РЕТРОСПЕКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА ДВУХ СЛУЧАЕВ БЕШЕНСТВА У ПАЦИЕНТОВ ИЗ АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ
advertisement
РЕТРОСПЕКТИВНАЯ ДИАГНОСТИКА ДВУХ СЛУЧАЕВ БЕШЕНСТВА У ПАЦИЕНТОВ ИЗ АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ Бешенство • Бешенство – особо опасное вирусное заболевание животных и человека, поражающее центральную нервную систему • Возбудитель бешенства – Rabies virus, принадлежащий роду Lyssavirus семейства Rhabdoviridae 2 род Lyssavirus 1. Aravan virus 2. Australian bat lyssavirus 3. Duvenhage virus 4. European bat lyssavirus1 5. European bat lyssavirus2 6. Irkut virus 7. Khujand virus 8. Lagos bat lyssavirus 9. Mokola virus 10. Rabies virus Andrew M.Q. King, Michael J. Adams, Eric B. Carstens,and Elliot J. Lefkowitz., Virus Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses, Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, 2012 Распределение риска заражения человека бешенством в мире (2012 г.) (WHO Expert consultation on rabies, 2013) •Бешенство наблюдается более чем в 150 странах •Более 55 000 человек ежегодно умирают вследствие инфицирования вирусом бешенства (преимущественно в Азии и Африке) •Более 15 000 000 человек ежегодно получают антирабическую сыворотку, что позволяет избегать нескольких сотен тысяч ВОЗ, сентябрь 2012г. смертей Заболевание людей бешенством на территории России в 1960-2011 гг. n 25 23 23 22 22 21 21 20 19 18 17 17 17 15 14 15 16 16 14 15 14 14 13 12 12 12 11 10 10 12 11 11 10 12 11 11 10 10 8 8 8 8 8 7 8 7 6 5 5 5 3 3 3 2 1 1 1 0 1960 1963 1966 ВСЕГО 1969 1972 1975 1978 1981 1984 1987 От укусов диких животных 1990 1993 1996 1999 2002 2005 2008 2011 Полещук и др., 2013 ПУТИ ПЕРЕДАЧИ ВОЗБУДИТЕЛЯ Заражение человека обычно наступает при укусах, реже при ослюнении повреждённых участков кожи больными бешенством животными; Описаны случаи заражения бешенством при трансплантации роговицы, почки, печени; Возможно инфицирование человека воздушно-капельным путем СТРОЕНИЕ ВИРИОНА ВИРУСА БЕШЕНСТВА 75нм Матриксный белок Липидная мембрана Гликопротеин 180нм РНК нуклеопротеин фосфопротеи н РНКполимераза Рибонуклео протеиновый комплекс (нуклеокапсид ) Warrell et al., 2004 ГЕНОМ ВИРУСА БЕШЕНСТВА Геном представляет собой единую одноцепочечную молекулу РНК (-) (~12kb) Геном вируса состоит из 5 генов: •N-ген (нуклеопротеин) •Р-ген (фосфопротеин) •М-ген (матриксный белок) •G-ген (гликопротеин) •L-ген (РНК-зависимая РНКполимераза) ПАТОГЕНЕЗ 5) инфекция в ГМ 4) Вирус реплицируется в спинальном ганглии и перемещается по спинному мозгу в головной мозг 1) Вирус проникает в организм человека после укуса животного 6) Вирус перемещается из головного мозга по нервам в другие ткани организма 3) вирус инфицирует нерв периферической нервной системы, перемещается по типу ретроградного транспорта 2) Вирус реплицируется в мышечной ткани в месте укуса http://pathmicro.med.sc.edu/virol/rabies.htm, Richard Hunt КЛИНИЧЕСКАЯ КАРТИНА Инкубационный период длится обычно 1-3 месяца. При течении болезни наблюдают 3 периода: 1)Стадия продромы (1-3 суток) у больного, хотя рана уже зарубцевалась, появляются неприятные ощущения в области укуса или ослюнения (жжение, тянущие боли, зуд), также наблюдается беспричинная тревога, депрессия, бессонница 2) Стадия возбуждения (1-3 суток) характеризуется гидрофобией, аэрофобией и повышенной чувствительностью. Температура тела субфебрильная. Слюноотделение повышено, больной не может проглотить слюну и постоянно ее сплевывает. Возбуждение нарастает, появляются зрительные и слуховые галлюцинации. Иногда возникают приступы буйства с агрессивными действиями 3) Стадия паралича (1-5 суток) Наступает паралич глазных мышц, нижних конечностей. Тяжёлые паралитические расстройства дыхания вызывают смерть ЛЕЧЕНИЕ И ПРОФИЛАКТИКА Этиотропная терапия не разработана. В случае контакта с бешеным животным, покусов диких и домашних животных при невозможности их обследования проводится экстренная вакцинопрофилактика и/или иммунноглобулинотерапия Первичная профилактика антирабической вакциной проводится декретированным группам населения (охотники, звероводы, ветеринарные врачи) Диагностика бешенства Золотой стандарт лабораторной диагностики бешенства – метод флюоресцирующих антител (МФА) Недостатки методов: Биопроба – имеет длительный временной интервал наблюдения (30 дней); МФА – требуется высокая квалификация специалиста; ИФА – имеет относительно более низкую чувствительность ; WHO Expert consultation on rabies, 2013 13 Микроскопия Клинический или патматериал Молекулярнобиологические методы Микробиологические и вирусологические методы ИФА Выделение ДНК/РНК Выделение ДНК/РНК Иммуночипы Секвенирование по Сэнгеру Real-Time PCR Неспецифическая амплификация SISPA/VEDISCA PCRфорез Mass-Tag PCR Родоспецифичес кая ПЦР ДНК-чипы Высокопроизводительное Секвенирование. Платформы Illumina, 454-Roche Расширение спектра специфических RealTime диагностикумов Улучшение качества рутинной диагностики Расширение спектра серологических маркеров 2003 г., Астраханская областная инфекционная больница; Смерть 2-х пациентов (мужчина 50 лет и ребенок 7 лет), энцефалит неясной этиологии; 15 Молекулярно-генетические методы исследования RNA-extraction kit (Qiagen) Мозговая суспензия ОТ (SuperScript III [Invitrogen]) РНК кДНК ПЦР в присутствии набора специчных для разных родов вирусов праймеров Смесь ампликонов кДНК TrueSeq Смесь ампликонов Illumina library MiSeq 16 Результаты NGS • Согласно результатам секвенирования ~2% прочтений (124781 из 6041914) обладали высокой степенью схожести к геному вируса бешенства; • Для подтверждения результатов секвенирования провели ОТ ПЦР в реальном времени с помощью набора реагентов «Амплисенс ® RABV-FL» 17 Набор реагентов для выявления РНК вируса бешенства методом ПЦР в режиме реального времени «Амплисенс ® RABV-FL» (проходит процедуру регистрации) • Целевая последовательность - фрагмент N-гена; • Аналитическая чувствительность 5*103 копий/мл • Аналитическая чувствительность, составила 0.1-1.0 LD50/мл; • Диагностическая чувствительность 100% (в сравнении с МФА , методом биологической пробы на мышах и ИФА) • Аналитическая специфичность 100% [Оценку аналитической специфичности набора реагентов проводили на разных семействах вирусов (Bunyaviridae, Reoviridae, Togaviridae, Picornaviridae и др.), мозговой ткани мыши, кошки, собаки, человека] 18 Подтверждение результатов NGS с помощью ПЦР в реальном времени 0,8 0,7 0,6 Норм. Флуоресц. 0,5 ПКО+ 0,4 образец1 образец2 0,3 0,2 0,1 ОКО- 0,0 5 10 15 20 25 Цикл 30 35 40 19 45 Валидация результатов (биопроба) (Исследования выполнены на базе ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора) • проводили на 3-недельных беспородных белых мышах (6-8 г) путём интрацеребральной инокуляции 30 мкл 10% суспензии головного мозга погибших. Срок наблюдения составлял 30 дней; • Животные, заражённые первичным материалом, заболели на 12-13 (в среднем 12,4) и 8-15 сутки (в среднем 11,8); заболевание сопровождалось характерными клиническими признаками; • Выделили штаммы 8329H и 8330Н; 20 Валидация результатов (МФА) (Исследования выполнены на базе ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора) Специфическая иммуннофлуоресценция антигена вируса бешенства в отпечатках головного мозга Отпечаток головного мозга инокулированных белых мышей 8229H 8330H Отпечаток головного мозга здоровых белых мышей 21 Валидация результатов (ИФА) (Исследования выполнены на базе ФБУН «Омский НИИ природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора) 8329Н 8330H 10-1 10-2 10-1 10-2 K- K- K+ K+ 22 Полногеномное секвенирование При помощи секвенирования методом Сэнгера получены все белок-кодирующие последовательности нуклеотидов 2 штаммов вируса бешенства, выделенных из мозговой ткани пациентов, погибших в результате энцефалита неясной этиологии; 23 Maximum Likelihood, General Time Reversible model (best according to AIC), Gamma Distributed, No of Discrete Gamma Categories – 4, No. of Bootstrap Replications – 1000 Степная подгруппа Северо-восточноевропейская подгруппа Европейские подгруппы WE/CE Кавказская подгруппа Арктическая подгруппа Cosmopolitan group N-gene, cds ВЫВОД: Использование современных молекулярно-биологических методов в сочетании с классическими методами диагностики бешенства существенно повышает эффективность диагностики и улучшает качество надзора за этой опасной инфекцией. 25 Спасибо за внимание!
