цитология - Cell Motility Lab

1989
ЦИТОЛОГИЯ
том XXXI, № 8
ВЛИЯНИЕ ЛАЗЕРНОГО МИКРООБЛУЧЕНИЯ
КЛЕТОЧНОГО ЦЕНТРА НА
ПОДВИЖНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ
Р. Э. Узбеков, И. А. Воробьев, К. А. Грачев
Межфакулътетская проблемная, научно-исследовательская лаборатория
молекулярной биологии и биоорганической химии,
Московский университет
Клеточный центр нейтрофилов человека, сенсибилизированных акридиновым
оранжевым, облучали микролучом аргонового лазера (λ= 488 нм). При дозе более 0.1 Дж
полностью и необратимо подавляется движение нейтрофилов, хотя клетки сохраняют
поляризацию. Облучение в той же дозе клеточного ядра, переднего и заднего участков
цитоплазмы мало влияет на подвижность клеток и не подавляет их направленного
движения к мишени. Электронно-микроскопическое исследование облученных в клеточный
центр нейтрофилов показало, что микротрубочки сохраняются в них не менее 30 мин и в
структуре клеточного центра не видно каких-либо нарушений. Предполагается, что
микрооблучение центросомы подавляет не только ее способность к полимеризации
микротрубочек, но и процесс их отделения от клеточного центра. Система микротрубочек,
таким образом, перестает обновляться, что делает невозможным перемещение нейтрофилов.
В настоящее время общепризнано, что в клетках многоклеточных
животных клеточный центр (центросома) является основным местом
полимеризации микротрубочек. В то же время имеются ряд наблюдений, а
также гипотеза о том, что функции центросомы этим не ограничиваются (см.
обзор: Воробьев, Надеж-дина, 1987). Однако механизмы осуществления
клеточным центром его предполагаемых функций до сих пор неясны.
Для выяснения этих механизмов группой исследователей в лаборатории М.
Бернса были предприняты попытки использовать лазерное микрооблучение
{Berns et al., 1977; Berns, Richardson, 1977; Berns et al., 1981). Предельно малый
объем поражения (около 0.1 мкм3) и возможность внутриклеточного разрушения
структур без повреждения наружной мембраны сделали лазерный луч
удобным инструментом для подобных исследований.
Главный вывод из работ Бернса с соавторами состоит в том, что микрооблучение центросом в профазе, в результате которого повреждается или разрушается перицентриолярный материал, приводит к тому, что облученные центросомы перестают функционировать в качестве центров организации микротрубочек. В итоге митоз останавливается на стадии промета- или метафазы, после
чего наступает аномальная цитотомия. Воробьев с соавторами (1988) облучали
центросому на разных стадиях митоза и показали, что облучение в профазе
приводит к остановке деления, даже без видимого в электронный микроскоп
повреждения перицентриолярного материала.
Таким образом, по вопросу о роли центросомы в митозе в настоящее время
уже имеются некоторые экспериментальные данные. Об интерфазных клетках
874
известно значительно меньше. Имеется лишь одна работа (Koonсе et al., 1984),
посвященная микрооблучению клеточного центра в движущихся клетках
(эозинофилах) тритона. Авторы показали, что после облучения района клеточного центра пучком ультрафиолетового света от неодимового лазера (λ= =266
нм) центриоли в нем повреждаются. Система микротрубочек также повреждается, но затем восстанавливается. Сами клетки после микрооблучения
движутся, хотя и медленнее, и, главное, движение их становится гораздо менее
упорядоченным. К сожалению, в данной работе авторам не удалось исследовать
способность облученных клеток к направленному движению — хемотаксису.
Кроме того, сравнительно большой (3 мкм) диаметр пучка и отсутствие контрольных экспериментов по облучению других, помимо клеточного центра,
участков клетки ставят под сомнение специфичность наблюдавшихся изменений
в поведении эозинофилов.
Исходя из этого в настоящей работе была поставлена задача изучить влияние
микрооблучения центросомы на подвижность нейтрофилов, в частности на их
способность к хемотаксису.
Материал и методика
В венозную кровь, полученную от здоровых доноров, для предотвращения свертывания
добавляли гепарин (25 мкг/мл). Для выделения богатой нейтрофилами плазмы кровь отстаивали в пробирках в течение 1—2 ч при 4 °С. Обогащенную плазму (0.2 мл) наносили на покровное стекло, которое предварительно покрывали полилизином (раствор в концентрации 2 мг/мл,
время нанесения — 45 мин) и выдерживали во влажной камере 15 мин при 37 °С. Для сенсибилизации клеток в плазму перед инкубацией вводили
акридиновый оранжевый до концентрации 5 мкг/мл. После
инкубации стекла с прикрепившимися клетками
споласкивали средой RPMI-1640 (без сыворотки) и переносили в камеру для прижизненных исследований,
представляющую собой модифицированную стеклянную
камеру для хемотаксиса (Zigmond, Sillivan, 1979) (рис. 1).
Микрооблучение проводили с помощью аргонового
лазера ILA-120 (Карл Цейсс, ГДР) при длине волны 488
нм. Луч лазера фокусировался наклетки через фотомикроскоп «Оптон-3» («Оптого, ФРГ) объективом
«Планапохромат 100/1.3» (Воробьев и др., 1988). Диаметр
центрального
максимума
сфокусированного
пучка
составлял 0.3 мкм. Мощность излучения (измеряемая на
входе в установку) варьировала от 0.15 до 1.0 Вт,
экспозиция — от 1/50 до 1/5 с. Доза облучения
варьировала в экспериментах от 0.003 до 0.12 Дж.
Для изучения направленного движения (некротаксиса) клетку-мишень получали разрушением
Рис. 1. Камера для прижизненных
нейтрофила облучением в дозе 0.8 – 3.0 Дж.
наблюдений за нейтрофилами (без
Для выявления системы микротрубочек
покровного стекла).
нейтрофилы на покровных стеклах промывали
1 – основание камеры (предметное стекло); 2 –
несколько раз физиологическим фосфатным
стенки камеры(пластинки, вырезанные из
буфером (PBS), затем лизировали в смеси,
предметного стекла); 3 – рабочая зона камеры.
состоящей из 25 мМ фосфатного буфера, рН 6.8,
Пластинка 3 тоньше пластинки 2 на 10 мкм.
1 мМ MgCl2, 1 мМ ЭГТА, 4%-ного
полиэтиленгликоля (мол. масса 40 000 Да) и
1%-ного Тритона Х-100, в течение 5 мин при 37 °С. После лизиса препараты фиксировали в
4%-ном формалине на PBS и окрашивали по непрямому методу Кунса поликлональными
антителами к тубулину (Fuller et al., 1975).
Для электронной микроскопии облученные клетки фиксировали через различные промежутки времени (от 1 до 30 мин) после облучения, перенося стекла из камеры в 2.5%-ный
раствор глутарового альдегида на 0.1 М фосфатном буфере Зёренсена. Дальнейшая подготовка препаратов для электронной микроскопии была стандартной. Облученные клетки после
заливки в Эпон-812 выбирали под фазово-контрастным микроскопом. Серийные ультратонкие
срезы этих клеток просматривали и фотографировали на электронных микроскопах HU-11B
и HU-12 («Хитачи», Япония).
Прижизненные и флуоресцентные исследования проводили на фотомикроскопе «Оптон».
Живые движущиеся клетки наблюдали и фотографировали при фазово-контрастном освещении на пленку «Микрат-300» с интервалом между кадрами 30 с. Скорость передвижения ней875
трофилов подсчитывали на полученных фотографиях по изменению положения центров клеток (середина длинной оси клетки). Характеристикой степени ориентированности
движения служило хемотаксическое отношение, вычислявшееся как отношение
перемещения центров клеток в направлении мишени некротаксиса к длине траектории
этого перемещения. Хемотаксическое отношение имеет знак «+», если вектор суммарного
перемещения клетки направлен в сторону клетки-мишени; если этот вектор направлен в
противоположную сторону, то хемотаксическое отношение имеет знак «—». Если клетка
не передвигалась или вектор перемещения перпендикулярен направлению на мишень, то
хемостоксическое отношение равняется 0. Температуру 37—39 °С на предметном столике
микроскопа поддерживали с помощью фена. Флуоресценцию акридинового оранжевого и
ФИТЦ-меченных антител наблюдали при длине волны более 520 нм и фотографировали на
пленку РФ-3 (чувствительность — 1200 ед. ГОСТ).
Результаты
Сенсибилизированные акридиновым оранжевым нейтрофилы хорошо распластываются на покрытых полилизином стеклах. Через 15—30 мин при температуре 37—39 °С происходит активация от 10 до 80 % клеток и они начинают
.двигаться со скоростью 6—30 мкм/мин. Активированные клетки всегда поляризованы, т. е. имеют морфологически и функционально различающиеся
передний и задний концы. Движение нейтрофилов представляет собой цикличеТаблица 1
Параметры движения нейтрофилов в градиенте некротаксиса
Клетка
Длина траектории, мкм
Хемотаксическое Время наблюдеотношение
ния, мин
Средняя скорость Начальное расстояние
движения, мкм/мин до клетки-мишени,
мкм
1
31.8
+0.83
2
15.9
42.7
2
30.9
+0.97
2
15.5
41.8
3
36.4
+0.98
2
18.2
46.3
4
23.6
+0.84
2
11.8
74.5
5
30.0
0
2
15.0
41.8
6
0
0
2
0
58.2
7
28.3
+0.79
1.5
18.9
110
8
23.6
+0.80
1.5
15.7
70
П р и м е ч а н и е . Таблица иллюстрирует поведение клеток, показанных на рис. 4 и 5. Клеточный
центр клеток 5 и 6 облучен в дозе 0.02 Дж. Клетки 7 и 8 появились в наблюдаемом поле зрения в ходе
эксперимента, полная их траектория не прослежена.
ское повторение нескольких последовательных стадий: 1) образование игловидных филлоподий (двух, реже — трех); 2) переход филлоподий в
лопастевидные ламеллоподии (одна, реже — две); 3) быстрое одновременное
перемещение большого числа гранул в ламеллоподию; 4) перемещение
центросомы и ядра с комплексом органелл эндоплазмы; 5) подтягивание задней
части цитоплазмы. Облучение производилось между 3-й и 4-й стадиями, т. е.
после заполнения вновь образованной ламеллоподии гранулами, но до начала
перемещения эндоплазмы. На этой стадии клетки максимально распластаны,
между сегментами ядра у них видна небольшая (около 2 мкм) зона, свободная
от гранул (рис. 2; см. вкл. II). Данные иммунофлуоресцентного окрашивания
антителами к тубулину (рис. 3) и электронной микроскопии подтвердили, что в
ней находится клеточный центр с парой центриолей.
Как показали предварительные эксперименты, окрашивание клеток акридиновым оранжевым не сказывается на их поведении: скорость движения и доля
подвижных клеток практически не меняются. В камере для прижизненных
наблюдений нейтрофилы сохраняют свою подвижность в течение нескольких
часов.
876
После разрушения одного из нейтрофилов лазерным облучением в
большой дозе остальные клетки в радиусе 50—100 мкм изменяли направление
своего движения и перемещались к убитой клетке-мишени некротаксиса. Были
проанализированы треки движения 25 клеток к 9 клеткам-мишеням. Средняя
скорость движения нейтрофилов в условиях некротаксиса составила 17.3+5.0
мкм/мин (x±xs), хемотаксическое отношение — 0.80+0.13. Пример такого
эксперимента приведен на рис. 4, а—г (см. вкл. III) (на рис. 5 приведены треки
движения тех же клеток). Можно видеть, что необлученные клетки движутся к
мишени по прямолинейным или слегка искривленным траекториям.
Параметры движения клеток приведены в табл. 1.
Рис. 5. Треки клеток, представленных на рис. 4.
Штриховыми контурами обозначено начальное положение клеток, сплошной линией — их положение через
150 с. Жирным -контуром выделена клетка-мишень. Клетки 5 и в были облучены в район клеточного
центра. Клетки 7 и 8 появились в наблюдаемом поле зрения в ходе опыта (их начальное положение не
показано).
В спонтанно движущихся нейтрофилах облучался один из следующих районов: клеточный центр (всего было облучено 22 клетки), передняя часть цитоплазмы (10 клеток), задняя часть цитоплазмы (9 клеток), один из сегментов
ядра (14 клеток). После микрооблучения клеточного центра (доза 0.02—0.12
Дж) движение нейтрофилов прекращалось и не возобновлялось но крайней
мере в течение 30 мин. При этом клетки продолжали образовывать филоподии
и ламеллоподии. В том направлении, в котором клетка двигалась до облучения,
их образование происходило более активно. Облученные таким образом клетки
теряли способность к перемещению эндоплазмы, у них отсутствовал ток гранул
в ламеллоподиях, хотя в некоторых случаях отдельные гранулы могли туда
проникать. Доза, достаточная для получения 100%-ного эффекта остановки
нейтрофилов при микрооблучении центросомы, колебалась в разных опытах
(различия, по-видимому, связаны с неидентичностью свойств клеток от разных
доноров). Поэтому в качестве контроля мы в каждом опыте облучали все участки клеток в подобранной «достаточной» дозе.
877
Облучение других, помимо клеточного центра, районов клеток никогда не
приводило к остановке их движения, хотя поведение облученных нейтрофи-лов
могло несколько измениться. Микрооблучение участка цитоплазмы позади ядра
не приводит к каким-либо видимым изменениям в движении клеток^ Облучение
одного из сегментов ядра в ряде случаев приводило к временной; (около 1 мин)
остановке, а затем движение возобновлялось в прежнем направлении. После
облучения участка цитоплазмы (содержащего гранулы) в передней части клетки
в большинстве случаев не перемещаются в направлении облученной
ламеллоподии, а образуют новую ламеллоподию под небольшим углом к
прежней. Траектория движения клетки при этом практически не меняетсяТаблица 2
Влияние облучения различных районов
клеток на их подвижность в градиенте
некротаксиса
Район облучения
Число клеток с разным результатом
Облучения
ненаправс движением
Общее число неподвиж- сленным
двипо хемотакклеток
ных
жением
сису
Клеточный центр
22
19
3
0
Ядро
11
2
0
9
Цитоплазма
Передней части клеток
задней части клеток
10
9
0
0
1
0
9
9
В экспериментах по изучению поведения нейтрофилов в условиях некротаксиса было облучено в различные районы всего 52 клетки (табл. 2). Как и в
предыдущей серии опытов, доза облучения для разных районов нейтрофило» в
каждом эксперименте была одинакова. После облучения поведение клеток
регистрировали в течение 2—3 мин (за это время, как правило, необлученные
клетки наползали на мишень, и градиент некроаттрактанта исчезал). В подавляющем большинстве случаев нейтрофилы после облучения клеточного
центра теряют способность к движению вообще, по 3 из 22 клеток не остановились, а изменили направление своего движения. Однако направление их последующего движения существенно отличалось от направления движения
контрольных клеток. Хемотаксическое отношение их движения от —1' до 0.
Трек одной из таких клеток (клетка № 5) приведен на рис. 5. Абсолютное большинство нейтрофилов, облученных в ядро, переднюю и заднюю части цитоплазмы, не теряли способности к движению и ползли по направлению градиента к клетке-мишени.
Поскольку при выбранных дозах облучения клетки останавливаются,, то
закономерен вопрос: не будет ли избирательно подавляться способность
нейтрофилов к ориентации в градиенте без полной потери подвижности, если:
облучать их клеточный центр в более низких дозах? Оказалось, что при дозе
облучения менее 0.005 Дж все клетки вели себя так же, как контрольные. Облучение клеточного центра дозами от 0.005 до 0.05 Дж имело различные последствия для отдельных клеток. Всего в этой серии было облучено 34 клетки, а
затем проанализировано их поведение в условиях некротаксиса. Большинство
из этих клеток (21), так же как и в предыдущих экспериментах, потеряло способность к движению. 4 клетки продолжали двигаться, но не по градиенту;
наконец, 9 клеток двигались по градиенту в некротаксисе, как и контрольные.
Для электронно-микроскопического изучения нейтрофилы, облученные в
область клеточного центра и потерявшие после этого подвижность, фиксировали через 1, 3—5 и 30 мин. Всего было исследовано 7 клеток.
878
В контрольных (необлученных) клетках клеточный центр располагается почти
в геометрическом центре клетки, между сегментами ядра, на небольшом
расстоянии от субстрата. В нем на расстоянии не более 0.4 мкм друг от друга
находятся две центриоли. На активной центриоли имеются перицентриолярные
сателлиты и придатки. Между центриолями располагаются, как правило, свободные фокусы схождения микротрубочек. От сателлитов и от свободных фокусов отходят радиально многочисленные микротрубочки (рис. 6, а, б; см. вкл. III).
Район клеточного центра, имеющий на ультратонких срезах, проходящих через
центриоли, поперечник около 1 мкм, свободен от гранул. Непосредственно вокруг
центросомы в виде пояса располагаются диктиосомы комплекса Гольджи.
Внутренний диаметр этого «пояса 0.7—1.3 мкм, ширина 0.4—0.6 мкм. Таким
образом, внешний диаметр комплекса Гольджи примерно соответствует границам свободной от гранул видимой в световой микроскоп зоны, в центре которой
находятся центриоли. Ультраструктура клеточного центра, как и облученного
нейтрофила, в целом не отличалась от контроля: не изменились ни структура
центрполей, ни количество отходящих от сателлитов и свободных фокусов
микротрубочек. Не было обнаружено каких-либо нарушений структуры комплекса Гольджи, нейтрофильных гранул и ядерной оболочки, находившихся в
непосредственной близости от района облучения. Эта картина сохранялась в
клетках, зафиксированных через 30 мин после облучения (рис. 6, в—е).
Обсуждение
Как показали наши эксперименты, нейтрофилы человека хорошо распластываются на покрытых полплизином стеклах. При этом скорость их движения
практически не замедляется: она составляет от 6 до 30 мкм/мин, в то время как
скорость колеблется от 6 до 45 мкм/мин (Ramsey, Harris, 1973; Bandmann et al.,
1974; Wilkinson et al., 1982; Howard, Meyer, 1984). Поляризация и активация
нейтрофилов на стекле при 37 °С происходят через 15—30 мин (Haston, Shield,
1986). В наших экспериментах нагруженные акридиновым оранжевым клетки
вели себя аналогичным образом. Единственное различие состоит в том, что мы
наблюдали до 80 % активно движущихся клеток, что значительно больше, чем
описывалось ранее (Маянский, Маянский, 1983; Keller et al., 1983). Вероятно, и
акридиновый оранжевый, и полилизин оказывают дополнительное активирующее воздействие на эти клетки.
В настоящей работе нами приводится подробное описание локомоторного
цикла нейтрофилов. В отличие от других авторов (Malech et al., 1977; Zigrnond,
1978; Flaherty et al., 1979) мы предполагаем выделить в две дополнительные стадии последовательно происходящие процессы: быстрое одновременное перемещение большого числа гранул во вновь образованную ламеллоподию и перемещение центросомы с ядром и комплексом органелл эндоплазмы. Таким образом,
движение нейтрофила представляет собой циклическое повторение пяти различающихся по общей структуре клетки и ее активного края состояний.
Иммуноцитохимическое и электронно-микроскопическое исследование мигрирующих нейтрофилов человека подтвердило сделанный ранее вывод о том,
что клеточный центр в них всегда находится между сегментами ядра в центральной части клетки (Гудима и др., 1984). В настоящей работе мы ни разу не
наблюдали случаев разбегания центриолей, описанных при стимуляции нейтрофилов (Schliwa et al., 1982), а также клеток, у которых центриоли располагались позади ядра (Anderson et al., 1982). Расположение центриолей внутри
клеточного центра в движущихся и остановленных в результате микрооблучения нейтрофилах было произвольным: их взаимно перпендикулярная ориентация, отмечавшаяся в эозинофилах тритона (Koonce et al., 1984), в наших опытах
встречалась относительно редко.
879
При облучении клеточного центра сенсибилизированных красителем нейтрофилов не отмечено повреждений облученного района. Это позволяет
сделать
предположение
о
фотохимическом
механизме
нарушения
функционирования центросомы. Фотохимические процессы, индуцированные
возбуждением под действием микрооблучения акридинового оранжевого,
могут вызвать образование высокоактивных интермедиатов (синглетный
кислород, перекиси и т. п.), которые могут оказывать общетоксическое
воздействие на клетку вне зависимости от места их возникновения, т. е. от
района облучения. Для проверки этой возможности нами были облучены
различные районы клетки.
Облучение ядра, наиболее интенсивно окрашенного органоида клетки, не
приводит к прекращению движения нейтрофилов. Облучение переднего и
заднего участков цитоплазмы также не блокирует подвижности. Движение
нейтрофилов прекращается только в том случае, если микрооблученшо
подвергается район клеточного центра; таким образом, неспецифический
эффект этого воздействия отсутствует. В непосредственной близости от
центросомы в виде пояса вокруг нее располагается комплекс Гольджи,
функционирование которого также может нарушаться при микрооблучении.
Однако в ряде опытов из-за быстрого движения клеток луч диаметром 0.3 мкм
фокусировался не в центр свободной от гранул зоны, а в ее край, попадая в
диктносомы комплекса Гольджи и не задевая центросому. В этом случае
движение не прекращалось. Полученные нами результаты определенно
указывают на то, что поражение именно клеточного центра подавляет
подвижность клеток.
Как уже упоминалось во введении, в литературе имеется лишь одна подобная работа, выполненная на эозинофилах тритона (Koonce et al., 1984). Результаты работы Кунса с соавторами и настоящего исследования несколько различаются, что может быть связано как с различием между использовавшимися
лазерами, так и с различием между клетками. В отличие от Кукса с соавторами
нам не удалось подобрать дозу облучения, при которой можно
преимущественно получать клетки с измененным характером движения. В
наших экспериментах при дозах облучения от 0.005 до 0.12 Дж подавляющее
большинство клеток теряло способность к движению, хотя клетки сохраняли
поляризацию и не происходило сильного их распластывания, свойственного
неподвижным ней-трофилам. В небольшой доле случаев (около 10 %) клетки
теряли способность ориентироваться в градиенте некротаксиса, но продолжали
движение. Другое отличие от экспериментов по микрооблучению эозинофилов
тритона, как уже было отмечено, состоит в том,что в наших опытах изменение
клеточного поведения не сопровождалось ультраструктурными изменениями
как в клетках, зафиксированных непосредственно после облучения (через 1
мин), так и через 30 мин после него.
Полученный в данной работе эффект прекращения или частичного нарушения движения клеток, возможно, аналогичен изученному ранее на этой же
установке (Воробьев и др., 1988) эффекту нарушения анафазного движения
хромосом и цитотомии при облучении центросомы на ранних стадиях митоза.
И в том и в другом случае механизм нарушения функционирования центросомы, по-видимому, фотохимический. Уменьшения количества микротрубочек
вблизи центросомы не наблюдается. Это объясняется, как мы считаем, тем, что
нарушается динамический процесс их образования. При этом центросома
теряет способность к полимеризации новых микротрубочек, в то время как
старые продолжают прикрепляться к ней. В результате этого система
микротрубочек перестает обновляться, нейтрофил теряет способность
переносить центросому с ядром и комплексом органелл эндоплазмы и, таким
образом, завершить свой локомоторный цикл.
880
Список литературы
Воробьев И. А., Дранее В. А., Чепцов Ю. С. Инактивация центросом в митозе лазерным
микрооблучением // Биополимеры и клетка. 1988. Т. 4, № 6. С. 313—320. — Воробьев И. А.,
Надеждина Е. С. Центриолярный аппарат и его роль в организации микротрубочек // Итоги
науки и техники. Сер. «Общие проблемы физико-химической биологии». Т. 7. М.: ВИНИТИ,
1987. 126 с. — Гудима Г. О., Воробьев И. А., Ченцов Ю. С. Клеточный центр макрофагов,
гранулоцитов и лимфоцитов при распластывании, поляризации и движении клеток in vitro //'
Цитология. 1984. Т. 26, № 9. С. 1002—1007. — Маянский А. Я., Маянский Д. Н. Очерки о
нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1983. 256 с. •— Anderson D. С., Wible L. Y.,
Hudhes В. J . , Smith С. W., Brinkley В. R. Cytoplasmic microtubules in polymorphonuclear leucocytes: effects of chemotactic stimulation and colhicine // Cell. 1982. Vol. 31. P. 719—729. •—
Bandmann U., Rydgren L., Norberg B. The differense between random movement and chemo-taxis
// Exp. Cell Res. 1974. Vol. 88. P. 63—73. — Berns M. W., A i s t J . , Edward J . , Strahs K., Girton
J., McNeill P., Rattner J. В., Kitzes M., Hammer-Wilson M., Liav L. H., Siemens A., Ko~ once M.,
Peterson S., Brenner S., Burt J., Walter H., Bryant P. /., van Dyk D., Colombe J . , Ca-hill Т., Berns
G. S. Laser microsurgery in cell and developmental biology // Science. 1981. Vol. 213. P. 505—513.
— Berns M. W., Rattner J . , Brenner S., Meredith S. The role of the centriolar region in animal
cell metosis // J. Cell Biol. 1977. Vol. 72. P. 351—367. — Berns M. W., Richardson S. M.
Continuation of mitosis after selective laser microbeam destruction of the centriolar region // J.
Cell Biol. 1977. Vol. 75. P. 977—981. — Flaherty J. Т., Showell L., Becker E. L., Ward P. A.
Neutrophiles aggregation and degranulation // Amer. J. Patol. 1979. Vol. 95. P. 433—444. •—
Fuller G. M., Brinkley B. R., Boughter J. M. Immunofluorescence of mitotic spindle by using
monospecifical antibody against bovine brain tubulin // Science. 1975. Vol. 187. P. 948—950. —
Hasten
W. S., Shield J. M. Signal transduction in human neutrophil leucocytes: effects of external
Na+ and Ca2+ on cell polarity // J. Cell Sci. 1986. Vol. 82. P. 249<— 261. — Howard T. H., Meyer
W. H. Chemotactic peptide modulation of actin assembly and lokomotion in neutrophiles // J. Cell.
Biol. 1984. Vol. 98. P. 1265—1271. — Keller H. U., Zimmerman A., Cottier H. Crawling-like
movement, adhesion to solid substrate and chemokinesis of PMN leucocytes // J. Cell. Sci. 1983.
Vol. 64. P. 89—106. — Koonce M. P., Cloney R. A., Berns M. W. Laser irradiation of
centrosomes in newt eosinophiles evidence of centriole role in motility // J. Celk Biol. 1984. Vol.
98. P. 1999—2010. — Malech H. L., Root R. K., Gallin J. I. Structural analisis of human
neutrophilsmigration // J. Cell Biol. 1977. Vol. 75. P. 666—693. — Ramsey W. S., Harris A.
Leucocytes locomotion and its inhibition by antimitotic drugs // Exp. Cell Res. 1973.. Vol. 82. P.
262—270. — Schliwa M., Pryzwansky В., Eutener U. Centrosome splitting in neutrophils. An
unusual phenomen related to cell activation and motility // Cell. 1982. Vol. 31. P. 705—717. —
Wilkinson P. S., Shields J. M., Hasten W. S. Contact guidance of human neutrophil leucocytes //
Exp. Cell Res. 1982. Vol. 140. P. 55—62. — Zigmond S. H. Chemotaxis by PMNLs // J. Cell
Biol. 1978. Vol. 77. P. 269—287. — Zigmond S. H . , Sillivan S. J. Sensory-adaptation of
leucocytes to chemotactic peptides // J. Cell Biol. 1979. Vol. 82. P. 517—527.
Поступила 15 VII 1988,
THE EFFECT OF LASER MICROIRRADIATION OF THE
CELL CENTER ON THE MOTILITY OF NEUTROPHILS,
R. E. Uzbekov, /. A. Vorobjev, V. A. Drachev
Interfaculty Problem Research Laboratory of Molecular Biology and Btoorganic Chemistry, Moscow
University
The cell center of human neutrophils spread on polylysine-coated coverslips was irradiated'
with an argon laser microbeam. After the cells were pretreated with acridine orange, the irradiation of the cell center in a dose of over 0.1 J completely and irreversibly suppressed the motility
of neutrophils (both random migration and chemotaxis), even though the cells retained their
polarization. The same dose, applied to the cell nucleus and the forward and backward edges of
the cytoplasm, resulted in little, if any, effect on cell motility, and did not inhibit their movement toward the target. Electron microscopy of the cells with the irradiated center showed the
microtubules to persist for no less than 30 minutes; no visible destruction was caused in the cell
center structure. Consequently, the cell center directly controls (not through polymerization of
microtubules) the motility of neutrophils.
К ст. Р. Э. Узбекова, И. А. В о р о б ь е в а , В. А. Драчева (с. 874)
Рис. 2. Живой нейтрофил, распластанный на стекле.
а — флуоресценция при окраске акридиновым оранжевым; б — та же клетка при фазово-контрастном
освещении. Об. 100 х, ок. 10 X.
Рис. 3. Лизированные нейтрофилы, фиксированные 4%-ным формальдегидом.
а — иммунофлуоресцентное окрашивание антителами к тубулину; б — те же клетки при фазово-контрастном освещении. Об. 40X, ок. 10х.
ВКЛЕЙ
К А III К ст. Р. Э. Узбекова, И. А. Воробьева, В. А.
Драчева (с. 874)
Рис. 4. Некротаксис нейтрофилов к клетке-мишени.
а—г — 30, 60, 90 и 150 с после облучения соответственно. Стрелками указаны клетки, облученные в районе
клеточного центра в дозе 0.02 Дж. Об. 40 X, ок. 10 X.