Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет
advertisement
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук на правах рукописи ШАМИЛОВ ФАРХАД АЗЕРОВИЧ Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов при иммунокорригирующей терапии рака молочной железы Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук 14.01.12 онкология Научные руководители: Д.м.н., профессор В.Ю.Сельчук Д.м.н., профессор Н.Н.Тупицын МОСКВА, 2014 г. 2 ОГ ЛАВЛЕНИЕ Список сокращений: ..................................................................................... 3 ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................... 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................ 10 ГЛАВА II. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................................................. 34 2.1 Пациенты и характеристика клинического, биопсийного материала ........................................................................................................... 34 2.2 Реактивы и методы исследования ................................................... 39 2.3 Статистическая обработка результатов исследования ................. 41 Глава 3. Результаты исследований ............................................................ 42 3.1 Характеристика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы методом проточной цитометрии ........... 42 3.1.1 Исследования на материале хирургически удаленной опухоли ......................................................................................................................... 42 3.1.2 Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы ............................................. 44 3.1.3 Сопоставление субпопуляционного состава лимфоцитов в материале кор-биопсии и материале удаленной опухоли ........................ 53 3.2 Сопоставление состава интратуморальных лимфоцитов с клиническими характеристиками и морфологическими признаками у больных раком молочной железы ................................................................... 57 3.3 ВЛИЯНИЕ ПОЛИОКСИДОНИЯ ИНТРАТУМОРАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ НА У СУБПОПУЛЯЦИИ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ .................................................................................... 63 ОБСУЖДЕНИЕ ........................................................................................... 85 ВЫВОДЫ ..................................................................................................... 92 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................... 94 3 Спис ок с ок ра ще ний: АГ – антиген; АТ – антитело; АПК – антиген-презентирующие клетки; МКА – моноклональные антитела; РМЖ – рак молочной железы; Трег – Т-регуляторные клетки; NK – естественные киллеры; ТПЛ – тумор-пенетрирующие лимфоциты; ТИЛ – тумор-инфильтрирующие лимфоциты; ПО – полиоксидоний. 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования В структуре онкологических заболеваний женского населения в России, как и в большинстве развитых стран мира, рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место и имеет тенденцию к неуклонному росту, причем болеют женщины в наиболее работоспособном возрасте. В России в 2007 году его доля составила 20%. 1 млн. новых случаев рака молочной железы регистрируется в мире по данным всемирной организации здравоохранения. Нельзя не отметить и рост смертности от рака молочной железы. В Москве и Санкт-Петербурге 5-летняя выживаемость составляет 59,6-59,3%. По данным различных учреждений, у вновь выявленных больных около 35% имеют III-IV стадии. Отдаленные метастазы возникают у 50% больных раком молочной железы, медиана выживаемости больных с метастатическим раком молочной железы составляет 24-36 месяцев и только 15% живут более 5 лет [12]. Исследования последних лет показали, что рост большинства злокачественных опухолей сопровождается значительными нарушениями различных звеньев иммунного ответа организма. Проведенные исследования у онкологических больных указывают на снижение количества естественных киллеров, Т-хелперов, функциональной активности Т-лимфоцитов, увеличение Т-супрессоров и их функциональной активности. 1. Установлено, что снижение уровня Т-клеточной инфильтрации опухоли имеет определенную связь с регионарным метастазированием или наличием микрометастазов [16]. Размер опухоли не взаимосвязан с уровнями лимфоцитарной инфильтрации опухоли. Было доказано, что увеличение количества интратуморальных Т-киллеров является фактором благоприятного прогноза у больных раком молочной железы, преимущественно без регионарного метастазирования [4]. 5 Более того, наибольшее значение имеет инфильтрация опухоли CD8+ лимфоцитами. Установлена связь степени распространенности опухолевого процесса от уровня CD8+ лимфоцитов. Повышение уровня инфильтрации CD8+ клетками наблюдается чаще у пациентов, не имеющих метастазов в регионарные лимфатические узлы, а снижение их количества более характерно для поздних стадий рака молочной железы. При использовании неоадъювантной химиотерапии у больных раком молочной железы уровни инфильтрации опухоли Т-клетками изменяются разнонаправленно. Повышение их уровня в сравнении с исходными значениями отмечено чаще, чем снижение. Это говорит нам о действенности химиотерапевтического лечения, но косвенно опровергает, что химиотерапия первоначально воздействует на лимфоидную систему, включая интратуморальную. Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов имеет определенное прогностическое значение [27]. Наибольший интерес в субпопуляциях интратуморальных лимфоцитов представляют CD25-позитивные клетки. Они являются одним из показателей противоопухолевого эффекта. Так при наличии в опухоли CD25+ клеток, при использовании химиотерапевтического лечения противоопухолевый эффект значительно повышается, а при отсутствии эффективность проводимого лечения была ниже в 5 раз. Динамика CD25+ клеток зависит от схемы лечения: при использовании одной схемы лечения уровень эффекторных клеток CD8+ и CD25+ в ряде случаев повышается или остается на прежнем уровне. При использовании иной схемы мы можем наблюдать обратный эффект. Что же касается B-клеточной инфильтрации, здесь не было выявлено взаимосвязей [27]. Работами Университета Калифорнии (США) доказано, что инфильтрация опухолевой ткани рака молочной железы цитотоксическими лимфоцитами (CD8+) является фактором благоприятного прогноза, а выраженная инфильтрация CD4+ лимфоцитами и макрофагами, напротив, ухудшает прогноз [74, 161]. 6 Прогностическая роль субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы также достаточно хорошо известна. При однофакторном принадлежит анализе главенствующая лимфоцитам CD8+ [1]. В прогностическая отсутствии роль выраженной инфильтрации рака молочной железы CD8+ клетками CD4+ лимфоциты способствуют опухолевой инвазии и развитию отдаленных метастазов рака молочной железы путем влияния на протуморальную активность опухолеассоциированных макрофагов [73]. Совокупность этих данных позволила предположить, что три клеточных типа – CD4+ и CD8+ лимфоциты, а также CD68+ макрофаги – могут играть главную роль в прогнозе рака молочной железы. На основании этих данных предложена трехмаркерная иммунная сигнатура для более точной оценки прогноза у больных раком молочной железы [74]. Иммунный профиль CD68LowCD4LowCD8High характерен для первичного рака молочной железы, который даже в случаях только хирургического лечения, характеризуется высокими показателями общей и безрецидивной выживаемости. Напротив, иммунные ответы CD68HighCD4HighCD8Low соответствуют группе больных с риском развития отдаленных метастазов и сниженной выживаемостью. Таким образом, на сегодняшний день понятны прогностически благоприятные иммунологические параметры состава интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы. Актуальной является задача по поиску путей иммунотерапевтического воздействия на субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов с целью его коррекции и улучшения прогноза у больных. Решению данной актуальной задачи и посвящена наша работа. ЦЕЛЬЮ работы является изучение количественного состава интратуморальных лимфоцитов, динамики их субпопуляций при проведении иммунокорригирующей терапии рака молочной железы. ЗАДАЧИ 7 1. Изучить количественно проточной методом цитометрии многопараметровой субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы (на материале хирургически удаленной опухоли). 2. На материале опухолевой ткани, полученном при кор-биопсии, определить уровень субпопуляций интратуморальных лимфоцитов по следующим показателям: Общий уровень лимфоидной инфильтрации – количество CD45+ лимфоцитов по отношению к общему числу событий, набранных при проточной цитометрии. Процент зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+). Процент зрелых CD4+CD3+ T-лимфоцитов. Процент зрелых T-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+ Соотношение CD8/CD4 Процент активированных (регуляторных) CD4+CD25+ клеток Процент NK-клеток – CD3-CD56+ Процент TNK клеток – CD3+CD56+ 3. Провести лечение препаратом полиоксидоний 20 больных раком молочной железы с оценкой клинических показателей и морфологических признаков эффективности (индукция апоптоза). 4. Изучить динамику показателей интратуморальных лимфоцитов в процессе иммунотерапии полиоксидонием. 5. Сопоставить иммунотерапии иммунологические с изменения клиническими в ходе характеристиками, морфологическими признаками и рецепторным статусом опухоли. 6. Определить показания для проведения иммунокорригирующей терапии у больных операбельным раком молочной железы. 8 НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые на достаточно большом клиническом материале проведен анализ субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов больных раком молочной железы. Методом многоцветной проточной цитометрии установлено, что доминирующей субпопуляцией среди интратуморальных лимфоцитов составляют (CD45++) в являются среднем 90% зрелые Т-клетки лимфоцитов. будет (CD3+), которые установлена роль субпопуляций интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы. Субпопуляции CD4+ и CD8+ среди зрелых Т-клеток находятся примерно в равных пропорциях, интратуморальных соотношение естественных CD8/CD4 киллерных ~ 1. клеток Субпопуляция (CD3-CD56+) не превышает 5,3%. Пропорции Т-регуляторных клеток CD4+CD25+ и NKTклеток являются минорными. Уровень общей лимфоидной инфильтрации рака молочной железы определяется, в первую очередь, Т-цитотоксическими клетками (CD8+) клетками. В материале опухолей больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (CD3+), количество которых достигало 95,2% от числа лимфоцитов, в среднем 86,5±1,2%. Количество CD4лимфоцитов незначительно преобладало над количеством цитотоксических лимфоцитов (CD8+) – в среднем 45,7% и 43,7% соответственно. Соотношение CD8:CD4 в целом по группе составило 1,09. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, незначительным и не превышал 5,29%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем – 4,2±0,5%. В процессе иммунотерапии полиоксидонием большинство субпопуляций интратуморальных лимфоцитов не изменяются, вместе с тем, достоверно снижается количество Выраженность эффекта интратуморальных полиоксидония естественных (индукция киллеров. патоморфоза) определяется, в первую очередь, нарастанием пропорции интратуморальных CD4+ лимфоцитов. 9 НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Практическое значение проведенной работы определяется двумя основными аспектами – диагностическим и лечебным. В диагностическом плане нами убедительно доказана возможность проведения полноценного изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов по материалу кор-биопсии методом многоцветной проточной цитометрии. Это дает основание для формирования групп больных, которым показана иммунотерапия в неоадъювантном режиме на этапе обследования, до проведения хирургического лечения. Применение полиоксидония у больных раком молочной железы вело к развитию иммуно-опосредованного апоптоза. Данный феномен наблюдался у 30% больных. Поэтому, практическим аспектом данной работы является рекомендация по целесообразности включения полиоксидония в арсенал препаратов, применяемых в неоадъювантном операбельным раком молочной железы. режиме у больных 10 Г ЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Иммунология рака – это одна из наиболее интригующих проблем онкологии. С одной стороны (теоретически) – здесь всѐ просто: антигенность опухолей доказана давно, и это положение является незыблемым и не подлежащим пересмотру [94, 42, 87, 147, 55, 90, 102]. С другой стороны (на практике) всѐ обстоит прямо противоположным образом: иммунокомпетентный организм человека или животного-носителя опухоли практически никогда не способен отторгать антигенные опухоли [144, 80, 156, 196] Парадокс состоит в том, что организм не способен отторгать антигенные опухоли, а существование антиген-специфических противоопухолевых иммунных ответов является убедительно доказанным и неоспоримым [54, 157]. За долгую, более чем 50-летнюю историю развития и становления иммунологии рака открыты многие фундаментальные иммунологические феномены, расшифрованы механизмы цитотоксического действия лимфоцитов и антител, но практический вклад иммунологии в лечение рака и, в частности рака молочной железы, всѐ ещѐ остается незначительным. В последние два года наметился явный прорыв в данной области. Авторитетнейшие фундаментальные американские журналы PNAS (Proceedings of National Academy of Sciences of the USA) и Cancer Discovery опубликовали статьи, доказывающие главенствующую роль иммунной системы человека в прогнозе рака молочной железы [74, 161]. Открытия эти сделаны при изучении тонких взаимодействий между Т-хелперными (CD4), Т-цитотоксическими (CD8) лимфоцитами и макрофагами, присутствующими в ткани опухоли, то есть интратуморальными клетками иммунной системы. К аналогичным результатам пришли и отечественные, российские ученые, убедительно доказавшие важную прогностическую роль количества и 11 качественного состава интратуморальных лимфоцитов, в особенности CD8+ Т-цитотоксических клеток в прогнозе рака молочной железы [4, 1]. Результаты этих работ проливают свет на то, какие клетки иммунной системы являются наиболее важными с точки зрения противоопухолевого иммунитета, и открывают перспективы поиска иммунологических путей воздействия для активации данных клеточных типов. Для лучшего понимания этого вопроса остановимся на описании клеток-эффекторов противоопухолевого иммунитета и на том, как данные клеточные типы представлены в составе интратуморальных лимфоцитов. Цитотоксические реакции клеток иммунной системы в отношении раковых клеток реализуются непосредственно в опухоли. Именно по этой причине изучение уровней инфильтрации опухоли лимфоцитами, макрофагами, плазмоцитами привлекало внимание исследователей в течение длительного времени морфологическом [14]. уровне, Вначале затем эти исследования методами велись на иммуногистохимии и сравнительно недавно в арсенале подходов к количественному изучению субпопуляционного состава лимфоцитов появилась многоцветная проточная цитометрия. Большинство авторов расценивали выраженную лимфоидную инфильтрацию опухоли, отмечаемую на морфологическом уровне, как проявление защитных функций организма и более благоприятного прогноза. Однако безоговорочно такую точку зрения принимать, по-видимому, нельзя: необходимо учитывать возраст больных, стадию заболевания, тип лечения и, конечно же, субпопуляционный состав и функциональную активность туморинфильтрирующих лимфоцитов [14], а также иммунофенотипические особенности опухолевых клеток [9]. Хотя лимфоциты и инфильтрируют многие мышинные и человеческие опухоли, но спонтанная регрессия опухолей наблюдается редко. Даже относительно значения воспалительных клеток в опухоли или окружающих ее тканях нет единства мнений [67, 68, 71, 202]. Вместе с тем, многие работы продемонстрировали связь 12 повышенных уровней тумор-инфильтрирующих лимфоцитов с более хорошим прогнозом [67, 68, 202]. Однако простое допущение, что накопление лимфоцитов в опухоли является непременно благоприятным для больного может быть не соответствующим действительности. По данным отечественных и зарубежных авторов, выраженная лимфоидная инфильтрация встречается у 45-70% больных РМЖ [3, 51]. Большинство исследователей трактуют высокую степень интенсивности лимфоплазмоцитарной инфильтрации опухоли как признак благоприятного прогноза [17, 139, 30]. Другие исследователи отрицают или ставят под сомнение концепцию защитной роли лимфоидной инфильтрации опухоли [35, 38, 10]. Они считают, что наличие выраженной инфильтрации в большом проценте случаев должно теоретически приводить к регрессии или стабилизации опухолевого процесса, однако этого, как правило, в клинике не наблюдается. Так, Володько Н.А. (1988) [10] считает, что мононуклеарная инфильтрация при РМЖ не может являться показателем благоприятного прогноза, поскольку она встречается с одинаковой частотой и в группе с благоприятным прогнозом, и при агрессивном течении заболевания. Ею установлено, что лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, могут проявлять как неспецифическую супрессорную, так и хелперную активность. Высокие уровни лимфоцитарной инфильтрации ассоциированы с увеличением выживаемости у больных моложе 40 лет [130] и с благоприятным прогнозом у части больных, опухоли которых сильно инфильтрированы макрофагами [150]. По данным Чобанян Н.С. [38] лимфоплазмоцитарная инфильтрация опухоли не оказывает существенного влияния на выживаемость больных, а пациентки молодого возраста при отсутствии инфильтрации вообще имеют более высокие показатели выживаемости. Федин Ю.В., Ермилова В.Д. [35], провели сопоставительный анализ степени лимфоидной инфильтрации с клиническими и иммунологическими 13 данными. Они считают, что лимфоидная инфильтрация сама по себе не является фактором, сдерживающим или способствующим регионарному метастазированию. При лечении местнораспространенного РМЖ применяется комплексный подход, включающий различные виды предоперационного лечения. Поэтому изучение и трактовка характера лимфоидной инфильтрации опухоли у этой категории больных представляет клинический интерес. Так, Билынский Б.Т. [8] показали корреляцию между степенью лимфоплазмоцитарной инфильтрации и благоприятным прогнозом при предоперационной лучевой терапии: чем более выражена инфильтрация, тем выше выживаемость. Федин Ю.В. и Ермилова В.Д. [35] при анализе неоадъювантной лимфоидной химиотерапии инфильтрации и установили клиническим связь между эффектом. степенью Выраженная лимфоидная инфильтрация у больных РМЖ, леченных с эффектом, была отмечена в 43,8% случаев, у больных, леченных без эффекта - в 6,3% случаев. Работами А.А.Субботиной [25, 26, 28] также показано, что выраженная инфильтрация опухоли Т-лимфоцитами (CD7+) ассоциируется с большим эффектом неоадъвантной полихимиотерапии – своего рода потенцирование. Последние исследования свидетельствуют, что тип, а не количество тумор-инфильтрирующих клеток может быть более важной определяющей для прогноза [72]. Например, инфильтрирующие регуляторные CD4+ клетки могут быть скорее вредными, чем полезными [72]. Эта субпопуляция ТИЛ может нарушать способность хозяина защищаться против опухолевых клеток [202, 189, 183, 182, 177, 167, 143, 117, 100, 92, 64, 124]. Большинство исследователей сходятся в том, что инфильтрация рака молочной железы Т-лимфоцитами положительно влияет на прогноз. Вместе с тем, уровни Т-клеточной (CD7+) и макрофагальной инфильтрации (CD163+) не были связаны с метастазированием рака молочной железы в регионарные лимфатические узлы [22]. Более того, даже при достоверной взаимосвязи с 14 регионарным метастазированием (отрицательная корреляция с индексом N) уровни Т-клеточной инфильтрации рака молочной железы не оказывали влияния на прогноз [121]. Это объясняется тем, что Т-лимфоциты представляют собой чрезвычайно гетерогенную группу клеток, различающихся по своей функциональной противоопухолевой активности. Противоопухолевые функции Т-лимфоцитов. Зрелые Т-лимфоциты включают TCRαβ Т-клетки, экспрессирующие CD4 или CD8, и CD4-/CD8- TCRγδ Т-клетки. Функция Т-клеток определяется экспрессией на их мембране корецепторов CD4 или CD8. Лигандом CD4+ лимфоцитов является β2-домен молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) II класса. Лигандом для CD8+ Т-лимфоцитов является α3-домен молекул МНС I класса. TCRαβ CD8+ Т-клеток ограничен распознаванием антигенов, представляемых молекулами МНС I, а TCRαβ CD4+ Т-клеток – антигенов, презентируемых молекулами МНС II класса. Важная роль Т-клеток как эффекторов противоопухолевого иммунитета была впервые продемонстрирована в многочисленных мышиных моделях. Опухоли, индуцированные ультрафиолетовым облучением, отторгаются у нормальных мышей, но продолжают расти в случаях отсутствия Т-клеток [194, 108, 174]. При меланоме человека активный Тклеточный ответ также имеет благоприятное прогностическое значение. Убедительно доказано, что Т-клеточный иммунитет необходим для отторжения опухолей, индуцированных вирусами или химическими канцерогенами [56, 103, 111, 184, 66, 161]. У мышей с опухолями, индуцированными метилхолантреном, внутривенное введение иммунных клеток, но не иммунной сыворотки переносит системный опухолеспецифический иммунитет сублетально облученным животным [56]. Эти результаты находятся в соответствии с исследованиями, показавшими, что протективный иммунитет против плазмоклеточных опухолей можно снизить предварительным удалением Т-клеток с помощью анти-Т-клеточных антител и комплемента [161]. 15 Важность Т-клеток в противоопухолевом иммунитете убедительно доказана у человека. Т-лимфоциты, выделенные из крови [135,105] или из опухоли [102] больных раком, реагируют in vitro с аутологичными опухолевыми клетками [89]. Использование адоптивного переноса размноженных in vitro ТИЛ в комбинации с химиотерапией позволяет получить положительные ответы у 50% больных с агрессивными опухолями поздних стадий [158, 159, 160, 80, 79]. Вместе с тем, общий уровень Т-клеточной инфильтрации опухоли, оцениваемый иммуногистохимически, не влиял на прогноз рака молочной железы при длительной прослеженности за больными. Значение имела инфильтрация опухоли субпопуляциями Т-лимфоцитов, в первую очередь, Тцитотоксическими (CD8+) клетками [3]. Роль различных Т-клеточных субпопуляций в отторжении опухолей уже длительное время является предметом споров [154]. Большинство исследователей отмечают преобладание Т-клеток над В-клетками в мононуклеарных инфильтратах опухолей молочных желез [166, 139, 10], причем относительное содержание Т-лимфоцитов колеблется от 49 до 75% клеточного состава [196]. Shimokawara J et al., [168], показали зависимость Т-клеточной инфильтрации от клинической стадии заболевания. С увеличением распространенности процесса количество Т-клеток уменьшается. Иммунофенотипирование популяций лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, позволило [97], выявить среди них СD5+- клетки. Другим исследователям удалось выделить достаточно большое количество различных субпопуляций лимфоцитов [47]. CD8+ T клетки в противоопухолевом иммунитете. Shijubo N. [166], показали преобладание в злокачественных опухолях молочной железы субпопуляции цитотоксических\супрессорных СD8+клеток над хелперами\индукторами СD4+. В то же время [41], получили противоположные результаты; кроме того, они установили отрицательную корреляционную связь между количеством СD4+- клеток и некоторыми 16 показателями: размером опухоли, клеточным полиморфизмом и числом пораженных лимфоузлов. Большинство опухолей позитивны по HLA-I, но негативны по HLA II класса, и CD8 ЦТЛ способны убивать опухолевые клетки путем прямого распознавания пептидных антигенов, презентируемых молекулами HLA-I злокачественных клеток. Поэтому, первоначально внимание в противоопухолевом иммунитете уделяли преимущественно CD8+ Т-клеткам. То, что CD8 T клетки являются главными эффекторами против опухолевых клеток, было в дальнейшем подтверждено многочисленными исследованиями в мышиных моделях. Например, для отторжения опухолей, индуцированных ультрафиолетовым облучением, необходимы CD8+ Тклетки [194]. Удаление CD8+ T-клеток у мышей противоопухолевый иммунный ответ, индуцированный снижает большинством раковых вакцин [85, 93, 78, 118]. Значение CD8+ Т-клеток подтверждено и у больных раком. Исследования по адоптивному переносу стимулированных in vitro CD8+ Т-клеточных линий и CD8+ клонов, специфичных к опухолевым антигенам, показало, что эти клетки, введенные больным, эффективно опосредуют противоопухолевый иммунитет [157, 158, 159]. Иммунизация с использованием либо адъювантов, либо дендритных клеток с чистыми опухолевыми пептидами может приводить к эффективному противоопухолевому иммунитету, который опосредован молекулами МНС I класса [141, 86]. Таким образом, CD8+ Т-клетки, несомненно, являются одним из главных подклассов Т-клеток, эффективно опосредующих противоопухолевый иммунитет. Хелперная и эффекторная роль CD4+ Т-клеток. Опухолеспецифичные CD4+ Т-клетки, которые способны распознавать опухолевые антигены, действительно существуют, и данные показывают, что эти Т-клетки мигрируют как в мышиные, так и в человеческие опухоли [145, 134, 46]. Однако возникают сложности в объяснении того, что в ряде случаев накопление CD4+ клеток в опухолевом микроокружении в ходе опухолевой 17 прогрессии отчетливо мешает эффекторной функции CD8+ клеток [202, 40, 51, 61, 193]. В целом фенотип CD4+ клеток, которые препятствуют противоопухолевым ответам, связан с наличием регуляторной функции [72, 77, 122, 198, 199]. CD4+ Т-клетки достаточны для элиминации опухолевых клеток в отсутствие CD8+ клеток в некоторых опухолевых моделях [134, 45, 90, 94, 138], однако, в большинстве случаев для эффективного отторжения опухоли необходимы как CD4, так и CD8 клетки [45]. Частично, это обусловлено тем, что значительная часть опухолевых клеток экспрессирует только молекулы МНС I класса, но не МНС II класса, что лимитирует прямое распознавание опухоли CD4+ Т-клетками. Более того преобладающим эффекторным механизмом в опухолевом иммунитете является прямой лизис опухолевых клеток CD8+ ЦТЛ, распознающими МНС I класса. Роль CD4+ Т-клеток в противоопухолевых ответах часто заключается в осуществлении помощи в активации CD8 цитотоксическими Т-клеток, ведущей Т-лимфоцитами. к деструкции Помощь CD4+ опухоли CD8+ Т-клеток CD8+ цитотоксическим Т-лимфоцитам включает 3 фазы: раннюю, индукцию, поддержание эффекторов. На этапе индукции, то есть примирования опухолеспецифических CD8 ЦТЛ, необходимость CD4 помощи заключается в активации АПК [152], вследствие которой на АПК усиливается экспрессия костимуляторных молекул ICAM-1 [169], CD80, CD86 [65] или индуцируется секреция цитокинов, включая ИЛ-12 [65]. Эти факторы необходимы для лучшей активации CD8+ Т-клеток. Большая часть Т-клеточной помощи для примирования ЦТЛ зависит от взаимодействий между лигандом CD40 (CD40L), экспрессированным на CD4+ Т-клетках и CD40 на АПК [120, 170, 49, 50]. Доказано, что взаимодействия CD40-CD40L являются важными в генерации защитного Т-клеточного противоопухолевого иммунитета [126, 125], своего рода «лицензирования» CD4+ клетками АПК для примирования ЦТЛ. Эта ситуация отличается от CD4-независимого ЦТЛ прайминга в 18 случаях прямой активации ЦТЛ вирусами, при которой обеспечивается оптимальный воспалительный сигнал для активации АПК [178, 123] с точки зрения последующего примирования антиген-специфических ЦТЛ ответов [123]. Необходимость CD4-помощи для примирования ЦТЛ при опухолях определяется целым рядом факторов. Например, в случаях наличия дренирующего опухоль лимфатического узла или при высоких уровнях экспрессии антигенного пептида примирование может происходить без CD4 клеток [203]. Общепринято, что CD4 лимфоциты необходимы для поддержания уровня ЦТЛ как при вирусных инфекциях, так и при опухолеспецифических иммунных ответах [43, 128, 63, 204], что частично обусловлено продукцией ИЛ-2. После освобождения организма от антигена большинство эффекторных ЦТЛ подвергаются апоптозу, и лишь незначительная их часть превращается в лимфоциты с фенотипом клеток памяти. Существуют доказательства того, что CD4+ клетки необходимы для превращения ЦТЛ памяти в эффекторные ЦТЛ при повторной встрече с антигеном. Как известно, CD4 клетки подразделяются в зависимости от их профиля продукции цитокинов. Тн1 клетки характеризуются продукцией ИФ-γ, а Тн2-клетки – продукцией ИЛ-4, ИЛ-5 и других цитокинов. Тн1 клетки в большей степени стимулируют клеточный иммунитет, а Тн2-клетки – гуморальный [156]. ИФ-γ положительно влияет на процессинг и презентирование антигена, поскольку экспрессия молекул гистосовместимости I и II классов, а также ряда других молекул (например, транспортера, ассоциированного с антигенным презентированием, ТАР), находятся под контролем этого цитокина [201]. Поскольку клеточный иммунный ответ предпочтителен для опухолевой деструкции, предполагают, что Тн1-ответ благоприятен для противоопухолевого иммунитета. Действительно, установлена связь между генерацией Тн1 ответа и более 19 сильным противоопухолевым иммунитетом [186, 39, 119, 84, 101]. Более того, счтитают, что Тн1 ответ необходим для противоопухолевого иммунитета, а Тн2 цитокины снижают противоопухолевый иммунитет [101, 106, 144]. Существует даже концепция, объясняющая неэффективность Тклеточного иммунитета при опухолях, иммунной девиацией, то есть сдвигом цитокинового профиля от Тн1 к Тн2 при опухолевой прогрессии [147]. Однако убедительно доказано существование опухолеспецифических Тн2клонов с выраженной противоопухолевой активностью [165, 140, 84, 104]. Предполагают, что в этом случае Тн2 клетки активируют врожденный иммунитет. CD4+ регуляторные Т-клетки в опухолевом микроокружении. В ходе опухолевой прогрессии микроокружение опухоли становится местом, где осуществляется баланс между эффекторным и регуляторным ответами. Подкласс Т-клеток, ответственных за регулирование эффекторного иммунного ответа в пределах опухоли, сходен с регуляторными Т-клетками, вовлеченными в аутоиммунитет [72, 202, 193, 77, 122, 198, 199]. Опухоли обычно развиваются в течение длительного периода времени. Вдобавок, главные патофизиологические характеристики злокачественных опухолей – инвазия через естественные тканевые барьеры и метастазирование – часто ассоциированы с разрушением нормальной тканевой архитектуры, и это ведет к возникновению воспалительных процессов. В этом смысле раки очень напоминают хронический воспалительный процесс. В свете этого можно предположить, что противовоспалительные механизмы, которые включаются в начале инвазии, в сочетании с внутренними злокачественные клетки к уравновешивают регуляторную механизмами, продукции контролирующими цитокинов реакцию, (напр., способную TGF-β), ингибировать противоопухолевый иммунитет. Негативная регуляторная роль CD4+ Т-клеток в опухолевом микроокружении хорошо установлена. В некоторых спонтанных опухолевых 20 моделях присутствие CD4+ Т-клеток способствует развитию рака вместо его ингибирования [73]. Аналогичные данные получены при иммунизации антиген-специфичными CD4+ Т-клетками [171]. Деплеция CD4+ клеток отменяет супрессию и индуцирует CD8+ Т-клеточный противоопухолевый иммунитет [40]. Вместе с тем, нельзя забывать и о необходимости Тклеточной CD4+ помощи для генерации полноценного противоопухолевого иммунного ответа. Все это объясняется существованием функционально различных подклассов CD4+ клеток. Супрессорными функциями в отношении противоопухолевого иммунитета обладают CD4+CD25+ клетки. В ряде работ использовали деплецию CD4+ клеток для усиления противоопухолевого иммунитета. Более специфичная деплеция с помощью анти-CD25 антител существенно усиливает эффективность противоопухолевого иммунитета при соответствующей вакцинации мышей [183, 182, 177, 167, 143, 117, 100, 92, 64, 124]. Трег могут ингибировать начальное примирование CD8+ Т-клеток, некоторые из которых распознают опухолевые антигены [143]. Эквивалентом Трег клеток мышей у человека являются CD4+CD25+CD45RO+ клетки, составляющие примерно 6% CD4+ лимфоцитов в крови здоровых взрослых людей [77]. CD4+CD25+ клетки с регуляторными свойствами описаны среди тумор-инфильтрирующих лимфоцитов при раке легкого, яичников, поджелудочной железы, молочной железы, желудочно-кишечного тракта и лимфомах [198, 199, 164, 127]. Для проявления супрессорной функции этих клеток в отношении CD4+ эффекторных клеток необходимы антиген-специфическая активация и межклеточные контакты. Присутствие CD4+ Tрег в самой опухоли указывает на то, что они могут ингибировать противоопухолевые Т-клеточные эффекторные ответы [72, 202, 193, 77]. Естественные киллерные клетки, несомненно, играют роль в противоопухолевом иммунитете в целом [129] и при раке молочной железы, в частности [175]. У некоторых больных раком молочной железы отсутствует активность NК-клеток в отношении мишеней К-562 [109]. 21 Уровни NK-клеточной активности являются более низкими у женщин с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы (N+) в сравнении с больными без метастазов в лимфатические узлы (N0) [116]. NK-клеточная цитотоксичность была значительно более низкой у больных с высокой частотой семейного рака в сравнении с пациентами, у которых раки в семьях встречались редко [180]. У женщин с поздними стадиями рака молочной железы отмечено подавление NK-клеточной цитотоксичности в сравнении со здоровыми женщинами [185]. Подавление NK-клеточной активности может быть важным медиатором ускорения опухолевого роста при стрессе [48]. Существуют данные, что NK-клеточный дефицит усугубляется по мере опухолевой прогрессии и зависит от клинической стадии заболевания [96, 132]. Тем не менее, роль NК-клеточной активности в контроле рака молочной железы остается не до конца понятной. По данным 4 методов изучения NK-клеток их активность у больных раком молочной железы и у женщин с доброкачественными процессами в молочной железе не различалась [149]. По данным Sachs G. и соавторов [163] активность LAKклеток, а не NK-клеток взаимосвязана с количеством регионарных аксиллярных лимфатических узлов, пораженных метастазами у больных раком молочной железы. Активность NK-клеток (по лизису клеток-мишеней К-562 и MCF-7) не различалась у больных раком молочной железы и у пациенток с доброкачественными процессами. Однако большее отношение к прогнозу имела активность в отношении клеток MCF-7 [98]. В пуле тумор-инфильтрирующих лимфоцитов рака молочной железы NK-клетки составляют небольшую пропорцию [162]. Их функциональная роль не совсем ясна. Следует отметить, что в настоящее время отношение к роли NК-клеток не столь однозначное. Помимо позитивной роли в противовирусной и противораковой защите эти клетки могут также угнетать CD8+ Тцитотоксический иммунитет [110]. Установлена регуляторная роль NK- 22 клеток в адаптивном иммунитете. Например, после удаления NK-клеток усиливается антигенная презентация в ходе инфекции вирусом лимфоцитарного хориоменингита [181]. Аналогичным образом, удаление NK-клеток улучшает формирование Т-клеток памяти [173]. Активация NKклеток ведет к подукции ими интерлейкина-10, который способствует вирусиндуцированному подавлению CD8+-клеток [114, 59]. Последние данные свидетельствуют о том, что отсутствие ингибиторного рецептора 2B4 на NKклетках ведет к редукции вирус-специфического CD8+ Т-клеточного ответа и более длительной персистенции вируса [192]. В последние 10-15 лет методы иммуногистохимии с применением МКА помогли установить состав иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих рак молочной железы, и оценить их значение с позиций современных представлений о противоопухолевом иммунитете. Проведенные в течение последних 15 лет исследования по изучению состава иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих рак молочной железы, позволяют со всей определенностью утверждать необходимость и полезность углубленного изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов и макрофагов для понимания патогенетических взаимодействий организма и опухоли. Без этих знаний сложно или невозможно планирование, проведение и контроль эффективности тех или иных видов иммунотерапии у больных раком молочной железы. Многообразие иммунологических реакций организма на опухоль является базисом для комплексного подхода к иммуногистохимической оценке субпопуляций количественно или лимфоцитов в полуколичественно ткани опухоли. оценивать Необходимо общий уровень лимфоидной инфильтрации на основании экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45 – выраженная инфильтрация, умеренная, минимальная. Выраженная Т-клеточная инфильтрация стромы опухоли иммунокомпетентными клетками свидетельствует о том, что опухоль распознается иммунной системой. По-видимому, как и в случаях реакции 23 отторжения трансплантата, формирование лимфоидного вала происходит при участии Т-хелперов (специфических и неспецифических), активно продуцирующих цитокины в ответ на опухолеспецифичные антигены или повреждение тканей. Выраженная реакция тумор-инфильтрирующих лимфоцитов отнюдь не означает их способности разрушать опухолевую ткань. При исследованиях в иммунофлуоресцентном методе хорошо видны два типа тумор-инфильтрирующих клеток: в строме и в зонах сплошного опухолевого роста. Даже при наличии весьма выраженной инфильтрации Тлимфоциты могут не проникать в пласт опухолевых клеток. Механизм этого явления еще не до конца понятен. Могут играть роль целостность базальной мембраны, отграничивающей пласт злокачественных эпителиальных клеток, васкуляризация опухолевой паренхимы или какие-то иные причины (в том числе и нарушения функции самих Т-клеток). Так или иначе, для успешного осуществления цитотоксического действия необходим контакт между опухолевой клеткой и Т-киллером, а при отсутствии этого контакта осуществление Т-лимфоцитарной цитотоксичности в отношении опухолевых клеток невозможно. В связи с изложенным, предложено наряду с общей инфильтрацией опухолевой ткани оценивать количество и качественный состав тумор-инфильтрирующих лимфоцитов (ТПЛ). Это разновидность интраэпителиальных лимфоцитов (ИЭЛ), обнаруживаемых в зонах сплошного роста раковых клеток [188]. ТПЛ представляют собой, главным образом, CD8-позитивные Т-киллеры [31]. Иными словами, иммунофенотипическая характеристика ТПЛ свидетельствует о том, что в зоны сплошного опухолевого роста пенетрируют клетки, которые, согласно современным представлениям, противоопухолевого иммунитета. могут являться Количество ТПЛ эффекторами достоверно взаимосвязано с общим уровнем лимфоидной инфильтрации опухоли, инфильтрацией опухоли Т-клетками и Т-киллерами. Отражением успешного распознавания опухоли как чужеродной Ткиллерами, пенетрировавшими в опухолевую массу, является активация 24 CD8-позитивных ТПЛ. В этом случае на мембране цитотоксических клеток появляются молекулы HLA-DR, рецептор ИЛ-2 (CD25) и целый ряд других активационных антигенов. Активированнные Т-лимфоциты могут пролиферировать и образовывать кластеры в зонах сплошного опухолевого роста, а также вызывать разрушение соседних опухолевых клеток. Все это в совокупности свидетельствует об иммуногистохимическом подтверждении способности Т-лимфоцитов распознавать и элиминировать раковые клетки. Характерным признаком активации ТПЛ явяется ―автономность‖ этого феномена, его независимость от уровня лимфоидной инфильтрации рака, количества и качественного состава ТПЛ [188]. Подобная особенность легко объяснима с позиций знания взаимодействий между лимфоцитом и клеткой опухоли, Т-клеточным рецептором и комплексом опухолеассоциированного пептида с молекулами HLA-I на мембране раковых клеток. Помимо Т-клеток в срезах рака молочной железы целесообразно изучать макрофаги, ЕК-клетки, В-лимфоциты и плазмоциты. В-лимфоциты в ткани рака молочной железы. В-клеточные реакции в ткани рака молочной железы не являются частыми. В ряде случаев можно наблюдать формирование фолликулоподобных структур, расположенных перитуморально и содержащих типичные фолликулярные дендритические клетки. Реакции макрофагов и плазмоцитов в ткани рака молочной железы имеют очень широкий диапазон: от единичных клеток до массивных инфильтратов. Роль плазмоклеточной инфильтрации опухоли в осуществлении противоопухолевого инфильтрация иммунитета плазмоцитами остается наблюдается неясной. Тем достаточно не часто менее, при иммуногистохимическом изучении рака молочной железы. Несмотря на наличие ряда антигенов, специфичных для плазматических клеток, например, синдекана (CD138), наибольшее распространение в визуализации 25 плазмоцитов получили МКА к CD38. Это обусловлено наличием яркой цитоплазматической реакции плазмоцитов. Доля В-лимфоцитов в составе мононуклеарных клеток, инфильтрирующих опухоль, невелика. Некоторые авторы обнаруживают до 15-30% В-клеток среди тумор-инфильтрирующих лимфоцитов рака молочной железы. Как правило, В-лимфоциты располагаются скоплениями в строме опухоли [41]. Для оценки антигена обще-В-клеточного кластера дифференцировки CD-22 [14], использовались МКА ИКО-91, полученные [7, 6]. Положительная реакция в виде умеренной инфильтрации получена в 7,7% случаев, при этом В-лимфоциты располагались небольшими и, редко, средних размеров скоплениями в строме опухоли без пенетрации в ее паренхиму. Выраженная инфильтрация не обнаружена ни разу. Из 92,3% наблюдений с негативной реакцией минимальная инфильтрация выявлена у 30,8% пациенток, а 61,5% приходился на долю опухолей с отсутствием Вклеточной инфильтрации. Таким образом, был сделан вывод, что Вклеточное звено достаточно редко принимает участие в местном иммунном ответе при РМЖ. Выраженная лимфоплазмоцитарная инфильтрация [153], а также повышенный апоптоз опухолевых клеток характерны для медуллярной формы рака молочной железы. Опухолевые зоны инфильтрированы активированными CD8+ Т-цитотоксическими гранзим В-позитивными лимфоцитами, которые разрушают опухолевые клетки путем апоптоза [200]. На мембране апоптотических раковых клеток экспрессируется -актин, который распознается гуморальной иммунной системой. Фрагменты актина обнаруживаются также лимфоплазмоцитарных в ткани клеток, рака молочной инфильтрирующих железы. Анализ медуллярный рак молочной железы, показал, что они продуцируют олигоклональные IgG, специфичные, в основном, к -актину. Таким образом, гуморальный иммунный ответ, направленный против антигенов клеток медуллярного рака молочной железы, не является 26 опухолеспецифическим, по своей природе он ближе к аутоиммунным реакциям [99]. Разумеется, оценить клиническое значение подобной инфильтрации и продукции антител к антигенам апоптотических раковых клеток чрезвычайно сложно. Большее значение имеет, по видимому, сам феномен апоптоза, присущий медуллярному раку молочной железы. В любом случае, гуморальный иммунный ответ направлен у данной категории больных лишь к апоптотическим клеткам, что явно недостаточно для элиминации опухоли. Отсутствие специфичности к антигенам опухолевых клеток IgGантител, продуцируемых интратуморальными В-лимфоцитами, показано при инфильтрирующем протоковом раке молочной железы [71]. В-лимфоциты формировали структуры типа фолликулов, содержащих фолликулярные дендритные клетки и зародышевые центры, которые в отличие от зародышевых центров лимфатических узлов не имели темной зоны (в темной зоне зародышевых центров лимфатических узлов сосредоточены центробласты – активно делящиеся клетки, в которых происходят соматические гипермутации). Интересно отметить, что имела место продукция антител IgG класса, более 60% которых были клональны (от 4 до 11 клональных групп). Установлено, что клоны В-лимфоцитов происходили из общего предшественника, то есть имели место соматические гипермутации и селекция наиболее аффинных клонов в ткани рака молочной железы. К аналогичным выводам пришли Nzula [142]. Авторы показали, что Влимфоциты в ткани рака молочной железы подвергаются антигенуправляемой пролиферации, соматическим гипермутациям и аффинному созреванию in situ. Эти клетки родственны по происхождению не только в пределах одного скопления В-лимфоцитов, но и в различных скоплениях, то есть мигрируют в ткани рака молочной железы. Кластеры В-лимфоцитов не имели типичных признаков фолликулярных центров – мантии, светлой и темной зон зародышевых центров. Вместе с тем присутствовали все 27 компоненты, необходимые для антиген-управляемой пролиферации и созревания клеток в зародышевом центре – Т- и В-лимфоциты, CD21позитивные фолликулярные дендритные клетки. Тканевые кластеры Влимфоцитов с подобной организацией имеют место при синдроме Шегрена, ревматоидном артрите, а также в тимусе больных миастенией гравис [179, 151, 172]. В последенее время доказана роль врожденных пентамерных IgM против опухолеспецифических гликанов в противоопухолевом иммунитете. Эти антитела продуцируются B1 CD5+ B-лимфоцитами [57]. Однако сведения о интратуморальных В1 лимфоцитах при раке молочной железы отсутствуют. Важно учитывать, что типы воспалительных реакций и иммунологическая характеристика лимфоидных инфильтратов различаются при инвазивных дольковых и протоковых раках [113]. Это продемонстрировано на примере изучения 123 инвазивных раков, включая 46 дольковых. протокового Диффузное рака воспаление (особенно было высокой наиболее степени характерно для злокачественности), инфильтрат в этих случаях состоял преимущественно из Т-клеток и макрофагов. Отмечена весьма слабая корреляция воспалительной реакции с некрозом, в развитии которого основную роль играют, по-видимому, другие факторы. Перилобулярное воспаление по краю опухоли наблюдалось в основном при дольковых раках и протоковых раках высокой степени злокачественности. Периваскулярная воспалительная реакция также чаще наблюдалась по краю опухоли, но не была типичной для долькового или протокового рака. В отличие от диффузного воспаления периваскулярные и перилобулярные инфильтраты состояли в основном из Т- и В-лимфоцитов. Сочетание перилобулярного и периваскулярного воспаления, состоящего из Т- и В-клеток, с эпителиальной экспрессией HLA-DR, напоминающее лимфоцитарный лобулит, чаще наблюдалось при дольковом, чем при протоковом раке. 28 Уровни лимфоидной инфильтрации рака молочной железы во многом определяются иммунологическим фенотипом злокачественных клеток [32]. Особое место в ряду антигенов раковых клеток занимают антигены гисосовместимости I и II классов, т.к. именно эти антигены ответственны за распознавание опухоли иммунной системой. Одни исследователи находят корреляцию экспрессии молекул HLA I, II класса с уровнями инфильтрации опухоли лимфоцитами и, в частности, CD4-клетками [206], другие ее не обнаруживают. По данным Conha A. [70] стромальная лейкоцитарная инфильтрация рака молочной железы не зависит от экспрессии антигенов HLA II класса на опухолевых клетках. Различий в количественном составе и строении воспалительных инфильтратов между HLA-DR+ и HLA-DR- опухолями не обнаружено. Аналогичным образом, [207] не наблюдали корреляции между снижением экспрессии HLA II на раковых клетках и величиной воспалительного инфильтрата. Рассматривая взаимосвязи иммунофенотипа раковых клеток с местными проявлениями иммунных реакций, важно учитывать, что мономорфная экспрессия или полное отсутствие того или иного антигена в пределах опухоли от одного больного наблюдается крайне редко. Значительно чаще имеет место гетерогенность опухолевых клеток по этому признаку, то есть различные участки опухоли экспрессируют молекулы HLA с различной интенсивностью. По этим причинам очень важно оценить уровень лимфоидной инфильтрации именно в той зоне опухоли, которая экспрессирует интересующий антиген. При реализации подобного подхода выявлены интересные закономерности [107]. Уровни экспрессии различных молекул HLA-II коррелировали с плотностью локальной лимфогистиоцитарной инфильтрации (Ii: p=0,003; HLA-DR: p = 0,0005; HLA-DP: p = 0,0000005; HLA-DQ: p = 0,001). Следовательно, в большинстве случаев экспрессия Ii/HLA-D антигенов на раковых клетках была непосредственно 29 взаимосвязана с уровнями близлежащей лимфогистиоцитарной инфильтрации. Однако в 26% рака молочной железы не отмечено связи между уровнями экспрессии HLA-II на раковых клетках и интенсивностью инфильтрации опухоли мононуклеарными клетками. Это явление названо неадекватной экспрессией Ii/HLA-D. Другим количественным подходом, позволяющим точно оценить взаимосвязь экспрессии молекул особенностями субпопуляций является проточной метод HLA на опухолевых тумор-инфильтрирующих цитофлуориметрии. клетках с лимфоцитов Этим методом было установлено [195], что диапазон экспрессии молекул HLA-I составляет от 1 до 74% (среднее – 12,9%), HLA-DR – 1-69% (среднее – 14,3%). Экспрессия HLA-I коррелировала с уровнями CD4-клеток (р 0,05) и CD8-клеток (р 0,02). Пропорция CD8+HLA-DR+ клеток коррелировала с экспрессией на опухоли молекул HLA-I (p 0,001) и HLA-II (p образом, Т-хелперные активированные 0,001). Аналогичным клетки (CD4+HLA-DR+) коррелировали с экспрессией на опухоли молекул HLA-I (p (p 0,01) и HLA-II 0,02). Отмечена также корреляция уровней CD25+CD4+ клеток с экспрессией антигенов I (р 0,05) и II классов (р 0,03) гистосовместимости на опухоли. Вместе с тем, наличие трансферринового рецептора на туморинфильтрирующих лимфоцитах не было взаимосвязано с экспрессией антигенов гистосовместимости на клетках рака молочной железы. Эти данные убедительно свидетельствуют о важной роли опухолевых антигенов гистосовместимости в развитии противоопухолевого иммунитета при раке молочной железы. Помимо лимфоцитарных субпопуляций (CD4, CD8 Т-клетки, CD20 Bлимфоциты) множество клеток миелоидной линии, в числе которых опухолеассоциированные макрофаги CD68+, инфильтрируют ткань рака молочной железы [76]. Роль макрофагов в противоопухолевом иммунитете остается неясной. Так, Fidler T. [87], сообщает об увеличении скрытого периода возникновения 30 опухоли у животных при введении им активированных in vitro макрофагов. В эксперименте на мышах при изучении роста трансплантируемых опухолей введение ингибиторов макрофагов укорачивало латентный период для аденокарциномы BSP3 [131]. В эксперименте на крысах было показано, что снижение инфильтрации опухоли макрофагами наблюдается при прогрессировании процесса [60]. Оригинальную точку зрения о возможности противоопухолевой активности высказали Окулов В.Б. [21]. По их мнению, в опухолевой ткани образуется ряд агентов, под влиянием которых макрофаги усиленно продуцируют ростовые факторы, ускоряющие пролиферацию клеток опухоли и повышающие их гетерогенность и инвазивность, то есть способствующие росту опухоли. По данным различных авторов, на долю макрофагов в лимфоплазмоцитарном инфильтрате опухоли приходится до 80% [137]. Содержание макрофагов в опухоли и РЛУ можно измерять на основании экспрессии панмакрофагального антигена СD163 с использованием отечественного МКА D11. Большинство исследований у больных раком молочной железы свидетельствуют о том, что инфильтрация опухолевой ткани CD68+ клетками коррелирует с признаками неблагоприятного прогноза [53, 136, 75], более высокой степенью злокачественности опухоли [82, 191, 112], повышенным ангиогенезом [190, 187, 54, 67], снижением выживаемости без признаков заболевания [75, 187, 115, 62] и повышенным риском развития отдаленных метастазов в случаях изучения в сочетании с эндотелиальными маркерами и маркерами раковых клеток [155]. Для визуализации макрофагов в ткани рака молочной железы нами широко используются МКА D11 (CD163), полученные в лаборатории иммунохимии, руководимой академиком Г.И.Абелевым, ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН. Эти МКА позволяют выявлять весь спектр макрофагов, присутствующих как в строме опухоли, так и в зонах сплошного роста раковых клеток [22]. 31 Одним из основных достижений сегодняшнего дня явилась оценка функционального значения специфических лейкоцитарных популяций в развитии рака молочной железы. Эти данные основаны на функциональных исследованиях на мышиных моделях канцерогенеза при раке молочной железы, с использованием мышей с гомозиготными нулевыми мутациями в генах, специфичных для развития или хоминга (рекруитмента) лейкоцитов. Накопленные факты относительно влияния различных популяций интратуморальных лимфоцитов на прогноз рака молочной железы ставят со всей определенностью вопрос, относительно того, может ли быть проведена иммунокоррекция субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов. На сегодняшний день подобных работ не проводилось. Одним из перспективных и разрешенных к клиническому использованию иммуномодуляторов в онкологии является полиоксидоний (азоксимера бромид). Это сополимер N-окси-1,4-этиленпиперазина и (Nкарбокси)-1,4-этиленпиперазиния бромида. Относится к лекарственным средствам с иммуностимулирующим и дезинтоксикационным действием. Полиоксидоний обладает выраженной иммуномодулирующей активностью и прежде всего, действует на систему врожденного иммунитета. При его воздействии регистрируется усиление продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-α и интерферонов). Препарат активирует синтез указанных цитокинов только при их исходно низких и средних уровнях, в то время как при исходно повышенных уровнях не оказывает влияния и даже снижает продукцию цитокинов. Наряду с активацией клеток моноцитарно-макрофагального ряда и естественных киллеров происходит усиление функциональной активности как клеточного, так и гуморального иммунитета. В конечном итоге под действием полиоксидония активируется вся иммунная система организма. Данная активация аналогична формированию иммунной реакции в ответ на антигенный (патогенный) фактор [13]. В условиях in vivo препарат обладает выраженной способностью стимулировать гуморальный иммунный ответ [23, 36]. 32 В РОНЦ им. Н.Н.Блохина проведено рандомизированное исследование по изучению влияния Полиоксидония на переносимость послеоперационной химиотерапии или химиолучевой терапии у больных раком молочной железы. Пациентки, которым после радикальной операции проводили адъювантную химиотерапию по схеме FAC (4 курса в стандартных дозах с интервалом 3 нед.) + лучевая терапия на область молочной железы и зоны регионарного метастазирования + лучевая кастрация, были рандомизированы на 2 группы методом блоковой рандомизации. В I группе (включена 31 больная) в интервалах между курсами FAC применяли Полиоксидоний по 6 мг в/м через день всего 9 инъекций с 3 по 19 дни цикла. II группа (31 больная) – контрольная. Применение полиоксидония достоверно снижало частоту инфекционных осложнений. У больных с исходно сниженными показателями иммунного статуса полиоксидоний обеспечивал нормализацию содержания CD3+ и CD4+ и CD16+ лимфоцитов [5]. Побочных эффектов Полиоксидония не выявлено. У 29% больных (9 из 31) отмечено значительное снижение исходно нормального содержания CD3+ лимфоцитов (с 63,4±0,5% до 48,6±1,2%, CD4 с 41,2±1,9% до 26,5±1,6%. Уменьшение уровня CD16+ клеток выявлено у 35% больных (11 из 31) с 20,8±1,4% до 11,8±1,3% (Манзюк Л.В. и др., 2005). Отмечено положительное влияние препарата на показатели «качества жизни» больных [15]. Полиоксидоний достаточно широко применяется в онкологии. Установлена его эффективность по цитогенетическим критериям при адъювантном применении после хирургического лечения у больных с меланомой кожи [19]. Использование полиоксидония в сочетании с химиопрепаратами при лечении среднечувствительных опухолей позволяет усилить действие цитостатиков за счет прямого активирующего действия препарата на клетки и функции иммунной системы [37]. Описано применение полиоксидония в комплексном лечении детей с гистиоцитозом и лимфомой Ходжкина [11]. 33 Синтетический препарат полиоксидоний вызывает хороший иммунный и терапевтический эффект у больных раком молочной железы. Этот эффект характеризуется стабильной экспрессией маркеров ICAM (CD50), CD7,CD38, CD95, CD11b. Отмечается эффективность по экспрессии маркеров CD4, CD20, CD45RA [34]. Следует отметить, что в цитированных работах оценка иммунологических показателей в ходе иммунотерапии полиоксидонием проводилась на основании изучения субпопуляций лимфоцитов периферической крови. Вместе с тем, как показали последние работы [75, 162], наибольшую информацию относительно прогностической роли дает изучение интратуморальных лимфоцитов. Поэтому, в нашей работе впервые предпринята попытка изучения действия полиоксидония, применяемого в неоадъювантном режиме, на субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы. 34 Г ЛАВА II. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГ О МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Па цие нты и х а ра к те рис тик а к линиче с к ог о, биопс ийног о ма те риа ла Материалом для настоящего исследования послужили результаты исследований 57 образцов опухолевой ткани от 37 больных раком молочной железы Т1-2N1-3M0 стадий. Установление диагноза рака молочной железы и лечение пациенток проведено в ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН в 2010-2012 годах. Все пациентки, включенные в исследование, проходили лечение в хирургическом отделении опухолей молочных желез (зав. отделением профессор. И.К.Воротников). ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН. Работа выполнена в лаборатории иммунологии гемопоэза (зав. лабораторией д.м.н. профессор Н.Н.Тупицын) ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (директор - академик РАН и РАМН профессор М.И.Давыдов). Морфологическая патологической часть анатомии исследования опухолей проводилась человека ФГБУ в отделе «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (зав. отделением профессор Карселадзе А.И.). Критерием отбора больных служил гистологически верифицированный диагноз рака молочной железы. В нашу работу вошли женщины в возрасте от 32 до 78 лет. Средний возраст больных составил 55 лет. При этом менструальная функция была сохранена у 9 больных (24,3%), в периоде менопаузы – 28 женщин (75,7%). Клинический диагноз рака молочной железы у всех больных подтвержден данными морфологического исследования опухоли. Стандартный объем предоперационного обследования у пациенток РМЖ включал ультразвуковое исследование и маммографию обеих молочных 35 желез в двух проекциях, ультразвуковое исследование подмышечных, надключичных и подключичных лимфатических узлов, органов малого таза и печени, рентгенографию органов грудной клетки, сканирование костей скелета. Распространенность опухоли оценивалась согласно Международной классификации злокачественных опухолей по системе ТNM. Полученные данные представлены в таблице 2.1. Таблица 2.1 Распределение больных РМЖ по стадиям ТNM Стадия I стадия: T1N0M0 IIа стадия: T1N1M0 T2N0M0 IIб стадия: Т2N1M0 IIIа стадия: T1N2M0 T2N2M0 IIIc стадия: T2N3M0 Всего Число больных абс. Частота % 6 10 1 9 10 10 10 1 9 1 1 37 16,2 27,0 2,7 24,3 27,0 27,0 27,0 2,7 14,3 2,7 2,7 100 Как видно из таблицы 2.1, наибольшее число больных относилось к IIa, IIb и IIIa стадиям (по 27,0%). До проведения настоящей работы больным специфического лечения не проводили. 20 больным в возрасте от 32 до 78 лет (медиана – 52,5) проводилась кор-биопсия опухоли, последующее лечение полиоксидонием, радикальная операция. Полиоксидоний применялся внутримышечно в дозе 12 мг в 1-й, 2й, 3-й, 5-й, 7-й дни (1-й день – день кор-биопсии). Препарат был предоставлен бесплатно в рамках протокола совместных исследований ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН и НПО «Петровакс». Протокол был утвержден этическим комитетом ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН. Все 36 больные подписывали информированное согласие. Операция осуществлялась на следующий день после последнего введения полиоксидония. По данным гистологического исследования хирургически удаленной молочной железы, инфильтративный обнаружено, протоковый что рак наиболее – 29 часто встречался наблюдений (78,4%), инфильтративный дольковый рак - 6 случаев (16,2%), тубулярный и медуллярный раки – по одному наблюдению. Результаты морфологического исследования представлены в таблице 2.2. Таблица 2.2 Распределение больных раком молочной железы в зависимости от гистологической формы опухоли Гистологический тип опухоли Число больных Частота % абс. Инфильтративный протоковый рак 29 78,4% Инфильтративный дольковый рак 6 16,2% Медуллярный рак 1 2,7 Тубулярный рак 1 2,7 Для всех пациенток при морфологическом исследовании было дано детальное описание лимфатический тканей, аппарат, окружающих определена опухоль инвазия и регионарный опухолевых клеток в лимфатические сосуды, наличие круглоклеточной инфильтрации, очагов некроза в опухоли, выраженность лечебного патоморфоза (морфологическое исследование проводилось в отделении патологической анатомии опухолей человека ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» РАМН, за что приносим благодарность). Наибольшее число пациенток 15 (40,5%) не имели метастазов в лимфатических узлах (критерий N0). 11 (29,7%) пациенток имели изменения 1 - 4 лимфоузлах (критерий N1). В 10 (27,0%) случаях определялись конгломераты увеличенных плотных лимфатических узлов подмышечной области или поражение от 5 до 9 лимфоузлов (критерий N2). Мы наблюдали 37 1 (3,7%) случай, соответствующий индексу N3 поражения регионарных лимфатических узлов при раке молочной железы. Степень злокачественности опухоли была определена у 34 больных исследуемой группы. В большинстве клинических случаев - 29 (85,3%) обнаружена II степень злокачественности, реже наблюдалась III степень – у 5 (14,7%) больных. Данные представлены в таблице 2.3. Таблица 2.3 Распределение больных раком молочной железы в зависимости от степени злокачественности Степень злокачественности опухоли II III Всего Число больных Частота абс. % 29 85,3 5 14,7 34 100 Хирургическое вмешательство различного объема выполнено всем больным изучаемой группы. Радикальную резекцию удалось выполнить в 8 клинических случаях, в остальных – хирургическое лечение проведено в объеме радикальной мастэктомии с сохранением грудных мышц. Помимо клинико-морфологических критериев прогноза (размер опухолевого узла, гистологический тип опухоли, количество пораженных лимфатических узлов), у всех больных изучаемой группы оценивался рецепторный статус опухоли, пролиферативный индекс (Ki-67), экспрессия рецептора Her2/neu.. Определение рецепторов стероидных гормонов осуществлялось в отделе патологической анатомии опухолей человека ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН (зав. отделом профессор Карселадзе А.И.), общепринятым иммуногистохимическим методом. Исследование рецепторов эстрогенов было проведено у 32 больных раком молочной железы, из которых у 27 (84,4%) больных опухоль была 38 рецепторположительной по рецепторам эстрогенов, у 5 (15,6%) – рецепторотрицательной (табл. 2.4). Таблица 2.4 Распределение больных раком молочной железы в зависимости от статуса рецепторов эстрогенов в опухоли Рецепторы эстрогенов Число больных Частота Абс. % РЭ+ 27 84,4 РЭ5 15,6 Итого 32 100 Уровень рецепторов прогестерона в первичной опухоли определен также у 32 больных. В 25 (78,1%) случаев опухоль содержала рецепторы к прогестерону, у 7 (21,9%) больных опухоль была рецепторотрицательной. Данные статуса рецепторов прогестерона в опухоли у больных раком молочной железы приведены в таблице 2.5. Таблица 2.5 Распределение больных раком молочной железы в зависимости от статуса рецепторов прогестерона в опухоли Рецепторы прогестерона РП+ РПИтого Число больных Частота Абс. % 25 78,1 7 21,9 32 100 Распределение больных в зависимости рецепторного статуса опухоли было следующим: у большинства больных опухоли содержали рецепторы эстрогенов и прогестерона (РЭ+РП+) 25 (78,1%). В 5 (15,6%) клинических случаях не обнаружены оба вида рецепторов (РЭ-РП-). Отрицательный рецепторный статус по рецепторам эстрогенов и положительный по рецептору прогестерона (РЭ-РП+) – не наблюдались. Опухоль, положительная по рецепторам эстрогенов и отрицательная по прогестерону 39 (РЭ+РП-) обнаружена у 2 (6,3%) больных. Данные представлены в таблице 2.6. Таблица 2.6 Рецепторный статус опухолей у больных раком молочной железы РЭ+РП+ РЭ-РП- РЭ-РП+ РЭ+РПабс. % абс. % абс. % абс. % 25 78,1 5 15,6 0 0 2 6,3 Уровень рецептора Her2/neu в первичной опухоли также определен у больных. В 17 (53,1%) случаях опухоль не содержала рецепторы к Her2/ neu (-), у 10 (31,3%) больных уровни рецепторов к Her2/neu (1+) были крайне низкие, у 3-х (9,4%) больных — Her2/neu (2+) /в одном из этих случаев методом FISH подтвержден положительный рецепторный статус/, у 2 (6,3%) больных Her2/neu (3+). Данные статуса рецептора Her2/neu в опухоли у больных раком молочной железы приведены в таблице 2.7. Распределение больных раком молочной железы в зависимости от статуса Her2/neu в опухоли Таблица 2.7 Количество больных Частота Абс. % Her2/neu (0) 17 53,1 Her2/neu (1+) 10 31,3 Her2/neu (2+) 3 9,4 Her2/neu (3+) 2 6,3 Итого 32 100 Her2/neu 2.2 Ре а к тивы и ме тоды ис с ле дова ния Реактивы 1. Моноклональные антитела. 40 Основными реактивами являются моноклональные антитела (МКА), с помощью которых выполнялось исследование. Специфичность использованных в работе МКА представлена в таблице 2.8. Таблица 2.8 Специфичность использованных МКА 1 2 3 4 5 Кластер дифференцировки, название CD45 CD 8 CD4 CD3 CD56 6 CD25 № Специфичность Все лейкоциты Т-киллеры Т-хелперы T-клетки NK-клетки Рецептор ИЛ-2; активированные лимфоциты, Трег Примечание: Использованы прямые конъюгаты представленных антител с флуорохромами - FITC, PE, PE-Cy5, ECD - производства фирмы Becton Diсkinson (США) или Beckman Coulter (США). Методы исследования Проточная цитометрия Иммунологическое исследование материала кор-биопсии и удаленной опухолевой ткани проводили методом 4-цветной проточной цитометрии с использованием следующих комбинаций антител: 1-ая проба – CD4/CD3/CD25/CD45, 2-ая проба – CD8/CD3/CD56/CD45. Анализ данных проводили с использованием программы WinMDI или (в случаях, требующих дополнительной компенсации параметров флуоресценции) – программы FCS, версия 3. Нами оценены следующие иммунологические показатели интратуморальных лимфоцитов: Общий уровень лимфоидной инфильтрации – количество CD45+ лимфоцитов по отношению к общему числу событий, набранных при проточной цитометрии. Процент зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+). 41 Процент зрелых CD4+CD3+ T-лимфоцитов. Процент зрелых T-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+ Соотношение CD8/CD4 Процент активированных (регуляторных) CD4+CD25+ клеток Процент NK-клеток – CD3-CD56+ Процент TNK клеток – CD3+CD56+ 2.3 Ста тис тиче с к а я обра ботк а ре з у льта тов ис с ле дова ния Для статистической обработки данных использовался пакет программ SPSS, версия 13. С применением теста Колмогорова-Смирнова проверялась гипотеза о принадлежности выборок к нормальным совокупностям. В случае значимого подтверждения этой гипотезы использовались: тест Стьюдента (при сравнении двух выборок) или дисперсионный анализ (при сравнении большего числа выборок). В противном случае применялись непараметрические тесты: Манна-Уитни (две выборки) или КраскелаУоллеса (больше двух выборок). Для установления связи между двумя дискретными величинами, в зависимости от их типа и получаемых таблиц сопряженности использовались точный тест Фишера или тест 2 по Пирсону. Для количественной оценки связи между двумя случайными величинами, в зависимости от их типа и нормальности распределения использовались коэффициенты корреляции по Пирсону или Спирману. 42 Гла ва 3. Ре з у льт а т ы ис с ле дова ний 3.1 Ха ра к те рис тик а с у бпопу ляций интра ту мора льных лимфоцитов у больных ра к ом молочной же ле з ы ме тодом проточной цитоме трии 3.1.1 Исследования на материале хирургически удаленной опухоли Мы изучили субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у 17 больных на материале хирургической опухоли, операции. удаленной в Субпопуляционный ходе радикальной состав лимфоцитов представлен в таблице 3.1. Таблица 3.1 Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы (материал - удаленная опухоль) Субпопуляция (CD) Процент клеток Число больных min max cреднее 17 16 16 16 9 16 16 70,95 31,54 23,25 0,57 1,48 0,39 0,25 95,20 81,80 67,80 3,52 9,09 23,30 5,29 84,88 47,14 46,39 1,24 4,35 4,11 1,94 стд. ошибка 1,87 3,10 3,86 0,21 0,77 1,43 0,42 17 0,08 27,90 2,32 1,60 CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Процент CD45++SSCLow В материале удаленной опухоли у больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (CD3+), количество которых достигало 95,2% от числа лимфоцитов, в среднем 84,02±2,0%. Количество цитотоксических лимфоцитов (CD8+) незначительно преобладало над количеством CD4+ лимфоцитов – в среднем 47,1±3,1% и 46,4% ±3,9% соответственно. Соотношение CD8:CD4 в целом по группе составило 1,24. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, 43 незначительным и не превышал 5,29%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 1,48 до 9,09%, в среднем – 4,4±0,8%. На представленном нами материале уровни инфильтрации рака молочной железы лимфоцитами можно разделить на низкие (менее 1,0% лимфоцитов от общего числа событий) – 12 из 17 больных (70,6%) и умеренные/высокие (более 1%) – 5/17 (29,4%). Преобладают, как видно, случаи с низкой и умеренной лимфоидной инфильтрацией (70,6%). В составе интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы до 95,2% составляют зрелые Т-клетки (CD3+). Их субпопуляционный состав характеризуется преобладанием Т-хелперов (CD4+) над Т-цитотоксическими лимфоцитами (CD8+) в 50% случаев (соотношение CD8/CD4 менее 1) и в 50% случаев – обратным соотношением (по 8 больных). При сравнении группы больных с низким и очень низким уровнем лимфоидной инфильтрации рака молочной железы с группой больных, у которых наблюдается умеренная и выраженная инфильтрация, получены интересные данные, таблица 3.2. Как видно, только уровни NK-клеток зависели от общего уровня лимфоидной инфильтрации опухоли, однако, были более выраженными при незначительной инфильтрации. Вместе с тем, CD8+ клетки, несомненно, определяли степень лимфоидной инфильтрации опухоли, так как при выраженной лимфоидной инфильтрации пропорция этих клеток составили в среднем 55%. Напротив, при выраженной лимфоидной инфильтрации пропорция CD4+ клеток снижалась – 42%. Именно этим обусловлено более высокое значение цитотоксического индекса в случаях выраженной лимфоидной инфильтрации опухоли, в среднем – 1,72. 44 Таблица 3.2 Процентное содержание субпопуляций клеток в пределах интратуморальных CD45++ лимфоцитов в зависимости от общего уровня лимфоидной инфильтрации опухолевой ткани (материал – удаленная опухоль) Популяция клеток (CD) CD3 Уровень Средний Стд. Ошибка N Р инфильтрации процент среднего 0 12 83,61 1,99 0,3 1 5 87,94 4,23 CD8 0 11 43,56 2,71 0,09 1 5 55,02 7,28 CD4 0 11 48,58 4,31 0,4 1 5 41,57 8,27 CD8/CD4 0 11 1,02 0,15 0,1 1 5 1,72 0,55 CD4+CD25+ 0 5 4,86 1,29 0,5 1 4 3,72 0,75 CD3+CD56+ 0 11 4,75 1,99 0,5 1 5 2,72 1,48 CD3-CD56+ 0 11 2,54 0,52 0,03 1 5 0,61 0,15 Примечание: 0 – изкий уровень инфильтрации, 1 – умеренный или высокий 3.1.2 Возможности изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов методом проточной цитометрии на материале кор-биопсии опухоли у больных раком молочной железы Метод многопараметровой проточной цитометрии дает возможность оценить экспрессию целого ряда маркеров на уровне одной клетки, что открывает перспективы исследований даже при получении очень маленьких образцов опухолевой ткани. Целью настоящей главы явилась оценка возможности изучения субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы на материале кор-биопсии. Мы остановимся на данном вопросе более подробно, так как исследования по кор-биопсии методом проточной цитометрии открывают перспективы до операционной оценки 45 статуса интратуморальных лимфоцитов, возможностей планирования неоадъювантной иммунотерапии. Исследование проведено у 20 больных операбельным раком молочной железы, у которых в процессе комплексного обследования с целью верификации диагноза проводилась кор-биопсия опухолевой ткани. Диагноз рака молочной железы во всех случаях был подтвержден морфологически. Для иммунологических исследований клетки опухоли дезагрегировали с использованием аппарата ―Medimashin‖ (Becton Dickinson, США), специально разработанного для выделения лимфоцитов из опухолевой ткани. Окраску клеток проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител, меченых флуорохромами. Количество проб, изучаемых иммунологически, было сведено до двух, учитывая крайне малое количество материала кор-биопсии: 1. CD4FITC/CD25-PE/CD3-ECD/CD45-PE.Cy5. 2. CD8/FITC/CD56-PE/CD3- ECD/CD45-Pe.Cy5. Эти комбинации антител позволяли оценить общий уровень инфильтрации опухоли лимфоцитами, пропорцию Т-клеток среди лимфоцитов, субпопуляции CD4 и CD8 клеток, активационные маркеры (CD25), и, в частности, CD4+CD25+ T-регуляторные клетки, TNKлимфоциты (CD3+CD56+) и естественные киллеры (CD3-CD56+). Сбор клеток проводили на проточном цитометре EPICS XL MCL, общее количество набираемых событий – от 75 000 до 500 000. Анализ цитометрических данных проводили с использованием программ MDI или FCS, версия 3. Статистическую обработку данных проводили с использованием программы SPSS. В большинстве случаев полученного материала кор-биопсии хватало для окраски обеих проб. Уровень лимфоидной инфильтрации опухолевой ткани колебался от незначительного до выраженного. На рисунке 1 представлена умеренная лимфоидная инфильтрация ткани рака молочной железы лимфоцитами. Анализ субпопуляций лимфоцитов проводили в гейте R1, как показано на рисунке 1. 46 Рис. 1. Умеренная инфильтрация рака молочной железы лимфоцитами (клетками с яркой экспрессией CD45 /ось Х/ и низким уровнем бокового светорассеяния SSC /ось Y/). В представленном случае общее количество накопленных при цитометрии событий – 75 453, из них лимфоцитов (CD45++ SSCLOW) – 1216 (1,61%). Количественная характеристика субпопуляций лимфоцитов по материалу кор-биопсии представлена в таблице 3.3. Таблица 3.3 Субпопуляции лимфоцитов ткани рака молочной железы (кор-биопсийный материал) Процент клеток Субпопуляция (CD) Число больных min max cреднее CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Процент CD45++SSCLow 19 19 19 19 15 18 18 72,90 25,38 24,49 0,43 0,58 0,59 0,00 95,00 57,38 60,82 1,43 9,13 28,00 4,12 88,02 40,87 45,18 0,96 4,03 4,36 1,59 Стд. ошибка 1,50 1,97 2,24 0,07 0,72 1,48 0,32 20 0,10 9,54 2,05 0,65 В материале кор-биопсии больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (CD3+), количество которых достигало 95% от числа лимфоцитов, в среднем 88,0±1,5%. Количество CD4-лимфоцитов 47 незначительно преобладало над количеством цитотоксических лимфоцитов (CD8+) – в среднем 45,2% и 40,9% соответственно. Соотношение CD8:CD4 в целом по группе составило 0,96. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, незначительным и не превышал 4,12%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем – 4,0±0,7%. Эти данные подтверждают результаты предшествующих исследований относительно главенствующей роли Т-лимфоцитарного звена иммунитета в инфильтрации опухолевой ткани рака молочной железы [4, 1, 27, 31]. Вместе с тем, впервые количественно подтверждено, что среди туморинфильтрирующих лимфоцитов преобладают CD4-клетки (45,2%) над цитотоксическими CD8+ лимфоцитами (40,9%), и соотношение CD8/CD4 не достигает единицы (0,96). Учитывая тот факт, что преобладание CD4 клеток является фактором неблагоприятного прогноза [75, 162], можно считать обоснованным рассмотрением возможности разработки методов повышения уровней CD8 лимфоцитов и соотношения CD8/CD4 в опухолевой ткани больных раком молочной железы. Вместе с тем, этот вопрос необходимо рассматривать индивидуально, учитывая особенности субпопуляционного состава лимфоцитов в ткани корбиопсии рака молочной железы. Действительно, у 9 из 15 пациенток, у которых было изучено соотношение CD8/CD4 в опухолевой ткани, значение индекса было менее 1 (минимально 0,4), однако, в 8 случаях Тцитотоксические лимфоциты преобладали – от 1,14 до 1,4. Пример высокого содержания CD8-лимфоцитов представлен на рисунке 2. Содержание ТNK-клеток и естественных киллеров было, как правило, невысоким. На рисунке 3 представлены эти субпопуляции интратуморальных лимфоцитов. Важное значение в исследованиях противоопухолевого иммунитета придается анализу Т-регуляторных клеток – субпопуляции CD4+CD25++ лимфоцитов, способной подавлять иммунный ответ на опухолевые антигены. 48 Пример выраженной пропорции CD4+CD25+ интратуморальных лимфоцитов в материале кор-биопсии рака молочной железы представлен на рисунке 4. А Б В Рис. 2. Выраженная Г инфильтрация опухоли CD8-лимфоцитами, соотношение CD8/CD4 = 1,19. А. Уровень общей лимфоцитарной инфильтрации очень высокий, в гейте R1 9,2% клеток от общего числа событий (158533). Б. – большинство лимфоцитов представлены зрелыми Тклетками (91%). В. Среди тумор-инфильтрирующих лимфоцитов преобладают CD8+ клетки (51%). Г. Содержание CD4+ лимфоцитов 43%. 49 Рис. 3. Субпопуляции ТNK-клеток и естественных киллеров в ткани рака молочной железы (материал кор-биопсии). Анализ в гейте CD45++/SSCLOW лимфоцитов (выделение гейта показано на рис. 1). Четко видны субпопуляция TNK-клеток (CD56+CD3+) – 1,0% и субпопуляция естественных киллеров (CD56+CD3-) – 1,07%. Рис. 4. Экспрессия CD25 на CD4+ Т-лимфоцитах и на CD4-негативных Т-клетках. Анализ в гейте CD45++/SSCLOW CD3-позитивных лимфоцитов. Количество CD3+CD4+CD25+ лимфоцитов – 8,09%. 50 Как видно на рисунке 4, уровни экспрессии CD25 на CD4+ Т-клетках примерно такие же, как и на CD4-негативных Т-клетках, что не позволяет отнести их однозначно к регуляторным Т-клеткам. Подобный фенотип более характерен для активированных CD4+ лимфоцитов (активированных Тхелперов). Наибольший интерес представляют случаи рака молочной железы, которые на основании субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов могут быть расценены как прогностически неблагоприятные. Подобное наблюдение с минимальной инфильтрацией опухоли лимфоцитами и низким содержанием Т-цитотоксических (CD8+) клеток представлено на рисунке 5. А. Б. Рис. 5. Низкое содержание тумор-инфильтрирующих лейкоцитов в материале кор-биопсии рака молочной железы (А), существенное преобладание CD4+ лимфоцитов (Б). Содержание клеток в гейте лимфоцитов составило всего 0,34% от общего числа событий. Более 90% из них представлены Т-клетками (CD3+), из которых 68% составили CD4+ клетки, соотношение CD8/CD4 ≈ 0,5. Согласно современным представлениям больные с выраженным преобладанием CD4+ лимфоцитов в опухолевой ткани характеризуются неблагоприятным прогнозом [75, 161]. Отбор этих случаев на этапе 51 диагностики (кор-биопсии) позволяет планировать лечебные мероприятия, например, иммунотерапевтические в неоадъювантном режиме. Таким образом, материала кор-биопсии, в большинстве случаев достаточно для оценки субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов. Для минимизации количества необходимого для исследования материала необходимо использовать многопараметровую (четырехцветную) проточную цитометрию, позволяющую количественно оценить как уровни инфильтрации опухоли Т-лимфоцитами, так и субпопуляции наиболее значимых эффекторных клеток противоопухолевого иммунитета: зрелые Тлимфоциты, Т-хелперы, активированные Т-лимфоциты, Т-регуляторные клетки, Т-цитотоксические лимфоциты, NKT-клетки и NK-клетки. На представленном нами материале уровни инфильтрации рака молочной железы лимфоцитами можно разделить на низкие (менее 1% лимфоцитов от общего числа событий) – 7 из 20 больных (35,0%) и умеренные/высокие (более 1%) – 13/20 (65,0. Преобладают, как видно, случаи с умеренной/высокой лимфоидной инфильтрацией (65%). В составе интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы до 95% составляют зрелые Т-клетки (CD3+). Их субпопуляционный состав характеризуется преобладанием в Т-хелперов (CD4+) над Т- цитотоксическими лимфоцитами (CD8+), соотношение CD8/CD4 менее 1 – 53% случаев, более 1 – 47% случаев. При сравнении группы больных с низким уровнем лимфоидной инфильтрации рака молочной железы с группой больных, у которых наблюдается умеренная и выраженная инфильтрация, получены интересные данные (табл. 3.4). 52 Таблица 3.4 Процентное содержание субпопуляций клеток в пределах интратуморальных CD45++ лимфоцитов в зависимости от общего уровня лимфоидной инфильтрации опухолевой ткани (материал кор-биопсии) Популяция клеток (CD) CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Уровень инфильтрации 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 N 7 12 7 12 7 12 7 12 5 10 6 12 6 12 Средний процент 86,87 88,66 35,17 44,20 43,89 45,94 0,88 1,005 5,26 3,42 8,65 2,21 1,72 1,53 Стд. Ошибка среднего 2,51 1,94 2,38 2,35 4,80 2,35 0,12 9,09 1,31 0,84 4,05 0,31 0,69 0,36 Р 0,58 0,02 0,67 0,38 0,24 0,03 0,79 *0 – низкий уровень инфильтрации, 1 – умеренная и высокая инфильтрация Из числа проанализированных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов только Т-цитотоксические (CD8+) клетки имели взаимосвязь с общим уровнем лимфоидной инфильтрации. При умеренной и высокой инфильтрации процентное содержание Т-цитотоксических клеток было достоверно более высоким: 44,2% и 35,2%, р=0,022. Это позволяет предположить, что, как и в случаях изучения материала удаленной опухоли, именно CD8+ лимфоциты во многом определяют общий уровень лимфоидной инфильтрации рака молочной железы. Подобное заключение о существовании положительной взаимосвязи между общим уровнем лимфоидной инфильтрации рака молочной железы и уровнем инфильтрации Т-цитотоксическими (CD8+) лимфоцитами было сделано ранее с использованием полуколичественного иммуногистохимического метода [4], а в нашей работе получило строго количественное подтверждение. 53 Взаимоотношения общего уровня лимфоидной инфильтрации (CD45++ SSCLow) с процентом TNK-клеток были иными: более высокое содержание TNK-клеток отмечено при низкой лимфоидной инфильтрации опухоли. Представленные количественного результаты свидетельствуют исследования о возможности субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы на материале корбиопсии. Эти данные могут быть использованы для разработки протоколов иммунокоррекции в прогностически неблагоприятных группах. Разумеется, дальнейшие исследования необходимо проводить с учетом иммунофенотипических особенностей опухоли, в частности, молекул рецепторов, опосредующих взаимодействия с клетками иммунной системы. 3.1.3 Сопоставление субпопуляционного состава лимфоцитов в материале кор-биопсии и материале удаленной опухоли Представленные в предыдущих разделах результаты свидетельствуют о сходстве субпопуляционного состава лимфоцитов при проведении исследования по материалу кор-биопсии и при изучении удаленной опухоли. Мы провели статистическую обработку данных, результаты которой представлены в таблице 3.5. Представленные данные убедительно свидетельствуют о том, что достоверных различий ни по одной из исследуемых нами субпопуляций не получено. Следовательно, материал кор-биопсии может считаться адекватным материалу удаленной опухоли для изучения субпопуляций интратуморальных лимфоцитов. Это позволяет нам представить результаты исследования субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов в целом по группе 37 больных раком молочной железы, таблица 3.6. В материале опухолей больных раком молочной железы преобладали зрелые Т-клетки (CD3+), количество которых достигало 95,2% от числа лимфоцитов, в среднем 86,5±1,2%. Количество CD4-лимфоцитов незначительно преобладало над количеством цитотоксических лимфоцитов 54 (CD8+) – в среднем 45,7% и 43,7% соответственно. Соотношение CD8:CD4 в целом по группе составило 1,09. Уровень клеток естественных киллеров (CD45+CD3-CD56+) был, как правило, незначительным и не превышал 5,29%. Т-регуляторные клетки находились в диапазоне от 0,58 до 9,13%, в среднем – 4,2±0,5%. Таблица 3.5 Сопоставление процентного содержания интратуморальных лимфоцитов различных субпопуляций, выделенных из материала кор-биопсии и хирургически удаленной опухоли CD Материал N Среднее Стд. ошибка среднего удаленная 19 88,0 1,5 опухоль1 CD3 кор-биопсия 17 84,89 1,87 удаленная 19 88,02 1,50 опухоль CD8 кор-биопсия 16 47,14 3,11 удаленная 19 40,87 1,97 опухоль CD4 кор-биопсия 16 46,39 3,86 удаленная 19 45,18 2,24 опухоль CD8/CD4 кор-биопсия 16 1,24 0,21 удаленная 19 0,96 6,86 опухоль CD4+CD25+ кор-биопсия 9 4,35 0,77 удаленная 15 4,03 0,72 опухоль CD3+CD56+ кор-биопсия 16 4,11 1,43 удаленная 18 4,36 1,48 опухоль CD3+CD56кор-биопсия 16 1,94 0,42 удаленная 18 1,59 0,32 Процент опухоль лимфоцитов кор-биопсия 17 2,32 1,60 1 Ни одна из больных не получала химио- или иммунотерапию в неоадъювантном режиме Р 0,2 0,1 0,78 0,18 0,78 0,91 0,51 0,87 55 Таблица 3.6 Субпопуляции лимфоцитов ткани рака молочной железы Процент клеток Субпопуляция (CD) Число больных min max среднее CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Процент CD45++SSCLow 36 35 35 35 24 34 34 70,95 25,38 23,25 0,43 0,58 0,39 0,00 95,20 81,80 67,80 3,52 9,13 28,00 5,29 86,54 43,74 45,74 1,09 4,15 4,24 1,75 Стд. ошибка 1,19 1,83 2,11 0,10 0,53 1,02 0,26 37 0,08 27,90 2,17 0,80 На представленном нами материале уровни инфильтрации рака молочной железы лимфоцитами можно разделить на низкие (менее 1% лимфоцитов от общего числа событий) – 21 из 37 больных (56,8%) и умеренные/высокие (более 1%) – 16/37 (43,2%).. Незначительно преобладают, как видно, случаи с низкой лимфоидной инфильтрацией (56,8%). В составе интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы до 95% составляют зрелые Т-клетки (CD3+). Их субпопуляционный состав характеризуется преобладанием Т-хелперов (CD4+) над Т-цитотоксическими лимфоцитами (CD8+), соотношение CD8/CD4 менее 1 – 51,4% случаев (18 из 35), более 1 – 48,6% случаев (17 из 35). При сравнении группы больных с низким уровнем лимфоидной инфильтрации рака молочной железы с группой больных, у которых наблюдается умеренная и выраженная инфильтрация, получены интересные данные, таблица 3.7. Лишь одна из проанализированных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов имела достоверную взаимосвязь с общим уровнем лимфоидной инфильтрации. При умеренной и высокой инфильтрации процентное содержание Т-цитотоксических клеток было достоверно выше, чем при 56 низких уровнях инфильтрации: 48,1% и 40,5%, р=0,039. Это позволяет предположить, что CD8+ лимфоциты во многом определяют общий уровень лимфоидной инфильтрации рака молочной железы. Подобное заключение о существовании положительной взаимосвязи между общим уровнем лимфоидной инфильтрации рака молочной железы и уровнем инфильтрации Т-цитотоксическими (CD8+) лимфоцитами было сделано ранее с использованием полуколичественного иммуногистохимического метода, а в нашей работе получило количественное подтверждение. Таблица 3.7 Процентное содержание субпопуляций клеток в пределах интратуморальных CD45++ лимфоцитов в зависимости от общего уровня лимфоидной инфильтрации опухолевой ткани Популяция клеток (CD) CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Уровень инфильтрации N Средний процент 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 21 15 20 15 20 15 20 15 12 12 19 15 19 15 85,28 88,30 40,49 48,07 46,90 44,18 0,96 1,26 4,69 3,62 5,67 2,43 2,09 1,32 Стд. Ошибка среднего 1,45 2,00 1,89 3,19 2,86 3,19 9,31 0,20 0,76 0,73 1,73 0,52 0,38 0,30 Р 0,22 0,039 0,53 0,15 0,32 0,12 0,14 *0 – низкие уровни инфильтрации, 1 – умеренная и высокая инфильтрация. Таким образом, результаты нашего исследования свидетельствуют о том, что в составе интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы преобладают зрелые Т-клетки (CD3+), которые могут составлять до 95,2% от всех лимфоцитов. Естественные киллерные клетки 57 (CD3-CD56+) представлены в незначительном количестве, не более 5,3%, в среднем – 1,8%. В составе Т-лимфоцитов Т-хелперы (CD4+) и Т-цитотоксические клетки (CD8+) представлены примерно в равных пропорциях. Пропорция Трегуляторных клеток невелика, так как общее число CD4+CD25+ лимфоцитов составляет не более 9,13%, в среднем – 4,2%. Содержание клеток с фенотипом CD3+CD56+ также, как правило, невелико, в среднем – 4,2%. 3.2 Сопос та вле ние лимфоцитов с с ос та ва к линиче с к ими интра ту мора льных х а ра к те рис тик а ми и морфолог иче с к ими приз на к а ми у больных ра к ом молочной же ле з ы У 37 больных, не получавших никакого лечения перед операцией (включая полиоксидоний), мы сопоставили иммунологические параметры интратуморальных лимфоцитов с клиническими характеристиками опухоли, такими как стадия заболевания, размер опухоли (рТ), вовлеченность регионарных лимфатических узлов (индекс N). Взаимосвязи с клинической стадией мы не отметили, таблица 3.8 Аналогичный анализ проведен для сравнения иммунологических показателей в зависимости интратуморальных от индекса лимфоцитов N. различных Различия в уровнях субпопуляций были недостоверными (р˃0,05). Учитывая то, что наиболее близкими к достоверным при одновременном сравнении четырех стадий были различия в уровнях интратуморальных CD3+ зрелых Т-клеток (р=0,097), мы предположили, что существуют различия между отдельными стадиями в уровнях CD3+ лимфоцитов. Средние значения CD3+ клеток при отдельных стадиях были такими: I стадия 83,4±2,9%; IIа стадия 84,2±2,6%; IIb – 91,3±0,8%; IIIa – 87,3±3,3%, 3c – 70,95%. 58 Таблица 3.8 Уровни интратуморальных лимфоцитов различных субпопуляций в зависимости от клинической стадии РМЖ (Критерий Краскела-Уоллеса) Популяция, CD Стадия I IIa CD3 IIb IIa I IIa CD8 IIb IIIa I IIa CD4 IIb IIIa I IIa CD8/CD4 IIb IIIa I IIa CD4+CD25+ IIb IIIa I IIa CD3+CD56+ IIb IIIa I IIa CD3+CD56IIb IIIa Всего I IIa Процент лимфоцитов IIb IIIa N Средний ранг 6 12,67 9 14,22 10 24,00 10 18,60 5 18,80 9 16,11 10 14,40 10 21,20 5 10,40 9 19,56 10 20,00 10 16,70 5 22,30 9 15,28 10 14,70 10 19,90 4 14,50 4 11,75 10 14,00 6 9,17 5 23,20 8 14,69 10 18,05 10 14,70 5 21,00 8 18,88 10 14,50 10 16,00 33 6 13,67 10 21,30 10 16,70 10 20,40 Р 0,097 0,456 0,305 0,394 0,541 0,362 0,586 0,460 Действительно, сравнение уровней лимфоцитов при I-IIа стадиях с уровнями при IIb-IIIс стадиях выявило достоверные различия, таблица 3.9. 59 Таблица 3.9 Сравнение уровней интратуморальных лимфоцитов при стадиях I-IIа с уровнями этих клеток при стадиях IIb-IIIс Популяция CD CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Процент лимфоцитов Стадия N Среднее IIb-IIIс I-IIа IIb-IIIс I-IIа IIb-IIIс I-IIа IIb-IIIс I-IIа IIb-IIIс I-IIа IIb-IIIс I-IIа IIb-IIIс I-IIа IIb-IIIс I-IIа 20 15 20 14 20 14 20 14 16 8 20 13 20 13 20 16 89,31 83,88 44,04 43,04 47,06 44,69 1,06 1,09 4,06 4,33 2,91 6,47 1,49 2,12 1,92 2,56 Стд. ошибка среднего 1,23 1,86 2,66 2,64 2,76 3,49 0,15 0,15 0,66 0,93 0,52 2,48 0,34 0,44 0,65 1,69 Р 0,016 0,8 0,6 0,89 0,82 0,098 0,26 0,71 Эти различия, в основном, обусловлены нарастанием уровней CD3+ интратуморальных лимфоцитов при стадии IIb. Различия между стадиями IIа и IIb высоко достоверны, р=0,013. Различия, установленные нами при различных стадиях опухолевого процесса, нашли отражение и во взаимосвязях с размером опухоли (Т) и наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы. При возрастании размера опухоли (сравнение рТ1 и рТ2) нарастали уровни CD3 лимфоцитов (недостоверно) и снижался процент интратуморальных TNK-клеток(CD3+CD56+), таблица 3.10. Уровни интратуморальных Т-лимфоцитов (CD3+) были выше при наличии метастатического поражения лимфатических узлов (N+), однако, различия не достоверны, таблица 3.11. 60 Таблица 3.10 Уровни интратуморальных лимфоцитов в зависимости от размера опухоли (рТ) Маркер, CD pT N Среднее Стд. ошибка среднего Р 1 8 82,63 2,34 CD3 0,08 2 28 87,66 1,33 1 7 46,07 4,68 CD8 0,53 2 28 43,16 1,99 1 7 39,71 5,38 CD4 0,16 2 28 47,24 2,24 1 7 1,36 0,28 CD8/CD4 0,18 2 28 1,02 0,11 1 4 4,81 1,37 CD4+CD25+ 0,59 2 20 4,02 0,58 1 7 9,79 4,25 CD3+CD56+ 0,004 2 27 2,80 0,44 1 7 2,71 0,64 CD3-CD56+ 0,059 2 27 1,51 0,27 1 8 0,55 0,11 Процент лимфоцитов 0,3 2 29 2,62 1,01 Таблица 3.11 Уровни интратуморальных лимфоцитов в зависимости от поражения регионарных лимфатических узлов Маркер, CD Индекс N N Среднее Стд. ошибка среднего Р N+ 22 88,26 1,40 CD3 0,07 N14 83,84 1,99 N+ 22 44,008 2,43 CD8 0,85 N13 43,29 2,83 N+ 22 47,15 2,67 CD4 0,39 N13 43,34 3,48 N+ 22 1,06 0,14 CD8/CD4 0,75 N13 1,13 0,16 N+ 16 4,06 0,66 CD4+CD25+ 0,82 N8 4,33 0,93 N+ 22 2,89 0,47 CD3+CD56+ 0,07 N12 6,72 2,65 N+ 22 1,68 0,34 CD3+CD560,71 N12 1,89 0,40 N+ 22 1,81 0,59 Процент лимфоцитов 0,59 N15 2,70 1,81 61 Уровни Т-клеток резко возрастали при возникновении регионарных метастазов, т.е. при индексе N1 в сравнении с N0 (P=0,005), таблица 3.12. Таблица 3.12 Субпопуляции интратуморальных лимфоцитов при возникновении регионарных метастазов (N1 в сравнении с N0) Маркер, CD ИндексN 0 CD3 1 0 CD8 1 0 CD4 1 0 CD8/CD4 1 0 CD4+CD25+ 1 0 CD3+CD56+ 1 0 CD3+CD561 0 Процент лимфоцитов 1 При дальнейшем N Среднее Стд. ошибка среднего P 14 83,84 1,99 0,005 11 90,93 1,03 13 43,29 2,83 0,19 11 38,32 2,13 13 43,34 3,48 0,19 11 50,72 4,24 13 1,13 0,16 0,15 11 0,83 0,099 8 4,33 0,93 0,97 9 4,38 0,88 12 6,72 2,68 0,21 11 2,99 0,65 12 1,89 0,40 0,83 11 1,76 0,46 15 2,70 1,81 0,59 11 1,49 0,81 распространении процесса (N2) различия с начальными стадиями были не столь достоверными и на первый план выходило достоверное повышение уровней интратуморальных киллеров (CD8+), таблица 3.13 Подобное достоверное (р=0,019) нарастание уровней интратуморальных Т-киллеров при наличии регионарных метастазов, соответствующем индексу N2, возможно, свидетельствует о том, что интратуморальная иммунная система реагирует на опухоль достаточно поздно – при наличии обширного регионарного метастазирования. При сопоставлении с гистологическим типом опухоли установлено, что уровни CD8+ Т-киллеров достоверно более высокие при инфильтративном протоковом раке в сравнении с инфильтративным дольковым раком – 62 45,6±2,1% и 36,0±3,1%, p=0,027. Вместе с тем, различий в субпопуляционном составе интратуморальных лимфоцитов в зависмости от рецепторного статуса нами не установлено как в отношении рецептора эстрогенов, так и в отношении рецептора прогестерона, р˃0,05. Аналогичным образом, степень злокачественности опухоли не была взаимосвязана ни с одной из субпопуляций иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих рак молочной железы, р˃0,05. Таблица 3.13 Сопосталение уровней интратуморальных лимфоцитов при индексах регионарного метастазирования N1 и N2 Маркер, CD CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Процент лимфоцитов Индекс N 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 Число больных 11 10 11 10 11 10 11 10 9 7 11 10 11 10 11 10 Среднее 90,93 87,05 38,32 49,89 50,72 44,55 0,83 1,28 4,38 3,65 2,99 2,88 1,76 1,55 1,49 2,25 Стд. ошибка среднего 1,03 2,12 2,13 4,10 4,24 3,24 0,09 0,27 0,88 1,06 0,65 0,79 0,46 0,58 0,80 1,0005 P 0,11 0,019 0,27 0,12 0,6 0,9 0,78 0,56 Для сопоставлений с экспрессией Her2/neu мы не располагали достаточным материалом, так как в изучаемой группе было всего 3 рецепторпозитивных случая. 63 3.3 ВЛИЯНИЕ ПОЛИОКСИДОНИЯ НА СУБПОПУЛЯЦИИ ИНТРАТУМОРАЛЬНЫХ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В представленной работе нами оценено влияние разрешенного к клиническому использованию в онкологии иммуномодулятора полиоксидония на уровни интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы. Иммунотерапия полиоксидонием проведена у 20 женщин, больных раком молочной железы. Диагноз во всех случаях был установлен на основании морфологического исследования опухолевой ткани. Больные проходили клиническое и инструментальное обследование, а также лечение в соответствии со стандартами, утвержденными Министерством Здравоохранения и социального развития РФ. 20 больным в возрасте от 32 до 78 лет (медиана – 53,5) проводилась кор-биопсия опухоли, последующее лечение полиоксидонием, радикальная операция. Полиоксидоний применялся внутримышечно в дозе 12 мг в 1-й, 2й, 3-й, 5-й, 7-й дни (1-й день – день кор-биопсии). Препарат был предоставлен бесплатно в рамках протокола совместных исследований ФГБУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН и НПО «Петровакс». Протокол был утвержден этическим комитетом РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Все больные подписывали информированное согласие. Операция осуществлялась на следующий день после последнего введения полиоксидония. Инфильтративный протоковый рак установлен у 14 пациенток (70,0%), инфильтративный дольковый – 4 (20%), тубулярный – 1 (5%), медуллярный – 1 (5%). Рецепторы эстрогенов были положительны в 16 случаях из 20 (80%), рецепторы прогестерона – в 14 из 20 (70%). Статус по Her2/neu: 0 – 9 (45%), 1+ – 7 (35,0%), 2+ – 3 (15,0%), 3+ – 1 (5,0%). В одном из 3 случаев, расцененных как 2+, экспрессия рецептора расценена как положительная на основании результатов FISH-реакции. Таким образом, положительный статус по Her2/neu имел место у 2 больных (20%). Пролиферативный индекс (Ki-67) 64 находился в диапазоне от 7 до 75% (среднее – 33,9±17,4%). У 12 больных установлена 2-ая степень злокачественности (70,6%), у 5 – 3-я (29,4%). Размеры опухоли в основном (95,0%, 19 больных) соответствовали индексу рТ2, лишь в одном случае (5,0%) – рТ1. Метастазы в регионарные лимфатические узлы установлены у 14 (70,0%) больных (N1 – 7 /35%/, N2 – 7 /35%/), у 6 больных (30%) метастазы отсутствовали. Отдаленных метастазов у больных анализируемой группы не было. В соответствии с клиническими стадиями заболевания больные распределились следующим образом: I стадия – 1 (5%), IIа – 5 (25%), IIb – 7 (35%), IIIа – 7 (35%). Иммунологическое исследование материала кор-биопсии и удаленной опухолевой ткани проводили методом 4-цветной проточной цитометрии с использованием следующих комбинаций антител: 1-ая проба – CD4/CD3/CD25/CD45, 2-ая проба – CD8/CD3/CD56/CD45. Анализ данных проводили с использованием программы WinMDI или (в случаях, требующих дополнительной компенсации параметров флуоресценции) - программы FCS, версия 3. Статистическая обработка проводилась с использованием программы SPSS/ Все больные хорошо переносили введение полиоксидония. Осложнений нами не отмечено. Ни у кого из больных во время проведения иммуномодулирующей терапии и в послеоперационном периоде не было инфекционных заболеваний. Интересно отметить, что по результатам морфологического исследования хирургически удаленной опухоли у 6 из 20 больных (30%), получавших в неоадъювантном режиме только полиоксидоний, отмечен лечебный патоморфоз: у 3 больных – 1 степени, у двух больных – патоморфоз второй степени, у 1 больной – патоморфоз 4 степени. Нами оценены следующие интратуморальных лимфоцитов: иммунологические показатели 65 Общий уровень лимфоидной инфильтрации – количество CD45+ лимфоцитов по отношению к общему числу событий, набранных при проточной цитометрии. Процент зрелых Т-лимфоцитов (CD3+) среди лимфоцитов (CD45+). Процент зрелых CD4+CD3+ T-лимфоцитов. Процент зрелых T-цитотоксических лимфоцитов CD3+CD8+ Соотношение CD8/CD4 Процент активированных (регуляторных) CD4+CD25+ клеток Процент NK-клеток – CD3-CD56+ Процент TNK клеток – CD3+CD56+ Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов по материалу исследования кор-биопсии рака молочной железы (до назначения полиоксидония) и удаленной опухоли (после назначения полиоксидония) представлен в предыдущем разделе. Сравнительная оценка субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов, выделенных из удаленной опухоли, представлена в таблице 3. Группа изученных опухолей, представленная в таблице 3, была неоднородна: у 20 больных исследование проводилось после применения полиоксидония, у 17 -полиоксидоний в неоадъювантном режиме не применяли. Сравнение этих групп больных представлено в таблице 3.14 Ни по одному из изученных показателей нами не установлено различий между группами больных, получавших полиоксидоний и не получавших данный препарат. 66 Таблица 3.14 Сравнительная характеристика субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов у больных, получавших и не получавших полиоксидоний в неоадъювантном режиме Маркер, CD CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Процент лимфоцитов Полиоксидоний Кол-во больных Средний процент + + + + + + + + - 17 19 16 19 16 19 16 19 9 19 16 18 16 18 17 20 84,89 87,87 47,14 43,76 46,39 44,90 1,24 1,02 4,35 3,41 4,11 3,28 1,94 1,27 2,32 3,22 Стд. ошибка среднего 1,87 1,18 3,11 2,10 3,86 1,78 0,21 8,33 0,77 0,41 1,43 0,56 0,42 0,27 1,60 0,95 р 0,18 0,36 0,72 0,30 0,25 0,58 0,18 0,62 При расширении группы сравнения, при объединении всех первичных больных раком молочной железы (37 пациенток) достоверных различий также не получено, таблица 3.15. Как видно из представленных данных, субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов после применения полиоксидония не отличался от субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы, которым полиоксидоний не назначали. 67 Таблица 3.15 Сравнение субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы после применения полиоксидония с составом этих клеток у больных без применения полиоксидония Маркер, CD Кол-во Полиоксидоний больных CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Процент лимфоцитов + + + + + + + + - Средний процент 19 36 19 35 19 35 19 35 19 24 18 34 18 34 20 37 87,87 86,54 43,76 43,74 44,90 45,74 1,02 1,09 3,41 4,15 3,28 4,24 1,27 1,75 3,22 2,17 Стд. ошибка среднего 1,18 1,19 2,10 1,83 1,78 2,11 8,33 0,10 0,41 0,53 0,56 1,02 0,27 0,26 0,95 0,80 р 0,48 0,99 0,79 0,66 0,29 0,51 0,24 0,43 Наиболее убедительные данные относительно влияния полиоксидония на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов получены при непосредственном (по парном) сравнении данных материала кор-биопсии и удаленной опухоли тех же самых больных. Сравнение средних величин по вышеперечисленным показателям приведено в таблице 3.16. После лечения полиоксидонием у больных не отмечено по большинству изученных показателей достоверного увеличения или снижения процента интратуморальных лимфоцитов в опухолевой ткани (р>0,05). 68 Вместе с тем, уровни NK-клеток были достоверно более низкими после лечения полиоксидонием (р<0,05). Таблица 3.16 Сравнение средних показателей содержания различных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов до (материал кор-биопсии) и после (материал хирургически удаленной опухоли) проведения иммуномодулирующей терапии полиоксидонием Стд. Показатель Материал Среднее N ошибка Р среднего Кор-биопсия 88,02 19 1,50 CD3 0,92 Операция 87,87 19 1,18 Кор-биопсия 40,87 19 1,97 CD8 0,28 Операция 43,76 19 2,11 Кор-биопсия 45,18 19 2,24 CD4 0,92 Операция 44,90 19 1,78 Кор-биопсия 0,96 19 0,07 CD8/CD4 0,5 Операция 1,012 19 0,08 Кор-биопсия 4,03 15 0,72 CD4+CD25+ 0,30 Операция 3,20 15 0,45 Кор-биопсия 4,54 17 1,56 CD3+CD56+ 0,41 Операция 3,25 17 0,59 Кор-биопсия 1,68 17 0,33 CD3-CD56+ 0,029 Операция 1,16 17 0,26 Кор-биопсия 2,05 20 0,65 Процент 0,13 лимфоцитов Операция 3,22 20 0,95 Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в процессе применения иммуномодулятора полиоксидония у больных раком молочной железы Помимо оценки средних значений процентного содержания антигенпозитивных клеток в пуле тумор-инфильтрирующих лимфоцитов у больных раком молочной железы мы оценили динамику различных субпопуляций лимфоцитов. Если разница процента антиген-позитивных лимфоцитов в материале удаленной опухоли и материале кор-биопсии не превышала 5%, то это расценивалось как отсутствие изменений в уровнях экспрессии маркера. Если разница в процентах антиген-позитивных клеток в 69 материале кор-биопсии и удаленной опухоли превышала 5%, то это расценивалось как снижение уровней соответствующих антиген-позитивных клеток (более высокий процент в кор-биоптате) или их повышение (более высокий процент в материале удаленной опухоли). При анализе динамики CD8-позитивных клеток у 19 больных отсутствие изменений в проценте CD8+ лимфоцитов установлено в 3 случаях (15,8%), снижение – в 7 случаях (36,8%) и повышение – в 9 случаях (47,4%). При этом уровни снижения процента CD8+ лимфоцитов были, как правило, незначительными – от 5,9% до 10,79%. Уровни повышения CD8+ клеток были более высокими – от 6,1% до 22,28%. В двух случаях отмечено повышение CD8+ клеток на 19,93 и 22,28%. В качестве примера приводим наблюдение (больная К.) на рисунке 6. А. Материал кор-биопсии (до полиоксидония) Б. Материал удаленной опухоли (после поликсидония) Рис. 6. Пример существенного возрастания лимфоцитов после лечения полиоксидонием (больная К.) процента CD8+ 70 Этот пример отчетливо показывает возможность резкого повышения процента CD8+ интратуморальных лимфоцитов в процессе применения иммуномодулятора полиоксидония. Интересно отметить, что уровень лимфоцитов в данном случае также нарастал с 1,3% до 2,4%. Цитотоксический индекс CD8/CD4 увеличился почти в 2 раза – с 1,17 до 2,27. Несомненно, подобная динамика изменений, расцениваемая с позиций наших знаний о субпопуляционном составе интратуморальных лимфоцитов, может считаться положительной. Анализ диагностике взаимосвязи и между характером цитотоксическим изменений процента индексом CD8+ при лимфоцитов представлен в таблице 3.17. Таблица 3.17 Взаимосвязь между цитотоксическим индексом и изменением CD8+ лимфоцитов снижение Динамика CD8 без изменений повышение Итого Частота % в столбце Частота % в столбце Частота % в столбце Частота % в столбце Уровень CD8/CD4 <1 >=1 2 5 20,0% 55,6% 3 0 30,0% ,0% 5 4 50,0% 44,4% 10 9 100,0% 100,0% Итого 7 36,8% 3 18,8% 9 56,3% 19 100,0% χ2 – 4,4; р=0,11 Как видно, взаимосвязи изменений CD8 в зависимости с исходным цитотоксическим индексом не установлено, р=0,11. Повышение процента CD8+ клеток отмечено в 55,6% случаев при низком исходном цитотоксическом индексе (менее 1) и в 44,4% случаев с индексом более 1. 71 Аналогичным образом оценили динамику содержания CD4+ лимфоцитов. Следует отметить, что изменения были разнонаправленными: снижение процента CD4+ клеток отмечено в 5 случаях (26,3%), в 8 случаях (42,1%) процент CD4 клеток практически не изменялся, в 6 наблюдениях отмечено повышение процентного содержания CD4+ лимфоцитов (31,6%). В случаях снижения процента CD4 клеток диапазон изменений был от 10,37% до 20,57%, причем в 2 случаях отмечены высокие проценты отличий – 19,85% и 20,57%. Кор-биопсия Удаленная опухоль Рис. 7. Пример снижения уровней интратуморальных CD4+ лимфоцитов в процессе иммунотерапии полиоксидонием (больная К-о). Сходные данные по снижению процента интратуморальных CD4+ клеток можно видеть на рисунке 8. 72 Кор-биопсия Удаленная опухоль Рис. 8. Пример снижения уровней интратуморальных CD4+ лимфоцитов в процессе иммунотерапии полиоксидонием (больная М-а). Эти примеры наглядно свидетельствуют о возможности снижения интратуморальных CD4+ клеток в процессе применения иммуномодулятора полиоксидония у больных раком молочной железы в неоадювантном режиме. Повышение процента CD4+ клеток наблюдали в 6 случаях: от 7,2% до 19,74%. На рисунке 9 приведен пример повышения процента CD4+ интратуморальных лимфоцитов. Как видно в последнем примере, уровни лимфоцитарной инфильтрации были низкими – 0,15% в материале кор-биопсии и 0,1% в хирургически удаленной опухоли. 73 Кор-биопсия Удаленная опухоль Рис. 9. Пример повышения уровней интратуморальных CD4+ лимфоцитов в процессе иммунотерапии полиоксидонием (больная Ч-а). Характеристика клинико-иммунологических особенностей больных раком молочной железы, у которых применение полиоксидония вело к индукции апоптоза опухолевых клеток Одним из интересных свойств полиоксидония явилась индукция патоморфоза клеток рака молочной железы. Этот феномен наблюдали у 6 из 20 пациенток (30%). Некоторые характеристики больных данной группы представлены в таблице 3.18. Как видно, в наблюдаемой группе преобладали больные IIб и IIIа стадий. Каких-либо взаимосвязей с размером опухоли, гистологическим типом и вовлеченностью регионарных лимфатических узлов не отмечено. 74 Таблица 3.18 Клинико-иммунологическая характеристика пациенток, у которых наблюдался патоморфоз опухолевых клеток после введения полиоксидония №пп Стадия рТ N Гистол. вариант Степень патоморфоза 1 IIб 2 1 ИПР 4 2 IIIа 2 2 ИПР 1 3 IIIа 2 1 ИДР 1 4 IIб 2 0 ИПР 2 5 I 1 0 ИПР 1 6 IIIа 2 2 ИПР 2 Мы оценили особенности рецепторного статуса, экспрессии Her2/neu, степени злокачественности опухоли и пролиферативного индекса у больных с выявленным патоморфозом опухолевой ткани, таблица 3.19. Таблица 3.19 Особенности рецепторного статуса, экспрессии Her2/neu, степени злокачественности опухоли и пролиферативного индекса у больных с выявленным патоморфозом опухолевой ткани №пп Рецепторы эстрогенов Рецепторы прогестерона HER2/neu Ki-67 1 0 0 0 75 2 7 5 1 28 3 3 5 0 18 4 7 0 3 31 5 7 6 0 26 6 0 0 2 20 Как видно, больная, у которой наблюдалась 4-ая степень патоморфоза опухолевой ткани, имела стадию IIб и очень высокий уровень пролиферативного индекса. Приводим описание данного случая. У больной 32 лет при маммографическом исследовании с УЗИ в нижне-наружном квадранте левой молочной железы обнаружено образование размером 3,0 х 3,4 см. В обеих аксиллярных зонах – гиперплазированные лимфатические узлы размерами до 1,0–1,5 см. При корбиопсии опухолевой ткани получено гистологическое заключение 75 «небольшие фрагменты ткани молочной железы с разрастаниями инфильтративного протокового рака 2-й степени злокачественности». В таблицах приведены данные рецепторного статуса и пролиферативного индекса, полученные при исследовании материала корбиопсии. Поставлен диагноз «рак левой молочной железы Т2N1M0, IIб стадия. Больная получала курс лечения полиоксидонием по описанной выше схеме (1-3, 5, 7 дни по 12 мг внутримышечно). На следующий день после последнего введения полиоксидония выполнена операция в объеме радикальной мастэктомии. Макроописание удаленной опухоли. Молочная железа 25х21х6 см с регионарной клетчаткой. Кожа и сосок без видимых изменений. На разрезе в ткани молочной железы, в нижнем наружном квадранте участок уплотнения 6х5,5х5 см с нечеткими границами, представленный участками распадающейся серовато-желтой ткани, очагами темно-красного цвета с разрастаниями белесоватой ткани. На остальном протяжении ткань молочной железы представлена широкими прослойками белесоватой ткани и дольками жира. В регионарной клетчатке 16 лимфоузлов 0.5-1 см по длиннику, с жировым перерождением. Отдельно: – "подключичные лимфоузлы", в салфетке, перевязанной капроном, фрагмент клетчатки с 3мя узелками 0.5-1 см по длиннику, серого цвета. "Подмышечные лимфоузлы" - 3 узелка 0.5-1 см по длиннику, серого цвета, эластичной консистенции.1. Опухоль. 2. Сосок, ткань железы вне опухоли. 3. Лимфоузлы регионарной клетчатки. 4. Подключичные лимфоузлы. 5. Подмышечные лимфоузлы. Микроскопическое описание: в молочной железе в области макроскопически описанных изменений обширные очаги выраженной полиморфноклеточной воспалительной рассасывания инфильтрации инородных с многоядерными тел, гистицитозом, клетками типа формированием неспецифических гранулем. Достоверных признаков опухолевого роста не обнаружено. С учетом результатов гистологического исследования № 23127/12, вышеописанные изменения можно трактовать как признаки 76 полного лечебного патоморфоза опухоли. В ткани молочной железы на остальном протяжении эктазия протоков. Сосок и кожа обычного строения. Во всех лимфатических узлах регионарной клетчатки – признаки реактивной гиперплазии, липоматоз. Этот пример уникален и достаточно доказателен, поскольку диагноз рака, морфологический вариант опухоли, рецепторный статус, степень злокачественности и пролиферативный индекс были установлены по материалу кор-биопсии до проведения лечения полиоксидонием. Мы сравнили уровни пролиферативного индекса опухолевых клеток у больных с явлениями лечебного патоморфоза и у больных, у которых не наблюдалось лечебного патоморфоза после лечения полиоксидонием. При наличии патоморфоза уровни пролиферативного индекса составили 33,0±8,6%, при отсутствии – 35,8±5,5%, различия не достоверны, р=0,76. У всех 6 больных, у которых отмечен лечебный патоморфоз опухоли, иммунологическое исследование интратуморальных лимфоцитов проводилось дважды – до назначения полиоксидония по материалу корбиопсии и после лечения полиоксидонием по материалу удаленной опухоли. Эти данные суммированы в таблице 3.20. Таблица 3.20 Динамика субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в ходе лечения полиоксидонием (больные, у которых отмечен патоморфоз опухолевой ткани) CD3 (%%) CD4 (%%) CD8 (%%) CD8/CD4 Пациент после после после после до п/о до п/о до п/о до п/о п/о п/о п/о п/о 1 87,3 88,5 46,6 55,4 42,2 32,7 0,9 0,6 2 93,8 87,9 49,5 51,5 51,4 33,0 1,0 0,6 3 94,2 88,0 50,0 49,5 36,0 34,5 0,7 0,7 4 81,4 83,4 52,0 52,8 29,0 41,4 0,6 0,8 5 81,4 82,7 42,9 54,6 32,0 45,5 0,8 0,8 6 89,4 88,5 44,5 41,6 57,4 49,6 1,3 1,2 Отмечено незначительное снижение Т-клеток (CD3), CD8+ цитотоксических лимфоцитов и цитотоксического индекса CD8/CD4. В то же 77 время уровни CD4+ лимфоцитов несколько повышались. При по парном сравнении этих показателей, различия во всех случаях были недостоверны. Наиболее близкие к достоверности данные получены для CD4+ лимфоцитов, средние по кор-биопсии 47,6±1,4%, по материалу хирургически удаленной опухоли – 50,9±2,0%. Не установлено различий при по парном сравнении процентного содержания NK-клеток, TNK-клеток, CD4+CD25+ лимфоцитов в материале кор-биопсии и удаленной опухоли в группе пациенток, у которых отмечены явления патоморфоза опухоли после назначения полиоксидония. Мы сравнили уровни процентного содержания различных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы при наличии и отсутствии лечебного патоморфоза (табл. 3.21). Таблица 3.21 Сравнение исходных уровней (по материалу кор-биопсии) процентного содержания различных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы при наличии и отсутствии лечебного патоморфоза Популяция клеток, Стд. ошибка Патоморфоз N Среднее Р CD среднего нет 10 87,71 2,55 CD3 0,96 есть 6 87,91 2,32 нет 10 40,83 2,53 CD8 0,92 есть 6 41,32 4,57 нет 10 41,51 3,68 CD4 0,24 есть 6 47,57 1,43 нет 10 1,06 0,10 CD8/CD4 0,28 есть 6 0,88 0,11 нет 9 3,49 0,94 CD4+CD25+ 0,64 есть 3 4,43 1,92 нет 10 2,52 0,62 CD3+CD56+ 0,18 есть 5 7,58 5,13 нет 10 1,95 0,44 CD3-CD56+ 0,57 есть 5 1,48 0,68 нет 11 1,92 0,78 Процент лимфоцитов 0,83 есть 6 1,64 0,99 К сожалению, на основании исходного содержания клеток той или иной субпопуляции было невозможно прогнозировать результат действия 78 полиоксидония. Достоверных различий между больными, у которых был получен лечебный патоморфоз, и больными, у которых подобного эффекта не наблюдалось, не выявлено. Мы сравнили субпопуляционный состав лимфоцитов удаленной опухоли в этих двух группах больных (с наличием и отсутствием патоморфоза), таблица 3.23. Таблица 3.23 Сравнение процентного содержания различных субпопуляций интратуморальных лимфоцитов после лечения полиоксидонием больных раком молочной железы при наличии и отсутствии лечебного патоморфоза (по материалу удаленной опухоли) Популяция клеток, CD Патоморфоз N Среднее нет есть нет есть нет есть нет есть нет есть нет есть нет есть нет есть 10 6 10 6 10 6 10 6 10 6 9 6 9 6 11 6 88,49 86,51 45,97 39,46 40,89 50,91 1,17 0,79 3,89 3,13 2,82 4,18 1,46 1,19 2,90 1,76 CD3 CD8 CD4 CD8/CD4 CD4+CD25+ CD3+CD56+ CD3-CD56+ Процент лимфоцитов Как видно из представленных Стд. ошибка среднего 2,003 1,11 3,41 2,91 2,26 2,05 0,13 0,09 0,68 0,56 0,90 0,94 0,43 0,48 0,95 0,82 данных, только Р 0,48 0,21 0,006 0,03 0,4 0,33 0,7 0,44 показатели интратуморальных лимфоцитов имеют связь с патоморфозом опухоли после терапии полиоксидонием – уровень интратуморальных Т-хелперов 79 (CD3+CD4+) и соотношение CD8/CD4 в опухолевой ткани. Уровень CD4+ лимфоцитов в случаях наличия патоморфоза выше, чем в группе сравнения (без патоморфоза). Именно это, также как и более низкое (не достоверно) количество CD8+ лимфоцитов в опухолевой ткани при наличии патоморфоза отражается на соотношении CD8/CD4 интратуморальных лимфоцитов, которое значимо снижается. Эти данные находятся в некотором противоречии с предсказываемой ролью в последние годы интратуморальных Т-лимфоцитов [75, 162]. Согласно данным этих авторов, в однофакторном анализе выраженная инфильтрация опухолевой ткани рака молочной железы CD8+ лимфоцитами является одним из главных факторов благоприятного прогноза, определяющим лучшие показатели общей и безрецидивной выживаемости. CD4+ лимфоциты в однофакторном анализе не влияют на прогноз, но ухудшают выживаемость за счет стимуляции макрофагов цитокинами, продуцируемыми Th1+ клетками. В более ранних работах онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина также была установлена благоприятная роль CD8+ клеточной инфильтрации в прогнозе рака молочной железы, в особенности, в случаях отсутствия регионарных метастазов – N0 [4]. При этом случаи выраженной характеризовались более CD4+ Т-клеточной благоприятным инфильтрации прогнозом также (различия не достоверны) в сравнении с пациентами без подобной инфильтрации. Логично считать, что Т-клеточная помощь в этих случаях необходима для осуществления противоопухолевого эффекта CD8+ Т-цитотоксических лимфоцитов. Следует отметить, что работы как американских, так и российских ученых иммуногистохимическим осуществлялись методом оценки полуколичественным, содержания субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в опухолевой ткани. Применение проточной цитометрии, является несомненно, более точным количественным подходом, позволяющим охарактеризовать уровни и субпопуляциями лимфоцитов в опухолевой ткани. соотношения между 80 Проиллюстрируем наиболее наглядные данные на примере, рисунок 10. А Б Рис. 10. Больная Б-а. CD4+ Т-клетки до (А) и после (Б) лечения полиоксидонием. Нарастание процента CD4-позитивных Т-клеток (CD3+) на 11%. Критерии эффективности неоадъювантной иммуномодулирующей терапии полиоксидонием у больных раком молочной железы Мы применили непараметрические критерии для 3-независимых выборок для оценки действия препарата полиоксидоний. По каждой изученной субпопуляции интратуморальных лимфоцитов сравнение проведено в трех группах больных: отсутствие изменений, возрастание процента соответствующих клеток, снижение процента этих клеток. В качестве исходного уровня процентного содержания лимфоцитов различных субпопуляций использовали данные, полученные при анализе материала кор-биопсии опухоли до проведения иммунотерапии. Интратуморальные CD8+ лимфоциты. Согласно всем трем критериям (Н Крускала-Уоллеса, медианному и Джонкхира-Терпстры), исходные значения уровней интратуморальных CD8+ лимфоцитов в трех сравниваемых группах достоверно различались, р= 0,02, 0,036 и 0,004 соответственно. Рассмотрим полученные данные на примере медианного критерия, таблица 3.24. 81 Таблица 3.24 Взаимосвязь динамики CD8+ интратуморальных лимфоцитов под действием полиоксидония с исходными уровнями CD8+ клеток в материале кор-биопсии Маркер CD8 Исходный уровень снижение > медианы 6 (67%)* <= медианы 1 (10%) Динамика CD8 без изменений повышение 1 (11%) 2 (22%) 2 (20%) 7 (70%) *Процент в строке Как видно, препарат, действительно, характеризовался иммуномодулирующим действием. Полиоксидоний снижал уровни (процент) CD8+ клеток в 67% случаев при исходных значениях выше медианы (медиана - 40,78%) и лишь в 10% случаев – при исходных значениях ниже или равняющихся медиане. Напротив, повышение процента CD8+ лимфоцитов отмечено в 70% случаев при их исходном значении не более медианы и лишь в 22% (2 из 9) при исходном значении выше медианы. Исходя из существующих представлений о прогностической роли CD8+ лимфоцитов при раке молочной железы, можно предполагать, что назначение препарата с целью иммунокоррекции противоопухолевого иммунитета показано пациенткам с количеством CD8+ интратуморальных лимфоцитов менее 41%. В этих случаях у 70% больных уровни CD8+ возрастают, что с точки зрения долгосрочного прогноза является благоприятным признаком. Мы оценили, насколько динамика CD8+ лимфоцитов под действием полиоксидония ассоциируется с непосредственным эффектом иммунотерапии, то есть индукцией патоморфоза опухолевой ткани, таблица 3.25. 82 Таблица 3.25 Взаимосвязь динамики интратуморальных CD8+ лимфоцитов с индукцией иммунологически опосредованного патоморфоза есть/ нет нет есть Признак Патоморфоз снижение 4 (31%)* 3 (50%) Динамика CD8 без изменений 2 (11%) 1 (17%) повышение 7 (54%) 2 (33%) *Процент в строке Как видно из таблицы, достоверной связи динамики интратуморальных CD8+ лимфоцитов с индукцией патоморфоза опухолевой ткани под действием полиоксидония не наблюдалось, р=0,68. Более того, у половины больных с наличием патоморфоза (3 из 6) данный феномен наблюдался на фоне снижения уровней интратуморальных CD8+ лимфоцитов. Интратуморальные CD4+ лимфоциты. Согласно всем трем критериям (Н Крускала-Уоллеса, медианному и Джонкхира-Терпстры), исходные значения уровней CD4+ лимфоцитов в трех сравниваемых группах достоверно различались, р= 0,022, 0,016 и 0,004 соответственно. Рассмотрим полученные данные на примере медианного критерия, таблица 3.26. Таблица 3.26. Взаимосвязь динамики CD4+ интратуморальных лимфоцитов под действием полиоксидония с исходными уровнями CD4+ клеток в материале кор-биопсии Маркер CD4 Исходный уровень > медианы <= медианы снижение 4 (44%)* 1 (10%) Динамика CD4 без изменений повышение 5 (56%) 0 (0%) 3 (30%) 6 (60%) *Процент в строке Как видно, препарат, действительно, характеризовался иммуномодулирующим действием на уровни интратуморальных CD4+ клеток. Полиоксидоний снижал уровни (процент) CD4+ клеток в 40% случаев 83 при исходных значениях выше медианы (медиана - 47,06%) и лишь в 25% случаев – при исходных значениях ниже или равняющихся медиане. Напротив, повышение процента CD4+ лимфоцитов отмечено в 60% случаев при их исходном значении ниже медианы и не наблюдалось в 0% (0 из 9) при исходном значении выше медианы. Исходя из существующих представлений о прогностической роли CD4+ лимфоцитов при раке молочной железы, можно было бы предполагать, что назначение препарата с целью иммунокоррекции противоопухолевого иммунитета показано пациенткам с количеством CD4+ интратуморальных лимфоцитов более 47%. Однако с этим не согласуются непосредственные результаты иммунотерапии полиоксидонием. Мы оценили, насколько динамика CD4+ лимфоцитов под действием полиоксидония ассоциируется с непосредственным эффектом иммунотерапии, то есть индукцией патоморфоза опухолевой ткани, таблица 3.27. Таблица 3.27 Взаимосвязь динамики интратуморальных CD4+ лимфоцитов с индукцией иммунологически опосредованного патоморфоза Признак Патоморфоз есть/ нет нет есть снижение 5 (38%)* 0 (0%) Динамика CD4 без изменений 4 (31%) 4 (67%) повышение 4 (31%) 2 (33%) *Процент в строке Как видно из таблицы, достоверной связи динамики интратуморальных CD4+ лимфоцитов с индукцией патоморфоза опухолевой ткани под действием полиоксидония не наблюдалось, р=0,17. Более того, ни у одной из больных с наличием патоморфоза (0 из 6) данный феномен не наблюдался на фоне снижения уровней интратуморальных CD4+ лимфоцитов в процессе иммунотерапии. 84 Таким образом, иммуномодулирующее полученные действие нами данные полиоксидония на подтверждают субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы: снижение уровней иммунокомпетентных клеток при их исходно высоком значении и повышение – при исходно низких показателях. Обычно иммуномодулирующее действие расценивается как благоприятный факт, своего рода приведение уровней тех или иных субпопуляций лимфоцитов к нормальным значениям, свойственным донорской группе. Однако при раке молочной железы мы не можем говорить о норме, сравнение проводилось с уровнем лимфоцитов равным медиане по группе пациенток. Поэтому, говорить о том, какое клиническое значение будет иметь снижение (в случаях исходно высоких значений) или повышение (в случаях исходно низких значений) процента клеток среди лимфоцитов на материале наших исследований не представляется возможным. Можно лишь подтвердить иммуномодулирующее действие препарата на субпопуляции интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы. 85 ОБСУЖДЕНИЕ Роль иммунной системы в прогнозе рака молочной железы длительное время недооценивалась. Внимание исследователей и врачей было сосредоточено на клинически значимых биологических особенностях опухолевых клеток – наличии рецепторов эстрогенов и прогестерона, пролиферативном индексе опухолевых клеток, гиперэкспрессии белка HER2/neu [24]. Важное значение в прогнозе операбельного рака молочной железы имеют циркулирующие в крови и диссеминированные в костном мозге опухолевые клетки [58, 133], однако, этот признак пока не используется повсеместно в клинике из-за отсутствия селективных методов эрадикации микрометастазов. Интратуморальные лимфоциты или тумор-инфильтрирующие лимфоциты (ТИЛ) – это клетки иммунной системы, находящиеся в опухоли и непосредственно контактирующие с раковыми клетками. В ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» РАМН исследования этих клеток проводятся на протяжении нескольких лет [4, 31]. Охарактеризованы уровни инфильтрации рака молочной железы различными субпопуляциями лимфоцитов и макрофагов, установлена взаимосвязь уровней местной (внутриопухолевой) иммунной реакции с иммунофенотипическими особенностями раковых клеток [4]. Детальный иммуноморфологический анализ на тканевом уровне позволил выделить 2 основных типа интратуморальных лимфоцитов – туморпенетрирующие лимфоциты, то есть клетки, проникающие непосредственно в зоны сплошного опухолевого роста, и лимфоциты, находящиеся в стромальных прослойках опухоли [199]. Предложены методы количественной характеристики и оценки активации этих клеток. При длительном наблюдении (7 – 15 лет) за больными после радикального хирургического лечения показано, что высокий уровень инфильтрации опухоли цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD8+) является важным 86 фактором благоприятного прогноза, в особенности, у пациенток, не имеющих метастазов в регионарные лимфатические узлы - N0 [1]. Работами Университета Калифорнии (США) доказано, что инфильтрация опухолевой ткани рака молочной железы цитотоксическими лимфоцитами (CD8+) является фактором благоприятного прогноза, а выраженная инфильтрация CD4+ лимфоцитами и макрофагами, напротив, ухудшает прогноз [75, 162]. Существует единство мнений относительно благоприятной роли в прогнозе инфильтрации лимфоцитами (CD8+), рака однако, молочной железы возможность цитотоксическими влиять на уровни интратуморальной иммунной реакции до настоящего времени практически не изучалась. А.А.Субботиной с соавторами [27] иммуногистохимическим методом изучены уровни интратуморальных лимфоцитов в ткани рака молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии. Показано, что ответ на неоадъювантную химиотерапию (степень патоморфоза) во многом зависит от иммунофенотипических особенностей опухоли и выраженности Т-клеточной инфильтрации. По данным Ruffel B. [162] большинство интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы у не леченых больных представлены активированными Т-клетками. Напротив, неоадъювантная химиотерапия приводит к усилению инфильтрации опухоли миелоидными клетками и снижает уровни Тн2-лимфоцитов. Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы имеет важное клиническое значение. При операбельном раке на основании этих данных возможно выделение групп пациенток с благоприятным и неблагоприятным прогнозом [4, 1, 31, 75, 162]. Это может являться основанием для расширения показаний для иммунологических исследований, их проведения на этапе диагностики по материалу кор-биопсии, так же как это делается для морфологической верификации диагноза, определения рецепторов эстрогенов и прогестерона, экспрессии HER2/neu и пролиферативного индекса Ki-67. 87 Роль изучения интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы была подтверждена иммуногистохимией и проточной цитометрией на материале хирургически удаленной опухоли [4, 1, 27, 31, 75, 162]. Исследования кор-биопсии не нашли широкого применения, так как считается, что материала, получаемого при кор-биопсии, недостаточно для иммунологического анализа. Вместе с тем, именно данные, получаемые при кор-биопсии, могли бы быть использованы для планирования и проведения лечебных мероприятий (химиотерапия, иммунотерапия) в неоадъювантном режиме у больных с неблагоприятным прогнозом. В работе Н.А.Субботиной и соавторов [27] показано, что иммуногистохимический анализ материала кор-биопсии с использованием люминисцентной микроскопии позволяет в полной мере охарактеризовать субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов. Вместе с тем, иммуногистохимическая оценка позволяет оценить уровни интратуморальных лимфоцитов лишь полуколичественно, что является менее точным при оценке динамики изменений после проведенного лечения. Прогностическая роль субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы также достаточно хорошо известна. При однофакторном принадлежит CD8+ анализе главенствующая лимфоцитам [1]. В прогностическая отсутствие роль выраженной инфильтрации рака молочной железы CD8+ клетками CD4+ лимфоциты способствуют опухолевой инвазии и развитию отдаленных метастазов рака молочной железы путем влияния на протуморальную активность опухолеассоциированных макрофагов [74]. Совокупность этих данных позволила предположить, что три клеточных типа – CD4+ и CD8+ лимфоциты, а также CD68+ макрофаги – могут играть главную роль в прогнозе рака молочной железы. При анализе общей выживаемости 179 больных раком молочной железы высокие уровни CD4+ лимфоцитов ухудшали прогноз (р=0,032), так же как и низкие уровни CD8+ клеток (р=0,012). При этом плотность макрофагов в опухолевых срезах не влияла на 88 прогноз [75]. Следует отметить, однако, что выраженная макрофагальная инфильтрация опухоли, как правило, ассоциировалась с низкой реакцией CD8+ лимфоцитов. На основании этих данных предложена трехмаркерная иммунная сигнатура для более точной оценки прогноза у больных раком молочной железы [75]. Иммунный профиль CD68LowCD4LowCD8High характерен для первичного рака молочной железы, который даже в случаях только хирургического лечения, характеризуется высокими показателями общей и безрецидивной выживаемости. Напротив, иммунные ответы CD68HighCD4HighCD8Low соответствуют группе больных с риском развития отдаленных метастазов и сниженной выживаемостью. В нашей работе впервые для оценки количественных взаимоотношений между субпопуляциями интратуморальных лимфоцитов применен метод 4цветной проточной цитометрии. Установлено, что среди интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы преобладают зрелые Т-клетки (CD3+), их субпопуляции CD4 и CD8 находятся в примерно равных количествах. Выявлены низкие уровни NK-клеточной инфильтрации рака молочной железы, что соответствовало данным зарубежных авторов [162]. Мы изучили влияние полиоксидония, применяемого в неоадъювантном режиме, на состав интратуморальных лимфоцитов при раке молочной железы. Полиоксидоний является синтетическим иммуномодулятором, влияющим преимущественно на клетки врожденного иммунитета. Иммуномодулирующие свойства полиоксидония являются основанием для его применения без предварительной оценки иммунного статуса. Вместе с тем, изучение субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов в процессе лечения полиоксидонием может способствовать отбору групп больных, у которых применение препарата наиболее обоснованно. Режим введений полиоксидония был разработан совместно с НПО «Петровакс». Внутримышечное введение препарата в дозе 12 мг хорошо переносилось больными. Интересно отметить, что у 6 из 20 больных (30%) после применения полиоксидония в неоадъювантном режиме отмечен 89 патоморфоз опухолевой ткани. В одном из этих случаев он расценен как патоморфоз 4 степени, то есть опухолевые клетки отсутствовали. Подобные изменения было бы трудно трактовать как доказательные без предварительной верификации диагноза. Именно поэтому, у всех больных раком молочной железы, которым в неоадъювантном режиме применялась иммунотерапия полиоксидонием верификация диагноза осуществлялась на основании морфологического изучения опухолевой ткани, полученной методом кор-биопсии. Следует отметить, что явления патоморфоза опухоли никогда не наблюдаются у пациенток, не получавших неоадъювантную полихимиотерапию, а в наших наблюдениях частота патоморфоза составила Несомненно, 30%. механизм данного явления является иммуно- опосредованным и требует дальнейшего детального изучения. Основное внимание в работе было уделено динамике субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в процессе неоадъювантной иммуномодулирующей терапии полиоксидонием. Наблюдаемые изменения в целом можно характеризовать как позитивные. При неизменном проценте зрелых Т-клеток в опухоли (CD3+) отмечено перераспределение субпопуляций лимфоцитов – снижение или повышение CD4+ лимфоцитов и разнонаправленные изменения процентного содержания CD8+ лимфоцитов. Отмечено некоторое нарастание общего уровня лимфоидной инфильтрации опухоли. Вместе с тем процент ЕК-клеток снижался. Оценить клиническое значение данного феномена сложно, так как уровни ЕК-клеточной инфильтрации опухоли очень низкие. Взаимоотношения между NK-клетками и CD8+ лимфоцитами при опухолях недостаточно изучены. Не ясно, какую роль при раке молочной железы играют регуляторные NK-клетки, способные подавлять цитотоксические CD8+ лимфоциты при инфекционной патологии [110]. Снижение уровней NK-клеток в ходе терапии полиоксидонием отмечено и другими авторами. Так, у более чем 30% больных раком молочной железы в ходе применения полиоксидония при неоадъювантной химиотерапии отмечено снижение пропорции CD16+ лимфоцитов 90 периферической крови [18]. На сегодняшний день нет стандартов интратуморального иммунного статуса у больных раком молочной железы. Поэтому трактовать подобные изменения сложно. Наши данные дают дополнительную строго количественную информацию относительно того, какой состав интратуморальных лимфоцитов в большей степени ассоциирован с благоприятным прогнозом. Попарное сравнение субпопуляций лимфоцитов в опухолевой ткани до и после применения полиоксидония является достаточно информативным. Вместе с тем, в настоящее время мы проводим индивидуальный анализ динамики интратуморальных лимфоцитов у каждого пациента с выделением групп больных с выраженным повышением CD8+ лимфоцитов или снижением CD4+ лимфоцитов. Информативной будет оценка этих изменений с клинических позиций. Кроме того, важно помнить, что даже нарастание уровней CD8+ интратуморальных лимфоцитов будет бесполезным с точки зрения противоопухолевой защиты у пациентов с утратой экспрессии на злокачественных клетках молекул гистосовместимости I класса (HLA–I). Поэтому дальнейшие исследования целесообразно проводить с учетом экспрессии молекул HLA на клетках рака молочной железы. Интересно отметить, что у больных с наиболее выраженным эффектом – наличием апоптоза опухолевой ткани после применения полиоксидония – уровни CD4+ Т-лимфоцитов возрастали. Эти данные находятся в некотором противоречии с предсказываемой в последние годы ролью интратуморальных Т-лимфоцитов [75, 162]. Согласно результатам этих авторов, в выраженная инфильтрация опухолевой ткани рака молочной железы CD8+ лимфоцитами является одним из главных факторов благоприятного прогноза, определяющим лучшие показатели общей и безрецидивной выживаемости. CD4+ лимфоциты в однофакторном анализе не влияют на прогноз, но ухудшают выживаемость за счет стимуляции макрофагов цитокинами, продуцируемыми Th1+ клетками. В более ранних работах онкологического научного центра имени Н.Н.Блохина также была 91 установлена благоприятная роль CD8+ клеточной инфильтрации в прогнозе рака молочной железы, в особенности в случаях отсутствия регионарных метастазов - N0 [4]. При этом случаи выраженной CD4+ Т-клеточной инфильтрации также характеризовались более благоприятным прогнозом (различия не достоверны) в сравнении с пациентами без подобной инфильтрации. Логично считать, что Т-клеточная помощь в этих случаях необходима для осуществления противоопухолевого эффекта CD8+ Тцитотоксических лимфоцитов. американских, так и Следует отметить, российских ученых что работы как осуществлялись полуколичественным иммуногистохимическим методом оценки содержания субпопуляций интратуморальных лимфоцитов в опухолевой ткани. Применение проточной цитометрии, является несомненно, более точным количественным подходом, позволяющим охарактеризовать уровни и соотношения между субпопуляциями лимфоцитов в опухолевой ткани. Результаты нашей работы свидетельствуют о том, что стратегия иммунотерапии и иммунокоррекции при раке молочной железы не может быть основана на стремлении повысить или понизить относительное содержание того или иного типа интратуморальных Т-клеток. По-видимому, для реализации полноценного противоопухолевого иммунного ответа необходимо взаимодействие нескольких субпопуляций иммунокомпетентных клеток, также как это реализуется в ходе нормальных иммунных ответов, например, на вирусные антигены. Конечным результатом действия препарата должно быть усиление цитотоксического действия лимфоцитов на опухолевые клетки. Именно эти случаи могут служить основой для лимфоцитов. изучения эффективной композиции интратуморальных 92 ВЫВОДЫ 1. Интратуморальные лимфоциты рака молочной железы представлены в основном (86,5±1,2) зрелыми Т-лимфоцитами, с примерно равным содержанием Т-хелперов (CD4+) и Т-цитотоксических клеток (CD8+) – 45,7±2,1 и 43,7±1,8, соответственно, соотношение CD8/CD4 составляет 1,1. 2. NK-клетки и Т-регуляторные клетки (CD4+CD25+ лимфоциты) представляют незначительную фракцию среди интратуморальных лимфоцитов у больных раком молочной железы: NK-клетки – 1,8±0,3%, CD4+CD25+ клетки – 4,2±0,5%. 3. Исследования субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов рака молочной железы методом многопараметровой проточной цитометрии может проводиться по материалу кор-биопсии: результаты не отличаются от таковых, полученных при изучении хирургически удаленной опухоли. 4. Существуют определенные взаимосвязи между субпопуляционным составом интратуморальных лимфоцитов и клиническими характеристиками опухолевого процесса. Содержание CD3+ зрелых Т-клеток в опухоли достоверно более высокое при стадиях IIb-IIIс в сравнении со стадиями I-IIа (89,3±1,2% и 83,8±1,9%, р=0,016). Это обусловлено, в первую очередь, нарастанием CD3+ клеток при стадии IIb в сравнении со стадией IIа (91,3±0,8% и 84,2±2,6%, р=0,013). 5. Увеличение размера опухоли (Т2 в сравнении с Т1) сопровождается достоверным снижением (р=0,004) уровней интратуморальных TNK (CD3+CD56+) лимфоцитов. Возникновение регионарных метастазов (N1 в сравнении с N0) ассоциируется с достоверным возрастанием интратуморальных CD3+ лимфоцитов, а нарастание метастатического процесса (N2) характеризуется более высокими уровнями интратуморальных Т-киллеров (CD8) в сравнении с группой больных с индексом N1 (p=0,019). 93 6. Субпопуляционный состав интратуморальных лимфоцитов взаимосвязан с морфологическим вариантом опухоли: уровни Т-киллеров достоверно более высокие при инфильтративном протоковом раке в сравнении с инфильтративным дольковым раком: 45,6±2,1 и 35,9±3,1, p=0,027. 7. Применение полиоксидония в неоадъювантном режиме хорошо переносится больными, не имеет побочных эффектов и в 30% случаев приводит к патоморфозу опухолевых клеток. Степень выраженности патоморфоза – от 1 до 4. 8. Использование полиоксидония в неоадъювантном режиме не ведет к изменению субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов больных раком молочной железы по большинству субпопуляций. Достоверные различия отмечены для NK-клеток (р = 0,029), уровни которых после применения полиоксидония были более низкими. 9. Больные, у которых применение полиоксидония сопровождалось патоморфозом опухолевых клеток, не имели особенностей субпопуляционного состава интратуморальных лимфоцитов до применения иммуномодулятора (материал кор-биопсии), но характеризовались достоверно более высокой пропорцией интратуморальных CD4+ Т-клеток (р = 0,006) и более низким соотношением CD8/CD4 после иммунотерапии (р = 0,03). 10. Полиоксидоний обладает иммуномодулирующим действием на субпопуляции интратуморальных CD4 (p=0,016) и CD8-лимфоцитов (p=0,036), что характеризуется достоверным повышением уровней этих клеток при их исходно низких значениях и снижением – при исходно высоких значениях. 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Артамонова, Е.В. Роль иммунофенотипирования опухолевых клеток в диагностике и прогнозе рака молочной железы / Е.В. Артамонова // Иммунология гемопоэза. – 2009. – Т. 6, № 1. – С. 8-51. 2. Артамонова, Е.В. Иммунологическая микрогетерогенность рака молочной железы: автореф. дис... канд. мед наук: 14.01.12 / Артамонова Елена Вячеславовна. – М., 1992. – 28с. 3. Артамонова, Е.В. Роль иммунофенотипирования опухолевых клеток в диагностике и прогнозе рака молочной железы: дис… д-ра мед. наук: 14.01.12 / Артамонова Елена Вячеславовна. – М., 2003. – 311 с. 4. Артамонова, Е.В. Рак молочной железы: иммунологические факторы прогноза / Е.В. Артамонова, Н.А. Огнерубов, Н.Н. Тупицын и др. – Воронеж: Воронежский государственный университет, 2005. – 240 с. 5. Артамонова, Е.В. Результаты применения полиоксидония у больных раком молочной железы / Е.В. Артамонова, О.В. Короткова, Т.Н.Заботина и др. // Российский биотерапевтический журнал. –2005. – Т. 4, № 1. – С. 96-97. 6. Барышников, А.Ю. Моноклональные антитела в лаборатории и клинике / А.Ю. Барышников. – М.: ВНТИЦ, 1997. – 212 c. 7. Барышников, А.Ю. Моноклональные антитела серии ИКО к дифференцировочным антигенам человека / А.Ю. Барышников // Гематология и трансфузиология. – 1990. – № 8. – С. 4-7. 8. Билынский, Б.Т. Иммунологические механизмы естественной противоопухолевой резистентности / Б.Т. Билынский, Н.А. Володько, Я.В. Шпарик. – Киев: АН УССР. Ин-т пробл. онкологии им. Р.Е. Кавецкого, 1991. – 248 c. 9. Васильев, М.Б. Иммунофенотипическая характеристика рака молочной железы и ее клиническое значение: дис… канд. мед. наук: 14.01.12 / Васильев Михаил Борисович. – М., 2000. – 103 с. 10.Володько, Н.А. Местные клеточные иммунные реакции при раке молочной железы (клинико-иммуноморфологическое исследование): 95 автореф. дис... канд. мед. наук: 14.00.14 / Володько Наталья Александровна. – Киев, 1988. –18 с. 11.Гордина, Г.А. Иммуномодулятор полиоксидоний в комплексном лечении детей с гистиоцитозом из клеток Лангерганса и лимфомой Ходжкина / Г.А. Гордина, О.В. Короткова, А.В. Киселев // Иммунология. – 2005. – № 4. – С. 228-230. 12.Давыдов М.И. Статистика злокачественных новообразований в 2009 / М.И. Давыдов, Е.М. Аксель. – М., 2010. – 281 с. 13.Дьяконова, В.А. Изучение механизма действия иммуномодулятора Полиоксидония на клеточном и молекулярном уровнях на клетках периферической крови человека в условиях in vitro / В.А. Дьяконова, С.В. Дамбаева и др. // Физиология и патология иммунной системы. – 2004. – Т 8, № 2. – С. 32-36. 14.Кампова-Полевая Е.Б. Иммунология и иммунотерапия рака молочной железы / Е.Б. Кампова-Полевая, Н.А. Огнерубов. – Воронеж: Воронежский государственный университет, 1994. – 175 c. 15.Комарова, Л.Е. Влияние иммуномодулятора «Полиоксидоний» на качество жизни больных раком молочной железы, получающих адъювантную химиотерапию / Л.Е. Комарова, Л.В. Манзюк, Е.В. Артамонова и др. // Российский биотерапевтический журнал. – 2004. – Т. 3, № 3. – С.72-77. 16.Крохина, О.В. Микрометастазы рака молочной железы в костный мозг. Иммуноморфологическая диагностика: дис…канд. мед. наук: 14.00.14 / Крохина Ольга Владимировна. М., 2003. – 170 с. 17.Лавникова, Г.А. Некоторые закономерности лучевого патоморфоза опухолей человека и их практическое использование / Г.А. Лавникова // Вестн. АМН СССР. –1976. – № 6. – С.13-19. 18.Манзюк, Л.В. Результаты применения Полиоксидония у больных раком молочной железы / Л.В. Манзюк, Е.В. Артамонова, З.Г. Кадагидзе и др. // Лекарственные препараты и оборудование. – 2005. – № 11. – 43 c. 19.Монахов, А.С. Определение клинической и цитогенетической эффективности иммунотерапии полиоксидонием у больных с 96 меланомой кожи (предварительные результаты) / А.С. Монахов, В.В. Анисимов, А.С. Барчук // Иммунология. – 2005. – № 4. – С. 231-235. 20.Монахов, А.С. Определение эффективности иммунотерапии Полиоксидонием у больных меланомой кожи / А.С. Монахов, В.В. Анисимов, А.С. Барчук // Мир фармации и медицины. – 2005. – № 5. – С. 6-9. 21.Окулов, В.Б. Про- и противоопухолевые реакции макрофагов, активированных модификаторами биологического ответа / В.Б. Окулов, С.А. Громов, Б.О. Войтенко // I Всесоюзный иммунологический съезд, г. Сочи, 15-17 ноября 1989: тез. секц. и стенд. сообщ. – М.,1989. – Т.1. – С. 213-345. 22.Паниченко, А.В. Взаимосвязь иммунофенотипа рака молочной железы с распространенностью процесса по регионарным лимфоузлам: дис… канд. мед. наук: 14.00.14 / Паниченко Анна Владимировна. – М., 2002. – 142 с. 23.Пинегин, Б.В. Иммуномодулятор полиоксидоний: механизмы действия и аспекты клинического применения / Б.В. Пинегин, А.В. Некрасов, Р.М. Хаитов // Цитокины и воспаление. – 2004. – Т. 3, № 3. – С.41-47. 24.Семиглазов, В.Ф. Неоадъювантная системная терапия рака молочной железы / В.Ф. Семиглазов, А.Г. Манихас, Т.Ю. Семиглазова и др. – СПб.: Аграф, 2012. – 110 c. 25.Субботина, А.А. Анализ результатов неоадъювантного лечения больных с учетом иммунофенотипических особенностей рака молочной железы / А.А. Субботина, В.П. Летягин, Н.Н. Тупицын и др. // Опухоли женской репродуктивной системы. – 2008. – № 4. – C.31-34. 26.Субботина, А.А. Исследование опухолевого фенотипа в процессе индукционной химиотерапии первичного рака молочной железы / А.А. Субботина, В.П. Летягин, Н.Н. Тупицын и др. // Маммология. – 2006. – № 1. – C.77-79. 27.Субботина, А.А. Роль иммунофенотипирования рака молочной железы в процессе неоадъювантной химиотерапии / А.А. Субботина, В.П. 97 Летягин, Н.Н. Тупицын и др. // Иммунология гемопоэза. – 2009. – Т. 6, № 1. – С. 52-78. 28.Субботина, А.А. инфильтрации Взаимосвязь опухоли и между уровнями эффективностью лимфоидной неоадъювантной химиотерапии / А.А. Субботина, Н.Н. Тупицын, В.П. Летягин и др. // Маммология. – 2006. – № 4. – С.30-33. 29.Субботина, А.А. Взаимосвязь эффективности неоадъювантной химитерапии при раке молочной железы с уровнями лимфоидной инфильтрации опухоли / А.А. Субботина, Н.Н. Тупицын, В.П. Летягин и др. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях». – Барнаул, 2007. – 130 c. 30.Теплоухова, И.М. Возможные подходы к прогнозированию при раке молочной железы / И.М. Теплоухова, В.Д. Ермилова // Вестн. ВОНЦ АМН СССР. – 1991. – № 1. – С. 53-57. 31.Тупицын, Н.Н. Иммунофенотип рака молочной железы. / Н.Н. Тупицын; под ред. Н.Е. Кушлинского, С.М. Портного, К.П. Лактионова // Рак молочной железы. – М.: Изд-во РАМН, 2005. – С.174-197. 32.Тупицын, Н.Н. Cубпопуляции иммуноцитов в гистологических срезах рака молочной железы / Н.Н. Тупицын, Е.В. Артамонова, З.Г. Кадагидзе и др. // Вопросы онкологии. – 1994. – Т. 40, № 7-12. – С. 314-318. 33.Тупицын, Н.Н. Уровень специфических антител к углеводному антигену LeC понижен у больных раком молочной железы / Н.Н. Тупицын, О.Е. Галанина, Н.В. Бовин и др. // Иммунология. – 2008. – № 2. – С.31-33. 34.Феденко, А.А. Влияние некоторых иммуномодуляторов на иммунную систему и переносимость адъювантной химио- или химиолучевой терапии у больных раком молочной железы: автореф. дис… канд. мед. наук: 14.00.14 / Феденко Александр Александрович. – М., 2007. – 25 с. 98 35.Федин, Ю.В. Клеточные реакции стромы опухоли и реактивные изменения регионарных лимфатических узлов при раке молочной железы / Ю.В. Федин, В.Д. Ермилова // Вопросы онкологии. – 1984. – № 11. – С. 38-44. 36.Хаитов, Р.М. Современные представления о механизме действия полиоксидония / Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. – 2005. – Т. 26, № 4. – C.197. 37.Цывкина, Г.И. Применение полиоксидония в комплексной терапии онкологических заболеваний / Г.И. Цывкина и др. // Саратовский медико-фармацевтический вестник. – 2005. – № 25. – С. 22-23. 38.Чобанян, Н.С. Рак молочной железы у женщин молодого возраста: автореф. дис... д-ра мед. наук: 14.00.14 / Чобонян Наира Симоновна. – М., 1992. – 41 c. 39.Aruga, A. Type 1 vs type 2 cytokine release by Vbeta T cell subpopulations determines in vivo antitumor reactivity: IL-10 mediates a suppressive role / A. Aruga, E. Aruga, K. Tanigawa et al. // J. Immunol. – 1997. – Vol. 159. – P. 664-673. 40.Awwad, M. Immunologically mediated regression of a murine lymphoma after treatment with anti-L3T4 antibody. A consequence of removing L3T4 suppressor T cells from a host generating predominantly Lyt-2+ T cell mediated immunity / M. Awwad, R.J. North // J. Exp. Med. – 1988. – Vol. 168. – P. 2193-2206. 41.Balch, C. Patterns of human tumor infiltrating lymphocytes in 120 human cancers / C. Balch, L. Riley, T. Bae et al. // Arch. Surg. – 1990. Vol. 125, N 2. – P. 200-205. 42.Baldwin, R.W. Immunity to methylcholantrene-induced tumours in inbred rats following atrophy and regression of implanted tumours / R.W. Baldwin // Br. J. Cancer. – 1955. – Vol. 9. – P. 652-657. 43.Battegay, M. Enchanced establishment of a virus carrier state in adult CD4+ T-cell-deficient mice / M. Battegay, D. Moskophidis, A. Rahemtulla et al. // J. Virol. – 1994. – Vol. 68. – P. 8056-8063. 99 44.Beatty, G. IFN-gamma-dependent inhibition of angiogenesis by tumorinfiltrating CD4+ T cells requires tumor responsiveness to IFN-gamma / G. Beatty, Y. Patterson // J. Immunol. – 2001. – Vol. 166. – P. 2276-2282. 45.Beatty, G.L. IFN-gamma can promote tumor evasion of the immune system in vivo by down-regulating cellular levels of an endogenous tumor antigen / G.L. Beatty, Y. Paterson // J. Immunol. – 2000. – Vol. 165. – P. 5502-5508. 46.Beck-Engeser, G.B. Point mutations in essential genes with loss or mutation of the second allele: relevance to the retention of tumor-specific antiges / G.B. Beck-Engeser, P.A. Monach, D. Mumberg et al. // J. Exp. Med. – 2001. – Vol.194. – P. 285-300. 47.Belldegrun, A. Human tumor infiltrating lymphocytes. Analysis of lymphokine mRNA expression and relevance to cancer immunotherapy / A. Belldegrun, A. Kasid, M. Uppencamp et al. // J. Immunol. – 1989. – Vol. 142, N 12. – P. 4520-4526. 48.Ben-Eliyahu, S. Evidence that stress and surgical interventions promote tumor development by suppressing natural killer cell activity / S. BenEliyahu, G.G. Page, R. Yirmiya et al. // Int. J. Cancer. – 1999. – Vol. 80. – P. 880-888. 49.Bennett, S.R. Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signaling / S.R. Bennett, F.R. Carbone, F. Caramalis et al. // Nature. – 1998. – Vol. 393. – P. 478-480. 50.Bennett, S.R. Induction of a CD8+ T lymphocyte response by cross-priming requires cognate CD4+ T cell help / S.R. Bennett, F.R. Carbone, F. Karamalis et al. // J. Exp. Med. – 1997. – Vol. 186. – P. 65-70. 51.Berendt, M.J. T-cell-mediated suppression of anti-tumor immunity. An explanation for progressive growth of an immunogenic tumor / M.J. Berendt, R.J. North // J. Exp. Med. – 1980. – Vol. 151. – P. 69-80. 52.Bilik, R. Characterization of T-lymphocyte subpopulations infiltrating primary breast cancer / R. Bilik, C. Mor, B. Hazaz et al. // Cancer Immunol Immunother. –1989. – Vol. 28, N 2. – P. 143-147. 100 53.Bingle, L. The role of tumor-associated macrophages in tumor progression: implications for new anti-cancer therapies / L. Bingle, N.J. Brown, S.E. Lewis // J. Pathol. – 2002. – Vol. 196. – P. 254-265. 54.Bolat, F. Microvessel density, VEGF expression, and tumor-associated macrophages in breast tumors : correlations with prognostic parameters / F. Bolat et al. // J. Exp. Clin. Cancer Res. – 2006. – Vol. 25. – P. 365-372. 55.Boon, T. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes / T. Boon, P. van der Bruggen // J. Exp. Med. – 1996. – Vol. 183. – P. 725-729. 56.Boyse, E.A. Some futher data on cytotoxic isoantibodies in the mouse / E.A. Boyse, L.J. Old, E. Stokert // Ann. N.-Y. Acad. Sci. – 1962. – Vol. 99. – P. 574-587. 57.Brandlein, S. Natural IgM antibodies and immunosurveillance mechanisms against epithelial cancer cells in humans / S. Brandlein, T. Pohle, N. Ruoff et al. // Canc. Res. – 2003. – Vol. 63. – P. 7995-8005. 58.Braun, S. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer / S. Braun, D.F. Vogl, B. Naume et al. // N. Engl. J.Med. – 2005. – Vol. 353, N 8. – P. 793-802. 59.Brooks, D.G. et al. Interleukin-10 determines viral clearance or persistence in vivo / D.G. Brooks et al. // Nat. Med. – 2006. – Vol. 12. – P.1301-1309. 60.Bugelski, P. Macrophage content of spontaneous metastases at different stages of growth / P. Bugelski, S. Corwin, S. North et al. // Cancer Res. – 1987. – Vol.47, N 15. – P. 4141-4145. 61.Bursuker, I. Generation and decay of the immune response to a progressive fibrosarcoma. II. Failure to demonstrate postexcision immunity after the onset of T cell-mediated suppression of immunity / I. Bursuker, R.J. North // J. Exp. Med. – 1984. – Vol. 159. – P. 1312-1321. 62.Campbell, R.J. Proliferating macrophages associated with high grade, hormone receptor negative breast cancer and poor clinical outcome / R.J. Campbell et al. // Breast cancer Res. Treat. – 2010. – Vol. 128. – P. 703-711. 101 63.Cardin, R.D. Progressive loss of CD8+ T-cell mediated control of a gamma herpervirus in the absence of CD4+ T cells / R.D. Cardin, J.W. Brooks, S.R. Sarawar et al. // J. Exp. Med. – 1996. – Vol. 184. – P. 863-871. 64.Casares, N. CD4+/CD25+ regulatory T cells inhibit activation of tumorprimed CD4+ T cells with IFN-gamma-dependent antiangiogenic activity, as well as long-lasting tumor immunity elicited by peptide vaccination / N. Casares, L. Arribillaga, P. Sarobe et al. // J. Immunol. – 2003. – Vol. 171. – P. 5931-5939. 65.Cella, M. Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production of high levels of interleukin-12 and enchances T cell stimulatory capacity: T-T help via APC activation / M. Cella, D. Scheidegger, K. Palmer-Lehmann et al. // J. Exp. Med. – 1996. – Vol. 184. – P. 747-752. 66.Cheever, M.A. Antigen-driven long term-cultured T cells proliferate in vivo, distribute widely, mediate specific tumor therapy, and persis long term as functionally memory T cells / M.A. Cheever, D.B. Thompson, J.P. Klarnet et al. // J. Exp. Med. – 1986. – Vol. 163. – P. 1100-1112. 67.Chen, J.J. Tumor-associated macrophages: the double-edged sword in cancer progression / J.J. Chen et al. // J. Clin. Oncol. – 2005. – Vol. 23. – P. 953-964. 68.Clark, Jr W.H. Model predicting survival in stage I melanoma based on tumor progression / Jr W.H. Clark, D.E. Elder, D.T. Guerry et al. // J. Natl. Cancer Inst. – 1989. – Vol. 81. – P. 1893-1904. 69.Clemente, C.G. Prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes in the vertical growth ohase of primary cutaneous melanoma / C.G. Clemente, Jr R.C. Mihm, R. Bufalino et al. // Cancer. – 1996. – Vol. 77. – P. 1303-1310. 70.Conha, A. Different patterns of HLA-DR antigen expression in normal epithelium, hyperplastic and neoplastic malignant lesions of the breast / A. Conha, F. Ruiz-Cabello, T. Cabrera et al. // Eur. J. Immunogenet. – 1995. – Vol. 22, N4. – P. 299-310. 102 71.Coronella, J.A. Antigen-driven oligoclonal expansion of tumor-infiltrating B-cells in infiltrating ductal carcinoma of the breast / J.A. Coronella, C. Spier, M. Welch et al. // J. Immunol. – 2002. – Vol. 169. – P. 1829-1836. 72.Curiel, T.J. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma fosters immune privilege and predicts immune survival / T.J. Curiel, G. Coucos, L. Zou et al. // Nat. Med. – 2004. – Vol. 10. – P. 942-949. 73.Daniel, D. Immune enchancement of skin carcinogenesis by CD4+ T cells / D. Daniel, N. Meyer-Morse, E.K. Bergsland et al. // J. Exp. Med. – 2003. – Vol. 197. – P. 1017-1028. 74.DeNardo, D.G. CD4+ T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enchancing protumor properties of macrophages / D.G. DeNardo et al. // Cancer Cell. – 2009. – Vol. 16. – P. 817-819. 75.DeNardo, D.G. Leucocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy / D.G. DeNardo et al. // Cancer discovery. – 2011. – Vol. 1, N 1. – P. 54-67. 76.DeNardo, D.G. CD4(+) T cells regulate pulmonary metastasis of mammary carcinomas by enchancing protumor properties of macrophages / D.G. DeNardo, J.B. Barret, P. Andreu et al. // Cancer Cell. – 2009. – Vol. 16. – P. 91-102. 77.Dieckmann, D. Ex vivo isolation and characterization of CD4(+)CD25(+) T cells with regulatory properties from human blood / D. Dieckmann, H. Plottner, S. Berchtold et al. // J. Exp. Med. – 2001. – Vol. 193. – P. 13031310. 78.Dranoff, G. Vaccination with irradiated tumor cells engeneered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific and long-lasting anti-tumor immunity / G. Dranoff, E. Jaffee, A. Lasenby et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1993. – Vol. 90. – P. 35393543. 103 79.Dudley, M.E. Adoptive-cell-transfer therapy for the treatment of patients with cancer / M.E. Dudley, S.A. Rosenberg // Nat. Rev. Cancer. – 2003. – Vol. 3. – P. 666-675. 80.Dudley, M.E. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation wuth anti-tumr lymphocytes / M.E. Dudley, J.R. Wunderlich, P.F. Robbins et al. // Science. – 2002. – Vol. 298. – P. 850-854. 81.Dunn, G.P. The three Es of cancer immunoediting / G.P. Dunn, L.J. Old, R.D. Schreiber //Ann. Rev. Immunol. – 2004. – Vol. 22. – P. 329-360. 82.Esserman, L.J. Magnetic resonance imaging captures the biology of ductal carcinoma in situ / L.J. Esserman et al. // J. Clin. Oncol. – 2006. – Vol. 24. – P. 4603-4610. 83.Fallarino, F. Cutting edge: differentiation of antitumor CTL in vivo requires host expression of Stat1 / F. Fallarino, T.F. Gajewski // J. Immunol. – 1999. – Vol. 163. – P. 4109-4113. 84.Fallarino, F. Th1 and Th2 cell clones to a poorly immunogenic tumor antigen initiate CD8+ T cell dependent tumor eradication in vivo / F. Fallarino, U. Grohmann, R. Bianchi et al. // J. Immunol. – 2000. – Vol. 165. – P. 5495-5501. 85.Fearon, E.R. Interleukin-2 production by tumor cells bypasses T-helper function in the generation of an anti-tumor response / E.R. Fearon, D.M. Pardoll, T. Itaya et al. // Cell. – 1990. – Vol. 60. – P. 397-403. 86.Feltcamp, M.C. Vaccination with T-lymphocyte epitope-containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16transformed cells / M.C. Feltcamp, H.L. Smits, M.P. Vierboom et al. // Eur. J. Immunol. – 1993. – Vol. 23. – P. 2242-2249. 87.Fidler, T. Macrophages in host defance against cancer metastasis / T. Fidler // Cancer Bull. – 1984. – Vol. 36, N 5. – P. 226-230. 88.Foley, E.J. Antigenic properties of methylcholantrene-induced tumors in mice of the strain of origin / E.J. Foley // Cancer Res. – 1953. – Vol. 13. – P. 835-837. 104 89.Fossati, G. Melanoma cell lysis by human CTL clones: differential involvement of T3, T8 and HLA antigens / G. Fossati, A. Anichini, G. Parmiani // Int. J. Cancer. – 1987. – Vol. 39. – P. 689-694. 90.Fujiwara, H. The role of tumor-specific Lyt-1+2- T cells in eradicating tumor cells in vivo. 1. Lyt-1+2- T cells do not necessarily require recruitment of host’s cytotoxic T cell precursors for implementation of in vivo immunity / H. Fujiwara, M. Fukuzawa, T. Yoshioka et al. // J. Immunol. – 1984. – Vol. 133. – P. 1671-1676. 91.Globerson, A. Antigenic specificity of benzo(a)pyrene-induced sarcomas / A. Globerson, M. Feldman // J. Natl. Cancer Inst. – 1964. – Vol. 32. – P. 1229-1243. 92.Golgher, D. Depletion of CD25+ regulatory cells uncovers immune responses to shared murine tumor rejection antigens / D. Golgher, E. Jones, F. Porwie et al. // Eur. J. Immunol. – 2002. – Vol. 32. – P. 3267-3275. 93.Golumbeck, P.T. Treatment of established renal cancer by tumor cell engeneering to secrete interleukin-4 / P.T. Golumbeck, A.J. Lasenby, H.I. Levitski et al. // Science. – 1991. – Vol. 254. – P. 713-716. 94.Greenberg, P.D. Eradication of disseminated murine leukemia by chemoimmunotherapy with cyclophosphamide and adoptively transferred immune syngeneic Lyt-1+2- lymphocytes / P.D. Greenberg, M.A. Cheever, A. Fefer et al. // J. Exp. Med. – 1981. – Vol. 154. – P. 952-963. 95.Gross, L. Intradermal immunization of C3H mice against a sarcoma that originated in an animal of the same line / L. Gross // Cancer Res. – 1943. – Vol. 3. – P. 326-333. 96.Hacene, K. Competitive prognostic value of clinicopathologic and bioimmunologic factors in primary breast cancer / K. Hacene, A. Desplaces, M. Brunet et al. // Cancer. – 1986. – Vol. 57. – P. 245-250. 97.Halpern, J. Tumor-infiltraring lymphocytes: in vitro characterization of morphological and phenotypical changes / J. Halpern, A. Islam, J. Simich et al. // Cancer Detect. Prev. – 1988. – Vol. 13, N 1. – P. 1-7. 105 98.Hamilton, G. Natural killer cell activities of patients with breast cancer against different target cells / G. Hamilton, A. Reiner, B. Teleky et al. // J. Cancer Res. Clinical. Oncol. – 1988. – Vol. 114. – P. 191-196. 99.Hansen, H.M. The tumor-infiltrating B-cell response in medullary breast cancer is oligoclonal and directed against the autoantigen actin exposed on the surface of apoptotic cancer cells / H.M. Hansen, H. Nielsen, H.J. Ditzel // PNAS. – 2001. – Vol. 98, N 22. – P. 12659-12664. 100. Jones, E. Depletion of CD25+ regulatory cells results in suppression of melanoma growth and induction of autoreactivity in mice / E. Jones, M. Dahm-Vicker, A.K. Simon et al. // Cancer Immun. – 2002. – Vol. 2. – 1 p. 101. Kacha, A.K. Cutting edge: spontaneous regression of poorly immunogenic P1.HTR tumors by Stat6-deficient mice / A.K. Kacha, F. Fallarino, M.A. Markiewicz et al. // J. Immunol. – 2000. – Vol. 165. – P. 6024-6028. 102. Klein, E. Separation and characteristicsof tumor-infiltrating lymphocytes in man / E. Klein, F. Vanky, U. Galili et al. // Contemp. Top. Immunobiol. – 1980. – Vol. 10. – P. 79-107. 103. Klein, G. Demonstration of resistance against methylcholantrene- induced sarcomas in the primary autochtonous host / G. Klein, H.O. Sjogren, E. Klein et al. // Cancer Res. – 1960. – Vol. 20. – P. 1561-1572. 104. Klugewitz, K. Transfer of IFNgamma-depleted CD4(+) T cells together with CD8(+) T cells leads to rejection of murine kidney sarcoma in mice / K. Klugewitz, A. Scheffold, A. Radbruch et al. // Int. J. Cancer. – 2000. – Vol. 87. – P. 673-679. 105. Knuth, A. T-cell-mediated cytotoxicity against autologous malignant melanoma: analysis with interleukin 2-dependent T-cell cultures / A. Knuth, B. Danowski, H.F. Oettgen et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –1984. – Vol. 81. – P. 3511-3515. 106. Kobayashi, M. A pathogenic role of Th2 cells and their cytokine products on the pulmonary metastasis of murine B16 melanoma / M. 106 Kobayashi, H. Kobayashi, R.B. Pollard et al. // J. Immunol. – 1998. – Vol. 160. – P. 5869-5873. 107. Koretz, K. Correlation of HLA-d/Ii antigen expression in breast carcinoma with local lymphohistiocytic infiltration reveals considerable dysregulation in a subset of tumors / K. Koretz, G. Moldenhauer, O. Majdic et al. // Int. J. Cancer. – 1989. – Vol. 44, N 5. – P. 816-822. 108. Kripke M.L. Antigenicity of murine skin tumors induced by ultraviolet light // J. Natl. Cancer Inst. – 1974. – Vol. 53. – P.1333-1336. 109. Kunningham-Rundles, S. Natural cytotoxicity of peripheral blood lymphocytes and regional lymph node cellsin breast cancer in women / S. Kunningham-Rundles, D.A. Filippa, D.W. Braun et al. // J. Natl. Cancer Inst. – 1981. – Vol. 67. – P. 585-590. 110. Lang, P.A. Natural killer cell activation enhances immune pathology and promotes chronic infection by limiting CD8+ T-cell immunity / P.A. Lang, K.S. Lang, H.C. Xu et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2012. – Vol.109, N 4. – P.1210-1215. 111. Leclerc, J.C. Cell-mediated reaction against tumors induced by oncorna viruses . I. Kinetics and specificity of the immune response in murine sarcoma virus (MSV)-induced tumors and transplanted lymphomas / J.C. Leclerc, E. Gomard, J.P. Levy // Int. J. Cancer. – 1972. – Vol. 10. – P. 589-601. 112. Lee, A.H. Angiogenesis and inflammation in invasive carcinoma of the breast / A.H. Lee, L.C. Happerfield, L.J. Bobrow et al. // J. Clin. Pathol. – 1997. – Vol. 50. – P. 669-673. 113. Lee, Q.H. Inflammatory infiltrate in invasive lobular and ductal carcinoma of the breast / Q.H. Lee, L.C. Happerfield, R.R. Millis et al. // Br. J. Cancer. – 1996. – Vol. 74, N 5. – P. 796-801. 114. Lee, S.H. Activating receptors promote Nk cell expansion for maintenance, IL-10 production, and CD8 T cell regulation during viral 107 infection / S.H. Lee, K.S. Kim, N. Fodil-Kornu et al. // J. Exp. Med. – 2009. – Vol. 206. – P. 2235-2251. 115. Leek, R.D. Association of macrophage infiltrationwith angiogenesis andprognosis in invasive breast carcinoma / R.D. Leek et al. // Cancer Res. – 1996. – Vol. 56. – P. 4625-4629. 116. Levy, S. Correlation of stress-factors with sustained depression of natural killer cell activity and predicted prognosis in patients with breast cancer / S. Levy, R. Herberman, M. Lippman et al. // J. Clin. Oncol. – 1987. – Vol. 5. – P. 348-353. 117. Li, J. Complete regression of experimental solid tumors by combination LEC/chTNT-3 immunotherapy and CD25(+) T cell depletion / J. Li, P. Hu, L.A. Khawli et al. // Cancer Res. – 2003. – Vol. 63. – P. 83848392. 118. Lin, K.Y. Treatment of established tumors with a novel vaccine that enchances major histocompatibility class II presentation of tumor antigen / K.Y. Lin, F.G. Guarnieri, K.F. Staveley-O’Carrol et al. // Cancer Res. – 1996. – Vol. 56. – P. 21-26. 119. Lowes, M.A. T helper 1 cytokine mRNA is increased in spontaneously regressing primary melanomas / M.A. Lowes, J.A. Bishop, K. Grotty et al. // J. Invest. Dermatol. – 1997. – Vol. 108. – P. 914-919. 120. Lu, Z. CD40-independent pathways of T cell help for priming of CD8(+) cytotoxic T lymphocytes / Z. Lu, L. Yuan, X. Zhou et al. // J. Exp. Med. – 2000. – Vol. 191. – P. 541-550. 121. Lucin, K. Prognostic significance of T-cell infiltrates, expression of beta 2-microglobulin and HLA-DR antigens in breast carcinoma / K. Lucin, Z. Iternicka, N. Jonjic // Pathol. Res. Pract. – 1994. – Vol. 190, N 12. – P. 1134-1140. 122. Lyianage, U.K. Prevalence of regulatory T cells s increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or 108 breast adenocarcinoma / U.K. Lyianage, T.T. Moore, H.G. Joo et al. // J. Immunol. – 2002. – Vol. 169. – P. 2756-2761. 123. MacDonald, G.D. Role of dendritic cell targeting in Venezuelan equine encephalitis virus pathogenesis / G.D. MacDonald, R.E. Johnston // J. Virol. – 2000. – Vol. 74. – P. 914-922. 124. Machiels, J.P. Cyclophosphamide, doxorubicin and paclitaxel enchance the antitumor immune response of granulocyte-macrophagecolony stimulating factor-secreting whole cell vaccines in HER2/neu tolerized mice / J.P. Machiels, R.T. Reylly, L.A. Emens et al. // Cancer Res. – 2001. – Vol. 61. – P. 3689-3697. 125. Mackey, M.F. Dendritic cells require maturation via CD40 to generate protective anti-tumor immunity / M.F. Mackey, J.R. Gunn, C. Malisczewski et al. // J. Immunol. – 1998. – Vol. 161. – P. 2094-2098. 126. Mackey, M.F. Protective immunity induced by tumor vaccines requires interaction between CD40 and its ligand CD154 / M.F. Mackey, J.R. Gunn, P.P. Ting et al. // Cancer Res. – 1997. – Vol. 57. – P. 2569-2574. 127. Marshall, N.A. Immunosuppressive regulatory T cells are abundant in the reactive lymphocytes of Hodgkin’s lymphoma / N.A. Marshall, L.E. Christie, L.R. Munro et al. // Blood. – 2004. – Vol. 103. – P. 1755-1762. 128. Matloubian, M. CD4+ T cells are required to sustain CD8+ cytotoxic T-cell responses during chronic viral infection / M. Matloubian, R.J. Concepcion, R. Ahmed // J. Virol. – 1994. – Vol. 68. – P. 8056-8063. 129. Melief, C.J. Lessons from T-cell responses to virus-induced tumours for cancer eradication in general / C.J. Melief, W.M. Kast // Cancer Surv. – 1992. – Vol. 13. – P. 81-99. 130. Menard, S. Lymphoid infiltration as a prognostic variable for early- onset breast carcinomas / S. Menard et al. // Clin. Cancer Res. – 1997. – Vol. 3. – P. 817-819. 131. Minorovits, J. Enhanced take of spontaneous murine tumors in mice treated with inhibitors of macrophage and/or NK cell function / J. 109 Minorovits, E. Kargzag, I. Foldes // Neoplasma. – 1989. – Vol. 36, N 1. – P. 3-9. 132. Mohanty, I. Cell mediated immune status in carcinoma of the breast / I. Mohanty, M. Nayak, B.K. Nanda // Indian J. Pathol. Microbiol. – 1999. – Vol. 34. – P. 1-6. 133. Molloy, T.J. The prognostic significance of tumour cell detection in the peripheral blood versus bone marrow in 733 early-stage breast cancer patients / T.J. Molloy, A.J. Bosma, L.O. Baumbusch et al. // Breast Cancer Res. – 2011. – Vol. 13, N 3. – 61 p. 134. Monach, P.A. A unique tumor antigen produced by a single amino acid substitution / P.A. Monach, S.C. Meredith, C.T. Siegel et al. // Immunity. – 1995. – Vol. 2. – P. 45-59. 135. Mukherji, B. Clonal analysis of cytotoxic T cell response against human melanoma / B. Mukherji, T.J. MacAlister // J. Exp. Med. – 1983. – Vol. 158. – P. 240-245. 136. Mukhtar, R.A. Tumor-associated macrophages in breast cancer as potential biomarkers for new treatments and diagnostics / R.A. Mukhtar, O. Nseyo, M.J. Campbell et al. // Expert Rev. Mol. Diagn. – 2011. – Vol. 11. – P. 91-100. 137. Muller, H. Correlation between Ki-67+ tumor cell and EBM2+ tumorassociated macrophages in breast cancer / H. Muller, H.J. Stitte // Exp. Cell Biol. – 1989. – Vol. 57, N 2. – P. 110-116. 138. Mumberg, D. CD4(+) T cells eliminate MHC class II-negative cancer cells in vivo by indirect effects if IFN-gamma / D. Mumberg, P.A. Monach, S. Wanderling et al. // Proc. Natl. Acad. Sci USA. – 1999. – Vol. 96. – P. 8633-8638. 139. Naukkarinen, A. Quantitative immunohistochemical analysis of mononuclear infiltrates in breast carcinomas - correlation with tumor differentiation / A. Naukkarinen, K.J. Syrganen // J. Pathol. – 1990. – Vol. 160, N 3. – P. 217-222. 110 140. Nishimura, T. Distinct role of antigen-specific T helper type 1 (Th1) and Th2 cells in tumor eradication in vivo / T. Nishimura, K. Iwakabe, M. Sekimoto et al. // J. Exp. Med. – 1999. – Vol. 190. – P. 617-627. 141. Noguchi, Y. Influence of interleukin-12 on p53 peptide vaccination against established Meth A sarcoma / Y. Noguchi, E.C. Richards, Y.T. Chen et al / Y. Noguchi // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1995. – Vol. 92. – P. 2219-2223. 142. Nzula, S. Antigen-driven clonal proliferation, somatic hypermutation. And selection of B-lymphocytes infiltrating human ductal breast carcinomas / S. Nzula, J.J. Going, J.I. Stott // Cancer Res. – 2003. – Vol. 63. – P. 32753280. 143. Onizuka, S. Tumor rejectin by in vivo administration of anti- CD25 (interleukin-2 receptor alpha) monoclonal antibody / S. Onizuka, I. Tawara, J. Shimizu et al. // Cancer Res. – 1999. – Vol. 59. – P. 3128-3133. 144. Ostrand-Rosenberg, S. Cutting edge: STAT6-deficient mice have enchanced tumor immunity to primary and metastatic mammary carcinoma / S. Ostrand-Rosenberg, M.J. Grusby, V.K. Klements // J. Immunol. – 2000. – Vol. 165. – P. 6015-6019. 145. Pardoll, D. Does the immune system see tumors as foreign or self? / D. Pardoll // Ann. Rev. Immunol. – 2003. – Vol. 21. – P. 807-839. 146. Pardoll, D.M. The role of CD4+ T cell responses in antitumor immunity / D.M. Pardoll, S.L. Topalian // Curr. Opin. Immunol. – 1998. – Vol. 10. – P. 588-594. 147. Pellegrini, P. Disregulation in TH1 and TH2 subsets of CD4+ T cells in peripheral blood of colorectal cancer patients and involvement in cancer establishment and progression / P. Pellegrini, A.M. Berghella, T. Del Beato et al. // Cancer Immunol. Immunother. – 1996. – Vol. 42. – P. 1-8. 148. Prehn, R.T. Immunity to methylcholantrene-induced sarcomas / R.T. Prehn, J.M. Main // J. Natl. Cancer Inst. – 1957. – Vol. 18. – P. 769-778. 111 149. Pross, H.F. Natural killer cell activity in woman at ―high risk‖ for breast cancer with and without benign breast syndrome / H.F. Pross, E. Sterns, D.R. MacGillis // Int. J. Cancer. – 1984. – Vol. 34. – P. 303-308. 150. Pupa, S.M. Macrophage infiltrate and prognosis in c-erb-2 overexpressing breast carcinomas / S.M. Pupa et al. // J. Clin. Oncol. – 1996. – Vol. 14. – P. 85-94. 151. Randen, I. The identification of germinal centers and follicular dendritic cell networks in rheumatoid synovial tissue / I. Randen, O.J. Mellbye, O. Forre et al. // Scand. J. Immunol. – 1995. – Vol. 41. – P. 481486. 152. Ridge, J.P. A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T helper and a T killer cell / J.P. Ridge, F. Di Rosa, P. Matzinger // Nature. – 1998. – Vol. 393. – P. 474-478. 153. Ridolfi, R.L. Medullary carcinoma of the breast: a clinicopathologic study with 10 year follow-up / R.L. Ridolfi, P.P. Rosen, A. Port et al. // Cancer. – 1977. – Vol. 40. – P. 1365-1385. 154. Robins, R.A. T-cell responses at the host: tumour interface / R.A. Robins // Biochim. Biophys. Acta. – 1986. – Vol. 865. – P. 289-305. 155. Robinson, B.D. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination / B.D. Robinson et al. // Clin. Cancer Res. – 2009. – Vol. 15. – P. 2433-2441. 156. Romagnani, S. The Th1/Th2 paradigm / S. Romagnani // Immunol. Today. – 1997. – Vol.18. – P. 263-266. 157. Rosenberg, S.A. A new era for cancer immunotherapy based on the genes that encode cancer antigens / S.A. Rosenberg // Immunity. – 1999. – Vol. 10. – P. 281-287. 158. Rosenberg, S.A. Progress in human tumour immunology and immunotherapy / S.A. Rosenberg // Nature. – 2001. – Vol. 411. – P. 380384. 112 159. Rosenberg, S.A. Progress in the development of immunotherapy for the treatment of patients with cancer / S.A. Rosenberg // J. Intern. Med. – 2001. – Vol. 250. – P. 462-475. 160. Rosenberg, S.A. Cancer Immunotherapy: moving beyond current vaccines / S.A. Rosenberg, J.C. Yang, N.P. Restifo // Nat. Med. – 2004. – Vol. 10. – P. 909-915. 161. Rouse, B.T. Anti-theta serum-induced suppression of the cellular transfer of tumour-specific immunity to syngeneic plasma cell tumour / B.T. Rouse, M. Rollinghoff, N.L. Warner // Nat. New Biol. – 1972. – Vol. 238. – P. 116-117. 162. Ruffel, B. Leucocyte composition in human breast cancer / B. Ruffel, A. Au, H.S. Rugo et al. // PNAS. – 2012. – Vol. 109, N 8. – P. 2796-2801. 163. Sachs, G. Lyric effector cell activity and major depressive disorder in patients with breast cancer: a prospective study / G. Sachs, S. RasoulRockenschaub, H. Aschauer et al. // J. Neuroimmunol. – 1995. – Vol. 59. – P. 83-89. 164. Sasada, T. CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with gastrointestinal malignancies: possible involvement of regulatory T cells in disease progression / T. Sasada, M. Kimura, Y. Yoshida et al. // Cancer. – 2003. – Vol. 98. – P. 1089-1099. 165. Shen, Y. A tumor-specific Th2 clone initiating tumor rejection via primed CD8+ cytotoxic T lymphocyte activation in mice / Y. Shen, S. Fujimoto // Cancer Res. – 1996. – Vol. 56. – P. 5005-5011. 166. Shijubo, N. Functional analysis of mononuclear cells infiltrating into tumors: establishment of a new system to obtain functionally active tumorinfiltrating cells / N. Shijubo, T. Uede, N. Nomura et al. // Jap. J. Cancer Res. – 1990. – Vol. 81, N1. – P. 28-34. 167. Shimizu, J. Induction of tumor immunity by removing CD25+CD4+ T cells: a common basis between tumor immunity and autoimmunity / J. 113 Shimizu, S. Yamazaki, S. Sakaguchi // J. Immunol. – 1999. – Vol. 163. – P. 5211-5218. 168. Shimokawara, J. Identiification of lymphocyte subpopulations in human breast cancer tissue and its significance: an immunoperoxidase study with anti-human T- and B-cell sera / J. Shimokawara, M. Imamura, N. Gamanaka et al. // Cancer. – 1982. – Vol. 49, N 7. – P. 1456-1464. 169. Shinde, S. CD40L is important for induction of , but not response to, costimulatory activity. ICAM-1 as a second costimulatory molecule rapidly up-regulated by CD40L / S. Shinde, Y. Wu, Y. Guo et al. // J. Immunol. – 1996. – Vol. 157. – P. 2764-2768. 170. Shoenberger, S.P. T cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions / S.P. Shoenberger, R.E. Toes, E.I. van der Voort et al. // Nature. – 1998. – Vol. 393. – P. 480-483. 171. Siegel, C.T. Enchanced growth of primary tumors in cancer-prone mice after immunization against the mutant region of an inherited oncoprotein / C.T. Siegel, K. Schreiber, S.C. Meredith et al. // J. Exp. Med. – 2000. – Vol. 191. – P. 1945-1956. 172. Sims, G.P. Somatic hypermutation and selection of B-cells in thymic germinal centers responding to acetylcholine receptor in myasthenia gravis / G.P. Sims, H. Shiono, N. Willcox et al. // J. Immunol. – 2001. – Vol. 167. – P. 1935-1944. 173. Soderquest, K. Cutting edge: CD8+ T cell primingin the absence of NK cells leads to enchanced memory responses / K. Soderquest // J. Immunol. – 2011. – Vol. 186. – P. 3304-3308. 174. Spellman, C.W. Ultraviolet light, tumors and suppressor T cells / C.W. Spellman, R.A. Daynes // Hum. Pathol. –1981. – Vol. 12. – P. 299301. 175. Standish, L.J. Breast cancer and immune system / L.J. Standish, E.S. Sweet, J. Noval et al. // J. Soc. Integr. Oncol. – 2008. – Vol. 6, N 4. – P. 158-168. 114 176. Stanzl, U. High level interleukin-12 production by murine dendritic cells: upregulation via MHC class II and CD40 molecules and downregulation by IL-4 and IL-10 / U. Stanzl, P. Jennewein et al. // J. Exp. Med. – 1996. – Vol. 184. – P. 741-746. 177. Steitz, J. Depletion of CD25+ Cd4+ T cells and treatment with tyrosinase-related protein 2-transduced dendritic cells enhance the interferon alpha-induced, CD8+ T-cell-dependent immune defense of B16 melanoma / J. Steitz, J. Bruck, J. Lenz et al. // Cancer Res. – 2001. – Vol. 61. – P. 86438646. 178. Stevenson, P.G. Virus-specific CD8(+) T cell numbers are maintained during gamma-herpesvirus reactivation in CD4-deficient mice / P.G. Stevenson, G.T. Beltz, J.D. Altman et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – Vol. 95. – P. 15565-15570. 179. Stott, D. Antigen-driven clonal proliferation of B-cells within the target tissue of an autoimmune disease. The salivary glands of patients with Sjogren syndrome / D. Stott, F. Hiepe, M. Hummel et al. // J. Clin. Invest. – 1998. – Vol. 102. – P. 938-946. 180. Strayer, D.R. Low natural cytotoxicity of peripheral blood mononuclear cells in individuals with high familial incidence of cancer / D.R. Strayer, W.A. Carter, S.D. Mayberry et al. // Cancer Res. – 1984. – Vol. 44. – P. 370-374. 181. Su, H.C. NK cell functions restrain T cell responses during viral infections / H.C. Su et al. // Eur. J. Immunol. – 2001. – Vol. 31. – P. 30483055. 182. Sutmuller, R.P. Synergism of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and depletion of CD25+ regulatory T cells in antitumor therapy reveals alternative pathways for suppression of autoreactive cytotoxic lymphocyte responses / R.P. Sutmuller, L.M. van Duivenvoorde, A. van Elsas et al. // J. Exp. Med. – 2001. – Vol. 194. – P. 823-832. 115 183. Tawara, I. Sequential involvement of two distinct CD4+ regulatory T cells during the course of transplantable tumor growth and protection from 3-methylcholantrene-induced tumorigenesis by CD25-depletion / I. Tawara, Y. Take, A. Uenaka et al. // Jpn. J. Cancer Res. – 2002. – Vol. 93. – P. 911916. 184. Tevethia, S.S. Requirement of thymus-derived theta-positive lymphocytes for rejection of DNA-virus (SV 40) tumors in mice / S.S. Tevethia, J.W. Blasecki, G. Vanek et al. // J. Immunol. – 1974. – Vol. 113. – P. 1417-1423. 185. Tsavaris, N. Immune changes in patients with advanced breast cancer undergoing chemotherapy with taxanes / N. Tsavaris, C. Kosmas, M. Vadiaka et al. // Br. J. Cancer. – 2002. – Vol. 87. – P. 21-27. 186. Tsung, K. IL-12 induces T helper 1-directed antitumor response / K. Tsung, J.B. Meko, G.R. Peplinski et al. // J. Immunol. –1997. – Vol. 158. – P. 3359-3365. 187. Tsutsui, S. Macrophage infiltration and its prognostic implications in breast cancer: the relationship with VEGF expression and microvessel density / S. Tsutsui et al. // Oncol. Rep. – 2005. – Vol. 14. – P. 425-431. 188. Tupitsyn, N.N. Relationships between semiquantitative and quantitative parameters of local immune response in gastric cancer / N.N. Tupitsyn, Z.G. Kadagidze, I.K. Tuichiev et al. // Experimental oncology. – 1995. – Vol. 17. – P. 31-36. 189. Turk, M.J. Concomitant tumor immunity to a poorly immunogenic melanoma is prevented by regulatory T-cells / M.J. Turk, J.A. GuevaraPatino, G.A. Rizzuto et al. // J. Exp. Med. – 2004. – Vol. 200. – P. 771-782. 190. Uzzan, B. Microvessel density as a prognostic factor in women with brest cancer: a systematic review of the literature and metaanalysis / B. Uzzan, P. Nicolas, M. Cucherat et al. // Cancer Res. – 2004. – Vol. 64. – P. 2941-2955. 116 191. Volodko, N. Tumour-associated macrophages in breast cancer and their prognostic correlations / N. Volodko, A. Reiner, M. Rudas et al. // Breast. – 1998. – Vol. 7. – P. 99-105. 192. Waggoner, S.N. Absence of mouse 2B4 promotes NK cell mediated killing of activated CD8+ T cells, leading to prolonged viral persistence and altered pathogenesis / S.N. Waggoner, R.T. Taniguchi, P.A. Mathew et al. // J. Clin. Invest. – 2010. – Vol. 120. – P. 1925-1938. 193. Wang, H.Y. Tumor-specific human CD4+ regulatory T cells and their ligands: implications for immunotherapy / H.Y. Wang, D.A. Lee, G. Pemg et al. // Immunity. – 2004. – Vol. 20. – P. 107-118. 194. Ward, P.L. Major histocompatibility complex class I and unique antigen expression by murine tumors that escaped from CD8+ T cell dependent surveillance / P.L. Ward, H.K. Koeppen, T. Hurteau et al. // Cancer Res. – 1990. – Vol. 50. – P. 3851-3858. 195. Whitford, P. Flow cytometric analysis of tumor-infiltrating lymphocyte activation and tumour cell MHC class I and II expression in breast cancer patients / P. Whitford, W.D. George, A.M. Campbell // Cancer Lett. – 1992. – Vol. 61, N 2. – P. 157-164. 196. Whitwell, H.L. Expression of major histocompatibility antigens and leucocyte infiltration in benign and malignant human breast disease / H.L. Whitwell, H.P.A. Hughes, M. Moore et al. // Brit. J. Cancer. – 1984. – Vol. 49, N 2. – P. 161-172. 197. Wick, M. Antigenic cancer cells grow progressively in immune hosts without evidence for T cell exhaustion or systemic anergy / M. Wick, P. Dubey, H. Koeppen et al. // J. Exp. Med. – 1997. – Vol. 186. – P. 229-238. 198. Woo, E.Y. Regulatory CD4(+)CD25(+) T cells in tumors from patients with early stage non-small cell lung cancer and late stage ovarian cancer / E.Y. Woo, C.S. Chu, T.J. Goletz et al. // Cancer Res. – 2001. – Vol. 61. – P. 4766-4772. 117 199. Woo, E.Y. Cutting edge: regulatory T cells from lung cancer patients directly inhibit autologous T cell proliferation / E.Y. Woo, H. Yeh, S.C. Chu et al. // J. Immunol. – 2002. – Vol. 168. – P. 4272-4276. 200. Yakirevich, E. Apoptosis, proliferation and FAS (APO-1/CD95)/Fas ligand expression in medullary carcinoma of the breast / E. Yakirevich, L. Maroun, O. Cohen // J. Pathol. – 2002. – Vol.192, N 2. – P. 166-173. 201. York, Y.A. Proteolysis and class I major histocompatibility complex antigen presentation / Y.A. York, A.L. Goldberg, X.Y. Mo et al. // Immunol. Rev. –1999. – Vol. 172. – P. 49-66. 202. Yu, P. Intratumor depletion of CD4+ cells unmasks tumor immunogenicity leading to the rejection of late-stage tumors / P. Yu, Y. Lee, W. Liu et al. // J. Exp. Med. – 2005. – Vol. 201. – P. 779-791. 203. Yu, P. Protective role of CD40 in Leishmania major infection at two distinct phases of cell-mediated immunity / P. Yu, M. Kamanaka, T. Yasui et al. // Immunity. – 1996. – Vol. 4, N 3. – P. 275-281. 204. Zhang, L. Intratumoral T-cells, reccurence and survival in epithelial ovarian cancer / L. Zhang, J.R. Conejo-Garcia, D. Katsaros et al. // N. Engl. J. Med. – 2003. – Vol. 348. – P. 203-213. 205. Zitvogel, L. Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells: dependence on T-cells, B7 costimulation, and T- helper cell 1-associated cytokines / L. Zitvogel, J.I. Mayordomo, T. Tjandrawan et al. // J. Exp. Med. – 1996. – Vol. 183. – P. 87-97. 206. Zuk, J.A. Immunohistochemical analysis of HLA antigens and mononuclear infiltrates in benign and malignant breast / J.A. Zuk, P.A. Walker // J. Pathol. – 1987. – Vol. 152, N 4. – P. 275-285. 207. Zuk, J.A. HLA class II sublocus expression in benign and malignant breast epithelium / J.A. Zuk, R.A. Walker // J. Pathol. – 1988. – Vol. 155, N 4. – P. 301-309.
