011951 - 1 - A. Область, к которой относится изобретение

011951
A. Область, к которой относится изобретение
Данное изобретение относится к способам лечения опухолевых заболеваний, а именно к способам,
в которых используются молекулы иммуноглобулина. В частности, данное изобретение относится к способам лечения, включающим использование молекул иммуноглобулина против антигена EpCAM. Данное изобретение, кроме того, относится к использованию таких иммуноглобулинов для получения лекарственных препаратов. И еще данное изобретение относится к молекулам иммуноглобулина, которые могут быть использованы при лечении опухолевых заболеваний, а также к композициям, содержащим такие молекулы иммуноглобулина.
B. Уровень знаний в данной области
При составлении схемы лечения, включающей введение молекул иммуноглобулина, имеют место
некоторые факторы, которые должны быть рассмотрены. С одной стороны, лечебный иммуноглобулин
должен вводиться пациенту в количестве, достаточном для достижения желаемого терапевтического эффекта. Этот эффект должен быть реализован при начальном курсе лечения и реализация должна быть
продолжена в значительной степени, насколько это возможно, когда иммуноглобулин постепенно выводится из организма пациента в промежутке времени между двумя последовательными введениями. С
другой стороны, количество вводимого иммуноглобулина не должно быть так велико, чтобы вызвать у
пациента отрицательный и/или токсичный побочный эффект.
Следовательно, возникает проблема, когда максимальная доза иммуноглобулина, которая может
быть допущена без возникновения побочных эффектов (максимально допустимая доза), ограничивает
количество иммуноглобулина до разовой дозы, которая недостаточна для длительного поддержания минимального уровня иммуноглобулина, необходимого для обеспечения продолжительной эффективности
действия. При таком плане лечения становится невозможным поддержание "минимального уровня сыворотки", необходимого для обеспечения продолжительного терапевтического эффекта до следующего
введения иммуноглобулина. "Минимальный уровень сыворотки" лечебного препарата означает здесь
самую низкую концентрацию, которой может достичь препарат в крови пациента без потери терапевтического эффекта. Это показывает, кроме того, минимальное количество лечебного препарата, которое
должно всегда присутствовать в крови пациента для того, чтобы реализовывалось благоприятное терапевтическое воздействие.
Существует несколько подходов к решению проблемы поддержания необходимого минимального
уровня сыворотки лечебного иммуноглобулина. Одним из подходов является увеличение начальной дозы иммуноглобулина для пациента. Однако этот подход обладает тем недостатком, что уровень лечебного иммуноглобулина, который является безопасным для пациента, может быть превышен, и пациент,
таким образом, может испытать отрицательное и/или токсичное побочное воздействие.
Другим подходом является увеличение частоты введения лечебного иммуноглобулина. Однако повышение частоты введения приводит к неуклонному ухудшению качества жизни пациента из-за необходимости многочисленных и частых посещений клиники. Это особенно неприятно в том случае, когда
лечение болезни производится на ранних стадиях и пациент во всех иных отношениях способен вести
нормальный образ жизни.
Кроме того, повышенная частота введения предполагает увеличение общего количества лечебного
иммуноглобулина, который необходим для полной программы лечения. По существу, повышенная частота введения предполагает более высокие общие издержки, связанные с данной схемой лечения, по
сравнению со схемой лечения, в которой лечебный иммуноглобулин вводится не так часто.
В случае когда лечебный иммуноглобулин, который должен быть введен пациенту, является специальным антителом для антигена, который присутствует как в здоровой, так и в больной ткани, причем
этот антиген преобладает в больной ткани про сравнению со здоровой, становится все более важным совершенствовать программу лечения, учитывая вышеуказанные моменты. Здесь особенно велик риск того, что слишком высокое или слишком частое дозирование приведет к нежелательному взаимодействию
между лечебным иммуноглобулином и антигеном, с которым лечебный иммуноглобулин особым образом связывается. Эти взаимодействия между иммуноглобулином и здоровой тканью приводят к отрицательным и/или токсичным побочным эффектам, которые могут осложнить программу лечения с использованием иммуноглобулина.
Одним из таких антигенов, присутствующих как в здоровой, так и в больной ткани человека, является фактор адгезии эпителиальной клетки (epithelial cell adhesion molecule, "EpCAM", также называемый
17-1A антиген, KSA, EGP40, GA733-2, ks 1-4 и esa). EpCAM является поверхностным гликопротеидом
(surface glycoprotein), экспрессируемым клетками простых эпителиев и клетками опухоли, происходящими из них. Хотя EpCAM показывается на поверхности клеток из здоровой ткани, его экспрессия подвергается повышающей регуляции в злокачественной ткани. EpCAM служит для адгезии эпителиальных
клеток ориентированно и строго упорядоченно (Литвинов, J.Cell Biol, 1997, 139, 1337-1348). Данные экспериментов с трансгенными мышами и крысами, экспрессирующими человеческий EpCAM на своих
эпителиях, показывают, что EpCAM на здоровой ткани не может, однако, быть доступным систематически вводимому антителу (Маклоклин, Cancer Immunol. Immunother. 1999, 48, 303-311). При злокачественной трансформации эпителиальных клеток быстро растущие клетки опухоли нарушают строгий по-1-
011951
рядок клеток эпителия. Следовательно, поверхностное распределение EpCAM меньше ограничивается, и
антиген лучше экспонируется на клетках опухоли. Вследствие своего происхождения из эпителиальных
клеток клетки опухоли из наибольших новообразований все еще экспрессируют EpCAM на своей поверхности.
В прошлом утверждалось, что EpCAM является оправдывающей себя целью для лечения рака моноклональным иммуноглобулином, особенно у пациентов с минимальным остаточным поражением,
страдающих от рассеянных опухолевых клеток, которые позже могут вызвать метастазы и тем самым
ухудшить прогноз пациента. У пациентов с минимальным остаточным колоректальным раком специальное средство с мышиным моноклональным иммуноглобулином против EpCAM понижало 5-летнюю летальность на 30% по сравнению с нелеченными пациентами, когда применялось систематически в пяти
дозах в пределах четырех месяцев после хирургии первичной опухоли (Ретмюллер, Lancet 343 (1994),
1177-83). В более позднее время сильную сверхэкспрессию EpCAM описывали примерно у 40% пациентов с раком молочной железы и ассоциировали с плохим общим периодом ремиссии (Спиззо и др., Int.
J.Cancer 98 (2002), 883-8). Еще позже экспрессию EpCAM анализировали у 3722 пациентов. Обнаружено,
что экспрессия EpCAM очень распространена в эпителиальных опухолях, причем такая экспрессия наблюдалась более чем в 88% проб опухолей. Более конкретно, экспрессия EpCAM наблюдалась при 94,1%
яичникового рака, 94% рака толстой кишки, 92,3% рака желудка, 90,1% рака простраты и 70,9% рака
легких.
Одним из примеров (мышиного) моноклонального антитела, распознающего EpCAM, является
Edrecolomab (Panorex) (Копровский, Somatic Cell Genet. 1979, 5, 957-971 и Герлин, Cancer Res., 1980, 40,
717-721; вводится с помощью ссылок). Однако первое введение Panorex во время дополнительной иммунотерапии рака толстой кишки привело к развитию и обострению гранулематоза Вегенера, наводя на
мысль, что Panorex должен применяться осторожно в случае пациента с аутоаллергической болезнью
(Франц, Oncologie, 2000, 23, 472-474; вводится с помощью ссылки). Ограничениями Panorex являются
быстрое образование человеческих антимышиных антител, ограниченная способность взаимодействия с
помощью его мышиного рецептора IgG2a Fcy с человеческими иммунными эффекторными механизмами
и короткий период полувыведения при циркуляции (Фродин, Cancer Res., 1990, 50, 4866-4871; вводится с
помощью ссылки). Кроме того, мышиное антитело вызывало у пациентов аллергические реакции немедленного типа и анафилаксию на повторную инъекцию (Ретмюллер, Lancet 1994, 343, 1177-1183, Ретмюллер, J Clin. Oncol.., 1998, 16, 1788-1794 и Мелстедт, Annals New York Academy of Sciences 2000, 910, 254261; каждая введена с помощью ссылки).
Другим известным иммуноглобулином против EpCAM является ING-l (Левис, Curr. Op. Mol. Ther.
5,433-6,2003; вводится с помощью ссылки). ING-l является мышино-человеческим химерным иммунолобулином IgG1, в настоящее время проходящим клинические испытания в фазе 1/11 на пациентах с запущенными эпителиальными опухолями. Хотя доза иммуноглобулина 1 мг/кг была установлена для обеспечения наибольшего эффекта на мышах, которым предварительно были впрыснуты человеческие опухолевые клетки, эта дозировка привела к панкреатиту у 2 из 2 пациентов-людей с аденокарциномами
(повышение амилазы и липазы вместе с болями в животе), препятствуя повышению добавочной дозы.
Установлено, что максимальная допустимая доза, вводимая внутривенно каждые три недели, должна
составлять только 0,3 мг на килограмм массы тела. Учитывая, что период полувыведения ING-1 при такой дозировке составляет около 31 ч, и предполагая, что средняя масса взрослого человека составляет 75
кг, а объем крови 4,25 л, уровень сыворотки ING-1 по прошествии 21 дня ( то есть, после 16,25 периодов
полувыведения) должен упасть ниже 7×10-5 мкг на миллилитр крови, т.е. более чем на четыре порядка
величины ниже, чем уровень сыворотки 1 г/мл, необходимый для максимального цитолитического эффекта. Следовательно, максимальная допустимая доза ING-1 предотвращает сохранение необходимого
минимального плазменного уровня иммуноглобулина против EpCAM.
Следовательно, существует необходимость в программе лечения, включающей антитела против антигена EpCAM, которая может быть использована для лечения рака. Соответственно, целью данного
изобретения является обеспечение программы лечения, включающей иммуноглобулины против EpCAM,
которая решает проблемы, указанные выше.
Краткое изложение сущности изобретения
Упомянутая необходимость удовлетворяется способом лечения опухолевых болезней у пациентачеловека путем введения этому пациенту человеческого иммуноглобулина, особым образом связывающегося с человеческим антигеном EpCAM, причем упомянутый иммуноглобулин обладает периодом
полувыведения сыворотки по меньшей мере 15 дней, а упомянутый способ содержит этап введения упомянутого иммуноглобулина не чаще, чем один раз в неделю.
С помощью использования иммуноглобулина против EpCAM, имеющего период полувыведения
сыворотки по меньшей мере 15 дней, возможна реализация некоторых положительных эффектов. Наиболее важно то, что этот относительно длительный период полувыведения сыворотки означает, что иммуноглобулин против EpCAM, введение которого является частью предлагаемого способа, не будет выделяться из крови так быстро, как другой иммуноглобулин с более коротким периодом полувыведения,
например упомянутый выше IMG-1. При условии, что иммуноглобулин против EpCAM, отвечающий
-2-
011951
требованиям к иммуноглобулину, используемому в предлагаемом способе, и иммуноглобулин против
EpCAM, не отвечающий этим требованиям, вводятся человеку оба одновременно и в абсолютно идентичных количествах, большая часть первого иммуноглобулина, нежели последнего, будет сохраняться в
сыворотке по прошествии указанного времени. В обратном смысле повышенное сохранение в сыворотке
позволяет вводить за один раз меньше иммуноглобулина, используемого в предлагаемом способе, чем
это возможно для других средств аналогичного назначения с более коротким периодом полувыведения
сыворотки, сохраняя пари этом определенный заданный минимальный уровень сыворотки, то есть обеспечивая гарантию того, что общая концентрация терапевтического средства никогда не упадет ниже минимального уровня, необходимого для сохранения эффективности действия в период между двумя последовательными введениями. Выгода здесь заключается в том, что для каждой дозы требуется меньше
иммуноглобулина, используемого в предлагаемом способе, благодаря чему устраняется или, по крайней
мере, уменьшается возможность возникновения каких-либо отрицательных и/или токсичных побочных
эффектов.
Относительно большой период полувыведения иммуноглобулина против EpCAM , используемого в
предлагаемом способе, означает также, что отпадает необходимость в частом введении лекарственного
препарата, вследствие чего повышается качество жизни пациента и уменьшается общая стоимость лечения.
То обстоятельство, что иммуноглобулин против EpCAM, используемый в предлагаемом способе,
является человеческим иммуноглобулином, уменьшает или даже устраняет возможность нежелательной
иммунной реакции со стороны иммунной системы пациента на вводимый иммуноглобулин. По существу, проблемы, связанные с человеческими противомышиными антителами ("HAMAs") и наблюдаемые,
когда в терапии используется много мышиных или даже мышино-человеческих химерных иммуноглобулиновых молекул, не возникают в связи с предлагаемым способом.
Хотя и не будучи связаны теорией, изобретатели полагают, что иммуноглобулин против EpCAM,
как используемый в этом аспекте изобретения, проявляет терапевтический эффект, основанный по крайней мере на одном из двух различных механизмов in vivo. Один из механизмов известен как опосредованная антителами клеточная цитотоксичность ("ADCC"). В ADCC клетка ("клетка-мишень"), которая
обволакивается иммуноглобулином, убивается клеткой ("клетка-эффектор ") с Fc-рецепторами, которые
распознают Fc-часть иммуноглобулинового покрытия клетки-мишени. В большинстве случаев клеткиэффекторы, участвующие в ADCC, являются природными клетками-киллерами, которые несут на своей
поверхности или Fc-рецептор Fc-D-RIII, или/и молекулу CD16. Этим способом уничтожаются только
клетки, покрытые иммуноглобулином, поскольку специфичность убийства клетки находится в определенном соотношении непосредственно со специфичностью связывания иммуноглобулина, обволакивающего такую клетку.
Другим механизмом, с помощью которого иммуноглобулин, используемый в этом аспекте данного
изобретения, проявляет терапевтический эффект, является механизм, известный как опосредованная комплементами цитотоксичность ("CDC"). В CDC два идентичных иммуноглобулина на поверхности клетки-мишени связываются с двумя идентичными антигенами (например, здесь EpCAM) таким образом, что
их соответствующие Fc-части приходят в близкое соседство друг с другом. Этим ходом действия привлекаются дополнительные белки, среди которых clq, с3 и с9, последний из которых создает пору в клетке-мишени. Клетка-мишень убивается этой перфорацией. В то же самое время клетка-мишень (клеткимишени) также становится (становятся) декорированной при других местоположениях на своей (своих)
поверхности (поверхностях) в процессе, называемом опсонизацией. Такая декорация привлекает клеткиэффекторы, которые затем убивают клетку-мишень (клетки-мишени) способом, аналогичным описанному выше в связи с механизмом ADCC.
Благодаря длительному периоду полувыведения иммуноглобулина, используемого в способе, соответствующем этому аспекту данного изобретения, преимущество одного или обоих вышеописанных механизмов может быть использовано в течение более длительного времени и на более высоких уровнях,
чем это возможно при использовании иммуноглобулина против EpCAM с более коротким периодом полувыведения.
В соответствии с этим аспектом данного изобретения иммуноглобулин против EpCAM вводится
пациенту не более часто, чем один раз в неделю, предпочтительно не более часто, чем один раз в две недели. В этом отношении преимущественно используется длительный период полувыведения сыворотки
иммуноглобулина против EpCAM. В том случае, если введение выполняется один раз в неделю, только
небольшие количества иммуноглобулина будут необходимы для введения за один раз, поскольку более
чем половина ранее введенного иммуноглобулина будет еще сохраняться в крови пациента.
Это происходит потому, что одна неделя меньше, чем приблизительно 15-дневный период полувыведения ранее введенного иммуноглобулина.
В случае если введение выполняется один раз в две недели, частота дозирования в соответствии с
предлагаемым способом приблизительно соответствует периоду полувыведения иммуноглобулина. По
существу, уровень сыворотки этого иммуноглобулина в промежуток времени между двумя последовательными введениями никогда не уменьшается более чем на половину его величины непосредственно
-3-
011951
после соответствующего предшествующего введения. Это означает, что дозирование любого данного
введения должно быть не выше количества, необходимого для того, чтобы привести непосредственно
после введения к удвоению заданного минимального уровня сыворотки, достигаемого к моменту времени следующего введения.
В общем, можно разграничить две фазы введения: первую "ударную фазу", в которой одна или несколько доз насыщения вводятся таким образом, чтобы достичь определенного постоянного уровня
плазмы иммуноглобулина, и последующую "поддерживающую фазу", в которой многочисленные поддерживающие дозы вводятся для того, чтобы поддержать желаемый уровень плазмы иммуноглобулина.
Доза (дозы) насыщения обычно вводится в большем количестве и/или с более частой последовательностью, чем более поздние поддерживающие дозы, тем самым сводя продолжительность ударной фазы к
минимуму.
В связи с ныне существующей схемой приема лекарственного средства, не соответствующей данному аспекту изобретения, практикующий врач оказывается перед выбором из двух вариантов: (1) либо
вводить иммуноглобулин против EpCAM в достаточно большом первоначальном количестве, чтобы
обеспечить, учитывая его быстрое выведение из организма, поддержание минимального уровня сыворотки перед следующим введением (в этом случае высокая начальная доза может вызвать отрицательные
и/или токсичные побочные эффекты, например панкреатит); либо (2) вводить иммуноглобулин против
EpCAM в достаточно низком первоначальном количестве, чтобы избежать отрицательных и/или токсичных побочных эффектов (в этом случае уровень сыворотки иммуноглобулина падает перед следующим
введением ниже минимально допустимого уровня, что приводит к потере терапевтического эффекта).
Компромисс состоит в повышении частоты введения низкой дозы, что приводит к значительному ухудшению качества жизни пациента.
В отличие от сказанного, способ, предлагаемый в этом аспекте данного изобретения, позволяет получить баланс, при котором, с одной стороны, отдельные дозы могут вводиться в количествах, которые
не приводят к отрицательным и/или токсичным побочным эффектам, и, с другой стороны, количество
лечебного иммуноглобулина в сыворотке не падает ниже минимального уровня, необходимого для непрерывного терапевтического эффекта между последовательными введениями. Ритм, по меньшей мере,
около одной недели между двумя последовательными введениями, предпочтительно около двух недель
между двумя последовательными введениями позволяет сохранить такой баланс, в то же время не ухудшая чрезмерно качество жизни пациента.
В соответствии с одним из вариантов осуществления данного изобретения уровень сыворотки антитела против EpCAM, все еще присутствующей после предшествующего введения, контролируется в крови пациента до осуществления следующего введения. Таким способом практикующий врач может избежать повторного введения иммуноглобулина против EpCAM слишком рано, например в том случае, если
в крови пациента еще присутствует обильное количество иммуноглобулина от предшествующего введения. Случайное передозирование, которое может привести к отрицательным и/или токсичным побочным
эффектам, тем самым устраняется также и для антитела, точный период полувыведения которого еще
неизвестен. В то же самое время практикующий врач, используя такие промежуточные измерения, которые в любом случае происходят, по крайней мере, на протяжении двух недель после предшествующего
введения, приобретает ценные знания относительно скорости выведения иммуноглобулина против EpCAM. Эти знания могут быть ценными для точного корректирования дополнительного графика введения. Такое точное корректирование позволяет ожидать того, что продолжительность промежутка между
последовательными введениями станет значительно большей чем одна неделя, предпочтительно больше
двух недель, вследствие чего дополнительно возрастет качество жизни пациента.
Преимущественно такой прерывистый контроль уровня сыворотки иммуноглобулина против EpCAM в крови пациента может выполняться следующим образом. Во-первых, практикующий врач может
определить по прошествии, по меньшей мере, одной недели, следующей за последним введением упомянутого иммуноглобулина, но до очередного введения упомянутого иммуноглобулина, уровень сыворотки этого иммуноглобулина, еще присутствующей в крови пациента, вследствие чего становится известной промежуточная величина уровня сыворотки для этого иммуноглобулина. Эта промежуточная величина уровня сыворотки для упомянутого иммуноглобулина затем сравнивается с заранее задаваемой величиной минимального уровня сыворотки для упомянутого иммуноглобулина. Если обнаруживается, что
промежуточная величина уровня сыворотки для упомянутого иммуноглобулина значительно превышает
заданный минимальный уровень сыворотки для упомянутого иммуноглобулина, то врач может спокойно
ожидать дальнейшего понижения уровня сыворотки иммуноглобулина против EpCAM. В это время могут быть повторены вышеуказанные этапы, чтобы получить значение нового промежуточного уровня
сыворотки упомянутого иммуноглобулина, которое затем будет понижаться до величины, более близкой
к заданному минимальному уровню. В любом случае не следует ожидать так долго, чтобы промежуточный уровень сыворотки, определенный для этого иммуноглобулина, опустился ниже заданного минимального уровня сыворотки для этого иммуноглобулина. Когда врач устанавливает, возможно, с помощью повторных циклов ожидания, определения промежуточного уровня сыворотки и сравнения этого
промежуточного уровня сыворотки с заданным минимальным уровнем сыворотки для специального им-4-
011951
муноглобулина против EpCAM, что промежуточный уровень сыворотки этого иммуноглобулина понизился до величины, лежащей в пределах определенного процентного отношения к упомянутому минимальному уровню сыворотки, может быть произведено следующее введение иммуноглобулина против
EpCAM, чтобы возвратить уровень сыворотки обратно к соответствующему значению для следующего
цикла выведения. Это определенное процентное отношение может соответствовать уровню сыворотки,
который находится в пределах 15%, предпочтительно в пределах 10%, наиболее предпочтительно в пределах 5% заданного минимального уровня сыворотки для специального иммуноглобулина, используемого против ЕрСАМ-антигена.
Промежуточный уровень сыворотки иммуноглобулина можно измерить любым способом, известным каждому ординарному специалисту, например, с помощью иммунологического анализа. Для этой
цели можно использовать, например, иммунофлюоресцентный анализ, радиоиммуноанализ или иммуносорбентный анализ с ферментной меткой - иммуноферментный твердофазный анализ, причем последний
предпочтительнее.
В предпочтительном варианте осуществления этого аспекта изобретения человеческий иммуноглобулин против EpCAM вводится не чаще одного раза в неделю. В особенно предпочтительном варианте
осуществления введение производится с интервалами в две недели, причем каждая последующая доза
эквивалентна по количеству первой введенной дозе, то есть все дозы равны между собой по количеству.
Введения по этому способу достаточно для поддержания уровня сыворотки иммуноглобулина, который
никогда не падает ниже заданного минимального уровня сыворотки, необходимого для полезного терапевтического эффекта этого иммуноглобулина и в то же время не вызывающего отрицательных и/или
токсичных побочных эффектов.
Однако в другом варианте осуществления представляется, что возможны частоты введения большие или много большие, чем две недели. В случае когда иммуноглобулин вводится с интервалами, большими чем две недели, количество антитела, вводимого в любое время после начальной дозы, должно
быть больше начальной дозы, выбранной в предположении интервала последующего введения в две недели. Количество, на которое такая последующая доза, вводимая больше чем через две недели, должно
превышать дозу, вводимую через две недели, может быть определено в каждом конкретном случае, например, с помощью фармакокинетического моделирования (например, с помощью WinNonlin 4.0.1, Pharsight Corporation, США, 2001) таким образом, как это описано в примерах, прилагаемых к настоящему
описанию. Любой ординарный специалист поймет, как можно построить и/или применить такое моделирование. Такое моделирование обычно строится таким образом, чтобы после соответствующего введения
не допустить падения уровня иммуноглобулина против EpCAM в сыворотке пациента ниже минимального уровня сыворотки, определенного с учетом необходимости терапевтической эффективности.
Длительный период полувыведения сыворотки человеческого иммуноглобулина против EpCAM гарантирует, что в течение этого более длительного промежутка времени между введениями, например
трех или даже четырех недель или любого промежуточного периода от 2 до 5 недель, поддерживается
заданный минимальный уровень сыворотки, необходимый для терапевтической эффективности. Другими словами, длительный период полувыведения сыворотки человеческого иммуноглобулина против EpCAM (то есть, около 15 дней) гарантирует, что достаточное количество этого иммуноглобулина будет
еще присутствовать в сыворотке от соответствующего предшествующего введения. Как результат, необходимо вводить меньшее количество человеческого иммуноглобулина против EpCAM с периодом полувыведения около 15 дней, чем антитела, не обладающего таким длительным периодом полувыведения
сыворотки. Это уменьшает риск возникновения отрицательных и/или токсичных побочных эффектов.
Следует заметить, что такие растянутые схемы введения и многочисленные преимущества, связанные с ними (смотри выше), были бы неосуществимы при иммуноглобулине с коротким периодом полувыведения, в то же время еще сохраняющем терапевтический эффект (например, при иммуноглобулине
ING, для которого был измерен у человека период полувыведения в диапазоне от 17 до 31 ч). Для гарантии того, что, по меньшей мере, заданный минимальный уровень сыворотки такого иммуноглобулина
против EpCAM будет сохраняться в сыворотке до следующего введения, должно быть введено столько
иммуноглобулина, что станут весьма вероятными отрицательные и/или токсичные побочные эффекты. С
другой стороны, устранение такой вероятности отрицательных и/или токсичных побочных эффектов
путем введения меньшего количества такого иммуноглобулина с коротким периодом полувыведения
привело бы к потере терапевтического эффекта в некоторой точке между двумя введениями, кодга количество иммуноглобулина, сохраняющегося в крови, упало бы ниже минимального уровня сыворотки.
Конечно, если это обусловлено клинической необходимостью или выгодой, человеческий иммуноглобулин против EpCAM с периодом полувыведения сыворотки около 15 дней может в добавочном
варианте осуществления вводиться с интервалами времени меньшими, чем две недели, например с интервалами в 1 неделю или в любой промежуточный период от 1 до 2 недель. Хотя при таком режиме не
используется полностью длительный период полувыведения сыворотки около 15 дней, имеются, тем не
менее, клинические ситуации, при которых такое введение может быть желательным. Чтобы избежать
нежелательного накопления человеческого иммуноглобулина у пациента в течение времени, предпочтительно уменьшить количество человеческого иммуноглобулина против EpCAM, вводимого с этими бо-5-
011951
лее короткими интервалами, относительно количества, которое необходимо было бы вводить при двухнедельном ритме введения. Количество, в котором такая последующая доза, вводимая после меньшего
чем две недели интервала, должно быть меньше, чем доза, вводимая после двухнедельного интервала, и
может определяться в каждом конкретном случае, например, с помощью фармакокинетического моделирования, описанного в примерах, прилагаемых к настоящему описанию. Любой из ординарных специалистов поймет, как построить и/или применить такое моделирование. Это моделирование преимущественно строится таким образом, чтобы после введения не допустить падения уровня иммуноглобулина в
сыворотке пациента ниже минимального уровня сыворотки, определенного с учетом необходимости терапевтической эффективности.
В соответствии с одним из вариантов осуществления данного изобретения введение может быть
внутривенным, внутрибрюшинным, подкожным, внутримышечным, локальным или внутрикожным.
Альтернативно, может быть использовано сочетание этих способов введения. Дополнительно предусмотрены правила совместного введения с другими соединениями, например структурами биспецифических антител, целевыми токсинами или иными соединениями, которые действуют с помощью Т-клеток,
или такими соединениями как противоопухолевые агенты, которые действуют с помощью других механизмов. Клиническая схема совместного введения иммуноглобулина против EpCAM может включать
совместное введение в одно и то же время, введение до или введение после других компонентов.
К опухолевым заболеваниям относятся рак молочной железы, рак эпителия, гепатоцеллюлярный
рак, холангиоцеллюлярный рак, рак желудка, рак толстой кишки, рак головы и шеи, рак кожи (меланома)
рак мочеполового тракта, например, яичниковый рак, внутриматочный рак, рак шейки и рак почек; рак
легких, рак тонкой кишки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак желчных
протоков, рак пищевода, рак слюнных желез и рак щитовидной железы.
В другом примере осуществления болезнь также может быть минимально резидуальной болезнью,
предпочтительно ранней твердой опухолью, запущенной твердой опухолью или метастазной твердой
опухолью, которая характеризуется локальным или нелокальным рецидивом опухоли, вызванным выживанием одиночных клеток.
В особо предпочтительном варианте осуществления этого аспекта изобретения опухолевое заболевание является раком простаты или раком молочной железы. Здесь особо предпочтительным является то,
что человеческий иммуноглобулин, вводимый против EpCAM, является одним из тех, которые содержат
тяжелую цепь иммуноглобулина с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO:1, и легкую цепь иммуноглобулина с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID N0:2. Когда такой
человеческий иммуноглобулин вводят против EpCAM, предпочтительно вводить его в соответствующем
количестве, то есть дозой 1-7 мг/кг массы тела, даже более предпочтительно 2-6 мг/кг массы тела один
раз каждые две недели.
В дополнительном аспекте данного изобретения предлагается применение человеческого иммуноглобулина, особым образом связывающегося с человеческим антигеном EpCAM и показывающего период полувыведения сыворотки, по меньшей мере, 15 дней, для получения препарата, используемого при
лечении опухолевых заболеваний. Иначе, для получения такого препарата может быть использована
композиция, содержащая такой иммуноглобулин. Препарат затем можно вводить в соответствии с графиком дозирования, кратко описанным выше, для выполнения способа лечения опухолевого заболевания.
В соответствии с одним из вариантов осуществления этого аспекта изобретения полученный препарат пригоден для введения внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно, локально или
внутрикожно. Иначе, введение может выполняться с помощью сочетания более чем одного из этих способов. Дополнительно предусмотрены правила совместного введения с другими соединениями, например структурами биспецифических антител, целевыми токсинами или другими соединениями, которые
действуют с помощью Т-клеток, или такими соединениями как противоопухолевые агенты, которые действуют с помощью других механизмов. Клиническая схема совместного введения иммуноглобулина против EpCAM может включать совместное введение в одно и то же время, введение до или введение после
других компонентов.
К опухолевым заболеваниям относятся рак молочной железы, рак эпителия, гепатоцеллюлярный
рак, холангиоцеллюлярный рак, рак желудка, рак толстой кишки, рак головы и шеи, рак кожи (меланома)
рак мочеполового тракта, например яичниковый рак, внутриматочный рак, рак шейки и рак почек; рак
легких, рак тонкой кишки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак желчных
протоков, рак пищевода, рак слюнных желез и рак щитовидной железы.
В другом примере осуществления болезнь также может быть минимально резидуальной болезнью,
предпочтительно ранней твердой опухолью, запущенной твердой опухолью и/или метастазной твердой
опухолью, которая характеризуется локальным или нелокальным рецидивом опухоли, вызванным выживанием одиночных клеток.
В дополнительном аспекте данное изобретение относится к человеческому иммуноглобулину, особым образом связывающемуся с человеческим антигеном EpCAM и показывающему период полувыведения сыворотки, по меньшей мере, 15 дней после введения пациенту-человеку. Преимущества, связан-6-
011951
ные с таким длительным периодом полувыведения сыворотки, подробно описаны выше в рамках применения такого антитела в способе лечения опухолевых заболеваний. Предпочтительно, чтобы иммуноглобулин показывал период полувыведения сыворотки 20, 19, 18, 17, 16 или 15 дней. Особенно предпочтительным является период полувыведения сыворотки около 15 дней.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления данного изобретения период полувыведения человеческого иммуноглобулина составляет 15 дней, а человеческий иммуноглобулин содержит тяжелую цепь иммуноглобулина с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO:1, и
легкую цепь иммуноглобулина с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO:2.
В дополнительном аспекте данного изобретения предлагается композиция, содержащая человеческий иммуноглобулин против EpCAM, как описано выше. Такую композицию можно вводить пациентучеловеку, что составляет часть схемы лечения заболевания. Принимая во внимание преобладание экспрессии фактора EpCAM в опухолевых заболеваниях, особо предпочтительным следует считать то, что
композиция может быть введена как часть схемы лечения и предназначена для лечения такого опухолевого заболевания. Опухолевые заболевания, лечение которых может осуществляться путем введения
композиции, соответствующей этому аспекту изобретения, включают рак молочной железы, рак эпителия, гепатоцеллюлярный рак, холангиоцеллюлярный рак, рак желудка, рак толстой кишки, рак головы и
шеи, рак кожи (меланома), рак мочеполового тракта, например яичниковый рак, внутриматочный рак,
рак шейки и рак почек; рак легких, рак тонкой кишки, рак печени, рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак желчных протоков, рак пищевода, рак слюнных желез и рак щитовидной железы.
В другом примере осуществления болезнь также может быть минимально резидуальной болезнью,
предпочтительно ранней твердой опухолью, запущенной твердой опухолью и/или метастазной твердой
опухолью, которая характеризуется локальным или нелокальным рецидивом опухоли, вызванным выживанием одиночных клеток.
В рамках этого аспекта изобретения такие опухолевые заболевания можно лечить либо поодиночке,
либо в комбинации, причем комбинация таких заболеваний возникает, например, вследствие распространения метастазами первичного опухолевого заболевания, что приводит к многочисленным вторичным опухолевым заболеваниям.
Термины "антитело ", "молекула антитела", "img" и "img-молекула" при использовании здесь следует понимать как эквивалентные. В определенных случаях при использовании множественного числа
подразумевается единственное число, а при использовании единственного числа подразумевается множественное число.
Краткое описание чертежей
Следующие чертежи являются частью данного описания и включены сюда, чтобы дополнительно
показать определенные аспекты данного изобретения. Изобретение можно лучше понять с помощью
ссылок на один или несколько из этих чертежей в сочетании с подробным описанием характерных примеров осуществления, приведенных здесь.
Фиг. 1 - схемы дозирования для когорт фазы 1.
Фиг. 2 - концентрация плазмы иммуноглобулина против EpCAM как функция времени на когорту.
Фиг. 3 - фармакокинетические параметры когорт пациентов после разовой дозы анти-ЕрСАМ иммуноглобулина.
Фиг. 4 - фармакокинетические параметры когорт пациентов после нескольких доз анти -EpCAM
иммуноглобулина.
Фиг. 5 - схематическое представление трехсекционной модели.
Фиг. 6 - максимальные и минимальные уровни плазмы иммуноглобулина против EpCAM с заданным минимальным уровнем 30 μг/мл.
Фиг. 7 - максимальный и минимальный уровни плазмы иммуноглобулина против EpCAM с заданным минимальным уровнем 10 μг/мл.
Фиг. 8А-F - иммуногистологическое окрашивание тканей, экспрессирующих EpCAM.
Фиг. 9 - средние значения полуколичественных гистологических показателей Ep-CAM у пациентов
с различными болезнями печени.
Фиг. 10 - уровни концентрации с течением времени.
Подробное описание изобретения
Следующие примеры включены сюда для того, чтобы показать предпочтительные варианты осуществления данного изобретения. Всем специалистам в данной области должно быть понятно, что методики, описанные в примерах, представляют собой способы, обнаруженные изобретателями, чтобы надлежащим образом осуществить данное изобретение на практике, и поэтому могут рассматриваться как
предпочтительные методики его осуществления. Однако в свете данного описания всем специалистам
должно быть понятно, что в характерные описанные здесь примеры можно внести многие изменения и
также получить подобные результаты без отступления от сущности и объема данного изобретения.
Пример 1. Получение фармакокинетических данных, измеряемых при исследовании фазы 1.
Когорты. Фармакокинетику иммуноглобулина против EpCAM, характеризуемого SEQ ID NO:1 и 2
-7-
011951
(здесь далее "Анти-ЕрСАМ "), исследовали у пациентов с гормональным рефрактерным раком простаты
после двух одиночных внутривенных вливаний с интервалом времени 14 дней. Вводимые дозы составляли 10, 20, 40, 64, 102, 164 и 262 мг на м2 площади поверхности тела. Двух или трех пациентов при каждом уровне дозы подвергали исследованию в день 1 и день 15. Пробы крови брали в 29-31 моменты времени взятия проб от дня 1 до дня 70 (56 дней после второго введения). Концентрацию сыворотки антиЕрСАМ измеряли с помощью иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA). Этот анализ проводили как обычный промежуточный (sandwich) иммуноферментный анализ, в котором в качестве захватного антитела использовали антитело крысы против анти-ЕрСАМ, а антитело цыпленка против антиЕрСМ - в качестве антитела обнаружения (как описано у Самбрука, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press). Схемы дозирования, использованные для когорт пациентов фазы 1, показаны на фиг. 1.
Символ "~ " в колонке 3 фиг. 1 означает, что величины, вычисленные для доз, несущих единицы мг/кг,
являются результатом усредненных доз (вычисленных для большого количества пациентов в соответствующей когорте), разделенных на среднюю массу тела (также вычисленных дня большого количества
пациентов в соответствующей когорте). По существу, соответственная величина дозирования представляет собой частное от деления двух средних значений.
Концентрация сыворотки. Уровни сыворотки анти-ЕрСАМ (средние значения ± стандартное отклонение из 2-3 определений) измеряли у отдельных пациентов после двух разовых внутривенных вливаний анти-ЕрСАМ. На фиг. 2 представлено сравнение индивидуальных профилей в пределах отдельных
когорт. Средняя концентрация/временной профиль (средние арифметические) получены для всех дозировочных групп пациентов с гормональным рефрактерным раком простаты после двух разовых внутривенных вливаний с интервалом времени 14 дней, как показано на фиг. 2.
Упрощенная схема дозирования. Пациенты получали персональное дозирование, которое вычислялось в миллиграммах анти-ЕрСАМ, разделенных на количество квадратных метров площади поверхности тела. Вследствие близости профилей сыворотки, наблюдаемых для различных пациентов в пределах одной дозировочной группы, проводили анализ, либо единственно возможным было упрощение дозировочной схемы. С этой целью профили когорт 5, 6 и 7 упорядочивали до равной общей дозы 500 мг и
результаты сравнивали с непостоянством уровней сыворотки.
Для 9 пациентов нормализация доз до 500 мг общей дозы привела к изменению уровней сыворотки
со средним коэффициентом (процент вариации) 26,6%. Коэффициент вариации колебался в пределах от
14,8 до 67,3%, наибольшая вариация наблюдалась при низких уровнях сыворотки. На основании этих
результатов упрощение схемы приема лекарственного средства до общей дозы рассматривалось как
осуществимое.
Фармакокинетика: неразделенная оценка. На фиг. 3 представлена итоговая сводка основных
фармакокинетических параметров (средние арифметические), вычисленных для пациентов всех семи
когорт с гормональным рефрактерным раком простаты после первого внутривенного вливания (разовая
доза) анти-ЕрСАМ. Основные фармакокинетические параметры (средние арифметические) анти-ЕрСАМ
после второго внутривенного введения (многократная доза) в день 14 показаны на фиг. 4.
Определения терминов, использованных на фиг. 3 и 4, приведены далее. Cmax - максимальная (измеренная) концентрация. AUCT - площадь под кривой концентрация/время (AUC), наблюдаемое в интервале одной дозы (T=14 дней), вычисленном по формуле трапеций от 14 до 28 дней (для многократной дозы). AUCINF относится к AUC, вычисленному по формуле трапеций от 0 ч до бесконечности в соответствии с формулой AUC∞ = AUCz + Cz/ke. t1/2 - средний кажущийся предельный период полувыведения
(ln2/λz), где термин "средний" относится к усредненному значению многочисленных величин, определенных для периода полувыведения сыворотки; термин "кажущийся" относится к экстраполяции кривой,
аппроксимирующей к выбранным фармокинетическим величинам на момент времени в бесконечности,
так что количество иммуноглобулина, присутствующее в сыворотке пациента в бесконечности, асимптотически приближается к нулю; и термин "предельный" относится к этому моменту времени в бесконечности. Параметр T является стандартным фармакокинетическим параметром, используемым как постоянный коэффициент умножения, а параметр z означает любой момент времени z. Clss относится к общему клиренсу организма, вычисленному по формуле доза/AUC. Vss - кажущийся объем распространения.
Vz - средний объем распространения. CL - средний объем очищения.
Средний кажущийся предельный период полувыведения (t1/2) определялся как 6,72±0,88 дней после
разовой дозы (вычисленной из 7-14 дней) и 14,74±4,23 дней после введения многократной дозы (вычисленной из последних трех моментов взятия пробы, то есть 28-42 дня или 35-70 дней). Величины периода
полувыведения различаются вследствие явно более длительного периода наблюдения после второй дозы,
причем измеренные величины периода полувыведения становятся более точными вследствие улучшения
аппроксимации кривой. По существу, величина для t1/2 - 14,74±4,23 дня - представляет более точное значение t1/2 , поскольку она была измерена в течение длительного периода времени.
После первого введения Vz составило 10,4 л и был определен средний объем клиренса 1,1 л/день.
Эти данные хорошо соответствовали результатам, вычисленным для второй дозы со средним Vz 11,5 л и
средним объемом клиренса (CL) 1,0 л/день. Кроме того, эти данные хорошо сопоставимы между всеми
-8-
011951
дозировочными группами (коэффициент вариации от 8,2 до 14,8%). В результате зависимость от дозы не
наблюдалась ни для параметра Vz, ни для параметра CL.
Линейность дозы. Определяли соотношение дозы с параметрами Cmax, AUClast(0-14)/AUCT(14-28) и
AUCinf. Для всех параметров (Cmax, AUClast(0-14)/AUCT(14-28) и AUCinf) можно предполагать линейное повышение дозы в исследованном диапазоне дозы.
Фармакокинетика: раздельная оценка. Блочный анализ основывался на двух различных моделях,
требующих постоянного вливания лекарственного препарата. Для оценки наилучшей раздельной модели
выбирали данные, полученные из когорты 6, относительно средней концентрации на время. Для обеих
оценок применяли профиль после второй дозы, поскольку именно тогда отмечалось более длительное
время наблюдения после введения препарата.
Для исследования наилучшего соответствия использовали следующие раздельные модели: 2секционная модель, 3-секционная модель.
Оценка была возможна при обеих моделях, однако наилучшее соответствие было получено при
анализе 3-секционной модели. Согласованность между наблюдаемым Y и прогнозированным Y после
анализа-3 была заметно лучше. Поэтому все дальнейшие оценки делались на основе этой 3-секционной
модели.
Фармакокинетику анти-ЕрСАМ исследовали у пациентов после внутривенных краткосрочных вливаний 10, 20, 40, 102, 164 и 262 мг на м2 площади поверхности тела. Лечению подвергались два или три
пациента на когорту. Пробы крови брали через 42 или 70 дней. Величины концентрации EpCAM измеряли методом иммуноферментного твердофазного анализа. Для всех пациентов можно было получить и
оценить полные профили сыворотки в момент времени свыше 42 или 70 дней.
Объем клиренса и объем распределения не выявили зависимости от дозы и не показали значительных различий между первой и второй дозой. На основе данных 7 когорты можно предполагать линейность дозы для параметров Cmax, AUCT1, AUClast и AUCinf в исследуемом диапазоне дозирования.
Раздельный анализ показал спад концентрации сыворотки анти-ЕрСАМ на три порядка при периоде
полувыведения 0,565 дня (t1/2α), 3,78 (t1/2β) и 13,3 дня (t1/2λz).
Как и ожидалось из предельного периода полувыведения (приблизительно две недели), моделирование различных схем приема лекарственного средства произвело наилучшие результаты для двухнедельного планирования. Моделирование недельной дозы привело к накоплению, тогда как введение каждые 4 недели имело результатом понижение уровней сыворотки EpCAM. Принимая во внимание достижение заданных минимальных уровней насколько возможно быстро, рекомендуется ударная доза с
двойным количеством наряду с поддерживающей дозой.
Пример 2. Моделирование стратегии дозирования анти-ЕрСАМ на основе данных измерений, полученных при исследовании фазы 1.
Схема приема лекарственного средства и продолжительность лечения, выбранные для этого исследовании, основываются на фармакокинетическом моделировании результатов клинического изучения
фазы I/II с анти-ЕрСАМ для пациента с раком простаты. Целью моделирования было получить график
дозирования для анти-ЕрСАМ, позволяющий достичь минимальных уровней сыворотки 10 и 30 мг/мл.
На основе доклинических экспериментов ожидалось, что минимальный уровень сыворотки 10
мг/мл должен быть эффективным для противоопухолевой активности анти-EpCAM. Однако не исключалось, что более высокие дозы могут быть более эффективными. Следовательно, вторая доза, вычисленная для достижения минимального уровня сыворотки 30 мг/мл, должна получить оценку при клинических исследованиях. При этой минимальной концентрации сыворотки не ожидается дополнительной
токсичности, поскольку значения Cmax и AUC не превышают величин, наблюдаемых при клинических
исследованиях фазы 1.
Принимая во внимание лучшее соответствие, моделирование во всех случаях основывали на данных анализа 3-секционной модели от когорт 5-7.
Целью моделирования была оценка оптимальной схемы введения и необходимых доз, принимая во
внимание частоту (еженедельно, один раз в две недели, каждые 4 недели), различные минимальные
уровни (10 мг/мл, 30 мг/мл анти-ЕрСАМ), и оценка выгоды ударной дозы анти-ЕрСАМ.
Как и ожидалось, имея в виду предельную величину периода полувыведения приблизительно две
недели, к наилучшим результатам привела двухнедельная схема приема лекарственного средства. С применением частоты введения 7 дней и 28 дней моделирование имело результатом накопление или небольшое понижение уровня сыворотки, соответственно. Применение ударной дозы (LD) привело к непосредственному достижению необходимых минимальных уровней. Последующие дозы и соответствующие минимальный и максимальный уровни сыворотки моделировались для внутривенного введения анти-ЕрСАМ.
Введение каждые 14 дней. Как и ожидалось, имея в виду предельную величину периода полувыведения анти-ЕрСАМ, введение один раз в две недели дало в результате моделированные профили с постоянными величинами Cmin и Cmax и, следовательно, могло рассматриваться как рекомендуемая схема
приема лекарственного средства. Таким образом, для вычисления необходимых доз, приводящих к заданным минимальным уровням 10 и 30 мг/мл анти-ЕрСАМ, была выбрана двухнедельная модель.
-9-
011951
Начальные параметры для вычислений были получены с помощью блочного анализа.
Данные исследований: фармакокинетические измерения, полученные при изучении фазы I/II рака
простаты.
Программное обеспечение: WinNolin 4.0.1 (Pharsight Corporation, USA; 2001).
Модель: PK Model 19 (3-секционная, IV- инфузия, макропостоянные, без латентного периода, очищение первого порядка, равномерная нагрузка).
Фиг. 5 является схематическим представлением 3-секционной модели, в которой 1 - центральная
секция, а 2 и 3 - две различные периферийные секции. Центральная секция находится в непосредственном равновесии с плазмой. Периферийная секция требует некоторого времени, чтобы достичь равновесия с центральной секцией после введения лекарства. K13, K31, K12, K21, K10 являются соответствующими постоянными скорости, в которых порядок цифр 13, 31 и т.д. означает направление прохождения
анти-ЕрСАМ.
Моделирование растянулось на период в 120 дней, хотя данные первоначального исследования ограничивались периодом в 70 дней. Каждое моделирование основывалось на ударной фазе (то есть введении лекарства в дни 1, 8 и 15) и поддерживающей фазе (то есть, введении лекарства в дни 29 и каждый
14 после этого):
группа А (низкая доза): ударная фаза - 2 мг анти-ЕрСАМ на килограмм массы тела еженедельно
(дни 1, 8, 15), за которой следуют 23 поддерживающие дозы по 2 мг анти-ЕрСАМ на килограмм массы
тела каждую вторую неделю;
группа В (высокая доза): ударная фаза - 6 мг анти-ЕрСАМ на килограмм массы тела еженедельно
(дни 1, 8, 15), за которой следуют 23 поддерживающие дозы по 6 мг анти-ЕрСАМ на килограмм массы
тела каждую вторую неделю.
Дозы, подразумеваемые в этом исследовании, приводят к фармакокинетическим параметрам (то
есть Cmax и AUC), которые не превышают измеренных величин при самых высоких дозах, вводимых пациентам при исследовании фазы I. Ударные фазы и поддерживающие фазы вычисляли, используя фармакокинетическое моделирование, чтобы достичь заданных минимальных концентраций сыворотки в
пределах короткого интервала времени и избежать максимальных концентраций плазмы, которые могли
бы превысить концентрации, определенные при исследовании фазы I.
На фиг. 6 показано моделирование введения анти-ЕрСАМ с двухнедельным интервалом, описанное
выше, включая ударную фазу с заданным минимальным уровнем сыворотки 30 мг/мл. На фиг. 7 показано
моделирование введения анти-ЕрСАМ с двухнедельным интервалом, описанное выше, включая ударную
фазу с заданным минимальным уровнем сыворотки 10 мг/мл.
На фиг. 6 и 7 показаны соответствующие вливания лекарства по всей шкале времени 120 дней.
Можно видеть максимальную и минимальную концентрации сыворотки, максимальные уровни, представляемые верхними частями кривой, и минимальные уровни, представляемые нижними частями кривой. Графики представляют случаи моделирования, направленные на достижение вышеуказанных различных минимальных уровней 10 и 30 мг/мл соответственно. Как видно на чертежах, максимальные и
минимальные концентрации сыворотки в двух случаях моделирования различаются.
Пример 3. Данные о токсичности анти-ЕрСАМ, сравнение с ING-1, экстраполяция.
Ниже описываются побочные явления, наблюдаемые в различных когортах пациентов. В целях нижеизложенного, такое побочное явление определяется как отрицательный медицинский случай с пациентом или субъектом клинического исследования, которому вводится фармацевтический продукт и который необязательно имеет причинную связь с этим лечением. Следовательно, оно может быть любым отрицательным и непредусмотренным признаком (включая необычные лабораторные результаты), симптомом или заболеванием, временно связанным с применением исследуемого продукта, так или иначе
рассматриваемыми как относящиеся к исследуемому продукту.
Побочные реакции на лекарственный препарат (т.е. побочные явления, рассматриваемые исследователем как предположительно имеющие отношение к исследуемому лекарственному препарату) классифицировались исследователем в соответствии с руководством "Общие критерии токсичности" (CTC),
вариант 2,0. Для побочных реакций на лекарственный препарат, не перечисленных в таблицах CTC, общие определения для классификации серьезности побочных явлений должны быть следующими. "Мягкое" побочное явление означает симптом, который только заметен у пациента. Он не оказывает влияния
на обычную активность или дееспособность пациента и/или не имеет клинических последствий. "Умеренное" побочное явление оказывает влияние на обычную активность субъекта и причиняет ему определенные неудобства. Оно имеет клинические последствия: может потребоваться лечение симптомов. "Тяжелое" побочное явление является случаем, который вызывает ощутимые неудобства и может быть
столь серьезным, что потребует перерыва экспериментального лечения. Субъект неспособен нормально
работать или выполнять обычные действия, и/или побочное явление имеет четко выраженные клинические последствия. Может потребоваться лечение симптомов. "Опасное" побочное явление определяется
как неблагоприятное медицинское происшествие, которое при любой дозе может привести к смерти,
опасно для жизни, требует госпитализации или продолжения существующей госпитализации, приводит к
длительной или значительной беспомощности или внутренней аномалии/пороку развития.
- 10 -
011951
120 побочных явлений, касающихся исследуемого препарата, были отмечены у 19 (95%) пациентов
во время лечения и безопасного периода 28 дней, следующего за последним вливанием. Больше всего
побочных явлений были отмечены у пациентов из когорты 6 (38 случаев) и когорты 7 (35 случаев) по
сравнению с когортами низкой дозы (когорта 1: 7; когорта 2: 9; когорта 3: 12; когорта 4: 7; когорта 5: 12).
Когорты показаны на фиг. 1, описанной выше в примере 1.
Наиболее часто возникающие при лечении клинические побочные явления, не стоящие оценки испытателя, представляли собой повышение температуры тела (отмечено у 30% всех пациентов), тошноту
(30%), пирексию (20%), понос (15%), чувство утомления (15%), чувство озноба (15%) и рвоту (15%).
Наиболее часто возникающие при лечении лабораторные изменения, отмеченные как побочные явления,
не стоящие оценки испытателя, представляли собой повышенную щелочную фосфатазу (отмечена у 30%
всех пациентов), лимфопению (30%), повышенный LDH (25%), понижение PTT (20%), понижение содержания гемоглобина (20%), нарушения в лейкоцитарной формуле (15%), гликозурию (15%) и повышенную трансаминазу (15%).
Большинство побочных явлений составляли мягкие (70%) или умеренные (25%). Шесть тяжелых
побочных явлений (степень 3) были отмечены у четырех пациентов как следующее: повышенная щелочная фосфатаза у пациента с умеренной (степень 2) величиной до лечения; гликозурия у пациента с известным diabetes mellitus; один пациент с пониженным содержанием гемоглобина и количеством эритроцитов и потерей веса; один пациент с грыжеобразованием межпозвоночного диска. Не было случаев,
касающихся экспериментального препарата и заслуживающих оценки испытателя. Не отмечены явления
степени 4.
Четыре опасных побочных явления были отмечены у 4 пациентов в период исследований. Одно из
них рассматривалось исследователем как имеющее возможное отношение к исследуемому препарату:
было назначено продолжение госпитализации вследствие высокой температуры после второго вливания
анти-ЕрСАМ пациенту из когорты 3 (40 мг/м2 площади поверхности тела).
Клинические исследования мышино-человеческого химерного высокоаффинного (KD:2×10-9) антитела ING-1 против EpCAM при дозе 1 мг/кг привело к панкреатиту. Эти побочные явления были зависимыми от дозы при явной максимально допустимой дозе. Возможно, что близость иммуноглобулина ING1 к антигену EpCAM, выше двумя порядками величины в сравнении с анти-EpCAM, была отнесена к
токсичному профилю, наблюдаемому для ING-1. Поскольку максимально допустимая доза ING-1 (1
мг/кг) и наибольшая доза, указанная в правилах для анти-ЕрСАМ (6 мг/кг), являются подобными, ожидается, что анти-ЕрСАМ, то есть иммуноглобулин вышеописанных исследований, имеет значительно более
высокий предел безопасности вследствие, вероятно, его много меньшей афинности.
Пример 4. Экспрессия EpCAM при болезнях.
Чтобы оценить диапазон применимости способа лечения, описанного выше, изучалась экспрессия
человеческого антигена EpCAM при большом количестве различных болезней. Ожидалось, что способ,
предлагаемый в данном изобретении, может быть эффективно применен к любой болезни, в которой
экспрессия EpCAM повышалась в болезненном состоянии относительно здорового состояния данной
ткани. В частности, особое внимание уделялось синтезу антигена EpCAM в ткани печени.
Пациенты и ткани. В общем и целом 254 образца ткани печени были охарактеризованы иммуногистологией в отношении EpCAM и релевантных морфологических параметров, как описано ниже. Были
проанализированы различные образцы опухолей, включая 63 злокачественные гематомы, 5 холангиокарцином печени и 30 дисплазированных узелков (предраковых печеночно-клеточных повреждений), а также 5 образцов здоровой печени. 33 биопсии были взяты от пациентов с хроническим гепатитом С, 27 от
пациентов с хроническим гепатитом В и 28 от пациентов с хроническим алкогольным заболеванием печени; 9 пациентов имели аутоиммунный гепатит. Ткани печени были получены с помощью биопсии с
использованием трепанационной иглы, а в случае злокачественной гематомы - путем резекции или эксплантации печени.
Ткани были незамедлительно помещены в 4-процентный нейтральный буферный формальдегид и
обработаны в соответствии с обычными правилами.
Морфологический анализ. Морфологический анализ проводили на основе срезов, окрашиваемых
Н&Е (классификация карцином и хронических гепатитов). Классификация злокачественных гематом
выполнялась, как описано у Нзико и др. Cancer 76, 1995, 579-88. Неопухолевые заболевания печени морфологически оценивались следующим образом: некровоспалительную активность случаев хронических
гепатитов В и С анализировали, используя модифицированный индекс гепатитной активности, как описано у Ишака, Mod. Pathol. 7,1994, 690-713.
Иммуногистологический анализ. Иммуногистологический анализ выполняли, как было описано
ранее (Прендж и др. , J.Pathol. 201, 2003, 250-9), используя так называемый метод ABC и диаминобензидин в качестве хромогена. Моноклональное антитело мыши против человеческого EpCAM (клон VU1D9; Novocastra, Newcastle, UK) разбавляли 1/50 и применяли после предварительного (30 мин) введения
трипсина (0,1%, рН 7,8). Соответственно выполнялась иммуногистология с циклином D1 (DCS-6; 1:100;
DAKO, Hamburg, Germany), р53 (FL-393; 1:50; Santa Cruz, Canta Cruz, USA) и убихитином (70458; 1:200;
DAKO). Производилось негативное регулирование, включая изъятие первичного антитела.
- 11 -
011951
Для оценки контрастирования EpCAM только в злокачественной гематоме интенсивность классифицировали полуколичественно (0 = отрицательно, +(1) = слабо положительно, ++(2) = умеренно положительно, +++(3) = весьма положительно (по меньшей мере, равна интенсивности окрашивания желчного протока)). Печеночно-клеточная экспрессия EpCAM в не относящемся к опухоли биопсическом образце классифицировалась следующим образом: 0 = отсутствие печеночно-клеточного контрастирования; (+) (0,5) = небольшое количество рассеянных позитивных гепатоцитов, +(1) = небольшие группы
гепатоцитов вдоль нескольких или большинства перегородок или портальных трактов и распространение
в мидацинозную зону, +++(3) = экстенсивная гепатоцеллюлярная позитивность, обычно покрывающая,
по меньшей мере, 50% ацинуса. Статистическая оценка выполнялась с помощью описательной статистики (не заслуживающий внимания, средний, максимальный, частый) и коэффициента корреляции Спирмена. Уровень р<0,05 рассматривался как значительный.
Неоэкспрессия EpCAM в злокачественных гематомах. Здоровая печеночная ткань показала
сильное окрашивание всего эпителия желчных протоков. В то же время гепатоциты оставались полностью негативными (данные не показаны). Иммуногистология для EpCAM в 9 из 63 проанализированных
злокачественных гематомах (14,3%; фиг. 8A-F) показала специфическую окраску мембран также, как и
во всех проанализированных холангиокарциномах печени (n = 5). В злокачественных гематомах экспрессия выявлялась в диапазоне от слабой до сильной и более часто в средне- и малодифференцированных
гематомах, в то же время только одна хорошо дифференцированная гематома оказалась позитивной.
Также среди 30 узелков дисплазии, которые представляли предраковые патологические изменения, только 3 показали умеренную экспрессию EpCAM. Те же самые ткани анализировали в отношении большого
количества других существенных для опухолей антигенов и данные экспрессии представляли на коррелятивный анализ. Выявилась умеренная, но значимая позитивная взаимосвязь экспрессии EpCAM в злокачественных гематомах с ядерной аккумуляцией и убихитином (р>0,05) , но не с предполагаемым 3'-5'регуляторным циклином D1.
Гепатоцеллюлярная неоэкспрессия EpCAM при хронической некровоспалительной болезни
печени. Особая мембранная позитивность гепатоцитов обнаруживалась в высоком проценте проанализированных не относящихся к опухолям тканей печени (фиг. 8С-Е). Явная позитивность была найдена в
случаях хронического гепатита и в небольшом количестве случаев алкогольного заболевания печени.
Кроме того, была замечена позитивность всех пролифераций протоков, а также отдельных малых клеток,
рассеянных в перипортальной паренхиме (потенциальные клетки-предшественники при дифференцировке). Гепатоцеллюлярная позитивность проявляла сильное перипортальное/перисептальное преобладание
и достигала в некоторых случаях интенсивности окраски желчных протоков. Ни в каких случаях не была
представлена особая реактивность EpCAM в непаренхиматозных клетках печени.
Когда анализировались незначительные и средние величины полуколичественной иммуногистологической оценки (см. методы), экспрессия EpCAM была наивысшей в тканях с вирусом гепатита В (минимальная оценка 0,93; средняя оценка 0,5; максимальная оценка 3; частота позитивной окраски EpCAM
(+/++/+++): 55,6%), с алкогольным заболеванием печени (минимальная оценка 0,88; средняя оценка 0,75;
максимальная оценка 2,5; частота позитивной окраски EpCAM (+/++/+++): 78,6%) и с вирусом гепатита
С (минимальная оценка 0,86; средняя оценка 0,5; максимальная оценка 3; частота позитивной окраски
EpCAM (+/++/+++): 63,6%). Пациенты с аутоиммунным гепатитом показали промежуточную окраску
EpCAM (минимальная оценка 0,72; средняя оценка 0,5; максимальная оценка 3; частота позитивной окраски EpCAM (+/++/+++):55,6%). Гепатоцеллюларная экспрессия EpCAM почти отсутствовала у пациентов с хроническими билиарными болезнями (первичный билиарный цирроз) (минимальная оценка 0,13;
средняя оценка 0; максимальная оценка 0,5; частота позитивной оценки EpCAM (+/++/+++): 25%) и воспалением желчных путей (минимальная оценка 0,04; средняя оценка 0; максимальная оценка 0,5; частота
позитивной окраски EpCAM (+/++/+++): 7,7%) (фиг. 9; описание статистических переменных на чертеже
показано в правом участке рамки).
Заключение. Образцы тканей пациентов с хроническими заболеваниями печени, такими как вирусная инфекция хронического гепатита С и вирусная инфекция гепатита В, аутоиммунный гепатит,
хроническое алкогольное заболевание печени и гептоцеллюлярная карцинома, подвергали анализу полуколичественно на экспрессию EpCAM во взаимосвязи с фазой фиброза печени, а также гистологическими и биохимическими параметрами некровоспалительной активности. Гепатоциты, которые в здоровой
печени взрослого человека являются ЕрСАМ-негативными, показали de novo экспрессию EpCAM во
многих тканях печени пациентов с хроническими болезнями печени. Гепатоцеллюларная экспрессия EpCAM оказалась наибольшей у пациентов с некровоспалительными заболеваниями (гепатиты С и В, аутоиммунный гепатит, алкогольное заболевание печени). Гепатоцеллюлярная экспрессия EpCAM в значительной степени находилась в связи с гистологическими и биохимическими параметрами воспалительной активности и величиной фиброза, которая была особенно сильной у пациентов с вирусом гепатита В.
Кроме того, 14,3% злокачественных гематом показали экспрессию EpCAM на клетках опухоли.
Результаты показывают, что de novo экспрессия EpCAM случается не только во фракции гепатоцеллюлярных карцином (злокачественных гематом), но часто на гепатоцитах при хронических некровоспалительных заболеваниях печени. Эта экспрессия находится в позитивной связи с активностью болезни
- 12 -
011951
и фиброзом. Особо была продемонстрирована взаимосвязь гепатоцеллюлярной неоэкспрессии EpCAM
при хронической некровоспалительной болезни печени с фиброзом и некровоспалительной активностью.
Эти выводы имеют значение для выбора развивающихся методов лечения, таких как определение объектов для моноклональных антител в злокачественных опухолях, и могут также применяться к некоторым
гематомам. Что особенно важно, фракция гепатоцеллюлярной карциномы может представлять адекватную цель для направленной EpCAM терапии.
Пример 5. Подтверждение фармакокинетических прогнозов, в котором используются данные о пациентах, полученные при исследовании фазы II "Анти-ЕрСАМ".
Желательно повысить точность прогнозов, основанных на фармакокинетическом моделировании
(которое само основано на фармакокинетических данных, полученных при исследовании фазы I антиEpCAM, см. примеры 1 и 2 выше), используя фактические данные о пациентах, полученные при последующем изучении фазы II, в которой анти-ЕрСАМ вводился в соответствии с данным изобретением. Это
исследование фазы II было международным, открытым, многоцелевым, рандомизированным, с двумя
параллельными лечебно-испытательными группами. Пациенты, участвовавшие в исследованиях фазы II
анти-ЕрСАМ, были разделены на две группы, первая из которых получала низкую дозу анти-ЕрСАМ (2
мг/кг массы тела), вводимую как указано ниже, а вторая получала высокую дозу анти-ЕрСАМ (6 мг/кг
массы тела), вводимую как указано ниже. В ходе исследования фазы II анти-ЕрСАМ каждый пациент
первоначально получал три ударные дозы анти-ЕрСАМ (каждая либо 2 мг/кг массы тела, либо 6 мг/кг
массы тела в зависимости от группы пациента) с промежутком в одну неделю во время ударной фазы, за
которыми следовали 23 последовательные поддерживающие дозы анти-ЕрСАМ (снова либо 2 мг/кг массы тела, либо 6 мг/кг массы тела в зависимости от группы пациента), причем разовые поддерживающие
дозы вводились каждые две недели.
В соответствии с фармакокинетическими прогнозами, основанными на данных исследования фазы I
анти-ЕрСАМ, минимальный уровень сыворотки пациентов первой группы, получавших низкую дозу
анти-ЕрСАМ, ожидался порядка 10 мг/мл (соотносясь с минимальным уровнем, показанным на фиг. 7), в
то время как минимальный уровень сыворотки второй группы пациентов, получавших высокую дозу
анти-ЕрСАМ, ожидался порядка 30 мг/мл (соотносясь с минимальным уровнем, показанным на фиг. 6).
Исследование выполняли следующим образом. 96 ячеистых планшетов покрывались HD4A4 (антиидиотип антитела против анти-ЕрСАМ; 5 мг/мл в объеме 100 мл), затем следовал этап блокирования и
промывки. Затем добавлялись калиброванные образцы проверенного качества и пробы анти-EpCAM (100
мл с соответствующим разбавлением) с последующим этапом промывки. Анти-ЕрСАМ, связанный
HD4A4, обнаруживали с помощью биотинилированного IgG, и снова следовал этап промывки. Добавляли стрептавидин (0,5 мг/мл в объеме 100 мл), 96 ячеистых планшетов снова промывали и на конечном
этапе добавляли 180 мл pNPP. Исследование было остановлено добавлением 50 μл 3М NaOH и выполнены измерения планшет-ридером для иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA) при 405 и 490
нм. Разбавление образцов с низкой дозой выполняли в соотношении 1:100. Разбавление образцов с высокой дозой выполняли в соотношении 1:300. Результаты показаны на фиг. 10.
На фиг. 10 показаны точками индивидуальные минимальные уровни, измеренные для одного пациента из группы с низкой дозой (номер пациента 401001; точки данных обозначены квадратами) и другого
пациента из группы с высокой дозой (номер пациента 101002; точки данных обозначены ромбами).
Средний вертикальный уровень горизонтальной линии, соединяющей точки данных для соответствующего пациента, представляет минимальный уровень сыворотки, наблюдаемый для этого пациента. Соответственно, можно видеть, что горизонтальная линия для пациента 101002 с большой дозой (ромбовидные точки) показывает концентрацию минимального уровня анти-ЕрСАМ в хорошем соответствии с
предсказанным значением 30 мг/кг для этой дозы (сравните горизонтальную линию, соединяющую предсказанные минимумы графика на фиг. 6). Подобным образом горизонтальная линия для пациента 401001
с низкой дозой (квадратные точки) показывает концентрацию минимального уровня анти-EpCAM в хорошем соответствии с предсказанным значением 10 мг/мл для этой дозы (сравните горизонтальную линию, соединяющую предсказанные минимумы графика на фиг. 7).
Эти данные подтверждают точность предсказания минимальных уровней с помощью фармакокинетического моделирования, основанного на данных, полученных во время исследования фазы I антиЕрСАМ, вместе с данными для реальных пациентов, полученными во время исследований фазы II антиЕрСАМ. По существу, можно сделать вывод, что допущения и результаты фармакокинетического моделирования были правильными и что лечебная схема, предлагаемая в данном изобретении, обладает эффективностью и преимуществами, конкретизированными выше.
Все композиции и способы, описанные и заявленные здесь, могут быть созданы и осуществлены в
свете данного изобретения без чрезмерного экспериментирования. Хотя композиции и способы, предлагаемые в данном изобретении, описаны при помощи предпочтительных вариантов осуществления, всем
специалистам в данной области ясно, что в композиции и способы, а также в этапы или последовательности этапов способов, описанных здесь, могут быть внесены изменения без нарушения концепции,
сущности и объема данного изобретения. Более конкретно, понятно, что определенные агенты, имеющие
отношение как к химии, так и к физиологии, можно заменить агентами, описанными здесь, причем могут
- 13 -
011951
быть достигнуты те же самые или подобные результаты. Все такие изменения и модификации, понятные
специалистам, могут находиться в пределах сущности, объема и концепции данного изобретения, определяемых прилагаемой формулой.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Человеческий иммуноглобулин, специфично связывающийся с человеческим антигеном EpCAM,
характеризующийся тем, что период выведения упомянутого иммуноглобулина составляет по меньшей
мере 15 дней после введения пациенту-человеку.
2. Человеческий иммуноглобулин по п.1, у которого период выведения составляет 20, 19, 18, 17, 16
или 15 дней.
3. Человеческий иммуноглобулин по п.1 или 2, у которого период выведения составляет 15 дней,
характеризующийся тем, что содержит тяжелую цепь иммуноглобулина с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 1, и легкую цепь иммуноглобулина с последовательностью аминокислот, указанной в SEQ ID NO: 2.
4. Фармацевтическая композиция, содержащая человеческий иммуноглобулин по любому из пп.1-3.
5. Способ лечения опухолевых заболеваний у человека, характеризующийся тем, что пациенту не
чаще одного раза в неделю вводят человеческий иммуноглобулин по любому из пп.1-3, при этом:
(a) определяют по истечении по меньшей мере одной недели, следующей за последним введением
иммуноглобулина, но до следующего его введения уровень еще присутствующего в крови пациента человеческого иммуноглобулина в сыворотке и получают промежуточное значение уровня человеческого
иммуноглобулина в сыворотке;
(b) сравнивают полученное промежуточное значение уровня человеческого иммуноглобулина в сыворотке с заданным минимальным значением уровня человеческого иммуноглобулина в сыворотке;
(c) если превышение промежуточного значения уровня человеческого иммуноглобулина в сыворотке над значением минимального уровня человеческого иммуноглобулина составляет от 5 до 15%, выполняют следующее введение иммуноглобулина;
(d) величину дозы вводимого человеческого иммуноглобулина устанавливают такой, чтобы в конце
периода времени между двумя введениями количество человеческого иммуноглобулина, сохраняющееся
в сыворотке, никогда не падало ниже заданного минимального уровня человеческого иммуноглобулина в
сыворотке.
6. Способ по п.5, характеризующийся необязательным повторением этапов (а), (b) и (с).
7. Способ по п.5 или 6, в котором введение иммуноглобулина имеет место один раз в каждые две
недели или в котором введение выполняют не чаще, чем один раз в каждые две недели.
8. Способ по п.5 или 6, в котором введение имеет место один раз в каждые две недели и в котором
вводимая доза человеческого иммуноглобулина остается неизменной от одного введения до следующего.
9. Способ по п.5 или 6, в котором введение выполняют не чаще, чем один раз в каждые две недели,
и в котором как вводимая доза человеческого иммуноглобулина, так и частота введения остаются неизменными от одного введения до следующего.
10. Способ по п.5 или 6, в котором величину первоначальной и всех последующих доз определяют с
помощью фармакокинетического моделирования.
11. Способ по любому из пп.5-10, в котором введение человеческого иммуноглобулина является
внутривенным, внутрибрюшинным, подкожным, внутримышечным, локальным или внутрикожным.
12. Способ по любому из пп.5-11, в котором к опухолевым заболеваниям относятся рак молочной
железы, рак эпителия, гепатоцеллюлярный рак, холангиоцеллюлярный рак, рак желудка, рак толстой
кишки, рак простаты, рак головы и шеи, рак кожи (меланома), рак мочеполового тракта, например яичниковый рак, внутриматочный рак, рак шейки и рак почек, рак легких, рак тонкой кишки, рак печени,
рак поджелудочной железы, рак желчного пузыря, рак желчных протоков, рак пищевода, рак слюнных
желез и рак щитовидной железы.
13. Способ по п.12, в котором опухолевое заболевание является раком простаты или раком молочной железы, а упомянутый человеческий иммуноглобулин вводят в дозе от 1 до 7 мг на кг массы тела
один раз каждые две недели.
14. Способ по п.13, в котором человеческий иммуноглобулин вводят в дозе от 2 до 6 мг на кг массы
тела один раз каждые две недели.
- 14 -
011951
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
- 15 -
011951
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
- 16 -
011951
Фиг. 7
Фиг. 8
Фиг. 9
- 17 -
011951
Фиг. 10
- 18 -
011951
SEQUENCE LISTING
- 19 -
011951
- 20 -
011951
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 21 -