На правах рукописи МАЛЫШЕВА МАРИНА ВЛАДИМИРОВНА
advertisement
На правах рукописи МАЛЫШЕВА МАРИНА ВЛАДИМИРОВНА ИММУНОЦИТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЯДРЫШКОВЫХ БЕЛКОВ В ЛИМФОИДНЫХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ 03.01.04. – биохимия 14.01.21. – гематология и переливание крови АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена в «Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН» и «Учреждении Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН». НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Т.И. Булычева, доктор биологических наук, профессор О.В. Зацепина ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор В.М. Погорелов, доктор биологических наук, профессор А.В. Филатов ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ФГУ «Московский научно-исследовательский имени П.А. Герцена Росмедтехнологий», Москва онкологический институт Защита диссертации состоится « ____ » ___________ 2010 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.042.02 в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН по адресу: 125167, Москва, Новозыковский проезд, дом 4. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН. Автореферат разослан « ____ » ______________ 2010 года Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук 2 Е.Е. Зыбунова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Оценка пролиферативной активности лимфоидных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях является одним из важных показателей в диагностике варианта заболевания и определении степени злокачественности процесса. Этот показатель используется для прогнозирования скорости опухолевого роста и выбора адекватного курса лечения. Активация клеток млекопитающих к пролиферации сопровождается увеличением содержания многих ядерных белков. К ним, в частности, относятся факторы репликации, транскрипционные факторы, циклинзависимые киназы, а также белки ядрышка – основного структурного домена клеточного ядра, необходимого для образования рибосом и обеспечивающего белоксинтезирующие функции клеток. Согласно последним данным протеомного анализа, ядрышки клеток человека содержат 700-4500 белков. К ядрышковым белкам относятся, в частности, белки связанные с транскрипцией рДНК (РНК полимераза I, факторы транскрипции рДНК, топоизомеразы), а также белки цитоплазматических рибосом и специфические ядрышковые белки, необходимые для процессинга рРНК, включая фибрилларин, В23/нуклеофозмин/нуматрин/NO38 (В23) и С23/нуклеолин (нуклеолин). Одним из важнейших свойств ядрышка является его высокая структурная и функциональная изменчивость, которая отражает общий уровень метаболизма и способность клеток к пролиферации. Показано, что размеры ядрышек прямо коррелируют со скоростью пролиферации опухолевых клеток. Изменение функционального состояния ядрышка в ходе клеточного цикла сопровождается также изменением количественного содержания его белков. К таким белкам относятся, в частности, аргентофильные белки. Количественный анализ содержания аргентофильных белков в настоящее время используется для оценки скорости пролиферации клеток, а также в диагностических и прогностических целях. Установлено, что размеры аргентофильных зон в ядрышках варьируют в зависимости от формы острого лейкоза и прямо коррелируют со злокачественностью процесса. Мажорные белки ядра и ядрышка - В23, PCNA, Ki-67, содержание которых возрастает при переходе от состояния пролиферативного покоя к делению, относят к маркерам клеточной пролиферации, а антитела ним используют в клинической диагностике для прогностической оценки скорости роста злокачественного клона. Однако, набор белковых маркеров активации лимфоцитов в настоящее время крайне ограничен, а белки, указывающие на ранние стадии активации лимфоцитов к пролиферации, которые могли бы найти применение в онкогематологии, на сегодняшний день отсутствуют. Целью работы явилось сравнительное изучение экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоидных клетках человека в различные периоды пролиферативного процесса, а также выявление ранних маркеров активированных лимфоцитов человека и мыши. 3 Задачи работы. 1. Изучить содержание ключевых белков ядрышка SURF-6 и В23 при активации лимфоцитов мыши к пролиферации с помощью конканавалина А (Кон А). 2. Изучить уровень экспрессии SURF-6 в лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации Кон А. 3. Изучить экспрессию белков ядрышка - фибрилларина, В23, нуклеолина и SURF-6 - при активации лимфоцитов периферической крови человека к пролиферации с помощью фитогемагглютинина (ФГА) методом иммуноцитохимии. 4. Оценить количественное содержание этих же белков в процессе ФГАстимуляции на иммуноблотах. 5. Проанализировать экспрессию В23, фибрилларина и SURF-6 в лимфоидных клетках ограниченного числа больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. 6. Сопоставить уровень экспрессии вышеназванных белков с уровнем пролиферации лимфоидных клеток, определяемым маркерными белками Ki-67 и PCNA. Научная новизна исследования. На модели ФГА-стимулированной культуры лимфоцитов человека показаны изменения в содержании и уровне экспрессии белков ядрышка фибрилларина и нуклеолина. Впервые на этой же модели показано, что белок SURF-6 не выявляется в покоящихся лимфоцитах, а его экспрессия в ФГА-активированных лимфоцитах начинается до экспрессии известных маркеров клеточной пролиферации белков Ki-67 и PCNA. Выявлена положительная корреляция между экспрессией белка SURF-6 и белками Ki-67 и PCNA в лимфоидных клетках больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Эти наблюдения впервые показали, что белок ядрышка SURF-6 может служить маркером ранней активации лимфоцитов человека к пролиферации, а также иметь прогностическое и, возможно, диагностическое значение. Показано, что, как и в лимфоцитах периферической крови человека, SURF-6 не выявляется в лимфоцитах, выделенных из селезенки мышей. Таким образом, на сегодняшний день белок SURF-6 является единственным белком ядрышка, который, не выявляясь в ядрышках покоящихся лимфоцитов млекопитающих (на примере человека и мыши), начинает экспрессироваться в митоген-стимулированных лимфоцитах раньше известных маркеров клеточной пролиферации (Ki-67 и PCNA). Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные результаты расширяют существующие фундаментальные представления о белках ядрышка как маркерах клеточной пролиферации. Возможность выявления по состоянию ядрышкового белка SURF-6 ранней стадии пролиферативной активности лимфоцитов (по-видимому, ранней G1-фазы), не выявляемой общеизвестным антигеном Ki-67, позволяет рекомендовать его анализ для лабораторных исследований в клинической практике с целью 4 ранней диагностики злокачественной транформации лимфоцитов. Выявленная корреляция экспрессии белков Ki-67 и SURF-6 у больных с лимфопролиферативными заболеваниями, с повышением их экспрессии при нарастании злокачественности процесса, позволяет рассчитывать на широкое клиническое применение антител к SURF-6. Положения, выносимые на защиту. 1. С использованием первичной культуры лимфоцитов селезенки мыши, активированных к пролиферации конканавалином А, показано, что уровень белков SURF-6 и В23 возрастает при активации клеток к пролиферации, при этом SURF-6 не выявляется в неактивированных лимфоцитах. 2. На модели стимулированной ФГА культуры лимфоцитов здоровых лиц показано, что белок SURF-6 является надежным маркером последовательных стадий активации лимфоцитов человека к пролиферации. SURF-6 отсутствует в неактивированных лимфоцитах и начинает выявляться в клетках раньше маркеров клеточной пролиферации – белков Ki-67 и PCNA. 3. Существует положительная корреляция между экспрессией белка SURF-6 и белков Ki-67 и PCNA в лимфоидных клетках больных различными лимфопролиферативными заболеваниями. 4. Белок ядрышка SURF-6 может служить новым маркером активации лимфоцитов млекопитающих к пролиферации и иметь дополнительное диагностическое и прогностическое значение. Апробация работы состоялась 21 июня 2010 г. на заседании проблемной комиссии «Гемопоэз, молекулярная биология, биотехнология, иммуногематология; гемобластозы и депрессии кроветворения» Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН и 24 июня 2010 года на заседании межлабораторного научного коллоквиума Учреждения Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Основные положения диссертации были представлены на II Съезде общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007), Научно-практической конференции «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине» (Ростов-на-Дону, 2007), VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), ХХI и ХХII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009 и 2010 гг.), XVIII Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии" (Украина, Гурзуф, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2010). Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК и 9 тезисов. Получено положительное заключение о выдаче патента. 5 Структура и объем работы. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных данных, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Библиографический указатель включает 29 отечественных и 218 зарубежных литературных источника. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами, 11 рисунками и 17 фотографиями. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали клетки человека и мыши, включая клетки линии Jurkat, полученные из трансформированных клеток Т-лимфобластной лейкемии человека; клетки лимфоидной и миелоидной линий (Ramos и К562); клетки карциномы шейки матки HeLa; фибробласты мыши NIH/3Т3. Были использованы также интактные и стимулированные конканавалином А (КонА) лимфоциты селезенки мыши; интактные и стимулированные фитогемагглютининм (ФГА) лимфоциты, выделенные из периферической крови практически здоровых лиц (8 человек), а также лимфоидные клетки, выделенные из периферической крови, селезенки и лимфатических узлов больных с лимфопролиферативными заболеваниями, находящихся на лечении в клинических отделениях ГНЦ РАМН (37 человек). Образцы поступали в лабораторию клинической иммунологии ГНЦ РАМН для иммунодиагностики лимфопролиферативных заболеваний. Для изучения локализации белков в фиксированных клетках методом непрямой иммунофлуоресценции потребовалось отрабатывать специальный протокол проведения реакций. Было обнаружено, что наиболее удачным фиксатором для иммуноцитохимического мечения клеток антителами является фиксация ацетоном. Этот вывод оказался справедливым для культивируемых клеток человека HeLa, Ramos, K562 и лимфоцитов. Непрямую иммунофлуоресцентную реакцию проводили на клетках монослойных культур, выращенных на стеклах или на клетках суспензионных культур, нанесенных на 8-луночные стекла, предварительно обработанные поли-L-лизином. Зафиксированные препараты клеток инкубировали с поликлональными кроличьими антителами к белку SURF-6 (Magoulas et al., 1998, разведение 1:100 в фосфатно-солевом буфере) или фибрилларину (1:100, «Abcam», США); моноклональными мышиными антителами к B23 (1:200, «Sigma», США), Ki-67 (1:50, «Dako», Дания) или нуклеолину (1:100, предоставлены др. Дж. Ольсоном, университет г. Джексона, Миссисипи, США) во влажной камере в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки в трех сменах фосфатно-солевого буфера (ФСБ; 0.14 M NaCl, 2.7 мM KCl, 8.1 мM Na2HPO4, 1.5 мM KH2PO4) по 10 мин клетки метили антителами к иммуноглобулинам кролика или мыши, конъюгированными с TRITC (1:400, «JacksonImmunoRes Lab.», США) или FITC (1:200, «Sigma»), при комнатной температуре в течении 40 мин. Препараты докрашивали 10 мин красителем 0.1 мкг/мл ДАФИ (DAPI, «Sigma») на хроматин и заключали в Мовиол (Mowiol, «Calbiochem», Швейцария). Препараты изучали в инвертированном эпифлуоресцентном микроскопе 6 Axiovert 200 («Carl Zeiss», Германия), используя объективы 100х PlanNeofluar/1.3Ph и соответствующие наборы фильтров. Изображения записывали с помощью 13-битной монохромной камеры CoolSnapcf («RoperScientific», США) и обрабатывали с помощью программы AdobePhotoshop CS3, версия 10. Для статистического анализа на каждую экспериментальную точку анализировали не менее 500 клеток, данные обрабатывали с помощью программы Microsoft Excel и сравнивали по критерию Манна-Уитни (U) и по коэффициенту корреляции Спирмена (rs). Начало активации лимфоцитов определяли путем мечения клеток аналогом тимидина, бромдезоксиуридином (БрдУ). БрдУ в конечной концентрации 20 мкМ добавляли в культуральную среду на 30 мин перед посадкой клеток на стекла и фиксации абсолютным ацетоном. После фиксации отмывали в ФСБ 3 раза по 5 мин и проводили гидролиз ДНК в 4 н НСl в течение 40 мин при комнатной температуре. После отмывки в ФСБ клетки инкубировали с мышиными моноклональными антителами к БрдУ (1:20, «Sigma») 40 мин в темноте во влажной камере при комнатной температуре. Отмывали в трех сменах ФСБ по 10 мин и инкубировали с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с FITC, в течение 40 мин в тех же условиях. Отмывали в ФСБ три раза по 10 мин, окрашивали 0.1 мкг/мл DAPI 10 мин и заключали в мовиол. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Axiovert 200, как описано выше. Анализ распределения активированных лимфоцитов по разным фазам клеточного цикла производили на цитофлуориметре EPICS «ELITE» («Beckman Coulter», США), с помощью сервисной группы ИБХ. Для этого лимфоциты осаждали центрифугированием при 700g 10 мин, дважды промывали ФСБ, фиксировали 70%-ным этанолом при 4о С 15 мин и инкубировали в буфере, содержащем 50 мкг/мл пропидия иодида и 0.5 мг/мл РНКазы А в ФСБ, 1 ч при 37о С. На каждую точку анализировали не менее 104 клеток. Данные обрабатывали с помощью программы MULTIGRAPH («Вeckman Coulter», США). Для того чтобы изучить качественные и количественные изменения ядрышковых белков при переходе клеток от состояния покоя к пролиферации, была использована модель первичной культуры лимфоцитов селезенки мыши, стимулированных КонА, а так же модель первичной культуры лимфоцитов периферической крови здоровых лиц, стимулированных ФГА. Выделенные лимфоциты культивировали в присутствии митогена в течение разных промежутков времени (от 16 до 72 ч), фиксировали и использовали для иммуноцитохимических реакций. Параллельно проводили количественное определение белков методом иммуноблотов. Для этого клетки лизировали в буфере, содержащем 10 мМ TrisHCl, рН 6.8, 20% глицерина, 4% SDS, 200 мМ, β-меркаптоэтанола, 0.1% бромфенолового синего. Лизаты были получены из одинакового количества покоящихся и активированных лимфоцитов (~ 105 клеток). Суммарную концентрацию белка в лизатах определяли на спектрофотометре Spectronic Genesis 10Bio («Thermo Electronic Co», США) по методу Лоури в модификации 7 Петерсона. Электрофоретическое разделение белков проводили в 10%-ном полиакриламидном геле на установке фирмы «Amersham Biosciences» (США) по методу Лэммли (Laemmli, 1970). В работе использовался метод полусухого переноса белков на мембрану в камере для электроблоттинга. Перед переносом гель и нитроцеллюлозную мембрану Protran (диаметр пор 0.22 мкм, «Schleicher and Schuell», Германия) инкубировали в буфере для переноса, содержащем 48 мМ Трис, 39 мМ глицина, 20% метанола, pH 9.2, в течение 30 мин. Перенос белков из геля на мембрану проводили в небольшом количестве буфера для переноса при постоянном напряжении 25 В в течение 40 мин. Для предотвращения неспецифической сорбции мембрану инкубировали в 5%-ном растворе обезжиренного сухого молока в буфере TBS-T (20 мM Трис-HCl, 150 мM NaCl, 0,05% Твин-20, pH 7.6) в течение ночи при +4° С. Мембрану инкубировали с поликлональными кроличьими антителами к белку SURF-6 (разведение 1:1000 в буфере TBS-T, содержащем 5% сухого молока) или фибрилларину (1:1000), моноклональными мышиными антителами к B23 (1:500) или нуклеолину (1:1000) или с поликлональными кроличьими антителами к PCNA (1:500, «Santa Cruz», США) 1 ч при комнатной температуре. Отмывали в буфере TBS-T, содержащем 5% сухого молока 4 раза по 5 мин и инкубировали мембрану с антителами к иммуноглобулинам кролика или мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (1:10000, «Sigma»), 40 мин при комнатной температуре. Антитела проявляли с помощью набора ECL+Plus Detection Kit («AmershamPharmaciaBiotech», Великобритания) и рентгеновской пленки HyperFilm ECL («AmershamPharmaciaBiotech»), следуя рекомендациям производителя. Для повторного использования мембраны связанные антитела удаляли в буфере, содержащем 100 мМ β-меркаптоэтанола, 2% додецилсульфата натрия, 62.5 мМ Трис-HCl (pH 6.7), 40 мин при 40-50о С. В отдельных экспериментах после переноса гели фиксировали 10%-ной трихлоруксусной кислотой 40 мин и окрашивали 0.08%-ным раствором коллоидного Coomassie blue G-250 («Amresco", США), содержащим 20% этанола, 1,6% ортофосфорной кислоты, 8% сульфата аммония и 70% воды, в течение ночи с интенсивным перемешиванием. В качестве контроля к каждому опыту использовали лимфоциты, которые инкубировали в тех же условиях без ФГА. Возможность использования антител к белкам В23, фибрилларину и SURF-6 в онкогематологии была изучена нами на клетках больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Подобно интактным лимфоцитам, лимфоидные клетки анализировали методом непрямой иммуноцитохимии и на иммуноблотах. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Подбор оптимального метода фиксации клеток мыши Поскольку одна из задач работы включала одновременное иммуноцитохимическое выявление белков SURF-6 и В23, было необходимо 8 подобрать универсальный протокол фиксации клеток, позволяющий в оптимальных условиях выявлять оба белка. Для решения этой задачи использовали фибробласты мыши линии NIH/3T3. Клетки фиксировали одним из следующих фиксаторов: • абсолютный ацетон (15 мин, 4о С); • абсолютный этанол (15 мин, 4о С); • абсолютный метанол (15 мин, 4о С); • 3%-ный раствор параформальдегида (ПФА) (15 мин, 21о С). Обнаружено, что лучшие результаты по выявлению обоих белков позволяет получить фиксация клеток ацетоном. Поэтому для одновременного выявления В23 и SURF-6 в активированных лимфоцитах селезенки мыши, в первую очередь, был использован этот способ фиксации клеток. Контроль активации лимфоцитов селезенки мыши к пролиферации Кон А Анализ активации лимфоцитов производили с помощью проточной цитофлуориметрии и мечения БрдУ в трех независимых сериях экспериментов. В совокупности, наши данные показали, что основная популяция неактивированных лимфоцитов селезенки мыши обладает диплоидным содержанием ДНК, т.е. находится в G0 (G0/G1) периоде клеточного цикла. Заметное увеличение доли клеток в S-периоде (около 10%) наблюдалось через 24 ч, а максимальное количество клеток в S-фазе клеточного цикла выявлялось через 48 ч после активации (табл. 1) Таблица 1. Доля клеток, меченых БрдУ (в %), на разных сроках после активации лимфоцитов селезенки мыши КонА. Время после активации (ч) Доля меченых клеток (%) 0 16 24 48 72 1,2 3,5 10,1 22,0 18,2 Локализация B23 и SURF-6 в лимфоцитах селезенки мыши на разных сроках активации В ядрышках неактивированных лимфоцитов отчетливо выявлялся белок B23. Как видно на рисунке 1 в ядрышках и ядрах тех же лимфоцитов SURF-6 не выявлялся (рис. 1). Следует отметить, что отсутствие окраски на SURF-6 в покоящихся лимфоцитах не являлось результатом недоступности антител к антигену, т.к. при двойном иммуномечении (рис. 1а, в) в ядрышках одних и тех же лимфоцитов выявлялся В23 (рис. 1а), а SURF-6 не обнаруживался (рис. 1в). При активации лимфоцитов КонА наблюдалось значительное укрупнение клеток, увеличение размеров ядрышек и появление в них SURF-6, начиная с 16 ч после добавления митогена (рис. 2). Подобно В23, SURF-6 сохранялся в ядрышках на всех сроках активации. В активированных лимфоцитах ядрышки окрашивались антителами к обоим белкам ярко и однородно (рис. 2). 9 Рис. 1. Двойное иммуномечение интактных лимфоцитов селезенки мыши антителами к В23 и SURF-6. Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия – 10 мкм. Рис. 2. Иммуноцитохимическое выявление белков В23 и SURF-6 в лимфоцитах селезенки мыши через 16, 24 и 72 ч после активации к пролиферации КонА. Стрелками указаны ядрышки. Нижний ряд – фазовый контраст для окрашивания антителами к SURF-6. Масштабная линия – 10 мкм. 10 Количественное содержание белков SURF-6 и В23 в лимфоцитах селезенки мыши на разных сроках после активации С помощью метода иммуноблоттинга было изучено количественное содержание SURF-6 и В23 в лимфоцитах. В качестве контрольного белка использовали белок PCNA. Как видно на рисунке 3, белок PCNA впервые выявлялся в суммарных лизатах лимфоцитов через 24 ч после активации, т.е. на том сроке когда, по результатам мечения клеток БрдУ и проточной цитофлуориметрии, наступала S-фаза первого клеточного цикла. Рис. 3. Содержание белков SURF-6, В23 и PCNA, в интактных лимфоцитах мыши и в лимфоцитах на разных сроках после активации пролиферации КонА. В неактивированных лимфоцитах белок SURF-6 не выявлялся, но его количество прогрессивно увеличивалось при их активации вплоть до 48 ч. Следует отметить, что SURF-6 начинал выявляться в ядрышках активированных лимфоцитов уже через 16 ч после добавления КонА, что свидетельствует о том, что данный белок начинает экспрессироваться на стадиях, предшествующих активной клеточной пролиферации. Через 72 ч наблюдалось некоторое уменьшение содержания SURF-6. Это, вероятнее всего, связано с началом гибели лимфоцитов при длительном культивировании in vitro, сопровождающейся деградацией SURF-6. Содержание В23 также увеличивалось с увеличением доли пролиферирующих лимфоцитов. Однако, в отличие от белка SURF-6, B23 выявлялся в неактивированных лимфоцитах, а его максимальное содержание наблюдалось через 72 ч после активации. Относительно высокий уровень B23, наблюдаемый через 72 ч после активации лимфоцитов, можно объяснить большей устойчивостью этого белка при гибели клеток (Сауткина и др., 2006). Таким образом, наши исследования показали, что содержание белков SURF-6 и В23 увеличивается при активации пролиферации лимфоцитов селезенки мыши in vitro. Однако, в отличие от В23, SURF-6 не выявлялся в покоящихся лимфоцитах селезенки, появляясь в ядрышках на ранних этапах активации. Подбор оптимальных условий фиксации клеток человека для выявления анализируемых белков Для выбора оптимальных условий фиксации лимфоцитов человека для выявления ядрышковых белков использованы антитела к белкам ядрышка 11 фибрилларину, В23 и SURF-6 и культивируемые клетки человека HeLa. Были апробированы следующие варианты фиксации клеток: • абсолютный ацетон (15 мин, 4о С); • абсолютный этанол (15 мин, 4о С); • абсолютный метанол (15 мин, 4о С); • 3%-ный раствор параформальдегида (3% ПФА) (15 мин, 21 о С). Характер окрашивания клеток одними и теми же антителами варьировал в зависимости от использованного фиксатора. Наиболее универсальной фиксацией при работе с данными антителами оказалась фиксация ацетоном - в этом случае флуоресцентные сигналы видны во всех ожидаемых районах клетки, а фоновое свечение – минимально (рис. 4). Рис. 4. Выявление белков ядрышка: фибрилларина (а-а’’’), B23 (б-б’’’) и SURF-6 (в-в’’’) в клетках HeLa после различных методов фиксации. 1 - фиксация 3% ПФА, 2 - фиксация ацетоном, 3 - фиксация метанолом, 4 - фиксация этанолом. Масштабная линия – 5 мкм. Пунктирная линия очерчивает ядро. Этот вывод оказался справедливым также для культивируемых клеток человека Ramos, K562 и лимфоцитов. Было замечено, что фиксация параформальдегидом, используемая в большинстве лабораторий, не дала лучших результатов при выявлении некоторых антигенов (В23, SURF-6), что, вероятно, связано со способностью формалиновых фиксаторов маскировать антигенные детерминанты, снижая, таким образом, их доступность для узнавания антителами (Plenat et al., 2001). Контроль активации пролиферации лимфоцитов периферической крови человека к Пролиферативную активность лимфоцитов на разных сроках после активации ФГА оценивали методом цитофлуориметрического анализа (табл. 2). Первые признаки вступления клеток в фазу репликации ДНК наблюдали через 16-24 ч после добавления митогена. Заметное увеличение доли клеток в Sпериоде (около 12%) обнаруживалось через 48 ч. Наибольшая доля клеток в Sфазе клеточного цикла (33%) выявлялась через 72 ч после добавления митогена. 12 Таблица 2. Распределение клеток по разным фазам клеточного цикла в контроле и на разных сроках после активации ФГА (в %) по данным цитофлуориметрического анализа, полученным в трех независимых сериях экспериментов. Фазы клеточного цикла 0ч 16 ч 24 ч 48 ч 72 ч G0/G1 100 98±1 94±2 84±6 63±3 S 0 2±1 6±2 12±4 33±2 G2 0 0 <1 4±2 4±1 Локализация белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови человека Изучение локализации белков SURF-6, фибрилларина, нуклеолина, Ki-67 и В23 в лимфоцитах периферической крови человека в процессе клеточного цикла производили в реакции непрямой флуоресценции. Содержание клеток, в которых выявляются данные белки, на разных сроках активации приведены в таблице 3 и на рисунке 5 по результатам 8 независимых экспериментов. Рис. 5. Доля клеток (в %), ядрышки которых окрашиваются на белки фибрилларин, нуклеолин, В23, SURF-6 и Ki-67 в популяции покоящихся лимфоцитов периферической крови здоровых доноров и на разных сроках после их активации ФГА. Таблица 3. Доля клеток (в %), ядрышки которых окрашиваются на белки: Ki-67, В23, нуклеолин, фибрилларин (фибр.) и SURF-6, в популяции интактных лимфоцитов периферической крови здоровых лиц на разных сроках после активации ФГА. Время (в ч) 0 16 24 48 72 Ki-67 0 <2 18±2 35±2 49±5 В23 54±8 60±5 74±3 84±3 95±3 нуклеолин 70±9 72±4 81±4 88±1 97±3 фибр. 79±6 85±3 86±2 91±1 97±3 SURF-6 0 12±3 32±7 54±8 85±2 Белок Ki-67 иммуноцитохимически не выявлялся в неактивированных лимфоцитах. Клетки, ядрышки которых метятся на Ki-67, впервые появлялись через 24 ч после добавления ФГА, и по мере активации их число увеличивалось. Через 72 ч этот белок присутствовал в ядрышках 49% клеток (табл. 3). Белок B23 отчетливо выявлялся в покоящихся лимфоцитах периферической крови и сохранялся в ядрышках на всех сроках активации. 13 Белки фибрилларин и нуклеолин в неактивированных лимфоцитах выявлялись в подавляющем большинстве клеток, а их доля превышала содержание В23позитивных клеток (рис. 5, табл. 3). Число клеток, содержащих данные белки, Рис. 6. Иммуноцитохимическое выявление белка SURF-6 в интактных лимфоцитах человека и в лимфоцитах, активированных к пролиферации ФГА. Нижний ряд – фазовый контраст. Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия – 10 мкм. 14 увеличивалось при активации лимфоцитов. Через 72 ч после добавления ФГА эти белки присутствовали в ядрышках всех клеток (табл. 3). В ядрышках и ядрах неактивированных лимфоцитов человека белок SURF-6 не выявлялся (рис. 6, табл. 3). Как и в лимфоцитах селезенки мыши, в лимфоцитах человека, стимулированных к пролиферации ФГА, SURF-6 обнаруживался в ядрышках уже через 16 ч после добавления митогена (рис. 6), т.е. на том сроке, когда не происходило значительного увеличения доли клеток в S-фазе клеточного цикла (табл. 2). Особенно заметны SURF-6-позитивные клетки были через 48 и 72 ч после активации, когда ядрышки достигали размеров 3-5 мкм (рис. 6). Число клеток, содержащих SURF-6, увеличивалось по мере активации лимфоцитов. Через 72 ч после добавления ФГА этот белок присутствовал в ядрышках практически всех клеток (рис. 6, табл. 3). Рис. 7. Двойное иммуномечение интактных лимфоцитов периферической крови человека антителами к В23 и SURF-6. Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия – 5 мкм. Методом двойного иммуномечения антителами к SURF-6 с антителами к В23 для интактных и Ki-67 для активированных лимфоцитов, было показано, что отсутствие окраски на SURF-6 в интактных лимфоцитах не связано с недоступностью антител к антигену, поскольку ядрышки тех же клеток отчетливо окрашивались антителом к В23 (рис. 7). Кроме того было обнаружено, что через 48 ч после активации в популяции присутствуют клетки, в которых выявляется SURF-6, но не выявляется Ki-67 (рис. 8). Рис. 8. Двойное иммуномечение лимфоцитов периферической крови человека через 48 ч после активации ФГА антителами к SURF-6 и Ki-67. Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия – 10 мкм. 15 Количественное содержание ключевых белков ядрышка в лимфоцитах здоровых лиц на разных сроках после активации ФГА Для количественной оценки содержания ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови человека, активированных к пролиферации in vitro, использовали метод иммуноблоттинга. Уровень экспрессии белков сравнили с содержанием известного маркера пролиферирующих клеток – белка PCNA, который подобно Ki-67 не выявляется в непролиферирующих клетках, но имеет намного меньшую молекулярную массу. Как видно на рисунке 9, PCNA не обнаруживался в неактивированных лимфоцитах и лимфоцитах, лизированных через 16 и 24 ч после активации, но его количество прогрессивно увеличивалось на последующих сроках и через 72 ч оказывалось сопоставимым с содержанием белка в клеточной линии Jurkat, используемой в качестве контроля. 0 16 24 48 72 Jurkat Рис. 9. Содержание белков SURF-6, фибрилларина (фибр.), нуклеолина (нукл.), В23 и PCNA в неактивированных лимфоцитах, в лимфоцитах на разных сроках после ФГАактивации и в клетках линии Jurkat. Справа - электрофореграмма суммарных белков. Цифрами обозначено время после активации в часах. Белок фибрилларин отчетливо выявлялся в неактивированных лимфоцитах, и его содержание оставалось практически одинаковым на всех сроках после активации лимфоцитов. Нуклеолин с электрофоретической подвижностью в районе 110 кДа, отчетливо выявлялся только через 72 ч после активации. Однако в неактивированных лимфоцитах и на всех сроках после активации к пролиферации на иммуноблотах выявлялись белки c меньшей массой - от 97 кДа до 105 кДа. Вероятнее всего это укороченные формы белка, которыми богаты покоящиеся клетки (Chen et al., 1991). В пользу этого говорят литературные данные, согласно которым стабильность молекулы нуклеолина находится в прямой зависимости от клеточной пролиферации (Mehes et al., 1995) и тот факт, что на иммуноцитохимическом уровне нуклеолин отчетливо выявлялся в ядрышках покоящихся лимфоцитов. Особенно отчетливо активация лимфоцитов сопровождалась увеличением содержания B23. При этом в соответствии с данными 16 иммуноцитохимического анализа белок выявлялся также в неактивированных лимфоцитах (рис. 9). Белок SURF-6 не выявлялся в покоящихся лимфоцитах, подобно известному маркеру пролиферации PCNA. Однако, подобно В23, отчетливое увеличение содержания SURF-6 отмечено уже через 16 ч после активации, т.е. на том сроке, когда не происходит значительного увеличения доли клеток в Sфазе клеточного цикла и пролиферативный маркер белок PCNA отсутствует (рис. 9). Затем уровень SURF-6 прогрессивно повышался вплоть до 72 ч после активации пролиферации. Содержание ключевых белков ядрышка в лимфоидных клетках больных лимфопролиферативными заболеваниями Основные результаты анализа локализации и содержания белков ядрышка в лимфоидных клетках 37 больных лимфопролиферативными заболеваниями суммированы в таблице 4, в сравнении с данными исследования лимфоцитов 8 здоровых лиц. Как видно из таблицы 4, у больных доля клеток с экспрессией Ki-67 варьировала в зависимости от диагноза заболевания. Наименьшие значения Ki67-положительных клеток отмечены у больных с лимфоцитомой селезенки (от 2 до 12%). При хроническом лимфолейкозе количество Ki-67-положительных клеток варьировало от 1 до 55%, в зависимости от стадии болезни, что согласуется с литературными данными (Diop et al., 2005; Xu et al., 2006). Наибольшие значения пролиферативной активности по количеству Ki-67положительных клеток отмечены у больных с лимфомой из клеток мантийной зоны селезенки (от 10 до 32%) и при лимфосаркоме (до 75%). Полученные результаты согласуются с литературными данными (de Melo et al., 1992; Лорие, 2006; Broyde et al., 2009). Доля клеток, ядрышки которых окрашивались на фибрилларин, у больных, составляла, в среднем, от 68 до 81%, существенно не отличаясь от числа фибрилларин-положительных лимфоцитов периферической крови здоровых лиц (табл. 4), что свидетельствует о нецелесообразности использования данного белка в качестве диагностического или прогностического маркера. Содержание лимфоцитов с экспрессией В23 было повышено у четверти больных по сравнению со здоровыми лицами, составляя, в среднем, от 44 до 60%. При этом белок В23 выявлялся также и в интактных лимфоцитах, что снижает его диагностическое значение. Между экспрессией В23 и Ki-67 была обнаружена положительная корреляция (коэффициент ранговой корреляции Спирмена rs=0,3; p<0,05). При иммуноцитохимическом окрашивании клеток антителом к SURF-6 присутствие белка в ядрышках было выявлено в лимфоидных клетках больных всех нозологических групп, что принципиально отличает их от лимфоцитов периферической крови здоровых лиц. При этом содержание SURF-6положительных клеток варьировало от 10% до 67% и прямо коррелировало с 17 уровнем экспрессии Ki-67 (rs=0,5; p<0,01), отражающим агрессивность течения заболевания. Так, у больных с неагрессивной формой лимфоцитомы число SURF-6-положительных клеток не превышало 30%. В то же время, при более злокачественных заболеваниях доля SURF-6-положительных клеток возрастала (табл. 4), достигая максимальных значений - от 47% до 67% - при лимфосаркомах (рис. 10б) и лимфоме из клеток мантийной зоны селезенки, а так же у половины больных с лимфомой маргинальной зоны (рис. 10а). Таблица 4. Содержание Ki-67-, В23-, фибрилларин- и SURF-6-положительных клеток (в %) в образцах лимфоидных клеток здоровых лиц и больных с лимфопролиферативными заболеваниями. Группы обследованных лиц Здоровые лица Статистические показатели Ki-67 Антигены SURF-6 Фибр. B23 медиана колебания 0 0 медиана колебания 2 2-12 26 12-30 79 55 70-85 45-63 68 56 55-90 35-90 медиана колебания медиана колебания 2 1-3 10 7-55 46 21-75 30 18-55 80 41,5 74-87 35-48 81 44 78-85 40-47 медиана колебания 10 7-65 48,5 23-55 78,5 45 75-82 32-60 Лимфома маргинальной зоны селезенки (n=6) медиана колебания Лимфома из клеток мантийной зоны селезенки (n=3) Лимфосаркома (n=4) медиана колебания 12 2-21 17 10-32 41 22-67 65 60-67 74 56 61-87 52-67 74 60 72-85 58-92 медиана колебания 42 9-75 55 47-65 70 75 55-89 45-76 (n=8) Лимфоцитома селезенки без признаков трансформации (n=8) Хронический лимфолейкоз: начальная стадия (n=6) прогрессирующая стадия (n=4) Т-клеточная лимфома (n=6) n – число здоровых или больных лиц, клетки которых использовали для анализа. При анализе экспрессии SURF-6 по U-критерию Манна-Уитни статистически значимые различия были выявлены между группами «хронический лимфолейкоз» и «лимфоцитома» (р<0,05), «лимфосаркома» и «лимфоцитома» (р<0,01), «лимфома мантийной зоны» и «лимфоцитома» (р<0,01), «Т-клеточная лимфома» и «лимфома мантийной зоны» (р<0,01), «хронический лимфолейкоз» и «лимфома мантийной зоны» (p<0,05). При анализе экспрессии белка В23 статистически значимые различия были выявлены между группами «хронический лимфолейкоз» и «лимфосаркома» (p<0,05). Значимые различия в экспрессии фибрилларина у различных нозологических групп не обнаружены. 18 Рис. 10. Иммуноцитохимическое выявление белка SURF-6 в лимфоидных клетках селезенки больных с диагнозами лимфома маргинальной зоны (ЛМЗ, а), лимфосаркома (ЛС, б) и хронический лимфолейкоз (ХЛЛ, в). Нижний ряд (а’-в’) фазовый контраст. Масштабная линия – 10 мкм. Результаты одновременного иммуномечения показали, что у некоторых больных присутствуют лимфоциты, которые содержат SURF-6 (рис. 11а), но не содержат Ki-67 (рис. 11в). В лимфоцитах здоровых лиц, активированных к пролиферации in vitro, такой характер окрашивания клеток проявлялся только в G1 периоде клеточного цикла. Это свидетельствует о возможности выявления с помощью антител к SURF-6 ранних стадий активации клеток к пролиферации, что может иметь как диагностическое, так и прогностическое значение в клинике. Рис. 11. Двойное иммуномечение лимфоидных клеток селезенки больного Тклеточной лимфомой антителами к SURF-6 (а) и Ki-67 (в). Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия – 10 мкм. 19 У двух больных (с лимфомой из клеток мантийной зоны селезенки и хроническим лимфолейкозом) было проанализировано содержание SURF-6, фибрилларина и B23 не только в лимфоцитах периферической крови, но и селезенки. У обоих больных количество SURF-6-позитивных лимфоцитов в селезенке несколько превышало число SURF-6-положительных лимфоцитов в периферической крови. Для того чтобы получить дополнительную информацию об экспрессии изучаемых белков у больных лимфопролиферативными заболеваниями, на иммуноблотах было исследовано содержание белков SURF-6 и В23 в лимфоидных клетках в сравнении с экспрессией белка PCNA. Белки SURF-6 и В23 методом иммуноблоттинга отчетливо выявлялись в лимфоидных клетках больных лимфопролиферативными заболеваниями (рис. 12). При этом уровень экспрессии SURF-6 был сходным с содержанием PCNA, но отличался от уровня экспрессии В23: повышенная экспрессия SURF-6 при Т-клеточной лимфоме сопровождалась относительно низким уровнем экспрессии В23. 1 2 3 Jurkat Рис. 12. Содержание белков SURF-6, В23 и PCNA в лимфоидных клетках больных лимфопролиферативными заболеваниями и клетках линии Jurkat. Справа - электрофореграмма суммарных белков. 1 - В-ХЛЛ, 2 - Т-клеточная лимфома, 3 - лимфома маргинальной зоны. В тех же образцах была оценена доля Ki-67-, SURF-6- и В23-позитивных клеток в реакции непрямой иммунофлуоресценции (табл. 5). Таблица 5. Содержание Ki-67, В23, и SURF-6-положительных клеток (в %) в лимфоидных клетках больных лимфопролиферативными заболеваниями. Диагноз 1 2 3 Хронический лимфолейкоз Т-клеточная лимфома Лимфома маргинальной зоны Источник лимфоидных клеток кровь лимфоузел кровь Ki-67 Антигены SURF-6 B23 2 42 4 35 55 22 45 40 45 Из рисунка 12 и таблицы 5 видно, что результаты иммуноцитохимического окрашивания и иммуноблотов находятся в хорошем соответствии друг с другом. Так, максимальная экспрессия PCNA и SURF-6 на иммуноблотах и максимальное число Ki-67-позитивных (42%) и SURF-620 положительных (55%) клеток наблюдались в лимфоцитах больного с диагнозом Т-клеточная лимфома. Таким образом, уровень экспрессии PCNA и Ki-67 прямо коррелировал с содержанием белка SURF-6, что еще раз подчеркивает его диагностическое значение. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Таким образом, в результате изучения экспрессии ядрышковых белков фибрилларина, нуклеолина, В23 и SURF-6, в сопоставлении с известными маркерами пролиферирующих клеток Ki-67 и PCNA, в процессе искусственно вызванной пролиферации было обнаружено, что белок ядрышка SURF-6 является ранним маркером активации лимфоцитов к пролиферации и может иметь дополнительное диагностическое и прогностическое значение в клиниколабораторный исследованиях. Белок ядрышка SURF-6 на сегодняшний день был наиболее подробно изучен в клетках мыши (Magoulas and Fried, 1996; Magoulas et al., 1998). Именно поэтому в ходе работы первоначальные исследования были проведены на лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации КонА. Обнаружено, что белок SURF-6 не выявляется в интактных лимфоцитах селезенки мыши, но его количество прогрессивно увеличивается после их активации. Следует отметить, что SURF-6 начинал выявляться в ядрышках активированных лимфоцитов уже через 16 ч после добавления КонА, что свидетельствует о том, что данный белок начинает экспрессироваться на стадиях, предшествующих активной клеточной пролиферации. Кроме того, были получены результаты, подтверждающие, что белок В23 является иммуноцитохимическим маркером последовательных стадий активации лимфоцитов млекопитающих к пролиферации. Для дальнейших исследований уровня экспрессии ключевых белков ядрышка у человека был проведен анализ влияния разных способов фиксации клеток на выявление ядрышковых антигенов в клетках линии HeLa, в ходе которого обнаружено, что наиболее адекватным фиксатором для иммуноцитохимического мечения клеток антителами к известным ядрышковым антигенам является фиксация ацетоном. Этот вывод оказался справедливым также для культивируемых клеток человека Ramos и K562 и лимфоцитов. Классической моделью для изучения изменений в содержании и локализации основных белков ядра и ядрышка при активации клеток к пролиферации и синтезу рибосом является активация лимфоцитов периферической крови с помощью ФГА (Булычева и др., 2000; Козинец и др., 2002). В качестве контрольного белка был использован Кi-67, широко применяемый в клинической практике. Все литературные данные неизменно свидетельствуют о том, что антиген Кi-67 присутствует в S- и G2-фазах клеточного цикла и митозе, но отсутствует в G0 (Khoruzhenko et al., 2010). Однако некоторые авторы указывают на то, что уровень экспрессии Ki-67 в G1 фазе может быть минимальным (Bruno et al., 1992), в связи с чем, клетки, находящиеся в данном периоде, могут быть ошибочно идентифицированы, как 21 покоящиеся (Urruticoechea et al., 2005). Поэтому наше особое внимание при изучении динамики ключевых белков ядрышка в ходе ФГА-стимуляции было направлено на изучение ранних этапов активации лимфоцитов. В проведенных нами исследованиях методами иммуноцитохимии и иммуноблоттинга было обнаружено, что в интактных лимфоцитах отчетливо выявляются белки ядрышка В23, нуклеолин и фибрилларин, сохраняясь в ядрышках на всех сроках пролиферации. При этом впервые показано, что белок SURF-6 не выявляется в покоящихся лимфоцитах периферической крови здоровых лиц, а его количество прогрессивно увеличивается по мере активации лимфоцитов к пролиферации с помощью ФГА. SURF-6-позитивные лимфоциты начинали выявляться на препаратах до появления Ki-67-позитивных клеток; на иммуноблотах SURF-6 проявлялся раньше PCNA, что позволяет сделать вывод о более ранней экспрессии SURF-6 по сравнению с известными маркерами клеточной пролиферации. Так же, как и в лимфоцитах селезенки мыши, в лимфоцитах человека, стимулированных к пролиферации, SURF-6 выявлялся в ядрышках уже через 16 ч после добавления митогена, т.е. на том сроке, когда еще не происходило значительного увеличения доли клеток в S-фазе клеточного цикла. По-видимому, это накопление белка SURF-6 связано с активацией ядрышек при вступлении клеток в G1-период. Уровень содержания SURF-6 в лимфоцитах достигал наибольшего значения к 72 ч стимуляции, когда, как было показано методом проточной цитофлуориметрии, пролиферативная активность лимфоцитов была максимальной, аналогичной клеткам культуры Jurkat. К началу выполнения работы данные об относительном содержании SURF-6 в динамике клеточного цикла в клетках человека в литературе отсутствовали. Результаты настоящей работы, проведенной на митогенстимулированных лимфоцитах мыши и человека, не только показывают, что уровень экспрессии белка SURF-6 находится в прямой зависимости от пролиферативного статуса клеток, но и свидетельствуют о том, что активация его экспрессии происходит до появления в клетках известных маркеров клеточной пролиферации Ki-67 и PCNA. Поскольку содержание белков ядрышка, участвующих в биогенезе рибосом, как правило, возрастает в динамике клеточного цикла (Sirri et al., 2000), в совокупности с литературными данными (Magoulas et al., 1998; Vernon and Gaston, 2000; Гурченков и др., 2005), это косвенно указывает на то, что белок SURF-6 принимает участие в биогенезе рибосом и регуляции клеточной пролиферации у млекопитающих. Оценка пролиферативной активности лимфоидных клеток при лимфопролиферативных заболеваниях с использованием антител к ядерным антигенам, ассоциированным с клеточной пролиферацией, является одним из важных показателей в диагностике варианта заболевания и определении степени злокачественности процесса. Однако набор белковых маркеров активации лимфоцитов в настоящее время крайне ограничен, а белки, указывающие на ранние стадии активации лимфоцитов к пролиферации, которые могли бы найти применение в онкогематологии, отсутствуют. 22 Возможность подобного использования антител к белкам В23, фибрилларину и SURF-6 в онкогематологии была изучена нами на клетках ограниченного числа больных с различными лимфопролиферативными заболеваниями. Индекс клеточной пролиферации определяли по числу Ki-67позитивных клеток. Процент клеток, ядрышки которых окрашивались на фибрилларин, у больных существенно не отличался от числа фибрилларин-положительных лимфоцитов периферической крови здоровых лиц. Не было выявлено корреляции между экспрессией фибрилларина и Ki-67, а экспрессия фибрилларина у разных нозологических групп различалась незначительно. Эти результаты свидетельствуют о нецелесообразности использования данного белка в качестве диагностического или прогностического маркера в клинической онкогематологии. Была подтверждена положительная корреляция между экспрессией В23 и Ki-67 (Булычева и др., 2003). Однако белок В23 выявлялся также и в интактных лимфоцитах, что снижает его диагностическое значение. Количество SURF-6-позитивных клеток у больных варьировало в зависимости от варианта заболевания. Важно отметить, что SURF-6позитивные клетки выявлялись у всех обследованных больных, в том числе и с неагрессивной формой заболевания, что принципиально отличает их от лимфоцитов периферической крови здоровых лиц. У больных с более благоприятным диагнозом (лимфоцитома) число SURF-6 положительных клеток не превышало 30%. Характерно, что при неоплазиях высокой степени злокачественности (лимфосаркома, лимфома мантийной зоны) всегда наблюдали интенсивное окрашивание на SURF-6 (> 45% SURF-6-позитивных клеток). Статистически значимые различия по экспрессии SURF-6 были выявлены между группами больных с лимфопролиферативными заболеваниями различной степени злокачественности. При этом содержание SURF-6положительных клеток коррелировало с уровнем экспрессии Ki-67 и PCNA, отражающих агрессивность течения заболевания. Следует отметить, что у подавляющего большинства больных число SURF-6-позитивных лимфоцитов превышало число Ki-67-позитивных клеток. При этом методом двойного окрашивания выявлено, что у больных присутствуют лимфоидные клетки, которые содержали SURF-6 при отсутствии Ki-67, что свидетельствует о том, что стадии клеточного цикла, в течение которых выявляются данные белки, совпадают лишь частично. Это предположение находится в соответствии с полученными нами результатами по динамике SURF-6 и Ki-67 в ФГАстимулированных лимфоцитах и свидетельствует о том, что SURF-6 появляется в клетках на более ранних стадиях активации к пролиферации, чем Ki-67. Следует отметить, что среди пациентов с диагнозами, характеризующимися низким содержанием белка Ki-67, как, например, начальная стадия хронического лимфолейкоза, встречались больные с повышенным уровнем белка SURF-6. Эти наблюдения говорят о том, что лимфоциты этих больных характеризуются повышенным уровнем биогенеза рибосом и, возможно, находятся на ранних стадиях активации к пролиферации, 23 не выявляемых с помощью Ki-67. Поэтому наблюдение за такими больными может иметь существенное прогностическое значение. Учитывая полученные данные по динамике экспрессии SURF-6 в лимфоцитах периферической крови доноров, активированных к пролиферации in vitro, эти наблюдения позволяют рассматривать белок ядрышка SURF-6 в качестве нового - раннего - маркера активированных лимфоцитов у онкогематологических больных. Полученные на ограниченном количестве больных результаты исследования говорят в пользу диагностической, а, возможно, и прогностической значимости SURF-6 и необходимости дальнейшего изучения уровня экспрессии этого ядрышкового белка у больных. Большой интерес представляет продолжение исследований в этом направлении с дальнейшим накоплением количественных данных, результатом которого может стать повышение достоверности начальных результатов исследования, а также выявление более тонких различий между отдельными нозологическими группами с помощью антител к SURF-6. Однако уже данное исследование, выявившее определенные корреляции между обследуемыми группами больных, свидетельствует о том, что оценка количества SURF-6позитивных клеток может быть важной для диагностики различных злокачественных заболеваний системы крови, а также использоваться при прогнозировании течения заболевания. ВЫВОДЫ. 1. 2. 3. 4. 5. Установлено, что ядрышковый белок SURF-6, в отличие от других изученных в работе белков ядрышка – В23, нуклеолина и фибрилларина, не выявляется в покоящихся (неактивированных) лимфоцитах периферической крови человека. На модели ФГА-стимулированных лимфоцитов человека выявлено, что экспрессия SURF-6 начинается раньше экспрессии известных маркеров клеточной пролиферации белков Ki-67 и PCNA, что позволяет рассматривать белок ядрышка SURF-6 в качестве раннего маркера активации лимфоцитов человека. Показано, что содержание SURF-6, В23, нуклеолина и фибрилларина увеличивается при активации пролиферации лимфоцитов с помощью ФГА in vitro, что свидетельствует в пользу участия данных белков в регуляции клеточного цикла лимфоцитов человека. На ограниченном числе больных лимфопролиферативными заболеваниями выявлено, что в ядрышках лимфоидных клеток всех больных обнаруживается белок SURF-6, содержание которого коррелирует с уровнем экспрессии белков Ki-67 и PCNA, что может иметь дополнительное диагностическое значение. Установлено, что в покоящихся лимфоцитах селезенки мыши белок SURF-6, в отличие от В23, не выявляется. Однако содержание обоих белков увеличивается при активации клеток к пролиферации in vitro. 24 Список работ, опубликованных по теме диссертации. 1. Зацепина О.В., Малышева М.В. Способ фиксации клеток человека HeLa и HEp-2 для иммуноцитохимического выявления ядерных аутоантигенов. Положительное заключение о выдаче патента №2362583 от 27.07.2009 г. 2. Моралева А.А., Малышева М.В., Магоулас Х., Ползиков М.А., Зацепина О.В. Ранняя экспрессия белка ядрышка SURF-6 в лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации in vitro. Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины (2009) №5, Т. 147 . С. 507-511. 3. Малышева М.В., Моралева А.А., Дейнеко Н.Л., Булычева Т.И., Зацепина О.В. Сравнительный анализ экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров, активированных к пролиферации in vitro. Иммунология (2010) №1, Т. 31. С. 13-17. 4. Малышева М.В., Григорьев А.А., Булычева Т.И., Зацепина О.В. Повышенная чувствительность ядрышек пролиферирующих клеток человека к ингибированию синтеза белка анизомицином. Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины (2010) №8, Т. 150. С. 223-228. 5. Малышева М.В., Моралева А.А., Булычева Т.И., Ползиков М.А., Зацепина О.В. Белок ядрышка SURF-6 – новый и ранний маркер активированных лимфоцитов млекопитающих. XVIII Международная конференция "Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии", Ялта-Гурзуф (Украина), 2010, с.32-34. 6. Малышева М.В., Дейнеко Н.Л., Булычева Т.И., Ползиков М.А., Зацепина О.В. Сравнительный анализ экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови здоровых лиц и больных лимфопролиферативными заболеваниями. III Всероссийская научнопрактическая конференция «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты», Москва, 2010, с. 42-44. 7. Малышева М.В., Моралева А.А., Дейнеко Н.Л., Булычева Т.И., Зацепина О.В. Сравнительный анализ экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров, активированных к пролиферации in vitro. ХХII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2010, с. 40. 8. Малышева М.В., Моралева А.А., Зацепина О.В. Ранняя экспрессия белка ядрышка SURF-6 в лимфоцитах селезенки мыши, активированных к пролиферации in vitro. ХХI зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2009, с. 38. 9. Моралева А.А., Зубрицкий А.В., Малышева М.B., Булычева Т.И., Ползиков М.А., Зацепина О.В. Белок ядрышка SURF-6 – новый маркер пролиферирующих лимфоцитов здоровых доноров и больных гемобластозами. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды», Казань, 2009, с. 389. 10. Малышева М.В., Моралева А.А., Ползиков М.А., Булычева Т.И., Зацепина О.В. Белки ядрышка – новые возможные маркеры клеточной 25 пролиферации. VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток», Звенигород, 2009, с. 29-30. 11. Жарская О.О., Андрющенко А.С., Малышева М.В., Зацепина О.В. Разработка и внедрение отечественных тест-систем для клинико-лабораторной диагностики системных аутоиммунных заболеваний человека. Симпозиум «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств, Москва, 2008, с.63-64. 12. Малышева М.В., Андрющенко А.С., Жарская О.О., Александрова Е.Н., Зацепина О.В. Разработка технологии и создание отечественных препаратов для первичного скрининга аутоиммунных сывороток. Научнопрактическая конференция «Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине». Ростов-на-Дону, 2007, с. 147-148. 13. Моралева А.А., Малышева М.В., Зубрицкий А.В., Григорьев А.А., Ползиков М.А. Особенности состояния белков ядрышка в клетках млекопитающих с разным уровнем транскрипции рибосомных генов. II Съезд общества клеточной биологии, Ст-Петербург, 2007, Цитология 49: 778-779. 26
