Лейкостимулирующее действие фрагментов

Е.В. Долгова1, В.А. Рогачев1, В.П. Николин1, Н.А. Попова1, А.С. Лихачева1, Е.А.
Алямкина1, Т.Е. Себелева1, Е.Р. Черных2, Е.Л. Гельфгат2, С.С. Богачев1, М.А. Шурдов3
ЛЕЙКОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ФРАГМЕНТОВ ЭКЗОГЕННОЙ ДНК,
ЗАЩИЩЕННЫХ ПРОТАМИНОМ, ПРИ ВЫЗВАННОЙ ЦИКЛОФОСФАНОМ
МИЕЛОСУПРЕССИИ МЫШЕЙ
1
Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, 2 Научно-исследовательский
институт клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск, 3 ООО «Панаген»
В нашей работе мы продемонстрировали, что протамин в соотношении 80% к ДНК по
массе полностью защищает молекулы ДНК от деградации под действием нуклеаз,
естественно присутствующих в сыворотке крови млекопитающих. Было показано, что
экзогенная ДНК, связанная с протамином, эффективно стимулирует восстановление
лейкопоэза у мышей после воздействия циклофосфана. Предполагается, что экзогенная
ДНК, попадая в организм экспериментальных животных, стимулирует репаративные
процессы
в
стволовых
кроветворных
клетках,
подвергшихся
действию
кросслинкирующего цитостатика циклофосфана. Связывание ДНК с протамином
позволяет уменьшить количества вводимой ДНК и сохранить исходный размер
фрагментов, что способствует вовлечению более продолжительных участков хроматина в
репаративную гомологичную рекомбинацию, в конечном счете, увеличивая шанс клетки
избавиться от возникших многочисленных повреждений.
Ключевые слова: протамин, циклофосфан, экзогенная ДНК, межцепочечная сшивка,
лейкостимуляция.
При воздействии на организм алкилирующих цитостатиков, таких как циклофосфан, в
молекулах ДНК активно делящихся клеток образуются межцепочечные сшивки. В случае
если репаративной системе клетки не удается репарировать все такие повреждения, клетка
с неизбежностью вступает на путь апоптотического самоуничтожения. Циклофосфан и его
аналоги широко используются при химиотерапии онкологических заболеваний для
уничтожения опухолевых клеток. Однако при использовании указанных цитостатиков
кроме раковых клеток гибнут клетки крови, клетки волосяных фолликул и эпителия
кишечника. В том числе циклофосфан воздействует и на лейкоциты на всех этапах
созревания. Лейкоциты для продолжения дифференцировки должны репарировать
возникшие двуцепочечные разрывы, которые появляются в результате остановки
репликативной вилки, наталкивающейся на препятствие в виде сшивки цепей ДНК.
1
Двуцепочечные разрывы нити ДНК хромосомы являются летальным повреждением,
активирующим клеточные процессы, направленные на его репарацию. После того, как
клетка опознает повреждение, активируется система передачи сигнала, состоящая из
нескольких
трансдуцирующих
молекулярных
событий,
киназ.
Сигнальные
определяющих
арест
киназы
клеточного
запускают
цикла
и
каскад
активацию
репаративных систем. В конечном счете, включается система репаративной гомологичной
рекомбинации, которая использует для репарации донорные последовательности
сестринской
хроматиды
или
гомологичной
хромосомы.
Однако
при
наличии
множественных повреждений возникают стерические препятствия для протекания
процесса
рекомбинации
или
сказывается
недостаток
репаративных
комплексов,
осуществляющих репарацию, и клетка оказывается неспособной устранить возникшие
повреждения и вступает в апоптоз.
Фрагменты экзогенной ДНК экстрахромосомальной локализации могут быть
востребованы в качестве субстрата при репарации двуцепочечных разрывов [5, 6]. В
результате такого участия основная масса повреждений будет репарирована, целостность
хромосом восстановлена. И, как следствие, будет сохранена вся генетическая
информация, необходимая для дальнейшего созревания лейкоцитов.
Экспериментально было показано, что введение мышам препаратов экзогенной
фрагментированной ДНК, очищенной безфенольным способом, после воздействия
цитостатика
циклофосфана
приводит
к
стимуляции
лейкопоэза
и
быстрому
восстановлению количества лейкоцитов в периферической крови [2].
Любая незащищенная ДНК, попавшая в кровь, практически мгновенно подвергается
воздействию нуклеаз, что приводит к ее деградации до размера ~ 200 п.н. [3]. Для
достижения плейотропного [1, 2, 5, 6, 8] терапевтического эффекта, связанного с размером
вводимой ДНК, участвующей затем в различных типах репаративной гомологичной
рекомбинации, количество экзогенной ДНК, вводимой в организм, составляло суммарно
до 6 мг на животное, что многократно превышало физиологическую норму,
составляющую 10 – 14 нг/мл крови.
Мы предположили, что сформированный комплекс ДНК и протамина сделает
фрагменты экзогенной ДНК устойчивыми к действию нуклеаз кровяного русла [3] без
изменения терапевтической активности. Это позволит уменьшить количества вводимой
ДНК и сохранить исходный размер вводимых в кровь фрагментов, что позволит создать
условия для вовлечения более продолжительных участков хроматина в репаративную
гомологичную рекомбинацию, что увеличит шанс клетки избавиться от возникших
повреждений, находящихся в зоне гомологичного обмена.
2
Материалы и методы
Исследования проводились на мышах-самцах линии CBA разводки вивария Института
цитологии и генетики СО РАН. Мышей содержали в пластиковых клетках по 10 особей в
каждой со свободным доступом к пище и воде.
Препараты человеческой ДНК получали из плацент здоровых рожениц. Для выделения
ДНК использовали безфенольный метод, который позволяет получить полноценный
геном, сохраняя те фрагменты ДНК, которые in vivo прочно ассоциированы с белками
ядерного матрикса (скафолда). Фрагментация ДНК осуществлялась ультразвуковым
дезинтегратором при частоте 22 КГц, в результате чего получали смесь фрагментов ДНК
размером от 200 до 6000 п.н.. Полученные препараты ДНК хранили в морозильной камере
при –18оC.
Динамику деградации ДНК человека в 1, 10, 50 и 97% сыворотке мышиной крови
оценивали после инкубации смеси в течение 10 мин при 370С.
Для формирования комплекса с ДНК использовали раствор протамина сульфата 1%
или 10 мкг/мкл для инъекций («Ферейн», Москва) и ДНК бактериофага λ,
гидролизованную Hind III («Медиген», Новосибирск), или ДНК плаценты человека,
фрагментированную до размеров от 200 до 6000 п.н.. 2 мкг ДНК λ Hind III и 15 мкг ДНК
человека инкубировали при комнатной температуре несколько минут с различным (от 10
до 150% по массе) количеством протамина. Далее Hind III гидролизат ДНК фага λ и ДНК
человека, связанные с протамином в различных соотношениях, инкубировали 60 мин при
370С в 10% сыворотке крови мыши. После совместной инкубации ДНК и сыворотки крови
мышей добавляли протеиназу К и инкубировали 1 ч при 650С. После экстракции
фенол/хлороформом ДНК переосаждали 0,6 объемами изопропанола в присутствии
линейного акриламида и проводили электрофорез в агарозных блоках.
Циклофосфан
(«Биохимик»,
Саранск)
перед
применением
растворяли
в
физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно 12 мышам в дозе 200 мг/кг веса
животного. Каждая экспериментальная группа состояла из 4 мышей. Одна группа мышей
служила контролем (получали физиологический раствор), а двум другим следующие 3 дня
после введения циклофосфана внутрибрюшинно вводили по 50 мкг ДНК человека
интактной или в комплексе с протамином (ДНК/протамин=1/0,8 по массе). Кровь для
подсчета лейкоцитов брали из кончика хвоста индивидуально у каждой мыши
непосредственно перед введением и на 4, 7 и 11 сутки после введения циклофосфана.
Кровь разводили в 20 раз в 3% растворе уксусной кислоты, и в камере Горяева
подсчитывали количество лейкоцитов в 1 мм3. Достоверность различий между данными
определяли, используя t-критерий Стъюдента.
3
Результаты и обсуждение
Ранее
было
показано,
что
введение
мышам
экзогенной
ДНК приводит
к
существенному ускорению восстановления количества лейкоцитов в периферической
крови
после
угнетения
кроветворения
противоопухолевым
химиопрепаратом
циклофосфаном у экспериментальных животных [2].
В настоящей работе первоначально мы оценили нуклеазную активность сыворотки
крови. В качестве субстрата использовалась геномная ДНК человека, фрагментированная
до размеров от 200 до 6000 п.н.. Была исследована динамика деградации ДНК человека в
сыворотке мышиной крови в концентрациях – 1, 10, 50 и 97%. Как видно из полученных
результатов, уже через 10 мин инкубации в 1% сыворотке крови заметна деградация
исходной ДНК. При всех остальных концентрациях сыворотки, находящейся в
реакционной смеси, исходная ДНК деградирует до фрагментов размером 200 п.н. (Рис. 1).
Рис. 1. Нуклеазная активность сыворотки крови мыши. М – маркеры молекулярных весов.
ДНК – исходная ДНК человека, которая инкубировалась с 1%, 10%, 50% и 97%
сывороткой крови мыши (соответствующие дорожки) при 370С в течение 10 мин.
Цифрами слева от блока отмечены фрагменты соответствующего молекулярного веса в
т.п.н.
Мы предположили, что комплекс ДНК с протамином позволит защитить ДНК от
действия нуклеаз крови и при этом не снизит лейкостимулирующей активности препарата
экзогенной ДНК, охарактеризованной в нашей предыдущей работе [2].
4
Протамин – низкомолекулярный ядерный белок, молекулярная масса 4-12 кДа. Для
протамина характерно высокое содержание щелочных аминокислот, особенно аргинина
(70—80%), что обусловливает основные свойства протамина. В ядрах клеток протамин,
подобно
гистонам,
ассоциирован
с
ДНК
в
нуклеопротамины.
Методом
рентгеноструктурного анализа показано, что цепочка протамина обматывается как третья
нить вокруг двойной спирали ДНК. Присутствие протамина защищает ДНК от действия
нуклеаз и придает хроматину компактную форму [4, 7].
Для выяснения соотношения ДНК и протамина, при котором молекулы ДНК
полностью защищаются от деградации, Hind III гидролизат ДНК фага λ и ДНК человека,
связанные с протамином в различных соотношениях, инкубировали в 10% сыворотке
крови мыши. Как следует из полученных данных, протамин в соотношении 80% к ДНК по
массе практически абсолютно защищает ДНК от деградации (Рис. 2).
Рис. 2. Защита фрагментов ДНК, ассоциированных с протамином, от действия нуклеаз
сыворотки крови мыши. HindIII гидролизат ДНК фага λ и фрагментированная ДНК
человека, ассоциированные с различным (по массе) количеством протамина, после
инкубации в 10% сыворотке крови мыши при 370С в течение 60 мин. Цифры сверху геля
указывают содержание протамина в комплексе по отношению к ДНК в %. Цифрами слева
от блока отмечены фрагменты соответствующего молекулярного веса в т.п.н.
ДНК, связанная с протамином, в соотношении ДНК/протамин=1/0,8 по массе
использовалась для инъекций мышам. Исследовалась стимуляция восстановления
лейкопоэза
после
введения
мышам
алкилирующего
угнетающего кроветворение.
5
цитостатика
циклофосфана,
Рис. 3. Сравнение лейкостимулирующей активности экзогенной ДНК человека, интактной
и ассоциированной с протамином, по сравнению с контрольной группой после введения
мышам циклофосфана в дозе 200 мг/кг веса.
Как демонстрируют результаты эксперимента (Рис. 3), на 4 сутки, несмотря на полное
подавление активности белого ростка крови, в группе мышей, получавших ДНК,
связанную с протамином, лейкоцитов сохраняется в 2 раза больше, чем в контрольной
группе. На 7 сутки после введения циклофосфана количество лейкоцитов у мышей,
которым водили ДНК человека или ДНК человека, связанную с протамином, выше, чем в
контрольной группе. На 11 сутки наблюдается незначительное естественное снижение
числа лейкоцитов, однако, по-прежнему восстановление лейкопоэза в группах мышей,
получавших дополнительно инъекции экзогенной ДНК, более эффективное, чем в
контрольной группе.
В
проделанной
работе
показано,
что
после
совместного
введения
мышам
алкилирующего цитостатика циклофосфана и препарата фрагментированной экзогенной
ДНК, связанной с протамином – белком, который защищает ДНК от действия нуклеаз
крови, наблюдается эффективное восстановление лейкопоэза. Полученные данные
свидетельствуют о том, что применение комплексов ДНК с протамином позволяет
защитить ДНК от действия нуклеаз крови без изменения терапевтической активности
препарата ДНК [2].
6
При
введении
в
организм
животного
фрагменты
ДНК
доставляются
в
межхромосомное пространство активно пролиферирующих клеток, включая всех
предшественников лейкопоэза, и репарация межцепочечных сшивок, возникших при
воздействии циклофосфана, происходит с их участием. Экзогенные фрагменты, имеющие
гомологию с участками репарации, могут быть использованы в качестве донорных
последовательностей и могут принимать участие в гомологичной рекомбинации,
необходимой для завершения репарационного процесса. Такое участие экзогенной ДНК
благоприятно сказывается на жизнеспособности стволовых клеток крови.
ЛИТЕРАТУРА
1. Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е. и др. Влияние экзогенной ДНК на рост
экспериментальных опухолей // Вопр. онкол. – 2006. – Т. 52. – № 1. – С. 66-69.
2. Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е. и др. Влияние экзогенной ДНК на
восстановление лейкопоэза и противоопухолевый эффект циклофосфана // Вопр.
онкол. – 2006. – Т. 52. – № 3. – С. 336-340.
3. Черепанова А.В., Тамкович С.Н., Власов В.В., Лактионов П.П. Активность
дезоксирибонуклеаз крови в норме и при патологии // Биомед. химия. – 2007. – T. 93. –
№ 5. – C. 488-496.
4. Brewer L., Corzett M., Lau E.Y., Balhorn R. Dynamics of protamine 1 binding to single
DNA molecules // J Biol Chem. – 2003. – Vol. 278. – P. 42403-42408.
5. Likhacheva A.S., Nikolin V.P., Popova N.A. et al. Integration of human DNA fragments into
the cell genomes of certain tissues from adult mice treated with cytostatic cyclophosphamide
in combination with human DNA // Gene Ther Mol Biol. – 2007. – Vol. 11. – P. 185-202.
6. Likhacheva A.S., Nikolin V.P., Popova N.A. et al. Exogenous DNA can be captured by stem
cells and be involved in their rescue from death after lethal-dose γ-radiation // Gene Ther
Mol Biol. – 2007. – Vol. 11. – P. 305-314.
7. Vilfan I.D., Conwell C.C., Hud N.V. Formation of native-like mammalian sperm cell
chromatin with folded bull protamine // J Biol Chem. – 2004. – Vol. 279. – P. 20088-20095.
8. Yakubov L.A., Rogachev V.A., Likhacheva A.C. et al. Natural human gene correction by
small extracellular genomic DNA fragments // Cell Cycle. – 2007. – Vol. 6. – P. 2293-2301.
7
E.V. Dolgova1, V.A. Rogachev1, V.P. Nikolin1, N.A. Popova1, A.S. Likhacheva1, E.A.
Alyamkina1, T.E. Sebeleva1, E.R. Chernykh2, E.L. Gel’fgat2, S.S. Bogachev1, M.A. Shurdov3
A LEUKOCYTE-STIMULATING EFFECT OF EXOGENOUS DNA FRAGMENTS
PROTECTED WITH PROTAMINE IN THE CYCLOPHOSPHAMIDE-INDUCED
MYELOSUPPRESSION IN MICE
1
Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences,
Novosibirsk, 2 Institute of Clinical Immunology, Siberian Branch, Russian Academy of Medical
Sciences, Novosibirsk, 3 LLC Panagen
In this work, we have demonstrated that protamine at a ratio of 80 % w/w relative to DNA
completely protects DNA molecules from the degradation by nucleases, which are naturally
present in the mammalian blood serum. We used the DNA bound to protamine and showed that
administration of the fragmented exogenous DNA associated with protamine to the
cyclophosphamide-treated mice efficiently induces the restoration of leukopoiesis. It is assumed
that the exogenous DNA administered to experimental animals stimulates the repair in the blood
stem cells affected by the crosslinking cytostatic cyclophosphamide. The DNA binding to
protamine makes it possible to decrease the dose of administered DNA and preserve the initial
size of DNA fragments, thereby enhancing involvement of more extended DNA fragments into
the repair by homologous recombination, eventually increasing the chance of a cell to get rid of
numerous damages.
8