Актуальность проблемы
advertisement
На правах рукописи Стефанова Лидия Борисовна Механизмы устойчивости к гипоксии клеток эстрогеннезависимого рака молочной железы Специальность 14.01.12 – онкология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук (директор – д.м.н., проф., академик РАН и РАМН М. И. Давыдов) Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Красильников Михаил Александрович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории «Прогноза эффективности консервативного лечения» Федерального государственного бюджетного учреждения «Московский научноисследовательский онкологический институт имени П.А.Герцена» Министерства здравоохранения Российский Федерации Сергеева Наталья Сергеевна доктор медицинских наук, профессор кафедры онколо- Высоцкая Ирина Викторовна гии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Российский научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации Защита диссертации состоится «__» _________ 2014 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23. С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24) и на сайте www.ronc.ru Автореферат разослан «___» _________ 2014 года. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Барсуков Юрий Андреевич 2 Общая характеристика работы Актуальность проблемы Рак молочной железы (РМЖ) является одним из наиболее распространённых злокачественных заболеваний среди женщин [М.И.Давыдов, 2004, S.J.Fergusson, 2002, K.Lundgren, 2007], и, несмотря на значительный прогресс в его лечении, уровень смертности больных РМЖ остается достаточно высоким [М.И.Давыдов, 2004, Н.Е.Кушлинский и соавт., 2005, R.C.Bast Jr. Et al., 2000, J.R.Harris, 1996]. Одним из факторов, препятствующих снижению смертности, является развитие резистентности опухолей молочной железы к различным видам терапии [М.А.Красильников, 2004]. В этой связи актуально изучение молекулярных механизмов развития резистентности на моделях in vitro и выявление новых клеточных маркеров, определяющих чувствительность рака молочной железы к противоопухолевым препаратам. Основным критерием чувствительности больных РМЖ к гормональной терапии является содержание рецепторов эстрогенов (ERα) [T.BachleiterHofmann et al. 2002, J.Baselga et al., 2012]. Различают врожденную и приобретенную гормональную резистентность РМЖ (под последней подразумевают резистентность к гормональным препаратам, развившуюся в процессе терапии). В обоих случаях снижение гормональной зависимости может быть обусловлено как уменьшением содержания ERα, так рядом других факторов, среди которых – нарушение баланса между белками-активаторами и супрессорами ER; лиганд-независимая активация ERα; стимуляция сигнальных путей, идущих в обход ER (EGFR, PI3K, NF-kB) и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов [R.Clarke et al., 2003, A.Ring, 2004]. На сегодняшний день не вызывает сомнений важная роль, которую играет гипоксия в формировании фенотипа опухолевой клетки. Дефицит кислорода в микроокружении опухолевых клеток способствует развитию устойчивости к противоопухолевой терапии, в том числе к гормональным препаратам, что подтверждается большим количеством клинических данных. В целом опухоли, развивающиеся в условиях гипоксии, характеризуются более высокой степенью злокачественности и выраженной способностью к автономному, нерегулируемому росту [D.Generali et al., 2006, D.Generali et al., 2009, P.N.Span et al., 2003]. Основной задачей диссертации явилось исследование взаимосвязи между снижением гормональной зависимости и развитием устойчивости к гипоксии опухолей молочной железы. Предполагалось изучить особенности регуляции некоторых антиапоптотических сигнальных путей в клетках эст- 3 рогензависимого и эстроген-независимого рака молочной железы и установить их значение в развитии толерантности опухолевых клеток к гипоксии. Цели и задачи исследования Целью данной работы является исследование взаимосвязи между снижением гормональной зависимости и развитием устойчивости к гипоксии опухолей молочной железы, и установление молекулярного механизма толерантности к гипоксии в эстрогеннезависимых клетках рака молочной железы. Основные задачи работы: 1. Сравнительный анализ выживаемости в условиях гипоксии (1% О2) клеток эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы 2. Изучение базального и индуцированного гипоксией уровня экспрессии HIF-1α в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы 3. Исследование влияния гипоксии на содержание и активность рецептора эстрогенов ERα 4. Исследование значения Snail1/β-катенин-сигнального пути в регуляции выживаемости клеток рака молочной железы в условиях гипоксии 5. Исследование взаимной регуляции Snail1 и рецептора эстрогенов ERα в клетках рака молочной железы. Научная новизна и практическая значимость исследования Несмотря на значительный прогресс в исследовании молекулярного механизма реакции на гипоксию опухолевых клеток, значение аппарата рецепторов эстрогенов в этом процессе остается малоизученным. Судя по результатам отдельных работ, потеря рецепторов эстрогенов может провоцировать увеличение устойчивости клеток рака молочной железы к гипоксии, однако механизм активации протективных белков в гормонрезистентных опухолях РМЖ практически не исследован. В настоящей работе впервые продемонстрирован и исследован механизм устойчивости к гипоксии, основанный на активации в клетках эстрогеннезависимого рака молочной железы Snail1-сигнального пути, установлено значение белков Snail1 и β-катенина в поддержании роста и выживаемости опухолевых клеток в условиях гипоксии. 4 Получены новые данные о молекулярном механизме развития устойчивости к гипоксии опухолевых клеток и значении гормонального статуса опухолевых клеток в этом процессе. В экспериментах по подавлению экспрессии Snail1 c помощью РНК-интерференции установлено, что снижение экспрессии Snail1 повышает чувствительность клеток к гипоксии. Эти результаты позволяют рассматривать Snail1 в качестве перспективной мишени таргетной противоопухолевой терапии эстрогеннезависимого рака молочной железы. Личный вклад автора Автором самостоятельно проведён анализ отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме и разработан дизайн экспериментов, а также лично автором осуществлялись анализ и интерпретация результатов исследования, статистическая обработка данных, полученных в ходе экспериментов, формулирование выводов, оформление диссертационной работы. Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12. – «онкология», конкретно пунктам 2,3. Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите 22 апреля 2013 года на совместной научной конференции лаборатории молекулярной эндокринологии, лаборатории механизмов химического канцерогенеза, лаборатории механизмов гибели опухолевых клеток, лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Публикации По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 5 статей опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям учёной степени кандидата биологических наук. Структура и объём диссертации Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 24 рисунка. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список литературы содержит 221 источник. 5 Основное содержание работы Обзор литературы Первая часть обзора литературы включает в себя современные данные о регуляции клеточного метаболизма в условиях гипоксии, значении гипоксии при опухолевой прогрессии в целом, и при развитии рака молочной железы в частности. Особое внимание уделено описанию механизмов устойчивости к гипоксии клеток рака молочной железы. Вторая часть обзора посвящена изложению современных представлений о воздействии эстрогенов на клетки-мишени, о сигнальных путях рецепторов эстрогенов, о механизмах развития гормональной резистентности опухолей молочной железы. Третья часть обзора даёт представление о взаимосвязи механизмов устойчивости к гипоксии, развитием гормональной резистентности клеток рака молочной железы и процессами эпителиально-мезенхимального перехода. Материалы и методы В работе использовались следующие культуры клеток: ERположительная эстрогензависимая линия клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7; ER-положительная эстрогеннезависимая сублиния клеток MCF7/LS, полученная в результате культивирования клеток родительской линии MCF-7 в бесстероидной среде; ER-отрицательная линия клеток эпителия молочной железы HBL-100. Методы исследования: определение скорости роста клеток с помощью стандартного МТТ-теста; транзиторная трансфекция коротких интерферирующих РНК, экспрессионных и репортерных плазмид; определение транскрипционной активности методом репортерного анализа; определение эффективности трансфекции методом измерения активности β-галактозидазы; SDSэлектрофорез белков в полиакриламидном геле, определение уровня белков методом иммуноблоттинга, а также статистическая обработка полученных данных. Результаты исследования и обсуждение 1. Сравнительный анализ выживаемости в условиях гипоксии клеток эстрогензависимого и эстрогенрезистентного рака молочной железы 1.1. Рост клеток MCF-7 и HBL-100 в условиях гипоксии Для исследования реакции на гипоксию клетки культивировали в течение 3 суток при нормоксии и в условиях гипоксии (1% кислорода в атмосфере). Анализ скорости роста с помощью МТТ-теста показал, что в условиях гипоксии 6 происходит резкое снижение пролиферации клеток MCF-7 при сохранении относительно устойчивой пролиферации клеток HBL-100 (рис.1). Количество клеток, % 120 контроль 100 гипоксия, 1%О2 80 60 40 20 0 MCF-7 HBL-100 Рисунок 1. Чувствительность к гипоксии эстрогензависимых клеток линии MCF-7 и эстрогеннезависимых клеток линии HBL-100. Результаты MTT-теста, проведенного на 3-и сутки культивирования. Эти результаты позволили предположить, что в эстрогеннезависимых рецептор-негативных клетках срабатывают определённые механизмы, обеспечивающие устойчивость клеток к гипоксии. Предположение подтвердилось в экспериментах на культуре клеток MCF-7/LS – сублинии, полученной при длительном культивировании родительских клеток MCF-7 в отсутствие эстрадиола, и характеризующейся частичной инактивацией рецептора эстрогенов ERα, способностью к эстрогеннезависимому росту и высоким уровнем экспрессии рецепторов ростовых факторов [Y.S.Lobanova et al., 2007]. Анализ роста клеток MCF-7 и MCF-7/LS показал, что перевод в гипоксию приводит к существенно меньшему торможению пролиферации в клетках MCF7/LS по сравнению с родительскими клетками (рис.2). Количество клеток, % 120 контроль 100 гипоксия, 1%О2 80 60 40 20 0 MCF-7 MCF-7/LS Рисунок 2. Сравнительный анализ роста клеток MCF-7 и MCF-7/LS в условиях гипоксии. Результаты MTT-теста, проведенного на 3 сутки культивирования. 7 Полученные результаты свидетельствуют о том, что развитие гормональной резистентности и, следовательно, исключение ERα из цепи передачи митогенного сигнала, может сопровождаться существенным повышением устойчивости клеток к гипоксии. 1.2. Индукция HIF-1 под действием гипоксии HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1) является частью широко распространенного в различных тканях универсального механизма детекции уровня кислорода (P.J.Ratcliffe, 2006). По данным Sowter и соавт. в клетках рака молочной железы, так же, как и во многих других типах опухолей, основным маркёром гипоксии и, следовательно, более агрессивного фенотипа, является HIF-1α (H.M.Sowter, R.R.Raval, J.W.Moore, 2003). Связана ли повышенная устойчивость к гипоксии эстрогеннезависимых клеток с увеличенной экспрессией HIF1α? Наши результаты показали, что, несмотря на разницу в чувствительности к гипоксии, уровень активации HIF-1α в клетках MCF-7 и HBL-100 заметно не отличается (рис.3). Рисунок 3. Влияние гипоксии на содержание HIF-1α в клетках MCF-7 и HBL-100. Содержание HIF-1α определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из нескольких независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Таким образом, высокая устойчивость к гипоксии клеток HBL-100 не связана с повышенным уровнем индукции HIF-1α, и обусловлена, скорее всего, действием других факторов, участвующих в развитии реакции клеток на гипоксию. 1.3. Влияние гипоксии на содержание и активность рецептора эстрогенов ERα Каким образом наличие функционирующего рецептора в клетках делает их более чувствительными к гипоксии? Для ответа на этот вопрос необходимо выяснить, что происходит с рецептором в условиях недостатка кислорода. Мы 8 провели исследование содержания рецептора эстрогенов ERα в клетках MCF-7 в нормальных условиях и в условиях гипоксии. Результаты, полученные методом иммуноблоттинга, показали выраженную деградацию ERα через 24 час культивирования клеток в условиях гипоксии (рис.4). Рисунок 4. Влияние гипоксии на содержание ERα в клетках линии MCF-7. Содержание ERα определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Сходные данные были получены и при модулировании гипоксии в присутствии 200 мкм хлорида кобальта, добавляемого к клеткам на 24 часа (рис. 5). Рисунок 5. Влияние CoCl2 на содержание ERα в клетках линии MCF-7. Содержание ERα определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Эти результаты подтвердились при изучении активности ERα методом репортёрного анализа, продемонстрировавшим снижение транскрипционной активности ERα после культивирования клеток в течение 24 час в условиях гипоксии (рис.6) или в присутствии гипоксия-миметика хлорида кобальта (рис.7). 9 Рисунок 6. Влияние гипоксии на транскрипционную активность ERα в клетках MCF-7. Клетки культивировались в условиях гипоксии (1% О2) в течение 24 ч. после трансфекции. Репортёрный анализ Активность люциферазы (ERE/Luc) Усл.ед. 1500 контроль CoCl2 1000 500 0 MCF-7 Рисунок 7. Влияние гипоксия-миметика CoCl2 на транскрипционную активность ERα в клетках MCF-7. Клетки культивировались в присутствии 200 µM CoCl2 в течение 24 ч. после трансфекции. Репортёрный анализ Полученные результаты подтверждают известные данные о возможности деградации рецептора эстрогенов в условиях гипоксии. Так, схожая тенденция была продемонстрирована в работе J. Kurebayashi и соавт. на модели клеточных линий РМЖ ML-20 и KPL-1 [J.Kurebayashi et al., 2001]. Эти авторы показали, что гипоксия значительно снижает экспрессию и активность ERα в зависимости от времени культивирования в условиях 1% О2. Исследования, проведённые M.Stoner [M.Stoner et al., 2002) на ERα-положительной эстрогенчувствительной клеточной линии РМЖ ZR-75, показали, что снижение активности ERα в условиях гипоксии и при культивировании клеток с хлоридом кобальта связано с протеосомной деградацией этого белка. В экспериментах K.Ryu и соавт. на клеточных линиях MCF-7 и T47D было установлено, что в условиях гипоксии развитие гормональной резистентности вызвано как протеосомной деградацией ERα, так и подавлением транскрипции гена Esr1, кодирующего ERα [K.Ryu et al., 2011]. По данным клинико-лабораторных исследований, в образцах РМЖ пониженный уровень ERα наблюдается в перинекротических областях опухоли 10 и коррелирует с повышенной экспрессией маркёров гипоксии, таких как CA-IX и Glut-1 [C.Cooper et al., 2004]. Однако наши данные о снижении активности ERα в гипоксии частично противоречат наблюдениям Yi и соавт. [J.M.Yi et al., 2009]. Авторы этого исследования провели трансфекцию ERα-негативных эмбриональных клеток почки человека HEK293 плазмидой с ERα дикого типа и репортерной конструкцией с эстроген-чувствительными элементами. Эстрадиол и гипоксия приводили к росту активности ERα в этой модели, а их комбинация вызывала значительный синергетический эффект: увеличение активности ERα более чем в 10 раз по сравнению с контрольными клетками. Основываясь на этих данных, авторы делают вывод об активации ERα в условиях гипоксии. В этой работе Yi и соавт. также используют линию клеток MCF-7: в этой модели совместно воздействие эстрадиола и гипоксии приводило к деградации ERα, однако репортерный анализ на этих клетках не проведен, и авторы ограничились лишь анализом уровня белка ERα. По-видимому, снижение активности ERα в гипоксии, продемонстрированное в нашей работе и подтверждающее данные других авторов, является тканеспецифичным и не воспроизводится на клеточных моделях другого генеза при трансфекции экзогенным ERα. Таким образом, полученные нами результаты демонстрируют эффект снижения экспрессии и активности рецептора эстрогена ERα в клетках РМЖ в условиях гипоксии, что позволяет рассматривать гипоксия-зависимую деградацию ERα в качестве одного из факторов, определяющих сравнительно высокую чувствительность гормонозависимых опухолей молочной железы к гипоксии. 2. Гипоксия и эстрогеннезависимые сигнальные пути 2.1 Влияние гипоксии на уровень HER2/Neu В литературе неоднократно отмечалось, что в условиях гипоксии не только не снижается, но может и возрастать активность рецепторов белковопептидных факторов, в частности EGFR, Her2/Neu, IGFR, контролирующих пролиферацию эстрогеннезависимых клеток [D.G.Hicks et al., 2006]. Предполагается, что рецепторы ростовых факторов находятся под позитивным контролем со стороны HIF-1/2 [S.Eliasz et al., 2010, A.Franovic et al., 2007, M.B.Gariboldi et al., 2010], хотя некоторые исследователи указывают также на независимую от HIF активацию рецепторов ростовых факторов в условиях гипоксии [T.R.Kim et al., 2012, Y.Mizukami et al., 2007]. Мы исследовали динамику накопления в клетках Her2/Neu – белка из семейства рецепторов ЭФР. С этой целью была проведена трансфекция клеток 11 MCF-7 плазмидой, содержавшей дикий вариант гена Her2/Neu, с последующим определением уровня Her2/Neu в условиях нормоксии и гипоксии. Результаты показали, что в отличие от ERα, уровень Her2/Neu практически не изменяется в условиях гипоксии, оставаясь на прежнем уровне (рис.8). Рисунок 8. Влияние гипоксии на содержание HER2/Neu в клетках MCF-7. Содержание HER2/Neu определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Вероятно, экспрессия в эстрогеннезависимых клетках подобных тирозинкиназных рецепторов, малочувствительных к гипоксии, может частично поддерживать рост таких клеток в условиях гипоксии – в отличие от эстрогензависимых клеток, пролиферация которых преимущественно регулируется через аппарат рецепторов эстрогенов. Наши данные об устойчивости белка HER2/neu к гипоксическим условиям дополняют результаты Dragowska и соавт. [W.H.Dragowska et al., 2007] о действии гефитиниба на ERα-положительные опухоли с повышенной экспрессией HER2/neu у мышей. Известно, что основной мишенью для гефитиниба являются EGFR-положительные клетки, где этот препарат ингибирует EGFR и частично подавляет активность тирозинкиназы HER2/neu. В экспериментах, проведенных Dragowska и соавт., гефитиниб снижал активность EGFR, HER2/neu и МАP-киназ Erk1/2 и вызывал реоксигенацию опухолевой ткани у мышей. В статье аналогичной тематики Hardee и соавт. [M.E.Hardee et al., 2009] предлагается использовать трастузумаб (ингибитор HER2/neu) в качестве индуктора оксигенации опухолевой ткани; ожидается, что повышенный уровень кислорода сенсибилизирует опухоли к химио- и радиотерапии. На моделях in vitro, повидимому, возникает регуляторная петля: с одной стороны HER2/neu сигнальный путь обеспечивает гипоксию в опухолевой ткани, с другой – гипоксия стимулирует через HIF-1α активность тирозинкиназы HER2/neu. Наличие положительной обратной связи между белками HER2/neu и HIF-1α делает в ряде случаев неэффективной таргетную монотерапию такими препаратами как гефитиниб, эрлотиниб, трастузумаб и др., что может быть преодолено только с помо12 щью мультитаргетных подходов, включающих одновременное ингибирование различных сигнальных мишеней (рецепторных тирозинкиназ, MAP-киназ, PI3K, mTOR, ароматазы и др.). Клинические испытания таких комбинированных схем терапии РМЖ, проведенные за последние годы, показывают перспективность таких подходов [B.Kaufman et al., 2009, P.K.Marcom et al., 2007, L.S.Schwartzberg et al., 2010]. 2.2 Гипоксия и белок Snail1. Значение Snail1 в регуляции выживаемо- сти клеток в условиях гипоксии 2.2.1 Влияние плотности культивируемых in vitro клеток на чувствительность к гипоксии Известно, что потеря клетками рака молочной железы гормональной зависимости может сопровождаться утратой E-кадхерина, ослаблением клеточных контактов и появлением признаков эпителиально-мезенхимального перехода, что обеспечивает развитие более агрессивного и устойчивого фенотипа [N.Fujita et al., 2003]. Задачей следующего этапа наших экспериментов было исследование возможной связи между уменьшением клеточных контактов и развитием устойчивости к гипоксии клеток РМЖ. Анализ скорости роста клеток РМЖ после культивирования в условиях гипоксии показал, что в случае исходно высокой плотности клеток, не менее 60% монослоя, гипоксия приводит к существенному торможению роста клеток. В то же время при низкой плотности культуры, около 30% монослоя, рост-ингибирующий эффект гипоксии становится заметно менее выраженным (рис.9). Рисунок 9. Влияние плотности посева клеток MCF-7и HBL-100 на чувствительность к гипоксии. Рост клеток в условиях гипоксии при высокой и низкой плотности культуры. Представлены результаты МТТ-теста, проведённого на 3 сутки культивирования в условиях 1% О2. 13 Какую роль играют при этом клеточные контакты? Нельзя было исключить, что высокая плотность клеток тормозит их рост не за счет увеличения клеточных контактов, но вследствие истощения культуральной среды и накопления токсических метаболитов. Для исследования роли клеточных контактов в обеспечении реакции на гипоксию были проведены эксперименты по культивированию клеток на специальных вставках (Nunc Cell Culture Inserts), позволяющих в два раза увеличить культуральную поверхность лунок 24-луночного планшета при сохранении неизменными общего количества клеток и объема среды. Результаты показали, что снижения плотности клеток с помощью вставок достаточно для увеличения устойчивости к гипоксии, что свидетельствует о ведущем значении межклеточных взаимодействий в регуляции ответа клеток на гипоксию (рис.10). 120 контроль Количество клеток, % 100 гипоксия, 1%О2 80 60 40 20 0 без вставки со вставкой Рисунок 10. Влияние плотности посева клеток MCF-7 на чувствительность к гипоксии. Рост клеток в условиях гипоксии при посеве на дополнительные вставки; представлены результаты анализа MTT, проведенного на 3 сут. культивирования в условиях 1% О2; 2.2.2 Участие Snail1 в регуляции чувствительности клеток к гипоксии Известно, что одним из ключевых факторов развития эпителиальномезенхимального перехода является белок Snail1. По данным ряда исследователей, Snail1 напрямую подавляет транскрипцию E-кадхерина – основного белка клеточных контактов [E.Batle et al., 2000]. Эксперименты, проведённые T. Imai и соавт. и N. Kurrey и соавт. на клеточных линиях рака яичников показали, что гипоксия приводит к повышению экспрессии Snail1, снижению уровня Eкадхерина и повышению способности клеток к инвазии [T.Imai et al., 2003, K.A.Kurrey et al., 2005]. Предположительно, активация Snail1 усиливает клеточную инвазию и может стимулировать выживаемость опухолевых клеток при действии неблагоприятных факторов [S.Vega et al., 2004]. 14 Ранее мы показали, что эстрогеннезависимые клетки HBL-100 отличаются высоким содержанием Snail1 по сравнению с эстрогензависимыми клетками MCF-7. При изучении влияния гипоксии на уровень Snail1 мы обнаружили, что гипоксия существенно не изменяет содержание этого белка в клетках (рис. 11), но приводит к значительному повышению трансрепрессорной активности Snail1 (рис. 12). Для определения последней использовалась плазмида, содержащая ген-репортер люциферазы под контролем Snail1-связывающего участка промотора E-кадхерина – гена, находящегося под негативным контролем Snail1. 1500 Контроль 500 1000 Гипоксия 1%О2 0 Активность люциферазы E-cad/luc,отн.ед. Рисунок 11. Влияние гипоксии на содержание Snail1 в клетках MCF-7 и HBL-100. Содержание Snail1 определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трёх независимых экспериментов. Иммуноблоттинг MCF-7 HBL-100 Рисунок 12. Влияние гипоксии на трансрепрессорную активность Snail1 в клетках MCF-7 и HBL-100. Снижение активности люциферазы соответствует повышению трансрепрессорной активности Snail1. Репортёрный анализ Сравнительный анализ содержания и активности Snail1 в клеточных культурах с различной плотностью показал резкое увеличение уровня Snail1 при снижении плотности клеток (рис.13, 14). 15 Рисунок 13. Содержание Snail1 в клетках MCF-7 и HBL-100 при различной плотности посева. Содержание Snail1 определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг 100 200 300 400 низкая плотность 0 Активность люциферазы E-cad/luc,отн.ед. 500 высокая плотность MCF-7 HBL-100 Рисунок 14. Трансрепрессорная активность Snail1 при различной плотности посева: Снижение активности люциферазы соответствует повышению трансрепрессорной активности Snail1. Репортёрный анализ Связана ли относительная толерантность к гипоксии клеток РМЖ с повышенным содержанием в них Snail1? Мы предположили, что гиперэкспрессия Snail1 поддерживает выживаемость клеток в условиях гипоксии – и именно этот эффект обуславливает, как минимум частично, толерантность к гипоксии клеточных культур с низкой плотностью посева (активно экспрессирующих Snail1), и относительную (по сравнению с клетками MCF-7) устойчивость к гипоксии клеток HBL-100. Для подтверждения протективной роли Snail1 в регуляции ответа клеток на гипоксию была использована методика подавления экспрессии Snail1 с помощью короткой интерферирующей РНК. Действительно, было продемонстрировано, что подавление Snail1 приводит к увеличению чувствительности клеток 16 HBL-100 к гипоксии, что свидетельствует об участии этого белка в поддержании выживаемости клеток (Рис.15). количество выживших клеток, % контроль гипоксия, 1%О2 100 50 0 si-scrambl si-Snail Рисунок 15. Влияние трансфекции siRNA Snail1 на чувствительность клеток HBL-100 к гипоксии. Представлены результаты МТТ-теста, проведённого на 3 сутки культивирования клеток в условиях 1% О2. 2.3. Взаимоотношения между Snail1 и ER-alpha (Эксперименты проводились совместно с О.Е.Андреевой.) Существует ли взаимосвязь между уровнем Snail1 и наличием в клетках функционирующего рецептора эстрогенов? Согласно литературным данным, результаты многочисленных исследований, касающихся взаимосвязи между гормональным статусом опухоли и экспрессией Snail1, довольно противоречивы. Так, Fujita и соавторы показали, что гормонрезистентные ERα-негативные клетки часто утрачивают E-кадхерин, а следовательно, межклеточные контакты. Гормональная регуляция E-кадхерина осуществляется через стимуляцию МТА3 (Metastasis-associated protein 3), который подавляет экспрессию Snail1, поддерживая дифференцированный эпителиальный фенотип в клетках РМЖ. Биосинтез MTA3 возможен при наличии в клетке функционирующих рецепторов ERα и эстрогена. В отсутствие ERα снижается уровень MTA3 и, соответственно, возрастает экспрессия Snail1, что приводит к подавлению синтеза Eкадхерина и ослаблению межклеточных контактов [N.Fujita et al., 2003]. Эти данные согласуются с нашими результатами, показавшими высокий уровень Snail1 в ER-негативных клетках HBL-100. Существуют и противоположные экспериментальные данные, согласно которым эстрогены подавляют экспрессию E-кадхерина в ER-позитивных опухолях [S.Oesterreich et al., 2003]. Часто в исследованиях опухолей молочной железы выявляется очень разная и иногда противоположная корреляция между ак- 17 ER alpha 500 1000 1500 контроль 0 акт-ть люциф. (E-cad/luc), усл.ед. 2000 тивностью ERα, E-кадхерина, Snail1 и MTA3 [N.Fujita et al., 2003, S.M.Siitonen et al., 1996, P.Lipponen et al., 1994, K.B.Pedersen et al., 2002]. В наших экспериментах для изучения влияния ERα на активность Snail1 была проведена трансфекция клеток HBL-100 плазмидой, содержащей ген дикого типа ERα. Результаты показали, что трансфекция ERα приводит к заметному подавлению трансрепрессорной активности Snail1 при отсутствии выраженных изменений в уровне его экспрессии, что свидетельствует об участии ERα в негативной регуляции Snail1 на эпигеномном уровне (рис.16, 17). HBL-100 Рисунок 16. Влияние трансфекции клеток HBL-100 плазмидой, содержавшей ген дикого типа ERα, на трансрепрессорную активность Snail1. Репортёрный анализ Рисунок 17. Влияние трансфекции клеток HBL-100 плазмидой, содержавшей ген дикого типа ERα, на экспрессию Snail1. Содержание Snail1 определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трех независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Представленные данные свидетельствуют о том, что высокий уровень Snail1 является одним из факторов, поддерживающих выживаемость клеток рака молочной железы в условиях гипоксии; при этом активация Snail1 может 18 быть связана, в частности, со снижением активности рецептора эстрогенов ERα, участвующего в негативной регуляции Snail1. 2.4. Участие кадхерин-катенинового сигнального пути в реакции клеток на гипоксию Следующим этапом исследования стало изучение механизма протективного действия Snail1, идентификация Snail-зависимых сигнальных путей, участвующих в регуляции выживаемости клеток РМЖ в условиях гипоксии. Анализ содержания в клетках Е-кадхерина – одного из основных трансмембранных белков, находящихся под негативным контролем Snail1 – выявил резкое снижение уровня Е-кадхерина в клетках HBL-100 по сравнению с клетками MCF-7 (рис.18), при этом гипоксия практически не влияла на содержание Е-кадхерина (рис.19 ). Рисунок 18. Содержание Е-кадхерина в клетках MCF-7 и HBL-100. Содержание Е-кадхерина определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трёх независимых экспериментов. Иммуноблоттинг Рисунок 19. Влияние гипоксии на содержание Е-кадхерина в клетках MCF-7. Содержание Е-кадхерина определяли в тотальных клеточных лизатах. Представлены результаты одного из трёх независимых экспериментов. Иммуноблоттинг 19 контроль 10000 20000 гипоксия, 1%О2 0 Активность люциферазы (бета-катенин/Luc), усл.ед. 30000 Известно, что Е-кадхерин закрепляется в мембране посредством βкатенина – мультифункционального белка, который помимо стабилизации клеточных контактов, выполняет функцию транскрипционного фактора. β-Катенин связывается с цитоплазматическим доменом E-кадхерина, соединяя его с белками цитоскелета, тем самым закрепляя в мембране. При подавлении экспрессии E-кадхерина в процессе эпителиально-мезенхимального перехода βкатенин высвобождается из комплекса с E-кадхерином, переходя в цитоплазму, где может стабилизироваться и транспортироваться в ядро. В ядре β-катенин выступает в роли кофактора некоторых транскрипционных факторов, запускающих экспрессию генов контроля клеточного цикла [A.G.de Herreros et al., 2010, Y.G.Jiang et al., 2007, A.Novak et al., 1998], в том числе β-катенин может напрямую взаимодействовать с HIF1, регулируя экспрессию гипоксиязависимых генов [S.Iqbal et al., 2012]. Для исследования влияния гипоксии на активность β-катенина мы провели трансдукцию клеток линии MCF-7 репортерной конструкцией, содержавшей ген люциферазы под контролем β-катенин - чувствительного промотора с последующим культивированием клеток в гипоксии. Полученные результаты продемонстрировали выраженное увеличение транскрипционной активности βкатенина через 5-6 ч. культивирования в условиях гипоксии (рис.18), развивающееся параллельно с активацией Snail1. MCF-7 Рисунок 18. Влияние гипоксии на транскрипционную активность β-катенина. Клетки культивировались в условиях гипоксии (1% О2) 6 часов после трансфекции. Репортёрный анализ Целью следующих экспериментов явилось изучение влияния β-катенина на экспрессию HIF-1-зависимых генов. С этой целью клетки трансфицировали плазмидой, содержавшей ген люциферазы под контролем гипоксияреспонсивного элемента (hypoxia response element, HRE) – канонической последовательности ДНК, специфически связывающей HIF-1, с последующей обра20 3000 контроль 1000 2000 гипоксия, 1%О2 0 активность люциферазы (HRE/luc), усл.ед. боткой клеток специфическим ингибитором β-катенина – ICG-001 и переводом клеток в нормоксию или гипоксию. Мы показали, что уровень гипоксиязависимой активации репортерной плазмиды существенно ослабляется в присутствии ICG-001 (рис.19), что свидетельствует о непосредственном участии βкатенина в регуляции HIF-1-зависимых генов в клетках РМЖ. - + ICG-001 Рисунок 19. Влияние ингибитора β-катенина ICG-001 на активность гипоксияреспонсивного элемента (HRE). Заключение Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что потеря клетками РМЖ гормональной зависимости может сопровождаться развитием повышенной устойчивости опухолей к гипоксии. В основе этого эффекта лежит целый комплекс факторов, некоторые из которых нам удалось установить. В их числе – активация в эстрогеннезависимых клетках митогенного сигналинга, инициируемого рецепторами ростовых факторов – которые, в отличие от рецепторов эстрогенов, более устойчивы к гипоксии. Среди эстрогеннезависимых путей, активируемых в клетках при потере рецептора, выраженный протективный, антигипоксический эффект продемонстрировал Snail/β-катенинсигнальный путь, обычно находящийся под негативным контролем со стороны рецептора эстрогенов. Мы показали, что протективный эффект Snail1 в эстрогеннезависимых клетках может обеспечиваться активацией β-катенинсигнального пути, непосредственно регулирующего экспрессию гипоксиязависимых генов. Полученные данные свидетельствуют о том, что высокий уровень Snail1 является одним из факторов, поддерживающих выживаемость клеток рака молочной железы в условиях гипоксии, что позволяет рассматривать Snail1 в качестве перспективной мишени таргетной противоопухолевой терапии эстрогеннезависимого рака молочной железы. 21 Мы рассматриваем полученные результаты как базу для дальнейших исследований, целью которых является изучение механизма адаптации опухолевых клеток к гипоксии и разработка на основе полученных данных новых подходов к повышению чувствительности злокачественных опухолей к антиангиогенной терапии. Выводы 1. Эстрогеннезависимые клетки РМЖ линии HBL-100 и сублинии MCF-7/LS проявляют большую жизнеспособность в условиях гипоксии по сравнению с эстрогензависимыми клетками РМЖ линии MCF-7. 2. Несмотря на разницу в чувствительности к гипоксии, содержание фактора HIF-1α через 24 час культивирования в условиях 1% кислорода в клетках линии HBL-100 не возрастает по сравнению с таковым в клетках линии MCF-7. Предположительно, высокая устойчивость к гипоксии клеток HBL100 не связана с повышенным уровнем HIF-1α и обусловлена действием других факторов, участвующих в развитии реакции клеток на гипоксию. 3. Гипоксия способствует деградации рецептора эстрогенов ERα в эстрогензависимых клетках линии MCF-7. Наличие в клетках активного ERα можно рассматривать в качестве фактора, определяющего высокую чувствительность к гипоксии эстроген-зависимых клеток. 4. Уровень Her2/Neu – одного из основных эстрогеннезависимых митогенных факторов клеток рака молочной железы – не изменяется в условиях гипоксии, свидетельствуя о способности HER2/Neu частично поддерживать рост клеток в условиях гипоксии 5. Снижение плотности клеток MCF-7 в культуре повышает их устойчивость к гипоксии, что указывает на важную роль клеточных контактов в реакции клеток на пониженное содержание кислорода в среде. 6. Относительная устойчивость к гипоксии клеток в низкой плотности, как и толерантность к гипоксии эстрогеннезависимых клеток коррелируют с высоким содержанием Snail1. Подавление Snail1 приводит к увеличению чувствительности клеток к гипоксии, что свидетельствует об участии Snail1 в поддержании выживаемости клеток. 7. Протективный антигипоксический эффект Snail1 предположительно опосредован активацией β-катенин-сигнального пути, непосредственно регулирующего гипоксия-зависимые гены. 8. В целом, полученные результаты свидетельствуют, что потеря клетками рака молочной железы гормональной зависимости может сопровождаться повышенной устойчивостью опухолей к гипоксии; при этом выживаемость 22 клеток рака молочной железы в условиях гипоксии регулируется с участием Snail1/бета-катенин-сигнального пути, что позволяет рассматривать эти белки в качестве перспективных прогностических факторов чувствительности опухолей к антиангиогенной терапии. Список работ по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК 1. Щербаков,А.М. // Сигнальный путь β-катенина и устойчивость клеток рака молочной железы к гипоксическим условиям / А.М.Щербаков, Л.Б.Стефанова, И.А.Якушина, М.А.Красильников // Клиническая лабораторная диагностика. – 2013. - №10 – С.37-39. 2. Stefanova,L.B. // Snail/beta-catenin signaling protects breast cancer cells from hypoxia attack / L.B.Stefanova, A.M. Scherbakov, S.E.Semina et al. // Experimental cell research. – 2013. - Vol.319 - P.3150–3159. 3. Щербаков,А.М. // Механизм устойчивости к гипоксии клеток эстрогеннезависимого рака молочной железы: роль белков эпителиальномезенхимального перехода Snail1 и β-catenin /А.М. Щербаков, Л.Б. Стефанова, О.Е. Андреева и др. // Молекулярная медицина. – 2013. - № 1 - С. 29-33. 4. Щербаков,А.М. // Роль Snail-сигнального пути в развитии устойчивости к гипоксии клеток рака молочной железы. / А.М. Щербаков, Л.Б. Стефанова, О.Е. Андреева и др. // Технологии живых систем. – 2012. - № 9 С.63-67. 5. Стефанова,Л.Б. // Чувствительность к гипоксии культивируемых in vitro клеток рака молочной железы: роль аппарата рецепторов эстрогенов. / Л.Б.Стефанова, А.М. Щербаков, О.Е. Андреева и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2012. - № 10 - С.6063. Тезисы конференций 6. Stefanova, L. The involvement of estrogen receptors in hypoxia response of breast cancer cells. / L.B. Stefanova, M.A. Krasil'nikov // Abstracts of FEBS Workshop of Cell Biology and Pharmacology on Mendelian Disorders, Vico Equense, Italy, 2011. - P.69 7. Стефанова, Л.Б. Гормональная чувствительность клеток рака молочной железы в условиях хронической гипоксии: роль сигнального пути NF-kB. / Л.Б. Стефанова, О.Е. Андреева, М.А. Красильников. // Сборник тезисов 23 докладов и стендовых сообщений XXIII Международной зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 7-10 февраля 2011. – С. 114. 8. Стефанова, Л.Б. Механизм регуляции гормональной чувствительности клеток рака молочной железы в условиях хронической гипоксии. / Л.Б. Стефанова, О.Е. Андреева, М.А. Красильников. // Сборник материалов XIV Российского Онкологического Конгресса, Москва, 23-25 ноября 2010.- C. 245-246. 9. Стефанова, Л.Б. Влияние HIF-1 и рецепторов эстрогенов на чувствительность к апоптозу клеток рака молочной железы в условиях гипоксии. / Л.Б. Стефанова, М.А. Красильников. // Сборник тезисов докладов Международной научной конференции, посвящённой 85-летию биологохимического факультета МПГУ и 90-летию со дня рождения почётного профессора Ю.Б.Филипповича, Москва, 2009. - С. 356-357. 24
