На правах рукописи Гейн Сергей Владимирович β-ЭНДОРФИНА В НЕЙРОЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ

На правах рукописи
Гейн Сергей Владимирович
РОЛЬ β-ЭНДОРФИНА В НЕЙРОЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ
ФУНКЦИЙ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ
14.00.36 Аллергология и иммунология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Пермь - 2007
Работа выполнена в аналитической лаборатории Института экологии
и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь
Научный консультант:
академик РАН и РАМН Черешнев Валерий Александрович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Юшков Владимир Викторович
доктор медицинских наук, профессор Кузнецов Валериан Фёдорович
доктор медицинских наук, профессор Сибиряк Сергей Владимирович
Ведущая организация: Институт экспериментальной медицины РАМН,
Санкт-Петербург
Защита состоится «__»__________ 2007 г. в ____ часов на заседании
диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики
микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13.
Факс: (342)2446711.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и
генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь.
Автореферат разослан «___» _______________2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
чл.-корр. РАН
Ившина Ирина Борисовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Поддержание внутреннего гомеостаза
определяется взаимодействием нервной, эндокринной и иммунной систем
организма. Известно, что иммунная система многокомпонентна, ее
функционирование обеспечивается сложной сетью взаимосвязанных
сигналов. Одними из важнейших посредников во взаимодействии нервной и
иммунной
систем
выступают
эндогенные
опиоидные
пептиды,
представляющие собой группу факторов и играющие ключевую роль в
процессах адаптации организма (Корнева, Шхинек, 1988; Зозуля,
Пшеничкин, 1990; Корнева, 2007; Maier, 2003; Pruett, 2003; Bodnar, Klein,
2006; Sharp, 2006; Wilbert-Lampen et al., 2007). Несмотря на то, что в
последние годы изучению влияния эндогенных опиоидных пептидов на
процессы регуляции иммунитета в литературе уделяется достаточно много
внимания (Panerai, Sacerdote, 1997; Tomassini et al., 2003, 2004; Sacerdote,
2003), вопрос о механизмах реализации эффектов биорегуляторных пептидов
данного класса остается крайне актуальным.
Основной источник опиоидных пептидов в организме - центральная
нервная
система,
в
которой
группа
пептидных
гормонов
(адренокортикотропный гормон, β-липотропин, меланоцитстимулирующий
гормон, β-эндорфин) образуется в результате расщепления большой
молекулы – предшественника проопиомеланокортина. При этом наиболее
активным и полифункциональным представителем пептидов группы
проопиомеланокортина является β-эндорфин. Основной источник βэндорфина в центральной нервной системе – аркуатное ядро гипоталамуса,
на периферии – промежуточная доля гипофиза, из которой пептид
секретируется в кровь при стрессе, шоке, травмах и физических нагрузках.
β-эндорфин является ключевым фактором, осуществляющим контроль
стрессиндуцированных изменений иммунитета со стороны эндогенной
опиоидной системы (Зозуля, Пшеничкин, 1990; Pedersen, Hoffman-Goetz,
2000). Роль других соединений из семейства эндогенных опиоидных
пептидов, в частности энкефалинов, при стрессе более скромна, а, по мнению
отдельных авторов (Owens, 1987), вообще отрицается.
Известно (Panerai, Sacerdote, 1997), что изменение концентрации
β-эндорфина в головном, спинном мозге и гипофизе часто сочетается с
неврологическими и аутоиммунными нарушениями (мигрень, рассеянный
склероз, болезнь Крона). Важную роль β-эндорфин играет в патогенезе
инфекционных заболеваний, модулируя функции клеток адаптивного и
естественного звеньев иммунной системы при их контакте с
микроорганизмами и вирусами (Ляшев, 2000; Plotnikoff, 1999; Sitte et al.,
2007). В связи с этим изучение роли β-эндорфина в регуляции иммуногенеза
представляет большой интерес.
Широкий спектр биологической активности β-эндорфина определяется
его способностью взаимодействовать с различными по своей природе
сайтами связывания, к которым относятся опиоидные (налоксончувствительные) и неопиоидные (налоксон-нечувствительные) рецепторы.
Экспрессия опиатных рецепторов трёх основных классов (µ, δ, κ) и
неопиоидного рецептора на клетках различных органов и тканей, в том числе
и клетках иммунной системы, доказана методами радиолигандного
связывания и детекции соответствующей РНК (Наволоцкая и др., 2004;
Madden, 1995; Plotnikoff, 1999; Bidlack, 2000; Kraus et al., 2006; Lotsch et al.,
2006; Sharp, 2006). Подобное распределение участков связывания
β-эндорфина объясняет широкий спектр активности данного пептида и
указывает на возможность, как прямого, так и опосредованного влияния на
формирование иммунного ответа (Зозуля, Пшеничкин 1990; Bidlack, 2000;
Stanojević et al., 2006).
Нерешенными остаются вопросы, касающиеся изучения роли
эндогенной опиоидной системы в стрессиндуцированных изменениях
гуморального и клеточноопосредованного иммунитета; различных
рецепторов в регуляции выраженности иммунных процессов, индуцируемых
эндогенными опиоидами при стрессе, а также на фоне введения двух
основных
стрессреализующих
факторов –
глюкокортикоидов
и
катехоламинов. Малоизученными остаются молекулярные и клеточные
механизмы иммунорегуляторного действия β-эндорфина, связанные с
эффектами данного гормона на процессы пролиферации, кооперации и
дифференцировки клеток иммунной системы, продукцию ряда ключевых
цитокинов (IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12), являющихся маркерными для
регуляторных Т-лимфоцитов 1 и 2 типа (Th1/Th2) и определяющих выбор
типа иммунного ответа. В литературе имеются довольно противоречивые
данные о влиянии β-эндорфина на функции клеток естественного
иммунитета (Van den Bergh et al., 1994; Peterson et al., 1998; Voccarino, Kastin,
2000; Sacerdote, 2003; Bodnar, Klein, 2006).
Цель настоящей работы – изучение роли опиатергических
механизмов в нейроэндокринной регуляции иммуногенеза с оценкой
эффектов β-эндорфина на процессы пролиферации, дифференцировки и
кооперации клеток иммунной системы.
Основные задачи исследования
1. Изучить роль основных компонентов эндогенной опиоидной
системы в регуляции процессов иммуногенеза в условиях острого стресса.
2. Исследовать возможность опосредованности иммунорегуляторных
эффектов глюкокортикоидов и катехоламинов через взаимодействие с
эндогенной опиоидной системой.
3. Оценить влияние β-эндорфина на функции клеток адаптивного
иммунитета и исследовать механизм действия пептида на процессы
пролиферации, кооперации и Th1/Th2-дифференцировки лимфоцитов.
4. Изучить роль β-эндорфина в регуляции функций клеток
естественного иммунитета.
Научная
новизна
работы.
Экспериментально
обоснована
интегральная роль эндогенной опиоидной системы в нейроэндокринной
регуляции иммуногенеза в норме, в условиях стрессорного воздействия и при
введении
стрессреализующих
гормонов
–
глюкокортикоидов
и
катехоламинов. Впервые изучено влияние β-эндорфина на процессы
активации, пролиферации, кооперации и Th1/Th2-дифференцировки
Т-лимфоцитов с оценкой роли различных клеточных фракций. Выявлен
характер участия опиатных рецепторов различных типов в регуляции
иммунных реакций под воздействием β-эндорфина и синтетических лигандов
опиатных рецепоров пептидной природы. В экспериментах in vivo и in vitro
подтверждено, что основной мишенью β-эндорфина является гуморальное
звено иммунного ответа, при этом выявлена зависимость эффектов βэндорфина от фазы развития иммунной реакции. В модели
пролиферативного ответа лимфоцитов обнаружена зависимость эффекта βэндорфина и селективных агонистов µ- и δ-рецепторов от концентрации
митогена и концентрации исследуемых пептидов. Выявлена ключевая роль δ-
рецепторов в реализации стимулирующего эффекта β-эндорфина на
пролиферацию и продукцию IL-4. Впервые установлена зависимость
стимулирующего эффекта опиоидных пептидов на пролиферацию
лимфоцитов и продукцию IL-4 от присутствия моноцитов в клеточной
культуре. Обнаружено, что β-эндорфин снижает степень выраженности
реакции бласттрансформации лимфоцитов при удалении моноцитов из
клеточной культуры. Показано, что β-эндорфин стимулирует фагоцитарную
активность
эффекторов
естественного
иммунитета
и
оказывает
модулирующее влияние на цитокинпродуцирующую функцию моноцитов и
нейтрофилов. Изучен характер участия опиатных рецепторов в регуляции
этих процессов.
Теоретическая и практическая значимость. Полученные данные
расширяют представление о роли β-эндорфина и опиатных рецепторов
разных типов в регуляции иммуногенеза. Обосновано, что формирование
иммунного ответа в норме и при стрессе, а также регуляция адаптивного и
естественного иммунитета реализуется за счёт механизмов, связанных с
синтезом опиоидных пептидов. Выявлен механизм влияния опиоидных
пептидов
на
процессы
Th1/Th2-дифференцировки
Т-лимфоцитов.
Полученные экспериментальные данные подтверждают целесообразность
использования иммуномодулирующих свойств β-эндорфина в терапии ряда
аутоиммунных заболеваний (рассеянный склероз, болезнь Крона и пр.). В
связи с широким использованием агонистов опиатных рецепторов в
практической медицине, необходим учет последствий их применения.
Результаты работы используются в лекционном курсе «Экспериментальная
иммунопатология и иммунотерапия» на кафедре микробиологии и
иммунологии Пермского государственного университета (614990, Пермь,
Букирева 15).
Основные положения, выносимые на защиту
1. В условиях блокады опиатных рецепторов выявляется выраженная
модификация иммунорегуляторных эффектов ротационного стресса,
глюкокортикоидов и катехоламинов.
2. β-эндорфин в высоких дозах угнетает, в низких - стимулирует
гуморальное звено иммунитета, и при этом не влияет на выраженность
реакции гиперчувствительности замедленного типа. В клеточных культурах
β-эндорфин стимулирует пролиферацию лимфоцитов и продукцию IL-4, не
влияет на синтез IL-2 и IFN-γ, при этом усиливает степень поляризации Тхелперов в направлении Th2-клеток. В реализации стимулирующих эффектов
β-эндорфина на пролиферацию и продукцию IL-4 доминирующая роль
принадлежит δ-рецепторам.
3. Клетки моноцитарно-макрофагального ряда играют важную
регуляторную роль в направленности эффектов β-эндорфина в отношении
функциональной активности CD4+ лимфоцитов.
4. β-эндорфин стимулирует фагоцитарную активность эффекторов
естественного иммунитета и оказывает модулирующее влияние на
цитокинпродуцирующую функцию моноцитов и нейтрофилов.
Связь работы с крупными программами. Работа проводилась в
течение 2000-2007 гг. в соответствии с планом НИР ИЭГМ УрО РАН (номер
госрегистрации темы НИР 01.9.009927); в рамках Программы
фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и
клеточная биология»; гранта РФФИ № 06-04-49001, а также грантов молодых
учёных Президиума УрО РАН 2003, 2005 гг.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на
Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем
в норме и патологии», Санкт-Петербург, 2007; V-VIII конференциях с
международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», СанктПетербург, 2001-2007; ХIХ Российском съезде физиологического общества
им. И.П. Павлова с международным участием, Екатеринбург, 2004; VI
Международной конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды»,
Пермь-Казань, 2005; III съезде Российского научного общества иммунологов,
Екатеринбург, 2004; I-V конференциях иммунологов Урала, Екатеринбург,
2001; Пермь, 2002; Челябинск, 2003; Уфа, 2005; Оренбург, 2006; I-II
конференциях молодых учёных «Современные проблемы микробиологии,
иммунологии и экологии», Пермь, 1999, 2002.
Публикации. Материалы диссертационной работы обобщены в 46
печатных работах, в том числе 15 экспериментальных статьях и 31 материале
конференций.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 251 странице,
содержит 35 таблиц, 49 рисунков и состоит из введения, обзора литературы,
описания объектов и методов исследования, 7 глав результатов собственных
исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы,
включающего 448 наименований, в том числе 124 на русском и 324 на
английском языках.
Место проведения работы. Работа является частью исследований,
выполняемых в аналитической лаборатории ИЭГМ УрО РАН (зав. – к.г.-м.н.
М.А. Шишкин) совместно с лабораторией экологической иммунологии (зав.
– к.м.н. Б.А. Бахметьев) по изучению механизмов иммуномодулирующих
эффектов гормонов, продукция которых изменяется на фоне экологического
воздействия. Исследования по проблеме нейроэндокринной регуляции
иммуногенеза были инициированы профессором, заслуженным деятелем
науки РФ Н.Н. Кеворковым. Научные положения диссертации и выводы,
вытекающие из анализа полученного экспериментального материала,
базируются на результатах собственных исследований автора.
Автор выражает искреннюю благодарность М.А. Шишкину, к.х.н. С.П.
Тендряковой, профессору М.В. Черешневой, за внимание и моральную
поддержку. Автор особо признателен сотрудникам группы радиоизотопных
исследований к.б.н. Т.А. Баевой, инженеру Е.Г. Чижовой, магистрантам
кафедры микробиологии и иммунологии Пермского государственного
университета К.Г. Горшковой и И.Л. Шаравьёвой, способствующим
завершению настоящей работы и чей вклад в определённые разделы
исследований отражён в приведённых в списке литературы публикациях.
Автор благодарит главного специалиста Муниципального управления
здравоохранением Ростехнадзора, к.м.н. В.Г. Рыжаенкова за помощь в
проведении иммуноферментного анализа.
Глубокую благодарность и признательность автор выражает своим
учителям и наставникам, академику РАН и РАМН В.А. Черешневу и доценту
Ю.И. Шилову, оказавшим большое влияние на выбор целей научного поиска
и формирование научного мировоззрения автора.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. В работе использовали белых
беспородных мышей массой 20-22 г и лейкоциты периферической венозной
крови, полученной от здоровых людей – добровольцев мужского пола в
возрасте 19-35 лет.
Для экспериментального моделирования реакции стресс использовали
ротационную модель. Ротация мышей производилась в течение 60 мин по 10
мин с перерывами по 5 мин при 78 об/мин. Роль опиатных рецепторов в
постстрессорных изменениях иммунных реакций исследовали путем их
блокады налоксона гидрохлоридом и налтриндола гидрохлоридом.
Налоксона гидрохлорид (DuPont, США) в разовой дозе 0,2 мг/кг массы тела и
селективный антагонист δ-опиатных рецепторов налтриндола гидрохлорид
(ICN, США) в дозе 0,1 мг/кг вводили животным подкожно однократно за 20
мин до ротации (Ашмарин, 1988; Михайлова и др., 1992; Croock et al., 1992).
В дальнейших экспериментах в системе in vivo дозы опиатных антагонистов
не изменялись. Иммунизацию животных производили через 1 ч после
окончания ротации.
При исследовании иммунорегуляторных эффектов опиоидных
пептидов in vivo β-эндорфин (Sigma, США) в диапазоне доз от 100 мкг/кг до
0,0005 мкг/кг вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 0,2 мл.
Контролем для
животных, получавших β-эндорфин, служили мыши,
которым вводили по той же схеме 0,9% NaCl. µ-агонист DAGO ([d-Ala2,NDADLE ([d–Ala2,d-Leu5] Me-Phe4,Gly5-ol]-энкефалин и δ-агонист
энкефалин) (Sigma, США) в диапазоне 10 – 0,0001 мкг/кг вводили по схеме
аналогичной введению β-эндорфина. Иммунизацию животных производили
через 1 ч после введения опиоидных пептидов.
Гидрокортизона ацетат (Гедеон Рихтер, Венгрия) в дозе 50 мг/кг массы
тела вводили однократно внутрибрюшинно. Адреналина гидрохлорид
(Московский эндокринный завод, Россия) вводили подкожно однократно в
дозе 1 мг/кг. Налоксон и селективный антагонист δ-опиатных рецепторов
налтриндол вводили подкожно за 20 мин до введения гормонов (3 инъекции
через 2,5 ч в группе с гидрокортизоном и 1 инъекция в группе с
адреналином). Контролем служили интактные мыши, подвергшиеся
иммунизации, но не получавшие препаратов. Дополнительным контролем
для животных, получавших гидрокортизон и опиоидные пептиды, служили
мыши, получавшие по той же схеме изотонический раствор хлорида натрия.
Иммунизацию опытных и контрольных мышей проводили одномоментно
через 3 ч от начала эксперимента в группах с гидрокортизоном, через 30 мин
- в группах с адреналином.
Для моделирования локального иммунного ответа животных
иммунизировали эритроцитами барана (108 клеток вводили подкожно в
подошвенную поверхность правой стопы). На 4-е сутки вводили
разрешающую дозу антигена (108 клеток). На 5-е сутки оценивали
выраженность иммунного воспаления при реакции ГЗТ путём регистрации
толщины (инженерным микрометром) и массы (на торсионных весах)
опытной и контрольной стопы; количество ядросодержащих клеток (ЯСК);
интенсивность антителогенеза методом локального гемолиза в геле агарозы
(Jerne, Nordin, 1963). Оценку фагоцитарной активности клеток
периферической крови, селезенки, регионарного и отдаленного подколенных
лимфатических узлов проводили методом В.Н. Каплина с соавт. (Каплин,
1992, 1996) в модификации (Шилов и др., 1997, 1998).
Нефракционированную клеточную взвесь получали путём отстаивания
верхнего слоя плазмы крови с лейкоцитами. Выделение фракции
мононуклеаров и нейтрофилов проводили на градиенте плотности фиколлверографин. Разделение моноцитов и лимфоцитов проводили методом
адгезии на чашках Петри. CD4+ Т-клетки выделяли при помощи набора
магнитных бус Dynabeads M-450 CD4 (Invitrogen, США). Культивирование
клеток проводили в течение 24, 48 и 72 ч в пластиковых 24 и 96-луночных
планшетах (Orange Scientific, Бельгия) в соответствии с традиционными
методиками с использованием полной питательной среды, приготовленной
на основе RPMI 1640 или среды 199 (Биолот, Россия) с добавлением 10 mM
HEPES, 2 mM L-глутамина (Sigma, США), 100 мкг/мл гентамицина и 10%
эмбриональной телячьей сыворотки (Биолот, Россия) или аутоплазмы во
влажной атмосфере с 5% СО2 при 370С.
Пролиферативную активность оценивали по включению 3Hметилтимидина. Радиоактивность проб определяли на жидкостном
сцинтилляционном счетчике Guardian (Wallac, Финляндия). Для определения
концентрации IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-1ra, IL-2, IL-4 и IFN-γ в
супернатантах культур клеток использовали спектрофотометр Униплан
(Пикон, Россия) и иммуноферментные тест-системы производства ООО
Протеиновый контур, ООО Цитокин, Санкт-Петербург, Вектор-Бест,
Новосибирск. В экспериментах in vitro использовали агонист δ,µ-опиатных
рецепторов β-эндорфин в концентрациях 10-7-10-12М; меланотропин
потенцирующий фактор (MPF) - фрагмент 88-91 β-липотропина (Lys-LysGly-Glu) в концентрациях 10-7-10-12М; µ-агонист опиатных рецепторов DAGO
([d-Ala2,N-Me-Phe4,Gly5-ol]-энкефалин) в концентрациях 10-7– 10-12М; δагонист опиатных рецепторов DADLE ([d–Ala2,d-Leu5]-энкефалин) в
концентрациях 10-7–10-12М; неселективный антагонист опиатных рецепторов
налоксона гидрохлорид и селективный антагонист δ-рецепторов налтриндола
гидрохлорид в концентрациях 10-6, 10-8, 10-10М; липополисахарид (ЛПС)
Escherichia coli O26:B6 - 0,1 мкг/мл (Sigma, США), фитогемагглютинин
(ФГА) – 1,25; 2,5; 5,0; 10,0; 20,0 мкг/мл (Sigma, США), диклофенак натрия
(ДН) 25 мкг/мл, моноклональные анти-IL-1β антитела – 2 мкг/мл.
Полученные данные обрабатывали с помощью многофакторного
дисперсионного анализа для парных данных и корреляционного анализа.
Достоверность различий между группами оценивали с помощью t-критерия
Стьюдента и критерия Фишера наименьшей значимой разницы. Сортировку
и обработку данных проводили на компьютере IBM PC c использованием
программ Statistica for Windows 6.0 (Statsoft, Inc., США) и DIASTA
(Московский государственный университет, Россия).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние ротационного стресса на показатели иммунитета. Роль
опиатных рецепторов. В большинстве опубликованных работ,
посвященных изучению влияния стресса на иммунный ответ, исследуются
изменения системного иммунного ответа в условиях внутривенной или
внутрибрюшинной иммунизации. Принимая во внимание
разные
компоненты внутрисистемной регуляции общих и локальных форм
иммунного ответа, представлялось целесообразным исследование эффектов
стресса и блокады опиатных рецепторов в условиях развития локальной
формы иммунного ответа.
Как видно из рис. 1, в индуктивную фазу иммунного ответа на фоне
стресса наблюдается увеличение числа АОК в лимфатическом узле (ЛУ) и
усиление степени выраженности реакции ГЗТ. Блокада δ-опиатных
рецепторов приводит к ещё более выраженной активации антителогенеза, в
А
Б
Контроль
Контроль
*
Стресс
Стресс+налтриндол
Стресс+налоксон
*•
Налтриндол
Налоксон
*
Стресс
Стресс+налтриндол
Стресс+налоксон
*•
Налтриндол
Налоксон
0
1
2
3
4
0
log10АОК/орг
0,5
В
1,5
2
2,5
3
Г
Контроль
Контроль
Стресс
Стресс+налтриндол
Стресс+налоксон
Стресс
Стресс+налтриндол
Стресс+налоксон
Налтриндол
Налоксон
Налтриндол
Налоксон
0
1
log10АОК/млн
5
10
×106
15
*
0
5
10 15 20 25 30 35
%
Рис. 1. Влияние ротационного стресса в условиях блокады
опиатных рецепторов на абсолютное (А) и относительное (Б) число АОК,
количество ЯСК в регионарном лимфатическом узле (В) и
выраженность реакции ГЗТ (Г) в индуктивную фазу иммунного ответа.
Здесь и на рис. 2: * - p<0,05 к контролю; • - p<0,05 к стрессу.
то время как на фоне налоксона стимулирующий эффект ротационного
стресса на антителогенез отменяется. Стрессиндуцированное усиление
выраженности реакции ГЗТ отменяется как налоксоном, так и налтриндолом.
Изолированное введение животным налтриндола или налоксона на
количество АОК и степень выраженности ГЗТ влияния не оказывает. В
эффекторную фазу иммунного ответа
ротационный стресс (рис. 2)
стимулирует как клеточный, так и гуморальный ответ, однако, в отличие от
индуктивной фазы, на фоне блокады опиатных рецепторов эффекты стресса
не модифицируются. Таким образом, стимуляция опиатных рецепторов в
индуктивную фазу иммунного ответа играет важную роль в
стрессиндуцированных изменениях иммуногенеза и ответственна за
активацию функций иммунной системы при стрессе.
Влияние гидрокортизона и адреналина на локальный иммунный
ответ в условиях блокады опиатных рецепторов. В процессе развития
стрессреакции основные стрессреализующие факторы глюкокортикоиды,
А
Б
Контроль
Контроль
*
*
*
Стресс
Стресс+налтриндол
Стресс+налоксон
*
*
*
Стресс
Стресс+налтриндол
Стресс+налоксон
Налтриндол
Налоксон
Налтриндол
Налоксон
0
1
2
3
0
4
1
log10АОК/орг
Г
Контроль
Контроль
Стресс
Стресс+налтриндол
Стресс+налоксон
Стресс
Стресс+налтриндол
Стресс+налоксон
Налтриндол
Налоксон
Налтриндол
Налоксон
2
3
log10АОК/млн
В
0
2
4
6
×106
8
10
*
*
0
10
20
30
*
40
%
Рис. 2. Влияние ротационного стресса в условиях блокады
опиатных рецепторов на абсолютное (А) и относительное (Б) число АОК,
количество ЯСК в регионарном лимфатическом узле (В) и
выраженность реакции ГЗТ (Г) в эффекторную фазу иммунного ответа.
Таблица 1. Влияние гидрокортизона в условиях блокады µ- и δ-опиатных
рецепторов на число АОК, количество ЯСК в лимфатическом узле и
выраженность реакции ГЗТ в индуктивную фазу иммунного ответа
Лимфатический узел
Экспериментальное воздействие
ЯСК на орган
(×106)
log10 АОК на
106 ЯСК
log10 АОК на
орган
Интактные животные
(контроль), n=19
8,93±1,35
2,15±0,15
(142)
3,01±0,17
(1014)
Физиологический
раствор, n=16
7,79±1,08
2,27±0,16
(186)
3,10±0,13
(1252)
Гидрокортизон, n=19
4,98±0,68*#
1,64±0,23
(43)
2,17±0,25*#
(149)
Гидрокортизон
+налоксон, n=15
6,71±0,75a
0,96±0,21*#a
(9)
1,50±0,31*#
(32)
Гидрокортизон
+налтриндол, n=17
5,87±0,71
0,55±0,14*#a
(4)
1,07±0,22*#a
(12)
Налоксон, n=10
7,76±1,27
2,24±0,08
(173)
3,07±0,14
(1187)
Налтриндол, n=12
8,38±1,37
1,93±0,11
(86)
2,79±0,11
(622)
Примечание. Здесь и в табл. 2, 3, 4 в скобках указана средняя
геометрическая числа АОК (антилогарифм из средней арифметической log10
числа АОК). * - p<0,05 к контролю; # - p<0,05 к физиологическому раствору;
а - p<0,05 к гидрокортизону по непарному t-критерию Стъюдента.
катехоламины и эндогенные опиоиды находятся в тесной взаимосвязи и
оказывают друг на друга взаимное регуляторное влияние (O`Connor, 2000).
Как видно из табл. 1, в индуктивную фазу иммунного ответа гидрокортизон
снижает количество ядросодержащих клеток в лимфатическом узле и
абсолютное число АОК. При введении гидрокортизона на фоне блокады
опиатных рецепторов налоксоном и налтриндолом регистрируется отмена
индуцированного гидрокортизоном снижения количества ЯСК и ещё более
выраженное угнетение антителогенеза по абсолютным и относительным
показателям,
Таблица 2. Влияние адреналина в условиях блокады µ- и δ-опиатных
рецепторов на число АОК, количество ЯСК в лимфатическом узле и
выраженность реакции ГЗТ в индуктивную фазу иммунного ответа
Лимфатический узел
Экспериментальное воздействие
ЯСК на
орган
(×106)
log10
АОК на
106 ЯСК
log10
АОК на
орган
Интактные
животные (контроль)
n=11
6,29±1,04
2,43±0,16
(268)
3,15±0,22
(1403)
Адреналин, n=9
5,71±0,74
2,07±0,14
(118)
2,79±0,16
(618)
Адреналин
+налоксон, n=6
7,37±2,08
1,94±0,15*
2,73±0,24
(86)
(541)
Адреналин
+налтриндол, n=11
6,62±1,30
1,78±0,25*
(60)
2,45±0,32
(283)
Налоксон, n=10
7,76±1,27
2,24±0,08
(173)
3,07±0,14
(1187)
Налтриндол, n=9
8,07±1,82
2,08±1,97
(121)
2,90±0,13
(803)
особенно ярко проявляющееся в условиях блокады δ-рецепторов.
Изолированное введение экспериментальным животным налтриндола и
налоксона на исследуемые показатели влияния не оказывает. В эффекторную
фазу иммунного ответа гидрокортизон угнетает количество ядросодержащих
клеток в лимфатическом узле, абсолютное число АОК, однако в отличие от
индуктивного периода на фоне блокады опиатных рецепторов эффекты
гидрокортизона на показатели клеточности и антителогенеза не
модифицируются.
Несколько иная картина наблюдается при анализе эффектов
адреналина. Как видно из табл. 2, в индуктивную фазу адреналин оказывает
статистически достоверный эффект на антителогенез по относительным
показателям (F=5,28; p<0,03), несмотря на то, что при межгрупповом
сравнении по отношению к контролю угнетение относительного количества
АОК имеет место только при комбинации адреналина с опиатными
Таблица 3. Влияние β-эндорфина на число АОК, клеточность и
выраженность реакции ГЗТ в регионарном лимфатическом узле
ИнтенсивЛимфатический узел
ность ГЗТ
Эксперименталь Число
ное воздействие, живот- ЯСК на
Log10
Log10
ИР по
β-эндорфин
ных
АОК
на
АОК
на
массе
орган
106 ЯСК
орган
стопы, % •
(*106)
Контроль
9
4,62±0,89 2,43±0,10
3,04±0,01 17,22±2,41
(271,28)
(1088,94)
100 мкг/кг
9
4,33±0,71 1,98±0,22* 2,57±0,26* 19,84±3,68
(95,28)
(370,54)
10 мкг/кг
8
5,25±0,70 2,06±0,26
2,76±0,25 23,92±3,46
(115,56)
(569,35)
1 мкг/кг
9
4,87±1,06 2,46±0,18
3,05±0,16 20,25±4,25
(286,09)
(1128,59)
0,1 мкг/кг
8
7,55±1,35 2,25±0,18
3,08±0,13 18,82±6,17
(117,27)
(1198,91)
0,01 мкг/кг
9
5,33±1,13 2,68±0,09
3,34±0,13 26,72±3,88
(474,99)
(2192,95)
0,001 мкг/кг
8
5,90±1,73 2,62±0,73
3,21±0,13 21,27±4,88
(421,49)
(1607,54)
0,0005 мкг/кг
9
5,82±0,81 2,87±0,08* 3,61±0,07* 28,72±4,10
(743,72)
(4031,74)
Примечание. Здесь и в табл. 4: • - индекс реакции (ИР): И.Р. = (Ро–
Рк)/Рк·100%, где Ро и Рк - показатели массы в опытной и контрольной
конечностях. * - p<0,05 к контролю по t-критерию Фишера наименьшей
значимой разницы.
антагонистами. В эффекторную фазу иммунного ответа адреналин на
антителогенез в лимфатическом узле не влияет. Таким образом, блокада
опиатных рецепторов в индуктивную фазу иммунного ответа приводит к
существенной
модификации
иммунорегуляторных
эффектов
глюкокортикоидов и катехоламинов, связанной с изменениями секреции βэндорфина в ответ на введение гидрокортизона или адреналина (Mougey et
al., 1986; Bagdy et al., 1989; Goodwin et al., 1992).
Влияние β-эндорфина на показатели клеточного и гуморального
иммунитета. Степень выраженности эффектов β-эндорфина в системе in vivo
Таблица 4. Влияние β-эндорфина в условиях блокады опиатных
рецепторов на число АОК, клеточность и выраженность реакции ГЗТ
в регионарном лимфатическом узле в индуктивную фазу иммунного
ответа
Интенсивность ГЗТ
Экспериментальное
воздействие
Число
животных
ЯСК на
орган (×106)
log10
АОК
на
106 ЯСК
log10
АОК на
орган
Контроль
18
5,34±0,62
2,35±0,10
(223,55)
3,02±0,11
(1043,31)
22,43±3,19
β-эндорфин
(100 мкг/кг)
18
4,71±0,51
1,99±0,14*
(98,80)
2,36±0,15*
(423,03)
22,16±2,73
β-эндорфин
(0,0005 мкг/кг)
β-эндорфин
(100 мкг/кг) +
налоксон
β-эндорфин
(0,0005 мкг/кг) +
налоксон
β-эндорфин
(100 мкг/кг) +
налтриндол
β-эндорфин
(0,0005 мкг/кг) +
налтриндол
Налоксон
17
5,98±0,66
5,64±0,97
3,40±0,08*
(2519,33)
2,87±0,18
(747,62)
27,95±2,73
11
2,67±0,07*
(465,21)
2,21±0,14
(161,61)
12
5,95±0,66
2,16±0,12
(143,12)
2,90±0,14
(798,77)
28,57±6,77
11
7,18±41,24
2,50±0,07
(314,71)
3,29±0,05*
(1945,42)
23,32±4,17
11
9,07±1,24*
2,52±0,09
(327,67)
3,43±0,12*
(2673,98)
25,67±3,12
12
6,40±0,73
8
6,98±0,55
3,01±0,11
(1013,98)
2,87±0,21
(755,38)
16,08±2,02
Налтриндол
2,23±0,09
(170,40)
2,04±0,24
(110,87)
Лимфатический узел
ИР по массе
стопы, %
23,79±4,27
18,36±1,92
Примечание. * - p<0,05 к контролю по непарному t-критерию
Стьюдента.
напрямую зависит от вводимой дозы пептида (табл. 3). Пептид оказывает
разнонаправленный эффект на гуморальный иммунный ответ, угнетающий в
дозе 100 мкг/кг и стимулирующий в дозе 0,0005 мкг/кг образование АОК в
регионарном ЛУ. При этом статистически достоверного влияния βэндорфина на клеточность ЛУ и степень выраженности реакции ГЗТ не
обнаруживается. Таким образом, β-эндорфин в системе in vivo в зависимости
от дозы как усиливает, так и угнетает образование антителопродуцентов.
Данные о влиянии β-эндорфина на фоне блокады опиатных рецепторов
представлены в табл. 4. Блокада рецепторов неселективным антагонистом
налоксоном отменяет как угнетающий эффект дозы 100 мкг/кг, так и
стимулирующий эффект дозы 0,0005 мкг/кг на относительное и абсолютное
количество АОК. В то же время введение мышам β-эндорфина на фоне
блокады δ-рецепторов налтриндолом по абсолютным показателям не
отменяет стимулирующего эффекта низкой (0,0005 мкг/кг) дозы пептида и
приводит к увеличению числа АОК в ответ на введение животным высокой
дозы (100 мкг/кг). Кроме этого, введение пептида в дозе 0,0005 мкг/кг на
фоне налтриндола приводит к статистически достоверному увеличению
клеточности ЛУ по сравнению с контролем. На степень выраженности
иммунного воспаления комбинация β-эндорфина с антагонистами опиатных
рецепторов влияния не оказывает. Таким образом, β-эндорфин в зависимости
4,5
log10AOK/млн
**
**
log10AOK/орг
***
2,8
4
3,5
2,3
**
*
**
3
2,5
1,8
2
К
10
1
0,1
0,01
мкг/кг
0,001 0,0001
К
20
15
15
10
%
10
5
1
0,1
0,01
мкг/кг
0,001 0,0001
*
106 ЯСК
20
10
*
5
0
0
К
10
1
0,1
0,01
мкг/кг
0,001 0,0001
К
10
1
0,1
0,01
мкг/кг
0,001 0,0001
Рис. 3. Влияние DADLE на относительное и абсолютное число
АОК, выраженность реакции ГЗТ и клеточность в регионарном
лимфатическом узле в индуктивную фазу иммунного ответа.
* - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 к контролю по t-критерию Фишера
наименьшей значимой разницы.
от дозы оказывает разнонаправленное влияние на образование
антителопродуцентов, не влияя на клеточноопосредованный ответ.
Способность пептида взаимодействовать с δ-рецептором проявилась только
при введении высокой дозы, что, в свою очередь, указывает на возможность
реализации через δ-рецептор иммуносупрессивных эффектов, напротив,
блокада µ-рецепторов отменяет эффекты пептида независимо от вводимой
дозы. В эффекторную фазу влияния β-эндорфина на иммунный ответ не
выявляется.
Параллельно нами изучалось сравнительное влияние селективных µ и
δ-агонистов на выраженность локального иммунного ответа. Как видно из
рис. 3, в индуктивную фазу иммунного ответа введение δ-агониста DADLE
в дозах 10,0; 0,1; 0,01 мкг/мл стимулирует количество АОК по абсолютным и
относительным параметрам, не влияет на степень выраженности иммунного
воспаления (ГЗТ) и оказывает разнонаправленное действие на клеточность
регионарного лимфатического узла, при этом в дозе 10 мкг/кг угнетая, а в
дозе 0,1 мкг/кг, увеличивая содержание ЯСК. Введение µ-агониста DAGO
статистически достоверно влияет только на относительное число АОК и
клеточность регионарного лимфатического узла. В дозах 10,0; 1,0; 0,0001
***
*
*
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
log10AOK/орг
log10AOK/млн
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
К
10
1
0,1
0,01
мкг/кг
0,001 0,0001
К
20
20
15
106 ЯСК
25
15
%
10
10
10
***
1
**
0,1
0,01
мкг/кг
0,001 0,0001
*
5
5
0
0
К
10
1
0,1
0,01
мкг/кг
0,001 0,0001
К
10
1
0,1
0,01
мкг/кг
0,001 0,0001
Рис. 4. Влияние DAGO на относительное и абсолютное число АОК,
выраженность реакции ГЗТ и клеточность в регионарном
лимфатическом узле в индуктивную фазу иммунного ответа.
* - p<0,05; ** - p<0,01; *** - p<0,001 к контролю по t-критерию Фишера
наименьшей значимой разницы.
мкг/кг пептид активирует образование антителопродуцентов по
относительным показателям и в диапазоне доз 10-0.1 мкг/кг угнетает
количество ЯСК (рис. 4). Таким образом, по нашим данным, в системе in
vivo эффекты β-эндорфина и аналогов энкефалинов с µ,δ-селективным
спектром связывания DAGO и DADLE значительно варьируют по
направленности действия, эффективному диапазону доз, взаимодействию с
опиатными рецепторами различных типов, а также зависят от этапа, на
конкретный опиоидный пептид вмешивается в развитие иммунных реакций.
В то же время наиболее выраженное активирующее влияние наблюдается
при введении экспериментальным животным селективного агониста δрецепторов DADLE.
Влияние β-эндорфина, 88-91 фрагмента липотропина MPF,
селективных лигангдов DAGO, DADLE на пролиферативный ответ
лимфоцитов. Степень выраженности эффектов исследуемых опиоидных
пептидов в системе in vitro зависит от их концентрации и присутствия
митогена в культуральной среде. Все лиганды опиатных рецепторов
проявляют активность только на стимулированных митогеном культурах.
Как видно из рис. 5, β-эндорфин в концентрации 10-7М статистически
значимо усиливает пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с ФГА 5
мкг/мл. Внесение пептида в культуры в концентрации 10-8М приводит к
стимуляции реакции бласттрансформации в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
Низкие (10-10, 10-11М) концентрации β-эндорфина стимулируют
пролиферативный ответ в культурах с ФГА 5,0 и 2,5 мкг/мл, соответственно.
Внесение β-эндорфина в концентрации 10-12М, отражающей фоновый
уровень пептида в плазме крови, не оказывает существенного влияния на
пролиферацию лимфоцитов. А.А. Зозулей и С.Ф. Пшеничкиным (1990)
высказано предположение, что иммуномодулирующие эффекты β-эндорфина
могут проявляться через С-концевой участок пептидной цепи,
невзаимодействующий с δ-, µ-рецепторами. В связи с этим, представлял
интерес анализ эффектов С-концевого тетрапептида β-эндорфина MPF
(меланотропин-потенцирующего фактора) на пролиферативную активность
лимфоцитов периферической крови. Как видно из рис. 6, MPF ни в одной из
исследуемых концентраций статистически значимых эффектов на
A
20000
*
*
имп/мин
15000
I
*
10000
*
5000
II
III
IV
0
К
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Концентрация пептида, log М
Б
20000
имп/мин
15000
10000
*
*
*
*
*
I
II
5000
III
0
IV
К
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Концентрация пептида, log М
Рис. 5. Влияние β-эндорфина (A) и DAGO (Б) на ФГАиндуцированный пролиферативный ответ лимфоцитов.
Здесь и на рис. 6: I - ФГА 5 мкг/мл, II - ФГА 2,5 мкг/мл, III - ФГА 1,25
мкг/мл, IV – без внесения ФГА. Число наблюдений в группах с βэндорфином n=9, в группах с DAGO - n=8. * - р<0.05 к контролю по парному
t-критерию Фишера наименьшей значимой разницы.
спонтанную и индуцированную митогеном пролиферацию лимфоцитов не
оказывает. Это позволяет предположить, что выявленный стимулирующий
эффект β-эндорфина на пролиферативную активность лимфоцитов не
опосредуется через его С-концевой участок.
В связи с тем, что β-эндорфин N-концевой последовательностью
связывается как с µ-, так и δ-опиатными рецепторами и не ясно, какой тип
A
20000
имп/мин
15000
I
*
II
10000
III
5000
IV
0
К
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Концентрация пептида, log М
Б
80000
I
имп/мин
60000
40000
20000
II
III
IV
0
К
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Концентрация пептида, log М
Рис. 6. Влияние DADLE (А) и MPF (Б) на ФГА-индуцированный
пролиферативный ответ лимфоцитов.
Число наблюдений 8.
рецепторов в данном случае является основным проводником сигнала с
поверхности клетки, мы сопоставили его эффекты на пролиферацию с
эффектами селективных µ- и δ-агонистов. Данные о влиянии синтетического
селективного агониста µ-опиатных рецепторов DAGO на пролиферативную
активность лимфоцитов периферической крови представлены на рис. 5.
Анализ зависимости эффектов от концентрации показал, что DAGO в
высоких и низких концентрациях достоверно усиливает пролиферативный
ответ лимфоцитов исключительно в присутствии субоптимальной
концентрации (2,5 мкг/мл) митогена. На спонтанный пролиферативный ответ
DAGO подобно β-эндорфину влияния не оказывает.
Аналогичные результаты получены при анализе влияния селективного
δ-агониста DADLE на пролиферацию лимфоцитов (см. рис. 6). Выявлено, что
DADLE усиливает включение 3Н-тимидина лимфоцитами по сравнению с
контролем в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл и высокой концентрации (10-7 М)
данного пептида.
В дальнейшем проводилась сравнительная оценка влияния βэндорфина на пролиферативный ответ на фоне блокады опиатных
рецепторов в нефракционированных и фракционированных, очищенных от
моноцитов, лимфоцитарных культурах. Как видно из рис. 7, в
нефракционированной лейкоцитарной суспензии стимулирующий эффект βэндорфина на пролиферативный ответ не отменяется, а напротив,
усиливается. При удалении моноцитов из фракции мононуклеаров βэндорфин (F=13,07; p=0,006) и налоксон (F=10,21; p=0,011) оказывают
высоко достоверные
А
Б
Контроль
β-эндорфин
β-эндорфин+
налоксон
Налоксон
Контроль
β-эндорфин
β-эндорфин+
налоксон
Налоксон
DAGO
DAGO
DADLE
DADLE
0
200 400 600 800 1000
имп/мин
0
*
*•
*
*
*
20000
40000
60000
имп/мин
Рис. 7. Эффекты β-эндорфина на фоне блокады опиатных
рецепторов, DAGO и DADLE на спонтанную (A) и индуцированную ФГА
2,5 мкг/мл (Б) пролиферативную активность лимфоцитов в
нефракционированных клеточных культурах.
Здесь и на рис. 8, 11, 12: β-эндорфин 10-7М; налоксон 10-8М; DAGO 108
М; DADLE - 10-7М. * - р<0,05 к контролю по парному t-критерию
Стъюдента; • - p<0,05 к β-эндорфину.
самостоятельные эффекты на ФГА-индуцированную пролиферацию, не
проявляя статистически значимого взаимодействия между собой (F=4,08;
p=0,074). Последующее сравнение средних величин показало, что
направленность эффектов
опиоидных
пептидов противоположна
влиянию, оказываемому β-эндорфином и налоксоном в присутствии фракции
моноцитов (рис. 8). В частности, выраженное угнетение пролиферации
лимфоцитов по сравнению как с контролем, так и с β-эндорфином
наблюдается при совместном внесении в культуры β-эндорфина и налоксона.
Угнетающий эффект на захват 3Н-тимидина лимфоцитами оказывает
селективный µ-агонист DAGO. Селективный агонист δ-рецепторов DADLE
не влияет на ФГА-индуцированную пролиферативную активность
лимфоцитарной фракции. При этом эффекты исследуемых опиоидов в
аналогичных культурах без митогена не обнаруживаются. Проведенный
корреляционный анализ выявил статистически достоверную (r=0,73; р<0,05)
зависимость между интенсивностью пролиферации лимфоцитов в
нефракционированных культурах под воздействием β-эндорфина и в
аналогичных культурах, очищенных от фракции моноцитов.
Анализ роли δ-рецепторов в регуляции пролиферативного ответа в
нефракционированной лейкоцитарной суспензии и фракции лимфоцитов
(рис. 9) показал отмену стимулирующего эффекта β-эндорфина
налтриндолом во фракции лейкоцитов. Во фракции лимфоцитов β-эндорфин
и налтриндол на степень выраженности пролиферации не влияют, что
свидетельствует о возможной реализации стимулирующего эффекта пептида
через δ-рецептор, но только в присутствии моноцитов.
А
Б
Контроль
β-эндорфин
β-эндорфин+
налоксон
Налоксон
Контроль
β-эндорфин
β-эндорфин+
налоксон
Налоксон
DAGO
DAGO
DADLE
DADLE
0
200
400
600
800
0
*•
*
10000
имп/мин
20000
имп/мин
Рис. 8. Эффекты β-эндорфина на фоне блокады опиатных
рецепторов, DAGO и DADLE на спонтанную (A) и индуцированную ФГА
2,5 мкг/мл (Б) пролиферативную активность лимфоцитов в клеточных
культурах, очищенных от фракции моноцитов.
* - р<0,05 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.
А
Б
Контроль
Контроль
β-эндорфин
*
β-эндорфин+
налтридол
Налтриндол
0
10000 20000 30000 40000
β-эндорфин
β-эндорфин+
налтридол
Налтриндол
0
20000
имп/мин
40000
60000
имп/мин
Рис. 9. Эффекты β-эндорфина 10-7М на фоне блокады δ-опиатных
рецепторов налтриндолом 10-6М на индуцированную ФГА 2,5 мкг/мл
пролиферативную активность лимфоцитов во фракции лейкоцитов (А)
и фракции лимфоцитов (Б).
* - р<0,05 к контролю по парному t-критерию Стъюдента.
Учитывая важную регуляторную роль моноцитов, в дальнейшем мы
попытались оценить роль IL-1β и продуктов циклооксигеназного цикла в βэндорфинопосредованной регуляции пролиферативного ответа лимфоцитов в
присутствии ФГА (рис. 10А). Все обследованные здоровые доноры были
разделены по индивидуальной чувствительности к β-эндорфину на две
группы: у 1-й группы пептид стимулировал пролиферативный ответ, а у 2-й –
угнетал. В первой группе доноров на фоне моноклональных антител к IL-1β
наблюдается резкое снижение пролиферативной активности, в то же время
при внесении в культуры анти-IL-1β-антител в присутствии β-эндорфина
наблюдается некоторое усиление пролиферативного ответа, достоверно
отличающееся от культур с анти-IL-1β-антителами, но по сравнению с
контролем уровень захвата метки был также достоверно ниже. Как видно на
рис. 10Б, у второй группы доноров на фоне при культивировании лейкоцитов
в присутствии диклофенака натрия как стимулирующий, так и угнетающий
эффект β-эндорфина на пролиферативный ответ нивелируется, что
подтверждает
данные
о
возможном
участии
простагландинов
(простагландина E2 (PGЕ2), в частности) в регуляции функциональной
активности лимфоцитов под воздействием опиоидных пептидов. Таким
образом, регуляция функциональной активности лимфоцитов β-эндорфином
может опосредоваться как системой IL-1, так и простагландинами. анти-IL1β-антител интенсивность пролиферативного ответа в присутствии
А
Контроль
β-эндорфин
*
*а
β-эндорфин+анти-IL-1β
Анти-IL-1β
*
β-эндорфин+ДН
ДН
0
5000
10000
15000
имп/мин
Б
Контроль
β-эндорфин
*
β-эндорфин+анти-IL-1β
*
*
Анти-IL-1β
β-эндорфин+ДН
ДН
0
10000
20000
имп/мин
Рис. 10. Влияние β-эндорфина 10-7М на ФГА-индуцированный
пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии анти-IL-1β
β антител
и на фоне блокады синтеза простагландинов ДН у доноров 1-й (А, n=9) и
2-й (Б, n=11) групп.
* - р<0,05 к контролю; а - р< 0,05 к анти-IL-1β по парному t-критерию
Стъюдента.
β-эндорфина не изменяется.
Влияние β-эндорфина и селективных лигандов опиатных
рецепторов на процессы клеточной кооперации и переключение Th1/Th2
цитокинового профиля. Следующим этапом исследований являлось
изучение роли β-эндорфина в регуляции продукции IL-4 и IFN-γ в
супернатантах
нефракционированной
лейкоцитарной
взвеси,
лимфоцитарной фракции и культуре CD4+ клеток.
А
Контроль
β-эндорфин
Контроль
β-эндорфин
β-энд+налоксон
β-энд+налоксон
Налоксон
Налоксон
DAGO
DAGO
DADLE
DADLE
0
6
12
18
24
0
30
40
60
80
пг/мл
пг/мл
без ФГА
20
ФГА 2,5 мкг/мл
Б
Контроль
Контроль
β-эндорфин
β-эндорфин
β-энд+налоксон
Налоксон
β-энд+налоксон
Налоксон
DAGO
DAGO
DADLE
DADLE
0
2
4
6
пг/мл
без ФГА
8
10
∗
0
6
12 18 24 30 36
пг/мл
ФГА 2,5 мкг/мл
Рис. 11. Влияние β-эндорфина, DAGO, DADLE на продукцию IFN-γγ
в нефракционированной (А) и фракционированной культурах (Б).
Здесь и на рис. 12 число наблюдений n=10. * - р<0,05 к контролю по парному
t-критерию Стъюдента.
Как показано на рис. 11, уровень IFN-γ в супернатантах под
воздействием β-эндорфина, а также в случае комбинации β-эндорфина с
налоксоном не отличается от контроля как в нефракционированных
культурах, так и в культурах, очищенных от моноцитов, независимо от
присутствия ФГА в среде культивирования. Однако в фракционированных
клеточных культурах, стимулированных митогеном, регистрируется эффект
селективного δ-агониста DADLE на продукцию IFN-γ, что, очевидно,
обусловлено его прямым эффектом на рецепторные структуры клеточной
поверхности лимфоцитов.
На рис. 12 приведены результаты исследования влияния β-эндорфина,
DAGO, DADLE на продукцию IL-4 в нефракционированной лейкацитарной
А
Контроль
β-эндорфин
Контроль
β-эндорфин
β-энд+налоксон
∗
β-энд+налоксон
DAGO
DADLE
∗
DAGO
DADLE
0
10
20
30
∗
Налоксон
∗
Налоксон
40
∗
0
50
10 20 30 40 50 60
пг/мл
пг/мл
без ФГА
ФГА 2,5 мкг/мл
Б
Контроль
β-эндорфин
Контроль
β-эндорфин
β-энд+налоксон
β-энд+налоксон
Налоксон
*
Налоксон
DAGO
DAGO
DADLE
DADLE
0
5
10
15
20
0
3
пг/мл
без ФГА
6
9
12
пг/мл
ФГА 2,5 мкг/мл
Рис. 12. Влияние β-эндорфина, DAGO, DADLE на продукцию IL-4
в нефракционированной
(А) и фракционированной клеточных
культурах (Б).
* - р<0,05 к контролю по парному t-критерию Стьюдента.
суспензии и фракции лимфоцитов. По нашим данным, под воздействием
налоксона и DAGO в культурах без митогена регистрируются угнетающий и
стимулирующий эффекты, соответственно. Выраженный стимулирующий
эффект на ФГА-индуцированную продукцию IL-4 оказывают β-эндорфин,
налоксон и DADLE. В очищенной фракции лимфоцитов значимых эффектов
исследуемых соединений на продукцию IL-4 не выявляется, за исключением
угнетающего эффекта налоксона, зарегистрированного в культурах без
добавления митогена. Корреляционный анализ выявил отрицательную
зависимость (r=-0,68; р<0,05) между интенсивностью пролиферации и
уровнем IL-4 в культурах с совместным внесением β-эндорфина и налоксона
80
Мононуклеары
CD4+-клетки
CD4+ + моноциты
***
70
*
пг/мл
60
50
40
30
20
10
0
К
Бета-энд
К
Бета-энд
К
Бета-энд
-7
Рис 13. Влияние β-эндорфина 10 М на продукцию IL-4 фракцией
мононуклеаров,
CD4+-лимфоцитами
и
CD4+-лимфоцитами
в
присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
пг/мл
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию
Стъюдента.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Мононуклеары
CD4+-клетки
CD4+ + моноциты
***
*
К
DADLE
К
DADLE
К
DADLE
Рис 14. Влияние DADLE 10-7 М на продукцию IL-4 фракцией
и
CD4+-лимфоцитами
в
мононуклеаров,
CD4+-лимфоцитами
присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию
Стъюдента.
в присутствии ФГА. Таким образом, β-эндорфин, налоксон и селективный
агонист δ-рецепторов DADLE, усиливая пролиферацию, способствуют
изменению соотношения Т-хелперов в сторону Th2-клеток.
Учитывая, что во фракции лимфоцитов находятся Т-, В-лимфоциты,
NК-клетки, присутствие которых может оказывать влияние на конечный
результат, дальнейшие эксперименты проводились с использованием CD4+клеток, основных продуцентов IL-4. Как видно из рис. 13, β-эндорфин
усиливает продукцию IL-4 во фракции мононуклеаров, и не влияет на
уровень IL-4 в культуре CD4+-клеток. Добавление к CD4+-лимфоцитам
моноцитов приводит к восстановлению уровня продукции IL-4 под
воздействием β-эндорфина. Аналогичный по силе и направленности эффект
на продукцию IL-4 CD4+-лимфоцитами оказывает селективный δ-агонист
DADLE (рис. 14). Анализ влияния µ-агониста DAGO выявил тенденцию
80
Мононуклеары
CD4+-клетки
CD4+ + моноциты
70
пг/мл
60
50
40
30
20
10
0
К
DAGO
К
DAGO
К
DAGO
Рис 15. Влияние DAGO 10-8 М на продукцию IL-4 фракцией
и
CD4+-лимфоцитами
в
мононуклеаров,
CD4+-лимфоцитами
присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию
Стъюдента.
к усилению продукции IL-4 фракцией мононуклеаров (рис. 15), однако
статистически достоверного эффекта достичь не удалось. Как видно из рис.
16, внесение β-эндорфина на ФГА-индуцированную продукцию IL-2
мононуклеарами,
CD4+-лимфоцитами
и
комбинацией
CD4+лимфоциты+моноциты влияния не оказывает. Таким образом, полученные
данные свидетельствуют о том, что от присутствия моноцитов зависит
направленность влияния β-эндорфина и δ-агониста DADLE на Th1/Th2поляризацию лимфоцитов. Учитывая важное участие δ-рецепторов в
регуляции синтеза IL-4 была проанализирована их роль в эффекте β-
эндорфина на продукцию данного цитокина. В условиях блокады δрецепторов нивелируется усиливающее действие пептида на уровень IL-4 в
нефракционированных клеточных культурах. Во фракции лимфоцитов βэндорфин и налтриндол на продукцию IL-4 не влияют (рис. 17).
40
Мононуклеары
CD4+-клетки
CD4+ + моноциты
30
20
10
0
К
Бета-энд
К
Бета-энд
К
Бета-энд
Рис 16. Влияние β-эндорфина 10-7 М на продукцию IL-2 фракцией
CD4+-лимфоцитами в
мононуклеаров, CD4+-лимфоцитами и
присутствии моноцитов в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию
Стъюдента.
А
Б
Контроль
Контроль
β-эндорфин
*
β-эндорфин+
налтридол
Налтриндол
0
50
100
пг/мл
150
β-эндорфин
β-эндорфин+
налтридол
Налтриндол
0
50
100
150
пг/мл
Рис. 17. Эффекты β-эндорфина 10-7М на фоне блокады δ-опиатных
рецепторов
налтриндолом
10-6М
на
продукцию
IL-4
в
нефракционированной клеточной взвеси (А) и фракции лимфоцитов (Б)
в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию
Стьюдента.
Таким
образом,
результаты
проведённых
исследований
свидетельствуют о важной роли моноцитов в регуляции секреторной
активности клеток адаптивного иммунитета, при этом, как агонисты, так и
антагонисты опиатных рецепторов оказывают самостоятельные эффекты на
активность клеточных популяций.
Роль β-эндорфина в регуляции фагоцитарной активности клеток
естественного звена иммунитета. По нашим данным, β-эндорфин в
концентрациях 10-7 и 10-8 М (46,25±1,57 в контроле – 51,3±1,66 - β-эндорфин
10-7 М; P<0,001 к контролю) увеличивает процент фагоцитоза и
фагоцитарное число нейтрофилов (0,61±0,02 в контроле - 0,68±0,03 βэндорфин 10-7 М; P<0,001 к контролю). Помимо нейтрофилов пептид
усиливает фагоцитарную активность моноцитов в концентрациях 10-7 – 10-8
М, увеличивая процент фагоцитоза (36,9±2,75 в контроле – 47,7±4,8 - βэндорфин 10-7 М; P<0,05 к контролю) и фагоцитарное число (0,44±0,03 в
контроле - 0,67±0,08 β-эндорфин 10-7 М; P<0,05 к контролю). Так же βэндорфин стимулирует общий (суммарный) фагоцитоз. На фагоцитарную
активность эозинофилов β-эндорфин не влияет.
Роль β-эндорфина в регуляции цитокинпродуцирующей функции
моноцитов и нейтрофилов. Как видно из табл. 5, 6, ЛПС усиливает
продукцию IL-1β, TNF-α, IL-6 только в культурах с фракцией моноцитов, в
то время как в культуре лейкоцитов эффект ЛПС на синтез IL-1β, TNF-α, IL6 отсутствует. В то же время уровень IL-8 в ответ на ЛПС усиливается в
нефракционированной клеточной фракции и не изменяется в очищенной
моноцитарной фракции. В нефракционированной клеточной культуре βэндорфин (10-7-10-11М) активирует LPS-индуцированную продукцию IL-1β,
не влияя на синтез IL-6, TNF-α и угнетая продукцию IL-8 в концентрациях
10-7 и 10-11М. β-эндорфин в концентрациях 10-7 - 10-11М усиливает продукцию
IL-1ra, рецепторного антагониста IL-1β. Значительно менее выраженный
стимулирующий эффект пептид оказывает на спонтанную продукцию IL-1β в
концентрациях 10-7 и 10-9М. На индуцированную субоптимальной дозой ФГА
продукцию исследуемых цитокинов, а также на их спонтанный и ЛПСиндуцированный синтез в очищенной фракции моноцитов β-эндорфин не
влияет.
Данные, представленные на рис. 18, указывают на отсутствие отмены
стимулирующего эффекта β-эндорфина на уровень IL-1β в условиях блокады
опиатных рецепторов неселективным антагонистом налоксоном (δ, µ) и
селективным δ-антагонистом налтриндолом в течение 24 ч культивирования.
Также
обнаруживается
самостоятельный
стимулирующий
эффект
налтриндола на продукцию IL-1β. Выявленная динамика сохраняется в
течение 48 ч культивирования. Действие β-эндорфина на продукцию
Таблица 5. Влияние β-эндорфина на продукцию IL-1β
β, TNF-α
α, IL-6
в нефракционированной лейкоцитарной суспензии
Цитокин,
Экспериментальное
пг/мл
воздействие
контроль
10-7
10-9
10-11
IL-1β,
n=8
Без индуктора
193,01±
39,16
190,87±
54,43
271,66±
77,96*
305,76±
49,50***
266,57±
49,18*
300,95±
76,95**
238,22±
50,19
279,41±
62,40*
253,72±
52,60
269,59±
53,90
286,79±
61,43
297,93±
66,45
277,46±
67,08
295,42±
68,59
290,90±
62,32
295,49±
60,45
1115,41±
30,54
1094,73±
36,40
1084,09±
50,23
1082,85±
28,72
1101,83±
56,55
1051,07±
36,16
1109,70±
46,66
1115,41±
33,88
1353,68±
114,42
1699,20±
68,25а
1340,28±
104,42
1278,40±
31,34***
1664,63±
44,10
1635,43±
68,31
1313,30±
156,25
1364,28±
59,85**
Без индуктора
1811,38±
272,30
1840±
275,54
1817,25±
431,75
1932,5±
297,55
ЛПС 0,1 мкг/мл
1957,13±
232,16
2346,5±
198,97***
2168,13±
261,74*
2175,13±
198,06*
ЛПС 0,1 мкг/мл
TNF-α,
n=8
Без индуктора
ЛПС 0,1 мкг/мл
IL-6,
n=8
Без индуктора
ЛПС 0,1 мкг/мл
IL-8,
n=4
Без индуктора
ЛПС 0,1 мкг/мл
IL-1ra,
n=4
Концентрация β-эндорфина, M
Примечание. Здесь и в табл. 6: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001
к контролю по парному t-критерию Фишера наименьшей значимой разницы,
a – р <0,05 – к спонтанной продукции.
антагониста IL-1β IL-1ra (рис. 19) имело картину, схожую с полученной нами
при анализе продукции IL-1β. β-эндорфин и налтриндол стимулируют
продукцию IL-1ra по сравнению с контролем, как на 1-е, так и на 2-е сутки
культивирования. Отмены стимулирующего влияния пептида на фоне
блокады опиатных рецепторов не наблюдается. Анализ влияния пептида на
продукцию IL-8 показал статистически достоверный угнетающий эффект,
как на 24, так и на 48 ч культивирования. В условиях блокады опиатных
рецепторов налоксоном и налтриндолом угнетающее влияние β-эндорфина
нивелируется. Внесение налоксона и налтриндола на продукцию IL-8 не
влияет.
Таблица 6. Влияние β-эндорфина на продукцию IL-1β
β, TNF-α
α, IL-6 в
очищенной фракции моноцитов
Цитокин,
Экспериментальное
пг/мл
воздействие
контроль
10-7
10-9
10-11
Без индуктора
153,22±
33,48
121,65±
19,83
249,92±
84,88
118,71±
28,97
ЛПС 0,1 мкг/мл
230,26±
42,25а
202,84±
36,47
223,97±
71,16
235,21±
53,29
Без индуктора
137,52±
51,33
153,81±
58,24
148,31±
57,56
133,20±
55,31
ЛПС 0,1 мкг/мл
163,21±
60,48а
178,81±
69,78
174,97±
68,63
178,73±
70,21
Без индуктора
1204,61±
354,15
1435,55±
379,02а
1174,58±
356,34
1442,89±
340,04
1281,19±
357,40
1346,26±
342,73
1243,46±
332,03
1414,19±
367,26
1198,38±
153,25
1307,22±
213,04
1230,63±
85,79
1422,48±
90,89
1294,63±
219,75
1159,64±
121,80
1148,68±
200,81
1228,32±
154,70
280,38±
90,82
302,13±
88,60
364,25±
128,06
343,40±
115,95
352,83±
133,52
377,35±
148,54
359,05±
146,50
348,80±
141,58
IL-1β,
n=8
TNF-α,
n=8
IL-6,
n=8
ЛПС 0,1 мкг/мл
Без индуктора
IL-8,
n=4
ЛПС 0,1 мкг/мл
Без индуктора
IL-1ra,
n=4
ЛПС 0,1 мкг/мл
Концентрация β-эндорфина, M
При оценке влияния опиатов на уровень TNF-α выявлено
угнетение продукции TNF-α по сравнению с контролем при совместном
внесении в культуры β-эндорфина и антагонистов опиатных рецепторов на
24 и 48 ч культивирования (см. рис. 18). На продукцию IL-6 на 24 ч
культивирования β-эндорфин не влияет. На 48 ч культивирования продукцию
IL-6 стимулирует налтриндол, как при изолированном внесении, так и в
комбинации с β-эндорфином. Учитывая, что во фракции лейкоцитов помимо
24 ч
48 ч
IL-1β
400
***
***
**
75
200
*
50
*
*
0
0
К
1
2
3
4
К
5
TNF-α
300
*
200
1
**
100
2
3
4
5
4
5
TNF-α
300
пг/мл
400
*
200
*
100
0
0
К
1
2
3
4
К
5
1
IL-6
2
3
IL-6
1500
700
600
500
400
300
200
100
0
*
1300
пг/мл
пг/мл
*
25
100
пг/мл
IL-1β
100
пг/мл
пг/мл
300
***
*
1100
900
700
500
К
1
2
3
4
5
К
1
2
3
4
5
Рис. 18. Влияние β-эндорфина в условиях блокады опиатных
рецепторов на продукцию IL-1β
β, TNF-α
α, IL-6 в нефракционированной
клеточной суспензии в присутствии ЛПС.
Здесь и на рис. 19: К – контроль; 1- β-эндорфин 10-7М; 2 - β-эндорфин 10-7М
+ налоксон 10-6М; 3 - β-эндорфин 10-7М + налтриндол 10-6М; налоксон 10-6М;
налтриндол 10-6М. * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по
парному t-критерию Стьюдента.
моноцитов, основных продуцентов провоспалительных цитокинов,
присутствуют гранулоциты, преимущественно нейтрофилы (Abraham et al.,
2003; Fujiharaa et al., 2003; Xing, Remick, 2004), так же способные
продуцировать IL-1β и IL-8, мы исследовали влияние β-эндорфина на
продукцию IL-1β и IL-8 во фракциях мононуклеаров и нейтрофилов.
Результаты исследований влияния β-эндорфина на продукцию IL-1 и
IL-8 во фракциях мононуклеаров и нейтрофилов представлены на рис. 20. βэндорфин 10-7М стимулирует спонтанную и ЛПС-индуцированную
продукцию IL-1β мононуклеарами. Аналогичная картина наблюдается во
фракции нейтрофилов. На фоне LPS наблюдается статистически значимое
усиление продукции IL-1β. β-эндорфин 10-7М стимулирует, как спонтанную,
так и LPS-индуцированную продукцию IL-1β нейтрофилами. ЛПСиндуцированная продукция IL-8 мононуклеарами и нейтрофилами под
24 ч
48 ч
IL-8
IL-8
*
1100
**
пг/мл
пг/мл
1100
900
700
900
700
К
1
2
3
4
5
К
1
IL-1ra
2000
**
3
4
5
IL-1ra
2000
*
*
1500
пг/мл
пг/мл
1500
*
2
1000
500
*
*
*
1
2
3
*
1000
500
0
0
К
1
2
3
4
5
К
4
5
Рис. 19. Влияние β-эндорфина 10-7М в условиях блокады опиатных
рецепторов на продукцию IL-8 и IL-1ra в нефракционированной
клеточной суспензии в присутствии ЛПС.
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю по парному t-критерию
Стъюдента.
IL-1β
400
Мононуклеары
*
пг/мл
300
а
* **
Нейтрофилы
200
* **
100
а
*
0
К
1
2
3
К
1
2
3
IL-8
1000
Мононуклеары
Нейтрофилы
пг/мл
900
*
а
800
а
700
600
К
1
2
3
К
1
2
3
Рис. 20. Влияние β-эндорфина 10-7М на продукцию IL-1β
β и IL-8 во
фракциях мононуклеаров, нейтрофилов и моноцитов, стимулированных
ЛПС.
К – контроль, 1 - β-эндорфин, 2 – ЛПС, 3 – ЛПС+β-эндорфин. * - р < 0,05; **
- р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю, а - р < 0,05 к ЛПС по парному tкритерию Стъюдента.
воздействием β-эндорфина снижается. В культурах без ЛПС пептид уровень
IL-8 не изменяет. При анализе влияния β-эндорфина на продукцию
исследуемых цитокинов
мононуклеарами в присутствии ФГА были
получены следующие результаты (рис. 21). Во фракции мононуклеаров ФГА,
как и ЛПС, усиливает выработку IL-1β, и не влияет на уровень IL-8. βэндорфин стимулирует, как спонтанную, так и ФГА-индуцированную
продукцию IL-1β мононуклеарами. Уровень IL-8 под воздействием пептида в
нестимулированных ФГА пробах не изменяется, а в стимулированных снижается. Как следует из полученных данных, продукцию цитокинов
семейства IL-1 нефракционированными лейкоцитами, нейтрофилами и
мононуклеарами (но не очищенными моноцитами) β-эндорфин активирует, а
продукцию IL-8 угнетает, таким образом, оказывая двоякое действие, с
одной стороны, активируя процессы пролиферации и дифференцировки, а, с
другой, угнетая хемотаксис. При этом, в отличие от IL-1, депрессия IL-8
проявляется только в ЛПС и ФГА-индуцированных культурах и
нивелируется опиатными антагонистами, что указывает на вовлечённость
различных рецепторных механизмов в регуляцию синтеза IL-1β и IL-8 βIL-8
1000
а
* * *
а
800
пг/мл
IL-1β
500
400
600
300
400
200
200
100
0
0
К
1
2
3
К
1
2
3
Рис. 21. Влияние β-эндорфина 10-7М на продукцию IL-1β
β и IL-8
мононуклеарами, стимулированными ФГА 2,5 мкг/мл в течении 24 ч
культивирования.
К – контроль, 1 - β-эндорфин, 2 – ФГА, 3 – ФГА+β-эндорфин. * - р < 0,05; **
- р < 0,01; *** - р < 0,001 к контролю, а - р < 0,05 к ФГА по парному tкритерию Стъюдента.
эндорфином. Ранее (Nandhra, 2000) был зарегистрирован угнетающий
блокируемый налоксоном, эффект β-эндорфина на продукцию IL-8 клетками
хориодецидуальной оболочки. Н.Л. Елизарова с соавт. (2001) установили, что
аминокислотная последовательность β-эндорфина в молекуле препарата
тимуса – тактивина обусловливает повышение функциональной активности
лимфоцитов, усиление фагоцитоза и снижение способности моноцитов к
адгезии, причём последняя функция отменялась налоксоном, в то время как
усиление фагоцитоза налоксоном не отменялось. По нашим данным,
депрессия продукции IL-8 отменяется селективным δ-антагонистом
налтриндолом, что свидетельствует о возможности реализации эффектов βэндорфина через δ-рецептор. В то же время, как показано в работе B.M. Sharp
(2006), в зависимости от экспериментальной модели и объекта исследования,
δ-рецептор может опосредовать проведение, как стимулирующих, так и
угнетающих сигналов.
СНС
Надпочечники
α-МСГ
Адаптивный
иммунитет
IL-4↑
пролиферация↑
антителогенез↑
Стресс
Гипофиз
ЦНС
Гипоталамус
Гипофиз
ПОМК
β -ЛПГ
β-эндорфин
Th2
Антиген
β-эндорфин
АКТГ
Врождённый
иммунитет
IL-1β ↑
фагоцитоз ↑
IL-8↓
TNF-α↓
СНС
Надпочечники
Рис. 22. Схема возможного механизма влияния β-эндорфина на процессы иммуногенеза.
Заключение
Результаты проведённых исследований представлены в виде схемы
возможного механизма влияния β-эндорфина на процессы иммуногенеза
(рис. 22). Установлено, что β-эндорфин является важным фактором в
поддержании внутреннего гомеостаза. Приведённые в работе данные,
свидетельствуют о том, что β-эндорфин поддерживает гомеостаз иммунной
системы через балансирование Th1 и Th2 ответа, смещая поляризацию Тхелперов в сторону Th2-клеток, параллельно усиливая естественную
резистентность. Следовательно, β-эндорфин является кофактором,
опосредующим переключение дифференцировки Т-хелперов с Th1 на Th2
тип и играющим решающую роль при целом ряде иммунопатологических
состояний, а иммуномодулирующие функции опиоидных пептидов могут
представлять собой значительный терапевтический интерес.
Оценивая роль эндогенных нейропептидов в стрессиндуцированных
изменениях иммунной системы, необходимо отметить, что полученные
данные прямо указывают на непосредственное участие эндогенных опиатов в
активации иммунной системы. Направленность ряда физиологических
эффектов эндогенных опиоидных пептидов при стрессе противоположна
эффектам глюкокортикоидов и катехоламинов. Ранее глюкокортикоиды и
катехоламины рассматривались исключительно как стрессреализующие
факторы, в то же время их основная биологическая роль может заключаться в
ограничении опасной для организма стрессиндуцированной активации
иммунных процессов.
ВЫВОДЫ
1. Подтверждена интегральная роль эндогенной опиоидной системы в
нейроэндокринной регуляции иммуногенеза в норме, при введении
глюкокортикоидов и катехоламинов и в условиях стрессорного воздействия.
Основные компоненты эндогенной опиоидной системы принимают
непосредственное участие в активации иммунной системы при стрессе.
2. Установлено, что в условиях блокады µ, δ-опиатных рецепторов в
период индукции иммунного ответа повышается степень выраженности
иммуносупрессивного действия гормонов стресса (глюкокортикоидов и
катехоламинов) на антителогенез, и регистрируется снижение степени
выраженности угнетающего действия глюкокортикоидов на количество
ядросодержащих клеток в регионарном лимфатическом узле.
3. Впервые показано, что β-эндорфин в высоких (100 мкг/мл) дозах
угнетает, а в низких (0,0005 мкг/кг) дозах стимулирует гуморальное звено
иммунитета, и при этом не влияет на степень выраженности реакции
гиперчувствительности замедленного типа. В клеточных культурах
β-эндорфин стимулирует пролиферацию лимфоцитов и продукцию IL-4, не
влияет на синтез IL-2, IFN-γ и при этом усиливает степень поляризации
Т-хелперов в направлении Th2-клеток. Доминирующая роль в реализации
стимулирующих эффектов β-эндорфина на пролиферацию и продукцию IL-4
принадлежит δ-рецепторам.
4. Впервые обнаружена зависимость стимулирующего эффекта
опиоидных пептидов на пролиферацию лимфоцитов и продукцию IL-4 от
присутствия моноцитов в клеточной культуре.
5. Показано, что β-эндорфин стимулирует фагоцитарную активность
клеток естественного иммунитета и оказывает модулирующее действие на
цитокинпродуцирующую функцию моноцитов и нейтрофилов. В условиях
блокады µ, δ-опиатных рецепторов отмены стимулирующего влияния
β-эндорфина на продукцию IL-1β не наблюдается, при этом угнетение
продукции IL-8 опиатными антагонистами отменяется.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Экспериментальные статьи
1. Шилов Ю.И., Гейн С.В. Адренергическая регуляция пролиферативного
ответа лимфоцитов в культурах с Т-клеточными митогенами // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. - 1999. - Т. 128, № 8. - С. 207-209.
2. Шилов Ю.И., Гейн С.В,
Черешнев В.А. Влияние блокады βадренергических рецепторов при стрессе на антителообразование,
гиперчувствительность замедленного типа, функции фагоцитирующих
клеток при локальной форме иммунного ответа // Russian Journal of
Immunology. - 2001. - V. 6, № 3. - P. 301-308.
3. Гейн С.В., Симоненко Т.А., Черешнев В.А. Влияние β-эндорфина и
селективного агониста µ-опиатных рецепторов DAGO на пролиферативную
активность лимфоцитов // Доклады академии наук. - 2003. - Т. 391, № 1. - С. 127-129.
4. Гейн С.В., Симоненко Т.А., Тендрякова С.П. Влияние агонистов опиатных
рецепторов на процесс антителообразования и гиперчувствительность
замедленного типа при локальном иммунном ответе // Вестн. Пермск.
университета. Серия Биолгия. - 2004. - Вып. 2. - С. 166-168.
5. Гейн С.В., Тендрякова Т.А. Иммуномодулирующие эффекты
гидрокортизона и адреналина в условиях блокады опиатных рецепторов //
Докл. Академии наук. - 2004. - Т. 399, № 3. - С. 412-414.
6. Gein S.V., Simonenko T. A., Tendryakova S. P. The effects of rotation stress on
measures of immunity. The role of opiate receptors // Neuroscience and Behavioral
Physiology. - 2004. - V. 34, № 9. - P. 935-938.
7. Гейн С.В., Баева Т.А. Роль опиоидных пептидов в регуляции
пролиферации лимфоцитов и изменении Тh1/Тh2 цитокинового профиля //
Проблемы эндокринологии. - 2005. - № 5. - С. 49-51.
8. Гейн С.В., Шаравьёва И.Л, Баева Т.А., Тендрякова Т.А. Роль блокады
различных типов опиатных рецепторов в регуляции иммуномодулирующих
эффектов ротационного стресса // Вестник Уральской медицинской
академической науки. - 2005. - № 3. - С. 70-73.
9. Гейн С.В., Баева Т.А., Гейн О.Н., Черешнев В.А. Роль моноцитов в
реализации эффектов β-эндорфина и селективных агонистов µ- и δ-опиатных
рецепторов на пролиферативную активность лимфоцитов периферической
крови // Физиология человека. - 2006. - Т. 32, № 3. – С. 111-116.
10. Гейн С.В., Шаравьёва И.Л, Тендрякова Т.А. Роль δ-опиатных рецепторов
в регуляции гуморального и клеточноопосредованного иммунного ответа при
ротационном стрессе // Доклады Академии наук. - 2006. - Т. 407, № 1. - С.
127-129.
11. Гейн С.В., Баева Т.А., Кичанова О.А. Влияние β-эндорфина на
антителогенез и продукцию ИЛ-4 в условиях блокады опиатных рецепторов
// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 142, № 8.
– С. 192-195.
12. С.В. Гейн, Е.Г. Чижова, С.П. Тендрякова Влияние гидрокортизона и
адреналина в условиях блокады µ- и δ-опиатных рецепторов на развитие
локального иммунного ответа у мышей // Российский физиологический
журнал им. Сеченова. - 2006. - Т. 92, № 7. - С. 827-834.
13. Горшкова К.Г., Гейн С.В., Тендрякова С.П. Роль бета-эндорфина в
регуляции продукции IL-1β и IL-8 моноцитами и нейтрофилами
периферической крови // Вестник Уральской медицинской академической
науки. - 2006. - № 3-1(14). - С. 46-47.
14. Гейн С.В., Баева Т.А., Чижова Е.Г., Кичанова О.А., Шаравьева И.Л.
Эндогенная опиоидная система и гормоны стресса в сочетанной регуляции
иммунных реакции при остром стрессе // Вестник Уральской медицинской
академической науки. - 2006. - № 3-1(14). - С. 38-40.
15. Гейн С.В., Горшкова К.Г., Тендрякова С.П.. Роль b-эндорфина в
регуляции продукции провоспалительных
цитокинов
моноцитами
периферической крови in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины. - 2007. - Т. 143, № 2. - С. 175-178.
Труды конференций
16. Shilov Ju.I., Gein S.V., Chereshnev V.A.. Adrenergic and cAMP-dependent
regulation of mitogen-induced lymphocyte proliferative responses // Annual
Meeting of AAAAI. J. Allergy and Clin. Immunol. - 1998. - V. 101, № 1. - Р. 3838.
17. Gein S.V., Shilov Ju.I. Influence of stress on expression of immune reactions //
Межд. конф. "Проблемы загрязнения окружающей среды-98". Москва, 1998.
- С. 238-238.
18. Шилов Ю.И., Гейн С.В. Влияние блокады бета-адренергических
рецепторов
и
иммобилизационного
стресса
на
реакции
клеточноопосредованного и гуморального иммунитета // Научная сессия
Пермской государственной медицинской академии. Пермь, 1998. - С. 68-68.
19. Гейн С.В., Шилов Ю.И. Адренергическая и цАМФ-зависимая регуляция
пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с митогенами // Научная
сессия Пермской государственной медицинской академии. Пермь, 1998. - С.
69-69.
20. Гейн С.В., Шилов Ю.И. Адренергическая и цАМФ-зависимая модуляция
пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с митогенами // V
Российский национальный конгресс "Человек и лекарство". Москва, 1998. C. 330-330.
21. Шилов Ю.И., Гейн С.В. Модуляция пропранололом стрессиндуцированных изменений иммунных реакций // Там же. - C. 340-340.
22. Гейн С.В., Шилов Ю.И., Черешнев В.А. Влияние адренергических
соединений на пролиферативный ответ лимфоцитов // II-й Национальный
конгресс Российской Ассоциации аллергологов и клинических иммунологов
«Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и
иммунофармакологии». Москва, 1998. - С. 345-345.
23. Шилов Ю.И., Гейн С.В. Влияние иммобилизационного стресса и блокады
β-адренергических рецепторов на антителообразование и реакции
гиперчувствительности замедленного типа в регионарных лимфатических
узлах и селезенке при подкожной иммунизации // Иммунология. - 1998. - №
6. - С. 25-26.
24. Шилов Ю.И., Гейн С.В. Влияние адреналина и селективных антагонистов
α1- и α2-адренорецепторов на пролиферативный ответ лимфоцитов
периферической крови // Матер. III Всерос. научного Форума «Дни
иммунологии в Санкт-Петербурге». Медицинская иммунология. - 1999. - Т.
1, № 3-4. - С. 28-29.
25. Гейн С.В., Шилов Ю.И. Роль адренорецепторов в регуляции
пролиферативного ответа лимфоцитов в культурах с Т-клеточными
митогенами
//
Всероссийской
научно-практической
конференция
"Актуальные вопросы эндокринологии". Пермь, 1999. - С. 101-102.
26. Шилов Ю.И., Гейн С.В., Орлова Е.Г., Черешнев В.А. Влияние блокады βадренергических рецепторов на иммунный ответ и функциональную
активность фагоцитирующих клеток в условиях стресса // Аллергология и
иммунология. - 2000. - Т. 1, № 2. - С. 116-117.
27. Шилов Ю.И., Гейн С.В. Иммуномодулирующие эффекты
адренергических соединений в системах in vivo и in vitro // Труды
российской научной конференции «Факторы клеточного и гуморального
иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях».
Челябинск, 2000. - С. 134-135.
28. Кеворков Н.Н., Шилов Ю.И., Бахметьев Б.А., Ширшёв С.В., Куклина
Е.М., Гейн С.В., Сидоров Д.В., Заморина С.А., Орлова Е.Г., Лихачева Н.С.,
Груздева Е.А., Харитонова А.В. Нейроэндокринная регуляция некоторых
функций фагоцитирующих и иммунокомпетентных клеток // Тез. докл.
научной
конференции
«Актуальные
проблемы
фундаментальных
исследований в области биологии и медицины». Санкт-Петербург, 2000. - С.
67-68.
39. Гейн С.В. Роль β-адренергических механизмов в регуляции реакций
клеточноопосредованного и гуморального иммунного ответа при стрессе // II
конференция молодых ученых России с международным участием
“Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины”. Москва. - Т. 1.
- С. 191-191.
30. Гейн С.В., Симоненко Т.А., Тендрякова С.П., Шилов Ю.И. Влияние
блокады δ-,µ-опиатных рецепторов при стрессе на показатели
клеточноопосредованного, гуморального иммунитета в условиях развития
локальной формы иммуного ответа // I конференция иммунологов Урала.
Екатеринбург, Иммунология Урала. – 2001. - №1. – С. 2-3.
31. Гейн С.В., Симоненко Т.А., Тендрякова С.П. Участие δ-, µ, κ-опиатных
рецепторов в развитии реакции гиперчувствительности замедленного типа и
изменении числа антителообразующих клеток в модели принудительного
головокружения // Труды международной научной конференции
«Перспективы развития естественных наук в высшей школе». Пермь, 2001. Т. 3. - С.120-124.
32. Гейн С.В., Симоненко Т.А., Тендрякова С.П. Роль δ-,µ-,κ-опиатных
рецепторов в регуляции функций иммунокомпетентных и фагоцитирующих
клеток при стрессе // II конференция иммунологов Урала. Пермь,
Иммунология Урала. – 2002. – №1. – С. 4.
33. Гейн С.В., Симоненко Т.А. Участие β-эндорфина и селективных лигандов
δ, µ-опиатных рецепторов в регуляции пролиферативной активности
лимфоцитов in vitro // III конференция иммунологов Урала. Челябинск,
Иммунология урала. – 2003. - № 1. - С. 5.
34. Гейн С.В., Симоненко Т.А. Роль β-эндорфина и опиодных пептидов в
регуляции пролиферации лимфоцитов и изменении Тh1/Тh2 цитокинового
профиля // Матер. VIII Всерос. научного Форума с международным участием
«Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». Медицинская иммунология. - 2004.
- Т. 6, № 3-5. - С. 226-227.
35. Гейн С.В., Симоненко Т.А. Опиоидная регуляция пролиферативного
ответа лимфоцитов in vitro // Rus. J. Immunol. - 2004. - V. 9, № 1. - P. 38-38.
36. Гейн С.В., Гейн О.Н., Гаврилова Т.В. Механизмы стрессорных
нарушений функций иммунной системы и их коррекция // XIX Съезд
физиологического общества им. И.П. Павлова 19-24 сентября 2004. Тез. докл.
– Российский физиологический журнал им. Сеченова. - 2004. - Т. 90, №8. - С.
106-107.
37. Гейн С.В., Чижова Е.Г. Влияние гидрокортизона на фоне блокады
опиатных рецепторов на развитие локального иммунного ответа // IX
международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биологиянаука XXI века». Пущино, 2005. - С. 174.
38. Гейн С.В., Баева Т.А. Роль опиодных пептидов в регуляции
пролиферации лимфоцитов и изменении Th1/Th2 цитокинового профиля //
Там же. - С. 69.
39. Баева Т.А., Гейн С.В., Шаравьева И.Л., Тендрякова С.П. Роль блокады
различных типов опиатных рецепторов в регуляции иммуномодулирующих
эффектов ротационного стресса // Международная конференция "Проблемы
загрязнения окружающей среды-2005". Пермь, 2005. - С. 56.
40. Гейн С.В., Баева Т.А., Черешнев В.А. Лиганды опиатных рецепторов в
регуляции пролиферативной активности лимфоцитов in vitro //
Международная конференция "Проблемы загрязнения окружающей среды2005". Пермь, 2005. - С. 94.
41. Шилов Ю.И., Шилов С.Ю., Ланин Д.В., Гейн С.В., Орлова Е.Г., Черешнев
В.А. Адренергические механизмы регуляции иммунного ответа и функций
неспецифических эффекторных клеток при стрессе // Матер. IX Всерос.
научного Форума с международным участием «Дни иммунологии в СанктПетербурге». Медицинская иммунология. - 2005. - Т. 7, № 2-3. - С. 127-127.
42. Гейн С.В., Баева Т.А., Черешнев В.А. Роль моноцитов в опиатергической
регуляции процессов пролиферации лимфоцитов и цитокинового синтеза //
Там же. - С. 110-110.
43. Гейн С.В., Баева Т.А., Черешнев В.А. Роль β-эндорфина в регуляции
процессов пролиферации и продукции IL-4 лимфоцитами периферической
крови in vitro // IV конференция иммунологов Урала. Уфа, Иммунология
Урала. - 2005. - № 1 (4). - С. 4-5.
44. Гейн С.В., Чижова Е.Г., Тендрякова С.П. Влияние гидрокортизона на
фоне блокады δ-, µ-опиатных рецепторов на иммунный ответ // Там же. - С.
5-6.
45. Гейн С.В., Горшкова К.Г. Влияние β-эндорфина на продукцию IL-1β,
TNF-α, IL-6 моноцитами периферической крови // V конференция
иммунологов Урала. Оренбург, Иммунология Урала. - 2006. - № 1. - с. 6-7.
46. Gein S.V., Gorshkova K.G., Baeva T.A. β-endorphin-induced modulation of
cytokine production by peripheral blood leukocytes // International symposium
«Interaction of the nervous and immune systems in health and disease» SaintPetersburg, 2007. - Р. 26-27.
Список основных сокращений
АКТГ - адренокортикотропный гормон
АОК
- антителообразующая клетка
ГЗТ
- гиперчувствительность замедленного типа
ЛПС
- липополисахарид
ПОМК - проопиомеланокортин
РБТЛ
- реакция бласттрансформации лимфоцитов
СНС
- симпатическая нервная система
ФГА
- фитогемагглютинин
ЦНС
- центральная нервная система
ЯСК
- ядросодержащая клетка
CD
- маркеры дифференцировки лимфоцитов
DADLE - δ-агонист ([d–Ala2,d-Leu5] - энкефалин
DAGO - µ-агонист ([d-Ala2,N-Me-Phe4,Gly5-ol]-энкефалин
IFN
- интерферон
IL
- интерлейкин
MPF
- меланотропин потенцирующий фактор
TNF
- фактор некроза опухоли