На правах рукописи ПЫЛАЕВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСЕЕВНА
advertisement
1 ФГБУ «РОССИЙСКИЙ КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННЫЙ КОМПЛЕКС» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ На правах рукописи ПЫЛАЕВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСЕЕВНА ЭФФЕКТОРНЫЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ У БОЛЬНЫХ СТАБИЛЬНОЙ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА 14.01.05 - Кардиология 03.03.04 – Клеточная биология, Гистология, Цитология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: академик РАН Е.И.ЧАЗОВ доктор биологических наук Т.И. АРЕФЬЕВА Москва, 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5 ВВЕДЕНИЕ 7 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12 1.1. История изучения атеросклероза 12 1.2. Изменения в артериальной стенке при атеросклерозе 14 1.3. Адаптивный иммунитет в атерогенезе 17 1.4. Т-хелперы 1 типа 21 1.5. Т-хелперы 2 типа 21 1.6. Т-хелперы 17 22 1.7. Регуляторные Т-лимфоциты 23 1.8. Изучение роли субпопуляций лимфоцитов в развитии атеросклероза и его осложнений у человека 27 1.9. Лимфоциты, распознающие антигены в атеросклеротической бляшке 34 1.10. Иммуномодулирующие эффекты окЛНП 35 1.11. Заключение 37 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 39 2.1. Клиническое обследование пациентов, включенных в исследование 39 2.2. Получение образцов крови 43 2.3. Получение и активация мононуклеарных клеток крови в культуре 43 2.4. Выделение CD4+ лимфоцитов методом иммуномагнитной сепарации из мононуклеарной фракции крови здоровых добровольцев 43 2.5. Иммунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и внутриклеточных антигенов) методом цитофлуориметрии в потоке 44 2.6. Определение содержания ИЛ-17, ИЛ-10, вчСРБ, sCD25 в крови 45 3 больных 2.7. Получение окЛНП 47 2.8. Культивирование мононуклеарных и CD4+ клеток в присутствии окЛНП 47 2.9. Определение лимфоцитов, активированных в присутствии окЛНП, методом ELISPOT 48 2.10. Определение концентрации цитокинов в среде культивирования лимфоцитов 49 2.11. Статистический анализ данных 49 3.РЕЗУЛЬТАТЫ 51 3.1. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления у пациентов с различной выраженностью и скоростью прогрессирования атеросклероза коронарных артерий 51 3.2. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления у пациентов с ИМ в анамнезе 60 3.3. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления в зависимости от пола 64 3.4. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления в зависимости от статуса курения 67 3.5. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления в зависимости от возраста 69 3.6. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления у пациентов с различной выраженностью атеросклероза сонных артерий 69 3.7. Оценка показателей субпопуляционного состава лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления в зависимости от скорости прогрессирования (проспективно) атеросклероза коронарных артерий 74 3.8. Оценка действия окЛНП на содержание субпопуляций лимфоцитов в культурах мононуклеарных клетоки и CD4+ 81 4 лимфоцитов 3.9. Оценка активации мононуклеарных лейкоцитов в присутствии окЛНП по содержанию цитокинов в среде культивирования 82 3.10. Оценка активации лимфоцитов в мононуклеарной фракции в присутствии окЛНП методом поточной цитометрии и ELISPOT 84 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 88 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103 ВЫВОДЫ 105 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 107 СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 108 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ - антиген, аутоАГ - аутоантиген АПК - антиген-презентирующие клетки АС - атеросклероз АСБ - атеросклеротическая бляшка БРА - блокаторы рецепторов ангиотензина БЦА - брахиоцефальные артерии ВСА - внутренняя сонная артерия вчСРБ - С-реактивный белок, измеренный высокочувствительным методом ДК - дендритные клетки ИАПФ - ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента ИБС - ишемическая болезнь сердца ИЛ - интерлейкин ИМ - инфаркт миокарда ИМТ – индекс массы тела ИФН-гамма - интерферон-гамма КА - коронарные артерии КАГ - коронарная ангиография ЛКА - левая коронарная артерия ЛНП - липопротеиды низкой плотности, окЛНП - окисленные липопротеиды низкой плотности НС - нестабильная стенокардия ОА - огибающая артерия ОКС - острый коронарный синдром ОСА - общая сонная артерия ПКА - правая коронарная артерия ПНА – передняя нисходящая артерия СС - стабильная стенокардия ССЗ - сердечно-сосудистые заболевания 6 ССО - сердечно-сосудистые осложнения Такт – активированные Т-лимфоциты ТИМ - толщина комплекса интима-медиа ТГ - триглицериды Тх1 - Т-хелперы 1 типа Тх2 - Т-хелперы 2 типа Тх17 - Т-хелперы, продуцирующие интерлейкин-17 Трег - регуляторные Т-лимфоциты УЗДС - ультразвуковое дуплексное сканирование ТФР-бета - трансформирующий фактор роста бета ФБ - фосфатный буфер ФМА - форболмиристатацетат ФНО-альфа - фактор некроза опухоли альфа ХС - холестерин МНС - major histocompatibility complex, главный комплекс гистосовместимости sCD25 - soluble CD25, растворимая форма CD25, рецептора интерлейкина-2. 7 ВВЕДЕНИЕ Атеросклероз (АС) – многофакторное хроническое заболевание артериальной стенки, характеризующееся образованием атеросклеротических бляшек (АСБ), суживающих просвет сосуда. Несмотря на обилие фактической информации, единой теории атерогенеза, объединяющей все гипотезы, нет. Наличие лейкоцитов в артериальной стенке в атеросклеротически изменѐнных участках было описано Рудольфом Вирховым в Германии и Карлом Рокитанским в середине XIX века [130,169]. К первому десятилетию ХХ века независимо друг от друга Александр Игнатовский и Николай Аничков показали, что холестерин, содержащийся в яичных желтках, является причиной атеросклероза у экспериментальных животных. В последующем АС рассматривался как процесс, развивающийся в артериальной стенке в ответ на еѐ механическое или химическое повреждение [70]. Выявление ключевой роли макрофагов, превращающихся в пенистые клетки, вАС [66,136], привлекло внимание исследователей и к другим иммунокомпетентным клеткам, которые могут быть вовлечены в патологический процесс. В последние три десятилетия экспериментальные и клинические данные исследования укрепили ученых во мнении, что АС представляет собой обусловленный нарушением липидного обмена хронический воспалительный процесс в артериальной стенке, в котором важная роль отводится компонентам врожденного и адаптивного иммунитета. Воспаление в артериальной стенке инициируется присутствием аутоантигенов (аутоАГ), в первую очередь, окисленных липопротеидов низкой плотности (окЛНП). АутоАГ фагоцитируются и презентируются дендритными клетками (ДК) и макрофагами Т-лимфоцитам, вызывая их активацию и пролиферацию. В свою очередь, Т-лимфоциты оказывают модулирующее действие на 8 активность макрофагов и участвуют в поддержании воспалительного процесса [71, 165]. Экспериментальные данные, полученные на моделях АС у животных, свидетельствуют о том, что Т-хелперы 1 типа (Тх1) оказывают проатерогенный эффект за счѐт секреции провоспалительных цитокинов (ИФН-гамма, ФНО-альфа). Т-хелперы, продуцирующие интерлейкин-17 (Tх17), оказывают провоспалительное и проатерогенное действие за счѐт синтеза интерлейкина (ИЛ)-17 и других цитокинов, стимулирующих Тх1. Регуляторные Т-лимфоциты (Tрег) оказывают противовоспалительное и антиатерогенное действие за счѐт подавления эффекторных клеток иммунной системы путем секреции противовоспалительных цитокинов ТФР-бета и ИЛ10, а также посредством контактных механизмов и синтеза цитотоксических агентов [24,62,113,168]. Большинство клинических данных о субпопуляционном составе лимфоцитов крови получено для пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС): показано снижение количества циркулирующих Tрег и повышение содержания Тх1 и Тх17 у пациентов с ОКС по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией (СС) и лицами без значимого поражения коронарного русла [37,183,184]. Наряду с этим, результаты исследований, посвящѐнных изучению иммунного баланса, соотношения содержания противовоспалительных субпопуляций лимфоцитов у стабильными проявлениями коронарного АС про- и пациентов со противоречивы. Ряд исследователей отмечают отсутствие различий в иммунологическом статусе пациентов с ИБС и практически здоровых добровольцев, некоторые указывают на подавление регуляторного звена (уменьшение содержания Трег и ассоциированных цитокинов) при СС [37,69,86,97,114]. В настоящее время отсутствуют исследования, посвящѐнные изучению субпопуляций лимфоцитов с регулирующими свойствами у пациентов с различной скоростью прогрессирования коронарного АС. 9 Целью работы явилось изучение количества и функциональной активности субпопуляций Т-лимфоцитов у пациентов с различной выраженностью атеросклероза коронарных и брахиоцефальных артерий и исследование влияния проатерогенных факторов на функциональную активность лимфоцитов в культуре. В работе были поставлены следующие задачи: 1. Определить содержание Тх1, Тх17 и Трег в крови у пациентов с различной степенью атеросклероза коронарных и брахиоцефальных артерий. 2. Исследовать уровень цитокинов ИЛ-17, ИЛ-10, С-реактивного белка, измеренного высокочувствительным методом, и субъединицы рецептора ИЛ-2 (sCD25) в крови у пациентов с различной степенью атеросклероза коронарных и брахиоцефальных артерий. 3. Оценить влияние модифицированных липопротеидов низкой плотности на содержание Тх1, Тх17 и Трег, а также на активность клеток по уровню продукции цитокинов в культуре мононуклеарных клеток и СD4+ лимфоцитов, полученных из периферической крови здоровых добровольцев и пациентов с ИБС. Научная новизна. Впервые выполнено подробное исследование субпопуляционного состава лимфоцитов, включая определение Tx1, Tx17 и Tрег, а также «растворимых» факторов воспаления (ИЛ-17, ИЛ-10, вчСРБ, sCD25) у пациентов с различной выраженностью АС КА и брахиоцефальных артерий (БЦА). Проведена оценка степени активации мононуклеарных клеток и субпопуляций CD4+ лимфоцитов в присутствии проатерогенных факторов (окЛНП). Впервые установлено изменение иммунологического баланса (уменьшение содержания Трег и ИЛ-10 и увеличение содержания Тх17 и ИЛ17 у больных с выраженным атеросклеротическим поражением коронарных 10 артерий (КА) и БЦА и с прогрессированием коронарного атеросклероза.Впервые показана ассоциация базального уровня ИЛ-10 продуцирующих Т-лимфоцитов со скоростью прогрессирования коронарного АС у пациентов с диагностированной ИБС, перенесших стентирование коронарных артерий. Впервые установлено присутствие в периферическом кровотоке лимфоцитов, специфических к окЛНП. Практическая значимость. Результаты данной работы расширяют представления о вовлечении иммунной системы в патогенез АС. Данные об изменении иммунного баланса у пациентов сАС сонных и коронарных артерий могут лечь в основу дополнительных методов оценки степени выраженности изменений. и скорости Полученные прогрессирования результаты будут атеросклеротических способствовать более эффективному выявлению пациентов с высоким риском прогрессирования атеросклероза, снижению количества повторных госпитализаций и сокращению затрат на лечение. Выявление новых патогенетических звеньев атерогенеза способствует разработке методов лечения, влияющих на воспалительный и иммунный компоненты АС, что позволит облегчить течение и улучшить прогноз больных с данным заболеванием. Личное участие автора. Автором работы проводился анализ литературы, посвящѐнной изучаемой проблеме, составление протокола исследования, ведение пациентов, включѐнных в исследование в течение стационарной госпитализации и осуществление дальнейших амбулаторных визитов. Автором проводилось выделение и культуральная работа с лимфоцитами крови, иммунофенотипирование клеток, отработана и внедрена в практику лаборатории методика определения лимфоцитов, активированных в присутствии статистическая окЛНП, обработка методом ELISPOT. результатов, Автором осуществлены написание статей и тезисов, 11 подготовка текста диссертации, разработка практических рекомендаций, а также их внедрение в клиническую и исследовательскую практику. 12 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ На сегодняшний день сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) остаются одной из лидирующих причин заболеваемости и смертности населения во многих развитых странах [178], в том числе в Российской Федерации, значительно опережая злокачественные новообразования, заболевания органов дыхания и другие причины. Согласно данным Федеральной государственной службы статистики РФ, количество зарегистрированных случаев ССЗ в РФ в 2013 г. составило 4285 тыс. человек (29,9 на 1000 человек населения) [2]. Смертность от всех причин в 2013 году составила 1871,8 тыс чел (1304,3 человек на 100.000 населения), из них от болезней органов кровообращения - 1001,8 тыс. человек (698,1 чел на 100.000 населения), то есть более 50% от общей смертности [7]. Ведущие позиции в структуре ССЗ занимают ИБС и ишемическая болезнь мозга. Основным фактором патогенеза данных заболеваний является АС - медленно прогрессирующее хроническое заболевание крупных и средних артерий. В инициации и прогрессии атерогенеза значительная роль принадлежит процессам врождѐнного и адаптивного иммунного ответа против различных аутоАГ, в первую очередь, липопротеидов. АутоАГ (окЛНП и их компоненты, в частности, апоВ100, а также белки теплового шока и другие) фагоцитируются и презентируются дендритными клетками и макрофагами Тлимфоцитам, вызывая их активацию и пролиферацию и, тем самым, усиление воспалительной реакции в сосудистой стенке [65,109,116,166,176]. 1.1. История изучения атеросклероза Описание воспалительных клеток в атеросклеротически изменѐнной сосудистой стенке Рудольфом Вирховым в Германии и Карлом Рокитанским в Австрии было дано в середине XIX века [130,169], более чем за полвека до открытия роли холестерина (ХС) в развитии АС [110]. Н. Н. Аничков первым 13 продемонстрировал роль ХС в чистом виде в развитии АС. Его эксперимент, выполненный в 1913 году и ставший классическим, открыл путь для дальнейших исследований в липидологии. Аничков и Халатов смогли воспроизвести атерогенез на модели атеросклероза у животных (кролики, которых кормили ХС, смешанным с растительным маслом), тем самым идентифицировав классический фактор риска прогрессии АС – гиперхолестеринемию. Долгое время наглядная и простая в понимании «инфильтративная» теория Аничкова [93], оставалась центральной. Гипотеза о первичной роли ХС в атерогенезе подтверждена многочисленными биохимическими, генетическими и эпидемиологическими исследованиями, а также экспериментами на животных, применение гиполипидемической терапии позволило снизить риск развития ССЗ и предупредить развитие сердечно-сосудистых осложнений (ССО). В то же время существует ряд ограничений данной теории. Во-первых, ХС – фактор, действующий системно, а атеросклеротические поражения чаще носят локальный характер. Это можно объяснить гемодинамическими особенностями (турбулентный ток крови в местах бифуркаций и изгибов сосудов) и локальной дисфункцией эндотелия. Другой аргумент – что даже при коррекции основных модифицируемых факторов риска АС заболевание в ряде случаев продолжает прогрессировать. У ряда видов животных, включая обезьян и собак, АС не развивается [174]. Помимо нарушения обмена липопротеидов существует большой спектр факторов, включая механические (атеросклеротические бляшки чаще образуются в местах бифуркаций и изгибов сосудов, генетические где стенка испытывает (предрасположенность кАС наибольшее и напряжение), сердечно-сосудистых заболеваниям в семьях) факторы и особенности самой сосудистой стенки, принимающей активное участие в процессе атерогенеза. В начале 1970-х годов АС считался неопластическим процессом, заключавшемся в гипертрофии гладкомышечных клеток в ответ на механические или химические повреждения артериальной стенки [70]. 14 Выявление ключевой роли макрофагов, превращающихся в пенистые клетки, в АСБ [66,136], привлекло внимание исследователей и к другим иммунокомпетентным клеткам, которые могут быть вовлечены в патологический процесс. В последние три десятилетия экспериментальные и клинические данные укрепили ученых во мнении, что АС представляет собой обусловленный нарушением липидного обмена хронический воспалительный процесс в артериальной стенке, в котором важная роль отводится компонентам врожденного и адаптивного иммунитета. 1.2. Изменения в артериальной стенке при атеросклерозе Интима – внутренняя оболочка артериальной стенки, снаружи прилежит к медии. Состоит из слоя эндотелиальных клеток, обращѐнного к просвету сосуда, и двух соединительнотканных слоѐв, разделѐнных внутренней эластической мембраной, плохо различимой в местах бифуркаций, ветвления и изгибов артерий. Основными клеточными компонентами интимы являются эндотелиальные и гладкомышечные клетки, макрофаги, редко встречаются тучные клетки. Межклеточный матрикс, состоящий из протеогликанов, коллагенов, эластина, фибронектина и ламинина, компонентов плазмы, является основным компонентом интимы и составляет 60% ее объема. Матрикс является важным посредником транспорта и обмена питательных веществ, накопления продуктов обмена и средой для миграции клеток [144]. Физиологическое утолщение интимы возникает в местах бифуркации и изгибов артерий и является компенсаторным механизмом в ответ на механический стресс в участках сосудов с переменным потоком и напряжением сосудистой стенки. Часто раннее развитие атеросклеротического поражения возникает в участках сосудистой стенки с адаптивным утолщением интимы (коронарные и почечные артерии, 15 внутренняя сонная артерия (ВСА) на уровне каротидного синуса, дорсальная стенка абдоминальной аорты) [144]. Повреждение или активация эндотелия часто рассматривается как фактор, предрасполагающий к развитию утолщения интимы. Согласно другой гипотезе, агрегация тромбоцитов или отложение фибрина на поверхности интимы (обнаруживающиеся уже у детей и молодых взрослых) могут служить инициирующим фактором к развитию АС [144]. Считается, что липопротеиды (нативные и модифицированные) инициируют воспалительную реакцию и развитие атеросклероза в сосудистой стенке. Липопротеиды проникают винтиму путѐм трансцитоза через эндотелиальный слой или диффузией через поры в базальной мембране и присутствуют в интиме всегда, однако лишь в ряде случаев вызывают развитие атеросклеротических изменений[144]. Браун и Голдштейн (Brown, Goldstein) в экспериментах по изучению эндоцитоза смоделировали захват искусственно модифицированных ацетилированием ЛНП макрофагами посредством скавэнджер-рецепторов, отличных от ЛНП-рецепторов [66]. В дальнейшем Хенриксен (Henriksen) с соавторами показали возможность захвата макрофагами ЛНП, модифицированных естественным путѐм с участием эндотелиальных клеток [72,148]. В последующих работах показана ключевая роль миелопероксидазы, именно ферментативно липоксигеназ и других) (с участием и ферметов неферментативно модифицированных ЛНП в атерогенезе [53,75,83,120,179]. В настоящее время нет единого мнения насчѐт конкретных эпитопов ЛНП, запускающих иммунный ответ. Исследователи из Швеции изучали иммунный ответ в отношении различных фрагментов пептида апоВ100, входящего в состав молекулы ЛНП, и разработали 2 синтетических пептида, обладающих наиболее выраженными иммуногенными и проатерогенными свойствами [117]. Предполагают, что не только липопротеиды, но и другие антигены, обнаруженные в АСБ, способны активировать воспалительные реакции в сосудистой стенке. Собственные молекулы организма, подвергшиеся 16 модификации (окислению или гликозилированию) начинают распознаваться организмом как чужеродные, активируя таким образом системы врождѐнного и адаптивного иммунного ответа. Например, окисленная и гликозилированная формы бета-2-гликопротеина 1 - плазменного протеина, выполняющего роль кофактора фосфолипидов и естественного антикоагулянта, - способны активировать незрелые дендритные клетки. Эндотелиальные клетки в ответ на различные стрессовые условия (окислительный стресс, химические агенты, вирусы, ишемическое и реперфузионное повреждение) экспрессируют значительные количества белков теплового шока как в цитозоле, так и на поверхности мембраны. Часть молекул высвобождается в межклеточное пространство, становясь триггером иммунного ответа (HSP90, gp96). Окисленная форма гемоглобина также может участвовать в клеточно-опосредованных иммунных реакциях при атерогенезе. Источником гемоглобина в АСБ являются геморрагии из vasa vasorum [26]. Классически принято выделять три начальных стадии формирования атеросклеротического поражения: I – локальные отложения липидов в виде пенистых клеток в интиме, II – объединение локальных скоплений пенистых клеток в жировые полоски, III – стадия, предшествующая выраженным изменениям (появление внеклеточных отложений липидов с дезорганизацией интимы). Общими чертами стадий начального АС является выраженное накопление липидов в пенистых клетках, увеличение количества клеточных элементов (преимущественно макрофагов и пенистых клеток, отмечаются незначительные количества Т-лимфоцитов, изолированные тучные клетки), при этом нарушение структуры межклеточного матрикса и архитектоники интимы минимально. Медиа и адвентиция, прилежащие к местам отложения липидов в интиме, на этих стадиях, как правило, интактны. Клиническая значимость начальной стадии прогрессирования болезни [146]. АС определяется возможностью 17 Следующие стадии – стадии выраженных изменений при АС, характеризуются прогредиентными нарушениями архитектоники интимы. Тип IV – атерома, отличающаяся крупным скоплением внеклеточных липидов («липидное ядро») и дезорганизацией интимы, фиброзная ткань на данной стадии не выражена. V (Va) тип характеризуется формированием выраженных слоѐв соединительной ткани. Vb, трансформирующиеся затем в VII, – кальцифицированные АСБ. АСБ Vc типа, трансформирующиеся в VIII, – характеризуются преобладанием фиброзной ткани, замещающей структуры интимы, и почти полным отсутствием липидного ядра. VI тип – осложнѐнные АСБ, характеризующиеся наличием изъязвлений (поверхностных, затрагивающих только эндотелиальный слой, или глубоких, проникающих до липидного ядра), интрамуральных кровоизлияний, тромбоза. Наиболее предрасположенные к изъязвлению типы АСБ – это IV и Va. Факторами, провоцирующими развитие повреждения поверхности АСБ, являются присутствие провоспалительных клеток в АСБ и синтез протеолитических ферментов и активных форм кислорода макрофагами, спазм коронарных артерий, структурные особенности АСБ, гемодинамические факторы. Все указанные типы выраженных атеросклеротических изменений артериальной стенки объединяет, в первую очередь, выраженная дезорганизация интимы, а также изменения структуры медии и адвентиции, заключающиеся в появлении скоплений лимфоцитов, макрофагов, пенистых клеток, источником которых могут служить, предположительно, vasa vasorum. Клиническая значимость описанных изменений заключается в формировании стенозирования просвета артерии, а также в высокой вероятности развития осложнений, приводящих к полной окклюзии просвета артерии [143,145]. 1.3. Адаптивный иммунитет в атерогенезе Воспаление в сосудистой стенке регулируется лимфоцитарными субпопуляциями. Антиген-презентирующие клетки (АПК), играют роль 18 связующего звена между неспецифическим и адаптивным иммунитетом, передающего информацию о клеточном повреждении Т-лимфоцитам. Пептидные антигены, синтезируемые внутри клетки, процессируются нелизосомальными протеазами синтезированными в и соединяются шероховатом в цитоплазме эндоплазматическом с ретикулуме молекулами МНС-1, затем комплекс АГ-МНС-1 поступает на наружную мембрану АПК и презентируются цитотоксическим СD8+ лимфоцитам. Экстрацеллюлярные патогены фагоцитируются и в фаголизосомах процессируются и связываются с молекулами МНС-2, активируя CD4+ Тхелперы. Молекулы создающими сайты CD1 богаты связывания для неполярными аминокислотами, гидрофобных липидных и гликолипидных молекул. Липидные антигены экзогенного происхождения интернализуются и в эндолизосомах связываются с CD1, затем комплекс АГCD1 попадает на плазматическую мембрану и презентируется цитотоксическим СD8+ лимфоцитам [150,167]. Таким образом, молекулы липопротеидов, являясь экзогенными по отношению к АПК молекулами и состоящие из пептидной и липидной частей, активируют Т-хелперные лимфоциты через МНС-2 и цитотоксические лимфоциты через CD1. Периферические Т-клетки являются долгоживущими и в основном существуют в G0 или G1 стадиях клеточного цикла. Т-клетки (как и Вклетки) могут быть активированы специфически, когда соответствующий клон Т-клеток встречает комплементарный АГ в комплексе с MHCгликопротеидом на АПК. При активации Т-клетки начинают экспрессировать гены своего ростового фактора — ИЛ-2 и его рецептора. В результате аутокринного действия ИЛ-2 Т-клетки активированных клонов пролиферируют, что обеспечивает эффективную иммунную защиту. На следующем этапе Т-клетки дифференцируются на основные разновидности в Т-зонах вторичных лимфоидных органов. Распределение в организме активированных и эффекторных Т-лимфоцитов отличается от такового наивных Т-клеток, что обусловлено изменением набора экспрессируемых 19 молекул адгезии и хемокиновых рецепторов [9]. В кровотоке циркулируют преимущественно наивные Т-лимфоциты (CD45RA+CD45RO-), которые после презентации им антигена в лимфатических узлах становятся активированными (CD45RA-CD45RO+) клетками памяти, в кровотоке присутствуют недолго и мигрируют в место воспалительной реакции, откуда дендритные клетки доставили антиген в лимфатический узел [76]. Когда эти клетки достигают АСБ, они взаимодействуют с эндотелием посредством молекул адгезии, экспрессируемых на его поверхности, проникают в подэндотелиальный слой и реактивируются местными АПК, что усиливает локальный воспалительный ответ в ткани АСБ. Параллельно активированные Т-клетки участвуют в В-клеточных реакциях синтеза специфических антител. Растворимые медиаторы воспаления, высвобождаемые Т-клетками и макрофагами, могут нарушать стабильность бляшки и индуцировать экспрессию протромботических и прокоагулянтных факторов [76,88]. Активированные Т-лимфоциты присутствуют в АСБ на всех стадиях развития, однако наибольшее их количество определяется на поздних стадиях. В осложнѐнных АСБ выше содержание ФНО-а и ИФН-гамма экспрессирующих Т-лимфоцитов, особенно среди CD4+ лимфоцитов, по сравнению со стабильными АСБ [125] Т-лимфоциты классифицируются по экспрессии рецепторов антигенов, ко-экспрессии одного из взаимоисключающих ко-рецепторов CD4 или CD8, и маркѐра всех Т-клеток CD3. Среди всех Т-клеток, присутствующих в АСБ человека, около 70% составляют СD4+ клетки, оставшуюся часть – СD8+ клетки и минорные субпопуляции (таблица 1) [88]. 20 Таблица 1. Т-клеточные субпопуляции, принимающие участие в атерогенезе. Т-хелперные клетки (CD4+), взаимодействуют с МНС II Название Тх1 Тх2 Тх17 Регуляторные Т-клетки (CD4+), взаимодействуют с МНС II Цитотоксические Т-клетки (CD8+), взаимодействуют с МНС I CD4+клетки, отсутствие CD28 (ко-стимуляторная молекула для взаимодействия с АПК) Т-лимфоциты с Тклеточным рецептором Т-клетки натуральные киллеры Индуцибельные Трег Естественные Трег Tr1 CTL Физиологическое значение Защита против внутриклеточных патогенов Защита против внеклеточных патогенов Защита против различных бактерий и грибов Периферическая иммунотолерантность и иммунорегуляция Защита против вирусов и опухолевых клеток Маркѐры Т-bet, ИЛ-12R, ИЛ-18R, CXCR3 GATA3, DEC2, MAF, ИЛ4R, ИЛ-33R, CCR4, ИЛ17Rb, CRTH2 ROR-gammat, ROR-gamma, CCR4, CCR6 FOXP3, CD25, CTLA4, GIRT FOXP3, CD25, CTLA4, GIRT, Helios AhR, cMAF CD8, EOMES, T-bet, BLIMP1 CD4CD28null Защита против патогенов Отсутствие CD28, NKG2D, CX3CR1 Т Защитный барьер слизистых оболочек Периферическая иммунотолерантность, защита против патогенов и опухолевых клеток, распознавание липидных антигенов T-клеточный рецептор NKT PLZF, NK 1.1, CD56, CD1d отсутствие, V-alpha14-Jalpha18 (мышь),V-alpha24J-alpha18 (человек) Цитокины ИФН-гамма, ФНО-альфа, LT-альфа ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13, ИЛ-10 ИЛ-17А, ИЛ-17F, ИЛ-21, ИЛ-22, CCL20 ТФР-бета, ИЛ-10 ТФР-бета, ИЛ-10, ИЛ-35 ИЛ-10, ИЛ-21 Перфорин, гранзимы, гранулизин, ИФН-гамма и другие цитокины, продуцируемые CD4+ клетками ИФН-гамма, ФНО-альфа, перфорин, гранзимы ИФН-гамма, ИЛ-17А, ИЛ17F, ИЛ-22 ИФН-гамма, ИЛ-4 Адаптировано из Ketelhuth,D.F., Hansson,G.K. (2011)[88] 21 1.4. Т-хелперы 1 типа Большинство СD4+ клеток, присутствующих в атеросклеротической бляшке, являются Тх1 [87]. Эти клетки характеризуются экспрессией фактора транскрипции Т-bet, рецептора ИЛ-12 и ИЛ-18, CXCR3 и секрецией цитокинов ИФН-гамма и ФНО-альфа, обладающих провоспалительными эффектами. Tх1-клетки реализуют свою активность посредством активации провоспалительных свойств макрофагов. В ранних работах показано, что отсутствие СD4+ лимфоцитов у мышей приводит выраженности атеросклероза [186], в то время как к уменьшению введение очищенных СD4+ лимфоцитов мышам с иммунодефицитом (генотип Apoe-/-,scid/scid) вызывает усиление прогрессии атеросклероза параллельно с увеличением уровня ИФН-гамма [185]. Важное продемонстрировано путѐм супрессии значение Тх1 в Т-специфического атеросклерозе сигнального каскада, связанного с трансформирующим ростовым фактором бета (ТРФбета). У Apoe-/- мышей с дефектом рецептора ТФР-бета II типа проявляется активация Тх1-ответа, что в итоге приводит к выраженной прогрессии атеросклероза [128]. Выключение фактора транскрипции Тх1-клеток T-bet или недостаточность Тх1 сигнального цитокина ИФН-гамма приводит к уменьшению размера и количества атеросклеротических бляшек у мышей с гиперхолестеринемией [24,25]. 1.5. Т-хелперы 2 типа Тх2 присутствуют в атеросклеротических бляшках в меньшем количестве, они характеризуются экспрессией маркѐров GATA3, DEC2, MAF, рецепторов к ИЛ-4 и ИЛ-33, CCR4) и секретируют цитокины ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13, ИЛ-10. В некоторых исследованиях на животных моделях показана проатерогенная роль Тх2. Дефицит ИЛ-4, прототипичного цитокина 22 Тх2, приводил к уменьшению тяжести заболевания [42,90]. С другой стороны, ИЛ-5, продуцируемый Тх2, продемонстрировал протективное действие в отношении атерогенеза у Ldlr-/- мышей [20]. Введение ИЛ-10 – цитокина, также секретируемого Тх2 и регуляторными Т-лимфоцитами (Трег) клетками, Apoe-/- мышам аналогично продемонстрировало противоатеросклеротический эффект [108,122]. Поляризация наивных Т-лимфоцитов в Тх1 (характеризующиеся экспрессией фактора транскрипции T-bet) происходит в провоспалительном микроокружении, т.е. в присутствии ИЛ-1, ФНО-альфа и ИФН-гамма. Поляризация в Тх2 (экспрессирующие фактор транскрипции GATA) – в присутствии противовоспалительных медиаторов (ИЛ-4, ИЛ-10, ИЛ-13, ТФРбета). Кроме того, ИФН-гамма, вырабатываемый Тх1, угнетает Т-клеточный ответ по Тх2 типу, и наоборот, ИЛ-4, вырабатываемый Тх2, угнетает ответ по Тх1-типу. Субпопуляции лимфоцитов с регуляторными свойствами, продуцирующие ИЛ-10 и ТФР-бета, также могут играть ключевую роль в поляризации иммунного ответа при АС [174]. Tх1-клетки реализуют свою активность, взаимодействуя с макрофагами, в то время как Tх2-клетки — с В-лимфоцитами [9]. 1.6. Т-хелперы 17 Тх17 – отдельная популяция клеток, для развития которой необходимо уникальное взаимодействие цитокинов и внутриклеточных факторов. Тх17 характеризуются экспрессией фактора транскрипции ROR-gamma-t, RORgamma-а, рецепторов CCR4, CCR6 и синтезом цитокинов IL-17A, IL-17F, а также IL-21, IL-22, CCL20 [47,52]. ИЛ-17 является ключевым цитокином, продуцируемым этими клетками и оказывающим провоспалительное действие [91]. Роль этих клеток, как и эффекторных лимфоцитов, заключается в опосредовании иммунного ответа против ряда экзогенных патогенов, однако доказана их роль в развитии многих аутоиммунных и 23 аллергических заболеваний [77]. Значение Тх17 в атерогенезе противоречиво. Экспериментальные и клинические исследования показали участие этой клеточной субпопуляции и ИЛ-17 в патогенезе хронического, в том числе аутоиммунного, воспаления [81,92,105,106]. У больных с активными аутоиммунными заболеваниями и в экспериментальных моделях у животных показано, что уровень ИЛ-17 в крови значительно повышен. Дефицит ИЛ-17А или его рецептора, а также нейтрализация ИЛ-17 путѐм введения антиИЛ-17-антител в эксперименте замедляли прогрессированию АС и способствовали формированию стабильного фенотипа АСБ [51,62,107,164]. В то же время Talebс соавт. (2009) показали, что введение рекомбинантного ИЛ-17 ограничивало развитие атеросклеротических бляшек на ранних стадиях у мышей, дефицитных по гену рецептора ЛНП (Ldlr-/-) [155]. 1.7. Регуляторные Т-лимфоциты В то время как практически все Т-клеточные реакции усиливают атеросклероз, некоторые Т-клеточные субпопуляции могут ограничивать воспаление и замедлять прогрессирование атеросклероза. Так, активность провоспалительных Т-лимфоцитов в норме подавляется регуляторными Тлимфоцитами (Tрег). предотвращают Трег развитие регулируют аутоиммунных Т-клеточный заболеваний гомеостаз, и реакций гиперчувствительности, обеспечивают толерантность после трансплантации. С дефицитом Трег связывают развитие аутоиммунных заболеваний [169]. С другой стороны, Трег подавляют противоопухолевый иммунитет и иммунитет к инфекциям [133]. В исследованиях in vitro и in vivо были охарактеризованы несколько популяций клеток с регуляторными свойствами: клетки, продуцирующие ИЛ-10 и ТФР-бета, CD8+CD28- Т-клетки, CD3+CD4-CD8- Т-клетки, гаммадельта-Т-клетки [115]. Однако наиболее выраженными регуляторными 24 функциями обладает субпопуляция CD4+ Т-клеток, экспрессирующих альфацепь рецептора ИЛ-2 (CD4+CD25high). Помимо высокой мембранной плотности CD25, регуляторные Т-клетки характеризует экспрессия фактора транскрипции FохР3. У человека натуральные Трег составляют около 2-4% от всех CD3+ Т-клеток крови [8]. Большинство этих клеток формируются в процессе нормальной дифференцировки в тимусе, поэтому они получили название естественных (натуральных) Трег. CD4+CD25+FoxР3+ натуральные Трег являются ключевыми клетками, поддерживающими иммунологическую толерантность к аутоантигенам [132]. Неонатальная тимэктомия, а также тимэктомия у взрослых особей или сублетальные дозы рентгеновского излучения приводят к развитию у грызунов аутоиммунных заболеваний, связанных с дефицитом Tрег [55]. Для идентификации Tрег часто используют поверхностный маркер CD25 (альфа-цепь рецептора для ИЛ-2), однако он недостаточно специфичен и может экспрессироваться Т- и В-лимфоцитами в процессе активации. Более точным способом определения субпопуляции Tрег является выделение клеток с высоким уровнем экспрессии CD25 – CD25high [17]. Высокий конститутивный уровень экспрессии CD25 необходим для функционирования T-рег, он обеспечивает чувствительность Трег даже к физиологически низким концентрациям ИЛ-2 [137]. В ряде исследований было показано, что у мышей, дефицитных по гену ИЛ-2, альфа-цепи рецептора ИЛ-2 (CD25) или бета-цепи рецептора ИЛ-2 (CD122), развивается смертельное воспалительное заболевание, названное «синдром дефицита ИЛ2», которое может быть предотвращено введением Tрег или ИЛ-2. У мышей, дефицитных по ИЛ-2 развиваются аутоиммуные заболевания, сходные с состояниями при дефиците Трег [55]. Дополнительным фенитипическим маркером Tрег является низкая экспрессия поверхностного маркѐра CD127 (альфа-цепи рецептора ИЛ-7 [102]. 25 Ключевую роль в дифференцировке и функционировании Трег играет транскрипционный фактор FoxP3 (forkhead helix protein 3), с наличием которого связана супрессорная активность данных клеток [60,80]. У человека экспрессия FoxP3 характерна преимущественно для CD4+CD8-CD25+ лимфоцитов, однако может осуществляться в небольшой фракции CD25клеток [183]. Мутация гена FoxP3 у человека приводит к развитию так называемой болезни IPEX (иммунная дисрегуляция, полиэндокринопатия, энтеропатия, Х-сцепленный синдром) [61]; у линии мышей Scurfy, характеризующейся мутацией гена FoxP3, аналога человеческого FoxP3, развивается состояние, сходное с IPEX. Обнаружена взаимосвязь между мутациями в данных генах и снижением количества Трег в периферическом кровотоке, что подтверждает необходимость этого гена для дифференцировки и/или выживаемости Трег [59]. Наоборот, у трансгенных мышей с повышенной экспрессией FoxP3 число Трег также возрастает [89]. Часть Трег образуется в ходе иммунного ответа – индуцибельные регуляторные клетки, iT-рег. Трег 1 типа (Тr1) - индуцируемая субпопуляция Трег, экспрессирующая маркѐры LAG3, CD49b, ICOS, PD-1 и LAP [131] и не экспрессирующая Foxp3. Тr1 осуществляют супрессорную функцию посредством синтеза ИЛ-10 и ТФР-бета. Показана их способность к подавлению разнообразных клеточных популяций, включая ДК и Тх17 [35]. Тх3-клетки - ТФР-бета-индуцируемая субпопуляция Трег, осуществляющая супресорную функцию посредством синтеза ТФР-бета, индукции экспрессии Foxp3 как в CD25+, так и в CD25− T-лимфоцитах [30]. FoxP3+ Трег индуцируемая присутствием ТФР-бета и ИЛ-2 субпопуляция Трег [36,54], в отличие от натуральных Трег быстро теряющая способность к экспрессии FoxP3+ и выполнению супрессорной функции в присутствии ИЛ-4, вырабатываемого Тх2 [153]. Вопрос о механизмах супрессии регуляторными Т-клетками эффекторных клеток до сих пор остаѐтся открытым, основными принято считать следующие механизмы: секреция цитокинов, индукция цитолиза и 26 метаболических нарушений в клетках-мишенях, воздействие на дендритные клетки. Основными ингибиторными цитокинами являются ИЛ-10, ТФР-бета [86], а также ИЛ-35 [38]. Существует гипотеза о контактном механизме осуществления супрессорной функции естественными Трег тимического происхождения [159]. Активированные человеческие Трег могут вызвать цитолиз других клеток посредством гранзима А [68], а также гранзима В и перфорина [29]. Ещѐ одним возможным путѐм воздействия на эффекторные Т-лимфоциты является метаболический: высокая экспрессия CD25 – рецептора для ИЛ-2 – на поверхности Трег способствует локальному потреблению и снижению локальной концентрации ИЛ-2, необходимого для жизнедеятельности метаболического эффекторных воздействия клеток является [44]. совместная Другим способом экспрессия Трег эктоэнзимов CD39 и CD73, способствующих образованию аденозина в микроокружении эффекторных лимфоцитов [45], что приводит к снижению экспрессии ИЛ-6 и повышению экспрессии ТФР-бета, следствием чего является угнетение образования Тх1 и Тх17 и активация адаптивных Трег [180]. Кроме воздействия на эффекторные Т-лимфоциты, Трег способны оказывать влияние и на созревание и функцию дендритных клеток посредством взаимодействия CTLA-4 Трег и рецепторов CD80/CD86 дендритных клеток [119], индуцирующим экспрессию дендритными клетками регуляторных молекул. Кроме того, Трег могут подавлять способность дендритных клеток активировать эффекторные клетки путѐм снижения экспрессии костимуляторных молекул CD80 и CD86 [33]. Также существуют исследования, показавшие возможность влияния Трег на моноциты и макрофаги [161]. Нейропилин-1, экспрессирующийся на поверхности Трег (и отсутствующий на поверхности наивных Тх0), ответственен за продление взаимодействия между Трег и дендритными клетками при распознавании антигенов, что приводит к подавлению избыточного иммунного ответа на собственные антигенные стимулы [135]. 27 Мишенями супрессорного действия Трег могут быть как Т-хелперы первого типа (Tх1), так и Tх2 [19], а также CD8+ клетки памяти [151]. Кроме того, Трег угнетают пролиферацию и продукцию антител В-клетками [27]. Интересно, что круг супрессивного влияния Трег не ограничивается CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитами [28], натуральными киллерами [177] и В-клетками [84], но также включает клетки неспецифического иммунного ответа (моноциты, макрофаги, дендритные клетки) [152] и нейтрофилы [95]. При культивировании Трег с моноцитами/макрофагами, последние приобретают фенотип альтернативно активированных макрофагов, обладающих мощным противовоспалительным действием и вовлечѐнных в процессы тканевого ремоделирования, борьбы с паразитами и опухолями [161]. На моделях у мышей было продемонстрировано, что Tрег оказывают противовоспалительный и антиатерогенный эффект [154]. В ряде исследований продемонстрировано, что введение АроЕ-/- мышам Трег приводит к значительному замедлению прогрессии атеросклероза, что проявляется формированием меньших по размеру и более стабильных атеросклеротических бляшек [57,113]. Введение животным CD25- специфических антител приводило к повышению степени сужения артерий [11]. Вмешательства, результатом которых является повышение содержания Tрег, приводят к торможению атерогенеза у экспериментальных животных [176]. 1.8. Изучение роли субпопуляций лимфоцитов в развитии атеросклероза и его осложнений у человека Значение лимфоцитарных субпопуляций в атерогенезе всесторонне изучено на модели экспериментального атеросклероза у животных. Эксперименты по изучению эффектов специфического блокирования тех или иных компонентов иммунной системы на прогрессирование атеросклероза в модели у животных расширили представление об атерогенезе (рисунок 1). 28 Однако следует отметить ряд существенных ограничений данных исследований. Рисунок 1. Упрощенная схема межклеточных взаимодействий в АСБ. Распознавание антигенов (в первую очередь липопротеидов низкой плотности и их производных) приводит к активации и пролиферации Т-хелперов 1 типа. За счѐт секреции провоспалительного цитокина ИФН-гамма Т-хелперы 1 типа стимулируют макрофаги к выработке провоспалительных цитокинов и оказывают таким образом проатерогенное действие.Функциональная активность Тх1 регулируется другими субпопуляциями лимфоцитов. Тх17 за счѐт продукции провоспалительных цитокинов (ИЛ-17) активируют Т-хелперы 1 типа и усиливают воспалительную реакцию. Регуляторные Тлимфоциты за счѐт синтеза противовоспалительных цитокинов ИЛ-10 и ТФР-бета, а также с помощью других механизмов подавляют функциональную активность Тхелперов и антиген-презентирующих клеток, тем самым оказывая противовоспалительное действие и сдерживая избыточную воспалительную реакцию в ответ на антигены. "Выключение" одного клеточного звена приводит не только к "выключению" его функций, но и к компенсаторному усилению эффектов других компонентов иммунной системы. Так, недостаток CD4+ Т-хелперов 29 был связан с компенсаторным увеличением числа CD8+ лимфоцитов, блокирование Т-клеточного звена в целом сопровождалось усилением активности В-1 лимфоцитов и увеличением содержания атеропротективных IgМ к окЛНП. Блокирование определѐнных рецепторов и косигнальных молекул Т-лимфоцитов не может быть строго специфичным, т.к. они могут быть экспрессированы другими типами клеток [12]. Вторым главным ограничением является сама экспериментальная модель атеросклероза. У мышей дикого типа атеросклеротические изменения сосудов не развиваются. Две основные модели АС основаны на нокаутировании генов, отвечающих за синтез белка АроА (компонент ЛНП, узнающийся рецептором) и рецептора ЛНП. У животных развивается выраженная дислипидемия и атероматоз крупных артерий [174]. Моделирование отдельных клинических ситуаций, характерных для человека (утолщение ТИМ, атеросклероз крупных и средних артерий, кальциноз, дестабилизация АСБ и развитие патологий, связанных с атеротромбозом), затруднено [21]. Роль лимфоцитарных субпопуляций в развитии и прогрессировании атеросклероза и его осложнений у человека наиболее изучена при ОКС (нестабильной стенокардии (НС) и инфаркте миокарда (ИМ)). Многочисленными исследователями подтверждено уменьшение содержания Трег и увеличение содержания Тх17 при ОКС. Содержание Трег (охарактеризованных как CD4+CD25+FoxP3+ и CD4+FoxP3+), экспрессия мРНК FoxP3 и уровень ТФР-бета1 в плазме были значительно снижены у пациентов с ОКС по сравнению со стабильной стенокардией (СС) и контролем [183]. Аналогичные данные об уменьшении содержания Трег и их супрессорной активности у пациентов с ОКС по сравнению с контрольной группой и пациентами с СС, были получены в более ранних исследованиях [100,114,182]. Помимо уменьшения содержания циркулирующих Трег при ОКС, исследователи обратили внимание на увеличение содержания провоспалительных клеток, в частности Тх17, и продуцируемых ими 30 цитокинов при ОКС, что свидетельствует о нарушении иммунного баланса у данной категории пациентов. Han с соавт. (2007) было выявлено, что у пациентов с ОКС (нестабильная стенокардия (НС) и ИМ) по сравнению с СС содержание Трег в периферической крови CD4+CD25+FoxP3+ оказалось ниже при одновременном повышении содержания Тх1 [69]. Аналогично, Hu с соавт. (2007) выявили, что у пациентов с ОКС снижены содержание Трег и их супрессорная активность, а также уровни ИЛ-10 и ТФР-beta1, и увеличено содержание ИФН-гамма по сравнению с контролем [82]. В исследование Cheng с соавт. (2008) были включены пациенты с ОКС (НС и ИМ) и СС, лица без коронарного атеросклероза составили контрольную группу. У пациентов с ОКС было выявлено увеличение содержания в периферической крови Tх17, цитокинов ИЛ-17, ИЛ-6 и ИЛ-23, а также экспрессии RORgammat при одновременном снижении содержания Трег и концентраций ИЛ-10 и ТФР-beta1, а также уменьшении экспрессии FoxP3 в клетках по сравнению с пациентами со СС и контрольной группой [37]. Аналогично, согласно данным Zhao с соавт. (2011), у пациентов с ОКС повышено соотношение Tх17/Tх1, количество Tх1 клеток и экспрессия T-bet, ИФН-гамма, STAT4, RORгаммаt, STAT3 и ИЛ-17, с одновременным снижением содержания Трег, экспрессии FoxP3 и уровня ТФР-бета1 в плазме по сравнению с пациентами со СС и контрольной группой [184]. В исследование Li с соавт. (2010) были включены пациенты с ОКС (ОИМ и НС), СС и пациенты контрольной группы без значимого поражения коронарного русла по результатам коронарной ангиографии (КАГ). Доля Трег (идентифицированных как CD4+CD25high, CD4+CD25+CD127low, CD4+CD25+FoxP3+) от CD4+ клеток оказалась ниже у пациентов групп ИМ и НС по сравнению с остальными (группы со СС и с малоизменѐнными КА). У пациентов со СС доля Трег оказалась ниже по сравнению с пациентами с интактными КА. Доля Тх17 у пациентов сИМ и НС оказалась выше по сравнению с остальными пациентами. При сравнении группы СС и 31 контрольной группы различия в содержании указанных субпопуляций оказались незначимы. При определении содержания цитокинов в сыворотке пациентов, выявлено, что уровень ИЛ-10 был значимо ниже у пациентов групп ИМ и НС, а уровень ИЛ-17, наоборот, был значимо выше у пациентов сИМ и НС по сравнению с остальными. Выявлены различия в содержании цитокинов также между группами со СС и контрольной (содержание ИЛ-17 оказалось выше, а ИЛ-10 - ниже в группе СС). Содержание охЛНП было значимо ниже у пациентов сИМ и НС, имела место обратная корреляция между содержанием окЛНП и Трег, окЛНП и ИЛ-10, прямая корреляция между содержанием окЛНП и Тх17, окЛНП и ИЛ-17. При дальнейшем исследовании активности лимфоцитов, выделенных из крови пациентов, было показано, что супрессивная способность Трег, выделенных из крови пациентов групп ИМ и НС, оказалась значимо ниже по сравнению с остальными группами. Супрессивная способность Трег, выделенных из периферической крови пациентов со СС, была ниже по сравнению с контрольной группой [97]. Продемонстрировано, что соотношение Трег/Тх17 является чувствительным маркѐром нестабильности АСБ и ОКС [98], нарушение баланса в пользу провоспалительного компонента отмечено при кардиогенном шоке [46]. Исследователями Ammirati с соавт. (2010) не выявлено значимого различия содержания Трег и экспрессии мРНК FoxP3 у пациентов со стабильной стенокардией по сравнению со здоровыми лицами. Напротив, отмечены статистически значимо более высокие уровни Трег у пациентов с ОКС с подъѐмом сегмента ST и более низкие - при ОКС без стойкого подъѐма ST по сравнению с контролем. Следует отметить, что выраженность коронарного атеросклероза в данном исследовании не верифицировалась с помощью КАГ, а оценивалась лишь по клиническим признакам. Авторы не показали различий в содержании Трег у лиц с начальными атеросклеротическими изменениями в бассейне сонных артерий (увеличение 32 толщины комплекса интима-медиа (ТИМ)) и различной скоростью увеличения ТИМ [14]. И.Н. Николаевой с соавт. (2012) выявлено увеличение содержания Трег в крови у пациентов с НС по сравнению с условно здоровыми лицами. Авторы связывают это явление с напряжением регуляторных систем, направленным на подавление воспалительного процесса в АСБ [6]. Противоречивые данные касаются также изменения содержания цитокинов крови у пациентов с ОКС. В то время как большинство исследователей показали уменьшение уровня ИЛ-10 у пациентов с ОКС по сравнению с пациентами со СС и контролем [37,79,82,97], Waehre с соавт. (2002) не выявили данную закономерность [171]. Simon с соавт. (2013) указывают на неблагоприятный прогноз у пациентов сИМ, у которых не произошло увеличения концентрации ИЛ-17 в крови в острый период заболевания [140]. В исследование George с соавт. (2012) были включены пациенты с различной выраженностью коронарного атеросклероза, с повторными ИМ в анамнезе и с неотягощѐнным анамнезом. Было показано, что у пациентов с повторными ИМ в анамнезе (т.е. с нестабильным течением атеросклероза КА), содержание Трег и ИЛ-10 ниже, чем у пациентов без ИМ в анамнезе [64]. Предиктивная значимость содержания популяции регуляторных Тклеток в отношении прогрессирования ИБС и развития еѐ обострений была рассмотрена в работе Wigren с соавт. (2012). В проспективном исследовании были проанализированы данные иммунного статуса 700 пациентов пожилого возраста, за которыми проводилось наблюдение с 1991-1994 по 2008 годы. Исследователями показано, что содержание CD4+FoxP3+ Tрег на момент включения в исследование было ниже у пациентов, перенесших ИМ за период наблюдения, по сравнению с пациентами без осложнений [175]. АС является системным заболеванием и поражает различные сосудистые бассейны. В исследовании Liu с соавт. (2012) пациенты с 33 выявленным атеросклерозом сонных артерий по данным ультразвукового дуплексного сканирования (УЗДС) сонных артерий разделены на группы по степени стеноза и ультразвуковым характеристикам (отсутствие АСБ, плоские, мягкие, твѐрдые, изъязвлѐнные АСБ). Содержание Тх17 и цитокинов ИЛ-17, ИЛ-6 и ФНО-альфа в крови оказалось выше у пациентов с большей степенью стеноза сонных артерий. Аналогичная взаимосвязь наблюдалась и с типом АСБ: наибольшие значения указанные показатели имели у пациентов с более тяжѐлым стенозом и изъязвлѐнными АСБ [103]. При разделении пациентов с атеросклеротическими изменениями БЦА по характеру АСБ (стабильные, нестабильные, отсутствие АСБ) и анализе содержания Трег, Тх17 и продуцируемых ими цитокинов Liu с соавт, (2012) было показано, что по сравнению с контролем содержание Тх17 и провоспалительных цитокинов (ИЛ-17, ИЛ-6, ИЛ-23 и ФНО-альфа), а также мРНК RORgammat были выше в группе со стабильными АСБ по сравнению с контролем, и наиболее высокими в группе с нестабильными АСБ. Напротив, содержание Трег (CD4+CD25+FoxP3+), концентрация цитокинов (ИЛ-10 и ТФР-бета1) и мРНК FoxP3 были ниже у пациентов с выявленными АСБ по сравнению с контролем, и наиболее низкие значения данных показателей выявлены в группе с нестабильными АСБ [104]. Исследователями Li с соавт. (2013) были проанализированы данные пациентов с ишемическим мозговым инсультом, транзиторными ишемическими атаками и контрольной группой, исследование БЦА проводилось с помощью ангиографического метода. У пациентов с инсультом выявлено повышение содержания Тх17, экспрессии RORgammat и сывороточных концентраций провоспалительных цитокинов ИЛ-17 и ИЛ-6 при одновременном снижении содержания Трег и уменьшении их супрессивной функции, уменьшении экспрессии FoxP3 и концентраций ИЛ10 и ТФР-бета. Концентрация окЛНП в сыворотке была пропорциональной уровню Тх17 и обратно - количеству Трег [99]. прямо 34 1.9. Лимфоциты, распознающие антигены в атеросклеротической бляшке АСБ человека получают во время оперативного лечения пациентов с выраженным АС поражением сосудистых бассейнов, клетки выделяют после ферментативной обработки структур АСБ. В АСБ выявлены различные лимфоцитарные субпопуляции, в том числе и Трег [141], что свидетельствует в пользу их вовлечения в атерогенез у человека. Лимфоцитарный состав АСБ значительно отличается от такового периферической крови. Ж.Ш. Гривель с соавт. (2012) показали, что различные клеточные субпопуляции неравномерно распределены между кровью и тканью АСБ. Наибольшее обогащение АСБ по сравнению с кровью наблюдалось по CD8+ лимфоцитам. CD4+ и особенно CD8+ Т-лимфоциты находились в АСБ в активированном состоянии (что оценивалось по экспрессии клетками поздних маркѐров активации CD25, CD38 и HLA-DR) [1]. Следует отметить, что авторы оценивали общие клеточные субпопуляции без выделения АГ специфических клеток. de Boer с соавт. (1997) документировали присутствие в АСБ человека лимфоцитов, экспрессирующих костимуляторные молекулы (B7-1, CD28 и CD70), участвующие в процессах распознавании АГ. Наибольшее их количество было сосредоточено в покрышке АСБ, в то время как в липидном ядре их содержание было минимальным. Таким образом, авторы доказали участие адаптивной компоненты иммунитета в атерогенезе у человека, однако отметили, что лишь небольшая часть лимфоцитов (5-15%), присутствующих в АСБ, принимает участие в процессе презентации АГ [43]. Из АСБ сонных артерий, полученных при эндартерэктомии у пациентов с ОНМК, исследователями выделены клоны Т-лимфоцитов, активирующиеся в присутствии окЛНП. В тоже время, в кровотоке тех же пациентов CD4+ лимфоцитов, узнающих данный АГ, выявлено не было. Пролиферативная активность мононуклеарных клеток, выделенных из 35 периферической крови, оценивалась по включению радиоактивной Н3тимидиновой метки в ДНК [149]. В АСБ также выявлены клеточные клоны, специфичные по отношению к другим антигенам. Так, Curry с соавт. (2000) показали наличие в АСБ человека Т-клеток, отвечающих на антигены C. pneumoniae (OMP2 и белок теплового шока 60 hsp60) [39]. 1.10. Иммуномодулирующие эффекты окЛНП Помимо триггерной роли в развитии воспалительных реакций в сосудистой стенке дополнительные окЛНП, по данным иммуномодулирующие ряда исследований, эффекты, имеют влияющие на выживаемость и функциональную активность лимфоцитов. Общеизвестно, что рецептор ЛНП синтезируется практически во всех ядерных клетках организма. ЛНП регулируют активацию или ингибирование транскрипции гена рецептора. При недостатке холестерина клетка инициирует синтез ЛНП-рецептора, а при избытке — наоборот, блокирует его. В ряде исследований показано стимулирующее влияние ЛНП на пролиферацию и функцию лимфоцитов. Так, в работе Cuthbert с соавт. (1984) было продемонстрировано, что ЛНП в низких концентрациях (до 10 мкг/мл) вызывают ЛНП-рецептор-опосредованное увеличение пролиферации клеток. В то же время в высоких дозах (100 мкг/мл) ЛНП вызывают независимое от рецептора угнетение митоген-стимулированной пролиферации лимфоцитов [40]. Аналогично, в исследовании Caspar-Bauguil с соавт. (1998) клетки выделенной из крови мононуклеарной фракции (Т-, В-лимфоциты, натуральные киллеры, моноциты) культивировали в течение 24-72 часов в присутствии ЛНП в концентрациях 100 и 200 мкг/мл, а также 10 мкг/мл окЛНП, полученными путѐм облучения УФ. Пролиферацию оценивали по включению Н3-тимидина, который добавляли в культуру в последние 16 36 часов эксперимента. Было показано, что ЛНП в концентрации 100 мкг/мл стимулировали пролиферацию лимфоцитов, а в дозе 200 мкг/мл (0,5 ммоль/л) - подавляли.окЛНП в концентрации менее 100 мкг/мл (0,25 ммоль/л) ингибировали пролиферацию лимфоцитов и экспрессию рецептора ИЛ-2 на поверхности клеток [31]. Присутствие окЛНП в культуре приводило к подавлению связывания ядерного транскрипционного фактора кВ с ДНК и снижению уровня синтеза ИЛ-2 активированными лимфоцитами [32]. В экспериментах, проведѐнных Alcouffe с соавт. (1999), с использованием мононуклеарных клеток периферической крови здоровых добровольцев, а также клеточной линией Т-лимфоцитов Jurkat, было показано, что ЛНП в высоких концентрациях (более 200 мкг/мл), а также окЛНП вызывают не только уменьшение пролиферативного ответа клеток, но и их апоптоз (что подтверждалось выявлением фрагментации ядра и ДНК, а также увеличением экспрессии раннего маркѐра апоптоза белка Аро2.7 в культуре лимфоцитов человека) [13]. Mor с соавт. (2006) в эксперименте in vitro показали, что окЛНП оказывают более выраженное подавляющее влияние на Трег, выделенные из периферической крови пациентов с ОКС, по сравнению с пациентами со СС и контролем, что может, по мнению авторов, объяснять дестабилизирующее действие окЛНП на АСБ и их роль в патогенезе ОКС [114]. Противоречащие предыдущим исследованиям результаты были получены в работе Li с соавт. (2010). Исследователями проводился анализ влияния окЛНП на содержание различных клеточных субпопуляций invivo в культуре. В исследовании приведены клинические данные о повышении содержания Тх17 и ИЛ-17 при уменьшении содержания Трег и ИЛ-10 в крови пациентов с ОКС (ИМ и НС) параллельно с увеличением содержания окЛНП (в среднем, 0,3-0,4 мкг/мл), что косвенно может свидетельствовать о провоспалительной роли окЛНП in vivo. Для подтверждения влияния окЛНП на иммунокомпетентные клетки, играющие роль в атерогенезе, 37 исследователи в экспериментальной части работы культивировали выделенные мононуклеарные клетки здоровых добровольцев в среде с различным содержанием окЛНП в течение 24 и 48 часов. Авторы показали, что по мере увеличения концентрации окЛНП в среде культивирования и продолжительности инкубации уменьшалось содержание Трег и увеличивалось содержание Тх17 (в процентном соотношении от CD4+ клеток; данных анализа динамики содержания CD4+ от всех мононуклеарных не представлено). При этом более значительное влияние окЛНП на содержание Трег и Тх17, а также супрессивную функцию Трег было получено при использовании клеток от пациентов сИМ и НС по сравнению с пациентами групп СС и контроля. Значимых различий в содержании цитокинов в среде культивирования в исследуемых группах получено не было [97]. 1.11. Заключение Атеросклероз – многофакторное хроническое заболевание. В результате воздействия совокупности окислительных, гемодинамических, биохимических стимулов и воспалительных факторов происходит нарушение эндотелиального слоя, проявляющееся в преобладании тромбогенных и сосудосуживающих эффектов, а также в накоплении в сосудистой стенки провоспалительных клеток и холестерин-содержащих молекул липопротеидов низкой плотности. Роль лимфоцитарных субпопуляций в развитии стенозирующих поражений артерий на сегодняшний день является предметом исследований ведущих лабораторий. Тх17, секретируя провоспалительные цитокины, в первую очередь, ИЛ-17, усиливают локальный воспалительный ответ в сосудистой стенке и способствуют прогрессированию АС и дестабилизации АСБ. На моделях атеросклероза у мышей была показана важная роль Трег в подавлении атерогенеза и стабилизации атеросклеротических поражений. Считают, что такое действие 38 Трег обусловлено супрессорной активностью в отношении «проатерогенных» Т-эффекторных лимфоцитов и макрофагов, а также с продукцией противовоспалительных цитокинов. Полученные в экспериментах на животных данные клинически подтверждены у пациентов с ОКС. В то же время у пациентов со стабильным течением ИБС этот вопрос изучен недостаточно. 39 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1. Клиническое обследование пациентов, включенных в исследование В период с октября 2012 года по октябрь 2014 года в исследование включено 132 пациента с ИБС, стабильной стенокардией, в возрасте 34-83 года. Критериями исключения служили: 1. ОКС, ИМ в предшествующие 6 месяцев, наличие в анамнезе ИМ оценивалось по критериям ESC/ACCF (2012) [160]; 2. Оперативные вмешательства (в том числе транслюминальная баллонная ангиопластика коронарных артерий (ТБКА) со стентированием КА, коронарное шунтирование) в предшествующие 6 месяцев; 3. Развитие рестеноза в стентированном ранее сосуде; 4. Злокачественные новообразования; 5. Тяжѐлая почечная или печѐночная недостаточность; 6. Наличие воспалительных/инфекционных заболеваний; 7. Сахарный диабет в стадии декомпенсации; 8. Приѐм иммунотропной терапии. В соответствии с критериями исключения из 132 обследованных пациентов 11 были исключены: 8 - в связи с развитием рестеноза в ранее стентированном сосуде, 1 - с манифестацией миелоидного лейкоза, 1 - с герпес-вирусной инфекцией, 1 - с пневмонией. Таким образом, участие в исследовании продолжили 121 человек, которые распределялись в 4 группы в зависимости от стадии и степени прогрессирования коронарного атеросклероза по данным коронарной ангиографии (КАГ). Группу 1 составили пациенты с неизменѐнными КА (n=28). 40 В группу 2 и 3 включались пациенты с ранее выполненным стентированием КА. У пациентов группы 2 (n=32) не было отмечено прогрессирования атеросклероза в сравнении с данными ранее выполненной КАГ, у пациентов группы 3 (n=24) зарегистрировано прогрессирование коронарного АС - появление ранее отсутствовавшего стеноза магистральной КА более 50% в сосуде, ранее не подвергавшемся коронарному стентированию (рисунок 2). Стентирование выполнялось за 23,8±8,4 (группа 2) и 22,4±8,7 (группа 3) месяца до включения в исследование (межгрупповые различия незначимы). Группу 4 составили пациенты с многососудистым поражением КА (n=37). Тяжесть атеросклеротического поражения коронарного русла (степень сужения просвета в зависимости от локализации - проксимального, среднего или дистального отделов артерии) оценивалась по модифицированной шкале Gensini у 30 пациентов (88%) группы 4, которым ранее не проводилось стентирование КА [63]. Всем пациентам проводилось стандартное клиническое обследование [3,157], включавшее в себя: 1. Общеклиническое обследование (сбор анамнеза, физикальный осмотр, аускультация, измерение артериального давления); 2. Электрокардиографическое исследование в 12 стандартных отведениях; эхокардиография; суточное мониторирование ЭКГ; проба с дозированной физической нагрузкой или перфузионная сцинтиграфия миокарда с 99mТс-МИБИ по протоколу покой-нагрузка; 3. Общий и биохимический анализ крови. 4. Селективная использованием КАГ. КАГ общепринятой проводилась техники. лучевым Наличие доступом коронарного с АС определяли по степени стеноза просвета магистральных КА, все результаты оценивались двумя опытными операторами. 41 Рисунок 2. Пример КАГ пациента из группы 3, которому ранее выполнялась ТБКА со стентированием правой коронарной артерии (ПКА). На левом рисунке – ангиограмма бассейна левой коронарной артерии (ЛКА) сразу после выполнения вмешательства, на правом рисунке – ангиограмма спустя 18,6 месяцев, красной стрелкой отмечен «новый» гемодинамически значимый стеноз, суживающий просвет огибающей артерии (ОА). Учитывая, что АС является системным заболеванием, затрагивающим различные артериальные бассейны, в работе были проанализированы данные пациентов, включѐнных в исследование, в зависимости от степени поражения брахиоцефальных артерий (БЦА). Шестидесяти шести пациентам из числа включѐнных в исследование выполнено УЗДС экстракраниального отдела БЦА. Исследование проводили с помощью линейного датчика с частотой 17,5 МГц (PHILIPS iU22 ultrasound system, Philips Inc., Eindhoven, the Netherlands). Все измерения выполнены в общей сонной артерии (ОСА), еѐ бифуркации и внутренней сонной артерии (ВСА) с обеих сторон и включали в себя оценку в продольных (передней косой, боковой, задней косой) и поперечной проекциях. ОпределениеТИМиАСБпроводилисогласнопротоколуConsensusStatementfrom theAmericanSocietyofEchocardiographyCarotidIntima-MediaThicknessTaskForce (2008) [147]. ТИМ > 0,9 мм расценивали как утолщение комплекса интимамедиа. Критериями АСБ служили выявление структуры, выдающейся в просвет артерии более чем на 0,5 мм или на 50% от ТИМ соседних участков артериальной стенки, увеличение ТИМ на 1,5 мм и более или сужение 42 просвета артерии на 20% и более. В зависимости от максимальной степени стеноза ОСА и ВСА, пациенты сформировали 3 группы: группа 1’ – пациенты с увеличением ТИМ, локальными АСБ или диффузными АСБ и стенозом менее 30% (n=15) (рисунок 3а); группа 2’ – пациенты с пролонгированным (диффузным) поражением каротидного бассейна и максимальной степенью стеноза менее 50% (n=29) (рисунок 3б);группа 3’ – пациенты с диффузным поражением брахиоцефальных артерий и максимальной степенью стеноза 50% и более (n=22) (рисунок 3в). Рисунок 3. Примеры УЗДС: а – утолщение ТИМ, плоская атеросклеротическая бляшка, суживающая просвет артерии менее чем на 30% (группа 1’), б – гетерогенная атеросклеротическая бляшка, суживающая просвет артерии на 40% (группа 2’), в – гомогенная гипоэхогенная атеросклеротическая бляшка, суживающая просвет артерии более чем на 50% (группа 3’). Пациенты всех групп получали на момент включения в исследование (до проведения КАГ) стандартную для больных ИБС терапию [3,157]: бета-блокаторы, аспирин, статины, при наличии показаний также назначались клопидогрел, антикагулянты, иАПФ, антагонисты кальция. Как видно из таблицы 2, группы больных были сопоставимы по частоте приема бета-блокаторов, аспирина, ангиотензин-превращающего клопидогрела, фермента статинов, (иАПФ)/блокаторов ингибиторов рецепторов ангиотензина (БРА) и антагонистов кальция. Дозы препаратов определялись врачами амбулаторной практики до госпитализации пациента; после 43 поступления в стационар и обследования пациентов дозы корректировались с учѐтом целевых значений показателей и сопутствующих заболеваний. Клиническая характеристика групп пациентов представлена в соответствующих разделах главы «Результаты». 2.2. Получение образцов крови Образцы периферической венозной крови получали перед проведением КАГ. Взятие крови осуществляли из кубитальной вены через 12 часов после приема пищи между 8 и 10 часами утра. Образцы периферической крови забирали в пробирки без антикоагулянта и в цитратный антикоагулянт. Для получения сыворотки образцы центрифугировали в течение 20 минут при 2000 g и в дальнейшем хранили при -70оC. Для исследования субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови образцы крови забирали в цитратный антикоагулянт и хранили не более 2 ч до иммунофенотипирования клеток. Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов крови проводили в течение 24 часов после окрашивания. 2.3. Получение и активация мононуклеарных клеток в культуре Мононуклеарные клетки выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности по методике Boyum [22]. Клетки в концентрации 5 млн/мл ресуспендировали в среде RPMI 1640, содержащей 5% пулированной сыворотки человека. Для активации клеток в культуру вносили 25 нг/мл форболмиристатацетата (ФМА), 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина (все реактивы Sigma). Клетки инкубировали 5 ч при 37°С и 5% СО2. 2.4. Выделение CD4+ лимфоцитов методом иммуномагнитной сепарации из мононуклеарной фракции крови здоровых добровольцев 44 Мононуклеарные клетки, выделенные из крови доноров, разводили в рабочем буфере (фосфатно-солевой буфер (ФБ) без Ca2+ и Mg2+ (рН 7.4), 0.5 % бычьего сывороточного альбумина, 2 мМ ЭДТА), 10 млн клеток в 80 мкл буфера. Для сепарации клеток использовали наборы производства MiltenyiBiotec. К клеткам добавляли магнитные бусы, конъюгированные с антителами к CD4 из расчета 20 мкл на каждые 10 млн клеток и инкубировали 15 минут при температуре 6-8оС. После инкубации клетки отмывали центрифугированием (300 g, 10 минут, +4 оС) в рабочем буфере, и клеточный осадок ресуспендировали в рабочем буфере из расчета 500 мкл буфера на каждые 100 млн клеток. Для получения фракции CD4+ Тлимфоцитов клеточную суспензию наносили на установленную в магнитном держателе колонку. Для удаления клеток, не экспрессирующих CD4, колонку промывали не менее трех раз рабочим буфером, после чего оставшиеся клетки снимали с колонки и отмывали в ФБ. Количество выделенных клеток подсчитывали в камере Горяева. Для определения чистоты полученной популяции клетки окрашивали антителами к CD3 и CD4, анализ связывания антител проводили на поточном цитофлюориметре. Содержание CD4+ лимфоцитов в выделенной фракции составляло 95-98%. 2.5. Иммунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и внутриклеточных антигенов) методом цитофлуориметрии в потоке Для выявления поверхностных антигенов использовали флуоресцентно меченные моноклональные антитела CD4-FITC, -PC5, CD25-PC5, CD127-PE, CD45-APC (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, eBioscience, BeckmanCoulter). Окрашивание поверхностных антигенов проводили в цитратной крови c использованием растворов для лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) и в культуре мононуклеарных внутриклеточных белков лейкоцитов. использовали Для наборы идентификации для фиксации и 45 пермеабилизации клеток (eBioscience) и флуоресцентно меченные антитела (FoxP3-Аlexa488, IL17А-РЕ, IL-10-PE, и IFN gamma-FITC, eBioscience). Окрашивание клеток антителами к цитокинам проводили после активации в культуре. Лизис эритроцитов, окрашивание лейкоцитов, фиксацию и пермеабилизацию производителей. клеток проводили Флюоресценцию цитофлуориметрии в потоке в соответствии клеток (FACS Сalibur, с протоколами измеряли методом Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Лимфоциты выделяли по параметрам прямого и бокового светорассеяния (рисунок 4) и по экспрессии CD45. Tрег типировали как СD4+CD25highCD127low (рисунок 5а) и CD4+FoxpP3+ (рисунок 5б) Т-лимфоциты, ИЛ-10 продуцирующие Тлимфоциты типировали как CD4+IL10+ (рисунок 5в). Тх1 и Tх17 типировали как CD4+IFNgamma+ (рисунок 5г) и CD4+IL17+ (рисунок 5д) Т-лимфоциты, соответственно. Активированные Т-лимфоциты (Такт) типировали как CD4+CD25lowCD127high клетки. Для определения количества апоптотических клеток пробы дополнительно окрашивали Аннексином V- FITC согласно протоколу производителя (BeckmanCoulter). 2.6. Определение содержания ИЛ-17, ИЛ-10, вчСРБ, sCD25 в крови больных Исследование концентрации sCD25 и ИЛ-10 в сыворотке крови проводили хемилюминесцентным методом на анализаторе Immulite 1000 (DPC - Siemens). Концентрацию ИЛ-17 в плазме крови измеряли иммуноферментным методом с использованием набора Bender MedSystems. Концентрацию СРБ определяли высокочувствительным нефелометре Bering Marburg GmbH, Dade (Германия - США). методом на 46 Рисунок 4. Примеры выделения лимфоцитов по параметрам прямого и бокового светорассеяния (а – в периферической крови, б – в мононуклеарной фракции). Рисунок 5. Примеры типирования субпопуляций лимфоцитов у малоизменѐнными КА и многососудистым поражением коронарного русла. пациентов с 47 2.7. Получение окЛНП окЛНП были любезно предоставлены в.н.с. лаборатории проблем атеросклероза ИЭК РКНПК О.И. Афанасьевой. Кратко, ЛНП выделяли из пулированной сыворотки методом ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте нейтральной соли NaBr [123], окисляли 12 часов в присутствии 30 мкМ Cu++ (CuSO4 x 5H2O) при 37оС и проводили диализ против ФБ согласно методике, описанной в работе В.З. Ланкина с соавт [4]. 2.8. Культивирование мононуклеарных и CD4+ клеток в присутствии окЛНП Выделенные мононуклеарные клетки или CD4+ лимфоциты, полученные от здоровых добровольцев и пациентов с коронарным атеросклерозом, 2-4 млн/мл, переводили в культуральную среду RPMI 1640, содержащую 10% инактивированной пулированной сыворотки человека, 10 мМ HEPES по 100 Ед/мл пенициллина и стрептомицина, 2 мМ L-глютамина, 20 мкМ меркаптоэтанола, по 1% пирувата и смеси неэссенциальных аминокислот. При культивировании CD4+ лимфоцитов в среду культивирования дополнительно вносили рекомбинантный интерлейкин-2 человека (Cys145Ser, RandDSystems) в количестве 4 нг/мл. Клетки культивировали в 24-луночных с плоским дном или 96луночных планшетах с U-образным дном в течение 24 (для мононуклеарных) или 48 часов (для СD4+) в СО2-инкубаторе при 37оС и 5% СО2. В опытные ячейки добавляли окЛНП в концентрации 5 и 50 мкг/мл. При анализе количества ИЛ-2-продуцирующих Т-клеток методом ELISPOT в качестве позитивного контроля использовали клетки, культивированные в присутствии фитогемагглютинина (митоген для Т-лимфоцитов, Sigma) в концентрации 5 мкг/мл. 48 Для оценки относительного содержания лимфоцитарных субпопуляций (Тх1, Тх17) в последние 4 часа инкубации в среду культивирования клеток вносили 25 нг/мл ФМА, 1 мкг/мл иономицина и 10 мкг/мл монензина (все реактивы Sigma). Образцы среды кондиционирования клеток отбирали на 2 и 4 сутки и замораживали при -70оС. 2.9. Определение лимфоцитов, активированных в присутствии окЛНП методом ELISPOT В данном эксперименте использовали клетки мононуклеарной фракции, выделенные из периферической венозной крови здоровых добровольцев (n=8, средний возраст 40,4 лет) и пациентов с ИБС (n=10, средний возраст 57,8 лет), верификацию ИБС и коронарного АС проводили c использованием нагрузочных стресс-тестов и КАГ/ мультиспиральной компьютерной томографии коронарных артерий). Выявление лимфоцитов, активированных в присутствии продуцируемого ими ИЛ-2 окЛНП, методом производили ELISPOT, по согласно производителя (BectonDickinson). Клетки культивировали в детекции протоколу 96-лучноных плашках в концентрации 200 тыс клеток в 200 мкл среды. Для каждой пробы методом иммунофлюоресценции и поточной цитометрии определяли количество Т-лимфоцитов (CD3+CD45+ клеток) в составе мононуклеарной фракции; количество активированных лимфоцитов нормировали на общее содержание Т-лимфоцитов. Количество ИЛ-2 продуцирующих клеток определяли визуально путем подсчета окрашенных пятен на дне планшетов. 49 2.10. Определение концентрации цитокинов в среде культивирования лимфоцитов Концентрацию ИЛ-1бета, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17, ФНО-альфа, ИНФ-гамма в супернатанте иммунофлуоресцентным методом культур с клеток (n=13) использованием измеряли наборов CBA (CytometricBeadArray) (BectonDickinson) согласно протоколу производителя, а также иммуноферментным методом ELISA с использованием наборов Bender MedSystems согласно протоколу производителя. 2.3. Статистический анализ данных Нормальный характер распределения данных оценивали критерием ШапироУилка. В случае соответствия распределения признака нормальному закону данные в таблицах указывали как среднее ± стандартное отклонение, в случае несоответствия распределения данных нормальному закону – как медиана (25й-75й перцентили). В случае соответствия распределения признака нормальному закону и сопоставимых по размеру выборок для множественного межгруппового сравнения использовали метод ANOVA, для попарных межгрупповых сравнений - t-критерий Стьюдента. В случае несоответствия распределения признака нормальному закону, малого объѐма выборок или различий в размере выборок для множественного межгруппового сравнения использовали тест медиан и критерий КраскаллаУоллиса, для попарных межгрупповых сравнений - U-критерий МаннаУитни. Для сравнения показателей в малых выборках в динамике использовали непараметрический парный тест Уилкоксона для зависимых выборок. Для сопоставления групп по качественным признакам (пол, распространѐнность АГ, статус курения, ИМ в анамнезе) использовали критерий Хи-квадрат, в случае малых групп – Хи-квадрат с поправкой Йетса. 50 Корреляционный анализ проводили с использованием метода Спирмена. Анализ чувствительности метода проводили при помощи построения ROCкривых [48]. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. В работе применялся пакет статистических программ Statistica 7,0. 51 3.РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаленияу пациентов с различной выраженностью и скоростью прогрессирования атеросклероза коронарных артерий В таблице 3 представлена клиническая характеристика пациентов, включѐнных в исследование. Число активных курильщиков было выше в 4 группе по сравнению с остальными, по остальным клинико-анамнестическим характеристикам и лабораторным показателям группы значимо не различались. Суммарное количество стентированных сосудов в группе 2 составило 41 (ПНА – 17 (53%), ПКА – 14 (43%), ОА – 10 (31%)), в группе 3 – 30 (ПНА – 12 (50%), ПКА - 12 (50%), ОА – 6 (25%)), локализация прогрессирования АС коронарных артерий в группе 3 - ПНА – 11 (46%), ПКА -9 (38%), ОА – 6 (25%). Как следует из таблицы 4 и рисунка 6, содержание Трег (CD4+CD25highCD127low и CD4+FoxP3+) и CD4+IL10+ T-лимфоцитов было ниже у пациентов с многососудистым атеросклеротическим поражением КА (группа 4) по сравнению с пациентами без значимого поражения КА (группа 1). Содержание Тх17 было выше у пациентов с прогрессированием коронарного АС (группа 3) и пациентов с многососудистым поражением коронарного русла (группа 4) по сравнению с группами 1 и 2. Отношение CD4+FoxP3+Tрег/Tх17 было ниже у пациентов с прогрессированием коронарного АС (группа 3) и пациентов с многососудистым поражением коронарного русла (группа 4) по сравнению с пациентами без значимого атеросклеротического поражения КА (группа 1) и без прогрессирования коронарного АС (группа 2) (рисунок 6 а-г), аналогичные закономерности наблюдались для отношения CD4+CD25highCD127low Трег/Тх17. 52 Таблица 2. Медикаментозная терапия на момент анализа иммунологических показателей. Бета-блокаторы Аспирин Статины, в т.ч.: - длительный (>1 мес) приѐм - менее 1 мес приѐм иАПФ/БРА Клопидогрел Антагонисты кальция Группа1 23 (82%) 25 (89%) 24 (86%) 6 18 21 (75%) 13 (46%) 6 (21%) Пациенты (n=121) Группа 2 Группа 3 30 (94%) 23 (96%) 32 (100%) 24 (100%) 32 (100%) 23 (96%) 25 23 7 0 24 (75%) 21 (88%) 15 (46%) 16 (67%) 8 (25%) 5 (21%) p Группа 4 36 (97%) 37 (100%) 35 (94%) 30 5 34 (92%) 24 (65%) 14 (39%) 0,09 0,29 0,15 0,13 0,24 0,25 Таблица 3. Клиническая характеристика пациентов, включѐнных в исследование. Сопоставление групп с различной степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий. Пол, мужчины Возраст, лет ИМТ, кг/м2 АГ Анамнез ИМ Лейкоциты, млн/мл Лимфоциты, млн/мл Курение ХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л Группа1 n=28 18 (64%) 68±7,0 28±3,8 22 (78%) 0 7,4±1,7 2,3±0,8 6 (21%) 5,2±1,3 1,6±0,7 5,26±0,5 Пациенты (n=121) Группа 2 Группа 3 n=32 n=24 28 (88%) 20 (83%) 62±12 61±11 29±5,1 30±4,5 24 (75%) 21 (88%) 17 (53%) 12 (50%) 6,8±1,7 7,8±1,6 2,1±0,6 2,6±0,7 8 (25%) 6 (25%) 4,8±0,8 4,9±0,9 1,8±1,4 1,9±1,1 5,25±1,2 5,3±1,3 р Группа 4 n=37 26 (70%) 65±9,0 29±5,1 31 (83%) 21 (57%) 7,8±2,3 2,4±0,6 16 (46%)* 4,7±1,2 1,7±0,7 5,3±1,1 0,07 0,40 0,32 0,41 0,80 0,28 0,83 0,01 0,45 0,75 0,81 Представлен уровень значимости при сравнении данных в четырѐх группах; в случае статистически значимых различий представлены значения р, зарегистрированные при попарном сравнении в группах 53 Таблица 4. Содержание клеточных субпопуляций и «растворимых» маркѐров воспаления в крови больных. Сопоставление групп с различной степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий. CD4+ (% от лимфоцитов) CD4+CD25highCD127low Трег (%CD4+) CD4+FoxP3+ Трег (%CD4+) Тх17 (%CD4+) Тх1 (%CD4+) CD4+IL10+ Т-лимфоциты (%CD4+) CD4+FoxР3+ Трег/Тх17 CD4+CD25highCD127low Трег/Тх17 sCD25 (Ед/мл) ИЛ-10 (пг/мл) ИЛ-17 (пг/мл) вчСРБ (мг/л) Группа 1 n=28 42 (36-50) 5,00 (3,89-6,94) 8,28 (6,89-9,74) 1,07 (0,76-1,45) Пациенты (n=121) Группа 2 Группа 3 n=32 n=24 39 (32-44) 39 (35-43) 4,24 (3,32-5,70) 4,45 (3,36-6,11) 7,13 (5,68-9,41) 7,27 (6,45-9,36) 1,10 1,32 (0,76-1,66) (0,96-2,19) Группа 4 n=37 43,4 (36-48) 3,90 (2,75-4,56) 6,58 (5,74-7,92) 1,64 (0,90-2,02) 24,2 (13,4-35,6) 5,09 (2,36-6,43) 7,10 (5,52-10,0) 19,9 (11,6-25,2) 4,08 (3,21-4,65) 6,67 (4,20-12,3) 17,3 (13,2-27,9) 3,56 (2,50-6,39) 5,17 (3,10-7,92) 18,8 (13,0-25,0) 3,43 (2,24-4,52) 4,57 (3,33-7,33) 4,11 (3,46-6,85) 3,67 (2,53-7,53) 2,90 (1,68-4,99) 2,85 (1,68-4,30) 568(428-779) 2,6(1,8-3,3) 1,0(1,0-2,0) 2,1(1,6-5,0) 682(544-1159) 2,4(1,8-3,1) 1,0(1,0-2,5) 1,0(0,5-3,3) 608 (430-772) 2,9 (1,9-3,7) 1,0 (1,0-4,25) 1,5 (1,0-6,2) 832 (664-1010) 1,7 (1,4-1,9) 1,5 (1,0-5,5) 3,0 (2,1-7,8) p* 0,27 p1/4=0,01 p1/4=0,05 p1/3=0,05 p1/4=0,048 p2/3=0,05 p2/4=0,046 0,44 p1/4=0,02 p1/3=0,02 p1/4=0,01 p2/3=0,05 p2/4=0,05 p1/3=0,02 p1/4=0,01 p2/4=0,05 p1/4=0,05 p1/4=0,05 0,60 p1/4=0,05 * представлен уровень значимости при сравнении данных в четырѐх группах; в случае статистически значимых различий представлены значения р, зарегистрированные при попарном сравнении в группах 54 Тридцати больным группы 4, которым ранее не проводилось КАГ и реваскуляризации миокарда эндоваскулярными методами (81%), была проведена оценка тяжести атеросклеротического поражения КА по модифицированной шкале Gensini, выявлена умеренная обратная связь между содержанием CD4+FoxP3+ Трег и индексом по шкале Gensini (r=-0,39, p=0,02) (рисунок 5д). Рисунок 6. Содержание CD4+CD25highCD127low Tрег (% от CD4+ лимфоцитов) (а), CD4+FoxP3+ Tрег (б), Tх17 (в), отношение содержания CD4+ FoxP3+ Tрег к Тх17 (г) у пациентов с различной выраженностью атеросклероза коронарных артерий (группы 14); данные представлены как медиана и межквартильный размах, * p<0,05. Обратная корреляция между индексом по шкале Gensini и содержанием CD4+FoxP3+ Tрег (д) у пациентов с многососудистым атеросклерозом коронарных артерий, ранее не подвергавшихся эндоваскулярным вмешательствам. 55 Для оценки возможности взаимодополняющего влияния изменения содержания CD4+FoxP3+ Трег и Тх17 пациенты были разделены на 4 группы по медианам содержания указанных субпопуляций: группа I имела высокое содержание Трег (более 7,6% от CD4+клеток) и низкое содержание Тх17 (менее 1,23% от CD4+), II – низкое содержание Трег (менее 7,6% от CD4+) и низкое содержание Тх17,III - высокое содержание Трег и высокое содержание Тх17 (более 1,23% от CD4+),IV – низкое содержание Трег и высокое содержание Тх17.В каждой группе определена доля пациентов с различной тяжестью поражения коронарных артерий (рисунок 7). Оказалось, что относительное количество больных с наименьшими признаками заболевания выше в группе I и II и ниже в группе IV, однако различия не достигли статистической значимости (Хи-квадрат с поправкой Йетса для малочисленных выборок 1,1, р=0,29). 100% 90% 80% 70% 60% группа 1 50% группа 2 40% группа 3 30% группа 4 20% 10% 0% Tрег ↑ Tх17 ↓ Tрег ↓ Tх17 ↓ Tрег ↑ Tх17 ↑ Tрег ↓ Tх17 ↑ Рисунок 7. Распределение пациентов по тяжести атеросклеротического поражения коронарных артерий в зависимости от содержания CD4+FoxP3+ Трег и Тх17. 56 Содержание sCD25 и вчСРБ в сыворотке крови было выше у пациентов с многососудистым поражением коронарного русла (группа 4) по сравнению с пациентами с интактными коронарными артериями (группа 1), в то время как уровень ИЛ-10 в сыворотке крови оказался ниже у пациентов с многососудистым поражением коронарного русла (группа 4) по сравнению с пациентами с интактными коронарными артериями (группа 1) (таблица 8). Подтверждена слабая прямая корреляция содержания Тх17 (в абсолютных значениях) и концентрации ИЛ-17 в сыворотке крови (коэффициент корреляции Спирмена R = 0,24, p<0,05). Выявлена слабая прямая корреляция сывороточной концентрации ИЛ-17 и вчСРБ (R = 0,26, p<0,05). Отмечена слабая прямая корреляция вчСРБ и ХС, ТГ, ИМТ (коэффициент корреляции Спирмена R= 0,27 для всех показателей, p<0,05). Выявлена слабая прямая корреляция уровня ТГ и содержания Тх17 (как в % от CD4+, так и в абсолютных значениях) (R= 0,2 и R= 0,26, соответственно, p<0,05). Взаимосвязи уровня глюкозы с изучаемыми показателями выявлено не было. Клинический пример 1 Пациент Г., мужчина, 71 год. Госпитализирован во 2 к/о в 2013 году в связи с жалобами на снижение переносимости физических нагрузок. Ранее амбулаторно при проведении суточного мониторирования ЭКГ регистрировалась горизонтальная депрессия ST до -1,0 мм при физической нагрузке, не сопровождавшаяся болями в области сердца. В анамнезе артериальная гипертензия (АГ), нарушение толерантности к глюкозе, курит в течение длительного времени; ИМ и острое нарушение мозгового кровообращения (ОНМК) в анамнезе отрицает. В течение длительного времени получал терапию антиагрегантами (ацетилсалициловая кислота), статинами (аторвастатин 20 мг/сут), бета-блокаторами, БРА, диуретиками. 57 Лабораторные показатели при поступлении: лейкоциты 8,4 млн/мл, лимфоциты 1,8 млн/мл, ХС 4,7 ммоль/л, ТГ 1,7 ммоль/л, глюкоза 5,8 ммоль/л. При КАГ: гемодинамически значимых стенозов КА не выявлено, на основании чего пациент включѐн в группу 1 (пациенты с малоизменѐнными коронарными артериями). Иммунологические показатели: содержание CD4+CD25highCD127low Трег периферической венозной крови составило 8,2% от CD4+ Т- лимфоцитов (верхний квартиль), CD4+FoxP3+ Трег - 7,3% (третий квартиль), Тх17 - 0,9% (второй квартиль), отношение CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 - 7,8 (третий квартиль). Сывороточная концентрация ИЛ-10 составила 2,3 пг/мл, ИЛ-17 - 1,0 пг/мл, sCD25 - 779 ЕД/мл, вчСРБ - 5,8 мг/л. Клинический пример 2 Пациент К., мужчина, 70 лет. Госпитализирован во 2 к/о в 2012 году в связи с жалобами на дискомфорт в грудной клетке без чѐткой связи с физической нагрузкой. В анамнезе АГ, постоянная форма фибрилляции предсердий с 1998 года, стенокардия напряжения, по поводу которой в 2008 г выполнена КАГ (выявлен гемодинамически значимый стеноз ПКА; ПНА и ОА без признаков гемодинамически значимого стенозирования), одномоментно была выполнена имплантация 2 стентов в ПКА. ИМ и ОНМК в анамнезе отрицает, (ацетилсалициловая кислота, не курит. клопидогрел Рекомендованную в течение 1 терапию года после стентирования, аторвастатин 10 мг/сут, бета-блокаторы, дигоксин, варфарин) принимал регулярно. Лабораторные показатели при поступлении: лейкоциты 8,5 млн/мл, лимфоциты 2,3 млн/мл, ХС 4,7 ммоль/л, ТГ 1,7 ммоль/л, глюкоза 6,1 ммоль/л. При КАГ (спустя 41 месяц от предыдущей): гемодинамически значимых стенозов магистральных артерий не выявлено, в среднем сегменте стентированный участок ПКА, потеря просвета не превышает 30%, на 58 основании чего пациент включѐн в группу 2 (пациенты без прогрессирования атеросклероза коронарных артерий). Иммунологические показатели: содержание CD4+CD25highCD127low Трег составило 5,7% от CD4+ Т-лимфоцитов (третий квартиль), CD4+FoxP3+ Трег - 5,2% (нижний квартиль), Тх17 - 0,3% (нижний квартиль), отношение CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 17 - (верхний квартиль). Сывороточная концентрация ИЛ-10 составила 1,2 пг/мл, ИЛ-17 - 1,0 пг/мл, sCD25 - 873 ЕД/мл, вчСРБ - 3,3 мг/л. Клинический пример 3 Пациент К., мужчина, 58 лет. Госпитализирован во 2 к/о в 2013 году в связи с клиникой стенокардии напряжения III ФК. В анамнезе АГ, ИМ заднебоковой локализации стенокардией. При в КАГ 2007 в г, 2007 осложнившийся постинфарктной года окклюзия выявлена ОА, гемодинамически незначимые стенозы ПНА, ПКА, одномоментно выполнено стентирование ОА. Рекомендованную терапию (ацетилсалициловая кислота, клопидогрел в течение 1 года после стентирования, аторвастатин 20 мг/сут, бета-блокаторы) принимал регулярно, не курит. Возобновление клиники стенокардии пациент отметил с 2012 года. Лабораторные показатели при поступлении: лейкоциты 9 млн/мл, лимфоциты 2,3 млн/мл, ХС 3,5 ммоль/л, ТГ 1,7 ммоль/л, глюкоза 5,7 ммоль/л. При КАГ (спустя 44 месяца от предыдущей): ствол ЛКА не стенозирован, стеноз ПНА в проксимальной трети 60-70%, стеноз ОА в устье 50%, стентированный участок в проксимальной трети ОА без потери просвета, диффузные атероматозные изменения ПКА, на фоне которых стеноз проксимальной трети 50-60%, окклюзия ПКА в средней трети, на основании чего пациент включѐн в группу 3 (пациенты с зарегистрированным прогрессированием атеросклерозанативных коронарных артерий). 59 Иммунологические показатели: содержание CD4+CD25highCD127low Трег периферической венозной крови составило 3,4% от CD4+ Т- лимфоцитов (нижний квартиль), CD4+FoxP3+ Трег - 5,8% (нижний квартиль), Тх17 - 1,4% (третий квартиль), отношение CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 - 4,2 (второй квартиль). Сывороточная концентрация ИЛ-10 составила 4,3 пг/мл, ИЛ-17 - 1,0 пг/мл, sCD25 - 949 ЕД/мл, вчСРБ - 6,0 мг/л. Клинический пример 4 Пациент З., мужчина, 73 года. Госпитализирован во 2 к/о в 2012 году в связи с клиникой стенокардии напряжения III ФК. В анамнезе АГ, ОНМК по типу ишемического инсульта в 2005 году, тогда же выявлены стенозы БЦА до 50%. ИМ в анамнезе отрицает, не курит. Поступил на фоне терапии ацетилсалициловой кислотой, аторвастатином 20 мг/сут, бета-блокаторами, иАПФ. Лабораторные показатели при поступлении: лейкоциты 7,9 млн/мл, лимфоциты 3,6 млн/мл, ХС 4,2 ммоль/л, ТГ 1,3 ммоль/л, глюкоза 5,6 ммоль/л. При КАГ: ствол левой коронарной артерии не стенозирован, окклюзия ПНА в проксимальной трети, 90% стеноз крупной диагональной артерии, ОА не стенозирована, 80% стеноз крупной артерии тупого края, 70% стеноз ПКА в проксимальном сегменте, окклюзия в среднем сегменте, на основании чего пациент включѐн в группу 4 (пациенты с многососудистым поражением коронарного русла). Иммунологические показатели: содержание CD4+CD25highCD127low Трег периферической венозной крови составило 3,3% от CD4+ Т- лимфоцитов (нижний квартиль), CD4+FoxP3+ Трег - 5,2% (нижний квартиль), Тх17 - 1,6% (третий квартиль), отношение CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 - 3,3% (нижний квартиль). Сывороточная концентрация ИЛ-10 составила 1,5 пг/мл, ИЛ-17 - 1,0 пг/мл, sCD25 - 894 ЕД/мл, вчСРБ - 0,2 мг/л. 60 Данные клинические примеры демонстрируют тот факт, что у пациентов с более тяжѐлыми атеросклеротическими изменениями и большей скоростью прогрессирования коронарного атеросклероза (группы 3 и 4) регистрируются большие значения Тх17 и меньшие – Трег, а также более низкие отношения Трег/Тх17 малоизмененѐнными прогрессирования по коронарными коронарного сравнению с артериями или атеросклероза пациентами (группы с отсутствием 1 и 2) при сопоставимых клинических характеристиках. 3.2. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления у пациентов с ИМ в анамнезе У 50 пациентов (41%) имел место ИМ в анамнезе, за 17,6±8,3 месяцев до включения в исследование. Группы пациентов сИМ в анамнезе и пациентов со стабильным течением ИБС значимо отличались по возрасту, (пациенты группы стабильного течения ИБС были старше). По остальным клиническим характеристикам группы были сопоставимы (таблица 5). Нами выявлено уменьшение содержания CD4+CD25highCD127lowTрег, увеличение содержания Тх17 (как в % содержании от лимфоцитов, так и в % содержании от CD4+) и, соответственно, уменьшение отношений CD4+CD25highCD127low/Тх17 CD4+FoxP3+ Tрег/Тх17 и у пациентов с ИМ в анамнезе по сравнению с пациентами с неотягощѐнным анамнезом (рисунок 8). При дополнительном анализе исследуемых иммунологических показателей у пациентов с клинически значимым АС коронарных артерий (группы 2-4), группы пациентов с перенесѐнным ИМ и со стабильным течением ИБС (группы 2-4 без ИМ в анамнезе, n=41) значимо различались по содержанию Тх17 (в % содержании от общего числа лимфоцитов) (таблица 6). 61 Таблица 5. Клиническая характеристика групп пациентов с перенесѐнным ИМ и анамнезом, в том числе пациентов со стабильным течением ИБС. Пациенты с ранее перенесѐнным ИМ (n=50) Возраст Пол, мужчины Курение АГ ИМТ, кг/м2 Лейкоциты, млн/мл Лимфоциты, млн/мл ХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л 60,2±8,1 40 (80%) 21 (42%) 40 (80%) 29,2±5,5 7,3±1,7 2,2±0,7 4,9±1,1 1,7±0,8 5,4±0,8 Все пациенты без ИМ в анамнезе (группы 1-4, n=71) 63,8 ±11,8 52 (73%) 25 (35%) 60 (84%) 28,5±4,2 7,4±1,9 2,3±0,7 4,8±1,0 1,8±1,1 5,6±1,1 p* пациентов с неотягощѐнным Пациенты со стабильным течением ИБС (группы 2-4, n=43) p* 64,8 ±11,1 0,04 0,02 0,39 35 (81%) 0,86 0,45 19 (44%) 0,83 0,52 38 (88%) 0,27 0,83 29,3±4,3 0,55 0,70 7,7±2,0 0,39 0,89 2,3±0,7 0,83 0,63 4,6 ±0,9 0,20 0,99 2,0±1,2 0,64 0,46 5,7±1,3 0,44 * p по сравнению с пациентами с ИМ в анамнезе 62 Таблица 6. Содержание клеточных субпопуляций и «растворимых» маркѐров воспаления в крови больных. Сопоставление групп пациентов с перенесѐнным ИМ и пациентов с неотягощѐнным анамнезом, в том числе пациентов со стабильным течением ИБС. Пациенты с ранее перенесѐнным ИМ (n=50) CD4+ (% лимфоцитов) CD4+CD25highCD127low Трег (%CD4+) CD4+FoxP3+ Трег (%CD4+) Тх17 (%CD4+) Тх17 (%лимфоцитов) Тх1 (%CD4+) CD4+IL10+ (%CD4+) CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 CD4+CD25highCD127lowТрег/Тх17 sCD25 (Ед/мл) ИЛ-10 (пг/мл) ИЛ-17 (пг/мл) вчСРБ (мг/л) p* Пациенты со стабильным течением ИБС (группы 2-4, n=43) р* 43 (35-48) 3,8 (3,0-5,1) Все пациенты без ИМ в анамнезе (группы 1-4, n=71) 38 (34-45) 4,5 (3,7-6,2) 0,07 0,02 38 (32-43) 4,4 (3,4-6,0) 0,01 0,10 7,5 (5,8-8,5) 1,3 (0,8-1,9) 0,7 (0,4-0,9) 17,7 (13,2-25,4) 3,7 (3,0-4,8) 4,6 (3,2-7,6) 3,1 (1,9-4,6) 7,3 (6,2-9,7) 1,0 (0,8-1,6) 0,4 (0,3-0,7) 20,1 (12,0-28,1) 4,0 (2,5-5,6) 6,9 (5,3-9,7) 4,0 (3,0-7,4) 0,30 0,12 0,01 0,54 0,80 0,01 0,02 7,3 (6,0-9,8) 0,9 (0,8-1,8) 0,4 (0,3-0,7) 18,3 (10,6-25,8) 3,6 (2,5-4,2) 6,7 (3,7-9,3) 4,0 (2,5-7,4) 0,54 0,20 0,02 0,81 0,38 0,05 0,09 621 (497,5-821,5) 2,2 (1,8-3,0) 1,6 (1,0-3,8) 1,3 (0,8-5,5) 650 (480-906) 2,4 (1,8-3,1) 1,0 (1,0-3,5) 1,8 (1,0-5,0) 0,72 685 (519-932) 0,36 0,69 2,4 (1,9-3,1) 0,90 0,08 1,0 (1,0-4,0) 0,16 0,60 1,6 (0,9-5,1) 0,70 *p по сравнению с пациентами с ИМ в анамнезе 63 Для исключения влияния ИМ на иммунный статус пациентов выполнен показавший ROC-анализ, слабую предсказательную значимость CD4+CD25highCD127lowTрег в отношении ИМ (площадь под ROC-кривой 0,624, p=0,038). Рисунок 8. Содержание клеточных субпопуляций (а – CD4+CD25highCD12low Трег, б – Тх17) и отношение Трег/Тх17 (в - CD4+CD25highCD12low Трег/Тх17, г – CD4+FoxР3+ Трег/Тх17) у пациентов с перенесѐнным ИМ по сравнению с пациентами с неотягощѐнным анамнезом. Данные представлены как медиана и интерквартильный размах, *р< 0,05. При дополнительном анализе исследуемых иммунологических показателей у пациентов без ИМ и эндоваскулярного лечения в анамнезе у больных с многососудистым поражением коронарного русла и стабильным течением ИБС (группа 4, только пациенты без ИМ, n=16) выявлено, чтосодержание CD4+CD25highCD127low Трег (а) и отношение CD4+CD25highCD127low Трег/Тх17 (б) было ниже по сравнению с 64 пациентами без атеросклероза КА (группа 1) (4,2 % (2,5-4,6) vs. 5,1% (3,9-7,0) и 3,6 (1,7-4,8) vs. 4,2 (3,4-8,8), p<0,05) (рисунок 9). Рисунок 9. Сравнение групп пациентов без значимого атеросклеротического поражения коронарного русла (группа 1) и пациентов с многососудистым поражением коронарного русла и стабильным течением ИБС (группа 4, пациенты без ИМ). Данные представлены как медиана и межквартильный размах, *р< 0,05. Эти результаты указывают на то, что изменение субпопуляционного состава лимфоцитов многососудистого в большей атеросклероза КА, степени нежели обусловлено перенесенным наличием ИМ и эндоваскулярными вмешательствами в анамнезе. 3.3. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления в зависимости от пола Среди исследуемых больных доля мужчин составила 76% (n=92), доля женщин – 24% (n=29). Группы мужчин и женщин были сопоставимы по основным клинико-анамнестическим и лабораторным характеристикам (таблица 7). Данные о содержании лимфоцитарных субпопуляций и концентрациях «растворимых» маркѐров воспаления у мужчин и женщин, включѐнных в исследование, представлены в таблице 8. 65 Таблица 7. Клиническая характеристика пациентов в зависимости от пола. Пациенты (n=121) Возраcт, лет ИМТ, кг/м2 АГ Курение ИМ в анамнезе Лейкоциты, млн/мл Лимфоциты, млн/мл ХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л Мужчины (n=92) 63 (55-69) 29 (26-31) 74 (80%) 30 (33%) 40 (43%) 7,2 (6,3-8,5) 2,4 (2,0-2,6) 4,6 (4,1-5,4) 1,5 (1,2-2,3) 5,3 (4,9-5,7) p Женщины (n=29) 62 (55-73) 29 (26-31) 26 (90%) 6 (21%) 10 (34%) 7,3 (6,2-8,1) 2,2 (1,7-2,6) 5,1 (4,4-5,7) 1,7 (1,3-1,9) 5,7 (5,1-6,2) 0,40 0,53 0,25 0,22 0,39 0,77 0,16 0,30 0,54 0,15 Таблица 8. Содержание клеточных субпопуляций и «растворимых» маркѐров воспаления в зависимости от пола. Пациенты (n=121) CD4+ CD4+CD25highCD127low Трег (%CD4+) CD4+FoxP3+ Трег (%CD4+) CD4+FoxP3+ Трег (% лимфоцитов) Тх17 (%CD4+) Тх1 (%CD4+) CD4+IL10+ (%CD4+) CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 CD4+CD25highCD127low Трег / Тх17 sCD25 (Ед/мл) ИЛ-10 (пг/мл) ИЛ-17 (пг/мл) вчСРБ (мг/л) Мужчины (n=92) 38 (34-45) 4,3 (3,6-6,3) 7,3 (6,0-9,4) 3,0 (2,3-3,8) 1,2 (0,8-1,8) 18 (12-27) 3,8 (2,8-5,4) 6,5 (3,9-10,5) 3,6 (2,1-7,2) 650 (504-873) 2,4 (1,7-3,0) 1,0 (01,0-3,5) 1,5 (0,8-4,6) р Женщины (n=29) 44 (39-52) 4,0 (3,4-4,6) 8,0 (7,0-9,4) 4,2 (3,1-4,9) 1,1 (0,8-1,4) 20 (14-31) 3,5 (2,1-4,8) 6,9 (5,5-9,6) 3,8 (2,6-4,7) 572 (429-859) 2,4 (1,9-3,6) 1,5 (1,0-3,6) 3,0 (1,0-8) 0,003 0,08 0,29 0,0006 0,59 0,51 0,30 0,23 0,83 0,30 0,16 0,42 0,04 66 У женщин содержание CD4+ лимфоцитов и CD4+FoxP3+ Трег, выраженное в % от лимфоцитов оказалось выше, чем у мужчин (рисунок 10). Указанные тенденции к более высокому содержанию CD4+ и Трег у женщин имели место в каждой из четырѐх групп пациентов (рисунок 11). Также у женщин выявлены более высокие уровни вчСРБ. Рисунок 10. Сопоставление содержания клеточных субпопуляций (а – CD4+ лимфоцитов, б – CD4+FoxP3+ Трег) у мужчин и женщин. Данные представлены как медиана и межквартильный размах, *р< 0,05. Рисунок 11. Сопоставление содержания клеточных субпопуляций (а – CD4+ лимфоцитов, б – CD4+FoxР3+ Трег) у мужчин и женщин в группах. 67 3.4. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления в зависимости от статуса курения Учитывая важную роль курения как фактора, способствующего атерогенезу, мы провели дополнительный анализ иммунологических показателей в группах курящих и некурящих пациентов. Доля активных курильщиков среди исследуемых больных составила 30% (n=36). Группы курящих и некурящих различались по частоте ИМ в анамнезе (значимо выше у курильщиков, p<0,05), по остальным клинико-анамнестическим и лабораторным характеристикам группы были сопоставимы (таблица 9). Как следует из таблицы 10 и рисунка 12, у курящих больных содержание CD4+ значимо выше по сравнению с теми, кто не курил на момент обследования. У курильщиков по сравнению с некурящими отмечены более высокие значения Такт (в абсолютных значениях) (356 тыс/мл (261-442) против 268 тыс/мл (205-372), p=0,03) (рисунок 12, а). Сывороточная концентрация sCD25 была выше у курящих пациентов (рисунок 12, б). По остальным показателям различий не было выявлено. Рисунок 12. Сопоставление содержания клеточных субпопуляций (а – Tх17 лимфоцитов, б –Такт) и sCD25(в) у курильщиков и некурящих пациентов. Данные представлены как медиана и межквартильный размах, *р< 0,05. 68 Таблица 9. Клиническая характеристика пациентов в зависимости от статуса курения. Пациенты (n=121) Пол, мужчины Возраcт, лет ИМТ, кг/м2 АГ ИМ в анамнезе Лейкоциты, млн/мл Лимфоциты, млн/мл ХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л Курят (n=36) 30 (83%) 60 (55-66) 29 (26-31) 29 (80%) 21 (58%) 7,6 (6,5-8,9) 2,5 (2,0-2,6) 4,6 (3,9-5,5) 1,7 (1,4-2,6) 5,3 (4,9-5,9) p Не курят (n=85) 62 (73%) 63 (55-73) 29 (26-31) 71 (84%) 29 (34%) 7,2 (6,2-8,0) 2,3 (1,8-2,6) 4,7 (4,2-5,6) 1,5 (1,1-2,1) 5,3 (5,0-5,7) 0,22 0,06 0,95 0,69 0,01 0,06 0,53 0,53 0,25 0,98 Таблица 10. Содержание клеточных субпопуляций и «растворимых» маркѐров воспаления в зависимости от статуса курения. Пациенты (n=121) CD4+ CD4+CD25highCD127low (%CD4+) CD4+FoxP3+ (%CD4+) Тх17 (%CD4+) Тх1 (%CD4+) CD4+IL10+ (%CD4+) CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 CD4+CD25highCD127low Трег /Тх17 sCD25 (Ед/мл) ИЛ-10 (пг/мл) ИЛ-17 (пг/мл) вчСРБ (мг/л) Курят (n=36) 44 (36-50) 4,2 (3,4-5,4) 7,4 (6,2-9,4) 1,3 (0,8-1,8) 18 (12-26) 3,6 (2,3-4,5) 6,0 (3,6-7,9) 3,4 (2,1-5,0) 743 (597-1064) 2,5 (2,0-3,2) 1,0 (1,0-3,5) 1,9 (1,1-9,4) р Не курят (n=85) 38 (34-45) 4,3 (3,6-6,0) 7,7 (6,1-9,4) 1,1 (0,8-1,7) 19 (13-28) 3,6 (2,5-5,4) 6,7 (4,2-11,6) 3,8 (2,2-7,3) 602 (449-851) 2,3 (1,7-3,1) 1,0 (1,0-3,5) 1,5 (0,8-5,1) 0,04 0,51 0,96 0,17 0,60 0,86 0,20 0,44 0,009 0,17 0,72 0,12 69 3.5. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и растворимых маркѐров воспаления в зависимости от возраста Отмечена слабая прямая корреляция возраста пациентов и содержания Тх1 (в % от CD4+ клеток) (коэффициент корреляции Спирмена R = 0,2, p<0,05), а также уровня sCD25 в сыворотке крови (R = 0,33, p<0,05). Выявлена слабая обратная корреляция возраста пациентов и содержания CD4+CD25highCD127low и CD4+Foxp3+ Трег (R = -0,26 и R= -0,23, соответственно, p<0,05). 3.6. Анализ содержания субпопуляций лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления у пациентов с различной выраженностью атеросклероза сонных артерий В таблице 11 представлена клиническая характеристика групп пациентов, сформированных согласно степени поражения брахиоцефальных артерий. Группы были сопоставимы по основным клиническим и лабораторным характеристикам. Данные о содержании субпопуляций лимфоцитов в группах представлены в таблице 12 и рисунке 13.Анализ субпопуляционного состава лимфоцитов крови показал, что у пациентов с выраженным стенозом сонных артерий (группа 3’) по сравнению с пациентами с малоизмененными артериями (группа (CD4+CD25highCD127low) 1’) количество снижено, а циркулирующих соотношение Трег Тх1/Трег (CD4+CD25highCD127low) увеличено. У пациентов с малоизмененными сосудами (группа 1’) по сравнению с пациентами со средней и высокой степенью стеноза (группы Такт/Трег(CD4+CD25highCD127low) 2’ оказался и ниже, 3’) а индекс соотношение CD4+CD25highCD127low Трег/Тх17 – выше. Содержание sCD25 (Ед/мл) в крови оказалось выше у пациентов 2’ и 3’ групп по сравнению с группой 1’. 70 Таблица 11. Клиническая характеристика пациентов, включѐнных в исследование. Сопоставление групп с различной степенью атеросклеротического поражения сонных артерий. Группа 1’ n=15 Группа 2’ n=29 Группа 3’ n=22 p Пол, мужчины 12 (80%) 22 (76%) 20 (91%) 0,30 Возраст, лет 55(50-73) 65(59-74) 65(59-70) 0,13 ИМТ, кг/м2 27(25-31) 28(26-29) 29(27-31) 0,45 Курение 1 (7%) 9 (31%) 8 (36%) 0,09 АГ 11 (73%) 26 (90%) 20 (91%) 0,33 ХС, ммоль/л 4,55(4,39-5,14) 4,44(3,86-5,04) 4,26(3,68-4,80) 0,41 ТГ, ммоль/л 1,62 (1,15-2,20) 1,52 (1,00-1,82) 1,38 (1,04-1,69) 0,73 Глюкоза, ммоль/л 5,57(5,30-5,86) 5,48(5,03-6,15) 5,10 (4,73-5,48) 0,06 71 Таблица 12. Содержание клеточных субпопуляций и «растворимых» маркѐров воспаления в крови больных. Сопоставление групп с различной степенью атеросклеротического поражения сонных артерий. Группа 1’ (n=15) Группа 2’ (n=29) Группа 3’ (n=22) р* 7,2(6,2-7,4) 7,5(6,4-8,5) 6,9(6,3-7,9) 0,15 Лимфоциты, % 34,9(27,6-39,6) 30,3(24,2-35,4) 34,3(29,3-38,5) 0,62 CD4+ (% от лимфоцитов) 42,0 (37,0-49,0) 40,0 (35,0-45,5) 39,5 (29,5-48,0) 0,06 5,1 (4,5-6,4) 4,2 (3,6-6,0) 4,0 (3,6-4,6) p1/3=0,02 36,1 (24,5-50) 41,2 (32,2-54,7) 37,6 (32,4-43,8) 0,25 Такт/Трег 6,0 (5,0-8,6) 9,2 (6,9-12,9) 10,0 (6,9-11,4) p1/2=0,01, p1/3=0,02 CD4+FoxP3+ Трег (% CD4+) 7,0 (6,0-8,3) 7,2 (6,2-9,8) 7,8 (6,0-9,0) 0,45 Тх17 (% CD4+) 0,9 (0,7-1,2) 1,2 (0,8-1,7) 1,3 (0,8-2,0) 0,25 Тх1 (% CD4+) 21,4 (12,8-25,0) 23,3 (15,5-30,2) 19,1 (17,6-27,8) 0,67 CD4+CD25high CD127low Трег/Тх17 4,9 (4,0-8,0) 4,0 (2,1-5,2) 3,1 (1,9-4,6) p1/2=0,01, p1/3=0,009 CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 6,6 (5,6-11,7) 6,7 (4,3-9,2) 6,1 (3,5-9,3) 0,43 вчСРБ (мг/л) 1,58 (0,66-2,2) 1,30 (0,73-9,23) 1,21 (0,70-4,71) 0,45 ИЛ-17 (пг/мл) 0,84 (0,13-1,25) 1,00 (0,60-3,06) 1,44 (1,00-5,50) p1/3=0,05 ИЛ-10 (пг/мл) 1,98 (1,54-2,75) 2,42 (1,82-3,04) 2,14 (1,71-2,92) 0,23 sCD25 (Ед/мл) 487(399-568) 849(564-1081) 768(551-1047) p1/2=0,01, p1/3=0,04 Лейкоциты, млн/мл CD4+CD25highCD127low Трег (% CD4+) Такт (% CD4+) * представлен уровень значимости при сравнении данных в четырѐх группах; в случае статистически значимых различий представлены значения р, зарегистрированные при попарном сравнении в группах. 72 Рисунок 13. Содержание CD4+CD25highCD127low Tрег (% от CD4+ лимфоцитов) (а), отношение содержания CD4+CD25highCD127low Tрег к Тх17 (б), отношение содержания Тх1 к CD4+CD25highCD127low Tрег (в), содержание sCD25 у пациентов с различной выраженностью атеросклероза сонных артерий (группы 1’-3’) (г). Данные представлены как медиана и интеквартильный размах, * p<0,05. В данной выборке пациентов (n=66) выявлена прямая слабая корреляция между уровнем sCD25 и содержанием Тх17 (коэффициент корреляции Спирмена R = 0,322; p<0,05) и обратная слабая корреляция между уровнем sCD25 и количеством CD4+CD25highCD127low Трег (R = 0,32; p<0,05). Также показана обратная корреляция между уровнем sCD25 и соотношениями CD4+CD25highCD127low Трег/Тх17 (R = -0,34; p<0,05) и CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 (R = -0,30; p<0,05). Значимые межгрупповые различия в содержании ИЛ-10 и СРБ в крови не были выявлены. Обращает на себя внимание тенденция к более высокому содержанию ИЛ-17 в крови у пациентов 3’ группы по сравнению с 1’ группой. 73 В зависимости от содержания CD4+CD25highCD127low Трег и Тх17 в крови пациенты были разделены на 4 группы: группа I имела высокое содержание Трег (более 4,30% от CD4+клеток) и низкое содержание Тх17 (менее 1,23% от CD4+) (n=17), II – высокое содержание Трег и высокое содержание Тх17 (более 1,23% от CD4+) (n=17),III – низкое содержание Трег (менее 4,30% от CD4+) и низкое содержание Тх17 (n=16),IV – низкое содержание Трег и высокое содержание Тх17 (n=16).В каждой группе определена доля пациентов с различной степенью поражения сонных артерий (стеноз менее 30%, стеноз 30-50%, стеноз более 50%) (рисунок 14). Рисунок 14. Распределение пациентов по тяжести атеросклеротического поражения сонных артерий в зависимости от содержания CD4+CD25highCD127low Трег и Тх17. Оказалось, что относительное количество больных с наименьшими признаками заболевания выше в группе I, а в группе IV таких пациентов не было. Различия между I и IV группами в количестве больных с начальными атеросклеротическими изменениями БЦА были статистически значимыми (Хи-квадрат с поправкой Йетса для малых выборок 4,78, p<0,05), между II и 74 IV группами – не достигли статистической значимости (Хи-квадрат с поправкой Йетса для малых выборок 3,52, p=0,06). 3.7. Оценка показателей субпопуляционного состава лимфоцитов и «растворимых» маркѐров воспаления в зависимости от скорости прогрессирования (проспективно) атеросклероза коронарных артерий Двадцати трѐм пациентам проводилось повторное обследование и контрольная КАГ через 16,5 (13-24) месяцев после включения в исследование. Все пациенты за период наблюдения получали терапию, рекомендованную приИБС: антиагреганты, бета-блокаторы, статины (в дозе с учѐтом целевых значений ХС), а также иАПФ/БРА, блокаторы кальциевых каналов по показаниям. У 12 пациентов выявлена скрытая ишемия миокарда по результатам пробы с физической нагрузкой (тредмил-тест), по данным КАГ у этих пациентов зарегистрировано прогрессирование коронарного атеросклероза в нативных КА, ранее не подвергавшихся эндоваскулярным вмешательствам. Клиническая характеристика пациентов исходно представлена в таблице 13. Группы статистически значимо различались по возрасту (пациенты, у которых выявлено прогрессирование АС, были старше) и количеству эндоваскулярных вмешательств в анамнезе (ТБКА со стентированием КА выполняласьбольшему числу пациентов в группе с зарегистрированным впоследствии прогрессированием АС). По остальным клиническим и лабораторным характеристикам межгрупповых различий не выявлено (таблица 13). При повторной госпитализации указанные показатели оценивались повторно, статистически значимых различий между показателями исходно и повторно получено не было. Как видно из таблицы 14, группы значимо не различались по содержанию Тх1, Тх17, Трег (CD4+CD25high, CD4+FoxP3+), соотношению Трег/Тх17, уровню sCD25. 75 Содержание CD4+IL10+ Т-лимфоцитов (%CD4+) было ниже у пациентов с зарегистрированным в последующем прогрессированием атеросклероза коронарных артерий (таблица 14, рисунок 15а). Указанные различия обусловлены меньшим содержанием CD4+FoxP3-IL10+ клеток (%CD4+) (таблица 14, рисунок 15б). При пограничном уровне CD4+IL10+ (%CD4+) - 3,51% - у 10 (83%) пациентов, имевших низкое содержание CD4+IL10+ клеток (3,51% и ниже), в последующем выявлены признаки прогрессирования коронарного АС. В то же время у 9 (82%) пациентов, имевших высокое содержание CD4+IL10+ клеток, в последующем не выявлено признаков прогрессирования коронарного АС. Эти значения свидетельствуют о чувствительности 83% при специфичности 82% (рисунок 16), площадь под ROC-кривой 0,778. Рисунок 15. Содержание CD4+IL10+ (а) и CD4+FoxP3-IL10+ (б) Т-лимфоцитов (% от CD4+ лимфоцитов) у пациентов с прогрессией и без прогрессии коронарного атеросклероза, данные представлены как медиана и межквартильный размах, *p<0,05. 76 Таблица 13. Клиническая характеристика групп пациентов с прогрессированием и без прогрессирования коронарного АС. Период наблюдения, мес Возраст, лет Пол, мужчины (%) Курение (%) АГ (%) ИМ в анамнезе (%) Доля пациенов 3-4 групп (%) Стентирование в анамнезе (%) ТБКА со стентированием в текущую госпитализацию (%) Кол-во стентов/чел ИМТ, кг/м2 ХС, ммоль/л ТГ, ммоль/л Глюкоза, ммоль/л Прогрессирование АС (n=12) 18 (13-24) 70 (63-76) 11 (92%) 4 (33%) 10 (83%) 3 (25%) 8 (67%) 8 (67%) 7 (58%) Без прогрессирования АС (n=11) 14 (12-21) 60 (46-66) 10 (91%) 4 (36%) 7 (64%) 8 (73%) 4 (36%) 8 (73%) 0 (0%) 0,40 0,04 0,95 0,87 0,28 0,06 0,15 0,75 0,01 1,57 29(26-32) 4,4 (4,1-4,7) 1,4 (1,1-1,7) 5,0 (4,7-6,1) 29 (26-32) 5,0 (4,3-5,9) 1,4 (1,1-1,8) 5,3 (5,1-5,6) 0,67 0,06 0,69 0,48 р 77 Таблица 14. Содержание клеточных субпопуляций и «растворимых» маркѐров воспаления в крови больных. Сопоставление групп пациентов с прогрессированием и без прогрессирования коронарного АС. CD4+ (% лимфоцитов) CD4+CD25highCD127low Трег (%CD4+) CD4+FoxP3+ Трег (%CD4+) Тх17 (%CD4+) Тх1 (%CD4+) CD4+IL10+Т (%CD4+) CD4+FoxP3-IL10+ Т (%CD4+) CD4+FoxP3+ Трег/Тх17 CD4+CD25highCD127low Трег / Тх17 sCD25 (Ед/мл) ИЛ-10 (пг/мл) ИЛ-17 (пг/мл) вчСРБ (мг/л) Прогрессирование АС (n=12) 34,5 (30-44) 5,6 (4,0-7,1) Без прогрессироваия АС (n=11) 38 (33-48) 5,7 (3,6-7,2) 0,23 0,86 8,3 (5,2-11,8) 0,8 (0,4-2,4) 11,5 (4,2-17,6) 2,8 (2,5-3,5) 2,3 (1,8-2,9) 15,0 (2,7-17,9) 6,4 (1,7-15,0) 710 (597-906) 2,1 (1,6-2,4) 4,5 (1,0-9,0) 3,0 (1,1-15,1) 8,4 (8,0-11,2) 1,1 (0,7-1,3) 18,9 (11,6-27,0) 4,4 (3,6-4,8) 3,3 (2,5-4,8) 6,6 (5,8-14,4) 4,4 (3,2-8,0) 604 (399-1064) 3,0 (1,7-3,2) 1,0 (1,0-2,6) 2,0 (0,6-9,4) 0,69 0,62 0,12 0,02 0,03 0,45 0,78 0,52 0,52 0,13 0,57 р 78 В общей выборке пациентов, включѐнных в исследование (n=121) выявлена слабая обратная корреляция между содержанием CD4+FoxP3-IL10+ Т-лимфоцитов и Тх17 (в абсолютных значениях) (R = -0,24, p<0,05), содержанием CD4+FoxP3-IL10+ Т-лимфоцитов с концентрациями ИЛ-17 и вчСРБ в сыворотке (R = -0,3 и R = -0,21, соответственно, p<0,05). Без прогрессирования Прогрессирование Доля пациентов 100% 80% 60% 40% 20% 0% 3,51% и менее более 3,51% Содержание CD4+IL10+ клеток (% от CD4+) Рисунок 16.Доля пациентов, у которых отмечена прогрессирование коронарного атеросклероза, в зависимости от базального уровня ИЛ-10-продуцирующих Тлимфоцитов. Клинический пример 5 Пациент В., мужчина, 63 года. Госпитализирован в 2012 году в связи с клиникой стенокардии напряжения II ФК. Не курил, инфаркт миокарда и ОНМК в анамнезе отрицает. Лабораторные показатели при поступлении: ХС 79 4,22 ммоль/л, ТГ 1,23 ммоль/л, глюкоза 4,69 ммоль/л. Иммунологические показатели: содержание CD4+IL10+ Т-лимфоцитов (% от CD4+ лимфоцитов) в периферической венозной крови составило 1,8%. При КАГ: ствол левой коронарной артерии (ЛКА) не изменен, ПНА и ОА имеют осложненные стенозы в проксимальном сегменте до 90%, ПКА имеет неровности контуров, в дистальном сегменте окклюзирована. В связи с наличием гемодинамически значимых стенозов выполнено стентирование проксимальных сегментов ПНА и ОА. В стационаре и на протяжении периода наблюдения пациенту проводилась стандартная для больных хронической ИБС терапия, из гиполипидемической терапии пациент получал аторвастатин 20 мг/сут. Повторно пациент В. поступил спустя 16 месяцев после предыдущей госпитализации с жалобами на возобновление ангинозных болей. Факт прогрессирования атеросклероза подтвердился после проведенного клиникоинструментального обследования. При КАГ выявлено появление «нового» стеноза в среднем сегменте ПНА, суживающего просвет сосуда на 70%, в остальных артериях - без значимых изменений, ранее стентированные сегменты без признаков рестенозирования. Учитывая данные за наличие ишемии миокарда при физической нагрузке и выявленные при КАГ изменения, пациенту потребовалось выполнение эндоваскулярного вмешательства с имплантацией стента RESOLUTE INTEGRITY 2.55х14мм в средний сегмент ПНА. Таким образом, выявленное исходно содержание ИЛ-10- продуцирующих Т-лимфоцитов ниже 3,51% от CD4+ клеток могло свидетельствовать о наклонности к прогрессированию атеросклероза коронарных артерий. 80 Клинический пример 6 Пациент С., мужчина, 70 лет. Госпитализирован в 2012 году в связи к клиникой стенокардии напряжения II ФК. Не курил, в анамнезе - инфаркт миокарда (2008, 2009 гг), в июле 2009 года выполнена КАГ, в связи с выявленными гемодинамически значимыми стенозами в передней нисходящей и огибающей артериях выполнено стентирование ПНА и ОА. Лабораторные показатели при поступлении: ХС 4,72 ммоль/л, ТГ 1,74 ммоль/л, глюкоза 5,45 ммоль/л. Иммунологические показатели: содержание CD4+IL10+ лимфоцитов (% от CD4+ клеток) в периферической венозной крови составило 4,0%. При КАГ выявлены незначимые стенозы ПНА, ОА (максимальная степень стеноза 20%) и ПКА (максимальная степень стеноза 40%), ранее имплантированные стенты проходимы. При УЗДС брахиоцефальных артерий выявлен стеноз 30-40% правой общей сонной артерии (ОСА) с переходом на устье внутренней сонной артерии (стеноз 35-40%), стеноз 20-25% левой ОСА переходом на устье и проксимальную треть ВСА (стеноз 30-35%). В стационаре и на протяжении периода наблюдения пациенту проводилась стандартная для больных хронической ИБС терапия, из гиполипидемической терапии пациент получал аторвастатин 20 мг/сут. Повторно пациент С. поступил в январе 2014 года спустя 21 месяц после предыдущей госпитализации с жалобами на боли в грудной клетке. Отсутствие прогрессирования атеросклероза подтверждено после проведения клинико-инструментального обследования. При КАГ не выявлено значимого стенозирования магистральных коронарных артерий, проходимость стентированных участков сохранялась удовлетворительной, показаний к проведению эндоваскулярных видов лечения не выявлено. При УЗДС брахиоцефальных артерий: отрицательной динамики (увеличения степени стеноза) не зарегистрировано (стеноз 30-35% правой общей сонной артерии 81 (ОСА) с переходом на устье внутренней сонной артерии (стеноз 35-40%), стеноз 20% левой ОСА переходом на устье и проксимальную треть ВСА (стеноз 30-35%)). Таким образом, выявленное исходно содержание ИЛ-10- продуцирующих Т-лимфоцитов выше 3,51% от CD4+ клеток могло свидетельствовать об отсутствии наклонности к прогрессированию атеросклероза коронарных и сонных артерий у данного пациента. 3.8. Оценка действия окЛНП на содержание субпопуляций лимфоцитов в культурах мононуклеарных клеток и CD4+ лимфоцитов В присутствии окЛНП в концентрации 5 мкг/мл наблюдалась активация мононуклеарных клеток в культуре, что микроскопически проявилось образованием конгломератов клеток (рисунок 17). Рисунок 17. Микроскопическая картина культур мононуклеарных клеток, а – контроль, б – в присутствии в среде культивирования окЛНП, стрелкой обозначены конгломераты клеток. Внесение окЛНП в количестве 5 мкг/мл в культуру мононуклеарных клеток крови не приводило к изменению содержания исследуемых субпопуляций лимфоцитов (таблица 15). При культивировании клеток в среде с высокой концентрацией окЛНП (50 мкг/мл) отмечено их токсическое 82 действие, проявлявшееся в индукции апоптоза клеток: доля аннексин V связывающих клеток (от СD4+ лимфоцитов) составила 8% (2,5-12) против 4,5% (1-10) и 5,7% (1-9), р=0,05, в культуре клеток с 5 мгк/мл окЛНП и контролем, соответственно. Аналогичные данные были получены при работе с CD4+лимфоцитами. Различий в содержании Трег (CD4+FoxP3+), Тх17 (CD4+IL17+) и Тх1 (CD4+INFgamma+) при культивировании клеток в присутствии окЛНП (5 мкг/мл) и в контроле выявлено не было (таблица 16). В таблицах 15 и 16 значения приведены как медиана (максимальное-минимальное значения) ввиду малочисленности выборок. 3.9. Оценка активации мононуклеарных лейкоцитов в присутствии окЛНП по содержанию цитокинов в среде культивирования Как видно из рисунка 18 и таблицы 17, в культуре окЛНП индуцируют секрецию ИЛ-1бета, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО-альфа, ИФН-гамма клетками мононуклеарной фракции, превышающую таковую в контроле на 1-2 порядка.окЛНП также индуцировали секрецию ИЛ-2 лимфоцитами. В то же время не наблюдалось значимых изменений содержания ИЛ-8, ИЛ-4 и ИЛ-17 в среде культивирования клеток в присутствии окЛНП. Культивирование CD4+ лимфоцитов, выделенных из крови доноров (n=8), с окЛНП не оказало значимого влияния на продукцию клетками ИЛ-10 и трансформирующего фактора роста ТФР-бета. Отмечена тенденция к снижению концентрации в среде культивирования ИЛ-17 (на 42% по сравнению с контролем) и ИНФ-гамма (на 22% по сравнению с контролем) (таблица 18), что может быть связано с токсическим действием окЛНП на популяции CD4+ лимфоцитов, продуцирующих указанные цитокины. 83 Таблица 15. Содержание клеточных субпопуляций в культуре клеток мононуклеарной фракции в присутствии окЛНП р Контроль окЛНП 5 мкг/мл CD4+ (% лимфоцитов) 45,5 (32,5-62) 45 (33-63) 0,58 Аннексин+ (% CD4+) 5,7 (1-9) 4,5 (1-10) 1,00 CD4+FoxP3+ Трег (% CD4+) 7,4 (4,3-12,6) 7,2 (5-12) 0,46 Тх17 (% CD4+) 0,6 (0,4-0,8) 0,6 (0,4-0,9) 1,00 Тх1 (% CD4+) 13,8 (7,1-26,1) 12,6 (6,7-19,9) 0,08 Таблица 16. Содержание клеточных субпопуляций в культуре CD4+ лимфоцитов в присутствии окЛНП Контроль окЛНП 5 мкг/мл CD4+FoxP3+ Трег (% CD4+) 7,5 (6,9-9,0) 8,5 (7-10,5) Тх17 (% CD4+) 1,1 (0,5-1,6) 0,9 (0,5-1,4) Тх1 (% CD4+) 16,0 (11,7-22,0) 16,8 (15,5-22,5) р 0,27 0,07 0,10 Таблица 17. Содержание цитокинов в супернатанте культуры мононуклеарных клеток при культивировании в течение 1 сут в присутствии окЛНП р Контроль окЛНП 5 мкг/мл ИЛ-8, нг/мл 14,1 (12,1-15,4) 13,8 (11,8-15,4) 0,70 ИЛ-1бета, пг/мл 22 (10-34) 2714 (1329-4036) 0,001 ИЛ-6, нг/мл 1,6 (1,0-2,0) 15,8 (4,6-17,5) 0,001 ИЛ-10, пг/мл 6,1 (5,1-10,3) 241 (87-308) 0,001 ФНО-альфа, пг/мл 60 (17-184) 2089 (1237-8452) 0,001 ИФН-гамма, пг/мл 0,5 (0,3-0,9) 36 (26-80) 0,001 ИЛ-4, пг/мл 2,5 (2,0-3,3) 3,6 (2,1-4,2) 0,62 ИЛ-17, пг/мл 3,3 (3,3-4,8) 4,8 (4,4-5,5) 0,17 ИЛ-2, пг/мл 3,0 (2,9-3,3) 5,0 (4,3-6,1) 0,03 84 100000 10000 Концентрации, пг/мл 1000 co ox pha lps 100 10 Л2 И Л17 Л4 И И Н -г ам м а ф а Ф И Н О -а ль Л10 И Л6 И Л1б ет а Ф 0 И И Л8 1 Цитокины Рисунок 18. Содержание цитокинов в среде культивирования клеток мононуклеарной фракции в контроле (co) и в присутствии ФГА (pha), липополисахарида (lps) и окЛНП (ox) 3.10. Оценка активации лимфоцитов в мононуклеарной фракции в присутствии окЛНП методом поточной цитометрии и ELISPOT Частота выявления ИФН-гамма и ИЛ-4 – продуцирующих лимфоцитов (Тх1, Тх2, CD4-IFNgamma+ цитотоксические лимфоциты) после культивирования с окЛНП методом поточной цитометрии оказалась сопоставима с таковой в контроле (n=5) (таблица 19). Учитывая недостатки поточной цитометрии в определении редких цитокин-продуцирующих клеток (низкий уровень флуоресценции, наличие клеточного «дебриса», затрудняющее анализ), выявление лимфоцитов, активированных в присутствии окЛНП, производили продуцируемого ими ИЛ-2 методом ELISPOT (рисунок 19). по детекции 85 Рисунок 19. Пример результатов ELISPOT здорового добровольца (левая половина) и пациента с ИБС (правая половина). Верхний ряд – клетки, спонтанно продуцирующие ИЛ-2 (отрицательный контроль), средний ряд - клетки, культивированные в присутствии окЛНП, 5 мкг/мл, нижний ряд – клетки, культивированные в присутствии ФГА (позитивный контроль). 86 Таблица 18. Содержание цитокинов в супернатанте культуры CD4+ лимфоцитов при культивировании в течение 2 сут в присутствии окЛНП ИЛ-17, пг/мл ИФН-гамма, пг/мл ТФР-бета, пг/мл ИЛ-10, пг/мл Контроль 3,95 (0,5-87) 6,5 (0-92,7) 28,7 (27-52,2) 0 окЛНП 5 мкг/мл 1,2 (0-112) 3,4 (0-93,4) 32,1 (23,7-58,9) 0 р 0,12 0,06 0,87 1,00 Таблица 19. Количество активированных (цитокин-продуцирующих) клеток в контроле и в присутствии окЛНП (оценка с помощью иммунофенотипирования) CD4+IFNgamma+ Тх1 CD4+IL4+ Тх2 CD4-IFNgamma+ Контроль 0,02-0,07% от CD4+ лимфоцитов 8-21 клетка на 100.000 событий 0,00-0,05% от CD4+ лимфоцитов 1-12 клеток на 100.000 событий 0,15-0,92% от CD4- лимфоцитов 20-70 клеток на 100.000 событий окЛНП 5 мкг/мл 0,03-0,06% от CD4+ лимфоцитов 11-19 клеток на 100.000 событий 0,02-0,10% от CD4+ лимфоцитов 6-26 клеток на 100.000 событий 0,21-0,80% от CD4- лимфоцитов 29-61 клеток на 100.000 событий 87 Нами впервые показано, что в крови здоровых доноров и пациентов с мультифокальным атеросклерозом присутствуют Т-лимфоциты, активирующиеся под действием окЛНП (окЛНП-специфические клетки). Отмечена тенденция к меньшему содержанию таких лимфоцитов у пациентов с ИБС по сравнению со здоровыми добровольцами (1 (0-5) против 6 (1,4-8,8) клеток на 100.000 CD3+ лимфоцитов, соответственно). 88 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Состояние эффекторного и регуляторного звеньев иммунитета приИБС привлекает в последние годы особое внимание учѐных и клиницистов. Это связано, прежде всего, с развитием современных экспериментальных решений. В работах ведущих лабораторий мира продемонстрирована значимость иммунного компонента атерогенеза. Полученные данные, в свою очередь, позволили предполагать абсолютно новые подходы к терапии атеросклероза, которые в настоящее время проходят доклинические фазы исследования, а некоторые уже допущены к клиническим исследованиям. В настоящем исследовании мы впервые оценили баланс проатерогенных (Tх1 и Tх17) и антиатерогенных (Трег) популяций лимфоцитов и ассоциированных с ними растворимых маркеров у больных со стабильным течением ИБС и различной выраженностью и скоростью прогрессии коронарного АС. У больных c тяжелым многососудистым атеросклерозом коронарных артерий по атеросклероза сравнению мы с пациентами наблюдали изменение без значимого коронарного субпопуляционного состава лимфоцитов крови – снижение содержания Трег и увеличение содержания Тх17. Содержание Трег было обратно пропорционально тяжести поражения коронарных артерий, оцененного по индексу Gensini. Поскольку АС является системным заболеванием и поражает различные сосудистые бассейны, мы подтвердили изменения иммунного баланса (уменьшение содержания Трег и большие значения активированных лимфоцитов и Тх17), отмеченные у пациентов с ИБС, у лиц с выраженными атеросклеротическими изменениями БЦА. В ряде работ подтверждено уменьшение содержания Трег [37,69,85] и нарушение их супрессорной функции [97,114] у пациентов со стабильной стенокардией по сравнению со здоровыми добровольцами. В одном из 89 крупнейших исследований в данной области, включившем 200 пациентов, напротив, не было выявлено различий в содержании CD4+CD25highCD127low Трег между лицами без ИБС и пациентами со стабильной стенокардией [14]. В настоящем исследовании мы также не выявили различий в содержании исследуемых клеточных субпопуляций (Трег и Тх17) и их соотношении у пациентов без значимого поражения КА и пациентов с 1-2-сосудистым поражением без прогрессирования коронарного АС. В то же время значимое изменение иммунологического баланса отмечается при тяжѐлых атеросклеротических изменениях сосудов. По-видимому, участие лимфоцитарного компонента в регуляции воспалительной реакции при атерогенезе наиболее важно на более поздних стадиях АС. Указанная тенденция прослеживается и при анализе результатов исследований, посвящѐнных изучению иммунологических особенностей при АС сонных артерий. Ammirati с соавт. [14] не выявили различий в содержании Трег у пациентов с различной выраженностью АС сонных артерий на начальных стадиях (увеличение ТИМ до 1,5 мм). Данные Lui с соавт. (2012) указывают на снижение содержания Трег и более высокое содержание Тх17 и ассоциированных цитокинов у пациентов с выраженными атеросклеротическими изменениями и нестабильными АСБ в сонных артериях по сравнению с пациентами без АСБ в сонных артериях [103]. Нами был выявлен более высокий уровень sCD25 в крови у пациентов c многососудистым атеросклерозом коронарных артерий и с выраженным диффузным поражением брахиоцефальных артерий по сравнению с пациентами без значимого поражения артерий. sCD25 – растворимая («отщепленная» с поверхности клетки) форма рецептора ИЛ-2. Основным, источником sCD25 являются активированные лимфоциты [23], и уровень sCD25 значительно повышается при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях [78]. Концентрация sCD25 в крови также выше у пациентов с онкологическими заболеваниями, в этом случае его источником могут являться Трег [96,121]. Подтверждено повышение уровня sCD25 у пациентов 90 с ОКС и стабильной стенокардией [5,139]. Ранее нами было показано увеличение содержания Трег и пропорциональное увеличение концентрации sCD25 в сыворотке у пациентов сАС коронарных артерий через 1 месяц после имплантации стентов с рапамициновым покрытием. Рапамицин и его аналоги, являясь цитостатическими агентами, подавляют иммунный ответ, опосредованный в том числе эффекторными лимфоцитами, и обладают уникальным действием, обеспечивающим выживание Трег. Вероятно, выявленное в данной работе увеличение содержания sCD25, пропорциональное увеличению уровня Трег, было обусловлено действием рапамицина. Указанные показатели возвращались к исходным значениям спустя 6 месяцев от вмешательства [124]. В настоящее исследование не включались пациенты, у которых срок от предыдущей ТБКА со стентированием не превышал 6 мес. В связи с тем, что содержание sCD25 в крови оказалось прямо пропорционально количеству Тх17 и обратно пропорционально содержанию Трег, мы считаем, что данный показатель может отражать процесс активации лимфоцитов при атеросклерозе. При анализе концентрации вчСРБ были выявлены ожидаемо более высокие значения вчСРБ у больных с выраженным многососудистым атеросклеротическим поражением коронарного русла по сравнению с пациентами без значимого атеросклероза КА [101]. Сывороточная концентрация ИЛ-10 оказалась ниже у пациентов с многососудистым коронарным АС по сравнению с пациентами с интактными КА. В то же время отмечена тенденция к повышению содержания ИЛ-17 у пациентов выраженным с многососудистым АС сонных поражением артерий по коронарного сравнению с русла и пациентами с малоизменѐнными артериями, что, в целом, подтверждает полученные ранее результаты, указывающие на связь повышенного уровна ИЛ-17 в сыворотке и атеросклеротических изменений сосудов у человека [97]. Полученные в настоящей работе данные указывают на связь различных клеточных субпопуляций с развитием, дестабилизацией и прогрессированием 91 АС в различных сосудистых бассейнах. Так, для КА наиболее точным маркѐром, отражающим тяжесть поражения русла явились CD4+FoxP3+ Трег и Тх17, а также их соотношение, для сонных артерий – CD4+CD25highCD127low субпопуляция Трег. Объяснением этому могут служить несколько фактов. Во-первых, ангиографическое исследование коронарных сосудов имеет ряд ограничений. КАГ не позволяет выявить начальные атеросклеротические изменения, при которых просвет сосуда может оставаться практически неизменѐнным. Преимущества УЗДС перед ангиографией, помимо неинвазивности и отсутствия лучевой нагрузки, состоят в возможности выявления начальных и эксцентрических атеросклеротических поражений, не изменяющих просвет сосуда, и оценки структуры АСБ (плотность, гомогенность, васкуляризация, наличие кальцинатов). Таким образом, при УЗДС брахиоцефальных артерий учитываются атеросклеротические изменения, начиная с более ранних стадий. Кроме этого, вероятно, существуют различные механизмы образования АСБ, доминирование одного из них зависит от локализации АСБ и индивидуальных особенностей человека. Так, Dalager с соавт. (2007) показали гистологические различия АСБ в различных сосудистых бассейнах. Для коронарных артерий были более характерны утолщение интимы без скопления пенистых клеток, чаще встречались АСБ с липидным ядром по сравнению с фиброзными АСБ. Напротив, в сонных артериях преобладали начальные изменения со скоплениями пенистых клеток и АСБ с липидным ядром; в бедренных артериях чаще встречалось утолщение интимы без пенистых клеток и фиброзные АСБ. Авторы также указывают на различия влияния «классических» факторов риска АС на формирование АСБ в артериях различной локализации. Так, дляИБС важнейшее значение имеет уровень холестерина, для атеросклероза сонных артерий – артериальная гипертония; курение и сахарный диабет - для атеросклероза артерий ног. Ключом к пониманию, вероятно, могут служить гемодинамические различия указанных сосудистых бассейнов и структура артериальной стенки. Общие 92 сонные артерии и аорта являются артериями эластического типа с выраженным эластическим каркасом, более предрасположенные к формированию скоплений пенистых клеток. Проксимальные сегменты коронарных артерий и внутренних сонных артерий являются переходными зонами между эластическим и мышечным типом. Средние и дистальные сегменты коронарных артерий и бедренные артерии принадлежат к артериям мышечного типа, предрасположенным к формированию фиброзных АСБ. Некоторые артерии, такие как маммарная, практически не подвержены атеросклеротическим изменениям [41]. Особенности течения воспалительных реакций в различных сосудистых бассейнах, лежащие в основе развития различных морфологических типов АСБ, практически не изучены. Прогрессирование АС в коронарных артериях обуславливает возобновление стенокардии и необходимость госпитализации, а также в ряде случаев проведения дорогостоящего оперативного лечения. Прогрессирование АС сонных артерий повышает риск развития нарушения мозгового кровообращения. В ряде случаев АС может развиваться даже при коррекции основных общепринятых факторов риска заболевания (снижение уровня холестерина и глюкозы до целевых значений, отказ от курения, и др). Своевременное выявление таких пациентов, усиление контроля над ними и назначение соответствующей терапии позволят уменьшить количество повторных госпитализаций и сократить затраты на оперативное лечение. В настоящее время нет маркѐров, однозначно указывающих на риск прогрессирования АС и развития ССО у пациентов со стабильными проявлениями ИБС при коррекции основных общепринятых факторов риска. Наиболее изученный маркѐр, ассоциированный с высоким риском развития осложнений у пациентов с острым коронарным синдромом (ОКС) и инфарктом миокарда (ИМ), - СРБ, - не показал прогностической значимости в отношении риска прогрессирования и развития осложнений при хроническом течении ИБС [157]. 93 В настоящей прогрессирующим работе течением впервые показано, коронарного что у больных атеросклероза, с оцененным ретроспективно, по сравнению с больными без коронарного атеросклероза и без признаков прогрессии заболевания отмечалось изменение баланса Трег/Тх17 в пользу провоспалительного звена. Согласно нашим данным, содержание ИЛ-10-продуцирующих Тлимфоцитов с фенотипом CD4+IL10+ было ниже у пациентов с зарегистрированной в последующие 12-24 месяца прогрессией атеросклероза коронарных артерий. Указанные различия обусловлены меньшим содержанием CD4+FoxP3-IL10+ клеток. Содержание ИЛ-10-продуцирующих Т-лимфоцитов (с фенотипом CD4+IL10+), выраженное в % отношении от CD4+ лимфоцитов, менее 3,5%, свидетельствует о высоком риске прогрессирования атеросклероза у пациентов со стабильной ИБС в краткосрочной перспективе (1-2 года). К настоящему времени получено множество данных о роли ИЛ-10 в подавлении атерогенеза и стабилизации АСБ как у животных, так и у человека. У мышей, дефицитных по гену ИЛ-10, атеросклеротические изменения более выражены, и введение экзогенного ИЛ-10 замедляет прогрессирование АС [108]. Варианты гена ИЛ-10 ассоциированы с различной выраженностью коронарного атеросклероза и атеросклероза сонных артерий, различным прогнозом в отношении ИМ [34,173]. Одной из субпопуляций Т-лимфоцитов, продуцирующих ИЛ-10, помимо естественных FoxP3+ Трег, являются FoxP3- индуцибельные Трег (Tr1) [88]. В отличие отестественных Трег, которые, как и Т-хелперы, начинают экспрессировать уникальный Т-клеточный рецептор и окончательно созревают в тимусе, индуцибельные Трег созревают в периферических органах иммунной системы и очагах воспаления после презентации антигена. Роль индуцибельных Трег заключается в ограничении избыточной иммунной реакции в отношении конкретного антигена непосредственно в очаге воспаления путѐм секреции ИЛ-10 или ТФР-бета 94 [112]. Можно предполагать, что в то время как естественные Трег отражают общую предрасположенность к развитию АС, уровень индуцибельных Трег ассоциирован со скоростью прогрессирования заболевания. ИЛ-10-продуцирующими Т-лимфоцитами, помимо Трег, являются Тх2. Антиатерогенная роль Трег обсуждалась в настоящей работе. Данные о роли Тх2 в атерогенезе противоречивы. С одной стороны, Тх2 являются источником ИЛ-4 и ИЛ-5, оказывающими разнонаправленные эффекты на воспаление в сосудистой стенке в экспериментальных моделях. С другой стороны - в недавно завершѐнном крупном проспективном исследовании подтверждена протективная роль высокого содержания Тх2 и ИЛ-4 в отношении долгосрочного риска ИМ и ОНМК экспериментальных условиях введение (индуцибельных) не значимого Тх2 оказало [49]. Однако в апоВ100-специфичных влияния на скорость прогрессирования АС в экспериментальных условиях [50]. Исследователи также описывают возможность секретирования ИЛ-10 такими клеточными субпопуляциями, как Тх1 и Тх17, а также Тх9 в определѐнных условиях микроокружения, при этом суммарный эффект ИЛ10 на выраженность воспаления зависит от межклеточных взаимодействий [67,162]. Учитывая тот факт, что настоящая часть исследования изначально не входила в задачи, прогрессированием АС группы пациентов нативных с зарегистрированным коронарных артерий и без прогрессирования различались по базальным характеристикам (возраст, количество выполненных ТБКА), что теоретически может оказывать влияние на исход. Тем не менее, результаты данной работы открывают новые перспективы в исследовании иммунологии атеросклероза. В большинстве исследований продемонстрировано снижение уровня и супрессорной активности Трег и повышение количества Tх17 в кровотоке у больных различными формами обострения ИБС – ОКС (НС и ИМ) по сравнению с индивидами без коронарного АС. Следует отметить, что 95 непосредственно при ОКС иммунологические изменения могут быть следствием некроза миокарда [156] и острого эмоционального стресса [172]. Существует гипотеза о «наклонности» к нестабильному течению ИБС и развитию ИМ у лиц с изменением иммунологического баланса и подавлением регуляторного звена. George с соавт. (2012) установили, что у пациентов с перенесѐнным ИМ (т.е. нестабильными проявлениями атеросклероза) различной давности содержание Tрег и ИЛ-10 в крови ниже, чем у пациентов со стабильным течением ИБС [64]. Показанные нами закономерности изменения иммунного баланса - увеличение содержания Tх17 и уменьшение содержания Tрег и их отношения Tрег/Tх17 - у пациентов с перенесѐнным ИМ в прошлом подтверждают эти результаты. Предиктивная значимость содержания популяции Трег в развитии ИМ была подтверждена в работе Wigren с соавт. (2012) [175]. В настоящей работе мы оценили влияние «классических» факторов риска атеросклероза (пол, возраст, курение, дислипидемия, ожирение) на содержание лимфоцитарных субпопуляций и "растворимых" маркѐров воспаления. Выявленные в настоящей работе более высокие уровни вчСРБ у женщин отмечались и в ряде ранних популяционных исследований [94] авторы связывают этот факт с влиянием эстрогенов и более высоким ИМТ. В популяционных исследованиях, включивших практически здоровых добровольцев, отмечено более высокое содержание CD4+ лимфоцитов у женщин по сравнению с мужчинами [134,163]. В данной работе мы показали аналогичную тенденцию как среди лиц без коронарного АС, так и среди пациентов с ИБС. Мы выявили, что у женщин содержание CD4+FoxP3+ Tрег выше, чем у мужчин, количество CD4+CD25highCD127lowТрег не зависело от пола пациентов. В недавно опубликованном исследовании Afshan с соавт. (2012) [10], включившем 50 практически здоровых мужчин и 47 женщин молодого возраста (16-25 лет), показано, что у женщин содержание CD4+CD25high Трег ниже по сравнению с мужчинами. В наше исследование 96 были включены пациенты пожилого возраста, в том числе женщины в постменопаузе, с атеросклерозом коронарных артерий. Известно, что с возрастом уменьшается созревание лимфоцитов в тимусе, и изменяется содержание Tрег за счѐт уменьшения количества естественных Tрег и увеличения количества индуцированных на периферии Tрег [58]. Вероятно, этот процесс протекает по-разному у женщин и у мужчин. Вопрос о роли Tрег как дополнительного протективного фактора в отношении атеросклероза у женщин требует дальнейшего изучения. Исследователи отмечают отрицательную корреляцию между возрастом и содержанием Трег в периферическом кровотоке [15]. В данной работе выявлена аналогичная зависимость содержания Трег в зависимости от возраста, также отмечена прямая корреляция возраста пациентов и содержания Тх1 и уровня маркѐра активации лимфоцитов sCD25 в сыворотке крови. Данные о влиянии курения на субпопуляционный состав лимфоцитов противоречивы. Внимание исследователей было обращено прежде всего на крупные лимфоцитарные популяции. По данным Santagostino с соавт. (1999), у курильщиков выше содержание CD4+в кровотоке по сравнению с некурящими [134]; Uppal с соавт. (2002) значимых различий не обнаружили [163]. В доступной литературе нет данных, посвящѐнных влиянию курения на минорные регуляторные клеточные субпопуляции. Мы показали, что у курильщиков имеет место активация лимфоцитов, проявляющаяся в увеличении количества активированных Т-лимфоцитов (экспрессирующих CD25) и концентрации sCD25 в сыворотке крови. Во множестве исследований показана взаимосвязь метаболических нарушений с наличием системного вялотекущего воспалительного процесса [101], маркѐром которого является вчСРБ. Мы подтвердили наличие взаимосвязи между показателями липидного спектра (ХС, ТГ) и ИМТ и уровнем вчСРБ. В настоящем исследовании также выявлена слабая прямая корреляция уровня ТГ и содержания Тх17. Взаимосвязи уровня глюкозы с 97 изучаемыми показателями выявлено не было, вероятно, поскольку критерием исключения служило наличие сахарного диабета, и у большинства исследуемых пациентов концентрация глюкозы находилась в диапазоне нормальных значений. Таким образом, проатерогенные эффекты факторов риска АС могут быть отчасти опосредованы подавлением регуляторного звена иммунитета и активацией провоспалительных клеточных субпопуляций. Влияние статинов на иммунологические показатели и содержание маркѐров воспаления у пациентов с ИБС и аутоиммунными заболеваниями активно обсуждаются в настоящее время. Терапия статинами способствует аккумуляции Трег в АСБ [111] и ассоциирована с увеличением количества циркулирующих CD4+ FoxP3+ Трег у здоровых добровольцев [129] и у пациентов с ОКС [82]. Указанные изменения иммунного статуса могут быть обусловлены плейотропными эффектами статинов, включая регуляцию внутриклеточных сигнальных каскадов и рецепторных межклеточных взаимодействий [16]. В настоящем исследовании все пациенты на момент включения получали терапию статинами в сопоставимых дозах, что позволило не учитывать данный параметр при анализе. Окисленные ЛНП вызывают активацию мононуклеарных клеток крови in vitro, сопровождающуюся секрецией цитокинов ИЛ-1бета, ИЛ-6, ФНОальфа, ИФН-гамма, ИЛ-10, в меньшей степени - ИЛ-4 и ИЛ-17. При этом в концентрации ИЛ-1бета, ИЛ-6, ИЛ-10 и ИФН-гамма в среде культивирования клеток мононуклеарной фракции оказались значительно выше в случае присутствия в среде окЛНП по сравнению с поликлональным Т-клеточным митогеном ФГА. Это свидетельствует о значительной роли моноцитов, присутствующих в культуре мононуклеарных клеток, в секреции указанных цитокинов. Указанное влияние окЛНП на активацию неспецифического иммунитета, аналогичное эффекту липоплисахарида, подробно описано ранее [18]. В настоящей работе мы обнаружили активирующее действие окЛНП на компоненты адаптивного иммунитета - секрецию ИЛ-2 98 лимфоцитами, выделенными из периферической крови. В литературе описано выявление клонов АГ (окЛНП)-специфических лимфоцитов в АСБ животных и человека. специфические Однако лимфоциты в попытки идентифицировать периферическом кровотоке окЛНПоказались безуспешны [149], что, вероятно, связано с низкой чувствительностью использованных методов. В настоящей работе мы применили ELISPOT для детекции АГ-специфических клеток. Метод ELISPOT (Enzyme-linked immunosorbent spot) в течение более чем 30 лет используется для детекции иммунного ответа в отношении инфекционных агентов, опухолевых антигенов, трансплантатов и вакцин. Отличие метода от иммуноферментного анализа заключается в том, что цитокины, продуцируемые активированными клетками в ответ на присутствие в среде культивирования антигена, сразу же связываются с антителами, которыми покрыто дно плашки, и не успевают деградировать в растворе, что обеспечивает высокую чувствительность метода и позволяет оценивать количество цитокин-продуцирующих клеток [158]. Fei c соавт. (2003) методом ELISPOT показали, что в АСБ человека присутствуют мононуклеарные лимфоциты, активирующиеся в присутствии окЛНП и продуцирующие ИЛ-12 и ИЛ-10 [56]. В данной работе впервые показано наличие АГ-специфических (активирующихся и секретирующих ИЛ-2) клеток в периферическом кровотоке здоровых добровольцев и, в меньшей степени, пациентов с мультифокальным АС. В нормальных условиях наличие Трег обеспечивает достаточный уровень толерантности организма к аутоАГ. В случае внедрения в организм чужеродного АГ происходит активация провоспалительного звена и подавление регуляторных систем для более быстрой элиминации чужеродного агента. После элиминации равновесие восстанавливается. Однако в случае аутоиммунной реакции постоянное присутствие аутоАГ приводит к хроническому непрерывному подавлению течению воспалительного регуляторных систем (Трег). процесса и Исходя из литературных данных и полученных в настоящей работе результатов, ход 99 воспаления в артериальной стенке при АС можно представить следующим образом. Нативные ЛНП проникают из плазмы в интиму здоровых сосудов. При активации эндотелия и присутствии в интиме макрофагов, вырабатывающих протеолитические ферменты и активные формы кислорода, ЛНП претерпевают химические изменения (в первую очередь, окисление). Модифицированные адаптивного ЛНП являются иммунитета.окЛНП триггерами фагоцитируются активации реакций АПК АСБ в и презентируются лимфоцитам в лимфатических узлах. В случае узнавания АГ в составе МНС-II лимфоцитом со специфическим Т-клеточным рецептором происходит активация и клональная пролиферация последнего. Клоны АГспецифических лимфоцитов попадают в кровоток и циркулируют как клетки памяти. При неинтенсивном воспалительном процессе в сосудистой стенке и медленном образовании окЛНП модифицированные молекулы успевают удаляться из внеклеточного пространства, фагоцитируемые макрофагами (клиренс). При нарушении процессов клиренса (нарушение подвижности макрофагов, апоптоз, избыточное накопление окЛНП в межклеточном пространстве) окЛНП узнаются циркулирующими АГ-специфическими лимфоцитами, те интенсивно мигрируют в сосудистую стенку, их содержание в периферическом кровотоке уменьшается. Данная гипотеза может объяснять полученные в исследовании различия в количестве АГспецифических лимфоцитов у здоровых лиц и пациентов с АС. Важно отметить различие в возрасте групп здоровых добровольцев и пациентов с мультифокальным АС. Это может обуславливать различия в содержании лимфоцитарных субпопуляций вообще и в количестве АГспецифических лимфоцитов в частности. Необходимо изучение динамики содержания клеток у здоровых людей с возрастом, сравнение с пациентами сАС соответствующего возраста. Диагностическая и прогностическая ценность данной методики в отношении пациентов с предрасположенностью к прогрессированию АС требует уточнения в дальнейших исследованиях. 100 Данные о влиянии окЛНП на выживаемость и активность мононуклеарных клеток в культуре немногочисленны и противоречивы. Культивирование лимфоцитов в среде с окЛНП приводило к подавлению пролиферации лимфоцитов в присутствии ФГА и усилению апоптоза [13,31]. Мы подтвердили усиление апоптоза Т-лимфоцитов в присутствии окЛНП. Возможно, отсутствие увеличения концентрации провоспалительных цитокинов в среде культивирования клеток с окЛНП обусловлено сравнительно невысоким содержанием АГ-специфических Т-лимфоцитов, их продуцирующих, и превалированием токсических эффектов окЛНП. Вероятно, в АСБ множественные факторы микроокружения способствуют развитию воспалительного ответа активированных лимфоцитов. Следует отметить, что АГ-специфические лимфоциты, активирующиеся в присутствии окЛНП, составляют крайне незначительную часть от общего количества циркулирующих клеток. Аналогично, концентрация цитокинов, продуцируемых лимфоцитами, либо увеличивается незначительно (ИЛ-2) или не увеличивается (ИЛ-4, ИЛ-17) в присутствии окЛНП на фоне выраженного увеличения концентрации остальных цитокинов (ИЛ-1бета, ИЛ-6, ФНО-альфа, ИФН-гамма и ИЛ-10), которые могут продуцироваться также и моноцитами/макрофагами (компонентами врождѐнного иммунитета). В то же время в клиническом исследовании нами получены значительные различия в содержании общих лимфоцитарных популяций (независимо от специфичности в отношении различных антигенов) у пациентов с интактными артериями и пациентов сАС различных локализаций. Это свидетельствует о неспецифическом (независимом от АГ) вовлечении лимфоцитов в регуляцию воспалительных процессов в сосудистой стенке при АС. Возможно, интенсивность воспаления в интиме регулируется системными эффектами продуцируемых Т-лимфоцитами цитокинов. В поддержку данной гипотезы выступает факт общности патогенеза атеросклероза и ряда аутоиммунных заболеваний. У пациентов с различными аутоиммунными заболеваниями (системная красная волчанка, 101 ревматоидный артрит, псориаз), в основе которых лежит патологическая активация Т- и В-лимфоцитов в отношении различных аутоантигенов, отмечается ускоренное прогрессирование атеросклероза [138]. Модуляция параметров клеточного и гуморального иммунитета является перспективным направлением разработки потенциальных терапевтических подходов лечения АС, включающим разработку вакцин, стимулирующих Трег-опосредованную иммунологическую толерантность к аутоАГ в АСБ, низкодозовую терапию иммуносупрессорными агентами, введение нейтрализующих антител к цитокинам или окисленным липопротеидам низкой плотности, клеточную терапию с применением толерогенных ДК. Результатами 20-летней работы группы профессора Я. Нильссона в Швеции, посвящѐнной поиску антигена, ответственного за стимуляцию адаптивных иммунных реакций и прогрессированию АС, а также разработке методов активации толерогенного звена (Трег и толерогенные ДК) в отношении указанных АГ, явилась разработка вакцины на основе пептидного фрагмента апоВ100. В революционной работе в иммунологии атеросклероза показаны эффекты иммунизации животных против АпоВ и его производных в виде предупреждения образования новых АСБ и замедления роста уже имеющихся АСБ, стабилизации АСБ за счѐт увеличения продукции коллагена, а также уменьшения клеточной воспалительной инфильтрации АСБ [73]. В настоящее время проводятся клинические испытания вакцины Cardiovax на основе пептидного фрагмента апоВ100 [118] и ингибитора фосфолипазы А2 Дарапладиба, специфически подавляющий модификацию липидов в АСБ (Stabilization of Atherosclerosis plaque By Initiation Разрабатываются of методы darapLadIb низкодозовой TherapY, STABILITY) иммуносупрессорной [142]. терапии метотрексатом (Cardiovascular inflammation reduction trial, CIRT), результаты ожидаются в 2015-2016 гг [126]. В клинических испытаниях также проходит проверку лекарственное средство на основе человеческих моноклональных антител к ИЛ-1бета (Canakinumab Anti-inflammatory Thrombosis Outcomes 102 Study, CANTOS), получение результатов также ожидается в 2015-2016гг [127]. Запатентован и проходит клинические испытания препарат на основе антител к пептидному фрагменту окисленной формы апоВ100 (MLDL1278a) [117]. Ряд перспективных разработок находится на стадии доклинических испытаний, например, методика индукции толерогенных ДК [74]. Так, различные режимы инкубации ДК с последующим их введением в кровоток оказывали различное влияние на скорость прогрессирования атеросклероза у животных. Присутствие в среде культивирования ДК ИЛ-10 приводило к подавлению атеросклероза у мышей. При этом присутствие специфического антигена в среде культивирования ДК («обучение» в отношении АроВ100) в обычных условиях способствовало атерогенезу, а в «противовоспалительных» условиях (в среде, содержащей ИЛ-10) - его более эффективному подавлению. Толерогенное действие ДК, вероятно, было опосредовано Трег: показано, что экспрессия FoxP3 была выше у животных, которым вводили толерогенные ДК (культивированные в присутствии ИЛ10) [74]. Данные об изменении иммунного баланса у пациентов сАС сонных и коронарных артерий, полученные в настоящем исследовании, могут лечь в основу дополнительных методов оценки степени выраженности и скорости прогрессирования атеросклеротических изменений. Изучение патогенетических звеньев атерогенеза способствует разработке методов лечения, влияющих на воспалительный и иммунный компоненты АС, что позволит облегчить течение и улучшить прогноз больных с данным заболеванием. 103 ЗАКЛЮЧЕНИЕ АС представляет собой хронический воспалительный процесс в артериальной стенке, протекающий на фоне накопления модифицированных липидов в слое интимы. Лимфоциты, присутствующие в АСБ на всех стадиях еѐ развития, модулируют течение воспалительного процесса. Субпопуляции лимфоцитов с провоспалительными свойствами (Тх17, продуцирующие ИЛ17) способствуют прогрессированию АС, субпопуляции лимфоцитов с противовоспалительными свойствами (Трег, продуцирующие ИЛ-10) подавляют воспалительную реакцию в артериальной стенке и тем самым сдерживают развитие АС. лимфоцитов в позволяет крови Определение содержания получить субпопуляций информацию о течении воспалительного процесса в артериальной стенке. Разнонаправленные изменения Трег и Тх17 у пациентов с ИБС, обнаруженные в данном исследовании, могут быть, по крайней мере, отчасти, обусловлены распространѐнностью атеросклеротического поражения и скоростью прогрессирования АС. Согласно нашим результатам, изменение соотношения Трег/Тх17 в пользу провоспалительного звена связано с многососудистым АС и прогрессированием заболевания. Поскольку АС является системным заболеванием и поражает различные сосудистые бассейны, мы подтвердили изменения иммунного баланса (уменьшение содержания Трег и большие значения активированных лимфоцитов и Тх17, а также маркѐра активации лимфоцитов sCD25), отмеченные у пациентов с ИБС, у лиц с выраженными атеросклеротическими изменениями БЦА. Согласно новым данным, полученным в данной работе, содержание ИЛ-10-продуцирующих CD4+FoxP3-IL10+ Т-лимфоцитов клеток) (главным ассоциировано с образом, большей за счѐт скоростью прогрессирования АС коронарных артерий в краткосрочной перспективе. 104 Можно предполагать, что в то время как естественные Трег, созревающие в тимусе, отражают общую предрасположенность к развитию АС, уровень индуцибельных Трег, созревающих непосредственно в очаге воспаления, ассоциирован со скоростью прогрессирования заболевания. Роль указанных клеточных субпопуляций в атерогенезе у человека требует дальнейшего изучения. "Нестабильное" течение ИБС у пациентов, перенесших 1 или несколько ИМ, согласно представленным данным, также ассоциировано с нарушением иммунного баланса в сторону уменьшения содержания Трег и увеличения Тх17. В данной работе мы выявили взаимосвязь наличия факторов риска АС (мужской пол, возраст, курение, дислипидемия) с нарушением иммунного баланса в пользу увеличения количества активированных и проатерогенных лимфоцитарных субпопуляций при меньшем содержании Трег, что может являться одним из механизмов патологического воздействия указанных факторов при АС. Обнаруженные эффекторных изменения субпопуляций воспалительный процесс в в соотношении лимфоцитов, АСБ, могут регуляторных и способных контролировать явиться дополнительным независимым фактором риска прогрессии заболевания и развития его осложнений. Нарушение баланса Трег/Тх17 в сторону провоспалительного звена, как и уменьшение содержания ИЛ-10 продуцирующих лимфоцитов, ассоциировано с прогрессированием атеросклероза и многососудистым поражением. sCD25 может являться маркѐром, отражающим иммунную активацию при атеросклерозе. Требуются дальнейшие исследования, чтобы определить место данных параметров в диагностическом и прогностическом поиске у больных ИБС. Изучение основ атерогенеза позволит подобрать наиболее эффективную иммунотропную терапию для пациентов с различными нарушениями иммунологического баланса. 105 ВЫВОДЫ 1. У больных многососудистым атеросклерозом коронарных артерий отмечено снижение содержания Трег и увеличение содержания Тх17 в крови по сравнению с пациентами с малоизменѐнными коронарными артериями. У больных с прогрессирующим соотношение Трег/Тх17 течением изменено в коронарного пользу Тх17. атеросклероза Количество циркулирующих Трег обратно коррелирует с выраженностью коронарного атеросклероза. 2. У больных со стенозами сонных артерий более 50% содержание Трег ниже по сравнению с пациентами с начальными атеросклеротическими поражениями. Отношение содержания активированных лимфоцитов к Трег выше, а отношение содержания Трег к тх17 - ниже у пациентов со стенозами сонных артерий более 30% по сравнению с пациентами с начальными атеросклеротическими поражениями. 3. Концентрация sCD25 и вчСРБ в крови повышена, а ИЛ-10 - снижена у пациентов с многососудистым поражением коронарных артерий по сравнению с пациентами с малоизменѐнными коронарными артериями.Содержание sCD25 в сыворотке выше у пациентов со стенозами сонных артерий более 30%, содержание ИЛ-17 - выше у пациентов со стенозами более 50% по сравнению с пациентами с начальными атеросклеротическими поражениями. 4. Окисленные ЛНП вызывают активацию мононуклеарных клеток крови in vitro, сопровождающуюся секрецией цитокинов ИЛ-1, -6, ФНОальфа, ИФН-гамма, ИЛ-10 и ИЛ-2. В высоких дозах окЛНП обладают проапоптотическим действием. В крови пациентов с ИБС и доноров 106 выявлены окЛНП-специфические Т-лимфоциты, секретирующие ИЛ-2 при культивировании с окЛНП. 107 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. В качестве новых тестов для комплексной диагностики тяжести и скорости прогрессирования атеросклеротического поражения может использоваться определение иммунологических показателей (содержание Тх17, Трег и ИЛ10-продуцирующих лимфоцитов и отношение Трег/Тх17, концентрации sCD25). 2. Рекомендуется применение метода ELISPOT с детекцией ИЛ-2продуцирующих лимфоцитов в экспериментальной и лабораторной практике для разработки и оценки эффективности иммунотропных методик лечения атеросклероза. 3. Рекомендуется использовать материалы диссертации в учебных программах в высших учебных заведениях медицинского профиля, а также на кафедрах последипломного образования. 108 СПИСОК ЦИТИРУЕМЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Гривель, Ж.-Ш., Иванова, О.И., Пинегина Н.В., Бланк, П.С., Шпектор, А.В., Марголис, Л.Б., Васильева, Е.Ю. Новый метод анализа клеточного состава атеросклеротических бляшек// Креативная кардиология.2012.- № 1.- С.26-40. 2. Здравоохрание в России. Статистический сборник.- 2014. - Режим доступа: http://www.gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat_main/rosstat/ru/statistics/population/h ealthcare/# 3. Клинические рекомендации. Диагностика и лечение хронической ишемической болезни сердца. Москва.- 2013. С.53. Режим доступа: http://www.cardioweb.ru/klinicheskie-rekomendatsii 4. Ланкин, В.З., Афанасьева, Дмитриева, О.А., Тихазе, А.К., О.И., Коновалова, Г.Г., Уткина, Е.А., Кумскова, Е.М., Покровский С.Н. Модификация липопротеида (а) природными дикарбонилами индуцирует его свободнорадикальное перекисное окисление// Доклады Академии Наук.2011.- Т.441(6).- С.829-832. 5. Мазуров, В.И., Стволов, С.В., Линецкая, Н.Э., Балдуева, И.А. Содержание провоспалительных цитокинов интерлейкина-2, интерлейкина-8 и растворимого рецептора интерлейкина2 в крови у больных ишемической болезнью сердца различных вариантов// Терапевтический архив.- 2001.- № 12.- С. 14-17. 6. Николаева, И.Н., Гольдерова, А.С., Кривошапкина, З.Н., Захарова, Ф.А. Уровень регуляторных Т-лимфоцитов (CD4+CD25+FoxP3+) у больных нестабильной стенокардией// Якутский медицинский журнал.- 2012.- №.2.С.24-26. 109 7. Российский статистический ежегодник.- 2014.- Режим доступа http://www.gks.ru/wps/wcm/connect/rosstat_main/rosstat/ru/statistics/publications/ catalog/doc_1135087342078 8. Ярилин, А.А. Естественные регуляторные Т клетки // Российский медицинский журнал.- 2007.- N 1.-С. 43-48. 9. Ярилин, А.А. Иммунология// ГЭОТАР-Медиа.- 2010.-749 C. 10. Afshan, G., Afzal, N., Qureshi, S. CD4+CD25(hi) regulatory T cells in healthy males and females mediate gender difference in the prevalence of autoimmune diseases// Clin Lab.- 2012.- V.58(5-6).- P.567-71. 11. Ait-Oufella, H., Salomon, B.L., Potteaux, S., Robertson, A.K., Gourdy, P., Zoll, J., Merval, R., Esposito, B., Cohen, J.L., Fisson, S., Flavell, R.A., Hansson, G.K., Klatzmann, D., Tedgui, A., Mallat, Z. Natural regulatory T cells control the development of atherosclerosis in mice// Nat Med.- 2006.- V.12.P.178 –180. 12. Ait-Oufella, H., Sage, A.P., Mallat, Z., Tedgui, A. Adaptive (T and B Cells) Immunity and Control by Dendritic Cells in Atherosclerosis// Circ Res.2014.- V.114.- P.1640-1660. 13. Alcouffe, J., Caspar-Bauguil, S., Garcia, V., Salvayre, R., Thomsen, M., Benoist, H. Oxidized low density lipoproteins induce apoptosis in PHA-activated peripheral blood mononuclear cells and in the Jurkat T-cell line// J Lipid Res.1999.- V.40(7).- P.1200-10. 14. Ammirati, E., Cianflone, D., Banfi, M., Vecchio, V., Palini, A., De Metrio, M., Marenzi, G., Panciroli, C., Tumminello, G., Anzuini, A., Palloshi, A., Grigore, L., Garlaschelli, K., Tramontana, S., Tavano, D., Airoldi, F., Manfredi, A.A., Catapano, A.L., Norata, G.D. Circulating CD4+CD25hiCD127lo regulatory T-Cell levels do not reflect the extent or severity of carotid and coronary atherosclerosis// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2010.- V.30(9).- P.1832-41. 15. Arismendi, M.I., Kallás, E.G., Santos, B.A., Carneiro-Sampaio, M.M., Kayser, C. Thymopoiesis and regulatory T cells in healthy children and adolescents// Clinics (Sao Paulo).- 2012;.- V.67(5).- P.425-9. 110 16. Arnaud, C., Veillard, N.R., Mach, F. Cholesterol-independent effects of statins in inflammation, immunomodulation and atherosclerosis// Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord.- 2005.- V.5(2).- P.127-34. 17. Baecher Allan, C., Brown, J.A., Freeman, G.J., Hafler, D.A. CD4+CD25high regulatory cells in human peripheral blood // J Immunol.- 2001.V.167.- P.1245–53. 18. Bekkering, S., Quintin, J., Joosten, L.A., van der Meer, J.W., Netea, M.G., Riksen, N.P. Oxidized low-density lipoprotein induces long-term proinflammatory cytokine production and foam cell formation via epigenetic reprogramming of monocytes// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2014.- V.34(8).P.1731-8. 19. Bellinghausen, I., Klostermann, B., Knop, J., Saloga, J. Human CD4+CD25+ T cells derived from the majority of atopic donors are able to suppress TH1 and TH2 cytokine production // J Allergy Clin Immunol.- 2003.V.111(4).- P.862- 8. 20. Binder, C.J., Hartvigsen, K., Chang, M.K., Miller, M., Broide, D., Palinski, W., Curtiss, L.K., Corr, M., Witztum, J.L. IL-5 links adaptive and natural immunity specific for epitopes of oxidized LDL and protects from atherosclerosis// J Clin Invest.- 2004.- V.114.- P.427–437. 21. Björkbacka, H., Fredrikson, G.N., Nilsson, J. Emerging biomarkers and intervention targets for immune-modulation of atherosclerosis - a review of the experimental evidence// Atherosclerosis.- 2013.- V.227(1).- V.9-17. 22. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of mononuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g //Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl.- 1968.- V.97.- P.77-89. 23. Brusko, T.M., Wasserfall, C.H., Hulme, M.A., Cabrera, R., Schatz, D., Atkinson, M.A. Influence of membrane CD25 stability on T lymphocyte activity: implications for immunoregulation// PLoS One.- 2009.- V. 4(11).- e7980 111 24. Buono, C., Binder, C.J., Stavrakis, G., Witztum, J.L., Glimcher, L.H., Lichtman, A.H. T-bet deficiency reduces atherosclerosis and alters plaque antigenspecific immune responses// Proc Natl Acad Sci USA.- 2005. V.-102.- P.1596– 1601. 25. Buono, C., Come, C.E., Stavrakis, G., Maguire, G.F., Connelly, P.W., Lichtman, A.H. Influence of interferon-gamma on the extent and phenotype of dietinduced atherosclerosis in the LDLR-deficient mouse// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2003.- V.23.- P.454–460. 26. Businaro, R., Tagliani, A., Buttari, B., Profumo, E., Ippoliti, F., Di Cristofano, C., Capoano, R., Salvati, B., Riganò, R. Cellular and molecular players in the atherosclerotic plaque progression// Ann N Y Acad Sci.- 2012.- V.1262.P.134-41. 27. Bystry, R.S., Aluvihare, V., Welch, K.A., Kallikourdis, M., Betz, A.G. B cells and professional APCs recruit regulatory T cells via CCL4 // Nat Immunol.2001.- V.2.- P.1126–32. 28. Câmara, N.O., Sebille, F., Lechler, R.I. Human CD4+CD25+ regulatory cells have marked and sustained effects on CD8+ T cell activation // Eur. J. Immunol. – 2003.- V.33.- P.3473–3483. 29. Cao, X., Cai, S.F., Fehniger, T.A., Song, J., Collins, L.I., Piwnica Worms, D.R., Ley, T.J. Granzyme B and perforin are important for regulatory T cell mediated suppression of tumor clearance // Immunity.- 2007.- V.27.- P.635– 646. 30. Carrier, Y., Juan, J., Kuchroo, V.K., Weiner, H.L. Th3 cells in peripheral tolerance. I. Induction of Foxp3-positive regulatory T cells by Th3 cells derived from TGF-beta T cell-transgenic mice// J Immunol.- 2007.- V.178.- P.179–85. 31. Caspar-Bauguil, S., Saadawi, M., Negre-Salvayre, A., Thomsen, M., Salvayre, R., Benoist, H. Mildly oxidized low-density lipoproteins suppress the proliferation of activated CD4+ T-lymphocytes and their interleukin 2 receptor expression in vitro// Biochem J.- 1998.- V.1(330).- P.659-66. 112 32. Caspar-Bauguil, S., Tkaczuk, J., Haure, M.J., Durand, M., Alcouffe, J., Thomsen, M., Salvayre, R., Benoist, H. Mildly oxidized low-density lipoproteins decrease early production of interleukin 2 and nuclear factor kappaB binding to DNA in activated T-lymphocytes// Biochem J.- 1999.- V.15(337).- P.269-74. 33. Cederbom, L., Hall, H., Ivars, F. CD4+CD25+ regulatory T cells down regulate co stimulatory molecules on antigen presenting cells // J Immunol.- 2000.V.30.- P.1538–1543. 34. Chao, L., Lei, H., Fei, J. A meta-analysis of interleukin-10-1082 promoter genetic polymorphism associated with atherosclerotic risk// Neurol India.- 2014.- V.62(2).- P.130-6. 35. Chaudhry, A., Samstein, R.M., Treuting, P., Liang, Y., Pils, M.C., Heinrich, J.M., Jack, R.S., Wunderlich, F.T., Brüning, J.C., Müller, W., Rudensky, A.Y. Interleukin-10 signaling in regulatory T cells is required for suppression of Th17 cell-mediated inflammation// Immunity.- 2011.- V.34.- P.566–78. 36. Chen, W., Jin, W., Hardegen, N., Lei, K.J., Li, L., Marinos, N., McGrady, G., Wahl, S.M. Conversion of peripheral CD4+CD25− naive T cells to CD4+CD25+ regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3// J Exp Med.- 2003.- V.198.- P.1875–86. 37. Cheng, X., Yu, X., Ding, Y.J., Fu, Q.Q., Xie, J.J., Tang, T.T., Yao, R., Chen, Y., Liao, Y.H. The Th17/Treg imbalance in patients with acute coronary syndrome// Clin Immunol.- 2008.- V.127(1).- P.89-97. 38. Collison, L.W., Workman, C.J., Kuo, T.T., Boyd, K., Wang, Y., Vignali, K.M., Cross, R., Sehy, D., Blumberg, R.S., Vignali, D.A. The inhibitory cytokine IL 35 contributes to regulatory T cell function // Nature.- 2007.- V.450.- P.566– 569. 39. Curry, A.J., Portig, I., Goodall, J.C., Kirkpatrick, P.J., Gaston, J.S. T lymphocyte lines isolated from atheromatous plaque contain cells capable of responding to Chlamydia antigens// Clin Exp Immunol.- 2000.- V.121(2).- P.261-9. 40. Cuthbert, J.A., Lipsky, P.E. Modulation of human lymphocyte responses by low density lipoproteins (LDL): enhancement but not immunosuppression is 113 mediated by LDL receptors// Proc Natl Acad Sci U S A.- 1984.- V.81(14).- P.453943. 41. Dalager, S., Paaske, W.P., Kristensen, I.B., Laurberg, J.M., Falk, E. Artery-related differences in atherosclerosis expression: implications for atherogenesis and dynamics in intima-media thickness// Stroke.- 2007.- V.38(10).P.2698-705. 42. Davenport, P., Tipping, P.G. The role of interleukin-4 and interleukin-12 in the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice// Am J Pathol.- 2003.- V.163.- P.1117–1125. 43. de Boer, O.J., Hirsch, F., van der Wal, A.C., van der Loos, C.M., Das, P.K., Becker, A.E. Costimulatory molecules in human atherosclerotic plaques: an indication of antigen specific T lymphocyte activation// Atherosclerosis.- 1997.V.133(2).- P.227-34. 44. de la Rosa, M., Rutz, S., Dorninger, H., Scheffold, A. Interleukin 2 is essential for CD4+CD25+ regulatory T cell function // Eur. J Immunol.- 2004.- V.34.- P.2480–2488. 45. Deaglio, S., Dwyer, K.M., Gao, W., Friedman, D., Usheva, A., Erat, A., Chen, J.F., Enjyoji, K., Linden, J., Oukka, M., Kuchroo, V.K., Strom, T.B., Robson, S.C. Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73 expressed on regulatory T cells mediates immune suppression // J Exp. Med.- 2007.- V.204. – P.1257–1265. 46. del Rosario Espinoza Mora, M, Böhm, M, Link, A. The Th17/Treg imbalance in patients with cardiogenic shock// Clin Res Cardiol.- 2014.- V.103(4).P.301-13. 47. Eid, R.E., Rao, D.A., Zhou, J., Lo, S.F., Ranjbaran, H., Gallo, A., Sokol, S.I., Pfau, S., Pober, J.S., Tellides, G. Interleukin-17 and interferon-gamma are produced concomitantly by human coronary artery-infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells// Circulation.- 2009.- V.119.P.1424–1432. 114 48. Eng, J. ROC analysis: web-based calculator for ROC curves// Baltimore: Johns Hopkins University.- Режим доступа: http://www.jrocfit.org 49. Engelbertsen, D., Andersson, L., Ljungcrantz, I., Wigren, M., Hedblad, B., Nilsson, J., Björkbacka, H. T-helper 2 immunity is associated with reduced risk of myocardial infarction and stroke// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2013.V.33(3).- P.637-44. 50. Engelbertsen, D., Rattik, S., Knutsson, A., Björkbacka, H., Bengtsson, E., Nilsson, J. Induction of T helper 2 responses against human apolipoprotein B100 does not affect atherosclerosis in ApoE-/- mice // Cardiovasc Res.- 2014.V.15(102).- P.304-12. 51. Erbel, C., Chen, L., Bea, F., Wangler, S., Celik, S., Lasitschka, F., Wang, Y., Böckler, D., Katus, H.A., Dengler, T.J. Inhibition of IL-17A attenuates atherosclerotic lesion development in apoE-deficient mice// J Immunol.- 2009.V.183.- P. 8167–8175. 52. Erbel, C., Dengler, T.J., Wangler, S., Lasitschka, F., Bea, F., Wambsganss, N., Hakimi, M., Böckler, D., Katus, H.A., Gleissner, C.A. Expression of IL-17A in human atherosclerotic lesions is associated with increased inflammation and plaque vulnerability// Basic research in cardiology.- 2011.V.106.- P.125–134. 53. Esterbauer, H., Dieber-Rotheneder, M., Waeg, G., Striegl, G., Jürgens, G. Biochemical, structural, and functional properties of oxidized low-density lipoprotein// Chem Res Toxicol.- 1990.- V.3.- P.77–92. 54. Fantini, M.C., Becker, C., Monteleone, G., Pallone, F., Galle, P.R., Neurath, M.F. Cutting edge: TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25− T cells through Foxp3 induction and down-regulation of Smad7// J Immunol.- 2004.- V.172.- P.5149–53. 55. Fehérvari, Z., Sakaguchi, S. CD4+ Tregs and immune control // The Journal P.1209-17. of Clinical Investigation.- 2004.- V114(9).- 115 56. Fei, G.Z., Huang, Y.H., Swedenborg, J., Frostegård, J. Oxidised LDL modulates immune-activation by an IL-12 dependent mechanism// Atherosclerosis.- 2003.- V.169(1).- P.77-85. 57. Feng, J., Zhang, Z., Kong, W., Liu, B., Xu, Q., Wang, X. Regulatory T cells ameliorate hyperhomocysteinaemia-accelerated atherosclerosis in apoE-/mice// Cardiovasc Res.- 2009.- V.1(84).- P.155-63. 58. Fessler, J., Ficjan, A., Duftner, C., Dejaco, C. The impact of aging on regulatory T-cells// Front Immunol.- 2013.- V.4.- P.231. 59. Fontenot, J.D., Gavin, M.A., Rudensky, A.Y. FOXP3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells // Nat.Immunol.2003.- V.4.- P.330–336. 60. Fontenot, J.D., Rasmussen, J.P., Williams, L.M., Dooley, J.L., Farr, A.G., Rudensky, A.Y.Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3// Immunity.- 2005.- V.22.- P.329–341. 61. Gambineri, E., Torgerson, T.R, Ochs, H.D. Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, and X linked inheritance (IPEX), a syndrome of systemic autoimmunity caused by mutations of FOXP3, a critical regulator of T cell homeostasis // Curr. Opin. Rheumatol.- 2003.- V.15.- P.430–435. 62. Gao, Q., Jiang, Y., Ma, T., Zhu, F., Gao, F., Zhang, P., Guo, C., Wang, Q., Wang, X., Ma, C., Zhang, Y., Chen, W., Zhang, L. A critical function of Th17 proinflammatory cells in the development of atherosclerotic plaque in mice// J Immunol.- 2010.- V.185.- P.5820–5827. 63. Gensini, G.G. A more meaningful scoring system for determining the severity of coronary heart disease// Am J Cardiol.- 1983.- V.51.- P.606. 64. George, J., Schwartzenberg, S., Medvedovsky, D., Jonas, M., Charach, G., Afek, A., Shamiss, A. Regulatory T cells and IL-10 levels are reduced in patients with vulnerable coronary plaques// Atherosclerosis.- 2012.- V.222(2).P.519-23. 65. George, J., Yacov, N., Breitbart, E., Bangio, L., Shaish, A., Gilburd, B., Shoenfeld, Y., Harats, D. Suppression of early atherosclerosis in LDL-receptor 116 deficient mice by oral tolerance with beta-2-glycoprotein I// Cardiovasc Res.2004.- V.62.- P.603–9. 66. Goldstein, J.L., Ho, Y.K., Basu, S.K., Brown, M.S. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition// Proc Natl Acad Sci USA.1979.- V.76.- P.333–337. 67. Gregori, S., Goudy, K.S., Roncarolo, M.G. The cellular and molecular mechanisms of immuno-suppression by human type 1 regulatory T cells// Front Immunol.- 2012.- V.29(3).- P.30. 68. Grossman, W.J., Verbsky, J.W., Tollefsen, B.L., Kemper, C., Atkinson, J.P., Ley, T.J. Differential expression of granzymes A and B in human cytotoxic lymphocyte subsets and T regulatory cells // Blood. - 2004. - V.104.- P.2840– 2848. 69. Han, S.F., Liu, P., Zhang, W., Bu, L., Shen, M., Li, H., Fan, Y.H., Cheng, K., Cheng, H.X., Li, C.X., Jia, G.L. The opposite-direction modulation of CD4+CD25+ Tregs and T helper 1 cells in acute coronary syndromes// Clin Immunol.- 2007.- V.124(1).- P.90-7. 70. Hansson, G.K., Jonasson, L. The discovery of cellular immunity in the atherosclerotic plaque// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2009.- V.29.- P.1714– 1717. 71. Hansson, G.K. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease// NEnglJMed.- 2005.- V.352.- P.1685–1695. 72. Henriksen, T., Mahoney, E.M., Steinberg, D. Enhanced macrophage degradation of low density lipoprotein previously incubated with cultured endothelial cells: recognition by receptors for acetylated low density lipoproteins// Proc Natl Acad Sci USA.- 1981.- V.78.- P.6499–6503. 73. Herbin, O., Ait-Oufella, H., Yu, W., Fredrikson, G.N., Aubier, B., Perez, N., Barateau, V., Nilsson, J., Tedgui, A., Mallat, Z. Regulatory T-Cell Response to Apolipoprotein B100–Derived Peptides Reduces the Development and Progression 117 of Atherosclerosis in Mice// Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology.2012.- V.32.- P.605-612. 74. Hermansson, A., Johansson, D.K., Ketelhuth, D.F., Andersson, J., Zhou, X., Hansson, G.K. Immunotherapy with tolerogenic apolipoprotein B-100-loaded dendritic cells attenuates atherosclerosis in hypercholesterolemic mice// Circulation.- 2011.- V.123(10).- P.1083-91. 75. Hevonoja, T., Pentikäinen, M.O., Hyvönen, M.T., Kovanen, P.T., AlaKorpela, M. Structure of low density lipoprotein (LDL) particles: basis for understanding molecular changes in modified LDL// Biochim Biophys Acta.2000.- V. 1488.- P.189–210. 76. Hilkens, C.M., Isaacs, J.D., Thomson, A.W. Development of dendritic cell-based immunotherapy for autoimmunity// Int Rev Immunol.- 2010.- V.29(2).P.156-83. 77. Hirota, K., Martin, B., Veldhoen, M. Development, regulation and functional capacities of Th17 cells // Semin Immunopathol.- 2010.- V.32(1).- P.316. 78. Hoeger, P.H., Niggemann, B., Ganschow, R., Dammann, C., Haeuser, G. Serum levels of sCD23 and sCD25 in children with asthma and in healthy controls// Allergy.- 1994.- V.49(4).- P.217-21. 79. Hong M, Wei W, Hu Y, Yang R, Yang Y. Plasma levels of the antiinflammatory cytokine IL-10 and inflammatory cytokine IL-6 in patients with unstable angina// J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci.- 2005.- V.25(6).P.639-41. 80. Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3// Science.- 2003.- V.299.- P.1057– 1061. 81. Hsu, H.C., Yang, P., Wang, J., Wu, Q., Myers, R., Chen, J., Yi, J., Guentert, T., Tousson, A., Stanus, A.L., Le, T.V., Lorenz, R.G., Xu, H., Kolls, J.K., Carter, R.H., Chaplin, D.D., Williams, R.W., Mountz, J.D. Interleukin 17- 118 producing T helper cells and interleukin 17 orchestrate autoreactive germinal center development in autoimmune BXD2 mice// Nat Immunol.- 2008.- V.9.- P.166-175. 82. Hu, Z., Li, D., Hu, Y., Yang, K. Changes of CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with acute coronary syndrome and the effects of atorvastatin// J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci.- 2007.- V.27(5).- P.524-7. 83. Itabe, H., Ueda, M. Measurement of plasma oxidized low-density lipoprotein and its clinical implications// J Atheroscler Thromb.- 2007.- V.14.- P.1– 11. 84. Janssens, W., Carlier, V., Wu, B., van der Elst, L., Jacquemin, M.G., Saint-Remy, J.M. CD4+CD25+ T cells lyse antigen presenting B cells by Fas–Fas ligand interaction in an epitope specific manner // J. Immunol.- 2003.- V.171.P.4604–4612. 85. Jia, L., Zhu, L., Wang, J.Z., Wang, X.J., Chen, J.Z., Song, L., Wu, Y.J., Sun, K., Yuan, Z.Y., Hui, R. Methylation of FOXP3 in regulatory T cells is related to the severity of coronary artery disease// Atherosclerosis.- 2013.- V.228.- P.34652. 86. Joetham, A., Takeda, K., Taube, C., Miyahara, N., Matsubara, S., Koya, T., Rha, Y.H., Dakhama, A., Gelfand, E.W. Naturally occurring lung CD4(+)CD25(+) T cell regulation of airway allergic responses depends on IL 10 induction of TGF beta // J Immunol.- 2007.- V.178.- P.1433–1442. 87. Jonasson, L., Holm, J., Skalli, O., Bondjers, G., Hansson, G.K. Regional accumulations of T cells, macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque // Arteriosclerosis.- 1986.- V.6.- P.131–138. 88. Ketelhuth, D.F., Hansson, G.K. Cellular immunity, low-density lipoprotein and atherosclerosis: break of tolerance in the artery wall// Thromb Haemost.- 2011.- V.106(5).- P.779-86. 89. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S.A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells // Nat. Immunol.- 2003.- V.4. - P.337– 342. 119 90. King, V.L., Szilvassy, S.J., Daugherty, A. Interleukin-4 deficiency decreases atherosclerotic lesion formation in a site-specific manner in female LDL receptor-/- mice // Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2002.- V.22.- P.456–461. 91. Kolls, J.K., Linden, A. Interleukin-17 family members and inflammation// Immunity.- 2004.- V.21.- P.467–76. 92. Komiyama, Y., Nakae, S., Matsuki, T., Nambu, A., Ishigame, H., Kakuta, S., Sudo, K., Iwakura, Y. IL-17 plays an important role in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis// J Immunol.- 2006.- V.177.P.566-573. 93. Konstantinov, I.E., Mejevoi, N., Anichkov, N.M. Nikolai N. Anichkov and his theory of atherosclerosis// Tex Heart Inst J.- 2006.- 33(4).- P.417-23. 94. Lakoski, S.G., Cushman, M., Criqui, M., Rundek, T., Blumenthal, R.S., D'Agostino, R.B. Jr., Herrington, D.M. Gender and C-reactive protein: data from the Multiethnic Study of Atherosclerosis (MESA) cohort// Am Heart J.- 2006.V.152(3).- P.593-8. 95. Lewkowicz, P., Lewkowicz, N., Sasiak, A., Tchórzewski, H. Lipopolysaccharide activated CD4+CD25+ T regulatory cells inhibit neutrophil function and promote their apoptosis and death // J. Immunol.- 2006. - V.177. P.7155–7163. 96. Li, L.F., Wang, H.Q., Liu, X.M., Ren, X.B. Epirubicin inhibits soluble CD25 secretion by Treg cells isolated from diffuse large B-cell lymphoma patients// Asian Pac J Cancer Prev.- 2013.- V. 14(3).- P.1721-4. 97. Li, Q., Wang, Y., Chen, K., Zhou, Q., Wei, W., Wang, Y., Wang, Y. The role of oxidized low-density lipoprotein in breaking peripheral Th17/Treg balance in patients with acute coronary syndrome// Biochem Biophys Res Commun.2010.- V. 9(394).- P.836-42. 98. Li, Q., Wang, Y., Wang, Y., Chen, K., Zhou, Q., Wei, W., Wang, Y. Treg/Th17 ratio acts as a novel indicator for acute coronary syndrome// Cell Biochem Biophys.- 2014.- V.70(2).- P.1489-98. 120 99. Li, Q., Wang, Y., Yu, F., Wang, Y.M., Zhang, C., Hu, C., Wu, Z., Xu, X., Hu, S. Peripheral Th17/Treg imbalance in patients with atherosclerotic cerebral infarction// Int J Clin Exp Pathol.- 2013.- V.15(6).- P.1015-27. 100. Li, Y.J., Zheng, D.D., Chen, J., Liang, Y.B., Kong, Q.Y., Xiong, Y., Tang, H., Li, X. Decrease in CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in patients with acute coronary syndrome// Zhongguo Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue.- 2008.V.20(12).- P.746-7. 101. Libby, P., Ridker, P.M., Maseri, A. Inflammation and atherosclerosis// Circulation.- 2002.- V.105(9).- P.1135-43. 102. Liu, W., Putnam, A.L., Xu Yu, Z., Szot, G.L., Lee, M.R., Zhu, S., Gottlieb, P.A., Kapranov, P., Gingeras, T.R., Fazekas de St Groth, B., Clayberger, C., Soper, D.M., Ziegler, S.F., Bluestone, J.A. CD127 expression inversely correlates with FOXP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells // J Exp Med.- 2006. –V.203. - P.1701–11. 103. Liu, Z., Lu, F., Pan, H., Zhao, Y., Wang, S., Sun, S., Li, J., Hu, X., Wang, L. Correlation of peripheral Th17 cells and Th17-associated cytokines to the severity of carotid artery plaque and its clinical implication// Atherosclerosis.2012.- V.221(1).- P.232-41. 104. Liu, Z.D., Wang, L., Lu, F.H., Pan, H., Zhao, Y.X., Wang, S.J., Sun, S.W., Li, C.L., Hu, X.L. Increased Th17 cell frequency concomitant with decreased Foxp3+ Treg cell frequency in the peripheral circulation of patients with carotid artery plaques// Inflamm Res.- 2012.- V.61(10).- P.1155-65. 105. Lubberts, E., Koenders, M.I., Oppers-Walgreen, B., van den Bersselaar, L., Coenen-de Roo, C.J., Joosten, L.A., van den Berg, W.B. Treatment with a neutralizing anti-murine interleukin-17 antibody after the onset of collagen-induced arthritis reduces joint inflammation, cartilage destruction, and bone erosion// Arthritis Rheum.- 2004.- V.50.- P.650-659. 106. Ma, H.L., Liang, S., Li, J., Napierata, L., Brown, T., Benoit, S., Senices, M., Gill, D., Dunussi-Joannopoulos, K., Collins, M., Nickerson-Nutter, C., Fouser, L.A., Young, D.A. IL-22 is required for Th17 cell-mediated pathology in a mouse 121 model of psoriasis-like skin inflammation// J Clin Invest.- 2008.- V.118.- P.597– 607. 107. Madhur, M.S., Funt, S.A., Li, L., Vinh, A., Chen, W., Lob, H.E., Iwakura, Y., Blinder, Y., Rahman, A., Quyyumi, A.A., Harrison, D.G. Role of interleukin 17 in inflammation, atherosclerosis, and vascular function in apolipoprotein e-deficient mice// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2011.- V.31.P.1565–1572. 108. Mallat, Z., Besnard, S., Duriez, M., Deleuze, V., Emmanuel, F., Bureau, M.F., Soubrier, F., Esposito, B., Duez, H., Fievet, C., Staels, B., Duverger, N., Scherman, D., Tedgui, A. Protective role of interleukin-10 in atherosclerosis. Circ Res 1999; 85: e17–24. 109. Maron, R., Sukhova, G., Faria, A.M., Hoffmann, E., Mach, F., Libby, P., Weiner, H.L. Mucosal administration of heat shock protein-65 decreases atherosclerosis and inflammation in aortic arch of low-density lipoprotein receptordeficient mice// Circulation.- 2002.- V.106.- P.1708–15. 110. Mayerl, C., Lukasser, M., Sedivy, R., Niederegger, H., Seiler, R., Wick, G. Atherosclerosis research from past to present--on the track of two pathologists with opposing views, Carl von Rokitansky and Rudolf Virchow// Virchows Arch.2006.- Jul;449(1).- P.96-103. 111. Meng, X., Zhang, K., Li, J., Dong, M., Yang, J., An, G., Qin, W., Gao, F., Zhang, C., Zhang, Y. Statins induce the accumulation of regulatory T cells in atherosclerotic plaque// Mol Med.- 2012.- V.18.- P.598-605. 112. Mills, K.H.G. Regulatory T cells: friend or foe in immunity to infection?// Nature Reviews Immunology.- 2004.- V.4.- P.841-855. 113. Mor, A., Planer, D., Luboshits, G., Afek, A., Metzger, S., Chajek-Shaul, T., Keren, G., George, J. Role of naturally occurring CD4+ CD25+ regulatory T cells in experimental atherosclerosis// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2007.V.27(4).- P.893-900. 122 114. Mor, A., Luboshits, G., Planer, D., Keren, G., George, J. Altered status of CD4(+)CD25(+) regulatory T cells in patients with acute coronary syndromes// Eur Heart J.- 2006.- V.27(21).- P.2530-7. 115. Mottet, C., Golshayan, D. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells: from basic research to potential therapeutic use // SWISS MED WKLY.- 2007.V.137.- P.625–634. 116. Mundkur, L., Mukhopadhyay, R., Samson, S., Varma, M., Kale, D., Chen, D., Shivaprasad, S., Sivanandan, H., Soman, V., Lu, X., Kakkar, V.V. Mucosal tolerance to a combination of АпоВ and HSP60 peptides controls plaque progression and stabilizes vulnerable plaque in АпоВ(tm2Sgy)Ldlr(tm1Her)/J mice// PLoS One.- 2013.- V.8(3).- P.e58364. 117. Nilsson, J., Wigren, M., Shah, P.K. Vaccines against atherosclerosis. // Expert Rev Vaccines. – 2013. – V.12, №3. – P.311-321. 118. Nilsson, J., Carvlin, M., Shah, P.K., Farina, J., Farina, C., Lahiri, A. Immunotherapies for cardiovascular disease. - 2015. - Режимдоступа: http://www.cardiovax.com/ 119. Oderup, C., Cederbom, L., Makowska, A., Cilio, C.M., Ivars, F. Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 dependent down modulation of costimulatory molecules on dendritic cells in CD4+ CD25+ regulatory T cell mediated suppression // Immunology.- 2006.- V.118.- P.240–249. 120. Palinski, W., Rosenfeld, M.E., Yla-Herttuala, S., Gurtner, G.C., Socher, S.S., Butler, S.W., Parthasarathy, S., Carew, T.E., Steinberg, D., Witztum, J.L. Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo// Proc Natl Acad Sci USA.- 1989.- V.86.- P.1372–1376. 121. Pedersen, A.E., Lauritsen, J.P. CD25 shedding by human natural occurring CD4+CD25+ regulatory T cells does not inhibit the action of IL-2// Scand J Immunol.- 2009.- V.70.- P.40–3. 122. Pinderski Oslund, L.J., Hedrick, C.C., Olvera, T., Hagenbaugh, A., Territo, M., Berliner, J.A., Fyfe, A.I. Interleukin-10 blocks atherosclerotic events in vitro and in vivo// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 1999.- V.19.- P.2847–2853. 123 123. Pokrovsky, S.N., Adamova, I.Yu., Afanasieva, O.Y., Benevolenskaya, G.F. Immunosorbent for selective removal of lipoprotein (a) from human plasma: in vitro study// Artif Organs.- 1991.- V.(2).- P.136-40. 124. Potekhina, A.V., Provatorov, S.I., Sokolov, V.O., Pylaeva, E.A., Masenko, V.P., Noeva, E.A., Krasnikova, T.L., Arefieva, T.I. CD4(+)CD25(high)CD127(low) regulatory T cells in patients with stable angina and their dynamics after intracoronary sirolimus-eluting stent implantation// Hum Immunol.- 2011.- V.72(7).- P.553-7. 125. Profumo, E., Buttari, B., Tosti, M.E., Tagliani, A., Capoano, R., D'Amati, G., Businaro, R., Salvati, B., Riganò, R. Plaque-infiltrating T lymphocytes in patients with carotid atherosclerosis: an insight into the cellular mechanisms associated to plaque destabilization// J Cardiovasc Surg (Torino).2013.- V.54(3).- P.349-57. 126. Ridker, P.M., Glynn, R., Everett, B.M., Pradhan, A., Solomon, D.H., Hasan, A.A.K., Zaharris, E., Cunniff, E., MacFaden, J., Clearfield, M.B., Gupta, M., Verma, S., Tsigoulis, M. The Cardiovascular Inflammation Reduction Trial (CIRT). - 2015. - Режим доступа: http://www.thecirt.org/ 127. Ridker, P.M., Libby, P., Glynn, R., Everett, B., MacFaden, J., Paynter, N., Zaharris, E., Cunniff, E., Cahill, C., Shapiro, I. Canakinumab Antiinflammatory Thrombosis Outcomes Study. - 2015. - Режим доступа: http://www.thecantos.org/cantos-summary.html 128. Robertson, A.K., Rudling, M., Zhou, X., Gorelik, L., Flavell, R.A., Hansson, G.K. Disruption of TGF-beta signaling in T cells accelerates atherosclerosis// J Clin Invest.- 2003.- V.112.- P.1342–1350. 129. Rodríguez-Perea, A.L., Montoya, C.J., Olek, S., Chougnet, C.A., Velilla, P.A. Statins increase the frequency of circulating CD4+ FOXP3+ regulatory T cells in healthy individuals// J Immunol Res.- 2015.- V.2015.P.762506. 130. Rokitansky, C. A manual of pathological anatomy// Blanchard and Lea, Philadelphia. 1855. 124 131. Roncarolo, M.G., Gregori, S., Lucarelli, B., Ciceri, F., Bacchetta, R. Clinical tolerance in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation// Immunol Rev.- 2011.- V.241.- P.145–63. 132. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic selftolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases// J Immunol.- 1995.- V.155.- P.1151–64. 133. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Shimizu, J., Yamazaki, S., Sakihama, T., Itoh, M., Kuniyasu, Y., Nomura, T., Toda, M., Takahashi, T. Immunologic tolerance maintained by CD25+ CD4+ regulatory T cells: their common role in controlling autoimmunity, tumor immunity, and transplantation tolerance// Immunol Rev.- 2001 .- V.182.- P.18-32. 134. Santagostino, A., Garbaccio, G., Pistorio, A., Bolis, V., Camisasca, G., Pagliaro, P., Girotto, M. An Italian national multicenter study for the definition of reference ranges for normal values of peripheral blood lymphocyte subsets in healthy adults// Haematologica.- 1999.- V.84(6).- P.499-504. 135. Sarris, M., Andersen, K.G., Randow, F., Mayr, L., Betz, A.G. Neuropilin 1 expression on regulatory T cells enhances their interactions with dendritic cells during antigen recognition // Immunity.- 2008.- V.28.- P.402– 413. 136. Schaffner, T., Taylor, K., Bartucci, E.J., Fischer-Dzoga, K., Beeson, J.H., Glagov, S., Wissler, R.W. Arterial foam cells with distinctive immunomorphologic and histochemical features of macrophages// Am J Pathol.1980.- V.100.- P.57–80. 137. Shevach, E.M., DiPaolo, R.A., Andersson, J., Zhao, D.M., Stephens, G.L., Thornton, A.M. The lifestyle of naturally occurring CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells// Immunol Rev.- 2006.- V.212.- P.60–73. 138. Shoenfeld, Y., Gerli, R., Doria, A., Matsuura, E., Cerinic, M.M., Ronda, N., Jara, L.J., Abu-Shakra, M., Meroni, P.L., Sherer, Y. Accelerated atherosclerosis in autoimmune rheumatic diseases. Circulation.-2005.- V.112.- P. 3337–3347. 125 139. Simon, A.D., Yazdani, S., Wang, W., Schwartz, A., Rabbani, L.E. Elevated plasma levels of interleukin-2 and soluble IL-2 receptor in ischemic heart disease// Clin Cardiol.- 2001.- V.24.- P.253–6. 140. Simon, T., Taleb, S., Danchin, N., Laurans, L., Rousseau, B., Cattan, S., Montely, J.M., Dubourg, O., Tedgui, A., Kotti, S., Mallat, Z. Circulating levels of interleukin-17 and cardiovascular outcomes in patients with acute myocardial infarction// Eur Heart J.- 2013.- V.34(8).- P.570-7. 141. Sokolov, V.O., Krasnikova, T.L., Prokofieva, L.V., Kukhtina, N.B., Arefieva, T.I. Expression of markers of regulatory CD4+CD25+foxp3+ cells in atherosclerotic plaques of human coronary arteries// Bull Exp Biol Med.- 2009.V.147(6).- P.726-9. 142. STABILITY Investigators. The Stabilization of Atherosclerotic Plaque by Initiation of Darapladib Therapy Trial (STABILITY). 2015.-Режимдоступа: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00799903 143. Stary, H.C. Natural history and histological classification of atherosclerotic lesions: an update// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2000.- V.20.P.1177–1178. 144. Stary, H.C., Blankenhorn, D.H., Chandler, A.B., Glagov, S., Insull, W. Jr., Richardson, M., Rosenfeld, M.E., Schaffer, S.A., Schwartz, C.J., Wagner, W.D. A definition of the intima of human arteries and of its atherosclerosis- prone regions: a report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association// Circulation. – 1992. – V.85.P.391–405. 145. Stary, H.C., Chandler, A.B., Dinsmore, R.E., Fuster, V., Glagov, S., Insull, W. Jr., Rosenfeld, M.E., Schwartz, C.J., Wagner, W.D., Wissler, R.W. A definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis: a report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association// Circulation.1995.- V.92.- P.1355–1374. 126 146. Stary, H.C., Chandler, A.B., Glagov, S., Guyton, J.R., Insull, W. Jr., Rosenfeld, M.E., Schaffer, S.A., Schwartz, C.J., Wagner, W.D., Wissler, R.W. A definition of initial, fatty streak, and intermediate lesions of atherosclerosis: a report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association// Circulation.- 1994.- V.89.- P.2462–2478. 147. Stein, J.H., Korcarz, C.E., Hurst, R.T., Lonn, E., Kendall, C.B., Mohler, E.R., et al; American Society of Echocardiography Carotid Intima-Media Thickness Task Force. Use of carotid ultrasound to identify subclinical vascular disease and evaluate cardiovascular disease risk: a consensus statement from the American Society of Echocardiography Carotid Intima-Media Thickness Task Force. Endorsed by the Society for Vascular Medicine// J Am Soc Echocardiogr.2008.- V.21(2).- P.93-111. 148. Steinbrecher, U.P., Parthasarathy, S., Leake, D.S., Witztum, J.L., Steinberg, D. Modification of low density lipoprotein by endothelial cells involves lipid peroxidation and degradation of low density lipoprotein phospholipids// Proc Natl Acad Sci USA.- 1984.- V.81.- P. 3883–3887. 149. Stemme, S., Faber, B., Holm, J., Wiklund, O., Witztum, J.L., Hansson, G.K. T lymphocytes from human atherosclerotic plaques recognize oxidized low density lipoprotein// Proc Natl Acad Sci U S A.- 1995.- V. 92(9).- P.3893-7. 150. Sugita, M., Peters, P.J., Brenner, M.B. Pathways for lipid antigen presentation by CD1 molecules: nowhere for intracellular pathogens to hide// Traffic.- 2000 .- V.1(4).- P.295-300. 151. Suvas, S., Kumaraguru, U., Pack, C.D., Lee, S., Rouse, B.T. CD4+CD25+ T cells regulate virus- specific primary and memory CD8+ T cell responses// J Exp Med.- 2003.- V.198.- P.889–901. 152. Taams, L.S., Akbar, A.N. Peripheral generation and function of CD4+CD25+ regulatory T cells // Curr. Top. Microbiol.Immunol.- 2005. - V.293.P.115–131. 153. Takaki, H., Ichiyama, K., Koga, K., Chinen, T., Takaesu, G., Sugiyama, Y., Kato, S., Yoshimura, A., Kobayashi, T. STAT6 Inhibits TGF-beta1-mediated 127 Foxp3 induction through direct binding to the Foxp3 promoter, which is reverted by retinoic acid receptor// J Biol Chem.- 2008.- V.283.- P.14955–62. 154. Taleb, S., Herbin, O., Ait-Oufella, H., Verreth, W., Gourdy, P., Barateau, V., Merval, R., Esposito, B., Clément, K., Holvoet, P., Tedgui, A., Mallat, Z. Defective leptin/leptin receptor signaling improves regulatory T cell immune response and protects mice from atherosclerosis// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2007 .- V.27(12).- P.2691-8. 155. Taleb, S., Romain, M., Ramkhelawon, B., Uyttenhove, C., Pasterkamp, G., Herbin, O., Esposito, B., Perez, N., Yasukawa, H., Van Snick, J., Yoshimura, A., Tedgui, A., Mallat, Z. Loss of SOCS3 expression in T cells reveals a regulatory role for interleukin-17 in atherosclerosis// J Exp Med.- 2009.- V.206.- P.2067– 2077. 156. Tang, T.T., Yuan, J., Zhu, Z.F., Zhang, W.C., Xiao, H., Xia, N., Yan, X.X., Nie, S.F., Liu, J., Zhou, S.F., Li, J.J., Yao, R., Liao, M.Y., Tu, X., Liao, Y.H., Cheng, X. Regulatory T cells ameliorate cardiac remodeling after myocardial infarction// Basic Res Cardiol.- 2012.- V.107(1).- P.232. 157. Task Force Members. 2013 ESC guidelines on the management of stable coronary artery disease: the Task Force on the management of stable coronary artery disease of the European Society of Cardiology// Eur Heart J.2013.- V.34(38).- P.2949-3003. 158. The Enzyme Linked Immunospot technique. Режимдоступа: http://www.biotechniques.com/multimedia/archive/00074/Abcam-FPElispot_74527a.pdf 159. Thornton, A.M., Shevach, E.M. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production // J Exp. Med.- 1998.- V.188.- P.287–296. 160. Thygesen, K., Alpert, J.S., Jaffe, A.S., Simoons, M.L., Chaitman, B.R., White, H.D., the Writing Group on behalf of the Joint ESC/ACCF/AHA/WHF Task Force for the Universal Definition of Myocardial Infarction. Third Universal Definition of Myocardial Infarction// Circulation.- 2012.- V.126.- P.2020-2035. 128 161. Tiemessen, M.M., Jagger, A.L., Evans, H.G., van Herwijnen, M.J., John, S., Taams, L.S. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells induce alternative activation of human monocytes/macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.2007.- V.104.- P.19446–19451. 162. Trinchieri, G. Interleukin-10 production by effector T cells: Th1 cells show self control// J Exp Med.- 2007 .- V.204(2).- P.239-43. 163. Uppal, S.S., Verma, S., Dhot, P.S. Normal values of CD4 and CD8 lymphocyte subsets in healthy indian adults and the effects of sex, age, ethnicity, and smoking// Cytometry B Clin Cytom.- 2003.- V.52(1).- P.32-6. 164. van Es, T., van Puijvelde, G.H., Ramos, O.H., Segers, F.M., Joosten, L.A., van den Berg, W.B., Michon, I.M., de Vos, P., van Berkel, T.J., Kuiper, J. Attenuated atherosclerosis upon IL-17R signaling disruption in LDLr deficient mice// Biochem Biophys Res Commun.- 2009.- V.388.- P.261–265. 165. van Puijvelde, G.H., Hauer, A.D., de Vos, P., van den Heuvel, R., van Herwijnen, M.J., van der Zee, R., van Eden, W., van Berkel, T.J., Kuiper, J. Induction of oral tolerance to oxidized low-density lipoprotein ameliorates atherosclerosis// Circulation.- 2006.- V.114.- P.1968–76. 166. van Puijvelde, G.H., van Es, T., van Wanrooij, E.J., Habets, K.L., de Vos, P., van der Zee, R., van Eden, W., van Berkel, T.J., Kuiper, J. Induction of oral tolerance to HSP60 or an HSP60-peptide activates T cell regulation and reduces atherosclerosis// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2007.- V.27(12).P.2677-83. 167. van Vré, E.A., Van Brussel, I., Bosmans, J.M., Vrints, C.J., Bult, H. Dendritic cells in human atherosclerosis: from circulation to atherosclerotic plaques// Mediators Inflamm.- 2011.- V.2011.- P.941396. 168. Vignali, D.A.A., Collison, L.W., Workman, C.J. How regulatory T cells work// Nat Rev Immunol.- 2008.- V.8(7).- P.523–53. 169. Virchow, R. Cellular pathology as based upon physiological and pathological histology (English translation of second German edition)// JB, Lippincott, Philadelphia.- 1975. 129 170. von Herrath, M.G., Harrison, L.C. Antigen-induced regulatory T cells in autoimmunity// Nat Rev Immunol.- 2003.- V.3.- P.223–32. 171. Waehre, T., Halvorsen, B., Damas, J.K., Yndestad, A., Brosstad, F., Gullestad, L., Kjekshus, J., Froland, S.S., Aukrust, P. Inflammatory imbalance between IL-10 and TNFalpha in unstable angina potential plaque stabilizing effects of IL-10// Eur J Clin Invest.- 2002.- V.32(11).- P.803-10. 172. Wang, H.Y., Gao, W.T., He, Q.H., Yang, C., Gu, W., Yan, J., Jiang, J.X. Endogenous glucocorticoid increases the basal level of Treg-Th17 balance under early phase of stress// Chin J Traumatol.- 2012.- V.15(6).- P.323-8. 173. Weng, K.P., Hsieh, K.S., Hwang, Y.T., Huang, S.H., Lai, T.J., Yuh, Y.S., Hou, Y.Y., Lin, C.C., Huang, S.C., Chang, C.K., Lin, M.W., Ger, L.P. IL-10 polymorphisms are associated with coronary artery lesions in acute stage of Kawasaki disease// Circ J.- 2010.- V.74(5).- P.983-9. 174. Wick, G., Grundtman, C. Inflammation and Atherosclerosis// Springer Wien New York.- 2012.- P.629. 175. Wigren, M., Björkbacka, H., Andersson, L., Ljungcrantz, I., Fredrikson, G.N., Persson, M., Bryngelsson, C., Hedblad, B., Nilsson, J. Low levels of circulating CD4+FoxP3+ T cells are associated with an increased risk for development of myocardial infarction but not for stroke// Arterioscler Thromb Vasc Biol.- 2012.- V.32(8).- P.2000-4. 176. Wigren, M., Kolbus, D., Dunér, P., Ljungcrantz, I., Söderberg, I., Björkbacka, H., Fredrikson, G.N., Nilsson, J. Evidence for a role of regulatory T cells in mediating the atheroprotective effect of apolipoprotein B peptide vaccine// J Intern Med.- 2011.- V.269.- P.546–56. 177. Wolf, A.M., Wolf, D., Steurer, M., Gastl, G., Gunsilius, E., GrubeckLoebenstein, B. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients // Clin. Cancer Res.- 2003. - V.9.- P.606–612. 178. WRITING GROUP MEMBERS, Lloyd-Jones, D., Adams, R.J., Brown, T.M., Carnethon, M., Dai, S., De Simone, G., Ferguson, T.B., Ford, E., Furie, K., Gillespie, C., Go, A., Greenlund, K., Haase, N., Hailpern, S., Ho, P.M., Howard, 130 V., Kissela, B., Kittner, S., Lackland, D., Lisabeth, L., Marelli, A., McDermott, M.M., Meigs, J., Mozaffarian, D., Mussolino, M., Nichol, G., Roger, V.L., Rosamond, W., Sacco, R., Sorlie, P., Roger, V.L., Thom, T., Wasserthiel-Smoller, S., Wong, N.D., Wylie-Rosett, J.; American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Heart disease and stroke statistics-2010 update: a report from the American Heart Association// Circulation.- 2010.V.121.- P.e46-e215. 179. Yla-Herttuala, S., Palinski, W., Rosenfeld, M.E., Parthasarathy, S., Carew, T.E., Butler, S., Witztum, J.L., Steinberg, D. Evidence for the presence of oxidatively modified low density lipoprotein in atherosclerotic lesions of rabbit and man// J Clin Invest.- 1989.- V.84.- P.1086–1095. 180. Zarek, P.E., Huang, C.T., Lutz, E.R., Kowalski, J., Horton, M.R., Linden, J., Drake, C.G., Powell, J.D. A2A receptor signaling promotes peripheral tolerance by inducing T cell anergy and the generation of adaptive regulatory T cells // Blood.- 2008.- V.111.- P.251–259. 181. Zelenay, S., Lopes Carvalho, T., Caramalho, I., Moraes Fontes, M.F., Rebelo, M., Demengeot, J. FOXP3+ CD25 CD4 T cells constitute a reservoir of committed regulatory cells that regain CD25 expression upon homeostatic expansion // Proc Natl Acad Sci U S A.- 2005.- V.102(11). - P.4091-6. 182. Zhao, Y.Q., Fu, Q., Li, Z.L., Yan, Q.N., Wu, H.C., Miao, F., Lu, Y.H., Liu, Y.F. Changes of CD4+CD28- T cell and CD4+CD25+ regulatory T cell subsets in patients with coronary heart disease// Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao.2007.- V.27(4).- P. 474-6. Абстракт. 183. Zhao, Z., Qi, Y.Z., Yuan, Z.Y., Cheng, M.L., Ji, Y.Q., Yang, X.B. Changes of Foxp3(+); regulatory T cells in patients with acute coronary syndrome// Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi.- 2011.- V.27(8).- P.893-5. Абстракт. 184. Zhao, Z., Wu, Y., Cheng, M., Ji, Y., Yang, X., Liu, P., Jia, S., Yuan, Z. Activation of Th17/Th1 and Th1, but not Th17, is associated with the acute cardiac event in patients with acute coronary syndrome// Atherosclerosis.- 2011.V.217(2).- P.518-24. 131 185. Zhou, X., Nicoletti, A., Elhage, R., Hansson, G.K. Transfer of CD4(+) T cells aggravates atherosclerosis in immunodeficient apolipoprotein E knockout mice// Circulation.- 2000.- V.102.- P.2919–2922. 186. Zhou, X., Robertson, A.K., Rudling, M., Parini, P., Hansson, G.K. Lesion development and response to immunization reveal a complex role for CD4 in atherosclerosis// Circ Res.- 2005.- V.96.- P. 427–434.
