прогностическая значимость экспрессии маркеров опухолевой

ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРОВ
ОПУХОЛЕВОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ KI-67, P53 и BCL-2 У БОЛЬНЫХ
КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ И ПОЛИПОЗОМ
Р.М. Смолякова, А.А. Машевский, В.Т. Кохнюк, О.Н. Касьяненко, А.Я.
Суворов, Т.И. Набебина, А.С. Зеленкевич, Н.М. Егорова, Найденова Т.Л.
РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова, г. Минск
Ключевые слова: рак толстой кишки, полипоз, иммуногистохимия,
пролиферация, апоптоз.
Прогностическая значимость экспрессии маркеров пролиферации Ki67, супрессора опухолевого роста р53 и индуктора апоптоза
bcl-2
определялась проспективно у 54 больных раком толстой кишки и 52
пациентов с полипозом толстой кишки иммуногистохимически. В результате
исследований
у
больных
раком
толстой
кишки
выявлено
три
иммунофенотипа опухоли: I-ый (у 26% больных) – р53(+)/bcl-2(+); II-ой (у
38,8%) – р53(+)/bcl-2(–); III-ий (у 11,1%) – р53(–)/bcl-2(+), что является
диагностически значимым для оценки эффективности лечения и прогноза
заболевания. Пролиферативная активность Ki-67 у больных раком толстой
кишки составила 55%±0,3. У больных полипозом диагностировано 3
иммунофенотипа полипов: I-ый – р53(–) /Ki-67(–)/bcl-2(–); II-ой – р53(+)/Ki67(+)/bcl-2(+);
III-ий
—
р53(+)/Ki-67(+)/bcl-2(–).
Прогностически
неблагоприятную группу составили 23% больных аденоматозным полипозом
с высокой экспрессией белков р53, Ki-67 при пониженной экспрессии
эффектора апоптоза bcl-2. К группе высокого онкологического риска
относятся больные железистым полипозом толстой кишки с высокой
пролиферативной активностью Ki-67.
PROGNOSTIC SIGNIFICANCE OF KI-67, P53 AND BCL-2 EXPRESSION
IN COLON CANCER AND ADENOMAS
R.M. Smolyakova, A.A. Mashevsky, V.T. Kokhnuk, O.N. Kasyanenko,
A.Y. Suvorov, T.I. Nabebina, A.S. Zelenkevich, N.M. Yegorova, T.L. Najdenova
Key
words:
colon
cancer,
adenomas,
immunohistochemistry,
apoptosis,
proliferation.
Prognostic significance of proliferation marker Ki-67, apoptosis-associated
proteins р53 and bcl-2 was prospectively investigated in a series of 54 colorectal
carcinomas and 52 adenomas according to the avidin-biotin-complex method.
Detecting three immunogenotypes in adenocarcinomas causes has a diagnostical
significance to evaluate an effection of therapy and prognostic for disease: I (in
26% patients) – р53(+)/bcl-2(+); II (in 38,8% causes) – р53(+)/bcl-2(–); III (in
11,1% causes) – р53(–)/bcl-2(+). The mean Ki67 labeling index in colon cancer
was 55%±0.3. In adenomas, three immunogenotypes was estimated: I – р53(–) /Ki67(–)/bcl-2(–); II – р53(+)/Ki-67(+)/bcl-2(+); III — р53(+)/Ki-67(+)/bcl-2(–). A
prognostical unfavorable group is 23% patients with adenomas with high
expression of р53, Ki-67 and low expression bcl-2. The group of patients with
glandula adenomas associates with a high oncological risk.
ВВЕДЕНИЕ
В Республике Беларусь отмечается неуклонный рост заболеваемости
раком ободочной кишки. Стандартизованный показатель заболеваемости
населения Беларуси злокачественными опухолями ободочной кишки в 2005
г. составил 19,6 случаев на 100 тысяч населения. Увеличение числа
заболевших раком толстой кишки (РТК) за период 2000–2005 гг. составило
среди мужского населения с 15,0 до 19,2 случаев, у женщин – с 16,6 до 20,0
случаев на 100 тысяч населения соответственно.
В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что использование
клинических характеристик заболевания (распространенность процесса,
гистологическое
строение
опухоли,
уровень
опухолеассоциированных
антигенов и др.) являются недостаточными для предсказания прогноза
течения заболевания и эффекта проводимой терапии. За последнее
десятилетие достигнут значительный прогресс в понимании молекулярной
биологии клетки. Интенсивно изучаются многие механизмы контроля
клеточного деления и апоптоза, поддержания генетической стабильности,
2
путей передачи сигнала от рецепторов в ядро. Одним из современных
подходов
к
выбору
злокачественными
индивидуальной
новообразованиями
программы
и
лечения
больных
прогнозирования
течения
заболевания является исследование молекулярно- биологических маркеров в
ткани опухоли. Прогностическую значимость имеют данные о нарушениях
механизмов пролиферации и апоптоза в опухолевых клетках. Основными
белками, участвующими в управлении апоптозом, являются белки семейства
bcl-2 и супрессор опухолевого роста р53 [1]. Пролиферативная активность
является
одной
из
основных
морфологических
характеристик
прогрессирования злокачественной опухоли [2,3]. С помощью индекса
пролиферации возможно прогнозирование эффективности лечения, а также
развития рецидивов, отдаленных метастазов и выживаемости больных РТК.
Диагностически значимым маркером при определении пролиферативной
активности признан ядерный белок Ki-67 [4].
Известно, что апоптоз принадлежит к одному из основных механизмов,
вызывающих
гибель
злокачественных
клеток.
Модуляция
апоптоза,
вследствие мутации гена-супрессора опухолевого роста р53, усиливает
резистентность опухоли к химио- и лучевой терапии. Первостепенной
задачей современной онкологии является поиск путей активации механизмов
стимуляции апоптоза опухолевых клеток [5,6].
Цель работы – определение прогностической значимости процессов
пролиферации и апоптоза с изменением их соотношений в опухолевой ткани
и ткани полипов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом исследования послужили данные о 54 больных раком
толстой кишки I–IV стадии, из них у 11 выявлен первично-множественный
рак, и 52 больных полипами толстой кишки. Все больные обследованы и
получили лечение в РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова.
3
У больных раком толстой кишки диагностирована I (T1N0M0) стадия у
4, IIА (T2N0M0) ст. — у 6, IIВ (T2N1M0) ст. — у 4, III (T3N0-1M0) ст. — у
21, IVА (T4N1M0) ст. — у 12, IVС (T3-4N0-2M1) ст. — у 7 пациентов.
Диагноз у всех больных установлен на основании эндоскопического,
ультразвукового,
компьютерной
рентгенологического,
томографии
и
клинического
подтвержден
обследования,
морфологически.
По
морфологическому строению опухоли у больных РТК верифицирована
аденокарцинома высокой степени дифференцировки (G1) у 11 (21%),
умеренной (G2) — у 40 (73%) и низкой степени дифференцировки (G3) – у 3
(6%).
У 8 (14,8%) больных РТК сочетался с полипами толстой кишки. В
анализируемой группе больных колоректальным раком при эндоскопическом
обследовании выявлено от 3 до 22 полипов толстой кишки.
Группа больных РТК представлена лицами женского пола в 48% и
мужского — в 52% случаев.
Возраст больных РТК колебался в пределах от 18 до 54 лет, средний
возраст составил 48,9±9,7 года.
Группу больных полипозом составили лица женского пола в 42%
случаев, мужчины — 58%. Возрастной состав больных полипозом толстой
кишки варьировал от 27 до 93 лет, средний возраст – 57,5±14,6 года. У
больных полипозом толстой кишки преобладающей морфологической
формой был железистый полип у 21 (40,3%) пациента, ворсинчатая опухоль
выявлена в 7 (13,4%) случаях, тубулярная аденома — в 5 (9,6%), папиллярная
аденома — в 3 (5,7%), тубулярно-папиллярная аденома и тубулярноворсинчатый полипы у 3 (5,7%) больных соответственно, фиброзный полип
— в 2 (3,8%), железисто-ворсинчатый полип в 2 (3,8%) случаях. Количество
эндоскопически выявляемых полипов колебалось от 1 до 20.
Больным РТК и полипозом проведена иммуногистохимическая оценка
экспрессии
маркеров
пролиферации
и
апоптоза:
Ki-67,
p53,
bcl-2.
Исследование проводилось на фиксированных в формалине и заключенных в
4
парафин опухолевых блоках. Исследование проводили по стандартной
методике
постановки
пероксидазной
авидин-биотиновой
иммуногистохимической реакции. Демаскировку антигенов выполняли в
микроволновой печи при tº=95–99ºC. Срезы докрашивали гематоксилином
Майера и заключали в бальзам. В работе использованы антитела: р53 (клон
N1581, DAKO), bcl-2 (клон N1587, DAKO), Ki-67 (клон N1633, DAKO).
Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового
микроскопа (увеличение х10, х20, х40). Для всех маркеров оценивали
локализацию окрашивания в клетке (ядро, цитоплазма).
В исследовании применялись следующие критерии оценки маркеров:
– опухоль считали отрицательной по р53, если в ткани опухоли
отсутствовала
ядерная
реактивность
с
антителами
или
количество
окрашенных клеток было меньше 10%; и положительной по р53, если было
окрашено более 10% ядер опухолевых клеток;
– опухоль считали отрицательной по bcl-2, если в ткани опухоли
отсутствовала
цитоплазматическая
реактивность
с
антителами
или
количество окрашенных клеток было менее 20%; положительной по маркеру,
если было окрашено более 20% опухолевых клеток;
– опухоль считали отрицательной по Ki-67, если в ткани опухоли
отсутствовала
цитоплазматическая
реактивность
с
антителами
или
количество окрашенных клеток было менее 10%; и положительной по
маркеру, при окрашивании более 10% опухолевых клеток.
Для обработки полученных данных использовалась программа Statistica
6.0. На основе базовой статистической обработки выполнен корреляционный
анализ с достоверностью р<0,05 между тремя исследуемыми маркерами:
анализ корреляционной зависимости bcl-2 и р53, их связь со степенью
распространенности
опухолевого
процесса;
корреляция
между
пролиферативной активностью Ki-67 и степенью дифференцировки опухоли;
анализ корреляционной зависимости Ki-67 с морфологической формой
полипа.
5
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты иммуногистохимического исследования показали, что
экспрессия р53 обнаружена у 64,8% (у 35 из 54) больных РТК. Окрашивание
наблюдалось в ядрах опухолевых клеток. Экспрессия р53 выявлена в
опухолях с высокой степенью дифференцировки у 33% больных, с
умеренной — в 52% случаев, с низкой степенью дифференцировки – в 15%
(рисунок 1).
.
Рисунок 1 – А) уровень экспрессии мутантного р53 в опухолевых
клетках. Увеличение х40. В) цитоплазматическое окрашивание
опухолевых клеток, экспрессирующих протеин bcl-2. х20
Белок семейства bcl-2 является одним из основных эффекторов
апоптоза в клетке. Экспрессия bcl-2 выявлена у 23 (42,6%) больных и не
коррелировала с различными клиническими характеристиками заболевания:
степенью распространенности процесса, дифференцировкой опухоли и
возрастом. На основании полученных данных, можно предположить, что
онкопротеин bcl-2 может служить независимым маркером в развитии
колоректального рака [7]. Высокий уровень bcl-2 выявлен у 11 (20%)
больных РТК, низкий уровень (менее 65% положительных клеток по
маркеру) – у 12 (22,2%). Следует отметить, что повышенная экспрессия
индуктора апоптоза bcl-2 достоверно значимо выше в р53-позитивных
опухолях (р=0,001).
6
В
зависимости
от
уровней
экспрессии
белков
представлялось
диагностически и прогностически значимым классифицировать опухоли по 3
иммунофенотипам: I группа (26% больных) — р53(+)/bcl-2(+); II группа
количество больных
(38,8%) — р53(+)/bcl-2(–); III группа (11,1%) — р53(–)/bcl-2(+) (рисунок 2).
25
20
15
10
5
0
21
14
6
p53+/bcl2+
p53+/bcl2-
p53-/bcl2+
Рисунок 2 – Отношение уровней экспрессии р53 и bcl-2 при раке толстой
кишки
У
больных
РТК
с
первым
иммунофенотипом
опухоли
характеризовались высоким уровнем экспрессии маркеров р53 и bcl-2 и
высоко коррелировали со степенью распространения опухолевого процесса
(р=0,02). При умеренно дифференцированных опухолях наблюдалось
снижение уровня экспрессии bcl-2. Ко-экспрессия р53 и bcl-2 заключалась в
том, что функциональные изменения белка р53 оказывали влияние на
регуляцию транскрипции bcl-2 и, следовательно, его гиперэкспрессию [8]. В
настоящее время установлено, что повышенная экспрессия bcl-2 сопряжена с
понижением уровня роста клеток и устойчивостью к цитостатическим
препаратам [9]. Опухоли, высоко экспрессирующие bcl-2, являются менее
агрессивными
по
сравнению
с
таковыми
без
экспрессии
данного
онкопротеина [7].
Иммунофенотип опухоли с позитивной экспрессией мутантного
супрессора опухолевого роста р53(+) и негативной экспрессией индуктора
апоптоза bcl-2(–) характеризуется, согласно данным литературы, быстрым
прогрессированием заболевания и плохим прогнозом по сравнению с
другими фенотипами [1]. Отмечено, что больные с низким уровнем
экспрессии р53(–) в опухоли имеют лучший прогноз после проведенного
7
лечения, чем с высоким уровнем экспрессии р53(+) [10]. Гиперэкспрессия
р53 сопряжена с низкой химиочувствительностью опухоли и является одним
из основных прогностических маркеров неблагоприятного прогноза [11].
Установлено, что уровень экспрессии белка Ki-67 во всех фазах
клеточного деления (G1, S, G2 и митоз), за исключением фазы покоя (G0),
характеризует пролиферативную активность опухоли (рисунок 3) [12].
Рисунок 3 – Уровень экспрессии Ki-67 в опухолевых клетках. х10
Пролиферативная активность Ki-67 у больных РТК составила 55%±0,3.
Пролиферативная активность Ki-67 обратно коррелировала со степенью
дифференцировки опухоли (r= –0,27; р=0,3). Опухоли с высокой степенью
дифференцировки имели более низкую пролиферативную активность.
Пролиферативная
активность
высокодифференцированных
опухолей
составила 39%±0,2; умеренно дифференцированных — 55%±0,3. Анализ
проведенных
исследований
показал,
что
высокая
пролиферативная
активность опухоли, в большинстве случаев, сочеталась с экспрессией р53
(рисунок 4).
8
15
13
Частота
экспрессии р53
15
10
4
5
0
Ki67≤14%
14<Ki67<70%
Ki67≥70%
Рисунок 4 – Частота экспрессии р53 в зависимости от пролиферативной
активности Ki-67 в опухоли
У больных первично-множественным раком опухоли толстой кишки
характеризовались высоким уровнем пролиферативной активности Ki-67. У 3
больных первично-множественным заболеванием выявлена корреляционная
зависимость между частотой экспрессии р53 и Ki-67 (р=0,04). Согласно
данным литературы, у больных РТК высокие уровни экспрессии маркеров
р53 и Ki-67 в опухолевой ткани обусловливают развитие резистентности к
химиотерапевтическому лечению и неблагоприятный прогноз [13].
Проведение
иммуногистохимических
исследований
у
больных
полипозом позволило выделить 3 иммунофенотипа полипов: I группа (25%
больных) – р53(–)/Ki-67(–)/bcl-2(–); II группа (17,3%) – р53(+)/Ki-67(+)/bcl2(+); III группа (23%) – р53(+)/Ki-67(+)/bcl-2(–) (рисунок 5).
Частота экспрессии p53/Ki-67/bcl-2
14
13
12
12
9
10
8
6
4
2
0
р53-/Ki-67-/bcl-2 -
р53+/Ki-67+/bcl-2+
р53+/Ki-67+/bcl-2 -
9
Рисунок 5 – Частота экспрессии р53/Ki-67/bcl-2 у больных полипами
толстой кишки
Больные полипозом с первым иммунофенотипом характеризовались
низкими уровнями экспрессии маркеров р53, Ki-67 и bcl-2. У 17,3% больных
полипозом диагностированы высокие уровни экспрессии р53, Ki-67 и bcl-2.
Прогностически
неблагоприятную
группу
составили
23%
больных
аденоматозным полипозом с высокой экспрессией белков р53, Ki-67 и при
пониженной экспрессии эффектора апоптоза bcl-2. В гиперпластических
полипах наблюдалась пониженная пролиферативная активность, что связано
с гиперплазией полипа (р=0,0001). Увеличение пролиферативной активности
(больше 30%) наблюдалось в случае железистого и ворсинчатого полипов,
что свидетельствует о неблагоприятном прогнозе заболевания.
ВЫВОДЫ
1. У больных раком толстой кишки выявлено три иммунофенотипа
опухолей: I-ый – р53(+)/bcl-2(+); II-ой – р53(+)/bcl-2(–); III-ий – р53(–)/bcl2(+),что является диагностически значимым для оценки эффективности
лечения и прогноза заболевания.
2. У больных раком толстой кишки пролиферативная активность Ki-67
составила 55%±0,3 и сочеталась с экспрессией р53.
3. У больных полипозом выделено 3 иммунофенотипа полипов: I-ый –
р53(–) /Ki-67(–)/bcl-2(–); II-ой – р53(+)/Ki-67(+)/bcl-2(+); III-ий — р53(+)/Ki67(+)/bcl-2(–).
4. Прогностически неблагоприятную группу составили 23% больных
аденоматозным полипозом с высокой экспрессией белков р53, Ki-67 при
пониженной экспрессии эффектора апоптоза bcl-2.
5. К группе высокого онкологического риска относятся больные
железистым полипозом толстой кишки с высокой пролиферативной
активностью Ki-67.
10
Список использованных источников
1.
Zhao, H.F. Prognostic significance of bcl-2 and p53 expression in colorectal carcinoma /
J. Zhejiang Univ. Science B. – 2005. – Vol. 6, № 12. – Р. 1163-1169.
2.
Prognostic impact of p21/waf1/cip1 in colorectal cancer / T.K. Zirbes [et al.] // Int. J.
Cancer. – 2002. – Vol. 89, № 1. – Р. 14-18.
3.
Zhang H.F. Mad2 and p27 expression profiles in colorectal cancer and its clinical
significance // World J. Gastroenterol. – 2004. – № 10. – Р. 3218-3220.
4.
Пожарисский, К.М., Леенман, Е.Е. Значение иммуногистохимических методик
для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний // Архив патол. –
2002. – № 5. – C. 3-11.
5.
Владимирская, Е.Б., Масчан, А.А., Румянцев, А.Г. Апоптоз и его роль в развитии
опухолевого роста // Гематол. трансфузиол. – 1997. – № 5. – С. 4-9.
6.
Сыркин,
А.Б.,
Герасимова,
Г.К.,
Барышников,
Ю.А.
Экспериментальная
химиотерапия злокачественных опухолей на современном этапе // Вопр. онкол. – 1995. –
№ 2. – С. 41-45.
7.
Evidence that the p53 negative/bcl-2 positive phenotype is an independent indicator of
good prognosis in colorectal cancer: a tissue microarray study of 460 patients / N.F. Watson [et
al.] // World J. Surg. Oncol. – 2005. – Vol. 3, № 47. – Р. 635-643.
8.
Blagosklonny, M.V. Paradox of Bcl-2 (and p53): why may apoptosis-regulating proteins
be irrelevant to cell death? // Bioаssays. – 2001. – № 23. – Р. 947-953.
9.
Manion, M.K., Hockenbery, D.M. Targeting BCL-2- related proteins in cancer therapy //
Cancer Biol. Ther. – 2003. – № 2. – P. 105-114.
10.
Immunohistochemical expression of p53 and bcl-2 proteins in advanced esophageal
cancer patients / S. Arbabi-Bidgoli [et al.] // Acta Medica Iranica. – 2005. – № 43. – P. 313322.
11.
Usefulness of p53 protein, Bcl-2 protein and Ki-67 as predictors of chemosensitivity of
malignant tumors // M. Itaya, Y [et al.] // Oncol. Rep. – 2004. – Vol. 6, № 3. – Р. 675-682.
12.
Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown // J. Cell.
Physiol. – 2004. – № 182. – P. 311-322.
13.
Apoptotic and mitotic indices predict survival rates in lymph node negative colon
carcinomas / F.A. Sinicrope [et al.] // Clin. Cancer. Res. – 2002. – № 5. – Р. 1793-1804.
11