Бондаренко Надежда Сергеевна ЗАЩИТНЫЕ ЭФФЕКТЫ
advertisement
На правах рукописи Бондаренко Надежда Сергеевна ЗАЩИТНЫЕ ЭФФЕКТЫ РЕГУЛЯТОРНОГО ПЕПТИДА ПРОЛИЛ – ГЛИЦИЛ – ПРОЛИНА (PGP) ПРИ ВОСПАЛЕНИИ 03.03.01 - физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва - 2012 Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский). НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Белла Анверовна Умарова доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Владимир Борисович Кошелев доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной и патологической физиологии ГУНИ ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова Надежда Норминовна Абушинова доктор биологических наук, профессор кафедры общей биологии и физиологии факультета педобразования и биологии Калмыцкого государственного университета ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Институт физиологически активных веществ РАН, г. Черноголовка Защита диссертации состоится 26 ноября 2012 года в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 501.001.93 при биологическом факультете Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, строение 12, аудитория М-1. С диссертацией можно ознакомиться в Фундаментальной библиотеке МГУ имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан 25 октября 2012 г. Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук О.П. Балезина 1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В основе развития ряда патологических состояний лежит нарушение регуляции и контроля адаптивных физиологических процессов. Воспаление - один из существенных компонентов большинства патологий. Весьма важным является понимание механизмов коррекции нарушенных функций организма и, прежде всего, участие в этом процессе эндогенных регуляторных систем. Проблема поиска новых лекарственных средств коррекции патологических нарушений, возникающих при воспалении, актуальна для исследований в области физиологии и медицины. Актуальность определяется как большой востребованностью таких средств, так и ограничением возможности применения многих известных на данный момент препаратов в связи с их побочными эффектами. Действие большинства применяемых в настоящее время лекарственных средств направлено на ликвидацию уже развившихся нарушений и значительно меньше таких, которые способны препятствовать их возникновению. В этом отношении перспективными могут быть эндогенные регуляторные пептиды семейства глипролинов, которые оказывают профилактическое и терапевтическое действие при различных патологических состояниях и в связи с этим могут рассматриваться как возможные агенты для коррекции нарушений, сопровождающих эти состояния. Глипролины представляют собой короткие ди- и трипептиды, содержащие аминокислоты глицин и пролин. Они образуются в организме при синтезе и расщеплении белков соединительной ткани, в частности, коллагена и эластина, а также могут поступать с пищей. К настоящему времени накоплено довольно много сведений о физиологических свойствах глипролинов. Исследования показали, что, не влияя на состояние организма в норме, глипролины проявляют свои регуляторные свойства при самых различных патологиях (Ашмарин и др., 1998; Astashkin et al., 2000; Жуйкова и др., 2002; Levitskaya et al., 2004; Себенцова и др., 2006; Романова и др., 2006; Storozhevykh et al., 2007; Дмитриева и др, 2008). Глипролины участвуют в поддержании гомеостаза слизистой оболочки желудка (Самонина и др., 2000), повышении антикоагулянтной и фибринолитической активности крови при венозном тромбозе (Lyapina et al., 2000), увеличении выживаемости клеток в условиях окислительного стресса (Safarova et al., 2003), снижают тонус кровеносных сосудов под действием норадреналина (Бакаева и др., 2003) и нормализуют стрессогенные нарушения поведения (Копылова и др., 2007). Вместе с тем, механизмы действия глипролинов не ясны, и крайне мало данных о возможных структурных и молекулярных мишенях их воздействия. Так, высказано предположение о возможном действии пептида через пост- и пресинаптические D2 и D3 рецепторы (Meshavkin et. al., 2011). Известно также, что ацетилированная по N-концу форма PGP может обладать свойствами хемоаттрактанта для нейтрофилов, связываясь с рецепторами CXCR2 (Pfister et al., 1995; Weathington et al., 2006; Gaggar et al., 2008; Kim et al., 2011). Большинство нарушений, в коррекции которых глипролины играют положительную роль, сопровождаются развитием воспалительной реакции, выражающейся в нарушениях общего гомеостаза организма и регуляции нормальных физиологических процессов на тканевом и клеточном уровнях. Поддержание гомеостаза организма в значительной мере обеспечивается взаимодействием нервной, иммунной и эндокринной систем. В регуляции баланса этого взаимодействия в норме, а также в поддержании и распространении процесса воспаления координирующая роль принадлежит тучным клеткам. Они секретируют широкий спектр биологически активных веществ, действие которых распространяется практически на все типы клеток и тканей (Puxeddu et al., 2003). Таким образом, в организме тучные клетки выполняют важнейшую регуляторную функцию, и поэтому понимание механизмов регуляции секреторной активности тучных клеток и возможность предотвращения их избыточной активации является крайне важным. В настоящее время в 2 терапии самых различных заболеваний, включая аллергические реакции, астму, сепсис, гипоксию, ишемию и др., всё чаще для ограничения секреторной активности тучных клеток и высвобождения гистамина используют препараты, стабилизирующие мембрану тучных клеток, и блокаторы Н1-рецепторов гистамина (Jin et al., 2009; Levi-Schaffer & Eliashar, 2009; Ramos et al., 2010). Ранее было показано, представители семейства глипролинов – пептид PGP и его метаболиты - могут оказывать протекторное действие при нарушениях функций различных систем организма, возникающих в ответ на стрессорные стимулы (Умарова и др. 2003; Копылова и др., 2007; Умарова и др., 2008). В настоящей работе мы изучали протекторные эффекты пептида PGP при воспалении. Цели и задачи исследования Цель работы - выявить противовоспалительные эффекты пептида PGP и изучить роль тучных клеток в их реализации. В соответствии с целью перед нами были поставлены задачи: • Исследовать влияние PGP на развитие локального отёка лапы, вызванного введением гистамина и каолина. • Исследовать действие PGP на секреторную активность тучных клеток и нарушения микроциркуляции при экспериментальном остром перитоните у крыс. • Изучить действие PGP на сократительную активность лимфатических сосудов брыжейки крыс при воспалении на фоне блокады тучных клеток и при их активации веществом 48/80. • Исследовать in vivo действие PGP на развитие анафилактоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80. • Исследовать in vitro действие PGP на секрецию бета-гексозаминидазы и гистамина перитонеальными тучными клетками крыс при их стимуляции активаторами различной природы. • Исследовать действие PGP на морфологические характеристики перитонеальных тучных клеток при их активации. • Исследовать влияние PGP на изменения концентрации кальция в цитоплазме тучных клеток при их активации. Научная новизна работы На моделях локального и системного воспаления впервые были выявлены защитные противовоспалительные эффекты регуляторного пептида PGP, которые проявляются как на тканевом уровне, препятствуя изменению проницаемости эндотелия кровеносных и нарушению сократительной активности лимфатических сосудов, так и на клеточном уровне, защищая эритроциты и тучные клетки от негативных воздействий в условиях воспаления. Впервые было показано, что трипептид PGP при анафилактоидных реакциях, вызванных введением экзогенного либератора гистамина - вещества 48/80, существенно снижает смертность экспериментальных животных и выраженность у них симптомов реакции. Впервые в работе было показано, что один из механизмов защитного действия PGP связан со стабилизацией тучных клеток. В опытах in vitro на очищенных перитонеальных тучных клетках крыс впервые было показано, что пептид препятствует секреции гистамина и β-гексозаминидазы при их активации эндогенным активатором аналогом АКТГ синактеном. Это подтвердилось результатами исследований морфологических параметров тучных клеток методом лазерной интерференционной микроскопии. Впервые было установлено, что морфологические характеристики предобработанных пептидом тучных клеток с последующей их активацией синактеном достоверно не отличались от параметров неактивированных клеток. 3 Впервые было установлено, что при активации тучных клеток синактеном и брадикинином предобработка клеток PGP препятствовала увеличению концентрации кальция в цитоплазме. Теоретическая и практическая значимость работы Результаты работы имеют как теоретическое, так и практическое значение. Полученные нами данные расширяют представления о возможных механизмах действия глипролинов. Способность типичного представителя семейства глипролинов - трипептида PGP - ограничивать секрецию провоспалительных медиаторов тучными клетками может быть одним из механизмов его защитного действия при патологиях с выраженным воспалительным компонентом. Наличие противовоспалительных свойств у PGP расширяет круг его регуляторных возможностей и может послужить дополнительным аргументом для обоснования применения глипролинов в практической медицине. Апробация материалов диссертации Основные результаты исследования были представлены в виде тезисов (6), стендовых сообщений (5) и устных докладов (5) на XV и XVI международной конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Россия, Москва, 2008 и 2009); Ежегодном съезде скандинавского физиологического общества (Финляндия, Оулу, 2008); 5ом международном симпозиуме по клеточным/тканевым повреждениям и цитопротекции/органопротекции (Украина, Крым, Ялта, 2008); Международной конференции «Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)» (Россия, Ярославль, 2009); IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Казань, 2009); Международной научной конференции (Беларусь, Минск, 2009); Научной конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов» (посвященная 85-летию со дня рождения академика РАМН И.П. Ашмарина) (Россия, Москва, 2010); ХХI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Россия, Калуга, 2010); 12-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2010» (Россия, Санкт-Петербург, 2010, 2 работы); Конференции молодых учёных «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (посвящённая 85-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН) (Россия, Санкт-Петербург, 2010); 5-ой Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно – сосудистой хирургии» (Россия, Москва, 2011); Научно-практической конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения» (Украина, Крым, Новый Свет, 2009 и 2011); V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Петрозаводск, 2011); Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Украина, Крым, Судак, 2012). Публикации По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа (в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ). Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 127 страницах и включает введение, обзор литературы, описание объектов и методов исследования, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (содержит 229 источников). Работа иллюстрирована 43 рисунками. 4 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использовали модели отёка лапы у крыс, вызванного подкожным введением гистамина и каолина, острого перитонита у крыс, вызванного внутрибрюшинным введением 40%-го раствора тиогликолата в дозе 4г/кг, и анафилактоидной реакции у мышей, вызванной веществом 48/80 (Kim SH et al., 2005; Li et al., 2005). Эксперименты проводили на самцах белых беспородных крыс (180-220г и 230-450г) и мышей (20-40г). Все эксперименты с животными выполняли в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларацией о гуманном отношении к животным. Выделение РНК и получение кДНК методом обратной транскрипции. Образцы для выделения РНК брали через 2 часа после индукции воспаления. Вырезанный образец сразу же помещали в раствор RNAlater. Выделение РНК из образцов тканей производили с использованием реактива TriReagent согласно протоколу производителя. Для получения одноцепочечных кДНК к 2 мкг тотальной РНК, предварительно обработанной ДНКазой I (1ед фермента на 1 мкг РНК), добавляли 80 пмоль random9 праймеров и инкубировали 5 мин при 70°С. В смесь на льду вносили 25 мкл «RT-MIX» (RTBuf 10x (Fermentas), 40 мМ дНТФ, 10 ед RNAsin (Promega) и инкубировали еще 5 мин при 37°С. После этого вносили 200 ед обратной транскриптазы M-MuLV и проводили реакцию при 42С в течение 1 ч. Реакцию останавливали прогреванием при 70С, 10 мин. Объем пробы доводили до 200 мкл деионизованной водой и хранили при -20°С. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени. ПЦР в реальном времени проводили с использованием амплификатора iCycler iQ5 (BioRad Laboratories GmbH, Германия). Матрицей для ПЦР служила кДНК. Реакционная смесь включала: 10 пмоль 5’ и 3’праймеров, 1.6 мМ MgCl2, 0.25 мкМ дНТФ, амплификационный буфер 10x с интеркалирующим флуоресцентным красителем Eva Green, 1 ед Taq-ДНК полимеразы. Реакционная смесь проходила предварительное прогревание в течение 10 мин при 95ºС и последующие 40 циклов денатурации (95ºС), отжига (60ºС) и полимеризации (72ºС) с детекцией количества накопленного продукта по спектру флуоресценции в конце стадии элонгации. Каждую реакцию проводили в трех повторах. В работе использовались следующие праймеры: COX-2 F–5’CCATGTCAAAACCGTGGTGAATG3’, COX-2 R5’ATGGGAGTTGGGCAGTCATCAG3’, GAPDH RN F5’CTGACATGCCGCCTGGAGAAA3’, GAPDH RN R5’TGGAAGAATGGGAGTTGCTGTTGA3’. Ген GAPDH, являющийся геном домашнего хозяйства, использовали в качестве референсного гена для выравнивания внесенного в реакцию количества транскриптов. Подбор праймеров осуществляли с помощью программы VectorNTI. Температуру отжига праймеров и количество циклов, при котором происходила амплификация каждого из фрагментов, подбирали экспериментально. Метод прижизненного исследования реактивности лимфатических сосудов брыжейки крыс (Сергеев, Лелекова, 2000). Животных наркотизировали уретаном (2,25 г/кг) и вскрывали брюшную полость, помещали на термостатируемый (37ºС) столик, извлечённую петлю кишечника с брыжейкой располагали на столике-световоде микроскопа. Изображение исследуемого участка брыжейки выводили на экран установки «Матрица» для визуального контроля. Оценивали параметры ответа лимфатических сосудов на аппликацию норадреналина (10-6М): латентный период, число и амплитуду сокращений на первой минуте ответа, длительность ответа, количество спонтанно активных сосудов, число и амплитуду их сокращений в минуту и др. 5 Определение проницаемости кровеносных сосудов желудка и тонкого кишечника. Раствор краски Evan’s blue (50 мг/кг) вводили в ярёмную вену. Через 15 мин животных наркотизировали, вскрывали и отбирали образцы экссудата. Животных транскардиально перфузировали в течение 2-3 мин раствором гепарина (20 ед/мл) в 0,85% NaCl. Образцы тканей желудка и тонкого кишечника измельчали, взвешивали, заливали формамидом и инкубировали 48 часов при 37˚С. Затем пробы центрифугировали 15 мин при 2000 об/мин. Количество экстрагированной краски определяли на спектрофотометре Multiscan EX (Thermo scientific) при λ=620 нм и выражали в мкг краски на грамм веса ткани. Количество краски в экссудате выражали в мкг/мл экссудата. Определение осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) методом Идельсона (Голубева, 2010). Кровь брали из яремной вены (консервант - 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1). Эритроциты вносили в пробирки с различной концентрацией NaCl (от 0,1 до 0,65%) Степень гемолиза эритроцитов при определенной концентрации NaCl рассчитывали как отношение оптической плотности исследуемого раствора к оптической плотности раствора при концентрации NaCl равной 0,1% (длина волны 540 нм) и выражали в процентах. Метод выделения перитонеальных тучных клеток крыс (Thon, Uvnas, 1967). Животных наркотизировали, декапитировали и обескровливали. Через надрез вводили в брюшную полость 10 мл Hepes-NaCl (рН=7,4) и массировали 1 мин. Перитонеальную жидкость собирали и центрифугировали 5 мин при 800 об/мин (4ºС). Супернатант удаляли, осадок суспендировали в 2 мл Hepes-NaCl (рН=7,4). Тучные клетки очищали на градиенте фиколла. Центрифугировали 10 мин при 1200 об/мин (18ºС). Вошедшие в фиколл тучные клетки трижды промывали сбалансированным раствором. После каждого промывания клетки центрифугировали 10 мин последовательно при 1000, 800 и 600 об/мин. Осадок перитонеальных тучных клеток разводили в сбалансированном растворе. Подсчёт клеток проводили в камере Горяева по стандартной методике. Метод определения медиаторов тучных клеток. В работе использовали стандартный метод определения гистамина (Shore et al., 1971), основанный на реакции конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом и образовании флуоресцирующего комплекса, и метод определения β-гексозаминидазы по высвобождению р-нитрофенола из 4-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминида в реакционной смеси, содержащей 4 мМ субстрата в 0,5 мл 0,04 М цитратного буфера (рН 4,5) (Schwartz et al., 1982). Метод лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) (Юсипович и др., 2006). Фиксация активированных тучных клеток. Клетки фиксировали глутаровым альдегидом (2,5%) в течение часа, образцы промывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе. Исследования проводили с использованием автоматизированного интерференционного микропрофилометра, разработанного в институте ВНИИОФИ, (Москва, Россия) на базе микроинтерферометра Линника МИИ-4 (ЛОМО, Россия). Для получения кадров использовали программу Winphast. Реконструкцию фазового изображения из интерференционной картины осуществляли с помощью метода фазового шага. Для захвата изображений использовалась черно-белая 12-битная видеокамера VS415U (NPK Videoscan, Russia), размер матрицы 6.5*4.83 мм, разрешение составляло 782*582. В каждом опыте получали девять интерферограмм. Источник излучения полупроводниковый лазер с длиной волны 650 нм и мощностью 5 мВ. Обработка фазовых изображений проводилась с помощью программы FIJI. Для оценки состояния цитоплазмы были выбраны следующие параметры: площадь клетки – площадь фазового изображения клетки; максимальная ОРХ клетки – максимальное значение ОРХ цитоплазмы клетки, 6 обусловленное коэффициентом преломления и геометрией ядра. Изменение максимальной ОРХ отражает перераспределение структуры цитоплазмы и/или ядра клетки, а также уменьшение количества вещества в клетке; среднее ОРХ клетки – среднее ОРХ клетки, является параметром, который используют при расчете количества вещества внутри клетки; количество вещества – произведение величины площади и среднего значения ОРХ, а также ряда констант: уменьшение данной величины по сравнению с контролем свидетельствует о выбросе вещества из клетки. Определение уровня кальция в цитоплазме тучных клеток. Очищенные перитонеальные тучные клетки (1мл) инкубировали с флуоресцентным красителем Fluo-3 AM (5 мкМ) в течение 45-60 мин при комнатной температуре, центрифугировали при 800 об/мин (5 мин), к осадку добавляли сбалансированный буфер и инкубировали в течение 30 мин. 90 мкл буфера, содержащего тучные клетки, помещали в стеклянную камеру. Съёмку проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica TCS SP5 STED (возбуждение 488 нм, детекция 500-550 нм, объектив Х40), с частотой 1 фото в 5 сек, в течение 1 мин перед активацией клеток и 5 мин после. Обработку результатов проводили с помощью программы ImageJ. Измеряли интенсивность флуоресценции каждой клетки во времени. Статистическая обработка данных. Для статистической обработки результатов использовали критерий Манна-Уитни, t-критерий Стьюдента, критерий χ-квадрат (с поправкой для малых выборок) в компьютерной программе “STATISTICA 6”. Критической величиной значимости считали 0,05. Величину корреляции оценивали при помощи коэффициента корреляции Пирсона. Обработка результатов экспериментов с использованием метода ПЦР и расчет относительной экспрессии гена COX-2 проводили с помощью программ Bio-Rad iQ5 2.0 Standard Edition Optical System Software и REST 2005. Расчет коэффициента эффективности реакции проводился с использованием программы LinRegPCR. 7 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Исследование противовоспалительных эффектов пептида PGP. В первой части нашей работы на разных моделях воспаления исследовали действие PGP на развитие отека, проницаемость кровеносных и сократительную активность лимфатических сосудов. Действие PGP на образование отёка лапы, вызванного гистамином и каолином. Отёк вызывали подкожным введением в лапу гистамина (0,2 мг в объёме 100 мкл). За 30 мин до индукции воспаления в ту же лапу внутримышечно вводили PGP (3,7 мкмоль/кг). Контрольным животным вместо пептида вводили физиологический раствор. Каждый час в течение 4 часов измеряли толщину и окружность лапы и выражали в процентах от исходных значений (до введения препарата). Полученные данные представлены на рисунке 1. У животных после предварительного введения пептида отёк был значительно меньше, уже через час окружность лапы по сравнению с контролем была меньше на 29,5% (р=0,01), через 2 и 3 часа на 38 и 47% (р=0,012 и p=0,002) соответственно. Через 2 часа после индукции воспаления толщина лапы была меньше на 38% (р=0,016) по сравнению с контролем, а через 3 часа на 35% (р=0,009). Полученные результаты свидетельствуют, что введение пептида до индукции воспаления препятствует развитию отёка. толщина лапы, % PGP+гистамин (n=22) 20 @ 10 * ** NaCl+гистамин (n=18) 30 окружность лапы, % NaCl+гистамин (n=12) 30 PGP+гистамин (n=24) 20 @ 10 * * ** 0 0 0 1 2 3 4 0 5 1 2 3 4 5 часы Рисунок 1. Влияние PGP (3,7 мкмоль/кг) на изменение толщины и окружности лапы при воспалении, вызванном гистамином (0,2 мг/100 мкл). * - р<0.05, ** - р<0.01, @ - р<0,1. Аналогичные результаты были получены и при использовании каолина в качестве индуктора воспаления. Динамика развития отёка, вызванного гистамином, отличалось от таковой при введении каолина. Если отёк, индуцированный гистамином, достигая максимальной величины через 30 минут, уменьшается через 4 часа и полностью исчезает через 24 часа, то отёк, вызванный каолином, постепенно увеличивается в течение времени наблюдения (до 24 часов). Таким образом, предварительное введение пептида PGP приводит к уменьшению отёка, вызванного как эндогенным провоспалительным медиатором – гистамином, так и неспецифическим провоспалительным агентом – каолином. 8 Во всех экспериментах, проведённых на модели отёка лапы, мы сравнивали эффекты PGP и нестероидного противовоспалительного препарата (НПВП) диклофенака. В ходе наших экспериментов было обнаружено, что пептид и диклофенак в равной степени уменьшали отёк, вызванный гистамином и каолином. Известно, что основным механизмом действия диклофенака является подавление циклооксигеназы - 2 (COX-2) — важного фермента в цепи синтеза простагландинов из арахидоновой кислоты. Поэтому в следующей серии экспериментов при воспалении, вызванном подкожным введением гистамина в лапу крысам, мы сравнили влияние PGP и диклофенака на экспрессию гена циклооксигеназы-2. Определение уровня относительной экспрессии гена COX-2 в очаге воспаления, вызванного подкожным введением гистамина, с помощью ПЦР в реальном времени показало, что подкожное введение гистамина увеличивало экспрессию гена COX-2 через 2 часа после начала воспаления практически в 5 раз. Предварительное введение диклофенака приводило к снижению уровня экспрессии исследуемого гена на 31%. Однако при введении пептида уровень экспрессии гена оставался на уровне такового при воспалении. Это может свидетельствовать о том, что пептид и диклофенак реализуют свои защитные свойства через разные механизмы. Поскольку образование отёка обусловлено увеличением проницаемости сосудистой стенки, мы в следующей части нашей работы выясняли возможность действия PGP на проницаемость кровеносных сосудов в условиях воспаления. Для этого использовали модель острого воспаления - экспериментальный перитонит у крыс, вызванный внутрибрюшинным введением 40% раствора тиогликолата. Действие PGP на изменение проницаемости кровеносных сосудов в желудке и тонком кишечнике при остром перитоните у крыс. Животным опытной группы за 15 минут до внутрибрюшинного введения тиогликолата внутримышечно вводили PGP в дозе 3,7 мкмоль/кг. Животные одной контрольной группы получали физиологический раствор вместо тиогликолата, животные другой группы – вместо пептида. Об уровне проницаемости судили по количеству краски в экссудате и образцах тканей желудка и кишечника. Полученные результаты представлены на рисунке 2. Было показано, что уровень проницаемости в контроле составлял 5,9 мкг краски на грамм ткани в желудке и 3,7 мкг/г в тканях тонкого кишечника и существенно отличался от такового при воспалении. Проницаемость кровеносных сосудов в желудке увеличивалась в среднем на 66% (р=0,028), а в кишечнике – в 2,4 раза (р=0,011). При предварительном введении пептида уровень проницаемости в желудке и кишечнике оставался в пределах нормы. О снижении проницаемости в случае предварительного введения пептида свидетельствует также уменьшение количества экссудата в перитонеальной полости на 14% (р=0,039) и количества краски в экссудате (мкг/мл) практически в 2 раза (р=0,02). 9 Evans blue, мкг/г ткани А * 12 * * Б 12 10 8 8 6 4 4 2 0 0 NaCl (n=7) NaCl+ТИО (n=8) PGP+ТИО (n=6) NaCl (n=7) NaCl+ТИО (n=8) PGP+ТИО (n=6) Рисунок 2. Изменение сосудистой проницаемости в желудке (А), тонком кишечнике (Б) при экспериментальном остром перитоните у крыс через 30 минут после введения тиогликолата. * -р<0,05. В воспалительный ответ вовлекаются не только область непосредственного очага воспаления, но и другие органы и ткани. Наиболее характерным для воспаления является изменение реологии крови - увеличение вязкости, агрегация и уменьшение осмотической резистентности эритроцитов (ОРЭ) (Pejler G., 1999), свидетельствующее о нарушении структуры их мембраны. Это, в свою очередь, влечет за собой изменение функциональных свойств эритроцитов, что в конечном итоге приводит к нарушениям микроциркуляции (Koldkjaer P. et al., 2004). Мы предположили, что противовоспалительные эффекты PGP могут включать в себя и коррекцию ОРЭ при воспалении. Поэтому мы провели исследования влияния пептида на изменение осмотической резистентности эритроцитов при остром перитоните. Влияние PGP на изменение осмотической резистентности эритроцитов при экспериментальном остром перитоните. Исследовали изменения осмотической резистентности эритроцитов в динамике развития экспериментального перитонита: через 30 минут, 2 и 18 часов после индукции воспаления. Статистически достоверные отличия в ОРЭ от контроля наблюдали через 2 часа после введения тиогликолата. Введение PGP до индукции воспаления уменьшало патологические изменения ОРЭ. Процент гемолизированных клеток снижался, различия были достоверными в растворах с содержанием соли 0,4% и 0,3%. Пептид, введенный на фоне развившегося воспаления (через 1 час 45 мин после введения тиогликолата) не оказывал корректирующего действия на ОРЭ. Полученные результаты свидетельствуют о способности PGP оказывать профилактическое протекторное действие на мембрану эритроцитов, предотвращая снижение ОРЭ. Влияние PGP на сократительную активность лимфатических сосудов брыжейки крыс при остром перитоните. Регистрировали параметры сократительного ответа лимфатических сосудов на аппликацию норадреналина у опытных животных через 30 минут, 2 часа, 6 часов и 18 часов после индукции воспаления. Развитие воспалительного ответа сопровождалось угнетением сократительной активности лимфатических сосудов. В наибольшей степени эти нарушения проявлялись 10 через 2 часа после введения тиогликолата. Поэтому в дальнейшем основные исследования были проведены именно в этот срок после начала воспаления. На следующем этапе работы мы исследовали влияние пептида PGP на нарушения сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки крыс. Животные опытной группы получали пептид (3,7 мкмоль/кг, внутрибрюшинно) за 15 минут до введения тиогликолата. Параметры сократительной активности лимфатических сосудов регистрировали через 2 часа после индукции воспаления. Животные контрольной группы получали физиологический раствор. Было выявлено, что пептид оказывал заметное протекторное действие на параметры, характеризующие ответ лимфатических сосудов на норадреналин. В опытной группе, которая получала пептид до тиогликолата, наблюдаемые изменения были выражены в меньшей степени (рисунок 3). Латентный период, с Число сокращений в мин * 120 20 16 80 # * 12 40 8 4 0 1 2 0 3 1 Ответившие сосуды, % # 80 40 * 40 3 % сосудов, ответивших изменением тонуса 120 80 2 0 0 1 2 3 1 дилатация 2 3 констрикция Рисунок 3. Изменение показателей ответа лимфатических сосудов брыжейки крыс на аппликацию норадреналина (10-6М) через 2 часа воспаления. 1. Интактные животные. 2. Введение физиологического раствора за 15 минут до тиогликолата. 3. Введение PGP ( 3,7 мкмоль/кг) за 15 минут до тиогликолата. р<0.001 по сравнению *-с группой 1, #-с группой 2. Количество животных в каждой группе было равно 8. От каждой крысы было исследовано по 8-10 сосудов. Известно, что в развитии воспаления ключевая роль принадлежит клеткам иммунной системы – тучным клеткам, секреторная активность которых при воспалении значительно возрастает. Учитывая это, мы на следующем этапе работы исследовали влияние PGP на функциональный статус тучных клеток при остром перитоните. Влияние PGP на дегрануляцию тучных клеток при экспериментальном остром перитоните. Морфометрический анализ проводили на плёночных препаратах брыжейки, приготовленных через 2 часа после индукции воспаления. Количество дегранулированных тучных клеток с учётом распределения по степеням дегрануляции подсчитывали в световом микроскопе при увеличении в 400 раз. 11 Установлено, что через 2 часа после индукции перитонита число дегранулированных клеток в брыжейке увеличилось в 1,8 раза (р<0,001), количество клеток со слабой степенью дегрануляции сократилось, а с умеренной и сильной степенями дегрануляции увеличилось. Пептид, введённый за 15 мин до индукции воспаления, способствовал уменьшению количества дегранулированных клеток практически до уровня нормы, при этом в большинстве клеток дегрануляция была выражена слабо. Эти данные свидетельствуют, что в условиях воспаления пептид препятствует увеличению секреторной активности тучных клеток. В следующей серии экспериментов с помощью блокады секреции тучных клеток или их активации мы выясняли, в какой степени функциональное состояние тучных клеток определяет проявление протекторных эффектов пептида. 2. Блокада секреции тучных клеток кетотифеном и действие PGP на сократительную активность лимфатических сосудов брыжейки крыс при остром перитоните. Для стабилизации тучных клеток животным в течение двух дней до индукции воспаления дважды в день (утром и вечером) внутрижелудочно вводили кетотифен (1 мл на 200 г массы тела, 1мг/кг). Параметры сократительной активности лимфатических сосудов регистрировали через 2 часа после введения тиогликолата. Латентный период, с 60 Число сокращений в минуту 20 * 40 # #@ 20 0 0 1 12 * 10 2 3 4 5 1 2 3 4 5 % сосудов, ответивших изменением тонуса Длительность, мин # констрикция 120 дилатация # 8 80 * 4 40 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5 Рисунок 4. Изменение параметров сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки крыс после введения: физиологического раствора (1, n=17), физиологического раствора на фоне кетотифена (1 мг/кг) (2, n=21), тиогликолата (3, n=14), тиогликолата на фоне кетотифена (4, n=24), тиогликолата на фоне кетотифена и спустя 2 часа PGP (3,7 мкмоль/кг) (5, n=19). * - p< 0,001 по сравнению с группой 1; # - p< 0,001 по сравнению с группой 3; @ - p< 0,001 по сравнению с группой 4. 12 Развитие воспаления на фоне стабилизации тучных клеток кетотифеном (рисунок 4, группа 4) характеризовалось менее выраженными нарушениями сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки по сравнению с введением одного тиогликолата (группа 3). Кроме того, большинство сосудов, как и в контроле (группа 1), отвечало на аппликацию норадреналина констрикцией. Кетотифен (группа 2) не оказывал влияния на параметры сократительной активности лимфатических сосудов. Если через 2 часа после индукции воспаления на фоне предварительной стабилизации тучных клеток кетотифеном, вводили PGP (3,7 мкмоль/кг) (группа 5), нарушения сократительного ответа сосудов практически отсутствовали. Таким образом, несмотря на предварительную стабилизацию тучных клеток кетотифеном, PGP оказывал дополнительное защитное действие на лимфатические сосуды брыжейки. Действие PGP на вызванные веществом 48/80 нарушения сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки крыс. При активации тучных клеток веществом 48/80 (внутримышечно, 1мг/кг) мы наблюдали нарушения сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки, сходные с таковыми при воспалении (рисунок 5, группа 2). Введение PGP за 15 минут до инъекции вещества 48/80 уменьшало выраженность практически всех этих нарушений параметры их ответа на аппликацию норадреналина достоверно не отличались от контроля (группа 3). Латентный период, мин Число сокращений в минуту 60 * 50 20 16 40 12 30 + * ** 8 20 4 10 0 0 1 8 2 3 4 5 1 100 Длительность, мин 2 3 4 5 % сосудов, ответивших изменением тонуса констрикция дилатация 80 6 60 * 4 ** ** 2 40 20 0 0 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Рисунок 5. Параметры сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки крыс при введении: 1 – физиологического раствора, 2 - физиологического раствора + вещества 48/80 (1 мг/кг), 3 – PGP (3,7 мкмоль/кг) + вещества 48/80, 4 - вещества 48/80 + физиологического раствора, 5 - вещества 48/80 + PGP. * - p<0,05; ** - p<0,01 относительно группы 1; + - p<0,05 относительно группы 2; Количество животных в каждой группе было равно 7. От каждой крысы было исследовано по 8-10 сосудов. 13 Другой группе животных PGP вводили через 15 мин после вещества 48/80, то есть на фоне активированных тучных клеток (группа 5). И в этом случае также наблюдали существенное улучшение реакции лимфатических сосудов брыжейки на норадреналин. Таким образом, противовоспалительное действие PGP проявлялось и при активации тучных клеток веществом 48/80. Известно, что введение вещества 48/80 в высоких дозах приводит к развитию тяжелых анафилактоидных реакций, часто заканчивающихся гибелью животных. Эта реакция протекает с выраженным воспалительным компонентом. Мы предположили, что противовоспалительные эффекты PGP могут проявиться и в этом случае, уменьшая тяжесть течения реакции. Для подтверждения этого исследовали действие PGP на выживаемость мышей и степень выраженности у них симптомов анафилактоидной реакции. 3. Влияние PGP на развитие анафилактоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80. Опытной группе мышей за 15 мин до введения вещества 48/80 (8 мг/кг), внутрибрюшинно вводили PGP (1 мг/кг). Животным контрольной группы вместо пептида вводили физиологический раствор. Наблюдения проводили в течение 1 часа, отмечая число животных с проявлениями симптомов анафилактоидной реакции (корчи, зуд, отёк морды и лап, гиперемия хвоста и судорожное дыхание), тяжесть этих симптомов, количество погибших животных и время смерти. После введения вещества 48/80 в течение получаса погибло 73% животных. Введение PGP (1 мг/кг) за 15 мин до вещества 48/80 снизило смертность животных до 27% (рисунок 6) и существенно уменьшило выраженность симптомов реакции. количество животных, % 120 выжило погибло 100 Рисунок 6. Влияние предварительного введения PGP (1 мг/кг) на выживаемость мышей при анафилактоидной реакции, вызванной веществом 48/80 (8 мг/кг). 1 – контроль - введение 0,85% NaCl и вещества 48/80 (n=18); 2 – опыт - введение PGP и вещества 48/80 (n=18). 80 60 40 20 0 1 2 В следующей серии экспериментов PGP вводили через 1 мин после вещества 48/80, то есть на фоне уже активированных тучных клеток. Введение PGP после вещества 48/80 уменьшало смертность на 33%. И в этом случае наблюдали уменьшение отёка морды и лап. Способность пептида ослаблять анафилактоидную реакцию у мышей при его введении на фоне уже активированных тучных клеток может свидетельствовать о наличии механизмов защитного эффекта пептида, не связанных с его действием на секреторную активность тучных клеток. Для выяснения возможности прямого действия пептида на тучные клетки мы провели серию опытов in vitro. 14 4. Влияние PGP на секреторную активность тучных клеток in vitro. Влияние PGP на секрецию гистамина и β-гексозаминидазы перитонеальными тучными клетками. В качестве активаторов использовали синактен, брадикинин и вещество 48/80. Для исследования эффекта PGP к очищенным тучным клеткам (≈1·106 клеток, по 90 мкл суспензии клеток в пробе) предварительно добавляли PGP (6·10-5 М) и инкубировали 10 мин при 37ºС, затем добавляли активатор (инкубация 10 мин, 37ºС). В контрольные пробы вместо пептида добавляли равный объём сбалансированного буфера. Активация тучных клеток синактеном приводила к увеличению на 57% (р<0,01) количества секретируемого гистамина и на 30% β-гексозаминидазы (рисунок 7). Предобработка тучных клеток PGP (6·10-5 М) при активации синактеном снижала количество секретируемого гистамина на 40% (р<0,01) и количество секретируемой βгексозаминидазы на 13% (р<0,05). Пептид в исследуемых концентрациях не влиял на уровень спонтанной секреции клеток. Подобный эффект пептид оказывал и при активации тучных клеток брадикинином (2 мкМ). # # 50 40 Гистамин, % 30 20 10 0 # 30 β-гексозаминидаза, % А * Б 20 10 0 1 2 3 4 1 2 3 4 -5 Рисунок 7. Влияние PGP (6·10 М) на секрецию гистамина (А) и β-гексозаминидазы (Б) перитонеальными тучными клетками при их активации синактеном (20 мкМ). # - р<0,01, * р<0,05; 1 - норма (n=8). 2 - PGP+NaCl (n=8). 3 - NaCl+синактен (n=8). 4 - PGP+синактен (n=6). Активация тучных клеток веществом 48/80 (0,2 мг/мл) увеличивала в 2,6 раза (р<0,01) количество высвободившейся β-гексозаминидазы и в 3,4 раза количество гистамина. Однако предобработка клеток PGP не снижала количество секретируемых медиаторов. Следует отметить, что механизмы действия используемых нами активаторов принципиально различаются. Эндогенные активаторы - синактен и брадикинин (Schwerin et al., 2005; Koike et al., 2005; Dlamini & Bhoola, 2005) - реализуют своё действие, связываясь с соответствующими рецепторами, в то время как экзогенный активатор - вещество 48/80, встраиваясь в мембрану клеток, непосредственно взаимодействует с G-белком (Metcalfe D.D. et al., 1997; Palomäki V.A. & Laitinen J.T., 2006). Этим могут быть обусловлены различия наблюдаемых эффектов PGP. В следующих сериях экспериментов мы использовали метод лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) для исследования изменений морфологических параметров клеток при их активации веществами различной природы. 15 Влияние PGP на изменение морфологических характеристик перитонеальных тучных клеток при их активации веществами различной природы. Для оценки изменения состояния тучных клеток в процессе их активации мы использовали следующие параметры: площадь, максимальное значение оптической разности хода (ОРХ) и количество вещества в клетке. На рисунках 8 и 9 приведены средние значения площади, максимальной ОРХ и количества вещества для тучных клеток при активации синактеном и веществом 48/80. Результаты представлены как отношение измеренного параметра для экспериментальной пробы к соответствующему значению для контрольной пробы. NaCl+синактен PGP+синактен NaCl+синактен 3 PGP+синактен 1,2 А Б * 2 * # 0,8 * # 0,4 1 * # * 0 0 0 2мкМ NaCl+синактен 20мкМ синактен 0 2мкМ 20мкМ синактен PGP+синактен 1,2 # В * 0,8 * 0,4 0 0 2мкМ 20мкМ синактен Рисунок 8. Изменение морфометрических характеристик (А-площадь, Б-макс.ОРХ, Вколичество вещества) тучных клеток при активации синактеном. * - достоверные различия по сравнению с контролем; # - достоверные различия по сравнению с пробами без предварительной обработки пептидом. Активация тучных клеток синактеном в концентрациях 2 и 20 мкМ сопровождалась увеличением площади клеток, уменьшением максимальной ОРХ и уменьшением количества вещества в клетке по сравнению с контрольными значениями (рисунок 8). В случае предобработки клеток PGP с последующей активацией синактеном величина измеряемых параметров не отличались от контрольных значений, что свидетельствует о выраженном протекторном эффекте PGP на тучные клетки при их активации синактеном. Добавление к неактивированным клеткам PGP в концентрации 6*10-5 М не оказывало воздействия на тучные клетки. В этом случае изменения определяемых параметров фазовых изображений отсутствовали. Активация клеток веществом 48/80 (0,2 мг/мл) приводила к статистически достоверным изменениям физических параметров по сравнению с контрольными значениями (рисунок 9). Однако в этом случае PGP не оказывал протекторного действия на 16 тучные клетки, и значения определяемых параметров не отличались от таковых у активированных клеток. NaCl+ 48/80 NaCl+48/80 PGP+ 48/80 2 А PGP+48/80 1,2 * 1,6 * Б 0,8 1,2 0,8 0,4 0,4 0 0 0 0,02 мг/мл NaCl+48/80 0 0,02 мг/мл PGP+48/80 1,2 В * * 0,8 0,4 0 0 0,02 мг/мл Рисунок 9. Изменение морфометрических характеристик (А-площадь, Б-макс.ОРХ, Вколичество вещества) тучных клеток при добавлении вещества 48/80. * - достоверные различия по сравнению с контролем. Снижение секреции гистамина и β-гексозаминидазы обработанными пептидом тучными клетками при их активации синактеном и брадикинином, а также отсутствие у них изменений морфологических характеристик при активации синактеном подтверждают возможность прямого стабилизирующего действия пептида на тучные клетки крыс. Это может лежать в основе одного из механизмов защитного действия пептида при воспалении. Определение уровня кальция в цитоплазме тучных клеток при их активации веществами различной природы. В опытные пробы (≈1·106 клеток, по 90 мкл суспензии клеток в пробе) последовательно с интервалом 10 минут добавляли PGP (6·10-5 М) и активатор (синактен, брадикинин или вещество 48/80). К контрольным пробам добавляли либо один активатор, либо PGP. Об изменении концентрации кальция в цитоплазме клеток судили по изменению уровня флуоресценции. Добавление синактена к перитонеальным тучным клеткам в течение первых 10 секунд увеличивало практически в 2,5 раза уровень внутриклеточного кальция, который через 1 минуту возвращался к контрольному значению (рисунок 10). В предобработанных PGP клетках уровень кальция при активации синактеном в течение 10 секунд увеличивался лишь на 25% и также достигал контрольных значений через 1 минуту после активации. В 17 бескальциевой среде не наблюдали резкого увеличения концентрации кальция в цитоплазме тучных клеток при их активации синактеном. Аналогичная картина наблюдалась и при активации тучных клеток брадикинином. Сбалансированный буфер синактен 140 120 100 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 250 300 синактен 160 PGP+синактен флуоресценция, % от нормы флуоресценция, % от нормы 160 Буфер без содержания кальция синактен 350 PGP+синактен 140 120 100 80 60 40 20 0 -20 0 50 100 150 200 250 300 350 секунды секунды вещество 48/80 48/80 PGP+48/80 200 150 100 50 0 0 -50 50 100 150 200 250 300 350 секунды флуоресценция, % от нормы флуоресценция, % от нормы 200 48/80 PGP+48/80 150 100 50 0 0 -50 50 100 150 200 250 300 350 секунды Рисунок 10. Уровень флуоресценции тучных клеток при их активации синактеном (20 мкМ) и веществом 48/80 (0,2 мг/мл) в буфере с содержанием кальция и бескальциевом буфере. Полученные результаты свидетельствуют о том, что PGP препятствует входу внешнего кальция в цитоплазму. При активации тучных клеток веществом 48/80 мы получили иную картину. При добавлении активатора наблюдали резкое увеличение уровня внутриклеточного кальция. Но предобработка клеток PGP не препятствовала увеличению уровня кальция в цитоплазме, как это было в случае активации синактеном и брадикинином. При активации клеток веществом 48/80 в буфере без содержания кальция его уровень в цитоплазме увеличивался практически в той же степени, что и в стандартном буфере. Это говорит о значительном вкладе внутриклеточных кальциевых депо при активации тучных клеток веществом 48/80, что согласуется с данными литературы (Jaffe et al., 2004; Yeung et al., 2008). Таким образом, в основе стабилизирующего действия PGP на тучные клетки может лежать его способность препятствовать увеличению уровня внутриклеточного кальция при их активации эндогенными активаторами - синактеном и брадикинином. 18 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В нашей работе на различных экспериментальных моделях воспаления были выявлены противовоспалительные свойства пептида. Эти свойства проявлялись как на тканевом уровне (уменьшение отёка, уменьшение проницаемости кровеносных сосудов и предотвращение нарушений сократительной активности лимфатических сосудов), так и на клеточном (снижение уровня секреторной активности тучных клеток и уменьшение осмотической резистентности эритроцитов). Сравнение противоотёчного действия пептида с действием известного нестероидного противовоспалительного препарата диклофенака показало, что, несмотря на однонаправленность их действия, пептид нельзя рассматривать как классический противовоспалительный препарат, поскольку, в противоположность диклофенаку, пептид не снижал уровень экспрессии гена циклооксигеназы-2. Можно предположить, что пептид реализует свои противовоспалительные свойства либо на других, более поздних этапах процесса метаболизма арахидоновой кислоты, либо с помощью иных механизмов, не связанных с синтезом простагландинов. Эффект пептида на проницаемость кровеносных сосудов может быть опосредован как его прямым действием на сосуды (Bakaeva et al., 2003), так и стабилизирующим действием на тучные клетки, медиаторы которых, как известно, вносят большой вклад в инициацию и регуляцию проницаемости сосудов при воспалении (Metcalfe., 1997; Kunder et al., 2011; Peachell, 2006; Leonardi & Quintieri, 2010). Результаты опытов in vitro свидетельствуют, что одним из механизмов в реализации защитного эффекта PGP при воспалении является его стабилизирующее действие на тучные клетки, в результате чего уменьшается выброс физиологически активных соединений. На очищенных перитонеальных тучных клетках мы показали, что предварительная (до активации) обработка клеток пептидом существенно снижала количество высвобождающихся гистамина и β-гексозаминидазы. Отсутствие у предобработанных пептидом очищенных перитонеальных тучных клеток морфологических изменений, характерных для активированных клеток, подтверждает возможность прямого действия пептида на клеточную мембрану. Известно, что во многих процессах, сопровождающих активацию тучных клеток, (изменение формы клеток, запуск внутриклеточных каскадов, слияние гранул с мембраной клеток, продукцию и секрецию медиаторов) определяющую роль играет увеличение концентрации внутриклеточного кальция (Neher, 1991; Logan et al., 2003; Ma & Beaven, 2011). В наших экспериментах установлено, что пептид препятствовал входу внешнего кальция в тучные клетки, что может оказывать влияние на процесс их активации. Вероятно, пептид может регулировать секреторную активность тучных клеток, либо препятствуя взаимодействию активатора с рецептором, либо модулируя работу ионных каналов мембраны клетки. При активации тучных клеток синактеном важная роль принадлежит внешнему кальцию, тогда как кальций из внутриклеточных депо, по всей вероятности, вносит не столь значительный вклад. При активации тучных клеток веществом 48/80 пептид не препятствовал увеличению внутриклеточной концентрации кальция, которое происходило как за счёт входа внешнего кальция, так и за счёт его выхода из клеточных депо. Причём вклад внутриклеточного кальция был значительно выше, чем внеклеточного. Проявление защитных эффектов PGP при активации клеток эндогенными активаторами и их отсутствие при активации экзогенным активатором говорит о зависимости действия пептида от механизма активации клеток. В условиях in vivo в реализации защитных свойств PGP, по-видимому, могут участвовать и другие, не связанные с активацией тучных клеток, механизмы. Об этом свидетельствует ослабление анафилактоидной реакции у мышей, вызванной введением 19 вещества 48/80 на фоне действия пептида, а также частичное сохранение протекторных эффектов PGP на фоне блокады секреции тучных клеток кетотифеном. Действие регуляторных пептидов в условиях in vitro и in vivo может быть различно. In vivo пептид включается в каскад реакций, и его действие в значительной степени зависит от способа введения, которое влияет на скорость его деградации, определяющей активность пептида (Ашмарин и др., 1998, 2008). Это может объяснить результаты наших опытов in vivo, в которых PGP проявлял свои защитные свойства, как при нарушениях сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки, вызванных введением вещества 48/80, так и при анафилактоидной реакции у мышей. Можно полагать, что действие пептида in vivo не ограничивается регуляцией секреторной активности тучных клеток и может включать в себя пептидную регуляцию тонуса сосудов (Бакаева и др., 2003), поддержание нормального уровня проницаемости эндотелия, поддержание адекватного кровотока (Жуйкова, Самонина 2002), повышение устойчивости клеток и тканей к окислительному стрессу (Safarova et al. 2003; Фалалеева и др., 2009, 2010). Мы показали, что PGP препятствовал увеличению проницаемости сосудистого эндотелия. Это может быть связано как с ограничением секреторной активности тучных клеток, так и возможным его действием на эндотелий. Показано, что пептид может связываться с рецепторами CXCR хемокинов на поверхности нейтрофилов (Pfister et al., 1995; Weathington et al., 2006; Gaggar et al., 2008; Kim et al., 2011). Эти рецепторы обнаружены и на поверхности клеток эндотелия (Feil & Augustin 1998; Subileau et al. 2009; Dixit & Simon 2012). Впервые нами было показано, что PGP может облегчать состояние организма и уменьшать смертность животных при анафилактоидных реакциях, вызванных введением вещества 48/80. Нарушения, возникающие при развитии этих реакций, связаны с массивной активацией тучных клеток и высвобождением из них провоспалительных медиаторов. В опытах in vitro мы показали, что пептид не способен защищать перитонеальные тучные клетки от активации веществом 48/80. Это служит дополнительным аргументом в пользу наличия у пептида механизмов, не связанных со стабилизацией тучных клеток. Воспалительный процесс можно рассматривать и как стрессорный фактор, в ответ на действие которого активируются гипоталамо-гипофизарно-адреналовая ось и симпатоадреналовая система. Известно, что PGP может проходить через ГЭБ (Ашмарин и др., 2008). Поэтому в общий протекторный эффект PGP может включаться и его действие на структуры ЦНС, обеспечивающее формирование адекватной стресс-реакции (Бадмаева и др., 2006; Копылова и др., 2004, 2007; Эдеева и др., 2008). Различия в действии PGP in vitro и in vivo в ряде случаев можно объяснить гетерогенностью тучных клеток и селективной секрецией медиаторов в зависимости от условий ( Knight et al. 2008; Valent et al. 2010). Возможно, тучные клетки разных типов и локализованные в различных тканях, могут отличаться по восприимчивости к действию пептида. Таким образом, результаты нашей работы позволили выделить в противовоспалительном действии PGP компонент, обусловленный стабилизацией тучных клеток. Вероятно, стабилизация осуществляется за счёт прямого действия пептида на мембранные структуры тучных клеток, что препятствует входу внешнего кальция в клетки и приводит к снижению уровня их секреторной активности. Наряду с этим, по-видимому, существуют и другие механизмы защитного действия PGP в условиях воспаления, не связанные со стабилизацией тучных клеток. Реализация этих механизмов на клеточном и тканевом уровне способствует предотвращению или уменьшению нарушений функций различных органов и систем при воспалении. 20 ВЫВОДЫ 1. На различных моделях воспаления выявлены защитные противовоспалительные эффекты регуляторного пептида пролил-глицил-пролина (PGP): 1.1. Пептид достоверно уменьшал вызванные гистамином и каолином отёки лапы у крыс, но не влиял на экспрессию гена COX-2. 1.2. При экспериментальном остром перитоните пептид предотвращал нарушение сократительной активности лимфатических сосудов брыжейки, уменьшал проницаемость кровеносных сосудов в тонком кишечнике и желудке, повышал осмотическую резистентность эритроцитов и уменьшал секреторную активность тучных клеток. 1.3. На модели анафилактоидной реакции у мышей, вызванной введением вещества 48/80, предварительное введение PGP в 2,7 раза увеличивало количество выживших животных и существенно ослабляло выраженность основных симптомов этой реакции. 2. В опытах in vitro установлено, что противовоспалительные эффекты PGP в определённой степени обусловлены его способностью стабилизировать тучные клетки: 2.1. PGP уменьшал количество секретируемых гистамина и β-гексозаминидазы очищенными перитонеальными тучными клетками при их активации эндогенными активаторами - синактеном и брадикинином. При активации тучных клеток экзогенным активатором – веществом 48/80 - стабилизирующий эффект PGP не выявлен. 2.2. Методом лазерной интерференционной микроскопии (ЛИМ) показано, что обработка тучных клеток PGP предотвращала характерные для активации изменения морфологических параметров клеток в ответ на действие синактена. При активации клеток веществом 48/80 протекторный эффект PGP не проявлялся. 2.3. PGP препятствовал увеличению концентрации внутриклеточного кальция при активации тучных клеток синактеном и брадикинином, но не веществом 48/80. 3. В условиях in vivo в реализации защитных свойств PGP, по-видимому, могут участвовать и другие, не связанные со стабилизацией тучных клеток, механизмы. Об этом свидетельствует ослабление анафилактоидной реакции у мышей, а также частичное сохранение протекторных эффектов PGP, на фоне блокады тучных клеток кетотифеном. 21 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: 1. Умарова Б.А., Лелекова Т.В., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Гончарова Е.Л., Бондаренко Н.С. Стабилизация тучных клеток уменьшает нарушения функций лимфатических сосудов при воспалении. // Цитокины и воспаление -2009. т. 8 (3), с. 44 – 47. 2. Умарова Б.А., Бондаренко Н.С., Лелекова Т.В., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е. Влияние пептида пролил-глицил-пролина (PGP) на нарушения функции лимфатических сосудов брыжейки крыс, вызванные введением вещества 48/80. // Бюлл.эксп.биол.и мед -2011, т.152 (10), с. 428 – 431. 3. Копылова Г.Н., Бондаренко Н.С., Умарова Б.А., Самонина Г.Е. Защитное действие пептида пролил – глицил – пролина (PGP) при анафилактоидной реакции у мышей, вызванной веществом 48/80. // Вестник МГУ Сер. 16 -2011, № 4, с. 9 – 12. 4. Б.А. Умарова, Н.С. Бондаренко, Г.Н. Копылова, Г.Е. Самонина. Влияние пептида PGP на секрецию β-гексозаминидазы и гистамина перитонеальными тучными клетками крыс in vitro. // Биологические мембраны -2011, т.28 (4), с. 262 – 266. 5. М.Г. Голубева, Б.А. Умарова, Г.Н. Копылова, Г.Е. Самонина, Н.С. Бондаренко, О.В. Черемнова. Трипептид PRO-GLY-PRO предотвращает нарушения осмотической резистентности эритроцитов крыс при воспалении. // Бюлл.эксп.биол.и мед -2012, т. 153 (3), с.269 – 272. 6. Бондаренко Н.С., Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Лелекова Т.В., Самонина Г.Е. Пептидная коррекция патологических нарушений при анафилактоидной реакции, вызванной введением вещества 48/80. // Материалы международной конференции (27 – 28 октября, 2009 г, Минск, Беларусь), Минск, «Бизнесофсет» - 2009, с. 24 – 27. 7. Бондаренко Н.С. Влияние пептида пролил-глицил-пролина (PGP) на активацию тучных клеток крыс синактеном. // Тезисы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов 2008, с. 207. 8. Bondarenko N.S. Effect of prolyl-glycyl-proline (PGP) peptide on mast cells activity in vitro. // Abstracts for the Scandinavian Physiological Society’s Annual Meeting, Oulu University, Finland, 2008, p. 140. 9. Bondarenko N.S. Protective effects of prolyl-glycyl-proline (PGP) in compound 48/80induced anaphylactoid reactions. // Abstracts for 5th International Simposium on Cell/Tissue Injury and Cytoprotection/Organoprotection, Yalta, Ukraine, 2008. 10. Бондаренко Н.С. Влияние модифицированных форм пролил-глицил-пролина (PGPR и PGPL) на секреторную активность тучных клеток крыс. // Тезисы Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных Ломоносов 2009, с. 248. 11. Бондаренко Н.С., Умарова Б.А., ЛелековаТ.В., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е. Изменение реактивности лимфатических сосудов (ЛС) брыжейки крыс при активации тучных клеток (ТК) веществом 48/80 in vivo. // Тезисы VII международной конференции Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику), Ярославль, Россия, 2009, с. 141. 12. Бондаренко Н.С., Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Платонова Р.Д. Влияние модифицированных форм пролил-глицил-пролина на секреторную активность тучных клеток крыс. // Тезисы докладов IV Российского симпозиума Белки и пептиды, Казань, 2009, с. 358. 13. Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Бондаренко Н.С., Лелекова Т.В., Самонина Г.Е. Стабилизация тучных клеток (ТК) как один из возможных механизмов противовоспалительного действия пролил – глицил – пролина (PGP). // Материалы 12-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург – Гастро-2010, Научно-практический журнал «Гастро-энтерология Санкт-Петербурга, № 2-3, 2010, с. 89. 14. Копылова Г.Н., Умарова Б.А., Бондаренко Н.С., Лелекова Т.В., Самонина Г.Е. Защитные эффекты глипролинов при экспериментальном перитоните у крыс. // Материалы 22 12-го Международного Славяно-Балтийского научного форума «Санкт-Петербург – Гастро2010, Научно-практический журнал «Гастро-энтерология Санкт-Петербурга, № 2-3, 2010, с. 45. 15. Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Лелекова Т.В., Бондаренко Н.С., Бакаева З.В. Противовоспалительные свойства глипролинов. // Материалы научной конференции «Физиологическая активность регуляторных пептидов» (посвященная 85-летию со дня рождения академика РАМН И.П. Ашмарина) Москва (15 сентября 2010), Изд-во Герофарм, С. – Петербург, с. 77 – 78. 16. Бондаренко Н.С., Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е. Влияние пептида пролил – глицил – пролина (PGP) на развитие отека лапы у крыс при введении гистамина. // Тезисы докладов ХХI съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, Калуга (19 – 25 сентября 2010) с. 77. 17. Бондаренко Н.С. Влияние пептида пролил-глицил-пролина (PGP) на развитие отёка лапы у крыс. // Тезисы конференции молодых учёных «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды» (посвящённая 85-летию со дня основания Института физиологии им. И. П. Павлова), Санкт-Петербург (21-22 декабря 2010), с 17. 18. Голубева М.Г., Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Бондаренко Н.С. Пептидная коррекция нарушений осмотической резистентности эритроцитов крыс при воспалении. // Материалы 5-ой Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно – сосудистой хирургии», Москва (3-5 февраля 2011), изд-во НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, с. 138 – 139. 19. Бондаренко Н. С., Умарова Б. А., Копылова Г. Н., Голубева М. Г., Самонина Г. Е. Противовоспалительные эффекты пептида пролил-глицил-пролина (PGP). // Тезисы конференции «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Новый свет, АР Крым, Украина, (23-28 мая 2011), с. 441. 20. Бондаренко Н.С., Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Гусева А.А. Влияние пептида пролил-глицил-пролина (PGP) на развитие патологических нарушений, вызванных веществом 48/80. // Тезисы докладов V Российского симпозиума Белки и пептиды, Петрозаводск (8-12 августа 2011), с. 340. 21. Умарова Б.А., Копылова Г.Н., Бондаренко Н.С. Значение стабилизации тучных клеток эндогенным регуляторным пептидом пролил–глицил–пролином (PGP) при воспалении. // Тезисы докладов 8го Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина (3-13 июня 2012), с. 407-408.
