Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет
advertisement
1 Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Гончарова Варвара Сергеевна ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА В ГЕНЕЗЕ НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ 14.01.01. – «Акушерство и гинекология» Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель: д.м.н., проф. Макаров О.В. Москва – 2016 2 Оглавление Список сокращений...................................................................................................4 Введение.......................................................................................................................5 Глава 1. Обзор литературы....................................................................................11 1.1. Введение...............................................................................................................11 1.2. Этиологические факторы невынашивания беременности..............................12 1.2.1. Инфекционные заболевания............................................................................13 1.2.2. Эндокринные расстройства.............................................................................14 1.2.3. Иммунные расстройства..................................................................................14 1.2.4. Анатомические аномалии................................................................................15 1.2.5. Мужской фактор...............................................................................................16 1.2.6. Социальные факторы.......................................................................................17 1.2.7. Генетические факторы.....................................................................................18 1.3. Окислительный стресс в патогенезе невынашивания беременности............20 1.3.1. Окислительный стресс.....................................................................................21 1.3.2. Окислительный стресс и беременность.........................................................23 1.3.3. Маркеры окислительного стресса..................................................................24 1.4. Генотоксическое влияние окислительного стресса.........................................28 1.4.1. Механизмы ДНК-повреждений......................................................................29 1.4.2. Пути восстановления ДНК-повреждений......................................................31 1.4.3. Методы измерения повреждений ДНК..........................................................31 Глава 2. Материалы исследования.......................................................................36 2.1. Материал, объект исследования........................................................................36 2.2. Клинико-лабораторное исследование...............................................................37 2.3. Специальное исследование................................................................................39 2.3.1. Оценка ДНК-повреждений в клетках крови..................................................40 2.3.2. Оценка индуцируемых ДНК-повреждений ex vivo.......................................42 2.3.3. Определение уровня 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в клетках крови.......42 3 2.3.4. Определение уровня белка P53 в сыворотке крови......................................43 2.3.5. Определение уровня белка цитохрома c в сыворотке крови.......................43 2.3.6. Оценка уровней 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови.........44 2.3.7. Оценка концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови..........................44 2.4. Методы статистического анализа полученных данных..................................44 Глава 3. Клиническая характеристика групп....................................................46 Глава 4. Результаты собственных исследований...............................................72 4.1. ДНК-повреждения в клетках крови при невынашивании беременности......72 4.1.1. Оценка ДНК повреждений в клетках крови методом ДНК-комет..............74 4.1.2. Оценка индуцируемых ДНК повреждений ex vivo.......................................77 4.1.3. Оценка уровня 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в клетках крови.................82 4.2. Анализ содержания белка P53 при невынашивании беременности...............84 4.3. Анализ содержания белка цитохрома С в сыворотке крови при невынашивании беременности.................................................................................89 4.4. Анализ содержания 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови при невынашивании беременности.................................................................................92 4.5. Оценка концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови при невынашивании беременности.................................................................................94 Заключение..............................................................................................................101 Выводы.....................................................................................................................116 Практические рекомендации...............................................................................119 Список используемой литературы.....................................................................120 4 Список сокращений АФК – активные формы кислорода АФС – антифосфолипидный синдром ВИЧ – вирус иммунодефицита человека внДНК – внеклеточная дезоксирибонуклеиновая кислота ВОЗ – Всемирная Организация Здравоохранения ВПГ – вирус простого герпеса ВПЧ – вирус папилломы человека ДЖВП – дискинезия желчевыводящих путей ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИМТ – индекс массы тела КОК – комбинированные оральные контрацептивы НБ – неразвивающаяся беременность НчВ. РГ – начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома ПМК – пролапс митрального клапана ПОЛ – перекисное окисление липидов СОД – супероксиддисмутаза СР – свободные радикалы Физ Б – физиологически протекающая беременность ХГЧ – хорионический гонадотропин человека ЦМВ – цитомегаловирус 8-oxodG – 8-гидрокси-2-деоксигуанозин CBMN – /The cytokinesis-block micronucleus cytome/ блокирующий цитокинез микроядерный тест Cyt C – цитохром С OGG1 – ген 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы TUNEL – /Transferase mediated dUTP Nick End Labeling/ терминальное дезоксиуридиновое мечение концов разорванной нити ДНК 5 Введение Актуальность темы Невынашивание беременности относится к одной из наиболее сложных проблем репродуктологии, которая в настоящее время приобретает все большее медицинское и социально-экономическое значение в связи со сложившейся демографической ситуацией в России. Эпидемиологические данные показывают, что частота невынашивания беременности составляет 15-20%. До 85% выкидышей приходятся на первый триместр беременности, остальные 15% – на второй и третий [16, 19, 29, 60, 139]. Исследованиями в области медицинской генетики установлено, что хромосомные и межхромосомные перестройки в 5-6% случаев являются причиной привычного невынашивания беременности с репродуктивными потерями на 6ой – 8ой неделе. Такие мутации определяют нежизнеспособность, либо тяжелую патологию эмбриона [29]. Но прерывание беременности происходит и при нормальном кариотипе плода. При этом вопрос о вкладе генетических повреждений остается открытым, ввиду недостаточной разрешающей способности цитогенетических методов. Поэтому, углубленное изучение роли генетических нарушений как у беременных женщин, так и у плода, мутаций, предмутационных повреждений, ведущих к репродуктивным потерям, является актуальной научной задачей, решение которой перспективно для создания новых методов диагностики и разработки терапевтических стратегий. Генотоксические повреждения вызываются как эндогенными, так и экзогенными факторами. Исключая прямые физические или химические взаимодействия с ДНК, в качестве основного механизма индукции мутаций 6 рассматриваются свободно-радикальные процессы. Нарушение баланса про- и антиоксидантных систем ведет к окислительному стрессу, избыточному образованию активных форм кислорода, продуктов перекисного окисления липидов, способных нарушать структуру и функциональную активность макромолекул клетки, включая нуклеиновые кислоты [22, 76, 217]. На сегодняшний день накоплено достаточное количество сведений об участии окислительного стресса в патологии беременности [49, 54, 77, 79, 85, 104, 256, 271], с которым сопряжены разнообразные факторы, вызывающие невынашивание беременности [14, 34, 36, 134, 241]. Однако, данные о генотоксических проявлениях окислительного стресса немногочисленны, что, по-видимому, связано с методическими сложностями изучения этой взаимосвязи. Решение вопроса представляется возможным при использовании новых подходов к анализу генетических нарушений. К числу новейших способов оценки ДНК-повреждений, включая предмутационные, относится метод ДНК-комет [113], основанный на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом токе ДНК и ее фрагментов, заключенных в агарозном геле. Определение специфического продукта свободно-радикальной атаки ДНК – 8-гидрокси-2-деоксигуанозина также обнаруживает ДНК повреждения [161, 203]. Характеристики нарушений структуры ДНК, окислительного стресса, апоптоза могут быть дополнены специфическими показателями, такими как уровни внеклеточной ДНК, белка Р53, экспрессирующегося при деструкции ДНК [182], цитохрома С, отражающего апоптотическую гибель по митохондриальному пути [186]. Метод ДНК-комет может быть использован в опытах ex vivo путем инкубации клеток со стандартным прооксидантом, что позволяет дать сравнительную оценку «антиоксидантной емкости» анализируемых образцов. 7 Поэтому для выяснения закономерностей возникновения генотоксических дефектов, зависящих от окислительного стресса, в настоящей работе предпринято комплексное исследование с использованием выше приведенных показателей в группах пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома», «Неразвивающаяся беременность» в сравнении с группой с физиологически протекающей беременностью. Учитывая, что при физиологической беременности имеют место динамические процессы, отражающиеся на состоянии про- и антиоксидантной системах, аналогичные показатели определили у здоровых небеременных женщин. Цель исследования Выявление генетических повреждений, зависимых от окислительного стресса, и оценка маркерной значимости показателей генотоксичности при невынашивании беременности. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи 1. Провести комплексное обследование пациенток с невынашиванием беременности и сформировать группы с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома», «Неразвивающаяся беременность», «Физиологически протекающая беременность» и группу здоровых небеременных женщин. 2. На выделенных группах провести сравнительный анализ уровня ДНКповреждений методом ДНК-комет. 8 3. Исследовать содержание 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в клетках и в сыворотке крови пациенток с патологией беременности, с нормально протекающей беременностью и у небеременных. 4. В сформированных группах провести сравнительный анализ содержания внеклеточной ДНК в плазме крови. 5. Провести оценку экспрессии белка Р53 в сыворотке крови у пациенток с патологией беременности, физиологической беременностью и у небеременных. 6. В сформированных группах провести сравнительный анализ содержания цитохрома С в сыворотке крови. 7. Оценить чувствительность клеток крови, полученных от пациенток выделенных групп, к действию стандартного прооксиданта. 8. Провести статистическую определить показатели обработку результатов генотоксичности, исследования ассоциированные и с невынашиванием беременности. Основные положения, выносимые на защиту 1. В сравнении с показателями, зарегистрированными при физиологически протекающей беременности, невынашивание беременности у пациенток с диагнозом «Начавшийся сопровождается выкидыш. увеличением Ретрохориальная повреждений ДНК, гематома» регистрируемых методом ДНК-комет, в сроках 10-11, 12-13, 14-15 недель в 2,5, 2,6, 2,5 раз соответственно, при определении внеклеточной ДНК в плазме крови в сроках 10-11, 14-15 недель в 1,3, 1,6 раз соответственно, у пациенток с диагнозом «Неразвивающаяся беременность» сопровождается увеличением повреждений ДНК, регистрируемых методом ДНК-комет, в 9 сроке 10-11 недель в 1,8 раз, при определении внеклеточной ДНК в плазме крови в 1,5 раз. 2. Экспрессия белка Р53 увеличивается при патологической беременности по сравнению с физиологической, специфически повышаясь при начавшемся выкидыше в сроке 14-15 недель в 1,75 раз и при неразвивающейся беременности в сроке 10-11 недель в 2,3 раз по сравнению с показателями соответствующих сроков при физиологически протекающей беременности. 3. При физиологически протекающей беременности антиоксидантная емкость клеток выше, чем при патологии беременности. Степень защиты к действию прооксиданта в сроке 10-11 недель при диагнозе «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» выше в 1,35 раз, чем при неразвивающейся беременности. 4. Для состояний невынашивания беременности установлена маркерная значимость кластера показателей: чувствительность к прооксиданту, уровень ДНК повреждений, внеклеточной ДНК, экспрессии белка Р53. Научная новизна Впервые в клиническом исследовании установлено увеличение уровня генетических повреждений, включая предмутационные, при невынашивании беременности. Доказано, что применение метода ДНК-комет и определение внеклеточной ДНК в крови пациенток с патологией беременности позволяет характеризовать проявления генотоксичности на ранних сроках. Выявлены изменения экспрессии белка Р53, специфичные для диагноза «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома», «Неразвивающаяся беременность». Доказано, что степень антиоксидантной защиты клеток крови пациенток при патологии беременности на ранних сроках снижена. Для состояний 10 невынашивания беременности установлена маркерная значимость кластера показателей, включающего чувствительность к прооксиданту, уровень ДНКкомет, содержания внеклеточной ДНК, экспрессии белка Р53. Научно-практическая ценность Выявление кластера показателей, характеризующих проявления генотоксичности при невынашивании беременности, позволяет дополнить обследование пациенток методами, информативными в отношении повреждений ДНК, включая предмутационные. Доказательства различий в степени антиоксидантной защиты при физиологически протекающей беременности и при невынашивании беременности с использованием метода ДНК-комет ex vivo определяет целесообразность данного анализа при обследовании беременных пациенток и при медико-генетической консультации. Доказательство высокодостоверных различий в показателях генотоксичности и апоптоза на относительно небольших выборках создает предпосылки для масштабирования исследований с целью определения популяционных границ как физиологической нормы показателей кластера, так и их значений, свидетельствующих о патологии. Патогенетическая значимость сдвигов зарегистрированных параметров генотоксичности, зависимой от окислительного стресса, определяет возможность разработки фармакотерапевтических стратегий профилактики нежелательных последствий, связанных с патологией беременности. 11 ГЛАВА 1. Обзор литературы 1.1. Введение Анализ эпидемиологических данных показывает, что репродуктивные потери на разных сроках беременности остаются крайне актуальной проблемой, несмотря на большое число научных исследований, направленных на ее решение [16, 19, 79, 134, 235]. Самопроизвольным абортом, по определению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), является самопроизвольное изгнание или экстракция эмбриона или плода массой менее 500г., что соответствует сроку гестации до 22 недель беременности [2, 29]. Американское общество репродуктологии в качестве спонтанного аборта рассматривает прерывание беременности в сроке до 22 недели, подтвержденное ультразвуковым или гистологическим методом [212]. В отечественной терминологии, невынашиванием беременности считается самопроизвольное прерывание беременности в сроке до 37ми недель гестации, прерывание беременности до 22ой недели – самопроизвольным выкидышем (до 12ой недели беременности – ранний выкидыш, с 12ой по 22ую неделю – поздний выкидыш), а с 22ой по 37ую недели – преждевременными родами (с 22ой по 27ую неделю – ранние преждевременные роды, с 28ой недели – преждевременные роды) [2, 29, 44, 52, 60]. Неразвивающаяся беременность – остановка развития плодного яйца и его задержка в полости матки при отсутствии клинических данных самопроизвольного прерывания беременности [19]. Частота данной патологии в структуре репродуктивных потерь высока и занимает 10-20% [19]. У женщин в возрасте 20-30 лет шансы забеременеть в течение одного менструального цикла и родить здорового ребенка не превышают 30% [98]. Так, существенная часть оплодотворений неуспешна. Многочисленные 12 литературные данные свидетельствуют, что до 60% зигот элиминируется на пре- и самых ранних постимплантационных стадиях развития по причине генетической нестабильности клеток [41, 98], по той же причине в течение 1-го триместра прерывается до 20% лабораторно подтвержденных беременностей [125]. Частота невынашивания по данным ВОЗ составляет 15-20% [60, 61, 139]. По статистике США также около 15-20% американок сталкиваются с проблемой невынашивания беременности. Среди женщин в возрастной группе до 25 лет, данная патология встречается в 15%, и увеличивается с возрастом до 35% в группе старше 38 лет [105]. Wilcox проводил исследование, включавшее 221 женщину, стремящуюся забеременеть. Число спонтанных абортов составило 12% среди клинически выявленных беременностей. Однако, когда в исследование были включены данные об уровне хорионического гонадотропина человека в крови пациенток, процент спонтанных выкидышей возрос до 31% [266]. Что касается привычного невынашивания беременности, определяемого как 2 или более спонтанных прерывания беременности в сроки до 20 недель [212], риск самопроизвольного выкидыша увеличивается с каждым последующим эпизодом, 23% беременностей прерываются после одного самопроизвольного выкидыша, 29% – после двух, до 33% – после 4х [115]. По определению ВОЗ привычным выкидышем считается наличие в анамнезе трех подряд и более эпизодов самопроизвольного прерывания беременности в сроках до 22ой недели [29]. Неразвивающаяся беременность составляет от 1,8-20% [48, 58] до 80% [28] случаев самопроизвольного прерывания беременности. 1.2. Этиологические факторы невынашивания беременности Этиологические факторы самопроизвольного прерывания беременности крайне многочисленны и разнообразны. Ведущим может быть как один из них, 13 так и их комплекс [16, 134, 171]. Среди наиболее распространенных причин прерывания беременности выделяют следующие: генетические аномалии, инфекционные особенности заболевания, матки, эндокринные иммунологические заболевания, расстройства, анатомические экстрагенитальная патология, коагулопатии. Мужской фактор часто также является причиной самопроизвольного прерывания беременности. Серьезное влияние на течение и развитие беременности оказывают социальные факторы. [16, 60]. Однако, до сих пор, этиология от 26 до 66% самопроизвольных репродуктивных потерь первого триместра остается невыясненной [134, 269]. В некоторых зарубежных странах терапия начавшегося выкидыша первого триметра беременности не применяется вовсе, что основано на дискуссионном, с нашей точки зрения, мнении ряда специалистов, рассматривающих самопроизвольный выкидыш на ранних сроках беременности как эволюционный механизм элиминации неполноценного потомства [164]. 1.2.1. Инфекционные заболевания Острые и хронические заболевания органов малого таза, вирусные и бактериальные инфекции относят к самым распространенным причинам самопроизвольного выкидыша [11, 31, 45, 61, 202]. При первичном инфицировании на ранних сроках беременности возможны повреждения эмбриона, несовместимые с жизнью [4; 52]. По данным многих исследователей, у женщин, страдающих привычным невынашиванием, вне беременности хронический эндометрит гистологически верифицируют в 45-70% случаев и в 60-86,7% случаев микроорганизмов в отмечают эндометрии. персистенцию Смешанную условно персистентную патогенных вирусную инфекцию (ВПГ, вирусы Коксаки А и В, ЦМВ, энтеровирусы) обнаруживают у 14 больных с привычным невынашиванием беременности достоверно чаще, чем у женщин с неотягощенным акушерским анамнезом [5]. 1.2.2. Эндокринные расстройства Эндокринопатии являются частой причиной невынашивания беременности [116, 258, 62]. Эпидемиологические исследования показывают, что патологии эндокринной системы, приводящие к спонтанному выкидышу, встречаются в 8-23% случаев. К основным нейроэндокринным нарушениям относятся: неполноценная лютеиновая фаза, гиперсекреция лютеинизирующего гормона, нарушение секреции андрогенов, заболевания щитовидной железы, сахарный диабет [62, 118, 142, 212]. Недостаточная выработка хорионического гонадотропина человека также может привести к репродуктивной потере первого триместра [62, 64]. У 5-60% пациенток с самопроизвольным прерыванием беременности выявляется именно недостаточность лютеиновой фазы [59, 165, 213, 234]. Нарушение функции щитовидной железы, в частности гипотиреоз, приводит к риску отслойки хориона, а также формированию врожденных аномалий плода [60, 231, 234]. 1.2.3. Иммунные расстройства Ряд осложнений беременности, ведущих к невынашиванию, связан с нарушением регулирующей роли иммунной системы. [9, 14, 37, 42, 60, 67, 68, 81, 107, 220, 167]. Как указано в монографии Г.Т. Сухих и соавт., иммунные механизмы, включенные в патогенез прерывания беременности, разделяют на аллоиммунные и аутоиммунные. К аллоиммунным относят дефицит блокирующих факторов, присутствующих у женщин с физиологическим течением беременности. Спонтанные аборты связаны с недостаточностью 15 локальной децидуальной естественными супрессорной супрессорными активности, клетками, опосредуемой продуцирующими трансформирующий ростовой фактор-β2. У женщин с привычным выкидышем уменьшается количество лимфоцитов с большими гранулами и отсутствует мРНК трансформирующего фактора роста β2. Предполагают, что именно этот фактор в матке угнетает активированные лимфокинами NK-клетки, которые прямо или косвенно опосредуют выкидыш, и регулирует инвазию трофобласта в спиральные артерии [14, 230]. В целом, недостаточная или избыточная активность иммунологических механизмов, необходимых для нормального развития беременности, приводит к ее осложненному течению или прерыванию [14, 81]. К ним относятся как различные защитные механизмы, предотвращающие «отторжение» фетального аллотрансплантата, так и разные дефекты в защите, которые могут привести к выкидышу. Одной из основных аутоиммунологических причин (аутоантитела к фосфолипидам, к гормонам, нейротрансмиттерам) прерывания беременности является антифосфолипидный синдром, при котором происходит выработка антител к фосфолипидам или фосфолипид-связывающим протеинам. При данной патологии в маточноплацентарной системе образуются тромбозы артерий и вен, нарушается дифференцировка трофобласта в синцитиотрофобласт и имплантация [61, 81]. 1.2.4. Анатомические аномалии Аномалии развития органов репродуктивной системы, в частности матки, встречаются среди 5-15% женщин, страдающих невынашиванием беременности [1, 11, 61, 252]. Наиболее частые аномалии развития матки: неполное слияние мюллеровых протоков или внутриматочная перегородка, истмико-цервикальная недостаточность, аномалии маточных артерий, аномалии 16 шейки матки, приобретенная патология шейки матки, синехии в полости матки, лейомиома матки [1, 16, 252]. 1.2.5. Мужской фактор В качестве отдельного фактора развития патологической беременности выделяют так называемый мужской фактор (male factor) – нарушения, возникающие в процессе сперматогенеза [215], в первую очередь, дефекты упаковки хроматина и фрагментация ДНК сперматозоидов [101]. Мета-анализ данных 16 масштабных фрагментации спонтанного ДНК исследований сперматозоидов прерывания показал, отцов беременности что значимо [225]. При высокий уровень увеличивает этом риск наибольшие достоверности выявляются при применении метода TUNEL (Transferase mediated dUTP Nick End Labeling) – мечения разрывов ДНК терминальной трансферазой и метода ДНК-комет. Методом ДНК-комет было показано, что повышенный уровень двойных разрывов ДНК сперматозоидов наблюдается в 85% случаев спонтанных прерываний беременности по сравнению с 33% в контрольных группах [223]. Хорошо известно, что сперматозоиды крайне чувствительны к повреждениям, снижающим их качество и активность. GilVilla A.M., Cardona-Maya W. и Agarwal A. в своих исследованиях 2009 года показали, что партнеры пациенток, страдающих невынашиванием беременности, имели повышенную частоту таких хромосомных аномалий как анеуплоидия, ДНК-фрагментация, повышенный апоптоз [136]. Анализируя эти работы, уместно отметить, что продукты окислительного стресса являются важнейшими индукторами повреждений ДНК в сперматозоидах [34, 35]. Последние крайне чувствительны к действию активных форм кислорода, так как лимитированы в антиоксидантной защите в отличие от соматических клеток [241]. 17 1.2.6. Социальные факторы Ряд социальных проблем приводят к неудовлетворительным бытовым и финансовым условиям, что определяет стрессирующие воздействия, вызывающие чрезмерные эмоционально-стрессовые реакции, которые могут иметь пагубные последствия для развития беременности, вплоть до ее потери. Социально-зависимые факторы образа жизни и питания влияют на репродуктивное здоровье и развитие заболеваний [99, 100, 131]. Например, жирная пища и избыточная масса тела оказываются связанными с развитием системного воспаления, сопровождающегося окислительным стрессом [221], что, в свою очередь, ведет к эндотелиальной дисфункции и к невынашиванию беременности. Мета-анализ данных нескольких исследований показал, что женщины, имеющие индекс массы тела ≥25 кг/м2 более подвержены риску спонтанного прерывания беременности [191]. Проведенный регрессионный анализ показал, что повышенный индекс массы тела является вторым по значимости после показателя возраста фактором повышенного риска невынашивания [190]. В другой работе, включающей анализ данных 6 масштабных исследований (около 30 000 беременностей) было показано, что индекс массы тела более 28-30 кг/м2 значимо увеличивает риск спонтанных выкидышей [99]. Неправильный образ жизни, злоупотребление алкоголем, психоактивными средствами, табакокурение также относятся к факторам, нарушающим нормальное течение беременности [36, 192, 206, 251]. Потребление алкоголя дозозависимо повышает риск прерывания беременности [82]. Для незначительных доз алкоголя это риск возрастает в 1.7-3 раза, тогда как при умеренном потреблении – более чем в 4 раза [82]. Не выявлено значимого влияния потребления кофе на протекание беременности. Лишь употребление более 7 чашек кофе увеличивало риск выкидышей в 1.5 раза [91]. 18 Курение рассматривается как важный фактор спонтанного прерывания беременности. Мета-анализ данных 98 исследований показал, что курение во время беременности на 23-32% увеличивает риск выкидышей, а пассивное воздействие табачного дыма на 11% [209]. При этом каждая дополнительная выкуренная в день сигарета увеличивает риск на 1%. Интересны данные, показывающие, что у курящих женщин, воздерживающихся от курения во время беременности, риск прерывания беременности не увеличивается, независимо от стажа курения [201]. Социальную природу могут иметь неизбежные контакты с токсическими продуктами [205]. Таким образом, имеющиеся на сегодняшний день сведения демонстрируют разнообразие факторов, лежащих в основе возникновения нарушений беременности или увеличивающих их риск. Анализ данных многочисленных исследований позволяют рассматривать окислительный стресс как важное патогенетическое звено в развитии нарушений беременности, вызываемых факторами различной этологии. 1.2.7. Генетические факторы Наследственность, индуцируемые мутации являются ведущими факторами, приводящими к потере беременности на ранних сроках, составляя по данным различных авторов, от 18 до 80% прервавшихся в первом триместре беременностей [8, 41, 79, 163, 198, 216, 227]. По последним данным эта цифра составляет около 45% [259]. В качестве основных генетических причин в литературе рассматривают хромосомные аномалии, генные мутации и наследственную предрасположенность [10, 13]. Анализ данных цитогенетических исследований показал, что большинство хромосомных аномалий (86%) включают численные нарушения хромосом [139]. Наиболее часто встречающиеся хромосомные аномалии по данным Stephenson M.D.: 19 полные трисомии аутосом у 49,8% абортусов, Х-моносомии у 23,7%, триплоидии и другие полиплоидии у 17,4% [250]. В 6% случаев выявляются стабильные хромосомные аберрации и в 8% – хромосомный мозаицизм [139]. Предполагается, что выявляемые при невынашивании беременности хромосомные аномалии плода возникают de novo вследствие генетических нарушений в процессе гаметогенеза родителей. По разным данным лишь при 36% случаев нарушений беременности хромосомные аномалии наблюдаются у одного из родителей [156]. Они включают, прежде всего, сбалансированные транслокации и инверсии, не имеющие фенотипического проявления у носителей, но на 50% увеличивающие риск возникновения генетических аномалий у потомства и, как следствие, риск раннего прерывания беременности [102]. Другие авторы также подтверждают, что хромосомные аномалии являются основной генетической причиной бесплодия и невынашивания беременности [97]. Факты, указывающие на наличие наследственной предрасположенности, в последние десятилетия в связи с развитием геномных методов анализа приобретают все большее значение [3, 7, 46]. Так, с 2000 года изучен аллельный полиморфизм около 100 генов «предрасположенности» к невынашиванию беременности. контролирующими детоксикацию Выявлены ассоциации ксенобиотиков, с метаболизм генами, гормонов, фолиевой кислоты, витамина В12, гены дисфункции эндотелия, факторов роста, иммунной системы, факторов свертывания крови, вовлеченные в развитие наследственной тромбофилии [96, 166, 194, 229]. Последнюю некоторые авторы относят к одной из главных причин репродуктивных потерь [47]. Из приведенного, далеко не полного списка литературы, очевидно, что невынашивание беременности является мультифакториальным заболеванием. По мнению В.С. Баранова в сочетании с неблагоприятными условиями окружающей среды, различные аллельные варианты могут приводить либо к развитию заболевания, либо, наоборот, способствовать устойчивости [7]. 20 Таким образом, рассмотренные этиологические факторы запускают ряд патогенетических механизмов, приводящих к невынашиванию беременности. Многие из патологических процессов известны и подробно описаны в литературе [14, 16, 19, 78, 79, 134, 235]. На основе патофизиологических исследований разработаны и применяются клинико-лабораторные методики, необходимые для диагностики, назначения терапии, прогноза заболевания. Однако, как указано выше, многие причины прерывания беременности остаются неясными, что обуславливает необходимость их дальнейшего изучения. Одним из наиболее важных, возможно результирующих звеньев разнообразных патологических изменений, ведущих к прерыванию беременности, следует рассматривать окислительный стресс. Образующиеся свободно-радикальные интермедиаты способны повреждать жизнеобеспечивающие клеточные и макромолекулярные структуры, включая наследственный аппарат, детерминирующий нормальное формирование плода. 1.3. Окислительный стресс в патогенезе невынашивания беременности Обсуждая данную проблему, необходимо иметь ввиду литературные данные последнего десятилетия, которые свидетельствуют, что процессы окислительного стресса включены в развитие физиологической беременности [19, 20, 49, 79, 152, 158]. Однако, резко повышенный уровень маркеров окислительного стресса регистрируется в тканях женщин с патологически протекающей беременностью [77, 79, 126, 148, 149, 151, 195, 232, 248, 104]. Таким образом, данный ряд исследований указывает на связь повышенной выработки свободных антиоксидантной системы радикалов с такими кислорода патологиями и недостаточности беременности как 21 невынашивание, в частности неразвивающаяся беременность, а также с плацентарной недостаточностью и преэклампсией. 1.3.1. Окислительный стресс Кислород необходим для функционирования клеток. В ферментативных реакциях кислород активно метаболизируется с образованием множества метаболитов, в числе которых и высокоактивные вещества, имеющие неспаренный электрон – свободные радикалы. Под термином АФК (ROS, reactive oxygen species) объединяют собственно свободные радикалы кислорода и их различные производные – молекулы с неспаренными электронами на внешней орбитали. Такая нестабильная электронная конфигурация обуславливает их высокую реакционную способность [145]. К активным формам кислорода относят супероксид-анион, перекись водорода, гидроксильный радикал, оксид азота, синглетный кислород, гипогалоиды, алкоксильные и перекисные радикалы и другие [26]. Источники образования АФК в клетках и факторы их индукции многообразны [145, 207]. Большинство активных кислородных метаболитов генерируются в клетках за счет митохондриальной дыхательной цепи [22, 211,217]. С позиции теории, окислительный стресс – это дисбаланс между образованием и удалением активных форм кислорода, что составляет важное звено патогенеза многих заболеваний [76]. В основе его возникновения лежит генетически детерминированная или алиментарная недостаточность антиоксидантной защиты и/или прооксидантные воздействия, превосходящие компенсаторные возможности защиты [22, 57]. АФК являются продуктами нормального метаболизма клеток и в условиях баланса между их образованием и детоксикацией системой антиоксидантной защиты не представляют опасности. Вместе с тем, чрезмерная продукция АФК 22 под действием различных эндо- и экзогенных факторов и/или вследствие неадекватного функционирования системы антиоксидантной защиты может приводить к развитию окислительного стресса – нарушению устойчивого баланса в сторону прооксидантных процессов, и как следствие, разнообразным цитотоксическим повреждениям в клетках [217]. Гидроксильному радикалу принадлежит центральная роль в реализации повреждающих эффектов окислительного стресса. Данный радикал вследствие высокой реакционной активности способен повреждать все известные типы клеточных макромолекул, в том числе белки, ДНК и липиды, а также образовывать вторичные радикалы при реакции с низкомолекулярными соединениями [261]. Запуск цепных реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ) под действием гидроксильного радикала приводит к необратимым изменениям в клетке, прежде всего к нарушению структуры липидов, входящих в состав клеточных мембран с последующим нарушением их функционирования и образованию цитотоксических соединений. Антиоксидантная система – многокомпонентная система, основой которой является совокупность ферментов и соединений, поддерживающих редокс-баланс. К ним относятся супероксиддисмутаза (SOD), каталаза (CAT), глутатионпероксидаза (GPX), параоксоназа (PON), витамин Е, коэнзим Q, флавоноиды, каротиноиды, аскорбиновая кислота и другие [26, 32]. Повышенная продукция свободных радикалов при патофизиологических состояниях, например, при гипоксии, воспалении, инфекционных заболеваниях вызывает при субклеточных недостаточности структур, ядер, антиоксидантной митохондрий, системы клеточных повреждение мембран и макромолекул, включая ядерную и митохондриальную ДНК [103, 228, 78], что в свою очередь ведет к изменению клеточных функций, генетической нестабильности и к нарушениям в организме в целом [121, 183, 264]. Генетическая нестабильность, дополняя порочный круг, может влиять на белки, 23 участвующие в репликации ДНК, репарации, апоптозе, регуляции клеточного цикла и хромосомной стабильности, приводя к развитию патологических состояний [92]. 1.3.2. Окислительный стресс и беременность Окислительный стресс патогенетически значим для самопроизвольного прерывания беременности. В ряде работ недостаточность антиоксидантной системы определена в качестве причины невынашивания [6, 33, 38, 39, 49, 51, 54, 58, 69, 70, 85, 256, 271]. В других исследованиях также подтверждается роль редокс-дисбаланса в генезе невынашивания беременности [14, 33, 39, 54, 63, 77, 146]. Однако, не смотря на имеющиеся данные о значимости окислительного стресса в патогенезе прерывания беременности, углубленное изучение его генотоксических эффектов остается крайне актуальной задачей акушерства и гинекологии, решение которой способно снизить уровень перинатальных потерь. Для физиологически протекающей беременности характерно состояние окислительного стресса, это объясняется увеличенной активностью митохондрий плаценты, а также повышенной выработкой активных форм кислорода, в частности супероксидного анион-радикала [27, 222]. Находясь в физиологической концентрации, активные кислородные метаболиты регулируют важные клеточные функции и процессы, необходимые для прогрессирования беременности. Так, в сроках беременности 8-9 недель в периферической части формирующейся плаценты возникает окислительный стресс, наблюдается локальная высокая концентрация кислорода, при этом уровень антиоксидантных ферментов низок [157]. В данной ситуации локальное окислительное повреждение трофобласта и дегенерация ворсин хориона запускает процесс образования плодных оболочек [158, 159]. Окислительный 24 стресс и повышение оксигенации может также стимулировать выработку различных трофобластических белков, таких как хорионический гонадотропин и эстрогены. Пик концентрации в сыворотке материнской крови хорионического гонадотропина приходится на конец первого триместра [208]. При патологиях беременности, таких как ранний выкидыш или преэклампсия, уровень маркеров окислительного стресса может увеличиваться в несколько раз [79, 104]. Эти патологические состояния беременности ассоциированы с некрозом и апоптозом трофобластического эпителия плацентарного ворсинчатого окисллительного стресса физиологические антиоксидантных дерева [158]. При приспособительные резервов не под действием патологиях факторы, происходят, еще возникшего гестации как такие увеличение более усугубляя редоксдисбаланс в организме беременной женщины [106, 260]. Таким образом, индуцированные окислительным стрессом повреждения, нарушения формирования маточно-плацентарного кровотока, аномальная плацентация могут играть роль в патофизиологии идиопатической привычной потери беременности. 1.3.3. Маркеры окислительного стресса Поиск специфических маркеров окислительного стресса ведется в системах образования свободных радикалов, антиоксидантов, в выявлении специфических повреждений ДНК и др. У женщин с патологией беременности в доступных биологических субстратах регистрировали уровень перекисного окисления липидов, супероксиддисмутазы, каталазы, глутатиона. Авторы сделали заключение, что некротические процессы в матке при неразвивающейся беременности и связанные с этим фактом нарушения в плазменно- коагуляционного звена приводят к нарушениям антиоксидантной защиты [54]. 25 В других работах изучались такие показатели, как общий оксидативный статус, общая антиоксидантная емкость, индекс окислительного стресса и уровень свободных сульфгидрильных групп. В группах пациенток с неразвивающейся беременностью выявлен повышенный уровень показателей общего оксидантного статуса и высокий индекс окислительного стресса, а также резкое снижение уровня антиоксидантной емкости и сульфгидрильных групп [256, 271]. Проведены перекисного исследования, окисления зарегистрирован рост направленные липидов, уровня оксида на выявление азота и витамина малондиальдегида в третьем уровней Е, где триместре беременности и резкое снижение уровней оксида азота и витамина Е при привычном невынашивании беременности [85]. В последнее время в ряде клиник активно изучают значение регистрации белка Р53 – фактора, регулирующего клеточный цикл, апоптоз, восстановление повреждений ДНК и являющегося супрессором образования злокачественных опухолей [71]. Митохондриальный белок Р53 активируется при ДНК-повреждениях [176, 262]. Повышенная экспрессия Р53 в ворсинах хориона зарегистрирована при неразвивающейся беременности [236, 265]. По данным геномики наличие аллеля Pro гена Р53, а также генотип G/G связаны с неразвивающейся беременностью [123]. Найдены ассоциации полиморфизма С11992А гена P53 и гомозиготного Pro72Pro с невынашиванием беременности [128, 253]. Цитохром С, как и белок Р53 является маркером апоптотической гибели клеток через митохондриальный путь, активируемый при окислительном стрессе и ДНК-повреждениях [141]. В доступной литературе есть одиночные данные о увеличении процентного содержания цитохрома С в гомогенате плаценты от родильниц, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции в третьем триместре [43]. ДНК, обнаруженная в плазме крови, а не в ядрах и митохондриях, также представляет большой интерес, потенциально являясь маркером 26 окислительного стресса. Постоянный процесс апоптоза в организме поставляет свободные фрагменты ДНК в плазму крови, так как не все апоптотические продукты утилизируются макрофагами, дендритными и эндотелиальными клетками, и часть из них попадает в кровоток [199]. Увеличение концентрации внеклеточной ДНК выше 100 нг/мл плазмы/сыворотки, по данным литературы, косвенно указывает на патологический процесс [65]. Из доступной литературы известно, что увеличение внеклеточной ДНК ассоциируется с онкологическими, аутоиммунными, лучевыми, посттравматическими процессами, вирусными заболеваниями [30, 66, 83, 133, 169, 249, 245]. Доказано, что концентрация свободной ДНК и плода, и матери повышается при приэклампсии [143, 181, 196] и при начавшемся выкидыше [50, 124, 270]. Причем в исследовании 2013 года доказано, что при спонтанном аборте с выявленной хромосомной патологией плода уровни свободной плодовой ДНК и общей ДНК в плазме выше, чем в случаях выкидыша при нормальном кариотипе [178]. Ji Hyae Lim et al. исследовали взаимосвязь общей свободной ДНК и фетальной свободной ДНК с самопроизвольным выкидышем. В этом исследовании приняли участие 268 пациенток в первом триместре беременности, из них у 41 произошел самопроизвольный выкидыш с нормальным кариотипом плода, у 26 – с анеуплоидиями, 201 пациентка составили контрольную группу. Было выявлено значительное повышение уровней общей и плодовой свободной ДНК в группах с патологией беременности, причем уровни общей и плодовой свободной ДНК при выкидыше с анеуплоидией были выше, чем при выкидыше с нормальным кариотипом плода [178]. Схожие данные описаны и другими авторами [93, 94, 95, 162, 177, 193]. Aihua Yin et al. в целях выявления риска самопроизвольного выкидыша оценивали значение показателя свободной плодовой и общей ДНК. В исследовании участвовали 1114 пациенток, их них 164 – с полным самопроизвольным выкидышем, 575 – с кровотечением первого триместра беременности с диагнозом «Начавшийся выкидыш» и 375 женщин с 27 физиологически протекающей беременностью. Выявлено увеличение концентрации общей и фетальной ДНК в период с 6 по 11,6 неделей гестации среди здоровых беременных по мере прогрессирования беременности. Однако, данный показатель у пациенток с самопроизвольным выкидышем был выше в несколько раз, при этом именно повышенный уровень общей свободной ДНК был ассоциирован с самопроизвольным выкидышем [270]. Clark-Ganheart C.A. et al. исследовали ассоциации концентрации свободной ДНК и неразвивающейся беременности в 50 случаях. Было выявлено, что после 8ой недели беременности беременности уровень значительно беременности [110]. свободной выше, чем ДНК при при неразвивающейся нормально протекающей Miranda M.L. et al., учитывая факт увеличения циркулирующей свободной ДНК в крови при заболеваниях, связанных с ишемией и гипоксией, предположили, что данный параметр может иметь маркерную значимость при преэклампсии и HELLP синдроме. Проведя исследование образцов крови 20 здоровых беременных, 9 пациенток с умеренной преэклампсией, 24 пациенток с тяжелой формой преэклампсии и 8 пациенток с HELLP синдромом, авторы сделали заключение о повышении уровня свободной ДНК по мере усложнения исследованных патологий [196]. Неинвазивный пренатальный скрининг в виде анализа свободной ДНК оказался эффективным при выявлении часто встречаемых трисомий, в частности синдрома Дауна [108, 109, 204, 246]. Однако, в других работах такой точности не достигнуто [93]. Другие продукты, 8-гидрокси-2-деоксигуанозин, 2-деокситимидин [237], 5-ОН-урацил, 8-ОН-аденин [185] также активно изучались в качестве потенциальных биомаркеров окислительного стресса. 8-гидроксигуанин, окисленная форма гуанина, является наиболее распространенным и наиболее изученным маркером свободнорадикального повреждения ДНК [117, 184]. Увеличение числа повреждений ДНК, определенные по уровню 8- 28 гидроксигуанина, зафиксировано при осложнениях беременности [152, 167]. В 2014 году Negi с соавторами показали значительное увеличение уровня 8гидрокси-2-деоксигуанозина при снижении уровней каталазы, витамина А, Е, С и общего антиоксидантного статуса при преэклапсии и эклампсии [200]. Наибольшая часть исследований, посвященных осложнениям беременности, связанных с влиянием окислительного стресса, направлена на выявление специфических маркеров последнего при патологиях второй половины беременности, в частности при приэклампсии и эклампсии [79, 103, 130, 189, 210, 224], задержке внутриутробного роста плода [103, 150], гестационном диабете [80, 172, 175, 197]. Таким образом, патогенетические процессы при невынашивании беременности, при ее осложнениях, сопровождаемые окислительным стрессом, получают подтверждение биохимической диагностикой. При этом, клинически значимыми можно рассматривать как показатели активности про- и антиоксидантной системы, непосредственно определяя уровни свободнорадикальных продуктов, элементы антиоксидантной системы, так и маркеры повреждения ДНК. Последние представляются важными, учитывая вклад генетических нарушений в невынашивание беременности, возможность их индукции экзо- и эндогенными факторами. Поскольку данных о генотоксическом влиянии окислительного стресса при неразвивающейся беременности, начавшемся выкидыше в доступной литературе сравнительно немного, представляется целесообразным более подробно рассмотреть его механизмы. 1.4. Генотоксическое влияние окислительного стресса Существует множество эндо- и экзогенных факторов, способных вызывать дисбаланс про- и антиоксидантной систем. Одной из важных причин 29 нарушений в генетическом аппарате является воздействие средовых факторов, с которыми контактирует человек, наличие которых, по нашему мнению, необходимо учитывать для выделения групп риска при беременности. Опасные токсические вещества, содержатся практически во всей среде обитания, начиная от загрязнений воздуха, до нахождения в косметических средствах. Невынашивание беременности часто связано с повреждающим действием генотоксикантов, которое заключается в повреждении структуры ДНК и индукции различных мутаций, приводящих к прерыванию беременности [13, 15, 36, 72]. Как показано выше большинство промежуточных и конечных продуктов, возникающих в реакциях окислительного стресса, являются эндогенными генотоксикантами. Изучение экзо- и эндогенных генотоксикантов в аспекте их влияния на беременность в настоящее время находится в центре внимания исследователей [18, 36, 55, 73, 74]. Недавно выполненные экспериментальные исследования доказали связь индуцированных нарушений ДНК с пре- и постнатальными дефектами развития. В числе изученных генотоксикантов – циклофосфамид, этанол, экспозиция табачным дымом, продуктами сгорания торфа [18, 24, 25, 55, 72, 73, 74, 140]. 1.4.1. Механизмы ДНК-повреждений Специалистами в области молекулярной биологии и генетики показано, что ежедневно, в геноме человека возникает множество повреждений, включающих аддукции, модификации и фрагментации азотистых оснований ДНК [242]. Ядерная ДНК подвергается различным модификациям, таким как окисление, гидролиз и алкилирование. Нуклеотиды могут делетироваться, возможны перекрестные сшивки с другими основаниями и белками, сдвиг рамки считывания, замена оснований, могут возникать разрывы цепей ДНК и хромосомные аберрации, обмены сестринских хроматид [114]. Оставшись 30 неустранѐнными, ДНК повреждения формируют мутации, такие как замены оснований и транслокации хромосом, генетическую нестабильность, что нарушает нормальную экспрессию генов, ведет к появлению аномальных белков, пагубно влияющих на корректное функционирование клетки [114]. Повреждения ДНК могут быть вызваны экзогенным источником, например радиацией, или косвенно под действием экзогенных и эндогенных агентов, вызывающих окисление, алкилирование, гидролиз и другие метаболические превращения [89, 168]. Также могут нарушаться эпигенетические механизмы, такие как метилирование ДНК. Известны подобные изменения в генах, отвечающих за метаболическую детоксикацию, за восстановление поврежденной структуры ДНК [257]. В аспекте обсуждаемой проблемы особенную роль включающие приобретают вредные факторы привычки, такие неправильного как курение, образа жизни, злоупотребление алкоголем и употребление в пищу продуктов быстрого питания, которые способствуют развитию окислительного стресса и опосредуемых патологических изменений [111, 167, 218]. С социальными факторами в значительной степени связаны эмоционально-стрессовые реакции. В ранних работах С.Б. Середенина доказано, что эмоциональный стресс может вызвать хромосомные повреждения у млекопитающих [56]. Не меньшее значение имеют хронические инфекции, вызывающие воспалительную реакцию, генерацию перекисного окисления липидов и формирование активных форм кислорода. При хронических воспалительных процессах установлены различные повреждения ДНК, нарушенная репарация структуры ДНК, нарушенные процессы апоптоза поврежденных клеток [88]. Эпидемиологические исследования показывают, что в развитых странах, именно средовые факторы, непроизвольно воздействующие на организм, имеют большое значение для ДНК-повреждений [144, 226]. 31 1.4.2. Пути восстановления структуры ДНК В восстановлении повреждений структуры ДНК участвуют сотни генов. Многие дефекты быстро обнаруживаются, приводя к с активации сложной сети сигнальных путей, направленной на восстановление структуры ДНК [89]. В отношении восстановления поврежденной структуры ДНК ооцит человека превосходит зрелые сперматозоиды [187, 188]. Поэтому считается, что большинство повреждений ДНК эмбриона, возникают в мужской гамете [87]. К сожалению, не многое известно о качестве ДНК в ооцитах, исследования осложняются малым количеством материала для анализа. Точность репликации генома имеет принципиальное важное значение абсолютно в каждой клетке эмбриона [87]. Существует три варианта развития эмбриональных клеток с повреждениями ДНК. Первый заключается в активации апоптоза [75]. В этом случае выживаемость будет зависеть от баланса между проапоптотическими факторами и антиапоптотическими факторами, присутствующими в яйцеклетке. Второй путь – повреждения остаются неизмененными. Это может привести к мутациям и в последующем к возникновению пороков развития. Третий путь заключается в исправлении повреждений [87]. Ясно, что деструктивные и восстановительные процессы имеют свое соотношение в определенные временные промежутки. Обнаружение объективно регистрируемых показателей этих процессов представляется важным при беременности. 1.4.3. Методы измерения повреждений ДНК В настоящее время мониторинг повреждений ДНК преимущественно используется для оценки воздействия загрязнений окружающей среды (мутагенов). В свете вышеприведенных данных измерение повреждений ДНК имеет большое значение во время беременности, так как плод подвергается 32 тератогенным действиям различных факторов окружающей среды, а также субстанций, преодолевающих плацентарный барьер. Очевидно, что для таких замеров необходимы доступные, хорошо воспроизводимые методы. С этой точки зрения, маркер окислительного стресса 8-гидроксигуанин может быть легко обнаружен с помощью иммуноферментного анализа, различных хроматографических методов, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография, газовая хроматография и масс-спектроскопия, а также спектрофотометрического и флуоресцентного методов [120, 153]. Более чувствительны другие современные методы исследования повреждений ДНК. Метод "TUNEL" (The terminal deoxynucleotidyl transferasw-mediated dUTP-nick end-labeling) или терминальное дезоксиуридиновое мечение концов разорванной нити ДНК, представляется наиболее важным для оценки фрагментации ДНК. Этот анализ часто используется для оценки повреждения ДНК в сперме. Подобные исследования с помощью анализа TUNEL проводились в области проблем бесплодия и невынашивания беременности [174]. Еще один распространенный метод – метод ДНК-комет, позволяющий снимать профиль различных повреждений ДНК, включая 8-гидрокси-2-деоксигуанозин, а также позволяющий «от обратного», через оценку окислительных поражений, количественно и интегративно оценивать уровень антиоксидантной защиты [84, 112, 113, 137, 138, 254]. В литературе есть данные о том, что метод ДНК-комет также был использован для демонстрации увеличения ДНК-повреждений при осложненной беременности [86, 241, 268]. Данный метод позволил получить сведения о корреляциях между предмутационными поражениями ДНК эмбриональных клеток и нарушениями пре- и постнатального развития при действии ряда агентов [21, 23, 74]. Метод ДНК-комет является более чувствительным, чем TUNEL [154, 173]. 33 Еще одним распространенным методом регистрации ДНК-повреждений и ДНК-репараций является метод CBMN (The cytokinesis-block micronucleus cytome). Он используется для биомониторинга генотоксичности различных веществ. Исследования показали, что CBMN надежный, чувствительный метод измерения ДНК повреждений в лимфоцитах периферической и пуповинной крови. Этот метод был включен в протокол ряда исследований [132]. Недостатки этого метода заключаются в длительности тестирования (68-72ч) и сложности выполнения, что требует подбора высококвалифицированных лаборантов и научных сотрудников. Из представленных методов, метод ДНК-комет в его двух вариациях (single cell gel electrophoresis и fluorescence in situ hybridization) представляется наиболее удобным и значимым для определения ДНК повреждений и ДНК восстановлений в клетках при генотоксическом действии окислительного стресса. * * * Таким образом, анализ литературных данных показывает, что процесс репродукции является не столь результативным, в первом триместре от 30 до 80% беременностей заканчиваются спонтанными абортами. Большинство репродуктивных потерь происходят во время имплантации. Совокупность этиологических факторов позволяет рассматривать окислительный стресс в качестве важнейшего звена возможных нарушений. Не вызывают сомнения генотоксические эффекты окислительного стресса. В современных условиях жизни репродуктивное население подвергается воздействию экзогенных генотоксикантов. Известно, что генотоксичеким действием обладают многие вещества, в контакте с которыми беременные женщины находятся постоянно. Таким образом, многочисленные данные 34 свидетельствуют, что невынашивание беременности может быть связано с повреждающим макромолекулы ДНК и вызывающим мутагенез действием свободных радикалов, избыточное образование которых индуцируется экзо- и эндогенными факторами. Поэтому изучение вклада и роли окислительного стресса в генезе невынашивания беременности является перспективным направлением исследований для решения проблем акушерских потерь. Принципиально, что до сих пор отсутствуют методические возможности количественной оценки генотоксических повреждений и уровней окислительного стресса в эмбриональных клетках человека. Окислительный стресс – динамическая ситуация с непрерывно меняющимися параметрами, любая его оценка – это оценка «здесь и сейчас», а генотоксические оценки производятся post factum. Следовательно, ни те, ни другие не могут являться основой для разработки опережающей стратегии лечения и сохранения беременности. Выход из ситуации может основываться на двух предпосылках. Первая – фундаментальные наблюдения, доказывающие теснейшую взаимосвязь между окислительным стрессом и генотоксическими поражениями. Строго говоря, единственным мерилом окислительного стресса, его биомаркером, могут являться и являются исключительно повреждения ДНК. Исчерпывающе доказано, что модифицированное основание – 8-гидроксигуанин – специфический продукт свободнорадикальной атаки ДНК. Вторая – наличие методов регистрации генотоксических повреждений, в частности метода «ДНКкомет», который позволяет снимать профиль различных повреждений ДНК, включая 8-гидроксигуанин, а также позволяет «от обратного», через оценку окислительных поражений, количественно и интегративно оценивать уровень антиоксидантной защиты. Примечательно, что в этом случае речь идет не об отдельных показателях активности или содержания элементов антиоксидантной защиты (ферменты, низкомолекулярные антиоксиданты), а о регистрации 35 биологически значимых, интегративных биомаркеров. Учитывая системный характер окислительного стресса и универсальность генотоксического действия его продуктов на соматические, зародышевые и эмбриональные клетки, можно обоснованно рассчитывать, что оценка генотоксичности в сравнительно доступных клетках крови окажется достаточно информативной для прогноза исхода беременности и мониторинга возможного лечения. Исследования свободно радикальных повреждений и влияния окислительного стресса на течение беременности позволят добавить к алгоритму обследования женщин с невынашиванием беременности новые методики исследования, выявляющие предмутационные повреждения ДНК. Вызванные окислительным стрессом повреждения ДНК и белки восстановления структуры ДНК могут быть биомаркерами для ранней пренатальной диагностики заболеваний плода и патологий беременности, ранней диагностики и формирования алгоритма лечения. Дальнейшее изучение проблемы окислительного стресса при беременности позволит сформировать группы риска по невынашиванию беременности с учетом генотоксического действия окислительного стресса, создать научно-обоснованную базу для поиска патогенетической специфической терапии и профилактики мутационных поражений, что позволит снизить уровень репродуктивных потерь первой половины беременности. Учитывая вышеизложенные данные литературы, становится очевидной значимость исследования роли генотоксического действия окислительного стресса в генезе невынашивания беременности. 36 ГЛАВА 2. Методы исследования 2.1. Материал, объект исследования Клинический раздел работы выполнен на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, на базе кафедры в ГБУЗ городская клиническая больница № 55 и частично в женской консультации при ГБУЗ родильный дом № 10, в ГБУЗ Центр планирования семьи и репродукции № 2. В группы беременных включены пациентки с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» (группа 1), «Неразвивающаяся беременность» (группа 2), «Физиологически протекающая беременность» (группа 3). В международной классификации болезней 10-го пересмотра (МКБ10), принятой как единый нормативный документ для учета заболеваемости, диагнозы пациенток групп 1, 2 представлены как «Угрожающий аборт» (О20.0) и «Полный или неуточненный аборт» (О03.9). Обязательными условиями включения в исследование было согласие пациентки на участие в исследовании, срок беременности от 8 до 16 недель, отсутствие грубой генитальной или экстрагенитальной патологии. Из исследования исключали беременных, находящиеся в программах ВРТ. Дополнительно анализировали группу здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста без самопроизвольных прерываний беременности в анамнезе, также включенных в сравнительное исследование (группа 4). Диагноз «Начавшийся «Неразвивающаяся выкидыш. беременность», Ретрохориальная «Физиологически гематома», протекающая беременность» устанавливали на основании данных анамнеза, общего осмотра, 37 специального гинекологического исследования и ультразвукового сканирования органов малого таза. У пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» при прогрессирующей беременности проводили терапию, направленную на пролонгирование беременности, включающую назначение препаратов прогестерона, витаминотерапию, антиоксидантную терапию, спазмолитическую и гемостатическую терапию. При установке диагноза неразвивающейся беременности, пациенткам проводили инструментальное удаление измененного плодного яйца, выскабливание слизистой тела матки с последующей антибактериальной, противовоспалительной, утеротонической терапией, физиотерапией. При установке диагноза физиологически протекающей беременности пациенток наблюдали в женской консультации согласно протоколам ведения беременности. У всех пациенток, включенных в исследование, взято информированное согласие на участие в клиническом исследовании. 2.2. Клинико-лабораторное обследование Всем пациенткам, включенным в исследование, за время госпитализации или наблюдения проведено клинико-лабораторное обследование, включавшее в себя: 2.2.1. Активное выявление жалоб; 2.2.2. Сбор анамнестических данных: наследственность, аллергоанамнез, гемотрансфузии, гормонотерапия, эпидемиологический анамнез, заболевания, оперативные вредные вмешательства, трудовой анамнез, привычки, перенесенные менструальная функция, 38 секреторная функция, половая функция, репродуктивная функция, гинекологические заболевания. 2.2.3. Объективный осмотр: антропометрические показатели, температура тела, состояние кожных покровов и слизистых оболочек, телосложение, состояние периферических лимфатических узлов, щитовидной железы, молочных желез, оценка дыхательной, кровеносной, мочеполовой систем, желудочно-кишечного тракта, неврологический статус. 2.2.4. Гинекологический осмотр: оценка состояния развития наружных половых органов, оволосения; осмотр при помощи зеркал стенок влагалища и шейки матки, оценка характера выделений из цервикального канала; бимануальное влагалищно-абдоминальное исследование (емкость влагалища, положение, форма, размеры, консистенция, болезненность шейки матки, тела матки и придатков матки). 2.2.5. Лабораторное обследование: клинический анализ крови, определение группы крови и резус-фактора, обследование на ВИЧ, гепатиты В и С, антитела к Tr. Pallidum, биохимический анализ крови, коагулограмма, общий анализ отделяемого мочи, ЭКГ, цервикального бактериоскопическое канала, влагалища исследование и уретры, бактериологическое исследование отделяемого цервикального канала. 2.2.6. Ультразвуковое исследование: аппарат для проведения исследования – Voluson E8 фирмы GE, датчик – мультичастотный микроконвексный внутриполостной ректо-вагинальный, частота 4.0 - 11.0 МГц. Проводилось: оценка общего состояния органов малого таза, определение положения, формы, размеров матки, толщины и эхоструктуры эндометрия, миометрия, определение положения, формы, размеров, эхоструктуры яичников, измерение размеров плодного яйца (внутренний диаметр плодного яйца) и эмбриона (копчико-теменной размер), толщины 39 воротниковой зоны, положение и состояние хориона, наличие сердцебиения эмбриона. 2.3. Специальные Специальное исследование исследования выполнены на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова при консультативном участии членкорр. РАН А.Д. Дурнева и в.н.с. А.К. Жанатаева. В качестве материала использовали венозную кровь, забор которой производили из локтевой вены единовременно в объёме 15мл (2 системы взятия крови по 7,5мл) в гинекологических отделениях ГБУЗ ГКБ № 55. В группах 1, 3 пациенток с прогрессирующей беременностью забор крови произведен трижды, каждые 2 недели в гестационные сроки 10-11 недель, 1213 недель, 14-15 недель. В группе 2 пациенток с неразвивающейся беременностью забор крови произведен однократно. Согласно поставленным цели и задачам, специальное исследование включало: оценку ДНК-повреждений в клетках крови методом ДНК-комет в щелочной версии, оценку устойчивости клеток крови к ДНК-повреждающему действию перекиси водорода методом ДНК-комет, оценку уровней 8-гидрокси2-деоксигуанозина в ДНК клеток крови модифицированным методом ДНКкомет, оценку уровней P53 в сыворотке крови, оценку уровней цитохрома С в сыворотке крови, оценку уровней 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в сыворотке крови, оценку концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови. 40 2.3.1. Оценка ДНК-повреждений в клетках крови Уровень ДНК-повреждений в клетках крови оценивали методом гельэлектрофореза отдельных клеток (метод «ДНК-комет»). Данный метод позволил определить интегрально все типы повреждений (одно – и двунитевые разрывы, щелочно-лабильные сайты), в том числе индуцированные по свободнорадикальному механизму. Метод основан на регистрации различной подвижности в постоянном электрическом поле ДНК и фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий «хвост кометы» (рис. 1), параметры которого зависят от степени поврежденности ДНК [112]. Рис. 1. Цифровое изображение с препарата ДНК-комет Метод использовали в соответствии с общепринятым протоколом [247]. Кровь отбирали в пробирки с антикоагулянтом (цитрат натрия). Образцы крови в объеме 50 мкл. вносили в пробирки с 500 мкл. 1% раствора легкоплавкой агарозы (Sigma, кат. №A9414, low gelling agarose), ресуспендировали и наносили на предварительно покрытые агарозой предметные стекла (Panreac, кат.№374113 Agarose Type I standard). После затвердевания агарозы микропрепараты лизировали охлажденным буфером (10 mM Tris-HCl [pH 10], 41 2.5 M NaCl, 100 mM EDTA-Na2, 1 % Triton X-100, 10% DMSO) не менее 1 часа. После окончания лизиса микропрепараты инкубировали буфером для электрофореза (300 mM NaOH , 1 mM EDTA-Na2, pH>13) в течение 20 минут для реализации щелочно-лабильных сайтов и щелочной денатурации ДНК. Проводили электрофорез в течение 20 минут при напряженности поля 1V/cm и силе тока ~300 mA. После проведения электрофореза микропрепараты фиксировали в 70% растворе этилового спирта, высушивали и хранили до анализа при комнатной температуре. Непосредственно перед микроскопированием препараты окрашивали флуоресцирующим красителем SYBR Green I (Invitrogen), 1:10000 в ТЕ-буфере, в течение 30 мин. Анализ проводили на эпифлуоресцентном микроскопе Микмед-2 12T («Ломо», Россия), совмещенном с цифровой камерой высокого разрешения (VEC-335, «ЭВС», Россия), при увеличении х200. Полученные с микропрепаратов изображения ДНК-комет анализировали с использованием программного обеспечения CASP 1.2.2. (рис. 2). В качестве показателя поврежденности ДНК использовали процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте от общего количества ДНК в комете). Рис. 2. Анализ цифровых изображений ДНК-комет в программной среде CASP 1.2.2 42 2.3.2. Оценка индуцируемых ДНК-повреждений ex vivo Метод позволяет косвенно оценить антиоксидантную систему защиты на уровне отдельных клеток. Клетки крови подвергали воздействию перекиси водорода в концентрации 100 мкм в течение 5 минут при температуре 5 0С. По окончанию инкубации клетки переносили в агарозный гель и проводили процедуры по методу ДНК-комет как описано выше. Индуцируемые ДНКповреждения оценивали в Δ%ДНК в хвосте, определяемом как разница показателей %ДНК в хвосте в клетках, обработанных H2O2 и аналогичного показателя для необработанных клеток. 2.3.3. Определение уровня 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в клетках крови Данный показатель используется в качестве маркера свободно- радикального повреждения ДНК. Для оценки содержания 8-гидрокси-2деоксигуанозина в ДНК клеток использовали набор ― Human 8-oxoGuanine DNA Glycosylase (OGG1) FLARE Assay‖ (R&D Systems Inc., USA, Catalog Number 4130-100-FK). FLARE (Fragment Length Analysis using Repair Enzymes) является модификацией метода ДНК-комет и основан на регистрации уровней одно- и двухнитевых разрывов ДНК индивидуальных клеток после обработки hOGG1 – ферментом эксцизионной репарации 8-гидроксигуанина в ДНК клеток [112]. Приготовление препаратов для анализа проводили в соответствии с инструкцией производителя. Образцы крови в объеме 50 мкл вносили в пробирки с 500 мкл 1% раствора легкоплавкой агарозы (Sigma, кат. №A9414, low gelling agarose), ресуспендировали и наносили по 35 мкл геля с клетками в две лунки двухлуночных предметных стекол с гидрофобным покрытием. После затвердевания агарозы микропрепараты лизировали в охлажденном буфере (10 mM Tris-HCl [pH 10], 2.5 M NaCl, 100 mM EDTA-Na2, 1 % Triton X-100, 10% 43 DMSO) не менее 1 часа. После лизиса микропрепараты дважды отмывали в нейтрализующем буфере. На одну лунку наносили 25 мкл буфера для фермента, на другую лунку наносили 25 мкл фермента hOGG1 (1:200 в буфере) и накрывали покровным стеклом. Микропрепараты инкубировали в течение 1 часа при 370С во влажной камере. По окончанию микропрепараты помещали в электрофорезный буфер и проводили процедуры стандартной методики ДНКкомет, как описано выше. Содержание 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина выражали в %ДНК в хвосте, определяемом как разница показателей %ДНК в хвосте в лизированных клетках, обработанных hOGG1 и аналогичного показателя для лизированных клеток, обработанных только ферментным буфером [247]. 2.3.4. Определение уровня белка P53 в сыворотке крови Данный показатель рассматривается в качестве маркера апоптоза и ДНК повреждений. Кровь отбирали в пробирки BD Vacutainer® PLUS с разделительным гелем для получения сыворотки. Образцы сыворотки до анализа хранили при -200С. Оценку уровней белка P53 в сыворотке проводили иммуноферментным методом с использованием набора «Human P53 Platinum ELISA» (eBioscience, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию P53 выражали в условных единицах на мл сыворотки (U/ml). 2.3.5. Определение уровня белка цитохрома С в сыворотке крови Показатель является маркером апоптотической гибели клеток через митохондриальный путь, активируемый при окислительном стрессе и ДНК повреждениях. Кровь отбирали в пробирки BD Vacutainer® PLUS с разделительным гелем для получения сыворотки. Образцы сыворотки до 44 анализа хранили при -200С. Оценку уровней cyt c в сыворотке крови проводили иммуноферментным методом с использованием набора «Human Cytochrome c Platinum ELISA» (eBioscience, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию cyt c выражали в нг/мл сыворотки. 2.3.6. Оценка уровней 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови Показатель является маркером повреждений ДНК. Кровь отбирали в пробирки BD Vacutainer® PLUS с разделительным гелем для получения сыворотки. Образцы сыворотки до анализа хранили при -200С. Оценку проводили иммуноферментным методом с использованием набора «8-hydroxy2-deoxyGuanosine EIA Kit» (Cayman Chemical, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина выражали в нг/мл сыворотки. 2.3.7. Оценка концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови Для получения плазмы образцы крови после отбора аликвот для проведения метода ДНК-комет центрифугировали в два этапа, 10 минут при 1000 g, затем 10 минут при 5000 g. Концентрацию внеклеточной ДНК в плазме крови определяли с использованием набора Qubit® dsDNA HS Assay Kit (Invitrogen, USA) на флуориметере Qubit® 1.0, в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию внеклеточной ДНК выражали в нг/мл плазмы. 2.4. Методы статистического анализа полученных данных Статистический анализ полученных экспериментальных данных проводили при консультативном руководстве научного сотрудника ФГБНУ 45 НИИ фармакологии им. Н.Н. Закусова Н.Г. Богдан при помощи пакета программ Statistica 10 (StatSoft Inc.). Для оценки свойств распределения исследуемых показателей использовали критерии Шапиро-Уилка и Колмогорова-Смирнова. Для анализа количественных показателей использовали: непараметрический дисперсионный анализ по методу Краскела-Уоллеса и метод апостериорных множественных сравнений – при сравнении трѐх и более независимых групп, дисперсионный анализ по методу Фридмена – при внутригрупповых сравнениях в случаях множественных повторных измерений. Для попарных сравнений применяли U-критерий Манна-Уитни при анализе данных независимых групп и T-критерий Вилкоксона при сопоставлении зависимых групп. Корреляционные зависимости между показателями оценивали по методу Спирмена. В случаях нормального распределения параметров использовали t-критерии Стьюдента для зависимых и независимых групп. Качественные показатели оценивали при помощи метода хи-квадрат (Пирсона и максимального правдоподобия) и точного критерия Фишера. Полученные результаты считали статистически достоверными при значениях p<0,05 [12, 17, 53]. 46 Глава III. Клиническая характеристика групп В соответствии с целью и задачами диссертационного исследования обследованы 94 женщины, разделенные на 4 группы. Первую группу составили 20 пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома». Во вторую группу включены 25 пациенток с неразвивающейся беременностью. 24 пациентки с нормально протекающей беременностью, без репродуктивных потерь в анамнезе, без выраженной экстрагенитальной и генитальной патологии, не проходящие в программах ВРТ составили третью группу. 25 небеременных женщин без репродуктивных потерь в анамнезе, без выраженной экстрагенитальной и генитальной патологии вошли в четвертую группу. Сбор материала групп с патологией беременности и группы небеременных женщин проведен на базе кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета исследовательский расположенной клиническая медицинский в ВПО № протекающей национальный Российский университет гинекологических больница физиологически ГБОУ им. отделениях Н.И. Пирогова, ГБУЗ городская 55. Сбор материала группы пациенток с беременностью проведен в женской консультации при ГБУЗ родильный дом № 10 и в ГБУЗ Центр планирования семьи и репродукции № 2. В процессе исследования данные каждой пациентки занесены в специально созданную электронную статистическую базу, включающую следующие параметры: возраст, антропометрические показатели, индекс массы тела, анамнестические данные, в том числе информация об образовании, материальном положении, условиях труда и быта, вредных привычках, перенесенных и хронических заболеваниях, самооценка подверженности психоэмоциональному стрессу и наличия тревожных расстройств, о профессиональных вредностях, особенности гинекологического анамнеза, 47 количество беременностей, родов и акушерских потерь, данные о приеме лекарственных препаратов во время беременности, а также результаты клиниколабораторного обследования и специального исследования. Все женщины, включенные в настоящее исследование, проживали в одинаковых климатогеографических зонах, в г. Москва и Московской области. При оценке распределения параметров по группам процент вычисляли условно. При статистическом анализе количественных показателей использовали непараметрический дисперсионный анализ по методу Краскела-Уоллеса, при сравнении трех или четырех независимых групп – метод апостериорных множественных сравнений. При попарных сравнениях применяли U-критерий Манна-Уитни и Т-критерий Вилкоксона. При оценке качественных показателей использовали метод Хи-квадрат и точного критерия Фишера. По возрасту обследованные женщины варьировали от 20 до 37 лет (n = 94). В группе 1 возраст пациенток составил от 23 до 34 лет, среднее значение – 28,7±3,7 (n = 20). В группе 2 средний возраст оказался сходным – 28,4±3,5 лет, в пределах от 22 лет до 37 лет (n = 25). В группу 3 вошли пациентки от 22 лет до 37 лет, средний возраст – 27,2±3,2 лет (n = 24). В группе 4 минимальный возраст женщин составил 20 лет, максимальный 35 лет, средний возраст – 24,2±3,7 лет (n = 25). При проведении статистического анализа однородности групп 1–3 достоверных различий по возрасту не установлено (р = 0,33). Средний возраст женщин группы 4 был меньше, чем в группах беременных пациенток (p 0,01). (Таблица 1). Таблица 1. Средний возраст обследованных пациенток Группа 1 «Начавшийся Возраст Группа 2 Группа 3 Группа 4 «Неразвивающаяся «Физиологическая «Небеременные выкидыш» беременность» беременность» женщины» n M n M n M n M 20 28,7±3,7 25 28,4±3,5 24 27,2±3,2 25 24,2±3,7 48 Исходя из данных литературы о влиянии индекса массы тела на течение беременности, увеличении риска спонтанного прерывания беременности при повышенном индексе, анализировали антропометрические данные [99, 190, 191]. Установлено, что по показателям роста, массы тела и индекса массы тела группы были однородными, статистически достоверно не различаясь (вес: р = 0,62, рост: р = 0,46, индекс массы тела: p = 0,21). В группе 1 пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» средний рост составил 165,95,9см (n =20), варьируя от 154см до 180см, средний вес – 62,910,7кг (n = 20), в пределах от 48кг до 84кг. Индекс массы тела в среднем был равен 22,83,6кг/рост2 (n =20), колеблясь от 18,3кг/рост2 до 30,9кг/рост2. В группе 2 пациенток с неразвивающейся беременностью средний рост пациенток составил 165,34,76см (n = 25), варьируя от 154см до 173см, средний вес – 62,612,2кг (n = 25), средний индекс массы тела – 22,84,8кг/рост2 (n =25), варьируя от 16,6кг/рост2 до 37,1 кг/рост2. В группе 3 пациенток с физиологически протекающей беременностью средний рост пациенток составил 166,75,3см (n = 24), варьируя от 157см до 175см, средний вес – 59,56,7кг (n = 24), средний индекс массы тела – 21,42кг/рост2 (n =24), варьируя от 17,4кг/рост2 до 24,8 кг/рост2. В группе небеременных женщин средний рост составил 1676,5см (n = 25), варьируя от 150см до 176см, средний вес – 58,15,7кг (n = 25), средний индекс массы тела – 20,91,8кг/рост2 (n =25), варьируя от 18кг/рост2 до 24,5кг/рост2. Результаты представлены в таблице 2. 49 Таблица 2. Антропометрические показатели обследованных пациенток, ИМТ Группа 1 «Начавшийся выкидыш» Рост Группа 2 Группа 3 Группа 4 «Неразвивающаяся «Физиологическая «Небеременные беременность» беременность» женщины» n M n M n M n M 20 165,95,9 25 165,34,76 24 166,75,3 25 1676,5 Вес 62,910,7 62,612,2 59,56,7 58,15,7 ИМТ 22,83,6 22,84,8 21,42 20,91,8 В качестве социальных факторов с возможным влиянием на течение и исходы беременности, определяли социально-экономический статус женщин, включенных в исследование, оценивая такие показатели, как уровень образования, материальное положение, профессиональную занятость. В отобранных группах женщины имели высшее/неоконченное высшее или среднее образование. В группе 1 50% (n = 10) женщин имели высшее или неоконченное продолжающееся высшее образование, 50% (n = 10) – среднее специальное образование. В группе 2 72% (n = 18) женщин имели высшее образование или были студентками учреждений высшего профессионального образования, 28% (n = 7) – среднее специальное образование. Пациентки с нормально протекающей беременностью в своем большинстве имели высшее образование или продолжали обучение, имея среднее образование – в 87,5% (n = 21) случаев. 12,5% (n = 3) не имели высшего образования, получив среднее. В группу 4 вошли женщины с высшим образованием либо продолжающие обучение в вузах (n = 25). Данные представлены на гистограмме 1. По анализируемым показателям выявлены статистически значимые отличия при оценке всех групп (2 18,39, р = 0,0004), так и по группам 1 – 3 (2 7,47, р = 0,02). При сравнении групп с патологией беременности (1, 2) достоверные различия отсутствовали (2 2,29, р = 0,13). При сравнении групп пациенток с 50 нормально протекающей беременностью и небеременных (3, 4) так же не выявлено достоверных отличий (2 3,33, р = 0,07). Таким образом, однородными по параметрам образования оказались группы пациенток с патологией беременности, и группы с нормально протекающей беременностью и небеременных. Гистограмма 1. Уровень образования пациенток * 100% * 87,50% 100% 90% Группа 1 "НчВ. РГ" 72% 80% Группа 2 "НБ" 70% 60% Группа 3 "Физ. Б" 50% Группа 4 "Небеременные" 50% 50% 28% 12,50% 0% 40% 30% Группа 4 "Небеременные" 20% Группа 3 "Физ. Б" 10% Группа 2 "НБ" 0% Группа 1 "НчВ. РГ" Высшее, неокон. высшее Среднее * - статистически достоверные различия, p < 0,05 Практически все женщины, включенные в исследование, оценили свое материальное положение как среднее, лишь по одной пациентке (5%) из группы 1 и группы 2 – как высокое, и по одной из тех же групп – низким. Статистических различий по данным параметрам не выявлено (2 4,66, р = 0,58). В группе 1 пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» 15% (n = 3) были домохозяйками, 85% (n = 17) профессионально занятыми или студентками образовательных учреждений. 51 Пациентки из группы 2 «Неразвивающаяся беременность» работали или были учащимися в 76% случаев (n = 19), 24% (n = 6) не работали. Женщины с нормально протекающей беременностью в своем большинстве были трудоустроены или были учащимися (83,3% (n = 20), 16,7% (n = 4) были домохозяйками. Среди небеременных 100% составили работающие женщины или учащиеся в учреждениях высшего профессионального образования (n = 25). Достоверных статистических различий по данному показателю не выявлено (2 6,37, р = 0,09). Профессиональная деятельность может быть связана с контактами с токсическими продуктами, воздействиями электромагнитного излучения, например, при постоянной работе с компьютером, на что также обращали внимание при характеристике групп. Ни одна из обследованных не отметила контакта с токсическими веществами. Среди пациенток из группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» 60% (n = 12) постоянно работали с компьютером, 40% (n = 8) им не пользовались. Среди пациенток группы 2 с неразвивающейся беременностью постоянную работу с компьютером отметили 56% (n = 14), 44% (n = 11) не использовали компьютер. В группе 3 пациенток с физиологически протекающей беременностью 37,5% (n = 9) постоянно использовали компьютер, 62,5% (n = 15) не использовали. В группе небеременных 80% (n = 20) постоянно работали с компьютером, лишь 20% (n = 5) не пользовали. При сравнении групп 1 – 3 достоверных различий не установлено (2 2,65, р = 0,27). Больший контакт с компьютером имели небеременные (2 9,2, р = 0,03). Таким образом, по характеру работы с компьютером исследуемые группы беременных были однородными. Данные представлены на гистограмме 2. 52 Гистограмма 2. Работа пациенток с компьютером * 80% 80% 62,50% 70% 60% 56% 60% 50% 40% 37,50% 44% Группа 1 "НчВ. РГ" Группа 2 "НБ" 40% Группа 3 "Физ. Б" 20% Группа 4 "Небеременные" 30% 20% 10% Группа 4 "Небеременные" Группа 3 "Физ. Б" Группа 2 "НБ" 0% Группа 1 "НчВ. РГ" * - статистически достоверные различия, p < 0,05 Многочисленные исследования указывают на отрицательное влияние табакокурения и употребления алкоголя во время беременности [36, 82, 209, 243, 251]. В нашем исследовании не оказалось женщин, употреблявших алкоголь во время беременности. По табакокурению, в группе 1 с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» только одна пациентка подтвердила факт табакокурения 5%, 95% (n = 19) не курили. В группе 2 среди пациенток с неразвивающейся беременностью выявлено 16% (n = 4) курящих во время беременности женщин, 84% (n = 21) не курили. В группе 3 с физиологически протекающей беременностью одна пациентка курила (4,2%), а 95,8% (n = 23) не курили. В группе небеременных было три курящих (12%), 53 88% (n = 22) не курили. Достоверных различий между группами как беременных, так и небеременных не выявлено (2 2,66, р = 0,45). Информативными представлялись данные о эмоционально-стрессовых нагрузках и состоянию тревожности. Не проводя специального исследования, мы включили в характеристики пациенток данные самооценки. В группе 1 80% (n = 16) женщин отметили наличие хронического стресса, и лишь 20% (n = 4) его отрицали, повышенный уровень тревожности также отметили 80% (n = 16). Пациентки группы 2 с неразвивающейся беременностью оценили уровень стресса в своей жизни как высокий в 60% (n = 15) случаев, для 40% (n = 10) стресс был незначим. Повышенную тревожность отметили 64% (n = 16) пациенток, тогда как 36% (n = 9) отрицали ее наличие. Пациентки, чья беременность протекала без патологии, в отличии от групп 1, 2 с патологией беременности, лишь в 25% (n = 6) случаев считали себя подверженными психоэмоциональному стрессу, при отсутствии такого в 75% (n = 18). В этой группе тревожность отметили 29,2% (n = 7) пациенток, что ниже, чем в группах с патологией беременности. Таким образом, выявлены достоверные различия по самооценке подверженности психо-эмоциональному стрессу и тревожности между группами с патологией беременности (1, 2) и группой 3 с нормально протекающей беременностью (2 13,91, р = 0,00095) (2 12,36, р = 0,002). Практически все небеременные женщины считали себя подверженными психоэмоциональному стрессу – 80% (n = 20), оставшиеся 20% (n = 5) дали отрицательный ответ, тревожность отметили 48% (n = 12), оставшиеся 52% (n = 13) ее не отмечали. Данные представлены на гистрограммах 3 и 4. Установлены статистически достоверные различия между группами по самооценке подверженности психо-эмоциональному стрессу (2 19,84, р = 0,00018) и по тревожности (2 12,78, р = 0,005). Однако между группами с патологией беременности достоверных различий не выявлено (2 2,07, р = 0,15), (2 1,38, р = 0,24). При сравнении группы 3 с группой небеременных пациенток по 54 показателю самооценки подверженности психо-эмоциональному стрессу выявлены статистически значимые различия (2 15,73, р = 0,00012). По показателю самооценки уровня тревожности достоверных различий в данных группах не выявлено (2 1,85, р = 0,18). При сравнении данных показателей в группах с патологией беременности и среди небеременных женщин достоверных различий не выявлено (2 3,25, р = 0,2; 2 4,9, р = 0,09). Несмотря на условность метода самооценки, достоверные различия между пациентками с нормально протекающей беременностью и при патологии представляют интерес для дальнейшего обсуждения. Гистограмма 3. Самооценка подверженности психо-эмоциональному стрессу * 80% 75% 80% 80% 70% 60% 60% * 50% 25% 40% Группа 1 "НчВ. РГ" 40% Группа 2 "НБ" 20% Группа 3 "Физ. Б" Группа 4 "Небеременные" 30% 20% 20% 10% Группа 4 "Небеременные" Группа 3 "Физ. Б" Группа 2 "НБ" 0% Группа 1 "НчВ. РГ" Стресс "+" Стресс "-" * - статистически достоверные различия, p < 0,05 55 Гистограмма 4. Самооценка тревожности 80% 71% 80% 64% 70% 48% 52% 60% * 50% 29% 36% Группа 1 "НчВ. РГ" 40% Группа 2 "НБ" 30% Группа 3 "Физ. Б" 20% 20% 10% Группа 4 "Небеременные" Группа 4 "Небеременные" Группа 3 "Физ. Б" Группа 2 "НБ" 0% Группа 1 "НчВ. РГ" * - статистически достоверные различия, p < 0,05 Анализ репродуктивной функции пациенток, включенных в исследование позволяет отметить следующие показатели. Среднее число беременностей во всех группах составило 1,661,43. Выявлено, что в группе 1 пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» среднее количество беременностей составило 2,41,42, настоящая беременность в 25% (n = 5) случаев была первой, в 45% (n = 9) – второй, в 15% (n = 3) – третьей, в 10% (n = 2) – четвертой по счету, в одном случае настоящая беременность оказалась седьмой по счету беременностью 5% (n = 1). Среднее количество родов в группе 1 составило 0,350,49. В данной группе родами предыдущие беременности закончились лишь в 25,9% (n = 7), остальные 55,6% беременностей самопроизвольно прервались в первом триместре (n = 15), причем из этого числа у одной пациентки в анамнезе было два самопроизвольных выкидыша (в 6,7% (n = 1)), у одной – три самопроизвольных 56 прерывания беременности (в 6,7% (n = 1)). Среднее количество выкидышей составило 0,750,79. Аборты произведены в 18,5% (n = 5) случаев, их среднее количество по группе составило 0,250,55. Настоящая беременность в 95% случаев (n = 19) завершилась срочными родами, в одном случае беременность закончилась преждевременно в 36 недель (5%). В группе 2 пациенток с неразвивающейся беременностью среднее количество беременностей составило 2,61,2, среднее количество родов – 0,60,7, из всех предыдущих беременностей (n = 39) родами закончились 38,5% (n = 15), самопроизвольные выкидыши в первом триместре встречались в 43,6% (n = 17) случаев, их среднее количество – 0,680,8. Из этого числа неразвивающиеся беременности наблюдались повторно у двух пациенток (11,8%), у одной пациентки в анамнезе было 3 неразвивающиеся беременности (5,9% (n = 2) случаев). Произведено 7 абортов (17,9%), их среднее число в группе составило 0,320,6. Среди пациенток группы 3 с физиологически протекающей беременностью среднее число беременностей составило 1,61, настоящая беременность была повторной в 33,3% (n = 8) случаев. Среднее число родов составило 0,40,7. Репродуктивных потерь в данной группе не было по критериям включения в соответствии с целью и задачами работы. 4 пациентки (16,7% (n = 4)) добровольно прерывали предыдущие беременности, среднее число абортов в группе составило 0,20,5. Настоящая беременность в 95,8% (n = 23) закончилась срочными родами, одна беременность закончилась преждевременно в сроке 35 недель (4,2% (n = 1) случаев). В группе 4 в анамнезе небеременных женщин в 12% (n = 3) случаев были срочные роды. Среднее число беременностей в группе составило 0,20,6, среднее число родов – также 0,20,6. Репродуктивных потерь и абортов в данной группе не было. При сравнении групп 1 – 3 достоверные различия выявлены по количеству беременностей (р = 0,049). По количеству родов все группы оказались однородными (р = 0,08), как и по количеству 57 абортов (р = 0,09). По количеству выкидышей в группах 1 и 2 достоверных различий не выявлено (р = 0,6966). Основные данные представлены в таблице 3. Таблица 3. Репродуктивная функция пациенток Количество Группа 1 Группа 2 Группа 3 Критерий «НчВ. РГ» «НБ» «Физ. Б» значимости р n M n M n M 20 2,41,42 25 2,61,2 24 1,61 беременностей 0,049 Количество 0,350,49 0,60,7 0,40,7 0,45 0,250,55 0,320,6 0,20,5 0,802 0,750,79 0,680,8 0 0,01 родов Количество абортов Количество выкидышей В нашем исследовании не было пациенток с эктопической беременностью, а также с бесплодием в анамнезе. Приведенные выше данные демонстрируют отсутствие существенных различий по показателям репродуктивной функции в группах 1, 2 пациенток с патологией беременности. Группа 3 пациенток с физиологически протекающей беременностью по среднему количеству беременностей и среднему количеству выкидышей статистически достоверно отличалась, что объясняется критериями включения в исследование для выполнения поставленной цели и задач (р = 0,049, р 0,01). Известно, что в течение беременности вносит большой вклад генитальная патология. Мы изучили такие показатели, как наличие в анамнезе миомы матки, наружного эндометриоза, аденомиоза, эктопии шейки матки, рубцовой деформации шейки матки, воспалительных заболеваний: хронического 58 цервицита, хронического сальпингоофорита, эндометрита, а также апоплексии яичников, дисфункции яичников, гиперплазии и полипов эндометрия. Данные представлены на гистограммах 5 и 6. Миома матки среди включенных в исследование пациенток не встречалась. Наружный эндометриоз выявлен в 5% случаев у одной женщины из группы 1. В других группах данной патологии не наблюдалось. Аденомиоз выявлен лишь у двух пациенток, обе входили в состав группы 2, их количество составило 8%. Статистически достоверных различий по данным параметрам не выявлено (2 3,74, р = 0,29) (2 5,64, р = 0,13). В группе 1 пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» эктопия шейки матки встречалась в 25% (n = 5) случаев. В группе 2 пациенток с неразвивающейся беременностью данная патология встречалась в 36% (n = 9) случаев. Среди пациенток с нормально протекающей беременностью эктопия шейки матки наблюдалась в 25% (n = 6) случаев. В группе небеременных у 3 пациенток выявлена эктопия шейки матки (12%). По данному показателю достоверных различий не обнаружено (2 3,9, р = 0,27). Рубцовая деформация шейки матки выявлена у двух пациенток группы 1 (10%), у 4 пациенток группы 2 (16%), у 2 пациенток группы 3 (8,3%). В группе небеременных данной патологии не наблюдалось. По данному параметру группы статистически достоверно не отличались (2 6,5, р = 0,09). Апоплексию яичников в анамнезе отметила одна пациентка из группы 1 (5%) и одна пациентка из группы 3 с нормально протекающей беременностью (4%). Статистически достоверных различий по данному показателю не выявлено (2 2,31, р = 0,51). Дисфункция яичников репродуктивного периода в группе 1 пациенток с начавшимся выкидышем наблюдалась в 10% (n = 2) случаев, в четырех – при 59 неразвивающейся беременности (16%), в одном – при физиологически протекающей беременности (4,2%). Среди небеременных у 5 женщин отмечена данная патология (20%). По этому параметру группы также однородны (2 3,14, р = 0,37). Гиперпластические процессы эндометрия выявлены у одной пациентки из группы 1 (5%), у двух пациенток с неразвивающейся беременностью (8%), у одной пациентки из группы без патологии беременности (4,2%). В группе небеременных гиперплазии или полипов эндометрия не наблюдалось. По данному показателю группы оказались однородными (2 1,99, р = 0,57). Гистограмма 5. Гинекологические заболевания 60 Хронический цервицит в группе 1 не выявлен, а в группе 2 установлен у трех женщин (12%). У четырех пациенток с физиологически протекающей беременностью диагностирован хронический цервицит (16,7%), а среди небеременных у 2-х (8%). Статистически достоверно по данному показателю группы не отличались (2 4,24, р = 0,24). На наличие хронического сальпингоофорита в анамнезе указали 6 пациенток группы 1 (24%), 6 пациенток группы 2 с неразвивающейся беременностью, (28%), 6 пациенток группы 3 с нормально протекающей беременностью (25%). Среди небеременных данная патология диагностирована у 4 пациенток (16%). Все пациентки, включенные в данное исследование, находились в стадии стойкой ремиссии хронического сальпингоофорита. Статистически достоверных различий выявлено не было (2 1,47, р = 0,69). Хронический эндометрит в анамнезе наблюдался лишь у одной пациентки из группы 1 (5%), и у одной из группы 2 (4%). В группах без патологии беременности и среди небеременных хронического эндометрита не выявлено. Достоверные различия по данному показателю отсутствовали (2 2,28, р = 0,52). 61 Гистограмма 6. Воспалительные заболевания органов малого таза 28% 30% 24% 25% 20% 16,70% 15% 25% 16% 12% Группа 1 "НчВ. РГ" 8% 10% 5% 5% 0% 0% Группа 2 "НБ" 4% 0% 0% Группа 3 "Физ. Б" Группа 4 "Небеременные" Известно, что нарушение микробиоциноза влагалища оказывает влияние на течение беременности. В настоящем исследовании выявляли наличие в анамнезе бактериального вагиноза, присутствия условно патогенной и патогенной микрофлоры: уреаплазмы, микоплазмы, хламидий, кандиды, носительство цитомегаловирусной инфекции (ЦМВ), вируса папилломы человека (ВПЧ), вируса простого герпеса (ВПГ). Данные по нарушению микробиоциноза влагалища представлены на гистограмме 7. Бактериальный вагиноз в анамнезе в группе 1 установлен в семи случаях (35%), при этом у всех семи пациенток выявлен уреаплазмоз. В данной группе кандидоз выявлен у 30% (n = 6), ЦМВ у 25% (n = 5), ВПГ у 20% (n = 4), ВПЧ у 2 пациенток (10%). В группе 2 пациенток с неразвивающейся беременностью бактериальный вагиноз в анамнезе встречали в 44% случаев (n = 11), как и первой группе у всех пациенток с бактериальным вагинозом был выявлен уреаплазмоз. Кандидоз в анамнезе установлен в 28% случаев (n = 7), ЦМВ 62 также у 28% (n = 7) пациенток, ВПГ – у 40% (n = 10), ВПЧ – у 4 пациенток (16%). В группе с нормально протекающей беременностью 10 пациенток (41,7%) имели в анамнезе бактериальный вагиноз, уреаплазмоз – 41,7% (n = 10), кандидоз – у 20,8% (n = 5), носительство антител к ЦМВ выявлено в 16,7% (n = 4), к ВПГ – в 12,5% (n = 3), ВПЧ – лишь в одном случае (4,2%). В группе небеременных всего у 4 пациенток (16%) выявлен в анамнезе бактериальный вагиноз, во всех случаях преобладала условнопатогенная микрофлора – уреаплазма. Кандидоз выявлен в 12% (n = 3), ЦМВ – в 24% (n = 6), ВПГ – в 40% (n = 10), ВПЧ в трех случаях (12% (n = 3). Ни у одной пациентки из обследованной выборки не выявлен хламидиоз. Статистический анализ по данным показателям достоверных различий не обнаружил (Бактериальный вагиноз 2 7,23, р = 0,06, ЦМВ 2 1,77, р = 0,62, ВПЧ 2 1,87, р = 0,6, ВПГ 2 7,61, р = 0,05). Гистограмма 7. Нарушения микробиоциноза влагалища в анамнезе 45% 44% 41,70% 44% 41,70% 40%40% 40% 35% Группа 1 "НчВ. РГ" 35% 35% 30% 28% 30% Группа 2 "НБ" 28% 25% 25% 20% 15% 20,80% 16% Группа 3 "Физ. Б" 24% 16,70% 16% 12% Группа 4 "Небеременные" 20% 16% 12,50% 10% 12% 10% 5% 0% 4,20% 63 Врожденная тромбофилия, как возможный фактор невынашивания беременности, в нашем исследовании выявлена лишь у двух пациенток, у одной из группы 1 (5%) и у одной из группы 2 (4%), что не внесло статистически достоверных различий (2 2,28, р = 0,52). Экстрагенитальная патология, такая как заболевания мочевой системы, сердечно-сосудистой системы, пищеварительного тракта, дыхательной системы, эндокринопатии также могут осложнять течение беременности. Хронический пиелонефрит в стадии стойкой ремиссии выявлен у 2 пациенток группы 1 (10%), хронический цистит в стадии стойкой ремиссии – у 6 пациенток группы 1 (30%). В группе 2 пациенток с неразвивающейся беременностью хронический пиелонефрит в стадии стойкой ремиссии встречался в 8% (n = 2), хронический цистит в стадии стойкой ремиссии – в 36% (n = 9). В группах пациенток без патологии беременности и небеременных хронический пиелонефрит отметили по одной пациентке из каждой группы (4,2% и 4%), хронический цистит – по пять пациенток: 20,8% пациенток с нормально протекающей беременностью, 20% пациенток группы небеременных. Все пациентки данных групп отметили отсутствие обострений хронического пиелонефрита и хронического цистита в течение последних трех лет. Достоверных различий между всеми группами по данным показателям не выявлено: 2 0,98, р = 0,8 при сравнении по наличию хронического пиелонефрита, 2 2,22, р = 0,53 при сравнении по наличию хронического цистита. Данные представлены на гистограмме 8. 64 Гистограмма 8. Хронические заболевания мочевой системы 40% 36% 35% 30% 30% 25% 20,80%20% 20% 15% 10% 10% Группа 1 "НчВ. РГ" Группа 2 "НБ" Группа 3 "Физ. Б" Группа 4 "Небеременные" 8% 4,20% 4% 5% 0% Хр. пиелонефрит Среди заболеваний Хр. Цистит сердечно-сосудистой системы гипертоническая болезнь выявлена лишь в одном случае у пациентки из группы 1 (5%), в других группах данная патология не установлена. Пролапс митрального клапана диагностирован у одной пациентки из группы 1 (5%), у одной из группы 2 (4%) и у одной из группы небеременных (4%). По выбранным показателям группы являются однородными: 2 3,73, р = 0,29; 2 1,11, р = 0,77. Диффузное увеличение щитовидной железы выявлено у одной пациентки из группы 1 (5%), при этом выработка гормонов щитовидной железы была в норме. Среди заболеваний желудочно-кишечного тракта наиболее часто в 45% случаев в группе 1 встречался хронический гастрит (n = 9). Все пациентки группы 1, имевшие диагноз хронический гастрит находились в стадии стойкой ремиссии данного заболевания. Дискинезия желчевыводящих путей (ДЖВП) выявлена только у одной пациентки (5%). Язвенная болезнь желудка в анамнезе – у трех пациенток (15%) более 3 лет назад, хронический панкреатит у двух пациенток (10%). В группе 2 хронический гастрит в стадии стойкой ремиссии встречался в 36% случаев (n = 9). Дискинезия желчевыводящих путей – у одной пациентки (4,2%). Язвенная болезнь – у одной пациентки (4,2%) более трех лет назад. Хронический панкреатит – у одной пациентки (4,2%). В группе 3 65 пациенток с нормально протекающей беременностью хронический гастрит в стадии стойкой ремиссии выявлен в 33,3% (n = 8) случаев, ДЖВП в 4,2% (n = 1), язвенная болезнь желудка в 8,3% (n = 2) случаев более трех лет назад. Пациенток, страдающих хроническим панкреатитом в данной группе выявлено не было. В группе 4 хронический гастрит в стадии стойкой ремиссии выявлен в 52% (n = 13) случаев, ДЖВП и язвенная болезнь в не встречались. Хронический панкреатит выявлен в одном случае (4%). При статистическом анализе по показателям, отражающим заболевания желудочно-кишечного тракта, группы оказались однородными: хронический гастрит 2 2,21, р = 0,53; ДЖВП 2 1,16, р = 0,76; язвенная болезнь желудка 2 4,58, р = 0,21; хронический панкреатит 2 2,69, р = 0,44. Данные представлены на гистограмме 9. Гистограмма 9. Заболевания сердечно-сосудистой системы, щитовидной железы, пищеварительного тракта 66 Среди заболеваний дыхательной системы в группе 1 чаще встречался хронический бронхит, в 30% (n = 6) наблюдений, стадия заболевания – стойкая ремиссия. Одна пациентка страдала бронхиальной астмой (5%), хронический тонзиллит не выявлен. В группе 2 хронический бронхит в стадии стойкой ремиссии выявлен в 12% случаев (n = 3), у одной пациентки выявлен хронический тонзиллит (4%). Бронхиальной астмы в данной группе не диагностировано. В группе 3 12,5% пациенток (n = 3) страдали хроническим бронхитом, последнее обострение отмечали более двух лет назад. Хронического тонзиллита и бронхиальной астмы не выявлено. Среди небеременных у 24% женщин (n = 6) встречался хронический бронхит в стадии ремиссии, у 12% (n = 3) – хронический тонзиллит в стадии ремиссии. Бронхиальной астмы выявлено не было. Статистически достоверных различий при сравнении групп по данным показателям выявлено не было. (Хронический бронхит 2 3,41, р = 0,33, хронический тонзиллит 2 7,14, р = 0,06; бронхиальная астма 2 3,74, р = 0,29). Проведен анализ приема пациентками разных групп препаратов, направленных на пролонгирование беременности, в частности гормональной терапии прогестероном, антиоксидантной терапии фолиевой кислотой и витамином Е, а также прием поливитаминов, препаратов магния, применение комбинированных оральных контрацептивов до беременности. Данные представлены на гистограмме 10. В группе 1 большая часть пациенток принимала препараты прогестерона, в 70% случаев (n = 14), поливитамины – 45% (n = 9), препараты магния – 70% женщин (n = 14), фолиевую кислоту – 100% (n = 20), витамин Е – 95% (n = 1). В анамнезе 45% женщин группы 1 был прием КОК до беременности. Пациентки из группы 2 принимали до постановки диагноза препараты прогестерона в 56% (n = 14), поливитамины – 40% (n = 9), препараты магния – 16% (n = 4), фолиевую кислоту – 60% (n = 15), витамин Е – 56% (n = 14). КОК до беременности принимали 36% пациенток этой группы (n = 9). 67 Женщины группы 3 в 16,7% (n = 4) принимали прогестерон, поливитамины – 20,8% женщин (n = 5), препараты магния – 4,2% (n =1), фолиевую кислоту – 83,3% (n = 20), витамин Е – 54,2% (n = 13). До беременности КОК принимали 12,5% (n = 3) пациенток группы с нормально протекающей беременностью. Среди небеременных одна женщина принимала прогестерон в циклическом режиме (4%). Поливитамины принимали 16% (n = 4) женщин. Препараты магния пациентки группы 4 не принимали. Фолиевую кислоту принимала одна пациентка (4%), витамин Е также одна женщина (4%). КОК принимали 40% пациенток группы. Данные представлены на гистограмме 11. При статистической обработке данных выявлены достоверные различия в группах по приему препаратов прогестерона 2 29,68, р = 0,00, поскольку женщины из группы 4 не нуждались в приеме данного препарата ввиду отсутствия беременности, препаратов магния 2 41,2, р = 0,00, фолиевой кислоты 2 51,26, р = 0,00 и витамина Е 2 37,89, р = 0,00 по той же причине. Достоверных различий по приему КОК (2 6,52, р = 0,89), поливитаминов 2 6,62, р = 0,08 не выявлено. При сравнении групп 1 – 3 беременных женщин установлены статистические различия групп по приему препаратов прогестерона (2 13,94, р = 0,00094), что объясняется проведением терапии, направленной на пролонгирование беременности в группах с ее патологией и отсутствием гормональной поддержки в большинстве случаев при нормально протекающей беременности. В данных группах прием препаратов магния и витамина Е был достоверно чаще в группе 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» (2 26,31, р = 0,00) (2 10,19, р = 0,006), прием фолиевой кислоты был реже в группе 2 (211,29, р = 0,003). При сравнении групп 1, 2 с патологией беременности по применению препаратов прогестерона статистически достоверных различий не выявлено (2 0,93, р = 0,34), однако прием препаратов магния, фолиевой кислоты и витамина Е был достоверно 68 реже в группе 2 «Неразвивающаяся беременность» (2 13,5, р = 0,00024), (2 10,29, р = 0,001), (2 8,64, р = 0,003). Гистограмма 10. Данные о приеме препаратов 40% 12,50% КОК в анамнезе 36% 45% * * 0% 4,20% 16% Препараты Mg 70% 16% 20,80% Поливитамины * 4% Витамин Е Группа 4 "Небеременные" 40% 45% Группа 3 "Физ. Б" 54,20% 56% 4% Фолиевая к-та 4% 0% * *16,70% 20% 40% 56% 60% 95% Группа 1 "НчВ. РГ" 83,30% 60% Прогестерон Группа 2 "НБ" 100% 70% * - статистически достоверные 80% 100%различия, p < 0,05 В процессе нашего исследования в группе пациенток «Неразвивающаяся беременность» мы оценили срок гестации на момент гибели эмбриона. Согласно поставленной цели и задачам мы включали в исследование пациенток со сроком гестации от 8 до 16 недель, с целью исключить из исследования пациенток, чья беременность прервалась ввиду аномалий кариотипа плода и других грубых хромосомных аномалий, учитывая, что указанные патологии являются причинами прерывания беременности в более ранние сроки. Средний срок гестации составил 10,01,7 недель беременности, варьируя от 8 до 15 недель. 69 * * * Таким образом, пациентки групп 1 и 2 с патологией беременности были статистически достоверно однородными по всем изученным показателям, кроме применения препаратов магния, фолиевой кислоты и витамина Е, прием которых был достоверно чаще в группе 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» (2 13,5, р = 0,00024), (2 10,29, р = 0,001), (2 8,64, р = 0,003). Среди групп 1 – 3 беременных пациенток были выявлены статистически достоверные различия между группами 1, 2 с патологией беременности и группой 3 пациенток с нормально протекающей беременностью по следующим показателям: - уровень образования пациенток группы 3 был достоверно выше, чем в группах с патологией беременности (2 7,47, р = 0,02) (Гистограмма 1) - уровень подверженности уровень тревожности психо-эмоциональному при самооценке этих стрессу и показателей пациентками группы 3 были достоверно ниже, чем в группах 1, 2 (2 13,91, р = 0,00095), (2 12,36, р = 0,002) (Гистограмма 3, 4) - среднее количество беременностей группы пациенток с нормально протекающей достоверно ниже, чем в группах с патологией (р = 0,049) (Таблица 3) - среднее количество выкидышей группы 3 достоверно ниже, чем в группах 1, 2 (р = 0,01) (Таблица 3) - прием препаратов прогестерона и магния пациентками группы 3 был достоверно реже, чем в группах 1, 2 (2 13,94, р = 0,00094), (2 26,31, р = 0,00) (Гистограмма 10) 70 Также, анализируя характеристики групп 1 – 3, выявлено, что прием фолиевой кислоты пациентками, входящими в состав группы 2 «Неразвивающаяся беременность» был достоверно реже, чем в группах 1, 3 (2 11,29, р = 0,004). Дополнительно обследованная группа 4 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста отличалась по следующим показателям: - средний возраст пациенток был достоверно ниже, чем в группах беременных (р 0,01) (Таблица 1) - уровень образования был выше, чем в группах с патологией беременности (2 15,4, р = 0,0005) (Гистограмма 1) - работа с компьютером встречалась достоверно чаще, чем в группах 1 – 3 беременных женщин (2 9,2, р = 0,03) (Гистограмма 2) - уровень подверженности психо-эмоциональному стрессу при самооценке данного показателя пациентками группы 4 были достоверно выше, чем в группе 3 (2 15,73, р = 0,00012) (Гистограмма 3) - среднее количество выкидышей группы 4 достоверно ниже, чем в группах 1, 2 (р = 0,01) (Таблица 3) - прием препаратов прогестерона, магния, фолиевой кислоты и витамина Е пациентками группы 4 был достоверно ниже, чем в группах беременных пациенток (2 29,68, р = 0,00), (2 41,2, р = 0,00) (2 51,26, р = 0,00) (2 37,89, р = 0,00) (Гистограмма 10) Большинство выявленных в процессе исследования статистически достоверных различий обусловлено критериями включения в группы, согласно поставленным цели и задачам работы. 71 Выше указанные характеристики и данные статистического анализа позволяют сделать вывод о том, что группы беременных пациенток, вошедших в представленное исследование были однородными, что определяет возможность проведения сравнительного анализа отобранных групп пациенток по параметрам, изучение которых явилось целью исследования. 72 Глава 4. Результаты собственных исследований Регуляция клеточного гомеостаза осуществляется механизмами, поддерживающими нормальную функцию клетки и опосредующими ее программированную гибель. Как следует из обзора литературы, отобранные для исследования в диссертационной работе показатели относятся к ключевым элементам процессов клеточных повреждений, ведущих к апоптотической или некротической деструкции, что является важным патогенетическим звеном невынашивания беременности. Выявление маркеров невынашивания беременности перспективно для формирования новых диагностических методов и разработки методов лечения и профилактики акушерских потерь, что является важной задачей современного акушерства и гинекологии. Поэтому, для формирования представлений о маркерной значимости необходим анализ отобранных показателей у пациенток с нормально развивающейся беременностью и при патологии беременности. Для корректных оценок требуется также характеристики параметров у женщин с нормально протекающей беременностью и у здоровых небеременных. 4.1. ДНК-повреждения в клетках крови при невынашивании беременности Регистрация повреждений ДНК целесообразна, поскольку нарушения в ДНК влияют на физиологические и патологические процессы беременности на всех стадиях ее течения, начиная с гаметогенеза до развития плаценты и плода на поздних этапах гестации. Отклонения в уровне ДНК-повреждений свидетельствуют о наличии деструктивных изменений, связанных с гибелью клеток, о возможных дефектах в процессах репарации. Следует иметь в виду, что последние снижены во время беременности, что по мнению Skoner et al. 73 приводит к большей подверженности беременных женщин к действию эндо- и экзогенных генотоксикантов [242]. Выше отмечено, что основные этиопатогенетические факторы, ведущие к патологии беременности, связаны с активацией свободно-радикальных процессов. Известно, что основная роль в реализации окислительного повреждения ДНК принадлежит высокореакционному гидроксильному радикалу, образующемуся при участии связанных с ДНК ионов переходных металлов из супероксида и гидропероксида водорода [160]. Другие активные формы кислорода, синглетный кислород, пероксильный радикал, пероксинитрит, гипохлорная кислота также могут вызвать нарушения в ДНК [135]. Повреждающие свойства АФК опосредованы их взаимодействием с азотистыми основаниями и дезоксирибозой. Окисление оснований ведет к образованию более 20 различных модификаций, например 8-гидрокси-2дезоксигуанозин, тимингликоль, 8-гидроксиаденин и др. [160]. При этом из всех оснований ДНК наиболее подвержен окислительным модификациям гуанин, с образованием 8-гидрокси-2-деоксигуанозина (8-охоG) [160]. Данное соединение обладает высокой мутагенной активностью, эволюционно выработана сложная система репарации окисленных гуанинов [120]. Поэтому рядом авторов предложено рассматривать уровень 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в качестве биомаркера окислительного повреждения ДНК [203]. 74 Рис. 3. Основные продукты модификации азотистых оснований АФК 4.1.1. Оценка ДНК повреждений в клетках крови методом ДНК-комет В представленном разделе исследования оценивали уровень ДНК повреждений в клетках крови методом ДНК-комет в щелочной версии при патологически протекающей беременности (Начавшийся выкидыш, неразвивающаяся беременность) и физиологически протекающей беременности. В группе 1 пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» среднее процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет в сроке беременности 10-11 недель составило 3,81,8, варьируя от 0,7 до 6,9, в сроке 1213 недель – 4,22,9 [0,9 – 11,0], в сроке 14-15 недель – 3,34,7 [1,2 – 15,6] (n = 20). В группе 3 «Физиологически протекающая беременность» данный показатель в сроке 10-11 недель составил 1,51,1 [0,3 – 4,1], в сроке 12-13 недель – 1,61,8 [0,3 – 7,6], на 14-15 неделе – 1,31,1, варьируя от 0,5 до 5,4 (n = 24). Выявлено статистически достоверное различие групп 1 и 3, указывающее на большее количество ДНК повреждений в группе с патологически протекающей беременностью во всех исследованных сроках беременности (p = 0,000549, р = 0,000266, р = 0,000021). Данные представлены в таблице 4. 75 Таблица 4. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по уровню содержания ДНК в хвосте ДНК-комет 10-11 недель Физ Б НчВ 1,51,1 3,81,8 [0,3-4,1] [0,7-6,9] 12-13 недель р Физ Б НчВ 1,61,8 4,22,9 [0,3-7,6] [0,9-11,0] 14-15 недель р Физ Б НчВ 1,31,1 3,34,7 [0,5-5,4] [1,2-15,6] р %ДНК в хвосте 0,000549 0,000266 0,000021 В группе 2 пациенток с «Неразвивающейся беременностью» среднее процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет в сроке беременности 10-11 недель также, как и в группе 1 было выше, чем при нормально протекающей беременности в данном сроке, и составило 2,73,5, колеблясь от 0,6 до 16,2 (n = 25). Выявлены статистически достоверные различия группы 2 и 3 по данному показателю (p = 0,013557) (Таблица 5). Таблица 5. Сравнение группы 2 «Неразвивающаяся беременность» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по уровню содержания ДНК в хвосте ДНК-комет 10-11 недель Физ Б НБ %ДНК в 1,51,1 2,73,5 хвосте [0,3-4,1] [0,6-16,2] р 0,013557 76 При сравнении групп 1, 2 с патологией беременности статистически достоверных различий выявлено не выявлено (р = 0,263140). При сравнении группы 3 с дополнительно обследованной группой 4 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста, в которой среднее процентное содержание ДНК в хвосте ДНК-комет составило 2,61,3, колеблясь от 0,3 до 4,2 (n = 25) статистически достоверных различий не выявлено (Таблица 6). Таблица 6. Сравнение группы 3 «Физиологически протекающая беременность» и группы 4 «Небеременные женщины» по уровню содержания ДНК в хвосте ДНК-комет 10-11 недель Физ Б Небер 1,51,1 2,61,3 [0,3-4,1] [0,3-4,2] 12-13 недель р Физ Б Небер 1,61,8 2,61,3 [0,3-7,6] [0,3-4,2] 14-15 недель р Физ Б Небер 1,31,1 2,61,3 [0,5-5,4] [0,3-4,2] р %ДНК в хвосте 0,340473 0,203737 0,198406 Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что при патологически протекающей беременности уровень ДНК повреждений, регистрируемых методом ДНК-комет, статистически достоверно выше, чем при нормально протекающей беременности (Гистограмма 11). Установленное на ранних сроках беременности увеличение ДНК-повреждений свидетельствует о включении механизмов апоптоза в процессы прерывания беременности, что позволяет использовать данные показатели для разработки более совершенных и чувствительных методик диагностики, их внедрения в алгоритм обследования пациенток из групп риска по осложнениям беременности, а также возможности терапевтической коррекции акушерских потерь. 77 Гистограмма 11. Уровень ДНК повреждений, регистрируемых методом ДНКкомет, в клетках крови пациенток групп 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» (НчВ. РГ), 2 «Неразвивающаяся беременность» (НБ), 3 «Физиологически протекающая беременность» (Физ.Б), 4 «Небеременные женщины» (Небер) 4.1.2. Оценка индуцируемых ДНК повреждений ex vivo В данном разделе мы применили подход, позволяющий судить о чувствительности клеток к ДНК-повреждениям, индуцируемым по свободнорадикальному механизму, что позволяет косвенно оценить антиоксидантную защиту организма беременной женщины на уровне отдельных клеток. Установлено, что при обработке перекисью водорода клеток, полученных из крови пациенток группы 1 с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» различия в уровне %ДНК в хвосте и данного показателя в интактных клетках (Δ%ДНК в хвосте) составили в сроке 78 беременности 10-11 недель 23,17,9, варьируя от 12,0 до 36,6, в сроке 12-13 недель – 28,610,7, колеблясь от 11,5 до 48,3, в сроке 14-15 недель – 30,58,6 [9,4-39,0]. В группе 3 данный показатель был статистически достоверно ниже при сроке беременности 14-15 недель (р = 0,041432) и составил в среднем в группе 20,48,9, варьируя от 13,9 до 51,7, практически не отличаясь в других исследованных сроках: в сроке 10-11 недель показатель составил в среднем в группе 17,16,6, колеблясь от 10,2 до 31,7 (р = 0,073190), в сроке 12-13 недель – 23,06,9, варьируя от 13,1 до 36,4 (р = 0,077028. Данные представлены в таблице 7. Таблица 7. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по Δ%ДНК в хвосте 10-11 нед. d%ДНК в хвосте 12-13 нед. 14-15 нед. Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р 17,1±6,6 [10,2-31,7] 23,1±7,9 [12,036,6] 0,073190 23,0±6,9 [13,136,4] 28,6±10,7 [11,548,3] 0,077028 20,4±8,9 [13,651,7] 30,5±8,6 [9,4-39,0] 0,041432 Исходя из данных таблицы 8, в группе 2 «Неразвивающаяся беременность» средний показатель Δ%ДНК в хвосте составил 31,110,4, варьируя от 14,1 до 49,3, что статистически достоверно выше, чем в группе 3, где разница показателей %ДНК в хвосте в клетках, обработанных H2O2, и показателя %ДНК в хвосте для необработанных клеток в среднем в группе составила 17,16,6, колеблясь от 10,2 до 31,7 (p = 0,000147). 79 Таблица 8. Сравнение группы 2 «Неразвивающаяся беременность» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по Δ%ДНК в хвосте 10-11 нед. d%ДНК в хвосте Физ Б НБ р 17,1±6,6 [10,2-31,7] 31,1±10,4 [14,1-49,3] 0,000147 При сравнении данного показателя в группах 1 и 2 с патологически протекающей беременностью значения Δ%ДНК в хвосте было большим при неразвивающейся беременности, достоверно отличаясь от группы 1 (p = 0,025221). Данные представлены в таблице 9. Таблица 9. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 2 «Неразвивающаяся беременность» по Δ%ДНК в хвосте 10-11 нед. d%ДНК в хвосте НчВ НБ р 23,1±7,9 [12,0-36,6] 31,1±10,4 [14,1-49,3] 0,025221 По показателю Δ%ДНК в хвосте при физиологически протекающей беременности и среди небеременных женщин достоверные различия установлены в сроке беременности 12-13 недель, где Δ%ДНК в хвосте выше при беременности (23,06,9 [13,1-36,4], чем при ее отсутствии (17,14,0 [10,326,7] (p = 0,001736). В других исследованных сроках беременности статистически достоверных различий не выявлено. Данные представлены в таблице 10. 80 Таблица 10. Сравнение группы 3 «Физиологически протекающая беременность» и группы 4 «Небеременные женщины» по Δ%ДНК в хвосте 10-11 нед. d%ДНК в хвосте 12-13 нед. 14-15 нед. Физ Б Небер р Физ Б Небер р Физ Б Небер р 17,1±6,6 [10,231,7] 17,1±4,0 [10,326,7] 0,705232 23,0±6,9 [13,136,4] 17,1±4,0 [10,326,7] 0,001736 20,4±8,9 [13,651,7] 17,1±4,0 [10,326,7] 0,056591 Дополнительно при статистическом анализе можно указать на различия между группой 2 «Неразвивающаяся беременность» и группой 4 небеременных пациенток, в которой исследуемый показатель был ниже и составил в среднем в группе 17,14,0, варьируя от 10,3 до 26,7 (р = 0,000192). Данные представлены в таблице 11. Таблица 11. Сравнение группы 4 «Небеременные женщины» и группы 2 «Неразвивающаяся беременность» по Δ%ДНК в хвосте 10-11 нед. d%ДНК в хвосте Небер НБ р 17,1±4,0 [10,3-26,7] 31,1±10,4 [14,1-49,3] 0,000192 Таким образом, анализируя полученные данные по показателю разницы %ДНК в хвосте в клетках, обработанных H2O2, и %ДНК в хвосте для необработанных клеток, можно заключить, что индуцируемые Н2О2 ДНК повреждения в большей степени возникают при патологически протекающей беременности, в особенности при неразвивающейся беременности (Гистограмма 12), что свидетельствует о большей чувствительности ДНК клеток пациенток с патологией беременности к свободно-радикальной атаке и, вероятно, указывает на снижение антиоксидантной защиты при патологически 81 протекающей беременности, что может явиться этиологическим фактором невынашивания беременности. Проведенная методика позволила косвенно оценить антиоксидантную емкость клеток крови и выявила истощение системы антиоксидантной защиты при начавшемся выкидыше и в большей степени при неразвивающейся беременности. Установленный факт увеличения ДНК повреждений, индуцируемых Н2О2, при нормально протекающей беременности в сроке 12-13 недель в сравнении с небеременными пациентками требует анализа в рамках процессов физиологически протекающей беременности. Добавление к стандартному алгоритму обследования беременных женщин анализа состояния антиоксидантной емкости клеток методом оценки индуцируемых ДНК повреждений ex vivo позволит выявить группу риска по возникновению осложнений беременности, в частности таких патологий как неразвивающаяся беременность и начавшийся выкидыш и своевременно предложить опережающую стратегию профилактики акушерских потерь. Гистограмма 12. Индуцируемые ДНК повреждения ex vivo в клетках крови пациенток групп 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» (НчВ. РГ), 2 «Неразвивающаяся беременность» (НБ), 3 «Физиологически протекающая беременность» (Физ.Б), 4 «Небеременные женщины» (Небер) 82 4.1.3. Оценка уровня 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в клетках крови Результаты, представленные в таблице 12 демонстрируют, что по уровню показателя 8-гидрокси-2-деоксигуанозина статистически достоверных различий между группами 1 и 3 не выявлено. Таблица 12. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по уровню 8-гидрокси-2-деоксигуанозина (8-oxodG) в клетках крови 10-11 недель Физ Б НчВ 8-oxodG в 3,23,0 3,93,1 ДНК [1,1-13,9] [1,1-13,4] 12-13 недель р 0,31509 Физ Б НчВ 5,23,2 4,93,5 [0,3-7,6] [1,6-12,7] 14-15 недель р 0,50156 Физ Б НчВ 3,73,3 4,64,6 [0,5-15,0] [0,6-21,1] р 0,436354 В группе 2 «Неразвивающаяся беременность» уровень 8-гидрокси-2деоксигуанозина составил 5,74,4, варьируя от 2,0 до 17,4. Статистически достоверных различий при сравнении с группами 1 и 3 не выявлено. Данные представлены в таблицах 13 и 14. Таблица 13. Сравнение группы 2 «Неразвивающаяся беременность» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по уровню 8-гидрокси-2деоксигуанозина (8-oxodG) в клетках крови 10-11 нед. 8-oxodG в ДНК Физ Б НБ р 3,2±3,0 [1,1-13,9] 5,7±4,4 [2,0-17,4] 0,083701 83 Таблица 14. Сравнение группы 2 «Неразвивающаяся беременность» и группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» по уровню 8-гидрокси-2деоксигуанозина (8-oxodG) в клетках крови 10-11 нед. 8-oxodG в ДНК НчВ НБ р 3,9±3,1 [1,1-13,4] 5,7±4,4 [2,0-17,4] 0,387489 Таким образом, различий в уровне данного маркера свободнорадикального повреждения между группами 1, 2 с патологически протекающей беременностью и группой 3 с нормально протекающей беременностью не выявлено. Сравнение группы 3 с группой 4 небеременных пациенток показало увеличение содержания 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в группе беременных пациенток в сроке 12-13 недель, уровень у которых составил 5,23,2, колеблясь от 0,3 до 7,6. А в группе 4 данный показатель составил 3,20,4, варьируя от 2,5 до 3,9. Данные различия статистически достоверны (р = 0,45799). В других исследованных сроках беременности достоверных различий не выявлено. Данные представлены в таблице 15. Таблица 15. Сравнение группы 3 «Физиологически протекающая беременность» и группы 4 «Небеременные женщины» по уровню 8-гидрокси-2- деоксигуанозина (8-oxodG) в клетках крови 10-11 нед. 8-oxodG в ДНК 12-13 нед. Физ Б Небер р 3,2±3,0 [1,1-13,9] 3,2±0,4 [2,5-3,9] 0,939695 Физ Б Небер 5,2±3,2 [0,3-7,6] 3,2±0,4 [2,5-3,9] 14-15 нед. р Физ Б Небер р 0,045799 3,7±3,3 [0,5-15,0] 3,2±0,4 [2,5-3,9] 0,649886 84 Таким образом, приведенные результаты указывают на возможность увеличения уровня 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в определенные сроки беременности. При этом повышение отмечено как в группах с нормально протекающей беременностью, так и при патологии. Отсутствие различий по данному показателю можно объяснить тем, что увеличение 8-гидрокси-2деоксигуанозина сопровождает и процессы повреждения ДНК, и процессы ее репарации, следовательно, в изученные в данной работе сроки беременности применение данного маркера для дифференцировки патологически протекающей и физиологической беременности не целесообразно. Однако, полученные данные не противоречат работам, демонстрирующим связь уровня 8-гидрокси-2-деокигуанозина с окислительным стрессом как при патологии беременности, так и при ее физиологическом течении [19, 49, 79, 158]. 4.2. Анализ содержания белка P53 при невынашивании беременности Нарушения в структуре ДНК ограничиваются путем репарации или элиминации поврежденных клеток. Существуют сложные биохимические механизмы, предупреждающие вхождение клеток с повреждениями ДНК в митоз. Одним из них является исключение клеточного деления на стадии входа в S фазу с участием белка Р53. Белок Р53 является транскрипционным фактором. Однако, в нормальных условиях он нестабилен и обычно не достигает уровня, достаточного для стимуляции транскрипции. Но при возникновении ДНК повреждений Р53 резко увеличивает способность активировать экспрессию специфических генов, необходимых для включения процессов репарации. В других условиях при более сложных повреждениях ДНК Р53 активирует экспрессию генов, ведущих к апоптозу [182]. Таким образом, определение уровня Р53 может характеризовать как нормальные, так и патологические процессы при 85 беременности, что определяет целесообразность представленного в настоящей работе сравнительного исследования. Белок P53, кодируемый геном TP53, впервые был идентифицирован более 30 лет назад как вирус-ассоциированный опухолевый антиген [179]. В дальнейшем была выявлена важная функция Р53 в качестве опухолевого супрессора, способного останавливать размножение трансформированных и опухолевых клеток [127]. Почти все раковые клетки имеют мутации в обоих аллелях гена Р53 или в биохимических путях, которые стимулирует Р53 в ответ на повреждения ДНК [129]. Известно также, что Р53 индуцирует экспрессию гена, кодирующего хорионический гонадотропин человека [244]. В эмбрионах белок Р53 предотвращает дефекты развития путем блокировки плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток при возникновении повреждений [122, 273]. Поскольку белок Р53 активируется практически во всех процессах клетки, угрожающих стабильности генома, в литературе ему было дано определение, как «стража генома» [170]. При исследовании уровня белка Р53 в сыворотке крови в группе 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» его значение в сроке беременности 10-11 недель составило 0,40,2, варьируя от 0,1 до 1,1 Ед/мл, в сроке 12-13 недель данный показатель составил 0,50,4, колеблясь от 0,1 до 1,4 Ед/мл, на 14-15 неделе – 0,70,3 [0,2-1,3]. В группе 3 уровень белка Р53 был статистически достоверно ниже в сроке беременности 14-15 недель, составляя 0,40,3, варьируя от 0,1 до 1,6 (p = 0,016694). В сроке беременности 10-11 недель уровень белка Р53 в группе 3 составил 0,30,3 [0,1-1,5], в сроке 12-13 недель – 0,20,4 [0,1-1,6]. В данных сроках беременности достоверных различий в группе 1 и 3 не выявлено (р = 0,153623, р = 0,198640). Данные представлены в таблице 16. 86 Таблица 16. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по уровню белка Р53 10-11 недель P53 12-13 недель 14-15 недель Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р 0,3±0,3 [0,1-1,5] 0,4±0,2 [0,1-1,1] 0,153623 0,2±0,4 [0,1-1,6] 0,5±0,4 [0,1-1,4] 0,198640 0,4±0,3 [0,1-1,6] 0,7±0,3 [0,2-1,3] 0,016694 В группе 2 «Неразвивающаяся беременность» уровень белка р53 составил 0,70,5, варьируя от 0,2 до 1,8, что статистически достоверно выше, чем в группе 3 пациенток с физиологически протекающей беременностью (р = 0,000803). Данные представлены в таблице 17. Таблица 17. Сравнение группы 2 «Неразвивающаяся беременность» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по уровню белка Р53 10-11 недель P53 Физ Б НБ р 0,3±0,3 [0,1-1,5] 0,7±0,5 [0,2-1,8] 0,000803 Исходя из данных, представленных в таблице 18, ясно, что при сравнении групп 1 и 2 с патологически протекающей беременностью уровень белка р53 был достоверно выше в группе 2 «Неразвивающаяся беременность» (р = 0,12283). 87 Таблица 18. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 2 «Неразвивающаяся беременность» по уровню белка Р53 10-11 нед. P53 НчВ НБ р 0,4±0,2 [0,1-1,1] 0,7±0,5 [0,2-1,8] 0,012283 В группе 4 небеременных женщин уровень белка р53 составил 0,60,2, варьируя от 0,3 до 1,1, что статистически достоверно выше, чем у беременных пациенток группы 3 (р = 0,000177, р = 0,00061, р = 0,000216 для каждого из исследованный сроков соответственно). Данные представлены в таблице 19. Таблица 19. Сравнение группы 3 «Физиологически протекающая беременность» и группы 4 «Небеременные женщины» по уровню белка Р53 10-11 нед. P53 12-13 нед. Физ Б Небер р 0,3±0,3 [0,1-1,5] 0,6±0,2 [0,3-1,1] 0,000177 Физ Б Небер 0,2±0,4 [0,1-1,6] 0,6±0,2 [0,3-1,1] 14-15 нед. р Физ Б Небер Р 0,000061 0,4±0,3 [0,1-1,6] 0,6±0,2 [0,3-1,1] 0,000216 Таким образом, сравнение результатов определения уровня белка Р53 в группах 1, 2 с патологией беременности и группы 3 пациенток с нормально протекающей беременностью показано более высокое содержание данного 88 маркера в группах пациенток с патологически протекающей беременностью (Гистограмма 13). Гистограмма 13. Уровень белка Р53 в сыворотке крови пациенток групп 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» (НчВ. РГ), 2 «Неразвивающаяся беременность» (НБ), 3 «Физиологически протекающая беременность» (Физ.Б), 4 «Небеременные женщины» (Небер) Повышенная экспрессия белка Р53 указывает на увеличение ДНКповреждений и повышенный уровень апоптоза в клетках крови пациенток с патологически заключение о протекающей вкладе беременностью, генотоксичности в подтверждая предыдущее патогенетический механизм прерывания беременности. Представляется важным, что в группе 2 пациенток с более тяжелой патологией с диагнозом «Неразвивающаяся беременность» значения Р53 в сроке 10-11 недель оказались выше, чем в группе 1. Полученные результаты соответствуют данным других исследований, в которых отмечено повышение экспрессии р53 в ворсинах хориона при неразвивающейся 89 беременности [236, 265]. В совокупности установленные результаты свидетельствуют о маркерной значимости уровня Р53 для патологически протекающей беременности. Сравнение группы 3 с группой 4 небеременных пациенток выявило, что значение маркера Р53, статистически достоверно ниже у беременных, чем у небеременных женщин, что можно рассматривать в аспекте включения адаптационных механизмов беременности. Определение данного маркера в ходе обследования беременных пациенток позволит на ранних сроках диагностировать увеличение ДНК-повреждений и инициацию апоптоза, что оптимизирует стартовые возможности проведения своевременной профилактики и лечения невынашивания беременности. 4.3. Анализ содержания белка цитохром С в сыворотке крови при невынашивании беременности В нормальных условиях цитохром С локализован между внутренней и внешней митохондриальными мембранами. Цитохром С выполняет функции переносчика электронов в дыхательной цепи митохондрий. Однако, в апоптотических клетках cyt c выходит из межмембранного пространства митохондрий в цитозоль и усиливает сигнальные пути апоптоза, активируемые при ДНК повреждениях и окислительном стрессе [186]. Впервые связь цитохрома С с апоптозом была показана в 1996 году в экспериментальных работах, где к экстрактам цитозоля добавляли дезоксиаденозинтрифосфат, что вызывало появление активности каспаз, которая не развивалась без участия цитохрома [180]. В дальнейших исследованиях показано, что микроинъекции цитохрома в клетки вызывают апоптоз через митохондриальный путь [174]. Анализ достоверные зарегистрированных различия между показателей группой 1 выявил статистически «Начавшийся выкидыш. 90 Ретрохориальная гематома» и группой 3 «Физиологически протекающая беременность», где средний уровень цитохрома С в группе 1 в сроке беременности 14-15 недель был выше, чем при нормальной беременности в том же сроке, составляя 0,80,6, варьируя от 0,2 до 2,8, и 0,40,6 [0,0-2,2] соответственно (р = 0,018462). В других исследованных сроках статистически достоверных различий не выявлено (р = 0,545968, р = 0,205509). В группе 1 в сроке беременности 10-11 недель уровень цитохрома С составил 0,60,7, варьируя от 0,1 до 3,2, в сроке 12-13 недель – 0,60,6, колеблясь от 0,1 до 3,0. В группе 3 в сроке 10-11 недель данный показатель составил 0,60,6, варьируя от 0,0 до 2,6, в сроке 12-13 недель – 0,50,6, варьируя от 0,0 до 2,6. Полученные данные указывают на усиление апоптоза при патологически протекающей беременности. Данные представлены в таблице 20. Таблица 20. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по уровню цитохрома С 10-11 недель Cyt c 12-13 недель 14-15 недель Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р 0,6±0,6 [0,0-2,6] 0,6±0,7 [0,1-3,2] 0,545968 0,5±0,6 [0,0-2,6] 0,6±0,6 [0,1-3,0] 0,205509 0,4±0,6 [0,0-2,2] 0,8±0,6 [0,2-2,8] 0,018462 В группе 2 «Неразвивающаяся беременность» уровень цитохрома С составил 0,60,3, варьируя от 0,2 до 1,8. При сравнении данного показателя в группах 2 и 3 статистически достоверных различий не выявлено (р = 0,717552). При сравнении групп 1 и 2 с патологией беременности по уровню цитохрома С статистически достоверных различий не выявлено (Таблица 21). 91 Таблица 21. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 2 «Неразвивающаяся беременность» по уровню цитохрома С 10-11 нед. Cyt c НчВ НБ р 0,6±0,7 [0,1-3,2] 0,6±0,3 [0,2-1,8] 0,681856 Исходя из данных таблицы 22 при сравнении группы 3 «Физиологически протекающая беременность» и группы 4 небеременных женщин статистически достоверных различий не выявлено. Таблица 22. Сравнение группы 3 «Физиологически протекающая беременность» и группы 4 «Небеременные женщины» по уровню цитохрома С 10-11 нед. Cyt c 12-13 нед. 14-15 нед. Физ Б Небер р Физ Б Небер р Физ Б Небер р 0,6±0,6 [0,0-2,6] 0,4±1,9 [0,2-10,0] 0,833668 0,5±0,6 [0,0-2,6] 0,4±1,9 [0,2-10,0] 0,968093 0,4±0,6 [0,0-2,2] 0,4±1,9 [0,2-10,0] 0,26700 Таким образом, определение cyt c при патологии беременности целесообразно для анализа наличия явлений апоптоза, ведущих к прерыванию беременности, формирующихся через митохондриальный путь. Выявление такой патологии определяет методы лечения, направленные на нормализацию митохондриальных процессов. 92 4.4. Анализ содержания 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови при невынашивании беременности В разделе 4.1.3 8-гидрокси-2-дезоксигуанозин рассмотрен, исходя из данных о его значимости как биомаркера окислительного повреждения ДНК в клетках крови [203]. Дополнительно оценка этого показателя проведена иммуноферментным методом в сыворотке крови, исходя из предположения об его информативности как в отношении ДНК повреждений, так и апоптоза. В группе 1 пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» концентрация 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови в сроке беременности 10-11 недель составила 2,50,6, варьируя от 1,6 до 3,6, в сроке 12-13 недель – 2,60,7, колеблясь от 1,3 до 3,8, в сроке 14-15 недель – 2,40,7 [0,9-3,9]. В группе 2 «Неразвивающаяся беременность» концентрация данного показателя составила 2,71,6, варьируя от 1,0 до 9,6. В группе пациенток с физиологически протекающей беременностью концентрация 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови в сроке беременности 10-11 недель составила 3,11,9, варьируя от 1,8 до 11,5, в сроке 12-13 недель – 2,30,9, колеблясь от 1,5 до 5,5, в сроке 14-15 недель – 2,01,1 [0,8-5,1]. Статистически достоверных различий между группой 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группой 3 «Физиологически протекающая беременность» не выявлено, данные представлены в таблице 23. Статистически достоверных различий между группами 1 и 2, 2 и 3 не выявлено (р = 0,464639), (р = 0,633853). 93 Таблица 23. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по концентрации 8-гидрокси-2-деоксигуанозина (8-oxodG) в сыворотке крови 10-11 недель 8-oxodG в сыв. крови 12-13 недель 14-15 недель Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р 3,1±1,9 [1,8-11,5] 2,5±0,6 [1,6-3,6] 0,156671 2,3±0,9 [1,5-5,5] 2,6±0,7 [1,3-3,8] 0,429077 2,0±1,1 [0,8-5,1] 2,4±0,7 [0,9-3,9] 0,219451 Однако, при сравнении группы 3 и группы 4 небеременных женщин выявлена более низкая концентрация 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови в группе беременных пациенток, составившая в сроке 12-13 недель 2,30,9 нг/мл, варьируя от 1,5 до 5,5, в сроке 14-15 недель – 2,01,1 нг/мл, колеблясь от 0,8 до 5,1. В группе 4 небеременных женщин концентрация 8-гидрокси-2-дезоксигуанозина составила 2,70,5, варьируя от 2,1 до 4,1. Данные различия статистически достоверны (р = 0,023512, р = 0,000900). Данные представлены в таблице 24. Таблица 24. Сравнение группы 3 «Физиологически протекающая беременность» и группы 4 «Небеременные женщины» по концентрации 8-гидрокси-2деоксигуанозина (8-oxodG) в сыворотке крови 10-11 нед. 8-oxodG в сыв. крови 12-13 нед. 14-15 нед. Физ Б Небер р Физ Б Небер р Физ Б Небер р 3,1±1,9 [1,8-11,5] 2,7±0,5 [2,1-4,1] 0,748969 2,3±0,9 [1,5-5,5] 2,7±0,5 [2,1-4,1] 0,023512 2,0±1,1 [0,8-5,1] 2,7±0,5 [2,1-4,1] 0,000900 94 Таким образом, по данному показателю среди групп пациенток с патологией беременности и с физиологически протекающей беременностью статистически достоверных различий не выявлено. Как указано выше, это объясняется тем, что 8-гидрокси-2-деоксигуанозин повышается и при процессах ДНК-повреждений, и при процессах репарации, как при патологических процессах, так и при нормальном течении беременности, отражая патогенетические аспекты невынашивания и физиологические процессы. Полученные данные указывают на снижение уровня окислительного стресса при физиологически протекающей беременности по сравнению с небеременными пациентками в сроках беременности 12-13, 14-15 недель, что может рассматриваться, как возможная активация механизмов адаптации при беременности. 4.5. Оценка концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови при невынашивании беременности Внеклеточная ДНК в плазме крови может выявляться при ряде патологических и физиологических процессов, таких как созревание форменных элементов крови, секреция нуклеиновых кислот, инфекционные, онкологические, аутоиммунные, лучевые заболевания [66, 83, 169]. Однако, в первую очередь источник внеклеточной ДНК – клеточный некроз или апоптоз (30, 155, 219). Впервые наличие структур клеток плода в материнском кровотоке было зарегистрировано в 1969 году [263]. Позже была выявлена и фетальная ДНК в плазме беременных женщин. С этого времени на данный маркер возлагались большие надежды, как на маркер неинвазивной диагностики хромосомных заболеваний плода, определения пола плода [119, 178, 196, 270]. При исследовании концентрации внеклеточной ДНК в плазме крови в группе 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» данный 95 показатель в сроке беременности 10-11 недель составил 0,80,2 нг/мл, варьируя от 0,4 до 1,4, в сроке 12-13 день концентрация внеклеточной ДНК составила 0,70,2, варьируя от 0,4 до 1,2, в сроке 14-15 недель – 0,80,2, колеблясь от 0,4 до 1,0. При физиологически протекающей беременности в группе 3 данный показатель составил в сроке 10-11 недель 0,60,2, варьируя от 0,4 до 1,1, в сроке 12-13 недель – 0,60,2, колеблясь от 0,3 до 1,0, в сроке 14-15 недель – 0,50,2, варьируя от 0,3 до 0,9. При сравнении группы 1 и 3 выявлены статистически достоверные различия в сроке 10-11 недель и 14-15 недель, где концентрация внеклеточной ДНК была выше при патологически протекающей беременности (р = 0,006245, р = 0,000530). В сроке 12-13 недель статистически достоверных различий не выявлено по данному показателю. Данные представлены в таблице 25. Таблица 25. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по концентрации внеклеточной ДНК 10-11 недель внДНК В 12-13 недель 14-15 недель Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р Физ Б НчВ р 0,6±0,2 [0,4-1,1] 0,8±0,2 [0,4-1,4] 0,006245 0,6±0,2 [0,3-1,0] 0,7±0,2 [0,4-1,2] 0,065974 0,5±0,2 [0,3-0,9] 0,8±0,2 [0,4-1,0] 0,000530 группе 2 «Неразвивающаяся беременность» концентрация внеклеточной ДНК составила 0,90,2 нг/мл, варьируя от 0,5 до 1,3, что, как и при сравнении групп 1 и 3, статистически достоверно выше, чем в группе 3 «Физиологически протекающая беременность» (р = 0,000230). Данные представлены в таблице 26. 96 Таблица 26. Сравнение группы 2 «Неразвивающаяся беременность» и группы 3 «Физиологически протекающая беременность» по концентрации внеклеточной ДНК 10-11 недель внДНК Физ Б НБ р 0,6±0,2 [0,4-1,1] 0,9±0,2 [0,5-1,3] 0,000230 При сравнении групп с патологией беременности 1 и 2 статистически достоверных различий не выявлено (р = 0,406006) (Таблица 27). Таблица 27. Сравнение группы 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группы 2 «Неразвивающаяся беременность» по концентрации внеклеточной ДНК 10-11 нед. внДНК НчВ НБ р 0,8±0,2 [0,4-1,4] 0,9±0,2 [0,5-1,3] 0,406006 При сравнении группы 3 пациенток с нормально протекающей беременностью и группы 4 небеременных женщин выявлены статистически достоверные различия, при этом уровень концентрации свободной ДНК был на всех исследованных сроках беременности ниже у беременных, чем у небеременных женщин, составляя у последних 0,90,2 нг/мл, варьируя от 0,5 до 97 1,2 (р = 0,000089, р = 0,000400, р = 0,000041). Данные представлены в таблице 28. Таблица 28. Сравнение группы 3 «Физиологически протекающая беременность» и группы 4 «Небеременные женщины» по концентрации внеклеточной ДНК 10-11 нед. внДНК 12-13 нед. 14-15 нед. Физ Б Небер р Физ Б Небер р Физ Б Небер р 0,6±0,2 [0,4-1,1] 0,9±0,2 [0,5-1,2] 0,000089 0,6±0,2 [0,3-1,0] 0,9±0,2 [0,5-1,2] 0,000400 0,5±0,2 [0,3-0,9] 0,9±0,2 [0,5-1,2] 0,000041 Полученные данные по показателю концентрации внеклеточной ДНК свидетельствуют о повышении уровня апоптоза у пациенток с патологически протекающей беременностью (Гистограмма 14), что соответствует полученным ранее данным исследований, указывающих на увеличение уровней внеклеточной ДНК у женщин со спонтанным выкидышем по сравнению с женщинами с нормально протекающей беременностью [270]. Полученные результаты позволяют рассматривать уровень внеклеточной ДНК как важный показатель наличия окислительного стресса, патогенетического фактора невынашивания беременности. Характерно, что содержание внеклеточной ДНК у женщин с физиологически протекающей беременностью ниже, чем у небеременных. Поэтому анализ динамики этого показателя на ранних сроках беременности перспективен для своевременной диагностики патологии беременности и применения необходимого комплекса лечебных мероприятий. 98 Гистограмма 14. Концентрация внеклеточной ДНК в плазме крови пациенток групп 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» (НчВ. РГ), 2 «Неразвивающаяся беременность» (НБ), 3 «Физиологически протекающая беременность» (Физ.Б), 4 «Небеременные женщины» (Небер) * * * Анализируя совокупность полученных результатов, можно констатировать, что изученные показатели, отражающие процессы апоптоза и свидетельствующие о наличии свободно-радикальной атаки, в большинстве случаев имеют специфику для нормально протекающей беременности и при возникающих патологиях. Так, ДНК повреждения, регистрируемые методом ДНК-комет, оказались достоверно выше в группах 1, 2 с патологией беременности, чем в группе 3 с физиологически протекающей беременностью. Эти результаты полностью соответствуют и другому показателю, определенному методом ДНК-комет, 99 чувствительности клеток к действию перекиси водорода. Данный прием позволяет судить о степени антиоксидантной защиты. Оказалось, что группы с патологией беременности достоверно отличаются по данному параметру от пациенток с нормально протекающей беременностью. Более того, с усложнением патологии от группы 1 к группе 2, чувствительность к действию перекиси водорода при регистрации в сроке 10-11 недель увеличивалась, что указывает на дифференцировочный потенциал и перспективу применения данного показателя. Неоднозначные данные получены при определении 8-гидроки-2деоксигуанозина, уровни которого в клетках крови в избранные сроки регистрации не отличались в группах с нормально и патологически протекающей беременностью, однако на сроке гестации 12-13 недель у пациенток с физиологически протекающей беременностью уровень 8-гидрокси2-деоксигуанозина был выше, чем у небеременных. Вместе с тем, в сыворотке крови содержание 8-гидрокси-2-деоксигуанозина также не различаясь в группах беременных, оказалось меньшим при физиологически протекающей беременности в сравнении с небеременными. Данные результаты будут обсуждены ниже в связи с физиологическими процессами беременности, динамикой повреждений ДНК и репаративных процессов. Важный показатель апоптоза белок Р53 также обнаружил свойства маркера. Его содержание возрастало от группы 3 пациенток с физиологически протекающей беременностью к группе 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группе 2 «Неразвивающаяся беременность». Примечательно, что уровень Р53 снижается у женщин с нормально протекающей беременностью по сравнению с небеременными, что может свидетельствовать о включении адаптационных механизмов. Достоверные различия выявлены и по митохондриальному маркеру апоптоза – цитохрому С. В данном случае его значения оказались выше у 100 пациенток группы 1 с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома». Внеклеточная ДНК, изменения содержания которой также отражает степень апоптоза, в больших количествах определялась у пациенток с патологией беременности, чем при физиологически протекающей беременности. Как и в случае с Р53, содержание внеклеточной ДНК снижалось при нормально протекающей беременности по сравнению с небеременными пациентками. Таким образом, отобранные показатели в подавляющем большинстве выполненных определений «Начавшийся выкидыш. отражали наличие Ретрохориальная патологии гематома», с диагнозом «Неразвивающаяся беременность» в сравнении с физиологически протекающей беременностью. 101 Заключение Невынашивание беременности продолжает оставаться одной из наиболее сложных и важных проблем современного акушерства и гинекологии, несмотря на активное проведение разносторонних исследований в данной области медицины. Этиологические факторы невынашивания разнообразны, включают в себя генетические аномалии, эндокринные, инфекционные и иммунологические заболевания, анатомические аномалии развития, социальные, мужской факторы и др. Без своевременной коррекции наличие приведенных факторов является причиной запуска патогенетических механизмов прерывания беременности. Поэтому изучение этиопатогенеза потери беременности рассматривается как наиболее перспективное направление акушерства и гинекологии, в рамках которого осуществляется поиск новых методов диагностики патологических состояний при беременности и опережающих стратегий профилактики и лечения невынашивания. Окислительный стресс, при котором повышенная концентрация активных форм кислорода повреждает клеточные и макромолекулярные структуры, является одним из основных патогенетических звеньев патологии беременности. Фундаментальными исследованиями установлена причинная связь нарушений в структуре ДНК с окислительным стрессом. Поэтому, для выяснения значимости генотоксичности, обусловленной активацией свободно-радикальных процессов, для невынашивания беременности в настоящей работе выполнены исследования на группах пациенток с патологией беременности и с физиологически протекающей беременностью с определением показателей ДНК повреждений, маркеров апоптоза, чувствительности клеток к действию прооксидантов. Учитывая динамический характер процессов изменения этих параметров при 102 физиологически протекающей беременности, анализируемый комплекс изучен у здоровых небеременных женщин. Для решения вопроса о связи генотоксичности с окислительным стрессом в исследование были включены 94 женщины: 20 пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома», 25 пациенток с диагнозом «Неразвивающаяся беременность», 24 пациентки с физиологически протекающей беременностью и 25 небеременных женщин репродуктивного возраста. В двух последних группах женщины не имели репродуктивных потерь в анамнезе, выраженной генитальной и экстрагенитальной патологии, не находились в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Срок беременности пациенток 1 – 3 групп был от 8 до 16 недель. При поступлении в гинекологические отделения стационара или при обращении в женскую консультацию у всех женщин, включенных в исследование, после взятия информированного согласия на участие в клиническом исследовании, был подробно собран анамнез, проведено клинико-лабораторное обследование, включавшее объективный осмотр, гинекологический осмотр, лабораторное обследование, ультразвуковое исследование органов малого таза. Целью проведенного исследования явилось выявление генетических повреждений, зависимых от окислительного стресса, и оценка маркерной значимости показателей генотоксичности при невынашивании беременности. Для достижения большей информативности при выборе маркеров для диагностированных состояний применен комплексный подход, в котором с одной стороны можно было установить факт наличия нарушений в структуре ДНК, что подтверждалось методом ДНК-комет в клетках крови, определением в тех же субстратах 8-гидрокси-2-деоксигуанозина и свободной ДНК, а с другой – белков-маркеров Р53, экспрессия которого повышена при генетических деструкциях, цитохрома С, свидетельствующего о митохондриальном пути 103 апоптоза, и, для оценки эндогенной антиоксидантной защиты – чувствительность клеток к перекиси водорода. Группы пациенток, включенных в представленное исследование, были однородными по клиническим характеристикам, что позволило провести сравнительный анализ групп по параметрам, изучение которых являлось целью проведенной научной работы. Большинство выявленных различий в группах обусловлено критериями включения и исключения в них, согласно поставленным цели и задачам проведенного исследования. Все пациентки проживали в одинаковых географических и климатических зонах (г. Москва и Московская область). Возраст пациенток групп 1 – 3 статистически достоверно не различался, возраст группы 4 дополнительно обследованных небеременных женщин репродуктивного возраста был несколько ниже. Индекс массы тела и антропометрические данные, материальное положение пациенток также были сходными во всех группах. По параметрам образования были однородными группы 1, 2 и группы 3, 4, уровень образования пациенток с физиологически протекающей беременностью и небеременных женщин был достоверно выше, чем в группах с патологией беременности. Принимая во электромагнитного внимание излучения возможность анализировали влияния на беременность характеристики активности работы с компьютером. Выявлено, что в группе 4 небеременные женщины работали с компьютером достоверно чаще, чем в группах беременных женщин, а группы 1 – 3 оказались однородны по данному показателю. Не вызывает сомнений неблагоприятное влияние табакокурения и приема алкоголя, патологического является течения причиной беременности пороков [36, 82, развития 209, эмбриона 251]. и Женщин, злоупотреблявших алкоголем во время беременности, в нашем исследовании не 104 зарегистрировано, курение табака отметили лишь единичные пациентки. Статистический анализ по данному параметру подтвердил однородность групп. Стабильность психо-эмоционального фона влияет на течение беременности. По самооценке повышенной тревожности и подверженности психо-эмоциональному стрессу достоверно более низкие параметры выявлены у пациенток группы 3 с физиологически протекающей беременностью. Анализ репродуктивной функции пациенток выявил статистически достоверно меньшее количество беременностей в группе 3 пациенток с нормально протекающей беременностью, также как и среднее количество выкидышей по отношению к группам с патологией беременности. Соответствующий целям исследования набор групп пациенток определил различия по используемой фармакотерапии. Так, пациентки группы 3 с физиологически протекающей беременностью принимали препараты прогестерона и магния достоверно реже, чем в группе 1, 2 с патологией беременности, а препараты фолиевой кислоты реже применялись в группе 2 «Неразвивающаяся беременность». В группе 4 пациентки достоверно реже принимали препараты прогестерона, магния, фолиевой кислоты и витамина Е. По параметрам генитальной патологии (миома матки, наружный эндометриоз, аденомиоз, эктопия шейки матки, рубцовая деформация шейки матки, хронический цервицит, хронический сальпингоофорит, хронический эндометрит, апоплексия яичников, гиперплазия и полипы эндометрия, нарушения микробиоциноза влагалища) и экстрагенитальной патологии (заболевания мочевой, сердечно-сосудистой, дыхательной, пищеварительной, эндокринной систем) группы обследованных пациенток были статистически достоверно однородными. Таким образом, однородность обследованных групп по клиническим характеристикам определила возможность корректного определения и анализа параметров, отобранных для достижения цели исследования, а именно оценки 105 ДНК повреждений в клетках крови, индуцируемых ДНК повреждений ex vivo, исследования уровня 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в клетках крови, анализа содержания белка Р53 и белка цитохром С в сыворотке крови, определения 8гидрокси-2-деоксигуанозина в сыворотке крови и оценки содержания внеклеточной ДНК в плазме крови для выявления генетических повреждений, зависимых от окислительного стресса. Для определения указанных параметров и выявления их маркерной значимости в невынашивании беременности были применены специальные методики, включившее в себя метод гель- электрофореза отдельных клеток (метод ДНК-комет) в двух модификациях, иммуноферментный анализ и специальные методы статистической обработки данных. В доступной литературе прямых аналогов проведенного клинического исследования нами не обнаружено, что, по-видимому, следует объяснить относительной новизной использованных методических приемов, не вошедших к настоящему времени в рутинную клиническую практику. Тем не менее, отечественными и зарубежными специалистами выполнен ряд исследований, близких по поставленным задачам. Наиболее интенсивно в качестве маркера ДНК повреждений, обусловленных окислительным стрессом, изучался уровень 8-гидрокси-2деоксигуанозина. В работе Ferguson et al. при определении в моче 130 преждевременно родивших женщин в 10, 18, 26 и 35 недель гестации содержания 8-гидрокси-2деоксигуанозина и 8-изопростана выявлено повышение уровня 8-гидрокси-2деоксигуанозина с увеличением срока беременности и снижение уровня 8изопростана. Ассоциация с преждевременными родами установлена при анализе динамических изменений для 8-изопростана и не установлена для 8гидрокси-2-деоксигуанозина. Авторы заключили, что окислительный стресс вносит значительный вклад в возникновение преждевременных родов [126]. 106 В более ранних работах повышение уровня 8-гидрокси-2- деоксигуанозина на ранних стадиях гестации оказалось связанным с низкой массой плода и укорочением длительности гестации, а снижение значения параметра – с дефектами плода [248]. Той же группой авторов в 2001 году проведено исследование, показавшее, что более высокий уровень 8-гидрокси-2деоксгуанозина в моче беременных женщин ближе к концу беременности ассоциирован с низкой (2500гр) массой плода [233]. Анализ изопростана изменений уровня 8-гидрокси-2-деоксигуанозина и 8- в связи с преэклампсией и задержкой внутриутробного роста плода провели Hsieh с соавт. Под наблюдением находились 503 беременные женщины. Было установлено значительное повышение 8-изопростана при преэклампсии и задержке внутриутробного роста плода. Высокие концентрации 8-гидрокси-2-деоксигуанозина на 24-26 неделях гестации наблюдали у женщин, родивших маловесных детей [151]. Сходные данные при определении 8-гидрокси-2-деоксигуанозина и малондиальдегида в моче 271 пациентки получены в работе J. Min et al. [195]. По этим же маркерам ассоциации с преждевременными родами и низкой массой плода при срочных родах установили Kim et al. [167]. Таким образом, цитированные работы демонстрируют, что изменения в сторону увеличения 8-гидрокси-2-деоксигуанозина могут быть связаны с патологией беременности, что, однако, подтверждается не во всех случаях. Но в каждой из работ рассматриваются разные сроки гестации, поэтому целесообразно сравнить эти результаты с показателями при физиологически протекающей беременности. Такая работа была проведена Tai-Ho Hung et al., исходя из понимания, что плацента во время беременности является источником окислительного стресса. Маркеры 8-гидрокси-2-деоксигуанозин в моче, 8-изопростан в плазме, общая антиоксидантная емкость, активность эритроцитарной 107 глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы определяли у 105 пациенток с физиологически протекающей беременностью на сроках 6-8, 15-20, 26-30, 37-41 неделя и через 6-8 недель после родов, и у 40 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста. Установлено, что все исследованные показатели увеличивались в третьем триместре беременности. Важно отметить, что уровни 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в моче оказались повышенными у беременных женщин в сроке от 26 до 30 и от 37 до 41 недель гестации в сравнении с небеременными пациентками [152]. Таким образом, анализируя результаты, полученные в нашей работе по определению 8-гидроки-2-деоксигуанозина, можно отметить соответствие ранее проведенным исследованиям как по увеличению маркера у женщин с физиологически протекающей беременностью, так и при патологии. При этом в избранные для анализа сроки зарегистрированные уровни 8-гидроки-2деоксигуанозина у пациенток 1ой группы с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома», 2ой группы «Неразвивающаяся беременность» и 3ей группы пациенток с физиологически протекающей беременностью оказались сходны. Объясняя эти данные, следует иметь ввиду, что показатель интегрально отражает как процессы повреждения ДНК, так и ее репарацию. Также необходимо учитывать, что ассоциированное с патологией увеличение 8гидрокси-2-деоксигуанозина в цитированных выше работах выявлялось в более поздние сроки по сравнению с изученными нами. Неоднозначные данные, вероятно также обусловленные динамическими соотношениями процессов нарушений в ДНК и их репарации, получены при определении в клетках 8гидрокси-2-деоксигуанозина у женщин с физиологически протекающей беременностью, в сроке 12-13 недель, уровень которого был выше, чем у небеременных. В те же сроки при регистрации 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в сыворотке крови, концентрация оказалась выше у небеременных. 108 Поэтому, на основании собственных результатов можно заключить, что определение уровня 8-гидрокси-2-деокигуанозина в ранние сроки беременности (10-11, 12-13, 14-15 недель гестации) не позволяет дифференцировать патологически протекающую беременность от физиологической. Однако, при анализе ранних сроков беременности маркерное значение могут иметь полученные нами данные по ДНК-кометам. Этот показатель оказался выше у пациенток с патологией беременности (Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома в сроке гестации 10-11 недель – 3,81,8 [0,7-6,9], в 12-13 недель – 4,22,9 [0,9-11,0], в 14-15 недель – 3,34,7 [1,2-15,6], Неразвивающаяся беременность в сроке гестации 10-11 недель – 2,73,5 [0,616,2]) по сравнению с физиологически протекающей беременностью (в сроке гестации 10-11 недель – 1,51,1 [0,3-4,1], 12-13 недель – 1,61,8 [0,3-7,6], 14-15 недель – 1,31,1 [0,5-5,4]) (р 0,05). Представляется важным, что по уровню ДНК-комет женщины с нормально протекающей беременностью не отличаются от небеременных (2,61,3 [0,3-4,2]) (р 0,05). Данные нашего исследования впервые продемонстрировали целесообразность определения уровня ДНК повреждений методом ДНК-комет, поскольку найдены достоверные ассоциации показателей с патологией беременности при регистрации на ранних сроках. При этом, выполненный в следующем разделе работы анализ уровня свободной ДНК в плазме крови показал соответствие полученных данных результатам, зарегистрированным методом ДНК-комет. Уровень внеклеточной ДНК оказался достоверно большим в группах с патологией беременности (Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома в сроке гестации 10-11 недель – 0,80,2 [0,4-1,4], 14-15 недель – 0,80,2 [0,4-1,0], Неразвивающаяся беременность в сроке гестации 10-11 недель – 0,90,2 [0,5-1,3]) по сравнению с физиологически протекающей беременностью (в сроке гестации 10-11 недель – 0,60,2 [0,4-1,1], 14-15 недель – 109 0,50,2 [0,3-0,9]) (р 0,05). Также, как и при измерении ДНК-комет, содержание свободной ДНК в группе 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и группе 2 «Неразвивающаяся беременность» не различалось. Таким образом, можно заключить, что при исследовании нарушений ДНК как методом ДНК комет, так и при определении свободной ДНК в крови, получены сходные, взаимодополняющие результаты, демонстрирующие, что данные показатели позволяют дифференцировать патологическую беременность от нормальной, что свидетельствует о возможности их применения для диагностики. Значимость результатов исследования ДНК повреждений методом ДНКкомет и при определении внеклеточной ДНК подтверждается результатами раздела работы, посвященного анализу экспрессионного фактора Р53. Содержание Р53 оказалось более высоким в группах с патологией беременности, чем у женщин с физиологически протекающей беременностью (Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома в сроке гестации 14-15 недель – 0,80,2 [0,7-0,3], Неразвивающаяся беременность в сроке гестации 1011 недель – 0,70,5 [0,2-1,8], Физиологически протекающая беременность в сроке гестации 10-11 недель – 0,30,3 [0,1-1,5], 14-15 недель – 0,40,3 [0,1-1,6]) (р 0,05). Более того, рассматривая неразвивающуюся беременность (группа 2) как более тяжелую патологию по сравнению с начавшимся выкидышем (группа 1), можно отметить достоверное отличие уровня Р53 в группе 2 от группы 1 в сроке 10-11 недель. При физиологически протекающей беременности уровень Р53 на ранних сроках меньше, чем у небеременных женщин (0,60,2 [0,3-1,1], р 0,05), что может отражать включение защитных механизмов. Сравнивая собственные данные с литературными, можно отметить исследования, в которых экспрессия Р53 оказалась увеличенной у пациенток с идиопатическим самопроизвольным прерыванием беременности [40, 236, 265]. 110 Увеличение уровня Р53 при задержке внутриутробного роста показали Heazell и соавт. [147]. Таким образом, результаты, полученные нами при определении уровня белка Р53, отражают неодинаковые механизмы индукции Р53, ведущие либо к репарации, либо апоптозу, что специфично для данного экспрессионного фактора. Подтверждением включения митохондриального пути апоптоза могло бы служить увеличение уровня цитохрома С. Однако, в нашем исследовании его содержание увеличивалось лишь в 14-15 недель гестации в группе 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома», а в более ранние сроки не отличалось от физиологически протекающей беременности. Не выявлены отличия по содержанию цитохрома С у группы 2 «Неразвивающаяся беременность по сравнению с нормально протекающей беременностью, а последняя группа не отличалась от небеременных. Судя по литературным данным, ассоциации изменения содержания цитохрома С с патологией беременности в ряде случаев регистрируются. Так, при герпес-вирусных инфекциях, вызывающих гипоксию при беременности, содержание цитохрома С в гомогенате плаценты увеличивалось [43]. В другой работе попытка найти ассоциацию преждевременных родов с содержанием цитохрома С в околоплодных водах оказалась нерезультативной [214]. В случаях, когда апоптоз вызывался физическими факторами при ультразвуковом обследовании, уровень цитохрома С обнаружен повышенным в ворсинах хориона [272]. Немногочисленные литературные данные позволяют сделать заключение, что ассоциации цитохрома С с патологией беременности выявляются при определенных условиях в некоторых субстратах регистрации. Однако, на основании собственных данных следует отметить, что определение цитохрома С в плазме крови пациенток с патологией беременности не дало оснований для однозначных заключений о диагностической ценности 111 параметра. Следует рекомендовать дальнейший анализ маркерной значимости определения содержания цитохрома С, особенно при состояниях, связанных с гипоксией. Основная идея работы состояла в анализе связи генотоксичности с окислительным стрессом. Поэтому, при наличии результатов, демонстрирующих увеличение ДНК повреждений и, сопряженных с этими процессами, маркеров апоптоза, представлялось уместным дать сравнительную оценку чувствительности клеток пациенток с патологически протекающей беременностью и с физиологической к действию прооксидантов. В качестве такового избрана перекись водорода, которую инкубировали с клетками крови пациенток, определяя индуцированный уровень ДНК-комет. Установлено, что в наибольшей степени количество ДНК-комет увеличивалось в образцах крови, полученных в сроке 10-11 недель от пациенток группы 2 «Неразвивающаяся беременность» (31,110,4 [14,1-49,3]), затем следовала группа 1 «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» (в сроке гестации 10-11 недель – 23,17,9 [12,0-36,6], 14-15 недель – 30,58,6 [9,439,0]), в меньшей степени индукция ДНК повреждений наблюдалась в клетках, полученных от женщин с физиологически протекающей беременностью (в сроке гестации 10-11 недель – 17,16,6 [10,2-31,7], 14-15 недель – 20,48,9 [13,6-51,7]) (р 0,05). Таким образом, результаты данного теста соответствуют опытам с регистрацией ДНК повреждений методом ДНК-комет и по определению внеклеточной ДНК. Очевидно, что по чувствительности к H2O2, характеристики патологии беременности разной степени тяжести имеют свою специфику, как и по уровню экспрессионного фактора Р53. Полученные данные позволяют сделать заключение, что чувствительность к прооксидантному воздействию клеток, полученных от пациенток с патологией беременности выше по сравнению с нормальной беременностью. Аналогичных работ, проведенных в клинике, в доступной 112 литературе нами не обнаружено. Тем не менее, имеются исследования, в которых обнаружено, что в то время как при физиологически протекающей беременности изменение показателей про- и антиоксидантной систем свидетельствовали о биохимической поддержке плода в виде физиологической гипоксии в первом триместре беременности, общая антиоксидантная емкость в сыворотке крови повышалась в третьем триместре беременности [90, 103, 255]. Следовательно, примененный тест ex vivo дал результаты полностью соответствующие данным предыдущих разделов работы и, очевидно, удобен для рутинного применения в клинике. Таким образом, проведенный комплекс исследований позволил выявить ассоциации генотоксичности, определенной по уровню ДНК-комет, внеклеточной ДНК, по содержанию белка Р53 с патологией беременности. На причинную связь этих результатов с окислительным стрессом указывают как литературные, так и собственные данные, доказавшие повышенную чувствительность клеток пациенток с патологией беременности к действию прооксидантов по сравнению с физиологически протекающей беременностью. Полученные данные могут быть использованы для создания новых методов диагностики и разработки стратегий фармакотерапии невынашивания беременности. * * * Индуцированная окислительным стрессом генотоксичность представляет собой важное звено патогенеза невынашивания беременности, возникновения дефектов развития, что на сегодняшний день является достаточно распространенной патологией. В результате выполнения настоящей работы установлен факт увеличения нарушений ДНК у пациенток с патологией беременности, подтвержденный 113 различными методическими приемами. При поиске ассоциаций ряда параметров повреждений структуры ДНК и маркеров апоптоза выявлен кластер показателей, характеризующих пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома», «Неразвивающаяся беременность», достоверно отличный от значений, зарегистрированных при физиологическом течении беременности. Современные данные патофизиологии и биохимии дают веские основания считать параметры кластера взаимосвязанными. Гипотетически представляется следующая схема. При патологии беременности, возможно как этиологический фактор, снижается емкость антиоксидантной защиты. В нашем исследовании это подтверждено опытами ex vivo с перекисью водорода, вызывавшей более выраженные нарушения ДНК в клетках, полученных от пациенток с патологией беременности. Далее, усиление свободно-радикальной атаки вызывает повреждения ДНК, что показано нами при определении ДНКкомет и внеклеточной ДНК. Ранее выполненные, хорошо документированные исследования продемонстрировали, что клеточный ответ на повреждения ядерной ДНК включает увеличение экспрессии белка Р53, что также подтверждено в настоящей работе. Исследование двух других параметров – 8гидрокси-2-деоксигуанозина и цитохрома С не выявило различий между группами пациенток с патологией беременности и с физиологически протекающей беременностью. Литературный анализ позволил объяснить сходство в содержании 8-гидрокси-2-деоксигуанозина динамическими процессами регуляции его концентрации, особенно на ранних сроках беременности как в норме, так и при патологии. Изменения цитохрома С, повидимому, специфичны для заболеваний, при которых апоптотическая гибель клеток развивается по митохондриальному пути. Выявленный кластер: чувствительность к прооксиданту, ДНК- повреждения, внеклеточная ДНК, белок Р53 оказался высокодостоверным на относительно небольших, но статистически корректных выборках, позволял 114 дифференцировать группы с различной тяжестью патологии беременности. Этот результат, помимо ответа на главный вопрос диссертационного исследования об ассоциации генотоксичности с невынашиванием беременности, открывает перспективу дальнейших исследований на больших выборках с целью установления популяционных границ физиологической нормы параметров кластера и уровней маркеров, характеризующих патологию беременности при разных причинах ее вызывающих. Внедрение этих показателей в диагностику расширит возможности терапии невынашивания беременности. Возникает вопрос, имеют ли значение показатели выявленного кластера для определения стратегии фармакотерапии патологии беременности. В сегодняшний медикаментозный беременности включены арсенал гормональные с целью препараты, пролонгирования применяемые при недостаточности прогестерона, антикоагулянты и антиагреганты, применяемые при коагулопатиях, спазмолитические и содержащие соли магния средства, токолитики, витаминные препараты. Ряд экспериментальных работ позволяет предположить возможности дополнения имеющихся средств терапии. В трансляционных экспериментальных исследованиях, выполненных при анализе эффектов повреждающих средовых факторов, изучали связь генотоксических и тератогенных воздействий. Анализировали действие стандартных мутагенов: циклофосфамида, алкоголя, табачного дыма, торфяного дыма при обработке самок крыс на протяжении беременности, начиная с зачатия. Во всех опытах установлены ассоциации ДНК повреждений, определенных методом ДНКкомет, с тератогенным эффектом. В этих же работах показали, что фармакологические препараты и вещества, обладающие антимутагенными свойствами, в значительной степени предотвращают вызванные токсикантами 115 аномалии плода и нарушения постнатального развития [18, 24, 55, 72, 73, 74, 238, 239, 240]. Учитывая сходство показателей генотоксичности, выявленных в нашей работе и в цитированных экспериментальных исследованиях, представляется возможным планирование научно-исследовательской работы по поиску новых средств фармакотерапии генотоксичностью. невынашивания беременности, связанной с 116 Выводы 1. У пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» установлено увеличение ДНК-повреждений, регистрируемых методом ДНК-комет, в сроке беременности 10-11 недель в 2,5 раз, 12-13 недель – в 2,6 раз, 14-15 недель – в 2,5 раз по сравнению со значениями при физиологически протекающей беременности в соответствующие сроки, что отражает генотоксические проявления при данной патологии и определяет целесообразность их регистрации. 2. У пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» выявлено увеличение содержания внеклеточной ДНК в плазме крови в сроке беременности 10-11 недель в 1,3 раза, 14-15 недель – в 1,6 раз по сравнению с определенным в те же сроки при физиологически протекающей беременности, демонстрирующее активацию процессов апоптоза и возможность использования уровня свободной ДНК в качестве их маркера при начавшемся выкидыше. 3. У пациенток с диагнозом «Неразвивающаяся беременность» в сроке 10-11 недель методом ДНК-комет выявлено увеличение ДНК-повреждений, установленных методом ДНК-комет, в 1,8 раз, содержание внеклеточной ДНК в плазме крови в 1,5 раз по сравнению с зарегистрированными в те же сроки показателями при физиологически протекающей беременности, что демонстрирует генотоксические проявления при неразвивающейся беременности и маркерную значимость определенных параметров. 4. Выявлено увеличение экспрессии белка Р53 в сыворотке крови в группе с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» в сроке 1415 недель в 1,75 раз, а в группе «Неразвивающаяся беременность» в сроке 10-11 недель в 2,3 раз по сравнению с показателями соответствующих сроков при физиологически протекающей беременности, что отражает 117 клеточный ответ на усиление генотоксичности и повреждения ДНК при изученной патологии. 5. В исследовании ex vivo установлено, что чувствительность клеток крови к повреждающему ДНК действию перекиси водорода минимальна при физиологически протекающей беременности, увеличивается в 1,5 раз в сроке 14-15 недель в группе с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома» и в 1,8 раз в сроке 10-11 недель в группе «Неразвивающаяся индуцированных беременность». В этот ДНК-повреждений в группе период значения «Неразвивающаяся беременность» выше в 1,35 раз, чем в группе «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома». Полученные результаты указывают на снижение антиоксидантной защиты при изученных патологиях, в большей степени при неразвивающейся беременности. 6. Содержание 8-гидрокси-2-деоксигуанозина в клетках крови в сроке 12-13 недель у беременных пациенток увеличено до 163% в сравнении с небеременными. Достоверных различий в группах с физиологически протекающей беременностью и при патологии в изученные сроки не выявлено, что свидетельствует об отсутствии маркерной значимости параметра для изученной патологии беременности на ранних сроках. 7. По уровню цитохрома С в сыворотке крови пациентки с физиологически протекающей беременностью и при патологии в изученные сроки не отличались, за исключением двукратного увеличения содержания цитохрома С на 14-15 неделе у пациенток с диагнозом «Начавшийся выкидыш. Ретрохориальная гематома». 8. Для характеристики генотоксичности, зависимой от окислительного стресса, определена маркерная значимость кластера показателей, включающего чувствительность клеток к повреждающему ДНК действию перекиси водорода ex vivo, уровень ДНК-комет, внеклеточной ДНК, 118 экспрессию белка Р53, что расширяет перспективы диагностики невынашивания беременности с целью предотвращения акушерских потерь. 119 Практические рекомендации Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать следующее. 1. Включение кластера показателей: определение чувствительности к прооксиданту ex vivo, уровень ДНК-комет, внеклеточной ДНК, содержания белка Р53, в алгоритм обследования женщин при беременности для выявления групп риска по невынашиванию беременности и своевременного применения профилактических и лечебных мероприятий по предотвращению репродуктивных потерь. 2. Исследования с целью определения популяционных границ физиологической нормы показателей, генотоксичности, информативных установленных в в отношении настоящей работе, проявлений что позволит применять новые методы диагностики невынашивания беременности на ранних сроках гестации. 3. Постановку экспериментальных фармакотерапевтических и методов генотоксичности при беременности. клинических работ профилактики для создания проявлений 120 Список используемой литературы 1. Адамян, Л.В. Пороки развития гениталий / Л.В. Адамян, Л.И. Кулаков, А.З Хашукоева. – М. : Медицина, 1998. – 320 с. 2. Акушерство: национальное руководство / под ред. Э. К. Айламазяна, В. И. Кулакова, В. Е. Радзинского, Г. М. Савельевой. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2014. – 1200с. 3. Алегина, Е.В. Генный полиморфизм как фактор, предрасполагающий к привычным потерям беременности / Алегина Е.В., Тетруашвили Н.К., Агаджанова А.А., Трофимов Д.Ю., Донников А.Е. // Акушерство и гинекология. – 2014. – №4. – С. 25-31. 4. Анкирская, А.С. Проблемы хронической (персистирующей) хламидийной инфекции / А.С. Анкирская //Акушерство и гинекология. – 1999. – №3. – С. 8-10. 5. Аржанова, О.Н. Этиопатогенез невынашивания беременности / Аржанова О.Н., Кошелева Н.Г. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2004. – Т. LIII, № 1. – С. 37-41. 6. Атыканов, А.О. Интенсивность перекисного окисления липидов и системы АОЗ в плазме крови у женщин с невынашиванием беременности: Репродуктивное здоровье и латентные инфекции : сборник научных статей Международной научно-практической конференции / А.О. Атыканов. – Бишкек, 2001. – С. 94-98. 7. Баранов, В.С. Геном человека и гены «предрасположенности». Введение в предиктивную медицину / Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. – СПб. : Интермедика, 2000. — 271 с. 8. Баранов, В.С. Научные и практические аспекты пренатальной диагностики / В.С. Баранов // Вестн. Рос. АМН. – 2003. – №10. – С. 8-13. 121 9. Батрак, Н.В. Иммунологические аспекты привычного невынашивания беременности / Батрак Н.В., Малышкина А.И., Крошкина Н.В. // Акушерство и гинекология. – 2014. – №12. – С. 10-14. 10.Беспалова, О. Н. Генетика невынашивании беременности // Журнал акушерства и женских болезней. – 2007. – Т. LVI. - №1. - С. 81-95. 11.Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению / Под ред. И.В. Кулакова. – М. : ГЕОТАР-Медиа, 2005. – 616 с. 12.Боровиков, В.П. Statistica. Искусство анализа данных на компьютере / В.П. Боровиков. – СПб., Питер, 2003. – 688 с. 13.Бочков, Н.П. Наследственность человека и мутагены внешней среды / Бочков Н.П., Чеботарев А.Н. – М: Москва, 1989. – 252 с. 14.Ванько, Л.В. Оксидативный стресс в генезе акушерских осложнений / Ванько Л.В., Сафронова В.Г., Н.К. Матвеева, Г.Т. Сухих. – М. : ГЭОТАРМедиа, 2010. – 264 с. 15.Владимирцева, Т.В. Окислительный стресс и нарушение морфологии гамет, индуцируемое хлоридом цинка / Владимирцева Т.В., Успенская Ю.А., Нефедова В.В., Егорова А.Б. // Гигиена и санитария. – 2003. – №1. – С. 5859. 16.Гинекология. Клинические лекции / под ред. О.В. Макарова. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 352с. 17.Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. – М. : Практика, 1999. – 459 с. 18.Горбатова, Д.М. Пренатальные эффекты продуктов сгорания торфа и их коррекция афобазолом у потомства крыс / Горбатова Д.М., Немова Е.П., Соломина А.С., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2014. – №11. – С. 604-608. 122 19.Доброхотова, Ю.Э. Неразвивающаяся беременность: тромбофилические и клинико-иммунологические факторы: Руководство / Ю.Э. Доброхотова. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2010. – 144 с. 20.Доброхотова, Ю.Э. Окислительный стресс в плаценте при физиологической и патологически протекающей беременности / Доброхотова Ю.Э., Иванова Т.А., Гуляева Н.В., Онуфриев М.В., Джобава Э.М., Гехт А.Б. // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2008. – №6. – 33-36. 21.Дурнев, А.Д. Методологические аспекты исследований по модификации химического мутагенеза / А.Д. Дурнев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2008. – Т.146. – №9. – С. 281-287. 22.Дурнев, А.Д. Мутагены (скрининг и фармакологическая профилактика воздействий): научное издание / А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин. – М. : Медицина, 1998. – 327 С. 23.Дурнев, А.Д. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации / Дурнев А.Д., Жанатаев А.К., Анисина Е.А., Сиднева Е.С., Никитина В.А., Оганесянц Л.А., Середенин С.Б. – Мб. – 2006. – 27с. 24.Забродина, В.В. Влияние «Афобазола» и бетаина на ДНК-повреждения в плацентарных и эмбриональных тканях крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом / В.В. Забродина, Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2015. – Т. 159, №6. – С. 731-735. 25.Забродина, В.В. Нарушения пренатального развития и гликемического статуса у потомства крыс с экспериментальным стрептозотоциновым диабетом и их коррекция афобазолом // В.В. Забродина, Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2014. – Т.158. – №7. – С. 20-24. 123 26.Зенков, Н.К. Окислительынй стресс: Биохимический и патофизиологический аспекты / Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б.. – М. : МАИК «Наука/Интерпериодика», 2001. – 343 с. 27.Золотухин, П. В. Окислительный стресс и беременность / П.В. Золотухин // Валеология. – 2010. – №2. – С. 2218-2268. 28.Золотухина, Т.В. Алгоритм клинико-генетического обследования при неразвивающихся беременностях: Методические рекомендации (№36) / Золотухина Т.В., Подзолкова Н.М., Шилова Н.В., Жислина И.Б. – М., 2002. – 13 с. 29.Клинические рекомендации. Акушерство и гинекология / под. ред. В.Н. Серова, Г.Т. Сухих. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2014. – 1024 с. 30.Ковалева, Ю.А. Определение внеклеточных ДНК крови – клиническое и диагностическое значение / Ю.А. Ковалева, А.А. Хасанов, С.М. Сингатуллина. – 2010. – №4(43). – С. 63-66. 31.Козлова, В.И. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий / Козлова В.И., Пухнер А.Ф. – М.: Триада-Х, 2003. – 440 с. 32.Колесникова, Л.И. Гены ферментов антиоксидантной системы / Колесникова Л.И., Баранова Т.А., Первушина О.А. // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2013. – №12. – С. 83-88. 33.Колесникова, Л.И. Особенности перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у женщин с хроническим эндометритом и репродуктивными нарушениями / Колесникова Л.И., Данусевич И.Н., Курашева Н.А., Сутурина Л.В., Долгих М.И. // Фундаментальные исследования. – 2013. – №9. – С. 829-832. 34.Колесникова, Л.И. Оценка показателей про- и антиоксидантного статуса в эякуляте мужчин репродуктивного возраста / Л.И. Колесникова, Н.А. Курашева, Л.В. Осадчук с соавт. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2015. – №6. – С. 697-700. 124 35.Колесникова, Л.И. Состояние репродуктивного здоровья и особенности функционирования антиоксидантная системы система» «Перекисное у мужчин окисление основных липидов этнических – групп Прибайкалья / Колесникова Л.И., Колесников С.И., Курашева Н.А., Осадчук Л.В., Осадчук А.В., Долгих М.И., Дашиев М.И., Шантанова Л.Н. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2015. – №7. – С.3840. 36.Колесникова, Л.И. Состояние системы «ПОЛ – антиоксидантной защиты» новорожденных и женщин, употреблявших небольшие количества алкоголя в период беременности / Колесникова Л.И., Протопопова Н.В., Колесников С.И., Марянян А.Ю., Власов Б.Я., Натяганова Л.В. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2015. – №5. – С.545-548. 37.Кречетова, Л.В. Диагностическая значимость оценки фенотипа лимфоцитов периферической крови женщин с привычным выкидышем / Кречетова Л.В., Тетруашвили Н.К., Хачатрян Н.А., Вторушина В.В., Степанова Е.О., Николаева М.А., Сухих Г.Т. // Акушерство и гинекология. – 2015. – №1. – С. 25-31. 38.Курманголиева, З.Б. Патофизиологические основы невынашивания беременности на фоне герпетической инфекции : автореф. Дис. …канд. мед. наук. : 14.01.01 / Курманголиева З.Б. – М., 2007. – 22С. 39.Кухарчик, Ю.В. Состояние прооксидантно-антиоксидантной системы у женщин с первым эпизодом невынашивания беременности / Кухарчик Ю.В., Гутикова Л.В. // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2013. – №2. С. 8-11. 40.Куцин, К.А. Экспрессия генов системы репарации (APEX1, XPD) и контроля клеточного цикла (CHEK2, P53) при патологии беременности / К.А. Куцин, К.А. Коваленко, Е.В. Машкина, Т.П. Шкурат // Современные проблемы науки и образования. – 2013. – №6. 125 41.Лебедев, И.Н. Молекулярно-цитогенетическая характеристика хромосомного дисбаланса в клетках спонтанных абортусов человека с низкой пролиферативной активностью in vitro / Лебедев И.Н., Островерхова Н.В, Никитина Т.В. // Генетика. – 2003. – Т.39. – №8. – С. 1111-1122. 42.Левкович, М.А. Иммуно-гормональные взаимодействия в генезе невынашивания беременности ранних сроков / Левкович М.А., Линде В.А., Андреева В.О., Плахотя Т.Г., Нефедова Д.Д. // Акушерство и гинекология. – 2012. – №8-1. – С. 10-14. 43.Луценко, М.Т. Содержание цитохрома С и количество ядер в состоянии апоптоза в плаценте беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции / Луценко М.Т., Андриевская И.А. // Фундаментальные исследования. – 2010. – №2. – С. 75-79. 44.Макаров О.В. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет / О.В. Макаров. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2007. – 176с. 45.Макаров, О.В. Изменение показателей иммунитета у пациенток с невынашиванием беременности инфекционного генеза в I триместре / О.В. Макаров, Л.А. Озолиня, Т.Н. Сумеди // Росс. Вестник акушера-гинеколога. – 2008. – №6. – С. 28-32. 46.Макаров, О.В. катехоламинов Полиморфизм и эксцизионной генов ферментов репарации системы ДНК как обмена предиктор репродуктивных потерь / Макаров О.В., Морозова К.В., Сальникова Л.Е., Хаджиева М.Б., Гончарова В.С., Луценко Н.Н. // Акушерство и гинекология. – 2015. – №2. – С. 60-65. 47.Макацария, А.Д. Тромбофилии и противотромботическая терапия в акушерской практике / А.Д. Макацария, В.О. Бицадзе. – М. : Триада-М, 2003. – 904 С. 48.Мещерякова, А.В. Иммуноморфологические изменения в децидуальной ткани при неразвивающейся беременности и сопутствующей 126 урогенитальной инфекции / Мещерякова А.В., Демидова Е.М., Старостина Т.А. // Акушерство и гинекология. – 2001. – №3. – С. 22-24. 49.Павлова, Н.Г. Значение ферментов глутатионзависимого звена антиоксидантной защиты для прогноза невынашивания беременности / Павлова Н.Г., Прокопенко В.М., Парцалис Г.К. // Журнал акушерства и женских болезней. – 2010. – Т. LIX. – № 2. – С. 65-68. 50.Парсаданян, Н.Г. угрожающем, / Уровень привычном свободной выкидыше и эмбриональной неосложненном ДНК при течении беременности в сроках до 22 недель / Парсаданян Н.Г., Шубина Е.С., Тетруашвили Н.К., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. // Акушерство и гинекология. – 2015. – №2. – С. 33-38. 51.Раджабова, Н.С. Состояние окислительно-антиоксидантной системы у женщин с невынашиванием беременности инфекционного генеза / Раджабова Н.С., Черкесова А.У., Аскерханова Э.Р., Черкесова Д.У. // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2013. – №5. – С. 4-7. 52.Радзинский, В.Е. Неразвивающаяся беременность / Радзинский В.Е., Димитрова В.И., Майскова И.Ю. – М. : ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 196 с. 53.Реброва, О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ Statistica / О.Ю. Реброва. – М. : МедиаСфера, 2002. – 312 с. 54.Рустанович, Ю.Г. Особенности антиоксидантной системы при неразвивающейся беременности / Ю.Г. Рустанович, Д.Ф. Костючек // Вестник Российской военно-медицинской академии. – 2012. – №4(40). – С. 91-96. 55.Середенин, С.Б. Влияние афобазола на эмбриональное развитие потомства у крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма / Середенин С.Б., Дурнев А.Д., Жуков В.Н., Соломина А.С. // Токсикологический вестник. – 2011. – №1. – С. 17-21. 127 56.Середенин, С.Б. Влияние эмоционального стресса на частоту хромосомных аберраций в клетках косного мозга мышей / С.Б. Середенин, А.Д. Дурнев, А.А. Ведерников // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1980. – Т.89. – №7. – С. 91-92. 57.Середенин, С.Б. Фармакологическая защита генома: научное издание / С.Б. Середенин, А.Д. Дурнев. М. : ВИНИТИ, 1992. – 160 С. 58.Серова, О.Ф. Основные патоморфологические причины неразвивающейся беременности и обоснование предгравидарной терапии женщин / Серова О.Ф., Милованов А.П. // Акушерство и гинекология. – 2001. – № 3. – С. 1923. 59.Сидельникова, В.М. Неполноценная лютеиновая фаза (НЛФ) – тактика ведения женщин с привычной потерей беременности. Привычная потеря беременности – новый взгляд на роль половых гормонов / Тезисы Всероссийского форума «Мать и дитя». – М., 2002. – С. 907-908. 60.Сидельникова, В.М. Подготовка и ведение беременности у женщин с привычным невынашиванием: Методические пособия и клинические протоколы / В.М. Сидельникова. – М. : МЕДпресс-информ, 2010. – 219 с. 61.Сидельникова, В.М. Привычная потеря беременности / В.М. Сидельникова – М. : Триада-Х, 2005. – 303 с. 62.Сидельникова, В.М. Эндокринология беременности в норме и при патологии / В.М. Сидельникова. – М. : МЕДпресс-информ, 2007. – 352 с. 63.Сидорова, И.С. Невынашивание беременности: нарушение антиоксидантной защиты и ее коррекция / Сидорова И.С., Унанян А.Л. // Российский вестник акушера-гинеколога. – 2009. – №1. С. 14-16. 64.Сидорова, И.С. Течение и ведение беременности по триместрам / Сидорова И.С., Макаров И.О. – М. : ООО «Медицинское информационное агентство», 2007. – 304с. 128 65.Тамкович, С.Н. Циркулирующие ДНК крови и их использование в медицинской диагностике / С.Н. Тамкович, В.В. Власов, П.П. Лактионов // Молекулярная биология. – 2008. – T.42. – №1. - C. 12-23. 66.Тамкович, С.Н. Циркулирующие нуклеиновые кислоты в крови больных раком желудка и толстой кишки / Тамкович С.Н., Брызгунова О.Е., Рыкова Е.Ю. с соавт. // Биомед. Химия. – 2005. – 51. – С. 321-328. 67.Хачатрян, Н.А. Аллоиммунные механизмы привычного выкидыша / Н.А. Хачатрян, Л.В. Кречетова, Н.К. Тетруашвили // Акуш. и гин. – 2014. – №5. – C. 3-8. 68.Хачатрян, Н.А. Лимфацитоиммуннотерапия в коррекции аллоиммунных нарушений при привычном выкидыше / Н.А. Хачатрян, Л.В. Кречетова, Н.К. Тетруашвили // Акуш. и гин. – 2014. – №1. – C. 9-14. 69.Хашукоева, А.З. «Оксидантный стресс» при привычном невынашивании беременности / Хашукоева А.З., Никулин Б.А., Маматиева М.А. // Материалы IX Всероссийского научного форума «Мать и дитя». Москва. – 2009. – С. 183-184. 70.Хашукоева, А.З. Особенности метаболического резерва фагоцитов и антиоксидантная активность крови при привычном невынашивании беременности в I триместре / Хашукоева А.З., Никулин Б.А., Маматиева М.А., Ходжаева Д.А. // Вестник РГМУ. – 2009. – №4. – С. 22-26. 71.Чумаков, П.М. Белок Р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме / П.М. Чумаков // Успехи биологической химии. – 2007. – Т.47. – С. 3-52. 72.Шредер, Е.Д. Влияние афобазола на генотоксические и нейротоксические эффекты в модели пренатальной алкоголизации крыс / Е.Д. Шредер, О.В. Шредер, В.В. Забродина, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2014. – № 4. – С. 492-495. 129 73.Шредер, О.В. Влияние афобазола на когнитивное поведение потомства крыс, подвергнутых воздействию табачного дыма в период беременности / Шредер О.В., Соломина А.С., Цорин И.Б., Трофимов С.С., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2011. – №1. – С. 48-54. 74.Шредер, О.В. Сопряженность генотоксических и тератогенных эффектов, вызываемых циклофосфамидом, и их модификация афобазолом / О.В. Шредер, Е.Д. Шредер, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин // Гигиена и санитария. – 2011. – № 5. – С. 64-68. 75.Ярилин, А.А. Апоптоз: природа феномена и его роль в норме и при патологии. Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. Б.Б. Мороза. – М. : Медицина, 2001. – С. 13-56. 76.Adly, A.M. Oxidative Stress and Disease: An Updated Review / A.M. Adly // Research Journal of Immunology. – 2010. – №3. – pp. 129-145. 77.Agarwal, A. Oxidative stress and its implications in female infertility – a clinician’s perspective / Agarwal A., Gupta S., Sharma R. // Reprod. Biomed. Online. – 2005. – №11. – November (5). – pp. 641–650. 78.Agarwal, A. Role of free radicals in female reproductive diseases and assisted reproduction / Agarwal A., Allamaneni S.S. // Reprod. Biomed. Online. – 2004. – №9. – pp. 338–347. 79.Agarwal, A. The effects of oxidative stress on female reproduction: a review / Agarwal A., Aponte-Mellado A., Premkumar B.J., Shaman A., Gupta S. // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2012. – 10:49. 80.Al-Shebly, M.M. Evaluation of oxidative stress and antioxidant status in diabetic and hypertensive woman during labor / Al-Shebly M.M., Mansour M.A. // Oxid. Med. Cell. Longev. – 2012. – 329743. 130 81.Alijotas-Reig, J. The European Registry on Obstetric Antiphospholipid Syndrome (EUROAPS): a preliminary first year report / Alijotas-Reig J., Ferrer-Oliveras R., EUROAPS Study Group // Lupus. – 2012. – №21. – pp. 766-768. 82.Andersen, A.M. Moderate alcohol intake during pregnancy and risk of fetal death / Andersen A.M., Andersen P.K., Olsen J., Gronbaek M., Strandberg-Larsen K. // Int. J. Epidemiol. – 2012. – №41. – pp. 405-413. 83.Anker, P. Circulating nucleic acids in plasma and serum as a noninvasive investigation for cancer: time for large-scale clinical studies? / Anker, P., Mulcahy H., Stroun M. // Int. I. Cancer. – 2003. – №103. – pp. 149-152. 84.Baatout, S. Cytometric methods to analyze radiation effects / S. Baatout, H. Derradgi // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. – 2004. – №18. – pp. 101-105. 85.Baban, R.S. Oxidative stress in recurrent pregnancy loss women / R.S. Baban // Saudi Med. Journal. – 2010. – V.31. – №7. – pp. 759-763. 86.Babazadeh, Z. Sperm DNA damage and its relation with leukocyte DNA damage / Babazadeh Z., Razavi S., Tavalaee M., Deemeh M.R., Shahidi M., Nasr- Esfahani M.H. // Reprod. Toxicol. – 2010. – January (1). – №29. – pp. 120–124. 87.Barratt, C.L. Sperm DNA: organization, protection and vulnerability: from basic science to clinical applications – a position report / Barratt C.L., Aitken R.J., Bjorndahl L. et al. // Hum. Reprod. – 2010. – April (4). – №25. – pp. 824–838. 88.Bartsch, H. Chronic inflammation and oxidative stress in the genesis and perpetuation of cancer: role of lipid peroxidation, DNA damage, and repair / Bartsch H., Nair J. // Langenbecks Arch. Surg. – 2006. – September (5). – №391. – pp. 499–510. 89.Barzilai, A. DNA damage responses to oxidative stress / Barzilai A., Yamamoto K. // DNA Repair (Amst.). – 2004. – August–September (8–9). – №3. – pp. 1109– 1115. 131 90.Basu, J. Placental oxidative status throughout normal gestation in women with uncomplicated pregnancies / J. Basu, B. Bendek, E. Agamasu et al. // Obstetrics and Gynecology International. – 2015. – 1 Feb. 91.Bech, B.H. Coffee and fetal death: a cohort study with prospective data / Bech B.H., Nohr E.A., Vaeth M., Henriksen T.B., Olsen J. // Am. J. Epidemiol. – 2005. – №162. – pp. 983-990. 92.Beckman, R.A. Genetic instability in cancer: theory and experiment / R.A. Beckman, L.A. Loeb // Semin. Cancer Biol. – 2005. – №15. – pp. 423-435. 93.Benachi, A. Cell-free DNA analysis in maternal plasma in cases of fetal abnormalities detected on ultrasound examination / A. Benachi, A. Letourneau, P. Kleinfinger, M.V. Senat et al. // Obstetrics and Gynecology. – 2015. – V.125. – №6. – pp. 1330-1337. 94.Bianchi, D.W. DNA sequencing versus standart prenatal aneuploidy screening / Bianchi D.W., Parker R.L., Wentworth J., Madankumar R., Saffer C., Das A.F., Craig J.A., Chudova D.I., Devers P.L., Jones K.W., Oliver K., Rava R.P., Sehnert A.J.: Care Study Groop // N. Engl. J. Med. – 2014. Feb 27. – №370(9). – pp. 799808. 95.Bijok, J. Non-invasive prenatal diagnosis of the most common aneuploidies with cell-free DNA in maternal serum – preliminary results / Bijok J., Gorzelnik K., Massalska D., Ilnicka A.m Pawlowska B., Zimowski J.G., Kucinska-Chahwan A., Jakiel G., Roszkowski T. // Ginekol. Pol. – 2014 – №85(3). – pp. 208-213. 96.Boas, W.V. Metabolism and gene polymorphisms of the folate pathway in Brazilian women with history of recurrent abortion / W.V. Boas, R.O. Goncalves, O.L. Costa, M.S. Goncalves // Rev. Bras. Ginecol. Obstet. – 2015. – №37(2). – pp. 71-76. 97.Bobadilla-Morales, L. Chromosome instability in a patient with recurrent abortions / Bobadilla-Morales L., Cervantes-Luna M.I., Garcia-Cobian T.A., 132 Gomez-Meda B.C., de la Torre C.O., Corona-Rivera J.R., Corona-Rivera // A Genet. Couns. – 2009. – №20 (2). – pp. 153–159. 98.Bonde, J.P. Relation between semen quality and fertility: a population-based study of 430 first-pregnancy planners / J.P. Bonde, E. Ernst, T.K. Jensen et al. // Lancet. – 1998. – №352. – pp. 1172-1177. 99.Boots, C. Does obesity increase the risk of miscarriage in spontaneous conception: a systematic review / Boots C., Stephenson M.D. // Semin. Reprod. Med. – 2011. – №29. – pp. 507-513. 100. Boots, C.E. Frequency of euploid miscarriage is increased in obese women with recurrent early pregnancy loss / C.E. Boots, L.A. Bernardi, M.D. Stephenson // Fertil. Steril. – 2014. – №102. – pp. 455-459. 101. Brahem, S. Semen parameters and sperm DNA fragmentation as causes of recurrent pregnancy loss / Brahem S., Mehdi M., Landolsi H., Mougou S., Elghezal H., Saad A // Urology. – 2011. – №78. – pp. 792–796. 102. Branch, D.W. Clinical practice. Recurrent miscarriage / Branch D.W., Gibson M., Silver R.M. // N. Engl. J. Med. – 2010. – №363. – pp. 1740-1747. 103. Burton, G.J. Oxidative stress / Burton G.J., Jauniaux E.// Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. – 2011. – V.25. – №3. – P. 287-299. 104. Burton, G.J. Oxygen, early embryonic metabolism and free radical – mediated embryopathies / Burton G.J., Hempstock J., Jauniaux E. // Reprod. Biomed. Online. – 2003. – №6. – pp. 84-96. 105. Cardone, T.A.F. Swanson’s Family Practice Review / Tallia A.F. Cardone, D.A., Howarth D.F. et al. // St. Louis, MO: Mosby, 2005. – 337 p. 106. Chamy, V. Oxidative stress is closely related to clinical severity of preeclampsia / Chamy V., Lepe J., Catal I., Retamal D., Escobar G., Madrid E. // Biol. Res. – 2006. – № 39. – pp. 229–236. 107. Chan, Y.Y. Reproductive outcomes in women with congenital uterine anomalies: a systematic review / Chan Y.Y., Jayaprakasan K., Tan A., Thornton 133 J.G., Coomarasamy A., Raine-Fenning N.J. // Ultrasound Obstet. Gynecol. – 2011. – №38. – pp. 371-382. 108. Chiu, R.W. Non-invasive prenatal assessment of trisomy 21 by multiplex maternal plasma DNA sequencing: large scale validity study / R.W. Chiu, R. Akolekar, Y.W. Zheng et al. // BMJ. – 2011. – №342 – Jan. 11. 109. Chiu, R.W.K. Noninvasive prenatal testing by maternal plasma DNA analysis: Current practice and future applications / Rossa W.K. Chiu // Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. – 2014. – №74 (Suppl. 244). – pp. 48-53. 110. Clark-Ganheart, C.A. Use of cell-free DNA in the investigation of intrauterine fetal demise and miscarriage / Clark-Ganheart C.A., Fries M.H., Leifheit K.M., Jensen T.J., Moreno-Ruiz N.L., Ye P.P., Jennings J.M., Driggers R.W. // Obstet. Gynecol. – 2015. – Jun. – №125(6). – pp. 1321-1329. 111. Cogswell, M.E. Cigarette smoking, alcohol use and adverse pregnancy outcomes: implications for micronutrient supplementation / Cogswell M.E., Weisberg P., Spong C. // J. Nutr. – 2003. – May (5 Suppl. 2). – №133. – pp. 1722–1731. 112. Collins, A.R. Measuring oxidative damage to DNA and its repair with the comet assay / A.R. Collins // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. – 2014. – №1840(2). – pp. 794–800. 113. Collins, A.R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair / Azqueta A.R. Collins. // Archives of Toxicology. – 2013. – №87(6). – pp. 949-968. 114. Cortopassi, G. There is substantial agreement among interspecies estimates of DNA repair activity / G. Cortopassi, E. Wang // Mech. Aging Dev. – 1996. – №91. – 211-218. 115. Cramer, D.W. The epidemiology of recurrent pregnancy loss / Cramer D.W., Wise L.A. // Seminin. Reprod. Med. – 2000. – №18. – pp. 331-339. 134 116. Daya, S. Luteal support: progestogens for pregnancy protection / S. Daya // Maturitas. – 2009. – V.65. – №1. – pp. 29-34. 117. De Bont, R. Endogenous DNA damage in humans: a review of quantitative data / De Bont R., van Larebeke N. // Mutagenesis. – 2004. – May (3). – №19. – pp. 169–185. 118. De Groot, L. Management of thyroid dysfunction during pregnancy and postpartum: an Endocrine Society clinical practice guideline / L. De Groot, M. Abalovich, E.K. Alexander et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2012. – №97. – pp. 2543-2565. 119. Di Tommaso, M. Cell-free fetal DNA in maternal circulation after chorionic villous sampling / M. Di Tommaso, V. Seravalli, F. Salvianti et al. // Prenat. Diagn. – 2013. – №33(7). – pp. 695-699. 120. Dizdaroglu, M. Measurement of oxidatively induced DNA damage and its repair, by mass spectrometric techniques / M. Dizdaroglu, E. Coskun, P. Jaruga // Free Radical Res. – 2015. – №49(5). – pp. 525-548. 121. Durackova, Z. Some current insights into oxidative stress / Durackova, Z. // Physiol. Res. – 2010. – №59. – pp. 459-469. 122. Eliyahu, D. Participation of P53 cellular tumor antigen in transformation of normal embryonic cells / D. Eliyahu, A. Raz, P. Gruss et al. // Nature. – 1984. – №312. – pp. 646-649. 123. Fang, Y. The P53-HDM2 gene-gene polymorphism interaction is associated with the development of missed abortion / Y. Fang, B. Kong, Q. Yang et al. // Reproductive genetics. – 2011. – V.26. – №5. – pp. 1252-1258. 124. Farina, A. High levels of fetal cell-free DNA in maternal serum: a risk factor for spontaneous preterm delivery / A. Farina, E.S. Leshane, R. Romero et al. // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2005. – №193. – pp. 421-425. 125. Farquharson, R.G. Early pregnancy / R.G. Farquharson, M.D. Stephenson // New York: Cambridge University Press, 2010. 135 126. Ferguson, K.K. Repeated measures of urinary oxidative stress biomarkers during pregnancy and preterm birth / K.K. Ferguson, McElrath T.F., Chen Y-H., Loch-Caruso R., Mukherjee B., Meeker J.D. // American Journal of Obstetrics and Gynecology. – 2015. – №212(2). – pp. 1-8. 127. Finlay, C.A. Activating mutations for transformation by P53 produce a gene product that forms an hsc70-P53 complex with an altered halp-life / C.A. Finlay, P.W. Hinds, T.H. Tan et al. // Mol. Cell. Biol. – 1988. – №8. – pp. 531-539. 128. Fraga, L.R. P53 signaling pathway polymorphisms associated to recurrent pregnancy loss / L.R. Fraga, C.G. Dutra, J.A. Boquett et al. // Mol. Biol. Rep. – 2014. – №41(3). – pp. 1871-1877. 129. Friedberg, E.C. DNA damage and repair / E.C. Frienberg // Nature. – 2003. – №421(6921). – pp. 436-440. 130. Fujimaki, A. Placental oxidative DNA damage and its repair in preeclamptic woman with fetal growth restriction / Fujimaki A., Watanabe K., Mori T., Kimura C., Shinohara K., Wakatsuki A. // Placenta. – 2011. – 32. – P. 367-372. 131. Funk, K.L. Women’s attitudes towards a pre-conception healthy lifestyle programme / K.L. Funk, E.S. LeBlanc, K.K. Vesco, V.J. Stevens // Clin. Obes. – 2015. – Mar. 4. 132. Furness, D.L. Increased lymphocyte micronucleus frequency in early pregnancy is associated prospectively with pre-eclampsia and/or intrauterine growth restriction / Furness D.L., Dekker G.A., Hague W.M., Khong T.Y., Fenech M.F. // Mutagenesis. – 2010. – №25. – pp. 489–498. 133. Gahan, P. Circulating Nucleic Acids in Plasma or Serum / Gahan P., Swaminathan R. et al. // Annals of the New York Academy of science. – 2008. – V. 906 – pp. 188. 134. Garrido-Gimenez, C. Recurrent miscarriage: causes, evaluation and management / Garrido-Gimenez C., Alijotas-Reig J. // Postgrad. Med. J. – 2015. – Mar. – 91(1073). – pp. 151-162. 136 135. Gates, K. S. An overview of chemical processes that damage cellular DNA: spontaneous hydrolysis, alkylation and reactions with radicals / K.S. Gates //Chem. Res. Toxicol. – 2009. – №22. – pp. 1747–1760. 136. Gil-Villa, A.M. Role of male factor in early recurrent embryo loss: do antioxidants have any effect? / A.M. Gil-Villa, W. Cardona-Maya, A. Agarwal et al. // Fertil. Steril. – 2009. – №92. – pp. 565-571. 137. Glei, M. Assessment of DNA damage and its modulation by dietary and genetic factors in smokers using Comet assay: a biomarker model / M. Glei, N. Habermann, K. Osswald et al. // Biomarkers. – 2005. – №10. – pp. 203-217. 138. Glei, M. Use of Comet-FISH in the study of DNA damage and repair: Review / M. Glei, G. Hovhannisyan, B.L. Pool-Zobel // Mutation Research. – 2009. – №681. – pp. 33-43. 139. Goddijn, M. Genetic aspects of miscarriage / Goddijn M., Leschot N.J. // Baillieres Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. – 2000. – №5. – pp. 855-865. 140. Gorbatova, D.M. Afobazole protects rats exposed to peat smoke in utero / Gorbatova D.M., Litvinova S.A., Durnev A.D., Seredenin S.B. // Bull. Exp. Biol. Med. – 2015. – №158(5). – pp. 664-669. 141. Green, D.R. The pathophysiology of mitochondrial cell death / D.R. Green, G. Kroemer // Science. – 2004. – №305(5684). – pp. 626-629. 142. Haas, D.M. Progestagen for preventing miscarriage / D.M. Haas, P.S. Ramsey // Cochrane Database Syst. Rev. – 2013. – №10. 143. Hahn, S. Cell-free nucteotic acids as potentional markers for preeclampsia / S. Hahn, C. Rusterholz, I. Hosli, O. Lapaire // Placenta. – 2011. – №32. – pp. 17-20. 144. Haines, D.D. Management of multicellular senescence and oxidative stress / D.D. Haines, B. Juhasz, A. Tosaki // Journal of Cellular and Molecular Medicine. – 2013. – V.17. – №8. – pp. 936-957. 145. Halliwell, B. Free radicals and antioxidants—quo vadis? / B. Halliwell // Trends Pharmacol. Sci. – 2011. – №32. – pp. 125–130. 137 146. Harvey, A.J. REDOX regulation of early embryo development / Harvey A.J., Kind K.L., Thompson J.G. // Reproduction. – 2002. – №123. – pp. 479-486. 147. Heazell, A.E. Intra-uterine growth restriction is associated with increased apoptosis and altered expression of proteins in the p53 pathway in villous trophoblast / A.E. Heazell, A.N. Sharp, P.N. Baker, I.P. Crocker // Apoptosis. – 2010. – №16. – pp. 135-144. 148. Heazell, A.E.P. Live and let die – regulation of villous trophoblast apoptosis in normal and abnormal pregnancies / Heazell A.E.P., Crocker I.P. // Placenta. – 2008. – №29. – pp. 772-783 149. Hempstock, J. The contribution of placental oxidative stress to early pregnancy failure / Hempstock J., Jauniaux E., Greenwold N. et al. // Hum. Pathol. – 2003. – №34. – P. 1265–1275. 150. Hracsko, Z. Evaluation of oxidative stress markers in neonates with intrauterine growth retardation / Hracsko Z., Orvos H., Novak Z., Pal A., Varga I.S. // Redox Rep. – 2008. – №13(1). – pp. 11-16. 151. Hsieh, T.T. The association between maternal oxidative stress and midgestation and subsequent pregnancy complications / T.T. Hsieh, S.F. Chen, L.M. Lo et al. // Reproductive Science. – 2012. – №19(5). – pp. 505-512. 152. Hung, T.H. A longitudinal study of oxidative stress and antioxidant status in women with uncomplicated pregnancies throughout gestation / Hung, T.H., Lo, L.M., Chiu, T.H., Li, M.J., Yeh, Y.L., Chen, S.F., Hsieh, T.T. // Reprod. Sci. – 2010. – №17(4). – pp. 401–409. 153. Il'yasova, D. Urinary biomarkers of oxidative status / Il'yasova D., Scarbrough P. et al. // Clin Chim Acta. – 2012. – №413(19-20). – pp. 1446-1453. 154. Irvine, D.S. DNA integrity inhumanspermatozoa: relationships with semen quality / Irvine, D.S., Twigg, J.P., Gordon, E.L., Fulton, N., Milne, P.A., Aitken, R.J. // J. Androl. – 2000. – №21(1). – pp. 33–44. 138 155. Jahr, S. DNA fragments in the blood plasma of cancer patients: quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells / S. Jahr, H. Hentze, S. Englisch et al. // Cancer Res. – 2001. – №61. – pp. 1659-1665. 156. Jaslow, C.R. Diagnostic factors identified in 1020 women with two versus three or more recurrent pregnancy losses / Jaslow C.R., Carney J.L., Kutteh W.H. // Fertil. Steril. – 2010. – №93. – pp. 1234-1243. 157. Jauniaux, E. Onset of maternal arterial blood flow and placental oxidative stress; a possible factor in human early pregnancy failure / Jauniaux E., Hempstock J., Greenwold N. et al. // Am. J. Pathol. – 2000. – №157. – pp. 2111– 2122. 158. Jauniaux, E. Placental-related diseases of pregnancy: involvement of oxidative stress and implications in human evolution / E. Jauniaux, L. Poston, G.J. Burton // Hum. Reprod. – 2006. – Update №12 November–December (6). – pp. 747–755. 159. Jauniaux, E. Trophoblastic oxidative stress in relation to temporal and regional differences in maternal placental blood flow in normal and abnormal early pregnancies / Jauniaux E., Hempstock J., Greenwold N. et al. // Am. J. Pathol. – 2003. – №162. – pp. 115–125. 160. Jena, N.R. DNA damage by reactive species: Mechanisms, mutation and repair / N.R. Jena // Journal of Biosciences. – 2012. – №37(3). – pp, 503-517. 161. Jena, N.R. Formation of ring-opened and rearranged products of guanine: mechanisms and biological significance / Jena N.R. and Mishra P.C. // Free Radical Biol. Med. – 2012. – №53. – pp. 81–94. 162. Jin, Y. Prenatal diagnosis of fetal chromosome aneuploidy by massively parallel genomic sequencing / Jin Y., Miao Z., Ge J., Zhang W., Li S., Liu X. // Zhonghua Yi. Xue. Za. Zhi. – 2014. – June 17. – №94(23). – pp. 1788-1790. 163. Kalousek, D.K. Phatogenesis of chromosomal mosaicism and effects on early human development / D.K. Kalousek // Am. J. Med. Genet. – 2000. – V.91. – pp. 39-45. 139 164. Katz, V. L. Recurrent miscarriage / Katz V. L., Kuller J. A. // Am. J. Perinatol. – 1994. – V.11. – pp. 386–397. 165. Ke, R.W. Endocrine basis for recurrent pregnancy loss / R.W. Ke // Obstet. Gynecol. Clin. North Am. – 2014. – №41(1). – pp. 103-112. 166. Khadzhieva, M.V. Assosiation of oxidative stress-related genes with idiopathic recurrent miscarriage / M.V. Khadzhieva, N.N. Lutcenko, I.V. Volodin et al. // Free Radical Research. – 2014. – №48(5). – pp. 534-541. 167. Kim, Y.J. Oxidative stress in pregnant women and birth weight reduction / Y.J. Kim, Y.C. Hong, K.H. Lee et al. // Reprod. Toxicol. – 2005. March-April (4). – №19. – pp. 487–492. 168. Kulkarni, A. The involvement of DNA-damage and -repair defects in neurological dysfunction / Kulkarni A., Wilson 3rd., D.M. // Am. J. Hum. Genet. – 2008. – №82 (March (3)). – pp. 539–566. 169. Lam, N.Y. Time course of early and late changes in plasma DNA in trauma patients / N.Y. Lam, T.H. Rainer, L.Y. Chan et al. // Clin. Chem. – 2003. – №49. – pp. 1286-1291. 170. Lane, D.P. Cancer. P53, guardian of the genome / D.P. Lane // Nature. – 1992. – №358(6381). – pp. 15-16. 171. Larsen, E.C. New insights into mechanisms behind miscarriage / E.C. Larsen, O.B. Christiansen, A.M. Kolte, N. Macklon. // BMC Med. – 2013. – №26. – 11:154. 172. Leach, L. Vascular dysfunction in the diabetic placenta: causes and consequences / Leach L., Taylor A., Sciota F. // J. Anat. – 2009. – №215. – P. 6976. 173. Leroy, T. Evaluation of three methods for the detection of DNA single-strand breaks in human lymphocytes: alkaline elution, nick translation, and single-cell gel electrophoresis / Leroy, T., Van Hummelen, P., Anard, D., Castelain, P., 140 Kirsch-Volders, M., Lauwerys, R., Lison, D. // J. Toxicol. Environ. Health. – 1996. – №47. – April (5). – pp. 409–422. 174. Lewis, S.E. Sperm DNA tests as useful adjuncts to semen analysis / S.E. Lewis, I. Agbaje, J. Alvarez // Syst. Biol. Reprod. Med. – 2008. – №54(3). – pp. 111-125. 175. Ley, S.H. Lower dietary vitamin E intake during the second trimester is associated with insulin resistance and hyperglycemia later in pregnancy / Ley S.H., Hanley A.J., Sermer M., Zinman B., O’Connor D.L. // Eur. Clin. Nutr. – 2013. – №67. – 1154-6. 176. Li, Z. Decision making of the P53 network: Death by integration / Z. Li, M. Ni, J. Li et al. // J. Theor. Biol. – 2011. – №271(1). – pp. 205-211. 177. Liao, C. Noninvasive prenatal diagnosis of common aneuploidies by semiconductor sequencing / Liao C., Yin A.H., Peng C.F., Fu F., Yang J.X., Li R., Chen Y.Y., Luo D.H., Zhang Y.L., Ou Y.M., Li J.,Wu J., Mai M.Q., Hou R., Wu F., Luo H., Li D.Z., Liu H.L., Zhang X.Z., Zhang K // Proc. Nati. Acad. Sci. USA. – 2014. – May 20. – №111(20). – pp. 7415-7420. 178. Lim, J.H. Cell-free fetal DNA and Cell-free total DNA levels in spontaneous abortion with fetal chromosomal aneuploidy / J.H. Lim, M.H. Kim, Y.J. Han et al. // PLOS ONE. – 2013. – V.8. – №2. – pp. 1-8. 179. Linzer, D.I. Characterization of a 54K Dalton cellular SV40 tumor antigen present in SV40-transformed cells and uninfected embryonal carcinoma cells / D.I. Linzer, A.J. Levine // Cell. – 1979. – №17. – pp.43-52. 180. Liu, X. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: requirement for dATP and cytochrome C / X. Liu, C.N. Kim, J. Yang et al. // Cell. – 1996. – №86(1). – pp. 147-157. 181. Lo, Y.M.D. Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in preeclampsia / Lo Y.M.D., Leung T.N., Tein M.S.C. et al. // Clin. Med. – 1999. – №45. – pp. 184-188. 141 182. Lodish, H. Molecular cell biology / H. Lodish, A. Berk, C.A. Keiser et al. – New York: Fifth edition. – 2003. 183. Loeb, L.A. Human cancers express mutator phenotypes: origin, consequences and targeting / L.A. Loeb // Nat. Rev. Cancer. – 2011. – №11. – pp. 450-457. 184. Loft, S. Urinary excretion of 8-oxo-7,8-dihydroguanine as biomarker of oxidative damage to DNA / Loft S., Danielsen P., Løhr M., Jantzen K., Hemmingsen J.G., Roursgaard M., Karotki D.G., Møller P. // Arch. Biochem. Biophys. – 2012. – №518(2). – pp. 142-150. 185. Malayappan, B. Urinary analysis of 8-oxoguanine, 8-oxoguanosine, fapyguanin and 8-oxo-2-deoxyguanosine by high-performance liquid chromatographyelectrospray tandem mass spectrometry as a measure of oxidative stress / Malayappan B., Garrett T.J., Segal M., Leeuwenburgh C. // J. Chromatogr. A. – 2007. – №1167. – pp. 54-62. 186. Mavridou, D.A. Cytochrome C assembly / D.A. Mavridou, S.J. Ferguson, J.M. Stevens // IUBMB Life. – 2013. – №65(3). – pp. 209-216. 187. Menezo, Y. DNA damage and repair in human oocytes and embryos: a review / Menezo, Y., Dale, B., Cohen, M. // Zygote. – 2010. – №21. – pp. 1–9. 188. Menezo, Y. Expression profile of genes coding for DNA repair in human oocytes using pangenomic microarrays, with a special focus on ROS linked decays / Menezo, Y., Russo, G., Tosti, E., El Mouatassim, S., Benkhalifa, M. // J. Assist. Reprod. Genet. – 2007. – №24. – November (11). – pp. 513–520. 189. Mert, I. Role of oxidative stress in preeclampsia and intrauterine growth restriction / Mert I., Oruc A.S., Yuksel S., Cakar E.S., Buyukkagnici U., Karaer A. et al. // J. Obstet. Gynaecol. Res. – 2012. – №38. – pp. 658-664. 190. Metwally, M. Body mass index and risk of miscarriage in women with recurrent miscarriage / Metwally M., Saravelos S.H., Ledger W.L., Li T.C. // Fertil. Steril. – 2010. – №94. – pp. 290-295. 142 191. Metwally, M. Does high body mass index increase the risk of miscarriage after spontaneous and assisted conception? A meta-analysis of the evidence / Metwally M., Ong K.J., Ledger W.L., Li T.C. // Fertil. Steril. – 2008. – №90. – pp. 714-726. 192. Metz, T.H. Marijuana use in pregnancy and lactation: a review of the evidence / T.H. Metz, E.H. Stickrath // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2015. – May 15. 193. Michaelson-Cohen, R. Israeli Society of Medical Genetics NIPTCommittee Opinion 072013: Non-invasive prenatal testing of cell-free DNA in maternal plasma for detection of fetal aneuploidy / Michaelson-Cohen R., Gershoni-Baruch R., Sharoni R., Shochat M., Yaron Y., Singer A. // Fetal Diagn. Ther. – 2014. – №36(3). – pp. 242-244. 194. Mierla, D. Assosiation of prothrombin (A20210G) and factor V Leiden (A506G) with recurrent pregnancy loss / D. Mierla, C. Szmal, D. Neagos et al. // Maedica. – 2012. – №7. – pp. 222-226. 195. Min, J. Effect of oxidative stress on birth sizes: consideration of window from mid pregnancy to delivery / J. Min, B. Park, Y.J. Kim et al. // Placenta. – 2009. – №30. – pp. 418-423. 196. Miranda, M.L. Role of circulating cell-free DNA levels in patients with severe preeclampsia and HELLP syndrome / M.L. Miranda, H.C. Macher, R. MunozHernandez et al. // Am. J. of Hypertension. – 2013. – №26(12). – 1377-1380. 197. Myatt, L. Oxidative stress in the placenta / Myatt L., Cui X. // Histochem. Cell. Biol. –2004. – №122. – pp. 369-382. 198. Nagaishi, M. Chromosome abnormalities identified in 327 spontaneous abortions collected in Japan / M. Nagaishi, T. Yamomoto, K. Iinuma et al. // J. Obstet. Gynecol. Res. – 2004. – №30. – pp. 237-241. 199. Nagata, S. Apoptotic DNA fragmentation / S. Nagata // Exp. Cell. Res. – 2000. – №256. – pp. 12-28. 200. Negi, R. Association of oxidative DNA damage, protein oxidation and antioxidant function with oxidative stress induced cellular injury in pre- 143 eclamptic/eclamptic mothers during fetal circulation / R. Negi, D. Pande, K. Karki et al. // Chemico-Biological Interactions. – 2014. – №208. – pp. 77-83. 201. Nielsen, A. Maternal smoking predicts the risk of spontaneous abortion / Nielsen A., Hannibal C.G., Lindekilde B.E. et al. // Acta. Obstet. Gynecol. Scand. – 2006. – №85(9). – pp. 1057-1065. 202. Nigro, G. Role of infections in recurrent spontaneous abortion / Nigro G., Mazzocco M., Mattia E et al. // J. Matern. Fetal Neonatal Med. – 2011. – №24. – pp. 983-989. 203. Nikitaki, Z. Stress-induced DNA damage biomarkers: applications and limitations / Nikitaki Z., Hellweg C.E., Georgakilas A.G. and Ravanat J.-L. // Front. Chem. – 2015. – June 2. 204. Norton, M.E. Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy / Mary E. Norton, Bo Jacobsson, Geeta K. Swamy et al. // The New England Journal of Medicine. – 2015. – April 1. 205. Page, C.M. Does smoke from biomass fuel contribute to anemia in pregnant women in nagpur, India? A cross-sevtional study / C.M. Page, A. Patel, P.L. Hibberd // PLOS One. – 2015. – №10(5). – May 29. 206. Petersen, I. Women’s perception of risks of adverse fetal pregnancy outcomes: a large-scale multinational survey / I. Petersen, R.L. McCrea, A. Lupattelli, H. Nordeng // BMJ Open. – 2015. – №5(6). – 1 Jun. 207. Phaniendra, A. Free radicals: properties, sources, targets, and their implication in various diseases / Phaniendra A., Jestadi D.B., Periyasamy L. // Indian J. Clin. Biochem. – 2015. – №30(1). – pp. 11-26. 208. Pidoux, G. Impact of trisomy 21 on human trophoblast behavior and hormonal function / G. Pidoux, J. Guibourdenche, J.L. Frendo et al. // Placenta. – 2004. – V.25. – pp. 79-84. 144 209. Pineles, B.L. Systematic review and meta-analysis of miscarriage and maternal exposure to tobacco smoke during pregnancy / Pineles B.L., Park E., Samet J.M. // Am. J. Epidemiol. – 2014. – №179(7). – pp. 807-23. 210. Poston, L. Role of oxidative stress and antioxidant supplementation in pregnancy disorders / Poston L., Igosheva N., Mistry H.D., Seed P.T., Shennan A.H., Rana S. et al. // Am. J. Nutr. – 2011. – №94. – pp. 1980-1985. 211. Poyton, R.O. Mitochondrial generation of free radicals and hypoxic signaling / Poyton R.O., Ball K.A., Castello P.R. // Trends Endocrinol. Metab. – 2009. – №20. – pp. 332-340. 212. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Definitions of fertility and recurrent pregnancy loss: a committee opinion // Fertil. Steril. – 2013. – №99. – pp. 63-68. 213. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. The clinical relevance of luteal phase deficiency: a committee opinion // Fertil Steril. – 2012. – №98. – pp. 63–68. 214. Puchner, K. The implication of second trimester amniotic fluid TNF-alpha, cytochrome C and cell death nucleosomes in the prediction of preterm labor and/or premature rupture of membranes / K. Puchner, C. Iavazzo, D. Gourgiotis et al. // Arch. Gynecol. Obstet. – 2012. – №285(1). – pp. 37-43. 215. Puscheck, E.E. The impact of male factor on recurrent pregnancy loss / Puscheck E.E., Jeyendran R.S. // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. – 2007. – №3. – pp. 222-228. 216. Qumsieh, M.B. Cytogenetics and mechanisms of spontaneous abortions: increased appoptosis and decreased cell prolipheration in chromosomale abnormal villi / Qumsieh M.B., Kim K.R., Ahmed M.N., Bradford W. // Cytogenet. Cell. Genet. – 2000. – V.88. – №3. – pp. 230-235. 217. Raha, A. Oxidative Stress, Prooxidants, and Antioxidants: The Interplay / A. Raha, A. Kumar, V. Singh // Biomed. Res. Int. – 2014. – №23. – 2014:761264. 145 218. Raimondi, S. Effects of diet on biomarkers of exposure and effects, and on oxidative damage / Raimondi, S., Garte, S., Sram, R.J., Binkova, B., Kalina, I., Lyubomirova, K., Taioli, E., Singh, R., Farmer, P.B. // Mutat. Res. – 2007. – №620. – pp. 93–102. 219. Rainer, T.H. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables / T.H. Reiner, Y.M. Lo, L.Y. Chen et al. // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2001. – №945. – pp. 211-220. 220. Rajewski, M. Frequency of antiphospholipid antibodies and antiphospholipid syndrome in women with recurrent miscarriages / Rajewski M., Skrzypszak J. // Ginecol. Pol. – 2011. – №82. – pp. 32-38. 221. Ramachandran, A. High prevalence of diabetes and cardiovascular risk factors associated with urbanization in India / A. Ramachandran, S. Mary, A. Yamuna et al. // Diabetes Care. – 2008. – №31(5). – pp. 893-898. 222. Reyes, M. Estrogens are potentially the only steroids with an antioxidant role in pregnancy: in vitro evidence / M. Reyes, A. Sifuentes-Alvarez, B. Lazalde // Acta Obstetrica et Gyn. – 2006. – №85. – pp. 1090-1093. 223. Ribas-Maynou, J. Double stranded sperm DNA breaks, measured by Comet assay, are associated with unexplained recurrent miscarriage in couples without a female factor / Ribas-Maynou J., Garcia-Peiro A., Fernandez-Encinas A., Amengual M.J., Prada E., Cortes P., Navarro J., Benet J. // PLoS One. – 2012. – Sep. 17. 224. Roberts, J.M. Hypertension in pregnancy. Report American College Obstetricians Gynecologists’ Task Force Hypertension Pregnancy / Roberts J.M., August P.A., Bakris G., Barton J.R., Bernstein I.M., Druzin M. et al. // Obstet. Gynecol. – 2013. – №122(5). – pp. 1122-1131. 225. Robinson, L. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: A systematic review and meta-analysis / Robinson L., Gallos I.D., Conner S.J., 146 Rajkhowa M., Miller D., Lewis S. et al. // Hum. Reprod. – 2012. – №27. – pp. 2908–2917. 226. Rodriguez-Rodero, S. Aging genetics and aging / S. Rodriguez-Rodero, J.L. Fernandez-Morera, E. Menendez-Torre et al. // Aging and Disease. – 2011. – V.2. – pp. 186-195. 227. Romero, S.T. Differentiation of genetic abnormalities in early pregnancy loss / Romero S.T., Geiersbach K.B., Paxton C.N., Rose N.C., Schisterman E.F., Branch D.W., Silver R.M. // Ultrasound Obstet Gynecol. – 2015. – 45(1). – pp. 89-94. 228. Ronnenberg, AG. Preconception folate and vitamin B(6) status and clinical spontaneous abortion in Chinese women / Ronnenberg A.G., Goldman M.B., Chen D. et al. // Obstet. Gynecol. – 2002. – №100. – pp. 107–113. 229. Rull, K. Genetics of recurrent miscarriage: challenges, current knowledge, future directions / K. Rull, L. Nagirnaja, M. Laan // Front. Genet. – 2012. – 3:34. – Feb. 16. 230. Russell, P. The distribution of immune cells and macrophages in the endometrium of women with recurrent reproductive failure I: Techniques / Russell P., Anderson L., Lieberman D., Tremellen K., Yilmaz H., Cheerala B. et al. // J. Reprod. Immunol. – 2011. – №91. – pp. 90–102. 231. Sarkar, D. Recurrent pregnancy loss in patients with thyroid dysfunction / D. Sarkar // Indian J. Endocrinol Metab. – 2012. – №2. – pp. 350-351. 232. Scholl, T.O. Oxidant damage to DNA and pregnancy outcome / Scholl T.O., Stein T.P. // J. Matern. Fetal Med. – 2011. – №10. – pp. 182-185. 233. Scholl, T.O. Oxidant damage to DNA and pregnancy outcome / T.O. Scholl, T.P. Stein // The Journal of Maternal-Fetal Medicine. – 2001. – №10. – pp. 182185. 234. Shah, D. Luteal insufficiency in first trimester / D. Shah, N. Nagarajan // Indian J. Endocrinol. Metab. – 2013. – №17(1). – pp. 44-49. 147 235. Shahine, L. Recurrent pregnancy loss: evaluation and treatment / Shahine L., Lathi R. // Obstet. Gynecol. Clin. North Am. – 2015. – Mar. – №42(1). – pp. 117134. 236. Shang, W. Elevated expressions of P53, CDKNA1, and Bax in placental xilli from patients with recurrent spontaneous abortion / W. Shang, M.-M. Shu, M. Liu et al. // European Review for Medical and Pharmacological Science. – 2013. – №17. – pp. 3376-3380. 237. Shigenaga, M.K. 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine as a biological marker of in vivo oxidative DNA damage / M.K. Shigenaga, C.J. Gimeno, B.N. Ames // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1984. – №86. – pp. 9697-9701. 238. Shreder, E.D. Afobazole modifies the neurotoxiv and genotoxic effects in rat prenatal alcoholization model / Shreder E.D., Shreder O.V., Zabrodina V.V., Durnev A.D., Seredenin S.B. // Bull. Exp. Biol. Med. – 2014. – №157(4). – pp. 492-495. 239. Shreder, O.V. Association of genotoxic and teratogenic effects induced by cyclophosphamide and their modification with afobazole / Shreder O.V., Shreder E.D., Durnev A.D., Seredenin S.B. / Gin. Sanit. – 2011. – №5. – pp. 64-68. 240. Shreder, O.V. Effects of Afobazole on the Searching Activity and FoodProcuring Skill of the Offspring of Rats Exposed to Hypoxia during Fetal Development / O.V. Shreder, E.D. Shreder, V.V. Zabrodina, A.D. Durnev // LongTerm Memory: Mechanisms, Types and Disorders // Eds. A.K. Alexandrov and L.M. Fedoseev. – N-Y, USA: Nova Science Publishers, 2012. – Ch.5 – pp. 117131. 241. Simon, L. Clinical significance of sperm DNA damage in assisted reproduction outcome / Simon, L., Brunborg, G., Stevenson, M., Lutton, D., McManus, J., Lewis, S.E. // Hum. Reprod. – 2010. – №25. – pp. 1594–1608. 148 242. Skoner, J.M. Suppressed DNA repair capacity of peripheral lymphocytes in pregnant women / Skoner, J.M., Sigmon, J., Larcom, L.L. // Mol. Cell. Endocrinol. – 1995. – №108. – pp. 179–183. 243. Slatter, T.L. Smoking during pregnancy causes double-strand DNA break damage to the placenta / T.L. Slatter, L. Park, K. Anderson et al. // Human Pathology. – 2014. – №45(1). – pp. 17-26. 244. Sohr, S. The tumor suppressor P53 induces expression of the pregnancysupporting human chorionic gonadotropin (hCG) CGB7 gene / S. Sohr, K. Engeland // Cell Cycle. – 2011. – №10:21. – pp. 3758-3767. 245. Sozzi, G. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and durin follow-up of lung cancer patients / Sozzi G., Conte D., Mariani L. et al. // Cancer Res. – 2001. – №61. – pp. 4675-4678. 246. Sparks, A.B. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18 / A.B. Sparks, C.A. Struble, E.T. Wang et al. // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2012. – №206:309. – pp. 1-9. 247. Speit, G. The Comet Assay: A Sensitive Genotoxicity Test for the Detection of DNA Damage and Repair / G. Speit, A.Rothfuss. // DNA Repair Protocols. Methods in Molecular Biology. – 2012. – №920. – pp. 79-90. 248. Stein, T.P. Oxidative stress early in pregnancy and pregnancy outcome / T.P. Stein, T.O. Scholl, M.D. Schluter et al. // Free Radical Research. – 2008. – №42(10). – pp. 841-848. 249. Steinman, C.R. Circulating DNA in systemic lupus erythematosis. Association with central nervous system involvement and systematic vasculitis / C.R. Steinman // Am. J. Med. – 1979. – №67. – pp. 429-435. 250. Stephenson M.D. Cytogenetic analysis of miscarriages from couples with recurrent miscarriage: a case-control study /Stephenson M. D., Awartani K. A., Robinson W. P. // Hum. Reprod. — 2002. — Vol. 17. — P. 446–451. 149 251. Stone, W.L. The pathophysiology of smoking during pregnancy: a systems biology approach / W.L. Stone, B. Balley, N. Khraisha // Front Biosci. – 2014. – №6. – pp. 318-328. 252. Sugiura-Ogasawara, M. Uterine anomaly and recurrent pregnancy loss / Sugiura-Ogasawara M., Ozaki Y., Katano K. et al. // Semin. Reprod. Med. – 2011. – №29. – pp. 514–521. 253. Tang, W. P53 codon 72 polymorphism and recurrent pregnancy loss: a metaanalysis / W. Tang, Zhou X., Chan Y. et al. // J. Assist. Reprod. Genet. – 2011. – №28. – pp. 965-969. 254. Tice, R.R. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing / R.R. Tice, E. Agurell, D. Anderson et al. // Environ. Mol. Mutagen. – 2004. – №35. – pp. 206-221. 255. Toescu, V. Oxidative stress and normal pregnancy / Toescu V., Nnuttall S.L., Martin U., Kendall M.J., Dunne F. // Clinical Endocrinology. – 2002. – V.57. – №5. – pp. 609-613. 256. Toy, H. Decreased serum prolidase activity and increased oxidative stress in early pregnancy loss / H. Toy, H. Camuzcuoglu, A. Camuzcuoglu et al. // Gynecol. Obstet. Invest. – 2010. – №69. – pp. 122-127. 257. Toyota, M. Epigenetic drivers of genetic alterations / Toyota M., Suzuki H. // Adv. Genet. – 2010. – №70. – pp. 309–323. 258. Twig, G. Pathogenesis of infertility and recurrent pregnancy loss in thyroid autoimmunity / Twig G., Shina A., Amital H. et al. // J. Autoimmun. – 2012. – №38. – pp. 1275-1281. 259. Van den Berg, M.M. Genetics of early miscarriage / Van den Berg M.M., van Maarle M.C., van Wely M., Goddijn M. // Biochim. Biophys. Acta. – 2012. – №1822. – pp. 1951–1959. 150 260. Vanderlelie, J. Antioxidant Gene Expression in Preeclamptic Placentae: A Preliminary Investigation / Vanderlelie J., Gude N., Perkins A.V. // Placenta. – 2008. – V.29. – pp. 519–522. 261. Villamena, F.A. Chemistry of Reactive Species. // In: Molecular basis of oxidative stress: chemistry, mechanisms, and disease pathogenesis, Hoboken, New Jersey: Wiley, 2013. 262. Vogelstein, B. Surfing the P53 network / B. Vogelstein, D. Lane, A.J. Levine // Nature. – 2000. – №408. – pp. 307-110. 263. Walknowska, J. Practical and theoretical implications of fetal-maternal lymphocyte transfer / J. Walknowska, F.A. Conte, M.M. Grumbach // Lancet. – 1969. – №1. – pp. 1119-1122. 264. Wallace, S.S. Biological consequences of free radical-damaged DNA bases / S.S. Wallace // Free Radical Biol. Med. – 2002. – №33. – pp. 1-14. 265. Wei, D. Apoptosis and p53 expression in the placental villi of females with unexplained recurrent spontaneous abortion / Dehua Wei, Qinghua Wu, Huirong Shi. // Experimental and therapeutic medicine. – 2014. – №7. – pp. 191-194. 266. Wilcox, A.J. Incidence of early loss of pregnancy / A.J. Wilcox, C.R. Weinberg, J.F. O’Connor et al. // N. Eng. J. Med. – 1988. – №319. – pp. 189-194. 267. Wong, L.F. Immunotherapy for recurrent miscarriage / Wong L.F., Porter T.F., Scott J.R. // Cochrane Database Syst Rev. – 2014. – Oct. 21. – 10:CD000112. 268. Wu, F.Y. Associations among genetic susceptibility, DNA damage, and pregnancy outcomes of expectant mothers exposed to environmental tobacco smoke / Wu F.Y., Wu H.D., Yang H.L., Kuo H.W., Ying J.C., Lin C.J., Yang C.C., Lin L.Y., Chiu T.H., Lai J.S. // Sci. Tot. Environ. – 2007. – №386. – pp. 124–133. 151 269. Wu, W. Up-regulation of Fas reverses cisplatin resistance of human small cell lung cancer cells / Wu W., Wang H.D., Guo W. et al. // J. Exp. Clin. Cancer Res. – 2010. – May, 14. 270. Yin, A. Correlation of maternal plasma total cell-free DNA and fetal DNA levels with short term outcome of first-trimester vaginal bleeding / A. Yin, E.H. Ng, X. Zhang et al. // Hum. Reprod. – 2007. – №22. – pp. 1736-1743. 271. Yiyenoglu, O.B. Assessment of oxidative stress markers in recurrent pregnancy loss: a prospective study / O.B. Yiyenoglu, M.G. Ugur, H.C. Ozcan et al. // Arch. Gynecol. Obstet. – 2014. – №289(6). – pp. 1337-1340. 272. Zhang, J.Y. Long Dwell-Time Exposure of human chorionic villi to transvaginal ultrasound in the first trimester of pregnancy induces activation of caspase-3 and cytochrome C release / J.Y. Zhang, F.Z. Zhou, Y.L. Song et al. // Biology of reproduction. – 2002. – №67. – pp. 580-583. 273. Zhao, T. P53 and stem cells: new developments and new corners / T. Zhao, Y. Xu // Trends Cell Biol. – 2010. – №20(3). – pp. 170-175. 274. Zhivotovsky, B. Injected cytochrome C induces apoptosis / B. Zhivotovsky, S. Orrenius, O.T. Brustugun, S.O. Doskeland // Nature. – 1993. – №423(3). – pp. 275-280.
