013615 Введение Изобретение касается рекомбинантного РНК-вируса, предпочтительно парамиксовируса, ... тительно вируса ньюкаслской болезни (NDV - Newcastle Disease Virus) для...

013615
Введение
Изобретение касается рекомбинантного РНК-вируса, предпочтительно парамиксовируса, предпочтительно вируса ньюкаслской болезни (NDV - Newcastle Disease Virus) для лечения болезней, в частности для онколитического лечения опухолей. Продуцируются рекомбинантные вирусы, которые кодируют связывающие белки (антитела, молекулы, содержащие анкириновые повторы, пептиды и т.д.), преобразовывающие пролекарство ферменты и/или протеазы и приводят к селективной экспрессии этих молекул, инфицированных вирусом, опухолевыми клетками. Активность этих связывающих белков, преобразовывающих пролекарство ферментов и/или протеаз, увеличивает противоопухолевый эффект вируса.
Дополнительно изобретение описывает изготовление и использование таких модифицированных вирусов для лечения рака.
Описание уровня техники
Вирус ньюкаслской болезни.
В целом, использование онколитических вирусов для лечения опухолей рассматривалось в Chiocca
(2002). Вирус ньюкаслской болезни использовался в качестве экспериментального терапевтического
агента в течение больше чем 40 лет и рассматривался Sinkovics и Horvath (2000). Вирус ньюкаслской болезни в общем описан в книге Alexander (1988). Штамм PV701NDV разрабатывается в качестве противоракового лечения для глиобластомы (Lorence et al., 2003). Штамм MTH68NDV использовался в качестве
экспериментального лечения рака и вводился людям в течение больше чем 30 лет (Csatary et al., 2004).
В работе Stojdl et al. (2003) описано, что в диапазоне 80% всех протестированных опухолевых клеточных линий существует дефект в интерфероновом ответе после инфицирования вирусом везикулярного стоматита (VSV - Vesicular Stomatitis Virus). Можно предположить, что подобный процент опухолевых клеточных линий будет восприимчив к инфицированию с помощью NDV, потому что и VSV, и NDV
принадлежат к отряду mononegavirales. Также показано, что механизм селективной репликации NDV в
опухолевых клетках основан на дефекте в клеточном интерфероновом ответе, направленном против вируса (см., например, US: 20030044384).
Рекомбинантные парамиксовирусы.
ЕР-А-0702085 касается генетически созданных мутантов вирусов инфекционных заболеваний, реплицирирующих несегментированную минус-РНК, содержащих вставку и/или делецию в открытой рамке
считывания, псевдогенный участок или интергенный участок вирусного генома.
WO 99/66045 касается генетически модифицированных NDV вирусов, полученных из полноразмерных молекул кДНК вирусного генома.
WO 00/62735 касается способа лечения опухолей, включающего введение чувствительного к интерферону, репликационно-компетентного клонового РНК-вируса, например NDV.
В WO 01/20989 (PCT/US 00/26116) описан способ для лечения пациентов, имеющих опухоль рекомбинантными онколитическими парамиксовирусами. Опухоль сокращается путем введения репликационно-компетентного вируса Paramyxoviridae. Описаны различные способы, которые могут использоваться для создания вирусного генома путем генной инженерии с целью улучшения онколитических
свойств.
WO 03/005964 касается рекомбинантного VSV, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую
цитокин.
В US 6699479 описаны мутанты NDV, экспрессирующие V-белок на сниженном уровне и содержащие замены нуклеотидов в локусе редактирования.
US 2004/0170607 касается лечения меланомы путем введения вируса, который не является распространенным человеческим патогеном.
Генетическое конструирование NDV.
NDV можно генетически сконструировать, используя обратную технологию генетики, как описано,
например, в ЕР-А-0702085. Например, известно создание рекомбинантных конструкций NDV, содержащих дополнительные нуклеиновые кислоты, кодирующие секретируемую щелочную фосфатазу (Zhao
and Peeters, 2003), зеленый флуоресцентный белок (Engel-Herbert et al., 2003), белок VP2 вируса инфекционной бурсальной болезни (Huang et al., 2004), гемагглютинин вируса гриппа (Nakaya et al., 2001) и
хлорамфеникол ацетилтрансферазу (Huang et al., 2001) (Krishnamurthy et al., 2000). Ни один из этих рекомбинантных NDV не был сконструирован для использования при лечении болезни человека. Рекомбинантные NDV были созданы для изучения или основной вирусологии NDV, или разработки штаммов
вакцин для домашней птицы. Поскольку родительские штаммы вирусов служили лентогенными штаммами NDV, эти штаммы не обладают существенными онколитическими свойствами.
Краткая характеристика изобретения
Настоящее изобретение касается РНК-вируса, например NDV, обладающего повышенной онколитической активностью. Более подробно изобретение касается РНК-вируса, особенно вируса ньюкаслской
болезни, содержащего рекомбинантную нуклеиновую кислоту, имеющего терапевтическую значимость
при лечении рака, в котором нуклеиновая кислота кодирует связывающий белок, преобразовывающий
пролекарство фермент и/или протеазу, обладающие терапевтической активностью при экспрессии инфицированной вирусом, опухолевой клеткой.
-1-
013615
Более предпочтительными являются рекомбинантные онколитические вирусы, например NDV, содержащие один или несколько трансгенов, в котором трансген(ы) кодирует(ют) связывающий белок,
преобразовывающий пролекарство фермент и/или протеазу. Возможны комбинации различных специфичностей.
Дополнительно изобретение касается нуклеокапсида рекомбинантного вируса, указанного выше,
содержащего вирусную РНК в комплексе с белками капсида, или вирусной РНК и/или РНК, комплементарной вирусной РНК в выделенном виде.
Кроме того, изобретение касается ДНК, например кДНК, кодирующей вирусную РНК, и/или ДНК,
комплементарной вирусной РНК. Кроме того, изобретение касается профилактики или лечения опухолевых болезней.
Детальное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения
Вирусы.
Изобретение в общем касается РНК-вирусов, предпочтительно минус-РНК-вирусов, более предпочтительно таких вирусов, которые обладают онколитическими свойствами и вместе с этим могут быть
созданы с помощью генной инженерии. К таким вирусам относятся
парамиксовирусы, предпочтительно вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус кори, вирус паротита, вирус Сендаи;
ортомиксовирусы, предпочтительно вирус гриппа;
рабдовирусы, предпочтительно вирус везикулярного стоматита.
Поэтому предметом настоящего изобретения является рекомбинантный онколитический РНКвирус, содержащий нуклеиновую кислоту по крайней мере с одним трансгеном, в котором нуклеиновая
кислота этого трансгена(ов) кодирует связывающий белок, обладающий терапевтической активностью
при экспрессии инфицированной вирусом опухолевой клеткой.
Другим предметом настоящего изобретения является рекомбинантный онколитический РНК-вирус,
содержащий нуклеиновую кислоту по крайней мере с одним трансгеном, в котором нуклеиновая кислота
этого трансгена(ов) кодирует преобразовывающий пролекарство фермент, обладающий терапевтической
активностью при экспрессии инфицированной вирусом опухолевой клеткой, предпочтительно в комбинации с соответствующим пролекарством.
Еще одним предметом настоящего изобретения является рекомбинантный онколитический РНКвирус, содержащий нуклеиновую кислоту по крайней мере с одним трансгеном, в котором нуклеиновая
кислота этого трансгена(ов) кодирует протеазу, обладающую терапевтической активностью при экспрессии инфицированной вирусом опухолевой клеткой.
Предпочтительно, чтобы вирус согласно настоящему изобретению обладал опухоль-селективным
инфицированием, которое приводит к опухоль-селективной экспрессии закодированного трансгена.
Рекомбинантный онколитический вирус согласно настоящему изобретению может содержать по
крайней мере один трансгенный ген, независимо выбранный из трансгенов, кодирующих связывающие
белки, преобразовывающие пролекарство ферменты и/или протеазы.
Предпочтительно, чтобы вирус согласно настоящему изобретению являлся минус-РНК-вирусом,
более предпочтительно парамиксовирусом.
В контексте настоящего изобретения нуклеиновая кислота по крайней мере с одним трансгеном является нуклеиновой кислотой, содержащей ген, который является гетерологичным онколитическому
РНК-вирусу, на котором базируется рекомбинантный РНК-вирус согласно настоящему изобретению.
Термин "гетерологичный" касается гена в целом или его части, которая может представлять собой кодирующий участок гена или его часть.
Гетерологичный ген может представлять собой искусственную последовательность или может быть
получен из природных источников или путем рекомбинации по крайней мере двух последовательностей,
выбранных из последовательностей, полученных из природных источников и/или искусственных последовательностей. "Природные источники" включают животных, таких как млекопитающие, растения, грибы и микроорганизмы, такие как бактерии, простейшие и вирусы, которые могут отличаться от других
онколитический РНК-вирусов согласно настоящему изобретению. Трансген может также кодировать
слитый белок. К млекопитающим относятся люди и мыши.
В особенно предпочтительном варианте осуществления вирус согласно настоящему изобретению
является вирусом ньюкаслской болезни, (NDV), наиболее предпочтительным является штамм МТН68
NDV. NDV может быть лентогенным, мезогенным или велогенным штаммом. Особенно предпочтительными являются мезогенный или велогенный штаммы NDV. Вирус является предпочтительно компетентным по репликации.
Генетическое конструирование вирусов.
Способы для генетического конструирования РНК-вирусов хорошо известны, как указано выше.
Кроме этого, генетическое конструирование онколитических вирусов рассматривается, например, в Bell
et al. (2002). РНК-вирусы в качестве агентов для вирусотерапии рассматриваются в Russell (2002). Содержание какого-либо из этих документов включается авторами путем предоставления ссылки.
Связывающие белки.
-2-
013615
В онколитическом рекомбинантном РНК-вирусе согласно настоящему изобретению по крайней мере один трансген может кодировать связывающий белок.
Связывающие белки являются белками, которые при экспрессии в клетке-мишени имеют способность к связыванию с компонентом указанной клетки и/или соседней клетки. Предпочтительно связывающие белки - это белки, которые связываются с внутриклеточными компонентами.
В предпочтительном варианте осуществления связывающие белки принадлежат к следующей группе: природный лиганд или генетически модифицированный лиганд, рекомбинантный растворимый домен природного рецептора или его модифицированная версия, например пептид или полипептид-лиганд,
молекула антитела и ее фрагменты и производные или подобная антителу молекула и ее производные.
Неполный обзор высокоаффинных связывающих структур приводится Ladner и Ley (2001).
Связывающие белки, как описано выше, могут иметь человеческое, мышиное или близкое происхождение или представлять собой химерную версию, то есть белок, который может быть слитым белком,
содержащим последовательности от различных видов, например человека и мыши.
Рекомбинантные связывающие молекулы на основании вышеуказанного описания могут быть мономерными, димерными, тримерными, тетрамерными или мультимерными и биспецифичными или
мультиспецифичными.
Предпочтительные связывающие белки выбираются из связывающих белков, обладающих терапевтической активностью.
Природный лиганд, указанный выше, может быть фактором роста или пептидом. Генетически модифицированный лиганд может быть аналогом встречающегося в природе фактора роста или пептида.
Рекомбинантные растворимые домены природного рецептора или его модифицированных версий,
указанные выше, являются рекомбинантно экспрессированными растворимыми внеклеточными доменами рецептора поверхности клетки и/или его фрагментами, рекомбинантно экспрессированным растворимым внеклеточным доменом молекулы клеточной адгезии и/или ее фрагментами.
Молекулы антитела, указанные выше, могут быть моноклональными иммуноглобулиновыми антителами любой известной специфичности и изотипа, их фрагментами и/или их фрагментами, слитыми с
белками-эффекторами. Молекулы антитела могут быть химерными, гуманизированными или человеческими антителами. Фрагменты антитела содержат по крайней мере один антигенсвязывающий домен
антитела. Фрагменты антитела были подробно описаны в литературе (рассмотрены, например, в Allen
(2002) и включены авторами путем ссылки). Предпочтительные примеры включают одноцепочечные
фрагменты Fv, фрагменты Fab, F(ab2'), версии с делецией домена под названием мини-тела, и другие иммуноактивные части, фрагменты, сегменты и прочие меньшие или большие парциальние структуры антител, причем последние обладают достаточными свойствами касательно нацеливания («таргетирования») или иммунологической стимулирующей или ингибиторной активностью, чтобы иметь терапевтическую эффективность в способах настоящего изобретения.
Такие антитела могут быть получены в экспериментах по клонированию гибридом при использовании трансгенных мышей или отборов фагового дисплея, отборов рибосомного дисплея или фильтрующего скрининга колоний библиотек антител, содержащих последовательности человеческих антител, или с
помощью похожих методов.
Указанные выше связывающие белки со свойствами, подобными свойствам антител, могут представлять собой генетически модифицированные белки или их домены, в которых одна или несколько
пептидных петель рандомизированы на уровне аминокислот таким способом, что высокоаффинные связывающие молекулы с высокой специфичностью могут быть обогащены против какого-либо антигена из
библиотек таких молекул путем фагового дисплея, рибосомного дисплея, фильтрующего скрининга колоний или с помощью похожих методов. Отобранные белки обычно обладают высокой тепловой и термодинамической стабильностью и хорошо экспрессируются в системах рекомбинантной экспрессии,
таких как системы экспрессии E.coli, дрожжей, насекомых и млекопитающих. К примерам таких связывающих белков со свойствами, подобными свойствам антител, относятся белки, содержащие анкириновые повторы, описанные в Binz et al. (2004), липокалины, описанные в Skerra (2000), гамма-кристаллины,
описанные в DE 19932688.6, модифицированный скелет белка А (аффитела), описанные в Hogbom et al.
(2003) или Nord et al. (2000), или фибронектиновая структура и другие. Подобные антителу молекулы
могут быть мономерными или повторными молекулами, или сконструированными в виде одноцепочечных молекул или в виде многоцепочечных молекул, при этом подобная антителу молекула обладает достаточными свойствами касательно нацеливания («таргетирования») или иммунологической стимулирующей или ингибиторной активностью, чтобы иметь терапевтическую эффективность в способах настоящего изобретения.
Связывающие молекулы с дополнительной функцией.
Связывающий белок может быть слитым белком, содержащим по крайней мере один связывающий
домен, например из антитела, и гетерологичный домен. "Гетерологичный" имеет значение, обсужденное
выше в контексте гетерологичных генов.
Связывающие белки, описанные выше, могут доставлять полезную нагрузку к участку, специфичному для болезни (например, опухоли), как так называемое интратело или внеклеточный доступный свя-3-
013615
зывающий белок. Доставленная полезная нагрузка может быть гетерологичным доменом, например токсином, таким как человеческая РНКаза (De Lorenzo et al., 2004) (Zewe et al., 1997), экзотоксином Pseudomonas (Chaudhary et al., 1989) (Kreitman and Pastan, 1995), (Batra et al., 1992), токсином Diphtheria (Kreitman et al., 1993), (Chaudhary et al., 1990), (Batra et al., 1991) или ферментом, таким как бета-галактозидаза,
бета-глюкуронидаза (Roffler et al., 1991), (Wang et al., 1992), (Bosslet et al., 1992), бета-глюкозидаза
(Rowlinson-Busza, 1992), карбоксипептидаза (Antoniw et al., 1990), (Bagshawe et al., 1988), бета-лактамаза
с терапевтической эффективностью или иммуно-стимулирующим белком с цитокиновой активностью,
таким как IL-2, IL-12, TNF-альфа, IFN-бета или GM-CSF (см., например, обзор Allen (2002)).
В другом примере связывающие белки, описанные выше, сами по себе обладают антагонистической
или агонистической эффективностью, которая является терапевтически полезной. Примеры антагонистических/блокирующих связывающих молекул включают VEGF ингибирующее антитело Авастин
(Avastin) (Ferrara et al., 2004), HER2/neu рецептор-блокирующее антитело Герцептин (Herceptin) (Noonberg and Benz, 2000) или EGF-рецептор-блокирующее антитело Эрбитукс (Erbitux) (Herbst and Langer,
2002). Агонистические связывающие белки могут представлять собой связывающие белки, которые индуцируют, например, апоптоз (Georgakis et al., 2005) или обладают регуляторной активностью относительно ДНК, РНК или белков (например, индуцируют транскрипцию, стабилизируют белки). Обзор (Adams and Weiner, 2005) описывает различные терапевтические антитела, которые могли также быть включены в онколитический вирус.
Преобразовывающие пролекарство ферменты.
В онколитическом рекомбинантном вирусе РНК согласно настоящему изобретению по крайней мере один трансген может кодировать преобразовывающий пролекарство фермент.
Пролекарство является производным или прекурсором терапевтически активного соединения, который может быть ферментативно преобразовано в активное соединение. Преобразовывающие пролекарство ферменты - это ферменты, способные к преобразованию пролекарства в терапевтически активное вещество.
Поэтому предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая
рекомбинантный онколитический вирус согласно настоящему изобретению, вирусный геном согласно
настоящему изобретению, вирусный антигеном согласно настоящему изобретению и/или молекулу ДНК
согласно настоящему изобретению в качестве активного компонента произвольно вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями и/или вспомогательными веществами, вирус, вирусный
геном, антигеном и/или молекула ДНК которой содержат по крайней мере один трансген, кодирующий
преобразовывающий пролекарство фермент.
Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать пролекарство, которое может быть
преобразовано в терапевтически активное соединение преобразовывающим пролекарство ферментом,
закодированным вирусом, вирусным геномом, антигеномом и/или молекулой ДНК. Фармацевтическая
композиция может подходить для лечения и/или облегчения пролиферативного нарушения.
Пролекарство может входить в состав одной композиции с рекомбинантным онколитическим вирусом согласно настоящему изобретению, вирусным геномом согласно настоящему изобретению, вирусным антигеномом согласно настоящему изобретению и/или молекулой ДНК согласно настоящему изобретению в качестве активного компонента, или может входить в состав композиции, отличной от композиции с онколитическим вирусом.
Если онколитический рекомбинантный РНК-вирус согласно настоящему изобретению кодирует
преобразовывающий пролекарство фермент, онколитический вирус согласно настоящему изобретению
вызывает селективную экспрессию преобразовывающего пролекарство фермента в инфицированной вирусом клетке-мишени (в особенности опухолевой клетке), которая обычно не экспрессирует или не достаточно экспрессирует преобразовывающий пролекарство фермент. Таким образом, при лечении субъекта, который в этом нуждается, пролекарство специфически преобразовывается в фармацевтическое активное соединение в клетке-мишени, в особенности в опухолевой клетке, но не может существенным
образом быть преобразовано в терапевтически активное соединение в нецелевой клетке, в особенности в
здоровой клетке субъекта, подлежащего лечению. Таким образом, нежелательный побочный эффект терапевтически активного соединения снижается по сравнению с монотерапией терапевтически активным
соединением.
В контексте настоящего изобретения, пролекарство может быть производным или прекурсором терапевтически активного соединения, подходящего для лечения и/или облегчения пролиферативного нарушения, пролекарство которого может быть преобразовано с помощью преобразовывающего пролекарство фермента. Пролекарство может быть соединением, известным специалисту, квалифицированному в
данной области. Производные и/или прекурсоры известны специалисту, квалифицированному в данной
области.
Предпочтительно, чтобы пролекарство являлось, по существу, фармацевтически неактивным и/или
нетоксичным.
Примеры преобразовывающих пролекарство ферментов согласно настоящему изобретению включают
бета-глюкуронидазу, бета-галактозидазу, бета-глюкозидазу, карбоксипептидазу, бета-лактамазу, D-4-
013615
аминоацикоксидазу. Дальнейшие примеры известны специалисту, квалифицированному в данной области.
Предпочтительно, чтобы преобразовывающий пролекарство фермент существенным образом не
экспрессировался в неопухолевых клетках.
Преобразовывающий пролекарство фермент может быть получен из организма, выбранного из млекопитающих, растений, грибов и микроорганизмов, таких как бактерии, простейшие и вирусы.
Наиболее предпочтительной комбинацией преобразовывающего пролекарство фермента и пролекарства является бета-глюкуронидаза Е. coli и пролекарство, которое может быть преобразовано бетаглюкуронидазой в активное цитотоксическое соединение. Примером является HMR1826 (доксорубицинглюкуронид), который может быть преобразован в доксорубицин, представляющий собой известное соединение для лечения рака.
Другим предметом настоящего изобретения является способ для лечения пролиферативного заболевания, в особенности гиперпролиферативного заболевания, такого как рак, включающий введение в
фармацевтически эффективном количестве субъекту, который в этом нуждается
(a) рекомбинантного онколитического вируса согласно настоящему изобретению, вирусного генома
согласно настоящему изобретению, вирусного антигенома согласно настоящему изобретению и/или молекулы ДНК согласно настоящему изобретению, содержащих по крайней мере один трансген, кодирующий преобразовывающий пролекарство фермент, и
(b) пролекарство, подходящее для лечения пролиферативного заболевания, при этом пролекарство
может быть преобразовано в фармацевтически активное соединение преобразовывающим пролекарство
ферментом (а).
Способ может включать введение одной фармацевтической композиции, содержащей оба компонента (а) и (b), или может включать введение двух разных фармацевтических композиций, одна из которых включает компонент (а), а другая содержит (b).
Протеазы.
В онколитическом рекомбинантном РНК-вирусе согласно настоящему изобретению по крайней мере один трансген может кодировать протеазу.
Поэтому предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая
рекомбинантный онколитический вирус согласно настоящему изобретению, вирусный геном согласно
настоящему изобретению, вирусный антигеном согласно настоящему изобретению и/или молекулу ДНК
согласно настоящему изобретению в качестве активного компонента произвольно вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями и/или вспомогательными веществами, вирус, вирусный
геном, антигеном и/или молекула ДНК которой содержат по крайней мере один трансген, кодирующий
протеазу. Фармацевтическая композиция может подходить для лечения и/или облегчения пролиферативного нарушения.
Если онколитический рекомбинантный РНК-вирус согласно настоящему изобретению кодирует
протеазу, онколитический вирус согласно настоящему изобретению вызывает селективную экспрессию
протеазы в инфицированной вирусом клетке-мишени (в особенности, опухолевой клетке), которая обычно не экспрессирует или не достаточно экспрессирует протеазу. Таким образом, при лечении субъекта,
который в этом нуждается, протеаза может необратимо расщеплять целевой полипептид в клеткемишени, таким образом ингибируя пролиферацию и/или рост клетки-мишени или уничтожая клеткумишень, но, может по сути не расщеплять молекулу-мишень в нецелевой клетке, в особенности в здоровой клетке субъекта, подлежащего лечению. В соответствии с этой тактикой снижаются нежелательные
побочные эффекты терапии протеазой.
Предпочтительно, чтобы протеаза являлась специфичной к последовательности протеазой. Более
предпочтительной является протеаза, специфично расщепляющая целевой полипептид. Протеаза может
или иметь природное происхождение и может быть получена из каких-либо видов, либо она может быть
создана с помощью генной инженерии. Аминокислотные последовательности, подходящие для специфичного расщепления предопределенного целевого полипептида, могут быть определены специалистом,
квалифицированным в данной области, например, на основании общедоступных баз данных последовательностей. US 2005-0175581 и US 2004-0072276 описывают получение протеин-сконструированных
протеаз с предопределенной субстрат-специфичностью. Эти два документа включены авторами путем
ссылки.
Целевая молекула протеазы может быть какой-либо молекулой-мишенью, как описано ниже для
мишеней связывающих белков.
Другим предметом настоящего изобретения является способ для лечения пролиферативного заболевания, в особенности гиперпролиферативного заболевания, такого как рак, включающий введение в
фармацевтически эффективном количестве субъекту, который в этом нуждается, рекомбинантного онколитического вируса согласно настоящему изобретению, вирусного генома согласно настоящему изобретению, вирусного антигенома согласно настоящему изобретению и/или молекулы ДНК согласно настоящему изобретению, содержащих по крайней мере один трансген, кодирующий протеазу.
Трансген согласно настоящему изобретению может кодировать слитый белок преобразовывающего
пролекарство фермента, как определено выше, связывающую молекулу, как определено выше, и/или
-5-
013615
протеазу, как определено выше. Особенно предпочтительным является слитый белок преобразовывающего пролекарство фермента и связывающая молекула или слитый белок протеазы и связывающая молекула.
Терапевтические применения
Настоящее изобретение показывает впервые, что трансген, кодирующий связывающий белок, преобразовывающий пролекарство фермент и/или протеазу, может функционально экспрессироваться в инфицированных онколитическим вирусом опухолевых клетках. Таким образом, настоящее изобретение
касается фармацевтической композиции, которая содержит в качестве активного компонента вирус, как
указано выше, нуклеокапсид вируса, геном вируса или молекулу ДНК, кодирующую геном и/или антигеном вируса, произвольно вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями и/или
вспомогательными веществами.
Фармацевтическая композиция может быть представлена в виде раствора, суспензии, лиофилизата
или в любой другой подходящей форме. В дополнение к активному компоненту, композиция может содержать носители, буферы, поверхностно-активные вещества и/или вспомогательные вещества, известные в данной области. Композиция может вводится, например, перорально, местно, назально, пульмонально или путем инъекции местно или внутривенно. Фармацевтическая композиция вводится в фармацевтически эффективном количестве в зависимости от типа нарушения, состояния и веса пациента, пути
введения и т.д. Предпочтительно при применении вводят 109-1012 вирусных частиц, 108-1011, 107-1010 или
106-109 вирусных частиц. Онколитическая терапия может быть произвольно комбинирована с другими
противоопухолевыми терапиями, такими как хирургия, лучевая терапия и/или химиотерапия, типа лечения циклофосфамидом и/или лечения гипертермии.
Согласно настоящему изобретению, рекомбинантный онколитический парамиксовирус может экспрессировать растворимый связывающий белок, преобразовывающий пролекарство фермент и/или протеазу, которые могут остаться или в инфицированной клетке либо могут секретироваться, такие как антитело, фрагмент антитела, белок с анкириновыми повторами или другая связывающая молекула, как
определено ниже. Не было в особенности описано, что такой белок может быть экспрессирован онколитическим штаммом РНК-вируса, например вируса ньюкастловой болезни.
В качестве примера NDV в настоящем применении был выбран штамм МТН68, потому что он обладает собственным онколитическим свойством с многообещающими данными из экспериментальных
лечений пациентов в клинических условиях (Sinkovics и Horvath, 2000). В принципе, однако, в качестве
онколитических агентов для лечения опухолей может использоваться большинство штаммов NDV с многоосновными участками расщепления слитого белка. Обратная технология генетики применима ко всем
штаммам.
Как было продемонстрировано, связывающие белки, описанные выше, имеют высокий терапевтический потенциал.
Комбинация онколитического NDV с терапевтическими связывающими белками, преобразовывающими пролекарство ферментами и/или протеазами с вышеупомянутыми свойствами будет иметь дополнительную или даже синергистическую эффективность двух терапевтических тактик. Онколитический самореплицирующийся вирус нацеливает препарат связывающего белка, преобразовывающий пролекарство фермент и/или протеазу на предпочтительный участок действия, где происходит экспрессия in
situ при высоких локальных концентрациях. Такая экспрессия белка, как ожидается, является очень селективной и связывающий белок, преобразовывающий пролекарство фермент и/или протеаза с их соответствующим способом действия дополнят собственную терапевтическую онколитическую активность
NDV. Основываясь на репликационно-компетентной природе используемого вируса и селективной репликации в опухолевых клетках ожидается, что количество экспрессированного трансгена [связывающего
белка, преобразовывающего пролекарство фермента и/или протеазы] является примерно пропорциональным массе опухоли.
Молекулы антител или подобные антителам молекулы или их производные представляют собой
идеальные связывающие белки для использования с NDV-системой. Молекулы антител были предметом
интенсивного исследования, и в данный момент существуют технологии для получения молекул антител,
которые являются неиммуногенными, высокоселективными и имеют высокую аффинность. Локальная
экспрессия молекул антител при высоких концентрациях приводит к очень значительной агонистической
или антагонистической эффективности или эффективному нацеливанию («таргетированию») эффекторных молекул со сниженным профилем токсичности по сравнению со стандартной терапией.
Использование подобных антителам молекул в системе NDV, как ожидается, является даже преимущественным. Эти молекулы разработаны для селективного высокоафинного связывания с очень высокой тепловой стабильностью и выходом по сравнению с обычными антителами. В случае подобных
антителу молекул на основе анкирина повторная природа молекулы может быть точно настроена согласно соответствующей мишени для оптимизированного нацеливания («таргетирования»), связывания, ингибирования или активации. Также различные связывающие специфичности могут быть скомбинированы в пределах одной анкириновой молекулы, используя возможность объединения в одной молекуле с
анкириновыми повторами нескольких единиц с различными связывающими специфичностями. Эта мо-6-
013615
дульная структура допускает многовалентное связывание больших поверхностей белка, чем это возможно в случае антител, что может быть чрезвычайно важным в блокировании взаимодействий белок-белок.
Модульная структура может также использоваться для блокирования нескольких эффекторов с помощью
только одного единственного блокирующего белка с анкириновыми повторами. Так как молекулы с анкириновыми повторами чрезвычайно устойчивы даже при восстановлении, эти молекулы могут быть
разработаны для нацеливания на белки внутри клетки ("интратело").
Также для идентификации мишени in vivo возможно использовать библиотеки связывающих кодирующих белок последовательностей с NDV.
Возможными мишенями для связывающих молекул или/и протеаз могут быть все структуры клетки-мишени или внеклеточной матрицы, окружающей клетку-мишень, которые могут распознаваться
описанными связывающими белками или/и протеазами и которые имеют отношение к определенному
типу патологического фенотипа. Они могут представлять собой структурные белки, ферменты, факторы
роста, рецепторы факторов роста, интегрины, факторы транскрипции и т.д.
Это изобретение может касаться даже мишеней, на которые не оказывают воздействия маленькие
молекулы (взаимодействия белок-белок, ДНК-связывание и т.д.).
Комбинация онколитического NDV и терапевтических связывающих белков, преобразовывающих
пролекарство ферментов и/или протеаз, описанная выше, предусматривается для лечения воспалительного заболевания, например ревматоидного артрита, и рака.
Для лечения рака можно нацеливаться на все пути, которые способствуют развитию рака. К этим
путям относятся автономность в сигналах роста, нечувствительность к рост-ингибирующим (антиростовым) сигналам, уклонение от апоптоза, безграничный репликативный потенциал, непрерывный ангиогенез и инвазия в ткани и метастазы. Краткий обзор этих путей приведен в (Hanahan и Weinberg, 2000).
Пути передачи сигналов, которые вовлечены в процесс канцерогенеза и на которые можно нацеливаться
с помощью описанного подхода, включают путь рецепторных тирозинкиназ (RTK), путь RB и р53, путь
апоптоза, путь АРС, путь HIF1, путь GLI, путь PI3K и путь SMAD. Детальное описание этих путей передачи сигналов приведен в Vogelstein и Kinzler (2004). Другие пути передачи сигналов, на которые описанные связывающие белки могли бы оказывать влияние, включают путь ras, Wnt и Hedgehog, где, например, могут быть блокированы взаимодействия белок-белок.
К примерам связывающих белков, оказывающих положительное влияние на вышеупомянутые пути
в раковых клетках, относятся
блокирующие белки автономных активных рецепторов факторов роста (например, EGFR, Met),
конкурентные связывающие вещества для факторов роста (антагонисты),
блокирующие белки для Rb-фосфорилирования,
блокирующие белки для Е2F-зависимой транскрипции,
стабилизаторы для р53,
антагонистические связывающие вещества для антиапоптических белков (например, Bcl-2),
антагонистические связывающие вещества для циклинов,
антагонистические связывающие вещества для Ras эффекторов (например, GEF),
антагонистические связывающие вещества для индуцированных гипоксией белков (например,
HIF1α),
ингибиторы факторов транскрипции, которые оказывают влияние на димеризацию или ДНКсвязывание или связывание кофактора (например, Мус/Мах),
индукторы дифференцирования,
ингибиторы smad передачи сигналов/транслокации,
ингибиторы взаимодействий клеточной адгезии (кадхерины, интегрины, например, α5β1, αvβ3),
ингибиторы ферментов, которые расщепляют внеклеточную матрицу (например, ММР),
антагонистические связывающие вещества для проангиогенных лигандов (например, растворимый
VEGF-R),
нгибиторы митотических киназ (например, Plk-1),
антагонистические связывающие вещества к проангиогенным рецепторам,
ингибиторы формирования ядерного комплекса (например, KSR/Ras),
ингибиторы инициирования трансляции (eIF4E, EIF2a).
Протеаза согласно настоящему изобретению, преобразовывающий пролекарство фермент и/или терапевтически активные соединения, полученные из пролекарств настоящего изобретения с помощью
преобразовывающего пролекарство фермента, могут также оказывать положительное воздействие на
вышеупомянутые пути раковых клеток.
Определения
Вирус ньюкаслской болезни.
Парамиксовирусы содержат одноцепочечные РНК геномы отрицательной полярности, причем геномы длиной 15-19 КБ (дикий тип), а геномы содержат 6-10 генов. Вирусная оболочка сформирована
поверхностными гликопротеинами и мембранной частью, полученной из клетки-хозяина. Поверхност-7-
013615
ные гликопротеины (F и HN или Н или G) опосредуют вход и выход вируса из клетки хозяина. Нуклеокапсид находится внутри оболочки и содержит РНК геном и нуклеокапсидный белок (NP), фосфо- (Р) и
большие (L) белки, ответственные за межклеточную вирусную транскрипцию и репликацию. Белок матрицы (М) соединяет вирусную оболочку и нуклеокапсид. В дополнение к этим генам, кодирующим
структурные белки, Paramyxoviridae могут содержать "дополнительные" гены, которые могут быть дополнительными транскрипционными единицами, вкрапленными в упомянутые выше гены. Дополнительные гены являются, главным образом, ORF, которые перекрываются с транскрипционной единицей
гена Р. Обширное описание семейства Paramyxoviridae можно найти в (Lamb, 2001).
NDV является прототипным членом рода Avulavirus в семействе Paramyxoviridae, принадлежащему
отряду Mononegavirales. Вирусный геном представляет собой одноцепочечную минус-смысловую РНК,
кодирующую шесть главных белков: нуклеокапсидный белок (NP), фосфопротеин (Р), матричный белок
(М), слитый белок (F), гемагглютининовый белок (HN) и полимеразный белок (L). Путем редактирования белка Р мРНК, транслируются один или два дополнительных белка, V (и W).
Штаммы NDV классифицируются по их патогенности для кур на велогенные штаммы (высоко вирулентные), приводящие к острой летальной инфекции кур всех возрастов, мезогенные изоляты (промежуточной вирулентности), которые являются летальными только для молодых цыплят, и лентогенные
штаммы (невирулентные), проявляющиеся в легкой или невыраженной форме болезни. Классификация
изолятов NDV на вело-, мезо- или лентоген определяется по среднему времени смерти (MDT - mean
death time) куриного эмбриона в 9-дневных оплодотворенных яйцах после инокуляции минимальной летальной дозой, чтобы убить эмбрион. Одной из детерминант вирулентности NDV, по-видимому, является участок расщепления F белка предшественника.
NDV подробно охарактеризован в Alexander (1988) and Lamb (2001).
Рекомбинантный вирус.
Рекомбинантный вирус означает вирус, который имеет созданное с помощью генной инженерии
определенное изменение в своей геномной РНК-последовательности. Это изменение может представлять
собой одну или несколько вставок, делеций, точечных мутаций или их комбинации.
Рекомбинантный вирус РНК настоящего изобретения может включать полную геномную последовательность природного (немодифицированного) РНК-вируса или последовательность, полученную из
нее, и может дополнительно содержать по крайней мере одну рекомбинантную транскрипционную кассету. По крайней мере одна транскрипционная кассета может быть расположена между двумя генами
(транскрипционными единицами) вирусного генома. В этом случае, по крайней мере одна транскрипционная кассета располагается между транскрипционными стартовой и конечной последовательностями.
По крайней мере одна транскрипционная кассета может также быть расположена в пределах транскрипционной единицы вирусного генома. В этом случае, не требуются какие-либо дополнительные транскрипционные стартовые и конечные последовательности.
По крайней мере одна транскрипционная кассета может включать сайты рестрикции, такие как PacI
или/и AscI, которые могут быть уникальными. Если присутствуют две транскрипционные кассеты, они
могут содержать различные сайты рестрикции.
Предпочтительно, чтобы РНК-вирус настоящего изобретения содержал одну или две рекомбинантные транскрипционные кассеты.
По крайней мере в одной транскрипционной кассете настоящего изобретения расположен трансген,
который может кодировать связывающий белок, преобразовывающий пролекарство, фермент и/или протеазу, описанные выше.
Любой интергенный участок между каждым из двух генов (транскрипционных единиц) вирусного
генома является подходящим для введения по крайней мере одной рекомбинантной транскрипционной
кассеты. Если присутствует больше чем одна рекомбинантная транскрипционная кассета, они могут
быть расположены в тех же самых или различных интергенных участках. Фиг. 1 описывает пример двух
рекомбинантных транскрипционных кассет в пределах одного интергенного участка. Предпочтительно,
чтобы по крайней мере одна рекомбинантная транскрипционная кассета располагалась между вирусным
F и HN генами, в особенности, если РНК-вирус настоящего изобретения представляет собой рекомбинантный вирус ньюкаслской болезни.
Нет известного верхнего предела для размера генома Paramyxoviridae. Поэтому нет никакого верхнего предела для количества и размера трансгенов, введенных в рекомбинантный РНК-вирус настоящего
изобретения. Предпочтительно, чтобы размер трансгена составлял приблизительно до 10 КБ, более
предпочтительно приблизительно до 5 КБ, наиболее предпочтительно приблизительно до 2 КБ.
Рекомбинантный РНК-вирус настоящего изобретения предпочтительно содержит до пяти трансгенов, более предпочтительно до четырех трансгенов, еще более предпочтительно до трех трансгенов, наиболее предпочтительно один или два трансгена. Если рекомбинантный вирус настоящего изобретения
содержит по крайней мере два трансгена, они могут быть идентичными или различными. Рекомбинантный РНК-вирус настоящего изобретения может содержать больше чем одну копию определенного трансгена, в особенности две, три, четыре из пяти копий.
При экспрессии (включая транскрипцию вирусной РНК в мРНК и трансляцию мРНК) трансгена ис-8-
013615
пользуются последовательности контроля экспрессии, такие как транскрипционные стартовые и конечные последовательности и последовательности, контролирующие трансляцию. Могут использоваться
последовательности контроля экспрессии РНК-вируса, который может представлять собой РНК-вирус,
на котором базируется рекомбинантный РНК-вирус настоящего изобретения. В частности, транскрипционные стартовые и конечные последовательности могут быть получены из РНК-вируса. Последовательности контроля экспрессии могут также быть получены из клетки-мишени, в особенности, последовательности, контролирующие трансляцию и/или транспортировку белка.
Из-за механизма репликации Paramyxoviridae геномные или антигеномные РНК обычно не представляют собой изолированные РНК. Геномные и антигеномные РНК собраны вместе с нуклеопротеином. Поэтому еще одним предметом настоящего изобретения является нуклеокапсид рекомбинантного
онколитического РНК-вируса настоящего изобретения. Нуклеокапсид содержит молекулу РНК, кодирующую геном и/или антигеном РНК-вируса и нуклеокапсидный белок. Нуклеокапсид может также
включать полимеразный белок L или/и фосфопротеин Р.
Также предметом настоящего изобретения является антигеном генома настоящего изобретения,
описанного выше.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является молекула ДНК, кодирующая геном и/или
антигеном рекомбинантного онколитического РНК-вируса настоящего изобретения. Молекула ДНК может представлять собой плазмиду. Молекула ДНК настоящего изобретения может использоваться для
создания с помощью генной инженерии РНК-вируса настоящего изобретения. Кроме этого, молекула
ДНК может использоваться для продуцирования РНК-вируса настоящего изобретения. Поэтому молекула ДНК может быть оперативно связана с транскрипционной контрольной последовательностью, например, прокариотической или эукариотической последовательностью контроля транскрипции.
Примером молекул ДНК настоящего изобретения является pflMTH68 мышиный IgG EDB (фиг. 2).
Геном, антигеном, нуклеокапсид и/или молекула ДНК настоящего изобретения может содержать по
крайней мере один трансген, который может быть расположен в пределах транскрипционной кассеты,
как описано выше. Как обсуждалось выше, трансген может кодировать связывающий белок, преобразовывающий пролекарство фермент и/или протеазу.
Другой аспект настоящего изобретения - способ для продуцирования рекомбинантного онколитического РНК-вируса, включающий экспрессию молекулы ДНК, кодирующей геном и/или антигеном рекомбинантного онколитического вируса настоящего изобретения.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является клетка, содержащая рекомбинантный онколитический вирус согласно настоящему изобретению, вирусный геном согласно настоящему изобретению, вирусный антигеном согласно настоящему изобретению и/или молекулу ДНК согласно настоящему
изобретению. Клетка может быть прокариотической клеткой или эукариотической клеткой. Клетка может представлять собой клеточную линию, в особенности, клеточную линию млекопитающего, особенно
клеточную линию человека или мыши. Клетка может использоваться в способе согласно настоящему
изобретению для продуцирования РНК-вируса настоящего изобретения. Подходящие системы для
транскрибирования молекулы ДНК известны специалисту, квалифицированному в данной области, например, в прокариотических системах, таких как Е. coli или эукариотических системах, таких как HeLa
или СНО.
Еще одним аспектом является онколитический РНК-вирус, его геном или антигеном или молекула
ДНК, включающие полный набор генов Paramyxoviridae или набор генов Paramyxoviridae, в котором по
крайней мере один ген или интергенный участок генетически модифицированы, и дополнительно содержащие по крайней мере одну рекомбинантную транскрипционную кассету, как описано выше. Такой
вирус, геном или антигеном или молекула ДНК может использоваться для изготовления лекарства и/или
лечения рака. Такой РНК-вирус, геном, антигеном или молекула ДНК являются подходящими для конструирования рекомбинантного вируса Paramyxoviridae, в особенности, рекомбинантного вируса ньюкаслской болезни методами генной инженерии, чтобы ввести рекомбинантную последовательность в кассету
транскрипции. С этой целью, по крайней мере одна кассета транскрипции может содержать сайт рестрикции. Если присутствует больше чем одна кассета транскрипции, уникальные сайты рестрикции
транскрипционных кассет могут отличаться. Примером является плазмида pflMTH68_Asc_Pac на фиг. 1.
Терапевтическая значимость.
Лечение рака означает ингибирование роста опухоли, предпочтительно уничтожение опухолевых
клеток или блокирование пролиферации во временном промежутке путем инфицирования. NDV селективно реплицируется в опухолевых клетках.
Вирус согласно настоящему изобретению может использоваться для лечения пролиферативных нарушений, в особенности гиперпролиферативных нарушений. Предпочтительно с помощью описанного
вируса можно лечить неоплазмы, предпочтительно можно лечить раковые образования из группы, состоящей из рака легкого, толстой кишки, предстательной железы, молочной железы и головного мозга.
Более предпочтительно можно лечить солидную опухоль.
Более предпочтительно можно лечить опухоль с низкой скоростью пролиферации.
Примеры опухолей с низкой скоростью пролиферации включают рак предстательной железы или
-9-
013615
рак молочной железы.
Более предпочтительно можно лечить опухоль головного мозга. Более предпочтительно можно лечить глиобластому.
Получение рекомбинантного РНК-вируса.
Рекомбинантный РНК-вирус настоящего изобретения, в особенности рекомбинантный NDV, может
быть создан, как описано в Romer-Oberdorfer et al. (1999). Конструкция новых последовательностей нуклеиновых кислот находится на уровне кДНК, которая затем транслируется в РНК внутри эукариотической клетки с использованием следующих стартовых плазмид:
pCITE P, pCITE N, pCITE L, pX8δT flNDV
NDV может быть каким-либо штаммом вируса ньюкаслской болезни, более предпочтительно
штаммом, который является онколитическим в его форме дикого типа.
Плазмида рХ8δТ описана в ЕР 0702085 (Conzelmann K.K.).
Рекомбинантный РНК-вирус настоящего изобретения, в особенности рекомбинантный NDV, может
быть выделен первоначально из клеток, экспрессирующих Т7 полимеразу, например клеток BHK Т7 или
транзиторно с помощью клеток СНО, трансфицированных Т7 полимеразой. Его можно амплифицировать в таких клетках, как 293, СЕС32, НТ29 или А431. Его также можно амплифицировать в аллантоисной жидкости оплодотворенных куриных яиц.
Рекомбинантный РНК-вирус, в особенности рекомбинантный NDV, хранят при следующих условиях. Рекомбинантный РНК-вирус, в особенности NDV, стабилен в 5% D-манните/1% (м/о) L-лизине/рН
8,0 или стандартной среде для клеточной культуры.
При -20°С в течение одного месяца. При -80°С в течение 10 лет.
Использование рекомбинантного NDV в качестве лекарственного средства.
Рекомбинантный вирус РНК согласно настоящему изобретению, в особенности очищенный рекомбинантный NDV согласно изобретению может использоваться в качестве лекарственного средства, поскольку он проявляет фармакологические эффекты.
Рекомбинантный вирус РНК согласно настоящему изобретению, в особенности NDV изобретения,
представляет собой лекарственное средство, особенно для профилактики и/или лечения рака, особенно
для профилактики и/или лечения рака легкого, рака предстательной железы, рака головного мозга, рака
толстой кишки, рака молочной железы.
Изобретение включает рекомбинантный РНК-вирус настоящего изобретения, в особенности NDV
изобретения в качестве лекарственного средства, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и наполнителями. Такой носитель и наполнители описаны в Remington's Pharmaceutical Science, 15th
ed. Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980). Используемые вирусные титры могут быть в
диапазоне 109-1012 pfu на дозу, в диапазоне 108-1011 pfu, в диапазоне 107-1010 pfu или в диапазоне 106-109
pfu, в зависимости от показания терапии.
Поэтому другим предметом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция,
включающая рекомбинантный онколитический вирус согласно настоящему изобретению, вирусный геном согласно настоящему изобретению или молекулу ДНК согласно настоящему изобретению вместе с
фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями и/или вспомогательными веществами.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может подходить для профилактики и/или лечения пролиферативного нарушения, такого как рак.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения может содержать эмульсию рекомбинантного онколитического РНК-вируса согласно настоящему изобретению, в особенности NDV согласно изобретению, и может вводиться путем ингаляции, внутривенной инфузии, подкожной инъекции, внутрибрюшинной инъекции или внутриопухолевой инъекции.
Еще одним предметом настоящего изобретения является способ для профилактики и/или лечения
пролиферативного нарушения, в особенности рака, включающий введение субъекту, который в этом нуждается, фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции настоящего изобретения. Фармацевтически эффективное количество - это титр онколитического РНК-вируса согласно настоящему изобретению, в особенности NDV согласно настоящему изобретению, вирусного генома согласно настоящему изобретению или молекулы ДНК согласно настоящему изобретению, который вылечивает или подавляет болезнь.
Для терапевтического эффекта приемлемая доза отличается и зависит, например, от конструкции,
пациента, пути введения и типа рака.
Предпочтительно, чтобы субъект (пациент) являлся млекопитающим, более предпочтительно человеком.
Еще один аспект настоящего изобретения состоит в использовании рекомбинантного РНК-вируса
настоящего изобретения, в особенности NDV изобретения, вирусного генома настоящего изобретения
или молекулы ДНК настоящего изобретения для изготовления лекарства для лечения рака.
Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими чертежами и примерами.
- 10 -
013615
Пояснения к фигурам
Фиг. 1 описывает плазмиду pflMTH68_Asc_Pac, содержащую полный геном NDV и две транскрипционные кассеты, включающие уникальные сайты рестрикции AscI или PacI соответственно. Нуклеотидная последовательность описывает интергенный участок между F и HN, содержащий две рекомбинантные транскрипционные кассеты (SEQ ID NO: 5).
Фиг. 2 описывает плазмиду pflMTH68 мышиный IgG ED-B, которая основана на
pflMTH68_Asc_Pac и включает последовательности, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь антитела
MOR03257 анти-ED-B IgG (см. пункт 42 немецкой патентной заявки DE 102004050101.7-43; Seq ID No.
77). И легкая цепь, и тяжелая цепь вставлены в одну из транскрипционных кассет.
Фиг. 3 описывает, что инфицирование клеток СНО или НТ29 с помощью NDV МТН146, содержащего гены для антитела MOR03257 анти-ED-B IgG, приводит к экспрессии антитела в клеточном супернатанте. Через 24 ч после инфицирования достигается уровень, составляющий приблизительно 20% максимального уровня экспрессии. Через приблизительно 72 ч после инфицирования достигается максимальная экспрессия антитела. В качестве контроля клетки инфицировали с помощью МТН115 (содержащего ген для β-глюкуронидазы). В этих клетках не было обнаружено IgG.
Фиг. 4 демонстрирует с помощью иммунофлюоресценции, что клетки, инфицированные МТН146,
показывают характер окрашивания, неразличимый от окрашивания рекомбинантным антителом
MOR03257.
Фиг. 5 демонстрирует с помощью иммуногистохимии, что супернатант от инфицированных
МТН146 клеток имеет неотличимый характер окрашивания по сравнению с очищенным αED-B антителом MOR03257, экспрессированным от устойчиво трансфицированной 239 клетки в сосудистой сетке
опухоли, где присутствует ED-B.
Фиг. 6 демонстрирует, что внутривенная инъекция МТН87 приводит к экспрессии GFP в опухоли в
мышиной ксенотрансплантатной модели.
Фиг. 7 описывает экспрессию β-глюкуронидазы в инфицированных МТН115 клетках Hela.
Фиг. 8 описывает уровни экспрессии β-глюкуронидазы в МТН115-инфицированных клеточных линиях.
Фиг. 9 и 10 описывают синергистический эффект HMR1826 и МТН115 в селективном уничтожении
опухолевых клеток.
Примеры
Пример 1. Получение рекомбинантного NDV с трансгенами, которые приводят к экспрессии антитела.
Для получения вирусной РНК использовался онколитический штамм МТН68 NDV. Используя ОТПЦР были получены несколько фрагментов кДНК, и с помощью многоэтапной процедуры клонирования
они были собраны в полногеномную кДНК, которую клонировали в вектор рХ8δТ (Schnell et al., 1994), в
результате чего получили плазмиду pflMTH68. Этот вектор может использоваться для трансфекции, чтобы извлечь рекомбинантный вирус из клеточной линии, экспрессирующей Т7-полимеразу.
Две дополнительных транскрипционных кассеты были клонированы в полноразмерную геномную
плазмиду NDV MTH68 (pflMTH68) между генами, кодирующими F-белок и HN-белок в уникальный сайт
рестрикции SfiI. Два ДНК-олигонуклеотида
Sfi fw (5'-aggccttaattaaccgacaacttaagaaaaaatacgggtagaacggcctgag-3', SEQ ID NO: 1) и
Sfi back (5'-aggccgttctacccgtattttttcttaagttgtcggttaattaaggcctctc-3', SEQ ID NO: 2)
были отожжены и впоследствии лигированы в SfiI-сайт pflMTH68.
Полученная плазмида pflMTH68Pac была разрезана с помощью PacI и другой dsДНКолигонуклеотид, состоящий из
Asc fw (5'-cgggcgcgccccgacaacttaagaaaaaatacgggtagaacagcagtcttcagtcttaat-3', SEQ ID NO: 3) и
Asc back (5'-taagactgaagactgctgttctacccgtattttttcttaagttgtcggggcgcgcccgat-3', SEQ ID NO: 4),
был вставлен в сайт рестрикции PacI, таким образом разрушая один из фланговых сайтов распознания
PacI и вставляя уникальный AscI-сайт.
Полученная плазмида была обозначена как pflMTH68 Asc Рас. Эта плазмида имеет две дополнительные транскрипционные кассеты, вставленные между генами для вирусного F и HN-генов. Обе транскрипционные кассеты находились между идентичными вирусными транскрипционными стартовой и
завершающей последовательностями (фиг. 1). Кассета 1 содержит уникальный сайт рестрикции PacI,
кассета 2 содержит уникальный сайт рестрикции AscI для вставки трансгенной кДНК.
Тяжелые и легкие цепи рекомбинантного функционального блокирующего терапевтического антитела против экстра-домена В (ED-B) фибронектина (MOR03257) были клонированы в два дополнительных уникальных сайта рестрикции AscI и PacI соответственно. Легкая цепь мышиного Igλ для антитела
анти-ED-B была вставлена в сайт AscI. Тяжелая цепь мышиного IgG для антитела анти-ED-B была вставлена в сайт PacI. Длина вставок вместе с адаптерными последовательностями была приспособлена к базисной величине, которая была кратной шести для того, чтобы следовать правилу шести относительно
длины полного генома рекомбинантного вируса. Полученная плазмида была обозначена как pflMTH68
- 11 -
013615
мышиный IgG ED-B (фиг. 2).
Используя стандартные методы для извлечения рекомбинантного NDV (трансфекция Т7экспрессирующих клеток ВНК), был получен вирус, содержащий два дополнительных гена, кодирующих
две цепи антитела анти-ED-В IgG. Этот вирус был назван МТН146.
Пример 2. Экспрессия антитела рекомбинантным вирусом ньюкаслской болезни.
Клетки, инфицированные МТН146, продуцируют антитело, которое распознает ED-B антиген фибронектин (ELISA).
Материалы и методы.
Клетки НТ29 (человеческая карцинома толстой кишки) и СНО (яичник китайского хомяка) были
посеяны в 6-лунковые планшеты в концентрации 4×105 клеток/лунку. День спустя, клетки инфицировали
в трехкратном повторении с MOI 0,01 либо вирусом МТН146 (содержащим гены для антитела анти-EDB), либо вирусом МТН115 (содержащем ген для несоответствующего секретируемого трансгена [βглюкоронидазы]).
Во временные точки 0 ч, 20 ч, 30 ч, 2 суток, 3 суток, 6 суток post infectionem, была отобрана аликвота клеточного супернатанта и подвергнута определению титра антитела.
Титр антитела был определен с помощью ELISA. Пластиковые лунки были покрыты рекомбинантным антигеном ED-B. В лунки добавили супернатант культуры ткани, содержащий антитело или в качестве стандарта известные количества рекомбинантного антитела. После промывки связанное антитело
было обнаружено с помощью HRP-спаренного вторичного антитела, образованного против мышиного
IgG. Используя очищенное рекомбинантное антитело (экспрессированное трансфицированными плазмидой клетками) в качестве стандарта можно было определить концентрацию вирусно продуцированного
антитела.
Результаты.
Инфицирование с помощью МТН146 приводит к экспрессии антитела в клеточный супернатант,
который специфично связывается со своей мишенью ED-B (фиг. 3). Инфицирование тех же клеток вирусом, экспрессирующим несоответствующий секретируемый трансген (МТН115), не приводит к сигналу в
ED-B ELISA с клеточным супернатантом. В опухолевых клетках НТ29 концентрация антитела в супернатанте достигает титров, составляющих приблизительно 8 мкг/мл (связывающий IgG), что является достаточной концентрацией для биологической активности. В клетках СНО титр антитела достигает даже
>20 мкг/мл в супернатанте.
Пример 3. Вирусно экспрессированное антитело связывается со своей мишенью.
Иммунофлюоресценция.
Материалы и методы.
Клетки мышиной F9 тератокарциномы высеяли в 6-лунковые планшеты. Клетки были инфицированы либо с помощью МТН146 (антитело анти-ED-B), либо с помощью МТН115 (несоответствующий
трансген β-глюкуронидаза) или фиктивно инфицированы.
Спустя два дня после инфицирования клетки зафиксировали с помощью 4% формальдегида. Клетки
промыли и связанное антитело визуализировали путем окрашивания с помощью Су3-спаренного вторичного антитела, направленного против мышиного IgG. В качестве положительного контроля фиктивно
инфицированные клетки инкубировали до фиксации в течение 1 ч с 5 мкг/мл рекомбинантного α-ED-B
IgG.
Результаты.
Отрицательный контроль не показывает значительного окрашивания клеток F9. Клетки, инфицированные МТН146, показывают характер окрашивания, который неотличимым от окрашивания рекомбинантным антителом (фиг. 4). Поэтому можно сделать заключение, что вирусная инфекция приводит к
продуцированию правильного антитела, которое связывается со своим антигеном подобно рекомбинантному антителу. Концентрация вирусно продуцированного антитела также достаточна, чтобы дать окрашивание, подобное концентрации антитела, составляющей 5 мкг/мл. Это согласуется с предполагаемой
концентрацией вирусно экспрессированного антитела, которая находится в диапазоне 5 мкг/мл.
Пример 4. Вирусно экспрессированное антитело связывается со своей мишенью.
Иммуногистохимия.
Материалы и методы.
Хранящиеся при криогенной температуре срезы тканей (10 мкм) меланомы SK-MEL, выращенной в
виде ксенотрансплантата подкожно у мышей, были зафиксированы в холодном ацетоне в течение 10 мин,
промыты в PBS и окрашены антителом. В качестве контроля служило очищенное антитело MOR03257 αED-B IgG (конц. 5 мкг/мл для окрашивания), которое было экспрессировано от стабильно трансфицированных 293 клеток. Отрицательный контроль инкубировали только с буфером и без первичного антитела. Супернатанты 293 клеток, инфицированных рекомбинантными вирусами, использовались для окрашивания в виде неразведенных супернатантов. До окрашивания вирус инактивировали путем облучения
УФ-излучением. Инфицированные МТН146 клетки продуцируют антитело α-ED-B IgG, инфицированные контрольные клетки были инфицированы рекомбинантным вирусом, который не продуцирует анти- 12 -
013615
тело как трансген. Связанное антитело визуализировали путем обнаружения с помощью протеин-Апероксидазы и окрашивания диаминобензидином в качестве субстрата. Срезы контрокрасили с помощью
гематоксилина QS. Фотодокументацию выполнили с помощью системы Zeiss Axiophot.
Результаты.
Не может наблюдаться какого-либо неспецифичного окрашивания криосрезов при инкубации без
антитела или с супернатантом культуры ткани от инфицированных контрольным вирусом 293 клеток.
Окрашивание очищенным антителом α-ED-B, экспрессированным от стабильно трансфицированных 293 клеток, показывает характерный сигнал для сосудистой сетки опухоли, где присутствует ED-B.
Инкубация с супернатантом от МТН146-инфицированных клеток приводит к неотличимому характеру
окрашивания (фиг. 5). Это демонстрирует, что вирусно экспрессированное антитело способно специфично связывать свою мишень ED-B также в срезах опухолевой ткани, и что концентрация в супернатанте
инфицированных клеток является достаточной, чтобы дать сигнал, сопоставимый с очищенным антителом, 5 мкг/мл.
Пример 5. Опухоль-селективная репликация рекомбинантного NDV in vivo.
Этот пример демонстрирует, что внутривенная инъекция GFP экспрессирующего онколитического
вируса МТН87 приводит к экспрессии GFP в опухоли на мышиной ксенотрансплантатной модели.
Ксенотрансплантаты карциномы поджелудочной железы MiaPaCa выращивали подкожно у голых
мышей. Мышам через день вводили повторно (6×) 1×109 pfu МТН87 (NDV с GFP в качестве трансгена).
В день 21 и день 34 после последнего введения индивидуальных животных умертвили и расчленили. Секции органов (приблизительно 2 мм) были непосредственно проанализированы под флюоресцентным микроскопом для обнаружения GFP-экспрессии (фиг. 6).
Фотографии срезов опухоли показывают GFP-экспрессию. Не могли обнаружить такую GFPэкспрессию ни в одном из следующих органов: селезенка, печень, легкое, сердце, почка, кишечник, надпочечник.
Повторное выделение NDV (MTH87) из органов.
Чтобы доказать присутствие реплицирующегося вируса в опухоли, а не в других органах, срезы органов (толщиной приблизительно 2 мм) инкубировали на вершине монослоя чувствительных к вирусу
клеток НТ29 в культуральной среде для тканей. День спустя клетки НТ29 оценивали на экспрессию GFP,
которая указывала на инфицирование МТН87, происходящее из органа/опухоли. Повторное выделение
МТН87 было возможным только от частей опухоли, а не из какого-либо из тестируемых органов. Из 6
частей опухоли от каждой опухоли по крайней мере 4 были позитивны на повторное выделение вируса.
Отрицательные органы включали селезенку, печень, легкое, сердце, почку, кишечник, надпочечник (другие органы не были включены в тест).
Эти результаты подтверждают, что рекомбинантный вирус МТН87 селективно реплицируется в
опухолевой ткани, а не в других органах. Вирусная репликация обнаружима спустя много дней после
последнего внутривенного введения вируса.
Пример 6.
Получение онколитического NDV, который экспрессирует антитело-эффектор слитый белок L19IL2.
Слитый белок L19-IL2 является цитокином, направленным на антитело. Фрагмент антитела L19 направлен против экстрадомена В фибронектина (ED-B), который экспрессируется, главным образом, в
окружающих опухоль кровеносных сосудах, а также и в строме опухоли.
Цитокин интерлейкин-2 индуцирует пролиферацию Т-клеток и активирует NK-клетки. Несвязанный, ненаправленный интерлейкин-1 (пролейкин) в настоящее время используется в низких дозах для
лечения почечно-клеточной карциномы (ПКК). Клиническое использование пролейкина ограничено изза его высокой системной токсичности. Показано, что направленная доставка IL-2 антителом, таким как
L19, может использоваться с целью доставки терапевтических эффективных доз к опухолям, при этом
поддерживая нетоксичные системные уровни IL-2. Опухоль-специфичная доставка и экспрессия L19-IL2
комбинирует селективность к опухоли онколитического вируса с дополнительной селективностью к
опухоли фрагмента антитела L19 и мощной эффекторной активностью IL-2.
Материал и методы.
Получение рекомбинантного NDV, экспрессирующего слитый белок L19-IL2.
Плазмида pflMTH68 Рас содержит полную геномную последовательность NDV МТН68 плюс одну
дополнительную транскрипционную кассету с уникальным сайтом рестрикции PacI. ДНК-трансген, кодирующий слитый белок L19-IL2, клонирован в сайт PacI. Этот трансген состоит из последовательности
Kozak ССАСС, сигнального пептида для внеклеточной секреции и кДНК для слитого белка L19-IL2
(Carnemolla et al., 2002). Полная длина генома приспособлена таким образом, чтобы быть кратной 6 для
соблюдения "правила шести" для длины вирусного генома. Рекомбинантный вирус извлекают из Т7экспрессирующих клеток, трансфицированных полноразмерной вирусной геномной плазмидой, содержащей ген для L19-IL2, с помощью стандартной техники извлечения вируса. Полученный вирус обозначается как МТН201. Вирус культивируют или в культуре ткани, или в аллантоисной жидкости куриных
- 13 -
013615
яиц, чтобы получить высокие титры.
Эксперимент с ксенотрансплантатом мышиной F9-тератокарциномы.
Терапевтические исследования выполняют на модели сингенной F9 мышиной тератокарциномы.
Мышиная модель F9-тератокарциномы - быстрорастущая сингенная опухоль, характеризующаяся высокой экспрессией ED-B -фибронектина, главным образом, в окружающих опухоль кровеносных сосудах, а
также и в строме опухоли.
2×106 F9 опухолевые клетки в 50% матригеле имплантируют подкожно голым мышам линии 129
(клон SvHsd). Когда опухоли достигают размера приблизительно 20 мм2, мышей инфицируют рекомбинантным NDV MTH201 (кодирующим слитый белок L19-IL2) или контрольным вирусом МТН87 (кодирующим GFP как трансген) в концентрации 1×109 pfu в дни 1, 3, 5 и 7 внутривенно. L19-IL2 (СНОполученный, димер) и IL2 (пролейкин) вводят в виде ежедневной внутривенной болюсной инъекции в
стерильном физиологическом растворе в течение 5 дней. Все концентрации, которые используются в
исследованиях на животных, находятся в диапазоне 1,8-2,16 млн МЕ/кг/сутки.
Спустя 12 дней мышей умервщляют и массу опухоли оценивают путем измерения площади опухоли (результат умножения наиболее длинного диаметра и его перпендикуляра) или объема опухоли, используя кронциркуль.
Результат.
При использовании димерного L19-IL2 наблюдается сокращение массы опухоли на 54,7% даже при
самой низкой дозе, равной 1430 МЕ/г/сутки, соответствующих низкодозированной схеме, используемой
у людей, тогда как 3- и 6-кратные более высокие дозы только немного улучшают терапевтическую эффективность направленного IL2. При использовании пролейкина масса опухоли уменьшается на 50,5%
при применении его наиболее высокой дозы. Никакой терапевтической эффективности не наблюдается
при дозе 1430 и 4290 МЕ/г/сутки. Лучшие результаты получены в группе мышей, получавших лечение
NDV MTH201. Снижение массы опухоли составляет свыше 55%. Этот факт можно объяснить комбинированным действием экспрессированного вирусом L19-IL2 и онколитическим эффектом NDV. Другое
преимущество состоит в том, что достигнутые результаты получены с меньшим количеством введений
NDV МТН201 по сравнению с монотерапией слитым белком.
Пример 7.
Получение онколитического NDV, который экспрессирует белок с анкириновыми повторами, который связывает VEGF и биологически активен.
Было продемонстрировано на экспериментальных моделях (Warren et al., 1995), что VEGF и его рецептор являются существенными для роста колоректальных видов рака и формирования и роста метастазов рака толстой кишки в печень, и этот принцип был клинически подтвержден путем системного использования VEGF-нейтрализующего человеческого антитела авастина у пациентов с метастатическим
колоректальным раком (Salgaller, 2003).
VEGF (или VPF) представляет собой гомодимерный гликопротеин, состоящий из четырех изоформ
(содержащих по 121, 165, 189, 206 аминокислотных остатков в зрелом мономере), который получается
путем альтернативного сплайсинга мРНК, полученной из одного гена. В то время как все формы VEGF
имеют сигнальную последовательность, секретируются только меньшие две разновидности. В отличие
от них большие формы ассоциированы с гепаринсвязанными протеогликанами во внеклеточном матриксе. VEGF является митогенетическим для ряда больших и малых эндотелиальных клеток сосудов, индуцирует продуцирование фактора ткани, коллагеназы, активаторов профибринолизина, и их ингибиторов
и также стимулирует транспорт гексозы в этих клетках. Наиболее важными рецепторами для VEGF являются fms-подобная тирозинкиназа flt1 и KDR (Waltenberger et al., 1994). Экспрессия VEGF была продемонстрирована в нескольких линиях рака человека in vitro и в хирургическим путем удаленных опухолях желудочно-кишечного тракта, яичника, головного мозга, почки, легкого человека и др. Во многих
экспериментальных моделях опухолей нейтрализация VEGF приводит к эффективному и существенному
ингибированию роста (Gerber и Ferrara, 2005).
Мы демонстрируем, что опухоль-направленная доставка анти-VEGF белка с анкириновыми повторами с помощью рекомбинантного NDV является преимущественной для лечения этой болезни. Это показано на экспериментальной модели колоректального рака безтимусных мышей. Как правило, печень
является первым и наиболее частым участком метастазирования при колоректальном раке. Поэтому сила
действия нового средства также демонстрируется на ортотопической экспериментальной модели метастазов печени.
Материал и методы.
Получение рекомбинантного NDV, экспрессирующего белок с анкириновыми повторами, который
нейтрализует VEGF.
Анти-VEGF молекула с анкириновыми повторами типа N3C выбирается с помощью стандартных
процедур (Binz et al., 2004). Последовательность выбранного белка с анкириновыми повторами известна.
Кассета экспрессии, кодирующая определенный белок с анкириновыми повторами (dARPIN) с ингибиторной активностью против VEGF, клонируется в полноразмерную геномную плазмиду NDV-MTH68.
- 14 -
013615
Плазмида pflMTH68 Рас содержит полную геномную последовательность NDV МТН68 плюс одну
дополнительную транскрипционную кассету с уникальным сайтом рестрикции PacI. ДНК-трансген, кодирующий dARPIN против VEGF, клонирован в сайт PacI. Этот трансген состоит из последовательности
Kozak ССАСС, сигнального пептида для внеклеточной секреции и кДНК для молекулы с анкириновыми
повторами. Полная длина генома приспособлена таким образом, чтобы быть кратной 6, для соблюдения
"правила шести" относительно длины вирусного генома. Рекомбинантный вирус извлекают из Т7экспрессирующих клеток, трансфицированных полноразмерной вирусной геномной плазмидой, содержащей ген для dARPIN против VEGF с помощью стандартной техники извлечения вируса. Полученный
вирус обозначается как МТН268. Вирус культивируют или в культуре ткани, или в аллантоисной жидкости куриных яиц, чтобы получить высокие титры.
Подкожные опухоли.
Сплошные культуры клеток LS LiM6 выращивают в 10 см2 чашках Петри и собирают путем краткой трипсинизации (0,05% трипсин/0,02% EDTA в HBSS без Ca2+/Mg2+), промывая несколько раз в
PBS, не содержащем Ca2+/Mg2+, и повторно суспендируя при конечной концентрации, равной 5×107
клеток в DMEM без сыворотки. Присутствие отдельных клеток подтверждают с помощью фазовоконтрастной микроскопии, а жизнеспособность клеток определяют с помощью трипана синего. Безтимусных
мышей Balb/c NCR-NU без патогенов (3-4-недельные самки, полученные от Simonson laboratories, Gilroy,
Ca) содержат в стерилизованных клетках и вводят подкожно 5×106 жизнеспособных клеток опухоли.
Животных наблюдают ежедневно на наличие роста опухоли и подкожные опухоли измеряют, используя
кронциркуль каждые 3 суток. В день 1, 3, 5 и 7 после инокуляции опухоли группам по пять животных
вводят внутрибрюшинно варьирующие количества или анти-VEGF mAB 4.6.1 (0-200 мкг на мышь), контрольное mAb того же изотипа (200 мкг/мышь), анти-VEGF белок с анкириновыми повторами (0-200
мкг/на мышь), 1×109 pfu NDV МТН268 либо 1×109 контрольного NDV MTH87. Перед введением вируса
в высоких дозах у животных уменьшают чувствительность путем введения увеличивающихся доз вируса
1×106 pfu, 1×107 pfu, 1×108 pfu, 5×108 pfu через день. Объемы опухоли рассчитывают, как описано ранее
(Kuan et al., 1987).
Метастазы в печень.
Клетки Н7 выращивают до сплошного роста и собирают, как описано выше для подкожной инъекции, и повторно суспендируют в DMEM, не содержащем сыворотки, при концентрации 20×106 клеток/мл. Безтимусных мышей обезболивают с помощью ингаляции метоксифлурана, стерильно приготовленной, и селезенку экстериоризируют через разрез левого бока. 2×106 клеток в 100 мл медленно вводят в
мякоть селезенки через 27-G иглу более 1 мин, после чего 1 мин спустя проводят спленэктомию. Экспериментальные животные получают антитело VEGF 4.6.1, контрольное антитело (100 мкг/мышь), антиVEGF белок с анкириновыми повторами (100 мкг/мл) путем внутрибрюшинной инъекции, начиная с 1
суток после селезёночной-портальной инъекции и каждые 3-4 дня после этого. Альтернативно мыши
получают внутрибрюшинно 1×109 pfu NDV MTH268 или 1×109 контрольного NDV MTH87 в день 1, 3, 5
и 7. Всех животных убивают, когда первая мышь кажется летаргической, и пальпируется увеличенная
печень (день 28). Печень вырезают, взвешивают и перечисляют метастазы, используя рассекающий микроскоп.
Чтобы оценить объем опухоли, диаметр каждого метастаза в печень измеряют до миллиметра и
объем каждой опухоли вычисляют, предполагая, что она является сферой. Определяют сумму объемов
всех опухолей в каждой печени. Печень двух контрольных животных почти заменяется опухолью, и индивидуальные узлы нельзя выделить. Объем опухоли в этих двух печенях оценивают следующим образом: полную массу объема печени измеряют путем вытеснения воды в 20-мл проградуированном цилиндре, и объем опухоли, по оценке, составляет 85% печени.
Результат.
Подкожные опухоли. Размер опухоли животных, получавших лечение, мониторируют, и для всех
тестируемых агентов обнаружено дозозависимое ингибирование роста опухоли. Размер опухоли у животных, которые получали контрольное mAb, составляет приблизительно 100 мм3 на день 8, 400 мм3 на
день 16 и 900 мм3 на день 22. Для mAb 4.6.1 измеренный размер опухоли на день 22 составляет 500 мм3,
когда 10 мкг mAb вводят при каждом введении, и 200 мм3 (100 мкг), 150 мм3 (50 мкг), 100 мм3 (200 мкг)
соответственно. Подобная зависимость от дозы обнаружена для анти-VEGF белка с анкириновыми повторами, когда вводится до 200 мкг, при этом лучший результат относительно размера опухоли, равного
100-500 мм3, достигается при применении 200 мкг агента. При лечении безтимусных мышей контрольным NDV MTH87 размер опухоли на день 22 составляет свыше 200 мм3. Этот противоопухолевый эффект имеет место из-за антипролиферативного эффекта, вызванного онколитическим NDV. Лучшие эффекты получены при инфицировании безтимусных мышей с помощью NDV MTH268 (экспрессирующего анти-VEGF белок с анкириновыми повторами). Измеренный размер опухоли составляет менее 100
мм3. Этот эффект имеет место благодаря выгодной комбинации опухоль-селективной экспрессии VEGFнейтрализирующего связывающего белка с анкириновыми повторами и его антиангиогенного эффекта и
независимого антипролиферативного действия опухоль-селективного NDV на клетки опухоли. Опухоль- 15 -
013615
селективная доставка и экспрессия анти-VEGF анкиринового связывающего белка обеспечивают стойкую и высокоуровневую сайт-специфичную экспрессию нейтрализирующего белка, который преодолевает фармакологические ограничения системного введения белка с анкириновыми повторами, такие как,
например, быстрый клиренс и неспецифическое распределение в тканях и обеспечивает эффективную
нейтрализацию VEGF. Этот эффект достигается при уменьшенном количестве введений, и поэтому ожидается более высокое удобство в применении для популяции пациентов.
Метастазы в печень.
Все животные демонстрируют доказательства наличия опухолей печени, но отличаются по числу,
размеру и массе метастазов в печень. Значительное сокращение по сравнению с мышами, получавшими
контрольное mAb, наблюдается после лечения анти-VEGF. Среднее количество опухолей в печени и
средний предполагаемый объем опухоли на печень 10- и 18-кратно ниже у животных, получавших антиVEGF mAb 4.6.1, по сравнению с животными, которым вводили контрольное антитело. Подобные результаты получены для мышей, получавших анти-VEGF белок с анкириновыми повторами. Наиболее
значительное сокращение наблюдается у животных, получавших лечение NDV МТН268. Хотя он вводился меньшее количество раз, число опухолей в печени уменьшается, и объем опухолей является меньшим по сравнению с мышами, получавшими А4.6.1.
Что касается первичной опухоли благоприятное воздействие NDV MTH268 на ингибирование формирования и роста метастазов в печень имеет место благодаря выгодной комбинации опухольселективной экспрессии VEGF-нейтрализирующего связывающего белка с анкириновыми повторами и
его антиангиогенного эффекта и независимого антипролиферативного действия опухоль-селективного
NDV на клетки опухоли. NDV селективно распространяется в этих остающихся опухолевых зародышах
и проявляет свой антипролиферативный эффект на эти опухолевые клетки, дополнительно уменьшая
количество выживших опухолевых клеток и число обнаружимых метастазов.
Даже увеличение терапевтической эффективности на рост первичной опухоли и число, размер и
массу колоректальных метастазов печени отмечается при использовании мультиспецифичного связывающего белка с анкириновыми повторами, который содержит специфичности для VEGF-A, VEGF-C и
PDGF.
Пример 8.
Получение рекомбинантного NDV, экспрессирующего внутриклеточный белок с анкириновыми
повторами, который ингибирует полоподобную киназную активность и ингибирует рост опухоли.
Plk-1, как показано, является мишенью для противораковой терапии. Экспрессия Plk-1 повышена в
неопластических тканях и имеет прогностический потенциал в широком диапазоне человеческих опухолей (см. например, WO 2005042505 и ссылки в нем).
Молекула античеловек Plk-1 с анкириновыми повторами типа N3C выбирается с помощью стандартных процедур (Binz et al., 2004, Amstutz et al., 2005). Связывание с Plk-1 измеряется в ELISA с помощью рекомбинантного GST-Plk-1 на глутатионовых пластинах в качестве субстрата. Выбирают положительные связывающие вещества, и соответствующие гены клонируют в эукариотическую CMV плазмиду
экспрессии pcDNA3.1. Плазмиды трансфицируют в клетки Hela и MaTu, и клетки подвергают тесту на
пролиферацию, как описано, например, в WO 2005042505. Этот способ предпочтитают киназному тесту
in vitro, чтобы иметь возможность также идентифицировать связывание dARPINS, блокирующего функцию без непосредственного блокирования киназной активности. Для вставки в геном онколитического
рекомбинантного NDV выбирают dARPIN с лучшей ингибиторной активностью клеточной пролиферации. Последовательность выбранного белка с анкириновыми повторами содержит 161 аминокислоту, что
соответствует 483 bp. Кассету экспрессии, кодирующую определенный белок с анкириновыми повторами (dARPIN) с ингибиторной активностью против человеческой Plk-1 клонируют в полноразмерную геномную плазмиду NDV-MTH68.
Плазмида pflMTH68 Рас содержит полную геномную последовательность NDV МТН68 плюс одну
дополнительную транскрипционную кассету с уникальным сайтом рестрикции PacI. ДНК-трансген, кодирующий dARPIN против Plk-1, клонирован в сайт PacI. Этот трансген состоит из последовательности
Kozak ССАСС и кДНК для молекулы с анкириновыми повторами. Полная длина генома приспособлена
таким образом, чтобы быть кратной 6, для соблюдения "правила шести" относительно длины вирусного
генома. Рекомбинантный вирус извлекают из Т7-экспрессирующих клеток, трансфицированных полноразмерной вирусной геномной плазмидой, содержащей ген для dARPIN против Plk-1 с помощью стандартной техники извлечения вируса. Полученный вирус обозначается как МТН261. Вирус культивируют
или в культуре ткани, или в аллантоисной жидкости куриных яиц, чтобы получить высокие титры. Вирус
очищают и концентрируют, используя тангенциальную проточную фильтрацию, и элюируют в буфере с
5% маннитом/1% L-лизином.
Ингибирование роста опухоли in vivo.
Самкам голых мышей NMRI вводят подкожно 1,5×106 клеток MaTu, разведенных в соотношении
1:1 (среда:матригель). Когда опухоли достигают размера 20-25 мм2 (прибл. 3 дня спустя), животные получают лечение рекомбинантным вирусом. Животным вводят 200 мкл вирусной суспензии (в буфере из
- 16 -
013615
5% маннита/1% L-лизина) внутривенно через день в следующих последовательных дозах: 1×106 pfu,
1×107 pfu, 1×108 pfu, 5×108 pfu, 1×109 pfu, 1×109 pfu, 1×109 pfu, 1×109 pfu, 1×109 pfu. Увеличение доз вначале дает возможность уменьшить чувствительность мышей к вирусу. Одна группа получает только буфер (5% маннит/1% L-лизин), одна группа получает рекомбинантный вирус МТН87, который экспрессирует нетерапевтический трансген (GFP), и одна группа - рекомбинантный онколитический вирус
МТН261, экспрессирующий dARPIN, который обладает ингибиторной активностью против Plk-1. Рост
опухоли мониторируют в течение трех недель и в конце опухоли взвешивают (день 21). Контрольные
опухоли находятся в диапазоне 1,0 г. Опухоли, получавшие лечение МТН87, показывают существенное
сокращение массы. Опухоли, получавшие лечение МТН261, являются еще меньшими и показывают существенное сокращение массы по сравнению с МТН87. Это факт свидетельствует о позитивном воздействии экспрессии dARPIN вирусом по сравнению с монотерапией вирусом. Результат также доказывает,
что внутриклеточно активный трансген может улучшить онколитические свойства рекомбинантного онколитического вируса.
Пример 9. Получение онколитического NDV, который экспрессирует белок с анкириновыми повторами, который связывает HIF1α и биологически активен.
В опухолях развивается гипоксия, если опухолевые клетки растут быстрее? чем эндотелиальные
клетки, которые формируют систему кровеносных сосудов, что приводит к снижению количества кислорода и питательных веществ в опухоли.
Установление гипоксических областей в солидных опухолях способствует прогрессии развития
опухоли. Дефицит кислорода в опухолевых клетках приводит к генетической нестабильности, что сопровождается процессом селекции, заканчиваясь в опухолевых клетках уменьшением апоптического потенциала и увеличением резистентности к стандартным видам терапии, таким как химиотерапия и лучевая
терапия. Как следствие, гипоксия в опухолях способствует более злокачественному фенотипу.
Гипоксия-индуцибельный фактор транскрипции HIF-1α главным образом отвечает за активацию
большинства генов в опухолевых клетках при гипоксических условиях. Генные продукты, индуцированные HIF-1α, регулируют такие процессы, как ангиогенез, метаболизм глюкозы, рост клеток и транспорт
кислорода. Примеры генов с повышенной экспрессией под воздействием HIF-1α включают переносчик
глюкозы 1 и 3, аденилаткиназу 3, лактатдегидрогеназу, VEGF, Flt-1 и другие.
Гетеродимерный фактор транскрипции HIF-1α состоит из субъединиц HIF-1α и HIF-1β. HIF-1αсубъединица и HIF-1β-субъединица постоянно экспрессируются. Но HIF-1α в отличие от HIF-1β сразу
же расщепляется при условиях нормоксии. В нормальной кислородной среде HIF-1α-субъединица распознается и помечается для протеасомального расщепления белком фон Хиппель-Линдау (pVHL - VonHippel-Lindau protein), который является частью комплекса Е3 убиквитинлигазы. В гипоксическом состоянии HIF-1α-субъединица больше не распознается pVHL, и белок сразу же транспортируется в ядро.
В ядре происходит димеризация с HIF-1β-субъединицей и ДНК-связывание с HRE (ответный элемент на
гипоксию - hypoxia response element), что приводит к специфичной генной индукции.
В описанном эксперименте демонстрируется на модели солидной опухоли, что внутриклеточное
нацеливание («таргетирование») HIF-1α-фактора транскрипции с помощью белка с анкириновыми повторами анти-HIF-1α, экспрессированного рекомбинантным NDV, является лучшим по сравнению с монотерапией NDV и отдельным применением только рекомбинантного очищенного белка с анкириновыми повторами анти-HIF-1α. Эффективность in vivo доказывают на ксенотрансплантатной модели рака
предстательной железы у голых мышей.
Материал и методы.
Получение рекомбинантного NDV, экспрессирующего белок с анкириновыми повторами, который
связывает HIF-1α.
Молекула с анкириновыми повторами анти-HIF-1α типа N3C выбирается с помощью стандартных
процедур (Binz et al., 2004). Последовательность выбранного белка с анкириновыми повторами известна.
Кассета экспрессии, кодирующая определенный белок с анкириновыми повторами (dARPIN) с ингибиторной активностью против HIF-1α, клонируется в полноразмерную геномную плазмиду NDV-MTH68.
Плазмида pflMTH68 Рас содержит полную геномную последовательность NDV МТН68 плюс одну
дополнительную транскрипционную кассету с уникальным сайтом рестрикции PacI. ДНК-трансген, кодирующий dARPIN против HIF-1α, клонирован в сайт PacI. Этот трансген состоит из последовательности Kozak ССАСС и кДНК для молекулы с анкириновыми повторами. Полная длина генома приспособлена таким образом, чтобы быть кратной 6, для соблюдения "правила шести" относительно длины вирусного генома. Рекомбинантный вирус извлекают из Т7-экспрессирующих клеток, трансфицированных
полноразмерной вирусной геномной плазмидой, содержащей ген для dARPIN против HIF-1α с помощью
стандартной техники извлечения вируса. Полученный вирус обозначается как МТН288. Вирус культивируют или в культуре ткани, или в аллантоисной жидкости куриных яиц, чтобы получить высокие титры.
PC 3 ксенотрансплантатная модель.
PC 3 ксенотрансплантаты переносят in vivo самкам или самцам безтимусных голых мышей. Ксе- 17 -
013615
нотрансплантаты вводят путем подкожной (sc) инъекции 5×105 РС-3 клеток на животное. После третьего
переноса опухоли разрезают на 2 мм3 части. Подкожная инокуляция ненекротических тканей опухоли у
голых мышей выполняется с помощью стерильных игол из нержавеющей стали. Мыши рандомизированно распределяют в различные группы лечения, когда объем опухоли достигает среднего размера, равного 150-200 мм3.
Начиная с дня 0 после распределения группам мышей вводят через день увеличивающиеся дозы
МТН288 (кодирующего анти-HIF-1α dARPIN), или МТН87 (контрольного вируса, кодирующего GFP как
трансген). Перед лечением вирусом в высоких дозах, для десенсибилизации к NDV внутривенно вводятся вирусные дозы, составляющие 106 PFU, 107 PFU, 108 PFU и 5×108 PFU. После десенсибилизации три
раза применяется самая высокая доза 109 PFU. Группа контроля получает лечение внутривенно с помощью очищенного белка с анкириновыми повторами анти-HIF-1α (200 мкг/мышь). Применение белка с
анкириновыми повторами анти-HIF-1α начинается во время первой вирусной инъекции и также повторяется через день, пока осуществляется терапия вирусом. Третьей группе контроля вводят только PBS. В
день 20 после первого введения животных наблюдают на наличие роста опухоли, и подкожные опухоли
измеряют, используя кронциркуль.
Результаты.
В день 20 после первого введения средний объем опухолей животных, которым вводили PBS, составляет 1500 мм3. У второй группы контроля, получавшей лечение только белком с анкириновыми повторами анти-HIF-1α, отмечается небольшое снижение роста опухоли. У животных, получающих NDV
MTH87, наблюдается значительное сокращение опухоли в день. Лучшее ингибирование роста опухоли в
день 20 отмечается у мышей, которым вводили NDV MTH288, экспрессирующий белок с анкириновыми
повторами анти-HIF-1α.
Ингибирование роста опухоли после лечения МТН288 значительно лучше, чем после других видов
лечения.
Этот результат демонстрирует, что внутриклеточная экспрессия NDV белка с анкириновыми повторами против HIF-1α имеет преимущество по сравнению с монотерапией NDV или применением рекомбинантного очищенного белка с анкириновыми повторами анти-HIF-1α.
Ожидается, что вирусная экспрессия секретируемого белка с анкириновыми повторами анти-HIF-1,
слитого с проникающим в клетку пептидом (например, пептидом tat, олигоаргининовыми пептидами,
пептидом AntP, пептидом VP22, пенетратином, транспортантом) (для обзора см. Ford et al., 2001) увеличивает терапевтический эффект. Эта тактика позволяет нацеливаться на опухолевые клетки с помощью
слитого белка с анкириновыми повторами анти-HIF-1α, которые сами по себе не инфицированы NDV.
Вирус, который экспрессирует одновременно трансгены для двух отдельных dARPINS - один внутриклеточный против HIF-1α и один секретируемый против интерлейкина 8, как ожидают, обладает повышенной противоопухолевой активностью благодаря блокированию двух компенсационных путей (Mizukami et al., 2005).
Пример 10. МТН1151 приводит к экспрессии β-глюкуронидазы в инфицированных клетках.
Материалы и методы.
Клетки Hela поместили в 6-лунковые чашки. После достижения сплошного роста клетки инфицировали очень низким MOI=0,00001 МТН87 и МТН115. В указанные периоды времени были отобраны аликвоты клеточного супернатанта и заморожены при -20°С. Спустя 72 ч после инфицирования была измерена активность β-глюкуронидазы одновременно во всех супернатантах в тесте MUG.
Тест MUG для количественного определения активности β-глюкуронидазы.
MU (4-метилумбеллиферон) и MUG (4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронид) от Sigma. MU используется для получения стандартной кривой. Вируссодержащие образцы облучают УФ-излучением в
течение 30 мин, чтобы инактивировать вирус перед тестом MUG. Образцы инкубируют в буфере из 25
мМ ацетата натрия, рН 5,6 с 10 мкМ MUG в течение 60 мин при 37°С. Реакцию прекращают путем добавления буфера из 200 мМ глицина, рН 10,4. Флюоресценцию измеряют с возбуждением при 320 нм и
эмиссией при 460 нм на флуоресцентном фотометре. На основании эмиссии флюоресценции рассчитывают специфичную активность в нмоль на мл на час.
Результаты.
Инфицирование с помощью МТН115 приводит к зависимому от времени увеличению экспрессии βглюкуронидазы, что является результатом вирусной репликации (фиг. 7). Хотя МТН87 в конечном счете
уничтожает клетки и, таким образом, высвобождает эндогенную β-глюкуронидазу из клеток, результирующая активность в супернатанте является незначительной. Инфекция МТН115 четко достигает массивного производства трансгена. CPE MTH115 сопоставима с МТН87 и МТН68 (вес), таким образом,
экспрессия β-глюкуронидазы вирусом не уменьшает репликацию вируса и не снижает цитопатогенность
вируса.
Пример 11. Количественное определение экспрессии трансгена МТН115 в различных клетках.
Материалы и методы.
- 18 -
013615
Клетки были посеяны в 96-лунковые планшеты. Число клеток было выбрано таким образом, чтобы
достигнуть сплошного роста, спустя один день после посева.
Спустя один день после посева клетки были инфицированы вирусом МТН115 при MOI 0,01. Подробно, клетки промыли PBS, инокулировали с 100 мкл суспензии вируса при 37°С, вирус удалили и 200
мкл теплой среды добавили к клеткам.
В указанные периоды времени из клеток отобрали супернатанты и подвергли тесту MUG на βглюкуронидазу. В каждый период времени анализировали тройные лунки.
Результаты.
Результаты подсуммированы на фиг. 8. В нормальных клетках HDMVEC и фибробластах не может
быть обнаружено какой-либо экспрессии трансгена. Также не наблюдалось никакого цитопатического
эффекта (не показан). В опухолевых клетках, которые являются восприимчивыми к вирусу Hela и НТ29
отмечается массивное производство трансгена β-глюкуронидазы, активность которой может быть измерена в супернатанте. Клетки Hela, которые уничтожаются вирусом в течение 48 ч, продуцируют относительно низкие уровни трансгена. Клетки НТ29, которые умирают только после 5 дней при используемых
дозах вируса, продуцируют еще более высокую активность β-глюкуронидазы, в 10 раз больше, чем клетки Hela и в 1000 раз больше относительно базового уровня.
Пример 12. NDV-β-глюкуронидаза и HMR1826 синергистически убивают клетки, которые являются
стойкими к любой из обработок отдельным агентом.
Материалы и методы.
Клетки помещают в день 1 в 24-лунковые чашки. В день 2 клетки были инфицированы NDV-βглюкуронидазой (МТН115) при MOI 0,001. В день 3 клетки обработали или доксорубицином при 1 мкМ,
или доксорубицина-глюкуронидом HMR1826 при 1 мкМ. В день 8 клетки были промыты, зафиксированы и окрашены Giemsa и сделаны фотографии лунок.
Результаты.
Результаты подсуммированы на фиг. 9 и 10. Непосредственно доксорубицин убивает клетки при
данной концентрации. Пролекарство при той же концентрации не токсично для клеток. Непосредственно
вирус при данной MOI также не токсичен, потому что были отобраны опухолевые клетки, которые имеют степень резистентности к терапии вирусом. Комбинация и глюкуронидаза-экспрессирующего вируса,
и пролекарства способна убить клетки, которые не были уничтожены ни одной из обработок отдельным
агентом. Контрольный вирус (который экспрессирует GFP вместо β-глюкуронидазы) не показывает синергизма при обработке пролекарством.
Литература
Adams, G.P. and Weiner, L.M. (2005) Monoclonal antibody therapy of cancer. Nat Biotechnol, 23, 11471157.
Alexander, D.J. (1988) Newcastle disease. Kluwer Academic Publishers, Norwell, Massachusetts.
Allen, T.M. (2002) Ligand-targeted therapeutics in anticancer therapy. Nat Rev Cancer, 2, 750-763.
Amstutz, P., Binz, H.K., Parizek, P., Stumpp, M.T., Kohl, A., Grutter, M.G., Forrer, P. and Pluckthun, A.
(2005) Intracellular kinase inhibitors selected from combinatorial libraries of designed ankyrin repeat proteins. J
Biol Chem, 280, 24715-24722.
Antoniw, P., Springer, C.J., Bagshawe, K.D., Searle, F., Melton, R.G., Rogers, G.T., Burke, P.J. and Sherwood, R.F. (1990) Disposition of the prodrug 4-(bis(2-chloroethyl)amino)benzoyl-L-glutamic acid and its active
parent drug in mice. Br J Cancer, 62, 909-914.
Bagshawe, K.D., Springer, C.J., Searle, F., Antoniw, P., Sharma, S.K., Melton, R.G. and Sherwood, R.F.
(1988) A cytotoxic agent can be generated selectively at cancer sites. Br J Cancer, 58, 700-703.
Batra, J.K., Fitzgerald, D.J., Chaudhary, V.K. and Pastan, I. (1991) Single-chain immunotoxins directed at
the human transferrin receptor containing Pseudomonas exotoxin A or diphtheria toxin: anti-TFR(Fv)-PE40 and
DT388-anti-TFR(Fv). Mol Cell Biol, 11, 2200-2205.
Batra, J.K., Kasprzyk, P.G., Bird, R.E., Pastan, I. and King, C.R. (1992) Recombinant anti-erbB2 immunotoxins containing Pseudomonas exotoxin. Proc Natl Acad Sci USA, 89, 5867-5871.
Bell, J.C., Garson, K.A., Lichty, B.D. and Stojdl, D.F. (2002) Oncolytic viruses: programmable tumor
hunters. Curr Gene Ther, 2, 243-254.
Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C, Forrer, P., Grutter, M.G. and Pluckthun, A.
(2004) High-affinity binders selected from designed ankyrin repeat protein libraries. Nat Biotechnol, 22, 575-582.
Bosslet, K., Czech, J., Lorenz, P., Sedlacek, H.H., Schuermann, M. and Seemann, G. (1992) Molecular and
functional characterisation of a fusion protein suited for tumor specific prodrug activation. Br J Cancer, 65, 234238.
- 19 -
013615
Carnemolla, В., Borsi, L., Balza, E., Castellani, P., Meazza, R., Berndt, A., Ferrini, S., Kosmehl, H., Neri,
D. and Zardi, L. (2002) Enhancement of the antitumor properties of interleukin-2 by its targeted delivery to the
tumor blood vessel extracellular matrix. Blood, 99, 1659-1665.
Chaudhary, V.K., Gallo, M.G., FitzGerald, D.J. and Pastan, I. (1990) A recombinant single-chain immunotoxin composed of anti-Tac variable regions and a truncated diphtheria toxin. Proc Natl Acad Sci USA, 87,
9491-9494.
Chaudhary, V.K., Queen, C., Junghans, R.P., Waldmann, T.A., FitzGerald, D.J. and Pastan, I. (1989) A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudomonas exotoxin. Nature,
339, 394-397.
Chiocca, E.A. (2002) Oncolytic viruses. Nat Rev Cancer, 2, 938-950.
Csatary, L.K., Gosztonyi, G., Szeberenyi, J., Fabian, Z., Liszka, V., Bodey, B. and Csatary, CM. (2004)
MTH-68/H oncolytic viral treatment in human high-grade gliomas. J Neurooncol, 67, 83-93.
De Lorenzo, C, Arciello, A., Cozzolino, R., Palmer, D.B., Laccetti, P., Piccoli, R. and D'Alessio, G. (2004)
A fully human antitumor immunoRNase selective for ErbB-2-positive carcinomas. Cancer Res, 64, 4870-4874.
Engel-Herbert, L, Werner, O., Teifke, J.P., Mebatsion, Т., Mettenleiter, T.C. and Romer-Oberdorfer, A.
(2003) Characterization of a recombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein. J
Virol Methods, 108, 19-28.
Ferrara, N., Hillan, K.J., Gerber, H.P. and Novotny, W. (2004) Discovery and
development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov, 3, 391400.
Ford, K.G., Souberbielle, B.E., Darling, D. and Farzaneh, F. (2001) Protein transduction: an alternative to
genetic intervention? Gene Ther, 8, 1-4.
Georgakis, G.V., Li, Y., Humphreys, R., Andreeff, M., O'Brien, S., Younes, M., Carbone, A., Albert, V.
and Younes, A. (2005) Activity of selective fully human agonistic antibodies to the TRAIL death receptors
TRAIL-R1 and TRAIL-R2 in primary and cultured lymphoma cells: induction of apoptosis and enhancement of
doxorubicin- and bortezomib-induced cell death. Br J Haematol, 130, 501-510.
Gerber, H.P. and Ferrara, N. (2005) Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies. Cancer Res, 65, 671-680.
Hanahan, D. and Weinberg, R.A. (2000) The hallmarks of cancer. Cell, 100, 57-70.
Herbst, R.S. and Langer, C.J. (2002) Epidermal growth factor receptors as a target for cancer treatment: the
emerging role of IMC-C225 in the treatment of lung and head and neck cancers. Semin Oncol, 29, 27-36.
Hogbom, M., Eklund, M., Nygren, P.A. and Nordlund, P. (2003) Structural basis for recognition by an in
vitro evolved affibody. Proc Natl Acad Sci USA, 100, 3191-3196.
Huang, Z., Elankumaran, S., Yunus, A.S. and Samal, S.K. (2004) A recombinant Newcastle disease virus
(NDV) expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus (IBDV) protects against NDV and IBDV. J
Virol, 78, 10054-10063.
Huang, Z., Krishnamurthy, S., Panda, A. and Samal, S.K. (2001) High-level expression of a foreign gene
from the most 3'-proximal locus of a recombinant Newcastle disease virus. J Gen Virol, 82, 1729-1736.
Kreitman, R.J., Chaudhary, V.K., Waldmann, T.A., Hanchard, В., Cranston, В., FitzGerald, D.J. and Pastan, I. (1993) Cytotoxic activities of recombinant immunotoxins composed of Pseudomonas toxin or diphtheria
toxin toward lymphocytes from patients with adult T-cell leukemia. Leukemia, 7, 553-562.
Kreitman, R.J. and Pastan, I. (1995) Importance of the glutamate residue of KDEL in increasing the cytotoxicity of Pseudomonas exotoxin derivatives and for increased binding to the KDEL receptor. Biochem J, 307
(Pt 1), 29-37.
Krishnamurthy, S., Huang, Z. and Samal, S.K. (2000) Recovery of a virulent strain of newcastle disease virus from cloned cDNA: expression of a foreign gene results in growth retardation and attenuation. Virology, 278,
168-182.
Kuan, S.F., Byrd, J.C., Basbaum, C.B. and Kim, Y.S. (1987) Characterization of quantitative mucin variants from a human colon cancer cell line. Cancer Res, 47, 5715-5724.
Ladner, R.C. and Ley, A.C. (2001) Novel frameworks as a source of high-affinity ligands. Curr Opin Biotechnol, 12, 406-410.
Lamb, R.A., Kolakofsky, D. (2001) Paramyxoviridae: The Viruses And Their Replication. In Fields, B.N.
(ed.), Virology. Lippincott Williams & Wilkins, pp. 1305-1485.
Lorence, R.M., Pecora, A.L., Major, P.P., Hotte, S.J., Laurie, S.A., Roberts, M.S., Groene, W.S. and
Bamat, M.K. (2003) Overview of phase I studies of intravenous administration of PV701, an oncolytic virus.
Curr Opin Mol Ther, 5, 618-624.
Mizukami, Y., Jo, W.S., Duerr, E.M., Gala, M., Li, J., Zhang, X., Zimmer, M.A., Iliopoulos, O., Zukerberg, L.R., Kohgo, Y., Lynch, M.P., Rueda, B.R. and Chung, D.C. (2005) Induction of interleukin-8 preserves
the angiogenic response in HIF-1 alpha-deficient colon cancer cells. Nat Med, 11, 992-997.
Nakaya, Т., Cros, J., Park, M.S., Nakaya, Y., Zheng, H., Sagrera, A., Villar, E., Garcia-Sastre, A. and Palese, P. (2001) Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector. J Virol, 75, 11868-11873.
Noonberg, S.B. and Benz, C.C. (2000) Tyrosine kinase inhibitors targeted to the epidermal growth factor
- 20 -
013615
receptor subfamily: role as anticancer agents. Drugs, 59, 753-767.
Nord, K., Gunneriusson, E., Uhl inverted question marken, M. and Nygren, P.A. (2000) Ligands selected
from combinatorial libraries of protein A for use in affinity capture of apolipoprotein A-1M and taq DNA polymerase. J Biotechnol, 80, 45-54.
Roffler, S.R., Wang, S.M., Chern, J.W., Yeh, M.Y. and Tung, E. (1991) Anti-neoplastic glucuronide prodrug treatment of human tumor cells targeted with a monoclonal antibody-enzyme conjugate. Biochem Pharmacol, 42, 2062-2065.
Romer-Oberdorfer, A., Mundt, E., Mebatsion, Т., Buchholz, U.J. and Mettenleiter, T.C. (1999) Generation
of recombinant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J Gen Virol, 80 (Pt 11), 2987-2995.
Rowlinson-Busza, G., Bamias, A., Krausz, T. and Epenetos, A.A. (1992) Antibody guided enzyme nitrile
therapy (Agent): in vitro cytotoxicity and in vivo tumor localisation. In Epenetos, a. (ed.), Monoclonal Antibodies 2. Applications in Clinical Oncology. Chapman and Hall, London, pp. 111-118.
Russell, S.J. (2002) RNA viruses as virotherapy agents. Cancer Gene Ther, 9, 961-966.
Salgaller, M.L. (2003) Technology evaluation: bevacizumab, Genentech/Roche. Curr Opin Mol Ther, 5,
657-667.
Schnell, M.J., Mebatsion, T. and Conzelmann, K.K. (1994) Infectious rabies viruses from cloned cDNA.
Embo J, 13, 4195-4203.
Sinkovics, J.G. and Horvath, J.C. (2000) Newcastle disease virus (NDV): brief history of its oncolytic
strains. J Clin Virol, 16, 1-15.
Skerra, A. (2000) Lipocalins as a scaffold. Biochim Biophys Acta, 1482, 337-350.
Stojdl, D.F., Lichty, B.D., tenOever, B.R., Paterson, J.M., Power, A.T., Knowles, S., Marius, R., Reynard,
J., Poliquin, L., Atkins, H., Brown, E.G., Durbin, R.K., Durbin, J.E., Hiscott, J. and Bell, J.C. (2003) VSV
strains with defects in their ability to shutdown innate immunity are potent systemic anti-cancer agents. Cancer
Cell, 4, 263-275.
Vogelstein, B. and Kinzler, K.W. (2004) Cancer genes and the pathways they control. Nat Med, 10, 789799.
Waltenberger, J., Claesson-Welsh, L., Siegbahn, A., Shibuya, M. and Heldin, C.H. (1994) Different signal
transduction properties of KDR and Flt1, two receptors for vascular endothelial growth factor. J Biol Chem, 269,
26988-26995.
Wang, S.M., Chern, J.W., Yeh, M.Y., Ng, J.C., Tung, E. and Roffler, S.R. (1992) Specific activation of
glucuronide prodrugs by antibody-targeted enzyme conjugates for cancer therapy. Cancer Res, 52, 4484-4491.
Warren, R.S., Yuan, H., Matli, M.R., Gillett, N.A. and Ferrara, N. (1995) Regulation by vascular endothelial growth factor of human colon cancer tumorigenesis in a mouse model of experimental liver metastasis. J
Clin Invest, 95, 1789-1797.
Zewe, M., Rybak, S.M., Dubel, S., Coy, J.F., Welschof, M., Newton, D.L. and Little, M. (1997) Cloning
and cytotoxicity of a human pancreatic RNase immunofusion. Immunotechnology, 3, 127-136.
Zhao, H. and Peeters, B.P. (2003) Recombinant Newcastle disease virus as a viral vector: effect of genomic
location of foreign gene on gene expression and virus replication. J Gen Virol, 84, 781-788.
- 21 -
013615
Перечень последовательностей
- 22 -
013615
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантный онколитический парамиксовирус, содержащий нуклеиновую кислоту по крайней мере с одним трансгеном, кодирующим обладающий терапевтической активностью при экспрессии
инфицированной вирусом опухолевой клеткой слитый белок, который содержит по крайней мере один
домен, связывающийся с внутриклеточными компонентами клетки-мишени, и второй домен, полученный из белков, которые выбраны из группы, включающей токсин, такой как человеческая РНКаза (экзотоксин Pseudomonas, токсин Diphtheria), фермент, такой как β-глюкуронидаза, β-галактозидаза, βглюкозидаза, карбоксипептидаза, β-лактамаза, и иммуностимулирующий белок с цитокиновой активностью, такой как IL-2, IL-12, TNF-α, IFN-β или GM-CSF.
2. Вирус по п.1, который является вирусом ньюкаслской болезни (NDV).
3. Вирус по п.2, который является нелентогенным NDV, например мезогенным или велогенным
NDV, в особенности мезогенным штаммом МТН68.
4. Вирус по любому из пп.1-3, в котором связывающий домен принадлежит к следующей группе:
природный лиганд или генетически модифицированный лиганд, рекомбинантный растворимый домен
природного рецептора или его модифицированная версия, пептид- или полипептид-лиганд, молекула
антитела, или ее фрагмент, или ее производное, или подобная антителу молекула, такая как белок с анкириновыми повторами, или фрагмент, или ее производные.
5. Вирус по любому из пп.1-4, в котором связывающий домен происходит из белка млекопитающего, например человека или мыши, или представляет собой химерный белок.
6. Вирус по любому из предыдущих пунктов, в котором связывающий домен является мономерным,
димерным, тримерным, тетрамерным или мультимерным белком.
7. Вирус по любому из предыдущих пунктов, в котором связывающий домен является моноспецифичным, биспецифичным или мультиспецифичным.
8. Вирус по любому из предыдущих пунктов, в котором второй домен выбирается из группы, включающей блокирующие белки автономных активных рецепторов факторов роста (например, EGFR, Met),
конкурентные связывающие вещества для факторов роста (антагонисты), блокирующие белки для Rbфосфорилирования, блокирующие белки для Е2F-зависимой транскрипции, стабилизаторы для р53; антагонистические связывающие вещества для антиапоптических белков (например, Bcl-2); антагонистические связывающие вещества для циклинов; антагонистические связывающие вещества для Ras эффекторов (например, GEF); антагонистические связывающие вещества для индуцированных гипоксией белков
(например, HIF1α); ингибиторы факторов транскрипции, которые оказывают влияние на димеризацию
или ДНК-связывание или связывание кофактора (например, Myc/Max); индукторы дифференцирования;
ингибиторы smad передачи сигналов/транслокации; ингибиторы взаимодействий клеточной адгезии
(кадхерины, интегрины, например Ва581, avB3); ингибиторы ферментов, которые расщепляют внеклеточную матрицу (например, ММР); антагонистические связывающие вещества для проангиогенных лигандов (например, растворимый VEGF-R); антагонистические связывающие вещества к проангиогенным
рецепторам; ингибиторы формирования ядерного комплекса (например, KSR/Ras); ингибиторы инициирования трансляции (eIF4E, EIF2a); ингибиторы митотических киназ (например, Plk-1).
9. Нуклеокапсид рекомбинантного онколитического парамиксовируса по любому из пп.1-8.
10. Геном рекомбинантного онколитического парамиксовируса по любому из пп.1-8.
11. Молекула ДНК, которая представляет собой геном и/или антигеном рекомбинантного онколитического парамиксовируса по любому из пп.1-8.
12. Молекула ДНК по п.11, оперативно связанная с последовательностью, контролирующей транскрипцию.
13. Клетка, содержащая рекомбинантный онколитический парамиксовирус по любому из пп.1-8,
вирусный геном по п.10 или молекулу ДНК по п.11 или 12.
14. Фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный онколитический вирус по любому из пп.1-8, вирусный геном по п.10 или молекулу ДНК по п.11 или 12 в качестве активного компонента при необходимости вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями и/или вспомогательными веществами.
15. Фармацевтическая композиция по п.14 для профилактики и/или лечения рака.
16. Способ профилактики и/или лечения рака, включающий введение субъекту, нуждающемуся в
этом, фармацевтически эффективного количества композиции по п.14 или 15.
17. Способ по п.16, в котором субъект является человеком.
18. Рекомбинантный вирус по п.1, в котором трансген, кодирующий слитый белок, в качестве второго домена содержит домен пролекарства, и который дополнительно содержит второй трансген, кодирующий фермент, благодаря которому пролекарство при экспрессии инфицированной вирусом опухолевой клеткой преобразуется в лекарство.
19. Рекомбинантный вирус по п.18, в котором дополнительный трансген кодирует протеазу, обладающую терапевтической активностью при экспрессии инфицированной вирусом опухолевой клеткой.
20. Фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный онколитический вирус по любо- 23 -
013615
му из пп.1-8, вирусный геном по п.10, и/или молекулу ДНК по п.11 или 12 в качестве активного компонента при необходимости вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями и/или
вспомогательными веществами, где вирус, вирусный геном и/или молекула ДНК дополнительно содержат по крайней мере один трансген, кодирующий преобразовывающий пролекарство фермент.
21. Фармацевтическая композиция по п.20, дополнительно содержащая пролекарство, которое может быть преобразовано в терапевтически активное соединение с помощью преобразовывающего пролекарство фермента, кодируемого вирусом, вирусным геномом и/или молекулой ДНК, как указано в п.20.
22. Фармацевтическая композиция по п.20 или 21 для лечения и/или облегчения пролиферативного
нарушения.
23. Способ лечения пролиферативного заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества
(а) рекомбинантного онколитического вируса по любому из пп.1-8, вирусного генома по п.10 и/или
молекулы ДНК по п.11 или 12, дополнительно содержащих по крайней мере один трансген, кодирующий
преобразовывающий пролекарство фермент, и
(б) пролекарства, подходящего для лечения пролиферативного заболевания, которое может быть
преобразовано в терапевтически активное соединение с помощью преобразовывающего пролекарство
фермента.
24. Фармацевтическая композиция, включающая рекомбинантный онколитический вирус по любому из пп.1-8, вирусный геном по п.10 и/или молекулу ДНК по п.12 или 13 в качестве активного компонента при необходимости вместе с фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями и/или
вспомогательными веществами, где вирус, вирусный геном и/или молекула ДНК дополнительно содержит по крайней мере один трансген, кодирующий протеазу.
25. Фармацевтическая композиция по п.24 для лечения и/или облегчения пролиферативного нарушения.
26. Способ лечения пролиферативного заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества рекомбинантного онколитического вируса по
любому из пп.1-8, вирусного генома по п.10 и/или молекулы ДНК по п.11 или 12, содержащих по крайней мере один трансген, кодирующий протеазу.
Фиг. 1
- 24 -
013615
Фиг. 2
Фиг. 3
- 25 -
013615
Фиг. 4a
Фиг. 4б
- 26 -
013615
Фиг. 5
Фиг. 6
- 27 -
013615
Фиг. 7
Фиг. 8
- 28 -
013615
Фиг. 9
- 29 -
013615
Фиг. 10
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 30 -