Теоретическая оценка аналитических возможностей

Теоретическая оценка аналитических возможностей иммунохимических тест-систем
Д.В. Сотников, А.В. Жердев, Б.Б. Дзантиев
Институт биохимии им. А.Н. Баха, ФИЦ Биотехнологии РАН
Для создания высокоэффективных аналитических систем первоочередное значение
имеют вопросы о ключевых факторах, влияющих на параметры этих систем и о путях
достижения предельных аналитических характеристик. Целью настоящей работы является
создание математических моделей разрабатываемых систем, позволяющих ответить на
обозначенные вопросы.
Следует отметить, что характер зависимости между константой связывания
иммунохимической реакции и пределом обнаружения целевого антигена в различных
методах иммунодетекции существенным образом зависит от формата анализа.
Классификации форматов иммуноанализа крайне разнообразны.
Методы иммуноанализа можно разделить по структурам анализируемого антигена.
Тогда
первую
группу
составят
моновалентные
антигены,
способные
провзаимодействовать только с одной молекулой антитела, а ко второй группе можно
отнести поливалентные антигены, присоединяющие несколько молекул антитела.
Основными объектами первой группы являются низкомолекулярные соединения:
пестициды, антибиотики и т.п. В свою очередь аналитические системы с односайтным
связыванием можно разделить по местоположению метки – мечение антигена или
мечение антитела. Большие макромолекулы и даже целые клетки могут быть идеальными
объектами для схем анализа второй группы.
Для данных двух групп используются форматы иммуноанализа, подразделяемые на
конкурентные и неконкурентные. В первом случае регистрируется конкуренция между
антигеном в пробе и вторым антигенным препаратом, имеющимся в системе, за
связывание с антителами, с последующей регистрацией образовавшихся на носителе
иммунных комплексов. Во втором случае детектируется непосредственно процесс
иммунного комплексообразования, как это происходит, например, в сэндвич формате
анализа с формированием комплексов антитело – антиген – меченые антитела.
Для всех аналитических схем, описанных выше, можно также провести разделение
на две большие группы – по способу введения метки; прямое введение через химическую
ковалентную связь с антителом или антигеном, или косвенное – когда метка вводится
отдельной стадией анализа через взаимодействие специфических антител с
антивидовыми, или же через использование модуля авидин-биотин. Для регистрации
метки возможны две стратегии, подразделяющие каждый из рассмотренных выше
подходов на два класса: либо гетерогенное измерение метки, иммобилизованной на фазе в
составе специфического комплекса, или гомогенное измерение несвязавшейся метки.
Данная классификация позволяет выделить 24 потенциально реализуемых формата
гетерогенного иммуноанализа, описываемых по единой схеме.
Следует отметить, тем не менее, что использование двухсайтного неконкурентного
анализа обеспечивает существенные преимущества в иммунохроматографии, поскольку в
данном случае различение между положительной пробой с малым содержанием антигена
и отрицательной основывается на наличии или отсутствии окраски (формировании
комплекса антитело-антиген-антитело-маркер), а не на относительной убыли сигнала, как
в случае конкурентного анализа.
*
* *
Традиционно отмечаемое достоинство антител – высокая аффинность
комплексообразования с соответствующими антигенами, определяющая возможность
выявления антигенов в крайне низких концентрациях. Однако аффинность иммунных
1
комплексов ограничена природой индукции иммунного ответа, что потенциально
накладывает ограничения и на предел детекции иммуноаналитических систем.
Максимальная константа скорости ассоциации (ka) для взаимодействия антител с
белковыми антигенами определяется скоростью диффузии белковых молекул в растворе и
составляет порядка 106 М–1с–1 [1]. Константа скорости диссоциации комплекса (kd) может
возрастать за счет отбора антител in vivo [2, 3], но лишь до определенного предела.
Согласно гипотезе «affinity ceiling» [3-5], для клонов, секретирующих высокоаффинные
антитела, их дальнейший отбор под действием антигена происходит менее эффективно.
Это связано с тем, что для антител с kd = 10–4 с–1 время полужизни комплекса антигена с
B-клеточным рецептором составляет 30 мин и становится в несколько раз больше, чем
время эндоцитоза комплекса антитела с B-клеточным рецептором (около 8,5 мин).
Дальнейшее увеличение времени полужизни комплекса уже не способствует
пролиферации B-клеток. В связи с этим при вторичном иммунном ответе для антител
класса IgG, специфичных к белковым антигенам, характерны значения равновесной
константы ассоциации в диапазоне 107–1010 М–1.
Следует отметить, однако, что описанные выше ограничения для механизма отбора
высокоаффинных клонов не исключают возможности того, что для некоторых антигенов
достигается существенно более высокая степень комплементарности с антигенсвязывающим сайтом антитела и, соответственно, более высокая константа связывания.
Недиссоциирующие комплексы антиген-антитело с бесконечной аффинностью описаны в
работе [6]. Аналогичные эффекты описаны для взаимодействия между антигеном и
комплексом антитело – ион металла [7].
В 1986 г. Jackson и Ekins [8] провели теоретическое сопоставление неконкурентного
и конкурентного иммуноанализа. Были установлены теоретические пределы детекции
этих методов, их связь с характеристиками антител.
Для неконкурентного анализа потенциально возможно выявление очень малых
концентраций антигена, если это позволяет чувствительность детекции метки или прямого
выявления иммунного комплекса, а также низкий фоновый сигнал. Существует ряд работ,
описывающих возможность выявления с помощью тех или иных средств усиления
сигнала единичных молекул антигена. Для усиления сигнала в таких
иммуноаналитических системах эффективно используются металлические наночастицы, а
также формирование многослойных комплексов с участием антител и аптамеров.
Несмотря на появление новых методических решений, позволяющих достоверно
детектировать в иммуноанализе крайне малое чисто образующихся иммунных комплексов
(единичные взаимодействия), они обычно требуют сложной процедуры проведения
анализа и привлечения дополнительного специального оборудования. Поэтому для
высокочувствительного иммуноанализа, ориентированного на широкое использование,
по-прежнему актуальны рекомендации Jackson и Ekins [8] и необходим поиск (или
специальное получение) антител с максимальной аффинностью. Очевидно, что предел
детекции аналита в сложном матриксе всегда будет хуже теоретически возможного, т.к.
необходима не только регистрация некоторого сигнала, но и подтверждение его отличия
от уровня неспецифического взаимодействия в аналитической системе. Поэтому при
рассмотрении рекордных результатов важное значение имеет оценка точности и
воспроизводимости детекции нескольких молекул аналита в реакционной среде.
С целью повышения чувствительности определения используют приемы,
увеличивающие величину аналитического сигнала, например за счет модификации
реагентов (вторичные антитела, металлические коллоидные частицы, полимерные
наночастицы, липосомы), что значительно увеличивает размер и массу адсорбируемых
молекул. Такие способы выделены в самостоятельный вид анализа (“mass amplified assay”
– анализ с усилением сигнала).
При применении соответствующих вторичных, или антивидовых антител,
взаимодействующих с антителами иммунного комплекса как с антигенами, на которые
2
они получены, наблюдается увеличение аналитического сигнала. Поскольку масса
вторичных антител не превышает 150 кДа, то происходит снижение предела обнаружения
соединений только на порядок. Анализ выполняют в две стадии. На первой стадии
происходит связывание иммобилизованного антигена с определяемыми антителами
(специфичными и неспецифичными). На второй стадии вводят вторичные антитела,
которые присоединяются только к специфичным антителам. Более значительное
снижение предела обнаружения аналитов отмечается при модифицировании антител
коллоидными частицами золота, свинца, сульфидов кадмия или цинка, оксидов хрома,
титана, железа, а также сложными частицами на основе латекса или липосомами. Таким
образом, применяя для усиления сигнала наночастицы различной массы, можно влиять на
предел обнаружения аналитов в пробе. Однако при выборе наночастиц для модификации
антител необходимо исключить неспецифические взаимодействия с компонентами пробы,
приводящими к снижению чувствительности и искажению результатов анализа.
Выбор формата анализа должен производиться с учетом диапазона концентраций
определяемого соединения, контроль которых имеет практическое значение. В целом
схемы с мечением антигена обеспечивают более низкий предел обнаружения (в
равновесном режиме анализа), но их применимость ограничивает влияние матрикса
пробы на результаты измерений. В неравновесном режиме оправданным представляется
мечение антител, в том числе макроносителями, увеличивающими амплитуду сигнала.
Данный подход определяет целесообразность разработки в рамках проекта экспрессных
тестов, к которым, в частности, относятся иммунохроматографические. Однако следует
иметь в виду, что реализация аналитических возможностей этих методов достижима лишь
при выполнении требований к оптимальному составу конъюгатов и структуре
усиливающего маркера, обеспечивающих максимальное снижение предела обнаружения
аналита.
Основные параметры, характеризующие иммуноаналитические системы, – это
предел обнаружения, чувствительность и время анализа [9, 10]. Поскольку в любом
формате иммуноанализа тем или иным способом детектируется количество
образовавшихся комплексов антиген–антитело, количественные характеристики этой
реакции (равновесные и кинетические константы) непосредственно влияют на параметры
анализа. В работах [11-12] отмечалось, что двумя факторами, лимитирующими предел
обнаружения иммуноанализа, являются величина экспериментальных ошибок и физикохимические параметры (аффинность) взаимодействия антиген–антитело. Потенциально
для аналитических методов с прямой зависимостью между концентрацией определяемого
аналита и величиной детектируемого сигнала предел обнаружения может быть уменьшен
на несколько порядков при уменьшении неспецифического сигнала. С другой стороны,
«визуализирующие» особенности метки определяют амплитуду сигнала в иммуноанализе
и также существенно влияют на предел обнаружения.
Количество публикаций, в которых представлены экспериментально или
теоретически установленные корреляции между характеристиками иммунохимического
взаимодействия (KD, ka, kd) и параметрами иммуноанализа, крайне ограничено. Rodbard и
Lewald [13] предложили первый алгоритм для описания радиоиммуноанализа и
построения линейных градуировочных зависимостей с целью предсказания пределов
обнаружения. Первая теоретическая модель, основанная на законе действующих масс,
была предложена для радиоммуноанализа в [14]. Авторы получили зависимость (1):
(1)
где С – концентрация антигена, не меченного изотопом; К – аффинность антител; [Ag*] –
начальная концентрация антигена, меченного изотопом; b0 – отношение концентрации
образовавшегося комплекса антиген–антитело к общей концентрации антигена в
3
отсутствии немеченого антигена; bс – то же отношение в присутствии немеченого
антигена.
В рамках этой модели параметр bс, учитывающий статистическую достоверность
измерений, является определяющим для величины предела обнаружения (2):
(2)
где t – критерий Стьюдента; s – стандартное отклонение по параметру b0; n – количество
измерений для одной концентрации антигена; n0 – количество определений параметра b0.
Предел обнаружения (CDL) иммуноаналитической системы вычисляется по
формуле (3):
(3)
Данная величина соответствует оптимальным условиям и показывает, как их
нужно изменять для достижения минимального значения предела обнаружения.
Например, при работе с высокоаффинными антителами количество меченого антигена
следует уменьшить. Если же аффинность < 1010 М-1, количество меченого антигена
рекомендуется увеличить, тем самым снизив ошибку случайных подсчетов.
В дальнейшем корреляцию между характеристиками иммунохимического
взаимодействия и иммуноанализа характеризовали для радиоиммуноанализа [15],
иммунного капиллярного электрофореза [16], ИФА [17], ИХА [18-21].
Известно, что в ИФА требуется значительное количество дополнительных
экспериментов, чтобы оптимизировать время анализа и концентрации антител [22-25].
Использование современных схем оптимизации, например, «Doehlert matrix» [26] или
«Box-Behnken design» [27], снижает трудоемкость этих исследований, однако не
предоставляет возможности априорной оценки предела обнаружения.
D.H. Choi и соавт. для предсказания параметров конкурентного ИФА (предела
обнаружения и рабочего диапазона) комбинировали кинетические и математические
модели, предложенные в работе [28], в которой для построения теоретической
градуировочной кривой использовали данные об изменениях концентраций комплексов
антиген – антитело и антитело – меченый антиген, определяемых с помощью
дифференциального уравнения по методу Рунге-Кутта. Выбор антител для конкурентного
ИФА, обеспечивающих низкий порог обнаружения и широкий рабочий диапазон, в
большинстве случаев основывают на афффинности. Однако антитела с высокой
аффинностью не всегда оптимальны. КА характеризует связывание в равновесном режиме,
но реакция антиген–антитело в ходе анализа не всегда достигает равновесия. Поэтому ka
становится более важной характеристикой, чем КА, при использовании реакций антигенантитело в аналитических схемах, ограниченных по времени [26, 29-32].
Модель Hayashi и соавт. [28] учитывает относительные стандартные отклонения
(ρТ) по следующим параметрам: ошибки пипетирования антигена (ρA), конъюгата антиген–
фермент (ρG), антитела (ρB) субстрата для фермента (ρS) и отличия в поглощении между
разными лунки микропланшета (σW) :
(4),
где А – концентрация аналита, G – IC50.
4
Данная модель позволяет, исходя из кинетических характеристик антител,
наблюдаемых в анализе, установить оптимальные условия проведения конкурентного
ИФА.
Рассмотрим подробнее теоретические модели, описывающие взаимодействия в
системах ИХА [18-20].
В работе [19] рассматривается модель «сэндвич»-формата ИХА, что представляет
особый интерес при разработке тест-систем для детекции вирусов растений. Эта модель
опирается на следующие положения:
– антитела (Ri) иммобилизованы на мембране на известном расстоянии (в
аналитической зоне);
– при прохождении жидкости через аналитическую зону с антителами могут
взаимодействовать как свободный антиген (Аi), так и антиген в комплексе с
конъюгатом (PAi).
Концентрация конъюгата (P), а значит, и детектируемой метки при расчетах
определяется как функция местоположения. Когда аналит присутствует в растворе,
концентрация конъюгата в определяемой зоне и, соответственно, детектируемый сигнал
будут выше. Однако величина сигнала не всегда пропорциональна концентрации аналита.
Авторы, исходя из четырех иммунохимических реакций:
Ai + P ↔ PAi;
Ai + R ↔ RAi;
PAi + R ↔ RPAi;
P +RAi ↔ RPAi.
приходят к итоговым уравнениям (5) и (6), в которых порядковый номер кинетических
констант соответствует номеру реакции, индекс e – равновесным концентрациям
(5)
(6)
Уравнение (7) учитывает уровень фона, величина DS («индекс контраста») –
отношение сигнала в аналитической зоне к фоновому сигналу.
(7)
Если концентрация аналита в пробе низкая, то уровень сигнала изменяется
практически линейно относительно изменения концентрации аналита. Однако при
высоких концентрациях аналита наблюдается иная зависимость – как только
концентрация аналита превышает определенный порог, сигнал уменьшается. Этот порог
определяется количеством иммобилизованных на мембране антител, концентрацией
конъюгата и константами реакций взаимодействия. Нетривиальным выводом из анализа
модели является также существование критической концентрации конъюгата с меткой,
ниже которой рост концентрации увеличивает сигнал без отрицательного воздействия на
«индекс контраста», а выше – при стабилизировавшейся амплитуде сигнала растет только
фоновый сигнал. Модель рекомендует устанавливать концентрацию иммобилизованных
антител таким образом, чтобы значения сигнала и DS были максимальны. Анализ модели
свидетельствует также о том, что взаимодействие между аналитом и конъюгатом до
момента входа в мембрану почти не влияет на амплитуду сигнала. В [19] отмечено, что
установленные теоретические закономерности согласуются с экспериментальными
5
результатами работ [33, 34], в которых в качестве метки использовали люминесцирующие
фосфорные наночастицы.
В равновесных условиях параметр предела обнаружения метода зависит главным
образом от равновесной константы связывания Аг-Ат. Равновесные константы иммунного
взаимодействия могут быть определены на основании результатов ИФА по методике
Фрике (Friguet) по схеме, которая включает:
1. Инкубация антигена (С варьирует) с антителами (С постоянная) в растворе
(равновесный режим);
2. Взаимодействие непрореагировавших антител с иммобилизованным антигеном (С
постоянная) (кинетический режим, без смещения равновесия первой стадии);
3. Регистрация комплексов на фазе с помощью меченых антивидовых антител (С
постоянная) (равновесный режим);
4. Линеаризация зависимости от содержания антигена и расчет констант.
На графике зависимости количества образовавшегося комплекса аналита (Аi) с
лигандом (Li) от количества аналита тангенс угла наклона касательной в любой точке
графика дает равновесную константу ассоциации (рис. 1).
Рис. 1. Определение равновесных констант ассоциации Аг-Ат по методу Фрике. Тангенс
угла наклона касательной равен равновесной константе ассоциации.
Эти же авторы (S. Qian и H.H. Bau) предложили математические модели для
описания конкурентного формата ИХА [20]. Модели были разработаны для двух случаев.
(I) Аналит (Аi) связывается как с иммобилизованным на мембрану антителом (RT),
так и с меченым конъюгатом (P). Чем больше аналита, тем меньше свободных центров
связывания на мембране для конъюгата и тем меньше уровень сигнала (8, 9).
(8)
(9)
где индекс 0 соответствует равновесной концентрации реагентов.
6
(II) Аналит (Аi) связывается только с меченым конъюгатом (P), но при этом
препятствует взаимодействию P c иммобилизованными на мембрану антителами (RT). Чем
больше аналита, тем меньше P, способного связаться в аналитической зоне. (10, 11):
(10)
(11)
∆ST соответствует уровню сигнала в аналитической зоне. При концентрации
аналита меньше порогового уровня величина ∆ST мало изменяемая и описывается
уравнениями (8, 10). При концентрации аналита больше порогового значения ∆ST –
величина, обратно пропорциональная концентрации аналита (9, 11).
Модели представляют величину сигнала в аналитической и контрольной зонах как
функцию концентраций аналита и конъюгата, а также констант реакций взаимодействия.
Показано, что на качественном уровне модели согласуются с экспериментальными
наблюдениями [35, 36]. Однако количественное сопоставление теории и экспериментов
проведено не было из-за нехватки данных о константах взаимодействия всех
взаимодействующих компонентов.
Параметры гетерогенных взаимодействий в иммунохроматографическом анализе в
существенной степени зависят от свойств мембранных носителей, главным образом от их
сорбционной емкости, пористости и скорости движения латерального потока.
Кроме того, в зависимости от буфера нанесения (его ионной силы, рН) изменяется
площадь контакта иммобилизуемых соединений с мембраной, что влияет на ширину
формируемой зоны. Предел обнаружения антигена в «сэндвич»-ИХА тем ниже, чем уже
аналитическая зона (и, следовательно, концентрированнее сигнал).
Иммунохроматографическая тест-система характеризуется временем анализа,
порогом обнаружения, рабочим диапазоном, которые зависят от правильно подобранных
компонентов и протокола анализа. Оптимизация тест-систем заключается в определении
концентраций наносимых на мембраны реагентов, для которых обеспечивается
максимальная интенсивность окраски аналитической и контрольной зон и достигается
минимальный порог обнаружения антигена при отсутствии фонового окрашивания
мембраны. Кроме обеспечения минимального порога обнаружения и достоверности
результатов, важно, чтобы при переходе от «модельной» детекции очищенных растворов
антигена к анализу реальных матриксов не происходило критического изменения
характеристик тест-системы.
большинстве
классических
работ,
посвященных
рассмотрению
В
иммунохимических реакций в гетерогенных иммунохроматографических системах [37,
38], динамика процесса описывалась в рамках формально-кинетических подходов,
разработанных для взаимодействия в растворе. При этом возможности независимого
корректного определения всех параметров, необходимых для численного анализа
подобной модели, весьма ограничены, и вопрос об адекватности принимаемых
приближений фактически остается открытым.
Рассмотрение открытых гетерогенных систем с проточным перемещением
реагентов вызывает необходимость перехода к моделям более высокого уровня
сложности. Такие объекты были рассмотрены в ряде исследований [39, 40].
Предложенные авторами модели учитывают как геометрию реакционной системы, так и
влияние диффузионного транспорта на кинетику связывания растворенных лигандов с
поверхностными рецепторами. Кроме того, при моделировании гетерогенных систем
необходимо принимать во внимание эффекты локальной неоднородности – отличия
локальных участков связывания по пористости, гидрофильности, сорбционной емкости и
др.
7
Принципиальной особенностью мембранных систем является отличие
иммунохимических свойств иммунореагентов в растворе и при иммобилизации. Перенос
«эффективных констант», определенных для одного из вариантов, в альтернативную
систему весьма условен, равно как и рассмотрение количества иммобилизованных
иммунореагентов в терминах объемной концентрации.
Распределенное в пространстве и времени формирование иммунных комплексов
разного состава в ходе иммунохроматографии не может быть описано стандартными
математическими моделями. Наиболее адекватным подходом для этих целей
представляется использование методов вычислительной потоковой динамики. В работе
[39] для описания формирования иммунных комплексов в аналитической и контрольной
зонах тест-полосок была предложена модель, учитывающая диффузию в порах проточная
модель в сочетании с системой дифференциальных уравнений, отражающих
взаимодействие в растворе. Модель рассматривает поток как двухфазную смесь: жидкая
фаза, которая частично или полностью заполняет поры, и воздух, занимающий оставшееся
пространство. Чтобы избежать необходимости рассматривать ряд систем уравнений,
необходимо выбрать объемно-усредненное фазовое уравнение, которое отражает вклад
каждой фазы. Авторы работы предположили, что поток двухмерный и потери реагентов с
поверхности мембраны за счет испарения не происходит. С учетом усредненного объема
плотность потока может быть представлена константой, а рассеянием, обусловленным
вязкостью, можно пренебречь. Транспорт реагентов рассматривался как диффузия через
«пустые» поры под действием градиента концентраций, что соответствовало практике
предыдущих исследований ([40] – анализ переноса влаги в почве и древесине). Положение
фронта жидкости пропорционально диффузионной константе, которая зависит от размера
пор, вязкости и поверхностного натяжения. Численные модели были разработаны для
моделирования потоков различных реагентов (воды, коллоидного золота в воде,
конъюгата коллоидного золота с БСА в воде) на мембранах Millipore и Schleicher& Schuell
с разным размером пор (от 4 до 20 мкм). Модели были использованы для изучения
влияния пористости мембран и положения линий связывания на интенсивность линии (т.е.
на количество формирующихся иммунных комплексов).
Результаты экспериментального и теоретического изучения [39] четко показывают,
что скорость потока падает с удалением от стартовой линии, т.е. ее положение заметно
влияет на чувствительность анализа. Скорость потока умеренно возрастает с увеличением
размера пор. Это уменьшает время инкубации и, соответственно, амплитуду сигнала,
получаемого на линии связывания. Таким образом, на чувствительность теста влияют
время, концентрации реагентов, размер пор и положение тестовой и контрольной зон.
Интенсивность излучения линий возрастает с уменьшением размера пор и расстояния от
стартовой линии до зоны с иммобилизованными реагентами. Данная работа
свидетельствует
о
применимости
мультипараметрического
вычислительного
моделирования для характеристики мембранных тест-систем.
Моделирование кинетики процессов образования иммунных комплексов,
протекающих на мембранах тест-полоски
Условные обозначения:
А – определяемое соединение (антиген или антитела);
Р – центры связывания определяемого соединения на частицах коллоидного
золота;
R – рецептор в аналитической зоне для связывания определяемого соединения;
AP – комплекс определяемого соединения с частицами коллоидного золота;
AR – комплекс определяемого соединения с рецептором в аналитической зоне;
APR – комплекс определяемого соединения с частицами коллоидного золота и
рецептором в аналитической зоне;
К – равновесная константа ассоциации;
ka – кинетическая константа ассоциации;
8
kd – кинетическая константа диссоциации.
При движении фронта жидкости через мембрану тест-полоски на первой стадии
происходит взаимодействие определяемого соединения с конъюгатом коллоидного
золота, которое выражается уравнением:
ka1
A+P
kd1
AP
(12)
где ka1 – кинетическая константа ассоциации, kd1 – кинетическая константа диссоциации.
После достижения фронтом жидкости аналитической зоны происходят реакции с
иммобилизованным в аналитической зоне рецептором, которые можно изобразить
схемами:
ka2
A+R
AP + R
P + AR
kd2
ka3
kd3
ka4
kd4
AR
(13)
APR
(14)
APR
(15)
Скорость реакции (1) выражается формулой:
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
ИФА
РИА
ИХА
АГ
АТ
DS
иммуноферментный анализ
радиоиммунный анализ
иммунохроматографический анализ
антиген
антитело
индекс контраста
9
(16)
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1
Schlosshauer M., Baker D. Realistic protein-protein association rates from a simple
diffusional model neglecting long-range interactions, free energy barriers, and landscape
ruggedness. Protein Sci. 2004. 13(6): p. 1660-1669.
2
Maynard J., Georgiou G. Antibody engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2000. 2: p.
339-376.
3
Foote J., Eisen H.N. Kinetic and affinity limits on antibodies produced during immune
responses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. 92: p. 1254-1256.
4
Batista F.D., Neuberger M.S. Affinity dependence of the B cell response to antigen: a
threshold, a ceiling, and the importance of off-rate. Immunity, 1998. 8: p. 751-759.
5
Cauerhff A., Goldbaum F.A., Braden B.C. Structural mechanism for affinity maturation
of an anti-lysozyme antibody. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. 101; p. 3539-3544.
6
Chmura A.J.; Orton M.S.; Meares C.F. Antibodies with infinite affinity. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2001. 98(15): p. 8480-8484.
7
Trisler K., Looger L.L., Sharma V. A metalloantibody that irreversibly binds a protein
antigen. J. Biol. Chem. 2007. 282(36): p. 26344-26353.
8
Jackson T.M., Ekins R.P. Theoretical limitations on immunoassay sensitivity: Current
practice and potential advantages of fluorescent Eu3+ chelates as non-radioisotopic tracers. J.
Immunol. Methods. 1986. 87(1): p. 13-20.
9
Wild D., ed. The immunoassay handbook. 2005. Kidlington, UK: Elsevier Ltd. 930 p.
10
Emon J.M.V., ed. Immunoassay and other bioanalytical techniques. 2007. CRC Press,
Taylor & Francis. 512 p.
11
Schuurman H.J., De Ligny C.L. Physical models of radioimmunoassay applied to the
calculation of the detection limit. Anal. Chem. 1979. 51(1): p. 2-7.
12
Hemmilä I., Dakubu S., Mukkala V.-M., Siitari H., Lövgren T. Europium as a label in
time-resolved immunofluorometric assays. Anal. Biochem. 1984. 137(2); p. 335-343.
13
Rodbard D., Lewald J.E. Computer analysis of radioligand assay and radioimmunoassay
data // Acta Endocrinol. Suppl. (Copenh.), 1970. 147: p. 79-103.
14
Ezan E., Tiberghien C., Dray F. Practical methods for optimizing radioimmunoassay
detection and precision limit. Clin. Chem. 1991. 37(2): p. 226-230.
15
O'Connor T., Gosling J.P. The dependence of radioimmunoassay detection limits on
antibody affinity. J. Immunol. Methods. 1997. 208(2): p. 181-189.
16
Taylor J., Picelli G., Harrison D.J. An evaluation of the detection limits possible for
competitive capillary electrophoretic immunoassays. Electrophoresis. 2001. 22(17): p. 36993708.
17
Choi D.H., Katakura Y., Matsuda R., Hayashi Y., Ninomiya K., Shioya S. Simulation
model for predicting limit of detection and range of quantitation of competitive enzyme-linked
immunosorbent assay. J. Biosci. Bioeng. 2007. 103(5): p. 427-431.
18
Ahmad A.L., Low S.C., Shukor S.R.A., Fernando W.J.N., Ismail A. Hindered diffusion
in lateral flow nitrocellulose membrane: Experimental and modeling studies. J. Membrane Sci.
2010. 357(1-2): p. 178-184.
19
Qian S., Bau H.H. A mathematical model of lateral flow bio-reactions applied to
sandwich assays. Anal. Biochem. 2003. 322(1): p. 89-98.
20
Qian S.Z., Bau H.H. Analysis of lateral flow bio-detectors: competitive format. Anal.
Biochem. 2004. 326(2): p. 211-224.
21
Karpinski K.F. Optimality assessment in the enzyme-linked immunosorbent assay
(ELISA). Biometrics. 1990. 46(2): p. 381-390.
22
Sitta Sittampalam G., Smith W.C., Miyakawa T.W., Smith D.R., McMorris C.
Application of experimental design techniques to optimize a competitive ELISA. J. Immunol.
Methods. 1996. 190(2): p. 151-161.
10
23
Niewola Z., Hayward C., Symington B.A., Robson R.T. Quantitative estimation of
paraquat by an enzyme linked immunosorbent assay using a monoclonal antibody. Clin. Chim.
Acta. 1985. 148(2): p. 149-156.
24
Butler J.E., Ni L., Nessler R., Joshi K.S., Suter M., Rosenberg B., Chang J., Brown W.R.,
Cantarero L.A. The physical and functional behavior of capture antibodies adsorbed on
polystyrene. J. Immunol. Methods. 1992. 150(1-2): p. 77-90.
25
Fjeld J.G., Skretting A. Evaluation of labelled monoclonal antibodies by simultaneous
estimation of the association constant, the immunoreactive fraction, and the number of effective
binding sites on the specific target. J. Immunol. Methods. 1992. 151(1-2): p. 97-106.
26
Ferreira S.L.C., dos Santos W.N.L., Quintella C.M., Neto B.B., Bosque-Sendra J.M.
Doehlert matrix: A chemometric tool for analytical chemistry. Review. Talanta. 2004. 63(4): p.
1061-1067.
27
Ferreira S.L.C., Bruns R.E., Ferreira H.S., Matos G.D., David J.M., Brandão G.C., da
Silva E.G.P., Portugal L.A., dos Reis P.S., Souza A.S., dos Santos W.N.L. Box-Behnken design:
An alternative for the optimization of analytical methods. Anal. Chim. Acta. 2007. 597(2): p.
179-186.
28
Hayashi Y., Matsuda R., Maitani T., Imai K., Nishimura W., Ito K., Maeda M., Precision,
limit of detection and range of quantitation in competitive ELISA. Anal. Chem., 2004. 76(5): p.
1295-1301.
29
Katakura Y., Zhuang G., Nakatani T., Furuta T., Omasa T., Kishimoto M., Suga K.-I.,
Shioya S. A practical kinetic model for efficient isolation of useful antibodies from phage
display libraries. J. Mol. Catalysis B: Enzym. 2004. 28(4-6): p. 191-200.
30
Hoylaerts M.F., Bollen A., De Broe M.E. The application of enzyme kinetics to the
determination of dissociation constants for antigen-antibody interactions in solution. J. Immunol.
Methods. 1990. 126(2): p. 253-261.
31
Hardy F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.E. Measurement of antibody/antigen
association rate constants in solution by a method based on the enzyme-linked immunosorbent
assay. J. Immunol. Methods. 1997. 200(1-2): p. 155-159.
32
Liliom K., Orosz F., Horváth L., Ovádi J. Quantitative evaluation of indirect ELISA.
Effect of calmodulin antagonists on antibody binding to calmodulin. J. Immunol. Methods. 1991.
143(1): p. 119-125.
33
Corstjens P.L., Zuiderwijk M., Nilsson M., Feindt H., Sam Niedbala R., Tanke H.
Lateral-flow and up-converting phosphor reporters to detect single-stranded nucleic acids in a
sandwich-hybridization assay. Anal. Biochem. 2003. 312(2): p.191-200.
34
Hampl J., Hall M., Mufti N.A., Yao Y.-M.M., MacQueen D.B., Wright W.H., Cooper
D.E. Upconverting phosphor reporters in immunochromatographic assays. Anal. Biochem. 2001.
288(2): p. 176-187.
35
Bell G.I., DeLisi C.P. Antigen binding to receptors on immunocompetent cells. I. Simple
models and interpretation of experiments. Cell. Immunol. 1974. 10(3): p. 415-431.
36
Goldstein B., Dembo M. Approximating the effects of diffusion on reversible reactions at
the cell surface: ligand-receptor kinetics. Biophys. J. 1995. 68(4): p. 1222-1230.
37
Doktorov A.B., Kadetov A.A., Kipriyanov A.A. General kinetic laws of monomolecularbimolecular reaction A+B=C in solutions. J. Chem. Phys. 2004. 120(18): p. 8662-8670.
38
Goldstein B., Wiegel F.W. The effect of receptor clustering on diffusion-limited forward
rate constants. Biophys. J. 1983. 43(1): p. 121-125.
39
Krishnamoorthy S., Makhijani V.B., Lei M., Giridharan M.G., Tisone T. Computational
studies of membrane-based test formats. In Technical Proceedings of MSM 2000. 2000. Applied
Computational Research Society, Cambridge, MA.
40
Berger D., Pei D.C.T. Drying of hygroscopic capillary porous solids. A theoretical
approach. Intern. J. Heat Mass Transfer. 1973. 16(2): p. 293-302.
11