Силаева Юлия Юрьевна ТРАНСГЕННЫЕ Т-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ ИММУННОМ ОТВЕТЕ Автореферат
advertisement
На правах рукописи Силаева Юлия Юрьевна ТРАНСГЕННЫЕ Т-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ В ПРОТИВООПУХОЛЕВОМ ИММУННОМ ОТВЕТЕ 14.01.12—Онколопм Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук 11 Москва — 2014 0055403«" шргщ Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Российской академии медицинских наук Директор — академик РАН и РАМН, профессор М. И. Давыдов Научный руководитель: Казанский Дмитрий Борисович доктор биологических н ^ ^ профессор Официальные оппоненты: Якубовская Раиса Ивановна доктор биологических наук, профессор, ФГУП «Московский научноисследовательский онкологический институт имени П. А. Герцена» МЗ РФ, руководитель отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии Купраш Дмитрий Владимирович доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгарта Российской Академии Н ^ заведующий лабораторией передачи внутриклеточных сигналов в норме и патологии Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение Гематологический н^'чный центр министерства Здравоохранения Российской Федерации Защита диссертации состоится « » 2014 г. в « часов на заседании ВУ«Р диссчтгационного совета Д001.017.02 ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. Адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) Автореферат разослан« ^ » Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор 2014 г. Барсуков Юрий Андреевич ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Одной из осуществление важньк. функций иммунологаческого )т1ичгожение иммуногенных системы приобретенного иммунитета является надзора, то есть своевременное распознание вариантов злокачественно трансформированных и клеток, возникающих в организме человека и животных. Основная роль в осуществлении иммунологического надзора принадлежит Т-лимфоцитам. Способность осуществлять иммунологический надзор прежде всего определяется широтой репертуара Т-лимфоцитов CD8* и специфичностью Т-клеточных рецепторов отдельных клонов. Кроме того, по всей видимости, способность к осуществлению иммунологического надзора может определяться функциональным состоянием Т-лимфоцита. Известно, что в организме одновременно присутствуют Т-лимфоциты, находящиеся в различных функционалышх состояниях. Наивные Т-клетки CDS"^ не активированы и могут циркулировать только через лимфоидные ткани. После активации наивные Т-клётки CD8^ превращаются в эффекгорные CTL, способные проникать в нелимфоидные ткани и убивать клетки-мищени, несущие специфический антиген. Большая часть эффекторных Т-лимфоцитов погибает во время фазы завершения иммунного ответа, но небольшая часть становится клетками памяти. Одной из основных особенностей клеток памяти является то, что, однажды образовавшись, они циркулируют в организме длительное время, ожидая встречи со специфическим антигеном. Вторичный иммунный ответ, определяемый клетками памяти, имеет ряд особенностей, отличающих его от первичного иммунного ответа: более быстрая активация и пролиферация клеток памяти, независимость вследствие клеток этого Цамяти от быстрая элиминация костимуляции. антигенов, Именно на сгаюсительная этих свойствах иммунологической памяти основаны все- методы вакцинации, известные на сегодняшний момент Тем не менее, не существует четких и однозначных критериев, по которым ту или иную популяцию Т-лимфоцитов можно отнести к клеткам памяти. Существуют два подхода к проблеме идентификации Т-клеток памяти: первый подход направлен на исследование функциональных особенностей Т-клеток памяти, второй подход основьшается на определении их специфических поверхностных маркеров. Идентификация пула Т-клеток памяти на основании экспрессии ряда поверхностных маркеров широко используется, но не всегда она коррелирует с функциональными характеристиками Т-клеток. Например, в условиях лимфопении наивные Т-лимфоциты приобретают поверхностный фенотип клеток памяти, что не всегда однозначно коррелирует с их функциональными 1 характеристиками. Более того, в условиях лимфопеши может формироваться популяция CD8^ Т-клеток с поверхностным фенотипом, характерным для клеток памяти, подавляющая противоопухолевый иммунный ответ. Таким образом, механизмы приобретения Т-клеткой того или иного поверхностного фенотипа и его взаимосвязь с функциональными характеристиками Т-лимфоцита остаются неясными. Между тем, исследование этих вопросов важно для верификации и определения границ применимости диагностических тестов, выявляющих клетки памяти методом проточной цитофлуориметрин в клинике, а также для создания новых методов иммунотерапии опухолей. Цель исследовапия Изучение взаимосвязи между поверхностным фенотипом популяции CD8^ Тлимфоцитов и их функциональными характеристиками. Задачи исследования 1. Изучить взаимосвязь акгивационного поверхностного фенотипа CD8^ Т-лимфоцитов и их функциональных особенностей в условиях лимфопении. 2. Получить первичных трансгенных животных, • Т-лимфоциты которых экснрессируют р-цепь Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, на генетической основе гибридной линии (СВАХ C57BL/6)Fi. 3. Получить чистые линии трансгенных животных на генетической основе линии B10.D2(R101) и гибридов F, (B10.D2(R101) X C57BL/10). 4. Оценить влияние экспрессии трансгенной р-цепи TCR на процессы развития Т-клеток в тимусе. 5. Охарактеризовать поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов трансгенных животных. 6. Оценить поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов трансгенных животных в условиях лимфопении. 7. Охарактеризовать функции Т-лимфоцитов трансгенных животных ш vitro и in vivo. Научная новизна исследования Взаимосвязь поверхностного активационного фенотипа с функциональными характеристиками популяций Т-лт!фоцитов в условиях лимфопении впервые исследована с помощью экспериментальной системы, позволяющей селективно вызвать иммунный ответ аллоспецифичных Т-клеток памяти. Впервые установлено, что появление функциональных свойств антигенспецифических клеток памяти возможно лшпь после первичного контакта с антигеном. Впервые получены и охарактеризованы линии трансгенных животных, Тлимфоциты которых экспрессируют Р-цепь Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти CD8*. Разработана новая модель иммунной селекции опухолевых клеток с использованием животных, трансгенных по р-цепи Т-клеточного рецептора. Теоретическая и практическая значимость работы Теоретическое значение работы состоит в обнаружении и детализации механизмов, управляющих формированием поверхностного акгивационного фенотипа Т-лимфоцитов. Показана особая важность разнообразия репертуара Т-лимфоцитов для эффективного развития реакций транснлантационного и противоопухолевого иммунитета. Получена принципиально новая модель иммунодефицита, который возникает вследствие генетического воздействия, ограничивающего разнообразие рецепторов Т-лимфоцитов. Практическое значение работы определяется тем, что она выявила неоднозначность оценки поверхностного фенотипа CD8^ Т-лимфоцитов как критерия принадлежности Т-клетки к популяции клеток памяти. Разработанная модель иммунной селекции опухолевых клеток может быть использована для скрининга и оценки биологической активности новых противоопухолевых препаратов и стимуляторов противоопухолевого иммунитета. Основные ноложения, выносимые на защиту 1. Для появления функциональных свойств антигенспецифических клеток памяти необходим первичный контакт с антигеном. 2. Получены и охарактеризованы две независимые линии мышей, трансгенных по рцепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 на генетической основе линии B10.D2(R101). 3. Экспрессия трансгена Р-цепи Т-клеточного рецептора изменяет баланс субпопуляций наивных и активированных Т-клеток в организме. 4. Т-лимфоциты CD8^ линии IDlbFF, экспрессирующие трансгенную р-цеш> Тклеточного рецептора, приобретают повермюстный фенотип активированных клеток в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением. 5. Уровень аллогенного иммунного ответа in vitro у мышей трансгенной линии IDlbFM заметно снижен по сравнению с мышами дикого типа. 6. Иммунный ответ Т-лимфощггов трансгенных животных in vivo недостаточен для эффективного отторжения аллогеннои опухоли* мыши линии IDlbFM на генетической основе В10.В2(К101) погибают через 40-60 дней после введения клеток тимомы ЕЬ-4. 7. Р1ммунный ответ лимфоцитов мышей трансгенной линии Ш1ЬРМ на генетической основе В10.В2(Я101) на клетки тимомы ЕЬ-4 вызывает потерю экспрессии молекулы К'' МНС I класса клетками тимомы. Апробация диссертации Апробация диссертации состоялась 10 октября 2013 года на объединенной конференции лаборатории механизмов регуляции иммунитета, лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток и лаборатории иммунологии гемопоэза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. Публикации по теме диссертации По теме диссертации опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 сообщений на российских и международных конференциях. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 161 странице машинописного текста, состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы содержит 175 источников, из которых 4 отечесгвенных и 171 иностранных. Работа иллюстрирована 50 рисунками и 4 таблицами. Материалы и методы исследования Животные. В работе были использованы линии мьпцей С57В176 (К''1-А"'П''), С57В1710 (КЧА''П''), В10.П2(Д101) ( К ^ Ь А ^ П " ) , РУВ (КЧ-АЧ-ЕЩ"), С57Виб-ТвК(АСТЬЕ0РР)108Ь (КЧ-А'О") (далее С57ВШ.ОРР) и B10.D2(R101)-TgN(ACTbEGFP)10sb (К^Х-А^О") (далее - В10.В2(К101).ОРР) разведения вивария Российского Онкологического Научного Центра РАМН, гибриды р1(СВА X С57В176) (питомник «Столбовая»). Мыши, трансгешше -цепи Т-клеточного рецептора гибpидo^ш клеток памяти Ш1 были получены и под держивались в лаборатории механизмов регуляции иммунитета ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. Клеточные линии. В работе были использованы клетки тимомы ЕЬ4 (К'О'") и мастоцитомы Р815(К''П0. Трансгенные животные были получены методом микроинъекции раствора Д Ж в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки. Наличие трансгена в геноме подгверждали методом ПЦР. Для оценки количества периферических Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансген, мононуклеары периферической крови трансгенных животных окрашивали моноклональными флуоресцентно мечеными антителами к вариабельному участку Р-цепи Тклеточного рецептора Vp6 и анализировали на проточном цитофлуоримегре. Для получения чистых линий трансгенных животных на генетической основе линии B10.D2(R101) бьшо проведено не менее 7 возвратных скрещиваний с мышами линии B10.D2(R101). Иммунизацию мышей проводили, вводя внутрибрюшинно каждому животному линии B10.D2(R101) 1 мл клеточной суспензии тимомы EL-4 (конентрация 2 х Ю'клегок/мл) или внутрибрюшинно каждому животному линии C57BL/6.GFP 1 мл клеточной суспензии мастоцитомы Р815 в PBS (концентрация 2 x 1 0 ' клеток/мл). Контрольной группе мышей вводили внутрибрюшинно 1мл 1х PBS (ПанЭко, Россия). Через 2 месяца после иммунизации спленоциты этих мьш1ей, облученных или интактных, использовали в экспериментах как источник долгоживущих клеток памяти. Иммунизацию мьппей трансгенной линии IDlbFM тимомой EL-4 проводшш также, как описано выше. Облучение мышей. Самок мьппей линий B10.D2(R101), C57BL/6 и IDlbFF, интакгных или предварительно иммунизированных как описано" вьппе, облучали в дозе 4,5 Gy при помощи терапевтического аппарата "Агат-Р" (Россия), содержащего источник гамма-излучения Со" с начальной мощностью 1,9x10" Бк. Адоптивный перенос. Интактных мъш1ей линии B10.D2(R101) или C57BL/6 облучали в дозе 4,5 Gy как описано выше, затем через 24 часа им вводили внутривенно спленоциты от интакгных или иммунных животных в количестве 1,5x10'. Через 10 дней спленоциты мышей-реципиентов использовали для окраски флуоресцентно мечеными антителами, а также в MLR в качестве отвечающих клеток. Оценка уровня аллогенного ответа in vitro. Способность Т-лимфоцитов трансгенных и облученных животных к аллогенному иммунному ответу in vitro оценивали в реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR). Оценка уровня противоонухолевого иммунного ответа in vivo. Через 12 дней после иммунизации вьщеляли клетки селезенки у интакгных и иммунизированных животных, окрашивали флуоресцентно мечеными антителами к корецепторам и поверхностным активационным маркерам и анализировали соотношение различных субпопуляций Т-клеток на проточном цитофлуоримегре. Цитотоксический тест. Клеточные суспензии, содержапще цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), и аллогенные клетвси-мишени, полученные в реакции бластфансформации, смешивали в соотношениях: 100:1, 50:1, 20:1 и 10:1. В качестве контроля CTL смешивали аналогично с сингенными клетками-мишенями. Клетки инкубировали 4 часа в полной ростовой среде при 37°С, 5% ССЬ и 100% влажности и затем анализировали содержание в суспензии живых GFP^ клеток методом проточной цитофлуориметрии. Окрашивание антителами и анализ на проточном цитофлуориметре. Окрашивание антителами проводили при 4°С в течение 30-50 мин. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре BD FACSCanto П (Becton Dickinson, USA) с использованием программы BD FACSDiva 6.0. Погибшие клетки исключали из анализа по окрашиванию Р1 (в ряде экспериментов - 7AAD ) и по показателям рассеивания. Анализировали не менее 100 тыс. событий для характеристики популяций Т-лимфоцитов в периферической крови трансгенных животных, не менее 1 млн. событий для характеристики популяций Т-лимфоцитов в тимусе и не менее 3 млн. событий для характеристики активационного поверхностного фенотипа популяций периферических Т-лимфоцитов. Для анализа результатов использовали программу FlowJo 7.6. Методы статистической обработки данных Статистическая обработка данных проводилась с использованием t-теста Стьюдента в программе Excel (Microsoft, USA). Различия признавались значимыми при р<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Функциональная активность Т-клеток памяти в условиях лнмфопении, вызванной сублетальным облучением Для исследования взаимосвязи поверхностного активационного фенотипа и функциональной активности CD8* Т-клеток мы сравнивали функциональные свойства спленоцитов двух групп сублегально облученных животных: в одну из групп входили неиммунизированные животные, а в другую — животные, иммунизированные клетками аллогенной опухоли за два месяца до облучения. Мы исследовали также функциональную активность спленоцитов сублетально облученных мышей, которым были адоптивно перенесены сингенные спленоциты от интактных или предварительно иммунизированных животных. В результате сублетального облучения большая часть CD8^ Т-лимфоцитов как интактных, 6 так и предварительно иммунизированных животных погибает, а оставшаяся часть приобретает поверхностный фенотип активированных Т-клеток. Способность спленоцитов осуществлять первичный и вторичный ответ in vitro оценивали в MLR с использованием сингенных (B10.D2(R101), аллогенных специфических (C57BL/6 (Н-г')) и аллогенных сторонних (FVB (Н-2'')) стимуляторов. Для оценки первичного иммунного ответа стимуляторы обрабатывали митомицином С, а вторичный иммунный ответ оценивали по способности Т-лимфоцитов отвечать на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку (прогревание в течение 1 часа при температуре 45° С). Способность Т-лимфоцитов селезенки отвечать на аллогенные стимуляторы, обработшшые митомицином С, сохраняется после сублетального облучения интактных и имму1П1ых животных. Однако, несмотря на практически одинаковое соотношение клеток с поверхностным фенотипом активированных и наивных Т-лимфоцитов в селезенке интактньк и иммунных животных, антигенспецифический ответ клеток памяти (способность отвечать на специфические стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку) имеет место только у предварительно иммунизированных животных (рис. 1). Для исследования функциональных свойств Т-клеток с поверхностным фенотипом клеток памяти, образовавшихся в процессе гомеостагической пролиферации, мы адоптивно перенесли сублетально облученным животным линии B10.D2(R101) сингенные клетки селезенки интактных и предварительно иммунизированных мьппей. Через 10 дней после адоптивного переноса мы оценивали способность спленоцитов этих мьппей отвечать в MLR на аллогенные стимуляторы, обработанные митомицином С, или подвергнутые острому тепловому шоку. Независимо от того, бьши адонтивно перенесены сингенные спленоциты интактных или предварительно иммунизированных животных, первичный и вторичный иммунный ответ in vitro практически отсутствует (рис. 2). Соотношение CD4* и CD8* Т-клеток в селезенке сублетально облученных мышей после адоптивного переноса не отличалось от такового у интакшых животных, поэтому отсутствие первичного иммунного ответа не может объясняться недостаточностью одной из популяций. При исследовании поверхностного активационного фенотипа Т-клеток донора и реципиента оказалось, что среди CDS" Т-клеток донора практтески все клетки приобрели поверхностный фенотип активированных Т-клеток (CD44*). Соотношение субпопуляций Тлимфоцитов CD8^ с различными профилями экспрессии активационных маркеров не изменялось вне зависимости от того, были предварительно иммунизированных животных. перенесены клетки интактных или Поскольку существуют данные о наличии киллерной активности у клеток с поверхностным фенотипом Т-клеток памяти, мы оценили цитотоксическую активность спленоцитов сублетально облученных мышей-реципиентов, которым были адоптивно перенесены клетки селезенки мышей-доноров (интакгных или предварительно иммунизированных) линии B10.D2(R101). В качестве контроля использовали спленоциты интакгных и иммунных мьппей линии B10.D2(R101). Оказалось, что в используемой нами экспериментальной системе спленоциты донора и реципиента специфической киллерной активностью не обладают. • RlOlMitC ИШ011°С HBLlOMitC B B L l O r e DFVBMhC D F V B e C Riol int Riol imm RlOl int rad Riol iimirad Рисунок 1. Аллогенный иммунный ответ клеток селезенки сублетально облученных животных in vitro. Пролиферация смешанной культуры лимфоцитов икгактных и иммунных мышей линии B10.D2(R101) через 10 дней после сублетального облучения в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомидином С (MitC) или подвегрнутые острому тепловому шоку ( f ) . В качестве отвечающей популяции были использованы интактные (R101 int) или иммунные (R101 imm) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101), а также интакгные (RIO int rad) или иммунные (RIO! imm rad) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101) через 3 и 10 дней после сублетального облучения. В качестве стимулирующей популяции бьши использованы спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (KW), обработанные митомицином С (R101 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (45'С в течение часа) (R101 t°C); спленоциты мышей линии C57BL/10 (K'D""), обработанные митомицином С (BL10 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (BL10 t°C); спленоциты мышей линии FVB (Н-2'), обработанные митомицином С (FVB MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (FVB t°C) Пролиферацию определяли через 72 часа по включению ^Н-тимидина, внесенного в культуру в последние 8 часов инкубации. Значимость отличия данных определяли с использованием t-теста Стьюдента (*р<0.05). На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. Использование двух разных экспериментальных моделей индукции Т-клеток с поверхностньпл фенотипом клеток памяти СВ44^ привело к получению различных результатов. Сублетальное облучение интактных животных приводит к увеличению доли Т- клеток с активационным феноташом, но эти клетки не обладают функциями клеток памяти. Таким образом, активационный фенотип, приобретаемый Т-лимфоцитами в условиях лимфопении, не коррелирует с функциональной антигенспецифических клеток памяти. Облучение активностью истинных иммунизированных животных не приводит к подавлению функциональной активности клеток памяти, что может объясняться их радиорезистентностью. Вместе с тем мы выяснили, что в результате адоптивного переноса спленоцитов интактных и иммунизированных животных сингенным сублетально облученным мышам формируется популяция CD8*CD44^ Т-лимфоцитов, которая не способна осуществлять аллогенный иммунный ответ in vitro. • Riol mite iSRlOlfC SBLIOmUC BBLIOfC OFVBmitC nFVEfC * I Riol int ^ Riol imm 1 RlOlradint adopt trans RlOl tad imm adopt trans Рисунок 2. Аллогенный иммунный ответ клеток селезенки сублетально облученных животных после адоптивного переноса. Пролиферация смешанной культуры спленоцитов сублетально облученных мышей линии B10.D2(R101) через 10 дней после того, как им были адоптино перенесены сингенные интактные или иммунные спленоциты, в ответ на различные стимуляторы, обработанные митомицином С (MitC) или подвегрнутые острому тепловому шоку ( f ) . В качестве отвечающей популяции были использованы интактные (R101 inf) или иммунные (R101 imm) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101), а также спленоциты сублетально облученных мышей, которым бьши адоптивно перенесены интактные (RIO rad int adopt trans) или иммунные (Rlül rad imm adopt trans) спленоциты мышей линии BL10.D2(R101). В качестве стимулирующей популяции были использованы спленоциты мышей линии B10.D2(R101) обработанные митомицином С (R101 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (45'С в течение часа) (R10I t°C); спленоциты мышей линии C57BL/10 (K'D''), обработанные митомицином С (BL10 MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (BL10 t°C); спленоциты мышей линии FVB (Н-2'), обработанные мшомицином С (FVB MitC) или подвергнутые острому тепловому шоку (FVB t°C) Пролиферацию определяли через 72 часа по включению 'Н-тимидина, внесенного в культуру в последние 8 часов инкубации. Значимость отличия данных определяли с использованием t-теста Стьюдента (•р<0.05). На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. Создание первичных трансгенов по Р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 и получение трансгенных линии IDlbFM и IDlbFF на генетической основе линии B10.D2(R101) При исследовании пролиферативного ответа Т-клеток памяти в состоянии лимфопении мы показали, что профиль экспрессии поверхностных активационжых маркеров не коррелирует не только с ответами клеток памяти, по и со способностью Т-лимфоцитов к аллогенному иммунному ответу in vitro. Мы предположили, что структура Т-клеточного рецептора является главным фактором, определяюицим судьбу и функциональные свойства индивидуального клона Т-лимфоцитов. Для проверки этой гипотезы были получены два первичных трансгена по р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1. Наличие трансгена в геноме бьшо подтверждено методом ПЦР. Наличие в организме трансгенных животных подтверждено с Т-лимфоцитов, экспрессирующих помопц>ю окрашивания трансгенную MOHOH>raeapoB (3-цепь, бьшо периферической крови моноклональными флуоресцентно мечеными антителами к семейству Vp6 вариабельного сегмента Р-цепи TCR (рис. 3). 1D1btg №1 C57BU10 I F l 2 F 1 3F1 1 2 spl l O l b I F l 2 F 1 3F1 1 2 spl X D l b 1D1btg №2 V(36 ^ЯЯЕВА ^^ Рисунок 3. Получение первичных трансгенов по р-цепи Т-клеточного рецептора габридомы клеток памяти Ш1. а — Анализ ПЦР-продукга ДНК мышей, рожденных после микроинъекции полноразмерной кДНК р-цепи Тклеточного рецептора гибридомы 101, клонированной в экспрессионный вектор ЬС02, и мышей первого поколения р1 трансгенной линии 1В1ЬРМ. Рг — праймеры к гену С Ш ; Рг tg - праймеры к гену Р-цепи Тклеточного рецептора гибридомы Ш1; 1Р1, 2Р1, ЗЕ1 - ДНК-матрица мьппей поколения К, трансгенной линии Ш1ЬРМ №1, №2 и №3, соответственно; 1,2 — ДНК-матрица первичных трансгенов Ш Ш №1 и №2; 8р1 - ДНКматрица мыши линии С57ВЬ/6 (негативный контроль); 1В1Ь — ДНК-матрица экспрессионного вектора Ь-Си2, содержащего полноразмерную кДНК р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы Ш 1 (позитивный контроль), б — Цитофлуориметрический анализ количества СВЗ"*" лимфоцитов (верхняя панель) и экспрессии р-цепи Тклеточного рецептора гибридомы клеток памяти Ш 1 (нижняя панель) в периферической крови первичных трансгенов Ш1Ь. С57ВЬ/10 — клетки периферической крови мыши линии СЗТВЬ/Ю; 1В1Ь — клетки периферической крови первичного трансгена Ш1Ь № 1; 1В1Ь 18№2 — клетки периферической крови 10 первичного трансгена l D l b № 2 . Рисунок 4. Экспрессия трансгенной р-цепи TCR СВЗ"^ лимфоцитами мышей трансгенной линии IDlbFM поколения F? и Fs. Относительное количество CD3^ лимфоцитов (а) и экспрессия Р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памягти Ш1 (б) в периферической крови трансгенов IDlbFM поколений F2, F, и F«. R101 — клетки периферической крови мыши линии B10.D2(R101) (п=7); IDlbFM F2 — клетки периферической крови трансгена 1D1FM Fz (п=6); IDlbFM F7-F8 — клетки периферической крови трансгенных мьппей IDlbFM F, и F. (ii=25). ^ 50 45 40 5 35 ^ 30 f 25 СО S 20 g 15 I 10 5 Оба О использованы 1D1bFMF2 1D1bFMF7-F8 первичных трансгена качестве бьши основателей линии: сублиния IDlb, ведущая начало от первичного 90 в трансгена №1 получила название IDlbFM, сублиния, основателем 80 5- которой стал первичный трансген №2 - I 60 I 50 IDlbFF. f Для 40- получения чистых линий трансгенных животных на генетической СО 8 30 S 20 основе линии B10/D2(R101) мы провели I 10 не менее 7 возвратных скрещиваний с мьппами этой линии. В каждом поколении 1D1bFMF2 1D1bFMF7-F8 выявляли животных, максимальное количество у которых лимфощ1тов экспрессирует трансген Р-цепи TCR. В поколении Fj мьппей обеих трансгенных линий 7080% периферических Т-лимфоцитов экспрессируют трансгенную Р-цепь; общее количество СОЗ'^ клеток в периферической крови мьппей обеих трансгенных линий не изменено по сравнению с контролем (рис. 4). Мы не обнаружили изменений клегочности лимфоидных органов у трансгенных животных линий IDlbFM и IDlbFF по сравнению с животными дикого типа. Продолжительность жизни животньк обеих трансгенных линий не отличается от продолжительности жизни мьппей дикого типа. Таким образом, мы получили две независимые сублшши мьппей, трансгенных по Рцепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, на генетической основе линии B10.D2(R101): IDlbFM и IDlbFF Обе тканеспецифической экспрессией трансгена. 11 линии характеризуются стабильной Развитие и поддержание гомеостаза CD3^ лимфоцитов мышей трансгенных линий IDlbFM и IDlbFF Экспрессия трансгенных а- и Р-цепей TCR может влиять на прохождение Т-клеткой внутритимусной селекции и, соответственно, на периферический репертуар Т-клеток. В нашем исследовании прежде всего необходимо бьшо оценить, , вызьшает ли экспрессия трансгенной р-цепи TCR клеток памяти какие-либо нарушения в онтогенезе CD3^ Тлимфопитов; существует ли предпочтительная линия дифференцировки (CD4^ или CD8*) трансгенных клеток; сопровождается ли экспрессия р-трансгена изменением соотношения популяций CD4'^ и CD8^ Т-лимфоцитов в периферических лимфоидных органах; изменяется ли поверхностный активационный фенотип Т-клеток под влиянием экспрессии Р-цепи Тклеточного рецептора гибридомы клеток памяти. Все эксперименты были проведены на двух независимых трансгенных сублиниях (IDlbFM и IDlbFF) для исключения возможных сторонних эффектов трансгенеза на процессы онтогенеза Т-клеток. Поверхностный фенотип тимоцитов мышей трансгенных линий IDlbFM и IDlbFF. В тимусе мышей трансгенных линии IDlbFM и IDlbFF соотношение двойных негативных CD4-CD8- (DN), двойных позитивных CD4^CD8^ (DP) и однопозитивных CD4XD8- и CD4 ~CD8^ (SP) тимоцитов не изменено по сравнению с мьппами линии B10.D2(R101). Соотношение CD4^ и CD8^ тимоцитов у трансгенных животных не нарушено, что означает отсутствие предпочтительной линии дифференцировки трансгенных клеток. Появление трансгенной Р-цепи на поверхности тимоцитов коррелирует со стадиями их созревания. Среди двойных негативных тимоцитов практически нет клеток, окрашиваюпщхся антителами к Vp6. На стадии DP доля клеток, несущих трансгенную Р-цепь, значительно возрастает Большая часть однопозитивных CD4^ и CD8^ тимоцитов экспрессирует трансген Р-цепи и несет на поверхности его продукт, что, по-видимому, связано с тем, что эспрессия трансгенной Р-цепи TCR подавляет реаранжировку эндогенных цепей. Кроме того, экспрессия трансгенной Р-цепи TCR в значительной степени подавляет реаранжировку цепей, входящих в состав TCRy/5. Тем не менее, около 20% Т-клеток успевают реаранжировать собственную эндогенную р-цепь и не экспрессируют трансген. Поверхностный фенотип периферических CD3^ Т-клеток мышей трансгенных линий IDlbFM и IDlbFF. Соотношение субпопуляций спленоцитов CD4"^ и CD8^ не изменено у животных трансгенных линий IDlbFM и IDlbFF по сравнению с животными дикого типа (рис. 5, а). Трансген экспрессируют обе субпопуляции CD3'^ спленоцитов (рис. 5, б, в). Таким образом, CD4* и CDS^ клетки, экспрессирующие трансген Р-цепи Т-рецептора гибридомы клеток памяти 1D1, не только проходят тимусную селекцию, но и успешно рециркуштруют на 12 периферии. IDlbFF Рисунок 5. Поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии IDlbFF. а — цитофлуориметрический анализ экспрессии молекул CD4 и CD8 одиночными живыми кпетаами селезенки мышей трансгенной линии IDlbFF на генетической основе линии B10.D2(R101). 6, в — цитофлуориметрический анализ экспрессии трансгенной р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти 1D1 CD4'^ (б) и CD8* (в) спленоцитами мышей трансгенной линии IDlbFF на генетической основе линии B10.D2(R101). B10.D2(R101)— спленоциты линии B10.D2(R101); I D l b F F — спленоциты мыши трансгенной линии IDlbFF поколения F?; Исследуемая Р-цепь TCR происходит из Т-клеточного рецептора гибридомы клеток памяти. Мы решили оценить, влияет клеток ли экспрессия памяти активационный периферических на р-цепи TCR поверхностньШ фенотип Т-лимфоцитов. Мы решили сравнить долю активированных Т-клеток в субпопуляциях спленоцитов, экспрессирующих эндогенные цепи TCR (Vp6^) и трансген (Урб"^) (рис. 6). У мьппей линии B10.D2(R101) дикого типа процентное содержание CD44^ клеток в субпопуляцшк Vp6~ и Vp6^ практически одинаково (рис. 6, а, б). У мьппей трансгенной линии IDlbFM в субпопуляции Урб'" преобладают Т-клетки с фенотипом CD44^, а в субпопуляции Урб"" — Т-лимфоциты с фенотипом наивных Т-клеток CD44~. (рис. 6, в, г). Таким образом, соотношение Т-лимфоцитов с фенотипом наивных и активированных Тклеток в субпопуляциях урб^ и Урб" у мьппей линиии IDlbFM существенно нарушено по сравнению с животными дикого типа. Наблюдаемый феномен не является особенностью Тклеток селезенки, эти же закономерности наблюдаются у Т-лимфоцитов в других периферических лимфоидных органах.Чтобы исключить влияния сторонних эффектов трансгенеза на активационный фенотип трансгенных периферических CD3^ лимфоцитов мы 13 сравнили поверхностный акгшвационный фенотип спленоцитов мьппей трансгенной линии Ш1ЬРМ с поверхностным фенотипом спленоцитов трансгенной линии Ш1ЬРР. Мыши обеих линий несут в геноме один и тот же трансген, однако между ними могут существовать различия, обусловленные разным количеством копий трансгена и различными местами интеграции трансгена в геном. Оказалось, что в популяциях периферических Т-лимфоцитов мьппей трансгенной линии Ш1ЬРР доля клеток с поверхносшым фенотипом СВ44" заметно снижена в популяции клеток СПЗ^Урб^ и сильно увеличена в популяции СВЗ^Урб". vpe- B10.D2(R-101) Рисунок 6. Поверхностный активационный фенотип Т-лимфоцитов с трансгенной и эндогенными р-цепями тса. Процентное содержание Т-лимфоцитов с активационньш фенотипом (СВ44^) в субпопуляциях со8"урбст*урби С04*УР6" спленоцитов мышей линии I D l b F M (IDlbFM, в, г) на генетической основе линии B10.D2(R101) по сравнению с линией B10.D2(R10I) (B10.D2CR101), а, б). _ Vp6 — процентное содержание CD44* лимфоцитов в субпопудяиии CD8"^VP6~ и С т Л ' Р б " ; Vp6^ — процентное содержание CD44* лимфоцитов в субпопужщии CD8*Vp6^ и С04Л'рб^; а, в — процентное содержание CD44* лимфоцитов в субпопуляции CD8*; б, г — процентное содержание CD44* лимфощпов в субпопулядаи CD4*; проанализировано б контрольных животных и 8 трансгенных животных; данные получены в трех независимых экспериментах). I Это означает, что увеличение доли клеток с поверхностным фенотипом наивных Т- лимфоцитов популяции СВЗ'Урб"^ не в является следствием сторонних эффектов трансгенеза и может объясняться только влиянием экспрессии трансгенной (З-цепи Тклеточного рецептора гибридомы Ш1. CD44 Т-лимфоциты мышей трансгенной линии в условиях лимфонении Хорошо известно, что сигнал, необходимый для выживания и поддержания гомеостаза. 14 периферические Т-лимфоциты получают, взаимодействуя со «своими» комплексами МНС/пептид. У животных трансгенных линий Ш1ЬРМ и Ш1ЬРР происходит уменьшение репертуара Т-клеточных рецепторов из-за экспрессии «инвариантной» Р-цепи, что, очевидно, должно приводить к сужению спектра комплексов МНС/пептид, с которыми могут взаимодействовать трансгенные Т-клетки. Таким образом, следовало ожидать, что у трансгенных животных индивидуальные клоны Т-лимфоцитов с трансгенной Р-цепью конкурируют за ограниченное количество комплексов МНС/пептид, необходимых для их выживания на периферии. Мы предположихш, что «наивный» фенотип Т-лимфоцитов с трансгенной цепью формируется именно из-за нехватки сигналов, получаемых Т-клеткой при взаимодействии с эндогенными комплексами МНС/пептид. Для проверки этой гипотезы мы решили снизить конкуренцию Т-клеток с трансгенной Р-цепью в организме животных линии Ш1ЬРР. Мы подвергли мьппей сублетальному облучению, таким образом значительно уменьшив количество Т-лимфоцитов в периферических лимфоидньк органах. Оказалось, что в условиях лимфопении большая часть Т-клеток с трансгенной р-цепью приобретает поверхностный фенотип СВ44"^ (рис. 7, б). Инта1стные 1D1bFF Рисунок 7. Поверхностный активавдонный фенотип периферических Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии IDlbFF через 3 дня после сублетального облучения. Коэкспрессия поверхностных маркеров CD44 и CD62L CD8* Т-клетками селезенки интактных (а) и облученных (б) мышей линии IDlbFF по сравнению с животными линии B10.D2(R101). Цитофлуориметрический анализ проведен через 3 дня после сублетального облучения животных. Проанализировано 3 контрольных и 3 трансгенных животных. 15 Таким образом, поверхностный фенотип наивных Т-клеток, характерный для трансгенных Т-лимфоцитов не является неизменным и способен меняться в зависимости от условий, в которьк оказалась Т-клетка. По всей видимости, сигналом для изменения поверхностного фенотипа служит снижение конкуренции за эндогенные комплексы МНС/пептид между различными клонами Т-клеток, несупщх трансгенную р-цепь TCR. Первичный аллогенный ответ Т-лимфоцитов мышей трансгенной линии IDlbFM in vitro При исследовании функциональных свойств CDS'" Т-клеток трансгенных животных необходимо прежде всего определить, способны ли Т-клетки, экспрессирующие трансгенную р-цепь, к полноценному иммунному ответу и «наследуют» ли они специфичность исходного гетеродимера TCR а/р. Т-клеточиый рецептор гибридомы 1D1, из которой бьша клонирована исследуемая р-цепь, специфичен к молекуле МНС I класса Н-гК'. Мы решили исследовать пролиферативный ответ in vitro спленоцитов мьппей трансгенной линии IDlbFM на сплен01щты линий C57BL/10 (K'T-A'D''', обработанные цитостатиком митомицином С (рис. 8). 35000,0 i 30000,0 25000,0 20000,0 • R101 15000,0 ВIDlbFM 10000,0 5000,0 ; 0,0 R101 1D1bFM BL10 FVB Стимуляторы Рисунок 8. Пролиферация смешанной культуры лимфошггов мышей линии IDlbFM в отвегг на различные стимуляторы, обработанные митомицином С. В качестве отвечающей популяции использованы спленоциты мышей линии IDlbFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (IDlbFM) и спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (R101). В качестве стимулирующей популяции использовали спленоциты мышей линии B10.D2(R101) (R101); IDlbFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (IDlbFM); C57BL/10 (BLIO); FVB (FVB), Пролиферацию определяли через 72 часа по включению 'Н-тимидина, внесенного в кулыуфу в последние 8 часов ишкубации. На рисунке представлены репрезентативные данные одного эксперимента из трех. 16 Оказалось, что первичный иммунный ответ спленоцитов трансгенных животных на спленоциты линии C57BL/10 снижен по сравнению с мышами дикого типа. Более того, ответ на сторонние аллогенные стимуляторы FVB (КЧ-АЧ-Е'О'') также заметно снижен по сравнению с мьппами дикого типа. Таким образом, стало ясно, что трансгенные Т-лимфоциты, экспрессирующие ß-цепь Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1, во-первых, не сохраняют специфичность исходного гетеродимера TCR a/ß, и, во-вторых, их способность отвечать на аллоантигены снижена. Иммунный ответ Т-лимфоцитов мышей линии IDlbFM на клетки аллогенной опухоли in vivo B10.D2(R101) CD62L А а Интактные +EL-4 Мьппам линии IDlbFM на генетической основе линии B10.D2(R101) (K'^I-A^I-EW) вводили внутрибрюшинно 20 млн. клеток тимомы EL-4 (KW). Через 12 дней выделяли Q О клетки селезенки интакгных и предварительно иммунизированных мьппей и Naive 27,4% Се Tíral memory оценивали относительное количество 19 0% активированных CDS"^ Т-лимфоцитов. При иммунном ответе на клетки аллогенной §Ü . CL)62L-C044- ¿ EITectorS . 3,19% ••: Я 156,% CD62L-CD44- ^^ffectora ^51.1% 2.45% Cwnp-tf о*: ecxt Сотв-АРС-к С&>< CD44 опухоли у трансгенных животных, так же, как и у мьппей дикого типа увеличивается относительное количество CD8^ Т- IDlbFM лимфоцитов. Однако доля клеток-эффекторов Naive 7,21% С:i»fitraí memory (CD44^CD62L-) среди CD8* Т-лимфоцитов с 1i,8% трансгенной р-цепью TCR у животных линии IDlbFM бьша значительно меньше, чем C062L-CD44T-Í^EfTectors 3.95% Natva 56.7% C«n(r«l memory 303% типа (рис. 9, а, г). Рисунок 9. Относительное количество клетокэффекторов в иммунном ответе мышей линии IDlbFM на клетки аллогенной опухоли in vivo. Цитофлуориметрический анализ коэкспрессии маркеров CD44 и CD62L CD8^ Т-клетками селезенки интактных (левая naHejn>) и предварительно Iсо Q ü среди Т-лимфоцитов CD8"" мьппей дикого CD82L-C044- ^^ETfadofs 5.32% CD44 иммунизированных (правая панель) животных линии IDlbFM (в, г) по qjaBHeHHre с животными дикого типа (а, 6). а, в — Т-лимфоциты, экспрессирующие эндогенные Р-цепи TCR (CD8*Vp6-); б — Т-лимфоциты, экспрессирующие ^ ц е п ь семейства VP6 (CD8*Vp6^); г — Т-лимфоциты, экспрессирующие трансгенную Рцепь TCR (CD8*Vp6''). Проанализировано 6 контрольных и 6 трансгенных животных. Кроме того, у трансгенных животных практически не изменялась доля активированных клеток среди Т-лимфоцитов CD8^, экспрессирующих эндогенные |3-цепи Т-клеточного рецептора (CD8^VP6~). Таким образом, пул клеток-эффекторов, формируюпшйся в организме трансгенных животных в процессе иммунного ответа на клетки тимомы EL-4, значительно меньше, чем у животных дикого типа. Продолжительность жизни трансгенных мышей линии IDlbFM, иммунизированных аллогенной опухолью Пул эффекторных Т-клеток, формируюпдайся в процессе иммунного ответа на клетки тимомы EL-4, у трансгенных животных значительно сокращен по сравнению с животными дикого типа. Остается неясным, достаточен ли его размер для эффективного отторжения клеток тимомы. Для исследования этого вопроса мьппам трансгенной линии IDlbFM (Ш-К") вводили внутрибрюшинно 20 млн. клеток тимомы EL-4 (Н2-К''). В качестве контроля использовали мьшюй линии B10.D2(R101) дикого типа (Ш-К"), которых также иммунизировали тимомой EL-4. В ходе эксперимента оценивали продолжительность жизни трансгенньк животньк, иммунизированньк тимомой EL-4 по сравнению с мьппами дикого типа. 120 - ^ 100 щ" f 80 S I 60 i i I со - —- - - - - ^ ^ 4-, ^ ^ . 40 \ 20 • 1 3 5 7 9 ; \ 1113151719212325272931333637394143454749515355675961636567697173757779 Время, ДНИ 1D1bFM+EL^ (п=9) B10.D2(R101)+EL^ (п=9) Рисунок 10. Продолжительность жизни мьпией трансгенной линии I D l b F M после иммунизации клетками тимомы EL-4. lDlbFM+EL-4 — B10.D2(R101)+EL-4 мыши трансгенной линии — мыши линии IDlbFM, B10.D2CR101), Проанализировано 9 опытных и 9 контрольных животных, 18 иммунизированнью иммунизированные клетками тимомы клетками тимомы EL-4; EL-4. Оказалось, что 90% трансгенных животных, иммунизированных тимомой EL-4, погибает в течение 80 дней после введения тимомы (рис. 10), причем пик гибели приходится на 40-60 дни после введения аллогенной опухоли. Гибели мьппей дикого типа после иммунизации тимомой EL-4 зафиксировано не было. Селекция опухолевызс клеток в организме трансгенньн животных Различия в главных трансплантационных антигенах мышей линии B10.D2(R101) и клеток тимомы EL-4 сводятся к различиям продуктов, кодируемых локусом К — клетки тимомы EL-4 экспрессируют молекулу МНС I класса И-2К}', а клетки организма мьппей линии IDlbFM - молекулу Н-2К''. Этого достаточно для развития полноценного иммунного ответа, отторжения опухоли и формирования пула долгоживущих клеток памяти. Мьшш трансгенной лшнии IDlbFM на генетической основе линии B10.D2(R101) оказались неспособны к эффективной элиминации опухолевых клеток. Тем не менее, тимома EL-4 развивается в организме животных линии IDlbFM значительно медленнее, чем в организме сингенных животных. Это связано с тем, что клетки тимомы находятся под давлением иммунного ответа, который недостаточен для полного отторжения опухоли, однако способен вызвать процессы селекции опухолевых клеток. Мы предположили, что селекция опухолевых клеток пойдет по пути утраты экспрессии молекулы H-IK*". Из асцита брюшной полости мьппей линии IDlbFM мы выделили опухолевые клетки и проанализировали экспрессию молекулы Н-2К''. В качестве контроля бьши использованы клетки тимомы EL-4, выделенные из асцита брюпшой полости мьшш линии C57BL/10. Оказалось, что клетки тимомы EL-4, выделенные из асцита брюшной полости мьппей линии IDlbFM полностью утратили молекулу Н-2К''МНС I класса на своей поверхности (рис. 11). Полученная сублиния тимомы EL-4 получила название EL-4.1b. Утрата экспрессии молекулы МНС I класса оказалась стабильной: поверхностный фенотип сохранялся через 21 день культивирования in vitro. Л /i i \ 1 !кь+ 0,586% У1'' 1 Рисунок 11. Экспрессия молекулы Н-ЗК' МНС I класса клетками тимомы прошедшими иммунную селекцию в организме трансгенных животных. Сплошная линия — клетки тимомы ЕЬ-4 выделены из асцита брюшной полости мьппи линии Ш1ЬРМ на генетической основе В}0.02(Я101). Пунктирная линия — клетки тимомы ЕЬ-4 выделены из асцита брюшной полости мыши линии С57ВЬ/10; Comp-FITC-A: Kb 19 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Мы исследовали взаимосвявь между поверхностным активационным фенотипом CDS"^ Т-лимфоцитов вьиванной и их функциональными сублетальным характеристиками в условиях облучением, с помощью лимфопении, экспериментальной методики, позволяющей оценить иммунньш ответ Т-клеток памяти без вовлечения наивных Тлимфоцитов. Эта методика основана на способности аллоспецифичных Т-клеток памяти цролиферировать ш vitfo в ответе на аллогенные спленоциты или опухолевые клетки подвергнутые острому тепловому шоку (прогревание в течение 1 часа при 45°С). Оказалось, что приобретение Т-клеткой поверхносгаого активационного фенотипа не приводит к появлению у нее функциональных характеристик Т-клетки памяти. Таким образом, способность Т-лимфоцита подвергнутые острому цролиферировать тепловому шоку, в ответ определяется на аллогенные стимуляторы, исключительно предыдущим «антигенным опытом» Т-клетки. Для исследования механизмов, лежащих в основе приобретения Т-лимфоцитом того или иного поверхностного фенотипа, мы создали две линии трансгенных животных, экспрессирующих ß-цепь Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1. Экспрессия трансгенной нарушений в развитии ß-цепи TCR гибридомы 1D1 не вызьшает каких-либо Т-лимфоцитов. Трансгенные Т-клетки успешно проходят внутритимусную селекцию и выходят на периферию. Для трансгенных Т-лимфоцитов не существует предпочтительной линии дифференцировки (CD4 или CD8). Оказалось, что экспрессия трансгенной ß-цепи Т-клеточного рецептора значительно изменяет баланс субпопуляций наивных и активированных Т-клеток в организме. 70-75% CD8^ Т-лимфоцитов, экспрессирующих трансгенную ß-цепь TCR обладают поверхностным фенотипом наивных Т-клеток (CD44-CD62L0. В то же время, значительная доля Тлимфоцитов, состоянии. экспрессирующих эндогенные цепи TCR, находится в активированном Этот эффёкг наблюдается у мьппей обеих трансгенных линий, что свидетельствует о том, что он не является следствием каких-либо сторонних эффектов трансгенеза. В условия снижения конкуренции за эндогенные комплексы МНС/пептид трансгенные Т-лимфоциты приобретают поверхностный фенотип CD44*. Таким образом, поверхностный фенотип периферических Т-лимфоцитов определяется доступностью эндогенных МНС-пептидных лигандов, с которыми может взаимодействовать их Тклеточный рецептор. Экспрессия трансгенной ß-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 приводит к значительному снижению уровня аллогенных ответов ш vitro и ¡п vivo. Слабый аллогенный 20 ответ; развивающийся в организме трансгенных животных, делает невозможным отторжение клеток аллогенной тимомы EL-4, однако приводит к иммунной селекщни опухолевых клеток. Таким образом, в работе исследована взаимосвязь поверхностного акгивационного фенотипа CD8* Т-клеток с их функциональными свойствами, а также механизмы, лежащие в основе приобретения Т-лимфоцитом того или иного поверхностного фенотипа. Эти результаты могут иметь важное значение для понимания процессов формирования пулов Тклеток с различными функциональными характеристиками и поверхностным активационным фенотипом. ВЫВОДЫ 1. Т-лимфоциты в условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением, приобретают поверхностный фенотип клеток памяти, однако оказываются неспособными отвечать in vitro на аллогенные стимуляторы, подвергнутые острому тепловому шоку. 2. Т-лимфоциты, приобретают адоптивно перенесенные поверхностный фенотип сублетально облученным активированных животньш, Т-клеток, однако их способность к первичному и вторичному аллогенному иммунному' ответу in vitro значительно подавлена. 3. Впервые получены и охарактеризованы две независимые линии мьппей, трансгенных по Р-цепи Т-клеточного рецептора гибридомы 1D1 на генетической основе линии B10.D2(R101). 4. Структура Т-клеточного рецептора в значительной степени определяет уровень экспрессии поверхностных маркеров CD44 и CD62L. 5. Экспрессия трансгена р-цепи Т-клеточного рецептора изменяет баланс субпопуляций наивных и активированных Т-клеток в организме. 6. Т-лимфоциты приобретают CD8^ линии IDlbFF, поверхностный фенотип экспрессирующие активированных трансгенную клеток в Р-цепь, условиях лимфопении, вызванной сублетальным облучением. 7. Уровень аллогенного иммунного ответа in vitro мьппей трансгенной линии IDlbFM за-метно снижен по сравнению с мышами дикого ттша. 8. Иммунный ответ Т-лимфоцитов трансгенных животных in vivo недостаточен для эффективного отторжения аллогенной опухоли: мыши линии IDlbFM на генетической основе B10.D2(R101) погибают через 40-60 дней после введения клеток тимомы EL-4. 21 9. Иммунный ответ лимфоцитов мышей трансгенной линии IDlbFM на генетической основе B10.D2(R101) на клетки тимомы EL-4 вызывает потерю экспрессии молекулы К"" МНС I класса клетками тимомы. Список работ, опубликованных по теме диссертации журналах, рекомецдованвых ВАК РФ 1. Казанский, Д. Б. Использование мультшшетных пептидов для форсификации вакцин, стимулируюпдах специфический клеточный иммунитет/ Д. Б. Казанский, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, В. Н. Петрищев, Е. Л. Агафонова, Н. В. Сернова, Д. А. Лим, Ю. Ю. Силаева, Л. Ю. Скляров, И. Н. Сбитяева, Н. А. Копина // Новости науки и техники. Серия Медицина. Аллергия, астма и клиническая иммунология. — 1999. — №9. —с. 57-60. 2. Казанский, Д. Б. Использование мультиплетных пептидов для стимуляции специфического клеточного иммунитета. / Д. Б. Казанский, Ю. Ю. Силаева, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, В. Н. Петрищев, Л. А. Побезинский, Е. Л. Агафонова, Л. Ю. Скляров, И. Н. Сбитнева, Н. А. Копина, И. Г. Сидорович // Аллергия, астма и клиническая иммунология. — 2001.—^№1. —с. 48-51. 3. Pobezinskaya, E.L. Cross reactivity of Т cell receptor on memory cells isolated after immmiization with allogeneic himor cells. / E. L. Pobezinskaya, L. A. Pobezinskii, Y. Y, Silaeva, T. V. Anfalova, L. M. Khromykh, T. S. Tereshchenko, E. S. Zvezdova, D. B. Kazanskii // Bull Exp Biol Med. — 2004. — V.137. — №5. — c. 493-498. 4. Звездова, E. C. Создание трансгенных животных, экспрессируюпщх а- и Р-цепи аугореактивного TCR / Е. С. Звездова, Ю. Ю. Силаева, М. С. Вагида, Е. В. Марюхнич, А. В. Дейкин, Т. Г. Ермолкевич, С. Г. Кадулин, Е. Р. Садчикова, И. Л. Гольдман, Д. Б. Клзанский // Мол. Биол. — 2010. — Т. 44. — №2. — с. 311-322. 5. Силаева, Ю. Ю. Сокращение пула Т-лимфоцитов с поверхностным фенотипом эффекторов и клеток памяти под воздействием экспрессии трансгена Р-цепн Тклегочного рецептора / Ю. Ю. Силаева, А. А. Калинина, М.С. Вагида, Л. М. Хромых, А.В. Дейкин, Т. Г. Ермолкевич, Е. Р. Садчикова, И. Л. Гольдман, Д. Б. Казанский // Биохимия. — 2013. — Т. 78. — №5. — с. 714-726. Другие работы, опубликованные по теме диссертации: 1. Kazansky, D. В. Heat shock of АРС results in profound decrease in constitutive expression of CD80 and CD86: Implication for expression of different patterns of cytokines by naive and memory T cells / D. B. Kazansky, V. N. Petrishchev, D. A. Lim, Y. Y. SUaeva, T. V. 22 Anfalova, L. M. Khromykh // John Humphrey Course "Self tolerance and self-recognition". — 2000.— Sinaia, Romania May 15-19. — P. 44-45. 2. Казанский, Д. Б. Использование мультиплешых пептидов для индукции специфического клеточного иммунитета / Д. Б. Казанский, Ю. Ю. Силаева, Л. Ю. Скляров, И. Н. Сбитнева, Н. А Копина, И. Г. Сидорович // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. — 2000. — Т. 4. — №. 1. — с. 93. 3. Казанский, Д. Б. Использование мулииплетных пептидов для индукции специфического клеточного иммунитета / Д. Б. Казанский, Ю. Ю. Силаева, В. Н. Петрищев, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, Л. Ю. Скляров, И. Н. Сбитнева, Н. А. Копина, И. Г. Сидорович // Материалы отчетной конференции по Межведомственной научно-технической программе "Вакцины нового поколения и медицинские диагностические системы будущего". Аллергология и иммунология. — 2000. — Т.1. — №3. —с. 110. 4. Казанский, Д. Б. Активация Т-клеток CD4+ древовидными пептидами последовательностью молекул МНС / Д. Б. Казанский, Л. А. Побезинский, с Е. Л. Побезинская, Ю. Ю. Силаева, В. Н. Петрищев, Т. В. Анфалова, Л. М. Хромых, Л. Ю. Скляров, И. Н. Сбитнева, Н. А. Копина, И. Г. Сидорович И Медицинская иммунология. — 2001, — Т З , — № 2 . —с. 125. 5. Kazansky, D. Generation of effector and memory CDS T cells: The abundance of memorylike T cells depends on TCR/MHC interactions (P1442) / D. Kazansky, Yu. Silaeva, A. Kalinina, M. Vagida, L. Khromykh, A. Deikin, T. Ermolkevich, E. Sadchikova, I. Goldman // Immunology 2013 Meeting Abstracto. J. Immunol. — 2013. — 190 (Meeting Abstract Supplement): 117.21. 6. Silaeva, Y. Expression of TCR trangenic beta-chain leads to contraction of T lymphocytes pools with surface phenotypes of effector and central memory cells / Y. Silaeva, A. Kalinina, M. Vagida, L. Khromykh, A. Deikin, T. Ermolkevich, E. Sadchikova, I. Goldman, D. Kazansky, // Front. Immunol. Conference Abstract: 15th International Congress of Immunology (ICI).—2013. — doi: 10.3389/conf.fimmu.2013.02.00339. 23 Подписано в печать 07.02.14 . Формат 60x84/16. Бумага офисная «8уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № ^03 Отпечатано на участке множительной техники • ФГБУ «РОНЦим.Н.Н.Блохина»РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24
