Оценка цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной
advertisement
На правах рукописи Ащина Людмила Андреевна Оценка цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы у больных с аутоиммунной формой хронической крапивницы 14.03.09. – клиническая иммунология, аллергология 14.03.10. – клиническая лабораторная диагностика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пенза, 2014 2 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Пензенский институт усовершенствования врачей» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: Баранова Надежда Ивановна, доктор биологических наук Научный консультант: Кулюцина Елена Романовна, кандидат медицинских наук Официальные оппоненты: Пинегин Борис Владимирович – доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом иммунодиагностики и иммунокоррекции Федерального государственного бюджетного учреждения «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства. Бержец Валентина Михайловна – доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией по разработке аллергенов Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова» Российской академии медицинских наук. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Защита диссертации состоится «___» _________ 201 _ года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.046.02 в Федеральном бюджетном учреждении науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу: 125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Автореферат разослан «____» ___________ 201_ года Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Л.И. Новикова 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования В современной аллергологии крапивница представляет серьезную проблему и по распространенности занимает третье место после аллергического ринита и бронхиальной астмы (Себекина О.В., 2011; Скороходкина О.В., Ключарова А.Р., 2013). Хронические формы крапивницы значительно снижают качество жизни пациентов ввиду косметических проблем, интенсивного зуда, нарушения сна, ухудшения психоэмоционального состояния и трудоспособности (Горячкина Л.А, Кашкин К.П., 2009; Петров В.И. и соавт., 2010). Ранее считалось, что хроническая крапивница (ХК) в 80-95% случаев является идиопатической (Феденко Е.С., 2002; Горячкина Л.А., Борзова Е.Ю., 2004). Однако в связи с многочисленными исследованиями в данной области процент хронической идиопатической крапивницы (ХИК) заметно сократился и составляет 55%, и около 45% в структуре ХК составляет хроническая аутоиммунная крапивница (ХАК) (Goh C.L., Tan K.T., 2009). Наиболее тяжелой формой ХК является ХАК. Ввиду сложности и малой изученности иммунных механизмов в патогенезе ХАК, терапевтическая тактика лечения таких пациентов является малоэффективной. Известно, что в основе патогенетических механизмов ХАК лежит образование аутоантител к высокоафинному IgE рецептору и молекуле IgE, которые способны стимулировать выброс медиаторов из базофилов и тучных клеток, результатом чего является развитие уртикарной реакции (Kaplan A.P., Greaves M., 2009). Однако причина образования аутоантител у больных ХАК на сегодняшний день остается неизвестной. Также отмечено, что при ХАК развиваются различные дефекты иммунной системы, которые могут выражаться в гиперактивации Т- и В-систем иммунитета, активации систем свертывания крови, компонентов комплемента, дисбалансе системы цитокинов (Santos J.C. et al., 2008; Soruri A. et al., 2008; Abd ElAzim М., Abd El-Azim S., 2011; Cugno M. et al., 2012). Доказано, что ключевую роль в патогенезе ХАК играют ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ (Баранова Н.И. и соавт., 2012; Ying S. et al., 2002; Jin C.Y. et al., 2008; Samia A.I. et al., 2009). Однако немногочисленные данные по этому вопросу являются противоречивыми и не дают полного представления о цитокиновой регуляции при ХАК, в связи с чем, изучение иммунологических механизмов с участием цитокинов при данной патологии является особенно актуальным. В последнее время одним из перспективных методов изучения цитокинов является исследование их продукции клетками иммунной системы в тестах ex vivo. Данные тесты создают своего рода модельные системы, наиболее приближенные к реальным условиям, исследовать которые можно вне организма. Кроме того, они позволяют дать оценку не только резервным возможностям клеток иммунной системы к продукции цитокинов, но и использовать их для изучения влияния фармакологических препаратов, с целью назначения терапии больным (Рыжикова С.Л. и соавт., 2011). Одним из наиболее эффективных методов в лечении больных ХАК является применение внутривенных иммуноглобулинов (ВВИГ). В нашей стране в МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского (Москва) был разработан ВВИГ четвертого поколения – препарат «Габриглобин-IgG», высокая эффективность которого была доказана в ряде работ (Больц Е.А., 2012; Молотилов Б.А. и соавт., 2013). Однако механизмы действия данного препарата при ХАК до сих пор остаются малоизученными. Также, несмотря на большой процент пациентов с хорошими результатами от терапии, сохраняется 4 процент с неудовлетворительными результатами. В связи с вышеизложенным для оптимизации терапии актуальным является разработка иммунологических критериев отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG». Степень разработанности темы исследования ХАК была открыта в 1993 году M.Greaves и M.Hide (Hide M. et al., 1993). В работе Sabroe R. и соавторов было показано, что в основе патогенеза данной формы ХК лежит образование аутоантител против высокоафинного IgE-рецептора и молекулы IgE (Sabroe R. et al., 1998). Однако до сих пор причина их образования остается неясной. Большой вклад в изучение патогенетических механизмов ХАК внесли зарубежные ученые. Так, Boguniewicz M., Cugno M. доказали роль активации коагуляционного каскада (Boguniewicz M., 2008; Cugno M. et al., 2009). KasperskaZajac A. и соавторы изучали роль гормональных нарушений в патогенезе данного заболевания (Kasperska-Zajac A. et al., 2008). Santos J.C. и соавторы исследовали цитокиновую регуляцию и роль хемокинов (Santos J.C., Azor M.H. et al., 2008; Santos J.C., De Brito C.A. et al., 2012). Кроме того, известны работы Caproni M. и соавторов, которые также изучали нарушения цитокиновой регуляции и иммунных клеток при ХК и ХАК (Caproni M., Volpi W. et al., 2003; Caproni M., Giomi B. et al., 2005; Caproni M., Giomi B., Melani L. et al., 2006). Известен ряд ученых, включая Samia A.I., Tedeschi A., Ying S., работы которых посвящены изучению цитокинов у больных с данной патологией (Ying S. et al., 2002; Tedeschi A. et al., 2007; Samia A.I., Naglaa A.K., 2009). Однако до сих пор нет единого мнения о цитокиновой регуляции при ХАК. Из отечественных ученых, которые занимаются проблемой ХАК, известны Борзова Е.Ю., Гервазиева В.Б., Груздева М.С. Голубчикова Р.Н., Горячкина Л.А., Данилычева И.В., Калимолдаева С.Б., Молотилов Б.А., Орлова Е.А., Сигбатуллина Н.А. и другие. Однако работы данных авторов посвящены, в основном, проблеме диагностики и лечения, а также исследованию отдельных немногочисленных иммунологических параметров. При этом остаются малоизученными вопросы, связанные с иммунными нарушениями у больных ХАК. Кроме того, до сих пор не было проведено комплексной оценки показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента и цитокинов. В перечисленных выше работах по изучению цитокинов при ХАК, исследования проводились в сыворотке крови, и до сих пор не было проведено изучения спонтанной и стимулированной продукции цитокинов клетками иммунной системы. Исследование цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы у больных с данной патологией является новым направлением в изучении патогенеза ХАК. Цель исследования Оценить цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы у больных с аутоиммунной формой хронической крапивницы и определить ее роль в оптимизации лечения. 5 Задачи исследования: 1. Оценить выработку ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в спонтанном и ФГАиндуцированном супернатанте в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей. 2. Отработать диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» на клетках иммунной системы здоровых доноров. 3. Определить влияние диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на показатели выработки ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы в тесте ex vivo у больных хронической аутоиммунной крапивницей. 4. Провести сравнительную оценку иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей и хронической идиопатической крапивницей. 5. Дать оценку влияния лечения препаратом «Габриглобин-IgG» на цитокинпродуцирующую способность клеток иммунной системы, а также иммунологические показатели у больных хронической аутоиммунной крапивницей. 6. На основе показателей продукции цитокинов клетками иммунной системы в тесте ex vivo разработать критерии отбора больных хронической аутоиммунной крапивницей к проведению лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Научная новизна Впервые проведена оценка продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы в спонтанном и ФГА-индуцированном супернатанте методом ex vivo у больных ХАК. Подобраны диагностически значимые разведения препарата «ГабриглобинIgG» для использования в тесте ex vivo с клетками иммунной системы больных ХАК. Впервые изучено влияние диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками в тесте ex vivo у больных ХАК. Проведена комплексная сравнительная оценка показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента, а также показателей ключевых цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК и ХИК. Выявлено влияние препарата «Габриглобин-IgG» на цитокин-продуцирующую способность клеток иммунной системы у больных ХАК, а также показатели иммунитета. Разработаны иммунологические критерии отбора больных ХАК к проведению лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Теоретическая и практическая значимость работы Результаты, полученные при изучении иммунологических показателей и цитокин-продуцирующей способности клеток иммунной системы больных ХАК, а также влияния на них препарата «Габриглобин-IgG», будут способствовать пониманию иммунологических механизмов в патогенезе ХАК и механизмов действия данного препарата. Различия в основных иммунологических параметрах между больными ХАК и ХИК могут указывать на различие патогенетических механизмов данных форм ХК. 6 Установлено, что тест ex vivo дает более полную информацию о цитокиновой продукции, в связи с чем изучение уровня цитокинов у больных ХАК целесообразнее проводить в супернатанте клеток, а не в сыворотке крови. Определены диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG» для использования в тесте ex vivo с клетками иммунной системы больных ХАК. На основании данных по продукции ключевых цитокинов, полученных в тесте ex vivo, разработаны критерии отбора больных ХАК, которым целесообразно назначать терапию препаратом внутривенного иммуноглобулина «Габриглобин-IgG». Методология и методы исследования Методология настоящего исследования спланирована согласно поставленной цели. Предметом исследования стала цитокин-продуцирующая способность клеток иммунной системы и основные иммунологические показатели у больных ХАК, а также их изменения после лечения препаратом «Габриглобин-IgG». Научная литература, посвященная проблеме ХАК, была проанализирована формальнологическими методами исследования. Планирование и проведение исследований, направленных на решение поставленных задач, осуществлялось на основе общенаучных и специфических методов. Основным объектом исследования являлась венозная кровь больных ХАК. Проведено клиническое, открытое, проспективное, рандомизированное исследование. Критериями включения пациентов в исследование явились: наличие аутоиммунной формы хронической крапивницы, возраст 18-60 лет, информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения: острая крапивница, психические заболевания, туберкулез любой локализации в активной фазе, онкологические заболевания, беременность и период лактации. Положения, выносимые на защиту: 1. Хроническая аутоиммунная крапивница протекает с преобладанием аутоиммунного механизма заболевания. Спектр иммунологических нарушений характеризуется повышением продукции ИЛ-4, ИЛ-17 и IFNγ клетками иммунной системы в тесте ex vivo, а также уровней CD4+ популяции лимфоцитов, общего IgE, С3-компонента комплемента, антител к нативной ДНК, и снижением продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы, снижением уровней CD8+ популяции лимфоцитов и ИЛ-4 в сыворотке крови. 2. Диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG», отработанные на клетках иммунной системы здоровых доноров в тесте ex vivo, составляют для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFNγ – 1:3 и для выработки ИЛ-18 – 1:10. Показано повышение продукции ИЛ-17 и снижение продукции IFNγ клетками под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в тесте ex vivo у больных ХАК. 3. Динамика иммунологических показателей у больных ХАК после проведения терапии препаратом «Габриглобин-IgG» характеризуется повышением продукции клетками иммунной системы ИЛ-10 и снижением продукции ИЛ-17 и IFNγ в тесте ex vivo, повышением уровня CD8+ популяции лимфоцитов, а также нормализацией соотношения CD4+/CD8+ популяций лимфоцитов и показателей антител к нативной ДНК. 7 Степень достоверности и апробация результатов исследования Результаты настоящего исследования являются достоверными, так как был проведен достаточный объем исследований с использованием адекватных и современных методологических подходов. Обработка данных проводилась при помощи специализированных компьютерных программ, которые позволяют проводить статистический анализ больших массивов данных. Диссертация обсуждена и одобрена на заседании межкафедральной комиссии ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздрава России (протокол № 16 от 25 декабря 2013 г.). Материалы диссертационной работы доложены на XVI Межрегиональной научно-практической конференции ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздрава России (Пенза, 2012); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов (Саранск, 2013); Объединенном иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013); On-line конференции «Медицина в XXI веке: тенденции и перспективы» (2013); III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы отечественной медико-биологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области» (Пенза, 2013). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из которых 8 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования результатов диссертаций. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В соответствии с поставленными в работе задачами было проведено комплексное аллерго-иммунологическое обследование 120 пациентов с ХК в возрасте от 18 до 60 лет, из которых пациенты с ХАК составили 100 человек (основная группа) и пациенты с ХИК – 20 человек (группа сравнения). В качестве контрольной группы было обследовано 30 практически здоровых лиц, сопоставимых по полу и возрасту с основной группой. Диагноз ХАК устанавливался на этапе предварительного обследования на основании клинических проявлений болезни, анамнестических данных, а также результатов аллерго-иммунологического обследования. В дальнейшем из 100 пациентов с диагнозом ХАК 27 пациентам было проведено лечение препаратом «Габриглобин-IgG». Лечение препаратом проводилось по следующей схеме: в дозе 2,5 грамма в сутки (0,03-0,04 г/кг веса) в течение 4 дней. Данная терапия проводилась дополнительно к базисному лечению. Клиническую эффективность лечения оценивали по разработанной 4-х бальной шкале (Больц Е.А., 2012). Аллергологическое обследование пациентов включало постановку кожных проб с аутосывороткой и определение общего IgЕ. Внутрикожные пробы с аутосывороткой выполнялись по методу М. Hide (Hide M. et al.,1993). Пациентам с диаметром пробы 7 мм и более ставили диагноз ХАК. Пациентов, которые давали отрицательную пробу с аутосывороткой, относили в группу с ХИК. Определение уровня общего IgE в сыворотке крови проводилось методом иммуноферментного анализа (ИФА) наборами фирмы «АлкорБио» (Россия). 8 Иммунологическое обследование больных включало исследование показателей клеточного иммунитета – CD4+ и CD8+ популяций лимфоцитов – методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител серии ИКО производства ООО «Сорбент» (Россия). Для оценки гуморального иммунитета было проведено исследование уровней сывороточных иммуноглобулинов классов А, M, G с помощью метода Mancini (Mancini C. et al., 1965) и циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом осаждения полиэтиленгликолем по V. Haskova (Haskova V. et al., 1978). Система комплемента оценивалась по уровню С3- и С4-компонентов в сыворотке крови иммунотурбидиметрическим методом с помощью набора фирмы «DiaSys» (Германия). Оценка уровня антител к нативной ДНК проводилась в сыворотке крови методом ИФА с использованием наборов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Изучение цитокинового профиля осуществлялось по трём направлениям. Первое направление включало изучение методом ex vivo спонтанной и ФГАиндуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы (Исаченко Е.Г. и соавт., 2002). Метод ex vivo осуществлялся следующим образом. Полученную венозную гепаринизированную кровь разбавляли до концентрации 1:5. Далее для постановки спонтанной продукции клеток к разбавленной крови добавляли стерильную среду 199, а для постановки индуцированной продукции – фитогемагглютинин (ФГА). Проводили инкубацию в течение 6 часов при 37°С, после чего пробирки центрифугировали при 800g, отбирали супернатант, в котором определяли концентрацию цитокинов. Второе направление заключалось в количественной оценке методом ex vivo продукции клетками иммунной системы ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG». Постановка теста ex vivo проводилась по вышеописанной методике. Вместо ФГА использовали препарат «Габриглобин-IgG». Диагностически значимые разведения препарата отрабатывались на клетках иммунной системы контрольной группы в тесте ex vivo c использованием разведений препарата 1:1, 1:3, 1:10. Третье направление заключалось в количественной оценке показателей ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови в изучаемых группах. Определение концентрации цитокинов в супернатанте и сыворотке крови осуществлялось методом ИФА с использованием наборов ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета прикладных программ «STATISTICA 6.0», а также с применением программы SPSS для проведения ROC-анализа. Использовали традиционные методы статистического анализа (Халафян А.А., 2009). При обработке полученных результатов аллергоиммунологических исследований использовались следующие методы. С помощью теста Колмогорова-Смирнова проводилась проверка на нормальность распределения по выборке. Так как большинство параметров имело ненормальное распределение, были применены методы непараметрической статистики. Для каждого параметра определяли медиану (Ме) и интерквартильный размах – 25% и 75%. Сравнение количественных признаков в независимых группах проводили по методу МаннаУитни и Вальд-Вольфовица. Сравнение количественных признаков в зависимых группах проводили по методу Вилкоксона. При р<0,05 различие между количественными признаками считалось статистически значимым. Для наиболее значимых факторов (иммунологических показателей, имеющих достоверную связь с 9 критерием эффективности) проводился ROC-анализ для установления пороговых значений. Исходя из цели и задач настоящего исследования, первым разделом работы было изучение спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFN-γ клетками иммунной системы у больных ХАК по сравнению с контрольной группой. Как видно из данных таблицы 1, у пациентов с ХАК наблюдался достоверно более высокий уровень спонтанной продукции ИЛ-4, составивший 0,55 пг/мл [0,2-3,5], по сравнению с группой контроля (0 пг/мл [0-0]) (Mann-Whitney test, р=0,000072), что может объясняться активацией Th2-популяции лимфоцитов при аутоиммунных заболеваниях. Самые значительные изменения у пациентов в сравнении с контрольной группой касались показателей ИЛ-17 и выражались в 10-кратном повышении уровня спонтанной продукции этого цитокина и 14-кратном увеличении уровня ФГА-индуцированной продукции (Mann-Whitney test, р=0,00068 и р=0,000028, соответственно). Доказано, что ИЛ-17 играет важную роль в патогенезе аутоиммунных заболеваний, а его уровень повышен у больных с данной патологией (Atwa M.A. et al., 2013). Полученные результаты свидетельствуют об активации Th17-популяции лимфоцитов и повышенной продукции ИЛ-17 клетками иммунной системы у больных ХАК. В то же время при оценке показателей спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-18 у пациентов был выявлен статистически значимый более низкий уровень спонтанной продукции данного цитокина, который составил 38,5 пг/мл [28,0-54,9] по сравнению с контрольной группой (80,4 пг/мл [54,0-123,0]) (Mann-Whitney test, р=0,0009). Аналогичные изменения были получены по уровню ФГА-индуцированной продукции ИЛ-18 в группе больных ХАК, который был достоверно более низким и составил 43,1 пг/мл [23,8-53,9] по сравнению с группой контроля (72,5 пг/мл [52,0-97,0]) (Mann-Whitney test, р=0,01). В настоящее время доказано, что, являясь провоспалительным цитокином, ИЛ-18 играет важную роль в иммунных и воспалительных реакциях, и особенно в патогенезе аутоиммунных заболеваний, в связи с чем, снижение уровня данного цитокина может свидетельствовать об ослабление его роли у больных ХАК. Кроме перечисленных цитокинов ключевую роль в механизмах патогенеза ХАК играет IFNγ, так как известно, что его повышенный уровень может вызывать запуск аутоиммунных реакций в организме (Skyrkovich S.V. et al., 2002). Исходя из этого, изучение продукции IFNγ клетками иммунной системы в тесте ex vivo у пациентов с данной патологией представляется важным. Было выявлено, что уровень спонтанной продукции IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК, составивший 11,3 пг/мл [0-33,6], был достоверно более высоким при сравнении с контрольной группой (0 пг/мл [0-0]) (Mann-Whitney test, р=0,00038). При изучении показателей ФГАиндуцированной продукции IFNγ у больных было выявлено повышение его уровня до 198,6 пг/мл [56,1-357,4] по сравнению с группой контроля, в которой данный показатель составил 73,0 пг/мл [57,6-105,0] (Mann-Whitney test, р=0,028). Полученные данные могут свидетельствовать о повышении способности клеток иммунной системы продуцировать IFNγ и об активации аутоиммунитета у наблюдаемых пациентов. 10 Таблица 1 – Основные иммунологические показатели у больных хронической аутоиммунной крапивницей Показатель Больные ХАК до лечения Контрольная группа n=100 n=30 Mediana [LQ-UQ] Mediana [LQ-UQ] Показатели цитокинов в спонтанном и ФГА-индуцированном супернатанте клеток иммунной системы (ex vivo) ИЛ-4 сп., пг/мл 0,55 [0,2-3,5]* 0 [0-0] ИЛ-4 инд., пг/мл 1,2 [0,4-3,3] 1,0 [0,7-3,3] ИЛ-10 сп., пг/мл 8,1 [0-17,8] 11,3 [6,05-18,9] ИЛ-10 инд., пг/мл 11,6 [3,5-24,8] 8,85 [0,7-21,25] ИЛ-17 сп., пг/мл 56,15[31,7-98,1]* 5,4 [0-22,0] ИЛ-17 инд., пг/мл 86,9 [55,95-112,6]* 6,1 [0-23,5] ИЛ-18 сп., пг/мл 38,5 [28,0-54,9]* 80,4 [54,0-123,0] ИЛ-18 инд., пг/мл 43,1 [23,8-53,9]* 72,5 [52,0-97,0] IFNγ сп., пг/мл 11,3 [0-33,6]* 0 [0-0] IFNγ инд., пг/мл 198,6 [56,1-357,4]* 73,0 [57,6-105,0] Показатели цитокинов в супернатанте клеток иммунной системы, стимулированных препаратом «Габриглобин-IgG» (ex vivo) ИЛ-10, пг/мл Г.(1:3) 9,9 [1,45-18,45] 18,3 [4,7-20,4] ИЛ-17, пг/мл Г.(1:3) 55,35 [33,8-111,0]* 9,95 [5,7-28,6] ИЛ-18, пг/мл Г.(1:10) 43,7 [31,3-56,3] 42,6 [37,9-49,1] INFγ, пг/мл Г.(1:3) 19,6 [4,6-42,3]* 44,05 [22,4-55,1] Основные иммунологические параметры и показатели цитокинов в сыворотке крови CD4+, % 47,0 [42,0-52,0]* 42,0 [38,0-46,0] CD8+, % 18,0 [16,0-21,0]* 22,0 [18,0-29,0] CD4/CD8 2,3 [2,0-3,2]* 1,8 [1,5-2,2] IgA, г/л 2,0 [1,6-2,75] 2,4 [1,5-3,1] IgM, г/л 1,7 [1,2-2,3] 1,5 [0,95-1,8] IgG, г/л 13,0 [11,0-15,0] 15,0 [10,6-17,0] IgE, МЕ/мл 91,5 [29,0-249,0]* 21,5 [12,5-34,5] ЦИК 3%, у.е 13,0 [8,0-26,0] 11,0 [8,0-14,0] ЦИК 4%, у.е 29,0 [17,0-50,0] 26,0 [21,0-33,0] С3, мг/дл 164,0 [138,0-215,0]* 141,0 [106,0-164,0] С4, мг/дл 24,5 [20,0-35,0] 22,0 [18,0-29,0] АТ к ДНК, МЕ/мл 10,7 [8,1-39,7]* 5,95 [3,7-8,5] ИЛ-4, пг/мл 0,39 [0-0,71]* 4,6 [0,21-5,0] ИЛ-10, пг/мл 0 [0-3,0] 1,0 [0-3,4] ИЛ-17, пг/мл 0 [0-0] 0 [0-1,0] ИЛ-18, пг/мл 87,1 [61,4-198,2] 111,0 [60,0-121,3] IFNγ, пг/мл 0 [0-5,5] 0 [0-7,0] Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК до лечения и контрольной группы; сп. – спонтанная продукция; инд. – индуцированная продукция; Г. – продукция под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG». 11 Таким образом, полученные в работе методом ex vivo результаты по спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ключевых цитокинов клетками иммунной системы констатируют одновременную активацию Th1 (IFNγ), Th2 (ИЛ-4) и Th17 (ИЛ-17) – популяций Т-лимфоцитов при ХАК, что свидетельствует о разбалансировке хелперных клонов Т-лимфоцитов. Для оптимизации терапии препаратом «Габриглобин-IgG» нас также интересовал вопрос о влиянии данного препарата на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы у больных ХАК в тесте ex vivo. С этой целью нами были подобраны диагностически значимые разведения препарата «Габриглобин-IgG», которые в дальнейшем использовались при постановке теста ex vivo с клетками больных ХАК. Данные разведения препарата «Габриглобин-IgG» подбирались опытным путем на клетках иммунной системы контрольной группы. Критерием для выбора диагностически значимых разведений препарата служил максимальный процент здоровых людей, у которых наблюдалась высокая выработка изучаемых цитокинов. Как видно из представленных графиков (рисунок 1), диагностически значимыми разведениями препарата «Габриглобин-IgG» для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFNγ оказалось разведение 1:3 и для выработки ИЛ-18 – 1:10. Рисунок 1 – Подбор диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG» на клетках иммунной системы здоровых людей в тесте ex vivo Примечание: по оси ординат – процент здоровых людей с высокой выработкой цитокинов при различных разведениях препарата «Габриглобин-IgG»; по оси абсцисс – разведения препарата «Габриглобин-IgG». Данные разведения 1:3 и 1:10 были взяты в работу по изучению влияния препарата «Габриглобин-IgG» на продукцию ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клеткам иммунной системы у больных ХАК в тесте ex vivo. По результатам изучаемого теста нами было выявлено (таблица 1), что у больных ХАК под действием диагностически 12 значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) наблюдался достоверно повышенный уровень ИЛ-17, который составил 55,35 пг/мл [33,8-111,0], по сравнению с контрольной группой (9,95 пг/мл [5,7-28,6]) (Mann-Whitney test, р=0,00091). Однако при изучении продукции IFNγ клетками иммунной системы с диагностически значимым разведением препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) было выявлено, что уровень данного показателя был достоверно снижен в 2 раза у больных ХАК (19,6 пг/мл [4,6-42,3]) по сравнению с показателем группы контроля (44,05 пг/мл [22,4-55,1]) (Mann-Whitney test, р=0,045). Полученные данные указывают на целенаправленное действие препарата «Габриглобин-IgG» на Th17- и Th1-популяции лимфоцитов больных ХАК в тесте ex vivo. Также в соответствии с задачами настоящего исследования для выявления иммунных нарушений у пациентов были изучены основные показатели клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента, а также показатели цитокинов в сыворотке крови в сравнении с контрольной группой (таблица 1). В результате проведенного анализа основных иммунологических параметров у больных ХАК были выявлены нарушения в клеточном звене иммунитета, которые проявлялись в повышенном уровне CD4+ популяции лимфоцитов, который составил 47,0% [42,0-52,0] (Mann-Whitney test, р=0,008) и сниженном уровне CD8+ популяции лимфоцитов, который составил 18,0% [16,0-21,0] (Mann-Whitney test, р=0,006) по сравнению с показателями в группе контроля (42,0% [38,0-46,0] и 22% [18,0-29,0], соответственно). Полученные данные указывают на дисбаланс в основных популяциях клеточного иммунитета при аутоиммунной форме ХК. При изучении показателей гуморального иммунитета у больных ХАК было выявлено достоверное повышение уровня общего IgE, который составил 91,5 МЕ/мл [29,0-249,0] по сравнению с контрольной группой (21,5 МЕ/мл [12,5-34,5]) (Mann-Whitney test, р=0,00018). Однако имеющиеся в литературе данные по этому вопросу являются противоречивыми, что, по-видимому, может быть связано с наличием атопического механизма у ряда больных ХАК, который не учитывается большинством исследователей. Кроме того, исследование системы комплемента позволило выявить достоверное повышение уровня С3-компонента комплемента у больных ХАК до 164,0 мг/дл [138,0-215,0], по сравнению с группой контроля (141,0 мг/дл [106,0-164,0]) (Mann-Whitney test, р=0,015). Повышенный уровень данного показателя у пациентов объясняется активацией комплемента по альтернативному пути под действием иммунных комплексов, содержащих IgE. Также в настоящее время доказана роль антител к нативной ДНК в качестве специфического маркера аутоиммунного процесса, вследствие чего вопрос изучения данного показателя у больных ХАК в сравнении с группой контроля представлялся интересным. При этом было выявлено, что у больных ХАК уровень данного показателя оказался достоверно выше в 1,8 раза и составил 10,7 МЕ/мл [8,1-39,7] по сравнению с контрольной группой, в которой данный показатель составил 5,95 МЕ/мл [3,7-8,5] (Mann-Whitney test, р=0,023). Известно, что ДНК-связывающие аутоантитела образуются при аутоиммунных заболеваниях и обладают способностью расщеплять ДНК, являясь каталитическими антителами. Связанные с ядерными антигенами антитела вместе с белками системы комплемента образуют крупные иммунные комплексы, накопление которых в разных тканях может приводить к патологическому эффекту. Полученные результаты согласуются с данными литературы о повышенном уровне антител к нативной ДНК у больных ХАК, что служит доказательством наличия аутоиммунного процесса при данном заболевании (Бездетко Т.В., Химич Т.Ю., 2012). 13 При изучении показателей ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в сыворотке крови у больных ХАК было выявлено только достоверное снижение в 12 раз уровня ИЛ-4, который составил 0,39 пг/мл [0-0,71], по сравнению с контрольной группой (4,6 пг/мл [0,21-5,0]) (Mann-Whitney test, p=0,000032). Учитывая факт, что показатели других изучаемых цитокинов у пациентов достоверно не отличались от контрольной группы, можно сделать вывод о том, что определение уровня цитокинов в сыворотке крови у больных ХАК не является достаточно информативным по сравнению с изучением цитокинов методом ex vivo. Несмотря на то, что клинические проявления разных форм ХК являются практически одинаковыми, механизмы развития их различаются. Исследованиями последних лет доказано, что при аутоиммунной форме ХК важную роль в патогенезе играет процесс образования патологических аутоантител, которые вызывают ряд иммунологических нарушений (Ozdemir O., 2006). Одним из важных диагностических критериев ХАК является положительная проба с аутосывороткой, которая позволяет отнести пациентов именно в группу с аутоиммунной формой ХК. В то же время, пациенты с ХИК имеют отрицательную пробу с аутосывороткой, так как в патогенезе данной формы ХК, по-видимому, играют роль другие механизмы развития патологии (Больц Е.А., 2012). В связи с этим, интересным представлялся вопрос изучения основных иммунологических параметров у больных ХИК по сравнению с контрольной группой, а также с больными ХАК. В результате анализа показателей клеточного, гуморального иммунитета, системы комплемента, а также показателей цитокинов в сыворотке крови у больных ХИК было выявлено, что уровни основных популяций клеточного иммунитета достоверно не различались с показателями контрольной группы, однако уровень CD8+ популяции лимфоцитов у больных ХИК, который составил 23,0% [19,0-30,0], был достоверно выше по сравнению с больными ХАК (18,0% [16,0-21,0]) (Mann-Whitney test, р=0,019) (таблица 2). Полученный результат может указывать на снижение показателей цитотоксических Т-лимфоцитов именно при ХАК. Кроме того, у пациентов с ХИК, также как и при ХАК, было отмечено достоверное повышение уровня общего IgE, который составил 98,5 МЕ/мл [35,5-304,0], по сравнению с группой контроля (21,5 МЕ/мл [12,5-34,5]) (MannWhitney test, р=0,0014), что свидетельствует о наличии атопического механизма в патогенезе данного заболевания. Различия по иммунологическим параметрам между больными ХАК и ХИК коснулись и системы комплемента. Было выявлено, что уровень С3-компонента комплемента у больных ХАК, который составил 164,0 мг/дл [138,0-215,0] был достоверно более высоким по сравнению с группой ХИК, где данный показатель составил 143,5 мг/дл [93,5-156,0] (Mann-Whitney test, р=0,003). Наряду с этим изучение системы цитокинов показало, что у пациентов с ХИК уровень ИЛ-4 составил 0 пг/мл [0-0], что было достоверно ниже по сравнению с группой контроля (4,6 пг/мл [0,21-5,0]) (Mann-Whitney test, р=0,00001). Также изменения у больных с ХИК были выявлены и по уровню ИЛ-10, который составил 19,3 пг/мл [0,8-78,8] и был достоверно выше по сравнению с контрольной группой (1,0 пг/ мл [0-3,4]) (Mann-Whitney test, р=0,0086) и группой больных ХАК – 0 пг/мл [0-3,0] (Mann-Whitney test, р=0,0018). Полученный результат может свидетельствовать о возможном участии ИЛ-10 в патогенетических механизмах ХИК. При изучении уровня ИЛ-18 у больных ХИК в сравнении с контрольной группой не было выявлено достоверно значимых различий, однако была отмечена тенденция к его повышению. При этом сравнительный анализ данного показателя между больными ХАК и ХИК выявил, что уровень ИЛ-18 был достоверно снижен у больных ХАК и составил 14 87,1 пг/мл [61,4-198,2] по сравнению с группой больных ХИК, где его уровень составил 156,4 пг/мл [99,2-382,4] (Mann-Whitney test, р=0,041). Аналогичные результаты были получены в работе Puxeddu I. и соавторов (Puxeddu I. et al., 2013). Известно, что ИЛ-18 является непосредственным фактором, высвобождающим гистамин. Кроме того, доказана его роль не только в аутоиммунном, но и в противоинфекционном иммунитете. Поэтому полученный результат о более высоком уровне ИЛ-18 у больных ХИК по сравнению с больными ХАК может свидетельствовать о возможном участии инфекционных агентов в патогенезе ХИК. Таблица 2 – Характеристика основных иммунологических показателей и цитокинов у больных ХАК и ХИК Показатели CD4+, % CD8+, % CD4/CD8 IgA, г/л IgM, г/л IgG, г/л IgE, МЕ/мл ЦИК 3%, у.е ЦИК 4%, у.е С3, мг/дл С4, мг/дл ИЛ-4, пг/мл ИЛ-10, пг/мл ИЛ-17, пг/мл ИЛ-18, пг/мл IFNγ, пг/мл Больные ХАК n=100 Mediana [LQ-UQ] 47,0 [42,0-52,0] 18,0 [16,0-21,0]* 2,3 [2,0-3,2]* 2,0 [1,6-2,75] 1,7 [1,2-2,3] 13,0 [11,0-15,0] 91,5 [29,0-249,0] 13,0 [8,0-26,0] 29,0 [17,0-50,0] 164,0 [138,0-215,0]* 24,5 [20,0-35,0] 0,39 [0-0,71] 0 [0-3,0]* 0 [0-0] 87,1 [61,4-198,2]* 0 [0-5,5] Больные ХИК n=20 Mediana [LQ-UQ] 46,0 [42,0-48,0] 23,0 [19,0-30,0] 1,9 [1,5-2,1] 2,15 [1,9-2,45] 1,53 [1,05-2,2] 11,5 [9,6-15,0] 98,5 [35,5-304,0]** 14,0 [10,0-23,0] 32,0 [21,0-50,0] 143,5 [93,5-156,0] 22,0 [16,0-28,0] 0 [0-0]** 19,3 [0,8-78,8]** 0 [0-0,8] 156,4 [99,2-382,4] 0 [0-0] Контрольная группа n=30 Mediana [LQ-UQ] 42,0 [38,0-46,0] 22,0 [18,0-29,0] 1,8 [1,5-2,2] 2,4 [1,5-3,1] 1,5 [0,95-1,8] 15,0 [10,6-17,0] 21,5 [12,5-34,5] 11,0 [8,0-14,0] 26,0 [21,0-33,0] 141,0 [106,0-164,0] 22,0 [18,0-29,0] 4,6 [0,21-5,0] 1,0 [0-3,4] 0 [0-1,0] 111,0 [60,0-121,3] 0 [0-7,0] Примечание: * – статистически значимое различие больных ХАК и ХИК; ** – статистически значимое различие больных ХИК и контрольной группы. Таким образом, выявленные в работе нарушения в иммунологических параметрах у больных ХАК по сравнению с контрольной группой характеризовались повышением уровня CD4+ популяции лимфоцитов, с одновременным снижением CD8+ популяции лимфоцитов, а также повышением уровней IgE, С3-компонента комплемента, антител к нативной ДНК, снижением уровня ИЛ-4, что указывает на ведущий аутоиммунный механизм у больных ХАК. В то же время у больных ХИК отмечались другие иммунные нарушения, которые характеризовались повышенным уровнем IgE, сниженным уровнем ИЛ-4 и повышенным уровнем ИЛ-10. Полученные результаты доказывает, что иммунные нарушения у больных ХАК и ХИК носят различный характер (схема 1). 15 Схема 1 – Различия в иммунологических показателях у больных ХАК и ХИК N – показатели в пределах значений контрольной группы; ↓ – снижение показателя; ↑ – повышение показателя С целью оценки влияния препарата «Габриглобин-IgG» на цитокинпродуцирующую способность клеток иммунной системы больных ХАК после терапии было проведено изучение спонтанной и ФГА-индуцированной продукции цитокинов ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ в тесте ex vivo у больных ХАК до и после лечения, в сравнении с контрольной группой. Как следует из данных таблицы 3, у больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» происходило достоверное повышение ФГА-индуцированной продукции ИЛ-10 в 2,8 раза с 10,1 пг/мл [4,3-20,0] до 28,0 пг/мл [11,4-39,5] (Wilcoxon test, р=0,013). Уровень данного показателя у пациентов после терапии также был достоверно более высоким и по сравнению с контрольной группой (Mann-Whitney test, р=0,032). Являясь продуктом Tr1 клеток и противо-воспалительным цитокином, ИЛ-10 способен снижать секрецию провоспалительных цитокинов, тем самым участвуя в реакциях аутоиммунитета. Поэтому повышение его уровня у больных ХАК после иммунотерапии может способствовать уменьшению аутоиммунного процесса. Кроме того, у больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» было выявлено статистически значимое снижение в 2,5 раза спонтанной продукции клетками иммунной системы ИЛ-17 с уровня 58,3 пг/мл [45,0-98,1] до 23,75 пг/мл [9,2-59,4] (Wilcoxon test, р=0,018) и в 2,3 раза ФГА-индуцированной продукции ИЛ-17 с 95,55 пг/мл [62,6-105,0] до 42,4 пг/мл [20,5-83,3] (Wilcoxon test, р=0,035). Однако, несмотря на положительную тенденцию в результатах после терапии, уровни спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-17 у больных ХАК после лечения были достоверно более высокими по сравнению с показателями контрольной группы (Mann-Whitney test, р=0,037 и р=0,0068, соответственно). Следовательно, лечение препаратом «Габриглобин-IgG» способствует снижению уровня ИЛ-17, не решая вопрос его нормализации у больных ХАК. В то же время при изучении показателей IFNγ в тесте ex vivo было выявлено, что у пациентов после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» происходило значительное снижение ФГА-индуцированной 16 продукции IFNγ в 6 раз с уровня 234,9 пг/мл [82,25-353,7] до 38,35 пг/мл [3,55-198,1] (Wilcoxon test, р=0,016). При этом уровень данного показателя становился сниженным в 2 раза по сравнению с группой контроля (73,0 пг/мл [57,6-105,0]) (WaldWolfowitz test, р=0,007). Известно, что высокие показатели IFNγ часто ассоциируются с активацией аутоиммунного процесса. Поэтому полученные в нашей работе данные по снижению показателей IFNγ могут свидетельствовать о снижении активности аутоиммунного процесса в целом после проведения лечения препаратом «Габриглобин-IgG». На основании полученных результатов можно судить о достаточно сильном воздействии препарата «Габриглобин-IgG» на показатели ИЛ-10, IFNγ и ИЛ-17, в результате которого происходит регуляция Th-взаимодействия у больных ХАК. С целью оптимизации терапии препаратом «Габриглобин-IgG» был проведен сравнительный анализ продукции цитокинов ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ клетками иммунной системы в тесте ex vivo c диагностически значимыми разведениями препарата «Габриглобин-IgG» у больных ХАК до и после лечения, а также у больных после лечения и контрольной группы (таблица 3). При этом отмечалась интересная закономерность. Уровень ИЛ-17 у больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» достоверно снижался с 57,85 пг/мл [50,5-72,0] до 33,0 пг/мл [21,8-42,0] (Wilcoxon test, р=0,0018), но оставался более высоким по сравнению с контрольной группой (9,95 пг/мл [5,7-28,6]) (Mann-Whitney test, р=0,0357), что еще раз свидетельствуют о том, что препарат «Габриглобин-IgG» способен снижать повышенную продукцию Th17-популяции лимфоцитов. Однако уровень IFNγ у пациентов достоверно не изменялся после терапии и оставался на более низком уровне по сравнению с группой контроля (Mann-Whitney test, р=0,01). Полученные данные можно объяснить тем, что препарат «Габриглобин-IgG» оказывал сильное воздействие на Th1-популяцию лимфоцитов у больных ХАК и значительно снижал повышенные показатели IFNγ после терапии, поэтому в тесте ex vivo не было выявлено достоверных изменений показателя данного цитокина. Однако, из-за того, что активность Th-17 популяции лимфоцитов под действием препарата «Габриглобин-IgG» снижалась не в полной мере, то дополнительная нагрузка на клетки иммунной системы больных ХАК после лечения данным препаратом приводила к снижению показателя ИЛ-17. С целью определения точек воздействия препарата «Габриглобин-IgG» было проведено изучение основных иммунологических показателей у больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» в сравнении с больными до лечения, а также с контрольной группой (таблица 3). В результате, у больных после терапии было выявлено достоверное повышение уровня CD8+ популяции лимфоцитов с 16,0 % [13,0-20,0] до 23,0% [20,0-26,0] (Wilcoxon test, р=0,002) и его нормализация. Полученные результаты указывают на активацию цитотоксического потенциала Тлимфоцитов у больных ХАК после терапии препаратом «Габриглобин-IgG» и согласуются с данными литературы о механизмах действия данного препарата (Алёшкин В.А. и соавт., 2008). Также было отмечено, что показатели С4-компонента комплемента у больных ХАК до лечения – 23,0 мг/дл [22,0-31,0] достоверно повышались до 31,0 мг/дл [22,0-43,0] у больных после лечения (Wilcoxon test, р=0,04). Полученный результат свидетельствует об активации комплемента по классическому пути, однако объяснения данного феномена в литературе не было найдено. В связи с этим данный вопрос требует дальнейшего изучения. 17 Таблица 3 – Основные иммунологические показатели у больных хронической аутоиммунной крапивницей до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» Показатель Больные ХАК до Больные ХАК после Контрольная лечения лечения группа n=27 n=27 n=30 Mediana Mediana Mediana [LQ-UQ] [LQ-UQ] [LQ-UQ] Показатели цитокинов в спонтанном и ФГА-индуцированном супернатанте клеток иммунной системы (ex vivo) ИЛ-4 сп., пг/мл 0,8 [0,2-3,2] 0,4 [0-2,5]** 0 [0-0] ИЛ-4 инд., пг/мл 1,8 [0,5-4,8] 1,0 [0,5-3,1] 1,0 [0,7-3,3] ИЛ-10 сп., пг/мл 9,75 [0-11,1] 10,8 [2,1-19,4] 11,3 [6,05-18,9] ИЛ-10 инд., пг/мл 10,1 [4,3-20,0]* 28,0 [11,4-39,5]** 8,85 [0,7-21,25] ИЛ-17 сп., пг/мл 58,3 [45,0-98,1]* 23,75 [9,2-59,4]** 5,4 [0-22,0] ИЛ-17 инд., пг/мл 95,55 [62,6-105,0]* 42,4 [20,5-83,3]** 6,1 [0-23,5] ИЛ-18 сп., пг/мл 32,9 [27,0-60,1] 34,0 [24,3-41,6]** 80,4 [54,0-123,0] ИЛ-18 инд., пг/мл 40,85 [26,05-51,2] 29,3 [22,4-40,9]** 72,5 [52,0-97,0] IFNγ сп., пг/мл 29,9 [0-33,6] 6,05 [1,1-22,65]** 0 [0-0] IFNγ инд., пг/мл 234,9 [82,25-353,7]* 38,35[3,55-198,1]** 73,0 [57,6-105,0] Показатели цитокинов в супернатанте клеток иммунной системы, стимулированных препаратом «Габриглобин-IgG» (ex vivo) ИЛ-10, пг/мл Г.(1:3) 9,8 [1,2-16,5] 10,5 [1,5-14,8] 18,3 [4,7-20,4] ИЛ-17, пг/мл Г.(1:3) 57,85 [50,5-72,0]* 33,0 [21,8-42,0]** 9,95 [5,7-28,6] ИЛ-18, пг/мл Г.(1:10) 37,5 [26,8-45,3] 37,9 [21,3-41,3] 42,6 [37,9-49,1] INFγ, пг/мл Г.(1:3) 22,75 [6,8-41,05] 11,5 [5,9-42,5]** 44,05 [22,4-55,1] Основные иммунологические параметры и показатели цитокинов в сыворотке крови CD4+, % 49,0 [42,0-55,0] 47,0 [40,0-53,0]** 42,0 [38,0-46,0] CD8+, % 16,0 [13,0-20,0]* 23,0 [20,0-26,0] 22,0 [18,0-29,0] CD4/CD8 2,7 [2,2-3,2]* 2,05 [1,6-2,55] 1,8 [1,5-2,2] IgA, г/л 2,2 [1,3-2,6] 2,0 [1,6-2,2] 2,4 [1,5-3,1] IgM, г/л 1,6 [1,2-2,5] 1,7 [1,25-2,3] 1,5 [0,95-1,8] IgG, г/л 12,0 [9,0-16,0] 13,0 [9,5-16,0] 15,0 [10,6-17,0] IgE, МЕ/мл 112,0 [65,0-249,0] 108,0 [37,0-221,0]** 21,5 [12,5-34,5] ЦИК 3%, у.е 12,0 [7,0-25,0] 16,0 [9,0-24,0] 11,0 [8,0-14,0] ЦИК 4%, у.е 24,0 [18,0-43,0] 31,0 [20,0-40,0] 26,0 [21,0-33,0] С3, мг/дл 158,0 [130,0-247,0] 173,0 [140,0-233,0]** 141,0 [106,0-164,0] С4, мг/дл 23,0 [22,0-31,0]* 31,0 [22,0-43,0]** 22,0 [18,0-29,0] АТ к ДНК, МЕ/мл 11,2 [9,0-39,7] 8,15 [6,15-30,8] 5,95 [3,7-8,5] ИЛ-4, пг/мл 0,5 [0-0,81] 0 [0-0,85]** 4,6 [0,21-5,0] ИЛ-10, пг/мл 0,9 [0,5-3,0] 0 [0-4,2] 1,0 [0-3,4] ИЛ-17, пг/мл 0 [0-0,5] 0 [0-4,2] 0 [0-1,0] ИЛ-18, пг/мл 79,9 [69,3-187,6] 98,7 [77,2-118,5] 111,0 [60,0-121,3] IFNγ, пг/мл 0 [0-7,6] 0 [0-0,9] 0 [0-7,0] Примечание: * – статистически значимые различия больных ХАК до и после лечения препаратом «Габриглобин-IgG»; ** – статистически значимые различия больных ХАК после лечения препаратом «Габриглобин-IgG» и контрольной группы; сп. – спонтанная продукция; инд. – индуцированная продукция; Г. – продукция под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG». 18 Кроме того, было выявлено, что достоверно более высокий уровень антител к нативной ДНК у больных ХАК до лечения (Mann-Whitney test, р=0,018) снижался до значений контрольной группы после проведения терапии, что может указывать на уменьшение аутоиммунного воспаления у пациентов и объясняется данными литературы о способности препарата «Габриглобин-IgG» к нейтрализации и выведению патологических аутоантител (Алешкин В.А., Лютов А.Г., 2006). Анализ показателей гуморального иммунитета и ключевых цитокинов в сыворотке крови не выявил статистически значимых изменений у больных после проведения терапии. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольшее влияние препарат «Габриглобин-IgG» оказывал на клеточное звено иммунитета, регулируя соотношение хелперы/цитотоксические лимфоциты, а также показатели антител к нативной ДНК, тем самым снижая уровни маркеров аутоиммунного процесса. Заключительным разделом работы было выявление критериев отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG». С этой целью нами была проведена оценка эффективности терапии у 27 пациентов с ХАК. Было выявлено, что у 20 человек (74%), наблюдался хороший эффект от лечения, у 2 человек (7%) – удовлетворительный эффект и у 5 человек (19%) – неудовлетворительный эффект от терапии (рисунок 2). В целом, эффективность лечения данным препаратом с учетом хороших и удовлетворительных результатов у больных ХАК составила 81%. Хороший эффект 19 % 7% Удовлетворительный эффект 74 % Неудовлетворительный эффект Рисунок 2 – Эффективность лечения препаратом «Габриглобин-IgG» у больных ХАК Для дальнейшего исследования, нами были сформированы две группы больных ХАК. В 1 группу нами были включены пациенты с хорошим эффектом от лечения (20 человек), а 2 группу составили больные с неудовлетворительным эффектом (5 человек). Далее с целью прогноза эффективности лечения в работе была проведена оценка связи эффективности терапии с полученными методом ex vivo показателями спонтанной и ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ, а также продукции ИЛ-10, ИЛ-17, ИЛ-18 и IFNγ под действием диагностически значимых разведений препарата «Габриглобин-IgG у больных ХАК. При сравнительном анализе больных ХАК 1 и 2 групп, было выявлено, что в 1 группе больных наблюдался более высокий уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, который составил 3,3 пг/мл [1,6-5,1] по сравнению с больными 2 группы (0,5 пг/мл 19 [0,2-0,5]) (Mann-Whitney test, р=0,025). Также было выявлено, что уровень спонтанной продукции IFNγ в 1 группе – 32,1 пг/мл [29,1-54,4] был достоверно более высоким по сравнению с больными 2 группы (0 пг/мл [0-2,6]) (Mann-Whitney test, р=0,033). Аналогично этому уровень продукции IFNγ клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в 1 группе больных – 27,2 пг/мл [19,6-75,3] был также достоверно повышенным по сравнению с показателем во 2 группе больных (1,5 пг/мл [0-10,8]) (Mann-Whitney test, р = 0,042). Далее для параметров ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ и продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) был проведен ROC-анализ и определены их пороговые значения, на основании которых можно будет сделать прогноз, хороший или неудовлетворительный эффект от лечения окажет применяемая терапия (рисунки 3,4,5). 8 неудовлетворительный эффект хороший эффект 7 Наблюдения 6 5 4 3 2 1 0 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Рисунок 3 – Распределение значений ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 в 1 (хороший эффект) и 2 (неудовлетворительный эффект) группах больных ХАК 40 неудовлетворительный эффект хороший эффект 35 Наблюдения 30 25 20 15 10 5 0 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Рисунок 4 – Распределение значений спонтанной продукции IFNγ в 1 (хороший эффект) и 2 (неудовлетворительный эффект) группах больных ХАК 20 5 неудовлетворительный эффект хороший эффект Наблюдения 4 3 2 1 0 -20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Рисунок 5 – Распределение значений продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» в 1 (хороший эффект) и 2 (неудовлетворительный эффект) группах больных ХАК Таким образом, нами были выявлены критерии отбора пациентов с ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG». Данными критериями явились: 1. Уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 более 1,05 пг/мл; 2. Уровень спонтанной продукции IFNγ более 15,85 пг/мл; 3. Уровень продукции IFNγ с диагностически значимым разведением препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) не менее 15,20 пг/мл. Исходя из полученных результатов, мы можем рекомендовать с целью назначения пациентам с ХАК терапии препаратом «Габриглобин-IgG» проводить постановку теста ех vivo, с определением уровня ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ, а также продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3). Хорошую эффективность лечения можно прогнозировать в 77,8% случаев при специфичности совокупности тестов 100,0%, если у пациента уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 будет больше 1,05 пг/мл, уровень спонтанной продукции IFNγ больше 15,85 пг/ммл, а уровень продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) составит не менее 15,20 пг/мл. ВЫВОДЫ: 1. С помощью теста ex vivo выявлено повышение спонтанной продукции ИЛ-4, спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-17 и IFNγ, а также снижение спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-18 клетками иммунной системы у больных ХАК. 2. Диагностически значимое разведение препарата «Габриглобин-IgG» для выработки ИЛ-10, ИЛ-17, IFNγ клетками иммунной системы составило 1:3 и для выработки ИЛ-18 – 1:10. 3. Показано повышение продукции ИЛ-17 и снижение продукции IFNγ клетками иммунной системы под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) в тесте ex vivo у больных ХАК. 21 4. Сравнительный анализ иммунологических показателей у больных ХАК и ХИК по сравнению с показателями контрольной группы показал повышение уровней CD4+ популяции лимфоцитов, показателей общего IgE, С3-компонента комплемента, антител к нативной ДНК, а также снижение уровней CD8+ популяции лимфоцитов и ИЛ-4 у больных ХАК. У больных ХИК изменения иммунологических показателей характеризовались повышением общего IgE и ИЛ-10, а также снижением ИЛ-4. 5. Лечение препаратом «Габриглобин-IgG» способствовало повышению индуцированной продукции ИЛ-10, снижению спонтанной и индуцированной продукции ИЛ-17 и индуцированной продукции IFNγ клетками иммунной системы, повышению уровня CD8+ популяции лимфоцитов, а также нормализации соотношения CD4+/CD8+ популяций лимфоцитов и показателей антител к нативной ДНК у больных ХАК. 6. Диагностически значимыми критериями отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG», полученными в тесте ex vivo, являются: уровень ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4 более 1,05 пг/мл, уровень спонтанной продукции IFNγ более 15,85 пг/мл, уровень продукции IFNγ с диагностически значимым разведением препарата «Габриглобин-IgG» (1:3) не менее 15,20 пг/мл. Практические рекомендации 1. Для выявления нарушений в системе цитокинов у больных ХАК предпочтительней является определение их уровня методом ex vivo в спонтанном и индуцированном супернатанте клеток иммунной системы, а не в сыворотке крови. 2. Для назначения терапии препаратом «Габриглобин-IgG» больным ХАК рекомендуется проводить постановку теста ех vivo с определением уровня ФГА-индуцированной продукции ИЛ-4, спонтанной продукции IFNγ, а также продукции IFNγ под действием диагностически значимого разведения препарата «Габриглобин-IgG» (1:3), и руководствоваться разработанными критериями отбора больных. Перспективные направления дальнейшей разработки темы. Существует несколько актуальных направлений дальнейшей разработки темы. Во-первых, доказанная в настоящем исследовании значимость применения теста ex vivo для изучения цитокинов и выявления иммунологических критериев отбора больных ХАК на лечение препаратом «Габриглобин-IgG» служит перспективой для дальнейшей работы в указанном направлении, включая широкое внедрение данного метода в лабораторную и медицинскую практику и для назначения других фармакологических препаратов пациентам. Во-вторых, актуальным является изучение Т-регуляторных клеток при ХАК, а именно, исследование транскрипционного фактора FOXP3 и связанного с ним генетического полиморфизма значимых цитокинов. Данное направление может открыть новые возможности в понимании патогенетических механизмов аутоиммунной формы хронической крапивницы. 22 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Баранова, Н.И. Иммунологические аспекты хронической аутоиммунной крапивницы / Н.И. Баранова, Е.А. Орлова, С.В. Коженкова, Л.А. Ащина // Российский аллергологический журнал. – 2012. – №1. – Вып. 1. – С. 30-31. 2. Баранова, Н.И. Сравнительная характеристика цитокинового профиля у больных с аутоиммунной и инфекционной формами крапивницы / Н.И. Баранова, Е.А. Орлова, Л.А. Ащина, С.В. Коженкова // Аллергология и иммунология. – 2012. – Т.13, №1. – С. 34. 3. Орлова, Е.А. Нейроиммунные показатели у больных хронической крапивницей / Е.А. Орлова, О.А. Левашова, Л.А. Ащина // Сборник трудов I Международной интернет-конференции «Медицина в XXI веке: традиции и перспективы». – Казань, 2012. – С. 188-190. 4. Орлова, Е.А. Анализ показателей нейрогенного воспаления у больных хронической психогенной крапивницей / Е.А. Орлова, О.А. Левашова, Л.А. Ащина // Сборник статей третьей Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». – СПб., 2012. – С. 99-101. 5. Ащина, Л.А. Иммунологические аспекты аутоиммунной формы хронической рецидивирующей крапивницы / Л.А. Ащина, Н.И. Баранова, Е.А. Орлова // Сборник материалов II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Сибирские медико-биологические чтения». – Барнаул, 2012. – С. 9-10. 6. Ащина, Л.А. Оценка спонтанной и индуцированной продукции цитокинов у больных с аутоиммунной формой хронической рецидивирующей крапивницы / Л.А. Ащина, Н.И. Баранова, Е.А. Орлова // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2012. – №4. – Вып. 41. – С. 83. 7. Орлова, Е.А. Клиническая эффективность метотрексата у больных с хронической аутоиммунной крапивницей / Е.А. Орлова, Б.А. Молотилов, Л.А. Ащина // Российский аллергологический журнал. – 2012. – №5. – Вып. 1. – С. 202-203. 8. Ащина, Л.А. Наличие антител к нативной ДНК как один из механизмов патогенеза аутоиммунной формы хронической рецидивирующей крапивницы / Л.А. Ащина, Н.И. Баранова, Е.А. Орлова // Сборник материалов XVI юбилейной Межрегиональной научно-практической конференции ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития России «Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных». – Пенза, 2012. – С. 3537. 9. Ащина, Л.А. Оценка спонтанной и индуцированной продукции цитокинов у больных с аутоиммунной формой хронической рецидивирующей крапивницей до и после лечения препаратом Габриглобин / Л.А. Ащина, Н.И. Баранова, Е.А. Орлова // Сборник материалов XVI юбилейной Межрегиональной научнопрактической конференции ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития России «Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных». – Пенза, 2012. – С. 37-38. 10. Орлова, Е.А. Значение уровня субстанции Р у больных хронической психогенной крапивницей / Е.А. Орлова, О.А. Левашова, И.Ю. Учаева, Л.И. Бирюзова, 23 Л.В. Варганова, Л.А. Ащина // Сборник материалов XVI юбилейной Межрегиональной научно-практической конференции ГБОУ ДПО «Пензенский институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития России «Актуальные вопросы диагностики, лечения и реабилитации больных». – Пенза, 2012. – С. 287288. 11. Баранова, Н.И. Цитокиновый профиль и показатели Т-клеток у больных аутоиммунной формой хронической крапивницы / Н.И. Баранова, Л.А. Ащина, Е.А. Орлова // Иммунопатология, аллергология, инфектология. – 2012. – №4. – С. 61-65. 12. Ащина, Л.А. Изучение влияния препарата Габриглобин на иммунокомпетентные клетки больных хронической аутоиммунной крапивницей в тесте ex vivo / Л.А. Ащина, Н.И. Баранова, Е.А. Орлова, В.А. Алешкин, Л.И. Новикова, А.Г. Лютов // Врач-аспирант. – 2013. – №1.2. – Вып. 56. – С. 264-268. 13. Ащина, Л.А. Особенности иммунологических параметров у больных хронической аутоиммунной крапивницей / Л.А. Ащина, Б.А. Молотилов, Н.И. Баранова, Е.А. Орлова // Российский аллергологический журнал. – 2013. – №2, ч.2. – С. 336-337. 14. Ащина, Л.А. Изучение иммунологических показателей в патогенезе и оценка влияния препарата Габриглобин на резервные возможности иммунокомпетентных клеток у больных хронической аутоиммунной крапивницей (ХАК) / Л.А. Ащина, С.В. Коженкова, В.А. Алешкин, А.Г. Лютов, Л.И. Новикова // Российский иммунологический журнал. – 2013. – Т. 7 (16), №2-3. – С. 310. 15. Ащина, Л.А. Изучение иммунологических показателей у больных хронической аутоиммунной крапивницей (ХАК) с атопическим и неатопическим механизмом аллергических реакций / Л.А. Ащина, С.В. Коженкова, Н.И. Баранова // Сборник материалов XII Международной научно-практической телеконференции «Актуальные проблемы современной науки». – Томск, 2013. – Т. 2, №3. – С. 64-65. 16. Ащина, Л.А. Критерии отбора больных хронической аутоиммунной крапивницей (ХАК) при назначении терапии препаратом Габриглобин / Л.А. Ащина, С.В. Коженкова, Н.И. Баранова // Сборник материалов III Международной научнопрактической конференции «Современные проблемы отечественной медикобиологической и фармацевтической промышленности. Развитие инновационного и кадрового потенциала Пензенской области. – Пенза, 2013. – С. 96-100. 24 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВИГ внутривенный иммуноглобулин ИЛ интерлейкин ИФА иммуноферментный анализ ФГА фитогемагглютинин ХАК хроническая аутоиммунная крапивница ХИК хроническая идиопатическая крапивница ХК хроническая крапивница ЦИК циркулирующие иммунные комплексы CD кластер дифференцировки Ig иммуноглобулин IFN интерферон Th 1 Т-хелперы первого типа Th 2 T-хелперы второго типа Tr1 Т-регуляторные клетки
