описани
advertisement
1 Предпосылки создания изобретения 1. Область изобретения. Изобретение относится к медицинской вирусологии и основано на манипуляциях с бактериальной флорой, которая безвредна и в норме населяет слизистые оболочки, для предотвращения развития инфекционного процесса. В частности, изобретение касается модификации непатогенных бактерий с целью придания им способности связывать (и функционально инактивировать) специфические вирусы. Несмотря на то, что в описании раскрывается способ предотвращения инфицирования вирусами, проникающими через слизистую оболочку, квалифицированному специалисту будет понятно, что данное изобретение может быть применено в отношении любого патогена, инфицирующего слизистые оболочки, в том числе бактерий, грибов и паразитов. 2. Уровень техники. Цитоплазматическая экспрессия гетерологичных белков бактериями широко используется для практических целей на протяжении последних двух десятилетий. Однако специфическая экспрессия гетерологичных белков на внешних поверхностях бактерий была достигнута только в последние несколько лет. Известны системы поверхностной экспрессии как для грамположительных, так и для грамотрицательных бактерий, например, см. патент США № 5,348,867 и WO 93/18163. Краткое описани изобретения Настоящее изобретение относится к способу защиты животных и человека от вирусной инфекции, заключающемуся в обеспечении контакта слизистой оболочки хозяина с таким количеством трансформированных бактерий, которое достаточно для колонизации слизистой оболочки и защиты животного от вирусной инфекции, при том, что указанные бактерии трансформированы генетическим материалом, обеспечивающим бактериям способность связывать вирус. В частности, изобретение относится к трансформированным бактериям, которые связывают вирус или другие патогены с использованием природных рецепторов, доменов рецепторов или антивирусных антител, являющихся продуктами экспрессии гетерологичного генетического материала. Предпочтительным хозяином является человек. Если известны природные рецепторы, для трансформации бактерий могут быть использованы гены, кодирующие данные рецепторы. Когда специфические рецепторы вирус/хозяин не известны, для трансформации бактерий могут быть применены гены, кодирующие антивирусные антитела или фрагменты антител. Например, в случае ретровирусов, несущих на своей поверхности человеческие лейкоцитарные антигены (HLA DR), могут быть применены антитела против данных антигенов. Соответственно, настоящее изобретение может 000576 2 быть применено против ротавируса, папилломавируса, аденовируса, респираторно-синцитиального вируса, коронавируса, цитомегаловируса, вируса Коксаки, эховируса, вируса гепатита А, риновируса, вируса иммунодефицита человека, полиовируса, вируса Эпштейна-Барр, вируса парагриппа и вируса простого герпеса при использовании бактерий, способных связываться с консервативными детерминантами капсидов соответствующих вирусов. Бактерии могут быть также модифицированы таким образом, чтобы экспрессировать специфические углеводные группы, которые служат рецептором для вируса. Например, бактерии могут быть трансформированы таким генетическим материалом, экспрессия которого приведет к появлению на поверхности бактерий дополнительных молекул сиаловой кислоты, что позволит бактериям связывать вирус гриппа. Бактерии могут быть также модифицированы таким образом, что обеспечивается слияние бактериальной мембраны и вирусной оболочки, если она существует. Примером может служить такая трансформация бактерий, когда они могут сливаться со связанными вирусными частицами при помощи домена слияния, встроенного в вируссвязывающий полипептид. Необходимым условием осуществления изобретения является колонизация слизистых оболочек трансформированными бактериями и предпочтительно, чтобы трансформированные бактерии обладали достаточным селективным преимуществом для эффективной конкуренции с резидентными бактериями и последующей успешной колонизации и выживанием на выбранной слизистой оболочке неопределенно долго. Одним из селективных преимуществ является усиленная способность прикрепляться к слизистой оболочке хозяина посредством домена гетерологичного белка, который связывается с детерминантой на определенной слизистой оболочке. Селективное преимущество может также достигаться при использовании трансформированных бактерий, устойчивых к антибиотику, при том, что антибиотики наносятся вместе с трансформированными бактериями. Другое преимущество может обеспечиваться использованием продуктов, разрушающих биопленку на слизистой оболочке. К таким продуктам относятся ДНКаза, пептидазы и гиалуронидазы. Предпочтительными слизистыми оболочками являются оболочки следующих органов: носоглотки, ротоглотки, пищевода, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки, влагалища и пениса. Трансформированные бактерии наносят на слизистые оболочки в виде жидких растворов, пены, суппозиториев, губки или капсул. В случае слизистой оболочки влагалища, бактерии должны быть трансформированы таким обра- 3 зом, чтобы связывать передающиеся половым путем патогены, например, HIV, HPV, HSV, возбудителей гонореи, сифилиса и хламидий. Вместе с бактериями могут вводиться небактерицидные спермициды. Изобретение также относится к способу предотвращения передачи вирусных патогенов от инфицированного индивидуума к другим людям. Для этого трансформированные бактерии вводят в количестве, достаточном для колонизации слизистых оболочек инфицированного индивидуума, причем бактерии связывают и инактивируют инфекционные вирусные частицы, присутствующие в организме хозяина. Модификации и возможные мишени описаны ниже. Трансформация бактерий может осуществляться in vitro или in vivo, когда резидентную бактериальную флору слизистых оболочек хозяина трансформируют желаемым гетерологичным генетическим материалом при непосредственном введении в резидентные бактерии генетического вектора, например, вектора, сообщающего бактериям способность связывать и инактивировать вирусные патогены и, тем самым, способность защищать хозяина от инфекции вирусными патогенами. Примером подобных векторов могут служить дефектные по репликации бактериофаги. В объем изобретения также включен способ инактивации инфекционных вирусных частиц в источниках водоснабжения, подозреваемых на инфицирование, путем добавления трансформированных бактерий, способных связывать и необратимо инактивировать специфические вирусы. Настоящее изобретение помимо способов относится также и к композициям, в состав которых входят бактерии, отобранные по способности колонизировать слизистые оболочки хозяина и экспрессирующие на своей поверхности хозяйский рецептор или антитело, направленное против вируса-мишени. Количество трансформированных бактерий достаточно для связывания и инактивации вируса-мишени. Предпочтительные композиции для различных способов приведены ниже. Краткое описание рисунка Фиг.1 иллюстрирует концепцию ViroShield TM. Вирусы обычно проникают в организм хозяина, связываясь со специфическими рецепторами, экспрессированными на поверхности клеток хозяина. Экспрессия данных рецепторов на поверхности бактерий, населяющих слизистые оболочки, будет приводить к связыванию большей части вирусов с бактериями, а не с клеточными рецепторами. Функционально инактивированные бактериями вирусы неспособны инфицировать лежащие более глубоко клетки хозяина. 000576 4 Подробное описание А. Введение. Большинство вирусов инфицирует организм хозяина, проникая через слизистые оболочки. Подробный обзор этой проблемы можно найти у Murray, P.R., et al., Medical Microbiology, 2nd Edition, (далее как Murray et al.,1994). Создание вирусблокирующей бактериальной флоры на слизистых оболочках путем колонизации их трансформированными бактериями, способными связывать и инактивировать вирус, может иметь особенные преимущества. Колонизация слизистых оболочек - это рутинный процесс. Большинство слизистых оболочек обычно изобилует бактериями, и изменения флоры, сопровождающие инфекцию патогенными бактериями и введение антибиотиков, являются нормальными. Главное преимущество настоящего изобретения базируется именно на рутинной природе изменения микрофлоры слизистых оболочек. Из последующего описания станут ясны способы усиления способности трансформированных бактерий колонизировать слизистые оболочки. Б. Общие методы. Методы амплификации генетических последовательностей при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР), вырезание и встраивание ДНК в плазмиды, трансформация бактерий плазмидами, тестирование связывания антител являются хорошо известными биотехнологическими методами и могут быть найдены в ряде изданий, включая Protocols in Molecular Biology, Molecular Biology of the Cell и Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989. В. Вирусные мишени. Далее приведен список вирусных мишеней. Они разделены на категории в зависимости от пути попадания в организм. 1. Верхние дыхательные пути. Большинство вирусов инфицируют носоглотку или ротоглотку путем прямого контакта или капельным путем. Эти вирусы включают риновирусы (HRV), аденовирус, вирус Коксаки, гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус (RSV), вирус Эпштейна-Барр (EBV) и цитомегаловирус (CMV). 2. Пищеварительный тракт. К вирусам, инфицирующим пищеварительный тракт, относятся ротавирус, агент Норуолк, вирус гепатита А, полиовирус и другие пикорнавирусы. 3. Половые пути. Вирус иммунодефицита человека (HIV), папилломавирус человека (HPV), вирус простого герпеса второго типа (HSV), цитомегаловирус (CMV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV). Г. Вирусные рецепторы. 5 Для репликации вирус должен проникнуть в клетку-хозяина. Для этого необходимо наличие поверхностных рецепторов на клеткехозяине (Murray et al.,1994). В частности, вирус сначала должен связаться со специфической молекулой на поверхности клетки-мишени. В последние годы были идентифицированы рецепторы для многих вирусов. Приведенный ниже перечень не ограничивает объем настоящего изобретения. 1. Риновирус человека (HRV), основная группа -> ICAM-1, домены 1 и 2 (Lineberger, D.W. et al., Virus Research, 24 (2):173-186, 1992). 2. Вирус гриппа -> сиаловая кислота. 3. Вирус иммунодефицита человека (HIV) -> CD4, домены 1 и 2. 4. Полиовирус ->PVR (рецептор полиовируса, белок суперсемейства иммуноглобулинов). 5. Вирус Эпштейна-Барр (EBV) -> CD21 (рецептор комплемента 2, рецептор C3d). 6. Вирус простого герпеса (HSV) -> гепаринсульфат. 7. Вирус гепатита В (HBV) -> рецептор IgA. 8. Аденовирус -> рецептор витронектина. Д. Слизистые оболочки в норме колонизированы бактериальной флорой (Murray et al., 1994). Верхние дыхательные пути состоят из носоглотки, ротоглотки (ротовая полость и гортань), параназальных синусов и среднего уха. Параназальные синусы и среднее ухо в норме стерильны. Однако многослойный чешуйчатый эпителий носоглотки и ротоглотки изобилует различной бактериальной флорой. Микрофлора носа состоит в основном из отрицательных по коагулазе стафилококков с небольшим количеством дифтероидов (аэробных и анаэробных) и негемолитических стрептококков. Наиболее многочисленными представителями флоры рта и глотки являются альфа-стрептококки. Обнаруживаются также грамотрицательные анаэробы (в чacтности, бактероиды) и другие кокки. Для толстой кишки характерна наиболее многочисленная популяция бактерий по сравнению со всеми другими слизистыми оболочками организма человека. Считается, что у здорового индивидуума на грамм содержимого толстой кишки приходится более 10 в 11-й степени бактерий, представленных более 400-ми видами. Анаэробные бактерии количественно превосходят аэробных в 100 - 1000 раз. Преобладающим родом являются Bacteroides. Также многочисленны Bifidobacterium, Enterobacteriacea, Streptococci и Lactobacilli. Тонкий кишечник имеет примерно такую же микрофлору, как и толстый, однако в значительно меньшем количестве. Желудок и проксимальный отдел тонкого кишечника почти стерильны, а дистальный отдел тонкого кишечника содержит приблизительно 1/10 бактериального содержимого толстой кишки. 000576 6 Слизистая оболочка влагалища также колонизирована большим числом бактерий. Преобладающими видами нормальной менархиальной вагинальной флоры являются Lactobacilli, составляя у здоровой женщины 100% бактерий. Lactobacilli являются факультативными анаэробами и образуют большое количество молочной кислоты, как конечного продукта ферментации сахара. Это создает кислую среду, которая неприемлема для многих бактериальных штаммов. Ж. ViroShield-TM: предотвращение связывания патогена с клетками хозяина может воспрепятствовать инфекции. Поскольку для заражения вирусом необходимо связывание последнего с рецептором на поверхности клетки-мишени, стратегия, направленная на подавление взаимодействия вируса с рецептором, должна быть эффективна для предотвращения инфекции. Использование бактериального "щита" против вирусных патогенов на слизистой оболочке было обозначено, как ViroShield ТМ (Вирошилд ТМ). Концепцию бактерий ViroShield ТМ можно проиллюстрировать на примере вирусных агентов, вызывающих простуду. Эти вирусные агенты в основном представлены риновирусами основной группы, которые у человека связываются с рецептором ICAM-1. Полученные методами рекомбинантных ДНК растворимые молекулы ICAM-1 оказались эффективны в подавлении связывания HRV чувствительными клетками и предотвращении инфекции (Martin, S.,et al., Antimicrob Agents Chemother., 37(6): 1278-84, 1993; далее как Martin et al.,1993). С одним вирионом HRV может связаться приблизительно 60 молекул ICAM-1 (HooverLitty, H and Greve, J.M., J.Virol, 76(1): 390-7, 1993). Это наблюдение коррелирует с тем фактом, что капсид HRV представляет собой икосаэдрический комплекс, состоящий из 60 копий каждого из вирусных белков оболочки (Smith.T. J., et ql., J.ViroL, 67(3): 1148-58, 1993). При помощи рентгеновской кристаллографии было показано, что в действительности сайт связывания с рецептором представляет собой углубление или "каньон" на поверхности капсида HRV (O1iveira, M.A.,et al., Structure, 1(1): 51-68,1993). Этот каньон слишком мал по размеру, чтобы в него могли попасть молекулы антител, и это является одним из объяснений того факта, что люди чувствительны к повторным заражениям HRV, поскольку вирус устойчив к связыванию антител в этом ключевом сайте нейтрализации. После связывания с ICAM-1 в капсиде индуцируются конформационные изменения, приводящие к проникновению вирусной РНК внутрь клетки-хозяина (Martin et al.,1993). Растворимые молекулы ICAM-1 относительно неэффективны при индукции конформационных изменений капсида и, тем самым, при функциональной инактивации вирионов (Martin et al., 1993; Crump, С.Е., et al., Antimicrob Agents Che- 7 mother., 38(6): 1425-7, 1994; далее как Crump et al.,1994); однако данным эффектом обладают химерные молекулы, состоящие из HRVсвязывающих доменов (1 и 2) ICAM-1 и константных областей молекул иммуноголобулинов (IgA, IgG или IgM). Этот эффект обусловлен способностью химерных молекул димеризоваться (IgA и IgG) или полимеризоваться (IgM) путем сборки иммуноглобулиновых доменов. Мультимерные рецепторы наиболее близко напоминают естественные структуры на клеточной поверхности, где несколько иммобилизованных рецепторов, связываясь с вирионом, способны индуцировать конформационные изменения капсида, приводящие к высвобождению вирусной РНК. Экспрессия ICAM-1 на внешней поверхности бактерий, населяющих слизистые оболочки, является развитием стратегии мультимерных молекул, имеющим ряд ключевых преимуществ. Поскольку бактерия значительно больше, чем вирусная частица, связанный HRV должен оказаться иммобилизованным на бактериальной поверхности. Важное преимущество настоящего изобретения состоит в том, что для эффективной иммобилизации и нейтрализации вириона в связывании должны участвовать всего несколько рецепторов ICAM-1. В случае использования растворимых молекул ICAM-1 они, повидимому, для полной нейтрализации единственного вириона должны связаться со всеми 60 сайтами связывания. Кроме того, молекулы ICAM-1 на бактериальной поверхности эффективно индуцируют конформационные изменения, поскольку одновременное связывание нескольких молекул ICAM-1, иммобилизованных на поверхности бактерии, с несколькими поверхностными участками вирусного капсида изменяет геометрию последнего и должно приводить к конформационным изменениям и преждевременному высвобождению вирусной РНК. Попавшая в бактериальную клетку вирусная РНК быстро деградирует под действием избыточных нуклеаз, находящихся в бактериальной цитоплазме. Это ведет к необратимой инактивации вирусных частиц, что является важным преимуществом настоящего изобретения, поскольку само по себе связывание является обратимым процессом и соединение растворимых молекул ICAM-1, химерных молекул или других структур с HRV без функциональной инактивации будет оставлять значительную часть вирусных частиц свободными для связывания с клеткой-хозяином в любой момент времени. При использовании стратегии ViroShield TM каждая бактерия способна необратимо инактивировать большое число вирусных частиц, что создает уверенность в элиминации значительной доли любого вирусного инокулята прежде, чем вирус сможет инфицировать лежащие более глубоко клетки хозяина. 000576 8 Аналогично, показана эффективность растворимых молекул CD4 в связывании HIV и предотвращении инфекции клеток-мишеней in vitro (Orloff, S.L., et al., J. Virol, 67(3)146171,1993). Однако результаты клинических испытаний по внутривенному введению растворимых молекул CD4 разочаровали исследователей (Moore, J.P. et al., Aids. Res. Hum. Retroviruses, 9 (6): 529-39, 1993). Это было обусловлено не тем, что полевые изоляты HIV обладают меньшей связывающей аффинностью к растворимым CD4 в сравнении с лабораторными штаммами вируса, а тем, что полевые изоляты HIV слабее инактивировались после связывания с растворимыми CD4 Ashkenazi, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7056-7060. 1991; Turner, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(4): 13359, 1992). Экспрессия CD4 на бактериальных поверхностях должна облегчать необратимую инактивацию всех штаммов HIV. В частности, экспрессия CD4 на поверхности Lactobacilli, населяющего вагинальную слизистую оболочку, должна быть эффективна при предотвращении заражения HIV при вагинальном половом акте. Аналогично трансформированные E.coli будут эффективно препятствовать передаче HIV при ректальном половом акте. Необходимо учитывать разницу между инфицированием и клиническими проявлениями заболевания. Для любого патогена имеется минимальная инокулирующая доза, необходимая для развития клинических симптомов после инфицирования. Следовательно, для успешного предотвращения заболевания не обязательно инактивировать каждую частицу, содержащуюся в инокуляте вируса, а достаточно снизить число жизнеспособных вирусных частиц ниже минимальной инфекционной дозы. Поскольку стратегия ViroShield TM направлена на предотвращение проникновения вирусного патогена в организм хозяина, она эффективна не только против собственно заболевания, но также и против заражения. Стандартные вакцины не предотвращают проникновения вирусных патогенов в организм хозяина. Это может иметь важное значение, поскольку отдельные вирусы способны индуцировать аутоиммунные процессы у определенных хозяев, несмотря на то, что они могут и не вызывать клинических проявлений инфекции. Возможные применения: Вирус Рецептор Путь попадания HRV ICAM-1 Верх. дых. пути (ВДП) Strept. gordonii или Грипп Аденовирус HIV сиаловая кислота витронектин CD4 ВДП/НДП ВДП Приемлемый бактериальный хозяин Флора ВДП Staph.xylosus Strept. или Staph. слизистая влага- Lactobacillus лища 9 HSV-2 гепарин сульфат слизистая влага- Lactobacillus лища 3. Нейтрализация патогенов "выше" места инфекции. Немногочисленными слизистыми оболочками тела, относительно свободными от бактериальной колонизации, являются слизистые желудка, верхней части тонкого кишечника и нижних дыхательных путей. Некоторые вирусы инфицируют верхние отделы тонкого кишечника и наиболее значимыми из них являются ротавирус и полиовирус (Murray et al.,1994). Поскольку численность бактерий в этих участках невелика, то даже если все бактерии будут экспрессировать рецептор вируса, этого может оказаться недостаточным для полной инактивации дозы вируса, содержащейся в инокуляте. Однако прежде чем попасть в тонкий кишечник, вирусные частицы должны преодолеть ротовую полость и пищевод, обильно колонизированные бактериями. Следовательно, если бактерии, населяющие слизистые оболочки ротоглотки и пищевода, экспрессируют вирусные рецепторы и могут абсорбировать / инактивировать достаточное количество вирусных частиц, то вирусный инокулят, достигший тонкого кишечника, будет значительно менее инфекционен. К вирусам, инфицирующим нижние дыхательные пути, относятся вирус гриппа, парагриппа и респираторно-синцитиальный вирус (Murray et al., 1994). Вирусные частицы, попадающие в дыхательные пути вместе с каплями, будут распределяться в различных количествах на слизистой оболочке в зависимости от физических свойств вириона, капли и потока воздуха. Трансформированные бактерии, помещенные по "ходу вируса" в верхних дыхательных путях, могут абсорбировать / инактивировать достаточное число вирусных частиц, чтобы уменьшить инокулирующую дозу, попадающую в нижние дыхательные пути, ниже необходимого для развития заболевания минимума. И. Предотвращение распространения патогенов и заражения неинфицированных хозяев. Настоящее изобретение также относится к способу предотвращения передачи вируса от инфицированного хозяина. Предотвращение "выхода" патогена из инфицированного хозяина означает предотвращение передачи патогена многим неинфицированным людям, что чрезвычайно важно для здравоохранения. Быстрое распространение патогена может уничтожить целые поселения в странах третьего мира. ViroShield TM может быть успешно применен к уже инфицированным людям для абсорбции / инактивации присутствующих у данного хозяина вирусных частиц. Даже при том, что ViroShield TM не способен предотвратить инфицирование ротавирусом или полиовирусом по указанным выше причинам (раздел Ж), трансформированные бактерии могут абсорбировать / инактиви- 000576 10 ровать вирусные частицы в толстой кишке прежде, чем они попадут в окружающую среду. К. Применение трансформированных бактерий для инактивации вирионов в потенциально зараженных водах. В странах третьего мира вирусы могут быстро передаваться посредством загрязненных источников водоснабжения. Вирусы, передающиеся фекально-оральным путем, такие как ротавирус, могут существовать в низких титрах в питьевой воде деревни после контаминации единственным инфицированным человеком и могут инфицировать многих здоровых людей. Непатогенные бактерии, экспрессирующие рецептор ротавируса, могут быть внесены в подозреваемые на загрязнение вирусами источники водоснабжения и абсорбировать / инактивировать вирусные частицы, при этом попадание таких бактерий в пищеварительный тракт человека не приносит никакого вреда. Подобный подход может быть эффективен и экономически оправдан для быстрого установления контроля над орально передающимися вирусами в странах третьего мира. Л. Источники генов, обеспечивающих вируссвязывающую способность. Способность связывать вирус может быть сообщена бактериям, по меньшей мере, тремя способами. Первый состоит в обеспечении экспрессии на поверхности бактерии нормального хозяйского рецептора вируса, такого, как ICAM-1 для HRV (основной группы) и CD4 для HIV. Это нормальные белки человека и полные последовательности многих из генов, кодирующих эти белки, определены и хранятся в базе данных GeneBank. Преимущество данного подхода состоит в том, что его эффективность не слишком зависит от мутаций вируса. Если вирус мутирует таким образом, что перестает связываться с экспрессируемым бактерией рецептором, он также теряет способность связываться с клеткой-мишенью и перестает быть инфекционным. Второй способ состоит в обеспечении экспресии на поверхности бактерии фрагмента антитела (или любого пептида, способного связываться со специфической мишенью на поверхности вируса), причем антитело направлено против консервативной детерминанты на поверхности вируса, такой как VP4 у полиовируса или gpl20 у HIV. Фрагменты антител (и пептиды) против практически любого антигена могут быть на сегодня выбраны из фаговых библиотек (Marks, J.D., et al., J. Biol.Chem. 267 (23):1600710.1992). При обнаружении подходящего клона можно выделить и использовать ген, кодирующий соответствующий фрагмент антитела. Кроме того, в последнее время показано, что оболочечные вирусы в ходе почкования от клетки-хозяина включают в свою оболочку отдельные белки клетки-хозяина, такие как HLA 11 DR в случае HIV (Arthur, et al., Science, 258 (5090): 1935-1938, (1992)). Таким образом, человеческие молекулы HLA DR являются нормальным компонентом оболочки HIV. Фрагменты антител, специфичных к консервативному эпитопу молекулы HLA DR, могут связывать все изоляты HIV и были бы особенно эффективны в предотвращении передачи HIV от мужчины к женщине. Для этого они должны экспрессироваться на поверхности бактерий слизистой оболочки влагалища, или при возможной передаче HIV при анальном половом акте генетически трансформированные бактерии должны вводиться в прямую кишку. Третий подход к связыванию вирусов бактериями заключается в обеспечении экспрессии определенных углеводов на поверхности бактерий. Многие вирусы для попадания в клетку используют в качестве рецепторов углеводы. Ярким примером служит вирус гриппа, который связывается с сиаловой кислотой. Бактерии могут быть трансформированы таким образом, чтобы синтезировать в своей цитоплазме фермент трансферазу сиаловой кислоты, что будет приводить к появлению у нормальных поверхностных белков дополнительных остатков сиаловой кислоты, и вирус гриппа будет связываться с такими бактериями. Известны и опубликованы полные последовательности генов многих бактериальных трансфераз углеводов. М. Системы для поверхностной экспрессии в бактериях. Экспрессия гетерологичных белков на поверхности бактерий в целом имеет некоторые преимущества в сравнении с экспрессией нормальных поверхностных белков бактерий. Известно, что определенные последовательности белка "направляют" его на "экспорт" из бактериальной цитоплазмы, а другие способствуют "заякориванию" белка на клеточной мембране. Созданы гибридные белки, в которых последовательность гетерологичного белка заменяет экспонированную часть нормального поверхностного белка, оставляя незатронутыми сигнальные последовательности, определяющие локализацию белка. Некоторые белки внешних мембран были использованы в качестве нацеливающих векторов для локализации гетерологичных белков, включая внешний мембранный белок E.coli мальтопорин (LamB), пилиновые белки E.coli K88ac и K88ad, внешние мембранные порины E.coli PhoE, OmpA и OmpC, флагеллин и липопротеин TraT S.typhymurium (патент США № 5,348,867). Более подробное обсуждение поверхностной экспрессии белков у грамотрицательных бактерий можно найти в патенте США № 5,348,867, а для грамположительных в заявке РСТ WO 93/18163. 1. Конструирование векторов. Плазмидами называют кольцевые ДНК, обычно обнаруживаемые в бактериях. Они реп- 000576 12 лицируются независимо от хозяйского бактериального генома, поскольку имеют собственный сайт начала репликации (ori). Встроенные в плазмиду гены эффективно транскрибируются, если они помещены "ниже" (downstream) соответствующих промоторных последовательностей. Существуют определенные промоторные последовательности, регулируемые внешними факторами, такими как молекулы IPTG. Многочисленные плазмиды были оптимизированы для индивидуальных штаммов бактерий-хозяев, в основном E.coli. Сконструированы плазмиды для поверхностной экспрессии гетерологичных белков в E.coli (например, pTX101, описанная в патенте США № 5,348,867), Streptococcus gordonii (система трансформации pVMB20-GP232, описанная в заявке PCT/US 93/02355) и другие. В обоих системах имеются сигнальные последовательности, направляющие полипептид на поверхность клетки, сайт встраивания нужного гетерологичного гена и ген устойчивости к антибиотику, обеспечивающий селекцию трансформированных бактерий. К другим подходящим стрептококкам относятся молочные стрептококки, которые широко использовались в опытах по трансформации (De Vos, FEMS Microbiology Reviews, 46:281-295 (1987)). После выбора соответствующей векторной плазмиды и приемлемого бактериального хозяина плазмиду расщепляют соответствующими ферментами рестрикции и получают сайт клонирования. Затем в плазмиду лигируют нужный гетерологичный ген. 2. Трансформация бактериальных клеток. В зависимости от конкретного патогена, гетерологичного белка (или другой молекулы), типа слизистой оболочки и выбранной плазмиды отбирают соответствующий штамм бактерий-хозяев. Бактериальный хозяин должен быть компетентным по трансформации, что достигается применением стандартных методов, например рубидий-хлоридного. После трансформации рекомбинантной плазмидой, содержащей нужный гетерологичный ген, бактерий выращивают на соответствующей среде (например, среда LB с 2,0% глюкозы). Трансформированных бактерий отбирают, добавляя в среду антибиотик, ген устойчивости к которому несет плазмида, так что выживают только трансформированные бактерии. 3. Демонстрация экспрессии нужной гетерологичной молекулы на поверхности бактерий. Экспрессия гетерологичного гена может быть конститутивной или индуцируемой путем стимуляции соответствующего промотора, например при помощи IPTG. Поверхностная экспрессия гетерологичной молекулы может быть продемонстрирована окрашиванием бактерий антителами, полученными против желаемой молекулы и меченными флуоресцентной меткой. Кроме того, связывание патогена-мишени с трансформированными бактериями может быть 13 показано следующим способом: трансформированные бактерии фиксируют на стекле, инкубируют с патогеном-мишенью, а затем окрашивают флуоресцентными антителами против патогена-мишени (например, красными) и против трансформированных бактерий (например, зелеными). Видно, что патоген-мишень (красный) тесно связан с трансформированными бактериями (зелеными). Н. Необратимая инактивация связанных вирусов. Для обеспечения инактивации вируса после связывания с трансформированной бактерией, процесс связывания должен инициировать последующее высвобождение вирусного генетического материала. Тогда бактериальные нуклеазы смогут разрушить вирусный генетический материал, и тем самым необратимо инактивировать вирус. Многие вирусы, такие как HRV, высвобождают свой генетический материал после связывания с иммобилизованным рецептором на поверхности клетки-мишени посредством конформационного изменения вирусного капсида (Martin et al.,1993). Подобная ситуация может быть успешно смоделирована путем экспрессии рецептора на поверхности бактерий. Некоторые вирусы, например HIV и вирус гриппа, имеют в составе поверхностных белков домен слияния, который облегчает высвобождение генетического материала после связывания (Murray et al.,1994). Разработаны различные механизмы для обеспечения высвобождения генетического материала и необратимой инактивации отдельных вирусов, используемые при получении трансформированных бактерий. О. Успешная колонизация трансформированными бактериями. Хорошо известна колонизация слизистых оболочек нетрансформированными бактериями. Оптимальным является совместное применение антибиотиков и устойчивых к ним бактерий (Freter, R., et al., Infection and Immunity, 39(2): 686-703, 1983). В нормальных условиях колонизация исчезает в течение 1-2 недель после отмены антибиотика по мере восстановления резидентной микрофлоры (Bennet, et al., 1992). Предлагаются следующие три способа усиления колонизации. Первый способ состоит в повторяющемся отборе быстро колонизирующих бактерий на слизистых оболочках животных или человека. Например, можно наносить бактериальный штамм дикого типа на слизистую оболочку, повторно выделять и культивировать бактерии in vitro, возвращая их после каждого этапа на слизистую поверхность. Неизбежно будут получены бактерии с усиленной колонизующей способностью. Второй способ состоит в получении рекомбинантных бактерий, экспрессирующих на своей поверхности слитые белки, состоящие из вируссвязывающего домена и "хозяинсвязы- 000576 14 вающего" домена. Последний позволяет бактериям связываться с высокой аффинностью с определенными детерминантами (белковыми или углеводными) на выбранной слизистой оболочке, сообщая таким образом трансформированным бактериям некоторое селективное преимущество над резидентной микрофлорой. Дополнительным преимуществом данного подхода является продолжающаяся коэкспрессия вируссвязывающего домена, экспрессия которого сама по себе в противном случае довольно быстро прекращается, поскольку она не сообщает бактериям значительного селективного превосходства. Третий способ состоит в индукции экспрессии вируссвязывающего белка у резидентной микрофлоры путем введения соответствующего гена посредством бактериофага. Бактериофаги успешно используются для введения генетического материала в бактерии. Для различных бактерий разработаны многочисленные бактериофагальные векторы. Повидимому, одним из наиболее подходящих для слизистой оболочки влагалища штаммом является Lactobacillus; имеются также бактериофагальные векторы, оптимизированные для Lactobacillus. Для Lactobacillus gasseri недавно был разработан бактериофагальный вектор на основе умеренного фага фи-adh (Raya. R.R., et al., J. Bacteriology, 174(17): 5584-5592, 1992; Fremaux, C.,et al., Gene, 125:61-66, 1993). Данный вектор обладает способностью сайт-специфической интеграции в хозяйскую хромосому по определенным фаговому (attP) и бактериальному (attB) сайтам. Кроме того, слитый ген может быть помещен в вектор под контролем сильного промотора, оптимизированного для Lactobacillus вместе с "суицидным" геном под контролем индуцибельного промотора. Для облегчения колонизации в инокулят бактерий могут быть добавлены определенные агенты. На слизистой оболочке многие бактерии секретируют капсульные вещества, которые при коагуляции образуют биопленку, покрывающую всю слизистую оболочку. Может оказаться полезным добавлять фермент, разрушающий эту биопленку, для облегчения проникновения трансформированных бактерий в биопленку и последующей колонизации. Эти ферменты включают ДНказы, пептидазы, коллагеназы, гиалуронидазы и другие ферменты, разрушающие углеводы. Могут быть добавлены также и антибиотики (к которым устойчивы тренсформированные бактерии) для снижения числа резидентных бактерий на слизистой оболочке и создания жизненного пространства для трансформированных бактерий. П. Постоянная экспрессия гетерологичного белка. Как указывалось выше, теоретически экспрессия чужеродного гена, который не нужен бактерии, со временем должна снижаться, а чу- 15 жеродный ген должен утрачиваться (Cardenas, L. and Clements, J.D., Vaccine, 11(2): 126-135, 1993). Для усиления постоянной экспрессии конструкта, содержащего ген гетерологичного белка, для бактерии может быть создан побудительный мотив экспрессировать данный ген. Один из способов описан выше: создание слитого белка с вируссвязывающим и "хозяинсвязывающим" доменами так, что "хозяинсвязывающая" способность будет сообщать селективное преимущество бактериям и обеспечит постоянную экспрессию слитых белков. Другой подход может состоять в создании внутренней потребности в гетерологичном белке таким образом, что трансформированные бактерии, переставшие экспрессировать белок, погибают. Р. Векторы для доставки / система дозирования. Доставка трансформированных бактерий на нужную слизистую оболочку определяется доступностью оболочки и рядом конкретных условий. Для доставки в носоглотку и ротоглотку бактерии можно поместить в физиологический раствор, а для доставки на слизистые оболочки влагалища и прямой кишки - в пену. Менее доступные слизистые облочки, например пищевода и трахеи, могут потребовать более вязких компонентов, таких как глицерин или сахар, которые облегчат колонизацию поверхности по мере продвижения бактерий по соответствующим органам. Необходимым условием колонизации жизнеспособными бактериями тонкого и толстого кишечника является их устойчивость к кислой среде желудка, гидролитическим ферментам поджелудочной железы и антимикробному действию желчи. Были предложены защитные капсулы для предотвращения инактивации бактерий по ходу их продвижения в верхних отделах пищеварительного тракта (Henriksson, A.,et al., Appl. Environ. Microbiol. 57(2): 499-502, 1991, далее как Henriksson, et al., 1991). Показано, что некоторые штаммы флоры толстого кишечника естественно устойчивы к воздействию перечисленных факторов и потому пригодны для колонизации пищеварительного тракта. Бактерии самореплицируются, поэтому, теоретически, если трансформированные бактерии успешно колонизируют слизистую оболочку, они могут персистировать неограниченно долго. Однако, многочисленные факторы препятствуют неограниченному выживанию трансформированных бактерий на данной слизистой оболочке. Главным из этих факторов является жесткая конкуренция за пространство с другими многочисленными бактериями. Поэтому считается, что нанесение трансформированных бактерий на слизистую оболочку должно повторяться на регулярной основе, достаточно легко определить интервалы, через которые это целесообразно делать. Очевидно, частота нанесения зависит от конкретной слизистой оболочки и 000576 16 штамма бактерий. Его можно проводить ежедневно или один раз в 2-4 недели. Оральное введение 10 в 8-ой - 10 в 11-ой степени жизнеспособных бактерий приводит к временной колонизации слизистой толстого кишечника (Henriksson, et al.,1991). Предполагается, что колонизация слизистых влагалища и верхних дыхательных путей потребует меньшего количества, около 10 в 6-ой степени жизнеспособных бактерий, поскольку эти поверхности более доступны и лишены многих неблагоприятных условий верхних отделов пищеварительного тракта, в частности воздействия кислоты. Для доставки генов прямо в бактерии, изначально присутствующие на данной слизистой оболочке (резидентные бактерии), в качестве вектора может быть использован бактериофаг, который специфически инфицирует определенные бактерии. Бактериофаги - это вирусы, инфицирующие бактерий. Примерами могут служить бактериофаги Лямбда, М13 и Т7, инфицирующие Escherichia coli, и фаг фи-adh, инфицирующий Lactobacillus gasseri. Нуклеиновые кислоты отдельных бактериофагов могут быть подвергнуты манипуляциям для замены генов поверхностных белков бактериофага гетерологичными генами; при этом фаг становится дефектным по репликации. Добавление таких рекомбинантных ДНК к клеточным лизатам, содержащим функциональные бактериофагальные белки, будет приводить к сборке функциональных фаговых частиц, несущих гетерологичные гены. Подобные дефектные по репликации частицы бактериофага могут быть нанесены на нужную слизистую оболочку и они способны инфицировать определенные резидентные бактерии. Обычная доза должна составлять от 10 в 8-ой до 10 в 12-ой степени бляшкообразующих единиц/мл. Количество раствора для обработки поверхности должно быть равно 0,1 - 1,0 мл на квадратный сантиметр слизистой оболочки. Способы введения в случае бактериофагов аналогичны описанным выше для бактерий. С. Ситуации, в которых настоящее изобретение наиболее применимо. 1. Для предотвращения заражения вирусами, против которых в настоящее время не существует эффективных вакцин: HIV, HPV, HSV, вирус гепатита А, вирус краснухи, ротавирусы и т.д. 2. Для защиты поголовья скота от патогенных вирусных инфекций. 3. В странах третьего мира, где вакцинация может быть затруднена и ненадежна; ViroShield TM против ротавирусов был бы особенно полезен в таких ситуациях. Кроме того, системой ViroShield TM могут воспользоваться: 4. Любой индивидуум, желающий минимизировать риск заражения вирусом гриппа и вирусами верхних дыхательных путей, в особенности те люди, которые часто путешествуют, 17 работают в публичных местах (служащие здравоохранения, школьные учителя и т.д.), имеют маленьких детей, и те, кто хочет снизить риск заболевания ввиду каких-либо важных событий. 5. Индивидуумы с подавленным иммунитетом, поскольку ViroShield TM обеспечивает дополнительный уровень защиты слизистых оболочек и его эффективность не зависит от нормального функционирования иммунной системы. 6. Индивидуумы с аллергическими реакциями на отдельные компоненты вакцинных препаратов, такие как яичный белок в вакцине против гриппа. 7. Индивидуумы, путешествующие в страны третьего мира, для которых характерны эндемичные вирусы, такие как гепатит А и полиовирус. 8. Индивидуумы с повышенным риском заболеваний, передающихся половым путем. Т. Определения. Бактерии: маленькие одноклеточные прокариотические организмы, классифицируемые как низшие протисты. Они могут встречаться у человека, животных, растений и других организмов как симбионты, паразиты или патогены. Большинство слизистых оболочек человека и животных обильно колонизированы широким разнообразными бактериями, которые выполняют ряд полезных для хозяина функций. Биопленка: сложное сочетание различных бактерий и материалов внеклеточного матрикса, секретируемых бактериями, которое становится непрерывным и подобно пленке покрывает многие слизистые поверхности. Колонизация: применительно к бактериальной флоре, состояние, в котором бактерии находятся на слизистой оболочке, не нанося вреда хозяину. Время колонизации может быть от 2 дней до постоянного, но обычно составляет от 1 недели до 1 месяца. Консервативная детерминанта: часть белка, которая является общей для многих его вариантов. Данное понятие важно применительно к вирусам, поскольку часто встречаются многочисленные штаммы одного вируса, которые характеризуются небольшими различиями в вирусных белках. Консервативная детерминанта вирусного белка представляет собой эпитоп, общий для всех штаммов вируса. Заболевание: применительно к вирусной инфекции, состояние, при котором хозяин страдает от повреждающих последствий вирусной инфекции, как немедленных (например, лихорадка, озноб, боли и т.д.), так и долгосрочных (например, хронический гепатит и гепатоцеллюлярная карцинома в случае хронической инфекции вирусом гепатита В и С и рак шейки матки при хронической инфекции HPV). Слияние: в контексте данного описания подразумевает объединение двух мембран та- 000576 18 ким образом, что содержимое двух структур объединяется в одно целое. Генетический материал: обычно ДНК, содержащая, по меньшей мере, один ген и регуляторные элементы, влияющие на экспрессию данного гена. Хозяйский рецептор: молекула на поверхности клетки-хозяина (клетки-мишени), к которой прикрепляется вирус для того, чтобы проникнуть внутрь клетки-хозяина. Хозяева: под хозяевами понимаются животные и человек. Одним из применений данного изобретения является защита поголовья животных, включая млекопитающих и птиц. Инактивация: процесс, приводящий к неспособности инфекционного агента инфицировать хозяина. Слизистая поверхность (оболочка): эпителиальная мембрана, выстилающая внутренние поверхности тела, включая респираторный тракт, желудочно-кишечный тракт и мочеполовой тракт. Рецепторы: применительно к вирусным рецепторам, нативный белок и функциональные домены, обладающие специфическими связывающими свойствами, которые и делают данный белок рецептором для связывания вируса. Отобранные по способности колонизировать слизистую оболочку: применительно к бактериям, означает те бактерии, которые отобраны в условиях селективного давления или путем генетической трансформации по признаку усиленной способности колонизировать слизистые оболочки. Эту способность оценивают или по абсолютному числу бактерий, или по времени колонизации. Указанная способность должна быть, по меньшей мере, в два раза выше в сравнении с колонизирующей способностью бактерий дикого типа. Селективное преимущество: определенные свойства, которые обеспечивают лучшую выживаемость бактерий в специфическом окружении; тем самым, в сравнении с другими бактериями, не обладающими селективным преимуществом, первые эффективнее выживают и размножаются в данном окружении. Трансформация: применительно к бактериям, введение чужеродного генетического материала в бактерии с целью экспрессии в указанных бактериях чужеродного гена (генов). Вирусная инфекция: проникновение вируса в организм хозяина или в клетку-хозяина. Это не обязательно предполагает повреждающие последствия, неблагоприятные для хозяина, и потому вирусную инфекцию необходимо отличать от клинического заболевания. Это важно для понимания концепции ViroShield TM, поскольку ViroShield TM обеспечивает способ предотвращения инфекции, а стандартные вакцины по сути не предотвращают ее, но могут предотвратить заболевание. 19 Вирус: инфекционный агент, состоящий из белков и генетического материала, ДНК или РНК, которые организованы определенным образом и иногда окружены оболочкой. Вирус обычно меньше бактерии и является облигатным внутриклеточным паразитом на генетическом уровне; для синтеза вирусных продуктов, кодируемых вирусной нуклеиновой кислотой, используются механизмы клетки. Вирусы подразделяют на 5 классов в зависимости от типа нуклеиновой кислоты (однонитчатая ДНК, двунитчатая ДНК, двунитчатая РНК, +нить РНК, -нить РНК), к шестому классу относятся вирусы, способные к обратной транскрипции +РНК в ДНК (ретровирусы, например HIV). Все публикации и заявки на патенты, цитированные в данном описании, приведены в качестве ссылок. Примеры Примеры приведены здесь в качестве иллюстрации и не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения. Квалифицированный специалист легко идентифицирует некритические параметры, которые могут быть изменены или модифицированы с получением практически сходных результатов. А. Следующие примеры описывают экспрессию ICAM-1. у рецептора для HRV основной группы на поверхности Staphylococcus aureus и нейтрализацию риновируса человека. 1. Экспрессия домена ICAM-1 на поверхности S.aureus с использованием плазмиды pSEBsp-X (Olaf Schneewind, UCLA). Домены 1 и 2 ICAM-1 (минимальный рецептор для HRV основной группы) экспрессируют на поверхности S. aureus путем конструирования слитого белка с 274-аминокислотным трансмембранным сигнальным фрагментом белка A Staphylococcus. Фрагмент ДНК, кодирующий домены 1 и 2 ICAM-1, амплифицируют полимеразной цепной реакцией (ПЦР) из плазмиды CD1.8 (Т.A. Springer, Harvard Blood Center), которая содержит полноразмерную кДНК ICAM-1 человека. Праймеры для ПЦР конструируют таким образом, чтобы ввести в рамку считывания сайт рестрикции KpnI на 5'-конце и сайт рестрикции HindIII на 3'-конце аминокислот 1-188, фланкирующих ICAM-1. Длина предполагаемого продукта составляла 597 пар оснований. Последовательности праймеров приведены ниже: 5'-праймер: TCG GTA CCT GCC CAG АСА ТСТ GTG ТСС ССС ТС 3'-праймер: GAC AAG CTT TGG GGG AGT CGC TGG CAG GAC Используют стандартные условия ПЦР (94°С-1', 65°С-1', 72°C-1', 30 циклов). По завершении ПЦР аликвоту продуктов ПЦР подвергают электрофорезу в 1,5% геле агарозы и выявляют успешную амплификацию фрагмента приблизительно в 600 пар оснований. Оставшиеся продукты ПЦР лигируют в вектор клонирования 000576 20 с использованием набора для клонирования ТА (InVitrogen). Отбирают белые колонии (содержащие вставку), подращивают в жидких культурах и содержащиеся в них плазмиды выделяют с использованием наборов Qiagen. Данные плазмиды подвергают рестрикции KpnI, HindIII, KpnI/HindIII и EcoRI, чтобы показать успешное клонирование вставки ICAM-1 длиной около 600 пар оснований в соответствующие сайты рестрикции. Плазмида pSEBsp-Х содержит последовательности стафилококкового энтеротоксина В (SEB), сигнального пептида SEB, сигнальной пептидазы, трансмембранного домена стафилококкового белка A (SPA) и сортазы. Нужный ген (фланкированный сайтами рестрикции KpnIHindIII) встраивают между сигнальной пептидазой и трансмембранной частью SPA с образованием слитого белка, что обеспечивает поверхностную экспрессию нужного гена. Плазмида также содержит последовательности начала репликации (ori) для S.aureus и E.coli, ген устойчивости к ампициллину, функциональный в S.aureus, и ген устойчивости к хлорамфениколу, функциональный в E.coli. Вектор линеаризуют рестрикцией по сайтам KpnI и BamHI. Линеаризованный вектор выделяют, разделяют продукты рестрикции в 1% геле агарозы, вырезая полосу размером 7 килобаз и элюируя фрагменты ДНК при помощи набора GeneClean. Для того чтобы убедиться в правильном складывании доменов ICAM-1, был введен длинный трансмембранный фрагмент SPA. Длинный трансмембранный сигнальный фрагмент SPA вырезают из вектора pSEBsp-Fab CWS250-524 рестрикцией EcoRI и KpnI. Продукты рестрикции разделяют электрофорезом в 1,5% геле агарозы и вырезают полосу, соответствующую фрагменту около 0,9 килобаз. Фрагменты ДНК выделяют из полос геля при помощи набора GeneClean. Линеаризованный вектор, трансмембранный фрагмент и вставку ICAM-1 лигируют вместе при молярном соотношении 1:1:1. Лигирование проводят в течение ночи при комнатной температуре, а затем продукт лигирования вводят электропорацией в компетентные клетки DH5-альфа (E.coli). Поскольку вектор содержит ген устойчивости к ампициллину, функциональный в E.coli, трансформированные колонии отбирают на чашках с ампициллином. Из отдельных колоний приготавливают минипрепараты плазмид и подвергают их рестрикции KpnI, HindIII, BamHI и KpnI/BamHI, пока не обнаруживают колонии, содержащие нужную вставку. Колонии бактерий, содержащих продукт лигирования, подращивают в жидких культурах и выделяют плазмиды с помощью набора Qiagen maxi-prep. 21 000576 2. Нейтрализация инфицирования HRV фибробластов легкого человека (MRC-5) in vitro при помощи трансформированных бактерий. Инфицирование клеток MRC-5 риновирусом (HRV) может быть легко обнаружена по цитопатическому эффекту. Образцы HRV получают из Американской коллекции культур клеток (АТСС); путем серийных разведений определяют разведение 1:1000, которое на 4-й день вызывает 50%-ный цитопатический эффект. Бактерии OS2, экспрессирующие pSEBspICAM, выращивают до оптической плотности OD 660 = 1,0. 1 мл бактерий смешивают с 20 мкл исходного препарата HRV, разведенного 1:10 (эффективное разведение 1:500). После 1 ч покачивания при комнатной температуре бактерии осаждают центрифугированием (1000 об/мин), супернатант фильтруют через мембрану с размером пор 0,22 мкм и разводят 1:2 (конечное разведение 1:1000). К каждой пробирке с клетками MRC-5 добавляют по 0,25 мл разведенного супернатанта. Ростовую среду заменяют через 24 ч и затем ежедневно оценивают развитие инфекции по цитопатическому действию вируса на клетки (его выражают от "-" до "4+") под световым микроскопом. Дни OS2 OS2/pSEBsp-ICAM OS2/pSEB-X HRV (1:1000) MRC-5 (без HRV) 1 - 2 - 3 1+ 1+ 1+ - 4 2+ 2+ 2+ - 5 4+ 3+ 3+ - 6 4+ 4+ 4+ - 7 4+ 4+ 4+ - Таким образом, бактерии OS2, экспрессирующие pSEBsp-ICAM, успешно нейтрализуют действие HRV in vitro. Б. Следующие примеры демонстрируют экспрессию рецептора HRV основной группы ICAM-1 на поверхности Escherichia coli. 1. Экспрессия домена ICAM-1 на поверхности E.coli с использованием плазмиды рТХ101. Домены 1 и 2 (минимальный рецептор для HIV основной группы) экспрессируют на поверхности E.coli путем конструирования слитого белка с аминокислотами 1-9 нормального поверхностного белка Lpp и аминокислотами 46-159 белка ОmрА с использованием системы, описанной в патенте США № 5,348,867. Фрагмент ДНК, кодирующий домены 1 и 2 ICAM-1, амплифицируют в ПЦР с праймерами, сконструированными таким образом, чтобы ввести в рамку считывания сайты рестрикции EcoRI, фланкирующие остатки 1-168 ICAM-1. Как описано в патенте США № 5,348,867, плазмида pXT101 содержит ген бета-лактамазы, сплайсированный по сайту EcoRI, который удаляется рестрикцией EcoRI с последующим разделением линеаризованной плазмиды и гена бета-лактамазы электрофорезом в геле агарозы. Фрагмент гена ICAM-1, амплифицированный в ПЦР, лигируют в очищенную плазмиду. Клет- 22 кам E.coli штамма JM109 придают компетентность рубидий-хлоридным методом и трансформируют путем электропорации конструктом рХТ 101-1 САМ. Конструкт Lpp-OmpA-ICAM находится под контролем сильного промотора Lpp, который индуцируется IPTG (изопропилтиогалактозидом). Таким образом, стимуляция IPTG приводит к высокому уровню экспрессии слитого белка. Трансформированные бактерии выращивают при 24°С, поскольку данная система экспрессии лучше работает при этой температуре (достигается более эффективная поверхностная экспрессия). 2. Подтверждение поверхностной экспрессии ICAM-1 и демонстрация связывания HRV. Для подтверждения правильной экспрессии ICAM-1 на поверхности бактерий применяют иммунофлуоресценцию. Трансформированные бактерии наносят на стекла и фиксируют метанолом. Стекла обрабатывают мышиными моноклональными антителами против ICAM-1, отмывают, а затем проводят реакцию с козьими IgG к антителам мыши, меченными родамином. Флуоресценцию оценивают микроскопически с помощью флуоресцентной системы распознавания изображения MRC-500 Bio-Rad. Для демонстрации связывания HRV трансформированными бактериями, стекла с фиксированными бактериями инкубируют с HRV, тщательно промывают, а затем окрашивают мышиными моноклональными антителами против поверхностного белка HRV. После отмывания стекла обрабатывают козьими IgG к антителам мыши, меченными родамином, и визуализируют, как описано выше. 3. Нейтрализация инфицирования HRV клеток HeLa in vitro при помощи трансформированных бактерий. Ранние этапы заражения клеток HeLa HRV in vitro прослеживают путем обнаружения мРНК HRV в инфицированных клетках HeLa методом Нозерн-блоттинга. Поверх монослоя клеток HeLa, выращиваемых в культуральных флаконах, помещают полупроницаемую мембрану, размер пор которой обеспечивает прохождение HRV, но не бактерий или клеток HeLa. На полупроницаемую мембрану помещают трансформированные или немодифицированные бактерии, затем на бактерии наносят инфекционный HRV и обеспечивают возможность инфицирования подлежащих клеток HeLa. По истечении достаточного для заражения времени (2-6 ч) бактерии и полупроницаемую мембрану удаляют и клетки HeLa тщательно промывают. Клетки лизируют и выделяют тотальную РНК для Нозерн-блоттинга, который служит стандартным методом обнаружения мРНК HRV. Именно наличие мРНК HRV является индикатором заражения HRV. 4. Способы получения препаратов трансформированных бактерий в соответствующем 23 носителе (пене, ДНКазе и т.д.) для применения на животных и человеке Для применения на животных трансформированные бактерии вводят в различные носители. Для орошения носоглотки трансформированные бактерии смешивают с физиологическим раствором и наносят в виде спрея. Бактерии добавляют к раствору в концентрации 10 в 6-ой - 10 в 8-ой степени клеток/мл и наносят дважды в день на слизистую оболочку носа в дозе 0,1 мл раствора на квадратный сантиметр поверхности. В. Экспрессия вирусного рецептора на поверхности Streptococcus gordonii. В следующих примерах описана экспрессия ICAM-1 на поверхности грамположительных бактерий, поскольку именно грамположительные бактерии являются основным компонентом флоры носоглотки. Система экспрессии основывается на описанной в заявке PCT/US 93/02355. Приведены примеры для Streptococcus gordonii, но метод легко адаптировать и в отношении других грамположительных бактерий, поскольку общая структура LPXTGX, позволяющая "заякоривать" белки на поверхности, присутствует у всех грамположительных бактерий. 1. Экспрессия ICAM-1 на поверхности Streptococcus gordonii. Используют S.gordonii штамма GP232, описанный Fischetti et al., в WO 93/18163. У данного штамма ген, кодирующий поверхностный белок М6 S.pyogenes (содержит структуру LPXTGX), emm-6.1 и ermC (ген устойчивости к эритромицину), разорван вставкой гена Cat (хлорамфениколацетилтрансферазы), встроенным в хромосому GP232 "ниже" (downstream) сильного хромосомного промотора. GP232 экспрессирует М6 на своей поверхности и чувствителен к эритромицину. Интеграционный вектор pVMB20, сконструированный Fischetti et al., позволяет вводить последовательности гетерологичной ДНК в emm-6.1. PVMB20 содержит функциональный (неразорванный) ген еrmС и представляет собой 6,3-кб плазмиду E.coli, которая не реплицируется в S.gordonii. PVMB20 расщепляют KpnI и HindIII для получения KpnI/HindIII- фрагмента размером 538 пар оснований, при этом структура LPXTGX остается незатронутой. Ген ICAM-1 амплифицируют при помощи ПЦР с праймерами, специально сконструированными так, чтобы получить в рамке KpnI/HindIII вставку, содержащую домены 1 и 2 гена ICAM-1. Вставку лигируют в расщепленный вектор. Анализ нуклеотидной последовательности конструкта pVMB20: ICAM-1 подтвердил правильное (в рамку) встраивание. Плазмиду линеаризуют и используют для трансформации GP232 обычными методами. Гомологичная рекомбинация между 5'-концом гена emm-6.1 и 3'концом гена ermC, представленными на обоих 000576 24 хромосомах PG232, и плазмидой, обеспечивает интеграцию гена ICAM-1 и функционального гена ermC в хромосому GP232. Трансформантов отбирают по устойчивости к эритромицину на среде, содержащей 5 мкг/мл эритромицина. 2. Демонстрация поверхностной экспрессии ICAM-1 и связывания HRV. Как и в примере А2, поверхностную экспрессию ICAM-1 подтверждают при помощи иммунофлуоресценции с использованием антител, специфичных к ICAM-1. Связывание HRV подтверждают так же, как в примере А2. 3. Нейтрализация инфицирования HRV клеток HeLa in vitro при помощи трансформированных бактерий. Нейтрализацию инфицирования HRV клеток HeLa при помощи трансформированных бактерий GP232 показывают так же, как в примере A3. Г. Экспрессия антител на поверхности E.coli. В следующих примерах описана экспрессия на поверхности E.coli фрагмента антитела против консервативной детерминанты молекулы HLA DR. Поскольку оболочка HIV содержит приблизительно 375 копий молекул HLA DR хозяина (Arthur,L.O.,et al., Science, 258 (5090): 1935:8,1992), фрагмент антитела против консервативной детерминанты HLA DR будет связываться со всеми изолятами HIV. Существует фаговая система, обеспечивающая быстрый отбор фрагментов антител, направленных практически против любой мишени (Marks, J.D., et al., J. Biol.Chem, 267 (23):16007-10,1992). Эту систему используют для селекции фрагментов антител, обладающих высокой аффинностью к консервативной детерминанте HLA DR. 1. Выбор фрагмента антитела с высокой аффинностью к консервативной детерминанте HLA DR. Используют фаговую библиотеку, состоящую приблизительно из 10 в 14-ой степени фагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальный фрагмент антитела (scFv) (например, G.Winters, MRC, Cambridge, UK). Отбор фагов, экспрессирующих HLA DR, осуществляют на основе того факта, что активированные Т-клетки экспрессируют HLA DR, a покоящиеся Т-клетки - нет. Отбирают все фаги, которые связываются с активированными Тклетками. Это позволило эффективно выделить субпопуляцию фагов, которые связывались с HLA DR, а также некоторую долю Т-клеточных активационных маркеров. В-клетки экспрессируют HLA DR конститутивно. Инкубация полученной субпопуляции фагов с В-клетками позволяла отобрать только анти-HLA DR фагов, поскольку В-клетки не экспрессируют Тклеточных активационных маркеров. 25 Из тех фагов, которые связывались с HLA DR, отбирали связывающиеся с консервативными детерминантами, скринируя субпопуляцию на В-клетках различной HLA DR специфичности, и отбирая только те клоны, которые связывались со всеми В-клетками. Если отбиралось несколько клонов, использовали тот, который обладал более высокой связывающей аффинностью. Предпочтительными были связывающие аффинности в интервале от 10 в 8-ой степени до 10 в 12-ой степени. 2. Способ экспрессии фрагмента антитела к консервативной детерминанте HLA DR на поверхности E.coli при помощи плазмиды рТХ101. Домены V-H и V-L отобранных scFv клонируют с использованием подходящих праймеров, сконструированных таким образом, чтобы ввести в рамку считывания сайты рестрикции EcoRI на N-конце V-H и С-конце V-L. Фрагмент гена, амплифицированный ПЦР, лигируют по EcoRI сайту в плазмиду pXT101. Плазмидой трансформируют бактерии штамма JM109 и индуцируют поверхностную экспрессию слитого белка добавлением IPTG при 20°С, как это описано в примере 1. 3. Подтверждение поверхностной экспрессии фрагмента антитела и демонстрация связывания HIV. Для подтверждения правильной экспрессии анти-DR scFv на поверхности бактерий используют иммунофлуоресценцию. Трансформированные бактерии наносят на стекла и фиксируют метанолом. Стекла обрабатывают растворимыми молекулами человеческого HLA DR, отмывают, а затем проводят реакцию с козьими IgG к антителам мыши, меченными родамином. Флуоресценцию оценивают микроскопически с помощью флуоресцентной системы распознавания изображения MRC-500 Bio-Rad. Для демонстрации связывания HIV трансформированными бактериями, стекла с фиксированными бактериями инкубируют с HIV, тщательно промывают, а затем окрашивают мышиными моноклональными антителами к поверхностному белку gp120 HIV. После отмывания стекла обрабатывают козьими IgG к антителам мыши, меченными родамином и визуализируют, как описано выше. 4. Способ оценки in vitro нейтрализации инфицирования HIV Т-клеток при помощи трансформированных бактерий. Ранние этапы заражения HIV клеток СЕМ (лабораторная линия Т-клеток) in vitro контролируют путем обнаружения обратнотранскриптазной активности в инфицированных клетках. Поверх клеток СЕМ, выращиваемых в культуральных флаконах, помещают полупроницаемую мембрану, размер пор которой обеспечивает прохождение HIV, но не бактерий или клеток СЕМ. На полупроницаемую мембрану помещают трансформированные или немоди- 000576 26 фицированные бактерии, затем на бактерии наносят инфекционный HIV и обеспечивают возможность инфицирования подлежащих клеток СЕМ. По истечении достаточного для заражения времени (обычно 2-6 ч), бактерии и полупроницаемую мембрану удаляют и клетки СЕМ тщательно промывают. Клетки лизируют и в их цитозольном содержимом определяют обратнотранскриптазную активность, которая служит индикатором заражения HIV. 5. Способы получения препаратов трансформированных бактерий в соответствующем носителе (пене, ДНКазе и т.д.) для применения на животных и человеке. Для использования в пищеварительном тракте трансформированные клетки E.coli выращивают и добавляют к смеси различных жирных кислот, обычно используемых для ректального введения, таких как гидрогенезированное кокосовое масло, глицерин, гидрогенизированное пальмовое масло или другие материалы, приемлемые для ректального введения. Бактерии добавляют к носителю в концентрации от 10 в 8-ой до 10 в 12-ой степени клеток на мг носителя. Каждый суппозиторий имеет вес 3-8 г. При том, что настоящее изобретение подробно описано в иллюстративных целях и для облегчения понимания приведены примеры, для квалифицированного специалиста очевидно, что могут быть сделаны определенные изменения и модификации, не нарушающие сущности изобретения в пределах его объема, охватываемого формулой. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Способ связывания и инактивации вирусов в организме млекопитающего, предусматривающий обеспечение контактирования слизистой оболочки млекопитающего с определенным количеством трансформированных бактерий, экспрессирующих на своей поверхности структуру, связывающую вирус. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности полипептид, представляющий собой рецептор вируса. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности рецептор, представляющий собой домен ICAM-1, вирус представляет собой риновирус человека, а млекопитающее является человеком. 4. Способ по п.2, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности СD4-рецептор, вирус представляет собой вирус иммунодефицита человека, а млекопитающее является человеком. 5. Способ по п.2, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности рецептор полиовируса, 27 вирус представляет собой полиовирус, а млекопитающее является человеком. 6. Способ по п.2, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности рецептор компонента 2 комплемента человека, вирус представляет собой вирус Эпштейна-Барр, а млекопитающее является человеком. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности фрагмент антитела, взаимодействующего с консервативной антигенной детерминантой вируса. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности фрагмент антитела, взаимодействующего с мономорфной детерминантой молекулы HLA DR человека, вирус представляет собой вирус иммунодефицита человека, а млекопитающее является человеком. 9. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности фрагмент антитела, взаимодействующего с консервативной детерминантой поверхностного белка ротавируса, вирус представляет собой ротавирус, а млекопитающее является человеком. 10. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности фрагмент антитела, взаимодействующего с консервативной детерминантой белка оболочки вируса простого герпеса, вирус представляет собой вирус простого герпеса, а млекопитающее является человеком. 11. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансформированные бактерии эксперессируют на своей поверхности фрагмент антитела, взаимодействующего с консервативной детерминантой белка оболочки папилломавируса человека, вирус представляет собой папилломавирус человека, а млекопитающее является человеком. 12. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности фрагмент антитела, взаимодействующего с консервативной детерминантой белка оболочки аденовируса, вирус представляет собой аденовирус, а млекопитающее является человеком. 13. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности фрагмент антитела, взаимодействующего с консервативной детерминантой белка оболочки респираторносинцитиального вируса, вирус представляет собой респираторно-синцитиальный вирус, а млекопитающее является человеком. 14. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности фрагмент антитела, взаимодействующего с консервативной детерминантой белка оболочки коронавируса, вирус пред- 000576 28 ставляет собой коронавирус, а млекопитающее является человеком. 15. Способ по п.7, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности фрагмент антитела, взаимодействующего с консервативной детерминантой капсида вируса, представляющего собой цитомегаловирус, вирус Коксаки, эховирус, вирус гепатита А или вирус парагриппа. 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что трансформированные бактерии экспрессируют на своей поверхности молекулы сиаловой кислоты, вирус представляет собой вирус гриппа, а млекопитающее является человеком. 17. Способ по п.16, отличающийся тем, что трансформированные бактерии сливаются со связанными вирусными частицами при помощи домена слияния, дополнительно встроенного в структуру, связывающую вирус. 18. Способ по любому из пп.1-17, отличающийся тем, что трансформированные бактерии обладают усиленной способностью прикрепляться к слизистой оболочке млекопитающего за счет того, что дополнительно экспрессируют домен гетерологичного белка, связывающийся с определенной детерминантой на слизистой оболочке. 19. Способ по п.1, отличающийся тем, что слизистая оболочка представляет собой слизистую оболочку носоглотки, ротоглотки, пищевода, тонкого кишечника, толстого кишечника, прямой кишки, влагалища или пениса. 20. Способ по любому из пп.1-19, отличающийся тем, что трансформированные бактерии наносят на слизистую оболочку с помощью жидкого раствора, пены, суппозитория, губки или капсулы. 21. Способ связывания и инактивации вирусов, передающихся от партнера при вагинальном половом акте, заключающийся в том, что во время полового акта во влагалище вводят трансформированные бактерии, экспрессирующие на своей поверхности структуру, связывающую вирус. 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что вирус представляет собой вирус иммунодефицита человека, папилломавирус человека или вирус простого герпеса. 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что трансформированные бактерии вводят во влагалище с помощью пены или губки. 24. Способ по п.23, отличающийся тем, что во влагалище дополнительно вводят небактерицидные спермициды. 25. Способ связывания и инактивации вирусов при их передаче от инфицированного индивидуума, предусматривающий обеспечение контактирования слизистой оболочки здорового индивидуума с определенным количеством трансформированных бактерий, экспрессирующих на своей поверхности структуру, связывающую передаваемый вирус. 29 000576 30 Фиг. 1 Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, Москва, ГСП 103621, М. Черкасский пер., 2/6