011859 Настоящее изобретение относится к соединениям, ... изобретением предлагаются гибридные белки, содержащие участок антитела, направленный против ан-

011859
Настоящее изобретение относится к соединениям, используемым для лечения рака. В частности,
изобретением предлагаются гибридные белки, содержащие участок антитела, направленный против антигена, характерного для опухолевого новообразования, привитого к интерлейкину-12. Предпочтительные гибридные белки, соответствующие настоящему изобретению, связываются с целевым антигеном
особенно прочной связью и могут использоваться при лечении плотных опухолевых образований.
Предпосылки изобретения
Лечение рака с помощью гибридных белков адресной доставки показало себя многообещающим,
однако, в связи с этим остается много нерешенных проблем. Например, конъюгированные с антителами
цитокины адресной доставки показали себя многообещающими при лечении рака на опытных животных
и, в некоторых исследованиях, на человеке, но еще предстоит определить оптимальный выбор антитела/антигена, цитокина и эффекторной функции антитела. Например, Джиллс (Gilles) (US 5650150) описал общую применимость цитокиновых гибридов для заполнения антител и, в частности, применимость
гибридных белков IL2.
Интерлейкин-12 (IL-12) является особенно привлекательным цитокином для иммунной терапии адресной доставки препарата, поскольку IL-12 стимулирует иммунную реакцию Th1, что наиболее эффективно при атаке на опухолевые клетки. IL-12 довольно токсичен при его систематическом введении и,
следовательно, очень важно направлять его действие именно в место нахождения опухоли. Джиллс
(Gilles) с соавторами (WO 99/29732) описали применимость гибридов IL-12 к антителам, а также показали особые методики, необходимые для доставки гибридных белков IL-12, опираясь на тот факт, что IL12 является цитокином с двумя субъединицами, из которых одна субъединица имеет возможность гомодимеризации. Галин (Halin) с соавторами 2002, Nature Biotechnology 20: 264-269 описали гибридный белок, состоящий из неразветвленного компонента IL-12, привитого к неразветвленному Fv (sFv) с изменяемыми доменами L19, антитело, которое связывается с опухолеспецифической неоваскулятурой. В
этой последней молекуле отсутствует участок антитела Fc, и, таким образом, отсутствуют все эффекторные функции. Даже когда IL-12 прививается к компоненту адресной доставки, после введения гибридного белка имеется определенный период, в течение которого этот белковый лекарственный препарат циркулирует в системе организма. В течение этого периода и до того, как лекарственный препарат аккумулируется в опухоли и исчезнет из остальной системы, в организме образуются вторичные цитокины, которые ухудшают результаты.
Следовательно, существует необходимость в улучшенных средствах доставки IL-12 в место нахождения опухоли в теле пациента.
Краткое описание изобретения
Первым аспектом изобретения является создание соединения, содержащего участок, ответственный
за адресную доставку, и эффекторный участок, в котором участок адресной доставки состоит из или содержит моноклонное антитело, обладающее специфичностью в отношении карциноэмбрионального
фибронектина, или его фрагмент или вариант, который несет в себе способность специфического связывания с карциноэмбриональным фибронектином моноклонного антитела-предшественника, а эффекторный участок состоит из или содержит интерлейкин-12 или его функциональный фрагмент или вариант.
Отличительной особенностью соединений, соответствующих настоящему изобретению, является
то, что моноклонное антитело, обладающее специфичностью в отношении карциноэмбрионального фибронектина, связывается с участком карциноэмбрионального фибронектина, отличающимся от участка
сверхдомена В участка (ED-B). Участок ED-B фибронектина представляет собой домен, который при
фрагментировании первичного транскрипта РНК либо присутствует, либо пропускается в фибронектиновых молекулах внеклеточной матрицы (см. ниже). Таким образом, моноклонное антитело, обладающее
специфичностью в отношении карциноэмбрионального фибронектина, не связывается с участком ED-B
(домен ED-B), хотя он связывается с фрагментированным вариантом фибронектина (именуемым «карциноэмбриональный фибронектин»), который содержит такой участок ED-B.
Под «участком адресной доставки» мы подразумеваем участок соединения, который содержит одну
или несколько точек связи, распознающих карциноэмбриональный фибронектин и прикрепляющихся к
нему. Карциноэмбриональный фибронектин представляет собой белок, выделяемый опухолевыми клетками, и он связан с опухолевой васкулятурой. Этот белок выделяется также эмбриональной тканью, но
он не появляется и не обнаруживается во всех нормальных взрослых тканях, за исключением эндометрии
регенерированной ткани и лечения ран (Карнемолла (Carnemolla) и др., 1989, J. Cell. Biol. 108, с. 11391148).
Карциноэмбриональный фибронектин образуется в опухолевых клетках путем чередующегося сращивания, посредством которого дополнительный домен, называемый доменом ED-B (дупликат ED-B
полного типа II, известный также, как дупликат В экстратипа III [EIIIB]), вставляется между фибронектиновыми дупликатами 7 и 8. ED-B у млекопитающих по данным, полученным на сегодняшний день,
является хорошо сохраняющимся доменом со стопроцентной гомологичностью (см. вышеуказанное:
Карнемолла (Carnemolla) и др., 1989 и Френч-Констант (French-Constant) и др., 1989, J. Cell. Biol. 109,
с. 903-914).
Таким образом, изобретением предлагаются соединения для доставки IL-12 или его функциональ-1-
011859
ного фрагмента либо варианта к опухолевым клеткам нацеливанием его на карциноэмбриональный фибронектин.
Под «специфичностью в отношении к карциноэмбриональному фибронектину» мы подразумеваем,
что целенаправленный участок (т.е. моноклонное антитело или его фрагмент либо вариант, который обладает специфической способностью связываться с карциноэмбриональным фибронектином моноклонного антитела-предшественника), связывается с карциноэмбриональным фибронектином, но не связывается в существенной степени с фибронектином, выделяемым нормальной взрослой тканью.
Подходящие моноклонные антитела для адресной доставки к антигенам (в данном случае к карциноэмбриональному фибронектину) могут быть изготовлены известными способами, например, такими,
как описано в публикации Monoclonal Antibodies: A manual of techniques, H. Zola (CRC Press, 1988) (Моноклонные антитела: Руководство по методикам приготовления, X. Золя, 1988) и в публикации Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, J G R Hurrell (CRC Press, 1982) (Моноклонные
гибридизированные антитела: Методики и применение, Хурелл, 1982), а также Antibody Engineering, A
Practical Approach, McCafferty, J. et al., ed. (IRL Pres, 1996) (Технологии антител, Практический подход,
Мак Кафферти Дж. и др. 1996).
Специфический участок адресной доставки соединений, отвечающих настоящему изобретению, характеризуется, как обладающий специфичностью по отношению к участку карциноэмбрионального фибронектина, отличному от участка ED-B. Точнее, специфический участок адресной доставки связывается
со скрытым эпитопом, который выступает/доступен в карциноэмбриональном фибронектине (содержащем домен ED-B), но не выступает/недоступен в нормальном фибронектине (не содержащем домен EDB). Как следствие, специфический участок адресной доставки связывается с фрагментированным вариантом фибронектина, содержащим домен ED-B, но не связывается с самим доменом ED-B.
Таким образом, агенты адресной доставки, содержащие антитело L19 или его связывающиеся с антигеном фрагменты (например, WO 03/07469), не входят в область распространения настоящего изобретения, поскольку антитело L19 связывается с доменом ED-B.
Предпочтительно, если специфический участок, ответственный за адресную доставку, связывается
с аминокислотной последовательностью, представленной в фибронектине, выделяющемся как в эмбриональной, так и во взрослой ткани. Еще более предпочтительно, если специфический участок, ответственный за адресную доставку, связывается с фланговым участком домена фибронектина, т.е. по соседству с
доменом ED-B. Наиболее предпочтительно, если специфический участок, ответственный за адресную
доставку, связывается с аминокислотной последовательностью, находящейся внутри дупликата 7 домена
фибронектина (см. приведенный ниже пример 3).
Для специалиста в данной области техники понятно, что соединения, соответствующие настоящему
изобретению, могут адресно доставляться на карциноэмбриональный фибронектин, выделяемый любыми видами животных. Преимущественно, лекарственные соединения адресно направляются на карциноэмбриональный фибронектин, выделяемый теми видами, которые должны быть подвергнуты терапевтическому лечению. Таким образом, в предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения
специфический участок, ответственный за адресную доставку препарата, является специфичным в отношении карциноэмбрионального фибронектина, выделяемого человеком.
В особенно предпочтительном варианте реализации первого аспекта изобретения специфический
участок, ответственный за адресную доставку, содержит или состоит из антитела ВС1 или антитела, способного конкурировать со связывающей способностью антитела ВС1 с карциноэмбриональным фибронектином, или его фрагмента либо варианта, который несет в себе специфичность связывания с антигеном моноклонного антитела-предшественника. Приготовление антитела ВС1 описано в ЕР 0344134 В, и
оно может быть получено из гибридомы, находящейся в Европейской Коллекции клеточных культур
животных, Порт Даун, Великобритания (номер хранения 88042101).
Антитело ВС1 специфически связывается с карциноэмбриональным фибронектином через локальный участок связи, расположенный в дупликате 7, находящийся за пределами домена ED-B, который в
нормальном фибронектине замаскирован, но является доступным, если в молекуле присутствует домен
ED-B (Карнемолла (Carnemolla) и др., 1989, J. Cell. Biol. 109:1139-1148; Карнемолла (Carnemolla) и др.,
1992, J. Biol. Chem. 267: 24689-24692; Мариани и др., (Mariani), 1997, Cancer 80:2378-2384; см. также приведенный ниже пример 1).
Способы определения того, способно ли испытуемое антитело конкурировать со способностью к
связыванию антитела ВС1 с карциноэмбриональным фибронектином, хорошо известны в данной области
техники, например, как конкурентный способ ELISA.
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения антитело ВС1 является антителом
человека или гуманизированным антителом. Под «гуманизированным моноклонным антителом» мы
подразумеваем моноклонные антитела, обладающие по меньшей мере одной цепью, в которой скелетные
участки преимущественно произведены из первого акцепторного моноклонного антитела человеческого
происхождения и по меньшей мере один комплементарно-определяющий участок (CDR) произведен из
второго донорного моноклонного антитела, обладающего избирательностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину. Донорное моноклонное антитело может быть человеческого или не че-2-
011859
ловеческого происхождения, например, это может быть муреиновое моноклонное антитело.
Предпочтительно, если обе цепи гуманизированного моноклонного антитела содержат участки
CDR, полученные трансплантацией из донорного моноклонного антитела, обладающего избирательностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину.
Преимущественно, если CDR-трансплантированная (т.е. гуманизированная) цепь содержит два или
три CDR-участка, взятых из донорного антитела, обладающего избирательностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину.
Удобно, если гуманизированное моноклонное антитело содержит в основной цепи только остатки
человеческого происхождения, а участки CDR из донорного антитела обладают избирательностью по
отношению к карциноэмбриональному фибронектину.
Однако для специалиста в данной области техники понятно, что для сохранения и оптимизации избирательной специфичности гуманизированного антитела может оказаться необходимым менять один
или несколько остатков в скелетных участках цепи так, чтобы они соответствовали эквивалентным остаткам в донорном антителе.
Предпочтительно, если скелетные участки цепи гуманизированного антитела будут произведены из
человеческого моноклонного антитела IgG.
Способы получения гуманизированных моноклонных антител хорошо известны, например, см.
Джонс (Jones) и др., (1986) Nature 321:522-525, Райхман (Reichmann) и др., (1988), Nature 332:323-327,
Верхойен (Verhoeyen) и др., (1988) Science 239:1534-1536 и ЕР 239400.
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение, соответствующее первому аспекту изобретения, связывается с карциноэмбриональным фибронектином с высокой степенью
сродства антител к антигену. Под «высокой степенью сродства» мы подразумеваем то, что ответственный за адресную доставку участок распознает карциноэмбриональный фибронектин с константой связывания не ниже Kd=10-6 М, предпочтительно не менее Kd=10-7М, приемлемо Kd=10-8M, более приемлемо
Kd=10-9М, еще более приемлемо Kd=10-10M или лучше всего Kd=10-11М или даже Kd=10-12М.
Предпочтительно, если соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения,
связывается с карциноэмбриональным фибронектином более прочной связью, чем исходное моноклонное антитело, например, ВС1, используемое для приготовления участка, ответственного за адресную
доставку. Прочность связи, с которой данное вещество и исходное моноклонное антитело связываются с
карциноэмбриональным фибронектином, может быть измерена путем определения константы диссоциации их связи с карциноэмбриональным фибронектином (см. примеры 2 и 3).
Лучше всего, если данное соединение связывается с карциноэмбриональным фибронектином по
меньшей мере в два раза сильнее, чем моноклонное антитело-предшественник, например, не менее чем в
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 20 раз сильнее, чем моноклонное тело-предшественник связывается с
карциноэмбриональным фибронектином.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения это соединение, соответствующее первому аспекту изобретения, имеет специфический участок, ответственный за адресную доставку,
содержащий или состоящий из целого (т.е. ненарушенного) моноклонного антитела, предпочтительно
антитела ВС1. Таким образом, специфический участок, ответственный за адресную доставку, может содержать два генных комплекса тяжелых иммуноглобулиновых цепей и две легкие иммуноглобулиновые
цепи, которые могут быть связаны дисульфидными связями. Одна или более из этих составляющих цепей могут быть конъюгированными, например, гибридизированными с эффекторным участком. Например, из двух тяжелых иммуноглобулиновых цепей обе могут быть привиты к эффекторному участку.
В альтернативном предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения специфический
участок, ответственный за адресную доставку, содержит или состоит из связывающегося с антигеном
фрагмента моноклонного антитела, обладающего избирательностью по отношению к карциноэмбриональныму фибронектину (например, ВС1).
В распознавании антигена участвуют переменный тяжелый (VH) и переменный легкий (VL) домены
антитела; этот факт был впервые обнаружен ранними экспериментами по протеазной ферментации.
Дальнейшее подтверждение было найдено при гуманизировании антител грызунов. Переменные домены,
взятые из организма грызунов, могут быть привиты к постоянным доменам человеческого происхождения, так что образующееся в результате антитело сохраняет антигенную специфичность исходного антитела, взятого из организма грызунов (Моррисон (Morrison) и др. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81,
6851-6855).
Избирательность по отношению к антигену обеспечивается переменными доменами и является независимой от постоянных доменов, что известно из экспериментов по бактериальным выделениям фрагментов антитела, все из которых содержали один или несколько переменных доменов. Эти молекулы
содержат Fab-подобные молекулы (Беттер (Better) и др., (1988) Science 240, 1041); Fv-молекулы (Скерра
(Skerra) и др., (1988) Science 240, 1038); дисульфидно-связанные Fv-молекулы (Янг (Young) и др., 1995,
FEBS Lett. 377:135-139); одноцепочечные Fv(ScFv)-молекулы, где партнерные домены VH и VL связаны
через гибкую олигопептидную цепь (Берд (Bird) и др., (1988) Science 242, 423; Хьюстон (Huston) и др.,
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879) и однодоменные антитела (dAbs), состоящие из изолирован-3-
011859
ных V-доменов (Уард (Ward) и др., (1989) Nature 341, 544). Общий обзор методик, использованных в
синтезе фрагментов антитела, сохраняющих их специфические точки связывания, можно найти в работе
Винтера и Милстейна (Winter&Milstein (1991) Nature 349, 293-299).
Преимущества использования фрагментов антитела, а не целых антител, могут быть многократными. Меньший размер фрагментов позволяет быстрее очищаться организму и может давать лучшее соотношение содержания препарата в опухолевых и неопухолевых тканях. Fab-, Fv-, ScFv-, дисульфид-Fv- и
dAb-фрагменты антитела - все могут образовываться внутри бактерий и выделяться в виде секрета из
бактерий, таких как Е. coli, или из эукариотных выделительных систем, таких как системы дрожжевых
грибков или системы млекопитания, что позволяет обеспечивать производство больших количеств указанных фрагментов.
Предпочтительно, если специфический участок соединений, соответствующих настоящему изобретению, ответственный за адресную доставку к ткани-мишени, содержит связывающийся с антигеном
фрагмент гуманизированного антитела, выбранный из группы, в которую входят Fab-подобные молекулы, такие как Fab и F(ab')2, Fv-молекулы, дисульфидно-связанные Fv-молекулы, ScFv-молекулы и однодоменные антитела (dAbs).
Более предпочтительно, если специфический участок, ответственный за адресную доставку к тканимишени, содержит Fab-молекулу или F(ab')2-молекулу.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения соединение, соответствующее
первому аспекту настоящего изобретения, имеет специфический участок, ответственный за адресную
доставку к ткани-мишени, содержащий переменную область последовательности № 1 тяжелой цепи человеческого ВС1.
В преимущественном случае соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, имеет специфический участок, ответственный за адресную доставку к ткани-мишени, содержащий
переменную область последовательности № 2 легкой цепи человеческого ВС1.
Удобнее, если соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, имеет специфический участок, ответственный за адресную доставку к ткани-мишени, содержащий переменную
область последовательности № 1 тяжелой цепи человеческого ВС1 и переменный участок последовательности № 2 легкой цепи человеческого ВС1.
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения участок, ответственный за адресную
доставку, содержит одну или несколько постоянных областей антитела, таких как постоянные домены
иммуноглобулина СН1, СН2 и СН3. Эти один или несколько постоянных участков для переменной области участка адресной доставки могут быть взяты от одного и того же антитела или от разных антител.
Подобным же образом, соединение, соответствующее настоящему изобретению, может содержать тяжелую цепь иммуноглобулина и легкую цепь иммуноглобулина, каждая из которых содержит постоянную
область (причем эти постоянные области могут быть взяты от одного и того же или от разных антителпредшественников).
Предпочтительно, если эти одна или несколько постоянных областей антитела содержат домен СН1
или состоят из него.
В другом предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения соединение, соответствующее изобретению, кроме того, содержит компонент иммуноглобулина Fc. Лучше всего, если компонент Fc взят из антитела IgG1 человека.
Под «компонентом Fc» мы подразумеваем фрагмент антитела, содержащий домены СН2 и СН3 постоянной области тяжелой цепи IgG, т.е. структурно эквивалентный фрагменту, папаинового деления
молекулы IgG или функционально эквивалентный ему полипептид.
Как уточнялось выше, соединения, соответствующие первому аспекту настоящего изобретения, содержат эффекторный участок, состоящий из IL-12 или содержащий его или его функциональный фрагмент или вариант (т.е. компонент 'IL-12'). В термин «функциональный» фрагмент или вариант мы включаем понятие фрагмента или варианта, способного стимулировать Th1 иммунную реакцию в хозяинемлекопитающем, т.е. установление различий между клетками Th1 и простыми Т-клетками.
Таким образом, эффекторный участок содержит полипептиды, обладающие активностью IL-12, или
состоит из них.
Предпочтительно, если эффекторный участок содержит человеческий интерлейкин-12 или его
функциональный фрагмент или вариант, или состоит из него.
Удобнее, если эффекторный участок содержит одноцепочечный интерлейкин-12 или состоит из не-4-
011859
го, например, содержащий домен IL-12р35 и домен IL-12p40, или состоящий из них. Предпочтительно,
если домен IL-12p35 конъюгирован с доменом IL-12p40 дисульфидной связью.
Предпочтительно, если эффекторный участок содержит домен IL-12р35, имеющий следующую
аминокислотную последовательность:
Предпочтительно, если эффекторный участок содержит домен IL-12p40, имеющий следующую
аминокислотную последовательность:
В особенно предпочтительном варианте реализации первого аспекта настоящего изобретения соединение представляет собой или содержит гибридное соединение или гибридный белок. Под «гибридным соединением» мы подразумеваем соединение, содержащее один или несколько функционально отдельных участков, причем отдельные участки содержатся внутри линейной одиночной цепи, получаемой
способами рекомбинации ДНК. Например, соединение может содержать целое антитело, в котором тяжелая цепь привита к одиночной цепи IL-12. В альтернативном варианте соединение может содержать
Fab или F(ab')2-фрагмент антитела, в котором усеченная тяжелая цепь (т.е. Fd-цепь) привита к одиночной
цепи IL-12.
Предпочтительно, если участок, ответственный за адресную доставку, и эффекторный участок гибридного соединения гибридизированы. Эти участки могут быть привиты друг к другу непосредственно
или через связующую последовательность (например, чтобы придать участкам большую гибкость по
отношению друг к другу).
В подходящем случае связующее звено представляет собой мутированную связующую последовательность, содержащую аминокислотную последовательность ATATPGAA или состоящую из нее.
[ПОСЛ. № 5].
В альтернативном варианте участок, ответственный за адресную доставку, и эффекторный участок
соединения, соответствующего настоящему изобретению, являются отдельными компонентами, связанными между собой любым из обычных способов полипептидной сшивки, таким, как, в общем, описаны в
работе О'Салливан (O'Sullivan) и др. Anal. Biochem. (1979) 100, 100-108. Например, часть, представляющая собой антитело, может быть обогащена тиольными группами, а энзимная часть может быть подвергнута реакции с бифункциональным агентом, способным реагировать с этими тиольными группами, например, N-гидроксисукцинимидным эфиром йодоуксусной кислоты (NHIA) или N-сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионатом (SPDP). Амидные и тиоэфирные связи, полученные, например, с помощью
м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидного эфира, в общем более стабильны в живом организме,
чем дисульфидные связи.
В предпочтительном варианте реализации соединение содержит полипептид последовательности № 6.
Тяжелая цепь ВС1, привитая к человеческому IL-12p35.
В другом предпочтительном варианте реализации изобретения соединение содержит полипептид
последовательности № 7.
-5-
011859
Легкая цепь ВС1.
В особенно предпочтительном варианте реализации изобретения соединение содержит полипептид
последовательности № 6 и полипептид последовательности № 7.
Лучше всего, если соединение, кроме того, содержит полипептид последовательности № 4, связанный дисульфидной связью с полипептидом последовательности № 7.
Таким образом, изобретением предлагается гибридный белок, содержащий участки антитела V, направляемые к карциноэмбриональному фибронектину, компонент Fc и компонент интерлейкин-12. Конкретно, изобретением предлагается иммуноглобулиновый (Ig) гибридный белок, содержащий участки
антитела V, которые связываются с карциноэмбриональным фибронектином, привитый к интерлейкину12. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения участки антитела V взяты из антитела ВС1 Карнемолла (Carnemolla) и др., 1992, J. Biol. Chem. 267: 24689-24692; Мариани (Mariani) и
др., Cancer 80:2378-2384. Компонент Fc предпочтительно производится из человеческого IgG1.
В предпочтительном варианте реализации изобретения гибридный белок содержит участки антитела V, как показано в последовательностях № 6 и 7, и компонент интерлейкина-12. Предпочтительно, если
компонент интерлейкин-12 является одноцепочечным интерлейкином-12.
Неожиданной отличительной особенностью настоящего изобретения является то, что гибридный
белок связывается с карциноэмбриональным фибронектином значительно более прочно, чем само соответствующее антитело ВС1. Такая прочная связь весьма полезна при лечении рака, поскольку более
прочная связь приводит к лучшей степени направленности IL-12 на опухоль, чем можно было ожидать,
на основании сродства антитела ВС1 с карциноэмбриональным фибронектином. Более прочная связь
дает особые преимущества в случае антигенов адресной доставки, которые не претерпевают быстрого
превращения, таких как компоненты внеклеточной матрицы.
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения используются также постоянные области антитела, например домен СН1. На фиг. 1 показаны некоторые конфигурации переменных
областей антитела (заштрихованные овалы), постоянных областей (белые овалы), субъединиц IL-12 р35
(маленькие прямоугольники), субъединиц IL-12 р40 (большие прямоугольники), шарниров и сшивок антитела (толстые линии) и дисульфидных связей (тонкие линии). Особенно предпочтительные варианты
реализации изобретения содержат ненарушенные антитела Ig- типа с р35, привитыми к С-концевой последовательности тяжелой цепи, и р40, прикрепленными к р35 посредством дисульфидной связи
(фиг. 1А); «мини-тело» с V-областями антитела, соединенное мостиком и прикрепленное через шарнир к
домену СН3, р35, привитые к С-концевой последовательности тяжелой цепи, и р40, прикрепленные к р35
дисульфидной связью (фиг. 1В); sFv с р35, привитыми к V-области, и р40, прикрепленные дисульфидной
связью (фиг. 1С); и Fab с р35, привитыми к С-области, и р40, прикрепленные дисульфидной связью
(фиг. 1D). Субъединица IL-12р35 также может быть прикреплена к N-концевой последовательности Vобласти. Субъединица IL-12р40 может быть прикреплена к р35 через дисульфидную связь или через
мостик, образуя так называемый компонент «IL-12 одиночной цепи» (scIL-12).
В более предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения используется ненарушенное антитело ВС1 с постоянными областями человеческого IgG1. Особое преимущество этой молекулы
состоит в том, что она обладает эффекторными функциями, такими как ADCC, которые отсутствуют у
мини-тела и гибридных белков Fab и sFv.
Вторым аспектом настоящего изобретения является создание молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей соединение, соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, или участок, ответственный за адресную доставку, эффекторный участок или один или несколько его составляющих полипептидов (например, тяжелая цепь ВС1, легкая цепь ВС1, субъединицы р35 и р40 IL-12 и/или компонент
Fc). В понятие «нуклеиновая кислота» мы включаем молекулы ДНК, сДНК и мРНК (DNA, cDNA,
mRNA).
В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения молекула нуклеиновой кислоты,
соответствующая этому изобретению, содержит одну или более нуклеотидных последовательностей,
выбранных из группы, состоящей из последовательностей № 8, 9 и 10.
-6-
011859
Тяжелая цепь ВС1чел., привитая к субъединице р35 IL-12чел. (VH подчеркнуто; р35 выделено
жирным шрифтом; заглавные и строчные буквы представляют кодирующую и не кодирующую последовательности соответственно):
-7-
011859
Легкая цепь ВС1чел. (VL подчеркнуто; заглавные и строчные буквы представляют кодирующую и
не кодирующую последовательности соответственно):
Субъединице р40 IL-12чел. (Эта конструкция представляет собой с-ДНК м-РНК р40. ДНК, кодирующая свой свойственный сигнальный пептид, обозначена курсивом, за которым следует ДНК, кодирующая развитую р40):
В альтернативном варианте молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидные последовательности, которые являются перерожденными последовательностями указанных выше нуклеотидных
последовательностей (т.е. которые кодируют ту же самую аминокислотную последовательность).
Предпочтительно, если молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность № 8.
Можно получить преимущество, если молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность № 9.
Удобно, если молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность № 8 и
нуклеотидную последовательность № 9.
-8-
011859
В подходящем случае молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность
№ 10.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является предложение способа получения соединения, соответствующего первому аспекту данного изобретения, причем указанный способ содержит экспрессию одной или нескольких молекул нуклеиновой кислоты, соответствующей второму аспекту этого
изобретения, в «клетке-хозяине» и изолировании от нее соединения (см. пример 1).
Предпочтительно, чтобы два участка соединения, соответствующего настоящему изобретению,
производились в виде гибридного соединения методом рекомбинации ДНК, в котором цепь ДНК содержит соответствующие области, кодирующие эти два участка соединения, расположенные либо по соседству друг с другом, либо разделенные областью, кодирующей пептидный мостик, который не нарушает
заданные свойства этого соединения.
Нуклеиновая кислота может экспрессироваться в подходящей клетке-хозяине, чтобы вырабатывать
полипептид, содержащий вещество, соответствующее настоящему изобретению. Таким образом, нуклеиновая кислота, кодирующая образование соединения, соответствующего настоящему изобретению,
или его часть, может использоваться в соответствии с известными способами, надлежащим образом модифицированными в свете приведенных здесь наставлений, чтобы составить экспрессирующий вектор,
который затем будет использован для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и выработки вещества, соответствующего настоящему изобретению. Такие методы включают в себя методы,
описанные в патентах США № 4440859, выданном 3 апреля 1984 Руттеру (Rutter) и др.; 4530901, выданном 23 июля 1985 Вейссману (Weissman); 4582800, выданном 15 апреля 1986 Кроулу (Crowl); 4677063,
выданном 30 июня 1987 Марку (Mark) и др.; 4678751, выданном 7 июля 1987 Гойдделу (Goeddel);
4704362, выданном 3 ноября 1987 Итакуре (Itakura) и др.; 4710463, выданном 1 декабря 1987 Мюррей
(Murray); 4757006, выданном 12 июля 1988 Туле мл. (Toole, Jr.) и др.; 4766075, выданном 23 августа 1988
Гойдделу (Goeddel) и др., и 4810648, выданном 7 марта 1989 Сталкеру (Stalker), - все из которых включены сюда в качестве ссылки.
Если соединение, соответствующее настоящему изобретению, мультимерно, тогда составляющие
цепи могут кодироваться единой молекулой нуклеиновой кислоты или отдельной молекулой нуклеиновой кислоты (экспрессируемой в общей клетке-хозяине или в других клетках-хозяевах, а сборка проводится в искусственных условиях).
Нуклеиновая кислота, кодирующая соединение, соответствующее настоящему изобретению, или
его часть, может быть присоединена к большому числу других нуклеиновых последовательностей для
внедрения в подходящую клетку-хозяина. Вид нуклеиновой кислоты-компаньона будет зависеть от природы клетки-хозяина, способа внедрения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина и от того, желательно
ли эписомное обслуживание или интеграция.
Следует принимать во внимание, что для предотвращения экспрессии цитотоксической части соединения, соответствующего настоящему изобретению, и уничтожения клеток-хозяев, в которых происходит экспрессирование, может оказаться необходимым связать нуклеиновую кислоту, соответствующую второму аспекту настоящего изобретения, с сигнальной последовательностью, способной управлять
секрецией вырабатываемого вещества (или его части) наружу из клетки-хозяина. Примером таких сигнальных последовательностей может служить сигнальная последовательность ompA (например, см. Такахара (Takahara) и др., 1985, J. Bid. Chem. 260(5):2670-2674).
В общем, нуклеиновая кислота внедряется в экспрессирующий вектор, такой как плазмид, в надлежащей ориентации и в нужной для экспрессии рамке считывания нуклеотидной последовательности.
При необходимости нуклеиновая кислота может быть связана с подходящими транскрипционными и
трансляционными регуляторными нуклеотидными последовательностями, распознаваемыми выбранной
клеткой-хозяином, хотя такой контроль, в общем, возможен и в экспрессирующем векторе. Например,
для усиления трансляции молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соединение, соответствующее
настоящему изобретению, может быть связана с согласующей рибосомной связующей последовательностью Козака (такой как GCCGCCACC), или может содержать ее.
Затем вектор вводится в клетку-хозяина с помощью стандартных методик. В общем, не все клеткихозяева будут трансформироваться вектором. Поэтому необходимо отобрать трансформируемые клеткихозяева. Одна из методик отбора предполагает внедрение в экспрессирующий вектор нуклеотидной последовательности со всеми необходимыми контрольными элементами, которая кодирует в трансформируемой клетке избирательный признак, такой как антибиотическая устойчивость. В альтернативном варианте ген, ответственный за такой селективный признак, может находиться на другом векторе, который
используется для сотрансформации выбранной клетки-хозяина.
Затем клетки-хозяева, трансформированные рекомбинантной нуклеиновой кислотой, соответствующей настоящему изобретению, культурируют в течение достаточного периода времени и в соответствующих условиях, известных в данной области техники, и в свете приведенных здесь указаний, чтобы
дать возможность образовываться полипептиду, который впоследствии может быть выделен.
Известны многие экспрессирующие системы, включая бактерии (например, E.coli и Bacillus
subtilis), дрожжевые грибки (например, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris), нитевидные грибки
-9-
011859
(например, Aspergillus), растительные клетки, животные клетки (например, клетки COS-1, COS-7, CHO,
NIH 3Т3, NS0 BHK) и клетки насекомых (например, клетки Drosophila, SF9).
Те векторы, которые содержат репликон, такой как прокариотный репликон, могут содержать также
соответствующий промотор, такой как прокариотный промотор, способный направлять экспрессию
(транскрипцию и трансляцию) генов в трансформируемой ими бактериальной клетке-хозяине, такой как
Е. coli.
Промотор является элементом контроля экспрессии, образованным ДНК-последовательностью, которая позволяет осуществлять связывание полимеразы РНК и транскрипцию. Промоторные последовательности, совместимые с выбранными бактериальными клетками-хозяевами, в типичном случае имеются в плазмидных векторах, содержащих подходящие рестрикционные участки для внедрения сегмента
ДНК, соответствующей настоящему изобретению.
Типичными прокариотными векторными плазмидами являются pUC18, pUC19, pBR322 и pBR329
(которые могут быть получены от Bioard Laboratories, Richmond, СА, USA), pTrc99A и pKK223-3 (которые можно получить от Pharmacia Piscataway, NJ, USA) и система pET (промотор Т7, Novagen Ltd).
Типичной векторной плазмидой клеток млекопитающих является pSVL, которую можно получить
от Pharmacia Piscataway, NJ, USA. Этот вектор использует промотор SV40 для ведения экспрессии клонированных генов, причем наивысший уровень экспрессии был обнаружен в клетках-продуцентах Тантигена, таких как клетки COS-1.
Примером индуцируемого экспрессирующего вектора клеток млекопитающих является pMSG, который также можно получить от Pharmacia. Этот вектор использует глюкокортикоидно-индуцируемый
промотор дупликата длинного оконечного участка вируса рака молочной железы мыши для управления
экспрессией клонированного гена.
Применимыми плазмидными векторами дрожжевых грибков являются pRS403-406 и pRS413-416, и
вообще, они могут быть получены от компании Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA.
Плазмиды pRS403, pRS404, pRS405 и pRS406 представляют собой интеграционные плазмиды дрожжей
(Yips) и они содержат в себе дрожжевые селективные маркеры his3, trp1, leu2 и ura3. Плазмиды pRS413416 представляют собой центромерные плазмиды дрожжей (YCps).
Другие применимые векторы для трансформации дрожжевых клеток, такие как Pichia, содержат 2μплазмид pYX243 (может быть получен от компании R and D Systems Limited) и интеграционный вектор
группы pPICZ (может быть получен от компании Invitrogen).
Было разработано множество методов для оперативной привязки ДНК к векторам через вспомогательные когезионные окончания. Например, к сегменту ДНК, который должен внедряться в векторную
ДНК, могут быть добавлены вспомогательные гомополимерные участки. Затем вектор и ДНК соединяются водородной связью, возникающей между вспомогательными гомополимерными хвостами, с образованием рекомбинантных молекул ДНК.
Альтернативный способ соединения сегмента ДНК с векторами обеспечивается синтетическими
связующими мостиками, содержащими один или несколько рестрикционных участков. Сегмент ДНК,
образующийся при рестрикционном сбраживании эндонуклеазы, как было описано ранее, обрабатывается бактериофагом Т4 ДНК-полимеразы или ДНК-полимеразой I бактерии Е. coli, т.е. энзимами, которые
удаляют выступающие концевые 3'-однострендовые отростки с их 3'-5'-экзонуклеотидной активностью,
и внедряют в утопленные 3'-концы способность к полимеризации.
Поэтому комбинация таких функциональных проявлений приводит к образованию тупоконечных
сегментов ДНК. Затем эти тупоконечные сегменты инкубируют с большим стехиометрическим избытком молекул-мостиков в присутствии энзима, способного каталитически воздействовать на сшивание
тупоконечных молекул ДНК, такого как ДНК-лигаза бактериофага Т4. Таким образом, продуктами реакции являются сегменты ДНК, несущие на своих концах полимерные мостиковые цепочки. Затем эти сегменты ДНК расщепляют подходящим рестрикционным энзимом и пришивают к экспрессирующему вектору, который был расщеплен энзимом, производящим концевые отростки, совместимые с такими отростками сегмента ДНК. Синтетические связующие мостики, содержащие разнообразные рестрикционные
эндонуклеазные участки, могут быть в значительных количествах получены из многих источников,
включая такие, как International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, USA.
Желательным путем модификации нуклеиновой кислоты, кодирующей соединение, соответствующее настоящему изобретению, или его часть, является использование полимеразной цепной реакции, как
это описано Сайки (Saiki) и др. (1988) Science 239, 487-491.
В этом методе нуклеиновая кислота, предназначенная для энзимного умножения, окружается с боков двумя специфическими олигонуклеотидными инициаторами, которые сами становятся включенными
в умножаемую нуклеиновую кислоту. Указанные специфические инициаторы могут содержать рестрикционные участки распознавания эндонуклеазы, которые могут использоваться для клонирования в экспрессирующие векторы с помощью известных методов.
Примерный перечень видов дрожжевых грибков, рассматриваемых в качестве предмета для возможного использования при практическом применении настоящего изобретения, включает такие, как
Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Torulopsis, Hansenula, Schizosaccharomyces, Citeromyces,
- 10 -
011859
Pachysolen, Debaromyces, Metschunikowia, Rhodosporidium, Leucosporidium, Botryoascus, Sporidiobolus,
Endomycopsis и им подобные. Предпочтительными видами являются виды, выбранные из группы, состоящей из Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces, Yarrowia и Hansenula. Примерами Saccharomyces являются Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces italicus и Saccaromyces rouxii. Примерами Kluyveromyces
являются Kluyveromyces fragilis и Kluyveromyces lactis. Примерами Hansenula являются Hansenula polymorpha, Hansenula anomala и Hansenula capsulata. Примером подходящего вида Yarrowia является Yarrowia lipolytica.
Способы трансформации S. Cerevisiae в основном рассматриваются в ЕР 251744, ЕР 258067 и
WO 90/01063, и все они приводятся здесь путем ссылки.
Подходящие промоторы для S. Cerevisiae включают в себя такие, которые связаны с геном PGK1,
генами GAL1 или GAL10, CYC1, РНО5, TRP1, ADH1, ADH2, генами для глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы,
гексокиназы,
пируватдекарбоксилазы,
фосфофруктокиназы,
триозфосфатизомеразы, фосфоглюкозоизомеразы, глюкокиназы, α-сопряженного феромона, а-сопряженного
феромона, промотор PRB1, промотор GUT и гибридные промоторы, включающие гибриды участков регуляторных областей 5' с участками регуляторных областей 5' других промоторов или с вышестоящими
активационными участками (например, промотор по патенту ЕР-А-258067).
Сигналом прекращения транскрипции предпочтительно является фланговая 3' последовательность
эукариотного гена, которая содержит соответствующие сигналы для прекращения транскрипции и полиаденилации. Подходящими 3' фланговыми последовательностями могут быть, например, такие из генов,
которые естественно связаны с последовательностью управления экспрессией, т.е. могут соответствовать
промотору. В альтернативном варианте они могут быть разными, и в этом случае предпочтительным будет сигнал прекращения гена AHD1 S. Cerevisiae.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформируемой с помощью полинуклеотидного вектора, составленного согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин может быть
либо прокариотной, либо эукариотной. Предпочтительными прокариотными клетками-хозяевами являются бактериальные клетки, и в типичном случае это штамм бактерий E.coli, такой, например, как штаммы E.coli DH5, которые можно получить от Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, и
RR1, которые можно получить от American Type Culture Collection (ATCC) of Rockvill, MD, USA
(№ ATCC 31343). Предпочтительными эукариотными клетками-хозяевами являются дрожжевые клетки
и клетки млекопитающих, преимущественно позвоночные клетки, такие как позвоночные клетки мыши,
крысы, обезьяны или клетки человеческой линии, синтезирующие волокнистые структуры. Предпочтительные эукариотные клетки-хозяева включают в себя клетки NS0, яичниковые клетки китайского хомячка (СНО), которые могут быть получены от АТСС, как клетки CCL61, NIH эмбриональные клетки
швейцарской мыши NIH/3T3, которые можно получить от АТСС, как клетки CPL 1658, и произведенные
из почки обезьяны COS1-клетки, которые можно получить от АТСС, как клетки CRL 1650 или клетки
WSO.
Трансформация подходящих клеток-хозяев нуклеиновой кислотой, конструкт которой соответствует настоящему изобретению, осуществляется хорошо известными методами и обычно зависит от используемого вектора. Относительно трансформации прокариотных клеток-хозяев см., например, Кохен
(Cohen) и др., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972); и Сэмбрук (Sambrook) и др., Molecular Cloning, A
Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989). Трансформация дрожжевых клеток описана Шерманом (Sherman) и др., Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor, NY (1986). Может использоваться также метод Беггса (Beggs), Nature, 275: 104-109 (1978).
Что касается позвоночных клеток, то реагенты, которые могут применяться при рассечении таких клеток, например, фосфат кальция и DEAE-декстран или липосомные препараты, могут быть получены от
компаний Stratagene Cloning Systems или Life Technologies Inc, Gaithersburg, MD 208777, USA.
Удачно трансформированные клетки, содержащие конструкт нуклеиновой кислоты, соответствующий настоящему изобретению, могут распознаваться хорошо известными методами. Например, клетки,
получившиеся в результате введения экспрессивного конструкта, соответствующего настоящему изобретению, могут выращиваться и давать полипептид, соответствующий настоящему изобретению. Клетки
могут быть собраны и подвергнуты лизису, и их ДНК-содержимое может быть исследовано на предмет
присутствия нужной ДНК с помощью такого метода, как описаны в работе Соутерна (Southern), J. Mol.
Biol., 98: 503 (1975) или в работе Берента (Berent) и др., Biotech., 3: 208 (1985). В альтернативном варианте присутствие протеина в надосадочной жидкости может выявляться с помощью антител, как это описано ниже.
Вдобавок к прямому определению присутствия рекомбинантной нуклеиновой кислоты успешную
трансформацию можно подтвердить хорошо известными иммунологическими методами, когда рекомбинантная нуклеиновая кислота способна направлять экспрессию белка. Например, клетки, успешно
трансформированные экспрессирующим вектором, выделяют белки, проявляющие соответствующую
антигенную активность. Образцы клеток, предположительно претерпевших трансформацию, отбирают и
оценивают на присутствие белка с помощью подходящих антител.
Таким образом, вдобавок к самим трансформированным клеткам-хозяевам настоящее изобретение
- 11 -
011859
охватывает также и культуру таких клеток, предпочтительно моноклонную (клонально гомогенную)
культуру, или культуру, выведенную из моноклонной культуры в питательной среде. Предпочтительно,
если эта культура содержит также белок.
Питательная среда, пригодная для культивирования трансформированных клеток-хозяев, хорошо
известна в данной области техники, и ее можно получить из нескольких разных коммерческих источников.
Третьим аспектом настоящего изобретения является вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, соответствующую второму аспекту настоящего изобретения.
Четвертым аспектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, содержащая вектор, соответствующий третьему аспекту настоящего изобретения.
Предпочтительно, если клетка-хозяин является клеткой млекопитающих, такой как клетка NS0 или
CHO.
Соединение, соответствующее настоящему изобретению, может быть выделено из среды культивирования с использованием последовательности из нескольких или из всех следующих стадий: жидкостная Abx-хроматография на смешанных смолах, хроматография рекомбинантного белка А и жидкостная
хроматография на Q-сефарозе, с последующей диафильтрацией тангенциального потока (Pellicon 2) для
буферного обмена в составной буфер. В эти стадии может быть включена вирусная дезактивация и удаление. Стадии вирусной дезактивации и удаления не являются необходимыми для собственно очистки,
но используются для удовлетворения нормативных соображений.
Подробности методов, пригодных для производства соединения, соответствующего настоящему
изобретению, описаны в работе Джиллиса (Gillies) и др., (WO 99/29732, включено сюда в виде ссылки).
Другие подходящие методики описаны в Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3-е издание, Сэмбрук и
Расселл (Sambrook and Russell), 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Пятым аспектом настоящего изобретения является лекарственный препарат, содержащий вещество,
соответствующее первому аспекту настоящего изобретения, и фармацевтически приемлемый носитель.
Предпочтительно, если соединение, например гибридный белок, может быть замешано в фосфатную буферную соль (PBS), в буферы, содержащие аргинин, цитрат, маннит и/или тройник или другой
подходящий стандартный буферный агент, входящий в состав белковых препаратов.
Определенные преимущества могут быть получены, если соединение пригодно для парентерального введения в организм.
Удобно, если препарат исполнен в единичной дозировке, содержащей дневную дозу или единицу,
частичную дневную дозу или соответствующую долю активного вещества.
Соединения, отвечающие настоящему изобретению, обычно будут вводиться перорально или каким-либо парентеральным путем в форме лекарственного препарата, содержащего активный ингредиент,
возможно в форме нетоксичной органической или неорганической кислоты или основания или аддитивной соли, в фармакологически приемлемой форме дозировки. В зависимости от заболевания и конкретного пациента, которого предстоит лечить, а также в зависимости от пути введения в организм, эти вещества могут назначаться в разных дозировках.
При лечении людей соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут назначаться отдельно, однако, в общем, они будут вводиться в смеси с подходящими фармацевтическим наполнителем,
разбавителем или носителем, выбранным с учетом предусмотренного пути введения и стандартной фармакологической практики.
Например, соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться в организм
перорально, внутриротно или подъязычно в форме таблеток, капсул, овул, эликсиров, растворов или суспензий, которые могут содержать ароматизирующие или красящие вещества, и их форма может предусматривать задержанное или контролируемое поступление вещества в организм. Вещества, отвечающие
настоящему изобретению, могут вводиться также путем внутрисосудистой инъекции.
Такие таблетки могут содержать наполнители, такие как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза,
цитрат натрия, карбонат кальция двухосновный фосфат кальция и глицин, дезинтеграторы, такие как
крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный или тапиоковый), натриевый крахмальный гликолят, кроскармелозу натрия и некоторые комплексные силикаты, а также связующие для грануляции, такие как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлозу (НРМС), гидроксипропилцеллюлозу
(НРС), сахарозу, желатин, аравийскую камедь. Дополнительно могут быть добавлены смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк.
Твердые составы подобного типа могут быть использованы в качестве наполнителей в желатиновых капсулах. В этом отношении предпочтительными являются такие наполнители, как лактоза, крахмал, целлюлоза, молочный сахар или высокомолекулярные полиэтиленгликоли. В случае водных суспензий и/или эликсиров вещества, соответствующие настоящему изобретению, могут применяться в комбинации с различными вкусовыми или ароматизирующими веществами, окрашивающими веществами или
красителями, с эмульгаторами и/или суспендирующими добавками, а также с разбавителями, такими как
вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин и их комбинациями.
Соединения, соответствующие настоящему изобретению, могут вводиться также парентерально,
- 12 -
011859
например, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшино, внутриоболочечно, внутревентрикулярно,
внутриастернально, внутрикраниально, внутримышечно или подкожно, либо они могут вводиться методами инфузии. Лучше всего использовать их в форме стерильного водного раствора, который может содержать и другие вещества, например, достаточное количество соли или глюкозы, которые делают раствор изоосмолярным по отношению к крови. Эти водные растворы, при необходимости, должны быть
надлежащим образом буферированы (предпочтительно, на pH от 3 до 9). Приготовление подходящих
парентеральных препаратов в стерильных условиях легко осуществляется стандартными фармакологическими методами, хорошо известными специалистам в данной области техники.
Препараты, пригодные для парентерального введения, включают в себя водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостаты и
растворы, которые придают препарату изоосмолярность по отношению к крови пациента, которому назначено лечение; а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие вещества и загустители. Препараты могут быть представлены в единичной дозировке или в многодозных контейнерах, например, в запаянных ампулах и пузырьках, и они могут храниться в высушенном на холоде (лиофилизированные) состоянии, требующем лишь добавления стерильного жидкого носителя, например воды для инъекции прямо перед использованием препарата. Растворы, приготовленные
для немедленной инъекции, и суспензии могут готовиться из стерильных порошков, гранул и таблеток,
которые были описаны ранее.
Врач будет определять фактическую дозу, которая будет наиболее подходящей для каждого конкретного пациента, и эта доза будет изменяться в зависимости от возраста, веса и реакции конкретного
пациента. Дозировки, описанные в примере 9, являются примерами, характерными для среднего случая.
Конечно же, на практике могут быть индивидуальные случаи, где назначаются более высокие или более
низкие дозировки, и все они попадают в область действия настоящего изобретения.
Шестым аспектом настоящего изобретения является соединение, соответствующее первому аспекту
настоящего изобретения, предназначенное для использования в медицине.
Седьмым аспектом настоящего изобретения является использование соединения, соответствующего
первому аспекту настоящего изобретения, для изготовления лекарственного препарата для лечения пациентов, больных раком.
Восьмым аспектом настоящего изобретения является способ лечения пациента, больного раком,
причем этот способ содержит введение в организм указанного пациента вещества, соответствующего
первому аспекту настоящего изобретения.
В принципе, соединения и композиции, соответствующие настоящему изобретению, могут использоваться для лечения любых млекопитающих, включая их детенышей, таких как собак и кошек, а также
сельскохозяйственных животных, таких как коровы, лошади и свиньи.
Однако преимущественно пациентом является человек.
Соединения, соответствующие настоящему изобретению, особенно пригодны для лечения плотных
опухолей, таких как глиобластомы. Другими предпочтительными показаниями являются раковые опухоли яичников, желудка, ободочной и прямой кишки и поджелудочной железы.
Теперь приведем подробное описание изобретения, ссылаясь при этом на следующие примеры, которые, однако, не ограничивают область распространения изобретения.
На фиг. 1 показана схема предпочтительных конфигураций переменных участков антитела (заштрихованные овалы) постоянных участков (белые овалы), субъединиц IL-12 р35 (маленькие прямоугольники), субъединиц IL-12 р40 (большие прямоугольники), шарниров и сшивающих цепочек антитела
(толстые линии) и дисульфидных связей (тонкие линии). Особенно предпочтительные варианты реализации изобретения содержат ненарушенные антитела Ig-типа с р35, привитыми к С-концевой последовательности тяжелой цепи, и р40, прикрепленными к р35 посредством дисульфидной связи (фиг. 1А); «мини-тело» с V-областями антитела, соединенное мостиком и прикрепленное через шарнир к домену СН3,
р35, привитые к С-концевой последовательности тяжелой цепи, и р40, прикрепленные к р35 дисульфидной связью (фиг. 1В); sFv с р35, привитыми к V-области, и р40, прикрепленные дисульфидной связью
(фиг. 1С); и Fab с р35, привитыми к С-области, и р40, прикрепленные дисульфидной связью (фиг. 1D).
Субъединица IL-12 р35 также может быть прикреплена к N-концевой последовательности V-области.
Субъединица IL-12 р40 может быть прикреплена к р35 через дисульфидную связь или через мостик, образуя так называемый компонент «IL-12 одиночной цепи» (scIL-12).
На фиг. 2 показан конструкт pdHL11-huBC1-M1-hup35 (см. пример 1). На рисунке изображены следующие отличительные особенности:
- 13 -
011859
На фиг. 3 показан конструкт pNeo-CMV-hu (см. пример 1). На рисунке изображены следующие отличительные особенности:
- 14 -
011859
На фиг. 4 показано связывание четырех конструктов (huBC1-muIL12, huBC1-huIL12, muBC1 и
huBC1) с фрагментами рекомбинантного карциноэмбрионального фибронектина FN789 и FN7B89 (см.
пример 3).
На фиг. 5A показан подбор дозы нескольких вводимых клеток U-87-MG в зависимости от скорости
роста подкожных опухолей (см. пример 5). На фиг. 5B показана противоопухолевая эффективность
huBC1-muIL12 в подкожной модели U87-MG на SCID-мышах.
На фиг. 6 показана противоопухолевая эффективность huBC1-muIL12 в подкожной модели А431на
SCID-мышах (см. пример 5).
На фиг. 7 показана противоопухолевая эффективность huBC1-muIL12 в подкожной модели
PC3mm2 на SCID-мышах (см. пример 5).
На фиг. 8 показана противоопухолевая эффективность huBC1-muIL12 в НТ29 подкожной модели на
SCID-мышах (см. пример 5).
На фиг. 9 показано влияние, оказываемое введением huBC1-muIL12, на (A) поверхность легкого,
покрытую метастазами, и (B) на вес легкого после инъекции клеток карциномы простаты PC3mm2 в
мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) (см. пример 5).
На фиг. 10 показан фармакокинетический анализ huBC1-muIL12 и huBC1-huIL12, проведенный на
мышах (см. пример 5). BALB/c-мышам делали инъекцию 25 мг huBC1-muIL12 в хвостовую вену. В различные моменты времени ретроорбитальным взятием крови отбирали небольшие образцы крови. Плазму
анализировали тестом для улавливания антигенов с античеловеческой IgG H&L антисывороткой с детектированием с помощью античеловеческого или антимуреинового антитела IL12 (компании R&D
Systems). Результаты были нормированы на исходную концентрацию в сыворотке каждой мыши, взятой
немедленно после инъекции (t=0). Время полуциркуляции для обеих молекул в организме мышей составляет приблизительно 19 ч.
Примеры
Пример 1. Продуцирование гибридного белка huBC1-huIL12.
I. Формирование экспрессирующих векторов для huBC1-huIL12.
1. Переменная область легкой цепи (VL).
ДНК, кодирующая переменную область легкой цепи (VL) гуманизированного антитела ВС1, была
представлена в форме плазмида RKA.pMMR010. Для приспособления VL ДНК к экспрессирующему
вектору pdHL11 была использована полимеразная цепная реакция (PCR). Форвардный праймер содержит
последовательность 5'-С ТТА AGC GAA ATT GTG TTG ACG CAG ТС-3' [ПОСЛ. № 11], где CTTAAG
представляет собой участок рестрикционного распознавания AflII, a GAA является N-концевым аминокислотным остатком зрелой VL. Реверсный праймер имеет последовательность 5'-GGATCCACTTACG
ТТТ GAT СТС CAG СТТ GG-3' [ПОСЛ. № 12], где подчеркнутая последовательность гибридизирована с
концом 3' легкой цепи VL, a GGATCC добавляет участок рестрикционного распознавания BamHI ниже
по ходу цепи от донорного участка расщепления VL.
Для секреции легких и тяжелых цепей гибридного белка huBC1 была использована геномическая
сигнальная пептидная последовательность гена легкой цепи иммуноглобулина мыши. Для оптимального
связывания рибосомы для инициирования трансляции при ATG была введена согласующая последовательность Козака CCACCATGG [Kozak (1984) Nature 308: 241]. Это достигалось мутированием первого
аминокислотного остатка после преобразования инициирующего кодона из AAG в GAG, чтобы получить
последовательность TCTAGACCACCATGGAG [ПОСЛ. № 13], где подчеркнута согласующая последовательность Козака, а участок (TCTAGA) рестрикционного распознавания XbaI помещается на конце 5'.
На конце 3' сигнального пептида генная последовательность, кодирующая -2 аминокислотный остаток (-1 аминокислота, являющаяся С-оконечным остатком сигнального пептида), была мутагенезирована
из серинового остатка в лейкиновый остаток (из AGC в ТТА), так что ДНК, кодирующая конец сигналь- 15 -
011859
ного пептида, будет представлять собой CTTAAGC, где CTTAAGC является созданным рестрикционным
участком AflII [Ло (Lo) и др., (1998) Protein Engineering 11: 495]. Поэтому сигнальная пептидная последовательность содержит заместитель на первом аминокислотном остатке после инициирующего кодона,
и другой заместитель в аминокислотном остатке в -2-положении. Поскольку сигнальный пептид вырезается сигнальной пептидазой внутри клетки и не появляется в секретируемом клеткой белке, эти мутации
не влияют на состав продуцируемого антитела. Фрагмент 450-bp XbaI-AflII, содержащий геномическую
сигнальную пептидную последовательность, был пришит к фрагменту AflII-BamHI, кодирующему VL
для получения фрагмента XbaI-BamHI, и он, в свою очередь, вводился в pdHL11 экспрессирующий вектор, который уже содержит регуляторные элементы транскрипции и последовательности постоянных
областей иммуноглобулина (см. далее).
2. Переменная область тяжелой цепи (VH).
ДНК, кодирующая переменную область тяжелой цепи (VH) гуманизированного антитела ВС1, была
получена в форме плазмида RHA.pGamma1. Для приспособления VH ДНК к экспрессирующему вектору
pdHL11 была использована полимеразная цепная реакция (PCR). Форвардный праймер содержит последовательность 5'-С ТТА AGC GAG GTG CAG CTG GTG CAG ТС-3' [ПОСЛ. № 14], где CTTAAG представляет собой участок рестрикционного распознавания AflII, a GAG является N-концевым аминокислотным остатком зрелой VH. Реверсный праймер имеет последовательность 5'-AAGCTTACT TAC CTG
AGG AGA CGG AGA СС-3' [ПОСЛ. № 15], где подчеркнутая последовательность гибридизирована с
концом 3' тяжелой цепи VH, a AAGCTT добавляет участок рестрикционного распознавания HindIII ниже
по ходу цепи от донорного участка расщепления VH.
Перед сшиванием с тяжелой цепью ДНК участок XbaI фрагмента 450-bp XbaI-AflII, содержащего
геномную сигнальную пептидную последовательность, был преобразован в участок XhoI путем пришивки соединительного мостика, чтобы получить последовательность CCTCGAGGCTAGACCACCATGGAG
[ПОСЛ. № 16], где CCTCGAGG является последовательностью сшивающего мостика XhoI, CTAGA
представляет собой прилипающий конец XbaI, который сделан тупым путем заполнения фрагментом
Кленова (Klenow) ДНК-полимеразы, a CCACCATGG представляет собой согласующую последовательность Козака (Kozak). Рестрикционный фрагменет XhoI-AflII, содержащий геномный лидер, пришивался
к фрагменту AflII-HindIII, содержащему VH-ген, а затем полученный фрагмент XhoI-HindIII вставлялся в
экспрессирующий вектор pdHL11, который уже содержит регуляторные элементы транскрипции и последовательности постоянной области иммуноглобулина (см. далее).
3. Постоянные области человеческого гена.
Конструкт легкой цепи использует постоянную область каппа-цепи человеческого гена, а конструкт
тяжелой цепи использует постоянные области человеческой гамма-1-цепи. Имеется рестрикционный
участок SmaI, расположенный 280 bp выше кодона прекращения трансляции в природной последовательности ДНК, кодирующей домен СН3. Этот участок SmaI был разрушен введением мутации в неструктурной части (ТСС в ТСА). Другая мутация в неструктурной части была введена 10bp выше кодона
прекращения трансляции для образования последовательности С CCG GGT ААА (STOP) [ПОСЛ. № 17],
которая содержит новый участок SmaI [Ло (Lo) и др., (1988) Protein Engineering 11: 495]. Этот рестрикционный участок SmaI теперь является уникальным в экспрессирующем векторе pdHL11, и он используется в качестве узла гибридизации для создания гибридных протеинов антитело-цитокин.
4. с-ДНК, кодирующие субъединицы р35 и р40 человеческого IL-12.
с-ДНК субъединиц р35 и р40 человеческого IL12 были клонированы из человеческих периферийных моноцитов крови (РВМС) с использованием полимеразной цепной реакции (PCR). Первая цепь сДНК была синтезирована с использованием олиго-dT-праймера и обращенной транскриптазы. Продукт
с-ДНК был использован в качестве шаблона для PCR. Для субъединицы р35 сенсорный праймер имел
последовательность 5'-CCAGAAAGCAAGAGACCAGAG-3' [ПОСЛ. № 18], а антисенсорный праймер
имел последовательность 5'-GGAGGGACCTCGAGTTTTAGGAAGCATTCAG-3' [ПОСЛ. № 19]. Сенсорный праймер выводится из последовательности в 5'-нетранслированной области передачи р35 сразу перед участком XmaI тогда как антисенсорный праймер кодирует кодон прекращения трансляции, за которым вскоре следует рестрикционный участок XhoI для направленного клонирования. Праймерами для
субъединицы р40 с-ДНК были 5'-CTCCGTCCTGTCTAGAGCAAGATGTGTC-3' [ПОСЛ. № 20] в случае
сенсорного праймера, и 5'-GCTTCTCGAGAACCTAACTGCAGGGCACAG-3' [ПОСЛ. № 21] в случае антисенсорного праймера. Сенсорный праймер вводит уникальный участок XbaI выше участка начала
трансляции, тогда как антисенсорный праймер вводит XhoI-участок ниже кодона прекращения трансляции.
5. Конструкция ДНК huBC1-H-цепь-чел. Р35.
Клонированная р35 с-ДНК после подтверждения последовательности была приспособлена к экспрессии в качестве гибридного белка следующим образом. При гибридном соединении аминокислотным
остатком на С-окончании СН3 является лизин, а на N-окончании остатком зрелой р35 является аргинин.
Для минимизации протеолиза при гибридном соединении с этими двумя основными остатками оба из
них были мутагенизированы в аланин, который, как было показано ранее, в случае иммуноцитокина IL2
продлевает период сывороточного полураспада [Джиллис (Gillies) и др., (2002) Clin. Cancer Res. 8: 210].
- 16 -
011859
Для реконструкции гибридного соединения имеется удобный участок BalI, расположенный как раз на 11
базисных конъюгации (bp) ниже зрелого N-окончания р35. Следовательно, олигонуклеотидный связующий мостик XmaI-BalI, состоящий из сенсорной цепи 5'-CCG GGC GCC GCA ААС СТС ССС GTG G-3'
[ПОСЛ. № 22] и антисенсорной цепи 5'-С САС GGG GAG GTT TGC GGC GC-3' [ПОСЛ. № 23], где GCC
GCA обозначает два аланиновых заместителя, был синтезирован и пришит к рестрикционному фрагменту BalI-XhoI, кодируя остаток субъединицы р35. Полученный фрагмент XmaI-XhoI, в свою очередь, был
пришит к уникальному рестрикционному участку XmaI в экспрессирующем векторе pdHL11, образуя
гибридное соединение СН3-р35. Пептидная последовательность в этом соединении LSLSPGAANLPV
[ПОСЛ. № 24], где АА представляют собой два аланиновых заместителя, является неизвестной и потенциально иммуногенной. Действительно, она содержит эпитоп потенциального Т-фага-помощника, который может быть удален мутацией остатков LSLS в АТАТ, опираясь на биотехнологию, именуемую деиммунизацией. Полученная в результате деиммунизированная гибридная последовательность называется
последовательностью М1. Поэтому ДНК huBC1-Н-цепь-М1-hu р35 состоит из фрагмента XhoI-HindIII,
кодирующего сигнальный пептид VH, фрагмента HindIII-XmaI, кодирующего постоянные области геномной человеческой Н-цепи lgG1 с деиммунизированным соединением, и фрагмент XmaI-XhoI, кодирующий субъединицу р35.
6. Экспрессирующий вектор pdHL11-huBC1-hu р35.
Экспрессирующий вектор pdHL11 выведен из pdHL7, который был описан ранее (Джиллис (Gillies)
и др., (1998) J. Immunol. 160: 6195). Как и в векторе pdHL7, две транскрипторные единицы для L и Н цепей в векторе pdHL11 содержат усилитель-промотор CMV [Босхарт (Boshart) и др., (1985) Cell 41: 521530]. ДНК для усилителя-промотора CMV были получены из фрагмента AflIII-HindIII доступной pcDNAI
(Invitrogen Corp. San Diego, CA). На конце 3' L-цепь использует 3'-нетранслированную область и полиаденилационный сигнал человеческого гена с иммуноглобулиновой каппа-цепью, а Н-цепь использует
3'-нетранслированную область и полиаденилационный сигнал позднейшего участка SV 40.
Главное различие между pdHL7 и pdHL11 заключается в транскрипторной единице для селекционного маркера дигидрофолатредуктазы (DHFR). Усилитель SV40 для этой транскрипторной единицы был
нарушен в pdHL11 следующим образом. В усилителе/промоторе SV40 имеется 72 bp-дупликации, и
внутри каждой из этих 72 дупликаций имеется рестрикционный участок SphI. Прививка участка Sall 5'
усилителя к удаленному участку SphI через олигонуклеидный мостик-переходник приводит к отмене 120
bp из двух дупликаций bp. Такой безусилительный промотор должен давать намного более низкий уровень экспрессии селекционного маркера DHFR. Теоретически это должно выражаться в меньшем числе
устойчиво тренсфектированных клеточных клонов, которые для выживания при выборе медикамента
должны бы иметь плазмид, встроенный в активную область транскрипции хромосомы, так чтобы из безусилительного промотора экспрессировалось достаточное количество DHFR. Интересующие нас гены,
возникающие под действием полностью функциональных усилителей и промоторов, должны экспрессироваться в этой активной области транскрипции на значительно более высоких уровнях. Кроме того, в
pdHL11 ориентация этой ослабленной транскрипторной единицы была перевернута, так что CMCусилитель для легкой цепи при экспрессировании DHFR не может оказывать прямого действия на удаленный промотор SV40.
Конструкт pdHL11-huBC1-M1-hup35 был в значительной степени картирован ограничением расщепления эндонуклеазы. Кодирующие области целых L- и Н-цепей были полностью секвенированы. Его
отличительные свойства показаны на фиг. 2.
7. Экспрессирующий вектор для субъединицы hu p40.
Клонированная р40 с-ДНК, содержащая полностью открытую рамку считывания, после подтверждения последовательности была вшита в отдельный экспрессирующий вектор, как фрагмент XbaI-XhoI.
Этот экспрессирующий вектор pNeo-CMV-hu p40 содержит неомициноустойчивый ген для отбора
трансфектированных клеток с использованием неомицинового аналога G418. Экспрессия р40 контролируется усилителем-промотором CMV, и использует муреиновый каппа-полиаденилационный сигнал.
Конструкт pNeo-CMV-hu p40 был в значительной степени картирован ограничением расщепления
эндонуклеазы. Его отличительные свойства показаны на фиг. 3.
II. ДНК и протеиновые последовательности huBC1-huIL12.
1. Пептидная и ДНК последовательность легкой цепи huBC1-huIL12.
Пептидная последовательность секретируемой легкой цепи гуманизированной ВС1-huIL12 имеет
следующий вид (VL подчеркнуто):
- 17 -
011859
Последовательности ДНК конструкта легкой цепи, начиная с кодона инициирования трансляции
ATG, и заканчивая кодоном прекращения трансляции TAG, приведены ниже (VL подчеркнуто; заглавные и строчные буквы представляют кодирующие и не кодирующие последовательности соответственно):
2. Пептидная и ДНК последовательность тяжелой цепи huBC1-huIL12.
Пептидная последовательность секретируемой тяжелой цепи huBC1-hup35 имеет следующий вид
(VH подчеркнуто, деимунизированное М1 соединение изображено курсивом, а человеческий р35 - жирным шрифтом):
Последовательности ДНК конструкта тяжелой цепи, начиная с кодона инициирования трансляции
ATG, и заканчивая кодоном прекращения трансляции ТАА, приведены ниже (VH подчеркнуто; заглавные и строчные буквы представляют кодирующие и не кодирующие последовательности соответственно):
- 18 -
011859
- 19 -
011859
1. Пептидная и ДНК последовательность субъединицы р40.
Пептидная последовательность секретируемой субъединицы человеческой р40 имеет следующий
вид:
Последовательности ДНК конструкта р40, начиная с кодона инициирования трансляции ATG, и заканчивая кодоном прекращения трансляции TAG, приведены ниже (конструктом является с-ДНК
p40mRNA; ДНК, кодирующая по собственному сигнальному пептиду, обозначена курсивом, а за ней
следует ДНК, кодирующая по зрелому р40):
Пример 2. Характеристика связывания (исследование I).
Для изучения связывания образцового гибридного белка BC1-IL12, соответствующего настоящему
изобретению, с карциноэмбриональным фибронектином были проведены эксперименты по плазменному
поверхностному резонансу и по окраске с использованием иммунной метки.
В ходе исследования связывания гибридного белка BC1-IL12 с его адресным антигеном было установлено, что этот гибридный белок связывается со своей мишенью более прочно, чем само соответствующее антитело ВС1. Например, с помощью метода плазменного поверхностного резонанса было измерено связывание ВС1 и BC1-IL12 с полипептидом, содержащим домены человеческого фибронектина 7,
ED-B, 8 и 9. Результаты двух экспериментов приведены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты показывают, что связывание huBC1-IL12 с его адресным антигеном не менее чем в
10 раз более сильное; наиболее вероятно, что оно в 16 раз превышает прочность связи соответствующего
- 20 -
011859
huBC1, взятого самого по себе.
Для подтверждения результатов, полученных методом плазменного поверхностного резонанса, у
иммунодефицитных SCID-мышей СВ17 в соответствии со стандартными процедурами создавали подкожные опухоли U87 MG, и срезы опухолей исследовали методом окраски с использованием иммунной
метки с применением антитела huBC1 и гибридного белка huBC1-IL12. Было обнаружено, что интенсивность окрашивания с гибридным протеином huBC1-IL12 была значительно больше, чем с антителом
huBC1 (данные не приводятся).
Пример 3. Характеристика связывания (исследование II).
Введение.
Техника плазменного поверхностного резонанса (SPR) была использована для демонстрации специфичности связывания антигена (т.е. распознавания только рекомбинантного карциноэмбрионального
фибронектина FN7B89), и для определения/сравнения значений констант кинетической скорости/сродства для муреиновых и человеческих антител ВС1 и иммуноцитокинов BC1-IL12. Все реагенты,
использованные при измерениях, и программное обеспечение были предоставлены компанией Biocore
(см. список реагентов и программ, приведенный в приложении).
Анализ.
ED-B-негативный (FN789) и ED-B-позитивный (FN7B89) рекомбинантные фибронектины (см. нижеследующий раздел «Данные последовательности») связывались в комплекс в двух разных проточных
ячейках полупроводникового датчика СМ5 с использованием стандартной процедуры образования амино-комплексов и комплексообразующих реагентов, представленных компанией Biocore. Две другие проточные ячейки были оставлены пустыми и использовались в качестве негативных контрольных поверхностей. Для демонстрации антигенной специфичности различные антитела ВС1 и иммуноцитокины разбавляли до концентрации 500 нМ в потоке буферного раствора HEPES (HBS-EP). Образцы впрыскивали
по поверхностям со связанным фибронектином в течение 5 мин, и сравнивали кривые связывания. Поток
буферного раствора (HBS-EP) вводили над каждой контрольной поверхностью в качестве негативного
контроля для получения базовой линии нулевого сигнала. Поверхности полупроводникового датчика
восстанавливали в течение 1 мин импульсным введением 0,1М раствора HCl (pH 1,5), после чего в течение следующей 1 мин пропускали 0,1М раствор H3PO4.
Для проведения кинетического анализа с датчиком связывали только ED-B-позитивный фибронектин (FN7B89). В три разные проточные ячейки были введены три разные плотности. Четвертая проточная ячейка была оставлена без связанного фибронектина и использовалась для контроля негативной реакции. Было приготовлено от четырех до пяти концентраций каждой из молекул путем двухкратного
последовательного разбавления в диапазоне концентраций от 1000 до 125 нМ (muBC1), от 200 до 25 нМ
(huBC1) и от 100 до 6,25 нМ (муреиновый и человеческий BC1-IL12). Последовательные разбавления
производились трижды в потоке буферного раствора (HBS-EP). Раствор каждой концентрации впрыскивали в течение 5 мин (ассоциация), а затем в следующие 5 мин следовала промывка потоком буферного
раствора (диссоциация) со скоростью потока 10 Тл/мин. Проточные ячейки восстанавливали также, как
это было описано выше в экспериментах по определению антигенной специфичности. Построение кривых проводили с помощью программного обеспечения, предоставленного компанией Biocore. Подробности построения кривых приведены в приложении.
Результаты.
В то время, как различные молекулы ВС1 связываются с рекомбинантным карциноэмбриональным
фибронектином FN7B89 с различной интенсивностью, они вовсе не связываются с рекомбинантным
«нормальным» фибронектином FN789 (см. фиг. 4). Это указывает на то, что во всех исследованных молекулах ВС1 как антитела, так и иммуноцитокины сохраняют свою антигенную специфичность (если
сравнивать с исходным muBC1). Эти данные также показывают, что кинетика связывания антигена в
случае разных молекул различна.
Кинетический анализ показывает, что константы скорости для разных молекул действительно значительно различаются (см. табл. 2).
Таблица 2
Кроме того, иммуноцитокины BC1-IL12 имеют намного более высокое сродство по отношению к
FN7B89, чем как муреиновые, так и человеческие антитела. Несмотря на различия в константах скорости, huBC1-muIL12 и huBC1-huIL12 обладают практически одинаковым сродством при связывании их
- 21 -
011859
антител. Эти данные указывают на то, что гуманизирование антитела ВС1, а также последующее формирование иммуноцитокина BC1-IL12 сопровождается образованием молекулы с повышенным сродством к
рекомбинантному карциноэмбриональному фибронектину.
Выводы.
Все из молекул ВС1 избирательно связываются с рекомбинантным карциноэмбриональным фибронектином FN7B89, что указывает на то, что конструирование иммуноцитокина huBC-huIL12 не сопровождается потерей антигенной специфичности. Гуманизирование муреинового антитела ВС1 приводит к
получению молекулы с повышенной способностью внедрения. Это повышение сродства возникает благодаря значительному ускорению захвата. Гуманизированное антитело связывается со своим антигеном
почти в 34 раза быстрее, чем его муреиновый конкурент. Однако гуманизирование оказывает также и
негативное влияние. Скорость выхода для huBC1 приблизительно в 5 раз быстрее, чем у muBC1. Введение IL12 в антитело для создания иммуноцитокина BC1-IL12 позволяет устранить этот недостаток, что
выражается в получении скоростей выхода, аналогичных скоростям выхода, характерным для muBC1. В
искусственной среде huBC1-huIL12 представляет собой иммуноцитокин с высоким сродством, который
потенциально может быть использован в качестве молекулы для адресной доставки в опухоль в живом
организме.
Данные последовательности
(а) Фрагмент фибронектина 789
Примечание 1. Группа с 1 по 207 является pQE-последовательностью, начинающейся с инициатора
и включающей в себя промотор-инициатор Qiagen (CCCGAAAAGTGCCACCTG). Группа с 1069 по 1126
является pQE12-последовательностью, начинающейся с конца гексагистидиновой метки и простирающаяся до инициирующей последовательности обращения Qiagen (GTTCTGAGGTCATTACTGG). Фибронектин-производная последовательность (т.е. без MRGS и гексагиксидиновой метки, записана строчными буквами).
Примечание 2. Имейте в виду, что кодирующая последовательность имеет мутации
СС(230)А>СА(230)А, приводящую к изменению P8Q; А(286)СА>G(286)CA, приводящую к изменению
Т27А; ТСА(657)>TCG(657), приводящую к изменению S150S.
- 22 -
011859
(а) Фрагмент фибронектина 7В89
Примечание 1. Группа с 1 по 207 является pQE-последовательностью, начинающейся с инициатора
и включающей в себя промотор-инициатор Qiagen (CCCGAAAAGTGCCACCTG). Группа с 1342 по 1399
является pQE12-последовательностью, начинающейся с конца гексагистидиновой метки и простирающаяся до инициирующей последовательности обращения Qiagen (GTTCTGAGGTCATTACTGG). Фибронектин-производная последовательность (т.е. без MRGS и гексагиксидиновой метки, записана строчными буквами).
Примечание 2. Имейте в виду, что кодирующая последовательность имеет мутации
- 23 -
011859
СС(230)А>СА(230)А, приводящую к изменению P8Q; А(286)СА>G(286)CA, приводящую к изменению
Т27А; ТСА(930)>TCG(930), приводящую к изменению S241S.
Использованные материалы и методы.
1. Материалы: Biacore AB, Uppsala
номера по каталогу и информацию о контактах можно поучить на интернет-странице:
www.biacore.com
Biacore 2000
Программа BIAControl (управляет прибором)
Программа BIAEvaluation (анализ данных)
Главный датчик Senior Chip CM5 (сертифицированный)
Буфер HBS-EP
Набор для аминного связывания
2. Кинетические параметры: параметры построения графика зависимости подбираются в программе
BIAEvaluation
кривая Fit=бивалентна (анализируемым веществом является антитело)
Начало введения=0 с
Ассоциация=30-270 с
Прекращение введения=300 с
Диссоциация=330-600 (5,5 мин)
Пример 4. Определение в искусственных условиях эффективности при лечении рака.
Чтобы проверить применимость гибридного белка BC1-IL12 для лечения рака гибридный белок
huBC1-muIL12 был конструктирован и экспрессирован в соответствии со стандартными методиками
(см. пример 1 и Джиллис (Gillies) и др., WO 99/29732, включенный сюда в виде ссылки). В этом белке
использован муреиновый IL-12, поскольку человеческий IL-12 не распознается муреиновыми рецепторами IL-12.
Иммунодефицитные мыши SCID CB17 с глиобластомными опухолями U87MG объемом около
140 мм3 были подвергнуты лечению либо huBC1, либо huBC1-IL12, как это показано в табл. 3.
- 24 -
011859
Таблица 3
Пример 5. Эффективность huBC1-g1-muIL12 на модельных опухолях мышей.
1. Введение.
Цель исследования состояла в определении эффективности применения huBC1-IL12 на различных
моделях опухолей мышей. huBC1 (гуманизированное антитело ВС1) адресно направлено на изоформу
человеческого фибронектина B-FN, которая присутствует в субэндотелиальной внеклеточной матрице
(ЕСМ) неоваскулятуры васкуляризированных опухолей. B-FN является хорошей опухолевой меткой,
поскольку он карциноэмбриональный и ангиогенетически ассоциирован, и не обнаруживается в нормальных взрослых тканях. Поскольку huBC1 распознает только человеческий B-FN и не вступает в перекрестную реакцию с муреиновым В-FN, для доклинических исследований были использованы ксеногенные модели опухолей, включающие человеческие опухолевые клетки, имплантированные в мышей с
тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) и в бесшертных мышей. Кроме того, поскольку
IL12 является видоспецифическим веществом, huBC1-huIL12 (гибридный белок гуманизированного антитела ВС1 - человеческого IL12), предназначенный для людей, не действует в мышах. Поэтому для проведения оценки на муреиновых моделях мы изготовили huBC1-муреиновый IL12 в качестве суррогата
кандидатного лекарственного средства.
2. Материалы и методы.
2.1. Виды мышей.
Иммунодефицитные SCID CB17 и бесшерстные мыши были приобретены у компаний Taconic,
Charles River, и Jackson Lab.
2.2. Линии опухолевых клеток.
Аденокарцинома простаты человека PC3mm2 была принесена в дар д-ром Ральфом Рейсфельдом
(Ralph Reisfeld) из Scripps Research Institute. Астроцитома человека U-87 MG, эпидермоидная карцинома
человека А431 и карцинома толстой кишки человека НТ29 были получены от American Culture
Collection.
2.3. Белки.
Белок huBC1-g1-muIL12 был аналогичен huBC1-g1-M1-muIL12. Он представляет собой гибридный
белок гуманизированного антитела ВС1 с человеческими постоянными областями g1 и муреиновым
IL12, а М1 представляет собой деиммунизированный гибридизирующий связующий элемент (см. приведенный выше пример 1).
huBC1-g1-muIL12 был изготовлен аналогичным способом, как и huBC1-huIL12 (см. приведенный
выше пример 1), за исключением того, что mup40 и mup35 были заменены на hup40 и hup35 соответственно.
3. План эксперимента, схема дозировки и оценка результатов.
3.1. Модель подкожной U-87MG у иммунодефицитных мышей SCID CB17.
02-23 Действие huBC1-g1-M1-muIL12 в клетках асторцитомы U87MG человека на подкожной модели опухоли у SCID СВ17-мышей.
Мыши: возраст 7 недель, самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области SCID СВ17-мышей 4×106 клеток
опухоли U-87MG в 0,1 мл PBS в соответствии с протоколом.
Группировка и лечение.
Лечение начинали, когда размер опухоли достигал ~100 мм3. Мышей сортировали на 5 групп (n=8)
с одинаковыми размерами и тяжестью опухоли:
- 25 -
011859
Анализ результатов лечения.
Измерение размеров опухоли проводили дважды в неделю.
Размер опухоли определяли по формуле ширина×длина×высота×0,5236.
Умерщвляли каждую мышь с размерами опухоли более 5000 мм3.
В соответствующие моменты времени вычисляли отношение Т/С (отношение объемов леченой и
контрольной опухолей).
3.2. Модель подкожной А431 у иммунодефицитных мышей SCID CB17.
02-37 Действие BC1-g1-M1-muIL12 в А431 на подкожной модели опухоли у SCID CB17-мышей.
Мыши: возраст 8 недель, SCID СВ17-мыши, самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области SCID СВ17-мышей 1×106 жизнеспособных клеток опухоли А431 в 0,1 мл PBS в соответствии с протоколом.
Группировка и лечение.
Лечение начинали, когда размер опухоли достигал ~100 мм3. Мышей сортировали на 2 группы
(n=8) с одинаковыми размерами и тяжестью опухоли:
Анализ результатов лечения.
Измерение размеров опухоли проводили дважды в неделю.
Размер опухоли определяли по формуле ширина×длина×высота×0,5236.
Умерщвляли каждую мышь с размерами опухоли более 5000 мм3.
В соответствующие моменты времени вычисляли отношение Т/С (отношение объемов леченой и
контрольной опухолей).
3.3. Модель подкожной РС3mm2 у иммунодефицитных мышей SCID CB17.
02-44 Действие BC1-g1-M1-muIL12 в PC3mm2 на подкожной модели опухоли у SCID CB17-мышей.
Мыши: возраст 8 недель, SCID СВ17-мыши, самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области SCID СВ17-мышей 2×106 жизнеспособных клеток опухоли PC3mm2 в 0,1 мл PBS в соответствии с протоколом.
Группировка и лечение.
Лечение начинали, когда размер опухоли достигал ~100 мм3. Мышей сортировали на 2 группы
(n=7) с одинаковыми размерами и тяжестью опухоли:
Анализ результатов лечения.
Измерение размеров опухоли проводили дважды в неделю.
Размер опухоли определяли по формуле ширина×длина×высота×0,5236.
Умерщвляли каждую мышь с размерами опухоли более 5000 мм3.
В соответствующие моменты времени вычисляли отношение Т/С (отношение объемов леченой и
контрольной опухолей).
3.4. Модель подкожной НТ-29 у бесшерстных мышей.
02-70 Действие huBC1-g1-M1-muIL12 в НТ-29 на подкожной модели опухоли у бесшерстных мышей.
Мыши: возраст 6-7 недель, бесшерстные мыши (бесш.м./бесш.м.), самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области бесшерстных мышей 1×106 жизнеспособных клеток опухоли НТ-29 в 0,1 мл PBS в соответствии с протоколом.
Группировка и лечение.
Лечение начинали, когда размер опухоли достигал ~100 мм3. Мышей сортировали на 2 группы
(n=5) с одинаковыми размерами и тяжестью опухоли:
- 26 -
011859
Анализ результатов лечения.
Измерение размеров опухоли проводили дважды в неделю.
Размер опухоли определяли по формуле ширина×длина×высота×0,5236.
Умерщвляли каждую мышь с размерами опухоли более 5000 мм3.
В соответствующие моменты времени вычисляли отношение Т/С (отношение объемов леченой и
контрольной опухолей).
3.5. Модель легочной метастазы РС3mm2 у иммунодефицитных мышей SCID СВ17.
03-11 Действие BC1-g1-M1-muIL12 в модели легочной метастазы PC3mm2 у SCID CB17-мышей.
Мыши: возраст 8 недель, SCID СВ17-мыши, самцы.
Инъекция опухоли.
Инъекция в среднюю часть срединной линии спинной области SCID СВ17-мышей 2×106 жизнеспособных единичных клеток опухоли PC3mm2 в 0,3 мл PBS i.v. в день 0.
Группировка (n=8) и лечение:
Завершение.
Умерщвляли мышей на 28-й день или когда контрольная мышь слабела.
Удаляли легкие и закрепляли их в растворе Боуина.
Определяли вес легких и вес тела.
Подсчитывали метастазы легких.
Проверяли и отмечали наличие метастаз в других органах и в лимфатических узлах.
4. Результаты.
4.1. Модель подкожной U-87MG у иммунодефицитных мышей SCID CB17.
Вначале нам необходимо определить модель подкожной опухоли с использованием астроцитомы
U-87MG человека, которая была выбрана потому, что в клетках этой линии опухолей имеет место высокий уровень экспрессии B-FN (Мариан (Mariane) и др., 1997, Cancer 80: 2378). Было проведено титрование, чтобы определить необходимое для инъекции число клеток, обеспечивающее оптимальный рост
опухоли. Для образования подкожной опухоли в спину каждой мыши вводили инъекцией различное число жизнеспособных клеток (от 1 до 6×106) и следили за скоростью роста опухолей (фиг. 5A). Интересно
отметить, что независимо от числа введенных инъекцией клеток, скорости роста опухолей оставались
низкими в течение приблизительно 3 недель, после чего все они быстро возрастали.
Для проведения последующих экспериментов в спину каждой мыши делали инъекцию 4×106 жизнеспособных клеток. Через шесть дней средний размер опухолей составлял приблизительно 135 мм3, и
тогда начинали лечение (день 0). Две группы мышей лечили в течение 8 последующих дней, вводя им
ежедневную дозу либо 5, либо 20 мкг huBC1-muIL12. Третья группа получала дневную дозу 20 мкг
huBC1-muIL12 в каждый второй день до суммы в 12 доз. Для сравнения четвертая группа мышей получала дневную дозу 0,5 мг антитела huBC1 в день 0 и в день 4. Результаты, полученные на этих 4 подопытных группах и на контрольной группе, которой вводили PBS, показаны на фиг. 5B. Опухоли у мышей PBS-контрольной группы медленно увеличивались, и на день 19 достигали объема 430 мм3, и с этого
времени начинался экспоненциальный рост опухолей, так что на день 35 их средний размер достигал
5627 мм3. Лечение антителом не оказало влияния на рост опухоли. На этой модели у иммунодефицитных
мышей лечение различными дозировками huBC1-muIL12 было эффективным в течение приблизительно
3 недель. На день 23 средний размер опухоли у группы, получившей 8 ежедневных доз 20 мкг, был приблизительно 446 мм3, а средний размер опухоли у двух групп, получивших дозы 80 мкг, составлял приблизительно 380 мм3, по сравнению с более чем 1000 мм3 для PBS-контрольной группы. Однако лечение
только задержало фазу экспоненциального роста приблизительно на 4 дня, поскольку, начиная со дня 23
и по день 35, опухоли у всех трех групп росли экспоненциально с такой же скоростью роста, как в группе, получавшей лечение препаратом PBS.
В табл. 4 показаны средние объемы опухолей (в мм3) в каждой их групп в разные дни.
- 27 -
011859
Таблица 4
4.2. Модель подкожной А431 у иммунодефицитных SCID-мышей.
Одноцикловое лечение 7-ю последовательными ежедневными дозами по 20 мкг huBC1-muIL12 каждая было эффективным на подкожной модели человеческой меланомы А431 у SCID-мышей, давая на
день 14 отношение Т/С, равное 0,31, и на день 25, равное 0,26 (см. фиг. 6).
В табл. 5 показаны средние объемы опухолей (в мм3) в каждой их групп в разные дни.
Таблица 5
4.3. Модель подкожной РС3mm2 у иммунодефицитных SCID-мышей.
Одноцикловое лечение 7-ю последовательными ежедневными дозами по 20 мкг huBC1-muIL12 каждая было эффективным на подкожной модели человеческой карциномы простаты у SCID-мышей, давая
на день 15 отношение Т/С, равное 0,34, и на день 25, равное 0,33 (см. фиг. 7).
В табл. 6 показаны средние объемы опухолей (в мм3) в каждой их групп в разные дни.
Таблица 6
4.4. Модель подкожной НТ-29 у бесшерстных мышей.
Одноцикловое лечение 5-ю последовательными ежедневными дозами по 20 мкг huBC1-muIL12 каждая было эффективным на подкожной модели человеческой карциномы простаты у SCID-мышей (очевидно, опечатка. Следует читать «подкожной модели человеческой НТ-29 у бесшерстных мышей...»
Примеч. переводчика), давая на день 13 отношение Т/С, равное 0,46, и на день 20, равное 0,43 (см.
фиг. 8). Поскольку это было всего лишь одноцикловое лечение, и у бесшерстных мышей функциональные Т-клетки отсутствуют, не слишком удивляет тот факт, что после дня 20 скорость роста опухолей в
группе, получавшей лечение, начинала увеличиваться. Интересно было бы оценить эффективность второго цикла лечения, проведенного в это время.
В табл. 7 показаны средние объемы опухолей (в мм3) в каждой их групп в разные дни.
- 28 -
011859
Таблица 7
4.5. Модель легочной метастазы РС3mm2 у иммунодефицитных SCID-мышей.
В этой ксеногеничной модели человеческая карцинома простаты PC3mm2 вводилась инъекцией
мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) за 11 дней до начала лечения, что давало достаточно времени для образования метастаз. Несмотря на отсутствие функциональных Т- и Вклеток у SCID-мышей, 5 ежедневных инъекций huBC1-muIL12 по 16 мкг полностью искоренили образовавшиеся метастазы у всех мышей и предотвратили их разрастание, что следует из результатов измерений поверхности легких, покрытой метастазами (фиг. 9A) и тяжести опухоли (фиг. 9B). Даже дозировка
8 мкг была очень эффективна, снижая метастазы легких приблизительно на 85% по отношению к PBSконтрольной группе.
В табл. 8 показана сводка данных по эффективности применения huBC1-muIL12 на моделях опухолей у мышей. Отношение Т/С для подкожных (s.c.) опухолей представляет собой отношение среднего
объема опухоли в группе, получающей лечение, к среднему объему опухоли в PBS-контрольной группе.
Для модели легочной метастазы Т/С представляет собой отношение средней тяжести опухоли в группе,
прошедшей лечение, к тяжести опухоли в PBS-контрольной группе.
Таблица 8
5. Обсуждение результатов.
Кандидатное лекарственное вещество huBC1-huIL12 нельзя оценить на современных муреиновых
моделях опухолей, поскольку человеческий IL12 является видоспецифическим. Поэтому мы изготовили
челВС1-муреиновый IL12, и показали, что эта суррогатная молекула обладала эффективностью в различных ксеногенных моделях метастаз и подкожных опухолей, как это показано в табл. 8. Невзирая на
то, что у SCID-мышей отсутствуют функциональные клетки Т и В, один цикл лечения с 7 ежедневными
инъекциями замедлили рост опухолей на 74 и 67% соответственно в моделях опухолей А431 и РС3. Такие результаты являются впечатляющими, особенно с учетом того факта, что huBC1-muIL12 характеризуется очень высокой скоростью очищения организма в α-фазе в мышах в сравнении с huBC1-huIL12
(см. нижеприведенные фиг. 10 и приложение). Одиночный цикл лечения, состоящий из 5 ежедневных
инъекций, также был эффективен в модели НТ-29 на бесшерстных мышах, замедляя рост опухоли на
57%. Эффективность могла бы повыситься при многоцикловом лечении препаратом huBC1-huIL12 в
клинике, где пациенты, проходящие курс постхимиотерапийного лечения, могут иметь значительно более функциональную иммунную систему, чем иммунодефицитные SCID-мыши. В экспериментальной
- 29 -
011859
модели метастаз легкого на SCID-мышах 5 ежедневных инъекций huBC1-muIL12 с разовой дозой 16 мкг
почти полностью искоренило метастазы, которым позволили образоваться за 11 дней до начала эксперимента.
6. Приложение. Фармакокинетика huBC1-muIL12 и huBC1-huIL12.
Фармакокинетику huBC1-muIL12 и huBC1-huIL12 определяли на бесшерстных мышах Balb/c. Было
обнаружено, что huBC1-huIL12 в организме мышей имеет большее значение сывороточного полупериода, чем huBC1-muIL12, особенно в α-фазе (фиг. 10).
Пример 9. Методы лечения.
Соединение, например гибридный протеин, соответствующий настоящему изобретению, может
применяться следующим образом.
Проводится лечение пациента, больного раком, например глиобластомой. Предпочтительным путем введения препарата является внутривенная или подкожная инъекция, но возможны также внутримышечный, внутрибрюшинный, внутрикожный или другие пути инъекции. Возможны также введение
ингаляцией, орально или с помощью суппозиториев, а также другие пути введения. Предпочтительным
является назначение препарата в виде четырехнедельного цикла, три раза в неделю, за которым следует
отсутствие лечения в течение следующих трех недель, но оно может быть и более или менее частым, в
зависимости от фармакокинетического поведения белка BC1-IL12 в данном конкретном пациенте. Дозировка для взрослых людей весом около 70 кг находится в диапазоне приблизительно от 4 до 20 мг в одной дозе. Наиболее предпочтительной дозировкой является приблизительно 10 мг на взрослого пациента
весом 70 кг, проходящего лечение один раз в месяц. Наблюдение за реакцией пациентов проводится в
соответствии со стандартной процедурой.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение, содержащее участок, ответственный за адресную доставку, и эффекторный участок,
в котором:
(i) участок, ответственный за адресную доставку, содержит моноклональное антитело, обладающее
специфичностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину, или его фрагмент либо вариант, который сохраняет специфичность связывания с карциноэмбриональным фибронектином исходного
моноклонального антитела, или состоит из него, и
(ii) эффекторный участок содержит интерлейкин-12 или его функциональный фрагмент либо вариант или состоит из него,
характеризующееся тем, что моноклональное антитело, обладающее специфичностью по отношению к
карциноэмбриональному фибронектину, связывается с участком карциноэмбрионального фибронектина,
не являющимся участком ED-B.
2. Соединение по п.1, в котором участок, ответственный за адресную доставку, способен связываться с аминокислотной последовательностью, присутствующей в фибронектине, экспрессируемой как в
эмбриональной, так и в нормальной взрослой ткани.
3. Соединение по п.1 или 2, в котором участок, ответственный за адресную доставку, способен связываться с аминокислотной последовательностью в пределах дупликации 7 домена фибронектина.
4. Соединение по любому из пп.1-3, в котором участок, ответственный за адресную доставку, является специфичным в отношении человеческого карциноэмбрионального фибронектина.
5. Соединение по любому из пп.1-4, в котором моноклональное антитело, обладающее специфичностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину, представляет собой антитело ВС1 или
антитело, способное конкурировать с антителом ВС1 по способности связываться с карциноэмбриональным фибронектином.
6. Соединение по п.5, в котором моноклональным антителом, обладающим специфичностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину, является антитело ВС1.
7. Соединение по любому из пп.1-6, в котором моноклональное антитело является человеческим
или гуманизированным моноклональным антителом.
8. Соединение по п.6 или 7, связывающееся с карциноэмбриональным фибронектином более прочно, чем исходное моноклональное антитело.
9. Соединение по п.8, связывающееся с карциноэмбриональным фибронектином по меньшей мере в
два раза прочнее, чем исходное моноклональное антитело.
10. Соединение по п.8 или 9, связывающееся с карциноэмбриональным фибронектином по меньшей
мере в 10 раз прочнее, чем исходное антитело ВС1 связывается с карциноэмбриональным фибронектином.
11. Соединение по любому из пп.1-10, в котором участок, ответственный за адресную доставку, содержит полипептид последовательности № 1.
12. Соединение по любому из предыдущих пунктов, в котором участок, ответственный за адресную
доставку, содержит полипептид последовательности № 2.
13. Соединение по п.11 или 12, в котором участок, ответственный за адресную доставку, содержит
- 30 -
011859
полипептид последовательности № 1 и полипептид последовательности № 2.
14. Соединение по любому из пп.1-13, в котором участок, ответственный за адресную доставку, содержит фрагмент моноклонального антитела, связывающийся с антигеном, обладающий специфичностью по отношению к карциноэмбриональному фибронектину, или состоит из него.
15. Соединение по п.14, в котором участок, ответственный за адресную доставку, состоит из или
содержит фрагмент, связывающийся с антигеном, выбранный из группы, состоящей из Fab-подобных
молекул, таких как Fab и F(ab')2, Fv-молекул, дисульфидно-связанных Fv-молекул, ScFv-молекул и однодоменных антител (dAbs).
16. Соединение по любому из пп.1-15, в котором участок, ответственный за адресную доставку, содержит одну или несколько постоянных областей антитела.
17. Соединение по п.16, в котором одна или несколько постоянных областей антитела содержит домен СН1 или состоит из него.
18. Соединение по любому из пп.1-17, в котором дополнительно содержится Fc-компонент.
19. Соединение по п.18, в котором Fc-компонент произведен из человеческого IgG1.
20. Соединение по любому из пп.1-19, в котором участок, ответственный за адресную доставку, содержит ненарушенное антитело ВС1 или состоит из него.
21. Соединение по любому из пп.1-20, в котором эффекторный участок содержит человеческий интерлейкин-12 или его функциональный фрагмент либо вариант или состоит из него.
22. Соединение по любому из пп.1-21, в котором эффекторный участок содержит одноцепочечный
интерлейкин-12 или состоит из него.
23. Соединение по п.22, в котором одноцепочечный IL-12 состоит из домена IL-12р35 и домена IL12р40.
24. Соединение по п.23, в котором домен IL-12р35 конъюгирован с доменом IL-12р40 дисульфидной связью.
25. Соединение по любому из пп.1-24, в котором веществом является гибридный белок.
26. Соединение по любому из пп.1-25, в котором участок, ответственный за адресную доставку,
привит к эффекторному участку.
27. Соединение по п.26, содержащее иммуноглобулиновую тяжелую цепь, привитую к эффекторному участку.
28. Соединение по п.27, в котором иммуноглобулиновая тяжелая цепь и эффекторный участок соединены между собой через мутированную сшивающую последовательность.
29. Соединение по п.28, в котором сшивающий мостик содержит аминокислотную последовательность ATATPGAA (ПОСЛ. № 5) или состоит из нее.
30. Соединение по любому из пп.1-29, в котором вещество содержит полипептид последовательности № 6.
31. Соединение по любому из пп.1-30, в котором вещество содержит полипептид последовательности № 7.
32. Соединение по п.30 или 31, в котором вещество содержит полипептид последовательности № 6
и полипептид последовательности № 7.
33. Соединение по любому из пп.30-32, дополнительно содержащее полипептид последовательности № 4, связанный дисульфидной связью с полипептидом последовательности № 6.
34. Гибридный белок, содержащий V-области антитела, направленные к карциноэмбриональному
фибронектину, Fc-компонент и компонент интерлейкина-12, отличающийся тем, что V-области антитела
связываются с областью карциноэмбрионального фибронектина, не являющейся областью ED-B.
35. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соединение, соответствующее любому из пп.1-34,
или участок, ответственный за адресную доставку, эффекторный участок или их составляющий полипептид.
36. Молекула нуклеиновой кислоты по п.35, содержащая одну или несколько нуклеотидных последовательностей, выбранных из групп, содержащих последовательности № 8-10.
37. Молекула нуклеиновой кислоты по п.36, содержащая нуклеотидную последовательность № 8.
38. Молекула нуклеиновой кислоты по п.36 или 37, содержащая нуклеотидную последовательность
№ 9.
39. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп.36-38, содержащая нуклеотидную последовательность № 8 и нуклеотидную последовательность № 9.
40. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, соответствующую любому из пп.35-39.
41. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты, соответствующую любому из
пп.35-39, или вектор, соответствующий п.40.
42. Способ изготовления соединения, соответствующего любому из пп.1-34, или участка, ответственного за адресную доставку, эффекторного участка или их составляющего полипептида, содержащий
экспрессирование молекулы нуклеиновой кислоты, по любому из пп.35-39, в клетке-хозяине и отделение
от нее этого вещества, участка или составляющего компонента.
- 31 -
011859
43. Лекарственный препарат, содержащий соединение по любому из пп.1-34 и фармацевтически
приемлемый носитель.
44. Лекарственный препарат по п.43, пригодный для парентерального введения в организм.
45. Соединение по любому из пп.1-34, предназначенное для применения в медицине.
46. Применение вещества, соответствующего любому из пп.1-34, для приготовления медикамента,
предназначенного для лечения пациента, больного раком.
47. Способ лечения пациента, больного раком, содержащий назначение указанному пациенту соединения по любому из пп.1-34.
48. Применение по п.46 или способ по п.47, где млекопитающим является человек.
49. Применение по п.46 или способ по п.47, где у пациента имеется плотная опухоль.
50. Применение по п.46 или способ по п.47, где раковым заболеванием является глиобластома.
Фиг. 1
Фиг. 2
- 32 -
011859
Фиг. 3
Фиг. 4
- 33 -
011859
Фиг. 5A
Фиг. 5B
- 34 -
011859
Фиг. 6
Фиг. 7
- 35 -
011859
Фиг. 8
Фиг. 9A
- 36 -
011859
Фиг. 9B
Фиг. 10
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 37 -