Булашев А.К., Сураншиев Ж.А. Эпизоотическая и эпидемическая

«Сейфуллин оқулары–11: Жастар және ғылым» атты Республикалықалық ғылыми-теориялық
конференциясының материалдары = Материалы
Республиканской научно-теоретической
конференции «Сейфуллинские чтения–11: Молодежь и наука». – 2015. – Т.І, ч.1. – С. 130-132
СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ
ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ
Булашев А.К., Сураншиев Ж.А.
Эпизоотическая и эпидемическая ситуация по бруцеллезу в Республике
Казахстан остается весьма напряженной. Долгие годы борьба с бруцеллезом
проводилась с применением вакцинации, диагностических исследований и
удалению из стад серопозитивных животных. Данная стратегия не привела к
стабильному улучшению ситуации по бруцеллезу. В 2007 году вакцинация была
отменена, и основным методом борьбы с инфекцией явилось выявление и
санитарный убой скота, положительно реагирующего на бруцеллез по
результатам ИФА. Последний, как известно, является высокочувствительным
тестом, однако его специфичность в полной мере зависит от природы
используемого антигена. В диагностических наборах ИФА, использованных в
Казахстане, антигеном служили липополисахариды (ЛПС) бруцелл.
Общеизвестно, что именно ЛПС обуславливают перекрестные реакций между
бруцеллами и грамотрицательными микроорганизмами, обусловленные наличием
общих эпитопов. Неслучайно, с внедрением данного теста в практику
ветеринарии Казахстана количество животных, положительно реагирующих
на бруцеллез, резко возросло, однако улучшение эпизоотической ситуации не
наступало. На наш взгляд, в период использования ИФА в Казахстане
необоснованно выбраковывалось большоепоголовье здоровых животных.
Причиной ложноположительных реакций в первые годы внедрения данного теста
могли быть не только перекрестно реагирующие, но и поствакцинальные антитела.
Учитывая сложившуюся ситуацию, Комитетом ветеринарии было принято решение
вновь использовать классические реакцийдля серодиагностики бруцеллеза и
возобновить
вакцинацию.ИФА
был
рекомендован
для
исследования
невакцинированного молодняка неблагополучной зоны. В этой связи, поиск более
специфичных для бруцелл антигенов и разработка достоверных методов
серодиагностики остается весьма важной проблемой ветеринарной науки и
практики Казахстана.
Еще в 1978 году G.G.Shurig et al. [1] установили, что сыворотка крови
инфицированных бруцеллезом коров в иммуноэлектрофорезе обнаруживают до
семи различных фракций в составе белкового антигена Brucella abortus 45/20, тогда
как антитела вакцинированных животных на 4 месяце вакцинации не выявляют
белковые полосы. С.Belzer et al.[2], используя метод иммуноблотинга, доказали, что
антитела инфицированных коров(1 группа); вакцинированных B.abortus 19, а затем
зараженных (2 группа), реагируют с растворимыми белками патогена с
молекулярной массой от 31 до 45 кД. Иммуноглобулины животных 2 группы
дополнительно выявляли белковые фракции с молекулярной массой от 66 до 71 кД.
Следует отметить, что антитела впервые вакцинированных не связывались с
полосами растворимых белков. Аналогичные результаты приводят в своей работе
Е.М.Hoffman et al. [3]. Согласно сообщению исследователей коровы, зараженные
бруцеллезом, вырабатывали специфические Ig к белковому компоненту B.abortus
1119-3, тогда как вакцинированные животные не содержали заметного количества
антител к этому антигену. J.C.Chin [4] испытал в ИФА антигены цельных клеток
(ЦК), ЛПС и БВМ B. ovis. Высокие титры антител против ЦК наблюдались как у
спонтанно зараженных, так у вакцинированных баранов, тогда как антительная
активность по отношению к ЛПС установлена только у иммунизированных
индивидуумов.БВМ связывались хорошо с антителами спонтанно зараженных
баранов (1:6 400), в то время как титры вакцинированных против этого антигена не
превышали 1:800. По данным M.Wanke et al. [5] ЛПС-свободные
цитоплазматические белки и внешние мембранные антигены B.canis придавали
высокую специфичность и чувствительность ИФА при диагностике бруцеллеза
собак и позволяли определить инфекцию вскоре после контакта с возбудителем.
Возможность замены ЛПС белковыми антигенами для минимизации перекрестных
реакций при диагностике бруцеллеза описана K.Y. Ko et al. [6].
Нами был разработан cпособ определения антител против возбудителя
бруцеллеза, отличительной особенностью которого является использование БВМ
B.abortus 19 в серодиагностике бруцеллеза. Данный способ был испытан в
сравнении с общепринятыми серологическими тестами, включая ИФА с ЦК B.
abortus 19. Результаты исследований образцов сыворотки крови 1041
коровыпоказали наличие противобруцеллезных антител по РА, РСК и ИФА с ЦК
соответственно у 27 (2,6%), 22 (2,1%) и 45 (4,3%) голов, тогда как предлагаемый
способ диагностировал бруцеллез у 60 (5,7%) животных. При этом, новый способ
полностью подтвердил позитивные показания РА, РСК и ИФА с ЦК и позволил
дополнительно выявить противобруцеллезные антитела у 15, или 1,4% коров.
При исследований 1483 коров с помощью ИФА в котором в качестве антигена
выступали БВМ или ЛПС бруцелл количество животных, положительно
реагировавших на бруцеллез в случае использования ЛПС, было в 1,4 раза больше
по сравнению с результатами нашего теста. Это «превосходство» мы объясняем
наличием в сыворотке крови здорового скота антител, перекрестно реагирующих с
эпитопами ЛПС бруцелл.
Мы склонны считать, что БВМ бруцелл вакцинных штаммов, которые, как
правило, задерживаются в организме в течение короткого времени (3-4 мес.), менее
доступны для иммунной системы организма, нежели ЛПС, расположенные на
поверхности клетки. Следовательно, у иммунизированных животных антитела
вырабатываются, в основном, на антигены ЛПС. В инфицированном организме
происходит продолжительная непримиримая борьба с возбудителем болезни,
который старается укрепиться в излюбленных тканях, и иммунная система успевает
ознакомиться с более глубоко лежащими компонентами клеточной стенки, т.е БВМ.
В этой связи, последние могут быть полезными не только в диагностике бруцеллеза,
но и в дифференциации постинфекционных антител от поствакцинальных. Однако,
для подтверждения этого вывода необходимо провести широкое испытание
эффективности и объективности ИФА-теста на основе БВМ в сравнении c
классическими реакциями и коммерческими аналогами. При этом, достоверность
серологических тестов следует определять путем бактериологических исследований
патматериала и анализа его образцов в ПЦР.
Изучение современной мировой тенденции развития исследований в области
диагностики и профилактики бруцеллеза животных показывает, что именно
белковые антигены рассматриваются как весьма перспективные компоненты в
разработке диагностикумов и вакцин. К сожалению, одним из главных факторов,
препятствующих внедрению ИФА-теста на основе БВМ является дороговизна и
трудоемкость методов получения названного антигена. Кроме того, как было
указано выше, не все фракций БВМ имеют диагностическую значимость. В этой
связи, за последние годы для получения диагностически важных компонентов БВМ
начали использоваться технология рекомбинантных ДНК, которая позволяет
получить высокоочищенные стабильные препараты рекомбинантного БВМ
возбудителя бруцеллеза. Так, доказана эффективность непрямого ИФА на основе
рекомбинантного БВМ с молекулярной массой 28 кД для серологической
диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота ChaudhuriP. etal. [7].
Рекомбинантный omp31B.melitensis были использован Gupta et al. в ИФА для
обнаружения специфичных антител у коз [8]. По данным исследователей, антитела
против генноинженерного антигена обнаруживались у 82-86% коз и овец, спонтанно
зараженных бруцеллезом.
Несмотря на наличие штаммов-продуцентов БВМ, до сих пор на мировом
рынке ветеринарных препаратов отсутствует ИФА-тесты на основе
рекомбинантного белка для диагностики бруцеллеза. Это объясняется тем, что в
странах, обладающих патентами на штаммы-продуценты, бруцеллез искоренен и,
следовательно, совершенствование методов диагностики болезни не является
актуальной проблемой. В нашей стране отсутствуют штаммы-продуценты
рекомбинантных белков бруцелл, хотя ветеринарная практика остро нуждается в
достоверных методах диагностики бруцеллеза. Выделение БВМ бруцелл
химическими методами - трудоемкая работа, и, самое главное, они не позволяет
получать антигены со стандартизированным составом. Поэтому, весьма важно
иметь отечественный штамм-продуцент рекомбинантного белка возбудителя
бруцеллеза,
что позволит
разработать
диагностические тест-системы,
превосходящие коммерческие аналоги как по чувствительности и специфичности,
так и по стоимости. Анализ данных литературы показывает, что среди БВМ
наибольшую практическую ценность представляют белок с молекулярной массой 31
кД, который является наиболее иммуногенным и рассматривается как
потенциальный компонент для изготовления диагностических и вакцинных
препаратов [9,10].
Таким образом, создание отечественного штамма кишечной палочки продуцента рекомбинантного БВМ B.abortus 19 и использование его в диагностике
бруцеллеза животных имеет большую практическую значимость. Использование
генноинженерного антигена вместо природного препарата БВМ, получаемого
химическим путем, несомненно придаст тесту конкурентоспособность не только в
пределах Казахстана, но и в странах, где бруцеллез наносит большой экономический
и социальный ущерб.
Список литературы
1. Schurig G.G., Jones L.M., Speth S.L., Berman D.R. Antibody Response to
Antigens distinct from smooth Lipopolysaccharide Complex in Brucella infection
//Inf.Immun.-1978.-V.21.- №.3.-P.997-1002.
2. Belzer C.A., Tabatabai L.B., Deyoe B.L. Differentiation by Westen blotting of
immune responses of cattle vaccinated with Brucella strain 19 or infected experimentally
or naturally with virulen Brucella abortus.//Vet.Microbiol.-1991.-V.27.-P.79-90.
3. Hoffman E.M., Shapiro S.J., Nicoletti P. Evaluation of serologic and cellular
immune responses of cattle to nonpolysaccharide antigen from Brucella abortus
//Am.J.Ver.res.-1990.-V.51.- №2.-P.216-221.
4. Chin L.J. Comparison o different antigenic preparations for the detection of ovine
serm antibodies against Brucella ovis by ELISA //Australian Vet.J.-1983.-V.60.№9.-P.261-264.
5. Wanke M., Delpino M.V., Baldi P.C. Comparative performance of tests using
cytosolic or outer membrane antigens of Brucella for the serodiagnosis of canine
brucellosis //Veterinary Microbiology.-2002.- V.-88.-№4.-P.367-375.
6. Ko K.Y., Kim J., Her M. et al. Immunogenic proteins of Brucella abortus to
minimize cross reactions in brucellosis diagnosis // Vet.Microbiology.2012.-V.156.-№3-4.-P.374-380.
7. Chaudhuri P., Prasad R., Kumar V., Basavarajappa A.G. Recombinant OMP28
antigen-based indirect ELISA for serodiagnosis of bovine brucellosis
//Mol.Cell.Probes.-2010.-№24.-P.142-145
8. Gupta V.K., Kumari K., Vohra J. et al. Comparative evaluation of recombinant
BP26 protein for serological diagnosis of Brucella melitensis infection in goats // Small
ruminant Research.-2010.- V.93.-№2–3.-P.119-125.
9. Gupta V.K.,. Rout P.K, Vihan V.S. Introduction of immune response in mice with
DNA vaccine encoding outer membrane protein (omp31) of Brucella melitensis 16M //
Research in Veterinary Science.- 2007.-, V.-82.-№3.- P.305-313.
10. Gupta V.K., Radhakrishnan G., Harms J., Splitter G. Invasive Escherichia
coli vaccines expressing Brucella melitensis outer membrane proteins 31 or 16 or
periplasmic protein BP26 confer protection in mice challenged with B. melitensis //
Vaccine.- 2012.-V. 30.- №27.-P. 4017-4022.