ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «МОСКОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОТЕХНОЛОГИИ ИМЕНИ К.И. СКРЯБИНА» На правах рукописи. Петров Михаил Алексеевич Влияние иммунных факторов на воспроизводительную функцию коров 06.02.06 – ветеринарное акушерство и биотехника репродукции животных. Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Научный руководитель: академик РАСХН, доктор биологических наук, профессор В.П. Дегтярев Москва – 2011 Оглавление Введение……………………………………………….........……………...4 1. Обзор литературы………..……………………….......…….…...………12 1.1. Иммунная система………………………………................……………...12 1.2. Элементы Иммунной системы……………………....................………...15 1.3. Антигены тканевой совместимости………………….......…..…………..17 1.4. Клеточный иммунитет ………………………………….............………..20 1.5. Гуморальный иммунитет…………………………….................………...22 1.6. Антитела к спермиям………………………………….........…………..…27 1.7. Антигены прозрачной зоны…………………………..................………...34 1.8. Пути повышения резистентности животных…………….……................38 2. Собственные исследования…………..…..............………………..........43 2.1. Материалы и методы исследований………….......……………..……….43 2.2. Методы исследования иммунитета…………...……………….…………46 2.2.1. Определение Т- и В-лимфоцитов……………………….……….….……46 2.2.2. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов крови…..….…..58 2.3. Определение уровня иммуноглобулинов в маточной слизи коров…………………….......……………………………..……..…60 2.4. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов в маточной слизи коров…….......………………………………..…….…64 2.5. Диагностика иммунного бесплодия коров……………..……..….……...67 2.6. Характеристика иммуномодулятора Миелопид……………..……....….69 3. Результаты собственных исследований………………………............70 3.1. Результаты акушерско-гинекологической диспансеризации коров в учебно-опытном хозяйстве «Бессоново»………......……….….70 3.2. Динамика показателей иммунитета у коров черно-пестрой 2 породы……….......………………………………………………...……..72 3.2.1. Значение иммунных факторов в нарушениях репродуктивной функции у коров…………………......…………...…..72 3.3 Значение иммунных факторов в регуляции репродуктивной функции коров………........……………………….….77 3.3.1. Содержание иммуноглобулинов в цервикальной слизи и сыворотке крови коров в стадию возбуждения полового цикла........………………………………………………….…77 3.3.2. Содержание лейкоцитов в крови подопытных коров………..….........78 3.3.3. Фагоцитарная активность нейтрофилов в цервикальной слизи у коров в стадию возбуждения полового цикла…….........…....79 3.3.4. Содержание Т-лимфоцитов в крови коров…………….…….…..........81 3.3.5. Содержание Т-хэлперов в крови коров………………….….……........82 3.3.6. Содержание Т-супрессоров в крови коров………………….........……83 3.3.7. Содержание В-лимфоцитов в крови коров……………….…..........…..85 3.3.8. Результаты воспроизводства коров…………………………..…...........86 3.3.9. Определение экономического ущерба от бесплодия коров…..............87 4. Обсуждение результатов исследований……………..……..…..........96 5. Выводы………………………………...…………………….…........…108 6. Практическое использование полученных научных результатов…………………………..………………….…..……........110 7. Рекомендации по использованию научных выводов……….........112 8. Библиографический список…………………………....…......……..113 9. Приложения 3 Введение Актуальность темы. Плодовитость коров – это их способность ежегодно приносить потомство, поэтому в системе мероприятий по увеличению воспроизводства животноводческой продукции и улучшения показателей воспроизводства стада в сельскохозяйственных предприятиях страны большое значение имеет интенсификация воспроизводства крупного рогатого скота (А.П. Студенцов, 1961; А.В. Бесхлебнов, 1967; А.Г. Нежданов, 1973; И.И. Родин, 1976; Н.А. Флегматов, 1977; Н.И. Полянцев, 1978; В.С. Шиплов, 1986; И.А. Порфирьев, 2006; И.А. Порфирьев, А.М. Петров, 2009). Оптимальный больше уровень приплода и воспроизводства, молочной продукции позволяющим от коров, получать существенно сдерживается из – за различных расстройств в функционировании их иммунной системы (Е.С. Воронин, А.М. Петров, М.М. Серых, Д.А. Девришов, 2002). Весь процесс созревания половых клеток: оплодотворение, имплантация эмбриона в эндометрий матки, его дальнейшее развитие в организме матери отмечен активными иммунологическими процессами (М.М. Серых, В.В. Зайцев, Н.А. Кленова и др., 2004). В.И. Говалло (1987) считает, что сперма, как продукт белковой природы, является антигеном, поэтому на каждое поступление спермы в гениталии самок в их организме образуются антиспермальные антитела. Попытки связать иммунологическую регуляцию фертильности с продукцией в организме самки антител к спермиям предпринимались уже давно, но окончательной ясности в этом вопросе нет до сих пор (И.И. Мечников, С.И. Метальников, 1900; Р.Д. Чантуридзе, 1975, И.И. Соколовская, В.К. Милованов, 1981, В.И. Говалло, 1987, А.М. Петров 2007, В.И. Трухачев, В.Я Никитин, В.М. Михайлюк и др., 2008). 4 Предполагается, что оплодотворяемость коров во многом снижается из – за различных нарушении воспроизводительной функции у производителей. В.И. Говалло (1987) считает, что сперма производителей содержит более 30 различных антигенов, и при определенных условиях они способны индуцировать образование антиспермальных антител в организме самки и вызвать их бесплодие. Воспроизводство и молочная продуктивность у самок — это тесно взаимосвязанные между собой физиологические процессы, в которых участвуют не только половые органы и молочная железа, ну и весь организм. При нарушении взаимосогласованности регулирующих центров органов размножения, связанном с повышенной функцией молочной железы, воспроизводительная деятельность у коров резко снижается, появляется бесплодие. При высокой молочной продуктивности, свыше 5000 кг молока в год от каждой коровы, главная причина бесплодия — неправильная система раздоя коров после родов. При несбалансированном кормлении и обильной лактации отдельные весьма важные для жизнедеятельности вещества могут выделяться в количествах, значительно превышающих поступление в их организм с кормом. Одна из главных причин бесплодия, особенно у первоотелов, удлиненная лактация. При длительной функциональный лактации антагонизм между наиболее резко молочной железой проявляется и органами размножения. Это возникает вследствие неправильной системы раздоя с разносторонним кормлением, активизирующим обменные процессы. Нарушается функциональное равновесие в гипотоламо — гипофизарной 5 системы организма, и прежде всего между регулирующими центрами половой функции и молочной железы. При проведении мероприятий по профилактике и ликвидации бесплодия особое внимание необходимо обращать на рациональное полноценное кормление. Для этого всех животных в хозяйстве следует обязательно содержать группами с учетом их физиологического состояния и продуктивности. Мероприятия по профилактике бесплодия у коров при раздое осуществляются с таким расчетом, что бы получить от животных максимальную молочную продуктивность и оплодотворить их в течение 25 — 42 дней после родов. В связи с этим раздой коров ведут за счет увеличения в рационе грубых и сочных кормов, а объем концентрированных кормов не должен превышать 200 г/кг молока. Цель и задачи исследований Целью наших исследований является изучение основных причин бесплодия коров, связанных с функционированием их иммунной системы. Для достижения поставленной цели нами были поставлены следующие задачи: - установить титры сывороточных спермиоагглютининов в цервикальной слизи и в сыворотке крови у коров с нормальным течением послеродового периода, оплодотворение которых наступило после 2х кратного осеменения в первую половую охоту после родов; - установить титры сывороточных спермиоагглютининов в цервикальной слизи и в сыворотке крови коров с нормальным течением послеродового периода, оплодотворение которых не наступило после многократных их осеменений; 6 - изучить основные параметры клеточного и гуморального иммунитета у бесплодных коров; - установить основные факторы иммунной системы, которые вызывают стойкую инфертильность коров; разработать рекомендации производству по профилактике и терапии иммунного бесплодия коров. Научная новизна Впервые изучены основные причины иммунного бесплодия коров в условиях Московской области. Определены параметры клеточного и гуморального иммунитета у коров с нормальным течением послеродового периода, оплодотворение которых наступало при искусственном осеменении в первую половую охоту после родов. Изучено содержание иммуноглобулинов в цервикальной слизи и сыворотке крови коров с нормальным течением послеродового периода, оплодотворение которых наступало в первую половую охоту после родов и у коров многократно осемененных, но остающихся бесплодными. Изучена фагоцитарная активность нейтрофилов в цервикальной слизи и крови коров с нормальной плодовитостью и у бесплодных животных. Впервые были изучены показатели клеточного и гуморального иммунитета и их взаимосвязь многократно осеменяемых, у коров с нормальной плодовитостью и но длительный период остающихся бесплодными. Впервые установлены основные причины бесплодия коров, вызванные иммунными факторами, разработаны практические рекомендации по их устранению. 7 Теоретическая и практическая значимость Впервые изучено содержание Т – лимфоцитов и их субпопуляций: Т – лимфоцитов – супрессоров, Т – хэлперов и Т – киллеров, а также IgG, IgM, Влимфоцитов и нейтрофилов в цервикальной слизи и крови коров с нормальной плодовитостью и у бесплодных коров. Установлены титры спермиоагглютининов в крови коров, которые вызывают стойкую их инфертильность. Впервые нами было установлено, что высокие титры антиспермальных антител в цервикальной слизи и крови бесплодных коров объясняются более высоким содержанием в их крови IgG, IgM, В-лимфоцитов, нейтрофилов (микрофагов), что указывает на активизацию их гуморального иммунитета. Также у бесплодных коров выявлено угнетение основных параметров клеточного звена иммунитета – Тлимфоцитов, Т-хэлперов, Т-супрессоров. Рекомендованы мероприятия по устранению основных факторов, вызывающих иммунное бесплодие у коров, иммуномодулирующей терапии и профилактики. 8 с использованием Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту 1. Анализ репродуктивной функции у коров черно – пестрой породы. 2. Определение титров спермиоагглютининов в цервикальной слизи и крови коров с нормальным течением послеродового периода и оплодотворившихся при их искусственном осеменении в первую половую охоту после родов и у коров, остающихся бесплодными после многократных осеменений. 3. Показатели основных параметров клеточного и гуморального иммунитета у бесплодных коров. 4. Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов в цервикальной слизи и крови у коров с нормальной плодовитостью и у бесплодных коров. 5. Основные факторы иммунитета, которые вызывают стойкую инфертильность у коров. 6. Рекомендации производству по устранению иммунных факторов, негативно влияющих на воспроизводительную функцию коров с использованием иммуномодулирующей терапии. 9 Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на конференциях профессорско – преподавательского состава, научных сотрудников, молодых ученых и аспирантов Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (2007-2011); Международной научно – практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного акушерства, гинекологии и биотехники размножения животных» (Ставропольский ГАУ, 15-18 мая 2007); Международной научно – практической конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения» (ВИЖ, Дубровицы, 21-23 октября 2008); Международной научно – практической конференции «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (ВИЖ, Дубровицы, 25-26 октября 2007); Международной ветеринарного конференции, образования государственной академии и посвященной 200 основания Санкт ветеринарной – летию – медицины высшего Петербургской «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных» (Санкт – Петербургская ГАВМ, 2931 октября 2008); на Всероссийском семинаре «Опыт создания и работы сервисных центров по воспроизводству сельскохозяйственных животных в рамках реализации Государственной программы развития сельского хозяйства» (ВИЖ, Дубровицы, 22-24 сентября 2009); Международной научно – практической конференции: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения» (РАМЖ, Быково, 16-18 июня 2010). 10 Публикации По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 2– в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, рекомендаций по использованию научных выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 12 таблицами. Список использованной литературы содержит 233 источника, из них 75 иностранных авторов. 11 1. Обзор литературы 1.1. Иммунная система Термин «иммунитет» происходит от латинского слова «immunis» (так в древнем Риме называли гражданина, свободного от определенных государственных повинностей). Первоначально этот термин использовался для обозначения резистентности организма к инфекциям, а иммунология составляла дисциплину, изучающую финомен иммунитета. В настоящее время это определение существенно расширено и касается множества реакций, направленных на элиминацию из организма любого чужеродного материала. К области иммунологии относятся также проблемы патологии, связанные с нарушением нормального хода иммунных реакций. Кроме того, наблюдается активное взаимопроникновение иммунологии в целый ряд ставших смежными дисциплин, таких как генетика, эмбриология, экология и др. (58,64,77,91,102,103,133). Антигены – вещества, специфически реагирующие с антителами или клеточными рецепторами и способные индуцировать продукцию антител, либо специфические клеточные реакции. Вещества, реагирующие с антителами, но неспособные при введении в организм вызвать продукцию антител, называются гаптенами. (130,131,132,172,183,192). Антитела – вещества, продукция которых может быть вызвана введением в организм антигенов или гаптенов при условии, что последние химически связаны с носителем. Непременным свойством антител является их способность специфически связываться с антигенами или гаптенами. (103,104,105,109). 12 Иммунологическая память – способность организма отвечать на повторное введение антитела иммунной реакцией, характеризующейся большей силой и более быстрым развитием. Иммунная система, так же как и другие системы высших позвоночных, (нервная, эндокринная), призвана обеспечить наилучшую приспособляемость организма к условиям внешней среды. Если формализовать признаки, характерные для этих основных систем, то окажется, что иммунная система более всего напоминает нервную. Действительно, обе системы могут распознавать «свое» и «чужое», способствуя, таким образом, самоидентификации организма в окружающей среде. Обе системы реагируют на внешние воздействия с исключительно высокой специфичностью. Обе системы обладают свойством памяти. В обоих случаях распространения сигнала внутри системы осуществляется по принципу сетей. Следуют, однако, заметить, что в основе указанного сходства могут лежать совершенно различные механизмы. (160,170,178,193,225). Помимо сходства, имеются и различия, главным из которых является способность клеток иммунной системы действовать в автономном режиме, что абсолютно исключено для клеток нервной системы. Уникальность иммунной системы состоит в том, что ее клетки могут одновременно выполнять рецепторные, секреторные и эффекторные функции и, обладая подвижностью, мобильно осуществлять свою сенсорную, регуляторную и защитную роль в то время и в том месте организма, когда, где и с какой интенсивностью это требуется. Таким образом, нервная и эндокринная системы как бы осуществляют химический и физический мониторинг через «стационарные посты» (нейроны, специализированные эндокринные клетки и другие структуры) наблюдения за химическими и физическими показателями, а иммунная система осуществляет генетический мониторинг – как через «стационарные 13 посты» (макрофаги и лимфоциты в различных тканях), так и через мобильные группы клеток (моноциты и лимфоциты крови, лимфы, межклеточной жидкости). (28,132,190,212). При осуществлении изменений химических, физических и биологических показателей гомеостаза, регуляторные системы включают свои механизмы для его поддержания на необходимом для организма уровне. Нервная, эндокринная и иммунная системы регуляции выступают, с одной стороны как самостоятельные, а с другой – как тесно взаимосвязанные системы, о чем свидетельствует наличие хорошо развитой симпатической и парасимпатической иннервации желез внутренней секреции, центральных и периферических лимфоидных органов, а также обнаружение в них общих гормонов, медиаторов и других биологических регуляторов. Например, некоторые нейроны головного мозга секретируют эндорфины и энкефалины, которые являются также составной частью, действующим началом лейкоцитарного интерферона, миелопептидов костного мозга, тимозина (гормона тимуса) и некоторых других гормонов. Некоторые гистогормоны (гистамин, серотонин), а также истинные гормоны (вазопрессин, окситоцин, норадреналин) одновременно являются нейромедиаторами. Соматотропин образуется и в гипофизе и в лимфоцитах Ацетилхолин, норадреналин, серотонин помимо нервных клеток образуются и в лимфоцитах. ИЛ-1 продуцируются преимущественно мононуклеарными фагоцитами. Его продуцентами также являются нейтрофилы, В-лимфоциты, естественные киллеры, клетки нейроглии, нейроны головного мозга, периферические симпатические нейроны, мозговое вещество надпочечников. (107,108,131, 132, 197). 14 1.2. Элементы иммунной системы Клетки. Лимфоциты – клетки, ответственные за специфичность действия иммунной системы, а также за сохранение иммунологической памяти. С помощью специализированных популяций лимфоцитов организм способен различать «свое» и «чужое», распознавать чужеродные антигены, продуцировать антитела, а также осуществлять специфически направленные цитотоксические реакции. (30,169). Макрофаги и моноциты – филогенетически наиболее древние клетки иммунной системы. Моноциты являются циркулирующими в периферической крови макрофагами. Функции макрофагов разнообразны и не исчерпываются потребностями иммунной защиты организма. Впервые на защитную функцию макрофагов указал И.И. Мечников, открывший явление фагоцитоза (Нобелевская премия за 1908 г.). В настоящее время известна другая фундаментальная роль макрофагов – представление антигенов информацией лимфоцитам. Без этой функции макрофагов невозможно специфическое распознавание чужеродного антигена. Кроме того, макрофаги являются продуцентами многочисленных медиаторов иммунных реакций (простагландины, интерлейкины), а также факторов комплемента. Клетки К и покрытые крайне NК. К-клетки способны разрушать клетки-мишени, малыми количествами IgG-антител. NK-клетки (естественные киллеры) также являются цитотоксическими клетками, осуществляющими цитотоксический эффект (главным образом против опухолевых клеток) без предварительной иммунизации и в отсутствие антител. Другие клетки. Следует отметить тучные клетки и базофилы, играющие важную роль в реакциях воспаления и анафилактических реакциях, а также 15 полиморфно-ядерные нейтрофилы и базофилы, участвующие в неспецифических иммунных реакциях. Гепатоциты, которые наряду с макрофагами являются продуцентами факторов комплемента. Специфические медиаторы. Антитела представляют собой высокомолекулярные белки, относящиеся к семейству иммуноглобулинов (Ig). У человека и большинства млекопитающих различают 5 классов иммуноглобулинов: A, D, E, G и M. Антигенсвязывающие рецепторы лимфоцитов представляют собой мембранные рецепторы иммуноглобулиновой (для В-лимфоцитов) или неиммуноглобулиновой (для Т-лимфоцитов) природы. С помощью этих рецепторов клетка специфически распознает антиген. (130). Антигенспецифические медиаторы, продуцируемые Т-лимфоцитпми. К этой группе веществ относятся усиливающие и супрессорные факторы, синтезируемые лимфоцитами в процессе иммунного ответа. Неспецифические медиаторы. К неспецифическим медиаторам иммунного ответа относятся лимфокины, монокины, фактор некроза опухоли, фактор торможения миграции макрофагов, медиаторы гиперчувствительности немедленного типа (гистамин, серотонин, фактор активации тромбоцитов), интерфероны, лизоцим, а также комплемента. (203,213,232). 1.3. Антигены тканевой совместимости 16 система Все многоклеточные организмы обладают распознающими системами, которые способны отличать белки своего организма от чужого. Распознавание происходит на клеточной поверхности, где идет также широкий обмен ионов, метаболитов и биологических молекул. Одна такая система у позвоночных была изначально охарактеризована по способности отторгать кожный трансплантат и, в частности, у мышей она получила название Н-системы (Histocompatibiliti – тканевая совместимость). У мышей отдельные продукты Н-генов были исследованы с помощью антител (антисывороток), полученных от иммунизированных животных конгенных (отличающихся по одному Н-гену) или рекомбинатных линий, а также в клеточных реакциях, преимущественно в смешанной культуре лимфоцитов – СКЛ. Поскольку последняя является адекватной моделью распознавания рецепторов чужеродных клеток, то ее применяют в нескольких вариантах, в том числе и с использованием гомозиготных клеток от близкородственных особей. В настоящее время систему Н-генов исследуют с помощью моноклональных антител на молекулярном уровне. (28). В зависимости от биологических отличий антигены и антитела обозначают как аутологичные (собственные), сингенные (отличие в пределах одной инбредной линии), аллогенные (отличия в пределах одного биологического вида) и ксеногенные (при межвидовых отличиях). В соответствии с этим трансплантацию тканей называют аутотрансплантацией, сингенной трансплантацией аллотрансплантацией (гетеротрансплантация). (прежний термин (гомотрансплантация) В точно таком и же - изотрансплантация), ксенотрансплантацией биологическом смысле применяются термины сингенные и аллогенные беременности, иммунизация или искусственный (пассивный) перенос лимфоцитов и антител. 17 Система Н-генов присуща всем млекопитающим, она определяет синтез антигенов, которые еще до недавнего времени называли трансплантационными. У человека ее обозначают как систему HLA (Human Leukocyte Antigens), у шимпанзе – ChLA, у макак – RhLA, у собак – DLA, у крыс – Ag-В, у кроликов – RLA и т.д. Антигены, кодируемые этими генами, принадлежат к категории аллоантигенов, их собирательно именуют генами или антигенами МНС (Major Histocompatibiliti Complex – главный комплекс гистосовместимости). У различных видов животных найдено сходство в серологических свойствах, аминокислотном составе продуктов и гинетической организации МНС. (30,217,226). В дальнейшем выяснилось, что те же антигены играют важнейшую роль не только в отторжении трансплантата или реакции трансплантата против хозяина – РТПХ, но и в регуляторных процессах внутри самого организма, который их распознает как аутоантигены или собственные генетические «опознавательные знаки». Функциональная активность МНСгенов и сочетание кодируемых ими антигенов определяет чувствительность или, напротив, устойчивость организма к ряду наследственных и приобретенных заболеваний. МНС-гены регулируют иммунный ответ организма в целом и взаимодействие всех типов клеток, участвующих в иммунологических процессах, а также такие на первый взгляд неиммунологические явления, как плодовитость, размеры органов и тела, репарация ДНК. МНС-антигены, расположенные на поверхностной мембране клетки, выполняют по отношению к этой клетке защитную роль, подобно тому как антитела или лимфоциты защищают целостный организм. Считается, что система МНС-генов произошла из простейших самораспознающих систем с целью предупреждения слияния различных организмов и защиты от паразитов и контагиозных опухолей. 18 Сегодня различают гены МНС и кодируемые ими гликопротеины – антигены трех классов. Гены I класса кодируют молекулы клеточной поверхности, часть из которых присуща всем клеткам организма (отсюда их значение в реакциях несовместимости при пересадках тканей и беременности), а другая – только гемопоэтическим клеткам (возможно, дифференцировочные антигены). Антигены I класса МНС выявляются преимущественно серологически, т.е. с помощью специфических антисывороток. Гены МНС, составляющие II класс, кодируют поверхностные молекулы лимфоцитов и макрофагов, они регулируют их кооперативные взаимоотношения и регулируют иммунный ответ на многие антигены. Антигены II класса определяются клеточными и серологическими методами. Гены III класса изучены мало, они определяют синтез ряда белков, участвующих в активации комплемента. (28,64,130). 19 1.4. Клеточный иммунитет Хотя разделение общего иммунного ответа организма на клеточный и гуморальный достаточно условное, мы здесь придерживаемся такой схемы исключительно для удобства изложения. Под клеточным иммунитетом подразумевают реакции гиперчувствительности замедленного типа – ГЗТ или клеточной сенсибилизации, связанные со специфическим взаимодействием тимусзависимых лимфоцитов (Т-лимфоцитов) с клетками – мишенями. Последними могут быть клетки аллотрансплантата, измененные собственные клетки, бактерии и др. Соответственно говорят о трансплантационном, противоопухолевом, антибактериальном клеточном иммунитете. Предшественники Т-лимфоцита – стволовые Т-клетки возникают в желточном мешке, откуда затем мигрируют в печень и далее – в костный мозг эмбриона. Созревание этих стволовых элементов в зрелые Т-лимфоциты происходит в вилочковой железе (тимусе), откуда они затем выселяются в лимфатические узлы и другие периферические лимфоидные ткани. Определение Т-лимфоцитов с помощью антител к их специфическим поверхностным молекулам (характерным для всех Т-клеток является 0- или Thy-I-антиген) показало, что в вилочковой железе их содержание составляет 100%, в крови – 70%, в лимфатических узлах до 60%, в селезенке – 35% и 0% в костном мозге. В дальнейших экспериментах на мышцах было показано, что Тлимфоциты обладают разными свойствами – киллерной (Kill - убивать) и супрессорной активностью (Cantor H., Boyse E., 1975, 1977). Первые разрушают клетки-мишени, вторые осуществляют иммунорегуляторные функции. Дальнейший прогресс обозначился, когда было показано наличие Т-лимфоцитов – помощников или Т-хэлперов (help- помогать), которые 20 служат посредниками лимфоцитами. между Т-хэлперы антигеннесущими необходимы, с одной макрофагами стороны, и для дифференцировки В-лимфоцитов в антителобразующие клетки, а с другой – для созревания Т-киллеров и Т-супрессоров из соответствующих лимфоидных предшественников. На поверхности хэлперных и супрессорных лимфоцитов были выявлены специфические активные участки – Fc-рецепторы, связывающие иммуноглобулины (Ig). Fc-рецептор к Ig класса М оказался присущим Тхэлперам, Fc-рецептор к Ig класса G – Т-супрессорам (Moretta L. Et., 1977). Деление Т-лимфоцитов на Т-киллеры, Т-хэлперы (Тµ) и Т-супрессоров (Т ) оказалось очень полезным для понимания существа иммунорегуляторных процессов, хотя функции Тµ и Т -клеток нельзя сегодня окончательно охарактеризовать. Так, среди Т -клеток здоровых людей около 70% лимфоцитов обнаруживает цитотоксическую и естественную киллерную активность (Vanderbeeken Y., Yliegne M.P. et al., 1982). 21 1.5. Гуморальный иммунитет Гуморальный иммунитет связан с активностью В-лимфоцитов, предшественники которых образуются в эмбриональном периоде также в желточном мешке. Центральным органом В-иммунитета у птиц является сумка Фабрициуса (Bursa), а у млекопитающих, по-видимому, костный мозг. В-лимфоцит, получивший информацию об антигене от макрофага и одновременно от Т-хэлпера, стимулирующий его пролиферацию, претерпевает несколько последовательных делений и превращается в плазматическую клетку, синтезирующую антитела (Ig). Ig составляют 15% общего количества сывороточных белков, их молекулы обладают разными свойствами, а их продукция протекает с участием Т-хэлперов и Тсупрессоров. (30,222,229). Взаимодействие гуморальных антител с антигеном – с аллогенными или ксеногенными клетками – проявляются in vitro в разных лабораторных феноменах. Антитела могут склеивать, агглютинировать антиген- эритроциты, -лейкоциты, -спермии и т. д.; в таких случаях говорят о гемагглютининах, лейкоагглютининах, спермиоагглютининах и т.д. Широкое распространение получила также реакция непрямой агглютинации, когда к эритроцитам или нейтрофильным частицам (латекс, полиакриламидные бусы др.) присоединяют антиген, а затем добавляют антитела к нему, побуждающие склеиваться нейтральные частицы. Метод применяется для выявления растворимых антигенов, но обладает высокой чувствительностью. Цитотоксический эффект регистрируется по числу погибших клеток после экспозиции сыворотки с антигеном (лимфоцитотоксины, спермоцитотоксины и др.), причем в отличие от клеточно-опосредованного лизиса он происходит только в присутствий комплемента. (147). 22 Иммунофлюоресцентные методы основаны на том, что антитела соединяют с флюоресцентным красителем (обычно изотиоционатом натрия), а затем экспонируют с объектом исследования, который связывает этот краситель, если антитела специфичны (авидны) к данному антигену. Непрямую иммунофлюоресценцию проводят, как и непрямую агглютинацию, через промежуточную стадию, когда к исследуемому антигену (клетки ткани) присоединяют антитела, а затем добавляют сыворотку против этого антитела (анти-антитело) с красителем. Метод преципитации основан на выпадении в осадок комплекса растворимого антигена с вводимыми в реакцию сывороточными антителами. Вариант реакции в агаре удобен для характеристики антигенов (или антител) по числу преципитационных полос, появляющихся на границе их взаимодействия. Преципитация в агаре часто использовалась для изучения ауто- и алло-антигенов (в частности гамет), так как специфическую антисыворотку (сыворотку, полученную направленной иммунизацией животных исследуемым антигеном) можно абсорбировать разными тканями. Снижение числа свидетельствует линий о том, преципитации что в полученные агаре после антитела абсорбции связывались с соответствующими антигенами в ткани, использованной для абсорбции. В таком случае говорят о наличии общих или перекрестных антигенов в клетках, использованных для иммунизации и последующей абсорбции. Преципитация в агаре применяется также изучения концентрации иммуноглобулинов в жидкостях организма. Сочетание в агаре лимфоцитов от животных, иммунизированных эритроцитами, с этими эритроцитами позволяет фиксировать зоны локального гемолиза и учитывать число антителообразующих клеток (АОК). Поскольку взаимодействия антител с антигеном происходит только в присутствии комплемента, изучение антител можно проводить, исследуя 23 потребление последнего в реакции связывания комплемента (РСК). Реакция оказывается положительной только в случае специфического взаимодействия исследуемых антител с известным антигеном (или наоборот). Радиоиммунологический распространение в метод, последнее время, получивший основан на широкое взаимодействии исследуемого материала со стандартным для данной реакции комплексом антиген + антитело, меченного радиоактивным йодом 3 H. 125 I или тимидином - Снижение радиоактивности преципитата стандартного комплекса означает присутствие в исследуемом материале субстрата (антигена, антитела), способного взаимодействовать с компонентами данного комплекса. Метод имеет высокую разрешающую способность (выявляется 110 нг исследуемого вещества). По чувствительности с радиоиммунологическим может конкурировать лишь иммуноферментный метод, основанный на взаимодействий комплекса антигена + антитело со стандартными антителами, меченными пероксидазой хрома. В случае образования специфического комплекса антитела реагента окрашиваются при добавлении соответствующего фермента. (28,208,215). Получение моноклональных антител открыло новую эпоху в иммунологии. Это стало возможным после того, как G. Köhler и C. Milstein (1975) открыли возможность гибридизации соматических клеток для получения стационарных клонов гибридных клеток или «гибридом», продуцирующих антитела узкой специфичности. С этой целью обычно используют гибрид В-клетки от животного, иммунизированного данным очищенным антигеном, с клеткой мышиной миеломы. Полученный гибрид синтезирует только антитела к исследуемому антигену (в организме синтез Ig данной специфичности непродолжителен). При длительном культивировании чистых клеточных линий гибридома является источником высокоспецифичных антител (цитировано по В.И. Говалло, 1987). 24 При электрофоретическом исследовании все сывороточные антитела оказываются в зоне -глобулинов. Позже эта фракция белков получила название иммуноглобулинов (Ig), что равнозначно понятию антитело (исключение составляют некоторые Ig – свободные цепи при лимфопролиферативных заболеваниях). Все Ig состоят из одной или нескольких основных структурных единиц, а каждая единица – из двух одинаковых тяжелых – Н (Heavy) и двух одинаковых легких L (Light) цепей. Каждая цепь свернута в несколько компактных глобулярных «клубков» или доменов, состоящих примерно из 110 аминокислот (мол. масса 12500). Все полипептидные цепи Ig состоят из двух частей – концевой вариабельной (V) области, ответственной за индивидуальный идиотип, и концевой – константной (С) области, определяющей аллотип. V-области цепей обоих типов (H и L) соответствуют по своей величине одному домену. С-области Lцепей имеют сходные размеры, тогда как С-области Н-цепей в 2 – 4 раза длиннее. Ни одна из цепей не обладает активностью антитело, его активный центр, соединяющийся с антигеном, формируется двумя Н- и одной L-цепью. При обработке антител протеолитическими ферментами они расщепляются на фрагменты (F). При папаиновой обработке молекула Ig расщепляется на три фрагмента (Poter R., 1959). Два из них, способные связываться с антигеном, называют Fab1 и Fab2 (antigen binding), а третий, соединяющийся с комплементом, Fc (constant). При расщеплении Ig пепсином происходит отщепление в другом месте молекулы, несущий оба Fab-фрагмента и обозначенной как F (ab )2, также способной связываться с антигеном. Fab-фрагменты называют моновалентным антителом, F (ab )2 двух валентным антителом. Мол. м. Fab-фрагментов – 45000. Среди иммуноглобулинов различают пять классов – IgM, IgG, IgA, IgD и IgE, отличающихся по молекулярной массе, физико-химическим и биологическим свойствам. IgG составляет 70 – 80% иммуноглобулинов в 25 сыворотке крови, их мол. м. 150 000 – 160 000, константа седиментации 7S. В электрофорезе различают относительно рано возникшие подвижные IgG1 и более поздние IgG2, IgG3 и IgG4, они соответственно составляют 60, 30,7 и 3% IgG. IgG – единственный класс антител, проникающих через плацентарный барьер (IgG1 и новорожденных. К этому IgG3) и присутствующих в крови классу относится также большинство противобактериальных и противовирусных антител, а также блокирующие антитела, определяющие феномен усиления. Концентрация IgG повышается также при некоторых аутоиммунных заболеваниях. IgM составляет 5 – 10% сывороточных белков, мол. м. 900 000 – 1 000 000, константа седиментации 19S. Это относительно крупная молекула, построенная из 5 субъединиц аналогичных IgG. IgM первыми появляются после антигенной стимуляции или при развитии инфекции («антитела тревоги»), позднее они уступают месту IgG, которые продуцируются другими плазматическими клетками. Уровень IgМ заметно повышен при перинатальных инфекциях и острых инфекционных заболеваниях. IgА в сыворотке встречаются в мономерной форме, он связывается с антигеном без участия комплемента и играет ключевую роль в невоспалительном удалении антигена. Катаболизм его комплексов с антигеном происходит в печени. Особое значение имеет димерный IgА, имеющий дополнительную полипептидную цепь. Такой секторный IgА (SIgA) присутствует в слезах, слюне, желчи, кишечном и желудочном соке, цервикальной слизи и других секретах репродуктивного тракта. Клетки, несущие IgА, составляют 70 – 90% всех плазматических клеток, присутствующих в слизистых оболочках здоровых людей. SIgA играет исключительно важную роль в создании местного иммунитета. В кишечнике он обезвреживает попавшие с пищей токсические вещества, в дыхательных 26 путях препятствует инфицированию слизистых оболочек носоглотки, в репродуктивной системе создает заслон развитию инфекции. IgD (мол.м. 172 000) продуцируют немногочисленные В-клетки толстого кишечника и костного мозга, синтез его происходит в 100 раз медленней IgМ. Число В-носителей IgD больше, чем его продуцентов. Еще медленнее синтезируется IgЕ, играющий важную роль в аллергических реакциях. (28,64,130,139,141). 1.6. Антитела к спермиям Е.С. Воронин, А.М. Петров, М.М. Серых, Д.А. Девришов (2002), предполагают, что животных многом во оплодотворяемость снижается из самок – за сельскохозяйственных различных нарушений воспроизводительных функций у производителей. Сперма производителей содержит более чем 30 различных антигенов, поэтому при определенных условиях она способна индуцировать образование аутоантител и вызывать соответствующую иммунопатологию. Антитела, образующиеся к спермиям, приводят к бесплодию коров. Данные антитела можно выявить в реакции агглютинации. Чаще всего они относятся к IgG, реже к IgМ и IgА. (105, 109,147). По мнению Л. Йегер (1986), обнаруживаемые антитела обладают различными свойствами, и выявляют их в реакциях агглютинации, иммобилизации и иммунофлюоресценции. Лабораторные методы диагностики нарушений функции репродукции приведены в описании А.М. Земского, В.М. Земского, А.В. Караулова (1999); П.С. Веревочкина, Н.Н. Едренина (1988); в описании Е.С. Воронина, А.М. Петрова, М.М. Серых и др. (2002). 27 Тест агглютинации спермиев. Тест весьма чувствителен и поэтому требует постановки контролей, исключающих ложноположительные результаты за счет спонтанной реакции. Существует две модификации теста. Макроскопический тест спермиоагглютинации по Kibr ick. После часового отстаивания эякулята при комнатной температуре клетки ресуспендируют до 40 млн/мл в 0,9%-ном растворе натрия хлорида, смешивают 1:1 с 10%-ным раствором желатина на натрия хлориде. К 0,3 мл сыворотки крови исследуемого животного (или ее разведений) добавляют равный объем эякулята на желатине, инкубируют 2 ч при 37 ˚С и учитывают при отрицательной реакции определенную мутность суспензии, обусловленную взвесью изолированных клеток, а при положительной реакции выявляют различные фракции: осадок, хлопьевидный агглютинат и прозрачный супернатант. В контроле используют образцы тест-положительной и тестотрицательной сывороток. Микроскопический тест спермиоагглютинации по Frankl in – Dukes и Schwimmer. Разводят эякулят до концентрации 60 млн/мл клеток, 0,025 мл тест-клеток смешивают с 0,25 мл инактивированной сыворотки крови животного (при 50 ˚С 30 мин), после часовой инкубации при 37 ˚С встряхивают и оценивают в фазовом контрасте на предметном стекле. При оценке реакции по методу Schill в 10 полях зрения подсчитывают процент агглютининов, при котором они имеют три варианта: головка – головка, хвост – хвост, смешанная форма. Тест иммобилизации спермиев по Isojima и Lehmann. Разводят пробу эякулята до 60 млн/мл, при чем тест-реагентами являются 0, 25 мл инактивированной (см. выше) сыворотки + 0,025 мл взвеси клеток эякулята + 0,0025 мл комплемента (контроль – тест-система без комплемента). 28 Выполняют также контроль комплемента, для чего сыворотку больного заменяют на 0,25 мл изотонического раствора натрия хлорида. В процессе реакции смесь инкубируют 1 ч при 37 ˚С, осадок ресуспендируют и учитывают реакцию в фазовом контрасте. При положительной реакции спермии утрачивают подвижность, как минимум, на 50%, в подобных случаях сыворотку титруют для определения титра. (28,173). Метод непрямой иммунофлюоресценции по Coons и Kaplan. Каплю эякулята наносят на стекло, делают мазок и фиксируют ацетоном отмытые клетки эякулята, после чего обрабатывают его сывороткой крови животного (разведении 1:5 и т.д.), инкубируют 30 мин во влажной камере при 37 ˚С, отмывают, обрабатывают далее ФИТЦ-меченой антисывороткой к гаммаглобулину человека, повторно инкубируют 30 мин, реакцию оценивают в флюоресцентном микроскопе. Специфическое свечение локализуется в различных участках клеток: акросома, постакросомная часть головы, хвост, промежуточная зона спермия. Ставят соответствующие контроли. Для диагностики инфертильности коров можно использовать метод диагностики иммунного бесплодия коров, разработанный в ВНИИРЖ (г. Пушкин) в описании П.С. Веревочкина и Н.Н. Едренина (1988) (см. в разделе: Материалы и методы исследований). Весь ход созревания половых клеток, оплодотворение, имплантация эмбриона и его дальнейшее развитие в организме матери отмечены активными потенциально иммунологическими аутоантигенными, процессами. нарушение Спермии являются целостности барьера, изолирующего их от клеток иммунной системы, ведет к развитию клеточного и гуморального иммунитета, что становится причиной последующей 29 мужской стерильности. В эксперименте это хорошо иллюстрируется моделью ЭАО (Экспериментальный аллергический орхит) после иммунизации тестикулярными тканями или деструкции одного семенника, в клинике то же наблюдается при перевязке семявыносящего протока – вазэктомии. Стерильность возникает в результате поражения антителами именно фертильной популяции спермий. (30,102,103,104,108,175) Аутоантигены спермий, возникающие в ходе последовательной смены мембранных белков, весьма многочисленны. Гематотестикулярный барьер, состоящий из нескольких непроницаемых слоев сократимых миоидных клеток, базальной мембраны, клеток зародышевого эпителия и спермий, явился тем эволюционным приспособлением, которое предупредило прямой контакт гамет с клетками иммунной системы. В противном случае гаметы, как клетки с выраженными дифференцировочными антигенами и гаплоидным набором хромосом, были бы иммунологически распознаны и истреблены. Если бы гаметы не отличались по антигенному составу от соматических клеток, они бы утратили фертильность (М.М. Серых, О.Н. Макурина, А.М. Петров и др. 2000). Иммуногенность спермий определяется не только их собственными антигенами, но и белками, которые абсорбируются ими из семенной плазмы. Среди последних особое значение имеет оболочечный антиген – SCA, близкий по специфичности к антигенам женского репродуктивного тракта. Этот антиген называемый оболочечным, обволакивающим SCA (Spermatozoa Coating Antigen) или скафферрином, защищает спермии во время их миграции в женском репродуктивном тракте (Hekman A., R mke P., 1969). Считают, что протективный эффект объясняется его сходством с антигенами цервикальной слизи и внутриматочной среды («антигенная мимикрия» спермий). По антигенным характеристикам 30 скафферрин близок к лактоферрину молока. Процесс утраты спермиями этого антигена в женском половом тракте называется капацитацией, что важно для оплодотворения. Не только SCA, но и другие антигены семенной плазмы абсорбируются на поверхности спермий. Эти антигены продуцируются не столько семенниками, сколько в семенных пузырьках, простате и добавочных железах. Благодаря SCA спермии могут дольше сохраняться в матке. Тому же способствуют антикомплементарные и иммуносупрессорные факторы, присущие семенной плазме и, возможно, самим спермиям. Очевидно, спермии могут стимулировать синтез супрессорных лимфоцитов, по крайней мере иммунизация самок мышей спермиями вызывает ускоренный рост перевиваемой тератокарциномы фибробластами подавляет (иммунизация опухолевый рост). ксеногенными Максимальной иммуносупрессорной активностью обладают экстракты предстательной железы. (121,129,131,132,185,189). Яйцеклетки сосредоточенными также обладают преимущественно тканеспецифичными в ПЗ (прозрачная антигенами, оболочка яицеклетки). Антитела к ПЗ подавляют пенетрацию спермий в яйцеклетку. Предполагается, что на поверхности ПЗ имеются видоспецифические рецепторы к спермиям, которые нарушаются преципитатом антител. Развивающаяся яйцеклетка содержит присущие только ей антигены, она, как и спермии, защищена от иммунных клеток организма фолликулярной жидкостью и наружными оболочками (преимущественно ПЗ). Аутоантитела к антигенам ПЗ служат частой причиной женского бесплодия. Для исследования гуморальной сенсибилизации используют яйцеклетки свиней, имеющие много общих антигенов с яйцеклетками человека. Антигены яичников дают перекрестные реакции с антигенами других органов (селезенка, печень, почка) и эндокринных желез, поэтому 31 иммунологическое повреждение яичников может наблюдаться при разных патологических состояниях (сахарный диабет, аддисонова болезнь, гипо- и гиперпаратиреоидоз). Презиготический отбор спермий, который осуществляет яйцеклетка, по-видимому, имеет сугубо иммунологическую природу. Есть основания полагать, что эту функцию определяют гены локуса Т/t, аллели которого выражены на спермиях и яйцеклетки. Локус Т/t является эволюционным предшественником МНС-генов. Твердо установлено наличие на гаметах антигенов МНС I класса, присутствие антигенов МНС II класса окончательно не доказано. Возможно, что последние присутствуют в подпороговом количестве или замаскированы мукополисахаридами и сиаловыми кислотами, которые сами могут выступать как дифференцировочные антигены, они же снижают антигенность макромолекул антигенов МНС. Поступление спермий в женский репродуктивный аппарат сопровождается массовым их фагоцитозом. Возможно, что такой процесс, развивающийся уже через несколько часов после контакта слизистой влагалища со спермой, является пусковым механизмом для миграции лимфоидных элементов их костного мозга в слизистую оболочку матки и для дифференцировки предшественников лимфоцитов-супресоров. Полноценный фагоцитоз спермий отсутствует, если в цервикальной слизи и маточной жидкости присутствуют антитела к спермиям (IgG и SIgA), которые препятствуют также последующей капацитации (сбрасывание SCA) спермиями. Активный местный синтез антител к спермиям отмечен у большинства бесплодных женщин (В.И. Говалло 1987). Следствием всасывания продуктов разрушенных спермий и их фагоцитоза является увеличение лимфатических узлов, дренирующих матку. Увеличение массы регионарных лимфатических узлов пропорционально степени МНС-антигенных отличий самца и самки, но оно имеет место и при 32 сингенной беременности. Последнее служит доказательством того, что распознавание самкой антигенов самца является непременным условием развития беременности, даже если эти различия ограничены H – Y- и органо (ткане)- или трофобластспецифическими антигенами. В той же связи со степенью антигенных отличий находится интенсивность децидуальной реакции и активность развития трофобласта. Предполагают, что распознавание фетальных аллоантигенов самцами и самками различно. Последние, в частности, под действием аллоантигенов могут вырабатывать медиаторы, обеспечивающие усиленное образование эмбриональных тканей. У самок мышей беременность со стороны рога матки, повторно иммунизированного МНС-антигенами самца, бывает более многоплодной. Процессы репродукции строго контролируются гонадотропными гормонами трех уровней: рилизинг-факторами (либеринами) гипоталамуса, фолликулостимулирующим и лютеинизирующим гормонами и пролактином гипофиза, стероидными гормонами – эстрогенами, андрогенами и прогестероном, вырабатываемых семенниками яичником, желтым телом, плацентой. Мишенью действия этих гормонов являются не только репродуктивные органы, но и иммунная система. На клетках вилочковой железы присутствуют рецепторы к андрогенам, эстрадиолу и прогестерону. Поскольку деятельность взаимодействие разных эндокринной гонадотропных системы гормонов и, в частности, основывается на принципах отрицательной обратной связи, можно думать, что вилочковая железа, побуждающая гипоталамус к продукции РФ, угнетается конечным звеном гормонального кругооборота – стероидными гормонами (М.М. Серых, В.В. Зайцев, Н.А. Кленова и др. 2004). 33 1.7. Антигены прозрачной зоны Внешняя прозрачная зона (оболочка) – ПЗ яйцеклетки выполняет ряд важных биологических функций, из которых нужно отметить следующие: а) защита фолликулярных ооцитов; б) связывание спермиев в начальной стадии фертилизации; в) предупреждение полиспермии; г) осмотическая регуляция яйцеклетки и развивающегося эмбриона; д) ограничение и защита яйцеклетки и эмбриона в яйцеводе и матке; е) участие в начальных стадиях имплантации. Большинство исследований антигенов ПЗ было проведено с неочищенными экстрактами тканей яичника. Антитела, полученные в ксеногенной системе, взаимодействовали преимущественно с ПЗ, что было подтверждено в многочисленных экспериментах на животных и в наблюдениях на людях (Sacco A., 1977). Иммунизация очищенными экстрактами ПЗ мышей позволила получить антисыворотки с резко выраженным in vitro антифертильным действием (Tsunoda Y., 1977; Aitken R., Richardson D., 1980). Антитела, реагирующие с ПЗ, полученные при ксеногенной иммунизации тканями яичников или очищенными экстрактами ПЗ, имеют высокую межвидовую перекрестную активность. Это относится к антисывороткам, полученным от грызунов (Shivers C., 1977), свиней (Palm V. et al., 1979; Tsunoda V., Sigie T., 1979), людей (Sacco A., 1977). Особо выраженные перекрестные антигены были найдены между ПЗ свиней и человека. F (ab )2-фрагменты сыворотки кроликов, иммунизированных экстрактами ПЗ свиньи или человека, после абсорбции сывороток соответственно человеческими или свиными тканями (клетками печени, плазмой крови, фолликулярной жидкостью) сходным образом реагировали затем в реакциях непрямой иммунофлюоресценции и преципитации (Sacco 34 A., 1978). Эта работа дала новый стимул для клинико-иммунологической оценки роли антител к ПЗ у инфертильных женщин, поскольку получение в необходимом количестве яйцеклеток человека связано с техническими трудностями. Очищенный антиген, полученный в растворимом состоянии ПЗ свиней и человека, оказался гликопротеином с мол.м. около 100 000. Из 30 000 свиных яйцеклеток удалось получить его в лиофилизированном состоянии лишь 30 мг (Noda Y. et al., 1980). Другие исследователи считают, что тканеспецифическая иммуногенность ПЗ связана с тремя гликопротеинами с мол.м. от 40 000 до 120 000 (Yurewicz E. et al., 1983). Были получены непрямые доказательства того, что антигены ПЗ обладают строгой тканевой и относительной видовой специфичностью. После введения хомячкам меченных изотопами ксеногенных сывороток с антителами к ПЗ наибольшая концентрация и медленное выведение отмечалось именно в яичниках (Yanagimachi R. et al., 1976). Следствием такой пассивной иммунизации была преходящая инфертильность, не связанная с поражением других органов и изменением сексуального поведения животных. H. Hasebe и сооавт. (1983) исследовали кроличью антисыворотку к ПЗ свиней, которая после очистки на колонке с сефадексом содержала антитела в титре 1:64 000. Никакие солевые растворы из тканей и органов 50 свиней, 40 обезьян и 30 людей с этими антителами не взаимодействовали, исключая фолликулярные ткани и яйцеклетки. То же самое подтвердили с помощью моноклональных антител к ПЗ S. Isojima и соавт. (1983). Видовая специфичность антигенов ПЗ была постулирована в ранней работе A. Sacco и C. Shivers (1973). Однако, в некоторых случаях тканевая специфичность превышает межвидовые отличия. Так перекрестные антигены, помимо ранее упомянутых у человека и свиньи, были показаны 35 между ПЗ мышей, крыс и хомячков (Tsunoda Y., Chang M., 1976), мышей, хомячков, беличьих обезьян макак резус (Gwatkin R. et al., 1977), кроликов, коров, мартышек, макак и человека (Gwatkin R., Williams D., 1978), зеленых мартышек, яванских макак и человека (Вербицкий М.Ш. и др., 1980). Несмотря на выраженные перекрестные реакции между антигенами ПЗ человека и свиньи, они не являются полностью тождественными. ПЗ человека содержит три различных антигена: один – специфичен только для ПЗ человека; другой – общий для ПЗ человека и свиньи; третий – связан с субстанциями крови (Takai I. et al., 1980). С помощью моноклональных антител было найдено два общих и несколько различных антигенов ПЗ свиней и человека (Kamado M. et al., 1983). М. Mori и соавт. (1982) отметили значительное снижение перекрестных реакций в иммунофлюоресценции после абсорбции человеческой антисыворотки к ПЗ аллогенными и свиными эритроцитами. Это объяснялось тем, что гемагглютинины сыворотки человека не реагировали с яйцеклетками свиней, но взаимодействовали с ПЗ человеческих яйцеклеток. Абсорбцию человеческой антисыворотки к ПЗ эритроцитами свиней рекомендовали как обязательное условие выявления антител к ПЗ в этой системе. Davies. M и соавт. (1982) нашли, что степень абсорбций неодинакова при использовании разных свиных эритроцитов, что указывает на наличие определенных аллоспецифических детерминант в ПЗ. Антисыворотки к ПЗ человека могут быть загрязнены антителами к микробам. При иммунизации свиными яйцеклетками могут быть получены антисыворотки, дающие выраженные реакции против свиных эритроцитов и почти не взаимодействующие с яйцеклетками человека (Sacco A., Moghissi K., 1979). Моноклональные антитела к свиной ПЗ, продуцируемые гибридомами, принадлежали к классам иммуноглобулинов и IgM и IgG2, и соответствующие антитела к ПЗ человека содержались только в фракции 36 IgG (Isojima S. et al., 1983). Из сказанного следует, что оптимальным условием для обнаружения антигенов ПЗ человека является использование в иммунологических тестах человеческих яйцеклеток. Очевидно, что на поверхности ПЗ существуют рецепторы к спермиям, обладающие видовой специфичностью. Экспозиция спермиев в растворимой фракции ПЗ снижает их способность прикрепляться к ПЗ и оплодотворять яйцеклетки (Gwatkin R., Williams D., 1977; Isojima S. et al., 1983). Спермии человека не прикрепляются к яйцеклеткам свиньи (Trounson A. et al., 1980), коровы (Gwatkin R., 1979) или человекообразных обезьян (Bedford M., 1977). Эти высокоавидные рецепторы имеют белково-углеводную природу, их дальнейшее изучение важно для конструирования антифертильных вакцин. 37 1.8. Пути повышения резистентности животных Для нормального функционирования всех звеньев системы иммунитета и механизмов их регуляции, необходимы полноценное сбалансированное питание; соблюдение зоогигиенических условий содержания животных; достаточная двигательная активность; закаливание; рациональный режим дня. От качества питания и особенно от содержания в пище достаточного количества незаменимых аминокислот, полиненасыщенных жирных кислот, минеральных веществ, витаминов, ее калорийности, зависит величина иммунного ответа на инфекцию и другие генетически чужеродные агенты. Пластические и энергетические компоненты пищи необходимы для обеспечения процессов пролиферации, дифференцировки клеток иммунной системы, синтеза антител, рецепторов иммуноактивных веществ, участвующих в иммунном ответе. При несоблюдении правил гигиены у животных возможно за счет выделения потовых и сальных желез и скопления грязи создания условий для развития микроорганизмов, процессов гниения, расчесов кожи с нарушением механических и химических факторов защиты и открытием так называемых «ворот для инфекции». В связи с тем, что иммунологические нарушения развиваются одновременно с нарушениями клеточного метаболизма и возникновением ряда патофизиологических процессов, которые нормализуются под влиянием неспецифических иммунокорректоров, в последние годы для уменьшения или устранения иммунологических расстройств все более широко используются препараты общего действия. В качестве мишени неспецифических иммуномодуляторов могут быть стволовые клетки, В- и Т-клетки, клетки иммунологической памяти, 38 иммуноглобулины различных классов. Некоторые препараты – нуклеинат натрия, тимусные производные (тималин, Т-активин), липополисахариды, миелопид (В-активин), риботан, левамизол (декарис), интерфероны, полиэлектролиты, могут влиять на все основные звенья иммунологической реактивности (специфические и неспецифические факторы). Среди иммунокорректоров имеются стимуляторы антиинфекционной и антитоксической резистентности. В частности, интерферонстимулирующей активностью обладают витамины А, В, С, дибазол, левамизол, метилурацил, миелопид, нуклеинат натрия, тимусные препараты, риботан и др. Функцию натуральных киллеров и К-клеток активируют ацикловир, интерфероны, левамизол, нуклеинат натрия, полиэлектролиты, тимусные препараты и др. В наибольшей степени подвергаются стимуляции препаратами общего действия клетки с расстроенным метаболизмом. Тесная взаимосвязь нервной, эндокринной и иммунной систем регуляции обусловливает иммуномодулирующее действие на различные звенья иммунной системы факторов и препаратов, повышающих общий тонус центральной нервной системы и регуляторную функцию эндокринных желез (достаточная двигательная активность, рациональный режим дня, закаливания; ультрафиолетовая, электромагнитное, лазерное излучения – в определенных дозах; препараты женьшеня, элеутерококка, лимонника, заманихи, расторопши, аралии, пантокрина и др.). Эндокринная система является важнейшей системой регуляции иммунологического гомеостаза. Сами гормоны не могут индуцировать иммунный ответ, но могут его усилить или ослабить. Стимулирующее влияние на активность лимфоидных клеток в физиологических условиях оказывают гормоны щитовидной и поджелудочной тормозящее – гормоны надпочечников и половых желез. 39 желез, эпифиз; Для специфической профилактики используют иммунизацию животных. Различают иммунизацию активную – путем введения в организм вакцины или анатоксина, пассивную – при которой вводят иммунную сыворотку (серопрофилактика) или иммуноглобулины, а также пассивноактивную – когда вначале вводят иммунную сыворотку, а затем вакцину или анатоксин. Вакцинопрофилактика по сравнению с серопрофилактикой обеспечивает защиту на более длительный срок. Иммунизация сывороткой проводится в первую очередь животным, которым раньше не вводились вакцины в связи с наличием противопоказаний, а также больным, находящимся в тяжелом состоянии. (201,210,219,227). В качестве специфической иммунотерапии применяют антитоксические иммуноглобулины и сыворотки (противостолбнячную, противоботулиническую, противодифтерийную и др.), противомикробные сыворотки и иммуноглобулины (противогриппозный, противокоревой, антистафилококковый и др.), фаготерапию (стафилококковая инфекция, сальмонеллез). Животных, общавшихся с больными инфекционной болезнью в эпизоотическом очаге, рассматривают как уже заразившихся и, следовательно, находящихся в инкубационном периоде болезни. Поэтому практически не разграничивается профилактическое и лечебное действие иммунных сывороток, которые, в связи с этим, называют лечебнопрофилактическими. (186,191,204,220,233). В последние годы появились работы о возможности профилактики иммунодефицитов у новорожденных путем введения иммуномодуляторов беременным животным. Так, например, показана возможность предупреждения снижения иммунного статуса новорожденных телят, полученных от высокопродуктивных коров при промышленных способах содержания, путем инъекции беременным коровам за 1,5-2 месяца до родов 40 Т- и В-активинов (В.Н. Денисенко, Е.С. Воронин, Г.Н. Печников, О.О. Смоленская-Суворова, 1992), которые, по мнению авторов, проникают через плацентарный барьер коров и непосредственно воздействуют на лимфоидную ткань плода. В наших исследованиях (Т.А. Зудова, А.А. Зудов, А.М. Петров, М.М. Серых, 1999,2000) в условиях крупного свиноводческого хозяйства введение свиноматкам в конце беременности иммуномодулятора риботана и препарата полифага (комплекса бактериофагов против пастерелл, сальмонелл, кишечной палочки, стрептококков, стафилококков, клебсиел и протея), каждого в отдельности и в сочетании друг с другом, привело к повышению в крови новорожденных поросят количества лейкоцитов и лимфоцитов, показателей фагоцитарной активности, а также лизоцимной (по отношению к лизирующему микрококку) и бактерицидной (по отношению к кишечной палочке 0-20) активности сыворотки крови, особенно при совместном применении риботана и полифага. Эти более высокие показатели естественной резистентности у поросят опытных групп, по сравнению с контрольными, сохранялись до 15 дня жизни, а при введении риботана с полифагом также и опытным поросятам более ысокие показатели естественной резистентности у них имели место более продолжительное время. Имеется сообщение (Р.М. Хаитов. «Здоровье», №1, 200, с. 40-45) о синтезе в Институте иммунологии РАМН уникального полимерного иммуномодулятора – полиоксидония и создании на его основе вакцин нового поколения. В частности, в Институте иммунологии создан препарат гриппол, в котором белки-антигены всех вариантов вируса гриппа соединены в одну молекулу с иммуномодулятором полиоксидонием. Гриппол вызывает мощный иммунный ответ организма на вирус гриппа. С использованием полиоксидония создана также вакцина против брюшного тифа, ведутся 41 работы по созданию новых вакцин против туберкулеза, бруцеллеза, гепатита В и С, ряда других инфекции. Таким образом, необходимыми условиями для повышения резистентности животных против эндо- и экзогенных чужеродных агентов являются полноценное питание, соблюдение правил гигиены, достаточная двигательная активность, использование неспецифических иммуномодуляторов и факторов, а также специфической активной и пассивной иммунизации. Однако следует обратить внимание на необходимость крайне осторожного использования иммуномодуляторов, особенно гормональных препаратов, исследования для коррекции иммунного статуса отдаленных иммуномодуляторов при последствий нарушениях организма, применения иммунных реакций так как многих далеко недостаточны и требуют дальнейших наблюдений и поисков более безопасных и эффективных методов иммунокоррекции. В частности, ведутся работы по созданию новых иммуномодуляторов-иммуностимуляторов и иммунодепрессантов, в том числе моноклональных антител против адгезивных молекул, отдельных цитокинов и их рецепторов. Цитокины и их антагонисты рассматриваются и как точки приложения, и как возможные источники новых препаратов для иммунокоррекции. Представляются перспективными работы по ингибированию экспрессии генов (цитокиновых и их рецепторов), интегрированию в геном регуляторных генов. Но при этом, по мнению ряда исследователей, остается в силе главная заповедь иммунокоррекции: «Не навреди», которой нам представляется целесообразным завершить данный раздел. (2,11,16,31,33,40,123,137,140). 42 2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы исследований Исследования проводили в период с 2007 – 2011 гг., на кафедре акушерства, гинекологии и биотехники репродукции животных ФГОУ ВПО МГАВМиБ и в учебно – опытном хозяйстве «Бессоново» Воскресенского района Московской области. Для экспериментальных исследований были подобраны три группы черно – пестрых коров в возрасте 4 – 5 лет. 1-я контрольная группа. Здоровые коровы – 10 голов с нормальной плодовитостью. 2-я опытная группа. Здоровые коровы – 10 голов, которые были бесплодными (яловыми) в течение 1,5 – 2-х лет. 3-я опытная группа. 10 голов коров, которые были бесплодными (яловыми) в течение 1,5 – 2-х лет. Животным данной группы трехкратно вводили иммуномодулятор миелопид (В-активин) в дозе по 8 мг сухого вещества на кг живой массы коров, разведенного в 5 мл физиологического раствора. Препарат вводили подкожно в область шеи на 5, 10, 15 сутки. Коров контрольной и опытных групп осеменяли искусственно спермой быков производителей, закрепленных индивидуально за каждой коровой. Для осеменения коров, оплодотворение которых не наступало после многократных осеменений, дополнительно использовали сперму заменяющих быков. Половую охоту у коров выявляли по рефлексу неподвижности в стойловый период на прогулке, а летом – на пастбище. Осеменяли коров ректо-цервикальным способом в первую половую охоту после родов с нормальными признаками течки и охоты без патологии половых органов. Сперму для искусственного осеменения коров всех трех групп получали из 43 центральной станции искусственного осеменения животных (п. Быково Подольского района Московской области). Кровь для исследований у подопытных животных брали из яремной вены утром до их кормления. Влагалищную слизь для исследования брали с помощью ложки Панкова. При анализе репродуктивной функции коров использовали данные первичной документации, учитывали продолжительность сервис – периода, продолжительность периода бесплодия (сут.), индекс осеменения. Стельность у коров определяли через два месяца после плодотворного осеменения методом ректального исследования. Определение количества Т- и В-лимфоцитов в периферической крови проводили по методу И.М. Карпуть, Л.М. Пивовар, И.З. Севрюк и др., 1992, в описании Е.С. Воронина, А.М. Петрова, М.М. Серых, Д.А., Девришов, 2002. Определение субпопуляций лимфоцитов производили электронно – автоматическим методом с использованием французского аппарата «Культер» (Gen-S), способного производить дифференциальный подсчет лейкоцитов, включая Т-хэлперы и Т-супрессоры на основе VCS-технологии (изменение объема, радиочастотных параметров и лазерного светорассеивания). Фагоцитарную активность нейтрофилов крови определяли по методу В.М. Бермана, Е.М. Славской, 1958, с использованием взвеси суточной культуры Е. coli шт. О. 20. Количественное определение иммуноглобулинов G и M классов в сыворотке крови коров проводили методом радиальной иммунодиффузии по методу Манчини, 1965., в описании Ю.Н. Федорова, 1985. Определение уровня иммуноглобулинов в маточной слизи и крови коров проводили по Г.Г. Козлову и Б.К. Акназарову, 1989. 44 Экономические показатели Определение экономического ущерба от бесплодия коров проводили по методике И.Н. Никитина, 1997 и Е.В. Ильинского, М.В. Назарова и др., в описании В.И. Трухачева, В.Я. Никитина и др., 2008. При этом определяли количество недополученных телят и молока, определяли их стоимость и экономическую эффективность использования миелопида. Статистическая обработка При обработке цифрового материала определяли среднюю величину каждого показателя, ошибку средней величины и достоверность различий средних величин. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы «Microsoft Excel 2000, Statistica 6.0». Критерий достоверности определяли с помощью таблицы t – распределения по Стъюденту с учетом рекомендации Г.Ф. Лакина (1990) и В.А. Середина (2001). 45 2.2 Методы исследования иммунитета 2.2.1. Определение Т- и В-лимфоцитов В качестве показателей иммунитета исследуют в цельной крови общее количество лейкоцитов, в том числе лимфоцитов. Идентифицируют среди них Т- и В-лимфоциты, а в сыворотке крови определяют содержание иммуноглобулинов различных классов. Кровь для исследования берут у крупного рогатого скота из яремной вены. Для получения цельной крови предварительно в пробирки вносят антикоагулянт — 100—200 ед. гепарина на10 мл крови. Для получения сыворотки пробирки с кровью помещают в термостат (37 °С) на 30 мин, после чего сгусток отделяют с помощью спицы из нержавеющей стали. После этого пробирки с сывороткой крови устанавливают в штатив и помещают в холодильник (4 ˚С) на 6-8 ч. В дальнейшем сыворотку переливают в пенициллиновые флаконы, закрывают пробками, хранят при температуре —20...—40 ˚С до ее использования. Визуальный метод подсчета лейкоцитов и определения лейкограммы Количество лейкоцитов подсчитывают в камере Горяева. Для этого в пробирку вносят 0,4 мл (0,38 мл) разводящей жидкости и 0,02 мл исследуемой крови. Получают разведение 1:20. В качестве разводящей жидкости используют 3%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашенный метиленовым синим (уксусная кислота лизирует эритроциты, метиленовый синий окрашивает ядра лейкоцитов). Перед заполнением камеры Горяева пробирку с разведенной кровью тщательно встряхивают. Чистое сухое покровное стекло притирают к камере 46 до появления радужных колец. Каплю крови наносят к краю шлифовального стекла камеры. Поскольку лейкоцитов гораздо меньше, чем эритроцитов, и на большой квадрат их приходится 1—2, то для точности подсчет производится в 100 больших квадратах (1600 малых). Расчет производят по формуле Х где Ф 4000 20 , 1600 Х – количество лейкоцитов в 1 мкл крови; А – количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах; 4000 – множитель, приводящий результат к объему 1 мкл крови, так как объем одного малого квадрата составляет 1/4000 мкл; 20 – разведение крови; 1600 – количество малых квадратов. Пример. В 100 больших квадратах (1600 малых) подсчитали 159 лейкоцитов. Помня о том, что объем одного малого квадрата равен 1/4000 мм 3 , а кровь разведена в 20 раз, подсчитывают количество лейкоцитов в 1 мкл крови: Х 159 4000 20 7950 . 1600 Практически (при условии соблюдения указанных правил разведения и подсчета) для получения действительного содержания лейкоцитов в 1 мкл достаточно полученную при подсчете сумму разделить пополам и умножить на 100. Лейкоформулу определяют посредством дифференциального подсчета форменных элементов белой крови на мазках. Мазки готовят общепринятым способом. После высушивания при комнатной температуре их по краю подписывают мягким 47 простым карандашом и фиксируют 5 мин в метаноле или 20 мин в этаноле. Мазки окрашивают в течение 20-40 мин свежеприготовленным раствором красителя по Романовскому – Гимзе (2 – 3 капли основного раствора красителя на 1 мл воды), затем их промывают водой, сушат и исследуют под микроскопом масляная или глицериновая иммерсия, объектив Х90 окуляр Х7—10. Дифференциацию клеток проводят сопоставляя форму, размер и окраску клеток с рисунками форменных элементов крови животных, приведенных в специальных цветных таблицах. Подсчитывают 100-200 клеток и определяют относительное содержание каждого типа клеток в процентах. Затем рассчитывают абсолютное содержание лимфоцитов крови по формуле: А=О ∙ Х где А – абсолютное количество лимфоцитов в крови, тыс/мкл; О – относительное количество лимфоцитов, определенное по формуле, %; X- количество лейкоцитов в крови, тыс/мкл. Электронно-автоматический метод подсчета лейкоцитов и определения лейкограммы В последние годы разработаны и широко используются автоматические приборы для подсчета лейкоцитов и эритроцитов. В основе большинства из них лежит импульсивный принцип работы, основанный на разнице в электропроводимости частиц крови и используемый для разбавления жидкости. На этом принципе работают применяемые в России счетчики «Целлоскоп» (Швеция) и «Культер» ( Франция). Кровяные тельца, взвешенные в физиологическом растворе, всасываются через микроотверстие (капиллярную апертуру) диаметром 100 мкм, с обеих сторон которой имеется по одному платиновому электроду. Скачкообразное 48 повышение сопротивления, возникающие при прохождении частиц крови через капилляр, вызывает электрический импульс, амплитуда которого прямо пропорционально объему частицы. подсчитываются в электронном Импульсы усиливаются и устройстве и могут быть измерены. Продолжительность аппаратов этого типа велика: весь процесс работы от введения образца крови до получения результата длится не более 20 с при ошибке ± 1-2%. Эти приборы постоянно совершенствуются, повышаются скорость и точность подсчета, воспроизводимость, упрощается использование. Счетчики можно применять отдельно или в комлекте с гемоглобинометром и электронным оборудованием, позволяющим одновлеменно с подсчетом кровяных клеток измерить объем одной клетки (эритроцита), гематокрит и некоторые другие показатели («Культер» модели ЗФ и S, «Целлоскоп-412»). Для подсчета эритроцитов описанными счетчиками готовят большие разведения крови в физиологическом растворе (1:80000; 1:50000). Точность разведения обеспечивается благодаря применению автоматических дозирующих аппаратов - дилюторов. Другой принцип подсчета – сцинтилляционный фотографический, который заключается в том, что узкий пучок света проходит через стеклянную кювету и далее на оптическую систему, перед которой стоит непроницаемый экран. Если через кювету проходит жидкость без частиц, то поток света задерживается экраном. Если в потоке жидкости попадаются частицы, то свет, отражаясь от них, рассеивается и огибает экран. Оптическая система фокусирует этот рассеянный свет, он проходит через диафрагму и фиксируется фотоэлементом. На таком принципе работает автоанализатор «Техникон» (Ирландия). Подсчет лейкоцитов в современных счетчиках частиц производят по тому же принципу, что и эритроцитов. Предварительно кровь разводят и 49 смешивают с каким-либо лизирующим эритроциты реактивом. В автоанализаторе «Техникон» в этом качестве используют раствор уксусной кислоты (разбавление происходит автоматически в соответствующем канале), в аппаратах «Культер» и «Целлюскоп»- сапонин или сапоглобин, который добавляют к разведенной (1:500, 1:700) в физиологическом растворе крови из расчета 6 капель на 20 мл разведения. С каждым годом в новых анализаторах возрастает количество исследуемых параметров, сокращается время исследование проб крови. Так, современный автоанализатор «Техникон Н-3» позволяет производить подсчет всех основных гемотологических параметров ( 25 показателей), дает возможность вывода лейкоцитарной формулы. Подсчет соотношения и количества моноцитов, определяется по лимфоцитов, пероксидазному нейтрофилов каналу. и эозинофилов Пропускная способность «Техникон Н-3» составляет 100 анализов в 1 ч. Аппарат «Культер» дифференциальный (измерение подсчет объема, (Gen, STKS, лейкоцитов радиочастотных на MAXM) основе параметров осуществляет VCS-технологии и лазерного светорассеивания), что исключает химическую обработку клеток, кроме лизиса эритроцитов. Автоанализатор «Культер» (Gen-S) одновременно определяет до 33 параметров крови, включая Т- хелперы и Т-супроссоры (СД4/СД8). Аппарат «Cobal Vega» (Швейцария) гемотологических имеет возможность определять до 26 показателей, а если его обеспечить дополнительным блоком – до 36, включая и степень зрелости различных клеток. К числу современных методов исследования в иммунологии относятся метод проточной цитометрии. Этот метод используется для анализа различных популяций клеток. Он оказался очень ценным при изучении лейкозов, аутоиммунных заболеваний и 50 иммунодефицитных заболеваний. Технологически этот метод напоминает усложненный микроскоп, имеющий возможность быстрого количественного анализа множества свойств одиночных клеток, суспендированных в жидкой среде. В процессе исследования клетки проходят через специальную камеру, пересекая пучок света высокой интенсивности, со скоростью несколько тысяч в секунду. Каждая клетка, проходя через луч света, испускает рассеянные и регистрируются флюоресцентные при световые помощи сигналы. Эти светочувствительных сигналы датчиков (фотоэлектронные умножители и фотодиоды), усиливаются и при помощи аналогово-цифровых преобразователей переводятся в цифровые значения. Для переработки и хранения информации используются компьютеры. Высоко оценивая электронно-автоматические методы подсчета форменных элементов крови, включая систему компьютерного анализа клеточного изображения с классификацией клеток путем создания модели распознавания, тем не менее следует отменить, что пока еще нет такого прибора, который бы смог так точно произвести подсчет и оценку клеток крови, как это делает опытный морфолог визуально. Определение Т-лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (E-POK) Принцип метода: Тимусзависимые Т-лимфоциты имеют рецепторы для эритроцитов барана, которые выступают, таким образом, специфическим маркером для их распознавания (E-POK: erythrocyte-розеткообразующие клетки). Оборудование и аппаратура: центрифуга ЦЛК-1; холодильник бытовой; термостат; микроскоп люминесцентный (МЛ-2 или другие типы); камера Горяева; счетчик клеток; автоматические пипетки или микропипетки; пробирки силконированные или пластиковые; штатив для пробирок. 51 Реактивы: среда 199, раствор Хенкса, гепарин (готовят раствор из расчета 25ЕД/мл крови); фосфатный буфер (pH 7,4); 0,01%-ный раствор акридинового оранжевого; 0,1% раствор эозина; 0,1% раствор трипанового синего на дистиллированной воде; гипак (изопак, верографин, уротраст); фиколл-400 (полисахарид с молекулярной массой 400000 Д); эритроциты барана. Ход определения. Вносят 10 мл крови в пластиковую пробирку с раствором гепарина (256 ЕД/мл) и осторожно перемешивают. Гепаринизированную кровь разводят фосфатным буфером (рН 7,4) в соотношении 1 : 2. 9 мл смеси осторожно наслаивают на раствор фиколл-гипак плотностью 1,077 г/мл (12 частей 9% фиколла и 5 частей 33,9%-ного гипака плотностью 1,077 г/мл). Пробирки центрифугируют 40 минут при 1500 об/мин. В связи с тем, что могут использоваться разные системы центрифуг, необходимо применять такие режимы центрифугирования, чтобы сила разделения в интерфазе составила 400g. Значение центробежного ускорения G вычисляют по формуле: G 1,1n 2 R 10 5 , Где n – число оборотов в мин; R – радиус от центра оси центрифуги до границы соприкосновения смеси фиколл-гипака с разделяемой суспензией, см. После центрифугирования слой лимфоцитов осторожно пипеткой извлекают из интерфазы и дважды отмывают буферным раствором. Концентрацию клеток доводят до 2 – 4 млн в 1 мл в среде 199*, содержащей 10%-ный раствор телячьей сыворотки. Перед использованием суспензии лимфоцитов проверяют их жизнеспособность. Равные объемы 0,1%-ного раствора водного эозина на среде Хенкса или Рингера двойной концентрации без глюкозы и 0,1%-ного раствора трипанового синего на дистиллированной воде смешивают перед 52 употреблением. 1 – 2 капли этой смеси добавляют к капле суспензии клеток и часть смеси переносят в камеру Горяева. Окрашенные (мертвые) клетки просчитывают на 100 клеток в поле зрения. При правильной обработке процент мертвых клеток не превышает 3. Приготовление эритроцитов барана. Используют эритроциты одного животного или смесь, полученную от нескольких. Эритроциты можно хранить в течение 2 недели при 4 ˚С в растворе Олсвера (глюкоза – 2,05, цитрат натрия – 0,8, хлорид натрия – 0,42 г, дистиллированная вода – 100 мл), рН этого раствора устанавливают равным 6,1 с помощью 10%-ного раствора лимонной кислоты. Перед употреблением эритроциты барана 3 – 4 раза отмывают фосфатным буфером и готовят 0,5%-ную (по объему) взвесь клеток. Подготовка и учет реакции розеткообразрвания. Реакцию проводят по методу, описанному Jondal и соавт. В 1972. В пластиковые пробирки (от 2 до 5) вносят 0,1 мл взвеси лимфоцитов и добавляют равный объем 0,5%-ной взвеси эритроцитов барана. Соотношение эритроциты: лимфоциты не должно превышать 50 : 1. Инкубируют смесь в термостате 37 ˚С в течение 10 мин. Затем пробы центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) и оставляют на ночь в холодильнике при температуре 4 ˚С. Подсчет клеток мы рекомендуем проводить в камере Горяева. Существующий метод фиксации суспензии глютаровым альдегидом с последующим приготовлением мазков и просчетом розеток в окрашенных препаратах позволяет накапливать стекла и анализировать результаты реакции в другой, свободный от постановки или менее загруженный день. Приготовление мазков для подсчета Т-лимфоцитов. Предметные стекла необходимо пронумеровать на каждое исследуемое животное. Из приготовленной суспензии на предметном стекле делают мазки (3 размазанные капли). Высушивают мазки на воздухе. Фиксируют на мостике 53 метанолом в течение 7 – 10 мин, промывают дистиллированной водой, высушивают и окрашивают краской Романовского-Гимзы, через 30 мин промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, укладывают в полиэтиленовый пакет и переносят в холодильник. Краску Романовского-Гимзы готовят таким образом: к 10 мл фабричного раствора краски Романовского-Гимзы добавляют 90 мл дистиллированной воды нейтральной реакции. Краску готовят перед употреблением. Время окрашивания 10 мин. Учет реакции проводят путем подсчета 100 (200) лимфоцитов под иммерсией микроскопа. Клетки, присоединившие 3 эритроцита барана и более, считают розеткообразующими лимфоцитами, остальные – нерозеткообразующими. Абсолютное количество Т-лимфоцитов можно рассчитать, зная количество лейкоцитов в 1 л крови (а), процент лимфоцитов в крови (б) и процент розеткообразующих Т-лимфоцитов (в) по формуле абв/10000. Например: в крови теленка содержание лейкоцитов составляет 8,7 ∙ 10 9 /л, в лейкограмме процент лимфоцитов – 70; процент розеткообразующих Тлимфоцитов – 52, значит, абсолютное содержание Т-лимфоцитов у животных будет равно 3,1668 ∙ 10 9 /л или 3,2 ∙ 10 9 /л. Для подсчета клеток в камере Горяева осадок клеток в извлеченных из холодильника пробирках осторожно ресуспендируют пастеровской пипеткой (несколько раз медленно набирают и выпускают клеточную взвесь) и добавляют 0,02 мл 0,01%-ного раствора в фосфатном буфере акридинового оранжевого. Этот краситель дает ярко-зеленую люминесценцию при возбуждении ультрафиолетом. Через 2 – 3 мин заполняют камеру Горяева и определяют процент Е-РОК путем подсчета 300 лимфоцитов в люминесцентном микроскопе. Это значительно облегчает и ускоряет 54 процедуру подсчета ярко светящихся лимфоцитов, окруженных розоватыми эритроцитами. Определение активных Т-лимфоцитов, образующих розетки с эритройитами барана Все (ЕА-РОК) подготовительные операции выполняют так, как это описано для Е-РОК, за исключением сыворотки, которую при определении ЕА-РОК не добавляют в инкубационную среду, и длительной холодовой инкубации. После термостатирования 10 мин при 37 ˚С и последующего центрифугирования при 1000 об/мин (для ЦЛК-1) в течение 5 мин проводят подсчет Т-активных лимфоцитов, способом, описанным выше для общих Т-клеток. Кроме субпопуляций определения важное численности значение Т- и необходимо В-лимфоцитов придавать и их хелперно- супрессорному отношению. Определение соотношения лимфоцитов с хелперной и супрессорной функциями проводят в теофиллиновом тесте. Принцип метода состоит в том, что в присутствии теофиллина Т-лимфоциты с супрессорной функцией теряют способность к Е-розеткообразованию. Определение теофиллинчувствительности Т-клеток Принцип метода. Препараты, повышающие уровень внутриклеточного цАМФ (теофиллин, аденозин), ингибируют реакцию спонтанного розеткообразования между зрелыми Т-лимфоцитами и эритроцитами барана. Ход определения. Используемые реактивы и оборудование аналогичны для описанного выше метода определения Т-активных лимфоцитов. Исключение составляет теофиллин (химически чистое соединение), 0,3 М раствор которого на дистиллированной воде, подогретой до 60 ˚С, готовят каждый раз при постановки метода. 55 Охлажденный до комнатной температуры теофиллин добавляют в инкубационную среду (без добавление сыворотки), термостатируют, центрифугируют и просчитывают клетки так же, как и Т-активные. теофиллинчувствительные Выявляют Т-клетки, т.е. две субпопуляции: лимфоциты, утратившие способность к розеткообразованию под влиянием обработки теофиллином, и теофиллинустойчивые Т-клетки. Определение В-клеток методом розеткообразования с эритроцитами барана в системе ЕАС Принцип метода. Тимуснезависимые В-лимфоциты имеют на своей мембране специфические детерминанты, позволяющие дифференцировать их от Т-лимфоцитов. Таким детерминантом является поверхностный (мембранный) иммуноглобулин класса М. Число лимфоцитов, несущих иммуноглобулины А, G, E или D, крайне незначительно ( A и G – 1 – 5%, D и E – 2 – 4%). Чаще применяется метод выявления B- клеток по их способности образовывать розетки с эритроцитами барана, нагруженными антителами в среде комплемента. Такие эритроциты маркируют и Fc-, и C3-рецепторы Влимфоцитов. Оборудование и реактивы те же, что и для метода определения Т-лимфоцитов. Аналогично готовят и суспензию лимфоцитов. Антисыворотку, содержащую антитела к эритроцитам, готовят путем иммунизации кролика эритроцитами барана или быка. Кролику в краевую вену уха вводят 3-5 мл 50%-ной суспензии эритроцитов. На 4 – 6-й день у него берут кровь и получают сыворотку, которая в этот период на высоте иммунного ответа преимущественно содержит антитела класса М. 56 Наилучший эффект бывает при работе с гамма-глобулиновой фракцией сыворотки, которую получают высаливанием в насыщенном растворе аммиака или риванола. Антисыворотку инактивируют и определяют ее гемолитический и агглютинационный титры. Можно использовать и широко доступную гемолитическую сыворотку кролика. Комплимент. Источником комплимента служат свежие сыворотки мыши. Активность комплимента определяют в гемолитической системе. Сенсибилизация эритроцитов. Смешивают равные объемы 1%-ной взвеси эритроцитов барана (предпочтительнее эритроциты быка) и антисыворотки к виду эритроцитов, используемых в реакции (или гемолитической сыворотки кролика) в субагглютинирующем разведении. Смесь инкубируют 40 мин при 37 ˚С, осторожно встряхивая каждые 10 мин. После термостатирования эритроциты трижды отмывают фосфатным буфером до 10 мин при 1500 об/мин. Супернатант отбрасывают, а к осадку добавляют первоначальный объем фосфатного буфера и равный объем абсорбированной сыворотки мыши, содержащей комплимент в разведении 1:10. Смесь помещают в термостат при 37 ˚С на 30 мин. Вновь эритроциты трижды отмывают. При отмывании их центрифугируют осторожно при 1000 об/мин 5 мин, чтобы не вызвать агглютинации эритроцитов. Готовят 0,5%ную суспензию эритроцитов и просматривают под микроскопом. При наличии агглютинации эритроцитов суспензия не пригодна. Готовые эритроциты, нагруженные антителами и комплементом (ЕАС), можно хранить в холодильнике (4˚С) 4 – 5 дней. Определение ЕАС-лимфоцитов. К 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляют 0,1 мл сенсибилизированных эритроцитов. Оптимальное соотношение эритроцитов к лимфоцитам равно 20 : 1. Смесь инкубируют 45 мин при 57 37 ˚С, после чего пробирки помещают в лед. Подсчет В-клеток проводят описанным выше способом. 2.2.2. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов (метод В.М. Бермана, Е.М. Славской, 1958) Принцип метода. Метод основан на учете числа бактерий, захваченных нейтрофилами в процессе их совместного инкубирования в термостате. Ход определения. В две стерильные центрифужные пробирки наливают по 0,2 мл 2%-ного раствора натрия цитрата и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови. Пробирки с содержимым центрифугируют при скорости 1000 об/мин в течение 3—5 мин. После центрифугирования пробирки ставят на 10—15 мин в бытовой холодильник для уплотнения лейкоцитарной пленки. Пипеткой удаляют плазму и снимают лейкоцитарную пленку с небольшим количеством эритроцитов, общий объем сыворотки крови 0,1 мл. Добавляют равное количество микробной взвеси кишечной палочки в 0,85%-ном растворе натрия хлорида, содержащей по оптическому стандарту мутности 500 мл микробных тел в 1 мл. Пробирки помещают в термостат на 30 мин при 37 °С, периодически их встряхивая. Одновременно в термостат ставят для подсушивания чашки Петри с мясопептонным агаром, предварительно извлеченные из холодильника и находившиеся 14—20 мин при комнатной температуре. Пробирки извлекают из термостата и центрифугируют 3—5 мин при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, а к осадку добавляют тройной объем физиологического раствора, после чего пробирки вновь центрифугируют, надосадочную жидкость удаляют пастеровской пипеткой. После встряхивания осадка его наносят в виде двух капель на поверхность подсушенного агара – по одной капле на край каждой половины чашки Петри. 58 Толстым стеклом с гладкими краями (можно использовать камеру Горяева), слегка подогретым, примерно до 37 °С, делают два мазка на поверхности агара, к одному из которых сразу же прикладывают слегка подогретое стекло и быстро снимают его пинцетом с агара. Чашку Петри со вторым мазком крови помещают в термостат при 37 °С на 1 ч, после чего к нему прикладывают второе, слегка подогретое предметное стекло. Стекла с отпечатанными на них мазками фиксируют и сначала окрашивают течение 4 мин краской Май-Грюнвальда, а затем после смывания краски водой докрашивают в течение 55 мин Романовского—Гимзы (на 10 мл краской воды обычно вносят 15 капель краски). Мазки промывают водопроводной водой и высушивают на воздухе. Под микроскопом в обоих мазках определяют: процент фагоцитоза — количество фагоцитирующих нейтрофилов при подсчете 100 клеток; фагоцитарное число — среднее число микроорганизмов, фагоцитированных одним нейтрофилом. Отдельно подсчитывают поглощенные живые (синие) и мертвые бактерии, находящиеся в стадии переваривания (фиолетовые, розовые, нередко разбухшие). Разница между процентом клеток, содержащих переваренные микроорганизмы, во втором и первом мазках составляет индекс переваривания. Подсчитывают микробную емкость крови путем умножения числа нейтрофилов, содержащихся в 1 мм крови, на фагоцитарное число, а также переваривающую способность крови, умножением этого же количества нейтрофилов на среднее число переваренных одним нейтрофилом бактерии. Процент фагоцитоза, фагоцитарное число, фагоцитарная (микробная) емкость, индекс переваривания и переваривающая способность крови достаточно полно характеризуют фагоцитарную реакцию нейтрофилов крови. 59 2.3. Определение уровня иммуноглобулинов в маточной слизи коров (по Г.Г. Козлову и Б.К. Акназарову, 1989) Количественная оценка уровня иммуноглобулинов маточной слизи имеет определенное прогностическое значение, позволяет понять патогенез воспалительных заболеваний матки и характер иммунобиологической перестройки ее и организма коров целом на воздействие антигенных факторов (бактерии, вирусы и др. генетически чужеродные агенты). За основу определения уровня иммуноглобулинов маточной слизи у коров принят метод радиальной иммунодиффузии по Манчини с соавторами (1965). Сущность метода состоит в том, что иммуноглобулины испытуемых проб радиально диффундируют в агар, в котором содержится моноспецифическая антисыворотка, образуя кольцо преципитации, деаметр которого прямопропорционален концентрации иммуноглобулина, содержащегося в испытуемой пробе. Необходимые оборудование и реактивы. Стеклянные пластинки 9х12 см. П-образная рамка толщиной 1 мм, зажимы, микрошприц, трафарет для пробивания лунок, пробойник, чертежный измеритель, водяная баня, влажная камера (эксикатор), полулогарифмическая бумага, агар Дифко, веронал-мединаловый буфер с рН-8,6 (5,52 г веронала, 35,04 г мединала, дистиллированная вода – до 1 л), моноспецифические антисыворотки к отдельным классам иммуноглобулинов с известным рабочим разведением, стандартная сыворотка с известным содержанием иммуноглобулинов, 0,1%ный раствор амидо-черного (1 г амидо-черного, 100 мл ледяной уксусной кислоты, дистиллированной воды до 1 л. Через 12 ч краску профильтровать через бумажный фильтр) ; 2%-ный раствор уксусной кислоты для отмывания краски. 60 Материал для исследования – маточная слизь, лохии или воспалительный экссудат матки. Их получают путем массажа матки и ее шейки при ректальном исследовании, а также рукой в стерильной полиэтиленовой перчатке из устья шейки матки в стерильные пробирки, пластмассовые емкости из под экзутера или стеклянные флаконы из под антибиотиков. При достаточных объеме и густоте полученные пробы маточного секрета гомогенизируют гомогенизатором типа 302 (ПНР) (можно использовать миксер) до получения жидкого гомогената. Полученный гомогенат разливают в пластмассовые пробирки с пробкой объемом 1 мл в нужных экземплярах и хранят при температуре 18 – 20 ˚С. При исследовании иммуноглобулинов (G, M, A) приготовленный гомогенат используют неразведенным. В случаях плохой гемогенизации или невозможности гомогенизировать из-за малого объема полученные пробы маточного секрета перед постановкой РИД разбавляют стерильным 0,9%-ным раствором хлорида натрия или мединаловым буфером (рН=8,6) с расчетом 1:2 – 1:4. Методика определения. Предварительно готовят пластинки из 3%ного агара, смешанного с антисывороткой. С этой целью используют 3%-ный агар «Дифко», приготовленный на мединаловом буфере, и антисыворотку с известным рабочим разведением. Для приготовления смеси антисыворотку, подогретую до температуры 55 ˚С, тщательно смешивают с равным объемом (по 5 мл каждого реагента) расплавленного агара, охлажденного до температуры 55 ˚С в бактериологических пробирках с отогнутыми краями, не допуская образования пузырей. Для получения слоя агара с антисывороткой одинаковой толщины используют две фотопластинки размером 9х12 см, отмытые от эмульсии и обезжиренные. Между этими пластинками устанавливают П-образную рамку 61 толщиной 1 мм с небольшим зазором между ними для более удобного заполнения смесью. Всю систему скрепляют зажимами. Поддерживая рамку со стеклами в слегка наклонном состоянии, осторожно заливают смесь в пространство, образованное между двумя стеклами, избегая образования пузырей. Заполненную форму оставляют в вертикальном положении на 15 – 20 мин при комнатной температуре. После застывания смеси снимают зажимы и удаляют одну из пластинок скользящим движением по поверхности рамки. Затем в агаровом слое пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм по трафарету на расстоянии 15 мм от друга. В первый ряд лунок микрошприцем вносят соответствующие разведения стандартной сыворотки по 1 мкл, а в остальные – исследуемые пробы маточной слизи. Пластинку в строго горизонтальном положении помещают во влажную камеру (эксикатор) и инкубируют в течение 24 ч (для IgG и IgA) или 48 ч (IgM). Учет результатов проводят в строго указанный срок. Расчет результатов. При положительном результате реакции вокруг лунок появляются зоны преципитации в форме концентрических окружностей. По истечении указанного времени измеряют диаметры образовавшихся колец преципитации. Затем строят калибровочную кривую с использованием полулогарифмической бумаги, откладывая по линии абсцисс диаметры колец преципитации различных разведений стандартной сыворотки, а по линии ординат – концентрацию иммуноглобулинов, выраженную в мг/мл. Калибровочную кривую строят для каждой пластинки и каждого класса иммуноглобулинов отдельно; полученные точки должны располагаться на прямой линии, т.е. иметь линейную зависимость. 62 Количество иммуноглобулина в испытуемой пробе определяют путем сравнения диаметра кольца преципитата вокруг ее лунки с калибровочной кривой. При определении концентрации иммуноглобулинов в разведенных пробах найденные значения умножат на степень разведения исследуемых проб. Измерять преципитационные кольца удобнее линейкой типа БерингВерке после окрашивания агаровых пластин. Стекла с агаром погружают на двое суток в буфер или физиологический раствор. В течение этого срока буфер или физиологический раствор трижды заменяют новой порцией. После отмывания от не участвующих в реакции веществ пластинки агара высушивают при комнатной температуре под фильтрованной бумагой. Удалив последнюю, пластинки помещают в раствор амидо-черного на 30 мин. Избыток краски отмывают раствором уксусной кислоты до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. 2.4. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов в маточной слизи коров (по Г.Г. Козлову и Б.К. Акназарову, 1989) Фагоцитоз в матке животных рассматривают как важный неспецифический иммунный фактор местной защиты, как первая реакция 63 организма на генетически чужеродные тела. Обнаружены также межвидовые различия фагоцитоза. Так, например, у кобыл лейкоциты скапливаются в строме матки, у свиней – в маточной жидкости, а у коров – в строме и маточной жидкости в равной мере (T. Frank et al., 1983). Фагоцитарной полиморфноядерные функцией в матке лейкоциты или в основном нейтрофилы. По обладают данным M. Vandeplasche et al. (1979), известно, что нейтрофилы в первую очередь фагоцитируют грамположительные микроорганизмы и в меньшей мере – грамотрицательные. Метод определения фагоцитарной активности лейкоцитов маточной слизи основан на визуальном учете числа бактерий, захваченных нейтрофилами в процессе естественного фагоцитоза в полости матки животных. При этом оценивают захватывающую способность нейтрофилам по двум показателям: фагоцитарному индексу (количество бактерий, захваченных одним нейтрофилом) и проценту фагоцитоза (отношение нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе, к общему числу подсчитанных). Методика определения фагоцитарной активности нейтрофилов маточной слизи коров состоит из следующих основных этапов: получение маточной слизи, приготовление мазков слизи и их окрашивание, подсчет числа нейтрофилов и захваченных бактерий, а также расчет полученных результатов. При определении фагоцитарной активности нейтрофилов маточной слизи использовали метод, предложенный М.С. Покровской и М.С. Макаровым (1942) в модификации П.А. Емельяненко (1980) для определения фагоцитарной активности лейкоцитов крови крупного рогатого скота. Необходимое оборудование и реактивы. Микроскоп световой биологический типа МБИ-6; обезжиренные чистые предметные стекла, контейнеры для окраски мазков 64 с кюветами, пинцет, стаканы градуированные, палочки стеклянные, пипетки градуированные, готовый краситель Романовского-Гимза (азур-эозиновая смесь), дистиллированная вода, абсолютный метиловый спирт (СН3ОН) (ХЧ), стерильный 0,85%-ный нейтральный раствор хлорида натрия, иммерсионное масло. Материал для исследования – маточная слизь. Её получают аналогичным способом, описанным в предыдущей методике. Содержимое шейки матки для приготовления мазков также собирают ватным тампоном, фиксированным корнцангом через влагалищное зеркало. Чистую пробу маточного секрета у коров можно получить с помощью универсального утеротома для биопсии и взятия маточной слизи, сконструированного нами. Методика приготовления мазков слизи. Мазки из маточной слизи делают сразу же после ее получения. Техника приготовления мазков зависит от состояния пробы и способа ее получения. При жидкой консистенции полученной пробы мазки приготовляют путем легкого соприкосновения ее с поверхностью предметного стекла. От секрета вязкой консистенции и пропитанной в тампоны слизи мазки делают путем равномерного размазывания на предметное стекло с легким прикосновением и скользящим движением. Приготовленные мазки высушивают на воздухе и фиксируют метиловым спиртом в течение 15 – 20 мин. Методика окрашивания мазков и учета захватывающей способности нейтрофилов. Высушенные мазки после фиксации окрашивают по Романовскому-Гимза (азур-эозиновая смесь). Рабочий раствор красителя (2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды) готовят перед употреблением. На фиксированные мазки наносят рабочий раствор краски и выдерживают в течение 20 – 30 мин, а затем 2 – 3 мин промывают водопроводной водой. После этого высушивают при комнатной температуре 65 на воздухе. Окрашивать мазки можно также азур-эозином или по Поппенгейму. Высушенные после окраски мазки просматривают под микроскопом с использованием иммерсионной системы. В мазке подсчитывают 50 нейтрофилов, а также количество захваченных ими бактерий. Расчет результатов. Оценивают фагоцитарную активность нейтрофилов по двум показателям, характеризующим захватывающую способность лейкоцитов: фагоцитарный индекс и процент фагоцитоза. Фагоцитарный индекс (Ф) подсчитывают по формуле: Ф М 50 где М – общее количество захваченных бактерий; 50 – общее количество подсчитанных нейтрофилов. Процент фагоцитоза (Пф) определяют по формуле: Пф N 100 50 где N – число нейтрофилов, участвующих в фагоцитозе, т.е. захватывающие микробы. Например, из 50 подсчитанных нейтрофилов в 35 было обнаружено 106 микробов. Следовательно, фагоцитарный индекс нейтрофилов будет равен 106 1,12, а процент фагоцитоза нейтрофилов составляет 50 35 100 70. 50 2.5. Диагностика иммунного бесплодия коров, разработанная во ВНИИРЖ (г. Пушкин) в описании П.С. Веревочкина и Н.Н. Едренина (1988) 66 Для осаждения сыворотки пробирки с кровью помещают в термостат на 30 – 40 минут при температуре 37 ˚С. Сгусток крови отслаивают от стенки пробирки над огнем с помощью пастеровской пипетки и оставляют пробирки на сутки в термостате при температуре 37 ˚С для ретракции сгустка, затем сыворотку крови отсасывают от сгустка стерильной пастеровской пипеткой также над огнем и переносят в другие стерильные пробирки и центрифугировают в течение 10 – 15 минут при 1000 об/мин с целью отделения от нее клеточных элементов. После чего сыворотку крови разливают в стерильные ампулы и хранят до исследования в бытовом холодильнике при температуре +4 ˚С. В качестве антигена используют сперму быков-производителей, индивидуально закрепленных за каждой коровой. Для постановки реакции сперму (2 мл) центрифугируют в течение 10 минут при 1000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют. Полученный осадок трехкратно промывают стерильным физиологическим раствором хлорида натрия. Далее осадок из спермиев разбавляют изотоническим раствором хлорида натрия (0,9%). Затем из пробирок при помощи пипетки берут одну каплю суспензии спермий и добавляют к 1,5 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия и получают 2%-ную взвесь спермий. Для опытов используют сперму с активностью спермиев в 8 – 9 баллов и концентрацией спермиев 0,8 – 1 млрд/мл. При постановке микробиологические реакции пробирки и агглютинации пластинки. используют Разведение сыворотки производят следующим образом. В первую пробирку наливают 1 мл сыворотки крови, физиологического а в последующие раствора. 10 Двенадцатая 67 пробирок пробирка – по 0,5 мл с чистым физиологическим раствором служит контролем. Далее из первой пробирки 0,5 мл переносят во вторую и т. д. Из одиннадцатой пробирки 0,5 мл раствора удаляют. Таким образом, получают ряд последовательных разведений сыворотки 1:1; 1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024. Затем в каждую пробирку глазной пипеткой вносят по 2 капли взвеси спермий, пробирки ставят на 1 час в термостат при температуре +37 ˚С, после чего производят учет реакции. Оценку реакции производят макро- и микроскопически. В процессе реакции спермии (в отсутствие антител к ним) оседают на дно пробирки (отрицательная реакция). При наличии антител в сыворотке крови коров к антигенам спермы быка в процессе реакции происходит агглютинация спермий и образование комплекса антигенантитело, которые выпадают в осадок. Для микроскопической оценки осадок переносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и определяют число агглютинированных спермиев. 2.6.Характеристика иммуномодулятора Миелопид 68 Миелопид или В-активин получают из ребер молодых свиней (до 6месячного возраста). Разработка препарата проведена на базе Института иммунологии АМН РФ (Р.В. Петров, Р.С. Степаненко, Ю.О. Сергеев и др.) и МГАВМиБ им. К.И. Скрябина (Е.С. Воронин, Д.А. Девришов). В-активин представляет собой лекарственную форму препарата, полученную на основе миелопептидов – естественных продуктов жизнедеятельности клеток костного мозга, накапливающихся в культурной среде при культивировании этих клеток. Из культуральной среды миелопептиды выделяют гельхроматографией и ультрафильтрацией. Препарат (группа гидрофобных отрицательно заряженных пептидов с молекулярной массой 1000 – 3000 Д) под названием В-активин разрешен для клинического применения в ветеринарии и под названием миелопид – в медицине. Миелопептиды вырабатываются клетками костного мозга различных видов животных без дополнительного антигенного или митогенного воздействия, не обладают видовой специфичностью; их стимулирующий эффект наиболее выражен при наличии иммунодефицита. Спектр функциональной активности миелопептидов включает их способность увеличивать выработку антител, вовлекая в антителогенез дополнительное количество предшественников антителопродуцирующих клеток, стимулировать функциональную активность Т-лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов, влиять на дифференцировку предшественников иммунокомпетентных клеток. 3. Результаты собственных исследований 69 3.1. Результаты акушерско-гинекологической диспансеризации коров в учебно-опытном хозяйстве «Бессоново» В учебно – опытном хозяйстве разводят крупный рогатый скот чернопестрой породы. Под нашим наблюдением в течение 2007 – 2011 гг. находилось 68 коров в возрасте от 4-х до 6-и лет. Для выявления основных факторов, обуславливающих репродуктивную функцию коров, в данном хозяйстве нами была проведена акушерско-гинекологическая диспансеризация животных. При этом учитывали время от отела до 1-го осеменения, от 1-го осеменения до оплодотворения, межотельный период, количество дней бесплодия и индекс осеменения. Таблица 1 Эффективность воспроизводства стада п/н 1 2 3 Показатели Количество коров Период дней а) от отела до 1-го осеменения б) от 1-го осеменения до оплодотворения в) межотельный г) дни бесплодия Индекс осеменения 2007 106 Период исследований (годы) 2008 2009 93 84 73,2±0,7 94,3±0,6 80,6±0,14 82,4±0,16 82,8±0,26 101,7 123,0 134,1±0,8 398,1±0,31 115,0±0,31 4,8±0,3 413,7±0,13 127,8±0,27 6,1±0,8 371,6±0,6 394,2±0,29 101,2±0,19 114,4±0,12 3,5±0,6 3,9±0,8 70 2010 62 Из табл.1 видно, что в учебно – опытном хозяйстве «Бессоново» наблюдается низкий уровень воспроизводства стада вследствие продолжительного периода бесплодия коров. Так, период от 1-го осеменения до оплодотворения коров по годам исследований составляет от 94,3±0,6 до 134,1±0,8 дней, а межотельный период – от 371,6±0,6 до 413,7±0,13 дней. Количество дней бесплодия составляет от 101,2±0,19 до 127,8±0,27 дней. Индекс осеменения очень высок и составляет от 3,5±0,6 до 6,1±0,8. Таблица 2 Результаты биохимических исследований сыворотки крови коров в стойловый период п/н Периоды исследований (год) 1 2 3 4 5 2007 2008 2009 2010 Норма в среднем Как каротин (мг%) 0,52-1,08 0,56-0,97 0,53-0,60 0,52-0,78 0,70 показывают Показатели кальций фосфор белок (мг%) (мг%) (г%) 10,3-11,1 9,6-10,8 9,56-12,6 10,1-11,0 12,2 результаты 4,5-6,0 4,1-6,3 3,9-5,4 3,5-4,0 4,5 6,2-8,1 6,5-8,6 6,9-8,8 7,7-11,3 8,5 биохимических Резервная щелочность (мг%) 320,0-392,2 340,4-356,2 328,1-440,8 420,1-420,3 460-540 исследований, представленные в табл. 2, у коров в стойловый период существенно снижены резервная щелочность сыворотки крови, содержание кальция и фосфора. Это свидетельствует о наличии ацидоза и нарушениях минерального обмена в организме животных, что, несомненно, нашло отражение в низких показателях репродуктивной функции у коров. 71 3.2. Динамика показателей иммунитета у коров черно-пестрой породы 3.2.1. Значение иммунных факторов в нарушениях репродуктивной функции у коров Известно, что сперма производителей содержит более 20 различных антигенов, поэтому при поступлении спермы в половые органы самок в их организме образуются антиспермальные антитела, которые приводят к иммунному бесплодию коров. После осеменения коров спермии попадают в условия биохимического, биофизического и иммунного воздействия цервикальной слизи. Под влиянием биологических факторов цервикальной слизи активность спермиев может быть понижена не только по причине изменения реакции (рН) среды, поверхностного натяжения осмотического давления, но и вследствие наличия поступающих из лимфатических узлов, дренирующих матку, спермиоантител. Поэтому, изучение биологических свойств цервикальной слизи, как и сыворотки крови, на наличие спермиоагглютининов, имеет большое значение при выявлении причин бесплодия и установления оптимальных сроков осеменения коров, находящихся в половой охоте. У подопытных коров проводили тщательные гинекологические исследования (вагинально и ректально) с целью исключения патологии половых органов, что явилось бы причиной их бесплодия. Пальпацией состояние через яичников, прямую кишку устанавливали определяли ригидность функциональное рогов матки, их консистенцию. При вагинальном исследовании с применением влагалищного зеркала определяли состояние слизистой оболочки преддверия влагалища, влагалища 72 и влагалищной части шейки матки. При этом обращали внимание на блеск слизистой оболочки, ее цвет, увлажненность, наличие или отсутствие кровоподтеков, а также на степень раскрытия шейки матки. Перед осеменением коров их цервикальную слизь исследовали на скрытый эндометрит по модифицированному тесту Уатсайда (Ю.Н. Попов, 1968), и реакции на димастин. Результаты исследований представлены в таблицах 3 и 4. Таблица 3 Титр спермиоагглютининов в цервикальной слизи и в сыворотке крови у коров с нормальным течением послеродового периода в стадии возбуждения полового цикла Инвент арный номер коровы в опыте 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Титр антител к спермием основного быка В В цервикал сыворотк ьной е слизи крови 1:8 1:8 1:2 1 : 16 1:8 1:8 1:8 1 : 16 1 : 16 1 : 32 1:4 1 : 16 1:8 1 : 16 1:2 1 : 16 1 : 16 1 : 16 1:8 1 : 16 Количество осеменений до оплодотвор ения 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Титр антител к спермиям заменяющего быка В цервикальной слизи В сыворотке крови 1:1 1:1 1:4 1:1 1:1 1:2 1:2 1:1 1:1 1:1 1 : 16 1:8 1:8 1 : 16 1:8 1 : 16 1 : 16 1 : 16 1 : 16 1 : 16 Количество осеменени й до оплодотвор ения 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 Как можно видеть из табл.3 титр спермиоагглютининов в цервикальной слизи коров с нормальным течением послеродового периода в стадии 73 возбуждения полового цикла к спермиям основного быка был в пределе 1:2 – 1:16. Титры антител к спермиям заменяющего быка (табл. 3) составили в цервикальной слизи в 1:2 и 1:4. Титр антител к спермиям в сыворотке крови заменяющего быка были у 3-х коров 1:8, у 7-и коров 1:16. Установлено, что титры антител к спермиям заменяющего быка в цервикальной слизи и сыворотке крови коров значительно ниже, чем к спермиям основного быка. Коровы были успешно оплодотворены в первую половую охоту после отела при титрах спермиоантител 1:16. Таблица 4 Титр спермиоагглютининов в цервикальной слизи и в сыворотке крови у многократно осеменяемых коров в стадии возбуждения полового цикла Инвент арный номер коровы в опыте 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Титр антител к спермием основного быка В В цервикал сыворотк ьной е слизи крови 1 : 64 1 : 128 1 : 128 1 : 128 1 : 64 1 : 128 1 : 64 1 : 64 1 : 64 1 : 64 1 : 128 1 : 128 1 : 64 1 : 64 1 : 64 1 : 64 1 : 32 1 : 128 1 : 32 1 : 64 Количество осеменений до оплодотвор ения 12 10 10 12 6 8 6 8 10 10 74 Титр антител к спермиям заменяющего быка В цервикальной слизи В сыворотке Крови 1:8 1:8 1 : 16 1 : 32 1 : 32 1 : 32 1 : 64 1 : 16 1 : 32 1 : 64 1 : 128 1 : 128 1 : 128 1 : 64 1 : 128 1 : 64 1 : 64 1 : 64 1 : 64 1 : 64 Количество осеменени й до оплодотвор ения 6 6 8 6 6 4 8 8 6 8 Из результатов исследований, представленных в таблице 4 видно, что титры спермиоагглютининов в цервикальной слизи и сыворотки крови у многократно осеменяемых коров в стадии возбуждения полового цикла существенно выше аналогичных показателей у коров с нормальным течением послеродового периода. Если титры спермиоагглютининов у многократно осеменяемых коров в цервикальной слизи составляли от 1:32 до 1:64, а у двух коров 1:128 (табл.4), то у коров с нормальным течением послеродового процесса они были не выше 1:16, т.е. значительно ниже (табл.3). Титры спермиоагглютининов в сыворотке крови коров многократно осеменяемых спермой основного быка от 1:64 до 1:128 (табл.4), аналогичные показатели титров спермиоагглютининов в сыворотке крови коров с нормальным течением послеродового периода были не выше, чем 1:16 (табл.3). Количество осеменений многократно осеменяемых коров (табл.4) с высокими титрами антител к спермиям основного быка в цервикальной слизи составило до 12, тогда как у коров с нормальным течением послеродового периода (табл.3), количество осеменений составило всего 2. Из результатов исследований, представленных в табл. 3-4 видно, что титры спермиоагглютининов как в цервикальной слизи, так и в сыворотке крови многократно осеменяемых коров как к спермиям основного, так и заменяющего быка были существенно выше, чем у коров с нормальным течением послеродового периода. Высокие титры циркулирующих спермиоагглютининов в цервикальной слизи и в сыворотки крови коров приводили к длительному безрезультативному их осеменению. Поэтому, наличие высоких титров агглютинирующих спермиоантител в сыворотке крови и цервикальной слизи коров может быть причиной их бесплодия. 75 Исходя из вышеизложенного, при акушерско-гинекологической диспансеризации коров без ясных клинических признаков бесплодия необходимо их исследовать на наличие циркулирующих спермиоагглютининов в их крови и цервикальной слизи к спермиям основных и заменяющих быков – производителей. Таким образом, результаты исследований, представленные в табл. 3 и 4, показывают, что результативное осеменение коров достигается лишь только в том случае, когда титры спермиоагглютинирующих антител в цервикальной слизи и в сыворотке крови коров не более чем 1:32. Для повышения эффективности осеменения коров целесообразно использовать сперму заменяющих быков-производителей – это особенно необходимо для плодотворного осеменения бесплодных коров. 76 3.3. Значение иммунных факторов в регуляции репродуктивной функции коров Таблица 5 3.3.1. Содержание иммуноглобулинов в цервикальной слизи и сыворотке крови коров в стадию возбуждения полового цикла (мг/мл) п/н 1 2 Состояние животных Коровы с нормальным течением послеродового периода Коровы многократно осемененные, но остающиеся бесплодными Содержание иммуноглобулинов В цервикальной слизи В сыворотке крови В цервикальной слизи В сыворотке крови Иммуноглобулины мг/мл G 2,57±0,04 M A 0,22±0,06 0,23±0,08 ____ 14,52±0,43 4,47±0,21 8,12±0,17 0,68±0,11 18,00±0,30 5,36±0,16 0,66±0,07 ____ Из результатов исследований, представленных в табл. 5 видно, что у коров с нормальным течением послеродового процесса в стадию возбуждения полового цикла концентрация IgG в цервикальной слизи составляет 2,57±0,04 мг/мл, IgM – 0,22±0,06 мг/мл и IgA – 0,23±0,08 мг/мл – соответственно. У бесплодных, многократно безрезультативно осемененных коров содержание IgG в цервикальной слизи составило – 8,12±0,17 мг/мл, IgM – 0,68±0,11 мг/мл и IgA – 0,66±0,07 мг/мл – соответственно. Концентрация IgG в сыворотке крови бесплодных коров была в 1,2 раза выше, чем в сыворотке крови коров с нормальным течением послеродового процесса и оплодотворившихся после 2х кратного осеменения в первую 77 охоту после родов. Концентрация IgM у бесплодных коров также была выше (в 1,2 раза), чем у коров с нормальным течением послеродового периода. Результаты исследований (табл. 5) показывают, что содержание IgG в цервикальной слизи бесплодных коров была в 3,2 раза, IgM – в 3,1 и IgA в 2,9 выше, чем у коров с нормальным течением послеродового периода. Мы предполагаем, что высокие титры спермиоагглютининов в цервикальной слизи бесплодных коров являются следствием высокой концентрации иммуноглобулинов класса G, M и А в цервикальной слизи и сыворотке крови бесплодных коров. Таблица 6 3.3.2. Содержание лейкоцитов в крови подопытных коров п/н 1 2 Состояние животных Коровы с нормальным течением послеродового процесса, осемененные в 1-ую половую охоту после отела Коровы многократно осемененные, но остающиеся бесплодными Общее к-во тыс/мкл лейкоцитов, тыс/мкл Б Э Л М нейтрофилы Ю П С 5,7±0,14 2 6 62 5 1 3 35 5,6±0,17 2 7 60 5 1 2 38 Лейкоцитарная формула, % Из результатов исследований, представленных в табл. 6 видно, что достоверных различий как в содержании общего количества лейкоцитов, так и в лейкоцитарной формуле у коров с нормальным течением послеродового 78 периода, плодотворно осемененных в первую половую охоту после родов и у бесплодных коров достоверно не выявлено. Содержание лейкоцитов и лейкоцитарная формула у подопытных животных соответствует физиологической норме, характерным для крупного рогатого скота. Таблица 7 3.3.3. Фагоцитарная активность нейтрофилов в цервикальной слизи у коров в стадию возбуждения полового цикла (%) п/н Состояние животных 1 2 Фагоцитарная активность (%) 53,4±0,16 Фагоцитарный индекс Коровы с нормальным течением послеродового периода Содержание нейтрофилов (фагоцитов) В цервикальной слизи В крови 54,0±0,09 6,54±0,07 Коровы многократно осемененные, но остающиеся бесплодными В цервикальной слизи В крови 66,8±0,19* 8,06±0,15* 65,6±0,21* 8,67±0,10 6,36±0,02 *Р 0,05 Фагоцитарная активность нейтрофилов (микрофагов) крови или процент фагоцитоза – это отношение лейкоцитов, захвативших тест – микробы к 100 подсчитанным. Фагоцитарный индекс – это среднее число поглощенных бактерий, приходящихся на 1 активный, участвующий в фагоцитозе нейтрофил (из 100 подсчитанных). Как можно видеть из табл. 7, фагоцитарная активность нейтрофилов крови в цервикальной слизи коров с нормальной плодовитостью составляет 53,4±0,16%, тогда как у бесплодных коров данный показатель был в пределах – 66,8±0,19, различия достоверны (Р 0,5). Фагоцитарная активность 79 нейтрофилов крови у коров с нормальной плодовитостью составила – 54,0±0,09%, у бесплодных коров – соответственно – 65,6±0,21%, были различия достоверны (Р 0,05). Результаты исследований, представленные в табл. 7 показывают, что фагоцитарная активность нейтрофилов как в цервикальной слизи, так и в крови у бесплодных коров существенно выше, по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового периода и осемененными в первую половую охоту после родов. Из табл. 7 также видно, что фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс в цервикальной слизи бесплодных коров существенно выше (Р 0,05), чем у коров с нормальным течением послеродового периода. Так, Фагоцитарный индекс в крови у бесплодных коров составил – 8,67±0,10, а у коров нормальной плодовитостью он был в пределах – 6,54±0,07 (Р 0,05). Таким образом, как можно видеть из результатов исследований, представленных в табл. 6, фагоцитарный индекс нейтрофилов крови как в цервикальной слизи, так и в крови у бесплодных коров значительно выше по сравнению с коровами с нормальной плодовитостью. Результаты проведенных исследований, представленные в табл. 7, указывают на высокую «агрессивность» нейтрофилов крови (фагоцитарный индекс) у коров, длительное время остающихся бесплодными, многократное искусственное осеменение которых не приводило к оплодотворению, хотя достоверных различий в содержании общего количества лейкоцитов и лейкоцитарной формуле животных не выявлено. 80 Таблица 8 3.3.4. Содержание Т+0-лимфоцитов в крови коров (тыс/мкл) Сроки исследований До применения иммуномодулятора 2,27±0,26 1,8±0,27 Р 0,05 1,76±0,24 Р 0,05 7-е сут. 2,41±0,14 1,88±1,88 Р 0,05 1,94±0,24 Р 0,05 15-е сут. 2,30±0,21 1,92±0,12 Р 0,05 2,16±0,13 Р 0,05 30-е сут. 2,34±0,23 1,83±0,19 Р 0,05 2,39±0,08 Р 0,05 Первая Группы животных Вторая Р Третья Р Из данных табл. 8 видно, что у бесплодных коров второй опытной группы содержание Т-лимфоцитов было на 21% ниже (Р 0,05), чем у животных контрольной группы, а у животных 3-ей опытной группы данный показатель был на 23% ниже (Р 0,05), чем у животных контрольной группы. На 7-е сутки содержание Т-лимфоцитов в крови коров 2-ой опытной группы было на 22% ниже, а у животных 3-ей опытной группы было на 20% ниже по сравнению с коровами 1-ой контрольной группы (Р 0,05). На 15-е сутки исследований содержание Т-лимфоцитов у животных 2-й группы оставалось на 17% ниже по сравнению с животными 1-ой контрольной группы (Р 0,05). Тогда как у животных 3-ей опытной группы данный показатель был только на 7% ниже, чем у животных 1-ой контрольной группы. Результаты исследований, представленные в табл. 8 показывают, что у животных 3-й опытной группы различия в содержании Тлимфоцитов на 15-е сутки исследований в крови повысились по сравнению с 7-и сутками лечения. На 30-е сутки после начала применения для лечения бесплодных коров иммуномодулятора миелопид различия в содержании Т-лимфоцитов между 81 животными 3-й опытной и 1-й контрольной групп отсутствовали, тогда как различия между животными 2-й опытной и 1-й контрольной групп были высокими в пределах 22% (Р 0,05). Следовательно, осемененных, но использование остающихся для лечения длительное коров время многократно бесплодными, иммуномодулятора миелопид способствовало увеличению содержания Тлимфоцитов до величин, характерных для коров с нормальной плодовитостью. Таблица 9 3.3.5. Содержание Т-хэлперов в крови коров (%) Сроки исследований До применения иммуномодулятора Первая Вторая Группы животных Р Третья 36,4±1,9 39,8±2,7 Р 0,05 39,1±0,2 Р 0,05 7-е сут. 37,0±2,3 40,3±2,7 Р 0,05 36,8±0,4 Р 0,05 15-е сут. 36,6±1,3 39,5±1,6 Р 0,05 37,2±0,8 Р 0,05 30-е сут. 36,9±1,7 40,0±1,8 Р 0,05 36,3±0,9 Р 0,05 Р Из табл. 9 видно, что относительное содержание Т-хэлперов в крови коров с нормальной плодовитостью, осемененных в первую половую охоту после отела не имеет достоверных различии во все периоды исследования (Р 0,05). У коров 2-й опытной группы, которые длительный период оставались бесплодными, относительное содержание Т-хэлперов (помощников) в их крови составляло 39,8±2,7%, что на 9% выше, чем у здоровых коров 1-й контрольной группы (Р 0,05). На 7-е сутки данный 82 показатель был также на 8%, на 15-е сутки на 7% и на 30-е соответственно на 8%, выше по сравнению с животными контрольной группы. У коров 3-й опытной группы содержание Т-хэлперов в крови до применения иммуномодулятора миелопид было значительно выше (на 7%), по сравнению со здоровыми коровами 1-ой контрольной группы, а на 7-е, 15е и 30-е сутки исследований содержание Т-хэлперов в крови коров достигало физиологической нормы и не имело достоверных различий с данным показателем у здоровых животных 1-й контрольной группы (Р 0,05). Таблица 10 3.3.6. Содержание Т-супрессоров в крови коров (%) Сроки исследований До применения иммуномодулятора Первая Вторая Группы животных Р Третья 15,3±1,9 13,2 ±0,6 Р 0,05 12,2±0,9 7-е сут. 14,7±1,5 12,9±0,3 Р 0,05 14,6±0,3 Р 0,05 15-е сут. 14,9±2,1 12,4±0,8 Р 0,05 14,8±0,5 Р 0,05 30-е сут. 15,0±1,7 12,6±0,2 Р 0,05 15,1±0,11 Р 0,05 Р Из результатов исследований, приведенных в табл. 10 видно, что содержание лимфоцитов Т-супрессоров до применения миелопида у животных 2-й и 3-ей опытных групп было достоверно ниже, чем у животных 1-й контрольной группы. На 7-е сутки содержание Т-супрессоров у бесплодных коров 2-й группы было на 14% ниже, на 15-е на 17% и на 30-е сутки на 16% соответственно ниже, чем у здоровых коров 1-й контрольной группы (Р 0,05). У бесплодных коров 3-й опытной группы содержание Тсупрессоров на 7-е сутки после 83 применения миелопида достигло физиологических величин, характерных для здоровых животных 1-й контрольной группы. Таким образом, из данных табл. 10 видно, что относительное содержание лимфоцитов Т-супрессоров у бесплодных коров 2-й и 3-й опытных групп до применения миелопида было существенно ниже, чем у здоровых животных 1-й контрольной группы. Однако, применение миелопида животным 3-й опытной группы способствовало начиная с 7-х суток исследований, повысить содержание лимфоцитов Т-супрессоров до показателей, характерных здоровым животным. Результаты исследований, представленные в табл. 10, убедительно доказывают тот факт, что у бесплодных коров 2-й опытной группы и 3-й опытной группы (до их лечения миелопидом) отмечается значительный дефицит лимфоцитов Т-супрессоров. Вероятно, что данный факт указывает на то, что применение бесплодным коровам иммуномодулятора миелопид способствовало коррекции факторов клеточного звена иммунитета у подопытных животных 3-й опытной относительного группы, что содержания подтверждается Т-хэлперов и некоторым увеличения снижением содержания лимфоцитов Т-супрессоров в крови коров 3-й опытной группы (табл. 10). 84 Таблица 11 3.3.7. Содержание В-лимфоцитов в крови коров (тыс/мкл) Сроки исследований До применения иммуномодулятора Группы животных Вторая Р Третья 0,86±0,23 1,06±0,27 Р 0,05 1,24±0,13 Р 0,05 7-е сут. 0,80±0,23 0,99±0,27 Р 0,05 0,94±0,27 Р 0,05 15-е сут. 0,87±0,19 1,12±0,14 Р 0,05 0,86±0,19 Р 0,05 30-е сут. 0,93±0,26 1,17±0,10 Р 0,05 0,90±0,11 Р 0,05 Первая Р Как видно из табл. 11 содержание В-лимфоцитов в крови у здоровых животных 1-й контрольной группы с нормальным течением послеродового процесса, нормально оплодотворяющихся в первую половую охоту после отела было постоянным в пределах физиологической нормы во все периоды исследований. У бесплодных коров 2-й опытной группы содержание В-лимфоцитов в их крови во все периоды исследований было достоверно выше (Р 0,05), чем у здоровых коров 1-й контрольной группы. У животных 3-й опытной группы до применения миелопида данный показатель был достоверно выше (Р 0,05) по сравнению со здоровыми животными 1-й контрольной группы. Однако, на 7-е, 15-е и 30-е сутки исследований он был таким же, как и у здоровых коров 1-й контрольной группы. Очевидно, эта коррекция гуморального звена иммунитета (В-лимфоциты) была достигнута применением иммуномодулятором миелопид. Данные исследований, представленные в табл. 11 показывают, что у коров длительное время остающихся бесплодными, отмечается достоверно 85 высокое (Р 0,05) содержание В-лимфоцитов в их крови. Это, вероятно объясняет факт высокой концентрации IgG и IgM в цервикальной слизи и крови коров, длительное время остающихся бесплодными. Результаты исследований, представленные в табл. 11 показывают, что применение миелопида в качестве иммуномодулятора способствует коррекции параметров гуморального иммунитета у коров 3-й опытной группы начиная с 15-х суток исследования. Вероятно, что иммуномодулятор миелопид оказывает положительный эффект на титры антиспермальных антител у бесплодных коров 3-й опытной группы. Титры спермиоагглютинирующих антител у коров 3-й опытной группы после их лечения миелопидом составляли 1:16 и менее, коровы данной опытной группы после их искусственного осеменения оплодотворялись, что соответственно устраняло причины их иммунного бесплодия. Таблица 12 3.3.8. Результаты воспроизводства коров Группа Количество Результативное Оплодотворяемость Получено телят осеменение животных животных (гол.) (%) (гол.) после отела (дней) 1-я контрольная 10 32 72 7 2-я опытная 10 103 42 4 3-я опытная 10 44 84 9 Из результатов исследований, представленных в табл. 12 видно, что оплодотворяемость коров 3-й опытной группы наступила в 1-ю половую охоту, на 20-ый день, после завершения их лечения миелопидом и составила 86 84%, от них получено 9 голов телят, тогда как у животных 2-й опытной группы (бесплодные) оплодотворяемость наступила на 103-й день после отела и составила 42%, от них было получены 4 головы телят, а у здоровых коров 1-й контрольной группы оплодотворяемость наступила на 32-й день в 1-ю половую охоту после отела и составила 72%, было получено 7 голов телят. Таким образом, результаты исследований, представленные в табл. 12, показывают, что применение иммуномодулятора миелопида для коррекции иммунной системы у коров (3-я опытная группа) способствовал высокой оплодотворяемости животных (84%) данной группы и получению максимального количества телят (9 гол.). 3.3.9. Определение экономического ущерба от бесплодия коров В каждом хозяйстве необходимо определять ущерб, наносимый бесплодием коров, и экономическую эффективность проводимых мероприятий, особенно лечебных. Многими авторами разработаны специальные формулы для определения экономических потерь при бесплодии коров. Мы считаем, что наиболее рациональной системой учета воспроизводительной функции самок является методика ученых Кубанского ГАУ (Е.В. Ильинского, М.В. Назарова и др.). Для прогнозирования выхода телят на 100 коров вначале вычисляют средний по стаду интервал от отела до оплодотворения за истекший период года по формуле: 87 Вт=(285+Сп) ∙ 100 : 365 + Дв – АМ, где Вт – выход телят; 285 – средняя продолжительность стельности, дн.; Сп – средний интервал между отелом и оплодотворением, дн.; 365 – количество дней в году; 100 – пересчет на 100 коров; Дв – количество двоен и двух отелов в год, %; АМ – аборты, мертвые плоды, %. Экономический ущерб от бесплодия коров, складывающийся из недополучения приплода, молока и утраты племенной ценности животных, определяется по формулам: Ущерб от потерь молока: У1 = Мб ∙ (Во – Вб) ∙ Т ∙ Ц, где Мб – количество бесплодных коров, гол.; Во и Вб – среднесуточный удой на корову, кг; Т – средняя продолжительность бесплодия, дн.; Ц – закупочная цена 1 кг молока базисной жирности, руб. Ущерб от недополучения приплода: У2 = (Кр ∙ Рв – Рф) ∙ Сп, где Кр – коэффициент рождаемости (равен 1,0); Рв – возможный контигент для получения приплода, гол.; 88 Рф – фактическое количество родившихся телят, гол.; Сп – условная стоимость 1 головы приплода, руб. (она приравнивается к себестоимости 3,61 ц молока). Ущерб от утраты племенной ценности животных: У3 = Му ∙ (Цп - Цу), где Му – количество животных, утративших племенную ценность, голов; Цп и Цу – средняя цепь реализации племенных и утративших племенную ценность животных, руб. Суммарный ущерб: У0 = У1 + У2 + У3. После проведения лечебно-профилактических мероприятий в борьбе с бесплодием крупного рогатого скота устанавливают их экономическую эффективность (Элп) по формуле: Элп = Пу – Злп, где Пу – предотвращенный экономический ущерб в результате проведения мероприятий (по разнице убытков до и после их осуществления), руб.; Злп – затраты на проведение лечебно-профилактических мероприятий, руб. Окупаемость этих мероприятий на рубль затрат определяется по формуле: 89 Олп = Пу : Злп. Кроме этих расчетов можно пользоваться и методикой Казанской государственной академии ветеринарной медицины. Она исключает вопросы о племенной ценности, учитывается только недополучение телят и молока. Согласно ее 1 день бесплодия (свыше 30 дней после родов) наносят ущерб, равный 0,003 теленка и 3 – 4 кг молока. Это вполне подходит к рядовым фермам коров. Стоимость теленка принято приравнивать к закупочной цене трех и более центнеров молока. Поэтому, стоимость недополученных телят определяют умножением количества телят на 3 ц молока по действующим закупочным ценам. Этот способ позволяет определить ущерб от бесплодия коров по количеству недополученных телят и недополученного молока в хозяйстве за год. В учебно – опытном хозяйстве МГАВМиБ «Бессоново» в 2010 году было 78 коров и зрелых телок. В течение года от них было получено 47 телят, количество корово-дней за год составило – 78 ∙ 315 = 24570. Следовательно, хозяйство могло получить за год 24570 : 315 = 78 телят, недополучено 78 – 47 = 31 телят. В хозяйстве насчитывалось дней бесплодия 315 ∙ 31 = 9765, из – за чего недополучено 9765 ∙ 3 = 29295 кг молока. В денежном выражении ущерб от бесплодия коров из – за недополучения телят составил (31 теленок ∙ 3,61 тыс.руб. = 111 тыс. руб.) и молока (24570 ∙ 10 руб. = 245700 руб.) Таким образом, суммарный ущерб от бесплодия коров в хозяйстве составил 356700 рублей. Экономическая эффективность при применении миелопида составило 540803 – 4800 = 536003 рубля. Экономический эффект на руб затрат составил 540803 : 4800 = 112 рублей. 90 Таким образом, в учебно-опытном хозяйстве «Бессоново» (табл.1) воспроизводство стада крупного рогатого скота находится на низком уровне. Бесплодие у коров составляло в период с 2007 – 2010 гг. от 101, 2 ±0,19 до 127,8±0,27 дней. Межотельный период у коров в 2010 году был – 413,7±0,13 дней, также весьма длительный период был у коров от 1-го осеменения до оплодотворения – 134,1±0,8 дней, индекс осеменения составлял – 6,1±0,8 спермодоз. Все это указывает на низкую эффективность воспроизводства стада. Результаты проведенных биохимических исследований сыворотки крови указывают на ацидоз и нарушение минерального обмена у коров, что, вероятно, и стало одной из причин низких показателей в воспроизводстве стада. Исследования спермиоагглютининов в цервикальной слизи и в сыворотке крови показывают на наличие высоких их титров у бесплодных коров, которых многократно и безрезультативно осеменяли. Результаты проведенных исследований показывают, что более высокие титры антиспермальных антител были выявлены к спермиям основного быка и более низкие – к спермиям заменяющего быка-производителя. На искусственное осеменение коров с высокими титрами спермиоагглютининов было израсходовано 10 – 12 спермодоз, тогда как у коров с более низкими титрами спермиоагглютининов было израсходовано 4,8 спермодоз. Результаты исследований также показывают, что титры антиспермальных антител значительно выше в сыворотке крови, чем в цервикальной слизи коров. Следует отметить и тот факт, что плодотворное осеменение коров наступало лишь только в том случае, когда титры спермиоагглютининов снижались до 1 : 32 и менее, при более высоких 91 титрах указанных антител коровы значительный период оставались бесплодными. В одну из основных задач наших исследований выходило изучение клеточного и гуморального иммунитета у коров с нормальной плодовитостью и у бесплодных коров и определение главных звеньев иммунитета, которые вызывают бесплодие у животных. Так, нами было установлено, что концентрация иммуноглобулина IgG и IgM в сыворотке крови у бесплодных многократно осемененных коров была значительно выше (в 1,2 раза), чем у коров, оплодотворившихся после 2-х кратного осеменения в первую половую охоту после родов. Результаты исследований также указывают, что концентрация IgG и IgM в цервикальной слизи у бесплодных коров была в 3,2, а IgA в 2,9 раза выше, чем у коров с нормальной плодовитостью. Очевидно, что высокая концентрация IgG и IgM в крови и цервикальной слизи способствует наличию высоких титров спермиоагглютининов в организме бесплодных коров. По всей вероятности, это одна из причин высокой инфертильности бесплодия коров. Нами также было установлено, что фагоцитарная активность и фагоцитарный индекс нейтрофилов крови у инфертильных коров значительно выше по сравнению с коровами, осемененными в первую половую охоту после родов. Таким образом, как поглатительная функция лейкоцитов (процент фагоцитирующих клеток), так и интенсивность фагоцитоза каждым нейтрофилом (фагоцитарный индекс) у инфертильных коров существенно выше, чем у коров с нормальной плодовитостью. Из результатов проведенных нами исследований видно, что достоверных различий в содержании лейкоцитов у коров с нормальной плодовитостью и у бесплодных коров нами не выявлено, тем не менее «агрессивность» лейкоцитов как в крови, так и в цервикальной слизи 92 бесплодных коров была значительно выше, чем у коров с нормальной плодовитостью. Вероятно, что высокая активность нейтрофилов является следующей причиной инфертильности коров. В то же время изучение содержания общего количества лейкоцитов в крови коров показало, что у бесплодных коров 2-й группы их было на 21%, а у коров 3-й опытной группы на 23% ниже, чем у коров 1-й контрольной группы (здоровые животные с нормальной плодовитостью). На 30-е сутки после начала применения миелопида для лечения бесплодия у коров в 3-й опытной группе различия в содержании Тлимфоцитов между животными 3-й опытной и 1-й контрольной группы отсутствовали (Р 0,05), тогда как различия в содержании Т-лимфоцитов между животными 2-й опытной и 1-й контрольной группами оставались достоверно высокими (22%). Таким образом, следующей причиной бесплодия коров является более низкое содержание в их крови Т-лимфоцитов (на 23%), по сравнению с коровами, у которых нормальная плодовитость. При изучении субпопуляций Т-лимфоцитов в крови подопытных коров нами было установлено, что содержание Т-хэлперов (помощников) в крови коров с нормальной плодовитостью, осемененных в первую половую охоту после отела, не имело достоверных различий во все периоды исследований. А у коров 2-й и 3-й опытной групп, которые длительный период оставались бесплодными, относительное содержание Т-хэлперов в их крови было на 9% и 7% выше, соответственно, чем у коров 1-й контрольной группы с нормальной плодовитостью. У коров 3-й опытной группы, которым для лечения бесплодия применяли иммуномодулятор миелопид, содержание Тхэлперов в их крови на 7-е, 15-е и 30-е сутки исследований достоверных различий не имело (Р 0,05). 93 Следовательно, следующей причиной бесплодия у коров является более высокое содержание в их крови лимфоцитов Т-хэлперов. Применение миелопида позволяет провести коррекцию в содержании Т-хэлперов в крови коров, что подтверждено результатами исследований у животных 3-й опытной группы. Результаты исследований о содержании лимфоцитов Т-супрессоров (супресс – угнетать) в крови животных 2-й и 3-й опытных групп было значительно ниже, чем у животных 1-й контрольной группы (Р 0,05). А применение миелопида животным 3-й опытной группы способствовало, начиная с 7-х суток исследований, повышению содержания Т-супрессоров, до величин, характерных здоровым животным 1-й контрольной группы. Низкое содержание лимфоцитов Т-супрессоров в крови бесплодных коров является следующей основной причиной их инфертильности. Изучение содержания В-лимфоцитов в крови подопытных животных показало более высокое их содержание у бесплодных коров 2-й и 3-й опытных групп, по сравнению с животными с нормальной плодовитостью 1й контрольной группы. Однако применение миелопида животным 3-й опытной группы способствовало на 7-е, 15-е и 30-е сутки исследований снизить концентрацию В-лимфоцитов в крови инфертильных коров и довести их содержание до физиологических величин, характерных здоровым животным. Очевидно, что коррекция гуморального звена иммунитета (В-лимфоциты) была достигнута применением иммуномодулятора миелопида. Результаты изучения гуморального звена иммунитета показывают, что у бесплодных коров содержание В-лимфоцитов в их крови значительно выше (Р 0,05) по сравнению со здоровыми коровами с нормальной плодовитостью, что, по всей вероятности также является причиной их 94 бесплодия. Мы предполагаем, что высокие титры антиспермальных антител в цервикальной слизи и крови инфертильных коров объясняются высокой концентрацией В-лимфоцитов и IgG, IgM в их организме. Применение иммуномодулятора миелопида для коррекции иммунной системы у инфертильных коров 3-й опытной группы позволило привести до состояния физиологической нормы параметры их иммунитета. Оплодотворяемость коров данной группы составило 84%, от них было получено 9 голов телят. 95 4. Обсуждение результатов исследований Увеличение производства мяса, молока и другой мясо-молочной продукции в значительной мере зависит от правильной организации воспроизводства стада и интенсивного использования биологических возможностей коров (В.П. Гончаров, В.А. Карпов, 1991). А.Я. Батраков (2003) считает, что бесплодие причиняет животноводству большой ущерб, складывающийся из недополучения приплода, снижения молочной продуктивности, расходов на кормление и содержания бесплодных коров, затрат на их лечение и многократное осеменение и раннее их выбытие из стада. По сути дела бесплодие существенно снижает продуктивное долголетие коров. В связи с этим основной задачей по воспроизводству крупного рогатого скота является ежегодное получение от каждой коровы и половозрелой телки по одному теленку. В.И. Трухачев, В.Я. Никитин, В.В. Марченко и др. (2008) отмечают, что согласно учению А.П. Студенцова бесплодной следует считать самку, не оплодотворившуюся в физиологически оптимальные сроки (корову в течение одного месяца после отела, а телку в течение месяца после достижения возраста физиологической зрелости – 16 – 18 месяцев). Убытки, наносимые бесплодием, нередко превышают потери, обусловленные заразными и незаразными болезнями животных. В каждом животноводческом хозяйстве кроме бесплодия у коров и телок необходимо учитывать яловость. Яловой коровой следует считать ту, которая не дала теленка в течение хозяйственного года. Яловость животных – это экономическое понятие. Оно обуславливается бесплодием и определяется в конце года, а бесплодие как 96 биологическое явление, должно учитываться на каждый текущий день (А.П. Студенцов, В.С. Шипилов, В.Я. Никитин и др., 2005). Результаты, полученные в процессе наших исследований, согласуются с утверждениями вышеуказанных авторов о высоких убытках в животноводстве, которые приносит бесплодие коров. Так межотельный период коров в учебно – опытном хозяйстве «Бессоново» в 2007 году был – 371,6±0,6 дней, в 2008 – 394,2 дней, в 2009 – 398,1±0,31 дней и в 2010 году соответственно – 413,7±0,13 дней. Дни бесплодия коров составили от 101,2±0,19 дней до 127,8±0,27 дней. Достаточно высоким был индекс осеменения коров. В 2010 году он составил – 6,1±0,8 спермодоз. Экономический ущерб от бесплодия коров только в 2010 году составил 356700 рублей. Как мы предполагали, одной из причин бесплодия коров в данном хозяйстве являются нарушения в кормлении животных, что приводило к нарушению обмена веществ и ацидозу у животных, что было нами подтверждено биохимическими исследованиями сыворотки крови подопытных коров. В.В. Храмцов, Т.Е. Григорьева, В.Я. Никитин и др., 2007, считают, что чем выше уровень процессов размножения, тем больше приплода, а, следовательно, мяса и молока. Поэтому профилактика бесплодия коров остается одной из самых насущных проблем в животноводстве. А.П. Студенцов (1949) предложил классификацию бесплодия, согласно которой с учетом последствий неблагоприятного влияния групп сходных по направленности действия причин, выделяются семь форм: врожденное, старческое, алиментарное, эксплуатационное, климатическое, симптоматическое и искусственное. Е.С. Воронин, А.М Петров, М.М. Серых и др., 2002, указывают, что среди основных причин бесплодия, которые описал А.П. Студенцов, необходимо учитывать роль и значение иммунных факторов, возникающих 97 при поступлении спермы в половые органы самок, которые могут стать причиной бесплодия животных. Возникают вопросы: почему при встрече нормальных (морфологически, физиологически, биохимически) спермий и яйцеклетки не всегда даже внутри одного вида происходит полноценное оплодотворение и почему для оплодотворения одной или нескольких яйцеклеток в половые пути самки должно поступить огромное количество спермий. Кроме того, в связи с тем, что взаимодействие половых клеток происходит по принципу связи антигена с антителом, целесообразно предварительно рассмотреть вопрос об отношении половых клеток с иммунной системой того организма, в котором они образуются. Известно, что антигены, появляющиеся в организме в эмбриональный период, в постэмбриональный период воспринимаются иммунной системой данного организма как «свои», а появляющиеся после рождения – как «чужие» и подлежат отторжению. В связи с этим половые клетки, развитие и дифференцировка которых происходит лишь с наступлением полового созревания, являются для иммунной системы даже своего организма «чужими». (13,24,162,180,199). Для предотвращения элиминации половых клеток в организме животных имеются барьеры, препятствующие взаимодействию клеток иммунной системы с аутоантигенами половых клеток. В мозговых канальцах семенников таким барьером является многоклеточный комплекс из слоя сократительных миоидных клеток, базальной мембраны, клеток зародышевого эпителия. Барьерной функцией обладает и акросомная оболочка спермий. В яичниках яйцеклетки защищены фолликулярным эпителием и содержимым фолликулов, а в половых путях яйцеклетка и оплодотворенное яйцо первично защищены прозрачной непроницаемой для клеток и растворенных макромолекул. 98 оболочкой, Однако существует предположение, что просачивание какого-то небольшого количества спермальных антител через гематотестикулярный барьер необходимо и имеет физиологическое значение. Аутоиммунные реакции формируются только тогда, когда имеет место расстройство иммунорегуляторных механизмов или их генетическое ослабление, а также при механических нарушениях гематотестикулярного барьера (хирургическое вмешательство, случайная травма), проникновении инфекции в семенники, простату и другие добавочные железы. Поэтому для нормального функционирования половых желез, а следовательно, и для процессов воспроизводства потомства необходимо сохранение целостности иммунологических барьеров. При их нарушении могут развиться аутоиммунные реакции, ведущие к нарушению репродуктивной функции, вплоть до бесплодия. (1,7,15,23,58,71,74,80,150). Объем спермы и концентрация в ней спермий у различных видов различна. Непарнокопытные, всеядные, плотоядные, грызуны выделяют сперму (продукт жизнедеятельности всего полового аппарата самца) в относительно большом объеме, но с низкой концентрацией спермий (обычно 0,1 – 0,2 млрд в 1 мл). У жвачных животных сперма выделяется в небольшом объеме, но с большой концентрацией спермий (0,1 – 0,2 млрд в 1 мл) (В.К. Милованов, 1962). Объем одного эякулята (объем спермы при одном акте семявыделения) составляет в среднем: у жеребца – 50 – 100 мл, у хряка – 250, у собаки – 10, у быка – 4 – 5, у барана – 1 – 2, у кролика – 0,5. Общее количество спермий в эякуляте: у жеребца – 4 – 20 млрд, у хряка – 20 – 80, у кролика – 0,1 – 0,2. Максимальные показатели объема эякулята (до 1200 мл) и количества спермий в нем (до 120 млрд) отмечены у хряков. (48,77,79,187). Исходя из того, что при оплодотворении с яйцеклеткой сливается один (или два) спермия, во всяком случае, «для оплодотворения требуется незначительное количество семени» (Спаланцани, 1780); в начале ХХ в. 99 господствовала теория о «расточительности» природы, производящей гаметы якобы в ненужном избытке. Однако широкое распространение метода искусственного осеменения (оплодотворения) животных, основоположником которого является русский биолог Илья Иванович Иванов, показало, что для каждого вида животных имеется минимальный объем спермы и минимальное количество спермий в ней, необходимых для эффективного оплодотворения животных. Оптимальное оплодотворяющей разбавление способности) для спермы (без большинства потери видов ее животных составляет 2 – 4 раза. Таким образом, для эффективного оплодотворения в половые пути самки необходимо одновременное поступление сотен миллионов спермий. Как же объяснить необходимость такого огромного количества спермий для оплодотворения одной яйцеклетки (или нескольких – у многоплодных животных)? Для искусственного осеменения подопытных коров ректоцервикальным способом в половые пути мы вводили с помощью шприца – катетера по 12,5 млн, спермий двукратно с интервалом 12 часов. В настоящее время развивается представление о неравнозначности спермий по фертильным свойствам и антигенной характеристике (В.И. Говалло, 1983, 1987). Одни из спермий обладают фертильностью, другие не обладают. Спермии содержат только им присущие антигены (аутоантигены) и антигены, общие с другими клетками, в частности с мозгом, антигенами групп крови, тканевой совместимости (аллоантигены), и антигены, одинаковые у представителей разных видов (ксеноантигены). Фертильные спермии при созревании в придатке семенника приобретают оболочечный антиген, сходный с антигенами цервикальной слизи, внутриматочной среды и клеток женского полового тракта («антигенная мимикрия» спермий). Этот антиген наглухо покрывает (как бы одевает) весь спермий, тем самым маскируя от иммунной системы самки 100 находящиеся под оболочкой спермия специфические антигены и способствуя беспрепятственному продвижению фертильных спермий в половых путях самки. (103,110,121). У самок генитальный тракт, особенно матка, обильно насыщен иммунокомпетентными клетками, способными распознавать чужеродный генетический материал (Т-лимфоциты), фагоцитировать его (макрофаги) и локально продуцировать антитела (В-лимфоциты). Скопление лимфоидных тканей репродуктивного тракта самок животных подобно пейеровым бляшкам кишечника или лимфоидным скоплениям в бронхах. Локальный иммунитет (продукция антител) может воспроизводиться непосредственным контактом слизистой оболочки с антигеном и быть относительно независимым от общего гуморального ответа, что свидетельствует о наличии локальной защитной системы (первичного барьера), препятствующего проникновению антигенов из внешней среды в организм. Ксеногенные спермии, искусственно введенные в половые пути самки, практически полностью погибают в репродуктивном тракте, не достигая яйцевода. При участии Т-лимфоцитов, антител и макрофагов значительная часть спермий погибает в половых путях самки за счет их фагоцитоза, что полностью подтверждено показателями фагоцитарной активности нейтрофилов крови. Так, у бесплодных многократно осемененных коров, остающихся длительный период бесплодными, фагоцитарная активность нейтрофилов как в крови, так и в цервикальной слизи были достоверно выше (Р 0,05) по сравнению с коровами с нормальной плодовитостью, плодотворное осеменение которых наступило в первую половую охоту после родов. Макрофаги с фагоцитированными спермиями поступают в лимфатические узлы, дренирующие матку, вызывая значительное их увеличение, с последующей сенсибилизацией матки и всего организма, 101 иммунная система которого реагирует на спермальные антигены изменением соотношения Т- и В-лимфоцитов. Ряд исследователей отмечает снижение общего количества Тлимфоцитов в крови, в среднем на 15% у инфертильных женщин по сравнению с фертильными женщинами (Mathur S. et al ., 1980). Результаты наших исследований полностью согласуются с данными, которые были получены вышеназванными исследованиями. Так, у бесплодных (инфертильных) коров 2-й опытной группы содержание Т-лимфоцитов было на 21% ниже, а у коров 3-й опытной группы на 23% ниже, чем у коров 1-й контрольной группы, которые были результативно осеменены в первую половую охоту после отела. На 30-е сутки после начала иммуномодулятором применения миелопид для лечения произошла бесплодных коррекция коров Т-клеточного иммунитета и содержание Т-лимфоцитов у бесплодных коров достигло физиологических параметров, характерных для здоровых животных. Иммунологический контроль, анализ причин бесплодия животных требовали создания относительно простой лабораторной техники обнаружения противоспермальных антител. Ранний период изучения антиспермального иммунитета был отмечен интересом к спермиоагглютинирующим антителам, которые обнаруживались в крови подавляющего большинства женщин, страдающим бесплодием неясной этиологии. Внедрение более специфических методов обнаружения спермиоантител (Isojima S., 1983), (Jeffery W., Parish W., 1972) способствовало появлению большого числа работ по выяснению участия циркулирующих в крови и местных антител в мужской и женской инфертильности. Было показано, что оба вида антител относятся к классам IgM и IgG. Поскольку эти антитела действуют вместе, спермии сначала теряют подвижность, а затем погибают (Helema H. et al., 1979). Тесты 102 спермиоагглютинации цервикальной слизи наилучшим образом отражают наличие и прогноз нарушений фертильности и результат проведенного лечения (Menge A., 1980; Hjort T., Hansen K.,1983). Для изучения природы антител к спермиям применяют метод непрямой иммунофлюоресценции, в котором используют меченную изотиоционатом анти- IgG-сыворотку и иммунопероксидазный тест. Последние особо важны при анализе антигенов с помощью высокоспецифичных моноклональных антител к разным участкам спермий (Isojima S. et al., 1982; Lee C. et al., 1983). В наших исследованиях было установлено, что концентрация IgG в 1,26 раза, а IgМ в 1,2 раза была выше в сыворотке крови бесплодных коров по сравнению с коровами с нормальным течением послеродового процесса и оплодотворяющихся в 1-ую половую охоту после отела, что вполне согласуется с данными вышеуказанных исследователей. По мнению Г.Т. Сухих, Л.В. Ванько, В.И. Кулакова (1997). Эти антитела в иммунофлюоресценции взаимодействовали преимущественно с акросомальной областью спермий, но некоторые из них фиксировались на лактатдегидрогеназе спермиями срединном – С4). млекопитающих. участке Антитела При спермий мышей вазэткомии (антитела к взаимодействовали со в клинике антитела, вызывающие склеивание головок и подавляющие движение спермий, встречались особенно часто у молодых животных, склонных к аутоиммунным процессам. При титровании антиспермальных сывороток было показано, что антитела в титрах до 1 : 32 не препятствуют фертильности, но в более высокой концентрации антитела могут стать причиной бесплодия. Подавляющее большинство иммунных сывороток с титрами антител выше 1 : 32 содержало IgG, четверть из них – IgМ и лишь в отдельных сыворотках присутствовали IgА (Zanchetta R., Busolo F., 1983). 103 Циркулирующие антитела могут стать причиной азооспермии и олигоспермии (Girgis M. et al., 1979; Rabin B. et al., 1977). С помощью непрямой иммунофлюоресценции показано, что в семенниках бесплодных животных, как и в яичниках инфертильных производителей откладываются аутоиммунные комплексы, включающие IgМ, G, А и комплемент – С3 и С4. Эти комплексы обнаруживались на стенках извитых канальцев, в цитоплазме зародышевого эпителия, на сперматидах и спермиях (Donat H., Morenz J., 1983). Вопрос о том, могут ли противоспермальные антитела взаимодействовать с другими аллогенными клетками, не до конца ясен. Титры антиспермальных антител, установленные исследованиях совпадают с данными, полученными в наших у вышеуказанных исследователей. Так, в наших исследованиях было установлено, что титры спермиоагглютининов у многократно осемененных коров и остающихся длительный период бесплодными, в цервикальной слизи составляли от 1 : 128, то у коров результативно осемененных в 1-ую половую охоту с нормальным течением послеродового процесса были не выше 1 : 16, т.е. значительно ниже. Титры спермиоагглютининов в сыворотке крови коров многократно осеменяемых спермой основного быка были у 2-х коров 1 : 64, у 6-и коров 1 : 128 и у 2-х коров 1 : 256, то аналогичные показатели титров спермиоагглютининов в сыворотке крови коров с нормальным течением послеродового периода были не выше, чем 1 : 16. Количество осеменений многократно осеменяемых коров с высокими титрами антител к спермиям основного быка в цервикальной слизи составило до 12, тогда как у коров с нормальным течением послеродового периода количество осеменений составило всего 2. 104 Попытки связать иммунную регуляцию фертильности с выработкой в организме самок антител к спермиям предпринимались давно, но окончательной ясности в этом вопросе нет до сих пор. У коров генитальный тракт, особенно матка, обильно насыщена иммунокомпетентными клетками, которые способны распознавать чужеродный антигенный материал (Тлимфоциты), фагоцитировать его (макрофаги) и локально продуцировать антитела (В-лимфоциты). Включению этого иммунологического аппарата могут способствовать следующие факторы: 1) огромное количество биологически излишней спермы, поступающей во влагалище (лишь небольшое количество из поступивших спермий способно достичь яйцепроводов, остальные не имеют необходимого антигенного (SCA) прикрытия; 2) сперма стимулирует репродуктивный тракт самки, который осуществляет процесс иммунологической селекции спермий (Austin C., 1976); 3) уже в матке большое число спермий оказывается разрушено внеклеточными ферментами (Katsh S. et al., 1968), что способствует массовому поступлению растворимых и фагоцитированных антигенов мужских гамет в дренирующие матку лимфатические узлы. Результаты наших исследований подтверждают данные рассуждения перечисленных исследователей о локальной продукции антиспермальных антител В-лимфоцитами непосредственно в матке. Так, у бесплодных коров 2-й опытной группы содержание Влимфоцитов в их крови во все периоды исследований было достоверно выше, чем у здоровых коров 1-й контрольной группы. У животных 3-й опытной группы до применения миелопида данный показатель был также достоверно выше по сравнению со здоровыми животными 1-й контрольной группы. Однако, на 7-е, 15-е и 30-е сутки исследований он был таким же, как и у здоровых коров 1-й контрольной группы. Очевидно, эта коррекция 105 гуморального звена иммунитета (В-лимфоциты) была достигнута применением иммуномодулятором миелопид. Данные исследований показывают, что у коров, длительное время остающихся бесплодными, отмечается высокое содержание В-лимфоцитов в их крови. Это, вероятно, объясняет факт высокой концентрации IgG и IgM в цервикальной слизи и крови коров, длительное время остающихся бесплодными. Очевидно, что такая сложная в антигеном отношении среда, как сперма, вызывает в репродуктивном тракте у самок целую гамму иммунорегуляторных процессов, в которых иммуностимуляция сочетается с иммуносупрессией. Последняя определяется как прямым гуморальным эффектом (простагландины, антигены семенной плазмы и спермий), так и ответной клеточной реакцией женского организма (лимфоциты-супрессоры), предотвращающей избыточный иммунный ответ к мужским гаметам и восстанавливающей к ним исходную реактивность в случаях, когда беременность не наступила. Возможно, что именно дефицитом лимфоцитовсупрессоров, важного звена иммунорегуляции, и объясняются многие случаи бесплодия (В.И. Говаль, 1987; Г.Т. сухих и др., 1997). Аналогичные результаты были получены нами в процессе экспериментальных исследований. Так, из результатов исследований видно, что содержание лимфоцитов Тсупрессоров у бесплодных было достоверно ниже, чем у здоровых коров 1-й контрольной группы. На 7-е сутки содержания Т-супрессоров у бесплодных коров 2-й группы было на 14% ниже, на 15-е на 17% и на 30-е сутки на 16% соответственно ниже, чем у здоровых коров 1-й контрольной группы. У бесплодных коров 3-й опытной группы содержание Т-супрессоров на 7-е сутки после применения миелопида достигло физиологических величин, характерных для здоровых животных 1-й контрольной группы. 106 Результаты наших исследований показывают, что у бесплодных коров 3й опытной группы (до их лечения миелопидом) отмечается значительный дефицит в их крови лимфоцитов Т-супрессоров, при повышенном содержании Т-хэлперов (на 70%). Применение бесплодным коровам иммуномодулятора миелопид способствовало коррекции факторов клеточного звена иммунитета. Тем самым способствовало увеличению содержания Т-супрессоров в крови и устранению одной из основных причин иммунного бесплодия коров. 107 5. Выводы 1. В учебно-опытном хозяйстве «Бессоново» воспроизводство стада находится на низком уровне. Основной причиной является бесплодие коров. В период с 2007 по 2010 г. бесплодие коров составляло до 127,8±0,27 дней, межотельный период у коров в 2010 году был – 413,7±0,13 дней, период от 1го осеменения до оплодотворения – 134,1±0,8 дней, индекс осеменения 6,1±0,8 спермодоз. Экономический ущерб от бесплодия коров составил в 2010 году 356,7 тыс. руб. 2. Установлены высокие титры спермиоагглютининов как в сыворотке крови (до 1 : 128), так и в цервикальной слизи (до 1 : 128) к спермиям основного быка у бесплодных коров, так и к спермиям заменяющего быка, 1 : 128 и 1 : 64 – соответственно. Однако, титры антиспермальных антител к спермиям заменяющего быка-производителя были менее высокими, чем к спермиям основного быка-производителя. 3. У инфертильных (бесплодных) коров содержание Т-лимфоцитов в крови было на 23%, Т-хэлперов на 9% и Т-супрессоров на 21% ниже, по сравнению со здоровыми коровами с нормальной плодовитостью. 4. У бесплодных коров содержание IgG и IgM в сыворотке крови было в 1,2 раза выше, чем у здоровых коров с нормальной плодовитостью. Вероятно, это можно объяснить более высоким содержанием В-лимфоцитов (на 44%) в крови бесплодных коров. 5. Фагоцитарная активность нейтрофилов в цервикальной слизи у инфертильных коров в стадию возбуждения полового цикла была на 25%, а в крови на 21%, фагоцитарный индекс у бесплодных коров был – 26% и 32% соответственно, выше, чем у здоровых коров с нормальной плодовитостью. Это указывает нейтрофилов (% на более фагоцитоза) высокую и их 108 поглатительную «агрессивность» функцию (фагоцитарная активность), по отношению к спермиям в гениталиях коров, что, вероятно, и является одной из причин их инфертильности. 6. Установлено влияние иммунных факторов на бесплодие коров. Оплодотворение коров может наступить только в том случае, если титры спермиоагглютининов как в крови, так и в цервикальной слизи коров не выше 1 : 16. Более результативное оплодотворение коров наступает при использовании спермы заменяющих быков-производителей, по сравнению с использованием спермы основных быков производителей. У инфертильных коров выявлен значительный дефицит Т-лимфоцитов и их субпопуляций – Т-хэлперов и Т-супрессоров. Это свидетельствует об иммунодефиците клеточного звена иммунитета. Также установлено более высокое содержание в крови и в цервикальной слизи у инфертильных коров В-лимфоцитов, IgG, IgM, IgA и показателей фагоцитоза нейтрофилов крови. 7. Для устранения причин бесплодия коров необходима коррекция их иммунной системы с использованием иммуномодулирующей терапии, которая в совокупности с условиями полноценного кормления и содержания животных позволят восстановить репродуктивные функции коров и повысить их продуктивное долголетие. 109 6. Практическое использование полученных научных результатов 1. Для профилактики бесплодия коров в учебно-опытном хозяйстве «Бессоново» необходимо ежеквартально проводить акушерско- гинекологическую диспансеризацию крупного рогатого скота. При этом необходимо учитывать: молочную продуктивность, количество полученных телят, межотельный период, дни бесплодия, индекс осеменения и период от осеменения до оплодотворения коров. 2. Для анализа полноценности обменных процессов в организме животных постоянно изучать рационы кормления животных, их структурный состав. Не мене 2-х раз в год – в период летнего лагерного содержания и в период зимнего стойлового содержания коров и телок случного возраста изучать биохимические и морфологические показатели их крови. При этом необходимо обращать внимание на содержание каротина, кальция, фосфора, общего белка и резервной щелочности в их крови. 3. При анализе бесплодия у коров необходимо изучать содержание в крови и цервикальной слизи IgG и IgM, титры спермиоагглютининов, содержание Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, Т-хэлперов, Т-супрессоров и нейтрофилов. У бесплодных коров отмечается некоторая активизация параметров гуморального звена иммунитета (В-лимфоциты, IgG, IgM), что вызывает их инфертильность. 4. Для устранения иммунных факторов, вызывающих бесплодие коров, необходимо проводить коррекцию клеточного и гуморального иммунитета у животных с использованием иммуномодулятора миелопид. Для повышения оплодотворяемости коров предпочтительнее использовать сперму «заменяющих» быков-производителей, а не основных, «закрепленных» в данном хозяйстве, так как более высокие титры 110 спермиоагглютининов возникают к спермиям быков производителей, длительное время используемых в хозяйстве. 111 7. Рекомендации по использованию научных выводов 1. При анализе бесплодия коров, которых многократно и безрезультативно осеменяли, следует учитывать условия их кормления, содержания, качество спермы быков-производителей, которую используют для искусственного осеменения коров. 2. Результаты проведенных исследований показывают, что основной причиной иммунного бесплодия коров являются высокие титры антиспермальных антител в их крови, а также состояние иммунодефицита клеточного звена иммунитета, особенно дефицит лимфоцитов Т-супрессоров и Т-хэлперов. 3. У инфертильных коров отмечается активизация фагоцитарной активности нейтрофилов крови, повышение концентрации В-лимфоцитов, IgG и IgM, что, вероятно, и является основной причиной их бесплодия при существенном дефиците основных параметров клеточного звена иммунитета. 4. коррекции Использование иммунной иммуномодулятора системы у миелопид бесплодных коров, способствует повышает их оплодотворяемость, выход телят, сокращает межотельный период и соответственно дни бесплодия у животных. 112 8. Библиографический список 1. Акатов В.А. Гинекологическая диспансеризация крупного рогатого скота в колхозах и совхозах. – Воронеж, 1973. –112 с. 2. Акушерство, гинекологии и биотехника размножения животных: учебно-метод. пособие для студентов IV курса по специальности 110502 – «Ветеринария» / сост.: А.М. Семиволос, В.С. Авдеенко, А.М. Петров; ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ». – Саратов, 2009. –92 с. 3. Аманов К. Причины возникновения и лечения эндометрита у коров в условиях молочного комплекса / А. Хангельжиев, К. Червонов // Итоги деятельности Туркменского НИИ животноводства и ветеринарии за 50 лет. – Ашхабад, 1980. – С. 122 – 125. 4. Аминов С.А. применение антибиотиков при эндометрите коров / Э. Мухтаров, А.А. Камалов, Ф. Х. Маджидов // Тр. Всесоюз. НИИ незаразных болезней. – Воронеж, 1991. - №4. – С. 44 – 45. 5. Афанасьев И.Н. Микрофлора матки и патологические изменения в эндометрии при бессимптомном бесплодии коров // Матер. межвуз. науч. – метод. конф. по акушерству, гинекологии, искусственному осеменению и патологии молочной железы с.-х. животных. – Ереван, 1971. – С. 16 – 17. 6. Ахмадеев А.Н. Повышение эффективности воспроизводства сельскохозяйственных животных / О.Н. Преображенский. – Казань, 1979. – С. 68. 7. Батраков А.Я. Акушерские и гинекологические болезни коров // Санкт-Петербург, «Петролазер»,2003 — 240 с. 8. Бегма А. Сокращение продолжительности сервис-периода у коров на молочных комплексах // Науч. – производ. конф. по созданию стад животных, пригодных к промышленной технологии животноводческой продукции. – Киев, 1978. – С. 5 – 6. 113 производства 9. Безбородин В.В. Бактериальная контаминация матки коров и ее влияние на воспроизводительную функцию после родов: Автореф. дис. … канд. вет. наук. – М., 1982. –26 с. 10. Белкин Б.Л. Характеристика условно-патогенной микрофлоры родовых путей у здоровых и больных коров / Б.Л. Бигманов, Х.Л. Юсупов // Совершенствование мер борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных в Таджикистане. – Душанбе, 1988. – С. 24 – 33. 11. Белобороденко А.М., Белобороденко М.А., Белобороденко Т.А. Руководство по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных / ТГСХА.- Тюмень, 2007.- 580с. 12. Беляков С.П. Гонадотропные и ваготропные в повышении воспроизводительной способности самок крупного рогатого скота в условиях Узбекистана: Автореф. дис. … д-ра вет. наук. – М., 1972. –51 с. 13. Бернатонис А. Исследование некоторых причин бесплодия высокопродуктивных коров / А. Маркявичютс, Ю. Шештакаускас, Т. Шакис // Гинекологические заболевания и яловость с.-х. животных / Управление науч. – техн. информ. – Рига, 1974. – С. 17 – 18. 14. Бесхлебнов А.В. Значение гинекологических заболеваний в происхождении яловости у крупного рогатого скота // Незаразные болезни сельскохозяйственных животных. – М.: Сельхозиздат, 1953. – С. 242 – 246. 15. Бесхлебнов А.В. Причины и пути ликвидации яловости // Сельскохозяйственное производство Нечерноземной зоны. – 1967. - №4 – С. 29 – 31. 16. Бондарчук П.М. динамика основных иммунологических параметров у коров при послеродовом эндометрите и возможность их коррекции: Автореф. дис. … канд. вет. наук. – М., 2003. –19 с. 17. Бочаров И.А. Основные способы терапии и профилактики бесплодия и яловости. – Л., 1967. – 42 с. 114 18. Бочаров И.А. Терапия при задержании последа у коров / А.И. Поспелов, С.И. Попов // Сб. работ Ленинградского вет. ин-та. – 1962. – Вып. 24. – С. 199 – 203. 19. Валеев Г.З. Из практики акушерства // Ветеринария. – 1980. - №7. – С. 44. 20. Валюшкин К.Д. Тривитамин стельным и яловым коровам // Матер. межвуз. науч. – метод. конф. по акушерству, гинекологии, искусственному осеменению и патологии молочной железы с.-х. животных. – Ереван, 1971. – С. 32 – 33. 21. Варганов А.И. Новый лечебно-профилактический препарат биосан СВ // Тез. докл. VII Всерос. науч. и учеб. – метод. конф. по акушерству, гинекологии и биотехники размножения животных. – Воронеж, 1994. – С. 36 – 37. 22. Варганов А.И. Санация половых органов коров-родильниц ихтиоловой мазью и эмульсией синтомицина / К. Опекунов, Н. Кунгурцева // Животноводство. – 1980. - №7. – С. 37 – 38. 23. Власов С.А. Фетоплацентарная недостаточность у коров: Автореф. дис. … д-ра вет. наук. – М., 2000. – 45 с. 24. Волосков П.А. Наука о физиологии и патологии размножения с.-х. животных к юбилею Октября / Н.Н. Михайлов // Ветеринария, 1967. - №10. – С. 77 – 80. 25. Воробьев Н.Н. Оплодотворяемость и показатели крови у коров с гипофункцией яичников // Ветеринария. – 1980. - №10. – С. 43 – 44. 26. Воронин В.В. Лечение коров при эндометрите // Ветеринария. – 1977. - №7. – С. 71 – 73. 27. Воронин В.В. Причины бесплодия коров в условиях молочных комплексов / З.Я.Косорукова, А.С. Гуров // Ветеринария. – 1980. - №9. – С. 48 – 49. 115 28. Воронин Е.С. Иммунология / А.М. Петров, М.М. Серых, Д.А. Девришов. – М.: Колос-Пресс. –405 с. 29. Глаз А.В. разработка и использование пролонгированных гормональных препаратов для стимуляции воспроизводительной функции у коров: Автореф. дис. … д-ра. вет. наук. – Витебск, 2001. – 39 с. 30. Говалло В.И. Иммунология репродукции. – М.: Медицина, 1987. – 304 с. 31. Голяркин Ф.Е. Использование витаминов А и Д для снижения бесплодия коров / И.В. Жуков // Информ. лист. – 1976. – 4 с. 32. Гончаров В.П. Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных / Д.А. Черепахин. – М.: Колос, 2004. –328 с. 33. Гончаров В.П. Гормональная стимуляция воспроизводительной функции и профилактика симптоматического бесплодия у коров и кобыл: Автореф. дис. … д-ра. вет. наук. – М., 1998. –46 с. 34. Гончаров В.П. Профилактика и лечение гинекологических заболеваний коров / В.А. Карпов. – М.: Россельхозиздат, 1981. –190 с. 35. Горев Э.Л. Теория и практика применения препаратов гормонального воздействия коровам в раннем после родовом периоде с целью профилактики бесплодия и повышения выхода телят / А.Н. Нятбеков, М.К. Волкова // Ветеринарная фармация для промышленного животноводства. – Рига, 1979. – С. 92 – 95. 36. Грига Э.Н. Послеродовая патология коров (этиология, диагностика, терапия и профилактика): Автореф. дис. … д-ра. вет. наук. – Ставрополь, 2003. –50 с. 37. Денисенко В.Н. Иммунодефицитные состояния и особенности иммунокоррекции организма телят. Дис. в виде науч. докл. на соиск. уч. степ. д-ра. вет. наук.- Москва 1999. – С 50. 116 38. Дюльгер Г.П. Кистозная патология яичников у коров и совершенствование методов ее дифференциальной диагностики и терапии. Автор. дис. на соиск. уч. степени докт. вет. наук. – Санкт-Петербург, 2008. 40 с. 39. Емельяненко П.А. Методические указания по тестированию естественной резистентности телят. // Ветеринария .- 1979 .- №1.- С. 33-35. 40. Жерлицын А. Опыт профилактики бесплодия коров / А. Радченко, Н. Никишев // Ветеринария. – 1972. - №7. – С. 98 – 100. 41. Завертяев Б.П. Селекция коров на плодовитость. – Л.: Колос, 1979. 208 с. 42. Захаров П.Г. Оценка состояния воспроизводства крупного рогатого скота в хозяйствах Ленинградской области // Сб. работ. Ленинградского вет. ин-та. – Л., Вып. 31. – С. 119 – 126. 43. Зазаров П.Г. Рекомендации по повышению оплодотворяемости коров и телок. – СПб., 2000. –25 с. 44. Заянчковский И.Ф. Задержание последа и послеродовые заболевания у коров. – М.: Колос, 1964. –384 с. 45. Заянчковский И.Ф. Профилактика и лечение акушерско- гинекологических заболеваний у коров. – Уфа, 1982. –232 с. 46. Зверева Г.В. Гинекологические болезни коров / С.П. Хомин. – Киев: Урожай, 1976. –151 с. 47. Зверева Г.В. Еще раз о профилактике бесплодия коров // Ветеринария. – 1974. - №5. – С. 73 – 76. 48. Зверева Г.В. Теория и практика воспроизводства крупного рогатого скота в условиях интенсивного животноводства // Воспроизводство и профилактика бесплодия с.-х. животных: Науч. тр. ВАСХНИЛ. – М., 1976. – С. 22 – 26. 117 49. Зверева Г.В. Тканевое дыхание плацент, слизистой оболочки матки и активность каталазы и пероксидазы крови коров при частичном и полном задержании последа / В.И. Юров // Науч. тр. Украинской СХА. – Львов, 1973. – Вып. 92, т.2 . – С. 19 – 22. 50. Ильина А.И. Влияние свойств цервикальной слизи на спермиев в канале шейки матки и на оплодотворяемость коров // Сб. работ Ленинградского вет. ин-та. – Л., 1967. – Вып. 28. – С. 287 – 294. 51. Ильинский Е.В. Изучение микрофлоры матки у коров при эндометритах и ее чувствительность к антибиотикам в условиях Кубани / Р.В. Казеев // Матер. межвуз. науч. –метод. конф. по акушерству, гинекологии, искусственному осеменению и патологии молочной железы с.х. животных. – Ереван, 1971. – С. 85 – 86. 52. Ильинский Е.В. К характеристики бесплодия на почве неспецифических воспалительных процессов репродуктивных органов // Науч. тр. Краснодарской науч. – исслед. вет. станции. – Краснодар, 1972. – Т. 5. – С. 150 – 156. 53. Ильинский Е.В. О некоторых последствиях лекарственной терапии, используемой в акушерско-гинекологической практике // Тез. докл. конф. – Рига, 1977. – С. 68 – 70. 54. Ильинский Е.В. патогенетическая терапия при бесплодии коров на почве неспецифических воспалительных процессов гениталиев: Автореф. дис. … д-ра вет. наук. – Харьков, 1968. – 43 с. 55. Ильинский Е.В. Физиология размножения и предупреждения бесплодия крупного рогатого скота. – Краснодар, 1972. – 224 с. 56. Инструкция по искусственному осеменению коров и телок. – Изд. 3е, дополн. – М.: Колос, 1982. – 77 с. 57. Исаханян С.Ш. Применение антибиотиков при послеродовых эндометритов у коров // Матер. межвуз. науч. –метод. конф. по акушерству, 118 гинекологии, искусственному осеменению и патологии молочной железы с.х. животных. – Ереван, 1971. – С. 88 – 89. 58. Карпуть И.М. Иммунологические аспекты бесплодия у животных / Ф.Д. Гудков, К.Д. Валюшкин, В.М. Холод // Матер. VI Всесоюз. конф. по патологической анатомии животных. – М., 1977. – Т.1. –С. 138 – 141. 59. Катеринов Ю. Един лабораторин метод за рано диагностика на беременностина у кравите по маточно-вагинания им секрет // Научн. Тр. инмед. и Инст. разв. болести и изкуств. осеменявоне сельскостоп. Животни, М-воземед. и горите. – 1959. – Кн.1.- С. 281 – 283. 60. Кашегин Г.И. Профилактика бесплодия коров // Ветеринария. – 1976. - №3. – С. 81 – 82. 61. Каширина Н.А. Сравнительная эффективность медикаментозной терапии больных послеродовым гнойно-катаральным эндометритом коров: Автореф. дис. … канд. вет. наук. – Воронеж, 2001. –18 с. 62. Кива М.С. Многоплодие коров, его параметры, биологические особенности и хозяйственное значение // Пути увеличения производства и улучшения качества продукции земледелия и животноводства. – Белая Церковь, 1980. – С. 98 – 101. 63. Куприянов Ю. Ликвидация массового бесплодия коров в молочном комплексе / И. Биршинов // Уральские нивы. – 1978. - №11. – С. 48 – 50. 64. Клиническая иммунология. Руководство для врачей / Под ред. акад. РАМН Е.И. Соколова. – М.: Медицина, 1998. – 272 с. 65. Козлов Г.Г., Акназаров Б.К. Определение факторов местной защиты матки и влияние на них препароатов, применяемых внутриматочно при лечении эндометритов у коров: Метод. Реком.- М.: МВА, 1988.- 16 с. 66. Конопельцев И.Г. Озонотерапия при одновременном заболевании коров эндометритом и цервицитом / А.В. Филатов, Н.В. Плетнев // Ветеринария. – 2003. - №1. – С. 35 – 37. 119 67. Константинов П. Приложение на хравохормона за повишаване заплодяемости при кравите / Л. Костов // Ветеринарно-медицински науки. – 1978. – Г. 15, кн. 4. – С. 14 – 19. 68. Кошевой В.П. Этиологическая роль микрофлоры в возникновении воспалительных процессов в гениталиях у телок // Тр. Харьковского СХИ. – Харьков, 1978. – Т. 249. – С. 48 – 52. 69. Красота В.Ф. Разведение с.-х. животных / Т.Г. Джопаридзе. – 4-е изд., перераб. и дополн. – М.: Изд-во ВНИИплем, 1999. – 386 с. 70. Куклин А.Д. Профилактика бесплодия коров на молочных комплексах / Р.Е. Ким // Ветеринария. – 1981. - №5. – С. 44 – 45. 71. Маркелов гинекологических О.В. Лечебно-профилактическая суппозиториев «Метрасул» эффективность при послеродовом эндометрите коров: Автореф. дис. … канд. вет. наук. – Саратов, 2003. –23 с. 72. Маркушин А.П. Сроки использования с.-х. животных. – М.: Россельхозиздат, 1983. – 157 с. 73. Мартынов В.Г. Сокращения матки и течение послеродового периода у коров // Тр. Троицкого вет. ин-та. – Челябинск, 1970 (1971). – Т. 13, вып. 2. – С. 52 – 57. 74. Медведев Г.Ф. О возникновении эндометритов у коров // Ветеринария. – 1973. - №4. – С. 85 – 87. 75. Медведев Г.Ф. Послеродовые изменения в половых органах коров // Ветеринария. – 1981. - №1. – С. 58 – 61. 76. Меркурьева Е.К. Биометрия в селекции и генетики с.-х. животных: Учеб. пособ. для зоотех. вузов и фак. – М.: Колос, 1970. –423 с. 77. Милованов В.К. Биологические и зоотехнические аспекты оплодотворяемости и плодовитости с.-х. животных // Животноводство. – 1967. - №4. – С. 62 – 70. 120 78. Миронова А.П. Влияние некоторых лекарственных препаратов на картину крови, воспроизводительную функцию коров при внутриматочном применении // Сб. ст. Донского СХИ. – Новосибирск, 1977. – Вып. 13. – С. 99 – 103. 79. Мисайлов В.Д. Меры борьбы с бесплодием и яловостью коров. – Улан-Уде, 1976. – С. 77. 80. Мисайлов В.Д. Роль половых стероидов и окситоцина в регуляции сократительной функции матки и разработка способов терапии и профилактики некоторых акушерских болезней у коров и свиней: Автореф. дис. … д-ра вет. наук. – Воронеж, 1990. –52 с. 81. Митрофанов С.А. Сравнительная терапевтическая эффективность различных способов лечения коров, больных эндометритом: Автореф. дис. … канд. вет. наук. – Оренбург, 2000. –21 с. 82. Михайлов Н.Н. К профилактике бесплодия заразной этиологии у с.-х. животных // Тр. ВИЭВ. – М., 1979. – Т. 49. – С. 53 – 58. 83. Михайлов Н.Н. К профилактики бесплодия скота // Ветеринария, 1977. - №9. – С. 68 – 69. 84. Михайлов Н.Н. Основы профилактики бесплодия заразной этиологии // Ветеринария. – 1977. - №4. – С. 82 – 84. 85. Михайлов Н.Н. Получение проб цервикальной слизи от коров / М.А. Лучко, З.С. Коннова // Ветеринария. – 1967. - №1. – С. 80. 86. Михайлов Н.Н. Условно-патогенная микрофлора и воспроизводительная функция самок / И.Я. Чистяков, Б. Муртазин // Ветеринария. – 1970. - №12. – С. 74 – 75. 87. Морозов В.А. К вопросу о бесплодии крупного рогатого скота // Ветеринария. – 1965. - №4. – С. 80 – 82. 121 88. Морозов Н.Л. Влияние внешних факторов на течение половых циклов коров // Учен. зап. Казанского вет. ин-та. – Казань, 1960. – Т. 79. – С. 207 – 213. 89. Нежданов А.Г. Значение сроков осеменения в профилактики бесплодия коров / Г.А. Черемисинов, А.А. Ковальчук // Ветеринария. – 1973. - №6. – С. 70 – 72. 90. Нежданов А.Г. Обмен веществ у коров при беременности, родах и в послеродовый период / Н.И. Кузнецов // Ветеринария. – 1978. - №4. – С. 79 – 82. 91. Нежданов А.Г. Общая неспецифическая резистентность и воспроизводительная функция у коров (при эндометритах) // проблемы патологии обмена веществ в современном животноводстве. – Воронеж, 1981. – С. 53 – 55. 92. Нежданов А.Г. Профилактика послеродовых осложнений у коров / С.А. Власов // Аетеринария. – 1980. - №11. – С. 49 -51. 93. Нежданов А.Г. Эндокринная функция яичников и щитовидной железы у коров после родов / К.А. Лободин // Ветеринария. – 2005. - №3. – С. 36 – 39. 94. Никитин В.Я. Практикум по акушерству, гинекологии и биотехнике размножения животных / М.Г. Миролюбов, В.П. Гончаров и др. – М.: Колос, 2003. –208 с. 95. Новиков Ф. Профилактика бесплодия коров // Ветеринария. – 1973. №11. – С. 72 – 74. 96. Овечкин Н.М. Терапевтическая эффективность надплевральной новокаиновой блокады при гинекологических болезнях коров // Учен. зап. Казанского вет. ин-та. – Казань, 1975. – Т. 120. – С. 51 – 53. 122 97. Овсищер Б. Минеральное питание коров в связи с использованием протеина и энергии пастбищных рационов: Автореф. дис. … д-ра с.-х. наук. – М., 1977. – 30 с. 98. Огурцов Р. Из опыта профилактики бесплодия с.-х. животных / А. Трофимов, И. Алексеев // Ветеринарное обслуживание животноводства в условиях интенсификации. – Чебоксары, 1980. – С. 48 – 50. 99. Осетров А.А. Разновидности бесплодия в стадах коров / А.П. Марчук, К.И. Жадовец // Матер. межвуз. науч. –метод. конф. по акушерству, гинекологии, искусственному осеменению и патологии молочной железы с.х. животных. – Ереван, 1971. – С. 208 – 211. 100. Осетров А.А. Распространение бесплодия и восстановление плодовитости коров / К.И. Жадовец, С.Н. Борисевич // Матер. межвуз. науч. – метод. конф. по акушерству и гинекологии искусственному осеменению с.-х. животных. – Львов, 1969. – С. 36 – 39. 101. Панков Б.Г. Профилактика, фармакопрофилактика, ранняя диагностика и лечение клинических и скрытых эндометритов у коров: Автореф. дис. … д-ра вет. наук. – М., 2003. – 44 с. 102. Петров А.М. Иммунологическое отношение при оплодотворении и беременности // Роль и значение метода искусственного осеменения с.-х. животных в прогрессе животноводства ХХ и ХХI вв.: Матер. межвуз. науч. – практ. конф., посвящ. 100-летию со дня рождения академика ВАСХНИЛ В.К. Милованова и профессора И.И. соколовской. – М. – С. 1 – 3. 103. Петров А.М., Петров М.А. Влияние иммунологических факторов на воспроизводительную функцию животных. // Актуальные проблемы ветеринарии, акушерства, гинекологии и биотехники размножения животных: сборник науч. трудов. – Ставрополь: АГРУС, 2007. – С. 51 – 60. 104. Петров А.М., Петров М.А. Влияние спермиоантител на фертильную функцию коров / Актуальные проблемы биологии 123 воспроизводства животных // Матер. междунар. науч. –практ. конф. – Дубровицы: ВНИИЖ, 2007.- С. 234 – 238. 105. Петров А.М., Петров М.А. Влияние иммунологических факторов на воспроизводительную функцию животных / Российский ветеринарный журнал спец. вып. – май, 2007. – С. 7. 106. Петров А.М., Петров М.А., Путилова Е.В. и др. Основные причины послеродовых заболеваний животных и современные методы их лечения / Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения // Матер. междунар. науч. –практ. конф.: научные труды ВИЖа. ГНУ ВНИИЖ. – Дубровицы: ВНИИЖ, 2008. – Вып. 64. – С. 428 – 431. 107. Петров А.М., Петров М.А., Федорович В.В. и др. Влияние иммунологических факторов на возникновение послеродовых эндометритов у животных / Международный вестник ветеринарии «Новые аспекты биотехнологии репродукции животных». -Санкт-Петербург, 2008. - №3. – С. 42 – 45. 108. Петров М.А. Значение иммунных факторов в репродукции животных / Сервисные центры по воспроизводству сельскохозяйственных животных – основы эффективного развития животноводства // Матер. семинара «Опыт создания и работы сервисных центров по воспроизводству с.-х. животных в рамках реализации Государственной программы развития сельского хозяйства». 22-24 сентября 2009. – Дубровицы, 2009. – С. 85 – 91. 109. Петров М.А. Противоспермальные антитела и их роль в оплодотворении коров / Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения. Матер. междун. науч. –практ. конф. Вып. 16 п. Быково, Моск. обл., 2010. – С. 151 – 153. 110. Петров С.Б. Борьба с яловостью коров. – Свердловск, 1977. – С. 103. 124 111. Петров С.П. Изучение клинической картины и продолжительности инволюции половых органов коров после отела // Тр. Свердловской науч. – исслед. вет. станции. – Свердловск ,1973. – Вып. 7. – С. 97 – 101. 112. Петров С.П. Состояние углеводного и минерального обмена в организме коров в послеродовой период // Матер. VI Уральской конф. физиологов, фармакологов и биохимиков. – Свердловск, 1969. – С. 480 – 482. 113. Плетнев Н.В. Применение озонированного изотонического раствора натрия хлорида при профилактике и терапии послеродового эндометрита у коров: Автореф. дис. … канд. наук. – Саратов, 2004. –20 с. 114. Полянцев Н.И. К диагностике и профилактики алиментарного малоплодия и бесплодия свиней // Науч. тр. Краснодарской науч. –исслед. вет. станции. – Краснодар, 1972. – Т.5. – С. 197 – 200. 115. Полянцев Н.И. К лечению эндометритов // Ветеринария. – 1964. №10. – С. 67 – 68. 116. Полянцев Н.И. Лечение при гинекологических заболеваниях с.-х. животных // Воспроизводство и сохранение молодняка с.-х. животных и птиц. – Воронеж, 1975. – С. 103 – 106. 117. Полянцев Н.И. Практические советы по борьбе с яловостью коров. – М.: Россельхозиздат, 1978. –91 с. 118. Порфирьев И.А. Бесплодие высокопродуктивных молочных коров / И.А. Порфирьев // Ветеринария. – 2006. - №10. – С. 39 – 41. 119. Порфирьев И.А. Бесплодие высокопродуктивных молочных коров / И.А. Порфирьев // Ветеринария. – 2009. - №8. – С. 37 – 40. 120. Порфирьев И.А. Бесплодие и его этиология у высокопродуктивных молочных коров / И.А. Порфирьев // С. –х. биология. – 2002. - №2. – С. 67 – 81. 125 121. Порфирьев И.А., Петров А.М. Акушерство и биотехника репродукции животных / И.А. Порфирьев, А.М. Петров // С. Петербург, Лань. - 2009. – 352 с. 122. Постовой С.Г. Влияние препаратов простагландина Ф2а на сократительную функцию матки коров / С.Г. Постовой // ветеринария. – 2007. - № 4. – С. 36 – 38. 123. Преображенский О.Н. О некоторых связях между кормлением и воспроизводством у жвачных / О.Н. Преображенский // Сельское хозяйство за рубежом. – 1974. - №4. – С. 23 – 26. 124. Преображенский О.Н. Современные методы диагностики беременности и бесплодия животных / О.Н. Преображенский // Ветеринария. – 2003. - №7. – С. 32 – 33. 125. Преображенский О.Н. Хирургические приемы, предложенные А.П. Студенцовым, для искусственно направленного бесплодия при откорме животных / О.Н. Преображенский // Материалы междунар. науч. –практ. конф. посвящ. 100-летию А.П. Студенцова. – Казань, 2003. – С. 115 – 118. 126. Пронин Б.Г. Механическая и биоэлектрическая активность матки у коров при искусственном осеменении / Б.Г. Пронин // Уч. записки КГАВМ 2005. – Т.180. – С. 295 – 301. 127. Пронин Б.Г. Определение экономического ущерба (неиспользованных резервов) вследствие бесплодия коров и телок / Б.Г. Пронин // Уч. записки КГАВМ 2009. – Т.197.-С. 325 – 332. 128. Родин И.И. Интенсификация воспроизводства – важный резерв увеличения выхода телят / В. Середин // Молочное и мясное скотоводство. – 1976. - №2. – С. 41 – 44. 129. Родин И.И. Меры профилактики бесплодия у коров // Молочное и мясное скотоводство. – 1974. - №9. – С. 28 – 30. 126 130. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. Пер с англ. – М.: Мир. – 2000. –592 с. 131. Серых М.М., Макурина О.Н., Петров А.М. и др. Общая и экологическая иммунология: Учебное пособие / М.М. Серых Самара: Изд-во «Самарский университет», 2000. 175 с. 132. Серых М.М., Зайцев В.В., Кленова Н.А. и др. Основы молекулярной эндокринологии: Учебное пособие. – Самара, 2004. – 144 с. 133. Соколовская И.И. Иммунология воспроизведения животных / В.К. Милованов. – М.: Колос, 1981. – 264 с. 134. Соколовская И.И. О рациональных сроках осеменения коров // Животноводства. – 1968. - №1. – С. 67 – 73. 135. Студенцов А.П. Борьба с бесплодием с.-х. животных – важнейшая задача специалистов животноводства Татарии: Матер. республ. конф. зооветспециалистов. – Казань, 1965. – С. 27 – 31. 136. Студенцов А.П., Шипилов В.С., Никитин В.Я., и др. Акушерство, гинекология и биотехника размножения животных / Под ред. В.Я. Никитина и М.Е. Миролюбова.- М.: КолосС, 2005.- 512 с. 137. Студенцов А.П. Профилактика и ликвидация бесплодия крупного рогатого скота в Татарской АССР / А.Г. Субботина, Б.Г. Пронин, О.Н. Преображенский, Ю. Ш. Пашаев, В.И. Наместников, М.Г. Миролюбов, А.Н. Ахмадеев. – Казань, 1963. – 20 с. 138. Сысоев А.А. Исследование цервикальной слизи коров для диагностики стельности и патологии // Животноводство. – 1961. - №11. 139. Сысоев А.А. Физиология размножения с.-х. животных. – М., 1978. – С. 8 – 24. 140. Терентьева Н.Ю. профилактическая эффективность фитопрепаратов при патологии послеродового периода у высокопродуктивных молочных коров: Автореф. дис. … канд. вет. наук. – Саратов, 2004. –24 с. 127 141. Трухачев В.И., Никитин В.Я., Марченко В.В. и др. Профилактика и лечение бесплодия у высокопродуктивных импортных коров и телок в условиях их содержания на молочных комплексах Ставропольского края: рекомендации / «Ставропольский ГАУ». – Ставрополь: АГРУС, 2008. –40 с. 142. Федоров Ю.Н. Иммунодефициты у животных: характеристика, диагностика и коррекция / Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский, М.А. Костына // Состояние, проблемы и перспективы развития ветеринарной науки России: Сб. материалов науч.сессии РАСХН/К 100-летнему юбилею Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, Москва, 16-17 июня 1998 г.- М.: 1999.- Т.2.-С. 138-141. 143. Федоров Ю.Н. Изучение механизма формирования иммунитета у животных / Ю.Н. Федоров, В.А. Горбатов, В.С. Гуткин и др. // Тр. ВНИИЭВ.М.1982.-Т.55.-С.102-108. 144. Федоров Ю.Н. Основы иммунологии и иммунопатологии собак / Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский, И.В. Слугин // ООО «Информ-12».-М.: 2000.- 248 с. 145. Флегматов Н.А. Профилактика и ликвидация бесплодия и яловости крупного рогатого скота / В.С. Шипилов, О.З. Исхаков, В.Ф. Кузнецов, В.Д. Маслов, Н.Д. Поташевский. – М.: Россельхозиздат, 1977. – 36 с. 146. Храмцов В.В., Григорьева Т.Е., Никитин В.Я., и др. Акушерство и гинекология сельскохозяйственных животных / Под ред. В.Я. Никитина.- М.: КолосС, 2007.- 197 с. 147. Чантуридзе Р.Д. Иммунологические факторы патологии беременности у коров // Ветеринария. – 1975. - №4. – С. 74 – 75. 148. Шевченко Б.Д. Профилактика и лечение послеродовых эндометритов у коров молочного комплекса с беспривязным боксовым содержанием животных / Л.М. Дубрава // Особенности терапии и 128 профилактики болезней животных в промышленных комплексах. – Кишинев, 1978. – С. 6 – 10. 149. Шевченко Б.Д. Профилактика симптоматического бесплодия у коров / Л.М. Дубрава // Ветеринария. – 1976. - №12. – С. 55 – 57. 150. Шейкин В.Н. Влияние условий проведения отелов на восстановление воспроизводительной функции / Н.Бойко, Р. Куксова // Молочное и мясное скотоводство. – 1980. - №8. – С. 29 – 30. 151.Шипилов В.С. Выбор времени осеменения коров // Матер. межвуз. науч. – метод. конф. по акушерству, гинекологии, искусственному осеменению и патологии молочной железы с.-х. животных. – Ереван, 1971. – С. 313 – 314. 152. Шипилов В.С. Диагностика скрытого хронического эндометрита у коров / В.В. Храмцов // Ветеринария. – 1980. - №10. – С. 46 – 47. 153. Шипилов В.С. Методы и сроки лечения коров при задержании последа / В.И. Рубцов // Ветеринария. – 1963. - №3. – С. 36 – 40. 154. Шипилов В.С. Практикум по акушерству, гинекологии и искусственному осеменению с.-х. животных / Г.В. Зверева, И.И. Родин, В.Я. Никитин. – М.: Агропромиздат, 1988. –335 с. 155. Шипилов В.С. Профилактика бесплодия с.-х. животных. – М.: Знание, 1976. –64 с. 156. Шипилов В.С. Профилактика некоторых форм бесплодия коров (клинико-экспериментальное исследование): Автореф. дис. … д-ра вет. наук. – Львов, 1968. – 41 с. 157. Шипилов В.С. Физиологические основы профилактики бесплодия коров. – М.: Колос, 1977. – 336 с. 158. Шипилов В.С. Эндометрит // Краткий справочник ветеринарного врача / А.И. Филоненко, Н.М. Алтухов, В.И. Афанасьев, В.А. Башкиров и др. – М.: Агропромиздат, 1990. – 574 с. 129 159. Agramal S. Concentration of some electrolytes ее - trace elemente in bovine cervico-vaginal mucus at estrus / I. Datta // Indian Journal Experimental Biology. - 1979. - Vol. 17, N5. - P. 514 – 516. 160. Aitren R.J.., Richardson D.W. Immunization against zona pellucida antigens. – In: Immunological Aspects of Reproduction and fertility Control./ Ed. J. P. Hearn. Lancasfer, 1980, p. 173 – 182. 161. Bostedt H. Klinische Erhebungenuber den Verlauf der Puerperalperiode bei Rindern aus Bestanden mit Fertilitatsproblemen / H. Reissinger, D. Gunzier // Berliner und Muhchener Tierarztliche Wochenerschrift. — 1976. — Jg. 89, H. 2. — Р. 24-28. 162. Bostedt H. Masanahmen zur Hebung des Fertiliatstandes in Milckuhbestanden // Veterinar-Medizinische Nachrichten. - 1982. - H. 1. - Р. 3 17. 163. Bostedt H. Problematik der Fruchtbarkeitsuberwachung in Milchrinderbes-tanden // Tierzuchter. - 1980. - Bd. 32, H. 5. - Р. 186 - 188. 164. Bostedt H. Zur Fertilitatslage nach рuerpега1а1егкгаnкungеn des Rindes // Berliner und Munchener Tierarstliche Wochenschrift. - 1979. - Bd. 92, N3. - Р. 43 - 47. 165. Car M. Prinos poznavanju btjecaja endomtritisa I retencija posteljice na visinu proizvonje mlijeka I reprodukcijaku efikasnost krava / L. Sustie // Veterinarski arkhiv. - 1980. -Kn. 50, sv. 3. - Р. 103 - 113. 166. Carson R. L. The relationship between narrow calcium-phosphorus ratio and reproductive problems in a dairy herd, a case report / A. B. Caudle, H. E. Riddle // Theriogenology. - 1978. - Vol. 9, N6. - P. 505 - 507. 167. Caselli R. Antibiotici: Quali ? Come? Quando? // Informatore Zootecnico. - 1972. - An. 19, N13. - P. 9. 168. Cupps P. J. Uterine changes associated with impaired fertility in the dairy cow // Journal Dairly Science. - 1973. - Vol. 56, N7. - P. 878 - 884. 130 169. Dach S. Augaben und zuch thygienischen Tatigkeit bei der Sicherung der Reproduktion der Rinder-bestande / H. Haase // Monatshefte fur Veterinar Medisin. - 1972. - Jg. 27, H. 10. - S. 387 - 392. 170. Das Purakaystha P. S. A note on milk production reproductive efficiency in a dairy herd / S. С Mazumdar // Indian Journal of Animal Sciency. 1979. - Vol. 49, N1. - P. 66 - 67. 171. Davies M., McLaughlin M. E., Sutcliffe R. G. Immune responsiveness against the human placenta. I. Generation of cellular and humoral activiti in experimental animals. – Immunology, 1982, vol. 47, p. 459 – 464. 172. Donat H., Morenz J. Importance of autoimmunity in infertili couples. – J. Reprod. Immunol., 1983, vol. 5, Suppl., p. 52 – 52. 173. Fairies E. Futterung in der Trockenperiode entschecheidet uber Milchleistung und Fruchtbarkeit // Unser Milchvieh. 1979. -V.31. -№ 1. -P. 14-15. 174. Fairies E. Prepartal feeding and the level of feeding at the peak of milk production. // Proceedings of the Third Internat.// Conference on Production Lisease in Farm Animals. -1977. -P.30-33. 175. Follicular dynamics in heifers during pre-pubertal and pubertal period kept undertow levels of dietary energy intake. Romano M.A., Barnabe V.H., Kastelic J.P., de Olivera С A.., Romano R.M. Reprod. Domest. Anim. 2007. 42, № 6, Р.516-622. 176. Frank Th., Braund D. Are your dry cows orphans? // Jerseu J. -1979. — V.26. -№7. -P.24-29. 177. Fronk Th., Braund D. Are your dry cows orphans? - Jersey J. -1979. V.26. - №7. -P.24-29. 178. Houe H., Ostergaard S. Thilsing - Hausen Т., Jorgensen R.J. Larsen Т., Sorensen J.T. Agger J.F., Blom J.Y. Milk fever and sub clinical hypocalcaemia an evaluation of parameters on incidence risk, diagnosis, risk factors and biological 131 effects as input for a decision support system for disease control // Acta veter., scand..-2001. -Vol. 42, № 1. -P 1-29. 179. Huszenicza G., Molnar L., Solti L. Haraszti J. Postpartal ovarian function in Holstein and crossbred cows on large scale farms in Hungary. //J. veter. Med. Ser. A.-1987.-V.34.-№4.-P.249-263. 180. Hutiens M., Otterbu D. When 12 sources recommend for dry cow care. Hoard s Dairumen. -1979.-V.124.-№1.- P.60-61. 181. Identification of putative pheromones in bovine (Bos Taurus) faeces in relation to estrus detection. Sankar R. , Archunan G. Anim. Reprod. Sci. 2008. 103, №1-2, Р. 149-153. 182. Ihm K., Tillack P. Beeinflussung des Milchertrages je Kuh und jahr durch die Zwischenktibezeit. - Tiersucht.-1982. -V.365.-P.213-216. 183. Isojima S., Koyama K., Hasegawa A. et al. Destribution and role fertilization of porcine zona pellucida antigens analyzed by monoclonal antibodies.- J. Reprod. Immunol., 1983, vol. 5, suppl., Р.8. 184. Jaskowski J.M., Olechnowicz J., Urbaniak K. Summer sub fertility in сows // Med. weter..- 2005.- Vol. 61, N 12.-P. 1323-1327. 185. Jeres G.P., Garnswerthy P.C. The effects of dietary energy content on the response of dairy cows to body condition at calving /Animal Production. 1989. Vol. 49.№2, P.183-191. 186. Kaczmarowski M., Malinowski E., Markiewicz H. Some hormonal and biochemical blood indices in cows with retained placenta and puerperal mertritis // Bull. Veter. Inst, in Pulawy.-2006.- Vol. 50, N 1. - P. 89-92. 187. Kalchreuter S.Futterungsbedingte Fruchtberkeitseterungen beis Milchviech. - Zuchtwehl und Besamung. -1978.-V.87.- Р.10-12. 188. Kailela K. Utfodringens detydelse for koraas fertilitet - Lantman Andeistolk. -1980. -V.6l.-№4.- Р.l59-l6l. 132 och 189. Kastelie. J.P., Curran S., Ginther O. Accuracy of ultrasonography for pregnancy diagnosis on days Ю to 22 in heifers. Theriogenology. -1989.- V. 31. №4.-P. 813-820. 190. Katoch R.C., Manuja N.K., Vaid J., Bhowmik K.B.D. Some studies on retention of foetal membranes in Jersey cows. - Indian veter.med. J.-1987.-V.11.№З.-Р.153-159. 191. Kawai K., Nagohata EL, Lee N.-Y., Ann A., Shimazaki K. Effect of infusing lactoferrin hybrolysate into bovine mammary glands with sub clinical mastitis// Veterinary Research Communications; Dordrecht. -2003. - Vol. №27,№7.- P.539-548. 192. Lee C.-Y. G., Wong E., The C.-Z. et al. Generation of mouse oocyte monoclonal isoantibodies: their effects and those of antisperm monoclonal antibodies on in vitro fertilization. –J. Reprod. Immunol.,1985, vol. 7,- Р. 3 – 13. 193. Malinowski E., Nievitecki W., Nadolny M., Lassa PL, Smulski S. Effect of liposome dimmer injections on results of intramammary treatment of acute mastitis in cows // Med. Veter. - 2006. - Vol. 62. №12.- P. 1395 - 1399. 194. Malletto S. Cause alimentary di infertilita nei bovini. - Zooprofilassi/1972.- V.27.-№ 11 .-P.471 -490. 195. Markiewicz H. Wplyw nadmiaru bialka w dawce pokarmowej na plodnosc krow mlecznych// Med. weter..-2003.- R. 59, N 8.- Р. 682-685. 196. Markiewicz H., Kuzma 1С, Malinowski E. Predisposing factors for puerperal metritis in cows// Bull. Veter. Inst, in Pulawy.- 2001.- Vol. 45, N 2.- P. 281-288. 197. McDonald L.E. Veterinary endocrinology and reproduction/ - London etc.: Bailliere Tindall, 2004,- 560 p. 198. Meisinger J. Untersucheqen tiber dis ekonomischen auswirkunqen der Rinder tuberkulosetilqunq aut die Produktivitat der Rinderbestande / J. Meisinger// Monatshefta fur veterinarmedizin, 1970, №1,8,7., Р. 175-179. 133 199. Metabolic changes in cows with or without retained fetal membranes in transition period. Seifi H. A., Dalir-Naghadeh В., Farzneh N., Mohri M., GorjiDooz M// Vet. Med. A 2007. 54, № 2,- Р 92-97. 200. Meyer H. Einfluss der Futterung auf die Fruchtbarkeit des Rindes.// DLG - Mitt., -1977. -V.92. - №18. -P. 990-992. 201. Mieth. K., Schuter H., Schwedler H. Kalkulation der in der DDR oluzch die Rinderlenkose hervorqerufenen vizschastlicheh Schedon / K. Mieth, H. Schuter, H. Schwedler//| Monatshefte fur Veterinar-medizin, 1970. №24.- Р.929933. 202. Mukherjee R., Ram G.C. Dash P.K., Gogwami Т., The activity of mile leucocytes in response to a water-soluble fraction of Mycobacterium phlei in bovine sub clinical mastis // Veterinary Research Communications; Dordrecht. 2004.- Vol. 28,№l.- P.47-54. 203. Naziroglu M., Gur S. Antioxidants and lipid per oxidation levels of blood and cervical mucus in cows in relation to pregnancy //Dtch. Tierarztl. Wochenschr., 2000, V. 107, №9. - P.374-376. 204. Neuchaus V., Six F. Bertiver und Munchener Tierarzliche Woche enschrift / V. Neuchaus, 1965.4,- Р.67-72. 205. Neuroendocrine control of reproductive function in ruminants. Okamura Hiroaki, Ohkura Satoshi. Anim. Sci. J. 2007. 78, № 2,- Р 105-111. 206. Otterbu D., LinnJ. Nutriticnal effecte on reproduction in dairy cattie. Minnescta Nutrition Conference. -1981.-V.42.-№9.- P.22. 207. Pagusu R.. De Baere R. Lousse A. The capacity of the mature cow to lose and recover nitrogen and the significance of protein reserves. - Brit. J. Nutr. 1972.-V.27. -№1.- Р.327-37. 208. Pandey N.N., Parai T.P. Clinic-biochemical and therapeutic studies of production disease in crossbred cows. -Indian J. anim. Sc- 1988.-V.58.- №1.- P.3638. 134 209. Pavlicek A., Masljenovic Z. Optimalni uslovi drsanja, visoke proizvodnja I plodnost. - Veter. Glasnik. -1980.-V.34.-№7.-P.679-682. 210. Pelisaler C. Daury, breeding efficiency. - Guernsey Breeder s J. -1970. V.125.-№125. - P.283-286. 211. Pentti Tuochimaa, Susanna Pasanen, Satu Passinen et al. Mechanisms of actions of sex steroid hormones: Basic concepts and clinical correlations. // Philadelphia etc.: Saunders Co., 2006. – 342 р. 212. Petit M. Effet du nivesu da alimentation a la fin de is gestation sur le poids a la naissance des veaux et leur devenir. // Annales de Biologie animale. 1979. -V. 19.-№ 1. - P.277-287. 213. Piatkowski B. Die Bedeutung der Futterung fur die Fruchtbarkeit der Milhkuhe. - Tiersucht. -1980. -V.34.-№9. -P.389-391. 214. Plank J. Futterung der trockenstehenden Kuh aber richtig. - Bauer.1978.-V.31.-№19.-Р.7. 215. Protein supplementation on onset of post-partum ovarian cyclicity of dairy cows. An isotopic immunoassay study. Khan Mohammed A.S. J. Labell. Compounds and radiopharm. 2007. 50, № Р 327-329. 216. Schoonover C. Pre-and post-calving feeds both important // Idaho Farmer Stockman. -1981.-V.99.-№8.-P.37. 217. Silvia W.I., Homanic Y.E. Embryonic mortality in sheep; Current concepts and researches //Agr. Experiment station. -1987, -V.304. - P.3-4. 218. Sladek Z., Rysanek D., Faldina M. Activation of phagocytes during initiation and resolution of mammary gland injury induces by lipopolysacharide in heifers // Veter. Res., - 2002. - Vol. 33, №2. - P. 191-204. 219. Sommer H. In den moisten Fallen liegt es an der Futterung // Landwirtschaftsblatt Wesser- Emg. - 1980. - V.127. -№16. -P. 18-20. 135 220. Sonderegger H. Schurch A. A study of the influence of the energy and protein supply on the fertility of dairy cows. Livestock Product. Sci. -1977.-V.4. P.327-333. 221. Steven E., Calvin M., Online D. Does resting in pregnant sheep cause a syndrome analogous to human preeclampsia //j. of veterinary Research. 1998, V. 1,№4.-P.43-53. 222. Stone J. Protein feeding - Caned. Ayrehire Rev.-1975. -V.56.-№5. -P.812. 223. Swensson Т., Olsson S. // Utfoding och fruktsamhet. Svensk Veter. Tiedn. -1982. - V.33. -№1. -P.11-21. 224. Tievs J. Mangelerscheinungen und Hochleistungszucht beim Rind. - Tierarztliche Umschau. -1962. -V.17.-P.357-362. 225. Tzora A. Leontides LS, Amiridis GS, Manos G. Fthenakis GC: Bacteriological and epidemiological findings during examination of the uterine content of ewes with retention of fetal membranes. Theriogenology 2002 226. Usmani RH.Ahmad N. Shafig P. Mirza MA: Effect of sub clinical uterine infection on cervical and uterine involution, estrous activity and fertility in postpartum buffaloes. Theriogenology 2001. 227. Vucko M., Potocnjak M. Otkrivanje estrusa kod krava mjerenjem elektricnog otpora vaginalne sluginalne sluznnice odredivanjem progesterone u serumukrvi. Veter. Glasnik.- 1988. -V.42.-№ 9.-P.561-566. 228. Wierzbowski S. Ultrasonografiajako inetoda rozszerzajaca mozliwosci diagnostyczne w ginikologii koni I bydla. Med. Weter. - 1989. -V. 45. -№ 1. P.50-54. 229. Wolf J. Untersuchungen zur Reproduction und Kuhselektion in Milchviehherden / P. Rybka // Tierzuchter. - 1979. - Jg. 33, H. 5. - S. 221 225. 136 230. Woolde O. E. Nonspecific postpartum endometritis / C. J. Johanns // Iowa State University Veterinary. - 1973. - Vol. 35, N2. - P. 63 - 65. 231. Wray J. Reasons for culling cows. - Bridgets, 1980. - N 20. - P. 21 -23. 232. Yokus В., Bademkiran S., Cakir U.D. Total anti-oxidant capacity and oxidative stress in dairy cattle and their associations with dystocia// Med. weter.2007.- Vol. 63, N 2.- P. 167-170. 233. Yongbuist R. S. Hormal influence on bovine reproductive cycles / R. G. Elmore, С J. Bierschwal, C. E. Martin // Charolais Bull-O-Gram. - 1979. Fed -march.-P. 12-15. 137
