На правах рукописи ПЛИЕВ БОРИС КОНСТАНТИНОВИЧ
advertisement
На правах рукописи ПЛИЕВ БОРИС КОНСТАНТИНОВИЧ СЕКРЕЦИЯ ХЕМОТАКТИЧЕСКИ АКТИВНОЙ D2D3 ФОРМЫ РАСТВОРИМОГО УРОКИНАЗНОГО РЕЦЕПТОРА АКТИВИРОВАННЫМИ НЕЙТРОФИЛАМИ ЧЕЛОВЕКА 03.00.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 г. Работа выполнена на Кафедре биологической и медицинской химии Факультета фундаментальной медицины ГУНУ МГУ имени М.В. Ломоносова Научный руководитель: академик РАН и РАМН Ткачук Всеволод Арсениевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Добровольский Анатолий Борисович доктор химических наук, профессор Румш Лев Давидович Ведущая организация: ГУ Институт ревматологии РАМН Защита диссертации состоится 12 ноября 2008 г. в 13 час 30 мин на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени доктора и кандидата биологических наук в ФГУ «Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс» Росмедтехнологий (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ РКНПК Росмедтехнологий. Автореферат разослан ____ октября 2008 года. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук В.Е.Синицын ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Нейтрофилы являются основными эффекторными клетками неспецифического иммунитета и представляют первую линию защиты организма от патогенных микроорганизмов. Эти клетки узнают и убивают микроорганизмы посредством их фагоцитоза и последующей секреции активных форм кислорода и цитотоксических компонентов гранул в фагосомы (Nauseef, 2007). Помимо элиминирования патогенных микроорганизмов, нейтрофилы, аккумулирующиеся в воспаленной ткани, секретируют хемоаттрактанты, привлекающие другие типы лейкоцитов в очаг воспаления. К настоящему времени показано, что аккумуляция нейтрофилов в очагах проникновения инфекции и поврежденных тканях сопровождается индукцией экспрессии генов многочисленных хемокинов (Scapini et al., 2000). Кроме того, помимо классических хемокинов, активированные нейтрофилы секретируют другие белки, способные оказывать хемотактический эффект на отдельные типы лейкоцитов (Плиев, 2008). Эти белки являются компонентами гранул нейтрофилов и быстро секретируются при дегрануляции активированных клеток. Урокиназный рецептор (uPAR) – мультилигандный рецептор, играющий важную роль в околоклеточном протеолизе мигрирующих клеток, клеточной адгезии и хемотаксисе (Ragno, 2006). В структуре uPAR выделяют три гомологичных домена: D1, D2 и D3. Линкерный участок, связывающий домены D1 и D2, может расщепляться многими сериновыми протеазами, что приводит к образованию D2D3 формы рецептора (Montuori et al., 2005). Мембраносвязанный uPAR может отщепляться GPI-специфичной фосфолипазой D с образованием растворимой формы рецептора – suPAR. Как и мембраносвязанный рецептор на плазматической мембране, suPAR в биологических жидкостях присутствует как в полноразмерной, так и в D2D3 формах. Расщепление линкерного участка между доменами D1 и D2 может происходить в разных сайтах. D2D3 форма suPAR с экспонированным фрагментом SRSRY (остатки 88-92) линкерного участка является хемоаттрактантом для базофилов, моноцитов и CD34+ гематопоэтических стволовых клеток (HSCs). Хемотактический эффект этой формы suPAR опосредован формилпептидными рецепторами FPRL1 и FPRL2 на базофилах, FPRL1 – на моноцитах и FPR – на HSCs. Нейтрофилы человека содержат значительный внутриклеточный пул uPAR, локализованный в первичных и третичных гранулах и секреторных везикулах (Plesner et al., 1994; Pedersen et al., 2000). Активация нейтрофилов приводит к быстрой транслокации uPAR из внутриклеточных компартментов на плазматическую мембрану (Plesner et al., 1994). Поскольку активированные нейтрофилы секретируют также сериновые протеазы (нейтрофильную эластазу и урокиназу), способные расщеплять линкерный участок между доменами D1 и 1 D2, мы предположили, что если активация нейтрофилов приводит к секреции suPAR (шеддингу uPAR), образующаяся форма, возможно, является хемотактически активной D2D3 формой рецептора. Таким образом, целью настоящей работы было выяснить возможность секреции растворимой формы урокиназного рецептора (suPAR) нейтрофилами человека в их различных функциональных состояниях и исследовать ее возможное участие в воспалительных процессах. Для этого мы поставили перед собой следующие задачи: 1. Показать возможность секреции suPAR при активации нейтрофилов; 2. Охарактеризовать доменную структуру и возможные хемотактические свойства секретируемого нейтрофилами suPAR; 3. Исследовать механизм образования suPAR при активации нейтрофилов; 4. Оценить секрецию suPAR активированными in vivo нейтрофилами очагов острого воспаления. Научная новизна и практическая значимость работы. В представленной работе впервые показана возможность секреции хемотактически активной D2D3 формы растворимого урокиназного рецептора клетками на примере активированных нейтрофилов человека. Хемотактически активная D2D3 форма растворимого урокиназного рецептора идентифицирована как новый хемоаттрактант, секретируемый активированными нейтрофилами человека. Обнаружен новый механизм образования хемотактически активных белков при активации нейтрофилов (шеддинг и протеолитический процессинг мембранного белка). Обнаружен новый механизм образования растворимого урокиназного рецептора – катализируемый катепсином G шеддинг мембранного урокиназного рецептора. Результаты работы существенно дополняют современные представления о роли нейтрофилов в привлечении других типов лейкоцитов в формирующийся очаг воспаления. Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторном семинаре Факультета Фундаментальной Медицины МГУ им. М.В. Ломоносова (Москва, 2008), на научных конференциях XIth International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation (Saltsobaden, 2007) и Gene Expression and Signaling in the Immune System (Cold Spring Harbor, 2008). Публикации. Результаты работы представлены в 2 статьях и в 2 тезисах докладов. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, изложения результатов, обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы. Работа содержит 125 страниц машинописного текста, 3 таблицы и 24 рисунка. Список литературы включает 281 источник. 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение нейтрофилов периферической крови. Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров согласно методу Boyum (Boyum, 1968). Образцы крови (с 13 mM цитратом натрия в качестве антикоагулянта) смешивали с 6% раствором декстрана T-500 в фосфатно-солевом буфере (PBS) в соотношении 5:1 и инкубировали при комнатной температуре в течении 45 мин. Верхний слой лишенной эритроцитов плазмы наслаивали на Histopaque-1077 в соотношении 2:1 и центрифугировали при 400 g в течении 30 мин при комнатной температуре. После центрифугирования осадок ресуспендировали в 1 мл PBS. Для удаления эритроцитов к ресуспендированному осадку добавляли охлажденную на льду стерильную воду в соотношении 1:5 и инкубировали суспензию в течении 1 мин при постоянном пипетировании. Затем к суспензии добавляли 10-кратный избыток охлажденного на льду PBS и центрифугировали при 250 g в течении 10 мин при 4oC. Осадок промывали 2 раза охлажденным на льду PBS при тех же условиях центрифугирования. Осадок нейтрофилов ресуспендировали в PBS и инкубировали во льду до использования. Выделение нейтрофилов синовиальных жидкостей. Синовиальные жидкости из коленных суставов больных ревматоидным артритом и образцы венозной крови этих больных собирались одновременно методом пункции. В качестве антикоагулянта использовали 130 mM раствор цитрата натрия в соотношении синовиальная жидкость (кровь) : антикоагулянт – 9:1. Нейтрофилы синовиальных жидкостей выделяли согласно методике выделения нейтрофилов периферической крови. Культивирование клеток FPRL1/293. Клетки линии human embryonic kidney (HEK)293, трансфицированные формилпептидным рецептором FPRL1 (обозначаемые далее FPRL1/293), были любезно предоставлены доктором J.M. Wang (National Cancer Institute at Frederick, Frederick, США) и доктором P.M. Murphy (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, США). Клетки FPRL1/293 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, пенициллин и стрептомицин (100 Ед/мл и 100 мкг/мл, соответственно), 1 мМ Lглутамин и 0.8 мг/мл генетицин (G418). Активация нейтрофилов. Непосредственно перед экспериментами по активации нейтрофилы ресуспендировали в солевом растворе Хэнкса (HBSS) в концентрации 106 клеток/мл (для анализа экспрессии uPAR методом проточной цитофлуориметрии), 2×107 клеток/мл (для ферментного иммуносорбентного анализа) или 108 клеток/мл (для иммуноблоттинга), инкубировали в течении 10 мин при 37oC и 5% CO2 и активировали как описано в разделе «Результаты». Эксперименты по активации проводили при 37oC и 5% CO2. Активацию нейтрофилов останавливали помещая образцы в лед. 3 Ферментный иммуносорбентный анализ. Количественный анализ suPAR проводили с помощью набора Human uPAR Quantikine ELISA Kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, США) в соответствии с указаниями производителя. Анализ поверхностной и общей клеточной экспрессии антигенов методом проточной цитометрии. Для анализа поверхностной экспрессии антигенов клетки ресуспендировали в растворе для мечения (PBS, 1% BSA) в концентрации 10 млн/мл. К аликвотам (100 мкл) полученной клеточной суспензии добавляли антиген-специфичные антитела, коньюгированными с флуорохромом (FITC, PE или Alexa Fluor 488), в концентрации, указанной в инструкции производителя. Образцы инкубировали в течение 30 мин при 4оС в темноте. Затем клетки промывали 2 раза ледяным PBS и фиксировали в 400 мкл раствора PBS, содержащего 1% параформальдегид. Для цитофлуориметрического анализа общей клеточной экспрессии антигенов клетки фиксировали в 0.5 мл фиксирующего раствора (PBS, 4% параформальдегид) в течении 20 мин при 4оС. Затем клетки промывали 2 раза ледяным PBS, ресуспендировали в 0.5 мл пермеабилизующего раствора (PBS, 0.1% сапонин) и инкубировали 20 мин при 4оС. После пермеабилизации клетки промывали 2 раза ледяным PBS и ресуспендировали в растворе для мечения, содержащем 0.1% сапонин в концентрации 10 млн/мл. К аликвотам (100 мкл) полученной клеточной суспензии добавляли антиген-специфичные антитела, коньюгированными с флуорохромом, в концентрации, указанной в инструкции производителя. Образцы инкубировали в течение 30 мин при 4оС в темноте. Затем клетки промывали 2 раза ледяным PBS, содержащем сапонин (0.1%) и фиксировали в 400 мкл раствора PBS, содержащего 1% параформальдегид. Полученные образцы анализировали методом проточной цитометрии на приборе FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, США). Экспрессию антигенов выражали в относительных единицах (MFI – mean fluorescent intensity), представляющих среднюю интенсивность флуоресценции в линейной шкале после вычитания неспецифической флуоресценции. Иммуноблоттинг. Белки разделяли с помощью SDS-электрофореза в 12% полиакриламидном геле (Laemmli, 1970). После электрофореза гель уравновешивали в буфере для электропереноса (48 мМ трис, 39 мМ глицин, рН ≈ 9,5; 20% метанол; 0,0375% SDS) в течение 10 мин. Электроперенос осуществляли на PVDF-мембрану, предварительно уравновешенную этим же буфером, в приборе Semi-dry transfer cell Trans-blot® (Bio-Rad Laboratories, Inc.) при постоянном напряжении 25 В в течении 30 мин. Эта, а также все последующие процедуры, проводились при комнатной температуре. После переноса мембрану инкубировали в блокирующем буфере (2% ECL Advance Blocking Reagent (Amersham Biosciences) в TBST (20 mM Tris-HCl, pH 7,6; 150 mM NaCl; 0,1% Tween-20)) в течение 1 ч. После блокирования мембрану инкубировали с первыми антителами, разведенными в блокирующем буфере, в течение 1 ч при перемешивании. От несвязывшихся антител мембрану 4 отмывали в TBST в течение 45 мин, меняя раствор 5 раз. Затем мембрану инкубировали со вторыми антителами (антитела козы к иммуноглобулинам мыши или кролика, коньюгированные с пероксодазой хрена), разведенными в блокирующем буфере, в течение 1 ч при перемешивании. От несвязывшихся антител мембрану отмывали в TBST течение 45 мин, меняя раствор 5 раз. Детекцию белков осуществляли с помощью набора ECL Advance Western Blotting detection Kit (Amersham Biosciences) в соответствии с указаниями производителя. Дегликозилирование suPAR. Для дегликозилирования suPAR использовали Nгликозидазу F Chryseobacterium meningosepticum. Анализируемые супернатанты смешивали с раствором 1% SDS/10% β-меркаптоэтанол в соотношении 9:1 и прогревали в термостате при 96 оС в течении 10 мин. Затем образцы смешивали с 10× буфером для дегликозилирования (0.2 M ацетат натрия, pH 7.5; 0.1 M EDTA; 8% Triton X-100) в соотношении 9:1 и инкубировали с N-гликозидазой F (50 Ед/мл) в течении 20 ч при 37 оС. Далее белки разделяли с помощью 12% SDS электрофореза в полиакриламидном геле и анализировали методом иммуноблоттинга. Анализ дегрануляции нейтрофилов. Влияние используемых в работе ингибиторов на дегрануляцию активированных иономицином нейтрофилов исследовали цитофлуориметрически, анализируя поверхностную экспрессию гранул-специфичных мембранных маркеров CD63 (маркер азурофильных гранул) (Cham and Bainton, 1994) и CD11b (маркер всех других типов гранул) (Lacal et al., 1988). Хемотаксис. Хемотаксис клеток FPRL1/293 к супернатантам нейтрофилов исследовали, используя камеру Бойдена (Neuroprobe, Cabin John, MD, США). Для получения супернатантов неактивированных нейтрофилов клетки (107 клеток/мл в HBSS) инкубировали при 37 оС и 5% СО2 в течении 65 мин. Для получения супернатантов активированных нейтрофилов клетки примировали TNF-α (10 нг/мл) в течении 5 мин и стимулировали IL-8 (10-8 М) в течении 60 мин при тех же условиях культивирования. Затем клеточные суспензии центрифугировали при 250 g в течении 10 мин при 4 оС. Супернатанты центрифугировали повторно при 15 000 g в течении 5 мин при 4 оС. Затем супернатанты концентрировали в 25 раз, используя микроконцентратор Centricon YM-10 (Millipore, Bedford, MA, США). Для удаления из супернатантов suPAR, супернатанты инкубировали с протеин G-агарозой с иммобилизованными моноклональными антителами, специфичными к D1 или D2 доменам suPAR или контрольными неспецифичными мышиными антителами в течении 1 часа при 4 оС при постоянном перемешивании. Далее сорбент удаляли центрифугированием (250 g в течении 3 мин при 4 оС). Клетки FPRL1/293 ресуспендировали в среде для хемотаксиса (DMEM, 1% BSA) в концентрации 106 клеток/мл. Этой суспензией заполняли верхние 5 лунки камеры Бойдена (50 мкл суспензии на лунку). В нижние лунки добавляли обработанные, как описано выше, супернатанты, смешанные с 2× средой для хемотаксиса в соотношении 1:1 (27 мкл на лунку). Клеточная суспензия и супернатант в камере Бойдена разделялись поликарбонатным пористым фильтром с диаметром пор 10 мкм (Neuroprobe, Cabin John, MD, США), покрытым коллагеном I типа (100 нг/мл). Клетки инкубировали в СО2инкубаторе при 37 оС в течении 5 часов. Затем непромигрировавшие клетки очищали с верхней поверхности фильтра, а клетки на нижней поверхности фиксировали в метаноле и окрашивали красителем Diff-Quik. Используя световой микроскоп (× 400), в каждой лунке подсчитывалось количество клеток в шести случайно выбранных секторах. Результаты представлены в виде хемотактических индексов, показывающих во сколько раз количество мигрирующих клеток в ответ на супернатанты превышает количество мигрирующих клеток при их спонтанной миграции (в ответ на среду для хемотаксиса). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Секреция suPAR нейтрофилами, активированными иономицином На первом этапе работы нашей целью было показать принципиальную возможность образования suPAR при активации нейтрофилов. Для этого мы исследовали секрецию suPAR нейтрофилами человека, активированными кальциевым ионофором иономицином, являющимся одним из самых сильных известных активаторов эффекторных функций нейтрофилов (Dahlgren et al., 1992; Sengelov et al., 1993). Неактивированные нейтрофилы спонтанно секретировали suPAR в культуральную среду (рис. 1А). Активация клеток иономицином (10-6 М) быстро (в течение нескольких минут) потенцировала секрецию suPAR и через 30 мин после начала стимуляции содержание антигена в культуральных средах активированных нейтрофилов превышало таковое в нестимулированном контроле в 24 ± 4.3 (среднее ± SEM, n = 4) раз. Накопление suPAR в культуральных средах было подтверждено методом иммуноблота с использованием поликлональных анти-uPAR антител (рис. 1Б). Экспрессия uPAR на нейтрофилах оценивалась методом проточной цитофлуориметрии. Иономицин вызывал быстрое 15-кратное увеличение поверхностной экспрессии uPAR, которое достигало пика через 10 мин после начала активации (рис. 2А,В). Более продолжительная активация клеток иономицином (от 10 до 60 мин) приводила к существенному снижению экспрессии uPAR на плазматической мембране нейтрофилов; поверхностная экспрессия uPAR на активированных клетках, однако, оставалась существенно выше по сравнению с контролем. Поскольку нейтрофилы содержат мобилизуемые внутриклеточные депо uPAR, общая клеточная экспрессия uPAR измерялась в клетках, пермеабилизованных сапонином. При активации 6 нейтрофилов иономицином наблюдалось зависимое от времени снижение общей клеточной экспрессии uPAR (рис. 2Б,Г). Общая клеточная экспрессия uPAR снижалась примерно в 2 раза после 30 мин стимуляции и падала еще сильнее к 60 мин. Суммируя эти данные, можно заключить, что помимо описанной ранее транслокации внутриклеточного uPAR на плазматическую мембрану (Plesner et al., 1994), активация нейтрофилов иономицином приводит также к быстрой секреции suPAR, что сопровождается снижением общей клеточной экспрессии uPAR. Б suPAR (пг/106 клеток) А 900 750 600 450 300 150 0 * 75 − 50 − 37 − * 20 − 20 40 Время (мин) 2 ← suPAR ← D2D3 25 − * 0 1 ← D1 60 Рис. 1. Влияние иономицина на секрецию suPAR нейтрофилами человека. А. Нейтрофилы (107 клеток/мл) инкубировали в отсутствие () и в присутствии ( ) иономицина (10-6 М) в течении различных промежутков времени. Супернатанты затем анализировали методом ферментного иммуносорбентного анализа. Представлены средние данные четырех независимых экспериментов (среднее ± SEM); *, р < 0.01 в сравнении с неактивированным контролем. Б. Нейтрофилы (108 клеток/мл) инкубировали в отсутствии (дорожка 1) и в присутствии (дорожка 2) иономицина (10-6 М) в течении 30 мин. Супернатанты затем анализировали методом иммуноблота. В качестве антигенспецифичных антител использовали кроличьи поликлональные антитела к uPAR человека. Представлены данные одного из четырех независимых экспериментов. 2. Секреция suPAR нейтрофилами, активированными провоспалительными медиаторами Для того, чтобы показать, секретируется ли suPAR нейтрофилами человека в ответ на их активацию физиологическими агонистами, клетки стимулировали бактериальным формилированным трипептидом fMLP или провоспалительными цитокинами TNF-α и IL-8. Мы обнаружили, что fMLP, TNF-α и IL-8 per se являются слабыми активаторами секреции suPAR нейтрофилами человека (рис. 3). Небольшое (примерно 1.5-2 раза) увеличение продукции suPAR наблюдалось только при стимуляции клеток 7 * * 0 В Количество клеток 0 20 40 60 80 100 ** 20 40 Время (мин) 60 иономицин 0 1 2 * * * 0 20 40 Время (мин) 60 Г IgG контроль контроль контроль 10 700 600 500 400 300 200 100 0 3 10 10 10 Log интенсивности флуоресценции 20 40 60 80 100 * 0 400 350 300 250 200 150 100 50 0 MFI (условные единицы) Б Количество клеток MFI (условные единицы) А 4 10 IgG контроль контроль иономицин 0 10 1 2 3 10 10 10 Log интенсивности флуоресценции 4 10 Рис. 2. Влияние иономицина на поверхностную и общую клеточную экспрессию uPAR нейтрофилами человека. А,Б. Нейтрофилы (106 клеток/мл) инкубировали в отсутствие () и в присутствии ( ) иономицина (10-6 М) в течении различных промежутков времени. Клетки затем анализировали цитофлуориметрически и определяли поверхностную (А) и общую клеточную (Б) экспрессию uPAR. Результаты представлены как средние интенсивности флуоресценции (MFI) 10000 клеток, полученные в четырех независимых экспериментах (MFI ± SEM); *, р < 0.01 в сравнении с неактивированным контролем. В,Г. Нейтрофилы (106 клеток/мл) инкубировали в отсутствии и в присутствии иономицина (10-6 М) в течении 30 мин. Клетки затем анализировали цитофлуориметрически и определяли поверхностную (В) и общую клеточную (Г) экспрессию uPAR. Результаты представлены в виде распределения 10000 клеток по поверхностной (В) и общей клеточной (Г) экспрессии uPAR. Представлены данные одного из четырех независимых экспериментов. 8 suPAR (пг/106 клеток) А 250 * 200 150 * 100 50 0 TNF-α (нг/мл) − fMLP (M) − suPAR (пг/106 клеток) Б * * − − 10 -7 -6 − 10 10 1 10 10 100 -7 10 -7 -7 10 10 100 1 10 -6 10 -6 180 10 -6 * 150 * 120 * * 90 60 30 0 TNF-α (нг/мл) − − IL-8 (M) − 10 − -8 -7 10 10 1 − 10 10 100 -8 10 -8 10 -8 10 100 1 10 -7 10 -7 -7 10 Рис. 3. Влияние хемоаттрактантов fMLP (A) и IL-8 (Б) на секрецию suPAR TNF-α-примированными нейтрофилами человека. А. Нейтрофилы (107 клеток/мл) инкубировали в отсутствие и в присутствии указанных концентраций TNF-α в течении 5 мин (этап прайминга), затем клетки инкубировали при тех же условиях в отсутствии и в присутствии указанных концентраций fMLP в течении последующих 25 мин (этап стимуляции хемоаттрактантом). Супернатанты анализировали методом ферментного иммуносорбентного анализа. Представлены средние данные пяти независимых экспериментов (среднее ± SEM); *, р < 0.01 в сравнении с неактивированным контролем. Б. Эксперименты проводили как описано выше, но вместо fMLP использовали указанные концентрации IL-8. 9 максимальными концентрациями указанных агонистов (10-6 М – fMLP, 100 нг/мл – TNF-α и 10-7 М – IL-8). Однако при примировании клеток TNF-α и последующей их стимуляции fMLP или IL-8 мы наблюдали существенный потенцирующий эффект TNF-α на fMLP- или IL-8-индуцированную секрецию suPAR (рис. 3А,Б). Существенное синергичное увеличение продукции suPAR наблюдалось, когда клетки примировались в течение 5 мин TNF-α и затем активировались в течение 25 мин fMLP или IL-8. В то время как активация нейтрофилов fMLP, TNF-α или IL-8 потенцировала продукцию suPAR не более чем в 2 раза, примирование клеток TNF-α и их последующая стимуляция fMLP или IL-8 приводили к вплоть до 8-кратному увеличению продукции suPAR в сравнении с нестимулированным контролем (рис. 3А,Б). Активация нейтрофилов fMLP, TNF-α или IL-8 не приводила к статистически значимому изменению обшей клеточной экспрессии uPAR (данные не приведены). Однако примирование нейтрофилов TNF-α и их последующая fMLP- или IL-8-индуцированная активация приводили к небольшому (до 20% через 30 мин после начала активации нейтрофилов), но статистически значимому (p < 0.05) снижению обшей клеточной экспрессии uPAR (данные не приведены). Таким образом, секреция suPAR происходит не только в ответ на фармакологические активаторы, такие как иономицин, но индуцируется также физиологическими агонистами, что свидетельствует о возможной физиологической значимости исследуемого феномена. 3. Доменная организация секретируемого нейтрофилами suPAR Для анализа доменной структуры секретируемого suPAR, супернатанты неактивированных и активированных клеток анализировались методом иммуноблота. uPAR, являющийся N-гликопротеином, сильно и гетерогенно гликозилирован (Behrendt et al., 1990) и точная идентификация отдельных форм рецептора методом иммуноблота оказывается затруднительной (рис. 1Б и 4А). Поэтому образцы дегликозилировались N-гликозилазой F перед электрофоретическим разделением белков для иммуноблота. Такая обработка приводит к расщеплению N-гликозидных связей в гликопротеинах и, следовательно, получению дегликозилированных форм N-гликопротеинов. Процедура дегликозилирования образцов перед иммуноблотом приводит к аккуратному разделению полноразмерной и D2D3 форм suPAR (рис. 4Б). Поскольку дегликозилирование белков приводит к снижению их молекулярной массы, дегликозилированные полноразмерная и D2D3 формы suPAR обнаруживают бóльшую электрофоретическую подвижность (кажущиеся молекулярные массы 40 и 30 kDa, соответственно), чем негликозилированные формы. Рис. 4Б показывает, что активация нейтрофилов потенцирует секрецию 10 обеих форм suPAR, при этом D2D3 форма suPAR является основной формой растворимого рецептора, секретируемого нейтрофилами. А 75 − 50 − 37 − 1 2 3 Б 4 75 − 50 − 37 − ← suPAR ← D2D3 25 − 25 − 20 − 20 − 1 2 3 4 ← suPAR ← D2D3 Рис. 4. Доменная организация секретируемого нейтрофилами suPAR. А. Нейтрофилы (108 клеток/мл) инкубировали в отсутствие (дорожка 1) и в присутствии (дорожка 2) иономицина (10-6 М) в течении 30 мин. Нейтрофилы также примировали в течении 5 мин TNF-α (10 нг/мл) и стимулировали в течении 25 мин fMLP (10-7 M) (дорожка 3) или IL-8 (10-8 M) (дорожка 4) при тех же условиях культивирования. Супернатанты анализировали методом иммуноблота. В качестве первых антигенспецифичных антител использовали мышиные моноклональные антитела к домену D2 uPAR человека. Представлены данные одного из четырех независимых экспериментов. Б. Эксперимент проводили как описано выше, но белки супернатантов перед анализом методом иммуноблота подвергали дегликозилированию N-гликозидазой F. Представлены данные одного из четырех независимых экспериментов. 4. Хемотактические свойства секретируемого нейтрофилами suPAR D2D3 форма suPAR, содержащая эпитоп SRSRY (аминокислотные остатки 88-92) является хемоаттрактантом и взаимодействует с формилпептидными рецепторами, тогда как D2D3 форма suPAR, лишенная этого эпитопа, свойств хемоаттрактанта не обнаруживает. Для того, чтобы выяснить, является ли секретируемая нейтрофилами D2D3 форма suPAR хемоаттрактантом, мы исследовали возможный вклад этого белка в способность супернатантов активированных нейтрофилов индуцировать хемотактический ответ клеток HEK293, трансфицированных формилпептидным рецептором FPRL1 (клеток FPRL1/293). Идея этого эксперимента заключается в том, что если нейтрофилы секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR, взаимодействующую с FPRL1, то удаление этой формы из супернатантов с помощью домен-специфичных антител, коньюгированных с протеин Gагарозой, будет приводить к снижению прохемотактических свойств супернатантов к клеткам FPRL1/293. 11 В качестве анализируемых супернатантов использовались супернатанты TNF-α-примированных и IL-8-активированных нейтрофилов человека. Клетки HEK293 не экспрессируют рецепторы IL-8 CXCR1 и CXCR2 (Matityahu et al., 2002), но некоторые клоны этих клеток экспрессируют рецепторы TNF-α – TNFRI и TNFRII (McFarlane et al., 2002; Todd et al., 2004). Для того, чтобы исключить возможный эффект TNF-α, который присутствует в супернатантах TNF-α-примированных и IL-8-стимулированных нейтрофилов, на хемотактический ответ клеток FPRL1/293, в отдельных экспериментах мы использовали нейтрализующие анти-TNF-α моноклональные антитела в Б 1.5 6 5 Хемотактический индекс Хемотактический индекс А * 4 3 2 1 0 WRW4 – + – – анти-D2 – + анти-D1 – – – IgG – – 1 0.5 – 0 WRW4 – + – – – – – анти-D2 – + – – – + – анти-D1 – – – – + – – – + IgG – – – – + Рис. 5. Влияние супернатантов TNF-α-примированных и IL-8-активированных (А) и неактивированных (Б) нейтрофилов человека на хемотаксис клеток FPRL1/293. А. Нейтрофилы (107 клеток/мл) инкубировали в присутствии TNF-α (10 нг/мл) в течении 5 мин (этап прайминга), затем клетки инкубировали при тех же условиях в присутствии IL-8 (10-8 M) в течении последующих 60 мин (этап стимуляции хемоаттрактантом). Прохемотактические свойства супернатанта анализировали в камере Бойдена, используя клетки FPRL1/293 в качестве тестируемых клеток. Эксперименты проводили в отсутствие и в присутствии гексапептида WRW4 (10 мкМ). В отдельных экспериментах из супернатантов удаляли suPAR с использованием моноклональных антител, специфичных к доменам D2 (анти-D2) или D1 (анти-D1) uPAR, а также использовали неспецифичные мышиные антитела (IgG) в качестве контроля. Представлены средние данные шести независимых экспериментов (среднее ± SEM); *, p < 0.01. Б. Эксперименты проводили как описано выше, но вместо супернатантов активированных нейтрофилов использовали супернатанты неактивированных клеток. 12 концентрациях, блокирующих биологическую активность этого цитокина, но не обнаружили статистически значимого эффекта этих антител на хемотактический ответ клеток FPRL1/293 (данные не приведены). Удаление D2D3 формы suPAR с использованием антител, специфичных к D2 домену uPAR, приводило к существенному (35 ± 7.8 %, р < 0.01, n = 6) ингибированию хемотаксиса клеток FPRL1/293 (рис. 5А). Напротив, использование антител, специфичных к D1 домену uPAR, или контрольных неспецифических мышиных антител не приводило к заметному изменению хемотактического ответа клеток FPRL1/293 (рис. 5А). Специфический антагонист рецептора FPRL1 гексапептид WRW4 практически полностью блокировал хемотаксис клеток FPRL1/293 к тестируемым супернатантам (рис. 5А). Суммируя все эти данные, можно сделать вывод, что TNF-αпримированные и IL-8-стимулированные нейтрофилы секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR, при этом хемотактический эффект этого белка опосредован его взаимодействием с формилпептидным рецептором FPRL1. Супернатанты неактивированных нейтрофилов вызывали слабый хемотактический ответ FPRL1/293 клеток (хемотактический индекс 1.35 ± 0.11, n = 6) и удаление D2D3 формы suPAR из этих супернатантов не приводило к статистически значимым изменениям в хемотаксисе клеток FPRL1/293 (рис. 5Б). 5. Механизм образования suPAR при активации нейтрофилов К настоящему времени показано, что образование suPAR из мембраносвязанной формы белка может катализироваться двумя ферментами: GPI-специфичной фосфолипазой D (GPI-PLD) (Wilhelm et al., 1999) и катепсином G (Beaufort et al., 2004). Возможность шеддинга uPAR катепсином G продемонстрирована только при добавлении рекомбинантного белка к uPARэкспрессирующим клеткам (моноцитам и моноцитарным клеточным линиям) (Beaufort et al., 2004). Поскольку катепсин G локализован в первичных гранулах нейтрофилов и секретируется при активации клеток, мы предположили, что этот фермент может участвовать в шеддинге uPAR при активации нейтрофилов. Для проверки этого предположения секреция uPAR неактивиронными и активированными нейтрофилами анализировалась в присутствии физиологического ингибитора катепсина G – α1-антихимотрипсина. Этот белок существенно (примерно на 60%) подавлял продукцию suPAR нейтрофилами, активированными иономицином и в меньшей степени (примерно на 25% – 30%) ингибировал секрецию suPAR TNF-α-примированными и fMLP- или IL-8стимулированными нейтрофилами (Таблица I). Интересно, что α1антихимотрипсин не влиял на спонтанную секрецию suPAR неактивированными нейтрофилами. 13 Таблица I. Влияние α1-антихимотрипсина, TAPI-1, GM6001, 1,10-фенантролина, TPEN and DTPA на секрецию suPAR неактивированными и активированными нейтрофилами человека. Нейтрофилы (107 клеток/мл) инкубировали в отсутствие (контроль) и в присутствии иономицина (10-6 М) в течении 30 мин. Нейтрофилы также примировали TNF-α (10 нг/мл) в течении 5 мин и стимулировали fMLP (10-7 M) или IL-8 (10-8 M) в течении последующих 25 мин при тех же условиях культивирования. Указанные инкубации проводились в отсутствие (–) и в присутствии α1-антихимотрипсина (α1-ACT) (1 мкМ), TAPI-1 (100 мкМ), GM6001 (25 мкМ), 1,10-фенантролина (1,10-Phth) (4 мМ), TPEN (100 мкМ) и DTPA (50 мкМ). Супернатанты анализировали методом ферментного иммуносорбентного анализа. Представлены средние данные четырех независимых экспериментов (среднее ± SEM); *, р < 0.01 в сравнении с пробами без ингибитора. ингибитор контроль – α1-ACT TAPI-1 GM6001 1,10-Phth TPEN DTPA 26.7 ± 3.1 25.2 ± 4.3 26.94 ± 6.1 26.14 ± 3.9 (19.7 ± 6.8)* 26.14 ± 4.3 26.40 ± 3.5 suPAR (пг/106 клеток) иономицин TNF-α + fMLP 445 ± 51.7 128.3 ± 10.1 (267 ± 65.6)* (89.8 ± 12.2)* 471.7 ± 51.6 125.73 ± 9.8 431.65 ± 53.1 130.87 ± 10.3 (146.8 ± 21.3)* (55.2 ± 12.7)* 427.2 ± 49.3 126.72 ± 8.4 458.35 ± 44.9 124.16 ± 11.2 TNF-α + IL-8 93.3 ± 7.2 (69.87 ± 9.7)* 96.23 ± 10.1 91.05 ± 8.2 (34.5 ± 11.9)* 90.5 ± 6.9 95.17 ± 7.5 Поскольку нейтрофилы человека содержат значительный пул внутриклеточного uPAR, подавление образования suPAR при активации нейтрофилов α1-антихимотрипсином может быть результатом ингибирования дегрануляции клеток и, как следствие, транслокации uPAR на клеточную поверхность. Для исследования влияния ингибиторов на дегрануляцию нейтрофилов мы использовали метод оценки экзоцитоза гранул, основанный на цитофлуориметрическом анализе поверхностной экспрессии гранулспецифичных мембранных маркеров: CD63 (маркер азурофильных гранул) и CD11b (маркер всех остальных типов гранул). α1-Антихимотрипсин не влиял на индуцированную иономицином транслокацию CD63 и CD11b из гранул на плазматическую мембрану нейтрофилов и, следовательно, не является ингибитором дегрануляции (Таблица II). Таким образом, подавление α1антихимотрипсином секреции suPAR активированными нейтрофилами является следствием ингибирования шеддинга uPAR, а не подавления экзоцитоза uPAR-содержащих гранул. 14 Таблица II. Влияние α1-антихимотрипсина, TAPI-1, GM6001, 1,10-фенантролина, TPEN and DTPA на индуцированную иономицином дегрануляцию нейтрофилов человека. Нейтрофилы (106 клеток/мл) инкубировали в отсутствии и в присутствии иономицина (ион) (10-6 М) в течении различных (5, 10 и 15 мин) временных интервалов. Инкубации с иономицином проводились в отсутствие и в присутствии α1антихимотрипсина (α1-ACT) (2 мкМ), TAPI-1 (100 мкМ), GM6001 (25 мкМ), 1,10фенантролина (1,10-Phth) (4 mM), TPEN (100 мкМ) и DTPA (50 мкМ). Клетки затем анализировали цитофлуориметрически и определяли поверхностную экспрессию CD11b и CD63. Результаты представлены как средние интенсивности флуоресценции (MFI) 10000 клеток, полученные в четырех независимых экспериментах (MFI ± SEM); *, р < 0.01 в сравнении с неактивированным контролем. поверхностная экспрессия CD11b 5’ 15’ 30’ − ион 310 ± 319 ± 8.4 332 ± 10.5 11.5 + ион 1887 ± 1915 ± 1823 ± 15.6 22.1 19.6 + ион + 1937 ± 1954 ± 1936 ± 42.8 16.1 α1-ACT 31.5 + ион + 2054 ± 2123 ± 2017 ± TAPI-1 51.2 39.3 42.8 + ион + 1768 ± 1821 ± 1728 ± GM6001 38.5 51.4 43.9 + ион + (954 ± (984 ± (1054 ± 1,1049.6)* 64.9)* 39.5)* Phth + ион + 1894 ± 1828 ± 1897 ± TPEN 19.8 46.5 32.1 + ион + 1956 ± 1885 ± 1823 ± DTPA 12.3 34.0 19.2 поверхностная экспрессия CD63 5’ 15’ 30’ 42 ± 3.1 41 ± 2.7 45 ± 3.4 580 ± 9.8 540 ± 446 ± 12.4 11.2 587 ± 7.9 534 ± 9.1 460 ± 9.5 601 ± 11.3 571 ± 10.8 (195 ± 16.1)* 585 ± 469 ± 10.7 12.6 545 ± 9.3 431 ± 15.1 (215 ± (170 ± 21.7)* 19.4)* 567 ± 8.6 559 ± 13.3 595 ± 580 ± 11.4 10.1 437 ± 12.9 470 ± 9.5 Поскольку шеддинг многочисленных мембранных белков обусловлен металлопротеиназами TACE (TNF-α-converting enzyme)-семейства, мы исследовали влияние ингибиторов металлопротеиназ широкого спектра действия – TAPI-1 (TNF-α Protease Inhibitor-1) и GM6001 на секрецию suPAR неактивированными и активированными нейтрофилами. Эти ингибиторы не 15 оказывали статистически значимого эффекта на дегрануляцию активированных нейтрофилов (Таблица II), но также не влияли на продукцию suPAR даже при их максимальных концентрациях, используемых при работе с клетками (Таблица I). Следовательно, металлопротеиназы не участвуют в секреции suPAR нейтрофилами человека. Как было отмечено выше, GPI-PLD катализирует шеддинг uPAR в раковых клетках. К настоящему времени не обнаружено специфического ингибитора GPI-PLD и для того, чтобы показать участие этого цинк-зависимого фермента в изучаемых процессах используются различные хелаторы цинка (Metz et al., 1994; Mann et al., 2004). В нашей работе мы использовали проникающие в клетку (1,10-фенантролин и TPEN) и непроникающие (DTPA) хелаторы цинка. Секреция suPAR нейтрофилами существенно подавлялась в присутствии 1,10-фенантролина, но не в присутствии TPEN и DTPA (Таблица I). Однако в отличие от TPEN и DTPA, 1,10-фенантролин ингибировал дегрануляцию нейтрофилов (Таблица II). Таким образом, влияние 1,10фенантролина на продукцию suPAR объясняется, по-видимому, его способностью подавлять дегрануляцию, а не шеддинг uPAR. Отсутствие эффекта TPEN и DTPA на образование suPAR нейтрофилами указывает на то, что секреция suPAR этими клетками является GPI-PLD-независимой. 6. Секреция suPAR нейтрофилами очагов острого воспаления В предшествующей части работы мы показали, что культивируемые in vitro нейтрофилы человека в ответ на определенные активирующие воздействия секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR. Известно, что активация нейтрофилов in vivo происходит в очагах острого воспаления. Для того, чтобы охарактеризовать секрецию suPAR активированными нейтрофилами очагов воспаления, мы провели сравнительный анализ парных образцов синовиальной жидкости (СЖ) и периферической крови (ПК) больных ревматоидным артритом. Нейтрофилы СЖ и ПК, выделенные в идентичных условиях, культивировались in vitro в течении 30 мин, после чего концентрация suPAR в супернатантах анализировалась ферментным иммуносорбентным анализом. Как видно на рис. 6А, нейтрофилы СЖ продуцировали существенно бόльшее количество suPAR, чем нейтрофилы ПК (83.3 ± 10.5 пг/30 мин/106 клеток и 26.3 ± 2.7 пг/30 мин/106 клеток suPAR, соответственно). Анализ супернатантов методом иммуноблота показал, что нейтрофилы из двух сравниваемых источников секретируют преимущественно D2D3 форму suPAR (рис. 6В,С). Для того, чтобы продемонстрировать хемотактические свойства suPAR, секретируемого нейтрофилами СЖ, мы использовали экспериментальный подход, подробно описанный выше. Сначала мы проанализировали способность супернатантов культивируемых in vitro нейтрофилов СЖ индуцировать хемотаксис клеток FPRL1/293. Рис. 9А показывает, что эти супернатанты 16 вызывали существенный хемотактический ответ клеток FPRL1/293 (хемотактический индекс 4.1 ± 0.2, n = 6), который был полностью подавлен в присутствии ингибитора рецептора FPRL1 гексапептида WRW4. Затем мы анализировали прохемотактические свойства супернатантов с удаленным методом иммунопреципитации suPAR. Удаление suPAR из исследуемых супернатантов с использованием моноклональных антител, специфичных к suPAR (пг/106 клеток) А Б 100 * ПК 75 − 80 50 − 60 37 − 40 СЖ ← suPAR ← D2D3 25 − 20 20 − 0 ПК СЖ В ПК СЖ 75 − 50 − ← suPAR 37 − ← D2D3 25 − 20 − Рис. 6. Спонтанная секреция suPAR нейтрофилами периферической крови и синовиальной жидкости коленных суставов пациентов с ревматоидным артритом. Нейтрофилы выделяли из парных образцов периферической крови (ПК) и синовиальной жидкости (СЖ) пациентов с ревматоидным артритом. Нейтрофилы (108 клеток/мл) инкубировали при 37 оС и 5% СО2 в течении 30 мин. Супернатанты затем анализировали методом ферментного иммуносорбентного анализа (А), методом иммуноблота без дегликозилирования белков (Б) и методом иммуноблота с предшествующим дегликозилированием белков N-гликозидазой F (В). Представлены средние данные шести независимых экспериментов (среднее ± SEM); *, р < 0.05 (А) и одного из трех независимых экспериментов (Б и В). 17 А Б 1.5 Хемотактический индекс Хемотактический индекс 5 4 * 3 2 1 1 0.5 – 0 WRW4 – + – – – – – анти-D2 – + – – – + – анти-D1 – – – – + – – – + IgG – – – – + 0 WRW4 – + – – анти-D2 – + анти-D1 – – – IgG – – Рис. 7. Нейтрофилы синовиальной жидкости коленных суставов пациентов с ревматоидным артритом секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR. Нейтрофилы выделяли из парных образцов синовиальной жидкости (А) и периферической крови (Б) пациентов с ревматоидным артритом. Нейтрофилы (107 клеток/мл) инкубировали при 37 оС и 5% СО2 в течении 60 мин. Прохемотактические свойства супернатантов анализировали в камере Бойдена, используя клетки FPRL1/293 в качестве тестируемых клеток. Эксперименты проводили в отсутствии и в присутствии гексапептида WRW4 (10 мкМ). В отдельных экспериментах из супернатантов удаляли suPAR с использованием моноклональных антител, специфичных к доменам D2 или D1 uPAR, а также использовали неспецифичные мышиные антитела (IgG) в качестве контроля. Представлены средние данные шести независимых экспериментов (среднее ± SEM); *, p < 0.01. домену D2 uPAR, приводило к статистически значимому снижению хемотаксиса клеток FPRL1/293 (на 41 ± 6.3 %, р < 0.01, n = 6). Использование моноклональных антител, специфичных к домену D1 uPAR, а также контрольных неспецифичных антител мыши, не вызывало статистически значимого изменения в хемотаксисе клеток FPRL1/293 (рис. 7А). Суммируя все эти данные, можно заключить, что нейтрофилы СЖ секретируют хемотактически активную D2D3 форму suPAR, являющуюся лигандом рецептора FPRL1. В отличие от супернатантов культивируемых in vitro нейтрофилов СЖ, супернатанты культивируемых нейтрофилов ПК вызывали слабый хемотактический ответ клеток FPRL1/293 (хемотактический индекс 1.29 ± 0.09, 18 n = 6) и удаление D2D3 формы suPAR из этих супернатантов не приводило к статистически значимым изменениям в хемотаксисе клеток FPRL1/293 (рис. 7Б). Последнее свидетельствует о том, что даже если хемотактически активная D2D3 форма suPAR и секретируется нейтрофилами ПК (и мы не можем показать это из-за недостаточной чувствительности метода), то в значительно меньших количествах, чем нейтрофилами СЖ. Поскольку концентрация suPAR в СЖ существенно выше, чем в ПК (5.8 ± 0.3 нг/мл и 1.4 ± 0.2 нг/мл suPAR, соответственно), мы предполагаем, что возможно существование концентрационного градиента хемотактически активной D2D3 формы suPAR между очагом воспаления и невоспаленной тканью, в создании которого участвуют активированные нейтрофилы очага воспаления, представляющие основную (80-90%) клеточную популяцию СЖ. Этот концентрационный градиент хемотактически активной D2D3 формы suPAR может участвовать в рекрутировании экспрессирующих формилпептидные рецепторы лейкоцитов в формирующиеся очаги острого воспаления (рис. 8). воспаленная ткань 2 1 нейтрофилы . . . . . IL-8, . . . . GRO-α, … ... мононуклеарные лейкоциты хемоаттрактанты suPAR 3 Рис. 8. Гипотетическая роль хемотактически активной D2D3 формы suPAR в иммунном ответе. Нейтрофилы являются первыми клетками, мигрирующими в области повреждения тканей и проникновения инфекции (1). В формирующемся очаге воспаления нейтрофилы активируются и секретируют многочисленные хемоаттрактанты (2), рекрутирующие другие типы лейкоцитов в воспаленную ткань (3). Согласно этому сценарию, хемотактически активная D2D3 форма suPAR, образуемая активированными нейтрофилами в очаге воспаления, может участвовать в рекрутировании экспрессирующих формилпептидные рецепторы лейкоцитов в воспаленную ткань. 19 ВЫВОДЫ 1. Впервые показано, что хемотактически активная D2D3 форма suPAR может секретироваться культивируемыми in vitro клетками (активированными нейтрофилами человека); 2. Обнаружен новый хемоаттрактант, секретируемый активированными нейтрофилами, и новый путь образования хемотактически активных белков (шеддинг и сопутствующий протеолитический процессинг мембранного белка) при активации нейтрофилов; 3. Катепсин G-зависимый шеддинг uPAR идентифицирован как механизм, частично опосредующий образование suPAR при активации нейтрофилов. Участие GPI-специфичной фосфолипазы D (GPI-PLD), а также металлопротеиназ, в образовании suPAR нейтрофилами человека не выявлено; 4. Показано, что активированные нейтрофилы очагов воспаления (синовиальных жидкостей больных ревматоидным артритом) секретируют бóльшие количества хемотактически активной D2D3 формы suPAR, чем циркулирующие нейтрофилы периферической крови. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Pliyev B.K., Tkachuk V.A. “Activated human neutrophils rapidly release the chemotactically active D2D3 form of the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR/CD87)”. Abstracts of XIth International Workshop on Molecular and Cellular Biology of Plasminogen Activation, Saltsobaden, 2007, p. 26. 2. Pliyev B.K., Tkachuk V.A. “Activated human neutrophils shed the chemotactically active D2D3 form of the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR/CD87)”. Abstracts of the meeting Gene Expression and Signaling in the Immune System, Cold Spring Harbor, 2008, p. 39. 3. Плиев Б.К. “Хемотактически активные белки нейтрофилов”, Биохимия, 2008, 73(9), 1206-1223. 4. Pliyev B.K. “Activated human neutrophils rapidly release the chemotactically active D2D3 form of the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR/CD87)”, Mol. Cell. Biochem., in press – http://dx.doi.org/10.1007/s11010008-9925-z. 20
