Куджоян Л.С., Тер-Погосян З.Р., Мириманова Р.П

Куджоян Л.С., Тер-Погосян З.Р.,
Мириманова Р.П.
ХАРАКТЕР КЛЕТОЧНОГО И ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА У
БОЛЬНЫХ
С СИНДРОМОМ ПОЛИКИСТОЗНЫХ ЯИЧНИКОВ
Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) до сих пор остается одной из наиболее
актуальных проблем гинекологической эндокринологии, поскольку в последние годы
отмечается тенденция к его увеличению в структуре нарушений менструальной и
генеративной функций [3,4].
Несмотря на всестороннее изучение патогенеза СПКЯ многие механизмы требуют
дальнейшего разрешения. На исследование этой патологии направлены многочисленные
фундаментальные и клинические исследования. Тем не менее, до настоящего времени
научные работы, симпозиумы и конференции, посвященные этой проблеме начинаются со
слова „загадка”. СПКЯ, как правило, развивается на фоне гипоталамического синдрома
периода полового созревания (ГСППС) и/или нейроэндокринного синдрома (НЭС) [1,2,4].
Нейроэндокринная и иммунная системы находятся в тесном взаимодействии,
обеспечивая адаптационные возможности организма. Это взаимодействие обеспечивается тем,
что посредством специфических рецепторов медиаторы иммунной системы (цитокины),
факторы неспецифической резистентности оказывают влияние на нейроэндокринную
систему, а медиаторы последней регулируют активность и дифференцировку клеток
иммунной системы [5,6,7]. Нарушение функционирования гипоталамо-гипофизарной
системы, в частности, ее механизмов обратной связи, приводят к повышению уровня
кортизола, а это приводит к угнетению транскрипции генов соответствующих цитокинов
иммунной системы, угнетению иммунной системы, нарушению ее регуляторных воздействий
на функционирование гипоталамо-гипофизарно-гонадальной систем [2,9]. Фактически
возникает новое патологическое кольцо, которое, в свою очередь, связано с первым. Все
вышеуказанное и приводит к нарушению адаптационных возможностей организма и
фертильности [8,10]. Итак, в детерминации и развитии СПКЯ важную роль играют факторы
неспецифической резистентности.
Цель: изучение показателей клеточной и гуморальной иммунореактивности у больных
с СПКЯ.
Материал и методы: обследованию подверглись 17 женщин детородного возраста
(27±0,13 лет), обратившихся по поводу нарушения менструального цикла и бесплодия.
Верификация диагноза проводилась на основании клинико-лабораторных данных: ИМТ>26
(35,2%); наличие инсулинорезистентности по Caro>0,33 (58,8%); гирсутизма (70,5%);
высокого базального уровня ЛГ в крови (17,3±9,6 мМЕ/мл); индекса ЛГ/ФСГ >2,5 (82,3%);
высокие уровни тестостерона (в среднем 1,2±0,32 нг/мл) и характерных эхографических
критериев – увеличение обьема яичников за счет гиперэхогенной стромы и наличия
множества анэхогенных яичников (более 10), диаметрами 4-9 мм, расположенными по II типу
[4].
Основные показатели иммунореактивности изучались путем определения количества
лимфоцитов:
Т-лимфоцитов-CD3+,
Т-хелперов/индукторов-CD4+,
Тсупрессоров/цитотоксических клеток-CD8+, иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+,
числа В-лимфоцитов – CD19+, субпопуляции естественных клеток- киллеров CD56+, а также
определения уровней сывороточных иммуноглобулинов класса G, M, A. Все полученные
данные иммунологических показателей сравнивались с данными 15 здоровых женшин того же
возраста (группа контроля).
Результаты исследования обработаны методами вариационной статистики, принятыми в
медицине и биологии, с использованием t- критерия Стьюдента, критерия χ² Пирсона с
применением профессиональной версии программы SPSS for Windows. В работе приведены
среднеарифметические величины со среднеквадратичной (стандартной) ошибкой, M±m.
Методы исследования: выделение лимфоцитов периферической крови.
Венозную кровь забирали в пробирку «Vacutainer», содержащую 0,02% ЭДТА. 2 мл
крови разводили в два раза питательной средой RPMI 1640 и наслаивали по стенке пробирки
на 1,5 мл раствора градиента плотности фиколл-пак (Франция), или Lymphoprep (Дания).
После центрифугирования при 1500 об/мин в течение 40 мин. образовавшееся в интерфазе
кольцо клеток отделяли и промывали дважды средой RPMI 1640 с помощью
центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток ресуспендировали в
среде RPMI 1640 и подсчитывали в камере Горяева.
Разделение лимфоцитов периферической крови на субпопуляции. Использовались
намагниченные полистиреновые бусинки Dynabeads M-450 (“Dynal”, Норвегия), покрытые
мышиными моноклональными антителами Ig, специфичными к соответствующим (CD3+,
CD4+, CD8+, CD19+) мембранным антигенам лимфоцитов человека. Естественные клеткикиллеры (ЕКК) выделялись с помощью намагниченных частиц BioMag Anti-CD56+ (“Bioadvance”), ковалентно связанных с мышиными моноклональными антителами, распознающими
молекулы адгезии N-CAM, присутствующими на ЕKК.
Изоляция CD3+, CD4+, CD8+, CD19+ и CD56+клеток. Образцы крови или выделенные
в градиенте плотности МПК охлаждают при 2-8°С. К 1 мл разведенной в два раза крови
прибавляли 70 мкл Dynabeads CD3+, CD4+ или CD8+, либо 25 мкл Dynabeads СD19+ и
BioMag Anti-CD56+. В случае суспензии лимфоцитов к выделенным в градиенте плотности и
дважды отмытым лимфоцитам в концентрации 1х106 кл/мл в фосфатно-солевом буфере с 2%
эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) прибавляли по 14 мкл взвеси Dynabeads CD3+,
CD4+ или CD8+, либо 7 мкл Dynabeads СD19+ и BioMag Anti-CD56+ Инкубировали при 2-80С
30 мин. при постоянном помешивании, после чего помещали пробирки в магнитное поле на 23 мин, при этом к стенкам пробирки прикреплялись соответствующие клетки-мишени.
Супернатант удаляли, а изолированные клетки промывали в магнитном поле 3-4 раза
фосфатно-солевым буфером с 2% ЭТС и подсчитывали образовавшиеся розетки в световом
микроскопе в камере Горяева.
Сывороточные иммуноглобулины (IgG, IgM, IgA) определялись методом радиальной
иммунодиффузии по Манчини с помощью наборов фирмы «Orgenics».
Результаты собственных исследований: Усредненные данные о количестве
основных субпопуляций лимфоцитов представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Показатели клеточной иммунореактивности у больных СПКЯ и здоровых лиц
Изученные
Показатели
Лимфоциты %
кл/мкл
СD3+ %
Кл/мкл
CD4+ %
Кл/мкл
CD8+ %
Кл/мл
Индекс D4+/CD8+
CD20+ %
Кл/мл
СD 56+ %
кл/мл
Примечание
Больные СПКЯ
до лечения (n=17)
М±m
21,6±0,14
1511.6±42,5
44,3±0,56
620,9±18,2
24,7±0,36
348,6±12,1
19,4±0,27
299,2±6,4
1.29±0.05
10,4±0.19
197,1±4,9
9,3±0,15
143,3±5,2
Здоровые
женщины
(n=15) М±m
29.1±0.92*
1830,7±39,2*
53,1±0,67*
921,8 ± 34,1*
35,9±0,45*
583,6 ± 17,1*
18,7±0,67
327,1 ± 8,2
1.85±0,07*
14,1±0,28
221,8±4,6
11,5 ± 0,23*
164,4±3,2*
*разница
между
показателями
больных
здоровыми женщинами статистически достоверна.
СПКЯ
и
практически
Согласно полученным данным (таблицы 1 и 2), у больных СПКЯ, по сравнению со
здоровыми женщинами, основные изученные показатели клеточного иммунитета, как
относительные, так и абсолютные, были угнетены. У больных СПКЯ наиболее часто
выявлялось угнетение показателей CD3+ клеток - у 15 больных из 17 (%) уровень их был
ниже показателей контрольной группы. Высокая частота угнетения наблюдалась также по
уровню СД4+-клеток, что приводило к достоверному снижению иммунорегуляторного
соотношения. В целом, угнетение одновременно 3-х и более показателей в иммунограмме
наблюдалось у 70,6% больных и трактовалось как иммунодефицитное состояние (ИД). Для
определения частоты иммунодефицита по отдельным параметрам индивидуальные
иммунограммы каждой обследованной больной сопоставлялись с аналогичными показателями
в контрольной группе. Полученные результаты отражены в таблице 2 и рисунке 1.
Как видно из таблицы и рисунка, по уровню CD3+ и СД4+ отмечено наибольшее число
больных с ИД (соответственно, 88.2 и 70,6%). Умеренное подавление изучаемых показателей
обнаружено от 17,5 до 31,2% больных СПКЯ. Дефицит различной степени выраженности
таких звеньев иммунореактивности, как Т-лимфоциты и Т-хелперы, у больных СПКЯ
свидетельствует о нарушении функции клеточно-опосредованного иммунитета, что,
несомненно, нуждается в коррекции, тем более, что оба этих показателя являются тесно
взаимосвязанными и взаимозависимыми.
Таблица 2.
Частота угнетения изученных показателей иммунитета
у больных СПКЯ
Показатели
Лимфоциты
CD 3+
CD4+
CD 56+
СД19+
Норма
3
2
5
13
12
Ниже нормы
14
15
12
4
5
82.4
88.2
70.6
23.5
29.4
Частота ИД (%)
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Норма
Ниже нормы
Частота ИД (в %)
Лимфоциты
CD3+
CD4+
CD56+
CD19+
Рисунок 1.
Для изучения активности гуморального иммунитета у тех же больных нами
определялись уровни основных классов иммуноглобулинов G, M и A в сыворотках или плазме
периферической крови методом иммунодиффузии. Результаты представлены в таблице 3.
Из табл.3 следует, что у больных СПКЯ уровни IgG соответствовали норме,
концентрации IgM и IgА несколько превышали показатели нормы. Необходимо отметить, что,
поскольку в норме диапазон колебаний уровней иммуноглобулинов большой, для выявления
выраженных изменений целесообразно изучение более значительных групп обследованных.
Полученные данные показывают, что у обследованного контингента больных наблюдается
определенная напряженность гуморального иммунитета, выражающаяся в повышенных
уровнях IgM и IgA, что наряду с иммунодефицитом клеточного звена иммунитета
свидетельствует о нарушениях иммунной системы больных СПКЯ.
Таблица 3.
Уровень иммуноглобулинов в сыворотках крови больных СПКЯ
Сывороточ
ные Ig
IgG
IgM
IgА
Больные СПКЯ
(mg/dL)
1301.4±11.3
390.1±13.5
487.3±21.4
Здоровые
(mg/dL)
1457.2±12.1
157.6±9.8
170.2±7.6
N (mg/dL)
800-1800
60-370
90-450
Выводы: Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что у
больных СПКЯ имеется иммунодефицит большинства изученных клеточных показателей
неспецифического иммунитета и напряженность гуморального. Проведенные исследования
открывают перспективу дальнейших исследований с пересмотром рекомендуемых схем
коррекции нарушений у больных этой категории.
ЦЗ ДЗАО «Нор Арабкир»,
МЦ ЗАО «Канакер-Зейтун»,
иммунологическая лаборатория Онкологического
научного центра им. В.А. Фанарджяна МЗ РА,
отделение оперативной репродуктологии
АОЗТ «Институт хирургии Микаелян».
²Ù÷á÷áõÙ
ÎáõçáÛ³Ý È.ê., î»ñ-äáÕáëÛ³Ý ¼.è., ØÇñÇÙ³Ýáí³ è.ä.
´ç³ÛÇÝ ¨ ÑáõÙáñ³É ÇÙáõÝÇï»ïÇ μÝáõÛÃÁ åáÉÇÏÇëïá½³ÛÇÝ Óí³ñ³ÝÝ»ñÇ Ñ³Ù³Ëï³ÝÇßáí
ÑÇí³Ý¹Ý»ñÇ Ùáï
Òí³ñ³ÝÝ»ñÇ åáÉÇÏÇëïá½áí ï³é³åáÕ 17 ϳݳÝó Ùáï ѻﳽáïí»É »Ý μçç³ÛÇÝ ¨ ÑáõÙáñ³É
ÇÙáõÝá黳ÏïÇíáõÃÛ³Ý óáõó³ÝÇßÝ»ñÁ, Ù³ëݳíáñ³å»ë` Т- ÉÇÙýáóÇïÝ»ñ - CD3+, Т - Ñ»É÷»ñÝ»ñ CD4+, óÇïáïáùëÇÏ μçÇçÝ»ñ CD8+, CD4+/ CD8+ óáõó³ÝÇßÁ, CD19+, CD56+, ÇÝãå»ë ݳ¨ ßÇ×áõϳÛÇÝ
ÇÙáõÝá·ÉáμáõÉÇÝÝ»ñ G, M, A ¹³ëÇ:
ä³ñ½í»ó, áñ ÒäÐ ÑÇí³Ý¹Ý»ñÇ Ùáï ³éϳ ¿ÇÝ áã ëå»óÇýÇÏ ÇÙáõÝÇï»ïÇ Ñ»ï³½áïí³Í
óáõó³ÝÇßÝ»ñÇ Ù»Í³Ù³ëÇ ³Ýμ³í³ñ³ñáõÃÛáõÝ, ÇÝãÁ ëï»ÕÍáõÙ ¿ ÑÇÙù»ñ ³Û¹ ËÙμÇ ÑÇí³Ý¹Ý»ñÇ
μáõÅÙ³Ý Ï³ï³ñ»É³·áñÍÙ³Ý Ù»ç, ÏÇñ³é»Éáí ÇÙáõÝáϳñ·³íáñÇã μáõÅáõÙ:
Summary
Kujoyan L.S., Ter-Pogosyan Z.R., Myrymanova R.P.
Character of cellular and humoral of immunity of patients
with polycystic ovaries syndrome
Cellular and humoral factors of immunoreactivity was investigated among 17 women with
PCOS /T-lymphocytes (CD3+), inductor/helpers (CD4+), suppressors CD8+, combinability
CD4+/CD8+, CD19+ cells, CD56+ cells and serum immunoglobulins IgM, IgA, IgG.
Immunodeficiency of majority of their factors was detected among patients of PCOS, which
can serve as a basis for the elaboration of methods and programs of immunocorrection.
Литература
1.
2.
3.
4.
5.
Гусак Ю.К., Лазарева Ю.В., Морозов В.Н. Психонейроиммунологические особенности адаптативных механизмов
нормального репродуктивного цикла у женщин.-М- 2000.
Гилязутдинов И.А., Гилязутдинова З.Ш. Нейроэндокринная патология в гинекологии и акушерстве.-М., 2005 С.92-136, 280-310
Геворкян М.А., Манухин И.Б., Царькова М.А., Городецкая М.Д., Кухаркина О.Б. Эндокринно-метаболические
характеристики СПКЯ.// Мат. Научного форума “Мать и дитя”-М., 2000 -С.36.
Назаренко Т.А. Синдром поликистозных яичников.- М., 2005.
Amato G., Conte M., Mazziotti G., Lalli E., Vitolo G., Tucker A., Bellastella A., Carella C., Izzo A. Serum and follicular
fluid cytokines in polycystic ovary syndrome during stimulated cycles. // Am. College of obst. and gynecol.- 2003- vol.
101, N.6.- P.1177-1182.
6.
7.
Bukulmez O., Arici A. Leukocytes in ovarian function. Hum. Reprod. Update -2000; 6; 1-15.
Fenichel P., Gobert B., Carre Y., Barbarino-Monnier P., Hieronimus S. Polycystic ovary syndrome in autoimmune disease.
Lancet -1999- 353:2210.
8. Haller K., Mathieu Ch., Rull K., Matt K., Béné M.C., Uibo R. IgG, IgA and IgM Antibodies against FSH: Serological
Markers of Pathogenic Autoimmunity or of Normal Immunoregulation? // Amer. J. Reprod. Imm. – 2005 - 54 (5), 262–269.
9. Homburg R. Polycystic ovary syndrome.- London, Martin Dunitz Ltd, 2001.
10. Tarkun I., Cetinarslan B., Turemen E., Canturk Z., Biyikli M. Association between Circulating Tumor Necrosis FactorAlpha, Interleukin-6, and Insulin Resistance in Normal-Weight Women with Polycystic Ovary Syndrome. // Metabolic
Syndrome and Related Disorders - 2006, 4(2): 122-128.