БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра молекулярной биологии

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра молекулярной биологии
Аннотация к дипломной работе
СОВА
Арсений Игоревич
ИЗУЧЕНИЕ БЕЛОК-БЕЛКОВЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ПРИ ПОМОЩИ
БАКТЕРИАЛЬНОЙ ДВУГИБРИДНОЙ СИСТЕМЫ
Научный руководитель:
Кандидат биологических
наук,
доцент Е.А. Николайчик
Минск, 2014
РЕФЕРАТ
Дипломная работа 38 с., 5 рис., 2 табл., 15 источников.
PECTOBACTERIUM CAROTOVORUM, ESCHERICHIA COLI, ДВУГИБРИДНАЯ
СИСТЕМА, БЕЛОК-БЕЛКОВЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ, ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК,
АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ, СИСТЕМА СЕКРЕЦИИ III ТИПА,
ЭФФЕКТОР, СЕКРЕТОРНЫЙ ШАПЕРОН
Объектами настоящего исследования являлись эффектор
секреторный шаперон DspF системы секреции III типа (ССТТ).
DspE
и
Целью работы являлось изучение взаимодействия белков DspE и DspF при
помощи бактериальной двугибридной системы BACTH, основанной на
восстановлении аденилатциклазной активности в клетках E.coli.
Работа выполнялась современными молекулярно-биологическими методами,
такими, как молекулярное клонирование, ПЦР, рестрикционный анализ.
Ключевым методическим подходом являлось введение в плазмиду pUT18 гена
секреторного шаперона DspF путем молекулярного клонирования, что
позволило получить плазмидную конструкцию, необходимую для проверки
взаимодействия кодируемого ею белка и других белков (в том числе и DspE) в
клетках E.coli.
Основными результатами выполненной работы являются:
 Подбор оптимальной индикаторной среды для работы в BACTH-системе
показал, что среда X-Gal/IPTG с лактозой является лучшей среди
опробованных.
 В ходе работы в результате успешного клонирования гена dspF в векторе
pUT18 была сконструирована плазмида pUT18::dspF, кодирующая
секреторный шаперон системы секреции III типа – белок DspF и T18
фрагмент каталитической области аденилатциклазы, что позволяет в
дальнейшем использовать эту плазмиду для скрининга белок-белковых
взаимодействий в системе BACTH.
 Бактериальная двугибридная система пригодна для детекции димеризации белка Dickeya dadantii OutC, однако детектировать с ее помощью
взаимодействие эффектора системы секреции III типа DspЕ с его секреторным шапероном DspF не удалось.
РЭФЕРАТ
Дыпломная работа 38 с., 5 рис., 2 табл., 15 крынiц.
PECTOBACTERIUM CAROTOVORUM, ESCHERICHIA COLI, ДВУГIБРЫДНАЯ
СIСТЭМА, БЯЛОК-БЯЛКОВЫЯ УЗАЕМАДЗЕЯННI, ХIМЕРНЫЙ БЯЛОК,
АДЭНIЛАТЦЫКЛАЗНАЯ АКТЫЎНАСЦЬ, СIСТЭМА СЕКРЭЦЫI III ТЫПУ,
ЭФФЕКТАР, СЕКРЭТОРНЫ ШАПЕРОН
Аб’ектамi дадзенага даследавання з’яўлялiся эффектар DspE i секрэторны
шаперон DspF сiстэмы секрэцыi III тыпу Pectobacterium carotovorum.
Мэтай працы з’яўлялася вывучэнне ўзаемадзеяння бялкоў DspE i DspF з
дапамогай бактэрыяльнай двугiбрыднай ciстэмы BACTH, заснаванай на
аднаўленнi адэнiлатцыклазнай актыўнасцi ў клетках E. coli.
Праца выконвалася сучаснымi малекулярна-бiялагiчнымi метадамi, такiмi, як
малекулярнае кланаванне, ПЛР, рэстрыкцыйны аналiз. Ключавым метадычным
падыходам з’яўлялася ўвядзенне ў плазмiду pUT18 гена секрэторнага шаперона
DspF шляхам малекулярнага кланавання, што дазволiла атрымаць плазмiдную
канструкцыю, неабходную для праверкi узаемадзеяння кадзiруемага ёю бялка i
iншых бялкоў (у тым лiку i DspE) у клетках E. coli.
Асноўнымi вынiкамi выкананай працы з’яўляюцца:
 Падбор аптымальнага iндыкатарнага асяроддзя для працы ў BACTHсiстэме праявiў, што сярод апрабаваных асяроддзяў лепшым з’яўляецца
асяроддзе X-Gal/IPTG
 У ходзе працы ў вынiку паспяховага кланавання гена dspF у вектары
pUT18 была сканструявана плазмiда pUT18::dspF, якая кадзiруе
секрэторны шаперон сiстэмы секрэцыi III тыпу – бялок DspF и T18
фрагмент каталiтычнай вобласцi аденiлатцыклазы, што дазваляе ў
далейшым выкарыстоўваць гэтую плазмiду для скрынiнга бялокбялковых узаемадзеянняў у сiстэме BACTH.
 Бактэрыяльная двугiбрыдная ciстэма прыгодная для дэтэкцыi
дiмерызацыi бялка Dickeya dadantii OutC, але дэтэктаваць з яе
дапамогай узаемадзеянне эффектара сiстэмы секрэцыi III тыпу DspE з
яго
секрэторным
шаперонам
DspF
не
ўдалося.
ABSTRACT
Graduation work 38 p., 5 fig., 2 tables, 15 sources.
PECTOBACTERIUM CAROTOVORUM, ESCHERICHIA COLI, TWO-HYBRID
SYSTEM, PROTEIN-PROTEIN INTERACTIONS, HYBRID PROTEIN,
ADENYLATE CYCLASE ACTIVITY, TYPE III SECRETION SYSTEM,
EFFECTOR, SECREORY CHAPERONE
Research objects were the effector protein DspE and the secretory chaperone
DspF of the type III secretion system of Pectobacterium carotovorum.
The purpose of this work was to study protein-protein interactions between
DspE and DspF using bacterial two-hybrid system based on reconstitution of
adenylate cyclase activity in E.coli.
Work was carried out using modern molecular biology techniques such as
molecular cloning, PCR, restriction analysis. The main method was construction of
plasmid pUT18::dspF which allows to study protein-protein interactions among
DspF and other proteins (including DspE) in E.coli.
The main results of the carried out work are:
 Selection of the optimal indicator media for work with BACTH system
has shown that X-Gal/IPTG is the best indicator media of those tried.
 During the work the plasmid pUT18::dspF was constructed coding for
secretory chaperone DspF of the type III secretion system and T18
fragment of the catalytic domain of the adenylate cyclase. This plasmid
can be used for screening of protein-protein interactions with BACTH
system.
 Bacterial two-hybrid system can be used for detection of dimerization of
Dickeya dadantii OutC protein, but interaction between the effector
protein DspE and secretory chaperone DspF could not be detected using
this system.