Молкулярный анализ клональности лимфоцитов
advertisement
МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ КЛОНАЛЬНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ЛИМФОМАХ Качество диагностики новообразований лимфоидной ткани существенно улучшается проведением анализа клональности лимфоцитов. Из большого количества маркеров клональности предпочтительнее анализировать состав антигенных рецепторов В- и Т-лимфоцитов, который формируется на ранних стадиях их созревания. Результатом этого многоступенчатого процесса является рекомбинация генов, кодирующих цепи иммуноглобулинов (Ig) и Т-клеточных рецепторов (ТКР). На конечной стадии такой перестройки формируется фрагмент ДНК, уникальный по длине и последовательности для каждой клетки. Поскольку количество подобных комбинаций оценивается величиной порядка 1012, крайне маловероятно, что идентичные рецепторы появляются у клеток из независимых линий. Большая часть (>98%) злокачественных лимфом характеризуется наличием идентичных антигенраспознающих структур. Принимая во внимание, что все клетки лимфомы являются потомками одного предшественника, т.е. представляют собой клон, обнаружение клональности по результатам генной рекомбинации может улучшить диагностику лимфопролиферативных заболеваний. Рекомбинация генов Ig и ТКР Рекомбинация обычно начинается со случайного объединения сегментов из групп D и J с последующим присоединением одного V-сегмента в случае с генами тяжёлой цепи Ig (IGH), бета- (TCRB) и дельта- (TCRD) цепей ТКР. В случае генов легких цепей Ig (IGK, IGL), альфа- и гаммацепей ТКР (TCRA и TCRG) комбинируются по одному сегменту из V- и J-локусов. Промежуточные последовательности удаляются в виде кольцевой ДНК (рис. 1)1. Рекомбинация D → J Рекомбинация V → D-J стык D-J Комбинированные сегменты Локус β1 Транскрипция Незрелая мРНК стык V-D сплайсинг трансляция Рис. 1. Схематическое изображение последовательных рекомбинационных событий, транскрипции, сплайсинга и трансляции гена TCRB. На первом этапе комбинируются сегменты Dβ2 и Jβ2.3, после чего к продукту присоединяется локус Vβ4. Полученная ДНК транскрибируется в мРНК-предшественник, который после сплайсинга транслируется в полипептидную цепь TCRβ. Показаны также побочные продукты рекомбинации, которые впоследствии элиминируются - два внехромосомных кольцевых фрагмента TREC (TCR excision circle). Перестройка генных сегментов имеет иерархический характер. На первом этапе созревания В-лимфоцитов рекомбинации подвергаются гены IGH, затем IGK, результатом чего может быть экспрессия IGH/κ; либо происходит переключение на рекомбинацию IGL с последующей экспрессией IGH/λ2. Это подразумевает, что все IGH/λ+ В-клетки несут моно- или биаллельные делеции гена IGK, т.е. продукты экспрессии IGK не обнаруживаются. При дифференциации Т-клеток за рекомбинацией генов TCRD следует перестройка TCRG-генов, с последующей экспрессией рецепторов TCRγδ. Рекомбинация может продолжаться с генами TCRB, затем TCRA, при этом происходит делеция TCRD, и в итоге экспрессируется TCRαβ. Такая схема наблюдается в целом для всех гемобластозов, хотя отклонения от неё также встречаются, особенно в некоторых случаях острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ)3. На основании описанной выше схемы перестройки генных сегментов была предложена стратегия молекулярного анализа клональности с использованием ПЦР4. Схема модифицирована фирмой InVivoScribe, производящей тест-системы, разработанные на основе независимого межлабораторного исследования BIOMED-2/EuroClonality. Предполагаемая В-клеточная пролиферация Лимфома клеток из мантийной ткани Фолликулярная лимфома BCL-1, t (11; 14) BCL-2, t (14; 18) IGH (VH-JH) предпочтительнее совместно с IGK Предполагаемая лимфоидная пролиферация неопределенной природы (В или Т) Предполагаемая Т-клеточная пролиферация Незрелые Т-клетки Наличие клональности TCRB предпочтительнее совместно с TCRG Клональность не обнаружена, но не исключается IGH (DH-JH) предпочтительнее совместно с IGL Наличие клональности TCRG и TCRD Отсутствие клональности Доказательства клональности осутствуют (Диагноз должен быть поставлен с учётом всех клинических, гистологических и иммунофенотипических данных) EuroClonality предлагает следующий алгоритм выбора объекта для анализа. 1. При предполагаемом наличии В-клеточной клональности в первую очередь амплифицируют фрагменты трех рамок считывания (FR1-3) вариабельных регионов гена IGH V-J параллельно или с последующим анализом гена IGK. Несмотря на то, что последовательный анализ IGH и IGK является более экономичным, одновременная их амплификация экономит время. 2. Хотя в большинстве случаев (>95%) оценки результатов ПЦР для комбинации IGH V-J и IGK оказывается достаточно для обнаружения клональности, в некоторых случаях совместный анализ незавершенной рекомбинации IGH (D-J) и фрагментов IGL может оказаться полезным в качестве диагностики второго ряда. Его следует проводить в случаях серьезных подозрений на наличие В-клеточной клональности, не подтверждаемых тестированием IGH V-J и IGK. 3. Аналогично В-лимфоцитам предполагаемую клональность Т-клеток тестируют в первую очередь по генам TCRB и TCRG в параллели или последовательно. TCRG традиционно считается золотым стандартом в такого рода исследованиях, однако, EuroClonality считает первоочередной анализ TCRB не менее информативным. 4. TCRD (обычно совместно с TCRG) следует использовать в качестве объекта только в случае ясно сформулированного клинического запроса, т.е. предполагаемой пролиферации TCRγδ или незрелых (лимфобластных) T-клеток. В прочих случаях анализ TCRD сложен для интерпретации, поскольку продукты рекомбинации этого гена элиминируются в клеточной линии TCRαβ при перестройках в локусе TCRA. В итоге недостаток матриц TCRD приводит к неспецифической амплификации и детектированию псевдоклональности (поэтому важно проводить ПЦР в повторностях, поскольку такие результаты, как правило, не воспроизводятся). Кроме того, даже аутентичные клональные перестройки TCRD не обязательно свидетельствуют о злокачественной лимфопролиферации (инфекция, воспаление). В 5-15% случаев постановка окончательного диагноза злокачественной опухоли лимфоидной ткани вызывает затруднения, несмотря на всестороннее иммунофенотипирование. Поэтому дополнительное молекулярное исследование клональности является существенным подспорьем при постановке или подтверждении диагноза, например, в следующих случаях: • предполагаемая злокачественная пролиферация В-клеток с неясными результатами иммунофенотипического и мофологического анализа • все случаи предполагаемой злокачественной пролиферации Т-клеток (возможны проблемы с интерпретацией В-клеточных неходжкинских лимфом, обогащённых Т-клетками) • лимфопролиферация у иммунодефицитных пациентов, в том числе после трансплантации • оценка родства двух лимфоидных новообразований у одного пациента или дифференциация между рецидивом и вторичной опухолью • более глубокая классификация опухоли, например, на основе рекомбинационной модели Ig/ТКР или хромосомных аберраций • в некоторых случаях определение стадии заболевания1. Использование ПЦР для исследования клональности заменяет Саузерн-блоттинг в качестве золотого стандарта, поскольку имеет следующие преимущества: • скорость анализа • небольшое количество стартового материала (ДНК) для исследования • возможность использования для анализа препарата ДНК низкого качества (в том числе из парафиновых блоков) • более высокая чувствительность (1-5% моноклональных лимфоцитов на фоне поликлональной популяции)4,5. В качестве материала для выделения ДНК используют: • 5 мл периферической крови, биопсии или аспирата костного мозга в присутствии антикоагулянтов (ЭДТА или гепарина) • Фрагменты ткани (куб с размером ребер не менее 5 мм) в среде RPMI, замороженные, при комнатной температуре или на льду • 2 мкг геномной ДНК • Парафиновые блоки. На начальном этапе анализ ПЦР часто приводил к ложноотрицательным результатам, т.е. реакция не давала возможности детектировать все возможные перестройки генов. По большей части это было вызвано тем, что лаборатории использовали праймеры только к TCRG и завершенной рекомбинации (V-J) генов тяжелой цепи Ig (IGH). В связи с возникшей необходимостью стандартизации аналитического этапа анализа группой лабораторий European BIOMED-2 (теперь консорциум EuroClonality) были проведены исследования, итогом которых был отбор наиболее эффективных наборов праймеров и условий реакции, позволяющих сравнивать результаты, полученные в разных лабораториях. Эти реагенты коммерчески доступны и предлагаются фирмой InVivoScribe (США). Тест-системы IVS используют мультиплексную ПЦР с праймерами к различным участкам последовательности генных сегментов Ig и ТКР (IGH, IGK, IGL, TCRG, TCRB, TCRD), детектируя и незавершенные перестройки (D-J) с максимальной чувствительностью 99% в случае B-клеточных лимфом и 94% - T-клеточных. Благодаря высоким результатам, неоднократно подтвержденным межлабораторными исследованиями, в том числе и за пределами консорциума6-9, мультиплексные тестсистемы IVS стали международным стандартом качества молекулярных исследований клональности лимфоцитов. Недавние рекомендации EuroClonality по оценке исходного материала на пре-аналитическом этапе, интерпретации результатов и стандартизации отчетов на постаналитической стадии10 служат дальнейшему повышению качества детекции лимфопролиферативных заболеваний. Наборы IdentiCloneTM производства IVS включают, как правило, несколько праймеров для амплификации различных локусов из областей V-, J- и D-генов. Например, в состав набора для определения клональной перестройки гена IGH входят более 20 праймеров для амплификации фрагментов трех рамок считывания вариабельных регионов гена IGH (V-J) и более 6 праймеров для изучения незавершенной рекомбинации (D-J). VH DH Праймеры к семейству генов VH JH Пробирка А: 6 праймеров VH-FR1 и консенсусный праймер JH Пробирка B: 7 праймеров VH-FR2 и консенсусный праймер JH Пробирка C: 7 праймеров VH-FR3 и консенсусный праймер JH Праймер к семейству генов JH DH JH Пробирка D: 6 праймеров DH и консенсусный праймер JH Пробирка E: праймер DH7 и консенсусный праймер JH DH3 DH1 DH2 DH5 DH4 D H6 DH7 Праймер к семейству генов JH Праймеры к семейству генов DH Ген тяжёлой цепи Ig на хромосоме 14 после рекомбинации. Черными стрелками обозначено относительное расположение праймеров к консервативным фрагментам рамок считывания FR1-3 вариабельных генных сегментов VH, соединительным (J) и D-сегментам. Для мечения праймеров используются различные флуорофоры, позволяющие дифференциально детектировать ампликоны различных семейств методом капиллярного электрофореза. Для анализа электрофорезом в геле используются немеченые праймеры. Интенсивность флуоресценции При амплификации ДНК, выделенной из нормальной поликлональной популяции, размер фрагментов распределяется по Гауссу (колоколообразная кривая): наблюдается размытое пятно после электрофореза в геле, и сливающийся набор пиков при анализе капиллярным электрофорезом в пределах ожидаемого размера продуктов реакции. В случае злокачественной лимфопролиферации увеличивается доля потомков одной-двух переродившихся клеточных линий. При этом на электрофореграмме в ожидаемой области размеров появляются 1-2 чётких пика (в случае гетеродуплексного анализа в геле количество полос для клонального образца может быть больше в связи с формированием не только гомо-, но и гетеродуплексов)10: 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Мультиплексная ПЦР, TCRG, пробирка А. Капиллярным электрофорезом детектируются два клональных пика (биаллельная рекомбинация). Гетеродуплексный анализ с форезом в геле: 4 полосы – два гомодуплекса (~144 и ~216 по) и два варианта гетеродуплексов 144 по 216 по 216 по 144 по Размер фрагмента, пары нуклеотидов, по Ниже приведены варианты профилей, полученных после проведения ПЦР с мультиплексной амплификационной смесью для локуса VH-FR1 IGH (пробирка А) (из статьи 10). 8000 2012-035 Клональность 2012-116 2000 Множественные продукты (воспроизводимые результаты) Интенсивность флуоресценции 6000 4000 1000 QC2012-3 300 Поликлональность 200 100 2000 0 0 2000 0 1200 2012-055 Клональный пик на поликлональном фоне 2012-034 300 Множественные продукты (воспроизводимые результаты) повторный анализ 800 Поликлональность, иррегулярное распределение 200 1000 400 0 100 0 0 230 270 310 350 Размер фрагмента, пары нуклеотидов, по 390 230 270 310 350 Размер фрагмента, пары нуклеотидов, по 390 230 270 310 350 Размер фрагмента, пары нуклеотидов, по 390 Информация для заказа Кат. № 91000010 91000031 91000020 91000041 91010020 91010061 91010040 91010081 91020020 91020021 91020030 91020031 91030010 91030011 91030020 91030021 92000010 92000011 92000020 92000021 92050010 92050011 92050020 92050021 92060010 92060011 92060020 92060021 92070020 92070021 92070040 92070041 93080010 93080020 93090020 93090040 92070101 92070111 51010030 51010031 51010040 51010041 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Наименование Набор для определения клональности В-лимфоцитов IGH+IGK, анализ с использованием гель-электрофореза, 33 р-ции Набор для определения клональности В-лимфоцитов IGH+IGK, Флуоресцентный анализ на анализаторе ABI, 33 р-ции Набор для определения клональности В-лимфоцитов IGH+IGK, Мега, анализ с использованием гель-электрофореза, 330 р-ций Набор для определения клональности В-лимфоцитов IGH+IGK, Мега, флуоресцентный анализ на анализаторе ABI, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена IGH методом гель-электрофореза, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена IGH методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена IGH, Мега, методом гель-электрофореза, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена IGH, Мега, методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена IGK методом гель-электрофореза, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена IGK методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена IGK, Мега, методом гель-электрофореза, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена IGK, Мега, методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена IGL методом гель-электрофореза, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена IGL методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена IGL, Мега, методом гель-электрофореза, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена IGL, Мега, методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 330 р-ций Набор для определения перестройки генов Т-клеточного рецептора TCRB+TCRG методом гель-электрофореза , 33 р-ции Набор для определения перестройки генов Т-клеточного рецептора TCRB+TCRG методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 33 р-ции Набор для определения перестройки генов Т-клеточного рецептора TCRB+TCRG, Мега, методом гель-электрофореза, 330 р-ций Набор для определения перестройки генов Т-клеточного рецептора TCRB+TCRG, Мега, методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена TCRB методом гель-электрофореза, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена TCRB методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена TCRB, Мега, методом гель-электрофореза, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена TCRB, Мега, методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена TCRD методом гель-электрофореза, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена TCRD методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена TCRD, Мега, методом гель-электрофореза, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена TCRD, Мега, методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена TCRG методом гель-электрофореза, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена TCRG методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 33 р-ции Набор для определения клональной перестройки гена TCRG, Мега, методом гель-электрофореза, 330 р-ций Набор для определения клональной перестройки гена TCRG, Мега, методом флуоресцентного анализа на приборе ABI, 330 р-ций Набор для детекции транслокаций BCL1/JH, анализ с использованием геля, 33 р-ции Набор для детекции транслокаций BCL1/JH, Мега, анализ с использованием геля, 330 р-ций Набор для детекции транслокаций BCL2/JH, анализ с использованием гель-электрофореза, 33 р-ции Набор для детекции транслокаций BCL2/JH, Мега, анализ с использованием гель-электрофореза, 330 р-ций Набор для определения перестройки гена Т-клеточного гамма-рецептора, версия 2.0, для флуоресцентного анализа на анализаторе ABI, 33 реакции Набор для определения перестройки гена Т-клеточного гамма-рецептора, версия 2.0, Мега, для флуоресцентного анализа на анализаторе ABI, 33 реакции Тест на соматические гипермутации IGH для оценки мутационного статуса и секвенирования генов, кодирующих тяжёлую цепь иммуноглобулинов, детекция электрофорезом в геле, 33 р-ции Тест на соматические гипермутации IGH для оценки мутационного статуса и секвенирования генов, кодирующих тяжёлую цепь иммуноглобулинов, детекция капиллярным электрофорезом ABI, 33 р-ции Тест на соматические гипермутации IGH для оценки мутационного статуса и секвенирования генов, кодирующих тяжёлую цепь иммуноглобулинов, детекция электрофорезом в геле, 330 р-ций Тест на соматические гипермутации IGH для оценки мутационного статуса и секвенирования генов, кодирующих тяжёлую цепь иммуноглобулинов, детекция капиллярным электрофорезом ABI, 330 р-ций van Dongen JJM, et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: Report of the BIOMED-2 concerted action BMH4-CT98-3936. Leukemia 17; 2257-2317, 2003. van Dongen JJM, Szczepanski T, Adriaansen HJ. Immunobiology of leukemia. In: Henderson ES, Lister TA, Greaves MF (eds) Leukemia. Philadelphia: WB Saunders Company, pp 85–129, 2002. Szczepanski T, et al. Unusual immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangement patterns in acute lymphoblastic leukemias. Curr Top Microbiol Immunol 246: 205– 215, 1999. van Krieken JHJM et al. Improved reliability of lymphoma diagnostics via PCR-based clonality testing:Report of the BIOMED-2 Concerted Action BHM4-CT98-3936. Leukemia 21; 201-206, 2007. Evans PAS et al. Significantly improved PCR-based clonality testing in B-cell malignancies by use of multiple immunoglobulin gene targets. Report of the BIOMED-2 Concerted Action BHM4-CT98-3936. Leukemia 21; 207-214, 2007. McClure RF et al. Validation of immunoglobulin gene rearrangement detection by PCR using commercially available BIOMED-2 primers. Leukemia 17; 2257-2317, 2003. HalldЧrsdЧttir AM et al. Application of BIOMED-2 clonality assays to formalin-ёxed parafёn embedded follicular lymphoma specimens: superior performance of the IGK assays compared to IGH for suboptimal specimens. Leuk Lymphoma 2007; 48: 1338–1343. Liu H et al. A practical strategy for the routine use of BIOMED-2 PCR assays for detection of B- andT-cell clonality in diagnostic haematopathology. Br J Haematol 2007; 138:31–43. Patel KP et al. Comparison of BIOMED-2 versus laboratory-developed polymerase chain reaction assays for detecting T-cell receptor-gamma gene rearrangements. J Mol Diagn 2010; 12:226–237. Langerak AW et al. EuroClonality/BIOMED-2 guidelines for interpretation and reporting of Ig/TCR clonality testing in suspected lymphoproliferations. Leukemia 26; 2159-2171, 2012. Группа компаний «БиоХимМак» 119991 Москва, Ленинские горы, МГУ. Тел.: (495) 939-2121, 647-2740, 932-9214 E-mail: info@biochemmack.ru, pcr@biochemmack.ru. www.biochemmack.ru
