1 002545 2 Область, к которой относится изобретение
advertisement
1 Область, к которой относится изобретение Изобретение относится к вакцинам, эффективно индуцирующим защитный иммунитет против малярии, в частности к вакцинам, содержащим универсальные Т-клеточные эпитопы, обусловливающие Т-клеточный ответ у индивидуумов различного генетического происхождения. Уровень техники Проблемы здравоохранения, связанные с малярией, которой в настоящее время во всем мире инфицированы 400-500 миллионов человек, в последнее время были усугублены появлением штаммов паразитов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, а также векторов для комаров, обусловливающих устойчивость к инсектицидам. Эти факторы привели к повышению усилий, направленных на получение эффективной вакцины, снижающей заболеваемость и смертность от малярии и, в частности, от болезни, вызываемой P.falciparum, наиболее вирулентным видом плазмодия. У хозяина-млекопитающего малярийная инфекция начинается с кратковременной спорозоитной стадии, когда малярийный плазмодий на стадии спорозоита попадает в кровоток при укусе инфицированными комарами. Спорозоиты попадают в печеночные клетки хозяина посредством взаимодействия главного компонента поверхностной мембраны спорозоита, циркумспорозоитного (CS) белка, со специфическими рецепторами на поверхности гепатоцитов. После внутриклеточного размножения и выхода из разрушенных гепатоцитов паразиты поражают красные клетки крови и начинается эритроцитный цикл малярии; эта стадия инфекции, ответственная за клиническое проявление заболевания в случае P.falciparum, может оказаться летальной. Главным фокусом в разработке малярийных вакцин явился белок CS, который присутствует как на спорозоитах, так и на паразитах в печеночной стадии. Поликлональные и моноклональные антитела, специфичные к иммунодоминантному В-клеточному эпитопу в области повторов белка CS, пептиду (NАNР)3, нейтрализуют инфекционность малярийных спорозоитов у грызунов, приматов и человека (Nardin et al., J. Exp. Med. 156:20,1982). Однако использование в вакцине пептида (NАNР)3 приводит к ограниченному иммунному ответу, по-видимому в основном из-за низкой плотности эпитопов и/или отсутствия удобного Т-клеточного эпитопа (Herrington et al., Nature 328: 257,1987). Авторы настоящего изобретения идентифицировали паразитарные Т-клеточные эпитопы с использованием CD4+ Т-клеточных клонов, полученных от четырех человекдобровольцев, которых иммунизировали путем повторных укусов облученных комаров P.falciparum, носителей малярии. Когда трое из этих добровольцев были заражены инфекцион- 002545 2 ными спорозоитами P.falciparum, они оказались защищенными от малярии, о чем свидетельствовало полное отсутствие эритроцитной стадии инфекции (Herrington et al., Am. J.Тrор. Нyg. 45:535,1991). С использованием CD4+ Т-клеточных клонов, полученных от иммунизированных спорозоитами добровольцев, были идентифицированы два Т-клеточных эпитопа. Один из них локализован в области повторов, а другой - на Сконце CS белка P.falciparum. Т-клеточный эпитоп, находящийся в NH2-терминальной области повторов, обозначенный Т1, состоит из чередующихся повторов NVDPNANP (Nardin et al., Science 246: 1603, 1989). Эпитоп Т1 сходен, но антигенно отличен, с СООН-терминальной областью повторов, содержащей В-клеточный эпитоп (NANP)3. CD4+ Т-клеточные клоны человека, которые специфически распознают пептиды, полученные из различных комбинаций NН2-терминальной области повторов и содержащие NVDPNANP, не отвечают на пептид с повторами (NANP)3. Эпитоп Т1 консервативен во всех просеквенированных к настоящему времени изолятах P.falciparum и потому его введение в состав вакцины должно индуцировать иммунный ответ на паразитов различных географических областей. Второй Т-клеточный эпитоп, идентифицированный спорозоит-специфическими CD4+ Тклеточными клонами человека, содержит пептид, перекрывающий аминокислотные остатки 326-345, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, CS белка P.falciparum штамма NF54 (Моrenо et al., Int.Immunol. 3:997,1991; Моreno et al., J. Immunol. 151:489,1993). Было показано, что данный эпитоп распознается цитотоксическими и нецитотоксическими клонами класс II-рестрицированных CD4+ Т-клеток и класс Iрестрицированных CD8+ цитотоксических Тклеток. Аминокислотная последовательность 326345 уникальна в том смысле, что она перекрывает как полиморфный, так и консервативный (RII) районы белка CS (Dame et al., Science 225: 593, 1984). Консервативный район RII+ содержит паразитарный лиганд, который взаимодействует с рецепторами гепатоцитов для инициации внутриклеточной стадии жизненного цикла возбудителя малярии. Пептидо-специфические CD4+ Т-клетки человека распознают ряд эпитопов в пептиде 326-345, причем все эти эпитопы перекрывают консервативный район RII, обнаруживаемый в белке CS всех видов Plasmodium. Тот факт, что эпитоп Т* был идентифицирован при помощи CD4+ Т-клеток, полученных от добровольцев, которых иммунизировали путем множественных укусов инфицированных малярией комаров, дает основания считать, что данная пептидная последовательность эффективно процессирована для презентации молекулами HLA класса II после экспозиции с натив- 3 ным белком CS на спорозоите. Считается, что вакцины, содержащие этот паразитарный Тклеточный эпитоп, могут вызывать анамнестический ответ у естественно инфицированных индивидуумов и обеспечивать вакциноиндуцированный иммунитет, который будет поддерживаться при контакте с паразитом в естественных условиях. Класс II-рестрицированные CD4+ Т-клетки играют главную роль в индукции клеточного и гуморального ответа к преэритроцитарным стадиям малярийного паразита (Nardin et al., Ann.Rev.Immunol. 11:687, 1993). Если Тклеточные эпитопы, содержащиеся в синтетической малярийной вакцине, связывают только ограниченный спектр молекул класса II, вакцина может оказаться неэффективной для индукции иммунного ответа у индивидуумов различного генетического происхождения. Ранними исследованиями показано, что повторы (NАNР)3SС белка Р.falciparum индуцировали низкий или даже необнаружимый Т-клеточный ответ у естественно инфицированных индивидуумов, живущих в эндемичных для малярии областях (Herrington et al., Nature 328: 257,1987; Etlinger et al., J.Immunol. 140:626,1988; Good et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85:1199,1988). Таким образом, имеется потребность в получении паразитарных Т-клеточных эпитопов, которые связывали бы большинство, если не все, молекулы класса II, для введения в состав иммуногенных композиций и вакцин с целью обеспечения защитного иммунного ответа у индивидуумов различного генетического происхождения. Краткое описание фигур Фиг. 1А представляет гистограмму флуоресценции, полученной при инкубации клеток EBV-B 9008 с биотинилированными пептидами. Фиг. 1В представляет гистограмму флуоресценции, полученной при инкубации клеток EBV-B 9065 с биотинилированными пептидами. Фиг. 2А представляет графическую иллюстрацию пептидной конкурентной ELISA с использованием молекул класса II DR4 (DRB1*0401). Различные концентрации конкурентных пептидов 326-345, Т1 или NАNР3 были проверены на способность подавлять связывание биотинилированного индикаторного пептида GFK(A)7 с растворимыми молекулами DR. Комплексы пептид/МНС, связанные на планшетах для ELISA, покрытых анти- DR моноклональными антителами, выявляли путем инкубации с HPR-авидином и субстратами пероксидазы. Фиг. 2В представляет графическую иллюстрацию пептидной конкурентной ELISA с использованием молекул класса II DR13 (DRB1*1301), осуществленной как описано для фиг. 2А. Фиг. 3А представляет графическую иллюстрацию конкурентного пептидного теста с ис- 002545 4 пользованием растворимых молекул класса II DQ9 (DQ A1*0201/DQ B1*0303), осуществленного как описано для фиг. 2А. Фиг. 3В представляет графическую иллюстрацию конкурентного пептидного теста с использованием растворимых молекул класса DQ7 (DQ A1*0501/DQ B1*0301), осуществленного как описано для фиг. 2А. Фиг. 4А представляет графическую иллюстрацию титров анти-MAP ELISA для мышей, которые были иммунизированы интраперитонеально 50 мкг (T1)4MAP. Фиг. 4В представляет графическую иллюстрацию титров анти-МАР ELISA для мышей, которые были иммунизированы интраперитонеально 50 мкг (Т*)4МАР. Фиг. 4С представляет графическую иллюстрацию титров анти-МАР ELISA для мышей, которые были иммунизированы интраперитонеально 50 мкг (Т*Т1)4МАР. Краткое описание изобретения Настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, обеспечивающим защитный иммунитет против малярии. Композиции содержат первый малярийный пептид, содержащий "универсальный" Т-клеточный эпитоп, обусловливающий антималярийный Тклеточный ответ у млекопитающих различного генетического происхождения. В настоящем контексте к млекопитающим "различного генетического происхождения" относятся без ограничений все млекопитающие, экспрессирующие множественные гаплотипы МСН класса II. В одном из вариантов осуществления изобретения универсальный Т-клеточный эпитоп содержит последовательность EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT. Предпочтительно, заявленные композиции дополнительно содержат, по меньшей мере, второй малярийный пептид, содержащий Вклеточный эпитоп, который стимулирует образование антималярийных антител у млекопитающих. Композиции могут также содержать дополнительные Т-клеточные эпитопы. Композиции предпочтительно вводят в состав вакцин, которые могут дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель или растворитель и, дополнительно, адъювант. В качестве другого аспекта, в настоящем изобретении заявлены способы подавления размножения малярийных организмов в чувствительном животном, предпочтительно индукцией защитного иммунитета против малярии у млекопитающего. Данные способы осуществляются путем введения млекопитающему иммуногенно эффективных количеств иммуногенных композиций и вакцин, описанных выше. Подробное описание изобретения Определения 1. " Иммуногенная композиция" - это композиция, вызывающая гуморальный и/или клеточный иммунный ответ в организме хозяина. 5 2. Термин "В-клеточный эпитоп" обозначает пептид или другую иммуногенную молекулу, или ее фрагмент, который вызывает образование специфических антител (т.е. антител, распознающих паразита, а также иммуногенную молекулу) в организме млекопитающегохозяина. Термин "Т-клеточный эпитоп" обозначает пептид или другую иммуногенную молекулу, или ее фрагмент, который активирует Тклетки таким способом, который специфичен для паразитарного пептида, также как и для иммуногенной молекулы. 3. Термин "универсальный" Т-клеточный эпитоп обозначает в данном контексте пептид или другую иммуногенную молекулу, или ее фрагмент, который связывается с множеством молекул МНС класса II таким способом, который активирует Т-клеточную функцию класс IIили класс I-рестрицированным образом. Активированные Т-клетки могут быть хелперными клетками (CD4+) и/или цитотоксическими клетками (класс II-рестрицированные CD4+ и/или класс I-рестрицированные CD8+). В одном из вариантов осуществления изобретения универсальный Т-клеточный эпитоп содержит последовательность EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT. В другом варианте осуществления изобретения универсальный Т-клеточный эпитоп, по существу, представлен последовательностью EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT. В данном контексте эпитоп, "по существу представленный" пептидной последовательностью, включает пептиды, в которых одна или несколько аминокислот могут быть делегированы или заменены с сохранением способности пептида связываться со множеством молекул МНС класса II и/или активировать Т-клеточную функцию клеток, несущих такие молекулы. Необходимо понимать, что делеция или замена одной или нескольких аминокислот может изменить способность пептида связываться с одной или несколькими молекулами МНС класса II, но при этом сохранять способность пептида связываться со множеством других молекул МНС класса II. Малярия-специфический или паразитспецифический универсальный Т-клеточный эпитоп обладает потенциалом к увеличению численности или индукции паразитспецифических Т-клеток у естественно инфицированных или нативных индивидуумов, соответственно, в популяции в целом. 4. Пептидный эпитоп, который "получен из" конкретного организма или из конкретного полипептида, содержит аминокислотную последовательность, обнаруживаемую целиком или частично в конкретном полипептиде и кодируемую геномом организма. Следует понимать, что в последовательность пептида могут быть введены изменения по сравнению с полипептидом, из которого он был получен, которые не скажутся отрицательно на способности измененно- 002545 6 го пептида, используемого в качестве компонента иммуногенной композиции, вызывать иммунный ответ, специфичный по отношению к полипептиду, из которого получен пептид. 5. "Пептид с множественной антигенной активностью" (MAP) обозначает пептидный мультимер, образованный из полилизинового ядра, вокруг которого имеется разветвленная "сеть", к которой конъюгируют пептиды (Tam, J.Immunol.Meth. 196:17, 1996; Nardin et al., Adv.Immunol. 60:105,1995). В настоящем изобретении заявлены иммуногенные композиции и способы индукции защитного иммунитета против малярии, в частности, против P.falciparum. Композиции состоят из одного или нескольких следующих компонентов: (i) по меньшей мере, одного малярийного пептида, содержащего универсальный Тклеточный эпитоп, способный вызывать образование антималярийного Т-клеточного ответа у вакцинируемых различного генетического происхождения; и (ii) по меньшей мере, одного малярийного пептида, содержащего В-клеточный эпитоп, способный стимулировать образование антималярийных (т.е. нейтрализующих) антител, направленных против спорозоитной стадии малярийного плазмодия. Предпочтительно, иммуногенные композиции согласно настоящему изобретению содержат, по меньшей мере, один В-клеточный эпитоп и, по меньшей мере, один Т-клеточный эпитоп, наиболее предпочтительно, универсальный Т-клеточный эпитоп. Вклеточные эпитопы преимущественно обусловливают образование антител, которые специфически распознают и связывают малярийный циркумспорозоитный (CS) белок. Композиции могут также содержать В-клеточные и/или Тклеточные эпитопы, полученные из и реагирующие с другими малярийными компонентами, например такими, как спорозоитный поверхностный белок Р. falciparum, обозначаемый как тромбоспондин-родственный адгезивный белок (TRAP), называемый также Поверхностным Белком 2 Спорозоита (SSP2); LSA I; hsp70; SALSA; STARR, Hep17; MSA; RAP-1 и RAP-2. В одном из вариантов осуществления изобретения компоненты В-клеточного эпитопа и универсального Т-клеточного эпитопа встроены в пептиды, обладающие множественной антигенной активностью (MAPs), образуя синтетический макромолекулярный полипептид, обладающий высокой плотностью эпитопов. Cпособы синтеза MAP описаны (Tam, Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85:5409,1988; Tam, Meth Enzymol. 168:7, 1989). В объем настоящего изобретения входят В-клеточные и Т-клеточные эпитопы, полученные от плазмодиев различных видов, включая без ограничения перечисленными Р.falciparum, P.vivax, P.malarie, P.ovale, P.reichenowi, P.knowlesi, P.cymomolgi, P.brasilianum, P.yoelii, P.berhei и P.chabaudi. Эпитопы обычно состоят, 7 по меньшей мере, из 5-ти аминокислотных остатков, предпочтительно - по меньшей мере, из 7-ти остатков, и наиболее предпочтительно - по меньшей мере, из 10-ти остатков, полученных из белка плазмодия. В-клеточные эпитопы можно идентифицировать методами, известными из уровня техники, такими как, например, (i) получение синтетических пептидов, чьи последовательности выведены из белка CS плазмодиев различных видов; и (ii) тестирование способности синтетических пептидов индуцировать образование антималярийных антител в модельной системе. Малярия-специфические Вклеточные и Т-клеточные эпитопы описаны Nardin et al., Ann.Rev.Immunol. 11:687,1993. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения заявленные иммуногенные композиции содержат пептид, представляющий малярийный В-клеточный эпитоп (NАNР)3 и пептид, представляющий универсальный Т-клеточный эпитоп, представленный аминокислотными остатками 326-345, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, CS белка P.falciparum штамма NF54, или полученными из него иммуногенными вариантами. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенная композиция содержит (NАNР)3, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT и эпитоп Т1. Родственные последовательности из других изолятов или других видов возбудителя малярии характеризуются идентичным расположением алифатических и ароматических остатков в положениях 327. 328, 331, 335 и 339. Считается, что эти остатки являются критическими для связывания пептида связывающей "ложбинкой" молекул класса II и класса I. Соответственно, последовательности, родственные EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, и обладающие данными структурными особенностями и/или эффективно связывающие различные молекулы класса II или класса I, могут быть использованы для осуществления изобретения. Для целей настоящего изобретения с использованием экспериментальных подходов, примененных для EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, могут быть идентифицированы другие универсальные Т-клеточные эпитопы. Идентификация универсальных Т-клеточных малярийных эпитопов В целях настоящего изобретения были идентифицированы малярия-специфические универсальные Т-клеточные эпитопы с использованием одного или нескольких из следующих способов: (i) экспериментальное измерение взаимодействия различных малярийных пептидов с выделенными полипептидами класса II in vitro и; (ii) компьютерный анализ различных пептидных последовательностей с целью идентификации высокоаффинных мотивов, специфичных к аллелям класса II. Уровни взаимодействия, определенные in vitro, коррелировали с иммуногенностью in vivo, о которой судили по 002545 8 иммунному ответу мышей различного генетического происхождения, иммунизированных пептидами с множественной антигенной активностью (MAPs), содержащими эти Т-клеточные эпитопы. Аналогично, пептид, полученный из TRAP/SS 2 P.falciparum, который, как было предсказано, содержал универсальный Тклеточный эпитоп, в эксперименте in vitro связывал многочисленные молекулы класса II. Способы идентификации универсальных Тклеточных рецепторов более подробно описаны ниже. 1. Тесты in vitro: Материалы и методы: Пептиды: Синтез пептидов с множественной антигенной активностью (MAPs) проводили, как первоначально описано (Tam, Proc.Natl.Acad. Sci.USA 85:5409,1988). Применяли твердофазный ступенчатый синтез на основе химии пептида Воc. Т-клеточные эпитопы синтезировали на четырехчленном ядре, построенном с использованием альфа- и эпсилон- аминогрупп лизина. Были сконструированы два моноэпитопных MAPs, содержащих только эпитоп Т1 (DPNANPNV)2, сокращенно (Т1)4, или только Тклеточный эпитоп 326-345 белка CS P.falciparum штамма NF54, EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, сокращенно (Т*)4. Был также сконструирован четырехчленный диэпитопный MAP, содержащий как эпитопы Т* и Т1 [Т*Т1]4, синтезированные в виде 36-членной последовательности, а также эпитоп Т*, дистальный по отношению к лизиновому ядру. NН2-терминально биотинилированные пептиды Т1, 326-345 и (NАNР)3 были получены от AnaSpect (Anaheim,CA). Чистота пептидов составляла более 90% по HPLC и биотинилирование пептидов подтверждали массспектроскопией. Мыши: Мыши в возрасте 6-8 недель четырех инбредных линий были получены от Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME. Мышей (5-10 животных в группе) линий A/J (H-2a), C57Bl/10 (Н-2b), ВАLВ/с(Н-2d) и С3Н (Н-2k) иммунизировали, вводя трехкратно интраперитонеально 50 мкг моно- или диэпитопного MAP, эмульгированного в адъюванте Фрейнда. Сыворотки для серологических исследований собирали 14-20 дней спустя после каждой иммунизации. Серологические тесты: ELISA: Фермент-связанный иммуносорбентный тест (ELISA) проводили с использованием в качестве антигенов моно- или диэпитопных MAPs (Munesingh et al., Eur.J.Immunol.12:3015, 1991). В ячейки планшетов для ELISA с адсорбированными MAPs вносили двукратные разведения сывороток в PBS/0.05% Tween/2.5% BSA. После отмывки связанные антитела обнаруживали с помощью меченных пероксидазой антимышиных IgG (γ- 9 цепь специфических) (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD) и ABTS (2,2'-Азино-ди-(3этилбензотиазолин сульфонат)/Н2О2 в качестве субстрата. Средние геометрические титры (GMT) определяли для каждой группы с использованием конечного разведения сывороток с O.D., большим, чем среднее +3 S.D. преиммунных сывороток. IFA: Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (IFA) проводили с использованием фиксированных глутаральдегидом спорозоитов P.falciparum и FITC-конъюгированных антимышиных IgG для обнаружения связанных антител. Спорозоиты получали из слюнных желез комаров Anopheles, инфицированных путем кормления гаметоцитами P.falciparum (штамма NF54), полученными из культур in vitro. Тесты на связывание пептидов Связывание пептидов клетками, экспрессирующими определенные молекулы класса II Связывание биотинилированных пептидов клетками EBV-B определенных гаплотипов или L-клетками, трансфицированными молекулами DR, определяли при помощи проточной цитофлуориметрии (Busch et al., J.Immunol.Meth. 134:1,1990). Клетки EBV-B линий 9065 и 9008, которые представляют пептиды Т1-специфическим CD4+ Т-клеточным клонам, были проверены на способность связывать биотинилированные пептиды Т1, (NАNР)3 или 326-345. Для проточной цитофлуориметрии клетки EBV-B или клетки L (2 х 105 клеток) инкубировали в равном объеме (100 мкл) биотинилированного пептида (200 мкг/мл) в ячейках круглодонных 96-луночных планшетов. После четырех часов инкубации на льду при острожном встряхивании несвязанные пептиды удаляли промывкой. Для увеличения интенсивности флуоресцентного сигнала при мечении клеток применяли два слоя FITC-авидина, сначала клетки метили FITC-авидин D, затем биотинилированными антиавидин D антителами, и уже затем - FITCавидин DCS (Vector, Burlingame, CA). Перед проточной цитофлуориметрией к клеткам добавляли пропидий иодид (2.8 мкг/мл) для окрашивания жизнеспособных клеток. ELISA на связывание пептидов Взаимодействие пептидов с растворимыми молекулами DR или DQ оценивали при помощи ELISA на связывание пептидов (Hammer et al., J. Exp. Med. 180:2353,1994). Молекулы класса II получали из приблизительно 109 клеток EBV-B путем лизиса и экстракции в 1% NP-40 (объем/объем) и смеси ингибиторов протеаз. Молекулы класса II из клеточных экстрактов очищали иммуноаффинно на колонке с СефарозойБелок А-антикласс II МКА, причем использовали МКА (моноклональные антитела), специфичные к молекулам DR (АТСС НВ-55) или DQ (ATCC 144 или SPV-L3). Гомозиготные клеточные линии EBV-B использовали в качестве источника молекул класса II 002545 10 для каждого конкурентного теста на пептид DR: DR1 - НОМ-2 (DRB1*0101), DR 3 - WT49 (DRB1*0301), DR4 - BSM или PREISS (DRB1*0401), DR 7EKR(DRB1*0701),DR8-BM9(DRB1*0801), DR11SWEIG(DRB1*1101) и DR13 -HHKB(DRB1*1301). Moлeкyлы DR2a(DRB5*0101)были выдeлeны из Lклeтoчнoгo трансфектанта L416.3. В конкурентном тесте на пептид DQ использовали растворимые молекулы DQ 7 (DQA1*0501/DQB1*0301), полученные из EBV-B клеток SWEIG. Димеры DQ 9αβ (DQA1*0201/DQB 1*0303) были получены в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы экспрессии. В тестах на связывание пептидов в ячейки 96-луночных планшетов вносили оптимальную концентрацию очищенных молекул DR или DQ вместе с биотинилированным индикаторным пептидом в цитрат-фосфатном буфере, содержащем 2% n-октил глюкозида, PMSF, ЭДТА и ингибиторы протеаз. Буфер для связывания с рН7 использовали во всех тестах на DR или DQ, за исключением буфера для связывания DRB1*0701 с рН5. После инкубации в течение ночи при комнатной температуре (RT) или при 37°С комплексы пептид/класс II переносили в лунки, покрытые анти-DR Mab L234 антителами (15 мкг/мл) или анти-DQ Mab HB144 (3.5 мкг/мл). После двух часов инкубации ячейки промывали PBS + 1% Tween и выявляли связывание биотинилированных комплексов пептид/молекулы класса II, добавляя меченый щелочной фосфатазой стрептавидин и субстрат, рнитрофенилфосфат (Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD). Оптические плотности определяли с помощью ELISA-ридера Titertek MC Multiscan (Flow Labs) с использованием 405 нм фильтра. Для повышения чувствительности в конкурентных тестах использовали биотинилированные индикаторные пептиды, которые оптимально связывались с различными аллелями DR. В качестве индикаторных пептидов применяли сконструированные полиаланиновые пептиды, содержащие аллель-специфические связывающие мотивы, поскольку эти пептиды давали возможность обнаруживать конкуренцию со 100-кратными увеличениями или уменьшениями аффинности связывания. Биотинилированный пептид Gly-Phe-Lys-(Ala)7, обозначенный GFK(A)7, использовали в качестве индикаторного пептида в тестах на DR 1,4,7 и 13 и тестах на DQ. В тесте на DR 3 использовали биотинилированный пептид IAYD(A)5, и в тесте на DR 8 использовали биотинилированный индикаторный пептид GYR(А)6L. Конкурентные тесты на DR4 также проводили с использованием биотинилированного пептида UD4, YPKFVKQNTLKAA, сконструированного для оптимального связывания всех аллотипов DR4. Связывание с молекулами DR2 (DRB5*0101) оценивали с использованием биотинилированного пептида основного белка миелина МВР. 11 При проведении конкурентных тестов оптимальные концентрации биотинилированного индикаторного пептида (0.1мкМ - 5мкМ) инкубировали с десятикратными разведениями (0.01мкМ - 100мкМ) немеченных конкурентных пептидов Т1, аа 326-345 или (NANP)3. В каждый конкурентный тест в качестве положительного контроля включали немеченный пептид определенной класс II-связывающей специфичности, что также давало возможность определить относительную аффинность. Способность немеченного конкурентного пептида конкурировать с биотинилированным индикаторным пептидом за связывание молекул класса II определяли по оптической плотности (O.D.). Подавление вычисляли в процентах по формуле: 100 x 1 - (∆ O.D. в присутствии конкурентного пептида/∆ O.D. в отсутствие конкурента). Определяли концентрацию конкурентного пептида, необходимую для подавления 50% связывания биотинилированного индикаторного пептида (IС50), и величина IС50 > 100 мкМ использовалась как показатель связывания пептида с молекулой класса II. Результаты Связывание Т-клеточных CS эпитопов с ассоциированными с клетками молекулами класса II DC4+ Т-клеточные клоны человека, полученные от иммунизированных спорозоитами добровольцев, распознают Т-клеточные эпитопы белка CS P.falciparum в контексте молекул класса II DR или DQ. Клоны, специфичные к Тклеточному эпитопу 326-345 (Т*) белка CS P.falciparum, ограничены множественными аллелями DR, включая DR 1, DR 4, DR 7 или DR 9. Недавно были определены генетические ограничения эпитопа Т1, локализованного в области повторов белка CS P.falciparum. Моноклональные антитела, специфичные к мономорфным детерминантам DQ, но не DR молекул, существенно подавляют пролиферативный ответ Т1 пептид-специфических Т-клеточных клонов. Когда в качестве АРС использовали клетки EBV-В, экспрессирующие гаплотип DR/DQ Т-клеток иммунизированного спорозоитами донора (DRB1*1502/*1301, DQB1*0602/*0603), то только клетки, экспрессирующие DQB1*0603 могли представлять пептид Т1 Т-клеточным клонам. Однако, количество CS-пептидспецифических Т-клеток, доступных для исследования генетических ограничений, было ограничено небольшим числом иммунизированных спорозоитами добровольцев. Для получения дополнительной информации о спектре молекул класса II, которые потенциально могут участвовать в презентации Т-клеточных эпитопов Т1 и 326-345, были проведены тесты на связывание in vitro с использованием клеточных линий определенных гаплотипов или DRтрансфектантов. 002545 12 а. Тесты на связывание с использованием клеток EBV-B определенного гаплотипа класса II. Для получения ответа на вопрос о том, могут ли клетки EBV-В известных гаплотипов применяться для скрининга молекул, способных связывать эпитопы CS, клеточные линии были проверены на связывание биотинилированных пептидов Т1 и 326-345. Был также проверен биотинилированный пептид (NАNР)3, который слабо распознается Т-клетками человека. Две клеточные линии EBV-B, одна экспрессирующая DR4 (BSM) и другая экспрессирующая DR7 (EKR), функционируют как АРС (антигенпрезентирующие клетки) при презентации пептида 326-345 DR4-и DR7-рестрицированным Тклеточным клонам. Как показала проточная цитофлуориметрия, биотинилированный пептид 326-345 связывался с клеточными линиями BSM и EKR со средним значением флуоресцентных каналов (MFC), равным 251 и 142, соответственно. Однако не было получено обнаружимого связывания эпитопа Т1 или биотинилированного пептида (NАNР)3 с данными клетками (MFC <35). В обратных тестах клеточные линии EBVB, которые функционируют как АРС для Т1 пептид-специфических Т-клеточных клонов, были проверены на способность связывать обнаружимые количества биотинилированных CS пептидов. Связывания биотинилированного пептида Т1 клеточными линиями EBV-B 9008 и 9065, которые экспрессируют гаплотипы DRB1*1501/DQB1*0602/0603 и DRB1*1301/DQB1*0603, обнаружить не удалось (фиг. 1А и 1В). Наоборот, пептид 326-345 связывался с обоими типами клеток EBV-B (9008 или 9065) с величиной MFC, равной 403 и 758, соответственно. б. Связывание пептида DR-трансфицированными клетками L. Поскольку клетки EBV-B экспрессируют множественные изотипы класса II, положительная флуоресценция, полученная с пептидом 326345, может отражать связывание с DR и/или с DQ, или с другими молекулами HLA. Специфичность связывания пептида относительно класса II была определена путем измерения взаимодействия биотинилированных пептидов CS с DR-трансфицированными клетками L. Уровень экспрессии DR на поверхности различных трансфектантов был сопоставим с таковым для клеток EBV-B, с MFC в пределах от 443 до 964 после окрашивания моноклональными антителами анти-DR (L243) (табл. 1). Таблица 1. Связывание биотинилированных малярийных пептидов мышиными L-клетками, трансфицированными DR Биотинилированный DR трансфектанты (MFCa) пептид DRB1* 0401 DRB1* 0701 DRB1* 1501 Биотинил-326-345 217.1 203.8 167.7 Биотинил-T1 18.9 35.7 12.7 Биотинил-(NАNР)3 12.9 22.8 12.7 13 Анти-DR МКАb 911.4 443.5 964.4 Контрольные МКА 18.5 23.8 19.3 а. Связывание биотинилированных пептидов CS (100 мкг/мл) мышиными L-клетками, трансфицированными DRA1* 0101 и DRB1* 0401, * 0701 или * 1501 определяли при помощи FACS. Результаты представлены как усредненный флуоресцентный канал (MFC). b. Экспрессия молекул класса II для каждого трансфектанта была показана при помощи окрашивания МКА, специфичными в отношении молекул класса II человека (МКА L234) или отрицательными контрольными МКА (3D11) (50 мкг/мл). Существенной флуоресценции не обнаружено при инкубации DR-трансфицированных клеточных линий с биотинилированными пептидами Т1 или (NANP)3. Биотинилированный пептид 326-345 связывался с клетками, трансфицированными DRB1* 0401 и *0701 с MCF 217 и 203, соответственно, что согласовывалось с аллельной специфичностью DR4- и DR7рестрицированных CD4+ Т-клеточных клонов, специфичных в отношении пептида 326-345. Кроме того, показано, что пептид 326-345 связывался с L-клетками, трансфицированными DRB1* 1501 (MFC 167),что согласовывалось с положительным связыванием в случае DR 15положительной клеточной линии 9008 EBV-B (фиг. 1). Связывание Т-клеточных CS эпитопов растворимыми молекулами класса II Для определения аффинности связывания пептидов и для того, чтобы исключить возможность неспецифического взаимодействия с неМНС поверхностными молекулами, экспрессируемыми на поверхности мышиных и человеческих клеточных линий, были проведены конкурентные тесты с использованием растворимых молекул класса II. 1. Молекулы DR. Для повышения чувствительности и специфичности тестов на связывание пептидов были проведены конкурентные тесты с использованием биотинилированного индикаторного пептида GFK(A)7, полиаланинового пептида, связывающегося с молекулой DR с такой аффинностью, которая делает возможной конкуренцию пептидов со 100-кратной разницей в аффинностях. Как видно из кривой "доза-ответ" для различных концентраций немеченого конкурентного пептида, пептид 326-345, но не пептид Т1 или (NАNР)3, мог эффективно подавлять связывание биотинилированного индикаторного пептида GFK(A)7 с растворимыми молекулами DR4 (фиг. 2А). Аналогичные результаты были получены, когда пептид 326-345 был использован в конкурентном тесте с растворимыми молекулами DR13 (фиг. 2В). Концентрация пептида 326-345, необходимая для 50%-ного подавления связывания биотинилированного пептида GFK(A)7 (IC50), была примерно одинакова как в случае DR4 (IC50 0.2 мкМ), так и случае DR13 (IC50 0.33 мкМ). Ни пептид Т1, ни пептид (NАNР)3 не 002545 14 проявляли подавляющей способности даже при самых высоких использованных концентрациях (IC50> 100 мкМ). Результаты конкурентных тестов на связывание петидов, проведенных с использованием различных биотинилированных индикаторных пептидов, выбранных для оптимального связывания с каждым аллелем DR, суммированы в табл. 2. Таблица 2. Конкурентный тест на связывание пептида с использованием растворимых молекул DR IС50 конкуБиотинилa рентноDRB1* DR пептид го пептида HA307-319 326-345 Т1 (NANP)3 DR1 DRB1*0101 GFK(A)7 0.10 20.0 >100 >100 DR2 DRB5*0101 MBP 0.03 80.0 >100 >100 DR3 DRB1*0301 IAY(A)5 10.0 70.0 >100 >100 DR4 DRB 1*0401 UD4 1.00 0.7 >100 >100 DR7 DRB 1*0701 GFK(A)7 0.10 0.4 >100 >100 DR8 DRB1*0801 GYR(A)6L 5.00 10.0 >100 >100 DR11(5) DRB1*1101 TT831-843 1.00 40.0 >100 >100 а. Результаты представлены в виде IС50, концентрации немеченного конкурентного пептида, необходимой для 50%-ного подавления связывания биотинилированного индикаторного пептида. Процент подавления вычисляли на основе значения O.D., полученного в присутствии различных концентраций конкурентного пептида (100 - 0.001 мкМ). Значение IС50< 100 мкМ, указывает на положительное связывание пептида. В каждый тест включали известный положительный конкурентный пептид НА307-319, полученный из гемагглютинина вируса гриппа, для определения относительной аффинности связывания пептидов CS с каждым аллелем DR. Данные тесты показали, что пептид 326345 связывается с генными продуктами DRB 1*, кодирующими следующие молекулы класса II: DR 1, DR 4, DR 7, DR 8, DR 11 и DR 13 (фиг. 2, табл. 2). Пептид 326-345 был слабым конкурентом за связывание с молекулами DR 3 (IС50> 100 мкМ) и молекулами DR 2, кодируемыми DRB5*0101 (IС50 80 мкМ). Значительного связывания пептида Т1 или пептида (NANP)3 нe обнаружено ни с одной из проверенных в тестах на связывание (IC50> 100 мкМ) растворимых молекул DR. Аффинность связывания пептида 326-345 отличалась для каждого аллеля DR, о чем свидетельствуют значения IС50 и относительная аффинность по сравнению с пептидом НА307-319. В случае аллелей DR 4,7 и 8 связывание CS пептида 326-345 было сопоставимо с таковым для универсального НА пептида с IС50 НА307-319/CS326-345, равными 1.4, 0.25 и 0.5, соответственно. Однако, относительная аффинность связывания пептида 326-345 с DR 1 и DR 11 была ниже, с отношениями IC50, равными 0.005 и 0.025. 2. Молекулы DQ. Результаты тестов по связыванию DR показывают, что пептид 326-345 может связывать множество молекул DR, тогда как пептиды Т1 и 15 (NАNР)3 не связываются с высокой аффинностью ни с одной из проверенных молекул DR. Для того, чтобы определить, может ли DQ6pecтрицированный эпитоп Т1 связывать другие аллели DQ, были проведены конкурентные тесты с использованием растворимых молекул DQ. Были проведены пептидные конкурентные тесты с использованием растворимых молекул DQ7 (DQA1*0501/B1*0301) и DQ9 (DQA1*0201/B1*0303). В каждый тест вводили известный DQ-связывающий пептид, CLIP83-101, полученный из аминокислот 83-101 инвариантной цепи, с целью определения относительной аффиности связывания пептидов CS с растворимыми молекулами DQ. Пептид Т1, который, как известно, связывает молекулы DQ 6, не связывал ни DQ 7, ни DQ 9 (фиг. 3). Аналогично, пептид (NАNР)3 не конкурировал с пептидом CLIP83-101 за связывание какого-либо аллеля DQ. Напротив, пептид 326-345 мог конкурировать с пептидом CLIP за связывание с молекулами DQ. В конкурентном тесте с использованием растворимых молекул DQ 9 пептид 326345 давал значение IС50, равное 2 мкМ, т.е. аффинность связывания находилась в тех же пределах, что и для пептида CLIP83-101 (IC50 0.5 мкМ) (фиг. 3А). Показано также связывание пептида 326-345 с растворимыми молекулами DQ 7(IС50 20 мкМ), хотя аффинность взаимодействия пептид/DQ была слабее по сравнению с таковой для пептида CLIP (IC50 0.5 мкМ) (фиг. 3В). Иммуногенность синтетических пептидных вакцин, содержащих эпитопы Т*Т1 a. Иммунизация моноэпитопным MAP, содержащим Т-клеточные CS эпитопы. Результаты тестов на связывание пептидов показывают, что пептид 326-345 может связываться с широким рядом молекул класса II, тогда как для пептида Т1 показано обнаружимое связывание только с молекулой DQ6 в Тклеточных тестах. Для того чтобы определить коррелируют ли с иммуногенностью in vivo широкие или узкие генетические ограничения по пептидам 326-345 и Т1, на различных линиях мышей был определен иммунный ответ на пептиды с множественной антигенной активностью (MAPs), содержащие эпитоп 326-345 или эпитоп Т1. Предварительными экспериментами было показано, что содержащие эпитоп 326-345 Вклетки, также как и Т-клеточные эпитопы, и потому уровень анти-МАР антительного ответа могут служить показателями функциональности класс II-рестрицированныхТ-хелперных клеток у МАР-иммунизированных мышей. В соответствии с полученными in vitro данными по связыванию пептида 326-345 с многочисленными молекулами класса II, моноэпитопный MAP, содержащий только последовательность 326-345 (сокращенно Т*), усиливал антипептидный ответ у мышей четырех прове- 002545 16 ренных линий (фиг. 4В). Величина ответа была генетически обусловлена, при этом наивысшие титры антипептидных антител отмечены у мышей BALB/C (Н-2d) и С57В1 (Н-2b), а промежуточные титры - у мышей A/J (Н-2a). Все мыши высоко- и среднеотвечающих линий после иммунизации MAP 326-345 вырабатывали сходные количества антипептидных антител (SEM <10%). Однако низкие и более вариабельные антительные ответы были характерны для мышей С3Н (Н-2k), среди которых только иммунизированные 2/5 MAP мыши отвечали обнаружимым уровням антител. Наоборот, при ответе на (Т*)4МАР, содержащий эпитоп 326-345, моноэпитопный МАО, содержащий эпитоп Т1 вызывал ответ антипептидными антителами только у одной линии мышей, Н-2b, (фиг. 4А), что согласуется с ранее опубликованными результатами (36). Таким образом, генетические ограничения ответа мышей на Т1 эпитоп, содержащий NН2терминальные повторы, аналогичны таковым, наблюдаемым в отношении СООН-терминально повторяющейся последовательности, (NANP)3, с Т-хелперными клеточными эпитопами, распознаваемыми только мышами С57В1 (Н-2b). Для того, чтобы получить ответ на вопрос о том, могут ли распознавать CS белок спорозоитов P.falciparum антипептидные антитела, полученные в ответ на иммунизацию MAP, содержащими повтор Т1 или СООН-терминальную последовательность 326-345, был проведен непрямой иммунофлуоресцентный анализ (ИФА). Ранее было показано, что иммунизация MAP конструктами, содержащими СООНтерминальные последовательности CS белка P.falciparum, часто приводит к образованию высоких титров антипептидных антител, которые не реагируют со спорозоитами. В соответствии с этими первичными результатами, только антиМАР антитела, которые распознают область повторов белка CS, реагируют со спорозоитами. Следовательно, при том, что у мышей BALB/C, иммунизированных (Т*)4, отмечены наивысшие титры анти-326-345 антител (ELISA GMT 163,840), реактивности со спорозоитами P.falciparum отмечено не было (ИФА <80). Наоборот, у мышей одной линии, С57В1, в ответ на иммунизацию моноэпитопным (Т1)4 MAP, содержащим Т-клеточный эпитоп с NН2терминальными повторами (фиг. 3А), отмечены сравнимые титры в анти-Т1-пептид ELISA (GMT 237,680) и ИФА (163,840) со спорозоитами P.falciparum. б. Иммунизация диэпитопными MAPs. Результаты тестов на связывание пептидов и изучение иммуногенности для мышей различных линий показали, что пептид 326-345 распознается множеством молекул класса II человека и мыши. Для того, чтобы определить может ли введение Т-клеточного эпитопа 326-345 в синтетическую вакцину преодолеть генетические 17 ограничения иммунного ответа на область повторов белка CS P.falciparum, был синтезирован диэпитопный (Т*Т1)4МАР, содержащий эпитоп 326-345 в тандеме с эпитопом Т1. Анти-МАР антительный ответ у мышей, иммунизированных (Т* Т1)4 MAP, показывает, что как и в случае моноэпитопного (Т*)4МАР, мыши всех четырех линий ответили на иммунизацию образованием больших количеств антипептидных антител (фиг. 4С). Величина анти(Т*Т1)4МАР антительного ответа у мышей различных линий демонстрирует ту же самую иерархию, которая наблюдалась у мышей, иммунизированных моноэпитопным (Т*)4МАР, т.е. BALB/C, C57/BL > A/J > С3Н. Кинетика анти-МАР антительного ответа была более быстрой у мышей, иммунизированных диэпитопным MAP (фиг. 4С). Титры антиМАР антител, превышающие 105, удавалось обнаружить после введения единичной дозы (Т*Т1)4 MAP мышам C57/BL. Самые низкие титры антител отмечены у мышей С3Н; однако, в отличие от мышей, иммунизированных моноэпитопным MAP, у всех мышей, иммунизированных диэпитопным (Т*Т1)4MAP, отмечено образование анти-МАР антител. Важно, что анализ тонкой специфичности антител показал, что у мышей всех линий, иммунизированных (Т*Т1)4 MAP, образовались антитела, реагирующие со спорозоитами P.falciparum. (таблица 3). Как было отмечено ранее для других МАР-конструктов, содержащих повторы белка CS P.falciparum, имеется положительная корреляция между уровнем антител к повторам, определенным в (Т1)4 MAP ELISA, и реактивностью со спорозоитами P.falciparum в сыворотках мышей, иммунизированных диэпитопным MAP. Таблица 3. Тонкая специфичность антител, образовавшихся в ответ на иммунизацию (Т*Т1)4 Штамм (T*)4 ELISA (T1)4 ELISA ИФА ELISA BALB/C 1,558,718 48,710 11,852 163,840 C57/BL 702,398 31,042 100,855 133,079 A/J 327,680 1,810 40,960 27,024 С3Н 94,101 452 1,470 3,225 Результаты представлены как GMT сывороток, собранных после 28-го дня с момента третьего внутриперитонеального введения (Т*Т1)4 MAP в адъюванте Фрейнда. В качестве антигена в ELISA использовали диэпитопные или моноэпитопные MAPs. В ИФА использовали фиксированные глутаральдегидом спорозоиты P.falciparum (NF54). Уровень антиспорозоитных и направленных с повтором антител, образовавшихся у мышей различных линий, отражает характер генетической рестрикции эпитопа 326-345. Высоко(C57/BL, BALB/C, A/J) и низко-(С3Н)отвечающие на моноэпитопный (Т*)4 MAP мыши также высоко (или низко) отвечали продукцией антиспорозоитных антител на иммунизацию диэпитопным MAP. 002545 18 Вакцины Заявленные в настоящем изобретении композиции могут использоваться как иммуногены для создания иммунитета, включая защитный иммунитет, у чувствительного хозяина. Иммунитет может включать индукцию образования у хозяина антител (или у другого хозяина, или in vitro, как в случае пассивной иммунизации), которые будут распознавать и связывать плазмодиальные клетки. Таким образом, иммуногенные композиции, содержащие универсальные Т-клеточные эпитопы, можно применять в вакцинных препаратах для создания профилактического или терапевтического иммунитета путем предотвращения (полностью или частично) развития заболевания у хозяина, например, путем подавления развития преэритроцитной стадии организма-паразита. Необходимо отметить, что 100%-ное подавление на любой стадии малярийной инфекции или размножения паразита при помощи иммуногенной композиции (или при помощи содержащей ее вакцины, или антителами) не является необходимым при применении подобных материалов. Любое существенное снижение уровня инфекции (определенное, например, по уровню паразитемии) будет значительно облегчать клинические симптомы и значительно повышать вероятность выживания и выздоровления хозяина. Из уровня техники известен ряд протоколов получения вакцин. Обычно вакцины готовят в виде инъекционных препаратов, растворов или суспензий. Могут быть также приготовлены твердые формы, применяемые для растворения или суспендирования в жидкости непосредственно перед инъекцией. Препарат может быть эмульгирован или инкапсулирован в липосомы. Активные иммуногенные ингредиенты можно смешать с такими наполнителями, как, например, вода, буфер, дестроза, глицерин, этанол и им подобные, или с их сочетаниями. Кроме того, при необходимости, вакцина может включать небольшие количества дополнительных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, вещества для поддержания рН и/или адъюванты для повышения эффективности вакцины. Иммуногенные композиции могут также вводиться после введения в липосомы или другие микроносители. Может потребоваться вторичная иммунизация для развития у хозяина иммунного ответа. Как количество иммуногена, так и протокол иммунизации могут быть определены экспериментально, как известно из уровня техники, с использованием животных (например, приматов), за которыми следуют клинические испытания на людях. Информация о вакцинных композициях и иммунизации приведена, например в Патенте США № 4,767,622, Ristic (30 августа, 1988); в Патенте CШA № 4,735,799, Patarroyo (5 19 апреля, 1988); в статье Patarroyo, M.E. et al., Nature 332:158, 1988 и в опубликованной Заявке на европейский патент А1 250,261 (опубликована 23 декабря 1987) Wellcome Foundation. Вакцины можно вводить подкожно, внутримышечно, орально, внутрикожно или интраназально. Дозировки могут находиться в пределах от около 5 мкн до около 5 мг на дозу; могут применяться как единичные, так и множественные дозировки. Количество вводимого препарата, количество введений и их график могут быть определены эмпирически, так, например, путем создания матрицы дозировок, частот введения и сравнительных групп экспериментальных единиц или субъектов для каждой точки матрицы. В настоящем изобретении также заявлены способы подавления размножения малярийного организма в чувствительном млекопитающем, которые включают введение млекопитающему иммуногенно эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей один или несколько из следующих компонентов: (i) по меньшей мере, один малярийный пептид, содержащий В-клеточный эпитоп, способный к стимуляции продукции антималярийных (т.е. нейтрализующих) антител, направленных на спорозоитную стадию организма; и (ii) по меньшей мере, один малярийный пептид, содержащий универсальный Т-клеточный эпитоп, способный вызывать антималярийный Тклеточный ответ у вакцинированных различного генетического происхождения. Иммуногенно эффективным количеством является такое количество, которое вызывает защитный иммунитет против малярийного организма, как он определен выше. В качестве другого аспекта изобретения, композицию можно вводить млекопитающему, уже контактировавшему ранее с малярийным организмом. В качестве другого аспекта изобретения, полипептид можно вводить млекопитающему до контакта млекопитающего с малярийным организмом. Следующие примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают его объем. Пример 1. Антималярийные вакцины, содержащие MAP. Исследования, выполненные на мышах различного генетического происхождения, показали, что пептидные вакцины, содержащие Т* эпитоп (см. выше), иммуногенны в отсутствие адъюванта, например, при введении в фосфатном буфере. Усиленный антительный ответ был получен при использовании таких адъювантов, как алюм (Rehydragel, Reheis NJ) или QS21 (Cambridge Biotech, Cambridge MA). Обычная МАР-содержащая вакцина содержит 1 мг (Т*Т1В)4МАР, смешанного со 100 мкг QS21. Эту вакцину вводили подкожно. 002545 20 Пример 2. Индукция CS-специфических антител у людей. Следующие эксперименты были проведены для того, чтобы проверить эффект иммунизации вакциной, содержащей универсальный Тклеточный эпитоп, на людей различного генетического происхождения. Методы: была получена полиоксимная синтетическая малярийная вакцина, обозначенная (ТIВТ*)4-Р3С. Вакцина содержит описанный выше универсальный Т-клеточный эпитоп (Т*) в сочетании с 28-остаточной последовательностью повторов, полученной из CS повторов P.falciparum, (DPNANPNV)2(NANP)3, (обозначенной как TIB). Вакцина также содержала ковалентно связанный синтетический адъювант, трипальмитоил цистеин (Pam3Cys), присоединенный к лизиновому ядру. Способы синтеза иммуногенных полиоксимных композиций в целом описаны в заявке на международный патент WO 94/25071. Способы синтеза Т*содержащих полиоксимов описаны в заявке, основанной на более ранней заявке, серийный № 60/034,506, поданной 24 декабря 1996. Вакцину вводили подкожно без дополнительных адъювантов или эмульгаторов десяти добровольцам, которые экспрессировали широкий спектр гаплотипов класса II (табл. 4). Вакцинацию проводили в дни 0 и 28. Сыворотки брали до иммунизации, на 14 и 42 дни после иммунизации. Титры антител определяли с применением энзим-связанного иммуносорбентного теста (ELISA) на планшетах, покрытых или триэпитопным полиоксимным иммуногеном (ТIВТ*)4, или диэпитопным MAP, содержащим только CS повторы (ТIВ)4. Планшеты инкубировали с двукратными серийными разведениями сывороток (начиная с разведения 1:80), после чего планшеты промывали и проводили реакцию с меченными пероксидазой античеловеческими IgG. Присутствие связанных антител выявляли добавлением субстрата пероксидазы (ABTS) и измерением оптической плотности (OD) при 410 нм. Конечные титры представляли как конечные разведения иммунных сывороток, для которых значение O.D. было больше, чем среднее O.D. + 3 стандартных отклонения, полученное с сыворотками десяти добровольцев до вакцинации. Результаты: Как видно из табл. 4, через 14 дней после введения первой дозы вакцины антитела, специфичные к полиоксимному иммуногену, обнаруживались у 50% вакцинированных. Введение второй дозы полиоксимной вакцины на 28 день повышало антительный антипептидный ответ, и положительные реакции были характерны для сывороток большинства вакцинированных. Кроме того, были обнаружены антитела, специфически реагировавшие с CS повторами, как показано ELISA с использованием (TIB)4 MAP. Область повторов CS белка 21 P.falciparum является мишенью для протективных антител, которые могут нейтрализовать инфекционность спорозоитов, блокируя инвазию гепатоцитов хозяина и предотвращая начало жизненного цикла малярийного плазмодия в млекопитающем-хозяине. Наконец, у всех индивидуумов после введения второй дозы вакцины отмечен положительный антительный (IgM) ответ. Таблица 4. Иммуногенность полиоксимной вакцины, содержащей универсальный Т-клеточный эпитоп Т* P.falciparum, для добровольцев различных HLA гаплотипов HLA Номер гапло- Первичный ответ Вторичный ответ добровольца тип (TIBT*)4 (TIB)4 (ТIВТ*)4 (TIB)4 ELISA ELISA ELISA ELISA DR <80 <80 <80 <80 03 7,11 DR 04 160 <80 2,560 > 1,280 11,15 DR 05 N.S. N.S. 320 320 4,13 DR 06 <80 <80 80 <80 8,15 07 DR 3,7 80 <80 80 <80 DR 08 160 <80 1,280 640 14,16 DR 320 320 > 2,560 > 1,280 09 4.15 10 DR 4,7 <80 <80 > 1,280 > 1,280 14 DR 3,4 160 <80 640 160 15 DR 3,4 <80 <80 640 320 а. Первичный IgG-антительный ответ определяли в сыворотках, собранных после 14-го дня с момента подкожного введения 1 мг(ТIВТ*)4 полиоксимной вакцины. Вторичный IgG-антительный ответ определяли в сыворотках, собранных после 14-го дня с момента второго введения вакцины в день 28. Приведенные результаты свидетельствуют о том, что вакцина, содержащая универсальный Тклеточный эпитоп, способна индуцировать выработку у всех вакцинированных, направленных к повторам антител IgG и IgM, специфичных к белку SC P.falciparum. Таким образом, введение в состав вакцины универсального эпитопа дает возможность преодолеть генетические ограничения в иммунном ответе на повторы SC и обеспечивает возможность получения синтетической пептидной вакцины, которая иммуногенна для индивидуумов различного генетического происхождения. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Иммуногенная композиция содержит первый малярийно-производный синтетический пептид с универсальным Т-клеточным эпитопом, причем указанный универсальный Т-клеточный эпитоп а) имеет картину алифатических и ароматических остатков, идентичную пептиду с последовательностью EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT (SEQ ID NO:3); б) является производным от циркумспорозоитного (CS) протеина плазмодиальных разновидностей; и 002545 22 с) связывает множество молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) Класс II, при этом данная композиция вызывает антималярийный Т-клеточный ответ у млекопитающих различного генетического происхождения. 2. Иммуногенная композиция по п.1, содержащая дополнительно второй малярийный пептид, который содержит В-клеточный эпитоп, стимулирующий выработку антималярийных антител у млекопитающих. 3. Иммуногенная композиция по п.2, отличающаяся тем, что указанный первый пептид встроен в пептид с множественной антигенной активностью. 4. Иммуногенная композиция по п.2, отличающаяся тем, что указанные первый и второй пептиды встроены в пептид с множественной антигенной активностью. 5. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанный первый пептид включает последовательность EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT. 6. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель или растворитель. 7. Вакцина по п.6, содержащая дополнительно фармацевтически приемлемый адъювант. 8. Способ подавления размножения малярийного организма в организме чувствительного млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему иммуногенно эффективного количества вакцины по п.6. 9. Способ индукции защитного иммунитета против малярии у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему иммуногенно эффективного количества вакцины по п.6. 10. Иммуногенная композиция, содержащая первый малярийный пептид, включающий последовательность EYLNKIQNSLSTEWSPCSVT, и вызывающая антималярийный Т-клеточный ответ у млекопитающих различного генетического происхождения. 11. Иммуногенная композиция по п.10, содержащая дополнительно второй малярийный пептид, который содержит В-клеточный эпитоп, стимулирующий выработку антималярийных антител у млекопитающих. 12. Вакцина, содержащая иммуногенную композицию по п.10 и фармацевтически приемлемый носитель или растворитель. 13. Вакцина по п.12, содержащая дополнительно фармацевтически приемлемый адъювант. 14. Способ подавления размножения малярийного организма в организме чувствительного млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему иммуногенно эффективного количества вакцины по п.12. 15. Способ индукции защитного иммунитета против малярии у млекопитающего, включающий введение указанному млекопитающему иммуногенно эффективного количества вакцины по п.12. 23 Фиг. 1А 002545 24 Фиг. 3А Фиг. 3В Фиг. 1В Фиг. 4А Фиг. 2А Фиг. 4В Фиг. 2В 25 002545 26 Фиг. 4С Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, ГСП-9 101999, Москва, Центр, М. Черкасский пер., 2/6
