 PARP1_HUMAN Poly [ADP-ribose] polymerase 1 / PARP-1 / ADPRT / NAD(+) ADPribosyltransferase 1 / Poly[ADP-ribose] synthetase 1 8.99 /112953 14 CDK2_HUMAN Cell division protein kinase 2/ p33 protein kinase 8.80 / 33929 15 CDN1A_HUMAN Cyclin-dependent kinase inhibitor 1 / p21 / CDK-interacting protein 1 / Melanoma differentiation-associated protein 6 / MDA-6 8.69 / 18119 16 CHK1_DROME CHK1_HUMAN Serine/threonine-protein kinase Chk1 8.37 / 57833 8.50 / 54419 17 CDK5_HUMAN 7.57 / 33304 18 RAD1_HUMAN 19 RAD17_HUMAN Cyclin dependent kinase 5 / Cyclin-dependent kinase 5 / Tau protein kinase II catalytic subunit / TPKII catalytic subunit / Serine/threonine-protein kinase PSSALRE Cell cycle checkpoint protein RAD1 / DNA repair exonuclease rad1 homolog / Rad1-like DNA damage checkpoint protein / hRAD1 Cell cycle checkpoint protein RAD17 / hRad17 / RF-C/activator 1 homolog 20 HUS1_HUMAN Checkpoint protein HUS1 / hHUS1 6.37 / 31691 21 ING1_HUMAN Inhibitor of growth protein 1 9.33 / 46781 22 CDN1C_HUMAN 5.39 / 32177 23 MCL1_HUMAN 24 MD2L2_HUMAN 25 PP1G_HUMAN Cyclin-dependent kinase inhibitor 1C / Cyclin-dependent kinase inhibitor p57 / p57KIP2 Induced myeloid leukemia cell differentiation protein Mcl-1 / Bcl-2-related protein EAT/mcl1 / mcl1/EAT Mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD2B / MAD2-like 2 / hREV7 Serine/threonine-protein phosphatase PP1-gamma catalytic subunit / PP1G / Protein phosphatase 1C catalytic subunit 26 P53_HUMAN 6.33 / 43653 27 MDM2_HUMAN Cellular tumor antigen p53 / Tumor suppressor p53 / Phosphoprotein p53 / Antigen NY-CO-13 E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 / p53-binding protein Mdm2 / Oncoprotein Mdm2 / Double minute 2 protein / Hdm2 (Dahm and 133 Hubscher 2002) 4.73 / 31827 6.63 / 77055 5.51 / 37337 6.05 / 24334 6.12 / 36983 4.60 / 55232 (Boulton, Gartner et al. 2002) (Dahm and Hubscher 2002) (Dahm and Hubscher 2002) (Scott, Bonnefin et al. 2001) (Watanabe, Pan et al. 1998) (Fujise, Zhang et al. 2000) (Stanyon, Liu et al. 2004) (Matsuoka, Yamaguchi et al. 1994; FloresDelgado, Liu et al. 2007) (Banks, Wu et al. 2006) (Banks, Wu et al. 2006) 134 Обозначение в базе Swiss-Prot HDAC1_HUMAN Название белка/ синоним Histone deacetylase 1 / HDAC1 / HD1 Теоретическ ие pI/ Mw 5.31 / 55103 2 ECO1_YEAST ESCO1_HUMAN N-acetyltransferase ECO1 / Establishment of cohesion protein 1 / Chromosome transmission fidelity protein 7 9.94 / 31845 9.27 / 94982 3 CAF1A_HUMAN 5.77/105223 # 1 4 EP300_HUMAN Chromatin assembly factor 1 subunit A / CAF-1 subunit A / Chromatin assembly factor I p150 subunit / CAF-I 150 kDa subunit / CAF-Ip150 Chromatin assembly factor 1 subunit p90 / CAF-1 90 kDa subunit / RAP1 localization factor 2 Histone acetyltransferase p300 / E1A-associated protein p300 5 DCC1_YEAST DCC1_HUMAN Sister chromatid cohesion protein DCC1 / Defective in sister chromatid cohesion protein 1 6.04 / 44074 5.05 / 44825 6 BAZ1B_HUMAN 8.70 / 170902 7 DNMT1_HUMAN 8 10 CTF8_YEAST Q8WV66_HUMAN CTF18_YEAST Q8WVB6_HUMAN PTMA_HUMAN Bromodomain adjacent to zinc finger domain protein 1B / WilliamsBeuren syndrome chromosomal region 9 protein / Williams syndrome transcription factor / hWALP2 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1 / Dnmt1 / DNA methyltransferase HsaI / DNA MTase HsaI / MCMT / M.HsaI / CXXC-type zinc finger protein 9 Chromosome transmission fidelity protein 8 / Clamp loading Chromosome transmission fidelity factor 8 homolog Chromosome transmission fidelity protein 18 / CTF18/CHL12 protein / Chromosome transmission fidelity factor 18 homologue / Clamp loading Prothymosin alpha 11 SETD8_HUMAN 9.69 / 42889 12 A6ZST7_YEAS7 PIF1_HUMAN 13 UBC9_HUMAN Histone-lysine N-methyltransferase SETD8 / H4-K20-HMTase SETD8 / SET domain-containing protein 8 / PR/SET domain-containing protein 07 / PR/SET07 / PR-Set7 / Lysine N-methyltransferase 5A DNA helicase / RRM3 ATP-dependent DNA helicase PIF1 / PIF1/RRM3 DNA helicase-like protein SUMO-conjugating enzyme UBC9 / SUMO-protein ligase / Ubiquitinconjugating enzyme E2 I / Ubiquitin-protein ligase I / Ubiquitin carrier protein I / Ubiquitin carrier protein 9 / p18 CAC1_YEAST 9 Ссылки (Milutinovic, Zhuang et al. 2002) (Skibbens, Corson et al. 1999; Moldovan, Pfander et al. 2006) (Moggs, Grandi et al. 2000) 6.38 / 70210 8.78 / 264143 7.99 / 183165 7.95 / 15169 7.90 / 13214 8.54 / 84373 6.78 / 107383 3.69 / 12072 (Hasan, Hassa et al. 2001) (Shiomi, Shinozaki et al. 2004) (Moldovan, Pfander et al. 2006) (Poot, Bozhenok et al. 2004) (Chuang, Ian et al. 1997) (Bylund and Burgers 2005) (Bylund and Burgers 2005) (Freire, Covelo et al. 2001) (Walhout, Reboul et al. 2002) 9.71 / 81592 9.81 / 69798 (Schmidt, Derry et al. 2002) 8.87 / 18006 (Stanyon, Liu et al. 2004) Таблица 7. PCNA-связывающиеся белки, участвующие в контроле клеточного цикла и выживаемости. Таблица 8. PCNA-связывающиеся белки, участвующие ремоделировании хроматина, а также в когессии хроматид. в сборке и (bypass replication) (Gaillard, Martini et al. 1996; Game and Kaufman 1999), указывая на то, что этот процесс важен для синтеза ДНК в хроматине. Соответственно, возникла интересная модель координации синтеза ДНК и сборки хроматина, основанная на структуре PCNA в виде двойного кольца, которое способно 135 одновременно связываться с ДНК полимеразой дельта и CAF-1 (Naryzhny, Zhao et al. 2005; Lee and Naryzhny 2006; Naryzhny 2007) (Рис.41а, Рис.41в). Так как эпигенетическая информация кодируется ковалентными модификациями ДНК и гистонов (“гистоновый код”), необходимые ферментативные активности также должны быть прямо связаны с аппаратом репликации ДНК. Разнообразные ковалентные модификации (ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, убиквитинирование, SUMO-илирование) формируют “гистоновый код”, который регулирует хроматиновые функции, определяя доступность генома для разного типа аппаратов, в первую очередь транскрипционного (Strahl and Allis 2000; Zhang and Reinberg 2001). ДНК цитозин метилтрансфераза 1 (DNMT1) отвечает за метилирование цитозина в ЦфГ последовательностях, которые отвечают за отключение генов. DNMT1 активируется и направляется в репликативные фабрики посредством взаимодействия с PCNA через PIP box (Cardoso, Sporbert et al. 1999; Iida, Suetake et al. 2002). Интересно то, что за взаимодействие DNMT1 с ДНК отвечает другой белок, UHRF1 (ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains 1), известный еще и как NP95 (nuclear protein) или ICBP90 (Bostick, Kim et al. 2007; Sharif, Muto et al. 2007; Arita, Ariyoshi et al. 2008). Таким образом, вырисовывается критическая роль тройственного комплекса Dnmt1/PCNA/UHRF1 в поддержании эпигенетического статуса хроматина (метилирования ДНК) в процессе репликации ДНК (Hervouet, Lalier et al. 2010). А нарушение этого тройственного комплекса, по-видимому, может вести к генетической нестабильности и канцерогенезу (Hervouet, Lalier et al. 2010). Действительно, известно, что хотя гипометилирование и является важным сопутствующим фактором при развитии 136 RFC A RFC 5’ RFC 3’ 5’ B 5’ DNA pol DNA pol 3’ 5’ HDAC C P300 DNMT 5’ 3’ CAF1 DNA pol 5’ Рис. 41a. Координирующая модель работы PCNA. Двойной тример PCNA необходим для координации репликации ДНК и других клеточных функций (например, эпигенетические модификации). (А) Двойной тример PCNA загружается на ДНК с помощью RFC. (B) RFC отделяется от хроматина/PCNA, а ДНК полимераза (дельта или эпсилон) присоединяется к комплексу PCNA со стороны направления полимеразной реакции. (С) CAF-1, HDAC 1, P300 или DNMT1 могут взаимодействовать с другой лицевой стороной комплекса двойного тримера PCNA. Таким образом, ремоделирование хроматина и эпигенетические модификации могут быть связаны с процессом репликации ДНК. 137 A RF-C B PCNA CAF-1 C DNA pol CAF-1 RP-A DNA pol PCNA Naryzhny SN, model Рис. 41б. Координирующая модель работы PCNA. Более детальное и художественное представление молекулярных процессов, происходящих при репликации хроматина. (A) RFC связывается с PCNA и (B) загружает его на ДНК. (С) RFC отделяется от хроматина/PCNA, а ДНК полимераза (дельта или эпсилон) присоединяется к комплексу PCNA со стороны направления полимеразной реакции, а CAF-1 взаимодействует с другой стороной двойного тримера PCNA, загружая нуклеосомы. 138 рака, уровень экспрессии DNMT1 при этом практически не затрагивается (Ehrlich, Jiang et al. 2002; Ehrlich, Woods et al. 2006). Следовательно, определяющим моментом, который влияет на работу этого фермента, может быть белок-белковое взаимодействие. Более того, есть основания полагать, что фосфорилирование DNMT1, а именно по серину-127 и/или по серину-143 киназами Akt и PKC, приводит к нарушению вышеупомянутого тройственного комплекса (Hervouet, Lalier et al. 2010). Гистон модифицирующие ферменты (гистон деацетилаза HDAC), гистон ацетилтрансфераза (p300) также попадают на репликативную вилку через взаимодействие с PCNA (Hasan, Hassa et al. 2001; Hasan and Hottiger 2002; Milutinovic, Zhuang et al. 2002). Картина участия PCNA в точной передаче наследственной информации дополняется еще и хромосомной сегрегацией. Для правильного распределения генетического материала между дочерними клетками сестринские хроматиды остаются связанными друг с другом посредством кольца когезии в течение всей G2-фазы и до наступления анафазы, когда это кольцо ликвидируются ферментами, давая возможность тубулиновому веретену растащить сестринские хромосомы по дочерним клеткам. Причем когезия сестринских хроматид образуется в S- фазе, сразу после репликации (Uhlmann and Nasmyth 1998), с помощью жизненно необходимого фактора - N-ацетилтрансферазы (ECO1). ECO1 напрямую связывается с PCNA через PIP-бокс, и это взаимодействие необходимо для его посадки на хроматин, образованию когезии и жизнеспособности дочерних клеток (Moldovan, Pfander et al. 2006; Moldovan, Pfander et al. 2007). Графическое изображение вышеописанных белок-белковых взаимодействий (Рис.42) позволяет получить общий вид процессов, происходящих 139 при репликации хроматина. Такой подход вообще характерен для нового направления биологии - биологии систем (Kohn, Aladjem et al. 2006). Это направление принципиально отличается от доминирующего до сего времени редукционисткого метода анализа биологических объектов тем, что ставит перед собой весьма амбициозную задачу выяснения общих, комплексных механизмов работы систем, состоящих из многих компонентов, поэтому его еще даже называют биологией 21 века (Vidal 2009). На Рис.42 номерами обозначены белок-белковые взаимодействия, имеющие место в процессе диссоциации и реассоциации хроматина при репликации ДНК. Объяснения обозначений различных взаимодействий даны на Рис.43. Номерами с 1 по 5 обозначены взаимодействия между гистонами внутри нуклеосом. 1 – взаимодействие между гистонами H3 и H4, образующих димер (Н3-Н4). 2 – взаимодействие этих димеров с образованием тетрамера (Н3-Н4)2, который затем связывается с ДНК (3). Два димера H2A-H2B (4) индивидуально связываются каждый с димером H3-H4 внутри связанного с ДНК тетрамера (H3-H4)2, образуя нуклеосому. Взаимодействие (5) показывает связывание димеров H2A-H2B с ДНК-связанными (Н3-H4)2 тетрамерами, а номер “2” на линии взаимодействия указывает на то, что два димера H2A-H2B связываются с одним (H3-H4)2 тетрамером. 6 - FACT (“facilitates chromatin transcription”) связывается с H2A-H2B димерами, вытесняя их из нуклеосом. Так как FACT связывается через MCM впереди репликативной вилки (см. далее взаимодействия 13 и 14, в данном случае предполагается, что FACT действует впереди репликативной вилки на предсуществующие нуклеосомы. 8 –11, оставшиеся тетрамеры (H3-H4)2 (2) могут остаться интактными, сохранив пост- 140 трансляционные модификации, и связываться случайным образом позади репликативной вилки, как с родительской, так и с дочерней нитью ДНК (8). Рис. 42. Карта белковых взаимодействий, образующих сеть, регулирующую репликацию хроматина и его эпигенетический статус, как описано в (Groth, Rocha et al. 2007; Kohn, Aladjem et al. 2008). Каждое взаимодействие имеет номер (объяснение в тексте). Карта взаимодействий является эвристической, как определено в (Kohn, Aladjem et al. 2006). Это означает, что разные взаимодействия и/или модификации отдельных молекул могут существовать одновременно. Интерактивная электронная версия данной карты может быть просмотрена на сайте http://discover.nci.nih.gov/mim/index.jsp. 141 Символы реакций нековалентное связывание (обратимое) ковалентное связывание ферментативный катализ разрыв связей H раскручивание спирали ДНК (хеликаза) p репликативный синтез ДНК (полимераза) взаимное замещение Символы событий стимулирование необходимость ингибирование цепь одних и тех- же взаимодействий Рис. 43. Символы молекулярных взаимодействий, используемые на рис. 42 (Kohn, Aladjem et al. 2008). Механизм же переноса димеров H3-H4 неизвестен. Последние данные говорят о том, что вновь синтезированные H3-H4 (9) инкорпорируются во вновь синтезированную ДНК как димеры, но не тетрамеры (Polo and Almouzni 2006). Димеры H3-H4 из диссоциированных нуклеосом могут быть перенесены случайным 142 образом на дочернюю нить ДНК (10) и могут образовывать нуклеосомы с вновь синтезированными димерами H3-H4 (11), которые входят в состав пула димеров, связанных с шаперонами (17), см далее. Этот механизм мог бы объяснить, как эпигенетическая информация о пост-трансляционных модификациях передается на вновь синтезированные коровые гистоны (Groth, Rocha et al. 2007). Далее два димера H2A-H2B (возможно освободившиеся от связывания с FACT) добавляются к тетрамерам (H3-H4)2 (12, 13) на дочерней нити, которые могут быть транспортированы как из предсуществующего (12), так и вновь синтезированого пула димеров H3-H4 (13). FACT также обеспечивает транспорт димеров H2A-H2B при транскрипции, облегчая работу РНК полимеразы (Belotserkovskaya and Reinberg 2004). FACT связывается с комплексом MCM хеликазы (14) (Gambus, Jones et al. 2006; Tan, Chien et al. 2006). MCM связывается с ДНК (15) и раскручивает ее (16) впереди ДНК полимеразы при репликации (Takahashi, Wigley et al. 2005) (Стрелка, обозначенная “H”, обозначает процесс раскручивания спирали). Таким образом, FACT может координировать транспорт гистонов H2A-H2B и раскручивание ДНК при репликации. CAF-1 (chromatin-assembly factor) связывается с комплексом вновь синтезированных гистонов H3-H4 и Asf-1 (17, а также далее 25a). Вновь синтезированные димеры H3-H4 далее могут быть переправлены из этого комплекса с шаперонами на вновь синтезированную ДНК (11, 18). Причем новые димеры H3H4 могут первыми связаться с синтезированной ДНК, а затем к ним присоединяются транспортированные димеры H3-H4 (не показано), или же этот процесс может идти в обратном порядке (то есть 10 следует за 11). Причем димеры Н3-Н4 содержат изоформу Н3.1 (Tagami, Ray-Gallet et al. 2004). Гидроксимочевина 143 блокирует продвижение репликативной вилки и в конечном итоге может остановить CAF-1–зависимый перенос гистонов. В этом случае Asf1 может взять на себя избыток вновь синтезированных цитозольных H3-H4 (порядок связывания CAF-1 и Asf1 с вновь синтезированными H3-H4, показанный на карте, является предположительным). CAF-1 связывается с PCNA (19) и тем самым направляется в места репликации ДНК (20, 21) (Taddei, Roche et al. 1999; Sporbert, Domaing et al. 2005) (стрелка, отмеченная “P”, указывает репликацию ДНК полимеразой на лидирующей нити, репликация запаздывающей нити не показана). CAF1 и PCNA остаются связанными на вновь синтезированной ДНК 20 мин, что соответствует репликации 20–40 кб ДНК, тем самым обеспечивая “окно возможности” для модификаций вновь синтезированного хроматина (Groth, Rocha et al. 2007). 22 – Связывание CAF-1 с PCNA зависит от фосфорилирования большой субъединицы CAF-1 (p150 у человека), катализируемого киназой Hsk1/Cdc7 - Dpf1/Dbf4 (Gerard, Koundrioukoff et al. 2006). Эта киназа помещена в заштрихованный зеленый квадрат, чтобы показать, что ее взаимодействия описаны более детально на другой карте (Aladjem, Pasa et al. 2004). (23–24) CAF-1 p150 содержит домен димеризации (23) (Moggs, Grandi et al. 2000; Gerard, Koundrioukoff et al. 2006). Причем димеризация конкурирует с PCNA за связывание его с мономером CAF-1 (19). Фосфорилирование CAF-1 p150, катализируемое Cdc-Dbf4, ингибирует димеризацию (24) (то есть стабилизирует p150 в конформации мономера) и тем самым стимулирует связывание мономера р150 CAF-1 с PCNA (Gerard, Koundrioukoff et al. 2006). 144 (25a– c) Asf1 (“anti-silencing function 1”) является очень консервативным шапероном, который связывается с растворимыми H3-H4 (25a). Asf1 может работать совместно с CAF-1 при сборке нуклеосом во время репликации (Tyler, Adams et al. 1999; Mello, Sillje et al. 2002; Groth, Ray-Gallet et al. 2005). Asf1 связывается с димерами H3-H4, предотвращая их переход в тетрамеры (25b и c) (English, Maluf et al. 2005; Mousson, Lautrette et al. 2005). Гипотетически можно предположить, что при отсутствии Asf1 вновь синтезированные немодифицированные тетрамеры (H3-H4)2 могут связываться с реплицированной ДНК с потерей информации о модификации гистонов. 26 - H3.3 не взаимодействует с CAF-1 и включается в хроматин как “замещающий гистон” независимо от репликации (Groth, Rocha et al. 2007). (27–29) DNMT1, ДНК метилтрансфераза, действующая на полуметилированные ЦфГ сайты и обеспечивающая симметричное Ц-метилирование (27, 28), связывается с PCNA (29) и тем самым рекрутируется на репликативную вилку (Leonhardt, Page et al. 1992; Chuang, Ian et al. 1997). Если CAF-1 действует по всему реплицируемому геному, то DNMT1 – в основном на эпигенетически молчащей ДНК и поддерживает это молчание посредством метилирования ЦфГ и Н3 (Groth, Rocha et al. 2007). Хотя DNMT1 является существенной метилазой, связывание DNMT1 с PCNA не является абсолютно необходимым для поддерживания метилирования ДНК в клетках человека (Spada, Haemmer et al. 2007). Правда здесь следует указать, что эти данные несколько расходятся с ранее упомянутой работой о критической роли тройственного комплекса Dnmt1/PCNA/UHRF1 в поддержании эпигенетического статуса хроматина (метилирования ДНК) (Hervouet, Lalier et al. 2010). 145 (30 –33) DNMT1 связывается с гистон H3 метилтрансферазой G9a (30) и EZH2 (31), тем самым рекрутируя их через PCNA на вновь синтезированную ДНК, где они могут метилировать H3 в новообразованном хроматине. G9a метилирует H3 по K9 (32) (Esteve, Chin et al. 2006), в то время, как EZH2 (a polycomb protein) метилирует H3 по K27 (33) (Vire, Brenner et al. 2006). Эти комплексы DNMT1 с Н3 метилтрансферазой координирующие могли состояние бы образовывать ДНК и бинарные метилирование Н3 модули при памяти, репликации эпигенетически молчащей ДНК (Esteve, Chin et al. 2006). (34–37) MBD1 связывается с метилированными ЦфГ в ДНК (34), он также взаимодействует с CAF1 (35), SETDB1 (36) и H3K9 метилтрансферазой (37) (Sarraf and Stancheva 2004). Комплекс CAF1-MBD1-SETDB1 поддерживает метилирование H3K9 и стабильное отключение определенных генов в пролиферирующих клетках (Groth, Rocha et al. 2007). SETDB1, который связан посредством MBD1 с метилированными ЦфГ впереди репликативной вилки возможно переходит на сайты метилированных ЦфГ позади вилки, где метилирует вновь образованные гистоны H3 (Sarraf and Stancheva 2004). (38–42) HP1 связывается с H3K9me3 в гетерохроматине или в стабильно отключенных генах (38a), где H3K9me3 маркирует репрессию генов (Maison and Almouzni 2004; Feldman, Gerson et al. 2006). HP1 связывается с CAF1 p150 напрямую (39) (Fujita, Watanabe et al. 2003). Также HP1 связывается с MBD1 (40) (Fujita, Watanabe et al. 2003) и H3K9 метилтрансферазой Suv39h (41, 42) (Aagaard, Laible et al. 1999). DNMT1 может связываться с HP1 напрямую (40a), тем самым помогая поддерживать метилированный статус ДНК в периферическом гетерохроматине а 146 также в отключенных генах (Fuks, Burgers et al. 2000; Lehnertz, Ueda et al. 2003; Esteve, Chin et al. 2006; Smallwood, Esteve et al. 2007). MBD1 (через HP1) связывается с предсуществующими метилированными нуклеосомными H3, Suv39h и SETDB1 в комплексе с MBD1 и / или HP1 могут затем метилировать вновь образованные Н3 в нуклеосомах, соответствующих сайтов. Эти действия производятся in trans (извне) (Рис.42) и обозначаются символом с разрывом (38b и c). (43– 45) Гистон деацетилаза (HDAC) связывается с PCNA (43) и тем самым рекрутируется на сайты репликации ДНК (20) (Milutinovic, Zhuang et al. 2002), где она деацетилирует лизины 4 и 12 на гистонах H4 (44). HDAC может также связываться с DNMT1 (45) (Fuks, Burgers et al. 2000; Rountree, Bachman et al. 2000). (46) Вновь синтезированные гистоновые димеры H3-H4 ацетилируются по K5 и K12 на H4 (Loyola, Bonaldi et al. 2006). Это ацетилирование осуществляется двухсубъединичной ацетил-трансферазой HAT1-RbAp46 и, возможно, необходимо для репарации на остановленных репликативных вилках (Barman, Takami et al. 2006). H4K5/K12 ацетилирование удаляется в течение 20–60 мин после репликации (Taddei, Roche et al. 1999). (47) MCM комплекс является хеликазой, играющей одну из ключевых ролей в репликации ДНК (подробно на сайте http://discover.nci.nih.gov/mim/. (48) PCNA является платформой для других белков, участвующих в репарации ДНК и контроле клеточного цикла. (49) Hsk1/Cdc7Dpf1/Dbf4 является киназным комплексом фосфорилирующим CAF-1 p150 (22). Эта киназа также фосфорилирует MCM комплекс и другие белки комплекса преинициации репликации ДНК (Masai, Taniyama et al. 2006; Chuang, Teixeira et al. 2009; Sheu and Stillman 2010). 147 7.1.5. Транскрипция (Table 9) Следует сказать, что белки-подмостки (scaffold proteins) вирусов и бактериофагов, образующие скользящие скрепки (sliding clamp), могут взаимодействовать с аппаратом транскрипции и регулировать экспрессию генов (Herendeen, Kassavetis et al. 1992). Однако не так много известно о возможном участии PCNA в траскрипции эукариот. Например, PCNA мог бы быть вовлечен в транскрипцию через взаимодействие и регуляцию таких ремоделирующих факторов, как фактор транскрипции синдрома Вильямса (BAZ1B_HUMAN) или p300 (EP300_HUMAN) (Hong and Chakravarti 2003; Poot, Bozhenok et al. 2004). Также было показано прямое взаимодействие PCNA с РНК полимеразой III (RPC1_NUMAN), а также некоторыми другими факторами транскрипции, например p53 (P53_HUMAN) (Таблица 9). 7.1.6. Другие разнообразные функции (Таблица 10) Удивительно то, что имеется большой список связывающихся с PCNA белков, которые вовлечены в клеточные функции, где роль PCNA пока еще трудно объяснить (Таблица 10). Определенно показано, что PCNA-зависимые процессы происходят в ядрах, ДНК или хроматине, где PCNA играет роль посадочной площадки для белков для координации многочисленных активностей. Однако функции большинства PCNA-связывающихся белков, представленных в Таблице 10, 148 Название белка/ синоним 1 Обозначение в базе Swiss-Prot EP300_HUMAN 2 BAZ1B_HUMAN 8.70 / 170902 3 MBB1A_HUMAN Bromodomain adjacent to zinc finger domain protein 1B / WilliamsBeuren syndrome chromosomal region 9 protein / Williams syndrome transcription factor / hWALP2 Myb-binding protein 1A 4 RPC1_YEAST RPC1_HUMAN DNA-directed RNA polymerase III subunit RPC1 8.50 / 162301 8.76 / 155748 5 TF65_HUMAN Transcription factor p65 / Nuclear factor NF-kappa-B p65 subunit 5.46 / 60219 6 YBOX1_HUMAN 9.87 / 35793 7 RUVB2_HUMAN 8 DHX9_HUMAN Nuclease sensitive element-binding protein 1 / Y-box-binding protein 1/ Ybox transcription factor / YB-1 / CCAAT-binding transcription factor I subunit A / CBF-A / Enhancer factor I subunit A / EFI-A / DNA-binding protein B / DBPB RuvB-like 2 / 48 kDa TATA box-binding protein-interacting protein / 48 kDa TBP-interacting protein / TIP49b / Repressing pontin 52 / Reptin 52 / 51 kDa erythrocyte cytosolic protein / ECP-51 / TIP60-associated protein 54-beta / TAP54-beta ATP-dependent RNA helicase A / Nuclear DNA helicase II / NDH II / DEAH box protein 9 9 T22D1_HUMAN 5.12 / 15679 10 NONO_HUMAN 11 DDX17_HUMAN TSC22 domain family protein 1 / Transforming growth factor beta-1-induced transcript 4 protein / Regulatory protein TSC-22 / TGFB-stimulated clone 22 homolog / Cerebral protein 2 Non-POU domain-containing octamer-binding protein / NonO protein / 54 kDa nuclear RNA- and DNA-binding protein / p54(nrb) / p54nrb / 55 kDa nuclear protein/ NMT55 / DNA-binding p52/p100 complex, 52 kDa subunit Probable ATP-dependent RNA helicase DDX17 / DEAD box protein 17 / RNA-dependent helicase p72 / DEAD box protein p72 12 TCP4_HUMAN Activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15 / SUB1 homolog / Positive cofactor 4 / PC4 / p14 9.60 / 14395 13 P53_HUMAN Cellular tumor antigen p53 / Tumor suppressor p53 / Phosphoprotein p53 / Antigen NY-CO-13 6.33 / 43653 # Histone acetyltransferase p300 / E1A-associated protein p300 Теоретические pI/ Mw 8.78 / 264143 9.34 / 148855 Ссылки (Hasan, Hassa et al. 2001) (Poot, Bozhenok et al. 2004) (Ohta, Shiomi et al. 2002) (Ho, Gruhler et al. 2002) (Bouwmees ter, Bauch et al. 2004) (Ise, Nagatani et al. 1999) 5.49 / 51025 (Ohta, Shiomi et al. 2002) 6.41 / 140958 (Loor, Zhang et al. 1997; Ohta, Shiomi et al. 2002) (Ewing, Chu et al. 2007) (Ohta, Shiomi et al. 2002) (Ohta, Shiomi et al. 2002) (Rual, Venkatesan et al. 2005) (Banks, Wu et al. 2006) 9.01 / 54231 8.82 / 72371 Таблица 9. PCNA-связывающиеся белки, участвующие в транскрипции. 149 Название белка/ синоним 1 Обозначение в базе Swiss-Prot ANXA2_HUMAN 2 41_HUMAN Protein 4.1 / Band 4.1 / P4.1 / EPB4.1 / 4.1R 5.42 / 97016 3 TC1D1_HUMAN Tctex1 domain-containing protein 1 9.04 / 20729 4 EF1A2_HUMAN Elongation factor 1-alpha 2 / EF-1-alpha-2/ Eukaryotic elongation factor 1 A-2 / eEF1A-2 Statin-S1 9.11 / 50470 5 RRMJ1_HUMAN Putative ribosomal RNA methyltransferase 1 / RNA (uridine-2'-O-)-methyltransferase 5.42 / 36079 6 EIF1B_HUMAN Eukaryotic translation initiation factor 1b / eIF1b / Protein translation factor SUI1 homolog GC20 6.82 / 12823 7 CBS_YEAST CBS_HUMAN Cystathionine beta-synthase / Serine sulfhydrase / Betathionase 6.25 / 56021 6.20 / 60586 8 KIN20_CAEEL KC1D_HUMAN Casein kinase I isoform delta 8.09 / 56808 9.77 / 47330 9 CSK22_YEAST CSK22_HUMAN Casein kinase II subunit alpha / CK II 8.68 / 39403 8.65 / 41213 10 11 TCOF_HUMAN KCNA2_HUMAN 9.06 / 144312 4.78 / 56716 12 GLYC_HUMAN Treacle protein / Treacher Collins syndrome protein Potassium voltage-gated channel subfamily A member 2 / Voltage-gated potassium channel subunit / Kv1.2 / HBK5 / NGK1 / HUKIV Serine hydroxymethyltransferase, cytosolic / Serine methylase / Glycine hydroxymethyltransferase / SHMT 13 G3P_HUMAN Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase / GAPDH 8.57 / 36053 14 Q9V9R2_DROME CUL2_HUMAN CG1512-PA, isoform A Cullin-2 / CUL-2 drosophila 6.46 / 87391 15 TRAF6_HUMAN TNF receptor-associated factor 6 / Interleukin-1 signal transducer / RING finger protein 85 6.00 / 59573 16 CRCM_HUMAN Colorectal mutant cancer protein / Protein MCC 5.40 / 93055 17 Q13537_HUMAN Putative transposase / Tigger / Pogo 8.89 / 51666 18 1C04_HUMAN HLA class I histocompatibility antigen, Cw-4 alpha chain [Precursor] / MHC class I antigen Cw*4 6.04 / 40994 19 IKKE_HUMAN 7.91 / 80462 20 1B08_HUMAN Inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase subunit epsilon / I kappa-B kinase epsilon / IkBKE / IKK-epsilon / IKK-E / Inducible I kappa-B kinase / IKK-i HLA class I histocompatibility antigen, B-8 alpha chain [Precursor] / MHC class I antigen B*8 # 21 Annexin A2 / Annexin-2 / Annexin II / Lipocortin II / Calpactin I heavy chain / Chromobindin-8 / p36 / Protein I / Placental anticoagulant protein IV / PAP-IV MHC Class II proteins AA65-79 NIAVLKHNLNIVIKR Теоретическ ие pI/ Mw 7.57 / 38604 7.61 / 53082 6.46 / 86983 5.46 / 40330 Ссылки Функция (Rual, Venkatesa n et al. 2005) (Ewing, Chu et al. 2007) (Giot, Bader et al. 2003) (Toueille, Saint-Jean et al. 2007) (Ewing, Chu et al. 2007) (Ewing, Chu et al. 2007) (Ho, Gruhler et al. 2002) (Boulton, Gartner et al. 2002) (Krogan, Cagney et al. 2006) [151] (Giot, Bader et al. 2003) (Boulton, Gartner et al. 2002) (Takasaki, Kaneda et al. 2004) (Stanyon, Liu et al. 2004) (Ewing, Chu et al. 2007) (Ewing, Chu et al. 2007) (Warbrick , Heatherin gton et al. 1998) (Ewing, Chu et al. 2007) (Ewing, Chu et al. 2007) (Ewing, Chu et al. 2007) (Ling, Kamangar et al. 2000) мембрана мембрана цитоскелет Трансляция, цитоскелет/ Миграция клеток трансляция трансляция Метаболизм цистеина circadian clock Wnt сигнальн ые пути транспорт транспорт ионов Взаимный переход S и G гликолиз протеолиз протеолиз рак транспозиция Иммунный ответ Иммунный ответ Иммунный ответ Иммунный ответ 150 Таблица 10. PCNA-связывающиеся белки, участвующие в разнообразных процессах. являются цитоплазматическими или мембранными. Это указывает на то, что существуют еще какие-то до сих пор не открытые функции PCNA. Одна из этих функций может быть иммунологической. В этой связи интересно отметить, что хотя PCNA изначально был обнаружен более 30 лет назад как антиген при заболеваниях системной красной волчанкой (Miyachi, Fritzler et al. 1978), механизм, связывающий PCNA и иммунный ответ, остается непонятным. Было высказано предположение, что PCNA выставляет себя для иммунной системы в виде специфической мишени или сенсора (Ling, Kamangar et al. 2000). Этим можно объяснить взаимодействие PCNA и белков гистосовместимости 1 и 2 класса, HLA и MHC соответственно (Ling, Kamangar et al. 2000; Ewing, Chu et al. 2007). В случае с мембранными и цитоскелетными белками возникает искушение предположить, что взаимодействие PCNA с некоторыми из них связано с транспортом. PCNA не содержит никаких сигналов ядерной локализации (nuclear localization signal, NLS), является очень кислым белком, что не характерно для ядерных белков, но локализуется обычно в ядре. По видимому, другие механизмы, не регулируемые по классической схеме импортином альфа и импортином бета, отвечают за импорт PCNA в ядро. Взаимодействие PCNA с факторами трансляции (EF1A, E1F1B) или ферментами метаболизма (G3P, бета-тионаза, серин-метилаза) указывает как на возможность дополнительных функций этих белков, так и на участие PCNA в метаболических процессах. Например, EF1A помимо того, что является основным фактором 151 трансляции, возможно, является также компонентом убиквитин-зависимой системы протеолиза (Gonen, Smith et al. 1994), которая вовлечена в систему баланса между моно- и поли-убиквитинированной формами PCNA (Toueille, Saint-Jean et al. 2007). PCNA регулируется через убиквитинирование и SUMO-илирование, и он сам также может управлять убиквитинированием и протеолизом других белков, таких, например, как Cdt1 (Arias and Walter 2006). Способность PCNA взаимодействовать с такими протеолитическими ферментами, как куллин-2 (CUL2_HUMAN), фактор 6, ассоциированный с TNF (TRAF6_HUMAN), или E3 убиквитин-протеин лигаза Mdm2 (MDM2_HUMAN) (Banks, Wu et al. 2006), дополняет картину участия PCNA в протеолизе других белков. 7.1.7. Гликолиз Как следует из названия (деградация глюкозы), гликолиз - это метаболическая цепь химических реакций, превращающая глюкозу (C6H12O6) в пируват, CH3COCOO− + H+ (Voet D 2004). Свободная энергия, освобождаемая в этом процессе, используется для образования высокоэнергетичных молекул АТФ и NADH. Гликолиз включает в себя 10 последовательных реакций, катализируемых 10 ферментами, и 10 промежуточных продуктов (Voet D 2004). Кроме того, многие другие метаболические пути выходят или наоборот входят в основной путь гликолитических реакций. Так, большинство моносахаридов, таких например, как фруктоза или галактоза, также может быть переведено в промежуточные продукты гликолитических реакций. А сами промежуточные продукты могут также быть использованы для других целей помимо гликолиза. Так, дигидроксиацетон фосфат 152 может быть использован для получения глицерина и синтеза жиров (Voet D 2004). Гликолиз является универсальным энергетическим процессом, присутствующим практически у всех организмов, как аэробов, так и анаэробов, что указывает на то, что он является наиболее древним метаболическим путем, возникшим еще до появления атмосферного кислорода (Romano and Conway 1996). Суммарно гликолиз можно изобразить следующим образом: глюкоза+2 NAD+ + 2 АДФ + 2 Pi → 2 пируват + 2 NADH + 2 H+ + 2 ATФ + 2 H2O То есть одна молекула глюкозы в конечном итоге преобразуется в 2 молекулы пирувата. Причем на первых трех стадиях гликолиза (энергоемких) 2 молекулы АТФ расходуются, зато 4 молекулы АТФ производятся на последних, энергопродуцирующих, стадиях, что дает чистый выход в 2 молекулы АТФ на каждую молекулу глюкозы. Кроме того, еще и две молекулы NADH образуются в процессе гликолиза. Более детально последовательность реакций гликолиза показана на Рис.44. Для большинства животных и растительных клеток гликолиз является всего лишь предварительным этапом в процессе трансформации знергии. В этих клетках пируват, образованный при гликолизе, немедленно транспортируется в митохондрии, где он преобразуется в АТФ посредством кислород-зависимого Понижение процесса электронного окислительного потенциала на фосфорилирования поверхностях (Рис.45). митохондриальных мембран, которое при этом происходит, используется АТФ-синтетазой, которая инкорпорирована в мембраны, для высокоэффективного производства АТФ. 153 глюкоза АТФ Стадия №1 гексокиназа Энергоемкие реакции Стадия №2 фосфоглюкоизомераза Стадия №3 фосфофруктокиназа АТФ Фруктозобифосфат Расщепление 6-углеродного сахара на 2 3-углеродного сахара Стадия №4 альдолаза Стадия №5 триозфосфатизомераза Стадия №6 G3P NADH NADH Стадия №7 PGK АТФ АТФ ЭнергоСтадия №8 продуцирующие PGM реакции Стадия №9 энолаза Стадия №10 пируват киназа АТФ АТФ пируват пируват Рис. 44. Схематичное изображение 10 последовательных стадий гликолиза. 154 Общий выход при этом достигает 38 молекул АТФ на одну исходную молекулу глюкозы (Voet D 2004). Злокачественные клетки в быстрорастущих опухолях обычно отличаются от нормальных клеток резко повышенным (до 200 раз) уровнем гликолиза. Это явление, впервые открытое еще в 1924 году Отто Варбургом (Otto Warburg), и называется эффектом Варбурга (Warburg O 1924). Варбург в свое время высказал предположение, названное опять же гипотезой Варбурга, что причиной рака как раз и является изменение клеточного метаболизма, вызванное повреждениями митохондрий (Warburg 1956). Однако до сего времени единого мнения в научном и медицинском сообществе в этом вопросе нет, тем более что повреждений митохондрий в раковых клетках обнаружено не было. Тем не менее эти митохондрии отличаются все-таки от митохондрий нормальных клеток повышенным электронным потенциалом (отрицательным зарядом). Много теорий было предложено для объяснения эффекта Варбурга (Zu and Guppy 2004; Vander Heiden, Cantley et al. 2009). Например одна из них предполагает, что постоянный метаболизм глюкозы в лактат даже в аэробных условиях является адаптацией к периодическому возникновению гипоксии в предраковых участках. В свою очередь повышенный гликолиз в этих областях приводит к увеличению кислотности и необходимости клеточной адаптации к таким токсичным условиям. Из-за этого клетки с повышенным уровнем гликолиза и кислотоустойчивостью получают преимущество, что ведет к неконтролируемой пролиферации и инвазивности 155 Н+ глюкоза O2 O2 глюкоза O2 O2 Н+ O2 HCO3 лактат 36 АТФ глюкоза транспортер глюкозы лактат 2 АТФ глюкоза гликолиз пируват Н+ Н+ Рис.45. Метаболизм глюкозы у млекопитающих. По кровеносным сосудам глюкоза и кислород (с помощью гемоглобина эритроцитов) доставляются к тканям, где они диффундируют к клеткам. Далее глюкоза переносится в клетки специфическими транспортерами и последовательно проходит через реакции гликолиза, начиная с фосфорилирования гексокиназой и образования глюкозо-6фосфата и кончая пируватом. В присутствии кислорода пируват окисляется до НСО3, дополнительно продуцируя 36 молекул АТФ на одну молекулу глюкозы. В отсутствии кислорода пируват восстанавливается до лактата, который затем экспортируется из клетки. Причем в обоих процессах образуются протоны, которые вызывают окисление внеклеточного пространства. 156 (Gatenby and Gillies 2007). Основная теория считает повышенный гликолиз не причиной, а последствием ракового роста (Vander Heiden, Cantley et al. 2009). Тем не менее высокий уровень гликолиза в злокачественных опухолях имеет очень важное практическое применение. Введение в организм радиоактивно меченого субстрата гексокиназы, 2-18F-2-дезоксиглюкозы (FDG), дает возможность диагностировать и контролировать опухоли в процессе лечения на позитронном томографе (РЕТ) positron emission tomography (PET) (Phelps, Hoffman et al. 1975; Ter-Pogossian, Phelps et al. 1975; Young, Baum et al. 1999). Кроме того, перспективным выглядит поиск методов блокировки гликолиза или активации окислительного фосфорилирования с целью лечения опухолей (Xu, Pelicano et al. 2005; Schulz, Thierbach et al. 2006; Gatenby and Gillies 2007). 7.1.8. Взаимодействующие с PCNA белки, обнаруженные Фар-вестерном Подход с использованием Фар-Вестерна в комбинации с 2DE выявил многочисленные пятна, представляющие белки в нормальных и раковых клетках, которые взаимодействуют с PCNA (Рис.46,47) (Naryzhny and Lee 2010). Чтобы идентифицировать эти белки, каждый образец был подвергнут двумерному электрофорезу в дубликатах. После разделения один гель был окрашен Кумасси R350, а другой переведен на PVDF мембрану и обработан в соответствии с протоколом Фар-Вестерн (см. Материалы и Методы). Совмещая пленку и окрашенную мембрану, пятна, соответствующие сигналам на Фар-Вестерн были выявлены в геле и самые 157 A B K2C7 K2C7 ENO EF1A ENOA SAHH RSSA EF1A SAHH PGK PGK1 RSSA ALDOA ALDOA G3P G3P ANXA2 PCNA ANXA2 LDHA MDHM LDHA PCNA MDHM CAH2 PRDX6 PGAM1 TIPS PRDX6 PPIA CAH2 TPIS PPIA Рис. 46. PCNA-связывающие белки, обнаруженные Фар-вестерном в нормальных (HMEC) клетках. (A) Клетки лизировали в буфере для образца, белки разделяли в 2DE, переводили на мембрану Immobilon-P, ренатурировали, инкубировали с PCNA, и PCNA-связывающие белки детектировали антителами к PCNA, PC-10 (Материалы и методы). (B) Белки, разделенные в 2DE, окрашивали Кумасси R350. Пятна, соответствующие сигналам на мембране, определяли, вырезали кусочки геля и белки идентифицировали процедурой белковой дактилоскопии (PMF). мажорные из них были идентифицированы с помощью белковой дактилоскопии (PMF), используя обработку трипсином (см. Материалы и Методы). Следует заметить, что идентификация и менее мажорных белков возможна таким способом, 158 A B K2C7 K2C7 EF1 ENO EF1 ENO RSSA PGK hRNP PGK RSSA ALDOA ALDOA G3P ANXA2 G3P ANXA2 PCNA LDHA LDHA MDHM PCNA MDHM PRDX6 TIPS TIPS PRDX6 COF1 COF1 PPIA PPIA Рис.47. PCNA-связывающие белки, обнаруженные Фар-Вестерном в раковых (MDA-MB468) клетках. Процедуры и обработки аналогичны, описанным в подписях к Рис.46. но требует повышения чувствительности детектирования. Удалось идентифицировать более 16 взаимодействующих с PCNA белков, причем уровень экспрессии некоторых из них отличается в нормальных и раковых клетках (Табл.11). Некоторые из этих белков, такие как аннексин 2, GAPDH (G3Р), EF1A2, уже ранее фигурировали в качестве связывающихся с PCNA белков (Takasaki, Kaneda et al. 2004; Rual, Venkatesan et al. 2005; Dall'Era, Oudes et al. 2007; Toueille, Saint-Jean et al. 2007), но многие другие - нет. Наиболее сильно уровень экспрессии в раковых клетках MDA-МВ468, по сравнению с нормальными клетками, HMEC, увеличен у EF1A2, чуть менее у пептидил-пролил-цис-транс изомеразы А, митохондриальной малат дегидрогеназы и пероксиредоксина-6. EF1A2 является потенциальным онкопротеином, и информация о том, что этот белок может 159 взаимодействовать с PCNA, уже была в нескольких публикациях (Tomlinson, Newbery et al. 2005; Dall'Era, Oudes et al. 2007; Toueille, Saint-Jean et al. 2007). № Название Функция 1 ALDOA_HUMAN (Fructose-bisphosphate aldolase A) Альдолаза TPIS_HUMAN (Triosephosphate isomerase) гликолиз, стадия #4 Экспрессия при раке Не меняется гликолиз, стадия #5 Не меняется гликолиз, стадия #6 Не меняется гликолиз, стадия #7 Не меняется гликолиз, стадия #8 Не меняется гликолиз, стадия #9 Не меняется гликолиз, стадия #11 Метаболизм Не меняется Биосинтез белка, миграция клеток Структура белка Повышенная 2 3 Триосефосфат изомераза G3P_HUMAN (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа 4 PGK1_HUMAN (Phosphoglycerate kinase 1) 5 PGAM1_HUMAN (Phosphoglycerate mutase 1) 6 ENOA_HUMAN (Alpha-enolase А) 7 LDHA_HUMAN (L-lactate dehydrogenase A chain) Лактат дегидрогеназа MDHM_HUMAN (Malate dehydrogenase, mitochondrial precursor) 8 Фосфоглицерат киназа 1 Фосфоглицерат мутаза 1 Альфа энолаза А Не меняется Малат дегидрогеназа 9 EF1A2_HUMAN (Elongation factor 1-alpha 2) 10 PPIA_HUMAN (Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A) Пептидил-пролил цис транс Фактор элонгации 1 альфа 2 Повышенная изомераза А 11 PRDX6_HUMAN (Peroxiredoxin-6) 12 CAH2_HUMAN (Carbonic anhydrase 2) 13 RSSA_HUMAN (40S ribosomal protein SA) 14 K2C7_HUMAN (Keratin, type II cytoskeletal 7) 15 HNRH1_HUMAN (Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H) Гетерогенный Пероксиредоксин 6 Угольная ангидраза 2 Белок SA из 40S рибосом Кератин, тип 2 из цитоскелета (7) ядерный рибонуклеопротеин Н ОкислительноПовышенная восстановительные реакции метаболизм Не меняется Синтез белка, рецептор, передача сигналов Цитоскелет, клеточный рост, дифференцировка Сплайсинг и процессинг мРНК Не меняется Пониженная Не меняется Физиология Пониженная Аннексин А2 мембран Таблица 11. PCNA- связывающиеся белки, обнаруженные Фар Вестерном. 16 ANXA2_HUMAN (Annexin A2) 160 Причем известны две формы факторов элонгации eEF1A, eEF1A1 и eEF1A2, последовательности которых как нуклеотидная, так и аминокислотная, гомологичны более чем на 90%. Эти ГТФ-связывающие белки взаимодействуют с аминоацил-тРНК и переносят его на А-сайт рибосомы на стадии элонгации биосинтеза белка. Вдобавок eEF1A2 может связываться и стимулировать липид киназную активность фосфатидилинозитол 4-киназы бета (phosphatidylinositol 4kinase betа), белка, катализирующего синтез фосфатидилинозитол 4-фосфата из фосфатидилинозитола. Также EF1A2 может активировать серин треониновую киназу АКТ, стимулировать ремоделирование актина и увеличивать скорость клеточной инвазивности и миграции in vitro. Инактивация EF1A2 у мышей приводит к иммунодефициту, нейромышечным нарушениям и в конечном итоге к смерти через 30 дней. Этот белок подвержен многочисленным модификациям, в том числе ацетилированию, метилированию и фосфорилированию. Обнаружена его связь с процессами опухолеобразования и онкогенеза (Anand, Murthy et al. 2002; Kulkarni, Turbin et al. 2007). Так, уровень EF1A2 повышен в большинстве (60%) опухолей груди, в 30% опухолей яичника и 40% опухолей легкого. Другой известный белок, пептидил-пролил-цис-транс изомераза А (PPIA_HUMAN), также имеет повышенный уровень экспрессии в большинстве опухолевых тканей и является хорошим независимым прогностическим маркером рака простаты (Gothel and Marahiel 1999; Wulf, Ryo et al. 2001; Ayala, Wang et al. 2003; Bao, Kimzey et al. 2004). Уровень митохондриальной малат дегидрогеназы также значительно увеличен в опухолях груди (Balinsky, Platz et al. 1984), а повышенная экспрессия пероксиредоксина-6 возможно связана с прогрессией метастазов рака груди (Chang, 161 Li et al. 2007). Среди белков с пониженной экспрессией аннексин А2 является самым заметным. Он очень сильно экспрессирован в нормальных и едва заметен в раковых клетках. Этот белок выполняет важные функции в физиологии мембран, и при раке часто его функции нарушены (Pena-Alonso, Rodrigo et al. 2008). О его способности взаимодействовать с PCNA ранее уже было сообщение (Rual, Venkatesan et al. 2005). Два других белка с пониженной экспрессией при раке – это карбоновая ангидраза 2 и кератин 7 (тип 2). Карбоновые ангидразы, которых примерно 14, катализируют гидратацию карбодиоксида. Среди них карбоновая ангидраза 2 наиболее изучена. Из-за того, что карбоновые ангидразы вовлечены во многие патологические процессы, включая рак, они уже давно являются объектом для разработок лекарственных препаратов (Potter and Harris 2003). Кератины являются хорошо известными белками из группы промежуточных филаментов. Как и актиновые, кератиновые филаменты гибкие, но образуют прочный цитоскелет. Цитокератины типа 2 специфически экспрессируются в простом эпителии, покрывающем внутреннюю поверхность органов, желез внутренней секреции и кровеносных сосудов. А кератин 7 (тип 2) или K2C7 в дополнение к участию в цитоскелете может также функционировать в виде мономера. В этом случае он известен под названием сарколектин (SCL) и является фактором роста. Сарколектин обнаружен во многих тканях, функционирует в координации с интерферонами (IFN) и влияет на клеточный рост и дифференцировку (Kaba, Jiang et al. 1999). Среди PCNA-связывающихся белков (Табл.11) с одинаковым уровнем экспрессии в нормальных и раковых клетках присутствует и рибосомальный белок SA (RSSA) из 40S субчастиц. Это тоже многофункциональный белок. В 162 дополнение к рибосомальной функции он участвует в клеточной адгезии и активации сигнальных каскадов. RSSA также является рецептором для многих других лигандов, таких как прионовые белки, вирусы и бактерии (Terranova, Rao et al. 1983; Kim, Chung et al. 2005). Особенно интересно то, что шесть белков в списке взаимодействующих с PCNA белков, обнаруженных Фар-Вестерном, являются гликолитическими ферментами (Табл.11). Естественным образом сразу возникает предположение об участии PCNA в гликолизе. Для получения большей информации в пользу этого предположения, были проведены дополнительные эксперименты. Сначала взаимодействие ферментов гликолиза с PCNA было подтверждено с использованием чистых белков и опять же Фар-Вестерна, но в комбинации с одномерным электрофорезом (Рис.48). Шесть из 10 ферментов, участвующих в гликолизе, фруктозо-бифосфат альдолаза А, триосефосфат изомераза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, фосфоглицерат киназа 1, фосфоглицерат мутаза 1, альфа-энолаза подтвердили свое взаимодействие с PCNA. Интересно то, что эти ферменты отвечают за 6 последовательных стадий (с 4 по 9) гликолиза. В дополнение, взаимодействие некоторых из них с PCNA было подтверждено в экспериментах с использованием иммуно-осаждения и гель фильтрации (Рис.49). Здесь следует отметить, что в свое время было предложено множество гипотез и схем, объясняющих пространственную и временную организацию реакций гликолиза, который в большинстве клеток проходит в цитоплазме (Srivastava and Bernhard 1986; Kurganov and Liubarev 1988; Ovadi 1988; Ryazanov 1988). Много усилий было потрачено также на обнаружение и выделение 163 гликолизного комплекса. Была даже предложена теоретическая модель пространственной организации такого комплекса (Kurganov and Liubarev 1988). Рис. 48. Взаимодействие гликолитических белков с PCNA, детектируемое ФарВестерном (Naryzhny and Lee 2010). (A) Гель, обработанный по протоколу ФарВестерна (см. Материалы и методы), (B) Гель, окрашенный Кумасси R350. 1 – гексокиназа (HK), 2 – глюкозо-6-фосфат изомераза (G6PI), 3- 6-фосфофруктокиназа (PFK), 4 – фруктозо-бифосфат альдолаза A (ALDOA), 5 – триосефосфат изомераза (TPIS), 6 – глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (G3P), 7 – фосфоглицерат киназа (PGK), 8 – фосфоглицерат мутаза 1 (PGAM1), 9 – альфа-энолаза (ENOA), 10 – пируват киназа, 11 – пируват киназа (PK) и лактат дегидрогеназа (LDHA). Однако убедительных доказательств его существования все еще не представлено. Трудность состоит в том, что эти модели очень сложно протестировать экспериментально из-за большого числа компонентов и их слабого взаимодействия друг с другом. Вполне возможно, что и PCNA также мог бы принимать участие в 164 гликолизе за счет одновременного взаимодействия с разными белками- ферментами, обеспечивая эффективный Рис. 49. Со-иммуноосаждение PCNA с альдолазой и G3P (Naryzhny and Lee 2010). Очищенный PCNA человека (10 мкг/мл), альдолазу кролика (100 мкг/мл) и кроличий G3P (100 мкг/мл) смешивали вместе в 200 мкл PBS, инкубировали 1 час при 4ºC и осаждали антителами к PCNA, коньюгированными с агарозными шариками (PC10-AC). Белки, связавшиеся с шариками, разделяли в 2DE и окрашивали Кумасси R350. переход продукт-субстрат. Структурная организация PCNA идеально подходит для этой роли. Как было ранее описано, являясь двойным кольцом, он может одновременно разместить на себе разные белки-партнеры и играть роль координирующей станции для репликации ДНК, репарации ДНК и ремоделирования хроматина (Naryzhny, Zhao et al. 2005; Lee and Naryzhny 2006; Naryzhny 2007). Эксперименты с гликолитическими ферментами in vitro 165 показывают, что присутствие PCNA также может стимулировать их работу (см. далее главу 7.1.10). 7.1.9. Локализация PCNA Процессы гликолиза идут в цитоплазме и соответственно гликолитические ферменты локализованы в основном в цитоплазме (Alberts B 2004 ). С другой стороны, PCNA, как даже следует из его названия, считается ядерным белком, и если имеется функциональный вклад PCNA в гликолиз, то, по-видимому, это должно происходить в цитоплазме. Чтобы прояснить данную ситуацию, аспект локализации PCNA был проанализирован более детально, в разных клетках и при различных условиях. Оказалось, что хотя PCNA и является в основном ядерным белком, значительная часть его все таки может присутствовать и в цитоплазме (Рис.50). Используя GFPPCNA вектор, можно получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие GFPPCNA. Что любопытно, локализация GFP-PCNA в этих линиях может быть очень разной, и в основном ядерной, и в основном цитоплазматической. Более того, распределение GFP-PCNA и ферментов гликолиза может быть очень похожим (Рис.50). Таким образом, следует отметить, что цитоплазматическая часть популяции PCNA может быть очень значительной и, по-видимому, обладает некими, еще неизвестными нам, функциями. Однако, по-видимому из-за того, что роль PCNA в процессах, происходящих в хроматине (ДНК репликация, ДНК репарация и другие) хорошо известна и интенсивно изучается, цитоплазматическая часть PCNA до сего времени рассматривалась в лучшем случае как артефакт, несмотря на то, что имеется много публикаций касающихся цитоплазматической локализации PCNA (Vriz, 166 Lemaitre et al. 1992; Tanno and Taguchi 1999; Grzanka, Skok et al. 2000; Ino and Chiba 2000; Morrow, Tung et al. 2004). В некоторых клеточных линиях, например в CD4+ T, PCNA вообще локализован в основном в цитоплазме (Morrow, Tung et al. 2004). Причем, что весьма любопытно, распределение PCNA в этих клетках очень напоминает распределение его в клетках СНО при экспрессии в них GFP-PCNA (Рис.50а,С). A B C D E F 167 Рис. 50a. Ядерная и цитоплазматическая локализация PCNA в клетках СНО. (A) Клетки, окрашенные антителами к PCNA, PC10. (B) Клетки, стабильно экспрессирующие GFP-PCNA с предпочтительно ядерной локализацией. (C) Клетки, стабильно экспрессирующие GFP-PCNA с предпочтительно цитоплазматической локализацией. (D) Клетки, экспрессирующие GFP-PCNA, были иммуноокрашены антителами к энолазе (E). (F) – совмещенная картинка. Фотографии сделаны на флуоресцентном микроскопе Zeiss Axiovert 100 (А,В.С – объектив 40, увеличение x200, D,E,F – объектив 63, увеличение x315, (см. Материалы и Методы). Рис. 50b. Ядерная и цитоплазматическая локализация PCNA в клетках человека (Naryzhny and Lee 2010). (А) Клетки MDA-MB468 и 184B5 были иммуноокрашены антителами к PCNA (окраска вторичными мечеными родамином куриными антимышиными антителами) и антителами к энолазе (окраска вторичными мечеными FITC козьими анти-кроличьими антителами). Белые стрелки указывают колокализацию PCNA и энолазы. Зеленые – присутствие энолазы и отсутствие PCNA. На вставке – увеличенная клетка справа внизу. (В) Клетки HEK 293, экспрессирующие GFP-PCNA с предпочтительно ядерной (слева) или цитоплазматической (справа) локализацией были окрашены антителами к G3P (cлева) или к альдолазе (справа). В обоих случаях использовались вторичные антитела меченые родамином. Микроскопия проводилась так же, как в случае с Рис.50а. 168 7.1.10. Активность ферментов гликолиза и PCNA Чтобы изучить возможный вклад взаимодействия PCNA с гликолитическими ферментами, активность некоторых из них была протестирована in vitro. (Рис.51). Например, была измерена активность альдолазы, используя ферментативный набор, содержащий триосефосфат изомеразу и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (G3Р). Оказалось, что присутствие PCNA стимулирует эту активность (Рис.51) (Naryzhny and Lee 2010). В данном случае мы имеем подражание ситуации с гликолизом in vivo, где вышеуказанные ферменты последовательно катализируют стадии гликолиза №4, №5, №6. А экстракт CHO клеток, стабильно экспрессирующих цитоплазматический GFP-PCNA, показывает более высокую активность G3Р по сравнению с таким же экстрактом, полученным из контрольных CHO клеток (Рис.52). В связи с тем, что кроме ферментов гликолиза имеется еще много других, взаимодействующих с PCNA, белков, которые в основном локализованы в цитоплазме, проявляется функциональная значимость присутствия в PCNA цитоплазме. Эти функции могут быть связаны с передачей внутриклеточных сигналов и цитоскелетом через взаимодействие с такими белками, как аннексин А2, сарколектин, фактор элонгации EF1A2, пептидил-пролил цистранс изомераза или рибосомальный белок SA. Другая область – метаболические пути и взаимодействие с такими белками, как малат дегидрогеназа, пероксиредоксин 6, карбоновая ангидраза 2, альдолаза А, триосефосфат изомераза, GAPDH (G3P), фосфоглицерат киназа 1, фосфоглицерат мутаза 1 и альфа энолаза. Большая часть этих метаболических ферментов 169 Рис. 51. Реакции гликолиза могут стимулироваться PCNA in vitro. Присутствие PCNA в системе ферментов, содержащих альдолазу (ALDOA), триосефосфатизомеразу (TPIS) и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (G3P), представляющих стадии №4, №5, №6 гликолиза, заметно увеличивает скорость реакции (Naryzhny and Lee 2010). Альдолазную реакцию проводили после пре-инкубации (10 min, 4ºC) компонентов реакции с разными количествами PCNA (0 – нет PCNA, 1 – 2.5 мкг/мл, 2 – 5 мкг/мл, 3 – 10 мкг/мл). Использовали калорометрический набор от Caldon Biotech, Inc (Carsbad, CA, USA), содержащий TPIS, G3P, NADH и альдолазу (1мкг/мл). представляет гликолиз и соответственно представляется весьма логичным предположение об участии PCNA в этом процессе (Рис.53). Если в случае репликации хроматина роль PCNA состоит в координации различных процессов, происходящих в одном месте (на репликативной вилке ДНК), в частности синтеза ДНК и сборки хроматина (Рис.41) (Naryzhny 2007), то в случае гликолиза координирующая роль PCNA может заключаться в обеспечении более эффективного прохождения последовательного каскада реакций. При этом за счет локализации ферментов этого каскада на PCNA, продукт одной реакции может немедленно использоваться как субстрат в следующей реакции (Рис.53). 170 A B GFP-PCNA G3P PCNA 1 2 3 4 Рис. 52. Повышенное содержание PCNA возможно ускоряет клеточный гликолиз (Naryzhny and Lee 2010). (A) Измеряли реакцию, катализируемую G3P, в экстрактах HEK клеток и в экстрактах HEK клеток, стабильно экспрессирующих GFP-PCNA. Активность G3P определяли по поглощению при 560 нм, используя набор реагентов, KDalert kit, и следуя инструкциям производителя (Ambion Inc, Austin, TX, USA). (B) Следует отметить, что уровень G3P в таких клетках одинаков (дорожки 3,4 – G3P), зато общее содержание PCNA за счет экспрессии GFP-PCNA повышено в ~1.5 раза (дорожки 3.4 – PCNA и GFP-PCNA). На дорожки 1,3 наносили экстракт клеток НЕК 293, а на дорожки 2,4 – экстракт клеток НЕК 293, экспрессирующих GFP-PCNA. 1,2 – окрашивание Кумасси R350, 3,4 – иммуноокрашивание антителами к G3P, а затем антителами к PCNA (РС10). Основные выводы (1) PCNA взаимодействует со своими белками-партнерами через гидрофобную ложбину на лицевой стороне тримера, образованную междоменной петлей, центральной петлей и С-концом. Таких сайтов на каждой стороне три, а всего 6, учитывая то, что четвертичная структура PCNA является двойным тримером. (2) Многие взаимодействующие аминокислотные с последовательности PCNA белки (PIP-бокс, имеют КА-бокс консервативные или же APIM), обеспечивающие образование специфической спирали типа 310, действующей как 171 гидрофобная затычка, вставляемая в гидрофобный карман, образованный IDCL, CL и CT. PCNA ALDOA Fructose 1, 6-diphosphate G3P Glyceraldehyde phosphate 1,3-diphoshoglyceric acid Рис. 53. Упрощенная модель функции PCNA, как координатора гликолизных реакций. Благодаря одновременному взаимодействию PCNA с Альдолазой А (ALDOA) и глицеральдегид -3- фосфат дегидрогеназой (G3P), продукт альдолазной реакции (глицеральдегид фосфат) может быть немедленно реализован как субстрат G3P в следующей реакции гликолизного каскада. (3) Имеется несколько модулей (функциональных процессов), таких как репликация хроматина и репарация ДНК, где PCNA достоверно является координирующим хабом и еще много таких, где его роль необходимо доказать. Интригующим 172 выглядит возможное участие PCNA в канцерогенезе и, весьма парадоксальным, - в гликолизе. (4) Роль PCNA в качестве платформы, поддерживающей ферментативные реакции при репликативном и репаративном синтезе ДНК, хорошо документирована и интенсивно изучается (Tsurimoto 1998; Paunesku, Mittal et al. 2001; Moldovan, Pfander et al. 2007). (5) Показано взаимодействие PCNA с множеством белков, часть из которых участвуют в процессах, происходящих за пределами хроматина и даже за пределами ядра (Warbrick 2000; Naryzhny 2008; Naryzhny and Lee 2010). Более того, многие из этих белков связаны с канцерогенезом, а уровень самого PCNA повышен в раковых клетках (Naryzhny and Lee 2007; Naryzhny 2008). Глава 8. Заключение Возвращаясь к исходному моменту нашего рассказа о внутриклеточных белковых взаимодействиях, следует отметить, что PCNA является идеальным образцом для интерактомики, так как не обладает никакими ферментативными активностями, и его роль в клетке полностью определяется способностью обеспечивать взаимодействия с белками и с ДНК. Это происходит благодаря симметричной структуре двойного кольца, которое охватывает ДНК и может связываться с белками, действующими в противоположных направлениях цепи ДНК. Такое положение позволяет PCNA играть важную роль во многих процессах, происходящих в хроматине. Будучи загруженной на ДНК и являясь движущейся платформой для ДНК полимераз и других белков, таких как p300, CAF-1 и HDAC1, 173 PCNA является мастером-координатором процессов, происходящих в хроматине. (Jonsson and Hubscher 1997; Lee and Naryzhny 2006; Moldovan, Pfander et al. 2007). Во время репликации, в S–фазе клеточного цикла, координация затрагивает в первую очередь синтез ДНК, который ведется разными полимеразами. Большинство из них имеет свою узкую специализацию и приступает к своим функциям за счет взаимодействия с PCNA. То есть в данном случае PCNA действует как переключатель, меняя одного партнера на другого. Очень важно отметить, что механизм такого переключения связан с модификациями PCNA, в первую очередь с убиквитинированием. Помимо этого PCNA также может действовать как адаптор или координатор, взаимодействуя с несколькими белками одновременно, а не по очереди. В таком режиме PCNA, находясь в хроматине, обеспечивает взаимодействия между процессами репарации/репликации ДНК и другими клеточными функциями, такими, как ремоделирование хроматина и эпигенетические модификации. Интересно то, что PCNA может также служить платформой для различных белков, и не взаимодействуя с ДНК (Xiong, Zhang et al. 1992; Xiong, Zhang et al. 1993). В таком случае возникает вопрос о том, как это связано с локализацией PCNA внутри клетки. Взаимодействует ли PCNA со специальными структурами типа ядерного матрикса, или же свободно распределен в нуклеоплазме или цитоплазме? Ответ на этот вопрос, по-видимому, состоит в том, что возможны все эти ситуации. Но если в ядре такие перемещения PCNA между нуклеоплазмой, ядерным матриксом и хроматином логично вписываются в картину регуляции процессов, связанных с генетическим и эпигенетическим материалом клетки, то в цитоплазме не все так 174 очевидно. Однако обнаруженная связь PCNA с гликолизом в совокупности с тем, что повышенные уровни PCNA и гликолиза являются характерной чертой раковых клеток, открывает для нас новые аспекты внутриклеточных белковых взаимодействий в нормальных и стрессовых ситуациях. Другой чрезвычайно важный вопрос состоит в том, как регулируется взаимодействие отдельных белков с PCNA в специфическое время и в специфическом месте. Основным механизмом этой регуляции, по-видимому, являются пост-трансляционные модификации PCNA и других белков. Таким образом, выявление сигнальных механизмов ведущих к пост-трансляционным модификациям и ассоциации диссоциации белковых комплексов с PCNA необходимо для полной картины PCNA-зависимых процессов. Хотя изучение этих процессов чрезвычайно затруднено из-за высокой динамики ассоциации и диссоциации PCNA с другими белками, вопрос о механизмах этого динамического взаимодействия различных белков в данное время и месте является чрезвычайно важным для объяснения регуляции разнообразных и сложных клеточных функций. Так как протеомные подходы, такие как 2DE или масс-спектрометрия, уже оказались продуктивными в изучении PCNA, мы вправе ожидать от них еще больших достижений в области взаимодействий PCNA с другими белками и роли этих взаимодействий в клеточном поведении. Совершенно новые методы или новые комбинации известных методов возможно будут критическим фактором для этого прорыва. А широкий спектр активностей PCNA-связывающихся белков указывает на возможное участие PCNA в каких-то неожиданных областях. Возможно эти 175 функции связаны с процессами, перечисленными в Таблице 10, или же они могут быть совершенно иными. Глава 9. Материалы и методы Реагенты Все используемые реагенты были получены от Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada) если не указан другой производитель. Источники остальных реагентов были следующие: дитиотриитол (DTT), коктейли ингибиторов протеаз и фосфатаз (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany); бычья гистон деацетилаза (Calbiochem, San Diego, CA USA); IPG гелевые полоски, IPG буферы, DryStrip покрывающая жидкость, мембраны из поливинилидин дифлюорида (polyvinylidene difluoride, PVDF), растворы для усиленной хемолюминисцетной реакции (enhanced chemiluminescence, ECL), радужные белковые маркеры для электрофореза, поли(dA)-(dT)12–18, (Amersham Biosciences, Montreal, Quebec, Canada); диализованная эмбриональная сыворотка, Invitrogen (Burlington, ON, Canada); [32P] ортофосфат, [3H] натрий ацетат, и [32P]дTTФ, PerkinElmer Life Sciences (Waltham, MA, USA). Мембрана PVDF, метанол, уксусная кислота (Fisher Scientific, Nepean, Ontario, Canada). Трис, 10 х TGS буфер (Трис, глицин, SDS), маркеры молекулярного веса белков для электрофореза (Precision Plus Protein Standards, dual color) от Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA). Среды для роста клеток, RPMI-1640, МЕМ, эмбриональную сыворотку теленка, сыворотку Fetal Clone II - от HyClone (Logan, UT, USA). Посуда, пипетки, культуральные чашки - от Sarstedt (Montreal, Quebec, Canada). 176 Антитела Анти-PCNA моноклональные антитела PC10, NeoMarkers (Fremont, CA, USA); поликлональные анти-ацетил белок антитела, Novus Biologicals (Littleton, CO, USA); вторичные антитела против кроличьих IgG, коньюгированные с пероксидазой (Pierce). Моноклональные анти-тубулин (T6557), поликлональные козьи анти-виментин (V4630), кроличьи поликлональные анти-актин (А2066) (Sigma, St.Louis, MO, USA). Моноклональные мышьи анти-фосфотирозин антитела 4G10 (05-321X) от Upstate Biotechnology (Lake Placid, NY, USA). Анти-PCNA моноклональные антитела PC10 (sc-56), анти-PCNA поликлональные козьи антитела С-20 (sc-9857), анти-PCNA-AC моноклональные антитела, пришитые на агарозу (agarose-conjugated), поликлональные анти-HDAC1, анти-ДНК полимераза бета и дельта антитела, поликлональные козьи анти-альдолаза A (sc-12059), поликлональные козьи анти-LDH (lactate dehydrogenase, лактат дегидрогеназа) антитела (sc-27232), моноклональные анти-фактор элонгации Tu (EF–Tu, sc-21758) антитела, поликлональные кроличьи анти-энолаза антитела (sc-15343), кроличьи поликлональные анти-PDI (protein disulfide isomerase) (sc20132), анти-GAPDH моноклональные антитела (sc-47724), моноклональные анти-Rb (sc-102) антитела, моноклональные мышиные анти-annexin II (sc-28385), моноклональные мышиные анти-убиквитин (Р4D1, sc-8017), а также коньюгированные с пероксидазой вторичные анти-мышиные, анти-кроличьи, анти-козлиные антитела, белок A/Gагарозные шарики, нормальные IgG мыши, получены от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Aнти-Cdk1 антитела получены от BD Biosciences 177 (Mississauga, ON, Canada), анти-циклин А антитела – от Oncogene Science (Cambridge, MS, USA). Клетки, клеточные культуры и клеточные экстракты Раковые клетки (MDA-MB468, MCF-7, MDA-MB231) и бессмертные „„нормальные‟‟ клеточные линии (CHO, MCF10A, 184B5 (Catalog No. CC-3150), и Hs578Bst) были получены от American Type Cell Culture Collection (ATCC) и выращивались в виде монослоя на 100мм культуральных чашках (Sarstedt) при 37˚С в атмосфере 5% СО2, используя среды, рекомендованные производителями с добавлением 10% сыворотки, 2мM L-глютамина, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина (Naryzhny and Lee 2007). Из нормальных клеток использовали эпителиальные, первичные клетки HMEC (human mammary ephytelial cells), Cambrex/Lonza (Walkersville, MD, USA) и бессмертные линии, 184В5 и Hs578Bst (Hackett, Smith et al. 1977). Линия эпителиальных клеток 184В5, в свое время полученная трансформацией бензопиреном нормальных клеток из молочных желез человека (Walen and Stampfer 1989). То есть эта клеточная линия является бессмертной, но не злокачественной. Эти клетки, посеянные в большом разведении, образуют при росте отдельные компактные колонии. Для роста клеток HMEC и 184В5 использовали среду MEGM (Mammary Epithelial Growth Medium, Clonetics (Catalog No. CC-3150), без сыворотки, но с добавлением холерного токсина (1 нг/мл). Клетки HS578Bst выращивали в среде DMEM (Life Technologies) с добавлением 10% FBS и эпидермального фактора роста (30 нг/мл). Клетки MCF 10A также являются бессмертными. Они в свое время были получены и отобраны 178 культивированием нормальных эпителиальных клеток в среде без сыворотки и с низкой концентрацией ионов Ca++. Хотя MCF10A не являются туморогенными для мышей с подавленной иммунной системой, они способны образовывать колонии в полужидком агаре, то есть обладают некоторыми свойствами, характерными для раковых клеток. Их выращивали в среде DMEM (Life Technologies) с добавлением 10% FBS. MDA-МВ468, MDA-MB231, MCF7 (человеческие эпителиальные раковые) или HEK293 (человеческие эмбриональные почечные) растили в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональную сыворотку теленка. СНО (клетки яичника китайского хомячка) – в среде МЕМ, содержащей 10% сыворотку Fetal Clone II. В экспериментах использовались клетки в логарифмической фазе роста. Для их пересеивания использовался раствор трипсина-ЭДТА (0.25% трипсина в 0.53 мМ ЭДТА). Культуральную среду удаляли и слой клеток быстро промывали раствором трипсина-ЭДТА (0.5-1мл), чтобы удалить остатки сыворотки, содержащей ингибитор трипсина. Этот раствор удаляли, заменяли на такой-же новый (0.5-1мл) и инкубировали в нем клетки при 37˚С в течение 5-15 мин. Этого времени обычно хватает для того, чтобы клетки перешли в раствор (небольшое встряхивание облегчает этот процесс). Добавляли 8 мл культуральной среды, перемешивали и клетки осторожно отбирали пипеткой в центрифужную пробирку. Далее клетки осаждали центрифугированием (5 мин, 800g), освобождаясь от остатков раствора трипсин-ЭДТА, переводили в свежую культуральную среду, рассеивали в нужном разведении в чашках и наращивали в инкубаторе. Для долговременного хранения клетки после осаждения ресуспендировали в культуральной среде, содержащей 20% сыворотку и 7% DMSO, разливали в 179 криовиалы и хранили в жидком азоте. При сборе клеток их монослой предварительно промывали раствором фосфатно-солевого буфера (PBS). Далее добавляли свежий раствор PBS, переводили в него клетки, используя специальный пластиковый шпатель (plastic cell lifter) и собирали центрифугированием 5 мин при 900g. Супернатант удаляли вакуумным отсосом, а осадок клеток экстрагировали различными буферами. Если клетки не использовали сразу, их немедленно замораживали и хранили при -80˚С. Для экстракции использовали следующие буферы – гипотонический буфер (10 мМ Трис, pH 7.5, 25% глицерин, 1 мМ ДТТ, анти-протеазный и анти-фосфатазный коктейли ингибиторов). При данной экстракции обычная концентрация белка получалась 2 мг/мл, что соответствует 107 клеток в 0.5 мл буфера. В случае 2DE анализа всех клеточных белков, клетки растворяли в лизирующем буфере (7 M мочевина, 2 M тиомочевина, 4% CHAPS, 1% ДТТ, 2% амфолиты (IPG-buffer, pH 3–10), коктейль протеазных ингибиторов и 0.001% бромфенол голубой). Концентрацию белка определяли с помощью реагента Кумасси (Pierce, Rockford, IL, USA). Плазмиды Штамм E.coli BL21 (DE3), трансформированный плазмидой pT7hPCNA, (Fien and Stillman 1992) был получен от Доктора Стиллмана (Dr. B. Stillman, Cold Spring Harbor Laboratory). Плазмида pEGFPCNA, подарок от Доктора Кардосо (Dr. C. Cardoso, Max Delbruck Center for Molecular Medicine, Germany), была изготовлена соединением открытых рамок считывания белков GFP и PCNA со вставкой гибкого и гидрофильного линкера, так чтобы GFP не мог мешать формированию 180 функционального кольца PCNA (Sporbert, Gahl et al. 2002). Конструкция pEGFPCNAL2 (подарок от Dr. C. Cardoso) отличается от pEGFPCNA тем, что дополнительно содержит последовательность для ядерной локализации. Дальнейшие манипуляции были проведены для получения точечных и делеционных мутаций, используя подходящие олигопраймеры и полимеразную цепную реакцию (PCR). Синхронизация по клеточному циклу Остановка клеток CHO в G0 фазе достигалась удалением из инкубационной среды изолейцина (Tobey and Ley 1970), а остановка на границе G1/S (старте S-фазы) через комбинацию удаления изолейцина и обработки ингибиторами репликации ДНК, мимозином или афидиколином (Gilbert, Neilson et al. 1995; Lee, Larner et al. 1997). Мимозин хранили при 4°C в виде 10 мМ раствора в PBS. Мимозин, β- N(3-hydroxy4-pyridone)-α-amino propionic acid, аминокислота из растений, является ингибитором инициации репликации ДНК посредством ингибирования метаболизма нуклеотидов (Gilbert, Neilson et al. 1995). Афидиколин, антибиотик с антивирусными и антимикробными свойствами, является обратимым ингибитором ДНК репликации у эукариот. Он останавливает клеточный цикл в ранней S–фазе за счет ингибирования ДНК полимераз альфа и дельта. Раствор афидиколина (Boehringer-Mannheim) (2 мг/мл) хранили в диметилсульфоксиде (ДМСО) при −20°C. В деталях это происходило следующим образом. Клетки СНО выращивали на 10 см чашках в виде монослоя в минимальной среде (МЕМ, 10 мл на чашку), содержащей 10% сыворотку Fetal Clone II. Когда количество клеток достигало 50-60% конфлуэнции, ростовая среда заменялась на минимальную среду, лишенную изолейцина и 181 содержащую 10% диализованную фетальную бычью сыворотку. Через 45 часов инкубации в этой среде практически все клетки переходят в G0-фазу. Для остановки на границе фаз G1/S, клетки, синхронизированные в G0-фазе, переводили на 14 часов в полную среду (МЕМ), содержащую афидиколин (2 мкг/мл) или мимозин (0.2мг/мл). Чтобы затем запустить в клетках S-фазу, их помещали в полную среду, лишенную ингибиторов. Для синхронизации клеток человека на стадии G0/G1 обычно используется сывороточное голодание (Kues, Anger et al. 2000). Для этого клетки, достигшие 50-60% конфлуэнции, промывают два раза ростовой средой без сыворотки, а затем инкубируют в такой же среде как минимум 72 часа. Если затем клетки опять перевести в полную среду, содержащую 10% сыворотку, то они проходят фазу G1 и начинают S-фазу примерно через 10 часов. Наиболее простым способом получить синхронную популяцию М-фазных клеток, является способ стряхивания (shake off) (Terasima and Tolmach 1963). Способ основан на том, что клетки, вошедшие в М-фазу, сильно уменьшаются в размере, округляются и теряют прочный адгезивный контакт с поверхностью чашки, на которой они растут. Поэтому резкого встряхивания чашки достаточно для отрыва клеток и перехода их в ростовую среду в свободное состояние. Эти свободно плавающие клетки можно затем просто собрать пипеткой. Так как обычно в клеточной популяции только небольшой процент клеток находится в М-фазе (10-15%), перед такой обработкой для большего выхода желательно наращивать клетки до 90-100% конфлуэнтости. Для синхронизации клеток в М-фазе возможно также использование таких химических соединений, как нокодазол (nocodazole) или кольцемид (colcemid), которые взаимодействуют с тубулинами и ингибируют образование 182 (полимеризацию) микротрубочек, что приводит к остановке клеток в прометафазе. Для синхронизации обычно используется добавление нокодазола в среду в концентрации 40-100 нг/мл и дальнейшая инкубация в течение 12-18 часов (Samake and Smith 1997). Следует однако иметь в виду, что более длительная инкубация обычно ведет к клеточной смерти через апоптоз. Сортировка клеток (fluorescence-activated cell sorting, FACS assay) Ядра, полученные экстракцией клеток буфером, содержащим 10 мМ Трис, рН 6.8, 100 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA, 10% глицерин, 0.5% Тритон Х-100, 1 мМ PMSF, ресуспендировали в окрашивающем растворе, который содержал 0.1% цитрат натрия, 0.3% Тритон X-100, 100 мкг/мл РНКаза A и 100 мкг/мл пропидиум иодида. В каждом измерении примерно 2х104 клеток анализировали, используя проточный цитометр Beckman Coulter Epics® Elite (Palo Alto, CA, USA). Мечение in vivo Для метки фосфопротеинов CHO клетки с конфлуенцией в 60–70% инкубировали 4 часа в МЕМ-среде, не содержащей фосфатов (Invitrogen, № 21097-035) с добавлением 10% диализованной эмбриональной сыворотки коровы (Invitrogen). Затем клетки инкубировали 9 часов при 37°C в свежей MEM-среде, содержащей [32P]ортофосфат (0.4 mCi/мл). Далее клетки дважды промывали холодным раствором PBS, собирали с помощью пластикового шпателя в раствор PBS содержащий коктейль протеазных и фосфатазных ингибиторов (20 мМ NaF и 1 мМ 183 Na3VO4), и осаждали центрифугированием 5 мин при 900g. Для экспериментов по ацетилированию клетки инкубировали 6 часов в MEM-среде, содержащей [3H]ацетат натрия (0.5 mCi/ml). Субклеточное фракционирование Субклеточные фракции получали, как было описано ранее (Spector DL 1998; Ramsby and Makowski 1999). Одно существенное отличие заключается в использовании дигитонина для получения цитозола. Клетки, выросшие в монослое на 10-см чашке, промывали холодным раствором PBS и обрабатывали 10 мин на льду одним миллилитром экстрагирующего буфера с дигитонином (10 мМ PIPES, pH 6.8, 0.015% дигитонин, 300 мМ сахароза, 100 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонил флорид и смесь ингибиторов протеаз). Клетки затем собирали с помощью пластикового шпателя, и ядра осаждали центрифугированием 5 мин при 2,000g. Супернатант, содержащий цитозол, (цитоплазматическая фракция), собирали, а ядра ресуспендировали в ядерном буфере для экстракции, (10 мМ Трис, pH 6.8, 100 мМ NaCl, 3 мМ MgCl2, 1 мМ EDTA, 10% глицерин, 250 мМ сульфат аммония, 2 мМ RVC, 1 мМ PMSF, коктейль ингибиторов протеаз). Ядерную суспензию центрифугировали 10 мин при 4000g, супернатант, ядерный экстракт собирали, а осадок ресуспендировали в 0.5 мл буфера для переваривания (10 мМ Трис, pH 7.4, 5 мМ MgCl2, 0.5% Тритон X-100, 2 мМ RVC, коктейль ингибиторов протеаз), добавляли микрококковую нуклеазу (40 U/мл) и оставляли на ночь при 4°C. Затем суспензию центрифугировали 5 мин при 4000g и супернатант (хроматиновая фракция) собирали. Осадок, содержащий фракцию ядерного 184 матрикса, ресуспендировали в 100 мкл буфера для образца, лизирующем буфере (7 М мочевина, 2 М тиомочевина, 4% CHAPS, 1% ДTT, 2% IPG буфер, pH 3–10, смесь протеазных ингибиторов, 0.1 мМ MG132, ингибитор протеосом, 0.001% бромфенол голубой). Процедуры проводили на льду для исключения деградации белков. Все буферы также содержали ингибиторы фосфатаз (20 мМ NaF и 1 мМ Na3VO4). Клеточная трансфекция Бактерии E.coli BL21 трансфецировали плазмидой T7hPCNA. Клетки СНО и HEK293 трансфецировали нормальными и мутантными плазмидами pEGFPCNA, используя липофектамин (Lipofectamin, Invitrogen) и следуя инструкциям производителя с некоторыми модификациями. В деталях это происходило следующим образом. Наращивали клетки в 10-ти сантиметровой чашке до примерно 50-80%-ной конфлуэнции. Готовили липосомы с ДНК. Для этого в одной пробирке разводили 10 мкл липофектамина в 50 мкл воды, а в другой пробирке - 1 мкг плазмидной ДНК тоже в 50 мкл воды. Затем эти растворы объединяли, осторожно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15-30 мин для формирования комплексов ДНК с липосомами. В течение этого времени подготавливали клетки для трансфекции. Для этого с помощью вакуумного отсоса удаляли ростовую среду из чашек, промывали чашки средой без сыворотки и добавляли сначала в каждую чашку 4 мл такой же среды, а затем осторожно 100 мкл липосом с ДНК. Растворы слегка перемешивали, и чашки помещали на 4-6 часов в СО2 инкубатор при 37˚С. После инкубации добавляли в каждую чашку равный объем (4 мл) ростовой среды, содержащей 20% сыворотки, и опять помещали в 185 инкубатор на 16-20 часов. После этого просматривали клетки во флуоресцентном микроскопе с зеленым фильтром и определяли эффективность трансфекции и состояние клеток. Выделение PCNA хроматографией и электрофорезом Клеточные экстракты получали из бактерий BL21 (DE3), трансформированных плазмидой T7hPCNA (Fien and Stillman 1992) путем озвучивания в буфере, содержащем 25 мМ Трис, pH 7.4, 25 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 10% глицерин, 0.01% Тритон X-100, и коктейль ингибиторов протеаз. Экстракт “осветляли” центрифугированием и наносили на колонку для гель фильтрации Sephacryl S200, 16/60 (Amersham Biosciences). Фракции собирали и анализировали электрофорезом с последующим Вестерн-блотом на предмет присутствия PCNA, используя антитела РС10. Пиковые фракции собирали и повторно проводили очистку на той же колонке Sephacryl. Далее фракции с PCNA наносили в PBS на колонку UnoQ1 (Bio-Rad), элюировали градиентом NaCl и далее очищали, используя колонку для гельфильтрации Superdex 200 10/300 GL (диапазон разделения по молекулярным весам 10,000–600,000). В некоторых случаях PCNA еще дополнительно очищали на колонке Phenyl-Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) перед гель-фильтрацией на Superdex 200 10/300 GL. Но даже без этой стадии очистка PCNA, оцененная с помощью электрофореза (SDS-PAGE) и окрашивания серебром, была около 95%. Выделение мономера PCNA после денатурирующего электрофореза (SDS-PAGE) проводили в одну стадию на установке UDSFE (Naryzhny 1996). Для этого прямо в клеточный экстракт добавляли буфер для образца (2% LDS, 0.065М Трис, рН 6.8, 186 1% ДТТ, 10% глицерин, 0.01% бромфенол голубой), прогревали при 100˚С и наносили на установку. Фракции собирали и анализировали Вестерн-блотом, используя антитела РС10. Ренатурацию молекул PCNA проводили путем последовательного диализа в следующем порядке: 1) буфер, содержащий 4 M мочевину, 0.1% Тритон X-100, 1мM EDTA, 20 мM Трис-HCl, pH 7.2, 2) 0.5% Тритон X-100, 20 мМ Трис-HCl, pH 7.2, 3) PBS, содержащий 20% глицерин и 1.0 мM EDTA, 4) PBS, содержащий 50% глицерин. Сшивки формальдегидом Клетки, выращенные на культуральной чашке, промывали один раз фосфатносолевым раствором (PBS) и инкубировали при комнатной температуре в растворе PBS, содержащем 1.5% формальдегид (сшивка in vivo). Реакцию останавливали добавлением глицина в финальной концентрации 0.15М При метке in vitro обрабатывали 1.5% формальдегидом клеточный экстракт, а не клетки. В этом случае реакцию останавливали добавлением буфера для анализа образца электрофорезом (2% додецилсульфат лития (LDS), 60мМ Трис, рН 6.8, 10% глицерин, 0.1М ДТТ, 0.001% бромфенол голубой). Обычно время обработки было 15 мин, если не было необходимости проконтролировать кинетику реакции и провести сшивки в меньшей или большей степени. Одномерный электрофорез (SDS-PAGE) Денатурирующий одномерный электрофорез проводили в присутствии SDS с концентрацией полиакриламида от 8 до 12% в разделяющем геле и 5% в концентрирующем геле (Laemmli 1970; Naryzhny, Desouza et al. 2006). Для 187 формирования карманов для образцов использовали гребенки с шириной зубцов 5 мм. Анализируемые образцы помещали в буфер для образца (2% LDS, 0.065 М Трис, рН 6.8, 1% ДТТ, 10% глицерин, 0.01% бромфенол голубой) и прогревали на кипящей водяной бане 2 мин. Использовался заранее приготовленный буфер для образца в пятикратной концентрации, который хранился в аликвотах при -20˚С. Образцы наносили в количестве 10-30 мкг (10-30 мкл) на дорожку. Концентрацию белка в образцах замеряли с помощью Кумасси (Coomassie Protein Assay Reagent kit (Pierce). В случае анализа разных образцов (клеточный цикл), где необходимо нанесение одинакового количества на каждую дорожку, этого добивались соответствующим разведением, чтобы концентрация белка во всех образцах была одинакова. Кроме того нормализация проверялось окраской геля и мембран, а также использованием контрольных антител (к актину) при Вестерн-блоте. Концентрирующий гель Разделяющий гель Концентрация (%) 5 Концентрация (%) 10 30% акриламид/0.8% бисакриламид (мл) 1.7000 30% акриламид/0.8% бисакриламид (мл) 6.6666 1M Tрис(pH6.8)(мл) 1.25 1.5M Tрис(pH8.8)(мл) 5 10% Персульфат аммония (мл) 0.1 10% Персульфат аммония (мл) 0.2 TEMED (мл) 0.01 TEMED (мл) 0.008 H2O (мл) 6.8000 H2O (мл) 7.9333 Объем (мл) 10 Объем (мл) 20 Таблица 12. Приготовление полиакриламидных гелей для SDS-PAGE 188 Использовали два типа аппаратов - Hoefer miniVE (для гелей размером 80х80х1мм) и S600 (для гелей 140х140х1мм). Оба аппарата были от Hoefer (San Francisco, CA, USA). SDS в гель не добавляли. Из-за того, что он является анионным детергентом, SDS, добавленный в гель, уйдет из него в процессе электрофореза, не вступив в контакт с белками. То есть его присутствие в геле совершенно не скажется на денатурации белков и их разделении. Для эффективной денатурации и хорошего разделения необходимо присутствие SDS, (а еще лучше LDS) только в образце и в электродном буфере TGS (0.1% SDS, 25 мМ Трис, 0.2 М глицин). Особенно важно качество электродного буфера в катодном резервуаре (для надежности всегда использовался свежеприготовленный раствор, хотя и возможно его использование несколько раз). Для приготовления гелей использовали заливочную камеру (gel caster, Amersham Biosciences), заливая сразу две пластины геля. Растворы акриламида и Триса, используемые для приготовления геля, готовили заранее, фильтровали через фильтр 0.45 µm (Schleicher & Schuell) и хранили при 4°С. Четкая ровная поверхность геля обеспечивалась осторожным нанесением сверху 20% раствора этанола (для лучшей визуализации он содержит небольшое количество бромфенол голубого). Полимеризация геля происходит в течение 30-50 мин, после чего стекла с гелями доставали, промывали водой, вставляли гребенки и формировали лунки, заливая раствор для концентрирующего геля (для исключения протечек лучше всего его заливать в горизонтальном положении, при этом раствор не вытекает из-за его капиллярного взаимодействия со стеклами). Электрофорез вели при постоянном токе (18 мА на гель). В этом случае напряжение вначале было 189 90V, а в конце 150V. На весь электрофорез, то есть достижение фронта, с которым идет бромфенол голубой, нижнего края геля, уходило 1:40 – 2 часа. Нативный электрофорез Нативный или неденатурирующий электрофорез проводили на основе подхода прерывистого электрофореза Орнстейна и Дэвиса (Ornstein and Davis) (Davis 1964; Ornstein 1964). В сущности это та же самая система, которая затем была использована Лэммли для денатурирующего электрофореза (Laemmli 1970). За давностью лет это уже стало забываться, и многие исследователи часто анекдотично говорят о системе Орнстейна и Дэвиса, как о системе Лэммли но без SDS! Так как в нашем случае гель уже изначально не содержит SDS (Таблица 12), то его заливали одинаково, независимо от того для какого разделения, нативного или денатурирующего, он использовался. Использовали электродный буфер (25 мМ Трис, 0.2 М глицин) и буфер для образца (0.065 М Трис, рН 6.8, 10% глицерин, 0.01% бромфенол голубой). Кроме того, в буфере для образца отсутствовал ДТТ и, естественно, сами образцы перед разделением не денатурировали прогревом. Голубой нативный электрофорез (BNPAGE) BNPAGE проводили, как описано Щегером и фон Яговом (Schägger and von Jagow) (Schagger and von Jagow 1991). Образцы помещали в 0.5 М 6-аминокапроновую кислоту, 50 мМ Трис, рН 7.0, 0.25% Кумасси G (Sigma B0770), и белковые комплексы разделяли за счет заряда, связанных с белком молекул красителя. Этот заряд пропорционален размеру белков. Для разделения использовали градиентные полиакриламидные гели (5-15%), содержащие 0.5 М Трис, рН 7.0, и 0.5 М 6- 190 аминокапроновую кислоту. Электродный буфер – 25 мМ Трис, рН 7.0, который при заливке в катодный резервуар содержал дополнительно еще и 0.02% Кумасси G. Следует отметить, что BNPAGE оказался не очень подходящим способом для анализа комплексов, образованных PCNA. Более того, не только комплексы, но даже четвертичная структура PCNA не выдерживает добавления Кумасси G, и он распадается в процессе электрофореза на мономеры. Двумерный электрофорез (2DE) Для 2DE использовали процедуру, описанную ранее (Naryzhny and Lee 2001; Naryzhny and Lee 2003). Образцы, содержащие до 2 мг белка, обычно растворяли в 100 мкл лизирующего буфера (7 М мочевина, 2 М тиомочевина, 4% CHAPS, 1% ДTT, 2% IPG буфер, pH 3–10, смесь протеазных ингибиторов, 0.1 мМ MG132, ингибитор протеосом, 0.001% бромфенол голубой). Белки разделяли изоэлектрофокусированием (ИЭФ), используя полоски DryStrip kit (Amersham Biosciences) и следуя протоколу производителя. Образцы в лизирующем буфере (50500 мкг) смешивали с регидрирующим буфером (7 М мочевина, 2 М тиомочевина, 2% CHAPS, 0.3% ДTT, 2% IPG буфер, pH диапазон тот же, что и в полоске, 0.001% бромфенол голубой) в конечном объеме 200 (7-см полоска), 300 (13-см полоска), или 450 микролитров (18-см полоска). Чтобы подготовить полоски для разделения в первом направлении, их замачивали на ночь при 10°C, помещая гелем вниз в регидрирующем растворе в специальной кювете (Immobiline DryStrip Reswelling Tray, Amersham Biosciences). Использовали следующие полоски - 7-cм (pH 4.0–7.0), 13-cм (pH 4.0–7.0), 13-cм (pH 3.0–10.0), или 18-cм (pH 4.0–5.0). 191 Изоэлектрофокусирование вели при 20°C, используя аппарат Малтифор 2 (Multiphor II) и источник питания EPS 3500 XL, который программировали следующим образом: вначале 300V в течение 10 мин, затем линейный градиент от 300V до 3500V (1.5 часа) и в конце 3500V (2, 4.5 или 12 часа в зависимости от длины полосок). Общий вольтаж был 9000, 18000 или 38000 вольтчасов для 7-, 13- или 18cм полосок, соответственно. Полоски перед вторым направлением вымачивали (2 раза по 10 мин) в уравновешивающем растворе (50 мМ Трис–HCl, pH 6.8, 6 M мочевина, 2% SDS и 30% глицерин), содержащем сначала 1% ДTT, а затем 5% иодацетамид. Каждую полоску затем помещали сверху на гель второго направления и закрепляли заливкой 1 мл горячего раствора 0.5% агарозы, содержащей TGS электродный буфер (25 мМ Трис, pH 8.3, 200 мМ глицин, и 0.1% SDS). Электрофорез второго направления (SDS–PAGE) вели, используя систему Hoefer miniVE для 7см полосок (10% гель размером 80х90х1мМ) или же систему S600 (Amersham Pharmacia Biotech) для 13см полосок (10% гель размером 140х140х1мМ). Электрофорез вели при комнатной температуре при постоянном токе (25 mA/гель) и напряжении от 100 to 160 V. При использовании таких параметров уходило 1.5 часа на маленький гель и 4 часа на большой. Окрашивание белков и сушка гелей После завершения электрофореза полиакриламидный гель фиксировали 15 мин в растворе 25%-ого изопропанола с 10%-ой уксусной кислотой, повторяя эту процедуру как минимум еще раз для отмывки от SDS. Использовали поддоны 192 размером 20х20 см из cтекла Pyrex. Все инкубации проводили на качалке. Объем заливаемого раствора для геля размером 14х14см был 200 мл. Белки в геле окрашивали серебром одним из двух методов, как было описано ранее (Oakley, Kirsch et al. 1980; Shevchenko, Tomas et al. 2006), с некоторыми модификациями. Первый метод - окрашивание аммиачным серебром по методу Oakley (Oakley, Kirsch et al. 1980). В этом случае гель после фиксации тщательно промывали водой (3 раза, меняя воду каждые 20 мин), инкубировали в 10%-ном глутаровом альдегиде 30 мин, и опять тщательно промывали водой (4 раза, меняя воду каждые 15 мин). Далее готовили раствор аммиачного серебра (100 мл на один гель). Для этого растворяли 0.8 г азотнокислого серебра в 4 мл воды. В другом стакане наливали 21 мл 0.36% NaOH, добавляли 1.5 мл NH4OH, ставили на магнитную мешалку и при энергичном перемешивании каплями добавляли 4 мл азотнокислого серебра. Если раствор при этом принимал коричневый цвет, то добавляли NH4OH до его обесцвечивания. Добавляли к раствору серебра воду до конечного объема 100 мл и помещали в него гель на 10 мин. Затем раствор удаляли, гель промывали кратковременной инкубацией в воде (1 мин) и помещали в раствор проявителя (0.0005%-ый формалин, 0.005%-ая уксусная кислота), который тоже через 1 мин меняли на свежий (как только он начинал коричневеть). Далее гель проявляли до необходимой интенсивности белковых полос или пятен, не допуская чрезмерного перекрашивания и сильного фона. Остановка проявления достигается удалением проявителя и помещением геля в 10%-ную уксусную кислоту. Другой используемый метод серебрения является небольшой модификацией метода Шевченко (Shevchenko et al) (Shevchenko, Tomas et al. 2006; Winkler, Denker et al. 193 2007), используемого в том случае если после окрашивания белки анализируются масс-спектрометрией. В этом случае после фиксации гель ополаскивали 10 мин в воде и обрабатывали 1 мин тиосульфатом натрия (0.2 г/литр). Гель промывали водой (два раза по 20 секунд каждый раз) и инкубировали 30 мин в растворе нитрата серебра (2.0 г/литр). После быстрого ополаскивания (30 сек) в воде, а затем в проявителе (карбонат натрия, 30 г/литр; формальдегид, 1.4 мл 37%-ого раствора на литр и тиосульфат натрия, 10 мг/литр), белковые полосы/пятна проявлялись при дальнейшей инкубации в проявителе. Реакцию останавливали переносом геля в 10%-ую уксусную кислоту. При окрашивании Кумасси гель после двойной инкубации по 15 мин в фиксирующем растворе (25% изопропанол с 10% уксусной кислотой) переносили в 0.1% раствор Кумасси R (лучше всего использовать R350 для увеличения чувствительности) в 30% метаноле, содержащем 10% уксусную кислоту. Гель красили как минимум 3 часа, и фон обесцвечивали многократной промывкой в воде (смена каждые 30 мин до получения удовлетворительного результата). В случае необходимости долговременного хранения, гель высушивали. Для этого его помещали между двух листов мокрого целлофана (Bio-Rad), аккуратно проглаживанием удаляли пузырьки воздуха, закрепляли этот сандвич между двух рамок, которые зажимали клипсами и высушивали как минимум 4 часа в печке с вентиляцией при 45°C. Как альтернативу можно использовать сушку обычным вентиллятором при комнатной температуре (Naryzhnyi and Krutiakov 1989). В этом случае, естественно, время высушивания значительно увеличится. 194 Иммуноосаждение Иммуноосаждение проводили в соответствии с протоколом производителя (Santa Cruz Biotechnology) с некоторыми модификациями. Вкратце, клетки, выросшие на чашке, промывали PBS, собирали пластиковым шпателем в PBS и осаждали центрифугированием (5 мин при 1,000g). После добавления 1–3 мл холодного RIPA буфера (для 7 x 107 клеток), клетки разрушали многократным пропусканием через носик пипетки и инкубированием 15 мин во льду. Клеточные обрывки удаляли центрифугированием (10 мин при 10,000g и 4°C). Для сведения к минимуму неспецифического осаждения, к клеточному лизату вначале добавляли 1.0 мкг контрольных IgG (т.е. соответствующих первичным антителам по хозяину) и затем 20 µл белокA/G-агарозы, с последующим центрифугированием (5 мин при 3,000g при 4°C). Супернатант, содержащий примерно 1.0 мг белка, инкубировали с 1.0–10 µл (0.2–2.0 мкг) первичных антител (1–2 ч при 4°C), после чего добавляли 20 µл раствора белок-А/G-агарозы. После 2-часовой инкубации на покачивающейся платформе при 4°C, иммунопреципитат собирали центрифугированием (3,000g, 5 мин при 4°C). Осадок промывали 2–4 раза в 1.0 мл PBS или RIPA буфера (для более интенсивной промывки) и центрифугировали при тех же условиях. Все растворы содержали коктейли протеазных и фосфатазных ингибиторов, как описано выше. Перенос на мембрану По окончании электрофореза гель опускали в буфер для переноса (48 мМ Трис, 39 мМ глицин, 0.037% SDS, and 20% метанол) и сразу переносили на PVDF мембрану, используя аппарат для полусухого переноса (Bio-Rad) и следуя рекомендациям 195 производителя и другим публикациям (Westermeier R 2001). PVDF мембрану (Immobilon-P, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA), нарезанную под размер геля (85х85 мм), увлажняли помещением в метанол (10 секунд) и уравновешивали в буфере для переноса (5 мин). Немного большего размера кусок толстой бумаги для переноса (87х87 мм) (VWR, Миссисага, Онтарио, Канада) также увлажняли в буфере для переноса и помещали на анодную пластину аппарата для полусухого переноса. Далее сверху по очереди помещали мембрану, гель и опять бумагу, обращая особое внимание бумага/гель/мембрана/бумага не на то, имел чтобы внутри образованный пузырьков воздуха, сандвич которые полностью исключают перенос белка в том месте, где они находятся. Это удобно делать, прокатывая сандвич специальным валиком или же просто достаточно большой пробиркой. Осторожно накрывали катодной пластиной и проводили перенос в течение 30 мин при 18V. Окрашивание мембран После переноса мембрану вымачивали в метаноле (10 сек) и белки окрашивали инкубацией в 0.1% растворе Кумасси R в 30% метаноле, содержащем 10% уксусную кислоту (1 мин) и промывали в 50% метаноле (2 раза по 1 мин). Мембрану полностью высушивали, так как это очень важно для последующего иммунодетектирования без интенсивного фона. Обычно достаточно 10 мин в печке с поддувом при 40˚С, но даже повышенная температура (до 60˚С) и большее время сушки не влияют на последующее иммунодетектирование. 196 Иммунодетектирование Голубой сухой Вестерн (Naryzhny 2009) Высушенную после окраски мембрану инкубировали 25 мин или менее в растворе антител (обычно в разведении 1:1000 в TBS (25 мM Трис, рН 7.5, 150 мМ NaCl), содержащем 3% БСА), ополаскивали в TBS и инкубировали 25 мин в растворе вторичных антител, меченных пероксидазой (разведение 1:10,000 в TBS содержащем 3% нежирное сухое молоко). После двойного ополаскивания в TBS мембрану инкубировали 1 мин в растворе ECL solution (GE Healthcare), помещали между двумя листами ацетатной пленки, вырезанной по размеру рентгеновской кассеты (X-ray), и экспонировали (15 сек или более) на рентгеновскую пленку (Amersham Hyperfilm) для получения сигнала удовлетворительной интенсивности. Пленку проявляли на процессоре для медицинских пленок (SRX-10/A, Konica Minolta Medical & Graphic, Mississauga, Ontario, Canada). В конечном итоге пленку и мембрану совмещали и идентифицировали положение антигенов на мембране. После детектирования, мембрану ополаскивали в TBS, просушивали и хранили при комнатной температуре между двух листов бумаги. Голубой (так как окрашен Кумасси в голубой цвет) Вестерн имеет множество преимуществ перед общепринятым методом иммунодетектирования после переноса белков на мембрану. Его применение позволяет драматически повысить эффективность и производительность рутинных операций. Растворы антител могут быть использованы повторно много раз и храниться при 4С до нескольких месяцев без понижения чувствительности. То же самое относится и к мембранам, которые в сухом виде хранятся просто в рабочем журнале. При возникновении 197 необходимости их можно опять обработать антителами. Единственным возможным неудобством метода является только то, что для него могут быть использованы только гидрофобные (PVDF), но не нитроцеллюлозные мембраны. “Классический” Вестерн-блот „„Классическое”, то есть общепринятое в большинстве лабораторий, иммунодетектирование проводили, следуя в основном протоколу лаборатории Колд Спринг Харбора (Cold Spring Harbor) (Harlow D.L. (Ed.) 1999). В деталях это выглядело следующим образом. После переноса мембрану помещали на ночь в блокирующий раствор (TBS, содержащий 3% БСА и 0.1% Tween 20) при температуре 4˚C. Затем мембрану инкубировали 1 час при комнатной температуре в блокирующем растворе, содержащем первичные антитела, промывали как минимум два раза по 15 мин в отмывочном растворе TBST (TBS с 0.1% Tween 20), и инкубировали 1 час при комнатной температуре с вторичными антителами, меченными пероксидазой и разведенными в блокирующем растворе (TBS, содержащий 5% обезжиренного сухого молока и 0.1% Tween 20). На последней стадии мембрану промывали 3 раза по 15 мин в TBS и инкубировали с ECL реагентом (GE Healthcare) для детектирования на рентгеновской пленке. В случае необходимости, проводили повторную обработку этой же мембраны антителами к другим антигенам, предварительно удалив первый сигнал с помощью стрипинга, который делали следующим образом. Мембрану промывали 5 мин в TBST и обрабатывали 30 мин SDS-буфером (2% SDS, 1% ДТТ, 60 мМ Трис pH 6.8) при 5060°C. Затем мембрану инкубировали в TBST (2 раза по 5 мин), повторно блокировали инкубацией в блокирующем буфере (1 час) и проводили 198 вышеописанные процедуры с использованием первичных и вторичных антител. Следует отметить, что в случае применения достаточно качественных антител (отсутствие фона и неспецифических сигналов) и хорошего разделения детектируемых антигенов друг от друга (это особенно хорошо достигается при использовании 2DE), возможна многократная обработка одной и той же мембраны разными антителами и без стрипинга. Естественно не обойтись без стрипинга в том случае, если есть необходимость в получении сигнала от разных эпитопов с одного и того же антигена (например, при детектировании различного рода посттрансляционных модификаций, например фосфорилирования, используя одномерный электрофорез). Фар-Вестерн Фар-Вестерн проводили на основании рекомендаций Гуше с соавторами (Guichet et al) (Guichet, Copeland et al. 1997) с некоторыми модификациями. Сначала белки, разделенные в 2DE или SDS-PAGE, переводили на мембрану стандартным полусухим переносом. Затем мембрану промывали сначала 5 мин в TBS, затем 10 мин в TBST с 5%-ным БСА (блокирующий раствор) и оставляли на ночь при 4°C в ренатурирующем буфере (10% глицерин, 100 мМ NaCl, 20 мМ Трис, рН 7.6, 0.5 мМ ЭДТА, 0.1% Tween-20, 3% БСА и 1 мМ ДТТ). На следующий день этот буфер меняли на такой же, только содержащий PCNA (2.5 мкг/мл), инкубировали при 4°C 4 часа. Несвязавшийся PCNA отмывали сначала инкубацией в ренатурирующем буфере (15 мин, 4°C), а затем в TBST c 3%-ным БСА (15 мин, 4°C). Далее мембрану обрабатывали практически таким же образом, как описано выше для “классического” Вестерн-блота, начиная с первичных антител (см. 199 “Классический”Вестерн-блот). В дополнение после получения иммунного сигнала, мембрану окрашивали Кумасси R350 (см. Окрашивание мембран). Такое окрашивание очень помогает при идентификации тех белков, которые дают иммунный сигнал. Моделирование Файлы с известными белковыми структурами получали из банка PDB (Protein Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), которые смотрели программами RasMol Version 2.7.2.1 (http://www.rasmol.org/) или Swiss-PDB Viewer DeepView v4.0 (http://spdbv.vital-it.ch/). Для поиска вариантов молекулярного взаимодействия использовали программу Hex 4.2 (http://www.loria.fr/~ritchied/hex/) (Macindoe, Mavridis et al. 2010). Иммуноокрашивание клеток В тех случаях, когда проводили иммуноокрашивание, в культуральные чашки (35мм х 6) при рассеивании клеток помещали покровные боросиликатные стекла 22x22x0.25мм (Fisher Scientific, Nepean, Ontario, Canada), покрытые поли-лизином. Стекла предварительно стерилизовали, промокая в этаноле и обжигая в пламени горелки. После наращивания достаточного количества клеток покровные стекла промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и клетки фиксировали, заливая стекла холодным метанолом и выдерживая при комнатной температуре в течение 10 мин. Другой способ фиксации, считающийся более надежным, состоит в предварительной обработке клеток 4% параформальдегидом в PBS (15 мин). И только затем следует промывка PBS и фиксация метанолом. После фиксации, стекла 200 с клетками промывали несколько раз TBS и блокировали в TBS, содержащем 5% бычью сыворотку в течение 1 часа при 4˚С. Затем их помещали на 1 час при комнатной температуре в блокирующий буфер, содержащий первичные антитела (50 мкл, разведение 1 к 20-50). После чего промывали TBS (два раза по 15 мин) и помещали на 30 мин в раствор вторичных антител (разведение 1 к 100 в блокирующем буфере), меченых FITC или родамином. Несвязанные антитела убирали промывкой (4 х 10 мин) в TBS, наносили на стекло 20 мкл 90%-ого глицерина в TBS и осторожно прижимали стекло к слайду. Излишки раствора удаляли, промокая салфеткой Kimwipe, и запечатывали стекло по краям лаком для ногтей. После этого слайды наблюдали под флуоресцентным микроскопом Zeiss Axiovert 100 (Carl Zeiss Canada Ltd, Toronto, Canada). При необходимости, слайды хранили в темном месте при -20˚С. Белки и ферменты Рекомбинантный PCNA человека, экспрессированный в E.coli (ALX-201-234), был получен от компании Alexis Biochemicals. Гексокиназа (H4502), глюкозо-6-фосфат изомераза (Р5381), фосфоглицерат киназа 1 (Р7634) из Saccharomyces cerevisiae, 6фосфофруктокиназа (F0137) из Basillus stearothermophilis, фруктозо-бифосфат альдолаза A (A8811), триосефосфат изомераза (T6258), глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (G2267), альфа-энолаза (E0379), пируваткиназа (P9136), и лактат дегидрогеназа (LDHA) из мышцы кролика были получены от Sigma. Рекомбинантная фосфоглицератмутаза 1 человека, экспрессированная в E.coli (#26118), была получена от USB Corporation (Cleveland, Ohio, USA). Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназную (G3P) активность определяли по 201 увеличению поглощения при 560 нм, используя набор ферментов KDalert (Ambion Incorporation, TX, USA) и следуя инструкциям производителя. Альдолазную активность измеряли по методу Пинто (Pinto et al) (Pinto, Kaplan et al. 1969), используя набор реагентов от компании Caldon Biotech Incorporation (Carlsbad, CA, USA) и замеряя понижение поглощение при 340 нм. Обработка деацетилазой HDAC1 и TSA проводили, как рекомендует производитель (Calbiochem). PCNA в комплексе с другими белками, иммуноосажденный антителами PC10 получали элюцией иммунопреципитата 0.1 М глицином с 0.15 М NaCl (pH 2.7), после чего pH повышали до pH 7.0 с помощью 1.0 М Триса (конечная концентрация 25 мМ). In vitro ДНК полимеризацию вели в 25 µл образца, содержащего иммуноосажденный PCNA (50 нг белка), 0.025 единиц смеси поли(дA) матрица-олиго(дT) праймер, 50 мМ Трис, pH 6.8, 0.25 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 1 мМ ДТТ, 6 мМ MgCl2, 10 мМ KCl, 1 мМ АТФ, 0.75 µCi [32P]TTФ (3,000Ci/ммоль) при 37°C (Podust, Podust et al. 1995). Реакцию останавливали, и ДНК осаждали добавлением 1.0 мл холодной 5% трихлоруксусной кислоты, содержащей 1% пирофосфат натрия. Осадок собирали на мембранный фильтр Protran 0.45 µm (Schleicher & Schuell) и радиоактивность считали на сцинтилляционном счетчике Beckman 6000IC. Масс-спектрометрия После разделения двумерным электрофорезом (2DE) и окрашивания Кумасси R350, кусочки геля диаметром 1-1.5 мм, соответствующие белковым пятнам вырезали и частично обесцвечивали 15 мин инкубацией в 500 мкл 50% ацетонитрила (ACN), содержащего 25 мМ бикарбонат аммония. Далее кусочки ужимали 10-ти минутной инкубацией в 200 мкл 100%-ого ацетонитрила. Ацетонитрил удаляли, и гель 202 высушивали в течение как минимум 20 мин на центрифуге Speed Vac. Высушенные кусочки геля вымачивали 25 мин на льду в 12 мкл 25 мМ раствора бикарбоната аммония (АБК), содержащего трипсин (Trypsin Gold, Promega, USA, 4 мкг/мл) или же Lys-C (5 мкг/мл), или Asp-N (10 мкг/мл) (Roche, Switzerland). Излишек раствора удаляли, добавляли 10 мкл раствора 25 мМ АБК и проводили протеолиз белка инкубацией при 37˚С, как минимум 4 часа. Продукты гидролиза смешивали (1мкл +1мкл) прямо на пластинке для масс-спектроскопии с матриксом CHCA (α-Cyano-4hydroxycinnamic acid, Fluka, Switzerland), растворенным в концентрации 10 мг/мл в 50%-ом ACN с 0.1%-ой трифторуксусной кислотой (TFA), кристаллизовали в потоке воздуха и анализировали на инструменте MALDI микромас MX (Waters Inc, USA). Спектры получали в режиме отражения (reflection mode), используя примерно 150 лазерных выстрелов по всей площади мишени (образца), и анализировали, используя программы Mascot (http://www.matrixscience.com/search_form_select.), FindPep, FindMod или Aldente (http://ca.expasy.org/tools). Образцы обессоливали, используя носики для микропипеток C4 ZipTips (Millipore, MS, USA), и наносили на пластину для MALDI образца (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Процесс происходил в следующем порядке. Сначала C4ZipTips активировали 60%ным ацетонитрилом (ACN), содержащим 0.3% трифторуксусную кислоту (TFA), а затем уравновешивали в 0.3% трифторуксусной кислоте. Белки, растворенные в 0.3% TFA, связывали с матриксом носика C4 ZipTip путем многократного пропускания через него, используя микропипетку, и элюировали из матрикса одним микролитром 60%-ого ацетонитрила, содержащего 0.3% трифторуксусную кислоту и синапиновую кислоту (10 мг/мл). Образцы анализировали в линейном режиме на 203 масс-спектрометре Voyager DE STR MALDI-TOF (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). Суммарные спектры получали со 150 случайных точек на нанесенном образце. Аналогичным образом образцы анализировали на инструменте ProteinChip Reader (Ciphergen Biosystems, CA, USA). В этом случае для анализа образцы наносили на пластинки Au ProteinChip (Ciphergen Biosystems, CA, USA). Список литературы Aagaard, L., G. Laible, et al. (1999). "Functional mammalian homologues of the Drosophila PEV-modifier Su(var)3-9 encode centromere-associated proteins which complex with the heterochromatin component M31." EMBO J 18(7): 19231938. Adachi, Y., J. Usukura, et al. (1997). "A globular complex formation by Nda1 and the other five members of the MCM protein family in fission yeast." Genes Cells 2(7): 467-479. Adimoolam, S., C. X. Lin, et al. (2001). "The p53-regulated cyclin-dependent kinase inhibitor, p21 (cip1, waf1, sdi1), is not required for global genomic and transcription-coupled nucleotide excision repair of UV-induced DNA photoproducts." J Biol Chem 276(28): 25813-25822. Aladjem, M. I., S. Pasa, et al. (2004). "Molecular interaction maps--a diagrammatic graphical language for bioregulatory networks." Sci STKE 2004(222): pe8. Alberts B, B. D., Hopkin K, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P Ed. (2004 ). Essential Cell Biology (2nd Edition). New York, Garland Science, . Almendral, J. M., D. Huebsch, et al. (1987). "Cloning and sequence of the human nuclear protein cyclin: homology with DNA-binding proteins." Proc Natl Acad Sci U S A 84(6): 1575-1579. Anachkova, B., V. Djeliova, et al. (2005). "Nuclear matrix support of DNA replication." J Cell Biochem 96(5): 951-961. Anand, N., S. Murthy, et al. (2002). "Protein elongation factor EEF1A2 is a putative oncogene in ovarian cancer." Nat Genet 31(3): 301-305. Ando, T., T. Kawabe, et al. (2001). "Involvement of the interaction between p21 and proliferating cell nuclear antigen for the maintenance of G2/M arrest after DNA damage." J Biol Chem 276(46): 42971-42977. Aparicio, T., A. Ibarra, et al. (2006). "Cdc45-MCM-GINS, a new power player for DNA replication." Cell Div 1: 18. Arakawa, H., G. L. Moldovan, et al. (2006). "A role for PCNA ubiquitination in immunoglobulin hypermutation." PLoS Biol 4(11): e366. Arias, E. E. and J. C. Walter (2006). "PCNA functions as a molecular platform to trigger Cdt1 destruction and prevent re-replication." Nat Cell Biol 8(1): 84-90. 204 Arita, K., M. Ariyoshi, et al. (2008). "Recognition of hemi-methylated DNA by the SRA protein UHRF1 by a base-flipping mechanism." Nature 455(7214): 818-821. Ayala, G., D. Wang, et al. (2003). "The prolyl isomerase Pin1 is a novel prognostic marker in human prostate cancer." Cancer Res 63(19): 6244-6251. Ayyagari, R., K. J. Impellizzeri, et al. (1995). "A mutational analysis of the yeast proliferating cell nuclear antigen indicates distinct roles in DNA replication and DNA repair." Mol Cell Biol 15(8): 4420-4429. Azam, N., M. Vairapandi, et al. (2001). "Interaction of CR6 (GADD45gamma ) with proliferating cell nuclear antigen impedes negative growth control." J Biol Chem 276(4): 2766-2774. Bader, G. D., D. Betel, et al. (2003). "BIND: the Biomolecular Interaction Network Database." Nucleic Acids Res 31(1): 248-250. Bailly, V., S. Lauder, et al. (1997). "Yeast DNA repair proteins Rad6 and Rad18 form a heterodimer that has ubiquitin conjugating, DNA binding, and ATP hydrolytic activities." J Biol Chem 272(37): 23360-23365. Balajee, A. S. and C. R. Geard (2001). "Chromatin-bound PCNA complex formation triggered by DNA damage occurs independent of the ATM gene product in human cells." Nucleic Acids Res 29(6): 1341-1351. Baldin, V., J. Lukas, et al. (1993). "Cyclin D1 is a nuclear protein required for cell cycle progression in G1." Genes Dev 7(5): 812-821. Balinsky, D., C. E. Platz, et al. (1984). "Enzyme activities in normal, dysplastic, and cancerous human breast tissues." J Natl Cancer Inst 72(2): 217-224. Banks, D., M. Wu, et al. (2006). "L2DTL/CDT2 and PCNA interact with p53 and regulate p53 polyubiquitination and protein stability through MDM2 and CUL4A/DDB1 complexes." Cell Cycle 5(15): 1719-1729. Bao, L., A. Kimzey, et al. (2004). "Prevalent overexpression of prolyl isomerase Pin1 in human cancers." Am J Pathol 164(5): 1727-1737. Barman, H. K., Y. Takami, et al. (2006). "Histone acetyltransferase 1 is dispensable for replication-coupled chromatin assembly but contributes to recover DNA damages created following replication blockage in vertebrate cells." Biochem Biophys Res Commun 345(4): 1547-1557. Barry, E. R. and S. D. Bell (2006). "DNA replication in the archaea." Microbiol Mol Biol Rev 70(4): 876-887. Baserga, R. (1991). "Growth regulation of the PCNA gene." J Cell Sci 98 ( Pt 4): 433436. Batagelj, V. and U. Brandes (2005). "Efficient generation of large random networks." Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys 71(3 Pt 2A): 036113. Bauer, G. A. and P. M. Burgers (1990). "Molecular cloning, structure and expression of the yeast proliferating cell nuclear antigen gene." Nucleic Acids Res 18(2): 261265. Bechtel, P. E., R. J. Hickey, et al. (1998). "A unique form of proliferating cell nuclear antigen is present in malignant breast cells." Cancer Res 58(15): 3264-3269. Bell, S. P. and A. Dutta (2002). "DNA replication in eukaryotic cells." Annu Rev Biochem 71: 333-374. Bell, S. P. and B. Stillman (1992). "ATP-dependent recognition of eukaryotic origins of DNA replication by a multiprotein complex." Nature 357(6374): 128-134. 205 Bello, L. J. (1974). "Regulation of thymidine kinase synthesis in human cells." Exp Cell Res 89(2): 263-274. Belotserkovskaya, R. and D. Reinberg (2004). "Facts about FACT and transcript elongation through chromatin." Curr Opin Genet Dev 14(2): 139-146. Berezney, R., D. D. Dubey, et al. (2000). "Heterogeneity of eukaryotic replicons, replicon clusters, and replication foci." Chromosoma 108(8): 471-484. Bienko, M., C. M. Green, et al. (2005). "Ubiquitin-binding domains in Y-family polymerases regulate translesion synthesis." Science 310(5755): 1821-1824. Bostick, M., J. K. Kim, et al. (2007). "UHRF1 plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cells." Science 317(5845): 1760-1764. Boulton, S. J., A. Gartner, et al. (2002). "Combined functional genomic maps of the C. elegans DNA damage response." Science 295(5552): 127-131. Bouwmeester, T., A. Bauch, et al. (2004). "A physical and functional map of the human TNF-alpha/NF-kappa B signal transduction pathway." Nat Cell Biol 6(2): 97105. Bowman, G. D., M. O'Donnell, et al. (2004). "Structural analysis of a eukaryotic sliding DNA clamp-clamp loader complex." Nature 429(6993): 724-730. Bravo, R. and J. E. Celis (1980). "A search for differential polypeptide synthesis throughout the cell cycle of HeLa cells." J Cell Biol 84(3): 795-802. Bravo, R. and J. E. Celis (1982). "Up-dated catalogue of HeLa cell proteins: percentages and characteristics of the major cell polypeptides labeled with a mixture of 16 14C-labeled amino acids." Clin Chem 28(4 Pt 2): 766-781. Bravo, R. and J. E. Celis (1985). "Changes in the nuclear distribution of cyclin (PCNA) during S-phase are not triggered by post-translational modifications that are expected to moderately affect its charge." FEBS Lett 182(2): 435-440. Bravo, R., S. J. Fey, et al. (1981). "Identification of a nuclear and of a cytoplasmic polypeptide whose relative proportions are sensitive to changes in the rate of cell proliferation." Exp Cell Res 136(2): 311-319. Bravo, R. and H. Macdonald-Bravo (1987). "Existence of two populations of cyclin/proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle: association with DNA replication sites." J Cell Biol 105(4): 1549-1554. Bylund, G. O. and P. M. Burgers (2005). "Replication protein A-directed unloading of PCNA by the Ctf18 cohesion establishment complex." Mol Cell Biol 25(13): 5445-5455. Cardoso, M. C., A. Sporbert, et al. (1999). "Structure and function in the nucleus: subnuclear trafficking of DNA replication factors." J Cell Biochem Suppl 32-33: 15-23. Castellanos-Serra, L. and D. Paz-Lago (2002). "Inhibition of unwanted proteolysis during sample preparation: evaluation of its efficiency in challenge experiments." Electrophoresis 23(11): 1745-1753. Celis, J. E., R. Bravo, et al. (1984). "Cyclin: a nuclear protein whose level correlates directly with the proliferative state of normal as well as transformed cells." Leuk Res 8(2): 143-157. Celis, J. E., K. Dejgaard, et al. (1990). "The MRC-5 human embryonal lung fibroblast two-dimensional gel cellular protein database: quantitative identification of 206 polypeptides whose relative abundance differs between quiescent, proliferating and SV40 transformed cells." Electrophoresis 11(12): 1072-1113. Celis, J. E., P. Gromov, et al. (1996). "Human 2-D PAGE databases for proteome analysis in health and disease: http://biobase.dk/cgi-bin/celis." FEBS Lett 398(23): 129-134. Celis, J. E. and E. Olsen (1994). "A qualitative and quantitative protein database approach identifies individual and groups of functionally related proteins that are differentially regulated in simian virus 40 (SV40) transformed human keratinocytes: an overview of the functional changes associated with the transformed phenotype." Electrophoresis 15(3-4): 309-344. Champion, K. M., D. Arnott, et al. (1999). "A two-dimensional protein map of Chinese hamster ovary cells." Electrophoresis 20(4-5): 994-1000. Chang, X. Z., D. Q. Li, et al. (2007). "Identification of the functional role of peroxiredoxin 6 in the progression of breast cancer." Breast Cancer Res 9(6): R76. Chen, U., S. Chen, et al. (1996). "p21Cip1/Waf1 disrupts the recruitment of human Fen1 by proliferating-cell nuclear antigen into the DNA replication complex." Proc Natl Acad Sci U S A 93(21): 11597-11602. Choi, J. M., H. S. Lim, et al. (2007). "Crystal structure of the human GINS complex." Genes Dev 21(11): 1316-1321. Chon, H., A. Vassilev, et al. (2009). "Contributions of the two accessory subunits, RNASEH2B and RNASEH2C, to the activity and properties of the human RNase H2 complex." Nucleic Acids Res 37(1): 96-110. Chuang, L. C., L. K. Teixeira, et al. (2009). "Phosphorylation of Mcm2 by Cdc7 promotes pre-replication complex assembly during cell-cycle re-entry." Mol Cell 35(2): 206-216. Chuang, L. S., H. I. Ian, et al. (1997). "Human DNA-(cytosine-5) methyltransferasePCNA complex as a target for p21WAF1." Science 277(5334): 1996-2000. Chuang, R. Y. and T. J. Kelly (1999). "The fission yeast homologue of Orc4p binds to replication origin DNA via multiple AT-hooks." Proc Natl Acad Sci U S A 96(6): 2656-2661. Clark, A. B., F. Valle, et al. (2000). "Functional interaction of proliferating cell nuclear antigen with MSH2-MSH6 and MSH2-MSH3 complexes." J Biol Chem 275(47): 36498-36501. Collavin, L., A. Lunardi, et al. (2010). "p53-family proteins and their regulators: hubs and spokes in tumor suppression." Cell Death Differ 17(6): 901-911. Costa, A., T. Pape, et al. (2006). "Structural studies of the archaeal MCM complex in different functional states." J Struct Biol 156(1): 210-219. Czyzewska, J., K. Guzinska-Ustymowicz, et al. (2004). "Evaluation of proliferating markers Ki-67, PCNA in gastric cancers." Rocz Akad Med Bialymst 49 Suppl 1: 64-66. D'Alessandro, A., P. G. Righetti, et al. (2010). "The red blood cell proteome and interactome: an update." J Proteome Res 9(1): 144-163. Dahm, K. and U. Hubscher (2002). "Colocalization of human Rad17 and PCNA in late S phase of the cell cycle upon replication block." Oncogene 21(50): 7710-7719. 207 Dall'Era, M. A., A. Oudes, et al. (2007). "HSP27 and HSP70 interact with CD10 in C4-2 prostate cancer cells." Prostate 67(7): 714-721. Dalrymple, B. P., K. Kongsuwan, et al. (2001). "A universal protein-protein interaction motif in the eubacterial DNA replication and repair systems." Proc Natl Acad Sci U S A 98(20): 11627-11632. Das-Bradoo, S., R. M. Ricke, et al. (2006). "Interaction between PCNA and diubiquitinated Mcm10 is essential for cell growth in budding yeast." Mol Cell Biol 26(13): 4806-4817. Davis, B. J. (1964). "Disc Electrophoresis. Ii. Method and Application to Human Serum Proteins." Ann N Y Acad Sci 121: 404-427. Delmolino, L. M., P. Saha, et al. (2001). "Multiple mechanisms regulate subcellular localization of human CDC6." J Biol Chem 276(29): 26947-26954. Dianova, II, V. A. Bohr, et al. (2001). "Interaction of human AP endonuclease 1 with flap endonuclease 1 and proliferating cell nuclear antigen involved in long-patch base excision repair." Biochemistry 40(42): 12639-12644. Dijkwel, P. A. and J. L. Hamlin (1988). "Matrix attachment regions are positioned near replication initiation sites, genes, and an interamplicon junction in the amplified dihydrofolate reductase domain of Chinese hamster ovary cells." Mol Cell Biol 8(12): 5398-5409. Dotto, G. P. (2000). "p21(WAF1/Cip1): more than a break to the cell cycle?" Biochim Biophys Acta 1471(1): M43-56. Dralyuk, I., M. Brudno, et al. (2000). "ASDB: database of alternatively spliced genes." Nucleic Acids Res 28(1): 296-297. Drury, L. S., G. Perkins, et al. (2000). "The cyclin-dependent kinase Cdc28p regulates distinct modes of Cdc6p proteolysis during the budding yeast cell cycle." Curr Biol 10(5): 231-240. Ducoux, M., S. Urbach, et al. (2001). "Mediation of proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-dependent DNA replication through a conserved p21(Cip1)-like PCNAbinding motif present in the third subunit of human DNA polymerase delta." J Biol Chem 276(52): 49258-49266. Dzantiev, L., N. Constantin, et al. (2004). "A defined human system that supports bidirectional mismatch-provoked excision." Mol Cell 15(1): 31-41. Eberharter, A. and P. B. Becker (2002). "Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. Second in review series on chromatin dynamics." EMBO Rep 3(3): 224-229. Ehrlich, M., G. Jiang, et al. (2002). "Hypomethylation and hypermethylation of DNA in Wilms tumors." Oncogene 21(43): 6694-6702. Ehrlich, M., C. B. Woods, et al. (2006). "Quantitative analysis of associations between DNA hypermethylation, hypomethylation, and DNMT RNA levels in ovarian tumors." Oncogene 25(18): 2636-2645. Ellison, V. and B. Stillman (2001). "Opening of the clamp: an intimate view of an ATPdriven biological machine." Cell 106(6): 655-660. English, C. M., N. K. Maluf, et al. (2005). "ASF1 binds to a heterodimer of histones H3 and H4: a two-step mechanism for the assembly of the H3-H4 heterotetramer on DNA." Biochemistry 44(42): 13673-13682. 208 Esteve, P. O., H. G. Chin, et al. (2006). "Direct interaction between DNMT1 and G9a coordinates DNA and histone methylation during replication." Genes Dev 20(22): 3089-3103. Ewing, R. M., P. Chu, et al. (2007). "Large-scale mapping of human protein-protein interactions by mass spectrometry." Mol Syst Biol 3: 89. Fan, J., M. Otterlei, et al. (2004). "XRCC1 co-localizes and physically interacts with PCNA." Nucleic Acids Res 32(7): 2193-2201. Feldman, N., A. Gerson, et al. (2006). "G9a-mediated irreversible epigenetic inactivation of Oct-3/4 during early embryogenesis." Nat Cell Biol 8(2): 188-194. Ferrer, M., H. Lunsdorf, et al. (2004). "Functional consequences of single:double ring transitions in chaperonins: life in the cold." Mol Microbiol 53(1): 167-182. Fien, K. and B. Stillman (1992). "Identification of replication factor C from Saccharomyces cerevisiae: a component of the leading-strand DNA replication complex." Mol Cell Biol 12(1): 155-163. Fletcher, R. J., B. E. Bishop, et al. (2003). "The structure and function of MCM from archaeal M. Thermoautotrophicum." Nat Struct Biol 10(3): 160-167. Flores-Delgado, G., C. W. Liu, et al. (2007). "A limited screen for protein interactions reveals new roles for protein phosphatase 1 in cell cycle control and apoptosis." J Proteome Res 6(3): 1165-1175. Fox, M. H., D. J. Arndt-Jovin, et al. (1991). "Spatial and temporal distribution of DNA replication sites localized by immunofluorescence and confocal microscopy in mouse fibroblasts." J Cell Sci 99 ( Pt 2): 247-253. Freire, J., G. Covelo, et al. (2001). "Identification of nuclear-import and cell-cycle regulatory proteins that bind to prothymosin alpha." Biochem Cell Biol 79(2): 123-131. Friedberg, E. C., A. R. Lehmann, et al. (2005). "Trading places: how do DNA polymerases switch during translesion DNA synthesis?" Mol Cell 18(5): 499-505. Frouin, I., G. Maga, et al. (2003). "Human proliferating cell nuclear antigen, poly(ADPribose) polymerase-1, and p21waf1/cip1. A dynamic exchange of partners." J Biol Chem 278(41): 39265-39268. Frouin, I., A. Montecucco, et al. (2002). "Cell cycle-dependent dynamic association of cyclin/Cdk complexes with human DNA replication proteins." EMBO J 21(10): 2485-2495. Fujise, K., D. Zhang, et al. (2000). "Regulation of apoptosis and cell cycle progression by MCL1. Differential role of proliferating cell nuclear antigen." J Biol Chem 275(50): 39458-39465. Fujita, N., S. Watanabe, et al. (2003). "Methyl-CpG binding domain 1 (MBD1) interacts with the Suv39h1-HP1 heterochromatic complex for DNA methylation-based transcriptional repression." J Biol Chem 278(26): 24132-24138. Fuks, F., W. A. Burgers, et al. (2000). "DNA methyltransferase Dnmt1 associates with histone deacetylase activity." Nat Genet 24(1): 88-91. Fukuda, K., H. Morioka, et al. (1995). "Structure-function relationship of the eukaryotic DNA replication factor, proliferating cell nuclear antigen." J Biol Chem 270(38): 22527-22534. 209 Fung, D. C., M. R. Wilkins, et al. (2010). "Using the clustered circular layout as an informative method for visualizing protein-protein interaction networks." Proteomics. Gaillard, P. H., E. M. Martini, et al. (1996). "Chromatin assembly coupled to DNA repair: a new role for chromatin assembly factor I." Cell 86(6): 887-896. Gambus, A., R. C. Jones, et al. (2006). "GINS maintains association of Cdc45 with MCM in replisome progression complexes at eukaryotic DNA replication forks." Nat Cell Biol 8(4): 358-366. Game, J. C. and P. D. Kaufman (1999). "Role of Saccharomyces cerevisiae chromatin assembly factor-I in repair of ultraviolet radiation damage in vivo." Genetics 151(2): 485-497. Garg, P. and P. M. Burgers (2005). "Ubiquitinated proliferating cell nuclear antigen activates translesion DNA polymerases eta and REV1." Proc Natl Acad Sci U S A 102(51): 18361-18366. Garrels, J. I., B. R. Franza, et al. (1990). "Quantitative exploration of the REF52 protein database: cluster analysis reveals the major protein expression profiles in responses to growth regulation, serum stimulation, and viral transformation." Electrophoresis 11(12): 1114-1130. Garrels, J. I. and B. R. Franza, Jr. (1989). "Transformation-sensitive and growth-related changes of protein synthesis in REF52 cells. A two-dimensional gel analysis of SV40-, adenovirus-, and Kirsten murine sarcoma virus-transformed rat cells using the REF52 protein database." J Biol Chem 264(9): 5299-5312. Gartel, A. L., M. S. Serfas, et al. (1996). "p21--negative regulator of the cell cycle." Proc Soc Exp Biol Med 213(2): 138-149. Gary, R., D. L. Ludwig, et al. (1997). "The DNA repair endonuclease XPG binds to proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and shares sequence elements with the PCNA-binding regions of FEN-1 and cyclin-dependent kinase inhibitor p21." J Biol Chem 272(39): 24522-24529. Gasteiger, E., A. Gattiker, et al. (2003). "ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis." Nucleic Acids Res 31(13): 3784-3788. Gatenby, R. A. and R. J. Gillies (2007). "Glycolysis in cancer: a potential target for therapy." Int J Biochem Cell Biol 39(7-8): 1358-1366. Gerard, A., S. Koundrioukoff, et al. (2006). "The replication kinase Cdc7-Dbf4 promotes the interaction of the p150 subunit of chromatin assembly factor 1 with proliferating cell nuclear antigen." EMBO Rep 7(8): 817-823. Gerner, C., K. Holzmann, et al. (1998). "Similarity between nuclear matrix proteins of various cells revealed by an improved isolation method." J Cell Biochem 71(3): 363-374. Gilbert, D. M., A. Neilson, et al. (1995). "Mimosine arrests DNA synthesis at replication forks by inhibiting deoxyribonucleotide metabolism." J Biol Chem 270(16): 95979606. Gilljam, K. M., E. Feyzi, et al. (2009). "Identification of a novel, widespread, and functionally important PCNA-binding motif." J Cell Biol 186(5): 645-654. Giot, L., J. S. Bader, et al. (2003). "A protein interaction map of Drosophila melanogaster." Science 302(5651): 1727-1736. 210 Glozak, M. A., N. Sengupta, et al. (2005). "Acetylation and deacetylation of non-histone proteins." Gene 363: 15-23. Gomez-Llorente, Y., R. J. Fletcher, et al. (2005). "Polymorphism and double hexamer structure in the archaeal minichromosome maintenance (MCM) helicase from Methanobacterium thermoautotrophicum." J Biol Chem 280(49): 40909-40915. Gonen, H., C. E. Smith, et al. (1994). "Protein synthesis elongation factor EF-1 alpha is essential for ubiquitin-dependent degradation of certain N alpha-acetylated proteins and may be substituted for by the bacterial elongation factor EF-Tu." Proc Natl Acad Sci U S A 91(16): 7648-7652. Gonzales, A. J., T. L. Goldsworthy, et al. (1998). "Chemical transformation of mouse liver cells results in altered cyclin D-CDK protein complexes." Carcinogenesis 19(6): 1093-1102. Gonzalez, M. A., K. E. Tachibana, et al. (2006). "Geminin is essential to prevent endoreduplication and to form pluripotent cells during mammalian development." Genes Dev 20(14): 1880-1884. Gothel, S. F. and M. A. Marahiel (1999). "Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, a superfamily of ubiquitous folding catalysts." Cell Mol Life Sci 55(3): 423-436. Gribun, A., M. S. Kimber, et al. (2005). "The ClpP double ring tetradecameric protease exhibits plastic ring-ring interactions, and the N termini of its subunits form flexible loops that are essential for ClpXP and ClpAP complex formation." J Biol Chem 280(16): 16185-16196. Groth, A., D. Ray-Gallet, et al. (2005). "Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress." Mol Cell 17(2): 301-311. Groth, A., W. Rocha, et al. (2007). "Chromatin challenges during DNA replication and repair." Cell 128(4): 721-733. Grzanka, A., Z. Skok, et al. (2000). "The expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in leukemia cell lines HL-60 and K-562 at the light and electron microscope level." Neoplasma 47(5): 288-293. Guichet, A., J. W. Copeland, et al. (1997). "The nuclear receptor homologue Ftz-F1 and the homeodomain protein Ftz are mutually dependent cofactors." Nature 385(6616): 548-552. Gulbis, J. M., Z. Kelman, et al. (1996). "Structure of the C-terminal region of p21(WAF1/CIP1) complexed with human PCNA." Cell 87(2): 297-306. Guo, C., T. S. Tang, et al. (2006). "Ubiquitin-binding motifs in REV1 protein are required for its role in the tolerance of DNA damage." Mol Cell Biol 26(23): 8892-8900. Hackett, A. J., H. S. Smith, et al. (1977). "Two syngeneic cell lines from human breast tissue: the aneuploid mammary epithelial (Hs578T) and the diploid myoepithelial (Hs578Bst) cell lines." J Natl Cancer Inst 58(6): 1795-1806. Hall, P. A., J. M. Kearsey, et al. (1995). "Characterisation of the interaction between PCNA and Gadd45." Oncogene 10(12): 2427-2433. Han, J. D., N. Bertin, et al. (2004). "Evidence for dynamically organized modularity in the yeast protein-protein interaction network." Nature 430(6995): 88-93. Haracska, L., R. E. Johnson, et al. (2001). "Physical and functional interactions of human DNA polymerase eta with PCNA." Mol Cell Biol 21(21): 7199-7206. 211 Haracska, L., R. E. Johnson, et al. (2001). "Targeting of human DNA polymerase iota to the replication machinery via interaction with PCNA." Proc Natl Acad Sci U S A 98(25): 14256-14261. Haracska, L., I. Unk, et al. (2002). "Stimulation of DNA synthesis activity of human DNA polymerase kappa by PCNA." Mol Cell Biol 22(3): 784-791. Harlow D.L. (Ed.) (1999). "Using Antibodies: A Laboratory Manual " Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, . Hasan, S., P. O. Hassa, et al. (2001). "Transcription coactivator p300 binds PCNA and may have a role in DNA repair synthesis." Nature 410(6826): 387-391. Hasan, S. and M. O. Hottiger (2002). "Histone acetyl transferases: a role in DNA repair and DNA replication." J Mol Med 80(8): 463-474. Hayduk, E. J., L. H. Choe, et al. (2004). "A two-dimensional electrophoresis map of Chinese hamster ovary cell proteins based on fluorescence staining." Electrophoresis 25(15): 2545-2556. He, H., C. K. Tan, et al. (2001). "A tumor necrosis factor alpha- and interleukin 6inducible protein that interacts with the small subunit of DNA polymerase delta and proliferating cell nuclear antigen." Proc Natl Acad Sci U S A 98(21): 1197911984. Henderson, D. S., U. K. Wiegand, et al. (2000). "Mutual correction of faulty PCNA subunits in temperature-sensitive lethal mus209 mutants of Drosophila melanogaster." Genetics 154(4): 1721-1733. Henneke, G., E. Friedrich-Heineken, et al. (2003). "Flap endonuclease 1: a novel tumour suppresser protein." Trends Biochem Sci 28(7): 384-390. Herbert, B., M. Galvani, et al. (2001). "Reduction and alkylation of proteins in preparation of two-dimensional map analysis: why, when, and how?" Electrophoresis 22(10): 2046-2057. Herendeen, D. R., G. A. Kassavetis, et al. (1992). "A transcriptional enhancer whose function imposes a requirement that proteins track along DNA." Science 256(5061): 1298-1303. Hervouet, E., L. Lalier, et al. (2010). "Disruption of Dnmt1/PCNA/UHRF1 interactions promotes tumorigenesis from human and mice glial cells." PLoS One 5(6): e11333. Ho, Y., A. Gruhler, et al. (2002). "Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry." Nature 415(6868): 180-183. Hoege, C., B. Pfander, et al. (2002). "RAD6-dependent DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO." Nature 419(6903): 135-141. Hoelz, D. J., R. J. Arnold, et al. (2006). "The discovery of labile methyl esters on proliferating cell nuclear antigen by MS/MS." Proteomics 6(17): 4808-4816. Hong, R. and D. Chakravarti (2003). "The human proliferating Cell nuclear antigen regulates transcriptional coactivator p300 activity and promotes transcriptional repression." J Biol Chem 278(45): 44505-44513. Houtman, J. C., M. Barda-Saad, et al. (2005). "Examining multiprotein signaling complexes from all angles." FEBS J 272(21): 5426-5435. Hu, J. and Y. Xiong (2006). "An evolutionarily conserved function of proliferating cell nuclear antigen for Cdt1 degradation by the Cul4-Ddb1 ubiquitin ligase in response to DNA damage." J Biol Chem 281(7): 3753-3756. 212 Ibe, S., K. Fujita, et al. (2001). "Terminal deoxynucleotidyltransferase is negatively regulated by direct interaction with proliferating cell nuclear antigen." Genes Cells 6(9): 815-824. Ideker, T., T. Galitski, et al. (2001). "A new approach to decoding life: systems biology." Annu Rev Genomics Hum Genet 2: 343-372. Iida, T., I. Suetake, et al. (2002). "PCNA clamp facilitates action of DNA cytosine methyltransferase 1 on hemimethylated DNA." Genes Cells 7(10): 997-1007. Ikeda, F. and I. Dikic (2008). "Atypical ubiquitin chains: new molecular signals. 'Protein Modifications: Beyond the Usual Suspects' review series." EMBO Rep 9(6): 536542. Ino, H. and T. Chiba (2000). "Expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in the adult and developing mouse nervous system." Brain Res Mol Brain Res 78(12): 163-174. Iragne, F., M. Nikolski, et al. (2005). "ProViz: protein interaction visualization and exploration." Bioinformatics 21(2): 272-274. Ise, T., G. Nagatani, et al. (1999). "Transcription factor Y-box binding protein 1 binds preferentially to cisplatin-modified DNA and interacts with proliferating cell nuclear antigen." Cancer Res 59(2): 342-346. Ito, T., K. Tashiro, et al. (2000). "Toward a protein-protein interaction map of the budding yeast: A comprehensive system to examine two-hybrid interactions in all possible combinations between the yeast proteins." Proc Natl Acad Sci U S A 97(3): 1143-1147. Jackson, D. A. and A. Pombo (1998). "Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells." J Cell Biol 140(6): 12851295. Jallepalli, P. V., G. W. Brown, et al. (1997). "Regulation of the replication initiator protein p65cdc18 by CDK phosphorylation." Genes Dev 11(21): 2767-2779. Jaskulski, D., C. Gatti, et al. (1988). "Regulation of the proliferating cell nuclear antigen cyclin and thymidine kinase mRNA levels by growth factors." J Biol Chem 263(21): 10175-10179. Jensen, L. J., M. Kuhn, et al. (2009). "STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms." Nucleic Acids Res 37(Database issue): D412-416. Jenuwein, T. and C. D. Allis (2001). "Translating the histone code." Science 293(5532): 1074-1080. Johnson, A. and M. O'Donnell (2005). "Cellular DNA replicases: components and dynamics at the replication fork." Annu Rev Biochem 74: 283-315. Johnson, E. S. (2004). "Protein modification by SUMO." Annu Rev Biochem 73: 355-382. Jonsson, Z. O., R. Hindges, et al. (1998). "Regulation of DNA replication and repair proteins through interaction with the front side of proliferating cell nuclear antigen." EMBO J 17(8): 2412-2425. Jonsson, Z. O. and U. Hubscher (1997). "Proliferating cell nuclear antigen: more than a clamp for DNA polymerases." Bioessays 19(11): 967-975. Ju, B. H., B. Park, et al. (2003). "Visualization and analysis of protein interactions." Bioinformatics 19(2): 317-318. 213 Kaba, A., P. H. Jiang, et al. (1999). "Sarcolectin (SCL): structure and expression of the recombinant molecule." Biochimie 81(7): 709-715. Kannouche, P. L. and A. R. Lehmann (2004). "Ubiquitination of PCNA and the polymerase switch in human cells." Cell Cycle 3(8): 1011-1013. Kannouche, P. L., J. Wing, et al. (2004). "Interaction of human DNA polymerase eta with monoubiquitinated PCNA: a possible mechanism for the polymerase switch in response to DNA damage." Mol Cell 14(4): 491-500. Kawabe, T., M. Suganuma, et al. (2002). "Cdc25C interacts with PCNA at G2/M transition." Oncogene 21(11): 1717-1726. Kedar, P. S., S. J. Kim, et al. (2002). "Direct interaction between mammalian DNA polymerase beta and proliferating cell nuclear antigen." J Biol Chem 277(34): 31115-31123. Kennedy, B. K., D. A. Barbie, et al. (2000). "Nuclear organization of DNA replication in primary mammalian cells." Genes Dev 14(22): 2855-2868. Kerns, S. L., S. J. Torke, et al. (2007). "Geminin prevents rereplication during xenopus development." J Biol Chem 282(8): 5514-5521. Kim, H. T., K. P. Kim, et al. (2007). "Certain pairs of ubiquitin-conjugating enzymes (E2s) and ubiquitin-protein ligases (E3s) synthesize nondegradable forked ubiquitin chains containing all possible isopeptide linkages." J Biol Chem 282(24): 17375-17386. Kim, K. J., J. W. Chung, et al. (2005). "67-kDa laminin receptor promotes internalization of cytotoxic necrotizing factor 1-expressing Escherichia coli K1 into human brain microvascular endothelial cells." J Biol Chem 280(2): 1360-1368. Kinebuchi, T., W. Kagawa, et al. (2004). "Structural basis for octameric ring formation and DNA interaction of the human homologous-pairing protein Dmc1." Mol Cell 14(3): 363-374. Kirisako, T., K. Kamei, et al. (2006). "A ubiquitin ligase complex assembles linear polyubiquitin chains." EMBO J 25(20): 4877-4887. Klammer, M., S. Roopra, et al. (2008). "jSquid: a Java applet for graphical on-line network exploration." Bioinformatics 24(12): 1467-1468. Kleczkowska, H. E., G. Marra, et al. (2001). "hMSH3 and hMSH6 interact with PCNA and colocalize with it to replication foci." Genes Dev 15(6): 724-736. Ko, R. and S. E. Bennett (2005). "Physical and functional interaction of human nuclear uracil-DNA glycosylase with proliferating cell nuclear antigen." DNA Repair (Amst) 4(12): 1421-1431. Koberna, K., A. Ligasova, et al. (2005). "Electron microscopy of DNA replication in 3-D: evidence for similar-sized replication foci throughout S-phase." J Cell Biochem 94(1): 126-138. Kohn, K. W., M. I. Aladjem, et al. (2006). "Depicting combinatorial complexity with the molecular interaction map notation." Mol Syst Biol 2: 51. Kohn, K. W., M. I. Aladjem, et al. (2006). "Molecular interaction maps of bioregulatory networks: a general rubric for systems biology." Mol Biol Cell 17(1): 1-13. Kohn, K. W., M. I. Aladjem, et al. (2008). "Chromatin challenges during DNA replication: a systems representation." Mol Biol Cell 19(1): 1-7. 214 Kong, D. and M. L. DePamphilis (2001). "Site-specific DNA binding of the Schizosaccharomyces pombe origin recognition complex is determined by the Orc4 subunit." Mol Cell Biol 21(23): 8095-8103. Koundrioukoff, S., Z. O. Jonsson, et al. (2000). "A direct interaction between proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and Cdk2 targets PCNA-interacting proteins for phosphorylation." J Biol Chem 275(30): 22882-22887. Kouzarides, T. (2000). "Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation?" EMBO J 19(6): 1176-1179. Krejci, L., S. Van Komen, et al. (2003). "DNA helicase Srs2 disrupts the Rad51 presynaptic filament." Nature 423(6937): 305-309. Krishna, T. S., X. P. Kong, et al. (1994). "Crystal structure of the eukaryotic DNA polymerase processivity factor PCNA." Cell 79(7): 1233-1243. Krogan, N. J., G. Cagney, et al. (2006). "Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae." Nature 440(7084): 637-643. Kubota, Y., Y. Takase, et al. (2003). "A novel ring-like complex of Xenopus proteins essential for the initiation of DNA replication." Genes Dev 17(9): 1141-1152. Kues, W. A., M. Anger, et al. (2000). "Cell cycle synchronization of porcine fetal fibroblasts: effects of serum deprivation and reversible cell cycle inhibitors." Biol Reprod 62(2): 412-419. Kulkarni, G., D. A. Turbin, et al. (2007). "Expression of protein elongation factor eEF1A2 predicts favorable outcome in breast cancer." Breast Cancer Res Treat 102(1): 31-41. Kunkel, T. A. and K. Bebenek (2000). "DNA replication fidelity." Annu Rev Biochem 69: 497-529. Kurganov, B. I. and A. E. Liubarev (1988). "[Hypothetical structure of the glycolytic enzyme complex (glycolytic metabolon) formed on erythrocyte membranes]." Mol Biol (Mosk) 22(6): 1605-1613. Kuriyan, J. and M. O'Donnell (1993). "Sliding clamps of DNA polymerases." J Mol Biol 234(4): 915-925. Laemmli, U. K. (1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature 227(5259): 680-685. Lebel, M., E. A. Spillare, et al. (1999). "The Werner syndrome gene product co-purifies with the DNA replication complex and interacts with PCNA and topoisomerase I." J Biol Chem 274(53): 37795-37799. Lee, H., J. M. Larner, et al. (1997). "A p53-independent damage-sensing mechanism that functions as a checkpoint at the G1/S transition in Chinese hamster ovary cells." Proc Natl Acad Sci U S A 94(2): 526-531. Lee, H. and S. H. Naryzhny (2006). Coordination of multiple cellular functions by PCNA: Implication of the PCNA double trimer model. PCNA(ed. Lee,H). Kerala, India, Research Signpost: 214 p. Lehnertz, B., Y. Ueda, et al. (2003). "Suv39h-mediated histone H3 lysine 9 methylation directs DNA methylation to major satellite repeats at pericentric heterochromatin." Curr Biol 13(14): 1192-1200. Leonhardt, H., A. W. Page, et al. (1992). "A targeting sequence directs DNA methyltransferase to sites of DNA replication in mammalian nuclei." Cell 71(5): 865-873. 215 Leonhardt, H., H. P. Rahn, et al. (2000). "Dynamics of DNA replication factories in living cells." J Cell Biol 149(2): 271-280. Levin, D. S., W. Bai, et al. (1997). "An interaction between DNA ligase I and proliferating cell nuclear antigen: implications for Okazaki fragment synthesis and joining." Proc Natl Acad Sci U S A 94(24): 12863-12868. Li, D., R. Zhao, et al. (2003). "Structure of the replicative helicase of the oncoprotein SV40 large tumour antigen." Nature 423(6939): 512-518. Li, F., J. Chen, et al. (2001). "The replication timing program of the Chinese hamster beta-globin locus is established coincident with its repositioning near peripheral heterochromatin in early G1 phase." J Cell Biol 154(2): 283-292. Li, H., B. Xie, et al. (2006). "Functional roles of p12, the fourth subunit of human DNA polymerase delta." J Biol Chem 281(21): 14748-14755. Lim, Y. P. (2005). "Mining the tumor phosphoproteome for cancer markers." Clin Cancer Res 11(9): 3163-3169. Ling, X., S. Kamangar, et al. (2000). "Proliferating cell nuclear antigen as the cell cycle sensor for an HLA-derived peptide blocking T cell proliferation." J Immunol 164(12): 6188-6192. Littlefield, J. W. (1966). "The periodic synthesis of thymidine kinase in mouse fibroblasts." Biochim Biophys Acta 114(2): 398-403. Liu, E. T. (2005). "Systems biology, integrative biology, predictive biology." Cell 121(4): 505-506. Liu, L., E. M. Rodriguez-Belmonte, et al. (2003). "Identification of a novel protein, PDIP38, that interacts with the p50 subunit of DNA polymerase delta and proliferating cell nuclear antigen." J Biol Chem 278(12): 10041-10047. Loor, G., S. J. Zhang, et al. (1997). "Identification of DNA replication and cell cycle proteins that interact with PCNA." Nucleic Acids Res 25(24): 5041-5046. Loyola, A., T. Bonaldi, et al. (2006). "PTMs on H3 variants before chromatin assembly potentiate their final epigenetic state." Mol Cell 24(2): 309-316. Ma, H., J. Samarabandu, et al. (1998). "Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells." J Cell Biol 143(6): 1415-1425. Macindoe, G., L. Mavridis, et al. (2010). "HexServer: an FFT-based protein docking server powered by graphics processors." Nucleic Acids Res 38 Suppl: W445-449. Maga, G. and U. Hubscher (2003). "Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): a dancer with many partners." J Cell Sci 116(Pt 15): 3051-3060. Maga, G., G. Villani, et al. (2002). "Human DNA polymerase lambda functionally and physically interacts with proliferating cell nuclear antigen in normal and translesion DNA synthesis." J Biol Chem 277(50): 48434-48440. Mahajan, R., C. Delphin, et al. (1997). "A small ubiquitin-related polypeptide involved in targeting RanGAP1 to nuclear pore complex protein RanBP2." Cell 88(1): 97107. Maison, C. and G. Almouzni (2004). "HP1 and the dynamics of heterochromatin maintenance." Nat Rev Mol Cell Biol 5(4): 296-304. Majka, J. and P. M. Burgers (2004). "The PCNA-RFC families of DNA clamps and clamp loaders." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 78: 227-260. 216 Malkas, L. H., B. S. Herbert, et al. (2006). "A cancer-associated PCNA expressed in breast cancer has implications as a potential biomarker." Proc Natl Acad Sci U S A 103(51): 19472-19477. Mann, M. and O. N. Jensen (2003). "Proteomic analysis of post-translational modifications." Nat Biotechnol 21(3): 255-261. Masai, H., C. Taniyama, et al. (2006). "Phosphorylation of MCM4 by Cdc7 kinase facilitates its interaction with Cdc45 on the chromatin." J Biol Chem 281(51): 39249-39261. Mathews, M. B., R. M. Bernstein, et al. (1984). "Identity of the proliferating cell nuclear antigen and cyclin." Nature 309(5966): 374-376. Matsumiya, S., S. Ishino, et al. (2002). "Physical interaction between proliferating cell nuclear antigen and replication factor C from Pyrococcus furiosus." Genes Cells 7(9): 911-922. Matsuoka, S., M. Yamaguchi, et al. (1994). "D-type cyclin-binding regions of proliferating cell nuclear antigen." J Biol Chem 269(15): 11030-11036. Matunis, M. J., J. Wu, et al. (1998). "SUMO-1 modification and its role in targeting the Ran GTPase-activating protein, RanGAP1, to the nuclear pore complex." J Cell Biol 140(3): 499-509. Mayer, B. J. (1999). "Protein-protein interactions in signaling cascades." Mol Biotechnol 13(3): 201-213. McAlear, M. A., E. A. Howell, et al. (1994). "Proliferating cell nuclear antigen (pol30) mutations suppress cdc44 mutations and identify potential regions of interaction between the two encoded proteins." Mol Cell Biol 14(7): 4390-4397. McGarry, T. J. and M. W. Kirschner (1998). "Geminin, an inhibitor of DNA replication, is degraded during mitosis." Cell 93(6): 1043-1053. Mello, J. A., H. H. Sillje, et al. (2002). "Human Asf1 and CAF-1 interact and synergize in a repair-coupled nucleosome assembly pathway." EMBO Rep 3(4): 329-334. Milutinovic, S., Q. Zhuang, et al. (2002). "Proliferating cell nuclear antigen associates with histone deacetylase activity, integrating DNA replication and chromatin modification." J Biol Chem 277(23): 20974-20978. Minguez, P., S. Gotz, et al. (2009). "SNOW, a web-based tool for the statistical analysis of protein-protein interaction networks." Nucleic Acids Res 37(Web Server issue): W109-114. Miyachi, K., M. J. Fritzler, et al. (1978). "Autoantibody to a nuclear antigen in proliferating cells." J Immunol 121(6): 2228-2234. Moggs, J. G., P. Grandi, et al. (2000). "A CAF-1-PCNA-mediated chromatin assembly pathway triggered by sensing DNA damage." Mol Cell Biol 20(4): 1206-1218. Moldovan, G. L., B. Pfander, et al. (2006). "PCNA controls establishment of sister chromatid cohesion during S phase." Mol Cell 23(5): 723-732. Moldovan, G. L., B. Pfander, et al. (2007). "PCNA, the maestro of the replication fork." Cell 129(4): 665-679. Montecucco, A., R. Rossi, et al. (1998). "DNA ligase I is recruited to sites of DNA replication by an interaction with proliferating cell nuclear antigen: identification of a common targeting mechanism for the assembly of replication factories." EMBO J 17(13): 3786-3795. 217 Morell-Quadreny, L., F. Clar-Blanch, et al. (1998). "Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) as a prognostic factor in renal cell carcinoma." Anticancer Res 18(1B): 677-682. Morris, G. F. and M. B. Mathews (1989). "Regulation of proliferating cell nuclear antigen during the cell cycle." J Biol Chem 264(23): 13856-13864. Morrow, P. W., H. Y. Tung, et al. (2004). "Rapamycin causes activation of protein phosphatase-2A1 and nuclear translocation of PCNA in CD4+ T cells." Biochem Biophys Res Commun 323(2): 645-651. Motegi, A., K. Kuntz, et al. (2006). "Regulation of gross chromosomal rearrangements by ubiquitin and SUMO ligases in Saccharomyces cerevisiae." Mol Cell Biol 26(4): 1424-1433. Mousson, F., A. Lautrette, et al. (2005). "Structural basis for the interaction of Asf1 with histone H3 and its functional implications." Proc Natl Acad Sci U S A 102(17): 5975-5980. Muller-Weeks, S. J. and S. Caradonna (1996). "Specific association of cyclin-like uracilDNA glycosylase with the proliferating cell nuclear antigen." Exp Cell Res 226(2): 346-355. Nakamura, H., T. Morita, et al. (1986). "Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus." Exp Cell Res 165(2): 291-297. Nakayasu, H. and R. Berezney (1989). "Mapping replicational sites in the eucaryotic cell nucleus." J Cell Biol 108(1): 1-11. Naryzhny, S. N. (1996). "Upside-down stopped-flow electrofractionation of complex protein mixtures." Anal Biochem 238(1): 50-53. Naryzhny, S. N. (2007). Coordination of multiple cellular functions by proliferating cell nuclear antigen (PCNA): Structure-functional aspect. . Gatchina. Naryzhny, S. N. (2008). "Proliferating cell nuclear antigen: a proteomics view." Cell Mol Life Sci 65(23): 3789-3808. Naryzhny, S. N. (2009). "Blue Dry Western: simple, economic, informative, and fast way of immunodetection." Anal Biochem 392(1): 90-95. Naryzhny, S. N., L. V. Desouza, et al. (2006). "Characterization of the human proliferating cell nuclear antigen physico-chemical properties: aspects of double trimer stability." Biochem Cell Biol 84(5): 669-676. Naryzhny, S. N. and H. Lee (2001). "Protein profiles of the Chinese hamster ovary cells in the resting and proliferating stages." Electrophoresis 22(9): 1764-1775. Naryzhny, S. N. and H. Lee (2003). "Observation of multiple isoforms and specific proteolysis patterns of proliferating cell nuclear antigen in the context of cell cycle compartments and sample preparations." Proteomics 3(6): 930-936. Naryzhny, S. N. and H. Lee (2004). "The post-translational modifications of proliferating cell nuclear antigen: acetylation, not phosphorylation, plays an important role in the regulation of its function." J Biol Chem 279(19): 20194-20199. Naryzhny, S. N. and H. Lee (2007). "Characterization of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) isoforms in normal and cancer cells: there is no cancerassociated form of PCNA." FEBS Lett 581(25): 4917-4920. Naryzhny, S. N. and H. Lee (2010). "Proliferating cell nuclear antigen in the cytoplasm interacts with components of glycolysis and cancer." FEBS Lett. 218 Naryzhny, S. N., H. Zhao, et al. (2005). "Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) may function as a double homotrimer complex in the mammalian cell." J Biol Chem 280(14): 13888-13894. Naryzhnyi, S. N. and V. M. Krutiakov (1989). "[Analysis of proteins in normal and regenerating rat liver using two-dimensional electrophoresis]." Biokhimiia 54(12): 2030-2036. Nasmyth, K. (1996). "Viewpoint: putting the cell cycle in order." Science 274(5293): 1643-1645. Natale, D. A., R. M. Umek, et al. (1993). "Ease of DNA unwinding is a conserved property of yeast replication origins." Nucleic Acids Res 21(3): 555-560. Neuwald, A. F., L. Aravind, et al. (1999). "AAA+: A class of chaperone-like ATPases associated with the assembly, operation, and disassembly of protein complexes." Genome Res 9(1): 27-43. Nieduszynski, C. A., Y. Knox, et al. (2006). "Genome-wide identification of replication origins in yeast by comparative genomics." Genes Dev 20(14): 1874-1879. Niimi, A., N. Suka, et al. (2001). "Co-localization of chicken DNA topoisomerase IIalpha, but not beta, with sites of DNA replication and possible involvement of a Cterminal region of alpha through its binding to PCNA." Chromosoma 110(2): 102-114. O'Keefe, R. T., S. C. Henderson, et al. (1992). "Dynamic organization of DNA replication in mammalian cell nuclei: spatially and temporally defined replication of chromosome-specific alpha-satellite DNA sequences." J Cell Biol 116(5): 10951110. Oakley, B. R., D. R. Kirsch, et al. (1980). "A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels." Anal Biochem 105(2): 361-363. Ohta, S., Y. Shiomi, et al. (2002). "A proteomics approach to identify proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-binding proteins in human cell lysates. Identification of the human CHL12/RFCs2-5 complex as a novel PCNA-binding protein." J Biol Chem 277(43): 40362-40367. Okuzawa, K., B. Franzen, et al. (1994). "Characterization of gene expression in clinical lung cancer materials by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis." Electrophoresis 15(3-4): 382-390. Orlando, V. (2000). "Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehydecrosslinked-chromatin immunoprecipitation." Trends Biochem Sci 25(3): 99-104. Ornstein, L. (1964). "Disc Electrophoresis. I. Background and Theory." Ann N Y Acad Sci 121: 321-349. Otterlei, M., E. Warbrick, et al. (1999). "Post-replicative base excision repair in replication foci." EMBO J 18(13): 3834-3844. Ovadi, J. (1988). "Old pathway--new concept: control of glycolysis by metabolitemodulated dynamic enzyme associations." Trends Biochem Sci 13(12): 486-490. Oyama, M., M. Wakasugi, et al. (2004). "Human NTH1 physically interacts with p53 and proliferating cell nuclear antigen." Biochem Biophys Res Commun 321(1): 183191. Pape, T., H. Meka, et al. (2003). "Hexameric ring structure of the full-length archaeal MCM protein complex." EMBO Rep 4(11): 1079-1083. 219 Papouli, E., S. Chen, et al. (2005). "Crosstalk between SUMO and ubiquitin on PCNA is mediated by recruitment of the helicase Srs2p." Mol Cell 19(1): 123-133. Pardee, A. B. (1989). "G1 events and regulation of cell proliferation." Science 246(4930): 603-608. Parker, A., Y. Gu, et al. (2001). "Human homolog of the MutY repair protein (hMYH) physically interacts with proteins involved in long patch DNA base excision repair." J Biol Chem 276(8): 5547-5555. Pascal, J. M., P. J. O'Brien, et al. (2004). "Human DNA ligase I completely encircles and partially unwinds nicked DNA." Nature 432(7016): 473-478. Paunesku, T., S. Mittal, et al. (2001). "Proliferating cell nuclear antigen (PCNA): ringmaster of the genome." Int J Radiat Biol 77(10): 1007-1021. Pelizon, C., M. A. Madine, et al. (2000). "Unphosphorylatable mutants of Cdc6 disrupt its nuclear export but still support DNA replication once per cell cycle." Genes Dev 14(19): 2526-2533. Pena-Alonso, E., J. P. Rodrigo, et al. (2008). "Annexin A2 localizes to the basal epithelial layer and is down-regulated in dysplasia and head and neck squamous cell carcinoma." Cancer Lett 263(1): 89-98. Peng, J., D. Schwartz, et al. (2003). "A proteomics approach to understanding protein ubiquitination." Nat Biotechnol 21(8): 921-926. Pfander, B., G. L. Moldovan, et al. (2005). "SUMO-modified PCNA recruits Srs2 to prevent recombination during S phase." Nature 436(7049): 428-433. Phelps, M. E., E. J. Hoffman, et al. (1975). "Application of annihilation coincidence detection to transaxial reconstruction tomography." J Nucl Med 16(3): 210-224. Pichler, A., A. Gast, et al. (2002). "The nucleoporin RanBP2 has SUMO1 E3 ligase activity." Cell 108(1): 109-120. Pinto, P. V., A. Kaplan, et al. (1969). "Aldolase. II. Spectrophotometric determination using an ultraviolet procedure." Clin Chem 15(5): 349-360. Podust, L. M., V. N. Podust, et al. (1995). "Mammalian DNA polymerase auxiliary proteins: analysis of replication factor C-catalyzed proliferating cell nuclear antigen loading onto circular double-stranded DNA." Mol Cell Biol 15(6): 30723081. Podust, V. N., L. M. Podust, et al. (1995). "Mechanism of inhibition of proliferating cell nuclear antigen-dependent DNA synthesis by the cyclin-dependent kinase inhibitor p21." Biochemistry 34(27): 8869-8875. Polo, S. E. and G. Almouzni (2006). "Chromatin assembly: a basic recipe with various flavours." Curr Opin Genet Dev 16(2): 104-111. Poot, R. A., L. Bozhenok, et al. (2004). "The Williams syndrome transcription factor interacts with PCNA to target chromatin remodelling by ISWI to replication foci." Nat Cell Biol 6(12): 1236-1244. Potter, C. P. and A. L. Harris (2003). "Diagnostic, prognostic and therapeutic implications of carbonic anhydrases in cancer." Br J Cancer 89(1): 2-7. Prelich, G., C. K. Tan, et al. (1987). "Functional identity of proliferating cell nuclear antigen and a DNA polymerase-delta auxiliary protein." Nature 326(6112): 517520. Prosperi, E. (2006). "The fellowship of the rings: distinct pools of proliferating cell nuclear antigen trimer at work." FASEB J 20(7): 833-837. 220 Prosperi, E., A. I. Scovassi, et al. (1994). "Proliferating cell nuclear antigen bound to DNA synthesis sites: phosphorylation and association with cyclin D1 and cyclin A." Exp Cell Res 215(2): 257-262. Pugh, B. F. (2004). "Is acetylation the key to opening locked gates?" Nat Struct Mol Biol 11(4): 298-300. Raghuraman, M. K., B. J. Brewer, et al. (1997). "Cell cycle-dependent establishment of a late replication program." Science 276(5313): 806-809. Raghuraman, M. K., E. A. Winzeler, et al. (2001). "Replication dynamics of the yeast genome." Science 294(5540): 115-121. Ramsby, M. L. and G. S. Makowski (1999). "Differential detergent fractionation of eukaryotic cells. Analysis by two-dimensional gel electrophoresis." Methods Mol Biol 112: 53-66. Randell, J. C., J. L. Bowers, et al. (2006). "Sequential ATP hydrolysis by Cdc6 and ORC directs loading of the Mcm2-7 helicase." Mol Cell 21(1): 29-39. Romano, A. H. and T. Conway (1996). "Evolution of carbohydrate metabolic pathways." Res Microbiol 147(6-7): 448-455. Rountree, M. R., K. E. Bachman, et al. (2000). "DNMT1 binds HDAC2 and a new corepressor, DMAP1, to form a complex at replication foci." Nat Genet 25(3): 269277. Rual, J. F., K. Venkatesan, et al. (2005). "Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network." Nature 437(7062): 1173-1178. Ryazanov, A. G. (1988). "Organization of soluble enzymes in the cell. Relay at the surface." FEBS Lett 237(1-2): 1-3. Rye, H. S., S. G. Burston, et al. (1997). "Distinct actions of cis and trans ATP within the double ring of the chaperonin GroEL." Nature 388(6644): 792-798. Sadoni, N., M. C. Cardoso, et al. (2004). "Stable chromosomal units determine the spatial and temporal organization of DNA replication." J Cell Sci 117(Pt 22): 5353-5365. Sadoul, K., C. Boyault, et al. (2008). "Regulation of protein turnover by acetyltransferases and deacetylases." Biochimie 90(2): 306-312. Saha, P., J. Chen, et al. (1998). "Human CDC6/Cdc18 associates with Orc1 and cyclincdk and is selectively eliminated from the nucleus at the onset of S phase." Mol Cell Biol 18(5): 2758-2767. Saifudeen, Z., J. Marks, et al. (2002). "Spatial repression of PCNA by p53 during kidney development." Am J Physiol Renal Physiol 283(4): F727-733. Sakurai, S., K. Kitano, et al. (2005). "Structural basis for recruitment of human flap endonuclease 1 to PCNA." EMBO J 24(4): 683-693. Samake, S. and L. C. Smith (1997). "Synchronization of cell division in eight-cell bovine embryos produced in vitro: effects of aphidicolin." Theriogenology 48(6): 969976. Sanchez, C., C. Lachaize, et al. (1999). "Grasping at molecular interactions and genetic networks in Drosophila melanogaster using FlyNets, an Internet database." Nucleic Acids Res 27(1): 89-94. Sarraf, S. A. and I. Stancheva (2004). "Methyl-CpG binding protein MBD1 couples histone H3 methylation at lysine 9 by SETDB1 to DNA replication and chromatin assembly." Mol Cell 15(4): 595-605. 221 Schagger, H. and G. von Jagow (1991). "Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form." Anal Biochem 199(2): 223-231. Schmidt, K. H., K. L. Derry, et al. (2002). "Saccharomyces cerevisiae RRM3, a 5' to 3' DNA helicase, physically interacts with proliferating cell nuclear antigen." J Biol Chem 277(47): 45331-45337. Schulz, T. J., R. Thierbach, et al. (2006). "Induction of oxidative metabolism by mitochondrial frataxin inhibits cancer growth: Otto Warburg revisited." J Biol Chem 281(2): 977-981. Schulze, E., D. J. Asai, et al. (1987). "Posttranslational modification and microtubule stability." J Cell Biol 105(5): 2167-2177. Schurtenberger, P., S. U. Egelhaaf, et al. (1998). "The solution structure of functionally active human proliferating cell nuclear antigen determined by small-angle neutron scattering." J Mol Biol 275(1): 123-132. Scorah, J., M. Q. Dong, et al. (2008). "A conserved proliferating cell nuclear antigeninteracting protein sequence in Chk1 is required for checkpoint function." J Biol Chem 283(25): 17250-17259. Scott, M., P. Bonnefin, et al. (2001). "UV-induced binding of ING1 to PCNA regulates the induction of apoptosis." J Cell Sci 114(Pt 19): 3455-3462. Scott, M. T., N. Morrice, et al. (2000). "Reversible phosphorylation at the C-terminal regulatory domain of p21(Waf1/Cip1) modulates proliferating cell nuclear antigen binding." J Biol Chem 275(15): 11529-11537. Senga, T., U. Sivaprasad, et al. (2006). "PCNA is a cofactor for Cdt1 degradation by CUL4/DDB1-mediated N-terminal ubiquitination." J Biol Chem 281(10): 62466252. Shackelford, R. E., W. K. Kaufmann, et al. (1999). "Cell cycle control, checkpoint mechanisms, and genotoxic stress." Environ Health Perspect 107 Suppl 1: 5-24. Sharif, J., M. Muto, et al. (2007). "The SRA protein Np95 mediates epigenetic inheritance by recruiting Dnmt1 to methylated DNA." Nature 450(7171): 908-912. Sherr, C. J. (1994). "G1 phase progression: cycling on cue." Cell 79(4): 551-555. Sheu, Y. J. and B. Stillman (2010). "The Dbf4-Cdc7 kinase promotes S phase by alleviating an inhibitory activity in Mcm4." Nature 463(7277): 113-117. Shevchenko, A., H. Tomas, et al. (2006). "In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes." Nat Protoc 1(6): 2856-2860. Shiio, Y. and R. N. Eisenman (2003). "Histone sumoylation is associated with transcriptional repression." Proc Natl Acad Sci U S A 100(23): 13225-13230. Shikata, K., T. Sasa-Masuda, et al. (2006). "The DNA polymerase activity of Pol epsilon holoenzyme is required for rapid and efficient chromosomal DNA replication in Xenopus egg extracts." BMC Biochem 7: 21. Shiomi, Y., A. Shinozaki, et al. (2004). "The reconstituted human Chl12-RFC complex functions as a second PCNA loader." Genes Cells 9(4): 279-290. Shumaker, D. K., L. Solimando, et al. (2008). "The highly conserved nuclear lamin Igfold binds to PCNA: its role in DNA replication." J Cell Biol 181(2): 269-280. Simbulan-Rosenthal, C. M., D. S. Rosenthal, et al. (1998). "Regulation of the expression or recruitment of components of the DNA synthesome by poly(ADP-ribose) polymerase." Biochemistry 37(26): 9363-9370. 222 Simpson, F., K. Lammerts van Bueren, et al. (2006). "The PCNA-associated factor KIAA0101/p15(PAF) binds the potential tumor suppressor product p33ING1b." Exp Cell Res 312(1): 73-85. Skibbens, R. V., L. B. Corson, et al. (1999). "Ctf7p is essential for sister chromatid cohesion and links mitotic chromosome structure to the DNA replication machinery." Genes Dev 13(3): 307-319. Smallwood, A., P. O. Esteve, et al. (2007). "Functional cooperation between HP1 and DNMT1 mediates gene silencing." Genes Dev 21(10): 1169-1178. Smith, M. L., J. M. Ford, et al. (2000). "p53-mediated DNA repair responses to UV radiation: studies of mouse cells lacking p53, p21, and/or gadd45 genes." Mol Cell Biol 20(10): 3705-3714. Solovjeva, L., M. Svetlova, et al. (2005). "High mobility of flap endonuclease 1 and DNA polymerase eta associated with replication foci in mammalian S-phase nucleus." Mol Biol Cell 16(5): 2518-2528. Spada, F., A. Haemmer, et al. (2007). "DNMT1 but not its interaction with the replication machinery is required for maintenance of DNA methylation in human cells." J Cell Biol 176(5): 565-571. Speck, C., Z. Chen, et al. (2005). "ATPase-dependent cooperative binding of ORC and Cdc6 to origin DNA." Nat Struct Mol Biol 12(11): 965-971. Speck, C. and B. Stillman (2007). "Cdc6 ATPase activity regulates ORC x Cdc6 stability and the selection of specific DNA sequences as origins of DNA replication." J Biol Chem 282(16): 11705-11714. Spector DL, G. R., and Leinwand LA. (1998). " The Nuclear Matrix: Preparation for Microscopy and Biochemical, ." Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pp. 44.41-44.44. Sporbert, A., P. Domaing, et al. (2005). "PCNA acts as a stationary loading platform for transiently interacting Okazaki fragment maturation proteins." Nucleic Acids Res 33(11): 3521-3528. Sporbert, A., A. Gahl, et al. (2002). "DNA polymerase clamp shows little turnover at established replication sites but sequential de novo assembly at adjacent origin clusters." Mol Cell 10(6): 1355-1365. Srivastava, D. K. and S. A. Bernhard (1986). "Metabolite transfer via enzyme-enzyme complexes." Science 234(4780): 1081-1086. Stanyon, C. A., G. Liu, et al. (2004). "A Drosophila protein-interaction map centered on cell-cycle regulators." Genome Biol 5(12): R96. Stelter, P. and H. D. Ulrich (2003). "Control of spontaneous and damage-induced mutagenesis by SUMO and ubiquitin conjugation." Nature 425(6954): 188-191. Stillman, B. (2005). "Origin recognition and the chromosome cycle." FEBS Lett 579(4): 877-884. Strahl, B. D. and C. D. Allis (2000). "The language of covalent histone modifications." Nature 403(6765): 41-45. Stucki, M., I. Stagljar, et al. (2001). "A coordinated interplay: proteins with multiple functions in DNA replication, DNA repair, cell cycle/checkpoint control, and transcription." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 65: 261-298. Stumpf, M. P., T. Thorne, et al. (2008). "Estimating the size of the human interactome." Proc Natl Acad Sci U S A 105(19): 6959-6964. 223 Szepesi, A., E. W. Gelfand, et al. (1994). "Association of proliferating cell nuclear antigen with cyclin-dependent kinases and cyclins in normal and transformed human T lymphocytes." Blood 84(10): 3413-3421. Taddei, A., D. Roche, et al. (1999). "Duplication and maintenance of heterochromatin domains." J Cell Biol 147(6): 1153-1166. Tagami, H., D. Ray-Gallet, et al. (2004). "Histone H3.1 and H3.3 complexes mediate nucleosome assembly pathways dependent or independent of DNA synthesis." Cell 116(1): 51-61. Takahashi, T. S., D. B. Wigley, et al. (2005). "Pumps, paradoxes and ploughshares: mechanism of the MCM2-7 DNA helicase." Trends Biochem Sci 30(8): 437-444. Takasaki, Y., K. Kaneda, et al. (2004). "Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is a novel autoantigen leading autoimmune responses to proliferating cell nuclear antigen multiprotein complexes in lupus patients." Int Immunol 16(9): 1295-1304. Takisawa, H., S. Mimura, et al. (2000). "Eukaryotic DNA replication: from prereplication complex to initiation complex." Curr Opin Cell Biol 12(6): 690-696. Tan, B. C., C. T. Chien, et al. (2006). "Functional cooperation between FACT and MCM helicase facilitates initiation of chromatin DNA replication." EMBO J 25(17): 3975-3985. Tan, C. K., C. Castillo, et al. (1986). "An auxiliary protein for DNA polymerase-delta from fetal calf thymus." J Biol Chem 261(26): 12310-12316. Tanno, M., M. Ogihara, et al. (1996). "Age-related changes in proliferating cell nuclear antigen levels." Mech Ageing Dev 92(1): 53-66. Tanno, M. and T. Taguchi (1999). "Proliferating cell nuclear antigen in normal and regenerating rat livers." Exp Mol Pathol 67(3): 192-200. Ter-Pogossian, M. M., M. E. Phelps, et al. (1975). "A positron-emission transaxial tomograph for nuclear imaging (PETT)." Radiology 114(1): 89-98. Terasima, T. and L. J. Tolmach (1963). "Growth and nucleic acid synthesis in synchronously dividing populations of HeLa cells." Exp Cell Res 30: 344-362. Terranova, V. P., C. N. Rao, et al. (1983). "Laminin receptor on human breast carcinoma cells." Proc Natl Acad Sci U S A 80(2): 444-448. Thanaraj, T. A., S. Stamm, et al. (2004). "ASD: the Alternative Splicing Database." Nucleic Acids Res 32(Database issue): D64-69. Tobey, R. A. and K. D. Ley (1970). "Regulation of initiation of DNA synthesis in Chinese hamster cells. I. Production of stable, reversible G1-arrested populations in suspension culture." J Cell Biol 46(1): 151-157. Tom, S., L. A. Henricksen, et al. (2001). "DNA ligase I and proliferating cell nuclear antigen form a functional complex." J Biol Chem 276(27): 24817-24825. Tomlinson, V. A., H. J. Newbery, et al. (2005). "Translation elongation factor eEF1A2 is a potential oncoprotein that is overexpressed in two-thirds of breast tumours." BMC Cancer 5: 113. Toueille, M., B. Saint-Jean, et al. (2007). "The elongation factor 1A: a novel regulator in the DNA replication/repair protein network in wheat cells?" Plant Physiol Biochem 45(2): 113-118. Tsuchimoto, D., Y. Sakai, et al. (2001). "Human APE2 protein is mostly localized in the nuclei and to some extent in the mitochondria, while nuclear APE2 is partly 224 associated with proliferating cell nuclear antigen." Nucleic Acids Res 29(11): 2349-2360. Tsurimoto, T. (1998). "PCNA, a multifunctional ring on DNA." Biochim Biophys Acta 1443(1-2): 23-39. Tsurimoto, T. (1999). "PCNA binding proteins." Front Biosci 4: D849-858. Tyler, J. K., C. R. Adams, et al. (1999). "The RCAF complex mediates chromatin assembly during DNA replication and repair." Nature 402(6761): 555-560. Uetz, P., L. Giot, et al. (2000). "A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae." Nature 403(6770): 623-627. Uhlmann, F. and K. Nasmyth (1998). "Cohesion between sister chromatids must be established during DNA replication." Curr Biol 8(20): 1095-1101. Ullrich, T. C., M. Blaesse, et al. (2001). "Crystal structure of ATP sulfurylase from Saccharomyces cerevisiae, a key enzyme in sulfate activation." EMBO J 20(3): 316-329. Ulrich, H. D. and S. Jentsch (2000). "Two RING finger proteins mediate cooperation between ubiquitin-conjugating enzymes in DNA repair." EMBO J 19(13): 33883397. van Dierendonck, J. H., R. Keyzer, et al. (1989). "Subdivision of S-phase by analysis of nuclear 5-bromodeoxyuridine staining patterns." Cytometry 10(2): 143-150. van Diest, P. J., G. Brugal, et al. (1998). "Proliferation markers in tumours: interpretation and clinical value." J Clin Pathol 51(10): 716-724. Vander Heiden, M. G., L. C. Cantley, et al. (2009). "Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation." Science 324(5930): 1029-1033. Vashee, S., C. Cvetic, et al. (2003). "Sequence-independent DNA binding and replication initiation by the human origin recognition complex." Genes Dev 17(15): 18941908. Veaute, X., J. Jeusset, et al. (2003). "The Srs2 helicase prevents recombination by disrupting Rad51 nucleoprotein filaments." Nature 423(6937): 309-312. Venables, J. P. (2004). "Aberrant and alternative splicing in cancer." Cancer Res 64(21): 7647-7654. Vidal, M. (2009). "A unifying view of 21st century systems biology." FEBS Lett 583(24): 3891-3894. Vire, E., C. Brenner, et al. (2006). "The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation." Nature 439(7078): 871-874. Voet D, a. V. J. (2004). Biochemistry 3rd Edition. New York, John Wiley & Sons, Inc. Vriz, S., J. M. Lemaitre, et al. (1992). "Comparative analysis of the intracellular localization of c-Myc, c-Fos, and replicative proteins during cell cycle progression." Mol Cell Biol 12(8): 3548-3555. Waga, S., G. J. Hannon, et al. (1994). "The p21 inhibitor of cyclin-dependent kinases controls DNA replication by interaction with PCNA." Nature 369(6481): 574578. Walen, K. H. and M. R. Stampfer (1989). "Chromosome analyses of human mammary epithelial cells at stages of chemical-induced transformation progression to immortality." Cancer Genet Cytogenet 37(2): 249-261. 225 Walhout, A. J., J. Reboul, et al. (2002). "Integrating interactome, phenome, and transcriptome mapping data for the C. elegans germline." Curr Biol 12(22): 1952-1958. Walker, D. H. and J. L. Maller (1991). "Role for cyclin A in the dependence of mitosis on completion of DNA replication." Nature 354(6351): 314-317. Walsh, C. T., S. Garneau-Tsodikova, et al. (2005). "Protein posttranslational modifications: the chemistry of proteome diversifications." Angew Chem Int Ed Engl 44(45): 7342-7372. Wang, S. C., Y. Nakajima, et al. (2006). "Tyrosine phosphorylation controls PCNA function through protein stability." Nat Cell Biol 8(12): 1359-1368. Warbrick, E. (2000). "The puzzle of PCNA's many partners." Bioessays 22(11): 9971006. Warbrick, E., W. Heatherington, et al. (1998). "PCNA binding proteins in Drosophila melanogaster : the analysis of a conserved PCNA binding domain." Nucleic Acids Res 26(17): 3925-3932. Warbrick, E., D. P. Lane, et al. (1997). "Homologous regions of Fen1 and p21Cip1 compete for binding to the same site on PCNA: a potential mechanism to coordinate DNA replication and repair." Oncogene 14(19): 2313-2321. Warburg, O. (1956). "On the origin of cancer cells." Science 123(3191): 309-314. Warburg O, P. K., Negelein E. (1924). "Ueber den Stoffwechsel der Tumoren." Biochemische Zeitschrift 152: 319-344. Watanabe, H., Z. Q. Pan, et al. (1998). "Suppression of cell transformation by the cyclindependent kinase inhibitor p57KIP2 requires binding to proliferating cell nuclear antigen." Proc Natl Acad Sci U S A 95(4): 1392-1397. Watanabe, K., S. Tateishi, et al. (2004). "Rad18 guides poleta to replication stalling sites through physical interaction and PCNA monoubiquitination." EMBO J 23(19): 3886-3896. Westermeier R (2001). Electrophoresis in Practice Weinheim, Germany, Wiley–VCH Verlag Westwood, J. T., R. B. Church, et al. (1987). "Patterns of protein synthesis during the cell cycle of Chinese hamster ovary cells." Biochem Cell Biol 65(3): 219-229. Winkler, C., K. Denker, et al. (2007). "Silver- and Coomassie-staining protocols: detection limits and compatibility with ESI MS." Electrophoresis 28(12): 20952099. Wulf, G. M., A. Ryo, et al. (2001). "Pin1 is overexpressed in breast cancer and cooperates with Ras signaling in increasing the transcriptional activity of c-Jun towards cyclin D1." EMBO J 20(13): 3459-3472. Xenarios, I., D. W. Rice, et al. (2000). "DIP: the database of interacting proteins." Nucleic Acids Res 28(1): 289-291. Xia, L., L. Zheng, et al. (2005). "Human 3-methyladenine-DNA glycosylase: effect of sequence context on excision, association with PCNA, and stimulation by AP endonuclease." J Mol Biol 346(5): 1259-1274. Xiao, W., B. L. Chow, et al. (2000). "The Saccharomyces cerevisiae RAD6 group is composed of an error-prone and two error-free postreplication repair pathways." Genetics 155(4): 1633-1641. 226 Xiong, Y., H. Zhang, et al. (1992). "D type cyclins associate with multiple protein kinases and the DNA replication and repair factor PCNA." Cell 71(3): 505-514. Xiong, Y., H. Zhang, et al. (1993). "Subunit rearrangement of the cyclin-dependent kinases is associated with cellular transformation." Genes Dev 7(8): 1572-1583. Xu, H., P. Zhang, et al. (2001). "A novel PCNA-binding motif identified by the panning of a random peptide display library." Biochemistry 40(14): 4512-4520. Xu, P. and J. Peng (2008). "Characterization of polyubiquitin chain structure by middledown mass spectrometry." Anal Chem 80(9): 3438-3444. Xu, R. H., H. Pelicano, et al. (2005). "Inhibition of glycolysis in cancer cells: a novel strategy to overcome drug resistance associated with mitochondrial respiratory defect and hypoxia." Cancer Res 65(2): 613-621. Xu, W., J. G. Aparicio, et al. (2006). "Genome-wide mapping of ORC and Mcm2p binding sites on tiling arrays and identification of essential ARS consensus sequences in S. cerevisiae." BMC Genomics 7: 276. Yamamoto, T., S. Kimura, et al. (2004). "Degradation of proliferating cell nuclear antigen by 26S proteasome in rice (Oryza sativa L.)." Planta 218(4): 640-646. Yamashita, M. M., R. J. Almassy, et al. (1989). "Refined atomic model of glutamine synthetase at 3.5 A resolution." J Biol Chem 264(30): 17681-17690. Yan, J. X., N. H. Packer, et al. (1998). "Protein phosphorylation: technologies for the identification of phosphoamino acids." J Chromatogr A 808(1-2): 23-41. Yang, X. J. and E. Seto (2008). "Lysine acetylation: codified crosstalk with other posttranslational modifications." Mol Cell 31(4): 449-461. Young, H., R. Baum, et al. (1999). "Measurement of clinical and subclinical tumour response using [18F]-fluorodeoxyglucose and positron emission tomography: review and 1999 EORTC recommendations. European Organization for Research and Treatment of Cancer (EORTC) PET Study Group." Eur J Cancer 35(13): 1773-1782. Yu, P., B. Huang, et al. (2001). "p15(PAF), a novel PCNA associated factor with increased expression in tumor tissues." Oncogene 20(4): 484-489. Yu, Y., J. P. Cai, et al. (2009). "Proliferating cell nuclear antigen is protected from degradation by forming a complex with MutT Homolog2." J Biol Chem 284(29): 19310-19320. Zhang, H. and C. W. Lawrence (2005). "The error-free component of the RAD6/RAD18 DNA damage tolerance pathway of budding yeast employs sister-strand recombination." Proc Natl Acad Sci U S A 102(44): 15954-15959. Zhang, H., Y. Xiong, et al. (1993). "Proliferating cell nuclear antigen and p21 are components of multiple cell cycle kinase complexes." Mol Biol Cell 4(9): 897-906. Zhang, Y. and D. Reinberg (2001). "Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails." Genes Dev 15(18): 2343-2360. Zu, X. L. and M. Guppy (2004). "Cancer metabolism: facts, fantasy, and fiction." Biochem Biophys Res Commun 313(3): 459-465. Терентьев А.А, М. Н. Т., Шайтан К.В. (2009). "Динамическая протеомика в моделировании живой клетки. Белок-белковые взаимодействия." Успехи биохимической химии. 49: 429.
